JP2002527761A - 細胞応答への影響に関する量的情報を入手するための改良方法 - Google Patents

細胞応答への影響に関する量的情報を入手するための改良方法

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バイオイメージ エイ／エス
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Abstract

(57)【要約】 細胞応答の影響の作用を定量するための改善された方法及び手段を記載する。詳しくは、生物活性ポリペプチドの細胞内転位又は再分布を検出するために改善した方法を記載する。この発明は、細胞を細胞応答に影響を及ぼす物質と接触させ、ほぼ同時に応答に関する量的情報を入手する幾つかの方法も記載する。この方法は、市場で入手可能な同時の、大量アッセイ技術を用いて、例えば新しい薬剤のスクリーニング、毒性のための物質の試験及び既知又は新しい薬剤に対する薬剤標的の同定に関連して、生理学的プロセスに対する物質の影響を試験又は発見するのに極めて有効な方法として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の要約 この発明は、細胞応答への影響、特に細胞応答(細胞応答は、細胞中の少なく
とも1つの成分の再分布で明示される)に影響する物質と細胞とを接触又はインキ
ュベートすることによって生じる影響に関する量的情報を入手するための改善さ
れた方法及び手段に関する。詳しくは、この発明は、細胞内経路に関連している
少なくとも1つの成分の再分布を伴う経路への影響に関する量的情報を入手する
ための改善された方法に関する。この発明の方法は、生理学的プロセスに対する
物質の影響を、例えば新しい薬剤のスクリーニング、物質の毒性試験、既知又は
新規な薬剤の薬剤標的の同定に関連した試験又は発見に極めて有効な手法として
用いることができる。特に、この発明は試験手法の同期化のための改善された方
法に関しており、多数の物質を市場で入手可能な手段を用いて同時に試験するこ
とができる。また、この発明は、細胞応答に影響する物質で細胞を接触させる幾
つかの方法及び適用性を改善するために細胞のこれらの物質との接触前、その最
中、及び後に実際の細胞になされる修飾、及びほぼ同時に細胞内経路に対する影
響に関する量的情報を入手するための方法の使用を記載する。この発明の方法及
び技術の他の有用な使用は、以下の記載に基づいて当業者に明らかであろう。こ
の発明の実際の具体例において、この発明は、細胞内プロセスに影響する生物学
的に活性なポリペプチド、好ましくは酵素の細胞内転位又は再分布を検出するた
めの方法、及びDNA構築物ならびに該方法で用いる細胞に関する。
【０００２】発明の背景 細胞内経路は、一時的かつ空間的に特徴的な様式でモジュレーションを受ける
成分のカスケードによってしっかりと調節されている。幾つかの疾患状態は、個
々のシグナル成分(つまり、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、
転位因子)の活性偏光の一因となっている。したがって、これらの成分が、治療
介入の魅力的な標的となる。 プロテインキナーゼとホスファターゼは、幾つかの細胞内シグナル経路に関し
てよく記載された成分である。プロテインキナーゼとホスファターゼの触媒活性
は、事実上全ての調節可能な細胞プロセスで役割を果たしているものと思われる
。細胞のシグナルと調節におけるプロテインキナーゼの関与は広範囲にわたって
研究されているが、例えばシグナル事象に関する正確なタイミングと空間的な特
徴づけにおける詳細な知識は、簡便な技術がないために得るのが難しいことが多
い。
【０００３】 キナーゼ及びホスファターゼのような細胞内酵素活性の測定は、手動及び種々
の自動化形態の双方の十分に確立された手法により、これらの手段を新しい薬剤
候補の研究に有用なものとする処理量速度で行うことができる。活性測定に加え
て、細胞中のこれら及び他の酵素の分布測定は有用であることが分かっており、
この種の測定にも確立された技術が存在する。プロテインキナーゼは、活性の前
、その間及び後に特異的な細胞内分布をしばしば示す。つまり、個々のプロテイ
ンキナーゼ又はそのサブユニットの転位プロセス及び/又は再分布のモニターに
より、その機能活性が暗示されるものと考えられる。転位と触媒活性との関連性
は、ジアシルグリセロール(DAG)-依存性プロテインキナーゼC (PKC)、cAMP依存
性プロテインキナーゼ(PKA) [Debernardiら、1996]及びマイトジェン活性化プロ
テインキナーゼErk-1 [Sanoら、1995] のようなプロテインキナーゼについて示
されている。プロテインキナーゼ及びホスファターゼの細胞内局在/活性の検出
に関するこのような方法には、免疫沈降、ウエスタンブロッティング及び免疫細
胞化学検出が含まれる。
【０００４】 完全には特徴づけられていない細胞内酵素の機能に関するひとつの観点は、酵
素の再分布である。酵素特異性機序としての酵素の細胞下再分布に関する重要性
、及び新規な薬剤標的の同定とこれらの標的に影響を及ぼす薬剤候補の研究の手
段としての細胞下再分布の測定に関する一般的な重要性は、優先年のあいだにWO 9845704号として公開されているように、その内容が優先権出願の一部であった
A METHOD FOR EXTRACTING QUANTITATIVE INFORMATION RELATING TO AN INFLUENC
E ON A CELLULAR RESPONSEに記載されている(ともに、引用によりここに導入す
る)。 細胞下成分の再分布が重要であることは知られているが、即時のこの現象の測
定は広く活用されていない。これは、主として適切な技術がないためである。本
質的に直接的な技術は1つしかない：興味ある細胞下成分を、例えばビデオ又は
科学的なCCDカメラと画像を収集して保存する適切なソフトウエアを用いて微細
な画像系によって可視化し、記録できるように標識する細胞の微細な画像化であ
る。完全な生細胞における細胞内経路の特異的なモジュレーションをモニターす
る新規な方法は、薬剤発見、機能的遺伝学、毒性学、患者モニター等に新たな機
会を提供するものと考えられる。
【０００５】 最近、哺乳類細胞を含む多くの種々の細胞型で発現される緑色蛍光タンパク質
(GFP)は高度な蛍光性になることが発見された[Chalfieら、1994]。WO 95/07463
号は、DNA分子によって産生されるタンパク質がGFPに融合した興味あるタンパク
質を有するように、GFPをエンコードするDNA配列に結合した興味あるタンパク質
をエンコードするDNA配列を有するDNA分子を細胞へ導入し、次いで融合タンパク
質の発現を可能にする条件で細胞を培養し、細胞中の蛍光の局在を検出し、それ
によって細胞中に興味あるタンパク質を位置づけることに基づいて、GFPを発現
しうる細胞、及び細胞で興味あるタンパク質を検出する方法を記載している。し
かし、このような融合タンパク質の例は提供されておらず、例えばプロテインキ
ナーゼ又はホスファターゼのようなシグナル経路に関与するタンパク質の活性化
によって細胞内プロセスに影響する生物学的に活性なポリペプチドの転位又は再
分布を検出もしくは定量するためにGFPを用いる融合タンパク質の使用は、提案
されていない。WO 95/07463号は、さらに、興味ある分子によって影響される遺
伝子の調節要素をGFPに操作的に連結すること(分子の存在が調節要素に影響し、
次いでGFPの発現に影響する)による、生物試料中のホルモン又は重金属のような
分子の検出に有用な細胞を記載している。このように、GFPをエンコードする遺
伝子は、特異的な分子同一性の存在をモニターするために構築される細胞でレポ
ーター遺伝子として用いられる。
【０００６】 緑色蛍光タンパク質(GFP)は、グルココルチコイド受容体(GR)の転位検出アッ
セイで用いられている[Carey, KLら、1996]。GR-S65TGFP融合体は、リガンドの
ないサイトゾルから核孔を通してリガンド結合後に依然としてある核へのアゴニ
ストデキサメタゾンに応じたグルココルチコイド受容体(GR)の転位に関与した機
序を研究するのに用いられている。GR-GFP融合体の使用によって、即時の画像化
及び蛍光シグナルの核/細胞質割合の定量が可能となる。同様の遺伝構築物を続
けて用い、自動薬剤スクリーニング用に設計したアレイスキャン(Array ScanTM)
(WO 97/45730)と呼ばれるシステムでヒーラ細胞における核へのGRの転位を誘導
するデキサメタゾンを定量した(Guiliano,K.A.ら、1997)。近年、幾つかの他の
研究によって、GFPとの細胞内シグナル経路に関与する特異的タンパク質(又はタ
ンパク質の一部)の標識化は、この経路に対する物質の影響を測定し定量する新
規な手段を提供することが立証されている。この概念は、アンドロゲン受容体(G
eorget Vら、1997)及びNF-Atc (Beals CRら、1997)のような転写因子の細胞質か
ら核への転位の双方について、上記GRについて既述しているものと同様に機能す
ることを示している。別の関連する例は、β-アレスチン(arrestin)-GFP構築物
であり、これはサイトゾルから原形質膜への転位によってG-タンパク質結合受容
体の活性化を伝達することが分かっている(Barak LSら、1997)。最後に、ホスホ
リパーゼCδ1のプレクストリン(pleckstrin)ホモロジードメイン様タンパク質の
小さな部分(Stauffer TPら、1998)及びPKCγのシステイン-リッチなドメイン(Oa
ncea Eら、1998)へのGFPの結合は、属する特異的シグナル経路の活性化中に細胞
内での再分布を定量することによって物質からの影響についてレポートするのに
使用できることも、立証されている。
【０００７】 プロテインキナーゼ活性に影響する化合物を見出すことを目的として現在使用
されている多くのスクリーニングプログラムは、人工物質又は天然物質、受容体
結合及び/又はレポーター遺伝子発現に関するキナーゼのリン酸化の測定に基づ
いている。しかし、将来的な処理量の高い薬剤スクリーニングの基礎としての蛍
光測定における興味は、ここ数年のあいだに劇的に高まっている(Silverman Lら
、1998)。この発明に特に興味深いのは、現在Molecular Devices Inc.によってF
LIPRTMとして市販されている、生細胞における蛍光変化の迅速なスクリーニング
のスキャンニングレーザーイメージャーである(Schroeder K & Neagle B 1996)
。
【０００８】発明の詳細な説明 この発明は、再分布に関与する細胞系の研究における新たな重要な次元を提供
するものであり、この発明によって、影響、一般的には化学物質又は化学物質の
混合物との接触、ならびに自然環境における変化によって引き起こされる再分布
応答又は事象が、大規模に同時に定量される。この定量によって、細胞系への影
響(又は影響の程度)と再分布応答とのあいだの数値で示される有意な関連性、又
は曲線もしくはグラフを設定することができる。これは、極めて有利である。と
いうのは、認められているように、定量は、迅速かつ再現性のある方法で達成す
ることができ、おそらくより重要なことに、この発明の方法を利用して定量化で
きる系は、莫大な量の新しい情報と洞察性が得られる系だからである。 このスクリーニングアッセイは、酵素活性の阻害/活性化よりむしろその作用
を調節する過程として完全に新規な作用モード(例えば、生物活性ポリペプチド
の再分布/転位の阻害又は促進)を有する生物活性物質を、生物活性ポリペプチド
の特定のイソ型に対する極めて高い選択性と、同じシグナル経路の同じ生物活性
ポリペプチド又は他の成分に関する他のイソ型に対する化合物選択性のさらなる
開発を保証する方法で同定できる系を提供することにおいて、他のスクリーニン
グアッセイ、例えば受容体結合アッセイ、酵素アッセイ及びレポーター遺伝子ア
ッセイより明らかに有用である。
【０００９】 もっとも広い観点において、この発明は、これまでの方法に比較して高い処理
量を有する、細胞応答に対する影響に関する量的情報を入手するための改善され
た方法に関しており、この方法は、発光団から発せられる空間の分散光中で、機
械的に無傷な生細胞に対する影響によって引き起こされる変化を記録することか
らなる。発光団は、細胞中に存在し、影響の程度に関連して再分布され得る、か
つ/又は影響の程度に関連して再分布され得る成分によってモジュレートされ得
る。結合によって発光団の発光特徴がモジュレートされ、蛍光強度の変化を測定
するよう設計した装置を用いて発光団からの空間分散光における変化が蛍光強度
の変更として検出及び記録され、かつ空間分散光中の記録された変化が処理され
、空間分散又は空間分散における変化が影響の程度と相関している量的情報が得
られる。この発明のひとつの観点において、機械的に無傷な生細胞は、影響が及
ぼされた後であるが、実際の実験記録の最中かその前に、しばらく透過性にされ
る。別の観点において、この発明は、細胞応答に対する影響に関する量的情報を
入手するための改善された方法に関する。その方法は、発光団から発せられた空
間分散光中で、透過性化生細胞に対する影響によって引き起こされる変化を記録
することからなる。発光団は細胞中に存在し、影響の程度に関連して再分布され
得る、かつ/又は影響の程度に関連して再分布され得る成分によってモジュレー
トされ得る。結合によって発光団の発光特徴がモジュレートされ、蛍光強度の変
化を測定するよう設計した装置を用いて発光団からの空間分散光が蛍光強度の変
更として検出及び記録され、かつ空間分散光中の記録された変化が処理され、空
間分散又は空間分散における変化が影響の程度と相関している量的情報が得られ
る。この発明の好ましい具体例において、細胞中に存在する発光団は、細胞内経
路の少なくともひとつの成分の再分布に関連するように、細胞内経路をモジュレ
ートして再分布され得る。この発明の別の好ましい具体例では、発光団は発蛍光
団である。
【００１０】 一般的には、細胞及び/又は細胞類は、実験のあいだ機械的に無傷で生きてい
る。この発明の別の具体例で、細胞は、影響を及ぼした後の時点(応答が有意で
あるように予定した時点)で固定し、後の任意の時間に記録する。別の具体例で
は、細胞及び/又は細胞類は、実験のあいだ機械的に無傷で生きているが、実験
分析の最初の工程として物理的又は化学的に崩壊もしくは透過性にされる。この
発明の別の観点では、細胞は原形質膜を永久に有し、実験のあいだ原形質膜が透
過性になるように実験開始前に安定的に透過性にされる。これによって、細胞内
経路の成分を、ペプチド、タンパク質及び親水性有機化合物のような細胞原形質
膜を通常は透過しない物質に接触させることができる。 機械的に無傷であるか又は透過性にされた生細胞は、酵母細胞のような真菌細
胞；昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞及び哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からな
る群から選択することができる。これらの細胞は、30℃かそれ以上の温度、好ま
しくは32〜39℃の温度、より好ましくは35〜38℃の温度、もっとも好ましくは約
37℃の温度で、影響が認められる時間のあいだ培養する。この発明のひとつの観
点において、機械的に無傷であるか又は透過性にされた生細胞は、同一又は非同
一細胞のマトリクスの一部である。この発明のひとつの具体例において、細胞は
、空間的な制限又は空間的な制限類の内部に含まれる細胞の群又は群類からなる
。ひとつの具体において、細胞は、定量的に同じであるが、種々の影響に付され
ている細胞の複数の群からなる。別の具体例で、細胞は、定量的に異なるが同じ
影響に付される細胞の複数の群からなる。
【００１１】 この発明のひとつの具体例において、空間的な制限(spatial limitation)は、
細胞が存在する基質上で限定される範囲である。空間的な制限は、共通の担体上
において１以上のアレイで配置されていてもよい。空間的な制限は、マイクロタ
イター型のプレートにおけるウエルであってもよく、例えば96、384、864及び15
36のウエルが、共通の担体上に位置する。別の具体例では、空間的な制限は、マ
イクロタイター型と異なる形式のプレートにおけるウエルである。この発明のひ
とつの具体例で、範囲は、範囲を画定するパターンで基質上に細胞が存在するこ
とによって確立される。この発明の別の観点では、範囲は、代わりとして、細胞
に用いられるか又は細胞によって接触される影響又は影響類の空間的なパターン
もしくはアレイによって確立される。この態様は、優先年のあいだにWO 9845704
号として公開されているように、その内容が優先権出願の一部であったA METHOD
FOR EXTRACTING QUANTITATIVE INFORMATION RELATING TO AN INFLUENCE ON A C
ELLULAR RESPONSEに開示されている(ともに引用によりここに導入する)。簡単に
言えば、発明のこの観点で、機械的に無傷であるか又は透過性にされた生細胞は
、細胞培養用に一般的に最適化された光学的に透明で平坦な表面上で培養される
細胞の連続又は不連続のシートの一部である。光学的に透明で平坦な表面は、細
胞の処理を可能にして膜孔を通して細胞を成長させ、かつ孔を通した直接的な液
体の毛細管流を可能にする孔膜であってもよい。
【００１２】 この発明で用いられる細胞は、ここに定義する融合ポリペプチドをエンコード
し、構築物によってエンコードされる配列を発現し得る核酸構築物を含むべきで
ある。細胞は、酵母細胞のような真菌細胞；昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞；哺
乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される真核細胞である。好ま
しい細胞は、哺乳類細胞である。 この発明の別の観点で、細胞は、ここに定義するような融合ポリペプチドをエ
ンコードする核酸配列を少なくともひとつの細胞成分に有し、該核酸配列を発現
し得る生物に由来していてもよい。生物は、単細胞生物及び哺乳動物のような多
細胞生物からなる群から選択される。
【００１３】 発光団は、影響の程度に関連した空間分散に光を発することによって再分布の
可視化及び/又は記録を可能にする成分である。再分布の用語は、発光団又は他
の成分の転位のような空間的な位置における変化の全ての態様をカバーすること
を意図している。発明のひとつの具体例において、発光団は、影響の程度に生理
的に関連して再分布され得る。別の具体例では、発光団は、影響の程度に生理的
に関連して再分布され得る成分と結合し得る。別の具体例では、発光団の再分布
と影響の程度との相関性は、実験的に立証できる。発明の好ましい観点では、発
光団は、細胞内経路の少なくともひとつの成分と実質的に同じ様式で再分布され
得る。発明の別の具体例では、発光団は、経路のモジュレーションにより再分布
される成分との空間的な結合によって消光され得る。消光は、発光強度における
変化として測定される。発明の別の具体例では、発光団は静止しているが、ある
空間分散を有し、影響の程度に生理的に関連した様式、1以上の発光団の発光特
性が発光団の近くで又は発光団から離れて作用する成分としてモジュレートされ
るように再分布され得る少なくともひとつの成分と相互作用していてもよい。
【００１４】 発光団は発蛍光団であってもよい。発明の好ましい具体例で、発光団は、細胞
に宿るヌクレオチド配列によってエンコードされ、かつ配列から発現されるポリ
ペプチドである。発光団は、ここに定義するように、一方が発光性ポリペプチド
からなり、他方が生物活性ポリペプチドからなる2つのポリペプチドそれぞれの
少なくとも一部の融合からなるハイブリッドポリペプチドであってもよい。 発光性ポリペプチドは、ここに定義するGFPであってもよく、又はF64L-GFP、F
64L-Y66H-GFP、F64L-S65T-GFPのようなここに定義するF64L突然変異型及びEGFP
を有する緑色蛍光タンパク質からなる群から選択され得る。GFPは、任意にペプ
チドリンカーを介して、生物活性ポリペプチド又はそのサブユニットの一部にN-
末端もしくはC-末端で標識されていてもよい。蛍光性プローブは、細胞内シグナ
ル経路の成分であってもよい。プローブは、核酸構築物によってコードされる。 発明のひとつの観点で、研究される経路は、細胞内シグナル経路である。
【００１５】 発明の好ましい具体例で、影響は、機械的に無傷であるか又は透過性にされた
生細胞の群又は群類と化学物質との接触、及び/又は機械的に無傷であるか又は
透過性にされた生細胞の群又は群類と溶液中の化学物質とのインキュベーション
であってもよい。優先年のあいだにWO 9845704号として公開されているように、
その内容が優先権出願の一部であったA METHOD FOR EXTRACTING QUANTITATIVE I
NFORMATION RELATING TO AN INFLUENCE ON A CELLULAR RESPONSE(ともに引用に
よりここに導入する)に完全に開示される発明のひとつの観点において、化学物
質は基礎となるマトリクスに結合している。この点で、化学物質は生産されても
よく、その遺伝学的に設計した細胞シートから分泌されてもよく、もしくはシー
トの原形質膜表面膜表面に結合していてもよい。発明のこの観点で、化学物質は
電気泳動を用いる非変性ゲルで二元に分離させてもよく、ゲルは、化学物質が拡
散又は伝達を通して細胞に接触できるように、直接、機械的に無傷であるか又は
透過性にされた生細胞と極めて密接に又は直接に接触させる。 影響によって、細胞内プロセスがモジュレートされるであろう。ひとつの観点
で、モジュレーションは細胞内プロセスの活性化であってもよい。別の観点で、
モジュレーションは細胞内プロセスの不活化であってもよい。さらに別の観点で
、影響は、細胞内プロセスの成分の代謝活性に直接影響を及ぼさずに再分布を阻
害又は促進し得る。
【００１６】 ひとつの観点で、この発明は、1つ又は多くの化学物質に対する用量-応答の関
連性を確立するのに用いられる。ひとつの具体例で、発明は、スクリーニングプ
ログラムの基礎として用いられ、化合物ライブラリーのような未知の影響の作用
を、標準的な条件下で既知の標準化合物の影響と比較することができる。 強度に加えて、細胞現象を基礎とする影響の作用によってモジュレートされ、
このために発明に使用できる蛍光及び発光の幾つかのパラメータがある。例とし
ては、共鳴エネルギー転移、蛍光存続期間、偏光及び波長シフトがある。これら
の方法それぞれは、所望の光成分を選択し、他の成分を退けるために、発出光路
に特定種類のフィルターを必要とする。光特性の記録は、CCDアレイのような値
を順序化するアレイ又はビディコンのような真空管装置の形態であってもよい。
さらに、興味あるタンパク質に結合する発光団の移行可動性又は自在な動きは、
基礎となる細胞の現象に対する影響によって及ぼされる重要な特性であってもよ
く、それ故に発明で用いることができる。
【００１７】 発明のひとつの具体例で、発光団によって発せられる空間分散光は、発光団と
発光団にエネルギーを送ることができる別の発光性物との共鳴エネルギー転移で
の変化によって検出される。そのそれぞれは、細胞内経路の特定成分の一部とな
り、成分に結合又は成分と会合するように選択もしくは設計される。この具体例
で、発光団又は発光団にエネルギーを送ることができる発光性物のいずれかは、
影響に応じて再分布を受ける。共鳴エネルギー転移は、発光団からの放出強度に
おける変化として測定され、好ましくは非空間的に解像して発光団の平均強度の
みに応答する単一チャンネルの光検出器によって検知される。 発明のひとつの具体例で、発光団によって発せられる空間分散光は、光の一様
な空間分散の場合を含む。 発明のひとつの観点で、発光団は、非同質の励起光フィールドにわたって再分
布する発蛍光団であり、異なるフィールドポイントでの励起光強度量における変
化の結果として発光団から発せられる光強度を変化させる。
【００１８】 発明のひとつの具体例において、空間分散光は、影響が及ぼされた後の時間中
のある時点で記録することができる。別の具体例では、影響が及ぼされる前の時
点と、その後の時点の2つの時点で記録してもよい。結果又は変化は、影響又は
モジュレーションに先立って測定した蛍光と比較して、蛍光における変化から測
定される。発明の別の具体例で、記録は、一連の記録の最初の時点の後しばらく
してから影響が及ぼされる一連の時点で行ってもよい。記録は、例えば0.1秒〜1
時間、好ましくは1〜60秒、より好ましくは1〜30秒、特に1〜10秒の所定の時間
間隔で、1秒〜12時間、例えば10秒〜12時間、例えば10秒〜1時間、例えば60秒〜
30分もしくは20分の時間をかけて行われる。結果又は変化は、時間中の蛍光にお
ける変化から測定される。結果又は変化は、時間中の蛍光の空間分散における変
更として測定してもよい。
【００１９】 ひとつの具体例において、記録は、1個又は数個の空間制限の細胞に関する時
系列の全発光からなる。ひとつの具体例で、全ての空間制限からのシグナルは、
時間中に1回、制限それぞれを検出器の視界範囲に連続的に位置付ける装置によ
り個々の空間制限でなされる記録を付け、全ての空間制限が測定されるまで位置
付けと測定処理を繰り返すことによって、測定される。検出器は、光電子増倍管
であってもよい。この発明の好ましい具体例において、1以上の空間制限が同時
に測定される。これは、一次元又は二次元のアレイ検出器によってなされ、それ
により、複数の空間制限がアレイ検出器に画像化され、アレイ検出器中の検出ユ
ニット(ピクセル)の個々のサブセットが、1個及び複数の空間制限のうちの1個の
みから、空間制限の1つから画像を受けるピクセルからのシグナルを組合わせた
いずれかひとつの空間制限からのシグナルを測定する。このアレイ検出器は、リ
ニアダイオードアレイ、ビデオカメラ(画像の捕捉と伝達に関する現在又は将来
的な標準及び定義による)又は電荷結合素子(CCD)のような電荷転移素子であって
もよい。ひとつの具体例で、シグナルの記録は、発光団を励起し、それらが光を
発するように複数の空間制限の照明を要する。ひとつの具体例では、全ての空間
的な制限を測定中に同時に照明する。別の具体例では、空間制限を測定される時
間中にのみ一回照明する。好ましい具体例では、照明は、測定される空間的な制
限の幾つか又は全てにわたるラスター様式でスキャンされるレーザーで生じる。
スキャンニングは、照明が測定プロセスにとっては測定領域にわたって時間的か
つ空間的に一様な連続的なものにとなるように、測定プロセスより実質的に早い
速度で行ってもよい。
【００２０】 発光団から発せられる空間分散発光の記録は、細胞中の蛍光分布を測定し、そ
れにより細胞中の蛍光分布におけるあらゆる変更を記録するための装置によって
行われる。装置は、最低限、以下の構成部分を含む：(a)光源、(b)発光団の発光
を励起する源から光波長を選択する方法、(c) 残りの系に対する励起光を迅速に
遮断又は通過させ得る装置、(d)励起光を試験片に送り、空間的に解像して発せ
られた蛍光を回収し、この放射蛍光から画像を形成する一連の光学部材(又は、
検出及び測定方法に関連している別の型の強度マップ)、(e)一連の光学部材に関
して所定の配列で測定される細胞容器を保持するベンチ又はスタンド、(f)画像
の形態で空間的に分割した蛍光を記録するための検出器、(g)記録した画像を捕
捉して記憶し、記録した画像から再分布の程度を計算するためのコンピューター
又は電子システム、及び関連のソフトウエア。 発明の好ましい具体例で、装置系は自動化される。ひとつの具体例で、d及びe
に上記した構成部分は、蛍光顕微鏡を含む。ひとつの具体例で、上記fの構成部
分はCCDカメラである。ひとつの具体例で、上記fの構成部分は光電子増倍チュー
ブ/装置のアレイである。 ひとつの具体例で、画像は、光学スキャンニングシステムによって形成され、
記録される。
【００２１】 ひとつの具体例で、光学スキャンニングシステムは、マイクロタイター型のプ
レートの底を照明するのに用いられ、発光又は蛍光における変更を、全ての空間
制限から同時に経時解析(time-resolved)記録することができる。 好ましい具体例で、実際の発光又は蛍光測定は、Molecular Devices,Inc.から
市販されているFLIPRTM装置でなされる。 発明のひとつの具体例で、実際の蛍光測定は、マイクロタイター型プレート用
の標準型蛍光計(蛍光プレートリーダー)でなされる。 ひとつの具体例で、液体添加システムは、細胞ホルダー中のいずれかの細胞又
は全ての細胞に、あらかじめ決定した時間で既知又は未知の化合物を加えるのに
用いられる。液体添加システムは、コンピューター又は電子システムの制御下に
あることが好ましい。このような自動化システムは、オペレーターの人物が手動
で装置を用いて生じるよりも大量の試験化合物から結果を生じる能力があるので
、スクリーニングプログラムに用いることができる。
【００２２】 細胞の検出層を物理的に化合物によって接触させる方法は、無機又は有機の支
持体(例えばガラス、プラスチック又は完全な生細胞の原形質膜)に結合した化合
物を細胞とともに伝達/拡散させるか、又は細胞と直接接触させることによって
、孔膜を通して化合物を細胞に送る、別の概念の方法であってもよい。これらの
方法は、優先年のあいだにWO 9845704号として公開されているように、その内容
が優先権出願の一部であったA METHOD FOR EXTRACTING QUANTITATIVE INFORMATI
ON RELATING TO AN INFLUENCE ON A CELLULAR RESPONSE(ともに引用によりここ
に導入する)に完全に開示されているが、以下の段落でも概説する。
【００２３】 この発明のひとつの観点で、細胞の検出層は、試験ユニット又はウエルに全く
分かれていない細胞の連続又は不連続のシートである。化合物は、溶媒中の溶液
として孔性物質の非吸収性シートにプリントされ、乾燥させられる。このプリン
トされた化合物シートは、次いで、基礎となる細胞の検出層に極めて近いか、又
はこれと直接接触してもたらすように、実験の試験パターンを規定する。細胞に
対する液層により新たに溶解した化合物は、伝達により膜孔を通して細胞と接触
する。化合物がプリントされている孔膜は光学的に透明で、優先年のあいだにWO 9845704号として公開されているように、その内容が優先権出願の一部であった
A METHOD FOR EXTRACTING QUANTITATIVE INFORMATION RELATING TO AN INFLUENC
E ON A CELLULAR RESPONSE (ともに引用によりここに導入する)に述べられてい
るように構成されていることが好ましい。この発明のこの観点に関する別の具体
例では、細胞の検出層は、試験ユニット又はウエルに全く分かれていない細胞の
連続又は不連続のシートであり、好ましくは上記の型の孔性で光学的に透明な膜
上で成長する。孔膜は、膜孔を通して細胞が細胞プロセスを送ることを可能にし
得る。化合物は、溶媒中の溶液としてガラス、プラスチック又は水晶のような光
学的に透明な基層上でプリントされ、乾燥される。実験時に、薄い液体フィルム
で覆った膜上の細胞シートは、プリントした化合物パターンの上部に積層する。
次いで、化合物を溶解させ、拡散及び伝達を介して細胞を接触する。化合物は、
コンビナトリアルケミストリー技術を用いてつくられてもよく、ペプチドであっ
てもよい。化合物は、光学的に透明な基層又は孔膜に共有結合していてもよい。
化合物は、平坦で光学的に透明な表面又は光学的に透明な孔膜上で連続又は不連
続のシートとして成長する、遺伝学的に修飾した細胞の原形質膜によって分泌さ
れるか又はそれに結合したタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであってもよ
い。
【００２４】 発光団によって発せられる光に関する変化又は結果の記録は、1以上のデジタ
ル画像として空間分散光を記録することによって行われ、記録された変化を再分
布の程度に関する1以上の典型例に縮小する処理は、デジタル画像処理手法又は
デジタル画像処理手法の組合わせからなる。細胞内経路における影響又は影響の
結果に対する細胞応答の程度を示す量的情報は、記録、又は応答もしくは結果に
基づく所定の較正にしたがった記録から引き出され、適切な特異的影響の既知の
程度に対して同様に記録される。この較正方法は、後述の原則にしたがって展開
される(Developing an Image-based Assay Technique)。特定のアッセイの手法
についての詳細な記載は、実施例に示す。
【００２５】 影響によって引き起こされる応答の典型値に画像又は画像類を縮小する必要が
ある段階手法は各アッセイに独特であるが、個々の段階は画像処理に関し一般的
に周知な方法である。個々の工程の幾つかの例には、減法、比例(ratioing)及び
限界化(thresholding)のようなポイント操作、平滑化、鮮明化及び端検出のよう
なデジタルフィルタリング法、フーリエフィルタリング、画像相互関係及び画像
自動較正、対象の発見と分類(ブロブ(blob)分析)及び可視化のための着色空間操
作(colour space manipulation)のような空間度数(space frequency)法がある。
アルゴリズム法に加えて、中立的ネットワークのような帰納的方法も用いること
ができる。発明の好ましい具体例では、用量-応答の関係は、上記及び実施例に
記載の方法を用いて、基礎となる細胞内シグナル経路の典型である特定の影響に
よって引き起こされる応答の定量に基づいて確立される。次いで、特定の影響に
対する用量-応答の関係を、FLIPRTMのようなマイクロタイタープレート又はマイ
クロタイタープレート用の通常の蛍光プレートリーダーにおける全てのウエルの
同時モニターを可能にする装置で同じアッセイを行って得られる用量-応答関係
と比較する。2つの異なる測定系から得られる用量-応答関係間の相関性が良好で
ある場合に、同時測定形態は有効であると言える(実施例8、9、10及び11参照)。
これは、同時測定形態が、応答に対する影響の時間単位当たりに著しく多数の物
質をスクリーニングするという潜在的な有用性があるスクリーニングアッセイの
主たる基礎として使用できることを意味する。例えば、顕微鏡で行われた1回の
実験で少なくとも96の実験チェンバーを同時に作動させる場合には、実験を行っ
ている人物の処理量は、96の因子まで増加する。
【００２６】 画像プレートリーダーは、時間点当たりに各ウエルからのシグナルを1つの値
に調整する。こうして、装置の1回の「作動」から生じるデータは、各ウエルに
つき1つの数値の時系列となり、試験化合物の注入が一連の時間の既知の点で生
じる。この種の装置の主要な利点は、所定の時間で処理できる試料数(処理量)が
非常に増すことである。これは、新規な医薬リード化合物用のスクリーニングプ
ログラムでのアッセイに用いる際に、極めて有効である。 データ分析での最初の工程は、互いに又はあらかじめ分析した既知化合物と比
較できるように、各ウエルからの結果を標準化することである。これは、常に、
ウエルごとに基づく全てのデータポイントから装置のバイアス(instrument bias
)を控除することによるシグナルの較正で開始される。この点から、２つの技術
それぞれを、アッセイの設計に応じて続行することができる： 方法１：試験化合物の添加前にシグナルの平均を、ウエルごとに基づく全てのデ
ータポイントから控除する。 方法２：データを、ウエルごとに基づく全てのデータポイントからバックグラン
ド値を控除することによって、いずれかの既知のバックグランドについて訂正す
る。得られたバックグランドの訂正データは、ウエルごとに基づく試験化合物の
注入前のデータ値の平均でセットされる各データを分割することによって標準化
する。
【００２７】 訂正又は標準化される時系列データを、次いで、時系列を1つの値に転換する
技術によりさらに縮小する。かかる方法は、少なくとも3つある： 一過的な応答については、ベースラインからの最大偏向を測定する。これは、「
ピーク高さ(peak height)」技術としても知られている。 あるいは、シグナルを、あらかじめ決定した範囲間の時間にわたって調整する
。データが上記の方法２にしたがって処理される場合、差し引きが控除され、応
答のない全体(integral)は誤測定範囲内のゼロである。これは、「ピークエリア
(peak area)」技術としても知られている。応答が累積的な応答、例えば新しい
レベルに対する指数的変化である場合、結果は、所定時間後のシグナルと試験化
合物添加前のシグナルとの相違又は比率のいずれかとしてみなされる。 上記方法は全て、所定のウエルについてのデータを1以上の単一の値に縮小す
る。スクリーニングの目的のためには、統計学的に測定したあるカットオフ値よ
り大きい値について、これらの値を調べる。特徴づけのためには、値は定量応答
を示し、用量-応答曲線に適合させるような技術によってセットでさらに処理さ
れる。
【００２８】 発明の別の具体例では、再分布の測定は、再分布を生じるために、プローブを
、細胞内環境内の動きに関する自主性又は制限における何らかの変化に付すとい
う事実を利用することによって間接的に達成される。転位の程度は、細胞質中で
自由に動く発光団の量と相関するであろう。試験化合物がいずれかの影響を有す
るようにした後の時点で、細胞の原形質膜を崩壊又は透過し、自由に動く発光団
を拡散させることによって、限られた発光団の量又は画分を測定することができ
る。検出器の検出量が細胞のすぐ周囲の領域に限られ、自由に動く発光団の拡散
し得る全体量がかなり大きい場合、自由に動く発光団は、検出器の視界から本質
的に消失し、そのシグナルは記録されない。 発明のひとつの観点において、再分布の上記測定は、細胞質環境を模倣した溶
液に含浸させた、永久的に透過性にされた原形質膜を有する細胞でおこなわれる
。こうして、通常は細胞の細胞質に入ることができない化合物の影響を試験する
ことができる。 この発明で用いられる核酸構築物は、細胞内シグナル経路の成分である生物活
性ポリペプチド又はその一部と、生物活性ポリペプチド又はその一部に、ペプチ
ドリンカーを任意に介してN-もしくはC-末端で融合したGFP、好ましくはGFPのF6
4L突然変異型とからなる核酸配列融合ポリペプチドをエンコードする。ひとつの
具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチドは、プロ
テインキナーゼ又はホスファターゼである。ひとつの具体例で、核酸構築物によ
ってエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化によって細胞の局在を変
化する転写因子又はその一部である。
【００２９】 ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチ
ドは、細胞骨格網と結合し、活性化によって細胞局在を変化するタンパク質又は
その一部である。ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物
活性ポリペプチドは、活性化によって細胞局在を変化するプロテインキナーゼ又
はその一部である。ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生
物活性ポリペプチドは、活性化によって細胞局在を変化し得るセリン/スレオニ
ンのプロテインキナーゼ又はその一部である。ひとつの具体例で、核酸構築物に
よってエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化によって細胞局在を変
化し得るチロシンプロテインキナーゼ又はその一部である。ひとつの具体例で、
核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化によって
細胞局在を変化し得る、リン脂質依存性のセリン/スレオニンプロテインキナー
ゼ又はその一部である。 詳細な具体例において、表１に挙げた構築物が、機械的に無傷であるか、又は
透過性にされた生細胞における細胞応答に対する影響に関する量的情報を入手す
るための方法であって、細胞中に存在し、影響の程度に関連して再分布、及び/
又は影響の程度に関連して再分布され得る成分によってモジュレートされ得る発
蛍光団から発せられる空間分散した蛍光の変化を、好ましくは蛍光強度の変化を
測定するよう設計した装置によって測定される蛍光強度の変更として記録するこ
とからなる方法で用いられる。 ここに記載した名称ならびに構築物及び全長アミノ酸配列をエンコードするDN
A配列の関連SEQ ID NOの参照によるこの発明の融合構築物
【表１】
【００３０】 実施例８、９及び１１に例示するように、PKA及びPKCの再分布は、例えばFLIP
RTM装置で測定されるような蛍光強度の変化として容易に検出することができる
。 ひとつの具体例で、PKA又はPKCについて顕微鏡で認められるパターンに似たパ
ターン(実施例１、２、８及び１１参照)、つまり集合形態から分散形態へ、又は
再分布を生じるような発光団についての分散形態から集合形態への影響に応じて
再分布するよう測定されるいずれかの新しい発光団は、例えばFLIPRTM装置で測
定されるような光強度の変化として検出できるものと予想される。 ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチ
ドは、活性化によって細胞局在を変化し得るcAMP依存性プロテインキナーゼ又は
その一部である。好ましい具体例において、核酸構築物によってエンコードされ
る生物活性ポリペプチドは、PKAc-F64L-S65T-GFP融合物である。ひとつの具体例
で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化によ
って細胞局在を変化し得るcGMP依存性プロテインキナーゼ又はその一部である。
【００３１】 ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチ
ドは、活性化によって細胞局在を変化し得るカルモジュリン依存性セリン/スレ
オニンプロテインキナーゼ又はその一部である。 ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチ
ドは、活性化によって細胞局在を変化し得るマイトジェン-活性化セリン/スレオ
ニンプロテインキナーゼ又はその一部である。好ましい具体例では、核酸構築物
によってエンコードされる生物活性ポリペプチドは、ERK1-F64L-S65T-GFP融合物
又はEGFP-ERK1融合物である。 ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチ
ドは、活性化によって細胞局在を変化し得るサイクリン-依存性セリン/スレオニ
ンプロテインキナーゼ又はその一部である。 ひとつの具体例で、核酸構築物によってエンコードされる生物活性ポリペプチ
ドは、活性化によって細胞局在を変化し得るプロテインホスファターゼ又はその
一部である。 発明の好ましい具体例で、核酸構築物はDNA構築物であってもよい。
【００３２】 ひとつの具体例で、生物活性ポリペプチドは、核酸構築物によってエンコード
される。ひとつの具体例で、核酸構築物にGFPをエンコードする遺伝子は、エク
オレア・ビクトリア（Aequorea victoria）に由来する。好ましい具体例で、核
酸構築物にGFPをエンコードする遺伝子は、EGFP又はF64L-GFP、F64L-Y66H- GFP
及びF64L-S65T-GFPから選択されるGFP変異型である。 発明の好ましい具体例で、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15及び17で示
されるいずれかのDNA配列によって同定し得るDNA構築物は、同じ融合ポリペプチ
ドをエンコードし得るこれらの配列の変異型又はそれらに生物学的に等価な融合
ポリペプチド、例えばイソ型又はスプライス変異型もしくは別種由来の同族体で
ある。 この発明は、細胞内シグナル経路に直接又は間接に影響を及ぼし、この性質の
ため薬剤として有用な可能性がある生物活性物質の同定用スクリーニングプログ
ラムを確立するのに使用できる方法を記載する。細胞内シグナル経路の活性化又
は不活性化により分布の変化を受けている発光団からの空間的に解像した発光再
分布を生細胞で測定することに基づくと、スクリーンされる物質それぞれの個々
の測定結果は、その潜在的な生物活性を示している。
【００３３】 発明のひとつの具体例において、スクリーニングプログラムは、細胞内シグナ
ル経路の干渉によって毒性作用を発揮する、ここに定義される生物毒性物質の同
定に用いられる。細胞内シグナル経路の活性化又は不活性化により分布の変化を
受けている発光団からの空間的に解像した発光再分布を生細胞で測定することに
基づくと、スクリーンされる物質それぞれの個々の測定結果は、その潜在的な生
物毒性活性を示している。スクリーニングプログラムのひとつの具体例において
、ここに定義される細胞内経路の成分をモジュレートする化合物を見出し、この
発明の方法にしたがった方法によって化合物の治療上の量を推定することができ
る。好ましい具体例では、この発明により、生物活性ポリペプチドの細胞内機能
に関する症状又は疾患に罹患している患者にこの発明にしたがったいずれかの方
法で発見される化合物の有効量を投与することからなる、該症状又は疾患を治療
する新規な方法の発見がもたらされる。発明の別の好ましい具体例では、方法は
、細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチドの群から新たな薬剤標
的又は幾つかの新たな薬剤標的を同定するために確立される。
【００３４】 発明の別の具体例では、個々の治療養生法は、病気に罹っている選択された患
者の選択治療のために確立される。ここで、発明による蛍光プローブをエンコー
ドする少なくとも1つのDNA配列を有する細胞又は細胞類をトランスフェクトし、
トランスフェクトした細胞又は細胞類を患者に戻して移し、又はプローブの発現
を許容する条件下で細胞又は細胞類を培養して利用可能な薬剤のアレイにそれを
曝し、次いで完全な生細胞中の蛍光プローブの蛍光パターン又は再分布パターン
における変化を比較して特定の薬剤に対する細胞応答を検出し(細胞作用プロフ
ィルが得られる)、次いで所望の活性及び副作用の許容されるレベルに基づいて1
以上の薬剤又は薬剤類を選択し、選択した患者にこれらの薬剤の有効量を投与す
ることからなる方法を用いて、患者の1つ又は幾つかの組織から得られる関連す
る始原細胞又は始原細胞類について病気の治療に用いられる利用可能な薬剤を試
験する。 この発明は、ここに定義されるバック-トラッキング(back-tracking)シグナル
の変換経路用のスクリーニングプログラムを確立するのに使用しうる方法を記載
する。ひとつの具体例において、スクリーニングプログラムは、研究中の細胞内
シグナル経路の活性化又は不活性化による分布変化を受けている幾つかの発光団
からの空間的に解像される発光の再分布に対する化合物又は化合物類の影響を連
続的に又は同時に試験することによって、1つ又は幾つかの化合物が特定のシグ
ナル変換経路に影響を及ぼすレベルをより正確に確立するのに用いられる。
【００３５】 一般的に、プローブ、即ち「GeneX」-GFP融合物又はGFP-「GeneX」融合物は、
「GeneX」特異的プライマーでPCRを用い、続くクローニング工程で「GeneX」をG
FPとインフレームで融合して構築される。融合物には、「GeneX」とGFPとの間（
例えば、プラスミドにおけるマルチクローニング部位領域の一部）にショートベ
クター由来の配列が含まれ、これは、得られた融合タンパク質において「GeneX
」とGFPとのペプチドリンカーとなる。 プローブの開発に関与する幾つかの工程には、以下が含まれる：遺伝子配列の
同定。これは、遺伝情報の供託所、例えば分子生物学者により広く利用され、か
つ常套的に用いられるGenBank Sequence Databaseを検索することによってもっ
とも容易になされる。詳細な以下の例には、問題の遺伝子のGenBank受託番号を
示している。
【００３６】 遺伝子特異的プライマーの設計。遺伝子配列を調べることにより、PCR反応に
用いる遺伝子特異的プライマーを設計することができる。代表的には、遺伝子を
GFPの後で融合する場合、即ちGFP-「GeneX」融合の場合、トップ鎖プライマーに
は、遺伝子のATG開始コドンとそれに続く約20ヌクレオチドが含まれ、ボトム鎖
プライマーには、終止コドンとそれに先立つ約20ヌクレオチドが含まれる。遺伝
子をGFPの前で融合する場合、即ち「GeneX」-GFP融合の場合、終止コドンを回避
しなければならない。任意には、GeneXの全長配列を融合に用いず、シグナルへ
の応答でGeneXのように局在化し再分布する部分のみを用いてもよい。遺伝子特
異的配列に加え、プライマーには、制限酵素に対する少なくとも1個の認識配列
が含まれ、それにより、PCR産物のその後のクローニングが可能となる。部位は
、PCR産物において固有でかつクローニングベクターの部位に適合するように選
択する。さらに、融合遺伝子の正しいリーディングフレーム及び/又は翻訳開始
コンセンサス配列を確立するためには、制限酵素部位と遺伝子特異的配列との間
に正確な数のヌクレオチドを含める必要がある。最後に、プライマーは常に制限
酵素部位の前に2、3個のヌクレオチドを含み、その酵素での消化を効率的にする
。
【００３７】 増幅されるべき遺伝子源の同定。PCR反応により遺伝子特異的プライマーで産
物を生産するためには、遺伝子配列が、反応物に、例えばcDNAの形態で最初に存
在しなければならない。GenBank又は科学文献の情報から、どの組織で遺伝子が
発現されるかが通常示されるであろう。また、様々な種に由来する非常に多様な
組織又は細胞型からのcDNAライブラリーが、例えばClontech （Palo Alto）、St
ratagene（La Jolla）及びInvitrogen（San Diego）から市販されている。多く
の遺伝子も、クローンの形態でAmerican Type Tissue Collection（Virginia）
から入手可能である。 PCR反応の最適化。幾つかの因子が、プライマーのアニーリング温度、反応物
中のイオン濃度、注目に値するところではMg2+及びK+濃度ならびに反応物のpHを
含むPCR反応の効率と特異性に影響することが知られている。PCR反応の結果が満
足すべきものでない場合、上記のパラメータが最適でないためかもしれない。種
々のアニーリング温度を、例えばStratagene（La Jolla）から入手可能な温度勾
配内臓のPCR装置で試験し、及び/又は種々の緩衝液組成物、例えばStratagene（
La Jolla）のOptiPrime 緩衝液系を試みるべきである。
【００３８】 PCR産物のクローン。プライマーを設計する場合、増幅させた遺伝子産物をク
ローンし、GFPと融合させるベクターは、既に考慮されている。ベクターを選択
する際には、プローブがその後、どの細胞型で発現するかを少なくとも考慮し、
プローブのプロモータ制御発現が細胞に適合するようにすべきである。大部分の
発現ベクターには、1以上の選択マーカー、例えば、安定なトランスフェクタン
トの生産を所望する際の有用な特徴である薬剤耐性付与も含まれる。その選択マ
ーカーもまた、用いる細胞に適合性であるべきである。 PCR産物の実際のクローニングは、一般的に2個の異なる制限酵素で消化したフ
ラグメントをその同じ2個の酵素で消化したベクターに一工程でクローニングす
るため、困難ではないはずである。このクローニングに問題が生じるとすれば、
それは、制限酵素がPCRフラグメントと十分に作用しなかったためである可能性
がある。この場合、プライマーの末端に長い伸長部を付加してフラグメント末端
近くでの不消化を克服するか、又は制限酵素消化に基づかない中間的なクローニ
ング工程を導入することが可能である。幾つかの会社、例えばInvitrogen（San
Diego）及びClontech（Palo alto）は、この方法のためのシステムを提供してい
る。 ひとたび遺伝子をクローニングし、そのプロセスにおいてGFP遺伝子と融合す
れば、通常はプラスミドである得られた生成物を注意深くチェックし、予想され
た通りであることを確認すべきである。最も正確な試験は、融合遺伝子のヌクレ
オチド配列を得ることであろう。
【００３９】 いったんプローブ用のDNA構築物が生成すれば、プローブを発現し得る細胞に
それをトランスフェクションさせることにより、その機能性及び有用性を評価す
ることができる。細胞の蛍光は、直後、一般的には翌日に調べる。この時点で、
細胞蛍光の2つの特徴に注意する：強度及び細胞下局在。 強度は、通常、細胞中の非融合GFPの強度と少なくとも同等であるべきである
。そうでない場合、プローブDNAの配列又は質が誤っている可能性があり、注意
深くチェックすべきである。 細胞下局在は、プローブが良好に働くか否かの指標である。それが、問題の遺
伝子に予想されるように局在している場合、例えば核から排除されている場合、
直ちに機能試験に付すことができる。トランスフェクション手順直後にプローブ
が局在しない場合、この時点における過剰発現のためであるかもしれない。とい
うのは、細胞が通常、非常に多数のプラスミドコピーを有し(take up)、局在化
が、プラスミドのコピー数及び発現レベルの低減にともない、例えば2、3週間内
に生じるからである。局在化が、時間を延長しても生じない場合、それは、GFP
への融合が局在化機能を破壊したため、例えば、その正常細胞固定-タンパク質
との相互作用に不可欠なタンパク質配列をマスクしたためである可能性がある。
この場合、例えばGeneX-GFPが働かない場合にGFP-GeneXが働く、というように反
対の融合が働くが、これは、GeneXの異なる2個の部分がGFPへの近位性に影響さ
れるためであろう。反対の融合が働かない場合、いずれかの末端でのGFPの近位
性に問題があるかもしれず、DNA構築物中のGeneXとGFPとの間により長いリンカ
ーを組み込むことにより距離を伸ばすようにすることができる。
【００４０】 局在化の事前知識がなく、局在化が観察されない場合は、プローブがこの時点
で局在化されるべきでなく、それがGFPに融合したタンパク質の性質であるため
である可能性がある。これは、次いで機能試験に付すべきである。 機能試験では、プローブを発現している細胞を、既知の少なくとも1つの化合
物で処理し、通常は、細胞内で再分布させることによりプローブがレポートする
と予想されるシグナル経路を活性化して、攪拌(perturb)する。再分布が予想さ
れた通りである場合、例えば、事前知識により、位置Xから位置Yまで、再分布を
転位させるべきである場合には、それを第1の臨界試験に付す。この場合、さら
に応答の特徴づけと定量化に付すことができる。 再分布が予想されたように働かない場合には、細胞が、シグナル経路の少なく
とも1成分、例えば細胞表面受容体を欠いているためであるかもしれないし、又
は、例えばプローブがヒト遺伝子産物の配列情報に基づいてモデル設計されたも
ので、細胞がハムスター由来である場合には、種間不適合性があるためであるか
もしれない。いずれの例においても、これらの問題が生じない試験プロセスにつ
いて他の細胞型を同定すべきである。 再分布のパターンについての事前知識がない場合、再分布の解析をより徹底し
て行い、何が必須でかつ指示的特徴か、いつそれが明らかになるのかを同定し、
応答のさらなる特徴づけ及び定量化に付すことができる。再分布の特徴が同定さ
れない場合、上に述べた問題点が生じるかもしれず、従って、より最適な細胞条
件下でプローブを再試験すべきである。プローブが最適な細胞条件で作用しない
場合には、次いで最初の段階に立ち戻る。
【００４１】 画像ベースの再分布アッセイを開始する過程は、再分布現象を可視化しうる未
計画の実験観察、又は生じることがすでに知られている再分布現象を特異的に追
跡する特異的プローブの設計のいずれかで開始する。どちらの事象でも、熟練し
た科学者又は技術者にとって最初の及び最善の研究技術は、現象を観察すること
である。コンピュータ技術の急速な進歩をもってしても、ヒトの眼-脳の組合わ
せは依然として既知の最も強力なパターン認識系であり、系の事前の知識を要さ
ずに、生データ中の興味深くかつ有用な可能性があるパターンを見出す。これは
、データがヒトの視覚処理に自然な「データ型」の画像形態で提示される場合に
、顕著である。ヒトの視覚処理は比較的狭い頻度の範囲でもっとも有効に作用す
る(つまり、視野範囲において極めて早いか又は極めて遅い変化のいずれも見る
ことができない)ので、データを記録し、時間の拡張又は時間の圧縮のいずれか
でそれを再生する必要があるかもしれない。 幾つかの発光現象は、ヒトの眼で直接には見ることができない。例えば、偏光
と蛍光存続期間が含まれる。しかし、適当なフィルター又は検出器で、これらの
シグナルは画像又は一連の画像として記録し、まさに記載されるようにヒトに示
すことができる。こうして、パターンが検出され、同じ方法が適用される。
【００４２】 いったん再分布が再現性の現象であることが決定されると、データから量的情
報を入手する方法を開発するために１以上のデータセットが生じる。同時に、ア
ッセイに対して最も質の良い生データを与える生物学的及び光学的条件が決定さ
れる。これにより、反復処理をすることができる：アッセイ条件を操作したアッ
セイに対する効果を評価するために、定量的手法を開発する必要のある可能性が
ある。 データセットは、画像処理技術の適用において生物学的現象の知識と技術を有
する人物又は人物達によって試験する。この実行の目的は、「応答」の記録を構
成している画像又は一連の画像を、応答の程度に相当する値に縮小する方法を決
定するか、又は少なくとも提案することである。画像処理ソフトウエア又は画像
処理ツールボックス及びプログラミング言語のいずれかを繰り返し用いることに
より、方法は、画像もしくは画像類をインプットとしてみなし、応答の程度を(
いずれかの単位で)そのアウトプットとして生じる手法又はアルゴリズムとして
符号化される。特定の方法の有効性を評価する幾つかの基準は、以下のとおりで
ある： 応答の程度は、生物学的に有意な様式で変化するか、つまり、それは、刺激的
な剤の濃度又は条件に対する既知又は推測される依存性を示すか？
【００４３】 応答の程度は再現性か、つまり、同じ濃度又はレベルの刺激剤もしくは条件は
、変化が許容される同じ応答を生じるか？応答の動的範囲は、アッセイの目的に
十分か？もし十分でなければ、方法の変更又はそのパラメータのひとつは動的範
囲を改善することができるか？方法は、なんらかの明らかな「病状」を示してい
るか、つまり、画像処理に一般的に欠陥が生じる場合に、方法は応答に対して法
外な値を生じるか？これらの病状を除き、制御し、又は攻撃することができるか
？方法は画像中の細胞の数及び/又は大きさの正常な変化に対処することができ
るか？ 幾つかの場合に方法は自明であろうし、他の場合に、多数の可能性ある手法が
示唆される。ある方法が他の方法より明らかに優れているとしても、パラメータ
の最適化が必要とされよう。種々の方法がデータのセットに適用され、上記に提
案される基準が決定されるか、又は１つの方法が繰り返し用いられて、もっとも
十分なシグナル、ノイズ、幅などの組合わせが達成されるまで、パラメータ又は
パラメータ類が調整される。これは、いずれかの型の単一チャンネルセンサーの
較正に等価である。 画像から１つの値を入手する方法の数は非常に多く、この結果、この数を可能
性のある手法に関して少数の限りのある数に縮小する最初の工程には、聡明な方
法を取らなければならない。これは、達せられる方法が必ず最善の方法であると
いうものではないが、最善の方法のための全体的な研究は、完全な数(sheer num
ber)の可能性が関与しているために問題から簡単に脱する。
【００４４】 画像ベースのアッセイは、有用性がパラメータ、例えば試料の所望成分の特異
性、動的範囲、変動、感受性、アッセイが作用する濃度範囲及び他のそのような
パラメータで特徴づけられることにおいて他のアッセイ技術と違いはない。アッ
セイの使用前にこれらのそれぞれ及び全てを特徴づける必要はないが、あるアッ
セイを他と比較する方法は１つのみ示す。 次に、最終工程は、スクリーニングプログラムの基礎としての有用性を改善す
るためにアッセイの処理量を増加させる可能性があるか否かをみることである。
このためには、上記及び実施例に記載の方法を用いて基礎となる細胞内シグナル
経路の典型である、特定の影響によって引き起こされる応答の定量に基づいて用
量-応答関係を確立する。次いで、特定の影響に対する用量-応答関係を、FLIPRT M のようなマイクロタイタープレート中の全てのウエルの同時モニターを可能に
する装置又は通常のイメージング又はマイクロタイタープレート用の蛍光プレー
トリーダーで同じアッセイを行って得られる用量-応答関係と比較する。２つの
異なる測定系から得られる用量-応答関係間が良好に相関している場合、同時測
定形態が有効であると言える(実施例８、９及び１１参照)。これは、同時測定形
態が、時間単位当たりの応答での影響に対して著しく多数の物質をスクリーニン
グする利点のある可能性があるスクリーニングプログラムの主要な基礎として使
用できることを意味している。
【００４５】 この明細書及び特許請求の範囲において、用語「影響」には、細胞の応答が再
分布からなるいずれかの影響が包含される。従って、例えば加熱、冷却、pH、高
圧、低圧、加湿又は乾燥が生じる再分布を定量できる細胞応答に対する影響であ
るが、上記のとおり、おそらく最も重要な影響は、再分布の寄与に関与する細胞
応答に対する影響を奏することが知られているかあるいは疑われている物質と細
胞を接触あるいはインキュベートさせることに関する影響である。この発明の別
の具体例では、影響は化合物薬物ライブラリーからの物質であってもよい。 この明細書において、用語「緑色蛍光タンパク質」は、細胞によって発現され
る際に、正確な励起波長光に暴露されることによって蛍光を発するタンパク質を
示すことを意図する｛Chalfie, M. ら,(1994) Science 263, 802-805参照｝。
以下において、１以上のアミノ酸が置換、挿入もしくは欠失されているGFPは、
ほとんどしばしば「修飾GFP」と称する。ここで用いられる「GFP」には、くらげ
エクオレア・ビクトリア由来の野生型GFP及びHeimらによって開示されるGFPの青
蛍光変異型のようなGFP修飾体｛Heim, R. ら. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
91:26, pp12501-12504｝、及びGFP蛍光のスペクトル特性を変化させる他の修飾
体、あるいは1997年3月27日にWO97/11094号として公開され、ここに引用して導
入されるPCT/DK96/00051に記載された、約30℃を超える温度で細胞で発現される
際に増加した蛍光を示し、エクオレア緑色蛍光タンパク質(GFP)由来の蛍光タン
パク質もしくはそれらのいずれかの機能的類似体（この発明の蛍光タンパク質が
細胞で発現される際に蛍光強度を増加するよう、発色団から上流の位置１におけ
るアミノ酸が突然変異されている）からなる修飾体が含まれる。好ましいGFP変
異型は、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP及びF64L-S65T-GFPである。この発明の全ての
観点において、用いられるGFPの特に好ましい変異型は、EGFP（哺乳動物細胞で
の発現用に最適化したコドンを有するF64L-S65T変異型であるEGFPをエンコード
するDNAは、Clontech, Palo Altoから入手可能であり、EGFP DNA配列を含むプラ
スミドはGenBank 受託番号 U55762、U55763参照）である。
【００４６】 用語「細胞内シグナル経路」及び「シグナル変換経路」は、生細胞が細胞応答
に外部もしくは内部シグナルを変換する共同作用する細胞内プロセスを示すこと
を意図する。上記シグナル変換は、酵素反応を伴うであろう。その酵素には、プ
ロテインキナーゼ、GTPアーゼ、ATPアーゼ、プロテインホスファターゼ、ホスホ
リパーゼ及びサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼが含まれるがそれ
らに限定されない。細胞応答には、遺伝子転写、分泌、増殖、機械的活性、代謝
活性、細胞死が含まれるが、それらに限定されない。 用語「第二メッセンジャー」は、細胞内シグナル変換経路の初期の事象に関与
する低分子量成分を示すために用いられる。 用語「発光団」は、本質的に、あるいは化学的もしくは物理的手段による刺激
によるいずれかで、光を発する特性を有する化学物質を示すために用いられる。
これには、蛍光、生物発光、リン光及び化学発光が含まれるが、それらに限定さ
れない。 用語「機械的に無傷な生細胞」は、正常な膜電位の維持、エネルギー代謝、増
殖能のようなその特定の細胞型に対する標準的な基準に従って生きていると考え
られ、かつマイクロインジェクションのような細胞に外部物質を導入するように
設計した物理的に侵襲性の処置を全く受けていない細胞を示すために用いられる
。
【００４７】 この明細書において、用語「透過性化生細胞」は、ストレプトリジンOもしく
はスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus Aureus）α-トキシンのよ
うな細孔形成剤が用いられ、それによって細胞の原形質膜中に導入されている細
胞を示すために用いられる。これは、暴露された細胞の原形質膜中に所定の細孔
サイズを有するタンパク性細孔を生じる。細孔はまた、エレクトロポレーション
、すなわち細胞を高電圧放電に暴露すること（必要な膜タンパク質を凝固させる
ことによって原形質膜中に小さい穴を生じる手順）によってもなされるであろう
。サポニンのような穏やかな界面活性剤での処理によって、同じことが得られる
であろう。これらの処置全てに共通なことは、細胞質構成成分及びオルガネラの
完全性に影響を及ぼすことなく原形質膜にのみ細孔が形成されることである。こ
の明細書において用語、生（living）の用語は、細胞内環境を模倣した溶液につ
けられている透過性化細胞が、活発に呼吸するミトコンドリア及びカルシウムイ
オンを吸収しかつ放出できる小胞体のような機能的オルガネラ、及び機能的構成
成分を依然として有することを意味する。この方法の利点は、通常原形質膜を通
過できないが、細胞内に影響を及ぼすと思われる物質を導入でき、単細胞への物
質の煩わしいマイクロ注入なしに、それらの影響を研究できるということである
。この方法を用いることによって、同時に多くの細胞からの影響に対する応答を
記録することができる。
【００４８】 この明細書において、用語「透過性化」は、サイトゾルにおいて自由に移動で
きる可溶性物質が細胞から喪失されるような原形質膜バリアーの選択的破壊を示
すことを意図する。透過性化は、「透過性生細胞」に関する上記のように、ある
いは注意深く滴定した量でトリトンX-100又はジギトニンのような他の化学的界
面活性剤を用いることによって達することができる。 用語「生理的に関連した」は、発光特性又は分布の変化によって測定されるよ
うな細胞内成分の実験的に測定した再分布に対して適用されるとき、上記再分布
が再分布を生じる基礎となる生物学的現象に関して説明できることを示すために
用いられる。 用語「画像処理」及び「画像分析」は、整理された数字配列（画像）をそれら
の整理された数字配列を記載する量的情報に縮小する、大きなデジタルデータ分
析技術又はそのような技術の組み合わせを記載するために用いられる。従って、
上記の整理された数字配列が物理的プロセスからの測定値を表すとき、誘導され
る量的情報は物理的プロセスの定量である。 用語「蛍光プローブ」は、任意に１以上のアミノ酸からなるペプチドリンカー
を介して、ここに定義する生物活性ポリペプチドにN-末端もしくはC-末端で融合
されているGFP又はそのいずれかの機能的部分からなる蛍光融合ポリペプチドを
示すために用いられる。リンカーペプチド自体の大きさは、蛍光プローブの所望
の機能が維持される限り、重要ではない。この発明による蛍光プローブは細胞中
で発現され、融合ポリペプチドの生物活性ポリペプチド分子の生理学的挙動を基
本的に模倣している。
【００４９】 用語「哺乳動物細胞」は、哺乳動物起源のいずれかの生細胞を示すことを意図
する。細胞は、その多くがThe American Type Culture Collection （ATCC, Vir
ginia, USA）から入手できる確立された細胞系、又はトランスジェニック動物由
来組織を含む哺乳動物組織由来の寿命の限られた始原細胞、あるいはトランスジ
ェニック組織を含む哺乳動物組織由来の新規に確立された不死細胞系、あるいは
哺乳動物起源の異なる細胞型を融合することによって誘導されるハイブリッド細
胞もしくは細胞系（例えばハイブリドーマ細胞系）であってもよい。細胞は任意
に、蛍光プローブより先にあるいは蛍光プローブに加えて、1以上の非天然の遺
伝子産物（例えばレセプター、酵素、酵素基質）を発現してもよい。好ましい細
胞系には、線維芽細胞起源のもの（例えばBHK、CHO、BALB）、あるいは内皮起源
のもの｛例えばHUVEC、BAE（ウシ動脈内皮）、CPAE（雌牛肺動脈内皮）、HLMVEC
（ヒト肺微小血管内皮細胞）｝、あるいは膵臓起源のもの（例えばRIN、INS-1、
MIN6、bTC3、aTC6、bTC6、HIT）、あるいは造血起源のもの（例えば最初に分離
されたヒト単核細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球及びリンパ球
集団、AML-193、HL-60、RBL-1）、あるいは脂肪細胞起源のもの（例えば3T3-L1
）、神経/神経内分泌起源のもの｛例えばAtT20、PC12、GH3｝、筋肉起源（例え
ばSKMC、A10、C2C12）、腎臓起源（例えばHEK293、LLC-PK1）が含まれるが、そ
れらに限定されない。
【００５０】 用語「ハイブリッドポリペプチド」は、２つのタンパク質各々の少なくとも１
部分の融合（この場合は、緑色蛍光タンパク質の少なくとも一部とプロテインキ
ナーゼの触媒及び/又は調節ドメインの少なくとも一部）であるポリペプチドを
示すことを意図する。さらに、ハイブリッドポリペプチドは、GFPもしくは機能
的発蛍光団を含む緑色蛍光タンパク質の少なくとも一部、及び生物活性ポリペプ
チドの少なくとも一部とからなる融合ポリペプチドを示すことを意図する。この
ように、GFPは、任意に１以上のアミノ酸配列からなるリンカー部分もしくはリ
ンカーペプチドによって、生物活性なポリペプチドに対してN-あるいはC-末端で
標識していてもよい。ハイブリッドポリペプチドもしくは融合ポリペプチドは、
上記ハイブリッドポリペプチドの発現を可能にする条件下でハイブリッドポリペ
プチドをエンコードするDNA配列を保持する完全な生細胞で蛍光プローブとして
作用するであろう。 用語「キナーゼ」は、細胞成分をリン酸化し得る酵素を示すことを意図する。 用語「プロテインキナーゼ」は、ペプチド及び/又はタンパク質中のセリン及
び/又はスレオニン及び/又はチロシンをリン酸化し得る酵素を示すことを意図す
る。 用語「ホスファターゼ」は、ペプチド及び/又はタンパク質中のホスホセリン
及び/又はホスホスレオニン及び/又はホスホチロシンを脱リン酸化し得る酵素を
示すことを意図する。 用語「サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ」は、3'-エステル結
合の加水分解によって二次メッセンジャー cAMP及びcGMPを不活性化しうる酵素
を示すことを意図する。
【００５１】 この明細書において、用語「生物活性ポリペプチド」は、細胞内プロセスで活
性な酵素もしくは生物学的機能を有するかあるいは細胞系において生物学的効果
を及ぼす所望のアミノ酸配列からなるそれらの一部のような、活性化により細胞
内プロセスに影響を及ぼすポリペプチドを示すことを意図する。ポリペプチドに
おいては、その生物学的機能を変えるために、例えば触媒部位を不活性化するこ
とによって、１つもしくはいくつかのアミノ酸が、欠失、挿入又は置換されてい
てもよい。好ましくは、生物活性ポリペプチドは、ここで定義されたようなキナ
ーゼ、プロテインキナーゼ及びホスホリラーゼを含む細胞内リン酸化プロセス及
び脱リン酸化反応プロセスに関与する酵素のような細胞内シグナル経路に加わる
タンパク質からなる群から選択されるが、細胞骨格を構成するタンパク質もまた
、細胞内シグナル変換に重要な役割を果たし、従ってここで「生物活性ポリペプ
チド」の意味に含まれる。より好ましくは生物活性ポリペプチドは、好ましくは
シグナル変換経路における中間成分のような、活性化もしくは非活性化された状
態に従って細胞内局在を変えるタンパク質である。生物活性ポリペプチドのこの
好ましい群には、cAMP依存性プロテインキナーゼAが含まれる。
【００５２】 用語「生物活性を有する物質」は、生物学的機能を有するかあるいは細胞系に
おいて生物学的効果を奏するいずれかの試料を示すことを意図する。試料は、血
液、血漿、唾液、乳、尿を含む体液又は微生物もしくは植物抽出物の試料のよう
な生物学的材料の試料、汚染物質（重金属もしくは毒素を含む）含む環境試料で
あってもよく、有機合成又は遺伝子技術によって調製された化合物もしくは化合
物の混合物を含む試料であってもよい。 表現「蛍光におけるいずれかの変化」は、波長及び強度のような吸収特性にお
けるいずれかの変化、あるいは波長、蛍光寿命、強度もしくは極性の変化ような
放射光のスペクトル特性におけるいずれかの変化、あるいは発蛍光団の細胞内局
在におけるいずれかの変化を意味する。このようにして、それは、特定の細胞成
分（例えばオルガネラ、膜、細胞骨格、分子構造）に局在してもよく、細胞もし
くは細胞の一部の至るところに均一に分布していてもよい。 ここで用いられる用語「生物」は、好ましくは原生動物を含む動物界に由来す
るいずれかの単細胞もしくは多細胞生物を示すが、藻類のような植物界のメンバ
ーである生物、真菌、ブリオフィテス（bryophytes）、及び維管束植物もまた、
この定義に含まれる。
【００５３】 用語「核酸」は、DNA配列、cDNA配列もしくはRNA配列のようないずれかの型の
ポリ又はオリゴ核酸配列を示すことを意図する。 タンパク質に関連する用語「生物学的に等しい」は、2つのタンパク質の細胞
機能が互いに置換できる場合、例えば2つのタンパク質が異なる遺伝子によって
エンコードされる密接に関連したイソ型である場合、それらがスプライス変異型
もしくは同じ遺伝子由来の対立遺伝子変異型である場合、それらが異なる細胞型
又は異なる種において同一の細胞機能を果たす場合に、第一タンパク質が第二タ
ンパク質に等価であることを意味する。DNAに関する用語「生物学的に等しい」
は、2つの遺伝子によってエンコードされる機能タンパク質が生物学的に等しい
場合に、ポリペプチドをエンコードする第一DNA配列がポリペプチドをエンコー
ドする第二DNA配列に等しいことを意味するものである。 用語「高度な処理量」は、実際の実験を行う人物当たりの時間単位当たりの実
験数の増加を意味することを意図する。 ここで用いられる用語「高度な処理量のスクリーニングアッセイ」は、当業者
１人の１回の作業日に発光団の再分布に対する影響について化合物を試験する個
々の実験が少なくとも100回あるスクリーニングアッセイを行う方法を意味する
ことを意図する。好ましい具体例では、高度な処理量のスクリーニングアッセイ
は、当業者の１回の作業日に少なくとも500回の個々の実験、例えば750回、1000
回、2000回、5000回又は10000回までもの個々の実験を伴う。
【００５４】 表現「シグナル変換経路のバック-トラッキング」は、生物における化学化合
物の影響又は疾患状態のいずれかによって、シグナル変換経路が影響を及ぼされ
るレベルをより正確に明らかにするプロセスを示すことを意図する。シグナル変
換がAからDに向かう、生物活性ポリペプチドA-B-C-Dによって示される特異的な
シグナル変換経路を考慮してみる。このシグナル変換経路の全ての成分を研究す
る際には、Dのみの活性又は再分布に影響する化合物又は疾患状態がC又はCの下
部組織(downstream)に作用すると考えられるが、AとBではなくC及びDの活性又は
再分布に作用する化合物又は疾患状態は、Bの下部組織に作用すると考えられる
。 用語「固定細胞」は、グルタルアルデヒドもしくはホルムアルデヒドのような
細胞固定液で処理した細胞を意味するために用いられ、その処理は、可溶性及び
不溶性タンパク質を細胞の構造内で化学的に化学的に架橋させ、固定させるのに
役立つ。ひとたびこの状態になれば、そのようなタンパク質は、現在の死細胞の
構造からは喪失されない。
【００５５】 この明細書において、「スクリーニングアッセイ」は、材料、細胞、器具、化
学薬品、試薬、検出単位、細胞内経路に対する影響に関連した機械的に無傷であ
るか又は透過性にされた生細胞からの応答を測定するために用いられる較正及び
定量手順を含むいずれかの測定プロトコルを意味する。 この明細書において、用語「用量-応答関係」及び「スクリーニングプログラ
ム」は、化合物のような影響の適用に対するスクリーニングアッセイにおける定
量した細胞応答と、適用した影響の濃度との明らかな相関関係を意味する。影響
に対する応答は、スクリーニングアッセイに用いられる定量パラメーターのアッ
プレギュレーション及びダウンレギュレーションの両方であってもよい。 この明細書で、用語「生理学」は、細胞と生物又は動物全体との生物学的及び
生化学的な細胞内プロセスの正常な機能を意味することを意図する。
【００５６】図面の簡単な説明 図1 PKAc-F64L-S65T-GFPハイブリッドタンパク質を発現するCHO細胞を、HAMのF
12培地中、37℃で50μMのフォルスコリン(forskolin)を用いて処理した。これら
の細胞中におけるGFP蛍光の画像は、処理後、異なる時間間隔：a）40秒、b）60
秒、c）70秒、d）80秒で撮影した。（無核）細胞質において、蛍光は斑点状から
より均一な分布へと変化する。 図2 フォルスコリンで誘発したPKAc-F64L-S65T-GFP再分布の経時分析。PKAc-F6
4L-S65T-GFP融合タンパク質を発現するCHO細胞を、経時蛍光顕微鏡によって分析
した。蛍光顕微鏡写真は、アゴニストの添加の2分前から8分後までの一定間隔で
獲得した。左上の画像が得られた直後（t＝0）、細胞を1μMのフォルスコリンで
調べた。フレームは次の時間：i）0、ii）1、iii）2、iv）3、v）4およびvi）5
分で回収した。測定バー10μm。
【００５７】 図3 種々のアゴニストに対するPKAc-F64L-S65T-GFP再分布の経時分析。PKAc-F6
4L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する1μMのフォルスコリン（A）、50μ
Mのフォルスコリン（B）、1mMのdbcAMP（C）ならびに100μMのIBMX(D)による効
果（添加は白矢印で示す）を、CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP細胞の経時蛍光顕微鏡検
査によって分析した。10μMのフォルスコリン（白矢印）を添加し、その直後に
緩衝液で洗浄を繰り返す（黒矢印）ことによるPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク
質の局在化に対する効果を同一細胞で分析した（E）。並行実験において、10μM
のフォルスコリンおよび100μMのIBMXの添加（白矢印）後、100μMのIBMXを含有
する緩衝液で洗浄を繰り返した（黒矢印）ことによる効果を分析した（F）。フ
ォルスコリンの除去により、PKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質が細胞質内集合
体に復帰するが、これはIBMXが引き続き存在することによって防止される（F）
。PKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する100nMのグルカゴンの効
果（図3G、白矢印）もまた、BHK/GR、PKAc-F64L-S65T-GFP細胞について示す。PK
Ac-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する10μMのノルエピネフリン（
黒矢印）の効果を、10μmのフォルスコリンで予備処理し(白矢印)、一過的に形
質転換したCHO、PKAc-F64L-S65T-GFP細胞で同様に分析し、[cAMP]を増加させた
。図3Hにおいて、x軸は12秒ごとの画像の数を算定することに注意されたい。各
実験の生データは、緩衝液またはアゴニストの添加前に得られた数枚の画像を含
む、一定間隔で得られた60枚の蛍光顕微鏡写真からなる。チャート（A-G）はそ
れぞれ、60枚の画像全てにおいて見られた応答の、分析法2に記載のように行わ
れた定量化を示す。蛍光凝集体の初期の面積に対する蛍光性の高い凝集体の全面
積の変化は、各実験において、図3の全てのグラフにおける対時間の縦座標とし
てプロットした。測定バー10μm。
【００５８】 図4 PKAc-F64L-S65T-GFP融合のフォルスコリン誘発再分布に関する用量-反応曲
線（2回の実験）。 図5 応答開始からPKAc-F64L-S65T-GFP再分布が最大の半分(t1/2max)になるまで
と、最大(tmax)になるまでの時間。データは“図2”に示すような曲線から抽出
した。全てのt1/2maxおよびtmaxの値は平均値±SDとし、各フォルスコリン濃度
での2−3回の独立した実験からの26−30細胞の合計に基づく。観察された再分布
は長時間維持されるため、tmax値は完全な再分布に到達した最も早い時点とする
。この値は再分布の程度とは無関係であることに留意のこと。 図6 フォルスコリンで誘発したcAMP上昇と、PKAc-F64L-S65T-GFP再分布の並行
用量-応答分析。96ウェルのプレートで成長させたCHO/PKAc-F64L-S65T-GFP細胞
中のPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する緩衝液または5段階増
加濃度のフォルスコリンの効果を、上記のように分析した。フォルスコリンの添
加前と添加後30分後に、細胞の同じフィールドで撮影した蛍光顕微鏡写真のSDの
比をコンピュータで計算することにより、PKAc-F64L-S65T-GFP再分布の再現可能
な基準が得られた。グラフに48の個々の測定結果と、各フォルスコリン濃度での
それらの平均値±s.e.m.のトレースを示す。比較のため、緩衝液または8段階増
加濃度のフォルスコリンの[cAMP]iに対する効果を、同条件で成長させた細胞の
シンチレーション近接アッセイによって分析した。グラフに4回の実験の任意の
ユニットで示した平均値±s.e.m.のトレースを示す。
【００５９】 図7 ヒトのムスカリン様(hM1)受容体とPKCα-F64L-S65T-GFP融合物で安定的に
トランスフェクトしたBHK細胞。カルバコール(1.0秒で100μM添加)は、PKCα-F6
4L-S65T-GFPの細胞質から細胞膜への一過性再分布を誘発した。画像は次の時間
：1)カルバコール添加の1秒前、b)添加から8.8秒後、およびc)添加から52.8秒後
に撮影した。 図8 hM1受容体とPKCα-F64L-S65T-GFP融合物で安定的にトランスフェクトしたB
HK細胞を、カルバコール(1μM、10μM、100μM)で処理した。1つの細胞において
、細胞内[Ca2+]をPKCα-F64L-S65T-GFPの再分布と同時に観察した。破線はカル
バコールの添加時を示す。上のパネルは各処理における各細胞の細胞内Ca2+濃度
の経時変化を示す。真中のパネルは各処理における各細胞の平均細胞質GFP蛍光
の経時変化を示す。下のパネルは1つの細胞の、通常の映像で見られるように特
に細胞の周縁部を含む領域内の周辺部での蛍光の変化を示す。蛍光強度の変化を
観察する最良の領域は細胞膜である。
【００６０】 図9 HAM F-12(血清なし)中100μMのMEK1阻害因子PD98059で30分間、37℃で処理
したHEK293細胞において発現したhERK-1-F64L-S65T-GFP融合物。この処理中、核
から蛍光が無くなる。(a)と同様の細胞を10％ウシ胎児血清を用いて37℃で15分
間処理した。HEK293細胞のGFP蛍光再分布の時間プロフィルは、Hepes緩衝液（HA
M F-12は実験直前にHepes緩衝液と取り替える）中の種々のEGF濃度での処理の結
果として起こる。蛍光の再分布を、1つの細胞の核と細胞質の面積比における変
化として表す。各時間プロフィルは6個の単細胞に見られる変化の平均である。 EGF処理の開始から600秒後である終了点での蛍光変化（核：細胞質）を測定し
た棒グラフは、EGFの種々の濃度に従う。 図10 HAM F-12中で一晩血清欠乏状態にしたHEK293細胞で発現したSMAD2-EGFP融
合物。HAM F-12はその後、実験の直前にpH7.2のHepes緩衝液と取り替えた。測定
バー10μm。 SMAD2-EGFP融合物を発現するHEK293細胞は、記載のように種々の濃度のTGF-β
で処理し、時間に対する蛍光の再分布を観察した。時間プロフィルプロットは核
内の蛍光増加を表し、測定した各細胞の初期値に標準化する。各トレースは単細
胞核の時間プロフィルである。 棒グラフは異なる濃度のTGF-βに対する核内の蛍光の終了点での変化を表す（
処理から850秒後）。それぞれの棒グラフは各処理における1個の核の値である。
【００６１】 図11 ヒトのインスリン受容体で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞中のV
ASP-F64L-S65T-GFP融合物。細胞はHAM F-12中で2時間、血清なしの欠乏状態にし
、次いで10％ウシ胎児血清で処理した。画像は処理の15分後に得られた蛍光再分
布を示す。GFP蛍光はアクチンストレスファイバーの長さに沿った局部的付着(fo
cal adhesion)として示される構造に局在する。 図12 実際の実験を行うためにFLIPRTMを用いてムスカリンアゴニストのカルバ
ミルコリンで刺激したBHKhM1細胞内のPKCα-GFPの転位の用量-応答関係。 図13 実際の実験を行うためにFLIPRTMを用いてフォルスコリンで刺激したCHO/P
KAc-F64L-S65T-GFP細胞内のPKCα-GFPの転位の用量応-答関係。 図14 ヒトのインスリン受容体と、マウスのcPKAで標識したS65T-GFPとを安定し
て発現するCHO細胞を、FLIPRTM機器でより詳細に検査した。6個の異なるウェル
を各濃度について経時的に画像形成し、フォルスコリン（細胞内でcAMPのアデニ
ル酸シクラーゼの生産を増加させる物質）の用量-応答を得た。蛍光変化は、刺
激の9分間でAUC（曲線下面積）として算出した。 結論：約50−100,000個の細胞を含む全部のウエルを照射し、単細胞または細胞
下事象を解像できない空間解像度で同時に画像形成するという事実にもかかわら
ず、マウスcPKA-BioSTの再分布はFLIPRTMで検出可能である。この方法は、細胞
内のcAMPレベルの同時測定に使用することができ、Gi及びGq型のG-タンパク質に
結合するG-タンパク質結合受容体へのリガンドの効果を測定するスクリーニング
アッセイとして使用することができる。
【００６２】 図15 異なる用量のフォルスコリンに予め暴露したときの、透過性にされたCHO/
PKAc -F64L-S65T-GFPから消失した蛍光の用量-応答関係。 図16 ヒトのインスリン受容体と、EGFPで標識したヒトのPKCβ1とを安定して発
現するCHO細胞を、顕微鏡で検査した。一連の細胞が各濃度において経時的に画
像形成され、用量-応答が得られた。蛍光変化は刺激の4分間でAUCとして算出し
た。画像から以下のデータが抽出された： 全画像：細胞とバックグラウンドを含む全体画像の強度変化の単なる分析。 単細胞：5個の独立した細胞をバックグラウンド補償の後に分析した。分析は細胞
全体について行った。 細胞質：上記と同じ5個の細胞をバックグラウンド補償の後に分析した。分析は
核近傍の細胞質の小さい領域について行った。 結論：ヒトPKCβ1-EGFPの再分布は、各細胞のサブ領域を分析した場合にのみ検
出可能である。この事象は、画像の連続を映画のようにして見たときに明らかに
見ることができる。しかしながら、全画像の蛍光変化または全細胞の蛍光変化が
分析されると、再分布は検出されない。
【００６３】 図17 ヒトのインスリン受容体と、EGFPで標識したヒトのPKCβ1とを安定して発
現するCHO細胞を、FLIPRTMで検査した。6個の異なるウェルを各濃度について経
時的に画像形成し、用量-応答を得た。蛍光変化は5分間の刺激でAUCとして算出
した。 結論：約50−100,000個の細胞を含む全部の細胞が照射され、単細胞または細胞
下構造物を解像するのに必要な解像度よりもはるかに低い解像度で検出器により
画像形成されるという事実にもかかわらず、ヒトPKCβ1-EGFPの再分布はFLIPRTM 機器において検出可能である。この現象は、図16の顕微鏡によるデータから明確
に予測することはできない。 図18 インスリン受容体とヒトNFkB-GFPタンパク質ハイブリッドとを安定して発
現するCHO細胞を、種々の濃度のIL-1で1時間刺激し、次いで低浸透性緩衝液(TRI
S-塩基 10mM、MgCl2 2mM、PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオライド) 0.5m
M、pH7.4)で洗浄し、顕微鏡に置いた。一連の画像を0.05％のトリトンX-100の添
加中に得て、その後、穏やかに混合して短時間インキュベートする。処理により
細胞膜が破壊され、後に核に転位するNFkB-GFPの画分が残るが、細胞質のある量
のプローブはより迅速に細胞を離れ、迅速に周囲の培地に無限に希釈される(焦
点が合わなくなる-プローブからの全蛍光のこの部分はそれによって喪失される)
。この処理前後の所定の時点で、全画像についての全強度値を抽出した。各実験
を標準化するために、後の値を先の値で割ると、より多いNFkBが核に転位されて
おり、それによって透過後の全蛍光に寄与している細胞に高い比率が認められる
。 結果：このプロトコルは、細胞質から核への蛍光プローブの転位又は核から細胞
質への転位を示す可能性がある良好な例である。
【００６４】実施例 実施例1：PKA活性化に基づくcAMPアッセイの構築、試験法及び実行 例えばGsまたはGlクラスのG-タンパク質に結合するG-タンパク質結合受容体の
活性化による、cAMPの濃度変化をもたらすシグナル経路の活性をモニターに有用
。 マウスのcAMP依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニット（PKAc）を、GFP
のF64L−S65T誘導体にC末端で融合させた。得られた融合物(PKAc-F64L-S65T- GF
P)は、生体内で転位をモニターし、それによってPKAの活性化をモニターするた
めに使用した。 PKAc-F64L-S65T-GFP融合物を構築するために、都合のよい制限エンドヌクレア
ーゼ部位を、マウスPKAc (Gen Bank 受託番号: M12303)およびF64L-S65T-GFP（W
O97/11094に開示の配列）をエンコードするcDNAにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
によって導入した。PCR反応は標準的なプロトコルに基づき、以下のプライマー
を使用して行った。 PKAcの増幅産物を次いでHindIII＋Asclで消化し、F64L-S65T-GFP産物をAscl＋
Xholで消化した。次に、消化した2つのPCR産物を、HindIII＋Xholで消化したプ
ラスミド（pZeoSVTM哺乳類発現ベクター、Invitrogen, San Diego, CA, USA）で
連結する。得られた融合構築物（SEQ ID NO:1および2）はSV40プロモーターの制
御下にあった。
【００６５】 トランスフェクションおよび細胞培養条件： チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)を、HEPES緩衝食塩水中でリン酸カルシ
ウム沈降法を用いることにより、PKAc-F64L-S65T-GFP融合物を含むプラスミドで
トランスフェクトした（Sambrookら、1989）。増殖培地(Technologies Inc., Ga
ithersburg, MD, USAから購入した1000mg/lのグルコース、10％ウシ胎児血清（F
BS）、100μg/mlのペニシリン-ストレプトマイシン混合物、2mMのL-グルタミン
を含有するDMEM)中で1000μg/mlのゼオシン（Invitrogen社）を用い、安定した
トランスフェクタントを選択した。トランスフェクトしなかったCHO細胞は対照
として使用した。融合タンパク質転位についてグルカゴンの効果を評価するため
、PKAc-F64L-S65T-GFP融合物を、ヒトのグルカゴン受容体を過剰発現する仔ハム
スター腎臓細胞（BHK/GR細胞）中で安定して発現させた。トランスフェクトしな
かったBHK/GR細胞は対照として使用した。GRの発現は、500μg/mlのG418（Neoマ
ーカー）で維持し、PKAc-F64L-S65T-GFPは500μg／mlのゼオシン（Sh bleマーカ
ー）で維持した。CHO細胞もまた、PKAc-F64L-S65T-GFP融合およびヒトのα2a副
腎受容器（hARa2a）を含むベクターで同時にトランスフェクトした。
【００６６】 蛍光顕微鏡検査において、細胞は少なくとも24時間のあいだLab-Tek チェンバ
ーカバーガラス（Nalge Nunc Int., Naperville, IL, USA）に付着させ、約80％
集密するまで培養した。実験の前に、細胞をグルタマックス(Life Technologies
)、100μg/mlのペニシリン-ストレプトマイシン混合物および0.3％FBSを含むHAM
F-12培地中で、選択圧なしで一晩培養した。この培地はインキュベーターから
直接的な細胞蛍光顕微鏡検査を可能にする低い自己蛍光を有する。 PKA活性の同時モニタリング： 生細胞の捕捉画像を、Fluar 40X、NA：1.3油浸レンズを備え、Photometrics C
H250電荷結合素子（CCD）カメラに連結させたZeiss Axiovert 135M蛍光顕微鏡を
用いて収集した。細胞は100WのHBCアークランプで照射した。光路には、画像バ
ックグラウンドを最小にするための470±20nm励起フィルター、510nmダイクロイ
ックミラーおよび515±15nm放射フィルターがある。細胞は特注の段階ヒーター
で37℃に維持した。
【００６７】 画像を加工し、以下の方法で分析した： 方法1： PKA転位を定量するための段階的手法 暗画像（カメラのシャッターを開けないことを除き、実際の画像と同じ条件下
で撮影した画像）をピクセルずつ除去することによって、画像をダークカラント
（dark current）を補正した。 フラットフィールド補正画像（均一蛍光検体の実際の画像と同条件で撮影され
た画像）とのピクセルずつの比を行うことによって、画像の照度の不均一性を補
正した。 画像の棒グラフ、すなわち画像における各強度値の発生頻度を算出した。 棒グラフの滑らかな二次関数（smoothed, second derivative）を算出し、2次
の0(second zero)を決定した。この0は、画像ピクセル値のバルクを表すメイン
ピークの高い方での棒グラフの変曲点に相当する。 工程4で確定した値を画像から消去する。負の値は全て除去した。 残りのピクセル値の平方偏差(標準偏差の二乗)を確定した。この値はその画像
の「応答」を表す。 cAMPの個別定量のためのシンチレーション近接アッセイ（SPA）。
【００６８】 方法2：PKA再分布を定量するための別の方法 対象とバックグラウンド間の情報基準(information measure)の最大化に基づ
いて自動的に得られた閾値を用いて、蛍光の集合を各画像から分割した。画像棒
グラフにおける先験的エントロピーを情報基準として使用する。 各画像で集合の占める面積を、分割した領域のピクセルを数えることによって
算出した。 連続の、または処理している対(treatment pair)の各画像について工程2で得
られた値を、回収した第一の（刺激していない）画像で見られた値に標準化する
。ゼロの値(0)は開始状態から蛍光が再分布されていないことを示す。この方法
による１の値(1)は完全な再分布に等しい。 細胞を、96ウェルのプレートで行う以外は上記のようにHAM F-12培地で培養し
た。培地を100μMのIBMXを含むCa2+-HEPES緩衝液と交換し、細胞を異なる濃度の
フォルスコリンで10分間刺激した。反応はNaOHを0.14Mまで加えることによって
停止させ、産生したcAMPの量をcAMP-SPAキットRPA538（Amersham）を用い、製造
者の記載のとおりに測定した。 PKAc-F64L-S65T-GFP融合を試験するためのcAMPの細胞内レベルでの操作。 以下の化合物を、cAMPレベルを変えるために使用した：アデニル酸シクラーゼ
の活性化因子であるフォルスコリン；ホスホジエステラーゼで分解されない膜透
過性cAMP類似体であるdbcAMP；ホスホジエステラーゼの阻害因子であるIBMX。
【００６９】 PKAc-F64L-S65T-GFPを安定して発現するCHO細胞では、1μMのフォルスコリン(
n＝3)、10μMのフォルスコリン(n＝4)、50μMのフォルスコリン(n＝4)(図1)、ま
たは1mMのdbcAMP(n＝6)での刺激後、融合タンパク質が斑点状の分布から細胞質
全体での均一な分布へと劇的に転位した。 図2に1μMのフォルスコリンで処理した後の応答の経時進行を示す。図3には、
融合タンパク質再分布の平均経時プロフィルの比較、ならびに3つのフォルスコ
リン濃度(図3A、E、B)、類似しているが応答が遅い1mMのdbcAMP（図3C）、およ
びアデニル酸シクラーゼ刺激がなくても応答を遅くする100μMのIBMX(n＝4、図3
D)の添加に対する各応答の程度の測定結果を示す。緩衝液の添加(n＝2)では、効
果はなかった(データ表示せず)。 融合タンパク質の挙動の対照として、F64L-S65T-GFPのみをCHO細胞で発現させ
、これらに50μMのフォルスコリン（n＝5）を与えた。これらの細胞におけるGFP
の均一拡散分布特性は、このような処理によって影響を受けなかった(データ表
示せず)。 フォルスコリンによって誘発されたPKAc-F64L-S65T-GFPの転位は、用量-応答
関係を示した（図4および6）。上記の定量化手順を参照のこと。
【００７０】 PKAc-F64L-S65T-GFP転位の可逆性 PKAcプローブの細胞質固定ホットスポットからの放出は、可逆的であった。10
μMのフォルスコリンで処理した後、細胞を緩衝液で繰り返し（5−8回）洗浄す
ると、2−5分間で斑点状パターンが完全に復元される（n＝2、図3E）。実際は、
融合タンパク質はフォルスコリン刺激の前に見られたものとほとんど区別のつか
ない細胞質内蛍光集合パターンに戻った。 融合タンパク質の細胞質内凝集体への復帰が減少した[cAMP]iを反映している
かどうかをテストするために、細胞を10μMのフォルスコリンと100μMのIBMX(n
＝2)の組み合わせで処理し、次いで100μMのIBMXを含む緩衝液で繰り返し(5−8
回)洗浄した（図3F）。これらの実験において、融合タンパク質はフォルスコリ
ンの除去後、刺激前の位置に戻らなかった。
【００７１】 生理学的に関連する薬剤を用いたPKA-F64L-S65T-GFPプローブの試験 アデニル酸シクラーゼの受容体活性化に対するプローブの応答をテストするた
めに、グルカゴン受容体で安定してトランスフェクトしたBHK細胞とPKA-F64L-S6
5T-GFPプローブをグルカゴン刺激に曝した。グルカゴン受容体は、アデニル酸シ
クラーゼを活性化するGsタンパク質に結合してcAMPレベルを増加させる。これら
の細胞では、100nMのグルカゴン(n＝2)の添加によって、細胞質内凝集体からのP
KA-F64L-S65T-GFPプローブの放出が生じ、その結果、2−3分間で融合タンパク質
が転位し、細胞質内でさらに均一に分布する(図3G)。類似ではあるがそれほど顕
著ではない効果が、より低いグルカゴン濃度で見られた(n＝2、データ表示せず)
。緩衝液の添加(n＝2)では、長時間にわたって効果がみられなかった（データ表
示せず）。 hARα2aとPKA-F64L-S65T-GFPプローブを発現する一時的にトランスフェクトし
たCHO細胞を、10μMのフォルスコリンで7.5分間処理し、次いで引き続きフォル
スコリンの存在下で10μMのノルエピネフリンに暴露して、外因性副腎受容体を
刺激する。これがGIタンパク質に結合し、アデニル酸シクラーゼが阻害される。
この処理は細胞質内凝集体において、[cAMP]iの減少を表す蛍光を再発させる(図
3H)。
【００７２】 [cAMP]iに相関する融合タンパク質転位 上記したように、応答が完了するまでの時間はフォルスコリンの用量に依存し
ていた(図5)。また、応答の程度も用量依存であった。処理量のやや高いシステ
ムでのPKA-F64L-S65T-GFP融合タンパク質転位をテストするために、PKA-F64L-S6
5T-GFP融合で安定してトランスフェクトしたCHO細胞を、緩衝液と5段階増加用量
のフォルスコリンで刺激した(n＝8)。上記の画像分析アルゴリズム(方法1)を利
用して、用量-応答関係を0.01−50μMのフォルスコリン範囲で観察した(図6)。
最大の半分の刺激が約2μMのフォルスコリンで見られた。並行して、細胞を緩衝
液と0.01−50μMの範囲において8段階で濃度が増加するフォルスコリンで刺激し
た(n＝4)。産生されたcAMPの量は、SPAアッセイで測定した。融合タンパク質転
位曲線の最も急な箇所と一致する1−5μMのフォルスコリンのあいだで急激な増
加が見られた(図6)。
【００７３】実施例2 ：PKC活性検出のためのプローブ PKC-GFP融合の構築 マウスPKCαのcDNA（GenBank 受託番号:M25811）とF64L-S65T-GFP（WO97/1109
4に開示の配列）を、それぞれポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅させて制限酵
素で処理した2つの産物を連結することによってプローブを構築した。Taq(登録
商標)ポリメラーゼと以下のオリゴヌクレオチドプライマーをPCRに使用した。 実施例1に記載のHindIII-Xholカセットとして、ハイブリッドDNA鎖をpZeoSV(
登録商標)哺乳類発現ベクターに挿入した。 誘導性メタロチオニンプロモーターの制御下でヒトM1受容体を発現し、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼマーカーで維持されるBHK細胞を、HEPES緩衝食塩水（HBS[pH
7.10]）中でリン酸カルシウム沈降法を用いてPKCα-F64L-S65T-GFPプローブでト
ランスフェクトした。安定的なトランスフェクタントを、増殖培地（1000mg/lの
グルコース、10％ウシ胎児血清（FBS）、100μg/mlのペニシリン−ストレプトマ
イシン混合物、2mMのL-グルタミンを含むDMEM）中で1000μg/mlのゼオシン(登録
商標)を使用して選択した。hM1受容体およびPKCα-F64L-S65T-GFP融合タンパク
質をそれぞれ、500nMのメトトレキセートおよび500μg/mlのゼオシン(登録商標)
で維持した。全ての実験の24時間前に、細胞をグルタマックス、100μg/mlのペ
ニシリン−ストレプトマイシン混合物および0.3％FBSを含むHAM F-12培地に移し
た。この培地は選択圧を軽減するので、シグナル変換経路の誘発が低く、インキ
ュベーターから直接的な細胞蛍光顕微鏡検査を可能にする適切な波長で低い自己
蛍光を有する。
【００７４】 方法1：PCAα活性の同時モニタリング 生細胞のデジタル画像を、40X、NA：1.3油浸レンズを備え、Photometrics CH
250電荷結合素子（CCD）カメラに連結させたZeiss Axiovert 135M蛍光顕微鏡を
用いて収集した。細胞は、100WのHBCアークランプで照射した。光路には、画像
バックグラウンドを最小にするための470±20nm励起フィルター、510nmダイクロ
イックミラーおよび515±15nm放射フィルターがある。細胞は特注の段階ヒータ
ーで37℃に維持して監視した。 画像はマッキントッシュのIPLabソフトウェアパッケージを用いて分析した。 PKCα-F64L-S65T-GFP融合を安定して発現するM1-BHK細胞をカルバコールで刺
激すると、細胞質から細胞膜への用量依存性一過性転位が見られた(図7a、b、c)
。細胞質ゾルの遊離カルシウム濃度の同時測定では、カルバコールによって誘発
されたカルシウムの移動が転位よりも先に起こることがわかる(図8)。 PKCα転位を定量化するための段階的手法： 暗画像（カメラのシャッターを開けないことを除き、実際の画像と同じ条件下
で撮影した画像）をピクセルずつ除去することによって、画像のダークカラント
を補正した。
【００７５】 フラットフィールド補正画像（均一蛍光検体の実際の画像と同条件で撮影され
た画像）とのピクセルずつの比を行うことによって、画像の照度の不均一性を補
正した。 縁部が確定された画像のコピーを作成した。画像の縁部は、大規模な変化しな
いすべての要素（すなわちバックグラウンド）を除去し、いずれかの小規模な変
化(すなわち鮮明な縁部)を強調する核を有する画像を巻き込む標準的な縁部検出
法によって見出した。この画像をその後、閾値を設けることによって二値画像に
変換した。二値画像の小さすぎて細胞縁部を表すことができない対象は除去した
。二値画像の拡張を行い、画像縁部の全ての隙間をふさいだ。画像の端部に接触
する画像中の全ての縁部の対象を除去した。この二値画像は、縁部マスクを表す
。 別の画像コピーを工程3の手順によって作成した。このコピーをさらに加工し
て「孔」を囲む対象を検出し、その孔の中の全てのピクセルを縁部の二値の値、す
なわち1にする。この画像は全体の細胞マスクを表す。最初の画像を工程3の縁部
マスクでマスクして、全ピクセルの値の合計を測定する。 最初の画像を工程4の全体細胞マスクでマスクして、全ピクセル値の合計を測
定した。 工程5の値を工程6の値で割って最終結果、つまり縁部に局在していた細胞中の
蛍光強度のフラクションを得る。
【００７６】実施例3 ：マイトジェンで活性化したプロテインキナーゼErk1の再分布を検出す
るためのプローブ MAPKを伴うシグナル経路のモニターに有用であり、例えば生細胞での経路の活
性をモジュレートする化合物を同定する。 セリン/スレオニンプロテインキナーゼであるErk1は、例えば多くの成長因子
によって活性化されるシグナル経路の構成要素である。 生細胞内でERK−1活性を同時に検出するためのプローブ： 細胞外シグナルによって調節されたキナーゼ（ERK−1、マイトジェン活性化プ
ロテインキナーゼ、MAPK）を、GFP誘導体にN-またはC-末端で融合する。異なる
哺乳類細胞で発現した融合物を、生体内の核転位、したがってMAPK経路を活性化
する刺激に応じてERK1の活性化をモニターするために使用する。 ヒトErk1遺伝子（GenBank 受託番号:X60188）を、標準プロトコルに基づくPCR
でプライマーを用いて増幅させた。 Erk 1-トップ 及びErk1-ボトム/+ストップ PCR産物を制限酵素EcoR1およびBamH1で消化し、EcoR1およびBamH1で消化したp
EGFP-C1（Clontech, Palo Alto; GenBank 受託番号 U55763）に連結する。これ
は、CMVプロモーターの制御下でEGFP−Erk1融合（SEQ ID No: 5および6）を生産
する。
【００７７】 EGFP−Erk1融合を含有するプラスミドは、FUGENEトランスフェクション試薬（
Boehringer Mannheim）を用いてHEK293細胞にトランスフェクトした。実験の前
に、細胞を8ウェルのチャンバーに分けた10％FCS含有DMEM中で80−90％集密する
まで成長させた。細胞を何も加えないHAM F-12培地（FCSなし）中で洗浄し、何
も加えないHAM F-12培地（FCSなし）中で、Erk1を活性化するキナーゼであるMEK
1の阻害因子であるPD98059の100μMとともに30−60分間インキュベートした。こ
の工程は、EGFP−Erk1の核を効果的に外に出す。実験を始める直前に、HAM F-12
をHepes緩衝液と入れ替え、その後Hepes緩衝液で洗浄を行う。これにより、PD98
059阻害因子が除去される。MEK1のブロッキングがさらに必要な場合には(例えば
対照実験において)、阻害因子をHepes緩衝液に含める。 顕微鏡の実験用装備は、実施例1に記載のとおりであった。 60枚の画像をそれぞれ10秒間隔で収集した。画像番号10以降では試験化合物を
加えた。 EGE(1−100nM)の添加により、数分以内に細胞質から核へのEGFP−Erk1の再分
布が生じた(図9a、b)。 応答は下記のようにして定量化し、EGF濃度とEGFP−Erk1の核転位との用量-依
存関係を見出した(図9c、d)。この実施例において、GFP蛍光の再分布は、細胞の
核対細胞質構成要素の面積比の変化として示される。各時間プロフィルは、各処
理における6個の細胞からの核対細胞質の比の平均である。
【００７８】実施例4 ：Smad2再分布検出のためのプローブ 形質転換成長因子βファミリーのいくつかのメンバーによって活性化されるシ
グナル経路をモニターするのに有用であり、例えば生細胞での経路の活性をモジ
ュレートする化合物を同定する。 シグナル変換因子であるSmad2は、サイトカインのTGFβファミリーのいくつか
のメンバーによって誘発されるシグナル経路の構成要素である。 a) ヒトSmad2遺伝子（GenBank受託番号：AF027964）は、標準プロトコルに基づ
くPCRでプライマーを用いて増幅させた。 Smad2-トップ 及びSmad2-ボトム/+ストップ PCR産物を制限酵素EcoR1およびAcc65Iで消化し、EcoR1およびAcc65Iで消化し
たpEGFP-C1（Clontech, Palo Alto; GenBank 受託番号 U55763）に連結した。こ
れは、CMVプロモーターの制御下でEGFP−Smad2融合（SEQ ID No: 7および8）を
生産する。
【００７９】 b) ヒトSmad2遺伝子（GenBank受託番号：AF027964）は、標準プロトコルに基づ
くPCRでプライマーを用いて増幅させた。 Smad2-トップ 及びSmad2-ボトム/-ストップ PCR産物を、制限酵素EcoR1およびAcc65lで消化し、EcoR1およびAcc65lで消化
したpEGFP-N1(Clontech, Palo Alto; GenBank受託番号：U55762)に連結した。こ
れはCMVプロモーターの制御下でSmad2-EGFP融合（SEQ ID Nos：9および10）を生
産する。
【００８０】 EGFP-Smad2融合を含有するプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトすると
、細胞質内再分布が生じた。実験前に、細胞を8ウェルのNuncチャンバーで、10
％FCS含有DMEM中で80％集密するまで成長させ、FCSを含まないHAM F-12培地で一
晩欠乏状態にした。 実験では、HAM F-12培地をpH7.2のHepes緩衝液と入れ替えた。顕微鏡の実験用
装備は、実施例1に記載のとおりであった。90枚の画像をそれぞれ10秒間隔で収
集した。画像番号5以降では試験化合物を添加した。 細胞の血清欠乏の後、それぞれの核は、GFP蛍光が周囲の細胞質に比べて低か
った(図10a)。TGFβの添加により、数分で細胞質から核へのEFGP-Smad2の再分布
が生じた(図10b)。 処理した細胞における蛍光の再分布を、刺激していない各細胞における核のGF
P蛍光の初期値に標準化した核の蛍光の単なるフラクションの増加として数量化
した。TGFβに対する用量依存変化を表示した（図10c）。
【００８１】実施例5 ：VASP再分布を検出するためのプローブ 細胞骨格構造の再配置を伴うシグナル経路のモニターに有用であり、例えば生
細胞における経路の活性をモジュレートする化合物を同定する。リンタンパク質
であるVASPは、細胞骨格構造の構成要素であり、局部的付着に影響を与えるシグ
ナルに反応して再分布する。 ヒトVASP遺伝子(GenBank受託番号：Z46399)を標準プロトコルに基づくPCRでプ
ライマーを使用して増幅させた。 VASP-トップ 及びVASP-ボトム/+ストップ
【００８２】 PCR産物を制限酵素Hind3およびBamH1で消化し、Hind3およびBamH1で消化したp
EGFP-C1（Clontech, Palo Alto; GenBank受託番号U55763）に連結した。これは
、CMVプロモーターの制御下でEGFP-VASP融合（SEQ ID Nos：11および12）を生産
する。 得られたプラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてヒ
トのインスリン受容体を発現するCHO細胞にトランスフェクトした。実験前に、
細胞を8ウェルのNuncチャンバーで成長させ、FCSを含まない培地で一晩欠乏状態
にした。実験は、実施例1に記載の顕微鏡設備を用いて行った。10％FCSを細胞に
添加し、画像を収集した。EGFP-VASP融合は、周辺近傍におけるある程度均一な
分布からより局在的な構造に再分布し、局部的付着点として同定された(図11)。
【００８３】実施例7 ：NFカッパB再分布を検出するためのプローブ NFカッパBの活性化を導くシグナル経路をモニターするのに有用であり、例え
ば生細胞の経路の活性をモジュレートする化合物を同定する。 転写の活性化因子であるNFカッパBは、サイトカイン、リンフォカインおよび
いくつかの免疫抑制剤を含む様々の誘発因子に応答するシグナル経路の構成要素
である。 a) ヒトのNFカッパB p65サブユニット遺伝子(GenBank受託番号：M62399)を、標
準プロトコルに基づくPCRでプライマーを用いて増幅させた。 NFカッパB-トップ 及びNFカッパB-ボトム/+ストップ PCR産物を制限酵素Xho1およびBamH1で消化し、Xho1およびBamH1で消化したpEG
FP-C1（Clontech, Palo Alto; GenBank受託番号U55763）に連結した。これは、C
MVプロモーターの制御下でEGFP-NFカッパB融合（SEQ ID Nos：13および14）を生
産する。
【００８４】 b) ヒトのNFカッパB p65サブユニット遺伝子(GenBank受託番号：M62399)を、
標準プロトコルに基づくPCRでプライマーを用いて増幅させた。 NFカッパB-トップ 及びNFカッパB-ボトム/-ストップ PCR産物を、制限酵素Xho1およびBamH1で消化し、Xho1およびBamH1で消化したp
EGFP-N1（Clontech, Palo Alto; GenBank受託番号U55762）に連結した。これは
、CMVプロモーターの制御下でNFカッパB-EGFP融合(SEQ ID Nos:15および16)を生
産する。
【００８５】 得られたプラスミドを適当な細胞系、例えばジャーカット(Jurkat)にトランス
フェクトすると、EGFP-NFカッパBプローブ及び/又はNFカッパB-EGFPプローブが
例えばIL−1によるシグナル経路の活性化に応答して細胞質から核への細胞分布
を変化させる。 インスリン受容体およびヒトのNFkB-GFPタンパク質ハイブリッドを安定して発
現するCHO細胞を、異なる濃度のIL-1で1時間刺激し、次いで低浸透緩衝液（TRIS
塩基10mM、MgCl2 2mM、PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオライド)0.5mM、pH
7.4）で洗浄し、顕微鏡に配置した。画像の連続は0.05％トリトンX−100を添加
している間に得て、その後穏やかに混合して短時間インキュベーションした。こ
の処理によって細胞膜が断裂し、後に核に転位するNFkB-GFPのフラクションは残
るが、細胞質のある量のプローブはより速く細胞を離れ、すぐに周囲の培地に無
限に希釈される（焦点から外れる−プローブからの全蛍光のこの部分はしたがっ
て失われる）。この処理前後の所定の時点において、全画像の合計強度値を抽出
した。各実験を標準化するために、処理後の値を処理前の値で割る。より多くの
NFkBが核に転位し、透過処理後の全蛍光に寄与した細胞においてより高い比が見
られた。二回行ったこの実験からの実際のデータは図18に示す。結論： このプロトコルは、一連の画像として記録された原形質膜透過の直前お
よび直後の測定によって、蛍光プローブのサイトゾルから核への転位、または核
からサイトゾルへの転位を明らかにする可能性がある良好な例である。
【００８６】実施例8 ：プロテインキナーゼCαの同時再分布 ムスカリン様M1受容体のカルバミルコリン刺激に応答するプロテインキナーゼ
Cαイソ型-GFP融合（PKCα-GFP、SEQ ID No:3および4）の同時再分布の測定；マ
イクロタイタープレートにて96回の再分布同時測定。 BHK細胞は、500μg/mlのメトトレキセートの選択下で組換えヒトムスカリン様
1型受容体を、さらに500nMゼオシンの選択下でPKCα-GFP構造物（KaA048）を安
定して発現していた。細胞を96ウェルのプレート(Packard ViewPlate、黒色で底
部は透明)で成長させ、洗浄し、フェノールレッドを含まない、20mM HEPESおよ
び5.5mMグルコース含有ハンクス緩衝塩水（HBSS）で予備培養した。 プレートをMolecular DevicesのFLIPRTM（蛍光画像形成プレートリーダー）で
測定した。アルゴンイオンレーザーから出力0.4−0.8Wで生じる488nm放出線を、
GFPからの蛍光を励起するために使用した。放出波長は、510−565nmの帯域フィ
ルターで回収した。
【００８７】 細胞は、先の研究によって公知のM1受容体アゴニストであるカルバミルコリン
の3回用量で試験し、PKCα-GFP構築物の再分布を顕微鏡で検出した［Almholtら
、1997］。測定は、5分間で10秒ごとに行った。異なるウェルでの基準蛍光の標
準化を含むデータ処理、バックグラウンド除去および各濃度で使用した6ウェル
の平均をとった後、図14に示すデータを得た。カルバミルコリンが、顕微鏡蛍光
測定で見られる時間および用量依存と極めて類似の時間および用量依存の一過性
蛍光減少を生じさせたことが明らかに示される（Almholtら、1997を参照）（図1
2）。この実験を細胞の同じバッチで2回繰り返したところ、結果は同様であった
。
【００８８】実施例9 ：サイクリックAMP依存プロテインキナーゼ触媒サブユニット-GFP融合の
同時再分布 アデニル酸シクラーゼのフォルスコリン刺激に応答するサイクリックAMP依存
プロテインキナーゼ触媒サブユニット-GFP融合（C-GFPLT SEQ ID No:1および2）
の同時再分布の測定：マイクロタイタープレートにて96回の並行再分布測定。 CHO細胞を、通常1000μg/mlのゼオシン（Invitrogen）を用いた連続的な選択
下で、PKA触媒サブユニット-F64L＋S65T GFP(C-GFPLT)融合タンパク質のハイブ
リッドDNAで安定してトランスフェクトした。細胞を選択せずに96ウェルのプレ
ート(Packard ViewPlate、黒色で底部は透明)で2日間成長させ、洗浄し、フェノ
ールレッドを含まない、20mM HEPESおよび5.5mMグルコース含有ハンクス緩衝塩
水（HBSS）で予備培養した。 プレートをMolecular DevicesのFLIPRTM（蛍光画像形成プレートリーダー）で
測定した。アルゴンイオンレーザーから出力0.4−0.8Wで生じる488nm放出線を、
GFPからの蛍光を励起するために使用した。放出波長は、510−565nmの帯域フィ
ルターで回収した。
【００８９】 細胞は、フォルスコリン（図13）と先の研究によって公知であるアデニル酸シ
クラーゼアゴニストの3回用量で試験し、C-GFPLT構築物の再分布を顕微鏡で検出
した。測定は、フォルスコリンを添加した時点から6分間で10秒ごとに行った。
異なるウェルでの基準蛍光の標準化を含むデータ処理、バックグラウンド除去お
よび各濃度で使用した6ウェルの平均をとった後、以下に示すデータを得た。図1
5において、フォルスコリンが、顕微鏡蛍光測定で見られる時間および用量依存
と極めて類似の時間および用量依存の蛍光減少を生じさせたことが明確に示され
る（Almholtら、1997を参照）。この実験を細胞の同じバッチで2回繰り返したと
ころ、結果は同様であった。図14に見られるように、より広範な用量-応答試験
は、この方法が処理量の高いスクリーニングアッセイの基礎として使用するのに
十分な感度および再現性を有していることをすぐに示している。
【００９０】実施例10 ：サイクリックAMP依存プロテインキナーゼ触媒サブユニット-GFP融合 アデニル酸シクラーゼのフォルスコリン刺激後のサイクリックAMP依存プロテ
インキナーゼ触媒サブユニット-GFP融合（C-GFPLT SEQ ID No:1および2）の再分
布応答の測定：アゴニストで処理した細胞の透過処理による全蛍光の変化の測定
。 CHO細胞を、通常1000μg/mlのゼオシン（Invitrogen）を用いた連続的な選択
下で、PKA触媒サブユニット-F64L＋S65T GFP(C-GFPLT)融合タンパク質のハイブ
リッドDNAで安定的にトランスフェクトした。ここに報告する実験では、細胞は
選択せずに8ウェルの組織培養処理したLab-Tek(登録商標)チャンバーカバーガラ
スユニットで90％集密するまで成長させた（チャンバーはNunc, Inc. Illinois,
USAより得た）。実験の直前に、増殖培地を細胞から洗い流し、ウェルあたり20
0μlのHEPES緩衝液と入れ替えた。 ここに報告する結果では、チャンバーは、x40油浸FluarレンズNA1.4を備えた
倒立顕微鏡（Diaphot 300, Nikon, Japan）に装備した冷却CCDカメラ（KAF1400
チップ, Photometrics Ltd., USA）を用いて測定した。細胞は50WのHBOランプか
らの450−490nmの光で照射し、放出光は510−560nmの間で回収した。
【００９１】 細胞を、先の研究によって公知のアデニル酸シクラーゼアゴニストであるフォ
ルスコリンの4回用量で試験し、C-GFPLT構築物の再分布を顕微鏡で検出した。画
像は、各処理について10秒間隔で10分間回収した。フォルスコリンまたは対照緩
衝液の添加から6分後、トリトンX-100を最終濃度0.1％まで加えた。この界面活
性剤は、細胞から自由に動くことのできるC-GFPLTを放出する。この損失から生
じる蛍光の変化を1分間の平衡後に測定した。バックグラウンド除去および変性
前の値への標準化を含むデータ処理の後、図16に示すデータを得た。透過処理に
よって蛍光が減少し、その大きさはフォルスコリン処理に依存していた。この実
験を細胞の同じバッチで2回繰り返したところ、同様の結果が得られた。
【００９２】実施例11 ：PKCβ1再分布を検出するためのプローブ プロテインキナーゼCを含むシグナル経路のモニターに有用であり、生細胞で
の経路の活性をモジュレートする化合物を同定する。 セリン/スレオニンプロテインキナーゼであるPKCβ1は、PKCαおよびPKCβ2と
密接に関連しているが、同一ではない。これはジアシルグリセロール種の増加を
伴う細胞内のカルシウム夾雑物の上昇によって活性化されるシグナル経路の構成
要素である。 a） ヒトPKCβ1遺伝子（GenBank受託番号：X06318）を標準プロトコルに基づく
PCRでプライマーを用いて増幅させた。 PKCβ1-トップ 及びPKCβ1-ボトム PCR産物を制限酵素Xho1およびBamH1で消化し、Xho1およびBamH1で消化したpEG
FP-C1（Clontech, Palo Alto; GenBank受託番号：U55763）に連結した。これは
、CMVプロモーターの制御下でEGFP-PKCβ1融合（SEQ ID No: 17および18）を生
産する。
【００９３】 b） ヒトのインスリン受容体とEGFPで標識したヒトPKCβ1とを安定して発現す
るCHO細胞を、顕微鏡で検査した。各濃度において一連の細胞の画像形成を経時
的に行い、用量-応答を得た。蛍光の変化は、4分間の刺激についてAUCとして算
出した。 図16によれば、顕微鏡測定を使用すると、ヒトPKCβ1-EGFPの再分布は各細胞
のサブ領域を分析した時のみに検出できることがわかる。この事象は、画像の連
続を映画のようにして見たときに明らかに見ることができる。しかしながら、全
画像の蛍光変化または全細胞の蛍光変化が分析されると、再分布は検出されない
。 ヒトのインスリン受容体とEGFPで標識したヒトPKCβ1とを安定して発現するCH
O細胞を、FLIPRTMで検査した。各濃度について、6個の独立したウェルを経時的
に画像形成し、用量-応答を得た。蛍光変化は、5分間の刺激についてAUCとして
算出した。図17に示すように、約50−100,000個の細胞を含む全部のウエルが照
射され、単細胞または細胞下構成要素を解像するのに必要な解像度よりもはるか
に低い解像度で画像形成されるという事実にもかかわらず、ヒトPKCβ1-EGFPの
再分布はFLIPRTM機器において検出可能である。この現象は図16の顕微鏡による
データから明確に予測することはできない。これらの知見に基づき、スクリーニ
ングアッセイがFLIPRTM機器で確立できることは明らかである。さらに最適化を
行うことによって、処理量の高いスクリーニングアッセイを確立することも可能
だろう。 引用文献
【００９４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 PKAc-F64L-S65T-GFPハイブリッドタンパク質を発現するCHO細胞を、HAMのF12
培地中、37℃で50μMのフォルスコリン(forskolin)を用いて処理した。これらの
細胞中におけるGFP蛍光の画像は、処理後、異なる時間間隔：a）40秒、b）60秒
、c）70秒、d）80秒で撮影した。（無核）細胞質において、蛍光は斑点状からよ
り均一な分布へと変化する。
【図２】 フォルスコリンで誘発したPKAc-F64L-S65T-GFP再分布の経時分析。PKAc-F64L-
S65T-GFP融合タンパク質を発現するCHO細胞を、経時蛍光顕微鏡によって分析し
た。蛍光顕微鏡写真は、アゴニストの添加の2分前から8分後までの一定間隔で獲
得した。左上の画像が得られた直後（t＝0）、細胞を1μMのフォルスコリンで調
べた。フレームは次の時間：i）0、ii）1、iii）2、iv）3、v）4およびvi）5分
で回収した。測定バー10μm。
【図３】 種々のアゴニストに対するPKAc-F64L-S65T-GFP再分布の経時分析。PKAc-F64L-
S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する1μMのフォルスコリン（A）、50μMの
フォルスコリン（B）、1mMのdbcAMP（C）ならびに100μMのIBMX(D)による効果（
添加は白矢印で示す）を、CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP細胞の経時蛍光顕微鏡検査に
よって分析した。10μMのフォルスコリン（白矢印）を添加し、その直後に緩衝
液で洗浄を繰り返す（黒矢印）ことによるPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の
局在化に対する効果を同一細胞で分析した（E）。並行実験において、10μMのフ
ォルスコリンおよび100μMのIBMXの添加（白矢印）後、100μMのIBMXを含有する
緩衝液で洗浄を繰り返した（黒矢印）ことによる効果を分析した（F）。フォル
スコリンの除去により、PKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質が細胞質内集合体に
復帰するが、これはIBMXが引き続き存在することによって防止される（F）。PKA
c-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する100nMのグルカゴンの効果（図
3G、白矢印）もまた、BHK/GR、PKAc-F64L-S65T-GFP細胞について示す。PKAc-F64
L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する10μMのノルエピネフリン（黒矢印
）の効果を、10μmのフォルスコリンで予備処理し(白矢印)、一過的に形質転換
したCHO、PKAc-F64L-S65T-GFP細胞で同様に分析し、[cAMP]を増加させた。図3H
において、x軸は12秒ごとの画像の数を算定することに注意されたい。各実験の
生データは、緩衝液またはアゴニストの添加前に得られた数枚の画像を含む、一
定間隔で得られた60枚の蛍光顕微鏡写真からなる。チャート（A-G）はそれぞれ
、60枚の画像全てにおいて見られた応答の、分析法2に記載のように行われた定
量化を示す。蛍光凝集体の初期の面積に対する蛍光性の高い凝集体の全面積の変
化は、各実験において、図3の全てのグラフにおける対時間の縦座標としてプロ
ットした。測定バー10μm。
【図４】 PKAc-F64L-S65T-GFP融合のフォルスコリン誘発再分布に関する用量-反応曲
線（2回の実験）。
【図５】 応答開始からPKAc-F64L-S65T-GFP再分布が最大の半分(t1/2max)になるまで
と、最大(tmax)になるまでの時間。データは“図2”に示すような曲線から抽出
した。全てのt1/2maxおよびtmaxの値は平均値±SDとし、各フォルスコリン濃度
での2−3回の独立した実験からの26−30細胞の合計に基づく。観察された再分布
は長時間維持されるため、tmax値は完全な再分布に到達した最も早い時点とする
。この値は再分布の程度とは無関係であることに留意のこと。
【図６】 フォルスコリンで誘発したcAMP上昇と、PKAc-F64L-S65T-GFP再分布の並行用量
-応答分析。96ウェルのプレートで成長させたCHO/PKAc-F64L-S65T-GFP細胞中のP
KAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する緩衝液または5段階増加濃度
のフォルスコリンの効果を、上記のように分析した。フォルスコリンの添加前と
添加後30分後に、細胞の同じフィールドで撮影した蛍光顕微鏡写真のSDの比をコ
ンピュータで計算することにより、PKAc-F64L-S65T-GFP再分布の再現可能な基準
が得られた。グラフに48の個々の測定結果と、各フォルスコリン濃度でのそれら
の平均値±s.e.m.のトレースを示す。比較のため、緩衝液または8段階増加濃度
のフォルスコリンの[cAMP]iに対する効果を、同条件で成長させた細胞のシンチ
レーション近接アッセイによって分析した。グラフに4回の実験の任意のユニッ
トで示した平均値±s.e.m.のトレースを示す。
【図７】 ヒトのムスカリン様(hM1)受容体とPKCα-F64L-S65T-GFP融合物で安定的にトラ
ンスフェクトしたBHK細胞。カルバコール(1.0秒で100μM添加)は、PKCα-F64L-S
65T-GFPの細胞質から細胞膜への一過性再分布を誘発した。画像は次の時間：1)
カルバコール添加の1秒前、b)添加から8.8秒後、およびc)添加から52.8秒後に撮
影した。
【図８】 hM1受容体とPKCα-F64L-S65T-GFP融合物で安定的にトランスフェクトしたBHK
細胞を、カルバコール(1μM、10μM、100μM)で処理した。1つの細胞において、
細胞内[Ca2+]をPKCα-F64L-S65T-GFPの再分布と同時に観察した。破線はカルバ
コールの添加時を示す。上のパネルは各処理における各細胞の細胞内Ca2+濃度の
経時変化を示す。真中のパネルは各処理における各細胞の平均細胞質GFP蛍光の
経時変化を示す。下のパネルは1つの細胞の、通常の映像で見られるように特に
細胞の周縁部を含む領域内の周辺部での蛍光の変化を示す。蛍光強度の変化を観
察する最良の領域は細胞膜である。
【図９】 HAM F-12(血清なし)中100μMのMEK1阻害因子PD98059で30分間、37℃で処理し
たHEK293細胞において発現したhERK-1-F64L-S65T-GFP融合物。この処理中、核か
ら蛍光が無くなる。(a)と同様の細胞を10％ウシ胎児血清を用いて37℃で15分間
処理した。HEK293細胞のGFP蛍光再分布の時間プロフィルは、Hepes緩衝液（HAM
F-12は実験直前にHepes緩衝液と取り替える）中の種々のEGF濃度での処理の結果
として起こる。蛍光の再分布を、1つの細胞の核と細胞質の面積比における変化
として表す。各時間プロフィルは6個の単細胞に見られる変化の平均である。 EGF処理の開始から600秒後である終了点での蛍光変化（核：細胞質）を測定し
た棒グラフは、EGFの種々の濃度に従う。
【図１０】 HAM F-12中で一晩血清欠乏状態にしたHEK293細胞で発現したSMAD2-EGFP融合物
。HAM F-12はその後、実験の直前にpH7.2のHepes緩衝液と取り替えた。測定バー
10μm。 SMAD2-EGFP融合物を発現するHEK293細胞は、記載のように種々の濃度のTGF-β
で処理し、時間に対する蛍光の再分布を観察した。時間プロフィルプロットは核
内の蛍光増加を表し、測定した各細胞の初期値に標準化する。各トレースは単細
胞核の時間プロフィルである。 棒グラフは異なる濃度のTGF-βに対する核内の蛍光の終了点での変化を表す（
処理から850秒後）。それぞれの棒グラフは各処理における1個の核の値である。
【図１１】 ヒトのインスリン受容体で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞中のVASP-
F64L-S65T-GFP融合物。細胞はHAM F-12中で2時間、血清なしの欠乏状態にし、次
いで10％ウシ胎児血清で処理した。画像は処理の15分後に得られた蛍光再分布を
示す。GFP蛍光はアクチンストレスファイバーの長さに沿った局部的付着(focal
adhesion)として示される構造に局在する。
【図１２】 実際の実験を行うためにFLIPRTMを用いてムスカリンアゴニストのカルバミル
コリンで刺激したBHKhM1細胞内のPKCα-GFPの転位の用量-応答関係。
【図１３】 実際の実験を行うためにFLIPRTMを用いてフォルスコリンで刺激したCHO/PKAc-
F64L-S65T-GFP細胞内のPKCα-GFPの転位の用量応-答関係。
【図１４】 ヒトのインスリン受容体と、マウスのcPKAで標識したS65T-GFPとを安定して発
現するCHO細胞を、FLIPRTM機器でより詳細に検査した。6個の異なるウェルを各
濃度について経時的に画像形成し、フォルスコリン（細胞内でcAMPのアデニル酸
シクラーゼの生産を増加させる物質）の用量-応答を得た。蛍光変化は、刺激の9
分間でAUC（曲線下面積）として算出した。 結論：約50−100,000個の細胞を含む全部のウエルを照射し、単細胞または細胞
下事象を解像できない空間解像度で同時に画像形成するという事実にもかかわら
ず、マウスcPKA-BioSTの再分布はFLIPRTMで検出可能である。この方法は、細胞
内のcAMPレベルの同時測定に使用することができ、Gi及びGq型のG-タンパク質に
結合するG-タンパク質結合受容体へのリガンドの効果を測定するスクリーニング
アッセイとして使用することができる。
【図１５】 異なる用量のフォルスコリンに予め暴露したときの、透過性にされたCHO/PKAc
-F64L-S65T-GFPから消失した蛍光の用量-応答関係。
【図１６】 ヒトのインスリン受容体と、EGFPで標識したヒトのPKCβ1とを安定して発現す
るCHO細胞を、顕微鏡で検査した。一連の細胞が各濃度において経時的に画像形
成され、用量-応答が得られた。蛍光変化は刺激の4分間でAUCとして算出した。
画像から以下のデータが抽出された： 全画像：細胞とバックグラウンドを含む全体画像の強度変化の単なる分析。 単細胞：5個の独立した細胞をバックグラウンド補償の後に分析した。分析は細胞
全体について行った。 細胞質：上記と同じ5個の細胞をバックグラウンド補償の後に分析した。分析は
核近傍の細胞質の小さい領域について行った。 結論：ヒトPKCβ1-EGFPの再分布は、各細胞のサブ領域を分析した場合にのみ検
出可能である。この事象は、画像の連続を映画のようにして見たときに明らかに
見ることができる。しかしながら、全画像の蛍光変化または全細胞の蛍光変化が
分析されると、再分布は検出されない。
【図１７】 ヒトのインスリン受容体と、EGFPで標識したヒトのPKCβ1とを安定して発現す
るCHO細胞を、FLIPRTMで検査した。6個の異なるウェルを各濃度について経時的
に画像形成し、用量-応答を得た。蛍光変化は5分間の刺激でAUCとして算出した
。 結論：約50−100,000個の細胞を含む全部の細胞が照射され、単細胞または細胞
下構造物を解像するのに必要な解像度よりもはるかに低い解像度で検出器により
画像形成されるという事実にもかかわらず、ヒトPKCβ1-EGFPの再分布はFLIPRTM 機器において検出可能である。この現象は、図16の顕微鏡によるデータから明確
に予測することはできない。
【図１８】 インスリン受容体とヒトNFkB-GFPタンパク質ハイブリッドとを安定して発現す
るCHO細胞を、種々の濃度のIL-1で1時間刺激し、次いで低浸透性緩衝液(TRIS-塩
基 10mM、MgCl2 2mM、PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオライド) 0.5mM、p
H7.4)で洗浄し、顕微鏡に置いた。一連の画像を0.05％のトリトンX-100の添加中
に得て、その後、穏やかに混合して短時間インキュベートする。処理により細胞
膜が破壊され、後に核に転位するNFkB-GFPの画分が残るが、細胞質のある量のプ
ローブはより迅速に細胞を離れ、迅速に周囲の培地に無限に希釈される(焦点が
合わなくなる-プローブからの全蛍光のこの部分はそれによって喪失される)。こ
の処理前後の所定の時点で、全画像についての全強度値を抽出した。各実験を標
準化するために、後の値を先の値で割ると、より多いNFkBが核に転位されており
、それによって透過後の全蛍光に寄与している細胞に高い比率が認められる。 結果：このプロトコルは、細胞質から核への蛍光プローブの転位又は核から細胞
質への転位を示す可能性がある良好な例である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１１月１日（２０００．１１．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｃ ４Ｂ０６３ 33/483 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ ４Ｂ０６５ // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｍｏｒｋｈｏｊ Ｂｙｇａｄｅ 28，ＤＫ −2860 Ｓｏｂｏｒｇ ＤＥＮＭＡＲＫ (72)発明者 スカッダー，カート，マーシャル デンマーク、ディケイ−2830 ヴィルム、 ラヴェンデルハーヴェン 70 (72)発明者 ビョーン，サラ，ペターゼン デンマーク、ディケイ−2800 リングビ ィ、クランペンボルグヴェイ 102 (72)発明者 サストラップ，オレ デンマーク、ディケイ−3460 ビルケラッ ド、ビルクヴェイ 37 (72)発明者 ハーゲル，グリス デンマーク、ディケイ−2791 ドラガー ル、ハレヴァンゲット 109 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 EA01 EA06 FA02 FA03 JA02 KA02 KA09 LA02 LA03 2G045 BB20 BB29 BB51 CB01 FA16 FB02 FB12 GC15 2G054 AA08 BB08 CA21 CE02 EA03 EA07 FA19 4B024 AA11 CA04 CA07 CA09 DA02 DA12 FA10 GA11 GA18 HA13 4B029 AA07 AA21 AA23 BB07 BB11 CC03 FA15 4B063 QA01 QA05 QQ07 QQ08 QQ13 QQ20 QR56 QR57 QR66 QR76 QR77 QR80 QR82 QS03 QS24 QS36 QS39 QX02 4B065 AA72X AA90X AA91X AA93X AA94X AB01 AC14 AC20 BA02 BC41 BD50 CA46

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 機械的に無傷であるか、又は透過性化生細胞における細胞
    応答に対する影響に関する量的情報を入手するための方法であって、細胞中に存
    在し、影響の程度に関連して再分布され得る、及び/又は影響の程度に関連して
    再分布され得る成分によってモジュレートされ得る発光団から発せられる空間の
    分散光中の変化を、蛍光強度での変化を測定するよう設計した装置によって測定
    される光強度の変更として記録することからなる方法。
  2. 【請求項２】 細胞下成分への影響又は影響の結果に対する細胞応答の程
    度を示す量的情報が、関連する特定の影響の既知の程度に対して同様に記録され
    た応答又は結果に基づく所定の較正にしたがって記録された変化から引き出され
    る、請求項１による方法。
  3. 【請求項３】 影響が、機械的に無傷であるか又は透過性化生細胞と化学
    物質との接触、及び/又は機械的に無傷であるか又は透過性化生細胞と化学物質
    とのインキュベーションからなる請求項１又は２による方法。
  4. 【請求項４】 細胞が、空間制限内に含まれる細胞群からなる請求項１〜
    ３のいずれかによる方法。
  5. 【請求項５】 細胞が、複数の空間制限内に含まれる細胞の複数の群から
    なる請求項１〜４のいずれかによる方法。
  6. 【請求項６】 細胞が、定量的に同じであるが、異なる影響に付されてい
    る複数の細胞群からなる請求項１〜５のいずれかによる方法。
  7. 【請求項７】 細胞が、定量的に異なるが、同じ影響に付されている複数
    の細胞群からなる請求項１〜５のいずれかによる方法。
  8. 【請求項８】 複数の空間制限が、一次元又は二次元のアレイ検出器によ
    って同時に測定され、それにより、複数の空間制限がアレイ検出器に画像化され
    、アレイ検出器中の検出ユニット(ピクセル)の個々のサブセットが、1個及び複
    数の空間制限のうちの1個のみから、空間制限の1つから画像を受けるピクセルか
    らのシグナルを組合わせたいずれかひとつの空間制限からのシグナルを測定する
    請求項１〜７のいずれかによる方法。
  9. 【請求項９】 検出器がリニアダイオードアレイである請求項８による方
    法。
  10. 【請求項１０】 検出器がビデオカメラである請求項８による方法。
  11. 【請求項１１】 検出器が電荷転移素子である請求項８による方法。
  12. 【請求項１２】 電荷転移素子が電荷結合素子である請求項８による方法。
  13. 【請求項１３】 複数の空間制限全てが、測定操作中に同時に照明される請
    求項１〜１２のいずれかによる方法。
  14. 【請求項１４】 個々の空間制限が、測定される時間中にのみ１回照明され
    る請求項１〜１２のいずれかによる方法。
  15. 【請求項１５】 照明が、測定される空間制限の幾つか又は全てにわたるラ
    スター様式でスキャンされるレーザーで生じ、照明が測定プロセスにとっては測
    定領域にわたって時間的かつ空間的に一様な連続的なものとなるように、スキャ
    ンが測定プロセスより実質的に早い速度で行われる、請求項１〜１４のいずれか
    による方法。
  16. 【請求項１６】 空間制限が、共通の担体に１以上のアレイで配置される空
    間制限である請求項１〜１５のいずれかによる方法。
  17. 【請求項１７】 空間制限が、マイクロタイター型のプレートにおけるウエ
    ルである請求項１６による方法。
  18. 【請求項１８】 空間制限が、細胞が存在する基質上で限定される範囲であ
    る請求項１〜１７のいずれかによる方法。
  19. 【請求項１９】 範囲が、範囲を明確にするパターンにおける基質上の細胞
    の存在によって確立される範囲である請求項１８による方法。
  20. 【請求項２０】 範囲が、細胞に適用されるか、又は細胞と接触するような
    影響の空間パターンによって確立される範囲である請求項１８による方法。
  21. 【請求項２１】 記録が一連の時点で行われ、一連の記録の最初の時点の後
    しばらくしてから影響が及ぼされ、記録が、例えば0.1秒〜1時間、好ましくは1
    〜60秒、より好ましくは1〜30秒、特に1〜10秒の所定の時間間隔で、1秒〜12時
    間、例えば10秒〜12時間、例えば10秒〜1時間、例えば60秒〜30分もしくは20分
    の時間をかけて行われる請求項１〜２０のいずれかによる方法。
  22. 【請求項２２】 影響が及ぼされる前の時点と、その後の時点の2つの時点
    で記録がなされる請求項２１による方法。
  23. 【請求項２３】 細胞を、影響を及ぼした後の時点(応答が有意であるよう
    に予定した時点)で固定し、後の任意の時間に記録する請求項１〜２２のいずれ
    かによる方法。
  24. 【請求項２４】 再分布により蛍光の消光が生じ、消光が蛍光強度の減少と
    して測定される請求項１〜２３のいずれかによる方法。
  25. 【請求項２５】 再分布がエネルギー転移を生じ、エネルギー転移が発光強
    度の変化として測定される請求項１〜２４のいずれかによる方法。
  26. 【請求項２６】 再分布がより多数又はより少数の励起される分子を生じる
    ように、蛍光を励起するのに必要な照明が非同質であり、結果が蛍光強度の変化
    として測定される請求項１〜２４のいずれかによる方法。
  27. 【請求項２７】 記録される光強度が、基礎となる細胞応答の結果としてモ
    ジュレートされる蛍光存続期間、偏光、波長シフト又は他の特性の関数である請
    求項１〜２４のいずれかによる方法。
  28. 【請求項２８】 測定されるべき光が、測定されるべき所望の光成分を選択
    し、他の成分を退けるフィルターを通過する請求項１〜２７のいずれかによる方
    法。
  29. 【請求項２９】 蛍光が、細胞に宿るヌクレオチド配列によってエンコード
    され、かつ発現される発蛍光団から生じる請求項１〜２８のいずれかによる方法
    。
  30. 【請求項３０】 蛍光が、トランスフェクション、インキュベーション、ス
    クレイプローディング、エレクトロポレーションのような細胞に物質を大量にロ
    ーディングするためのいずれか又は種々の技術により細胞に導入された発蛍光団
    から生じる請求項１〜２８のいずれかによる方法。
  31. 【請求項３１】 蛍光が、GFPのような発光ポリペプチドから生じる前記請
    求項のいずれかによる方法。
  32. 【請求項３２】 細胞が、酵母細胞のような真菌細胞；昆虫細胞を含む無脊
    椎動物細胞；及び哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される請
    求項１〜３１のいずれかによる方法。
  33. 【請求項３３】 機械的に無傷であるか又は透過性化生細胞が、30℃かそれ
    以上の温度、好ましくは32〜39℃の温度、より好ましくは35〜38℃の温度、もっ
    とも好ましくは約37℃の温度で、影響が認められる時間のあいだ培養される哺乳
    類細胞である請求項３２による方法。
  34. 【請求項３４】 核酸構築物が、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15及
    び17からなる群から選択される配列を有するDNA構築物、又は同じ融合ポリペプ
    チドをエンコードし得るそれらの変異型もしくはそれらに生物学的に等価な融合
    ポリペプチドである前記請求項のいずれかによる方法。
  35. 【請求項３５】 スクリーニングプログラムとして用いられる請求項１〜３
    ４のいずれかによる方法。
  36. 【請求項３６】 方法が、細胞内シグナル経路に直接又は間接に影響を及ぼ
    し、薬剤として有用な可能性がある生物活性物質の同定用スクリーニングプログ
    ラムであり、その潜在的な生物活性を示す、スクリーンされる物質それぞれの個
    々の測定結果が、細胞内シグナル経路の活性化により分布の変化を受けている、
    生細胞中の空間的に解像した発光再分布の測定に基づいている請求項３５による
    方法。
  37. 【請求項３７】 方法が、細胞内シグナル経路の干渉によって毒性作用を発
    揮する、ここに定義されるような生物毒性物質の同定用スクリーニングプログラ
    ムであり、その潜在的な生物毒性活性を示す、スクリーンされる物質それぞれの
    個々の測定結果が、細胞内シグナル経路の活性化により分布の変化を受けている
    、生細胞中の蛍光プローブの再分布の測定に基づいている請求項３５による方法
    。
  38. 【請求項３８】 蛍光プローブが、ここに定義するシグナル変換経路のバッ
    ク-トラッキングに用いられる請求項１〜３７のいずれかによる方法。
  39. 【請求項３９】 細胞中に存在し、影響の程度に関連して再分布され得る、
    及び/又は影響の程度に関連して再分布され得る成分によってモジュレートされ
    得る発光団から発せられる空間分散光中の変化を、蛍光強度の変更を測定するよ
    う設計した装置によって測定される光強度の変更として記録して得られる、機械
    的に無傷であるか又は透過性化生細胞における細胞応答に対する影響に関する一
    連のデータ。
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