JP2002527455A - Recombination deficient adenovirus vector - Google Patents

Recombination deficient adenovirus vector

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JP2002527455A JP2000576026A JP2000576026A JP2002527455A JP 2002527455 A JP2002527455 A JP 2002527455A JP 2000576026 A JP2000576026 A JP 2000576026A JP 2000576026 A JP2000576026 A JP 2000576026A JP 2002527455 A JP2002527455 A JP 2002527455A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定の宿主細胞条件下で複製し得る組換えアデノウイルスベクターに関する。特に、本発明は、治療的適用および診断的適用を有するＥ１ａ領域に対する改変を含むアデノウイルスを提供する。本発明のベクターは、新生物細胞において複製かつ溶解し得る。このベクターは、必要に応じて、特異的複製機能または標的化機能を損なうようにゲノムに対する改変を含み得る。本発明はまた、このようなベクターの薬学的処方物を提供する。本発明はさらに、このようなベクターを使用する方法を提供する。本発明はさらに、ベクターを調製する方法を提供する。 (57) Abstract The present invention relates to a recombinant adenovirus vector capable of replicating under specific host cell conditions. In particular, the present invention provides adenoviruses that include modifications to the E1a region with therapeutic and diagnostic applications. The vectors of the invention can replicate and lyse in neoplastic cells. The vector may optionally include modifications to the genome to impair specific replication or targeting functions. The invention also provides pharmaceutical formulations of such vectors. The invention further provides methods for using such vectors. The invention further provides a method for preparing a vector.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の背景） 前初期遺伝子Ｅ１ａおよび初期遺伝子Ｅ１ｂをコードするアデノウイルスＥ１
領域は、アデノウイルスの生活環において重要な役割を果たし、そして感染細胞
が細胞周期の進行、分化およびプログラムされた細胞死（アポトーシス）を調節
する能力の妨げの原因である。Ｅ１ａ遺伝子産物は感染細胞を刺激して（通常は
分化され、そして休止される）、ウイルスＤＮＡ複製が生じ得るように細胞周期
のＳ期に進行させる。正常細胞は通常、ｐ−５３依存性アポトーシスの活性化に
より、細胞周期進行の予定外の刺激（Ｅ１ａまたは他の有糸***因子により）に
応答する。しかし、ウイルス感染の状況において、Ｅ１ａ産物は、アポトーシス
を刺激しない。なぜなら、Ｅ１領域遺伝子の産物であるＥ１ｂは、アポトーシス
の有効なインヒビターであるからである。従って、ウイルス感染の初期段階の間
に、Ｅ１ａおよびＥ１ｂの遺伝子産物は、感染細胞においてある意味で腫瘍形成
性状態をもたらすように協同する。この状態は、有効なウイルスＤＮＡ複製およ
び生成可能な感染サイクルに必要である。アデノウイルスＥ１ａ領域の活性の全
範囲は、Ｂａｙｌｅｙ，Ｓ．およびＭｙｍｒｙｋ，Ｊ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ
．ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５：４２５−４４４に記載される。アデノウイルス
生物学の総合的な概説については、Ｓｈｅｎｋ，Ｔ．（１９９６）Ｆｉｅｌｄｓ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版：２１１１頁〜２１４８頁を参照のこと。BACKGROUND OF THE INVENTION Adenovirus E1 encoding immediate early gene E1a and early gene E1b
Regions play an important role in the adenovirus life cycle and are responsible for the impaired ability of infected cells to regulate cell cycle progression, differentiation and programmed cell death (apoptosis). The E1a gene product stimulates infected cells (usually differentiated and quiesced) to progress to the S phase of the cell cycle so that viral DNA replication can occur. Normal cells normally respond to unscheduled stimuli of cell cycle progression (by E1a or other mitotic factors) by activating p-53-dependent apoptosis. However, in the context of a viral infection, the E1a product does not stimulate apoptosis. This is because E1b, a product of the E1 region gene, is an effective inhibitor of apoptosis. Thus, during the early stages of viral infection, the gene products of E1a and E1b cooperate to produce a tumorigenic state in infected cells in some sense. This condition is necessary for effective viral DNA replication and the infection cycle that can be produced. The full spectrum of activity of the adenovirus E1a region is described in Bayley, S .; And Mymryk, J. et al. (1994) Int. J
. of Oncology 5: 425-444. For a comprehensive review of adenovirus biology, see Shenk, T .; (1996) Fields
Virology, 3rd edition: pages 2111-2148.

【０００２】 Ｅ１ゲノム配列は、３６ｋｂのアデノウイルスゲノムの最も右側の末端に位置
する。主なＥ１ａ ｍＲＮＡは、複製の初期段階の間に、２つの顕著なｍＲＮＡ
（１３Ｓおよび１２Ｓとよばれる）に差次的にスプライスされる。この１３Ｓお
よび１２Ｓは、それぞれ、２８９Ｒおよび２４３ＡＡタンパク質を生じる（添付
図面の図９を参照のこと）。２８９Ｒおよび２４３Ｒのタンパク質は、より大き
なタンパク質に固有の４６アミノ酸の内部配列によってのみ異なる。Ｅ１ａ初期
転写は、１１Ｓ、１０Ｓおよび９Ｓとよばれる、３つの他のｍＲＮＡにスプライ
スされ、これらは、それぞれ、２１７Ｒ、１７１Ｒ、および５５Ｒのタンパク質
をコードする。これらのｍＲＮＡは、タンパク質を作製するように伝えるが、感
染の初期において効率的に作製されず、２８９Ｒおよび２４３Ｒのタンパク質が
、ウイルスの生活環の間にＥ１ａの主要な機能を実行するようである。Ｅ１ｂ遺
伝子転写はまた、差次的にスプライスされて、２２Ｓ、１４．５Ｓ、および１３
ＳおのｍＲＮＡを生じる。これらの各々は、２つのオープンリーディングフレー
ムを含む。これらのオープンリーディングフレームのうちの１つは、全てのメッ
セージに共通し、そして１７９Ｒのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡに依存し
て、他のオープンリーディングフレームは、８４Ｒ、９３Ｒ、１５５Ｒおよび４
９６Ｒのタンパク質を生じる。Ｅ１ｂタンパク質のうち、１７６Ｒおよび４９６
Ｒのタンパク質（これらはまた、それぞれ、Ｅ１ｂ １９ＫおよびＥ１ｂ ５５
Ｋとよばれる）は、最も顕著であり、かつ最も欲得長づけられている。[0002] The E1 genomic sequence is located at the far right end of the 36 kb adenovirus genome. The major E1a mRNA has two prominent mRNAs during the early stages of replication.
(Referred to as 13S and 12S). The 13S and 12S give rise to the 289R and 243AA proteins, respectively (see FIG. 9 of the accompanying drawings). The 289R and 243R proteins differ only by an internal sequence of 46 amino acids that is unique to the larger proteins. E1a early transcription is spliced into three other mRNAs, called 11S, 10S and 9S, which encode 217R, 171R, and 55R proteins, respectively. These mRNAs signal to make proteins but are not efficiently made early in infection, and the 289R and 243R proteins appear to perform key functions of E1a during the viral life cycle. . E1b gene transcripts are also differentially spliced into 22S, 14.5S, and 13S.
It produces S mRNA. Each of these contains two open reading frames. One of these open reading frames is common to all messages and encodes a 179R protein. Depending on the mRNA, the other open reading frames are 84R, 93R, 155R and 4R.
This results in a protein of 96R. Of the Elb proteins, 176R and 496
R proteins (these are also E1b 19K and E1b 55, respectively)
K) is the most prominent and the most prolonged.

【０００３】 Ｅ１ａおよびＥ１ｂの遺伝子産物は、生成性の感染サイクルにおいて重要な役
割を果たして、ウイルス複製のための感染細胞を調製し、そしてウイルス特異的
プロセスを調節する。Ｅ１ａおよびＥ１ｂの産物は、本質的な酵素的活性を有さ
ないが、多くの細胞性タンパク質と相互作用することによりそれらの機能を実行
すると考えられている。Ｅ１ａタンパク質は、広範な細胞性タンパク質と会合し
、これらの細胞性タンパク質としては、ｐ４００、ｐ３００、ｃＡＭＰ応答性転
写結合タンパク質（ＣＢＰ）、ｐ１３０、ｐ１０７、ｐＲｂ、サイクリンＡ、ｃ
ｄｋ２およびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）が挙げられる。マッピング研究
を用いて、Ｅ１ａタンパク質における細胞性タンパク質結合ドメインおよび機能
的ドメインが比較されてきた（例えば、図１０を参照のこと）。Ｅ１ａによる細
胞周期進行の刺激は、２４３および２８９Ｒのタンパク質に共通なアミノ末端ド
メインにおける３つの領域にマッピングされた（Ｈｏｗｅら（１９９０）ＰＮＡ
Ｓ ８７：５８８３−５８８７）。３つの領域は、一般的にアミノ末端ドメイン
、保存領域１（ＣＲ１）および保存領域２（ＣＲ２）といわれる。このアミノ末
端ドメインおよびＣＲ１は、ｐ３００／ＣＢＰを含む多くのタンパク質を結合す
るために必要である。ｐ３００／ＣＢＰは、細胞増殖および分化に影響を及ぼし
ている遺伝子転写の補活性因子であると考えられている。Ｅ１ａにより細胞周期
調節に必要な第３のＥ１Ａ領域は、ＣＲ２であり、ＣＲ２は、ｐＲｂ、ｐ１０７
およびｐ１３０を含む関連細胞周期レギュレーターのｐＲｂファミリーの公知の
メンバーと会合するために必要である。[0003] The E1a and E1b gene products play an important role in the productive infection cycle, preparing infected cells for virus replication and regulating virus-specific processes. The products of E1a and E1b have no intrinsic enzymatic activity, but are thought to perform their functions by interacting with many cellular proteins. The E1a protein associates with a wide range of cellular proteins, including p400, p300, cAMP-responsive transcription binding protein (CBP), p130, p107, pRb, cyclin A, c
dk2 and TATA binding protein (TBP). Cellular protein binding and functional domains in the E1a protein have been compared using mapping studies (see, eg, FIG. 10). Stimulation of cell cycle progression by E1a has been mapped to three regions in the amino-terminal domain common to the 243 and 289R proteins (Howe et al. (1990) PNA.
S 87: 5883-5887). The three regions are commonly referred to as the amino-terminal domain, conserved region 1 (CR1) and conserved region 2 (CR2). This amino-terminal domain and CR1 are required to bind many proteins, including p300 / CBP. p300 / CBP is believed to be a co-activator of gene transcription affecting cell proliferation and differentiation. The third E1A region required for cell cycle regulation by E1a is CR2, where CR2 is pRb, p107
And required to associate with known members of the pRb family of related cell cycle regulators, including p130.

【０００４】 ｐＲｂファミリーメンバーは、Ｅ２Ｆクラスの転写因子に結合することにより
細胞周期を調節し、次いで細胞周期の相転移に必要な遺伝子の発現を調節する。
ｐ３００およびｐＲｂファミリーメンバーの結合は、これらのタンパク質が細胞
周期進行を抑制するの能力を不活化するようであり、そしてこのことは、Ｅ１ａ
が、休止細胞を細胞周期に進行させることを誘導する主要な機構であるようであ
る。この仮定を支持する、多くの一連の証拠が蓄積されている。例えば、ｐＲｂ
と会合することにより、Ｅ１ａタンパク質は、Ｅ２Ｆ−ｐＲｂ複合体を破壊し、
Ｅ２Ｆを遊離させて、細胞周期のＳ期に進行させる遺伝子発現を刺激する。ｐ３
００がどのように細胞増殖を調節するかは正確にはわかっていないが、ｐ３００
は、分化した表現型を維持するために必要とされ、そしてｐ３００の阻害は、最
終分化をブロックし得る遺伝子の発現を調節することが公知である。さらに、ｐ
３００と会合するが、ｐＲｂの結合を欠如することは、やはりｐＲｂ−Ｅ２Ｆ複
合体の破壊をもたらすｐＲｂのリン酸化および細胞周期進行を刺激し得る（Ｗａ
ｎｇら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１１：４２５３−４２６５）。[0004] pRb family members regulate the cell cycle by binding to transcription factors of the E2F class, which in turn regulate the expression of genes required for cell cycle phase transition.
The binding of p300 and pRb family members appears to inactivate the ability of these proteins to suppress cell cycle progression, and that E1a
Seems to be the major mechanism that induces resting cells to progress through the cell cycle. A large body of evidence has accumulated to support this assumption. For example, pRb
By associating with E1, the E1a protein disrupts the E2F-pRb complex,
E2F is released to stimulate gene expression that advances into the S phase of the cell cycle. p3
It is not exactly known how 00 regulates cell growth, but p300
Is required to maintain a differentiated phenotype, and inhibition of p300 is known to regulate the expression of genes that can block terminal differentiation. Furthermore, p
, But lacking pRb binding, can stimulate pRb phosphorylation and cell cycle progression, also resulting in disruption of the pRb-E2F complex (Wa
ng et al. (1991) Mol. Cell. Bio. 11: 4253-4265).

【０００５】 Ｅ１ａによる予定外のＤＮＡ合成の誘導は、感染宿主細胞により感知される細
胞ストレスである。感染細胞は、ｐ５３により通常は媒介されるアポトーシスを
誘導することにより応答する。ｐ５３は、広範な種々の細胞ストレスに応答して
活性化され、これらの細胞ストレスとしては、ＤＮＡ損傷、低酸素症およびＥ１
ａを含む有糸***性癌遺伝子が挙げられる。生成性のウイルス感染は、感染細胞
がプログラムされた細胞死の状況におかれる場合には生じ得ず、従って、ウイル
スは、少なくとも感染サイクルの初期段階では、Ｅ１ｂ １９Ｋおよび５５Ｋの
産物の生成により、アポトーシスを阻害するように進化してきた（Ｅ１ｂによる
アポトーシスの調節の概説については、Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．，１９９８，Ｓｅｍｉ
ｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：，５０３−５１３を参照のこと）。Ｅ
１ｂ １９Ｋは、Ｅ１ａ誘導性アポトーシスの主要なインヒビターであると見な
されている。なぜなら、Ｅ１ｂ １９Ｋは、単独で、Ｅ１ａ誘導性アポトーシス
を、Ｅ１ｂ ５５Ｋ単独より効率的に阻害するからである。Ｅ１ｂ １９Ｋは、
２つの異なる機構によりアポトーシスを阻害する。第１に、Ｅ１ｂ １９Ｋは、
アポトーシス促進性（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ）Ｂｃｌ−２ファミリーメンバ
ーであるＢａｘ、Ｎｂｋ／ＢｉｋおよびＢＮＩＰ３と会合し、そしてこれらのタ
ンパク質がアポトーシスを誘導する能力を阻害する。第２に、Ｅ１Ｂ １９Ｋタ
ンパク質は、ＦＡＤＤおよびＣＥＤ４のような因子（これらは、通常、アポトー
シスのためにカスパーゼを活性化するように作用する）と相互作用することによ
りアポトーシスを阻害し得る。Ｅ１ｂ ５５Ｋタンパク質は結合して、ｐ５３が
転写のアクチベーターとして作用する能力を阻害し、従って、Ｅ１Ｂ １９Ｋタ
ンパク質がｐ５３依存性アポトーシスを不活化する能力を増大させる。[0005] The induction of unscheduled DNA synthesis by E1a is a cellular stress that is perceived by infected host cells. Infected cells respond by inducing apoptosis normally mediated by p53. p53 is activated in response to a wide variety of cellular stresses, including DNA damage, hypoxia and E1
a including mitotic oncogenes. Productive viral infection cannot occur if the infected cells are in a state of programmed cell death, and therefore, the virus, at least in the early stages of the infection cycle, will produce E1b 19K and 55K products, Has evolved to inhibit apoptosis (for a review of the regulation of apoptosis by Elb, see White, E., 1998, Semi.
nars in Virology 8 :, 503-513). E
1b 19K is considered to be a major inhibitor of E1a-induced apoptosis. Because E1b 19K alone inhibits E1a-induced apoptosis more efficiently than E1b 55K alone. E1b 19K is
Inhibits apoptosis by two different mechanisms. First, E1b 19K is
It associates with the proapoptotic Bcl-2 family members Bax, Nbk / Bik and BNIP3 and inhibits the ability of these proteins to induce apoptosis. Second, the E1B 19K protein can inhibit apoptosis by interacting with factors such as FADD and CED4, which usually act to activate caspases for apoptosis. The E1b 55K protein binds and inhibits the ability of p53 to act as an activator of transcription, thus increasing the ability of the E1B 19K protein to inactivate p53-dependent apoptosis.

【０００６】 細胞周期進行の刺激およびアポトーシス経路を抑制することに加えて、Ｅ１ａ
およびＥ１ｂタンパク質はまた、ウイルスの複製サイクルの間に重要なウイルス
に特異的な役割を果たす。Ｅ１ａタンパク質は、他の初期遺伝子領域であるＥ２
、Ｅ３およびＥ４に加えてＥ１ｂ遺伝子についてのプロモーターの発現を刺激す
ることにより、ウイルスゲノムの協同した発現を開始させる。２８９Ｒ Ｅ１ａ
タンパク質は、初期アデノウイルスプロモーターの転写を主に担い、そしてマッ
ピング研究により、２８９Ｒタンパク質の４６アミノ酸の固有のドメインが初期
ウイルスプロモーターの活性化に主要な役割を果たすことが示された。Ｅ１ｂ
５５Ｋタンパク質はまた、生成性の感染サイクルの間に、重要なウイルスに特異
的な役割を果たす。アデノウイルスＥ１ｂ ５５Ｋ変異体は、後期ウイルスタン
パク質生成を欠損し、そして宿主細胞のタンパク質合成を遮断する。結果的に、
これらの変異体は、多くのヒト細胞株で増殖できない（ＢａｂｉｓｓおよびＧｉ
ｎｓｂｅｒｇ，（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５０：２０２−２１２；Ｂａｂｉ
ｓｓら，１９８５ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５２５５２−２５５８；Ｐｉ
ｄｌｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４７０−４７６；Ｙ
ｅｗら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：７９５−８０５）。さらに、最
近、Ｅ１ｂ５５Ｋが感染細胞における細胞周期制御を改変し得（Ｇｏｏｄｒｕｍ
およびＯｒｎｅｌｌｅｓ，１９９７ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５４８−５６１）
、そしてさらにＥ１ｂ５５ＫがウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼし得る（Ｒｉｄ
ｇｗａｙら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：４０４−４１３）ことが示
唆された。In addition to stimulating cell cycle progression and suppressing apoptotic pathways, E1a
The E1b protein also plays an important virus-specific role during the viral replication cycle. The E1a protein is located in another early gene region, E2
, E3 and E4, as well as the promoter for the E1b gene, to initiate cooperative expression of the viral genome. 289R E1a
The protein is primarily responsible for transcription of the early adenovirus promoter, and mapping studies have shown that a unique domain of 46 amino acids of the 289R protein plays a major role in activation of the early virus promoter. E1b
The 55K protein also plays an important virus-specific role during the productive infection cycle. The adenovirus E1b 55K mutant lacks late viral protein production and blocks host cell protein synthesis. as a result,
These mutants cannot grow on many human cell lines (Babiss and Gi)
nsberg, (1984) J. Am. Virol. 50: 202-212; Babi
ss et al., 1985 Mol. Cell. Biol. 52552-2558; Pi
dler et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 470-476; Y
ew et al. (1990) Virology 179: 795-805). Furthermore, recently, E1b55K may alter cell cycle control in infected cells (Goodrum)
And Ornelles, 1997 J .; Virol. 71: 548-561).
And even E1b55K can affect viral DNA replication (Rid
gway et al. (1997) Virology 237: 404-413).

【０００７】 Ｅ１ｂ ５５Ｋ機能を排除することによりｐ５３欠損細胞中で選択的に複製し
、そしてこれを殺傷するアデノウイルスの設計において、Ｅ１ｂ ５５Ｋタンパ
ク質がｐ５３を結合する能力を利用する試みが行われてきた。１９９７年１０月
１４日発行のＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，米国特許第５，６７７，１７８号を参照のこ
と。このベクターは、ＯＮＹＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより商品開
発中である。特定のベクター、ＯＮＹＸ−Ｏ１５は、ｐ５５コード配列に欠失を
含む。このことにより、ｐ５３を結合し得るＥ１ｂ５５Ｋ産物の発現が妨げられ
、そしてｐ５３欠損細胞におけるウイルスの優先的な複製が生じると主張されて
いる。しかし、以下に示したデータに加えて、多くの報告は、ｐ５３欠損腫瘍細
胞株に対するＥ１ｂ ５５Ｋウイルスの複製特異性に疑問を投げかけている。Ｇ
ｏｏｄｒｕｍおよびＯｒｎｅｌｌｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５
４８−５６１では、Ｅ１ｂ ５５Ｋタンパク質が、細胞周期によるウイルス複製
に負わされた増殖制限を救済すること、およびＥ１ｂ ５５Ｋ変異体ウイルスが
複製する能力は、ｐ５３の状態により左右されないことが示唆された。さらに、
他の研究では、ｐ５３とＥ１ｂ ５５Ｋの間の相互作用が、効率的なウイルス複
製のために必要であることが示唆された（Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９７）Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ２３７：４０４−４１３）。以下に示したデータは、Ｅ１ｂ ５５
Ｋ変異ウイルスが正常細胞におけるウイルス増殖を欠損するが、ｐ５３の状態に
拘わらず種々の腫瘍細胞株においてウイルス増殖を欠損することを実証すること
によって、これらの観察を拡大する。これらの観察とともに、Ｅ１ｂ ５５Ｋ変
異ウイルスは、全ての細胞型で増殖欠損性であり、そして選択的細胞殺傷に関し
てｐ５３欠損腫瘍細胞を標的にしないことを示唆する。従って、腫瘍細胞を特異
的に標的にする複製コンピテントアデノウイルスベクターが必要である。[0007] In the design of adenoviruses that selectively replicate in and kill p53-deficient cells by eliminating E1b 55K function, attempts have been made to exploit the ability of the E1b 55K protein to bind p53. Was. See McCormick, U.S. Pat. No. 5,677,178, issued Oct. 14, 1997. This vector is under commercial development by ONYX Pharmaceuticals. A particular vector, ONYX-O15, contains a deletion in the p55 coding sequence. This allegedly prevents expression of the E1b55K product capable of binding p53 and results in preferential replication of the virus in p53 deficient cells. However, in addition to the data presented below, many reports have questioned the replication specificity of the E1b 55K virus against p53 deficient tumor cell lines. G
oodrum and Ornelles et al. (1997) J. Am. Virol. 71: 5
48-561 suggested that the E1b 55K protein rescues the growth restriction imposed by cell cycle virus replication, and that the ability of the E1b 55K mutant virus to replicate is independent of p53 status. further,
Other studies have suggested that the interaction between p53 and E1b 55K is required for efficient viral replication (Ridgway et al. (1997) Vir.
237: 404-413). The data shown below are for E1b 55
We extend these observations by demonstrating that the K mutant virus lacks virus growth in normal cells, but lacks virus growth in various tumor cell lines regardless of p53 status. Together with these observations, it is suggested that the E1b 55K mutant virus is growth deficient in all cell types and does not target p53 deficient tumor cells for selective cell killing. Therefore, there is a need for a replication competent adenovirus vector that specifically targets tumor cells.

【０００８】 選択的に複製するベクターの考案の代替は、Ｅ１機能の徹底的な除去を含む、
複製欠損アデノウイルスベクターの使用である。詳細には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３の
除去および部分的Ｅ４欠失を含むベクターが、外因性トランスジーンを送達する
ために用いられている。このようなベクターは、ｐ５３遺伝子を標的細胞に送達
するために用いられている。ｐ５３欠損（ｐ５３変異またはｐ５３ヌル）腫瘍細
胞における外因性に投与された野生型ｐ５３の発現は、その腫瘍細胞においてｐ
５３媒介アポトーシスを誘導し得ることが実証されている。ｐ５３の送達のため
のこのようなウイルスベクターは、目下、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎおよびＩｎｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで開発中である。また
、これらのベクターは、ヒトでの治療適用に関して受容可能な毒物学プロフィー
ルおよび治療効力が実証された。そしてこれらのベクターは、ｐ５３関連悪性疾
患の処置に関してヒトにおいて第ＩＩ相臨床試験中である。[0008] Alternatives to the devising of selectively replicating vectors include exhaustive removal of E1 function.
The use of replication defective adenovirus vectors. In particular, vectors containing E1, E2, E3 removal and partial E4 deletion have been used to deliver exogenous transgenes. Such vectors have been used to deliver the p53 gene to target cells. Expression of exogenously administered wild-type p53 in p53-deficient (p53-mutated or p53-null) tumor cells is
It has been demonstrated that 53-mediated apoptosis can be induced. Such viral vectors for delivery of p53 are currently available from Schering Corporation.
Under development at ion and Introgen Corporation. Also, these vectors have demonstrated acceptable toxicological profiles and therapeutic efficacy for therapeutic applications in humans. And these vectors are in phase II clinical trials in humans for the treatment of p53-related malignancies.

【０００９】 複製欠損ベクターおよび選択的に複製するベクターは、少なくとも理論的には
、臨床医に懸念される設計的欠点を有する。複製欠損ベクターは、患者において
制御できずに増殖することがないので、これらは理論的に、より魅力的な安全プ
ロフィールを有する。しかし、有効な腫瘍除去は、かなり大多数の腫瘍細胞が感
染されることを必要とするので、治療有効性を確実にするために、実質的なモル
過剰のベクターが通常用いられる。選択的に複製するベクターは、患者において
複製し、そして潜在的に変異して十分に複製能力のあるベクターを形成する能力
によって、安全性の観点からより問題であると考えられる。しかし、このウイル
スが特定の条件下で増殖する天然の能力を維持することにより、これらのベクタ
ーが周囲の腫瘍細胞に伝播することが可能になる。ベクター自体が複製し得るの
で、より低い初回用量のこのようなベクターが必要とされる。これは、免疫学的
観点ならびにこのような薬剤の製造における経済的理由から好ましい。[0009] Replication-defective and selectively replicating vectors have, at least in theory, design drawbacks that are of concern to clinicians. Since replication deficient vectors do not grow uncontrollably in patients, they theoretically have a more attractive safety profile. However, effective tumor removal requires that a fairly large number of tumor cells be infected, so that a substantial molar excess of vector is usually used to ensure therapeutic efficacy. Selectively replicating vectors are likely to be more problematic from a safety perspective due to their ability to replicate in a patient and potentially mutate to form a fully replicable vector. However, maintaining the natural ability of the virus to grow under certain conditions allows these vectors to spread to surrounding tumor cells. Lower initial doses of such vectors are required, as the vectors themselves can replicate. This is preferred for immunological reasons as well as for economic reasons in the manufacture of such a medicament.

【００１０】 それゆえ、当該分野には、認識された安全性問題と取り組みつつ、一方では増
加した治療指数を提供する、選択的に複製するベクターについての必要性がある
。本発明は、ベクターが、急速に増殖する、分化しないまたは分化した細胞にお
いて優先的に複製するように、特定のＥ１ａ改変を含む、選択的に複製するアデ
ノウイルスベクターを提供することにより、これらの問題を解決する。本発明は
また、このようなベクターを含む薬学的処方物を提供する。本発明はまた、この
ようなベクターを用いることにより、腫瘍細胞を正常細胞の集団から除去する方
法を提供する。[0010] Therefore, there is a need in the art for a selectively replicating vector that addresses recognized safety issues while providing an increased therapeutic index. The present invention provides for selectively replicating adenoviral vectors, including certain E1a modifications, such that the vectors replicate preferentially in rapidly proliferating, non-differentiating or differentiated cells. Solve a problem. The invention also provides pharmaceutical formulations containing such vectors. The present invention also provides a method for removing tumor cells from a population of normal cells by using such a vector.

【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、Ｅ１ａ ＣＲ３ドメインのトランス作用性機能を維持しながら、Ｅ
１ａ遺伝子産物がｐ３００／ＣＢＰおよび／または関連タンパク質、ならびにＲ
ｂタンパク質ファミリーに結合する能力を排除するようにＥ１ａコード配列に改
変を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。このＥ１ａタンパク質は、
ｐＲｂに加えてｐ３００／ＣＢＰと会合して、野生型アデノウイルスに感染した
通常は、休止した分化細胞における分化および細胞増殖制御経路をダウンレギュ
レートする。Ｅ１ａによるこれらの細胞性調節タンパク質の結合は、生成性アデ
ノウイルス感染を必要とする感染細胞において、ある意味で腫瘍形成性状態を生
じる。本発明は、増殖休止した細胞および／または分化細胞とは対照的に、細胞
調節経路を脱調節（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅ）するＥ１ａ機能を低下させることに
より、急速に***する脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）細胞（例え
ば、腫瘍細胞）を標的とすることを意図する。これらの構築物は、腫瘍細胞のよ
うな細胞型において優先的に複製し、ここで細胞増殖および分化経路は、破壊さ
れる。本発明はさらに、薬学的処方物およびその使用方法を提供する。本発明は
また、このようなベクターおよび処方物を作製する方法を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION [0011] The present invention provides E1a CR3 domain trans-acting
1a gene product is p300 / CBP and / or related protein;
Recombinant adenovirus vectors comprising modifications to the E1a coding sequence to eliminate the ability to bind to the b protein family are provided. This E1a protein is
In association with pRb plus p300 / CBP, it downregulates the differentiation and cell growth control pathways in normally quiescent differentiated cells infected with wild-type adenovirus. Binding of these cellular regulatory proteins by E1a results in a tumorigenic state in infected cells in need of a productive adenovirus infection. The present invention provides for rapidly dividing de-differentiated cells (e.g., by reducing E1a function, which deregulates cell regulatory pathways, as opposed to growth-quiescent and / or differentiated cells). Tumor cells). These constructs replicate preferentially in cell types such as tumor cells, where cell proliferation and differentiation pathways are disrupted. The present invention further provides pharmaceutical formulations and methods of using the same. The present invention also provides methods for making such vectors and formulations.

【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、選択的に複製する組換えアデノウイルスを、新生物細胞に汚染され
た正常細胞の集団に投与することにより、この細胞の集団中のこの新生物細胞を
除去する方法を提供する。この選択的に複製する組換えアデノウイルスは、１つ
以上のｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよび１つ以上のＲｂタンパク質
ファミリーメンバーのタンパク質への結合が欠如しているＥ１ａ遺伝子産物を産
生するようにＥ１ａコード配列に対する改変を有するが、Ｅ１ａ ＣＲ３ドメイ
ンのトランス作用機能を保持する改変２８９Ｒタンパク質を発現する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [0012] The present invention provides for the administration of a selectively replicating recombinant adenovirus to a population of normal cells contaminated with neoplastic cells so that the new adenoviruses in this population of cells are administered. A method for removing biological cells is provided. The selectively replicating recombinant adenovirus has an E1a coding sequence so as to produce an E1a gene product that lacks binding of one or more p300 protein family members and one or more Rb protein family members to the protein. Expresses a modified 289R protein that has a modification to

【００１３】 用語「新生物細胞」は、正常な細胞増殖制御の独立により特徴付けられる異常
な増殖表現型を示す細胞である。新生物細胞は任意の所定の時点で複製される必
要はないので、用語、新生物細胞は、活発に複製されているかまたは一時的な非
複製休止状態（Ｇ１またはＧ０）にあり得る細胞を含む。新生物細胞の局所的集
団は新生物と呼ばれる。新生物は、悪性または良性であり得る。悪性新生物はま
た、ガンとも呼ばれる。用語、ガンは、本明細書において用語、腫瘍と互換可能
に用いられる。新生物形質転換とは、正常細胞の新生物細胞、しばしば腫瘍細胞
への転換をいう。The term “neoplastic cell” is a cell that displays an abnormal growth phenotype characterized by independence of normal cell growth control. The term neoplastic cell includes cells that are either actively replicating or may be in a transient, non-replicating quiescent state (G1 or G0), as neoplastic cells need not be replicated at any given time. . The local population of neoplastic cells is called a neoplasm. Neoplasms can be malignant or benign. Malignant neoplasms are also called cancers. The term cancer is used herein interchangeably with the term tumor. Neoplastic transformation refers to the transformation of normal cells into neoplastic cells, often tumor cells.

【００１４】 用語「選択的に複製する」は、別の表現型状態に対する１つの表現型状態で、
細胞において優先的な複製をし得る組換えアデノウイルスベクターをいう。異な
る表現型状態の例としては、所定の細胞型における新生物表現型対正常表現型が
挙げられる。「選択的に複製する」ベクターは、腫瘍細胞で実質的な細胞死を誘
導するのに十分だが正常細胞では誘導しない投薬レベルで、同じ型の組織細胞の
非形質転換正常細胞において、同じウイルスよりも少なくとも１０倍効率的に、
新生物細胞中で複製し、そして新生物細胞を殺傷する。投薬の効果は、与えられ
た組換えアデノウイルスが優先的な新生物細胞殺傷を生じるか否かを決定する場
合、重要な項目である。なぜなら、そのゲノムが改変された程度にかかわらず、
ほとんどの任意のアデノウイルスは、細胞傷害性であることが公知のヘキソンな
どのウイルスタンパク質の存在の効果に単に起因して、十分に高用量で、細胞傷
害性であるからである。同様に、たとえ、科学論文がＥ１変異アデノウイルスを
「複製欠陥」（これは、このウイルスが、Ｅ１欠失を補い得る細胞系統の非存在
下で、絶対的に複製し得ないことを示唆する）と呼び得ても、このようなウイル
スは、より正確には「複製が減弱された」と記載される。なぜなら、全Ｅ１領域
の欠失を有するウイルスでさえ、特に周期化している細胞または迅速に***して
いる細胞においては、ある程度、複製するからである。Ｍｕｌｌｉａｇａｎの観
察によると、以下の通りである（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６〜
９３２９： 「Ｅ１領域の発現が、複製に必要な他のウイルス遺伝子産物の発現に影響を与
えることが示されている（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆ
ｉｅｌｄｓ編（Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）第６０章を引用）と
はいえ、Ｅ１遺伝子の発現がウイルス複製に必要とされるのは絶対的ではないよ
うである。Ｅ１欠損ウイルスの初期の特徴付けは、高い感染多重度では、Ｅ１領
域が複製に関して重要でなかったことを実証する（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ
（１９７９）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７６（８）：３６６５−３６６９を引用）。」
その結果、ウイルス用量の効果は、ウイルスが本当に選択的に複製しているウイ
ルスであるか否かを決定する際には無視できない。Ｅ１の広範な欠失を有するウ
イルスは、選択性を有するようである。なぜなら、それらは特定の条件下および
特定の投薬量下で複製するからである。例えば、ｄｌ３１２アデノウイルス（Ｊ
ｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７９、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７６（８）：３６６
５〜３６６９）は、Ｅ１ａ機能全ての排除を生じるヌクレオチド４４８〜１３４
９の欠失を含む。２８９Ｒタンパク質をコードする配列は、ヌクレオチド５６０
で開始し、ほぼヌクレオチド１５４２で終わる。ＣＲ３トランス作用ドメインを
含む全２８９Ｒタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、この構成に完全に
存在しない。ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋが観察したように、ｄｌ３１２がＨｅ
Ｌａ細胞（形質転換された頸ガン細胞である）を感染するために用いられる場合
、「早期領域２、３、または４に対応するＲＮＡ種は、検出されなかった」こと
は、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子をトランス作用する原因であるＥ１ａ２８９Ｒ
タンパク質のトランス作用機能が存在しないことを明白に示す。しかし、より高
い用量で（多重感染）は、このウイルスの複製が見られた。さらにＨｅＬａ細胞
は、周期化する新生物的に形質転換された細胞（ただし、ｐＲｂ１０５について
は遺伝型として陽性）であり、ＨＰＶ １８Ｅ６およびＥ７機能（ｐＲｂ１０５
を分解し、従ってＨｅＬａ細胞をｐ１０５Ｒｂについて表現型を陰性にする）を
保有することを覚えておかねばならない。The term “selectively replicate” is one phenotypic state relative to another phenotypic state,
Refers to a recombinant adenovirus vector that can replicate preferentially in a cell. Examples of different phenotypic states include a neoplastic versus a normal phenotype in a given cell type. A "selectively replicating" vector is more effective in inducing substantial cell death in tumor cells, but not in normal cells, at dose levels that are higher in non-transformed normal cells of the same type of tissue cells than in the same virus. Is also at least 10 times more efficient,
It replicates in neoplastic cells and kills neoplastic cells. The effect of dosing is an important factor when determining whether a given recombinant adenovirus will cause preferential neoplastic cell killing. Because, regardless of the extent to which the genome has been modified,
Most adenoviruses are cytotoxic at sufficiently high doses simply due to the effects of the presence of viral proteins such as hexons, which are known to be cytotoxic. Similarly, even if scientific papers have described an E1 mutant adenovirus as "replication defective" (this suggests that the virus cannot absolutely replicate in the absence of a cell line that could compensate for the E1 deletion) ), But such viruses are more accurately described as "replicated". This is because even viruses with deletions of the entire E1 region replicate to some extent, especially in cycling or rapidly dividing cells. According to Mulliagan's observations, (1990, Science 260: 926-
9329: "Expression of the E1 region has been shown to affect the expression of other viral gene products required for replication (Horwitz, M. Virology, BNF).
(See Raven, New York, 1990, Chapter 60), however, it does not seem absolute that expression of the E1 gene is required for viral replication. Early characterization of the E1-deficient virus demonstrates that at high multiplicity of infection, the E1 region was not important for replication (Jones and Shenk)
(1979) PNAS (USA) 76 (8): 3665-3669). "
As a result, the effect of viral dose cannot be ignored in determining whether a virus is indeed a selectively replicating virus. Viruses with extensive deletions of E1 appear to be selective. Because they replicate under certain conditions and under certain dosages. For example, the dl312 adenovirus (J
ones and Shenk, 1979, PNAS (USA) 76 (8): 366.
5-3669) are nucleotides 448-134 that result in the elimination of all Ela functions.
Contains 9 deletions. The sequence encoding the 289R protein has nucleotide 560
And ends approximately at nucleotide 1542. The nucleotide sequence encoding the entire 289R protein, including the CR3 trans-action domain, is completely absent in this configuration. As observed by Jones and Shenk, dl312 was converted to He
When used to infect La cells (which are transformed cervical cancer cells), "no RNA species corresponding to early regions 2, 3, or 4 was detected," indicating that E2, E3 and E1a289R responsible for transacting the E4 gene
It clearly shows that the trans-acting function of the protein is absent. However, at higher doses (multiple infection), replication of this virus was seen. In addition, HeLa cells are cycling neoplasticly transformed cells (but genotype positive for pRb105), and have HPV 18E6 and E7 function (pRb105
(Which renders HeLa cells phenotypically negative for p105Rb).

【００１５】 さらに、Ｅ１変異アデノウイルスが真に選択的であるか否かを決定するため、
同じ組織細胞型の正常細胞、および転換していない細胞株または不死化した細胞
株（既に周期化している）と比較して、腫瘍細胞中でこのウイルスが複製する能
力を評価することが必要である。これは、Ｅ１ａアデノウイルスタンパク質の機
能の本発明者らの理解に基づいて明白である。Ｅ１ａタンパク質の主な目的は、
正常に休止状態の細胞に細胞周期を強制することである。ウイルス感染を伴うこ
の最初の工程は、静止細胞におけるウイルス複製に重要である。なぜなら、アデ
ノウイルスは、効率的なウイルス複製を達成するためには、Ｓ期にのみ存在する
因子を必要とするからである。しかし、細胞がすでに細胞周期を有していれば（
例えば、不死化した細胞株または転換した細胞株）、Ｅ１ａ欠失の効果は、ある
程度不明確である。従って、新生物細胞選択性を真に評価するためには、正常細
胞対新生物細胞を用いた比較がなされることが必要である。さらに、野生型ベク
ターはまた、感染後早期に、正常細胞に対して腫瘍細胞中で選択的に複製するよ
うである。なぜなら、この細胞は、既に周期化しているからである。しかし、一
旦このウイルスが細胞周期を刺激すると、この明白な選択性は時間と共に減じる
。結果的に、選択性が測定される感染後の時間は、正常細胞においてこの初回の
複製の遅延を回避するために十分でなければならない。Further, to determine whether the E1 mutant adenovirus is truly selective,
It is necessary to assess the ability of this virus to replicate in tumor cells compared to normal cells of the same tissue cell type, and non-converted or immortalized cell lines (already cycled). is there. This is evident based on our understanding of the function of the E1a adenovirus protein. The main purpose of the E1a protein is
To force the cell cycle on a normally dormant cell. This first step involving viral infection is important for virus replication in quiescent cells. This is because adenovirus requires factors present only in the S phase to achieve efficient virus replication. However, if the cell already has a cell cycle (
For example, immortalized or transformed cell lines), the effects of E1a deletion are somewhat unclear. Therefore, in order to truly assess neoplastic cell selectivity, a comparison using normal versus neoplastic cells needs to be made. In addition, wild-type vectors also appear to replicate selectively in tumor cells relative to normal cells early after infection. This is because the cells are already cycling. However, once the virus stimulates the cell cycle, this apparent selectivity diminishes over time. Consequently, the time after infection at which selectivity is measured must be sufficient to avoid this initial replication delay in normal cells.

【００１６】 通常用いられるパラメーターであるＥＤ50（これは、５０％の細胞の細胞死を
誘導するために十分な用量として規定される）は、比較の適切な基礎を提供する
。ウイルスのＥＤ50は、代表的なインビトロ用量漸増実験によって容易に決定さ
れ得る。比較の最も一貫した基礎を確実にするために、ＥＤ50は、比較される細
胞型の間の感染性のバリエーションおよび任意のアッセイバリエーションの効果
を最小にするために、ウイルスコントロールに対して最も適切に表される。その
結果、単位のない比ＥＤ50（ウイルス）／ＥＤ50（コントロール）を用いて、細
胞におけるウイルスの相対毒性が表され、そして「相対毒性指数」または「ＲＴ
Ｉ」と呼ばれる。本発明の目的のために、所定のウイルスの「選択性係数（ｓｅ
ｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）」は、以下の比：ＲＴＩ（腫瘍細胞）／ＲＴ
Ｉ（正常細胞）によって表現される。選択的に複製するベクターは、少なくとも
１０および好ましくはより大きい選択性係数を有する。例えば、選択的に複製す
るベクターｄｌ０１／０７は、Ａ５４９細胞（肺腫瘍細胞株）中で複製し、そし
てＡ５４９細胞を殺傷する能力について、ならびに適切なウイルスコントロール
を用いて正常な肺内皮細胞において、評価された。これらの実験の結果は、添付
の図面の図１１に示される。以下の表は、示されるデータをまとめている：The commonly used parameter, ED 50, which is defined as the dose sufficient to induce 50% cell death, provides a suitable basis for comparison. The ED 50 of a virus can be readily determined by representative in vitro dose escalation experiments. To ensure the most consistent basis for comparison, the ED 50 is most appropriate for virus controls to minimize the effects of infectivity variations and any assay variations between cell types being compared. Is represented by As a result, the unitless ratio ED 50 (virus) / ED 50 (control) was used to express the relative toxicity of the virus in the cells, and the “relative toxicity index” or “RT
I ". For the purposes of the present invention, the "selectivity factor (se
activity index) is the ratio of: RTI (tumor cells) / RT
I (normal cells). Selectively replicating vectors have a selectivity factor of at least 10 and preferably greater. For example, the selectively replicating vector d101 / 07 can replicate in A549 cells (lung tumor cell line) and kill A549 cells, as well as in normal lung endothelial cells using appropriate virus controls. Was evaluated. The results of these experiments are shown in FIG. 11 of the accompanying drawings. The following table summarizes the data shown:

【００１７】[0017]

【表１】 示されるデータに見られ得るように、ｄｌ３０９（野生型）ウイルスは、本質的
に選択性を保有しない。正常細胞に対して腫瘍細胞にみられる複製のわずかな増
加により、周期化している腫瘍細胞がウイルス複製を容易にすることが予期され
る。さらに、Ｅ１Ｂｄｌ５５Ｋウイルスは、本質的に選択性を保有しない。しか
し、０１／０７／３０９ウイルスは、高い選択性係数（１２５）を保有し、この
ことは、このウイルスが同じ組織学的型の正常細胞に対して腫瘍細胞で、複製に
ついて高い選択性を保有することを実証する。[Table 1] As can be seen in the data shown, dl309 (wild-type) virus has essentially no selectivity. Due to the slight increase in replication seen in tumor cells relative to normal cells, it is expected that cycling tumor cells will facilitate virus replication. In addition, the E1Bdl55K virus has essentially no selectivity. However, the 01/07/309 virus possesses a high selectivity factor (125), which indicates that the virus has high selectivity for replication in tumor cells versus normal cells of the same histological type. Demonstrate that.

【００１８】 選択的に複製するアデノウイルスを獲得するためには、２８９Ｒタンパク質お
よび２４３Ｒタンパク質が、２８９ＲのＣＲ３トランス作用ドメインの機能性を
維持しながら、ｐＲｂ１０５およびｐ３００の両方に結合する能力が検出される
ことが重要である。ＣＲ３ドメインは、２４３Ｒタンパク質が２８９Ｒタンパク
質のトランス作用を有さない場合、Ｅｌａ２８９Ｒポリペプチドにおいてのみ存
在する。２８９Ｒタンパク質のトランス作用の活性を保持することは、効率的な
ウイルス複製について重要である。ＣＲ３ドメインを保持することは重要である
が、それだけでは十分ではない。例えば、Ｗｈｙｔｅら（１９８９）Ｃｅｌｌ
５６：６７〜７５に記載されるｄｌ１０１０ウイルスは、２８９Ｒタンパク質の
アミノ酸２〜１５０の欠失を有し、それらは単一のグリシン残基で置換されてい
る。この欠失は、Ｅ１ａ２８９Ｒ遺伝子産物のｐ３００およびｐＢＲ１０５結合
ドメインを排除し、そしてＣＲ３ドメインを保持する（ただし、ＣＲ３機能にお
いて、アミノ酸の欠失の効果は、Ｊｅｌｓｍａら（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１６３：４９４〜５０２に記載されるｐｍ１１２０およびｐｍ１１２２の点変
異ウイルスの観点から、Ｖａｌ１４７およびＰｒｏ１５０の欠失のせいで疑問で
あり得る）。しかし、ｄｌ１０１０ウイルスは、ＣＲ３ドメインのトランス作用
の機能を保持していない。なぜなら、２８９Ｒタンパク質に対する欠失は広範す
ぎるからである。Ｊｅｌｓｍａらは、２８９Ｒタンパク質のアミノ酸４〜１３８
のより少ない欠失（おそらく間違いなくＣＲ３ドメイン内のＶａｌ４７残基およ
びＰｒｏ１５０残基を破壊しない）を含むＥ１ａ変異体（ｄｌ１１１９）を、そ
のトランス作用の活性について、試験することにより、このことを確認している
。この結果は参考文献の表２に示されており、そしてこの著者らのコメントは、
このＥ１ａ分子が「本質的にトランス作用する能力がない」ことを示している。
結果的に、ＣＲ３ドメインの上流のＥ１ａ領域における大きい欠失は、ＣＲ３ド
メインが発現されている場合でさえ、それが機能的でないようにコンフォメーシ
ョン的に破壊されている変異２８９Ｒ遺伝子産物を生じる。To obtain a selectively replicating adenovirus, the ability of the 289R and 243R proteins to bind to both pRb105 and p300 while maintaining the functionality of the CR3 trans-action domain of 289R is detected. It's important to. The CR3 domain is only present in the Ela289R polypeptide when the 243R protein does not have the trans action of the 289R protein. Retaining the trans-acting activity of the 289R protein is important for efficient viral replication. While retaining the CR3 domain is important, it is not enough. For example, Whyte et al. (1989) Cell
The dl1010 virus described at 56: 67-75 has a deletion of amino acids 2-150 of the 289R protein, which has been replaced with a single glycine residue. This deletion eliminates the p300 and pBR105 binding domains of the E1a289R gene product and retains the CR3 domain (although the effect of amino acid deletions on CR3 function was determined by Jelsma et al. (1988) Virology.
163: 494-502, in view of the pm1120 and pm1122 point mutant viruses, which may be questionable due to the deletion of Val147 and Pro150). However, the dl1010 virus does not retain the trans-acting function of the CR3 domain. This is because the deletion for the 289R protein is too wide. Jelsma et al., Amino acids 4-138 of the 289R protein
This was confirmed by testing an E1a mutant (dl1119) containing a fewer deletions (probably not destroying the Val47 and Pro150 residues in the CR3 domain) for its trans-acting activity. are doing. The results are shown in Table 2 of the reference, and the authors' comments
This indicates that this E1a molecule is "essentially incapable of trans-acting".
Consequently, large deletions in the E1a region upstream of the CR3 domain, even when the CR3 domain is expressed, result in a mutant 289R gene product that is conformationally disrupted such that it is not functional.

【００１９】 同様に、ｐ３００およびｐ１０５ Ｒｂ結合がそれ自体におけるそれぞれの排
除として排除されることが選択性を付与するには十分であることが必須である。
例えば、ｐ３００結合（ｄｌ１１０１）およびｐＢＲ結合（ｄｌ１１０７）に欠
失を有する複製コンピテントなアデノウイルスの能力を評価するためにＣＰＥア
ッセイが行われた。このアデノウイルスは、ＤＬＤ−１腫瘍細胞およびＭＲＣ−
９「正常」細胞株を殺傷するｄｌ０１／０７アデノウイルス（両方の機能を欠失
する）と比較された。適切なコントロールウイルスｒＡｄ ＣＯＮ（すなわち、
全Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域の欠失を含むＺＺＣＢ）、ｄｌ３０９（非必須Ｅ３領
域に欠失を含む組換えウイルス）、およびＥ１Ｂ５５Ｋ（Ｅ１ｂ５５ｋの５５ｋ
結合領域に欠失を含む組換えウイルス）が含まれた。この結果は、添付の図面の
図１２に示される。示されたデータから見られ得るように、等価用量（粒子濃度
）で、ｄｌ１１０１ウイルスおよびｄｌ１１０７ウイルスは、野生型ウイルスと
本質的に同じく効率的に、正常細胞（ＭＲＣ９）を殺傷し得た。類似の結果が腫
瘍細胞（ＤＬＤ−１）に関して得られた。しかし、正常細胞株および腫瘍細胞株
においてｄｌ０１／０７ウイルスの能力を比較する場合、ｄｌ０１／０７ウイル
スは、野生型ウイルスと同じく効率的に腫瘍細胞を殺傷したが、Ｅ１欠損コント
ロールウイルスと等価の用量でのみ正常細胞に毒性であった。さらに、ｄｌ０１
／０７ウイルスは、ｄｌ１１０１およびｄｌ１１０７ウイルスと比較したとき、
正常細胞に対して実質的に毒性が低かった。結果的に、選択性は、Ｒｂ１０５結
合の欠失のみによってではなく、ｐ３００結合の排除によっても決定される。Similarly, it is essential that the elimination of the p300 and p105 Rb bonds as their respective exclusions is sufficient to confer selectivity.
For example, CPE assays were performed to evaluate the ability of replication competent adenoviruses to have deletions in p300 binding (dl1101) and pBR binding (dl1107). This adenovirus is used for DLD-1 tumor cells and MRC-
9 compared to the dl01 / 07 adenovirus, which kills both "normal" cell lines. A suitable control virus rAd CON (ie,
ZZCB with deletion of the entire E1a and E1b regions), dl309 (recombinant virus with deletion in non-essential E3 region), and E1B55K (55k of E1b55k
(Recombinant virus containing a deletion in the binding region). The result is shown in FIG. 12 of the accompanying drawings. As can be seen from the data shown, at equivalent doses (particle concentration), the dl1101 and dl1107 viruses were able to kill normal cells (MRC9) essentially as efficiently as the wild-type virus. Similar results were obtained for tumor cells (DLD-1). However, when comparing the capacity of the dl01 / 07 virus in normal and tumor cell lines, the dl01 / 07 virus killed tumor cells as efficiently as the wild-type virus, but at a dose equivalent to the E1-deficient control virus. Was only toxic to normal cells. Furthermore, dl01
/ 07 virus was compared to the dl1101 and dl1107 viruses.
It was substantially less toxic to normal cells. Consequently, selectivity is determined not only by deletion of Rb105 binding, but also by elimination of p300 binding.

【００２０】 ｐ３００およびｐＲｂ結合の排除を獲得するために必要なＥ１ａ２８９Ｒコー
ド配列における欠失は、Ｅ１ａ ２８９Ｒタンパク質の二次構造および三次構造
の重大な破壊を防ぐため可能な限り最小限であることが好ましい。ｐ３００結合
を除去するためには、２８９Ｒのｐ３００結合ドメインをコードするＤＮＡ配列
に変異が導入されることが好ましい。ｐ３００結合を除去するためには、Ｃ末端
領域における約３０アミノ酸未満の欠失が好ましいが、より少ない改変が好まし
い。２８９Ｒタンパク質のアミノ酸４〜２５の欠失は、ＣＲ３のトランス作用機
能に影響することなくｐ３００結合を破壊するのに十分である。例えば、約アミ
ノ酸３０〜約アミノ酸４９（ｄｌ１１０３）、そしてより好ましくは３６〜４９
のアミノ酸の欠失が、ｐ３００結合を除去するために、代替的に好ましい。結合
するｐ３００を破壊するために十分な点変異が特に好ましい。例えば、２８９Ｒ
タンパク質における、アルギニンからグリシン（Ａｒｇ２→Ｇｌｙ２）の第２の
アミノ酸点変異は、ｐ３００結合を破壊することが実証されている（例えば、ｐ
ｍ５６３、Ｗｈｙｔｅら（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：６７〜７５を参照のこと
）。同様に、ｐＲｂ１０５結合の除去については、最小限の改変が好ましい。ア
ミノ酸１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびアミノ酸１２４〜１２７（ｄｌ１
１０８）のようなｐＲｂ１０５結合ドメインにおける選択的アミノ酸の除去が好
ましい。アミノ酸１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）の欠失は、それが２８９Ｒタ
ンパク質のｐ１０７結合活性を保持しているという点で、特に好ましい。The deletions in the E1a289R coding sequence required to obtain elimination of p300 and pRb binding should be as minimal as possible to prevent significant disruption of the secondary and tertiary structure of the E1a289R protein. preferable. In order to eliminate p300 binding, it is preferable to introduce a mutation into the DNA sequence encoding the p300 binding domain of 289R. To remove p300 binding, deletions of less than about 30 amino acids in the C-terminal region are preferred, but fewer modifications are preferred. Deletion of amino acids 4-25 of the 289R protein is sufficient to break p300 binding without affecting the trans-acting function of CR3. For example, from about amino acid 30 to about amino acid 49 (dl1103), and more preferably from 36 to 49.
Of amino acids is alternatively preferred to remove p300 binding. Point mutations sufficient to disrupt the binding p300 are particularly preferred. For example, 289R
A second amino acid point mutation from arginine to glycine (Arg2 → Gly2) in proteins has been demonstrated to disrupt p300 binding (eg, p
m563, see Whyte et al. (1989) Cell 56: 67-75). Similarly, for removal of pRb105 binding, minimal modification is preferred. Amino acids 111-123 (dl1107) and amino acids 124-127 (dl1
Preferred is the removal of selective amino acids in the pRb105 binding domain, such as 108). Deletions of amino acids 111-123 (dl1107) are particularly preferred in that they retain the p107 binding activity of the 289R protein.

【００２１】 ｄｌ０１／０７／３０９ウイルスは本発明の特に好ましい実施形態である。な
ぜなら、それはＥ１ａ ２８９Ｒタンパク質のｐ３００およびｐＲｂ１０５結合
領域を欠失するが、ｐ１０７に結合する２８９Ｒタンパク質の能力を保持してい
るからである。遊離のＥ２Ｆの上昇したレベルは、細胞周期を誘導する主要な因
子である。ｐ１０７結合ドメインを保持することにより、２８９Ｒタンパク質は
、シークエスター（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）ｐ１０７に結合し、Ｅ２Ｆの細胞内レ
ベルのわずかな上昇を生じる。この低レベルのＥ２Ｆは、正常細胞においてそれ
自体の細胞周期進行を開始するのに不十分であるが、腫瘍細胞において、ｐ１０
７に結合する２８９Ｒタンパク質の能力は、細胞周期を誘導するのに必要なＥ２
Ｆ閾値レベルを超えるＥ２Ｆのレベルの上昇を生じ、これによりウイルスが複製
する能力を増強する。これは、腫瘍細胞におけるウイルスの細胞傷害性の増強を
生じるが正常細胞へのウイルスの毒性には影響しない。The dl01 / 07/309 virus is a particularly preferred embodiment of the present invention. Because it lacks the p300 and pRb105 binding regions of the E1a 289R protein, but retains the ability of the 289R protein to bind to p107. Elevated levels of free E2F are major factors inducing the cell cycle. By retaining the p107 binding domain, the 289R protein binds to sequencer p107, resulting in a slight increase in intracellular levels of E2F. This low level of E2F is insufficient to initiate its own cell cycle progression in normal cells, but in tumor cells p10
The ability of the 289R protein to bind to E7 is necessary for E2 required to induce the cell cycle.
This results in elevated levels of E2F above the F threshold level, thereby enhancing the ability of the virus to replicate. This results in enhanced cytotoxicity of the virus in tumor cells but does not affect the toxicity of the virus on normal cells.

【００２２】 用語、「組換えアデノウイルス」は、用語「組換えアデノウイルスベクター」
と同義であり、そして細胞に感染し得るアデノウイルス属のウイルス（そのゲノ
ムは、従来の組換えＤＮＡ技術によって改変されている）をいう。用語、アデノ
ウイルス科は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのア
デノウイルスの亜属を含むがこれらに限定されないマストアデノウイルス属の動
物アデノウイルスを総称的にいう。詳細には、ヒトアデノウイルスとしては、Ａ
−Ｆ亜属（ｓｕｇｅｎｅｒａ）ならびにその個々の血清型が挙げられ、個々の血
清型およびＡ−Ｆ亜属は、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型
、５型、６型、７型、８型、９型、１０型、１１型（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１
Ｐ）、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、１
９ａ型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、
２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型
、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３
型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型および９１型を含むがこれらに限
定されない。用語ウシアデノウイルスは、ウシアデノウイルス１型、２型、３型
、４型、７型および１０型を包含するがこれらに限定されない。用語イヌアデノ
ウイルスは、イヌ１型（ＣＬＬ株、Ｇｌａｘｏ株、ＲＩ２６１株、Ｕｔｒｅｃｔ
株、Ｔｏｒｏｎｔｏ ２６−６１株）および２型を包含するがこれらに限定され
ない。用語ウマアデノウイルスは、ウマ１型および２型を包含するがこれらに限
定されない。用語ブタアデノウイルスは、ブタ３型および４型を包含するがこれ
らに限定されない。用語、組換えアデノウイルスはまた、キメラ（または多量体
でさえある）ベクター（すなわち、１つより多いウイルスサブタイプ由来の相補
的コード配列を用いて構築されたベクター）を含む。例えば、Ｆｅｎｇら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６〜８７０を参照のこと。
本発明の好ましい実施形態において、このアデノウイルスはヒトアデノウイルス
の血清型２または５である。The term “recombinant adenovirus” refers to the term “recombinant adenovirus vector”
Synonymous with, and refers to a virus of the genus Adenovirus that can infect cells, the genome of which has been modified by conventional recombinant DNA technology. The term adenoviridae collectively refers to animal adenoviruses of the genus Mastadenovirus, including but not limited to human, bovine, ovine, equine, canine, porcine, murine and simian subgenus of adenovirus. Specifically, human adenoviruses include A
-F subgenus (Sugenera) and its individual serotypes, wherein the individual serotypes and the AF subgenus are human adenovirus types 1, 2, 3, 4, 4a, 5, Type 6, Type 7, Type 8, Type 9, Type 10, Type 11 (Ad11A and Ad11
P), 12 type, 13 type, 14 type, 15 type, 16 type, 17 type, 18 type, 19 type, 1 type
9a type, 20 type, 21 type, 22 type, 23 type, 24 type, 25 type, 26 type, 27 type,
28 type, 29 type, 30 type, 31 type, 32 type, 33 type, 34 type, 34a type, 35 type, 35p type, 36 type, 37 type, 38 type, 39 type, 40 type, 41 type, 42 type , 43
Molds, including, but not limited to, molds 44, 45, 46, 47, 48 and 91. The term bovine adenovirus includes, but is not limited to, bovine adenovirus types 1, 2, 3, 4, 7, and 10. The term canine adenovirus is defined as dog type 1 (CLL strain, Glaxo strain, RI261 strain, Utract.
Strain, Toronto 26-61 strain) and type 2. The term equine adenovirus includes, but is not limited to, horse types 1 and 2. The term porcine adenovirus includes, but is not limited to, swine types 3 and 4. The term recombinant adenovirus also includes chimeric (or even multimeric) vectors (ie, vectors constructed with complementary coding sequences from more than one virus subtype). For example, Feng et al., Na
See Nature Biotechnology 15: 866-870.
In a preferred embodiment of the invention, the adenovirus is human adenovirus serotype 2 or 5.

【００２３】 用語、「改変」は、組換えアデノウイルスベクターのゲノム構造における変化
をいう。このような改変は、その基質への結合においてタンパク質欠損を生成す
るためのアミノ酸コード配列における欠失および／または変化を含む。例えば、
Ｅ１ａ−１２Ｓおよび１３Ｓタンパク質のＲｂ−１０５結合ドメインは、アミノ
酸１１１〜１２７内に配置されて特徴付けられている。Ｅ１ａ−１２Ｓおよび１
３Ｓタンパク質のｐ３００結合ドメインは、最初の６９アミノ酸に対して狭い。
Ｅｇａｎら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３９５５〜３９５９
。しかし、アミノ酸２６〜３５は、ｐ３００結合のために必須でないことが示さ
れている。約アミノ酸４〜２５およびアミノ酸３６〜４９由来の１２Ｓおよび１
３Ｓ分子においてｐ３００結合の２つの領域が存在する。１つまたは両方の排除
は、ｐ３００結合を破壊するために十分である。好ましくは、４〜２５領域にお
けるアミノ酸の排除は、ｐ３００結合機能を排除するために使用される。The term “modification” refers to a change in the genomic structure of a recombinant adenovirus vector. Such modifications include deletions and / or changes in the amino acid coding sequence to create a protein deficiency in binding to its substrate. For example,
The Rb-105 binding domain of the E1a-12S and 13S proteins has been characterized located between amino acids 111-127. E1a-12S and 1
The p300 binding domain of the 3S protein is narrow relative to the first 69 amino acids.
Egan et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8: 3595-3959
. However, amino acids 26-35 have been shown to be non-essential for p300 binding. 12S and 1 from about amino acids 4-25 and amino acids 36-49
There are two regions of p300 binding in the 3S molecule. Elimination of one or both is sufficient to disrupt p300 binding. Preferably, elimination of amino acids in the 4-25 region is used to eliminate p300 binding function.

【００２４】 用語「結合の欠損（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、生理
学的条件下において、野生型遺伝子産物の複合体のその基質に対する熱力学的安
定性の５０％未満で複合体を形成する遺伝子産物をいう。例えば、ｐ３００結合
ドメインにおいて欠失を含む１３Ｓ遺伝子産物は、野生型１３Ｓタンパク質の熱
力学的安定性の５０％未満でｐ３００タンパク質に結合する。結合の熱力学的安
定性は、従来のアッセイ技術によって、容易に決定され得、生理学的条件下で平
衡結合定数が決定され得る。The term “deficient in binding” refers to a gene product that forms a complex under physiological conditions with less than 50% of the thermodynamic stability of the complex of the wild-type gene product to its substrate Say. For example, a 13S gene product that contains a deletion in the p300 binding domain binds to the p300 protein with less than 50% of the thermodynamic stability of the wild-type 13S protein. The thermodynamic stability of binding can be readily determined by conventional assay techniques, and the equilibrium binding constant can be determined under physiological conditions.

【００２５】 用語「Ｅ１ａ遺伝子」は、感染後にまず転写される、アデノウイルスゲノムの
最初期遺伝子をいう。ゲノム配列は、９Ｓ、１０Ｓ、１１Ｓ、１２Ｓおよび１３
Ｓのタンパク質をコードする少なくとも５つのｍＲＮＡの転写を示す。１２Ｓお
よび１３Ｓタンパク質は、感染後早期に発現され、一方、９Ｓ、１０Ｓおよび１
１Ｓタンパク質は、アデノウイルスサイクルにおいて後期に発現される。この１
２Ｓおよび１３Ｓタンパク質は、それぞれ２４３アミノ酸および２８９アミノ酸
を有する。Ｅ１ａゲノム配列において、保存領域（「ＣＲ」）−１、ＣＲ２およ
びＣＲ３と呼ばれる、３つの保存領域が存在する。ＣＲ１は、１２Ｓおよび１３
Ｓタンパク質のアミノ酸４１〜８０を示す。ＣＲ２は、１２Ｓおよび１３Ｓ配列
のアミノ酸１２１〜１３９を示す。The term “E1a gene” refers to the immediate early gene of the adenovirus genome, which is first transcribed after infection. Genomic sequences were 9S, 10S, 11S, 12S and 13
2 shows the transcription of at least five mRNAs encoding the S protein. 12S and 13S proteins are expressed early after infection, while 9S, 10S and 1S.
The 1S protein is expressed late in the adenovirus cycle. This one
The 2S and 13S proteins have 243 and 289 amino acids, respectively. In the E1a genomic sequence, there are three conserved regions called conserved regions ("CR")-1, CR2 and CR3. CR1 is 12S and 13
Shows amino acids 41-80 of the S protein. CR2 represents amino acids 121-139 of the 12S and 13S sequences.

【００２６】 「ＣＲ３ドメインのトランス作用機能」は、Ｅ１ａ遺伝子の産物が、Ｅ１ｂお
よびＥ２のようなウイルスサイクルにおいて後期にプロモーターの転写を活性化
する能力をいう。ＣＲ３領域は、１３Ｓタンパク質においてのみ機能的に存在し
、そしてアミノ酸１４０〜１８８を示す。Ｅ１ａ遺伝子産物のトランス作用機能
は、ＣＲ３領域に含まれる。「トランス作用する領域」は、本発明のベクターに
おいて保持され、他のウイルス遺伝子の活性化を可能にし、そして細胞傷害性を
改善する。“CR3 domain trans-acting function” refers to the ability of the E1a gene product to activate transcription of the promoter late in the viral cycle, such as E1b and E2. The CR3 region is functionally present only in the 13S protein and represents amino acids 140-188. The trans-acting function of the E1a gene product is contained in the CR3 region. "Trans-acting regions" are retained in the vectors of the present invention, permitting activation of other viral genes and improving cytotoxicity.

【００２７】 用語「ｐ３００タンパク質ファミリーメンバー」は、ｐ３００およびＣＢＰを
含むＥ１ａのアミノ酸末端に結合するタンパク質をいう。詳細には、ｐ３００は
、トランス作用遺伝子であるＭｙｂおよびＣ／ＥＢＰの活性を同時に活性化する
。Ｍｉｎｋら（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ １７：６６０９〜６６１７。ヒトｐ３００タンパク質は、当該分
野で公知であり、そしてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて登録番号Ｑ
０９４７２として公的に入手可能である。その対応するｍＲＮＡは、登録番号Ｕ
０１８７７（１９９４年６月６日寄託）としてＧｅｎＢａｎｋから入手可能であ
り、そしてＥｃｋｎｅｒら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：８６９〜８８
４において記載されている。The term “p300 protein family member” refers to proteins that bind to the amino acid terminus of E1a, including p300 and CBP. In particular, p300 simultaneously activates the activities of the trans-acting genes Myb and C / EBP. Mink et al. (1997) Molecular and Cellular B.
ology 17: 6609-6617. Human p300 protein is known in the art and has accession number Q in the Swiss-Prot database.
It is publicly available as 09472. The corresponding mRNA has the registration number U
01877 (deposited June 6, 1994) from GenBank, and Eckner et al. (1994) Genes Dev. 8: 869-88
4.

【００２８】 用語「Ｒｂタンパク質ファミリーメンバー」は、網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐ
ｂ１０５）、ｐ１０７およびｐ１３０をいう。網膜芽細胞腫遺伝子は、当該分野
で十分に特徴付けられている。ヒトＲｂのアミノ酸配列は、受託番号１９０９５
９（１９９５年７月１２日寄託）としてＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、そ
してそのｍＲＮＡ配列は受託番号Ｍ１５４００としてＧｅｎＢａｎｋから入手可
能であり、そしてＬｅｅら（１９８８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：６０１７〜６
０２１に記載されている。The term “Rb protein family member” refers to the retinoblastoma gene product (p
b105), p107 and p130. The retinoblastoma gene has been well characterized in the art. The amino acid sequence of human Rb has the accession number 19095
9 (deposited July 12, 1995) from GenBank, and its mRNA sequence is available from GenBank under accession number M15400, and Lee et al. (1988) PNAS (USA) 85: 6017-6.
021.

【００２９】 本発明のベクターの有効性を実証するため、このベクターをまずインビトロ実
験を用いて評価した。以下に示すインビトロ実験は、腫瘍細胞を選択的に破壊す
るベクターの潜在能力を、野生型ウイルスおよびいくつかの他のベクター構築物
と比較して、決定するために設計された。これらの実験の結果は、ガンを含む過
増殖性疾患の処置のための因子としてのこのベクターの潜在能力を決定する。こ
のベクターは、本明細書において実施例１の教示に実質的に従って調製された。
比較に用いられるベクターは以下を含む：野生型アデノウイルス５型（Ａｄ５ｗ
ｔ）、ｄｌ３０９（表現型の野生型５型ヒトアデノウイルス（Ｊｏｎｅｓおよび
Ｓｈｅｎｋ（１９７８）Ｃｅｌｌ １３：１８１〜１８８；ならびにＪｏｎｅｓ
およびＳｈｅｎｋ（１９７９）Ｃｅｌｌ １７：６８３〜６８９）に記載の様に
、特定のＥ３機能を排除するために改変を含む））；変異アデノウイルス（Ｅ１
ｂｄｌ５５Ｋ）（これは、本明細書における実施例２の教示に実質的に従って、
調製した機能的Ｅ１ｂｄｌ５５Ｋタンパク質の産生を排除するＥ１ｂｄｌ５５Ｋ
遺伝子の大部分の欠失を有する）；変異アデノウイルスＥ１ｂｄｌ５５Ｋ／３０
９（これは、Ｅ１ｂ５５Ｋ遺伝子のコード領域に２重の点変異を含み、従ってま
た、Ｅ１ｂ５５Ｋタンパク質の生成を排除する）（ＭｃＬｏｒｉｅら、（１９９
１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４６７〜１４７１）、アデノウイルスに
基づく遺伝子治療ベクターＡＣＮ５３（Ｗｉｌｌｓら（１９９４）Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１０７９〜１０８８）（ここでは、完全Ｅ１領
域は、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ｐ５３遺伝子で置換されている）；なら
びにコントロールベクターＡＣＮ（完全Ｅ１領域欠失を含むが、治療用のトラン
スジーンはコードしない）。To demonstrate the effectiveness of the vector of the present invention, the vector was first evaluated using in vitro experiments. The in vitro experiments described below were designed to determine the potential of the vector to selectively destroy tumor cells in comparison to wild-type virus and some other vector constructs. The results of these experiments determine the potential of this vector as a factor for the treatment of hyperproliferative diseases, including cancer. This vector was prepared herein substantially according to the teachings of Example 1.
Vectors used for comparison include: wild-type adenovirus type 5 (Ad5w
t), dl309 (phenotype wild type 5 human adenovirus (Jones and Shenk (1978) Cell 13: 181-188; and Jones)
And Shenk (1979) Cell 17: 683-689), including modifications to eliminate specific E3 functions)); mutant adenoviruses (E1
bdl55K) (substantially following the teachings of Example 2 herein)
E1bdl55K eliminating production of prepared functional E1bdl55K protein
Mutant adenovirus E1bdl55K / 30 (with most deletions in the gene)
9 (which contains a double point mutation in the coding region of the E1b55K gene and thus also precludes the production of the E1b55K protein) (McLorie et al., (1992)
1) J. Gen. Virol. 72: 1467-1471), an adenovirus-based gene therapy vector ACN53 (Wills et al. (1994) Human.
Gene Therapy 5: 1079-1088) (where the complete E1 region has been replaced with the p53 gene under the control of the CMV promoter); and the control vector ACN (which contains the complete E1 region deletion but is therapeutic Transgenes are not coded).

【００３０】 インビトロにおいて細胞を破壊するベクターの能力は、ベクター構築物による
細胞殺傷を評価するためにＣＰＥアッセイを用いることにより、正常な二倍体線
維芽細胞において、およびいくつかの腫瘍株において、評価される。ＣＰＥアッ
セイは、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３〜３
７６において記載されている。このアッセイは、試験ウイルス構築物のウイルス
粒子の濃度の範囲内で培養中の細胞を感染させる工程、次いで、感染後の時点で
感染した細胞をクリスタルバイオレットで染色して細胞培養増殖基材上に残った
生存可能細胞の数を決定する工程を包含する。複製コンピテントなアデノウイル
ス感染の結果として細胞殺傷は、細胞溶解および増殖基材からの感染細胞の剥落
を生じる。従って、残っている細胞の数は、ウイルス構築物の細胞殺傷能力の定
量的値として用いられ得る。複製について非コンピテントなｐ５３遺伝子送達ベ
クターＡＣＮ５３による細胞殺傷はまた、このアッセイを用いて評価され得る。
複製コンピテントなベクターと対照的に、ＡＣＮ５３による細胞死は、ｐ５３依
存性アポトーシスの結果として多くの腫瘍細胞において生じる。これはまた、増
殖マトリックスからの細胞の剥落を導く。従って、上記のアッセイを使用して、
ｐ５３誘導性アポトーシスによる細胞死と複製コンピテントなベクターでの溶解
による細胞死を比較することが可能である。The ability of the vector to destroy cells in vitro was assessed in normal diploid fibroblasts and in some tumor lines by using a CPE assay to assess cell killing by the vector construct. Is done. The CPE assay is described in Bischoff et al. (1996) Science 274: 373-3.
76. This assay involves infecting cells in culture within a range of virion concentrations of the test virus construct, and then staining the infected cells with crystal violet at a post-infection time point to remain on the cell culture growth substrate. Determining the number of viable cells. Cell killing as a result of replication competent adenovirus infection results in cell lysis and detachment of infected cells from the growth substrate. Thus, the number of cells remaining can be used as a quantitative measure of the cell killing capacity of the viral construct. Cell killing by the p53 gene delivery vector ACN53, which is non-competent for replication, can also be assessed using this assay.
In contrast to replication competent vectors, cell death by ACN53 occurs in many tumor cells as a result of p53-dependent apoptosis. This also leads to detachment of cells from the growth matrix. Thus, using the above assay,
It is possible to compare cell death by p53-induced apoptosis and cell death by lysis with replication competent vectors.

【００３１】 この正常な繊維芽細胞株ＭＲＣ９（ｐ５３＋、ｐＲｂ＋）がこの試験ウイルス
構築物に感染した実験からの代表的な結果を、図４、図５および図６に示す。１
．８×１０7粒子／ｍｌという低濃度で感染したＭＲＣ９細胞において、いくつ
かの細胞の剥離が、ｗｔＡｄ５に感染したＭＲＣ９細胞においてのみ観察された
が、他の構築物に感染したものでは、観察されなかった。１．８×１０8粒子／
ｍｌという感染濃度で、ｗｔＡｄ５に感染したＭＲＣ９細胞は、効率的に破壊さ
れた。そして、このＥ１Ｂｄｌ５５Ｋに感染した細胞において、殺傷の証拠がい
くらか存在した。１．８×１０9粒子／ｍｌという高濃度での感染は、ｗｔＡｄ
５およびＥ１ｄｌ５５Ｋに感染したＭＲＣ９細胞において、ほぼ完全な殺傷を生
じた。細胞の殺傷はまた、１．８×１０8粒子／ｍｌでの感染後のＥ１Ａｄｌ０
１／０７を用いて観察されたが、Ｅ１ｄｌ５５ＫベクターおよびｗｔＡｄ５ベク
ターと比較して減少したレベルで観察された。ｐ５３遺伝子送達のためのＡＣＮ
５３ベクターは、空のベクターコントロールと比較して、ＭＲＣ９細胞に対して
小さい毒性効果しか有さず、そして１．８×１０9粒子／ｍｌという高濃度でし
か、毒性効果を有さなかった。Representative results from experiments in which this normal fibroblast cell line MRC9 (p53 +, pRb +) was infected with the test virus construct are shown in FIGS. 4, 5 and 6. 1
. In MRC9 cells infected at a low concentration of 8 × 10 7 particles / ml, some cell detachment was observed only in MRC9 cells infected with wtAd5, but not in those infected with other constructs. Was. 1.8 × 10 8 particles /
At an infectious concentration of ml, MRC9 cells infected with wtAd5 were efficiently destroyed. And there was some evidence of killing in the cells infected with E1Bdl55K. Infection at concentrations as high as 1.8 × 10 9 particles / ml is due to wtAd
Almost complete killing occurred in MRC9 cells infected with 5 and E1dl55K. Cell killing was also due to E1AdlO after infection at 1.8 × 10 8 particles / ml.
It was observed with 1/07 but at a reduced level compared to the E1dl55K and wtAd5 vectors. ACN for p53 gene delivery
The 53 vector had only a small toxic effect on MRC9 cells compared to the empty vector control, and only at high concentrations of 1.8 × 10 9 particles / ml.

【００３２】 この試験ベクターは、次に、頸部癌株Ｃ３３Ａ（ｐ５３-、ｐＲｂ-）における
細胞殺傷についてのその潜在能力を評価するための使用された。代表的実験の結
果を、図１、図２および図３に示す。１．８×１０9粒子／ｍｌでのＣ３３Ａ細
胞の感染後に、このウイルス構築物すべては、Ｅ１欠陥があるコントロールベク
ターＡＣＮを除いて、細胞の単層全体を効率的に破壊した。１．８×１０8粒子
／ｍｌおよび１．８×１０7粒子／ｍｌという濃度での、ｗｔＡｄ５およびＥ１
Ａｄｌ０１／０７による感染もまた、このＣ３３Ａ単層の完全な破壊を生じた。
しかし、このＥ１Ｂｄｌ５５Ｋベクターは、１．８×１０8粒子／ｍｌでの感染
後の細胞殺傷について、幾分欠陥があり、そして１．８×１０7粒子／ｍｌでの
感染後には、有意に欠陥があった。ｐ５３遺伝子送達のためのＡＣＮ５３ベクタ
ーは、１．８×１０9粒子／ｍｌというこの高い感染レベルを超えると、有意な
細胞死を誘導しなかった。これは、１．８×１０8粒子／ｍｌおよび１．８×１
０7粒子／ｍｌでのこの構築の感染後に残存する、Ｃ３３Ａ細胞の数によって、
示される。This test vector was then used to evaluate its potential for cell killing in cervical cancer line C33A (p53 − , pRb − ). The results of a representative experiment are shown in FIGS. 1, 2 and 3. After infection of C33A cells at 1.8 × 10 9 particles / ml, all of the virus constructs efficiently destroyed the entire monolayer of cells, except for the control vector ACN, which had an E1 defect. WtAd5 and E1 at a concentration of 1.8 × 10 8 particles / ml and 1.8 × 10 7 particles / ml
Infection with Ad101 / 07 also resulted in complete destruction of this C33A monolayer.
However, the E1Bdl55K vector is somewhat defective for cell killing after infection at 1.8 × 10 8 particles / ml and significantly defective after infection at 1.8 × 10 7 particles / ml. was there. ACN53 vector for p53 gene delivery did not induce significant cell death above this high infection level of 1.8 × 10 9 particles / ml. This is 1.8 × 10 8 particles / ml and 1.8 × 1
Remaining after infection of this construct in 0 7 particles / ml, the number of C33A cells,
Is shown.

【００３３】 インビトロでのウイルス増殖について、このベクターをさらに特徴付けるため
に、一パネルの細胞が、この試験構築物に感染され、そしてウイルス複製が、感
染の４８時間後に、Ｈｕｙｇｈｅら（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｈｙ ６：１４０３〜１４１６の手順を使用して、定量的に決定された。
この正常な株ＭＲＣ９（ｐ５３+、ｐＲｂ+）およびＣ３３Ａ（ｐ５３-、ｐＲｂ- ）腫瘍株に加えて評価された細胞株は、肺非小細胞癌株Ｈ３５８（ｐ５３null、
ｐＲｂ+）および肝癌株ＳＫＨｅｐ１（ｐ５３+、ｐＲｂ+）であった。細胞が、
１．８×１０9粒子／ｍｌまたは１．８×１０8粒子／ｍｌのいずれかに感染した
代表的実験の結果を、図３に示す。これらの実験の結果は、Ｅ１ｂｄｌ５５Ｋが
、ｗｔＡｄ５と比較して、すべての細胞株において増殖に関して欠陥があったが
、ＭＲＣ９正常株および肺腫瘍株Ｈ３５８において、最も欠陥があったことを、
示す。このＥ１Ａｄｌ０１／０７構築物は、予期したように、正常なＭＲＣ９細
胞においてウイルス産生について欠陥があるが、Ｃ３３Ａ頸部癌株において、野
生型ウイルスおよびｄｌ３０９ウイルスと同じ程度効率的に複製した。肺癌Ｈ３
５８（ｐ５３null、ｐＲｂ+）細胞および肝細胞癌ＳＫＨｅｐ１（ｐ５３+、ｐＲ
ｂ+）細胞の両方において、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７ウイルスは、ｗｔＡｄ５およ
びｄｌ３０９よりもわずかに低い効率性で複製したが、この構築物は、一貫して
、Ｅ１Ｂｄｌ５５Ｋウイルスよりも効率良く複製した。To further characterize the vector for virus propagation in vitro, a panel of cells was infected with the test construct and viral replication was determined 48 hours after infection by Huygh et al. (1995) Human Gene The The.
raphy 6: Quantitatively determined using the procedure of 1403-1416.
The cell lines evaluated in addition to this normal line MRC9 (p53 + , pRb + ) and C33A (p53 − , pRb − ) tumor lines were the non-small cell lung cancer line H358 (p53 null ,
pRb + ) and the hepatocellular carcinoma strain SKHep1 (p53 + , pRb + ). Cells
The results of a representative experiment infected with either 1.8 × 10 9 particles / ml or 1.8 × 10 8 particles / ml are shown in FIG. The results of these experiments indicate that E1bdl55K was defective in growth in all cell lines compared to wtAd5, but was most defective in MRC9 normal and lung tumor line H358.
Show. This E1Ad101 / 07 construct, as expected, is defective for virus production in normal MRC9 cells, but replicated as efficiently as wild-type and dl309 viruses in the C33A cervical cancer line. Lung cancer H3
58 (p53 null , pRb + ) cells and hepatocellular carcinoma SKHep1 (p53 + , pRb + )
In both b + ) cells, the E1Ad101 / 07 virus replicated slightly less efficiently than wtAd5 and dl309, but this construct consistently replicated more efficiently than the E1Bdl55K virus.

【００３４】 上記の実験の結果を総合すれば、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７ベクターが、正常な細
胞においてよりも腫瘍細胞株において、効率的に細胞殺傷を誘導したこと、およ
びこの腫瘍サプレッサー遺伝子ｐＲｂおよびｐ５３の状態が、このウイルスが腫
瘍細胞において複製する能力に影響しないようであったことを、示した。さらに
、本発明者らの結果は、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７
４：３７３〜３７６の結果と異なる。Ｂｉｓｃｈｏｆｆらは、Ｅ１ｂｄｌ５５Ｋ
ベクターが、ｐ５３欠損細胞株（本明細書にて研究されたＣ３３Ａ癌細胞株を含
む）において、ｗｔＡｄ５と同じ程度効率的に複製したが、ｐ５３＋細胞株にお
いては、複製欠損性であったことを報告した。Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９６）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３〜３７６を参照のこと。本発明者らの結果は、
Ｅ１Ｂｄ５５Ｋ構築物が、正常細胞株および腫瘍細胞株の両方において、細胞増
殖について欠陥があることを、示す。Taken together, the results of the above experiments show that the E1Ad101 / 07 vector induced cell killing more efficiently in tumor cell lines than in normal cells, and the status of the tumor suppressor genes pRb and p53. Showed that this virus did not appear to affect its ability to replicate in tumor cells. In addition, our results are shown in Bischoff et al. (1996) Science 27.
4: different from the results of 373-376. Bischoff et al., E1bdl55K
It was shown that the vector replicated as efficiently as wtAd5 in p53 deficient cell lines (including the C33A cancer cell line studied herein), but was replication deficient in p53 + cell lines. reported. Bischoff et al. (1996)
Science 274: 373-376. Our results are:
9 shows that the E1Bd55K construct is defective for cell proliferation in both normal and tumor cell lines.

【００３５】 本発明のベクターの効力を示すために、本発明のベクターが、頸部癌のインビ
ボモデルにおいて評価された。このマウスモデルは、腫瘍の樹立に基づき、次い
で、本明細書中の実施例３の教示に実質的に従って、上記のベクターで処理され
た。この結果を、以下に提供する表２に示す。To demonstrate the efficacy of the vectors of the present invention, the vectors of the present invention were evaluated in an in vivo model of cervical cancer. This mouse model was treated with the above vector based on tumor establishment and then substantially in accordance with the teachings of Example 3 herein. The results are shown in Table 2 provided below.

【００３６】[0036]

【表２】 表２に示されるデータから理解され得るように、Ｅ１Ａｄｌ０１／０７により例
示されるような本発明のベクターは、インビボでの有効な抗腫瘍活性を示す。さ
らに、この二重欠失（ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｌｅｔｅｄ）Ｅ１Ａｄｌ０１／０７ベ
クターは、その野生型ｄｌ３０９ウイルスとほぼ等しい、腫瘍サイズの減少を達
成したことが、着目されるべきである。これは、この腫瘍の増殖を単に遅くした
だけである、ＡＣＮ５３ベクターおよびＥ１Ｂｄ５５Ｋベクターとかなり対照的
である。[Table 2] As can be seen from the data shown in Table 2, the vectors of the invention as exemplified by E1Ad101 / 07 show potent anti-tumor activity in vivo. Furthermore, it should be noted that this double deleted E1Ad101 / 07 vector achieved a reduction in tumor size approximately equal to its wild-type dl309 virus. This is in sharp contrast to the ACN53 and E1Bd55K vectors, which simply slowed the growth of this tumor.

【００３７】 さらなるインビボ研究がヌードマウスにおいて実施されて、ウイルスの腫瘍内
投与および静脈内全身投与の両方の後の、本発明のベクターの効力が評価された
。第１の研究は、腫瘍内投与されたｄｌ０１／０７ウイルスの効力を評価するた
めの、ＤＬＤ−１腫瘍モデルであった。この研究の結果は、添付の図面のうちの
図１３に示される。示されるデータから理解され得るように、このｄｌ０１／０
７／３０９ウイルスは、野生型ウイルスと少なくとも同程度に（超えない場合で
も）効率的に腫瘍増殖を阻止する際に有効であり、そして、Ｅ１ｂｄｌ５５Ｋウ
イルスよりも有意に良好であった。これらの結果は、このＤＬＤ−１腫瘍が非常
に攻撃的であるので、特に重要である。この第２のモデルは、静脈内注射によっ
て全身に投与される場合に、ｄｌ０１／０７ウイルスの効力を評価するために設
計された。この研究の結果は、添付の図面の図１４に示される。示されるデータ
から理解され得るように、ｄｌ０１／０７ウイルスは、全身投与後に、インビボ
での腫瘍増殖を減少する際に有効である。このウイルスが、どのような標的化改
変が存在しないときにも、全身投与後にこの腫瘍を見出し、そしてこのウイルス
に対するその増殖を遅くし得たという事実は、特に意味がある（ｒｅｌｅｖａｎ
ｔ）。これらの研究を総合すれば、２８９Ｒ ｐ３００結合機能およびｐＲｂ１
０５結合機能の欠失を有する、選択的に複製するウイルスが、腫瘍内投与または
全身投与のいずれかをされた腫瘍の処置において有用であることを、示す。Further in vivo studies were performed in nude mice to evaluate the efficacy of the vectors of the invention after both intratumoral and systemic intravenous administration of the virus. The first study was a DLD-1 tumor model to evaluate the efficacy of intratumorally administered d101 / 07 virus. The results of this study are shown in FIG. 13 of the accompanying drawings. As can be seen from the data shown, this d101 / 0
The 7/309 virus was effective in inhibiting tumor growth at least as efficiently as (if not more than) the wild-type virus, and was significantly better than the E1bdl55K virus. These results are particularly important because this DLD-1 tumor is very aggressive. This second model was designed to evaluate the efficacy of d101 / 07 virus when administered systemically by intravenous injection. The results of this study are shown in FIG. 14 of the accompanying drawings. As can be seen from the data presented, the d101 / 07 virus is effective in reducing tumor growth in vivo after systemic administration. The fact that this virus was able to find this tumor after systemic administration in the absence of any targeting alterations and slow its growth against this virus is particularly significant (relevan
t). Taken together, these studies indicate that the 289R p300 binding function and pRb1
Figure 5 shows that selectively replicating viruses with a lack of 05 binding function are useful in treating tumors that have been administered either intratumorally or systemically.

【００３８】 本発明の好ましい実施において、この組換えアデノウイルスベクターは、アデ
ノウイルス属に由来する。特に好ましいウイルスは、ヒトアデノウイルス２型ま
たは５型に由来する。本発明の好ましい実施において、このベクターは、ヒトア
デノウイルス科に由来する。より好ましいのは、ヒトアデノウイルスサブグルー
プＣ由来のベクターである。最も好ましいのは、ヒトアデノウイルス血清型２型
または５型由来のアデノウイルスベクターである。本発明の最も好ましい実施に
おいて、このウイルスは、ヒトアデノウイルス５型ｄｌ３０９またはｄｌ５２０
由来である。In a preferred practice of the invention, the recombinant adenovirus vector is derived from the genus Adenovirus. Particularly preferred viruses are derived from human adenovirus type 2 or 5. In a preferred practice of the invention, this vector is from the human adenoviridae family. More preferred are vectors derived from human adenovirus subgroup C. Most preferred are adenovirus vectors derived from human adenovirus serotypes 2 or 5. In a most preferred practice of the invention, the virus is human adenovirus type 5 dl309 or dl520.
Origin.

【００３９】 本発明のベクターは、Ｅ１ａコード配列に欠失を有し、１３Ｓコード配列にお
いてｐ３００結合部位およびｐ１０５−Ｒｂ結合部位が除去されている。本発明
の好ましい実施において、ｐ３００結合の欠失は、アミノ酸およそ４〜およそ２
５、またはアミノ酸およそ３６〜およそ４９の除去により示される。本発明の好
ましい実施において、Ｒｂ結合の欠失は、アミノ酸およそ１１１〜１２７、好ま
しくはアミノ酸およそ１１１〜１２３の除去によって、示される。より好ましい
のは、Ｅ１ａ−ｐ３００結合ドメインにおけるこの欠失が、このアデノウイルス
Ｅ１ａ遺伝子産物のアミノ酸４〜２５についてのコドンの欠失を含む、ベクター
である。より好ましいのは、Ｅ１ａ−Ｒｂ結合ドメインにおけるこの欠失が、こ
のアデノウイルスＥ１ａ遺伝子産物のアミノ酸１１１〜１２３についてのコドン
の欠失を含む、ベクターである。あるいは、ｐＲｂ結合は、このＥ１Ａ ２８９
Ｒタンパク質２４３タンパク質のアミノ酸１２４〜１２７を除去するような変異
の導入によって、除去され得る。本明細書中に例示されるような本発明の最も好
ましい実施形態においては、このベクターは、Ｅ１ａ １３Ｓ遺伝子産物のアミ
ノ酸４〜２５および１１１〜１２３の欠失を含む。The vector of the present invention has a deletion in the E1a coding sequence and the p300 binding site and the p105-Rb binding site have been removed from the 13S coding sequence. In a preferred practice of the invention, the deletion of p300 binding is from about 4 to about 2 amino acids.
5, or removal of amino acids from about 36 to about 49. In a preferred practice of the invention, the deletion of Rb binding is indicated by the removal of about amino acids 111 to 127, preferably about amino acids 111 to 123. More preferred is a vector, wherein the deletion in the E1a-p300 binding domain comprises a deletion of the codon for amino acids 4-25 of the adenovirus E1a gene product. More preferred is a vector, wherein the deletion in the E1a-Rb binding domain comprises a deletion of the codon for amino acids 111-123 of the adenovirus E1a gene product. Alternatively, pRb binding can be achieved with this E1A 289
It can be removed by introducing a mutation that removes amino acids 124-127 of the R protein 243 protein. In a most preferred embodiment of the invention as exemplified herein, the vector comprises a deletion of amino acids 4-25 and 111-123 of the E1a 13S gene product.

【００４０】 本発明は、Ｅ１ａ遺伝子産物を生成するようにＥ１ａコード配列に対する改変
を含む、組換えアデノウイルスをさらに提供する。このＥ１ａ遺伝子産物は、１
つ以上のｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよび１つ以上のＲｂタンパク
質ファミリーメンバータンパク質への結合に欠陥があるが、Ｅ１ａ ＣＲ３ドメ
インのトランス作用機能、およびＥ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸およそ
２１９〜およそ２８９（またはＥ１ａ ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸およそ１
７３〜アミノ酸およそ２４３）の欠失を保持する。本発明の好ましい実施におい
て、ｐ３００ファミリーメンバーへの結合の欠失は、Ｅ１ａ ２４３Ｒタンパク
質およびＥ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸４〜２５に対応する欠失か、ま
たはＥ１ａ ２４３Ｒタンパク質およびＥ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸
３８〜６０に対応する欠失を導入することによって、達成される。本発明の好ま
しい実施において、ｐＲｂファミリーメンバーへの結合の欠失は、Ｅ１ａ ２４
３Ｒタンパク質およびＥ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸１１１〜１２３の
除去によって、達成される。あるいは、ｐＲｂファミリーメンバーへの結合の欠
失は、Ｅ１ａ ２４３Ｒタンパク質およびＥ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ
酸１２４〜１２７の除去によって、達成され得る。[0040] The present invention further provides a recombinant adenovirus comprising an alteration to the E1a coding sequence to produce an E1a gene product. This E1a gene product contains 1
Defective binding to one or more p300 protein family members and one or more Rb protein family member proteins, but the trans-acting function of the E1a CR3 domain, and amino acids from about 219 to about 289 (or E1a 243R protein) of the E1a 289R protein About 1 amino acid
73 to approximately 243). In a preferred practice of the invention, the deletion of binding to a p300 family member is a deletion corresponding to amino acids 4-25 of the E1a 243R and E1a 289R proteins or amino acids 38-60 of the E1a 243R and E1a 289R proteins. By introducing a deletion corresponding to In a preferred practice of the invention, the loss of binding to a pRb family member is E1a 24
This is achieved by removing amino acids 111-123 of the 3R protein and the E1a 289R protein. Alternatively, loss of binding to pRb family members can be achieved by removal of amino acids 124-127 of the E1a 243R and E1a 289R proteins.

【００４１】 以前に記載したように、このアデノウイルスゲノムにおける欠失は、迅速に分
裂する細胞における優先的複製を生じる。これらの望ましい特徴は、他の要素と
組み合わされて、このような細胞に対してより大きい程度でさえある、選択性お
よび／または細胞傷害性を提供し得る。例えば、本発明のベクターはまた、ウイ
ルスゲノムに対する改変を含む組換えアデノウイルスを含み、この改変は、細胞
型特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターを使用して、特定の細胞型にお
いて優先的複製を誘導する。用語「細胞型特異的プロモーター」とは、細胞周期
の進行の結果として、または異なる細胞型において、示差的に活性化される、プ
ロモーターをいう。細胞型特異的プロモーターの例としては、細胞周期調節遺伝
子プロモーター、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターまたは
経路応答性プロモーターが、挙げられる。用語「細胞周期調節遺伝子プロモータ
ー」とは、Ｓ期に入る際に実質的に活性化される遺伝子に関するプロモーターを
いう。このようなプロモーターの例は、Ｅ２Ｆ調節型プロモーター（例えば、Ｄ
ＨＦＲ、ＤＮＡポリメラーゼα、チミジレートシンターゼ、ｃ−ｍｙｃプロモー
ターおよびｂ−ｍｙｂプロモーター）を含む。組織特異的プロモーターおよび腫
瘍特異的プロモーターは、当該分野で周知であり、そして以下が挙げられる：平
滑筋において優先的に活性なプロモーター（α−アクチンプロモーター）、膵臓
特異的プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５０：４３５
）、肝臓特異的プロモーター（Ｒｏｖｅｔら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６７：２０７６５；Ｌｅｍａｉｇｉｎｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８：１９８９６；Ｎｉｔｓｃｈら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１３：４４９４）、胃特異的プロモーター（Ｋｏｖａｒｉｋら（１９
９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９９１７）、下垂体特異的プロモータ
ー（Ｒｈｏｄｅｓら、（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：９１３）、前立腺
特異的プロモーター（１９９７年１２月１６日発行の米国特許第５，６９８，４
４３号、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら）など。As previously described, this deletion in the adenovirus genome results in preferential replication in rapidly dividing cells. These desirable characteristics, in combination with other factors, may provide selectivity and / or cytotoxicity to such cells even to a greater extent. For example, the vectors of the present invention also include a recombinant adenovirus that includes a modification to the viral genome, the modification inducing preferential replication in a particular cell type using a cell type-specific or inducible promoter. I do. The term "cell type-specific promoter" refers to a promoter that is differentially activated as a result of cell cycle progression or in different cell types. Examples of cell type specific promoters include cell cycle regulatory gene promoters, tissue specific promoters or tumor specific promoters or pathway responsive promoters. The term "cell cycle regulatory gene promoter" refers to a promoter for a gene that is substantially activated upon entering the S phase. Examples of such promoters include E2F regulated promoters (eg, D
HFR, DNA polymerase α, thymidylate synthase, c-myc promoter and b-myb promoter). Tissue-specific and tumor-specific promoters are well known in the art and include: a promoter that is preferentially active in smooth muscle (α-actin promoter), a pancreas-specific promoter (Palmiter et al. (1987)). Cell 50: 435
), A liver-specific promoter (Rovet et al. (1992) J. Biol. Che).
m. 267: 20765; Lemaigin et al. (1993) J. Am. Biol. C
hem. 268: 19896; Nitsch et al. (1993) Mol. Cell.
Biol. 13: 4494), a stomach-specific promoter (Kovarik et al. (19
93) J.C. Biol. Chem. 268: 9917), a pituitary-specific promoter (Rhodes et al., (1993) Genes Dev. 7: 913), a prostate-specific promoter (US Pat. No. 5,698,4, issued Dec. 16, 1997).
No. 43, Henderson et al.).

【００４２】 用語「経路応答性プロモーター」とは、特定のタンパク質に結合し、そして近
くの遺伝子が正常細胞におけるこのタンパク質の結合に転写的に応答することを
引き起こす、ＤＮＡ配列をいう。このようなプロモーターは、転写因子が結合す
る配列である応答性エレメントを取り込むことにより生成され得る。漸増するタ
ンパク質レベルが転写を減少させる場合がいくつか存在するとはいえ、このよう
な応答は一般に誘導性である。経路応答性プロモーターは、天然に存在し得るか
または合成であり得る。経路応答性プロモーターは代表的には、この経路または
標的化される機能的タンパク質に対して構築される。例えば、天然に存在するｐ
５３経路応答性プロモーターは、ｐ２１プロモーターまたはｂａｘプロモーター
のような、機能的ｐ５３の存在により活性化される転写制御エレメントを含む。
あるいは、最小プロモーター（例えば、ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックス領域）の上
流にｐ５３結合部位を含む合成プロモーターは、合成経路応答性プロモーターを
作製するために用いられ得る。合成経路応答性プロモーターは一般に、コンセン
サス結合モチーフに適合する配列の１以上のコピーから構築される。このような
コンセンサスＤＮＡ結合モチーフは、容易に決定され得る。このようなコンセン
サス配列は一般に、いくつかの塩基対によって隔てられる直接反復物または頭−
尾反復物として配置される。頭−頭反復物を含むエレメント（例えば、ＡＧＧＴ
ＣＡＴＧＡＣＣＴ）はパリンドロームまたは逆方向反復と呼ばれ、尾−尾反復物
を有するエレメントは外反転（ｅｖｅｒｔｅｄ）反復と呼ばれる。The term “pathway-responsive promoter” refers to a DNA sequence that binds to a specific protein and causes nearby genes to transcriptionally respond to the binding of this protein in normal cells. Such a promoter can be generated by incorporating a responsive element, a sequence to which a transcription factor binds. Such responses are generally inducible, although there are some cases where increasing protein levels decrease transcription. Pathway-responsive promoters can be naturally occurring or synthetic. Pathway responsive promoters are typically constructed for this pathway or for the functional protein to be targeted. For example, the naturally occurring p
53 pathway responsive promoters include transcriptional control elements that are activated by the presence of functional p53, such as the p21 promoter or the bax promoter.
Alternatively, a synthetic promoter containing a p53 binding site upstream of a minimal promoter (eg, the SV40 TATA box region) can be used to create a synthetic pathway responsive promoter. Synthetic pathway responsive promoters are generally constructed from one or more copies of a sequence that matches a consensus binding motif. Such a consensus DNA binding motif can be easily determined. Such consensus sequences are generally direct repeats or head-separated by several base pairs.
It is arranged as a tail repeat. Elements containing head-to-head repeats (eg, AGGT
(CATGACCT) is called a palindrome or inverted repeat, and elements with tail-to-tail repeats are called everted repeats.

【００４３】 本発明の実施において有用な経路応答性プロモーターの例としては、コンセン
サスインスリン結合配列を含む合成インスリン経路応答性プロモーター（Ｊａｃ
ｏｂら（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７７７３−２７７７
９）、サイトカイン経路応答性プロモーター、グルココルチコイド経路応答性プ
ロモーター（Ｌａｎｇｅら（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５
６７３−８０）、ＩＬ１およびＩＬ６経路応答性プロモーター（Ｗｏｎ Ｋ．−
ＡおよびＢａｕｍａｎｎ Ｈ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０
：３９６５−３９７８）、Ｔ３経路応答性プロモーター、コンセンサスモチーフ
５’ＡＧＧＴＣＡ３’を含む甲状腺ホルモン経路応答性プロモーター、ＴＰＡ経
路応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＴＧＦ−β経路応答性プロモーター（Ｇｒｏ
ｔｅｎｄｏｒｓｔら（１９９６）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７：４６９−４８０に記載される通り）が挙げられる。
さらに、天然または合成のＥ２Ｆ経路応答性プロモーターが使用され得る。Ｅ２
Ｆ経路応答性プロモーターの例は、Ｐａｒｒら（１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ ３：１１４５−１１４９）に記載される。Ｐａｒｒらは、４つの
Ｅ２Ｆ結合部位を含み、そして報告されているところによれば、迅速な周期を有
する腫瘍細胞において活性である、Ｅ２Ｆ−１プロモーターを記載する。他の経
路応答性プロモーターの例は当該分野で周知であり、そしてｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｅｉｍｂ．ｒｓｓｉ．ｒｕ／ＴＲＲＤにてインターネットを通してアクセス
可能なＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔ
ｏｒｙ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅｓにおい
て同定され得る。Examples of pathway responsive promoters useful in the practice of the present invention include synthetic insulin pathway responsive promoters containing a consensus insulin binding sequence (Jac
ob et al. (1995). J. Biol. Chem. 270: 27773-2777
9), cytokine pathway responsive promoter, glucocorticoid pathway responsive promoter (Lange et al. (1992) J Biol. Chem. 267: 15).
673-80), an IL1 and IL6 pathway responsive promoter (Won K.-
A and Baumann H .; (1990) Mol. Cell. Biol. 10
: 3965-3978), T3 pathway responsive promoter, thyroid hormone pathway responsive promoter containing consensus motif 5′AGGTCA3 ′, TPA pathway responsive promoter (TRE), TGF-β pathway responsive promoter (Gro
tendorst et al. (1996) Cell Growth and Diffef.
7: 469-480).
In addition, natural or synthetic E2F pathway responsive promoters can be used. E2
Examples of F pathway responsive promoters are described in Parr et al. (1997, Nature Me.
dicine 3: 1145-1149). Parr et al. Describe an E2F-1 promoter that contains four E2F binding sites and is reportedly active in tumor cells with a rapid cycle. Examples of other pathway responsive promoters are well known in the art and are available at http: // www.
w. eimb. rssi. Database of Transcription Regulation accessible via the Internet at ru / TRRD
or in the Regions on Eukaryotics Genomes.

【００４４】 本明細書中に例示されるように本発明の好ましい実施では、ベクターは、ＳＲ
ＥおよびＰＡＩ−ＲＥ応答性エレメントを含むプロモーターのような、機能的Ｔ
ＧＦ−β経路の存在下で活性な合成ＴＧＦ−β経路応答性プロモーターを含む。
ＰＡＩとは、プラスミノーゲンアクチベーター−Ｉプロモーター領域から単離さ
れた、シグナル的にＴＧＦ−βに応答性の配列を含む合成ＴＧＦ−β経路応答性
プロモーターをいう。ＰＡＩ経路応答性プロモーターは、プラスミドｐ８００ｌ
ｕｃ（Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄら（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５５２５−５５２９
に記載され、そして登録番号Ｊ０３８３６の下でＧｅｎＢａｎｋから入手可能）
から単離され得る７４９塩基対のフラグメントとして単離され得る。ＳＲＥとは
、Ｓｍａｄ−４ ＤＮＡ結合配列（Ｚａｗｅｌら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
１：６１１−６１７に記載される通りのＧＴＣＴＡＧＡＣ）の４つの反復を含
む合成ＴＧＦ−β応答性エレメントをいう。ＳＲＥ応答性エレメントは、Ｓｍａ
ｄ−４結合配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、そ
してプラスミドｐＧＬ＃３−プロモータールシフェラーゼベクター（ＰｒｏＭｅ
ｇａから市販される）にクローニングすることにより作製され得る。In a preferred practice of the invention, as exemplified herein, the vector comprises
Functional T, such as a promoter containing E and PAI-RE responsive elements
Includes a synthetic TGF-β pathway responsive promoter active in the presence of the GF-β pathway.
PAI refers to a synthetic TGF-β pathway responsive promoter isolated from the plasminogen activator-I promoter region and containing a signal responsive to TGF-β. The PAI pathway responsive promoter was plasmid p800l
uc (Zonneveld et al. (1988) PNAS 85: 5525-5529).
And available from GenBank under accession number J03836)
From a 749 base pair fragment that can be isolated from SRE is a Smad-4 DNA binding sequence (Zawel et al. (1988) Mol. Cell
1: GTCTAGAC as described in 1: 611-617). The SRE responsive element is Sma
The complementary oligonucleotide encoding the d-4 binding sequence was annealed and the plasmid pGL # 3-promoter luciferase vector (ProMe
(commercially available from ga).

【００４５】 同様に、「ｐ５３経路応答性プロモーター」とは、機能的ｐ５３経路の存在下
で活性な転写制御エレメントをいう。ｐ５３経路応答性プロモーターは、ｐ２１
プロモーターまたはｍｄｍ２プロモーターのような、機能的ｐ５３経路の存在下
で活性な天然に存在する転写制御領域であり得る。あるいは、ｐ５３経路応答性
プロモーターは、ＳＲＥ経路応答性プロモーターおよびＰＡＩ−ＲＥ経路応答性
プロモーターのような、機能的ｐ５３経路の存在下で活性な合成転写制御領域で
あり得る。ｐ５３−ＣＯＮとは、ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスの上流の２つの合
成ｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配列（Ｆｕｎｋら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．１２：２８６６−２８７１に記載される通り）の挿入によって構
築される合成ｐ５３応答性エレメントを含むｐ５３経路応答性プロモーターを記
載する。ＲＧＣとは、リボゾーム遺伝子クラスターにおいて同定されたタンデム
のｐ５３結合ドメインを用いた合成ｐ５３経路応答性プロモーターをいう。ｐ５
３ＣＯＮ応答性エレメントおよびＲＧＣ応答性エレメントは、相補的オリゴヌク
レオチドをアニーリングすることにより構築され得、そしてｐ５３応答性プロモ
ーターは、プラスミドｐＧＬ３−プロモータールシフェラーゼベクター（Ｐｒｏ
Ｍｅｇａから市販される）にクローニングすることにより構築され得る。Similarly, “p53 pathway responsive promoter” refers to a transcription control element that is active in the presence of a functional p53 pathway. The p53 pathway responsive promoter is p21
It can be a naturally-occurring transcription control region active in the presence of a functional p53 pathway, such as a promoter or mdm2 promoter. Alternatively, the p53 pathway responsive promoter can be a synthetic transcription control region active in the presence of a functional p53 pathway, such as an SRE pathway responsive promoter and a PAI-RE pathway responsive promoter. p53-CON is defined as two synthetic p53 consensus DNA binding sequences upstream of the SV40 TATA box (Funk et al. (1992) Mol. Cel.
l Biol. 12: 2866-2871), describes a p53 pathway responsive promoter containing a synthetic p53 responsive element constructed by insertion. RGC refers to a synthetic p53 pathway responsive promoter using the tandem p53 binding domain identified in the ribosomal gene cluster. p5
The 3CON responsive element and the RGC responsive element can be constructed by annealing complementary oligonucleotides, and the p53 responsive promoter is a plasmid pGL3-promoter luciferase vector (Pro
(Commercially available from Mega).

【００４６】 あるいは、ウイルスゲノムは、化学的刺激または他の刺激に応答して特定の条
件下で機能的である誘導性プロモーターを含むように改変され得る。誘導性プロ
モーターの例は、科学文献において公知である（例えば、Ｙｏｓｈｉｄａおよび
Ｈａｍａｄａ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
．２３０：４２６−４３０；Ｉｉｄａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（９
）：６０５４−６０５９；Ｈｗａｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１（９
）：７１２８−７１３１；Ｌｅｅら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１７（９）：５０９７−５１０５；ならびにＤｒｅｈｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４６）；２９３６４−２９３７１を参照のこと）。
照射（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）誘導性プロモーターの例としては、ＥＧＲ−１プロ
モーターが挙げられる。Ｂｏｏｔｈｍａｎら（１９９４）第１３８巻、増補頁Ｓ
６８−Ｓ７１。Alternatively, the viral genome can be modified to include an inducible promoter that is functional under certain conditions in response to chemical or other stimuli. Examples of inducible promoters are known in the scientific literature (eg, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm.
. 230: 426-430; Iida et al. (1996) J. Am. Virol. 70 (9
): 6054-6059; Hwang et al. (1997) J. Am. Virol 71 (9
): 7128-7131; Lee et al. (1997) Mol. Cell. Biol.
17 (9): 5097-5105; and Dreher et al. (1997) J. Am. B
iol. Chem. 272 (46); 29364-29371).
An example of a radiation inducible promoter is the EGR-1 promoter. Bootman et al. (1994) Vol. 138, Aug. S.
68-S71.

【００４７】 細胞型特異的（組織特異的、腫瘍特異的、経路特異的、細胞周期調節プロモー
ター）プロモーターまたは誘導性プロモーターを、本発明のベクターにおいてネ
イティブなＥ１ａプロモーター領域の代わりに用いて、特定の細胞型において優
先的発現を提供し得る。A cell type-specific (tissue-specific, tumor-specific, pathway-specific, cell cycle-regulated promoter) or inducible promoter can be used in place of the native E1a promoter region in the vectors of the invention to provide specific It may provide preferential expression in a cell type.

【００４８】 あるいは、経路応答性プロモーターを使用して、ウイルス複製のリプレッサー
の発現を駆動し得る。用語「ウイルス複製のリプレッサー」は、所定の細胞にお
いて発現される場合、ウイルス複製を実質的に抑制するタンパク質をいう。アデ
ノウイルスベクターの場合、１９９５年１２月６日に公開された欧州特許出願第
９４１０８４４５．１号（公開第０ ６８５ ４９３ Ａ１号）に記載されるよ
うなＥ２Ｆ−Ｒｂ融合構築物が用いられ得る。Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質は、
Ｒｂ増殖抑制ドメイン（野生型Ｒｂタンパク質のアミノ酸３７９〜９２８）に融
合された、ヒトＥ２Ｆ−２転写因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよびＤＰ
１ヘテロダイマー化ドメイン（野生型Ｅ２Ｆのアミノ酸９５〜２８６）からなる
。Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質は、Ｅ２Ｆ転写の強力なリプレッサーであり、そ
してＧ１において細胞を停止させる。ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸１２８〜１
９３に存在し、そしてダイマー化ドメインは１９４〜２８９に存在する。ヒトＥ
２Ｆ２タンパク質の配列は、１９９７年１１月１日に寄託され、１９９８年７月
１５日に更新された登録番号２４９４２８８の下でＧｅｎＢａｎｋから利用可能
である。Alternatively, a pathway responsive promoter can be used to drive expression of a repressor of viral replication. The term "repressor of viral replication" refers to a protein that, when expressed in a given cell, substantially suppresses viral replication. In the case of adenovirus vectors, E2F-Rb fusion constructs as described in European Patent Application No. 94108445.1 published on Dec. 6, 1995 (publication No. 0685 493 A1) may be used. The E2F-Rb fusion protein is
DNA binding domain and DP of human E2F-2 transcription factor protein fused to Rb growth suppression domain (amino acids 379-928 of wild-type Rb protein)
One heterodimerization domain (amino acids 95-286 of wild-type E2F). The E2F-Rb fusion protein is a strong repressor of E2F transcription and arrests cells at G1. The DNA binding domain is amino acids 128-1
At 93 and the dimerization domain is at 194-289. Human E
The sequence of the 2F2 protein was deposited on November 1, 1997 and is available from GenBank under accession number 2494288, updated July 15, 1998.

【００４９】 これらの改変を、上記の先の細胞周期調節遺伝子プロモーターと組み合わせ得
る。例えば、Ｅ２Ｆ経路応答性プロモーターを用いて、改変されたＥ１ａコード
配列の発現を駆動し得る。Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質の発現を駆動するｐ５３
経路応答性プロモーターを用いて、Ｅ１機能およびＥ２機能の両方の抑制を達成
する。なぜなら、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質は、Ｅ２およびＥ２Ｆの両方の応
答エレメントを抑制するからである。ｐ５３欠損腫瘍細胞では、ｐ５３応答エレ
メントは不活性であり、そしてＥ２Ｆ−Ｒｂは発現されない。その結果、Ｅ１ａ
発現は、腫瘍細胞におけるＥ２Ｆの存在によって増強され、そしてＥ２プロモー
ターを抑制できないことは、ウイルス複製が進行することを可能にする。These modifications can be combined with the cell cycle regulatory gene promoters described above. For example, an E2F pathway responsive promoter can be used to drive expression of a modified E1a coding sequence. P53 drives expression of E2F-Rb fusion protein
A pathway responsive promoter is used to achieve repression of both El and E2 function. This is because the E2F-Rb fusion protein suppresses both E2 and E2F response elements. In p53 deficient tumor cells, the p53 response element is inactive and E2F-Rb is not expressed. As a result, E1a
Expression is enhanced by the presence of E2F in tumor cells, and the inability to repress the E2 promoter allows viral replication to proceed.

【００５０】 先に記載したように、アデノウイルスゲノムにおける欠失は、迅速に***する
細胞において優先的複製をもたらす。これらのウイルスは複製し、そして最終的
には腫瘍細胞を殺傷するが、これらのウイルスはまた、治療用トランスジーン発
現カセットを取り込んで細胞傷害性を増強し得る。用語「発現カセット」とは、
調節エレメントおよびトランスジーンコード配列を含み、その結果、形質導入さ
れた細胞においてトランスジーンの転写および翻訳をもたらす、ヌクレオチド配
列を定義するために本明細書中で用いられる。用語「調節エレメント」とは、プ
ロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などをい
う。調節エレメントは、トランスジーンの発現を特定の細胞型においてのみ、可
能にするか、増強するか、または容易にするように配置され得る。例えば、発現
カセットは、トランスジーンが誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターも
しくは腫瘍特異的プロモーター、または時間的プロモーターの制御下にあるよう
に設計され得る。用語「時間的プロモーター」は、応答性プロモーターの発現を
制御するプロモーターに対して、ウイルスのサイクルの後期にある時点で転写ま
たは治療トランスジーンを駆動するプロモーターをいい、そしてウイルスベクタ
ー系とともに用いられる。このような時間的に調節されるプロモーターの例とし
ては、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、他の後期プロモーター
が挙げられる。As noted above, deletions in the adenovirus genome result in preferential replication in rapidly dividing cells. Although these viruses replicate and ultimately kill tumor cells, they can also incorporate a therapeutic transgene expression cassette to enhance cytotoxicity. The term "expression cassette"
It is used herein to define a nucleotide sequence that includes regulatory elements and a transgene coding sequence, resulting in transgene transcription and translation in the transduced cell. The term "regulatory element" refers to a promoter, enhancer, transcription terminator, polyadenylation site, and the like. Regulatory elements can be arranged to allow, enhance, or facilitate expression of the transgene only in certain cell types. For example, the expression cassette can be designed such that the transgene is under the control of an inducible, tissue-specific or tumor-specific, or temporal promoter. The term "temporal promoter" refers to a promoter that drives a transcription or therapeutic transgene at some point later in the viral cycle, relative to a promoter that controls expression of a responsive promoter, and is used with viral vector systems. Examples of such temporally regulated promoters include the adenovirus major late promoter (MLP), other late promoters.

【００５１】 用語「治療用トランスジーン」とは、標的細胞におけるその発現が細胞傷害性
効果または細胞***抑制効果を生ずるヌクレオチド配列をいう。用語治療用トラ
ンスジーンは、腫瘍抑制遺伝子、抗原性遺伝子、細胞傷害性遺伝子、樹状細胞化
学誘引物質、細胞***抑制遺伝子、プロドラッグ活性化遺伝子、アポトーシス促
進を含むがこれらに限定されない。本発明のべクターは、ＩＲＥＳエレメントの
使用を通してタンデムでか、または独立して調節されるプロモーターを通してか
のいずれかで１つ以上の治療用トランスジーンを産生するために使用され得る。The term “therapeutic transgene” refers to a nucleotide sequence whose expression in a target cell results in a cytotoxic or cytostatic effect. The term therapeutic transgene includes, but is not limited to, tumor suppressor genes, antigenic genes, cytotoxic genes, dendritic cell chemoattractants, cytostatic genes, prodrug activating genes, pro-apoptosis. The vectors of the present invention can be used to produce one or more therapeutic transgenes, either in tandem through the use of an IRES element or through an independently regulated promoter.

【００５２】 用語「腫瘍抑制遺伝子」とは、標的細胞中でのその発現が、新生物表現型の抑
制および／またはアポトーシスの誘導をし得るヌクレオチド配列をいう。本発明
の実施において有用な腫瘍抑制遺伝子の例としては、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝
子、ＤＰＣ−４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺
伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：６４
２）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、腺腫様ポリープ症ｃｏｌｉタンパク質（１９９８年
７月２１日に発行された、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎら、米国特許第５，７８３，６６
６号）、結腸癌における欠損（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１
遺伝子、染色体３ｐ２１．３にマッピングされる鼻咽頭癌腫瘍抑制遺伝子（Ｃｈ
ｅｎｇら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：３０４２−
３０４７）、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ２遺伝子
、およびＶＨＬ遺伝子が挙げられる。The term “tumor suppressor gene” refers to a nucleotide sequence whose expression in a target cell is capable of suppressing a neoplastic phenotype and / or inducing apoptosis. Examples of tumor suppressor genes useful in the practice of the present invention include p53 gene, APC gene, DPC-4 gene, BRCA-1 gene, BRCA-2 gene, WT-1 gene, retinoblastoma gene (Lee et al. 1987) Nature 329: 64.
2), MMAC-1 gene, adenomatous polyposis coli protein (Albertsen et al., US Pat. No. 5,783,66, issued Jul. 21, 1998).
No. 6), deficiency in colon cancer (DCC) gene, MMSC-2 gene, NF-1
Nasopharyngeal carcinoma tumor suppressor gene (Ch mapped to chromosome 3p21.3)
eng et al., 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 3042-
3047), MTS1 gene, CDK4 gene, NF-1 gene, NF2 gene, and VHL gene.

【００５３】 用語「抗原性遺伝子」とは、標的細胞におけるその発現が、免疫系により認識
され得る細胞表面抗原性タンパク質の産生を生じるヌクレオチド配列をいう。抗
原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３（１９９４年２月３日に
公開された、Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／０２１６７によ
って記載される通り）が含まれる。免疫認識を容易にするために、抗原性遺伝子
は、ＭＨＣクラスＩ抗原に融合され得る。The term “antigenic gene” refers to a nucleotide sequence whose expression in a target cell results in the production of a cell surface antigenic protein that can be recognized by the immune system. Examples of antigenic genes include carcinoembryonic antigen (CEA), p53 (as described by Levine, A. PCT International Publication No. WO 94/02167, published February 3, 1994). To facilitate immune recognition, antigenic genes can be fused to MHC class I antigens.

【００５４】 用語「細胞傷害性遺伝子」とは、細胞におけるその発現が、毒性の効果を生ず
るヌクレオチド配列をいう。このような細胞傷害性遺伝子の例には、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ体外毒素、リシン毒素、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素な
どをコードするヌクレオチド配列が含まれる。The term “cytotoxic gene” refers to a nucleotide sequence whose expression in a cell produces a toxic effect. Examples of such cytotoxic genes include Pseud
omonas exotoxin, ricin toxin, diphtheria toxin and the like are included.

【００５５】 用語「細胞***抑制遺伝子」とは、細胞におけるその発現が、細胞周期の停止
を生じるヌクレオチド配列をいう。このような細胞***抑制遺伝子の例には、ｐ
２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ遺伝子、サイクリン依存性キナーゼイ
ンヒビター（例えば、Ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、およびｐ１９）をコードする遺
伝子、Ｂｒａｎｅｌｌｅｃら（１９９７年５月９日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ
９７／１６４５９および１９９６年１０月３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９６
／３０３８５）によって記載されたような、増殖停止特異的ホメオボックス（Ｇ
ＡＸ）遺伝子が含まれる。The term “cytostatic gene” refers to a nucleotide sequence whose expression in a cell results in cell cycle arrest. Examples of such cytostatic genes include p
21, genes encoding retinoblastoma gene, E2F-Rb gene, cyclin-dependent kinase inhibitors (eg, P16, p15, p18, and p19), Brunellec et al., Published PCT published May 9, 1997. WO
PCT Publication WO96 published on 97/16459 and October 3, 1996
Growth arrest-specific homeobox (G
AX) gene.

【００５６】 用語「樹状細胞化学誘引物質」とは、特定の位置への樹状細胞の移動を誘引お
よび／または指向し得る、走化性ケモカインをいう。特定のケモカインｆＭＬＰ
（細菌起源のホルミルペプチドの代表）、Ｃ５ａおよびＣ−Ｃケモカイン、単球
走化性タンパク質（ＭＣＰ）−３、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−
１α／ＬＤ７８、およびＲＡＮＴＥＳが、樹状細胞の補充および走化性移動に関
与していることが実証されている。Ｓｏｚｚａｎｉら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１９９５ １５５（７）：３２９２−５。Ｘｕらは、全てのＣ−Ｃケモ
カイン（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１βおよ
びＲＡＮＴＥＳを含む）が、ＩＬ−４を伴ってまたは伴わずに培養された、ＤＣ
富化細胞の移動を誘導したことを示唆する。Ｘｕら（１９９６）Ｊ．Ｌｅｕｋｏ
ｃ．Ｂｉｏｌ．６０（３）：３６５−７１。Ｇｒｅａｖｅｓら（１９９７）Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６（６）：８３７−４４は、ＭＩＰ−３−αが、樹状細胞
の移動を指向し得る樹状細胞上に発現されるＣＣケモカインレセプター６と特異
的に相互作用することを示す。本発明の好ましい実施では、樹状細胞化学誘引物
質はＭＩＰ−３−αである。樹状細胞化学誘引物質は、細胞内形態で発現され得
、ここで、この樹状細胞化学誘引物質は、細胞溶解の際に、またはシグナルペプ
チドの使用によって分泌形態で放出される。The term “dendritic cell chemoattractant” refers to a chemotactic chemokine that can attract and / or direct the migration of dendritic cells to a particular location. Specific chemokine fMLP
(Representative of formyl peptides of bacterial origin), C5a and CC chemokines, monocyte chemotactic protein (MCP) -3, macrophage inflammatory protein (MIP)-
It has been demonstrated that 1α / LD78 and RANTES are involved in recruitment and chemotactic migration of dendritic cells. Sozzani et al. (1995) J. Mol. Immu
nol. 1995 155 (7): 3292-5. Xu et al. Reported that all CC chemokines (including MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP1α, MIP-1β and RANTES) were cultured with or without IL-4, DC
This suggests that it induced migration of enriched cells. Xu et al. Leuko
c. Biol. 60 (3): 365-71. Greaves et al. (1997) J. Am.
Exp. Med. 186 (6): 837-44 show that MIP-3-α specifically interacts with CC chemokine receptor 6, which is expressed on dendritic cells that can direct the migration of dendritic cells. In a preferred practice of the invention, the dendritic cell chemoattractant is MIP-3-α. The dendritic cell chemoattractant can be expressed in an intracellular form, wherein the dendritic cell chemoattractant is released upon cell lysis or in a secreted form by use of a signal peptide.

【００５７】 用語「アポトーシス促進（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）遺伝子」とは、その
発現が、細胞のプログラムされた細胞死を生じるヌクレオチド配列をいう。アポ
トーシス促進遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ、アデ
ノウイルスＥ４ｏｒｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、およびカスパーゼをコード
する遺伝子を含む。The term “pro-apoptotic gene” refers to a nucleotide sequence whose expression results in programmed cell death of a cell. Examples of apoptosis-promoting genes include p53, adenovirus E3-11.6K, adenovirus E4orf4 gene, p53 pathway gene, and a gene encoding caspase.

【００５８】 用語「プロドラッグ活性化遺伝子」とは、その発現が、非治療用化合物を治療
用化合物に転換し得るタンパク質の産生を生じるヌクレオチド配列をいい、それ
は、外部の因子によって細胞を殺傷されやすくするか、または細胞内に毒性条件
を引き起こす。プロドラッグ活性化遺伝子の例は、シトシンデアミナーゼ遺伝子
である。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシンを、強力な抗腫瘍剤で
ある５−フルオロウラシルに転換する。腫瘍細胞の溶解は、腫瘍の局在化された
点において５ＦＣを５ＦＵに転換し得るシトシンデアミナーゼの局所的なバース
トを提供し、腫瘍細胞を取り囲む多くの細胞の殺傷を生じる。このことは、アデ
ノウイルスでこれらの細胞を感染させる必要性なしで、多数の腫瘍細胞の殺傷を
生じる（いわゆる、「傍観者効果」）。さらに、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝
子（例えば、Ｗｏｏら、１９９７年５月２０日に発行された米国特許第５，６３
１，２３６号および１９９７年２月１１日に発行されたＦｒｅｅｍａｎら、米国
特許第５，６０１，８１８号を参照のこと）（ここで、ＴＫ遺伝子産物を発現す
る細胞は、ガンシクロビルの投与による選択的な殺傷に感受性である）が用いら
れ得る。The term “prodrug-activating gene” refers to a nucleotide sequence whose expression results in the production of a protein capable of converting a non-therapeutic compound to a therapeutic compound, which is killed by an external factor in the cell. Or cause toxic conditions inside the cell. An example of a prodrug activation gene is the cytosine deaminase gene. Cytosine deaminase converts 5-fluorocytosine to 5-fluorouracil, a potent antitumor agent. Lysis of the tumor cells provides a localized burst of cytosine deaminase that can convert 5FC to 5FU at the localized point of the tumor, resulting in the killing of many cells surrounding the tumor cells. This results in the killing of large numbers of tumor cells without the need to infect these cells with adenovirus (the so-called "bystander effect"). Further, the thymidine kinase (TK) gene (see, eg, Woo et al., US Pat. No. 5,633, issued May 20, 1997).
No. 1,236 and Freeman et al., US Pat. No. 5,601,818, issued Feb. 11, 1997, wherein cells expressing the TK gene product were selected by administration of ganciclovir. Susceptible to severe killing) can be used.

【００５９】 野生型タンパク質の機能的なサブフラグメントをコードするための上記に言及
された遺伝子に対する改変およびまたは欠失が、本発明の実施における使用のた
めに容易に適合され得ることは、当業者には容易に明らかである。例えば、ｐ５
３遺伝子に対する言及は、野生型タンパク質を含むだけでなく、改変されたｐ５
３タンパク質をも含む。このような改変されたｐ５３タンパク質の例には、核残
留を増大させるためのｐ５３に対する改変、カルパインコンセンサス切断部位を
除去するためのΔ１３−１９アミノ酸のような欠失、オリゴマー化ドメインに対
する改変（Ｂｒａｃｃｏら、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９７／０４９２または米国特許
第５，５７３，９２５号において記載される通り）が含まれる。It will be appreciated by one of skill in the art that modifications and / or deletions to the above-mentioned genes to encode functional subfragments of the wild-type protein can be readily adapted for use in practicing the present invention. It is readily apparent. For example, p5
References to the 3 genes not only include the wild-type protein but also the modified p5
Also includes 3 proteins. Examples of such modified p53 proteins include modifications to p53 to increase nuclear retention, deletions such as the Δ13-19 amino acid to remove the calpain consensus cleavage site, modifications to the oligomerization domain (Bracco Et al., As described in PCT published application WO 97/0492 or US Pat. No. 5,573,925).

【００６０】 標的化部分（例えば、シグナルペプチドまたは核局在化シグナル（ＮＬＳ））
の含有によって、上記の治療用遺伝子が培地中に分泌され得るか、または特定の
細胞内位置に局在し得るかは、当業者には容易に明らかである。１型単純疱疹ウ
イルス（ＨＳＶ−１）の構造タンパク質ＶＰ２２を有する治療用トランスジーン
の融合タンパク質もまた、治療用トランスジーンの定義の中に含まれる。ＶＰ２
２シグナルを含む融合タンパク質は、感染した細胞において合成される場合、感
染した細胞の外部に搬出され、そして約１６細胞の幅の直径まで、周囲の非感染
細胞に効率的に侵入する。この系は、融合タンパク質が、周囲の細胞の核に効率
よく輸送されるので、転写活性タンパク質（例えば、ｐ５３）と組み合わせて特
に有用である。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｇ．およびＯ’Ｈａｒｅ，Ｐ．Ｃｅｌ
ｌ ８８：２２３−２３３：１９９７；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．およびＣａｓｔ
ｅｌｌｉｎｏ，Ａ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｗｓ Ｂｒｉｅｆｓ．Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５：２０５：１９９７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１
９９７年２月１３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９７／０５２６５を参照のこと
。ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する同様の標的化部分はまた、Ｖｉｖｅｓら
（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７に記載
される。A targeting moiety (eg, a signal peptide or nuclear localization signal (NLS))
It will be readily apparent to one of skill in the art whether the above therapeutic genes can be secreted into the medium or localized to specific intracellular locations by the inclusion of. Therapeutic transgene fusion proteins with the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) structural protein VP22 are also included within the definition of therapeutic transgene. VP2
When synthesized in infected cells, fusion proteins containing two signals are exported outside of infected cells and efficiently invade surrounding uninfected cells to a diameter of approximately 16 cells. This system is particularly useful in combination with transcriptionally active proteins (eg, p53) because the fusion protein is efficiently transported to the nucleus of surrounding cells. For example, Elliott, G .; And O'Hare, P .; Cel
88: 223-233: 1997; Marshall, A .; And Cast
ellino, A .; Research News Briefs. Nature
Biotechnology. 15: 205: 1997; O'Hare et al., 1
See PCT Publication WO 97/05265 published February 13, 997. Similar targeting moieties from the HIV Tat protein have also been described by Vives et al. (1997) J. Am. Biol. Chem. 272: 16010-16017.

【００６１】 本発明は、特定の細胞型へのウイルスの優先的な標識化を達成するために、「
標的化する改変」を含む組換えアデノウイルスを提供する。用語「標的化する改
変」とは、特定の細胞型の優先的感染性をもたらすように設計された、ウイルス
ゲノムに対する改変をいう。細胞型特異性または細胞型標的化はまた、特徴的に
広範な感染性を有するウイルス（例えば、アデノウイルス）に由来するベクター
において、ウイルスエンベロープタンパク質の改変によって達成され得る。例え
ば、細胞標的化は、固有の細胞表面レセプターとの特異的相互作用を有する改変
されたこぶドメインおよび線維ドメインの発現を達成するための、ウイルスゲノ
ムのこぶおよび線維をコードする配列の選択的改変によってアデノウイルスベク
ターを用いて達成された。このような改変の例は、Ｗｉｃｋｈａｍら（１９９７
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１（１１）：８２２１−８２２９（アデノウイルス線維タ
ンパク質へのＲＧＤペプチドの取り込み）；Ａｒｎｂｅｒｇら（１９９７）Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ２２７：２３９−２４４（眼および生殖管への向性を達成するた
めのアデノウイルス線維遺伝子の改変）；ＨａｒｒｉｓおよびＬｅｍｏｉｎｅ（
１９９６）ＴＩＧ １２（１０）：４００−４０５；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１
９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（６）：４７８２−４７９０；Ｍｉｃｈａｅｌら
（１９９５）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２：６６０−６６８（アデノウイルス
線維タンパク質へのガストリン放出ペプチドフラグメントの取り込み）；ならび
にＯｈｎｏら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：
７６３−７６７（シンドビスウイルスへのプロテインＡ−ＩｇＧ結合ドメインの
取り込み）に記載される。細胞特異的標的化の他の方法は、エンベロープタンパ
ク質への抗体または抗体フラグメントの結合体化によって達成されている（例え
ば、Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６８６６
−６８６９、Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９７）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ４：１
００４−１０１２；Ｄｏｕｇｌａｓら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ １４：１５７４−１５７８を参照のこと）。あるいは、特定の
部分をウイルス表面に結合体化して、標的化を達成し得る（例えば、Ｎｉｌｓｏ
ｎら（１９９６）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ３：２８０−２８６（レトロウイ
ルスタンパク質へのＥＧＦの結合体化）を参照のこと）。組換えによって改変さ
れたこれらのベクターは、本発明の実施に従って生成され得る。The present invention provides a method for achieving preferential labeling of a virus on a particular cell type,
A recombinant adenovirus comprising a "targeting modification" is provided. The term "targeting modification" refers to a modification to the viral genome designed to result in preferential infectivity of a particular cell type. Cell type specificity or cell type targeting can also be achieved by modification of the viral envelope proteins in vectors derived from viruses with characteristically widespread infectivity (eg, adenovirus). For example, cell targeting is the selective alteration of the sequences encoding the knobs and fibers of the viral genome to achieve expression of the altered knob and fiber domains with specific interactions with unique cell surface receptors. Using an adenovirus vector. Examples of such modifications are described in Wickham et al. (1997)
J.). Virol 71 (11): 8221-8229 (incorporation of RGD peptide into adenovirus fiber protein); Arnberg et al. (1997) Vi.
227: 239-244 (modification of the adenovirus fiber gene to achieve tropism to the eye and genital tract); Harris and Lemoine (
(1996) TIG 12 (10): 400-405; Stevenson et al. (1
997). Virol. 71 (6): 4782-4790; Michael et al. (1995) gene therapy 2: 660-668 (incorporation of gastrin releasing peptide fragment into adenovirus fiber protein); and Ohno et al. (1997) Nature Biotechnology 15:
763-767 (incorporation of the protein A-IgG binding domain into Sindbis virus). Other methods of cell-specific targeting have been achieved by conjugation of antibodies or antibody fragments to envelope proteins (see, eg, Michael et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 6866).
-6869, Watkins et al. (1997) gene therapy 4: 1.
004-1012; Douglas et al. (1996) Nature Biotec.
hnology 14: 1574-1578). Alternatively, specific moieties can be conjugated to the virus surface to achieve targeting (eg, Nilso
(1996) gene therapy 3: 280-286 (conjugation of EGF to retroviral proteins). These recombinantly modified vectors can be produced in accordance with the practice of the present invention.

【００６２】 本発明はさらに、自殺遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する
。いくつかの例では、ウイルスベクター中に自殺遺伝子を含めることが望ましく
あり得る。これは、ウイルスベクター送達系に「安全弁」を提供して、複製能力
のあるウイルスベクターの自然生成に起因する広範囲の感染を予防する。用語「
自殺遺伝子」とは、その発現が、細胞を外部因子によって殺傷されやすくするか
または細胞において毒性条件を引き起こす、核酸配列をいう。自殺遺伝子の周知
の例は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（例えば、Ｗｏｏら、１９９７年５月
２０日に発行された米国特許第５，６３１，２３６号および１９９７年２月１１
日に発行されたＦｒｅｅｍａｎら、米国特許第５，６０１，８１８号を参照のこ
と）（ここで、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与による
選択的な殺傷に感受性である）である。[0062] The present invention further provides a recombinant adenovirus vector comprising a suicide gene. In some cases, it may be desirable to include a suicide gene in the viral vector. This provides a "safety valve" for the viral vector delivery system to prevent widespread infection due to the spontaneous production of replication competent viral vectors. the term"
A "suicide gene" refers to a nucleic acid sequence whose expression renders a cell susceptible to killing by an external factor or causes a toxic condition in the cell. Well-known examples of suicide genes include the thymidine kinase (TK) gene (see, eg, Woo et al., US Pat. Nos. 5,631,236 and May 11, 1997, issued May 20, 1997;
See Freeman et al., U.S. Patent No. 5,601,818, issued today, where cells expressing the TK gene product are susceptible to selective killing by administration of ganciclovir. .

【００６３】 本発明はさらに、キャリアと組み合わせた組換えアデノウイルスの薬学的に受
容可能な処方物を提供する。本発明のベクターは、キャリアおよび賦形剤の添加
を伴う従来の薬学的実施に従って、用量投与のために処方され得る。投薬処方物
は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、局所、基質またはエアロゾルでの送達を
含み得る。The present invention further provides a pharmaceutically acceptable formulation of the recombinant adenovirus in combination with a carrier. The vectors of the invention may be formulated for dose administration according to conventional pharmaceutical practice with the addition of carriers and excipients. Dosage formulations may include intravenous, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, topical, matrix or aerosol delivery.

【００６４】 用語「キャリア」は、治療用化合物の安定性、無菌性および送達可能性を増大
させるために用いられる薬学的化合物の処方に対して通常、用いられる化合物を
いう。ウイルスが溶液または懸濁液として処方される場合、送達系は、受容可能
なキャリア、好ましくは水性キャリア中である。種々の水性キャリア（例えば、
水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が
用いられ得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得るか
、または滅菌濾過され得る。得られた水性溶液は、そのままでの使用のためにパ
ッケージングされ得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥調製物は、投与
前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、生理学的条件に近づけるため
に必要とされる場合、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節および緩
衝化剤、張度調節剤、湿潤剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、吸着（ｓｏｒｐｔｉｏｎ）モ
ノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど））を含み得る。The term “carrier” refers to a compound commonly used with pharmaceutical compound formulations used to increase the stability, sterility, and deliverability of a therapeutic compound. When the virus is formulated as a solution or suspension, the delivery system is in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. Various aqueous carriers (eg,
Water, buffered water, 0.8% saline, 0.3% glycine, hyaluronic acid, etc.). These compositions may be sterilized by conventional, well-known sterilization techniques, or may be sterile filtered. The resulting aqueous solutions can be packaged for use as is, or lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile solution prior to administration. The compositions may be used as needed to approximate physiological conditions, such as pharmaceutically acceptable auxiliary substances (eg, pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, wetting agents, etc., such as sodium acetate, Sodium lactate,
Sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, adsorption monolaurate, triethanolamine oleate, etc.).

【００６５】 本発明はさらに、キャリアおよび送達増強剤を含む本発明の組換えアデノウイ
ルスベクターの薬学的処方物を提供する。用語「送達エンハンサー」または「送
達増強剤」は、本明細書中で互換可能に用いられ、そして標的細胞へのウイルス
の取り込みを促進する１つ以上の薬剤を含む。送達エンハンサーの例は、１９９
８年７月７日出願の同時係属中の米国特許出願番号 号に記載される。このよ
うな送達増強剤の例としては、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、アルコール
、グリコール、界面活性物質（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、胆汁酸塩、ヘパリンア
ンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液およびアセテ
ートが挙げられる。アルコールとしては例えば、エタノール、Ｎ−プロパノール
、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコールのような脂肪族ア
ルコールが挙げられる。グリコールとしては、グリセリン、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコールおよび他の低分子量グリコール（例えば、グリセロ
ールおよびチオグリセロール）が挙げられる。酢酸、グルコン酸、および酢酸ナ
トリウムのようなアセテートは、送達増強剤のさらなる例である。１Ｍ ＮａＣ
ｌのような高張性塩溶液もまた、送達増強剤の例である。界面活性物質の例は、
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびリゾレシチン、ポリソルベート８０、
ノニルフェノキシポリオキシエチレン、リゾホスファチジルコリン、ポリエチレ
ングリコール４００、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンエーテル、ポリ
グリコールエーテル界面活性物質、ならびにＤＭＳＯである。タウロコレート、
タウロ−デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコレート、ケノデオキシコレー
ト（ｃｈｅｎｏｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、グリココール酸、グリコケノデ
オキシコール酸および他の収斂薬（例えば、硝酸銀）のような胆汁酸塩が用いら
れ得る。第４級アミン（例えば、硫酸プロタミン）のようなヘパリン−アンタゴ
ニストもまた用いられ得る。シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、サリ
チル酸ナトリウム、サリチル酸、および非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＡＳＩ
ＤＳ）（インドメタシン、ナプロキセン、ジクロフェナクのような）が用いられ
得る。The present invention further provides a pharmaceutical formulation of a recombinant adenoviral vector of the present invention comprising a carrier and a delivery enhancer. The terms "delivery enhancer" or "delivery enhancer" are used interchangeably herein and include one or more agents that promote uptake of the virus into target cells. An example of a delivery enhancer is 199
It is described in co-pending U.S. Patent Application No., filed July 7, 2008. Examples of such delivery enhancers include detergents, alcohols, glycols, surfactants, bile salts, heparin antagonists, cyclooxygenase inhibitors, hypertonic salt solutions and acetate. Examples of the alcohol include aliphatic alcohols such as ethanol, N-propanol, isopropanol, butyl alcohol, and acetyl alcohol. Glycols include glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol and other low molecular weight glycols such as glycerol and thioglycerol. Acetates such as acetic acid, gluconic acid, and sodium acetate are further examples of delivery enhancers. 1M NaC
Hypertonic salt solutions, such as 1, are also examples of delivery enhancers. Examples of surfactants are
Sodium dodecyl sulfate (SDS) and lysolecithin, polysorbate 80,
Nonylphenoxypolyoxyethylene, lysophosphatidylcholine, polyethylene glycol 400, polysorbate 80, polyoxyethylene ether, polyglycol ether surfactant, and DMSO. Taurocholate,
Bile salts such as sodium tauro-deoxycholate, deoxycholate, chenodeoxycholate, glycocholate, glycochenodeoxycholate and other astringents such as silver nitrate can be used. Heparin-antagonists such as quaternary amines (eg, protamine sulfate) can also be used. Cyclooxygenase inhibitors such as sodium salicylate, salicylic acid, and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NASI
DS) (such as indomethacin, naproxen, diclofenac) can be used.

【００６６】 用語「界面活性剤」としては、アニオン性、カチオン性、両イオン性および非
イオン性の界面活性剤が挙げられる。代表的な界面活性剤としては、タウロコレ
ート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチルピリジウム、ベナル
コニウムクロリド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４界面活性剤、ＣＨＡＰＳ
（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオル］−１−プロパンスル
ホン酸水和物）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔ
ｏｎ−Ｘ−１００界面活性剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシ
ド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ−Ｆ６８界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ ２０界面活性剤および
ＴＷＥＥＮ ８０界面活性剤（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。The term “surfactant” includes anionic, cationic, zwitterionic and nonionic surfactants. Representative surfactants include taurocholate, deoxycholate, taurodeoxycholate, cetylpyridium, benalconium chloride, Zwittergent 3-14 surfactant, CHAPS
(3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid hydrate), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, Trit
on-X-100 surfactant, C12E8, octyl-BD-glucopyranoside, PLURONIC-F68 surfactant, Tween 20 surfactant and TWEEN 80 surfactant (CalBiochem Biochemical).
s), but is not limited thereto.

【００６７】 本発明の単位投薬処方物は、凍結乾燥形態の請求項１の組換えアデノウイルス
、および凍結乾燥製品の再構成のための溶液を含む製品のキットに含まれ得る。
本発明の組換えアデノウイルスは、従来の手順により凍結乾燥され得、そして再
構成され得る。A unit dosage formulation of the invention may be included in a kit of products comprising the recombinant adenovirus of claim 1 in lyophilized form and a solution for reconstitution of the lyophilized product.
The recombinant adenovirus of the present invention can be lyophilized and reconstituted by conventional procedures.

【００６８】 本発明は、本発明の組換えアデノウイルスの薬学的に受容可能な処方物の投与
による、インビボでの哺乳動物生物体における新生物細胞の除去方法を提供する
。用語「除去（ａｂｌａｔｉｎｇ）」は、新生物細胞の存在の生理学的疾病状態
（ｍａｌａｄｉｃｔｉｏｎ）を軽減するための生存可能な新生物細胞の集団の実
質的な減少を意味する。用語「実質的な」は、哺乳動物生物体中の生存可能な新
生物細胞の集団の、前処置集団の約２０％より大きい減少を意味する。用語「生
存可能な」は、新生物細胞の制御されていない増殖特徴および細胞周期調節特徴
を有することを意味する。用語「生存可能な新生物細胞」は、もはや複製し得な
い新生物細胞からこの細胞を区別するために本明細書において使用される。例え
ば、腫瘍塊は、処置後も残存し得るが、腫瘍塊を含む細胞集団は死に得る。ある
程度の腫瘍塊が残存し得るとしても、これらの死んだ細胞は、除去され、そして
複製する能力が欠失している。The present invention provides a method of removing neoplastic cells in a mammalian organism in vivo by administering a pharmaceutically acceptable formulation of a recombinant adenovirus of the present invention. The term "ablating" means a substantial reduction in the population of viable neoplastic cells to reduce the physiologic disease state of the presence of the neoplastic cells. The term "substantial" means a reduction of the population of viable neoplastic cells in a mammalian organism that is greater than about 20% of the pre-treatment population. The term “viable” means having the uncontrolled growth and cell cycle regulatory characteristics of a neoplastic cell. The term "viable neoplastic cell" is used herein to distinguish this cell from neoplastic cells that can no longer replicate. For example, a tumor mass may survive treatment, but a cell population containing the tumor mass may die. Even though some tumor mass may remain, these dead cells are removed and lack the ability to replicate.

【００６９】 用語「哺乳動物生物体」は、ヒト、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコを含むがこ
れらに限定されない。好ましくは、処置される哺乳動物の型に内在性のアデノウ
イルスベクターを用いる。処置されるべき種由来のウイルスを使用することが一
般に好ましいが、ある場合には、有利な病原性特性を有する異なる種から誘導さ
れたベクターを用いることが有利であり得る。例えば、ヒトアデノウイルスベク
ターの免疫応答特性を最小限にするために、ヒツジのアデノウイルスベクターが
、ヒト遺伝子治療において用いられ得ることが報告されている（１９９７年４月
１０日公開、ＷＯ ９７／０６８２６）。免疫応答を最小限にすることにより、
ベクターの迅速な全身的クリアランスが回避され、このベクターのより長い作用
持続時間を生じる。[0069] The term "mammalian organism" includes, but is not limited to, humans, pigs, horses, cows, dogs, cats. Preferably, an adenoviral vector endogenous to the type of mammal being treated is used. While it is generally preferred to use a virus from the species to be treated, in some cases it may be advantageous to use vectors derived from different species that have advantageous pathogenic properties. For example, it has been reported that sheep adenoviral vectors can be used in human gene therapy to minimize the immune response properties of human adenoviral vectors (published April 10, 1997, WO 97 /. 06826). By minimizing the immune response
Rapid systemic clearance of the vector is avoided, resulting in a longer duration of action of the vector.

【００７０】 本発明は、組換えアデノウイルス単独の使用の方法を提供するが、本発明の組
換えアデノウイルスおよびそれらの処方物は、従来の化学療法剤または処置レジ
メンと組み合わせて使用され得る。このような化学療法剤の例としては、プリン
合成のインヒビター（例えば、ペントスタチン、６−メルカプトプリン、６−チ
オグアニン、メトトレキサート）またはピリミジン合成のインヒビター（例えば
、Ｐａｌａ、アザリビン（ａｚａｒｂｉｎ））、リボヌクレオチドからデオキシ
リボヌクレオチドへの変換のインヒビター（例えば、ヒドロキシウレア）、ｄＴ
ＭＰ合成のインヒビター（５−フルオロウラシル）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、照
射、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビ
シン、ドキソルビシン、ミトザントロン、アルキル化剤、マイトマイシン、シス
プラチン、プロカルバジン）、ならびに微小管機能のインヒビター（例えば、ビ
ンカアルカロイドおよびコルヒチン）が挙げられる。化学療法処置レジメンとは
、放射線療法のような新生物細胞を除去するために設計された非化学的な手順を
主にいう。治療用遺伝子がｐ５３である場合の併用療法の例は、Ｎｉｅｌｓｅｎ
ら ＷＯ／９８３５５５４Ａ２（１９９８年８月２０日公開）に記載されている
。Although the present invention provides methods of using recombinant adenoviruses alone, the recombinant adenoviruses and their formulations of the present invention can be used in combination with conventional chemotherapeutic agents or treatment regimens. Examples of such chemotherapeutic agents include inhibitors of purine synthesis (eg, pentostatin, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, methotrexate) or inhibitors of pyrimidine synthesis (eg, Pala, azaribine), ribonucleotides Inhibitors for the conversion of glycine to deoxyribonucleotides (eg, hydroxyurea), dT
Inhibitors of MP synthesis (5-fluorouracil), DNA damaging agents (eg, irradiation, bleomycin, etoposide, teniposide, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitozantrone, alkylating agents, mitomycin, cisplatin, procarbazine), and microtubule function Inhibitors such as vinca alkaloids and colchicine. Chemotherapy treatment regimens mainly refer to non-chemical procedures designed to remove neoplastic cells, such as radiation therapy. An example of a combination therapy where the therapeutic gene is p53 is Nielsen
WO / 9835554A2 (published August 20, 1998).

【００７１】 免疫学的応答は、ウイルスベクターのインビボでの反復投与に対して重要であ
る。従って、本発明のベクターは、免疫抑制剤と組み合わせて投与され得る。免
疫抑制剤の例としては、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、
シクロホスファミド、リンパ球免疫グロブリン、ＣＤ３複合体に対する抗体、副
腎皮質ステロイド、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌｚａｉｎｅ）、ＦＫ−
５０６、メトキサレンおよびサリドマイドが挙げられる。The immunological response is important for repeated administration of the viral vector in vivo. Thus, the vectors of the present invention can be administered in combination with an immunosuppressant. Examples of immunosuppressants include cyclosporine, azathioprine, methotrexate,
Cyclophosphamide, lymphocyte immunoglobulin, antibody to CD3 complex, corticosteroid, sulfasalazine, FK-
506, methoxsalen and thalidomide.

【００７２】 本発明はまた、エクスビボにおいて、新生物細胞により汚染された正常細胞の
集団への、本発明の組換えアデノウイルスの投与により、この集団における新生
物細胞を除去する方法を提供する。このような方法の適用の１例は、骨髄浄化（
ｐｕｒｇｉｎｇ）として通常知られた自己の幹細胞産物の浄化のようなエクスビ
ボの適用において、現在使用されている。用語「幹細胞産物」とは、筋切除（ｍ
ｙｏａｂｌａｔｉｖｅ）治療を受けた患者の長期の造血機能を再構成し得る造血
細胞、前駆細胞および幹細胞の集団をいう。幹細胞産物は、動員された末梢血ま
たは非動員末梢血のアフェレーシスにより従来得られる。アフェレーシスは、市
販のアフェレーシス装置（例えば、ＣＯＢＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１
１８５ Ｏａｋ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯから市販される、ＣＯ
ＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、公知の
手順の使用を通じて従来達成される。処置条件は、「３対数の浄化（３−ｌｏｇ
ｐｕｒｇｅ）」（すなわち、幹細胞産物からの腫瘍細胞の約９９．９％の除去
）を達成するように最適化されることが好ましく、そして「５対数浄化」（幹細
胞産物からの腫瘍細胞の約９９．９９９％の除去）を達成するように最適化され
ることが最も好ましい。本発明の好ましい実施において、１００ｍｌ容積の幹細
胞産物は、１×１０5〜１×１０9粒子の本発明の組換えアデノウイルスで、３７
℃で約４時間、処置される。The present invention also provides a method of removing neoplastic cells in a population of ex vivo, by administering the recombinant adenovirus of the present invention to a population of normal cells contaminated by the neoplastic cells. One example of the application of such a method is bone marrow purification (
It is currently used in ex vivo applications such as purifying autologous stem cell products, commonly known as purging. The term “stem cell product” refers to muscle resection (m
yoablative) refers to a population of hematopoietic cells, progenitor cells and stem cells that can reconstitute the long-term hematopoietic function of a treated patient. Stem cell products are conventionally obtained by apheresis of mobilized or unmobilized peripheral blood. Apheresis can be performed using a commercially available apheresis device (eg, COBE International, 1).
185 Oak Street, commercially available from Lakewood, CO
This is conventionally achieved through the use of known procedures using the BE Spectra Apheresis System. The treatment conditions are “3-log cleaning (3-log)
purge) (ie, about 99.9% removal of tumor cells from the stem cell product) and is preferably optimized to achieve a “5 logarithmic cleanup” (about 99% of tumor cells from the stem cell product). Most preferably to achieve a .999% removal). In a preferred practice of the invention, the stem cell product in a volume of 100 ml is 1 × 10 5 to 1 × 10 9 particles of the recombinant adenovirus of the invention, 37
Treat at 4 ° C. for about 4 hours.

【００７３】 上記の治療的な適用に加えて、本発明のベクターはまた診断目的にも有用であ
る。例えば、本発明のベクターは、ウイルス複製の際に、発現されるレポーター
遺伝子を組み込み得る。用語「レポーター遺伝子」とは、その産物が、さらなる
エレメントと組み合わせてか、または単独で検出可能なシグナルを生成し得る遺
伝子をいう。レポーター遺伝子の例としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ル
シフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、Ｘ線または磁場画像化シ
ステム（ＭＲＩ）のような画像化システムにより検出可能なタンパク質をコード
するヌクレオチド配列が挙げられる。このようなベクターはまた、蛍光標識され
た抗体のような結合分子により認識され得る細胞表面タンパク質を発現するため
に使用され得る。あるいは、応答性プロモーターが、ウイルス複製のリプレッサ
ー（例えば、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ）を駆動するために用いられる場合、後期ウイルスプ
ロモーター（例えば、Ｅ２Ｆ−Ｒｂにより停止されるＥ２）が、応答性プロモー
ターがオフである診断的な適用のためのレポーター遺伝子を駆動するために用い
られ得る。これらの診断構築物は、インビボまたはインビトロにおいて診断目的
のために用いられ得る。インビボ適用の例としては、Ｘ線、ＣＴスキャン、また
は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの画像化適用が挙げられる。In addition to the therapeutic applications described above, the vectors of the present invention are also useful for diagnostic purposes. For example, the vectors of the present invention may incorporate a reporter gene that is expressed during viral replication. The term "reporter gene" refers to a gene whose product, in combination with additional elements or alone, can produce a detectable signal. Examples of reporter genes include a β-galactosidase gene, a luciferase gene, a green fluorescent protein gene, a nucleotide sequence encoding a protein that can be detected by an imaging system such as an X-ray or magnetic field imaging system (MRI). Such vectors can also be used to express cell surface proteins that can be recognized by binding molecules, such as fluorescently labeled antibodies. Alternatively, when a responsive promoter is used to drive a repressor of viral replication (eg, E2F-Rb), the late viral promoter (eg, E2, which is stopped by E2F-Rb) turns off the responsive promoter. Can be used to drive a reporter gene for diagnostic applications. These diagnostic constructs can be used for diagnostic purposes in vivo or in vitro. Examples of in vivo applications include X-ray, CT scan, or imaging applications such as magnetic resonance imaging (MRI).

【００７４】 本発明はさらに、上記のＥ１ａ遺伝子産物のドメインに対して改変を含む組換
えアデノウイルスを生成する方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する
： ａ．本発明の組換えアデノウイルスを用いてプロデューサー細胞を感染させる
工程、 ｂ．このプロデューサー細胞中でのウイルスゲノムの複製を可能にする条件下
で、この感染したプロデューサー細胞を培養する工程、 ｃ．このプロデューサー細胞を収集する工程、および ｄ．この組換えアデノウイルスを精製する工程。The present invention further provides a method for producing a recombinant adenovirus comprising a modification to a domain of the E1a gene product described above. The method comprises the following steps: a. Infecting producer cells with the recombinant adenovirus of the invention, b. Culturing the infected producer cells under conditions that allow replication of the viral genome in the producer cells, c. Collecting the producer cells; and d. A step of purifying the recombinant adenovirus.

【００７５】 用語「感染させる」とは、組換えアデノウイルスでのプロデューサー細胞の感
染を容易にする条件下で、組換えアデノウイルスをプロデューサー細胞に曝露さ
せることを意味する。所定のウイルスの複数のコピーによって感染された細胞に
おいて、ウイルス複製およびビリオンパッケージングに必要な活性は協同的であ
る。従って、プロデューサー細胞がウイルスで多重感染される有意な可能性が存
在するように、条件を調整することが好ましい。プロデューサー細胞におけるウ
イルスの産生を増強する条件の例は、感染期におけるウイルス濃度の増加である
。しかし、プロデューサー細胞あたりのウイルス感染の総数が過度であり、この
細胞に対して毒性効果を生じ得る可能性がある。従って、１ｍｌあたり１０6〜
１０10ビリオンの範囲、好ましくは、１ｍｌあたり約１０9ビリオンのウイルス
濃度での感染を維持するように努めるべきである。化学薬剤もまた、プロデュー
サー細胞株の感染性を増加させるために使用され得る。例えば、本発明は、カル
パインインヒビターを含めることによって、ウイルス感染性についてプロデュー
サー細胞株の感染性を増加させるための方法を提供する。本発明の実施において
有用なカルパインインヒビターの例としては、カルパインインヒビター１（Ｎ−
アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナル（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ）と
してまた公知である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより市販される
））が挙げられる。カルパインインヒビター１は、プロデューサー細胞の組換え
アデノウイルスに対する感染性を増加させることが観察されている。The term “infecting” means exposing a recombinant adenovirus to a producer cell under conditions that facilitate infection of the producer cell with the recombinant adenovirus. In cells infected by multiple copies of a given virus, the activities required for virus replication and virion packaging are cooperative. It is therefore preferable to adjust the conditions so that there is a significant possibility that the producer cells will be multiply infected with the virus. An example of a condition that enhances virus production in a producer cell is an increase in virus concentration during the infection phase. However, it is possible that the total number of viral infections per producer cell is excessive and can produce toxic effects on this cell. Therefore, 10 6-
Efforts should be made to maintain infection at a virus concentration in the range of 10 10 virions, preferably about 10 9 virions per ml. Chemical agents can also be used to increase the infectivity of the producer cell line. For example, the invention provides a method for increasing the infectivity of a producer cell line for viral infectivity by including a calpain inhibitor. Examples of calpain inhibitors useful in the practice of the present invention include calpain inhibitor 1 (N-
Also known as acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal (commercially available from Boehringer Mannheim). Calpain inhibitor 1 has been observed to increase the infectivity of producer cells to recombinant adenovirus.

【００７６】 用語「プロデューサー細胞」とは、産生されるべき組換えアデノウイルスのウ
イルスゲノムの複製を容易にし得る細胞を意味する。種々の哺乳動物細胞株が、
組換えアデノウイルスの培養のために公に利用可能である。例えば、２９３細胞
株（ＧｒａｈａｍおよびＳｍｉｌｅｙ（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３
６：５９−７２）は、Ｅ１ａ機能における欠損を相補するように操作されており
、そしてこの現在のベクターの産生のために好ましい細胞株である。他のプロデ
ューサー細胞の例としては、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（
公報ＷＯ／９７／００３２６、出願番号ＰＣＴ／ＮＬ９６／００２４４において
記載される通り）が挙げられる。The term “producer cell” means a cell that can facilitate the replication of the viral genome of the recombinant adenovirus to be produced. Various mammalian cell lines
It is publicly available for cultivation of recombinant adenovirus. For example, the 293 cell line (Graham and Smiley (1977) J. Gen. Virol. 3)
6: 59-72) has been engineered to complement the defect in Ela function and is the preferred cell line for the production of this current vector. Examples of other producer cells include A549 cells, HeLa cells, PERC. 6 cells (
Publication WO / 97/00326, application number PCT / NL96 / 00244).

【００７７】 用語「ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する」とは、ウイルス
がプロデューサー細胞において増殖することを可能にするように、感染されたプ
ロデューサー細胞についての条件を維持することを意味する。各細胞によって産
生されるウイルス粒子の数を最大化するように、条件を制御することが望ましい
。従って、温度、溶存酸素、ｐＨなどのような反応条件をモニターおよび制御す
ることが必要である。ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎ
ｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．４４ Ｔａｌｍａ
ｄｇｅ Ｒｏａｄ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪから市販される）のような市販のバイオ
リアクターは、このようなパラメーターをモニターおよび維持するための設備を
有する。感染条件および培養条件の最適化は幾分変化するが、しかし、ウイルス
の効率的な複製および産生のための条件は、プロデューサー細胞株の公知の特性
、ウイルスの特性、バイオリアクターの型などを考慮して当業者によって達成さ
れ得る。２９３細胞をプロデューサー細胞株として使用する場合、酸素濃度は、
約５０％〜約１２０％の溶存酸素、好ましくは１００％の溶存酸素で、好ましく
は維持される。ウイルス粒子の濃度（例えば、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムを使
用してＨＰＬＣのような従来の方法によって決定される）が、プラトーに達し始
めた時に、このリアクターを収集する。The term “culturing under conditions that allow the replication of the viral genome” refers to maintaining conditions for infected producer cells to allow the virus to grow on the producer cells. means. It is desirable to control the conditions so as to maximize the number of virus particles produced by each cell. Therefore, it is necessary to monitor and control reaction conditions such as temperature, dissolved oxygen, pH, etc. CelliGen Plus Bioreactor (N
ew Brunswick Scientific, Inc. 44 Talma
Commercially available bioreactors (such as commercially available from dge Road, Edison, NJ) have facilities to monitor and maintain such parameters. The optimization of infection and culture conditions will vary somewhat, but conditions for efficient replication and production of the virus will take into account the known characteristics of the producer cell line, the characteristics of the virus, the type of bioreactor, etc. And can be achieved by those skilled in the art. When using 293 cells as a producer cell line, the oxygen concentration
It is preferably maintained at about 50% to about 120% dissolved oxygen, preferably 100% dissolved oxygen. The reactor is collected when the concentration of virus particles (eg, as determined by conventional methods such as HPLC using a Resource Q column) begins to plateau.

【００７８】 用語「収集する」とは、培地からの組換えアデノウイルスを含む細胞の採集を
意味する。これは、差示的遠心分離またはクロマトグラフィー手段のような従来
の方法によって達成され得る。この段階で、この収集された細胞を保存し得るか
、または溶解および精製によってさらに処理して、組換えウイルスを単離し得る
。保存のために、この収集された細胞は、生理学的ｐＨで、またはその付近で緩
衝化させて、そして−７０Ｃで凍結させるべきである。The term “harvesting” refers to the collection of cells containing the recombinant adenovirus from the culture medium. This can be achieved by conventional methods such as differential centrifugation or chromatographic means. At this stage, the harvested cells can be preserved or further processed by lysis and purification to isolate the recombinant virus. For storage, the harvested cells should be buffered at or near physiological pH and frozen at -70C.

【００７９】 用語「溶解」とは、プロデューサー細胞の破壊をいう。溶解は、当該分野で周
知の種々の手段によって達成され得る。プロデューサー細胞からウイルス粒子を
単離することが所望される場合、この細胞を、当該分野で周知の種々の手段を使
用して溶解させる。例えば、哺乳動物細胞を、低圧（１００〜２００ｐｓｉの圧
力差）条件下で溶解させ得るか、または従来の凍結融解法で溶解させ得る。外因
性の遊離ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅでの分解によって除去され
る。The term “lysis” refers to the destruction of a producer cell. Lysis can be achieved by various means well known in the art. If it is desired to isolate the virus particles from the producer cells, the cells are lysed using various means well known in the art. For example, mammalian cells can be lysed under low pressure (100-200 psi pressure differential) conditions, or by conventional freeze-thaw methods. Exogenous free DNA / RNA is removed by degradation with DNAse / RNAse.

【００８０】 用語「精製する」とは、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団の、この溶
解させたプロデューサー細胞からの単離を意味する。クロマトグラフィー方法ま
たは差示的密度勾配遠心分離方法のような従来の精製技術を使用し得る。本発明
の好ましい実施において、ウイルスは、１９９８年１１月１７日に発行されたＳ
ｈａｂｒａｍら，米国特許第５，８３７，５２０号（その教示全体は本明細書中
で参考として援用される）に記載のように、Ｈｕｙｇｈｅら（１９９５）Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４０３−１４１６のプロセスに実質的
に従って、カラムクロマトグラフィーによって精製される。The term “purify” refers to the isolation of a substantially pure population of recombinant virus particles from the lysed producer cells. Conventional purification techniques such as chromatographic methods or differential density gradient centrifugation methods can be used. In a preferred implementation of the present invention, the virus is the S virus issued on November 17, 1998.
Huyghe et al. (1995) Hum, as described in Habram et al., US Pat. No. 5,837,520, the entire teachings of which are incorporated herein by reference.
Purified by column chromatography substantially according to the process of An Gene Therapy 6: 1403-1416.

【００８１】 本発明の組換えアデノウイルスの産生を最適化するためのさらなる方法および
手順は、同時係属中の米国特許出願番号０９／０７３，０７６（１９９８年５月
４日出願）において記載される。Further methods and procedures for optimizing the production of the recombinant adenovirus of the invention are described in co-pending US patent application Ser. No. 09 / 073,076, filed May 4, 1998. .

【００８２】 （実施例） 本発明が、本発明の趣旨または必須の特徴から逸脱することなく、以下に具体
的に開示される形態以外の形態で具体化され得ることは、本発明が関与する分野
の当業者に明らかである。それゆえ、以下に記載される本発明の特定の実施形態
は、例示であって限定ではないとみなされるべきである。以下の実施例では、「
ｇ」はグラムを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを
意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「分」は分を意味し、「ＦＢＳ」はウシ胎
児血清を意味し、そして「ＰＮ」は粒子数を記載する。(Examples) It is to be understood that the present invention can be embodied in forms other than those specifically disclosed below without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. It will be apparent to those skilled in the art. Therefore, the specific embodiments of the invention described below are to be considered illustrative and not limiting. In the following example, "
"g" means gram, "ml" means milliliter, "mol" means mole, "C" means degree Celsius, "minute" means minute, "FBS" means cow Fetal serum is meant, and "PN" describes the particle number.

【００８３】 （実施例１．組換えアデノウイルスＥ１Ａｄｌ０１／０７の構築） Ｊｅｌｓｍａら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３、４９４−５０２に記
載されるような、インフレームの欠失変異ｄｌ１１０１およびｄｌ１１０７を、
Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）ＰＮＡＳ ８２、４８８−４９２により改変された、
ＺｏｅｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８４）ＤＮＡ ３、４７９−４８８のオ
リゴヌクレオチド部位特異的技術を用いて構築した。変異誘発のために用いた試
薬、細菌株およびＭ１３ベクターの全ては、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅインビトロ変異
誘発キット（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡから市販される）におい
て提供された。Ｅ１Ａ領域の変異誘発のために用いたＭ１３テンプレートＤＮＡ
は、Ｍ１３ｍｐ１９のマルチクローニング配列においてＢａｍＨＩ制限酵素部位
とＸｂａＩ制限酵素部位との間に挿入された、ヌクレオチド２２位〜１３３９位
のＡｄ５配列を含んでいた。次いで、Ｍ１３ｍｐ１９Ｅ１Ａと命名された、生成
されたバクテリオファージ構築物を、ｄｕｔ ｕｎｇ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌株ＣＪ
２３６において増殖させ、これは、新たに合成されるＤＮＡにおいてチミジンの
代わりのウラシルの偶然の取り込みを生じた。除去されるべきであった配列のい
ずれかの側において、１１ヌクレオチドまたは１２ヌクレオチドのいずれかのＡ
ｄ５センスＤＮＡ配列からなるように、Ｅ１変異体の構築のためのオリゴヌクレ
オチドを合成した。Example 1 Construction of Recombinant Adenovirus E1Ad101 / 07 In-frame deletion mutations dl1101 and dl1107 as described in Jelsma et al. (1998) Virology 163, 494-502 were constructed.
Modified by Kunkel (1985) PNAS 82, 488-492,
Zoeller and Smith (1984) DNA 3, 479-488, were constructed using oligonucleotide site-specific techniques. All of the reagents, bacterial strains and M13 vectors used for mutagenesis were provided in the Muta-Gene in vitro mutagenesis kit (commercially available from Bio Rad, Hercules, CA). M13 template DNA used for mutagenesis of E1A region
Contained the Ad5 sequence at nucleotide positions 22 to 1339, inserted between the BamHI and XbaI restriction sites in the multicloning sequence of M13mp19. The resulting bacteriophage construct, designated M13mp19E1A, was then cloned into dut ung E. coli. coli bacterial strain CJ
Growed at 236, which resulted in the accidental incorporation of uracil instead of thymidine in the newly synthesized DNA. On either side of the sequence that should have been removed, A of either 11 or 12 nucleotides
Oligonucleotides for the construction of E1 variants were synthesized to consist of the d5 sense DNA sequence.

【００８４】 変異誘発反応に関して、変異誘発オリゴヌクレオチドを５’末端にて最初にリ
ン酸化し、次いでウラシル含有Ｍ１３ｍｐ１１Ｅ１Ａの一本鎖テンプレートＤＮ
Ａにアニーリングした。アニーリングされたプライマー／テンプレート反応系を
、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびデオキシリボヌクレ
オチド（ｄＴＡＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）とともにインキュベー
トして、目的のＥ１Ａ変異を含む相補鎖を合成した。次いで、相補鎖合成反応物
を、ｕｎｇ+野生型宿主細菌株ＭＶ１１９０に形質転換した。形質転換後、ウラ
シルを含む親のＭ１３ｍｐ１９Ｅ１Ａ ＤＮＡ鎖は、ＭＶ１１９０において効率
的に複製し得ない。それゆえ、目的のＥ１Ａ変異を含む複製形態の二本鎖ＤＮＡ
を濃縮する。潜在的なＥ１Ａ変異体からのＭ１３ｍｐ１９Ｅ１ＡファージＤＮＡ
を、最初に制限酵素分析によって、次いでＤＮＡ配列決定（両方の鎖において）
によってスクリーニングして、所望のＥ１Ａ変異を確認した。For the mutagenesis reaction, the mutagenized oligonucleotide was first phosphorylated at the 5 ′ end and then the uracil-containing M13mp11E1A single-stranded template DN.
Annealed to A. The annealed primer / template reaction system was incubated with T4 DNA polymerase, T4 DNA ligase and deoxyribonucleotides (dTAP, dCTP, dGTP and dTTP) to synthesize a complementary strand containing the E1A mutation of interest. The complementary strand synthesis reaction was then transformed into ung + wild-type host bacterial strain MV1190. After transformation, the parental M13mp19E1A DNA strand containing uracil cannot replicate efficiently in MV1190. Therefore, a duplicated double-stranded DNA containing the E1A mutation of interest
Is concentrated. M13mp19E1A phage DNA from potential E1A mutant
Was first analyzed by restriction analysis and then by DNA sequencing (on both strands)
To confirm the desired E1A mutation.

【００８５】 Ｅ１Ａｄｌ０１／０７アデノウイルスの構築を、ＭｃＧｏｒｙら（１９８８）
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３、６１４−６１７の方法によって、アデノウイルスＥ
１領域含有２９３細胞株における相同組換えを用いることによって実施した。こ
の方法は、２つのプラスミドを必要とし、一方はｗｔＡｄ５ゲノム全体を含むウ
イルスプラスミドであり、そして他方はｄｌ０１／０７二重Ｅ１Ａ変異体を有す
るＥ１Ａ遺伝子を含む移入プラスミドである。この研究のために用いたこのウイ
ルスプラスミドは、非感染性の４０ｋｂプラスミドであるｐＪＭ１７であった。
ｐＪＭ１７は、Ａｄ５ｄｌ３０９ゲノム全体を含み、ここで４．４ｋｂのプラス
ミドｐＢＸが唯一のＸｂａＩ部位に挿入されている。用いた移入プラスミドｐＬ
Ｅ２は、ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン遺伝子中にクローニングされた２２〜
１７７４のｗｔＡｄ５配列を含む（Ｊｅｌｓｍａら（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １６３、４９４−５０２）。これらを構築したＭ１３ｍｐ１９バックグラウ
ンドからのＥ１Ａ ｄｌ１１０１およびｄｌ１１０７ Ｅ１ａ変異体の移入に関
して、ｐＬＥ２における野生のＥ１Ａ制限酵素フラグメントを、Ｍ１３ｍｐ１９
Ｅ１ｄｌ１１０１およびＭ１３ｍｐ１９Ｅ１Ａｄｌ１１０７からの同族の変異し
たＥ１Ａフラグメントによって置換して、ｐＬＥ２Ｅ１Ａｄｌ０１／０７を作製
した。アデノウイルスＥ１Ａｄｌ０１／０７を生成する組換えに関して、ウイル
スプラスミドｐＪＭ１７およびｐＬＥ２Ｅ１Ａｄｌ０１／０７を、リン酸カルシ
ウム媒介トランスフェクションによって２９３細胞に同時トランスフェクトした
。５時間後、沈殿物をリンスし、そして細胞に、アガロースを含む増殖培地を重
層してウイルスプラークを単離した。最初のトランスフェクションの７〜１０日
後、ウイルスプラークを単離し、プラークを２回精製し、続いて制限酵素分析お
よびＤＮＡ配列決定を用いてウイルスＤＮＡをスクリーニングした。ウイルスス
トックを、二重塩化セシウム勾配によって精製し、そしてＨｕｙｇｈｅら（１９
９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４０３−１４１６に記載
されるようにカラムクロマトグラフィーによって定量した。The construction of the E1Ad101 / 07 adenovirus was described by McGory et al. (1988).
Adenovirus E by the method of Virology 163, 614-617.
This was performed by using homologous recombination in a 293 cell line containing one region. This method requires two plasmids, one is a viral plasmid containing the entire wtAd5 genome, and the other is a transfer plasmid containing the E1A gene with the d101 / 07 double E1A mutant. The viral plasmid used for this study was pJM17, a non-infectious 40 kb plasmid.
pJM17 contains the entire Ad5dl309 genome, where the 4.4 kb plasmid pBX has been inserted into the unique XbaI site. Transfer plasmid pL used
E2 was cloned into the tetracycline gene of pBR322 from 22-
Containing the 1774 wtAd5 sequence (Jelsma et al. (1988) Virlog
y 163, 494-502). For the transfer of the E1A dl1101 and dl1107 E1a mutants from the M13mp19 background from which they were constructed, the wild E1A restriction enzyme fragment in pLE2 was transformed with the M13mp19 background.
Substitution by homologous mutated E1A fragments from E1dl1101 and M13mp19E1Adl1107 generated pLE2E1Adl01 / 07. For recombination producing adenovirus E1Ad101 / 07, 293 cells were co-transfected with viral plasmids pJM17 and pLE2E1Ad101 / 07 by calcium phosphate mediated transfection. After 5 hours, the precipitate was rinsed and the cells were overlaid with growth medium containing agarose to isolate viral plaques. Seven to ten days after the first transfection, viral plaques were isolated, plaques were purified twice, and subsequently screened for viral DNA using restriction enzyme analysis and DNA sequencing. The virus stock was purified by a double cesium chloride gradient and Huygh et al.
95) Quantified by column chromatography as described in Human Gene Therapy 6: 1403-1416.

【００８６】 （実施例２．Ｅ１Ｂｄｌ５５Ｋの構築） Ｅ１Ｂｄｌ５５Ｋアデノウイルスを、上記の実施例１の教示に実質的に従って
オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発を用いることにより調製した。この手順
を用いて、制限酵素ヌクレアーゼ切断部位をＥ１Ｂ ５５Ｋコード領域に導入し
た。最初の部位を、野生型Ａｄ５ゲノムの２２４７位および２２４８位を改変す
ることにより導入し、ここで、グアニン2247をチミジンで置換し、そしてチミジ
ン2248をシトシンで置換し（それぞれ）、ＥｃｏＲＩ切断部位を導入した。これ
は、７７位でバリンからセリンへのＥ１Ｂコード配列の改変をもたらした。第２
の制限部位を、３２７２位に導入し、ここでチミジン３２７２をシトシン部位（
サイレントな変異）で置換してＸｈｏＩ部位を導入した。新たな制限酵素部位を
、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いる制限酵素消化において用いた。ＥｃｏＲＩ
およびＸｈｏＩ部位を、小さなポリリンカーカセットで再度連結して、ｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から
単離されたポリリンカーを導入した。得られるＥ１Ｂ変異は、Ｅ１Ｂ５５Ｋタン
パク質の最初の７６アミノ酸、続いて１８個のミスセンスアミノ酸をコードする
コード配列をもたらし、非機能的な欠失したＥ１Ｂタンパク質をもたらす。Example 2. Construction of E1Bd155K E1Bd155K adenovirus was prepared by using oligonucleotide site-directed mutagenesis substantially in accordance with the teachings of Example 1 above. Using this procedure, a restriction enzyme nuclease cleavage site was introduced into the E1B 55K coding region. An initial site was introduced by modifying positions 2247 and 2248 of the wild-type Ad5 genome, where guanine 2247 was replaced with thymidine and thymidine 2248 was replaced with cytosine (respectively), creating an EcoRI cleavage site. Introduced. This resulted in a modification of the E1B coding sequence at position 77 from valine to serine. Second
Is introduced at position 3272, where thymidine 3272 is replaced with a cytosine site (
(Silent mutation) to introduce an XhoI site. New restriction sites were used in restriction digests with EcoRI and XhoI. EcoRI
And the XhoI site are religated with a small polylinker cassette to give pBlu
A polylinker isolated from eScriptSK (Stratagene, San Diego, CA) was introduced. The resulting E1B mutation results in a coding sequence that encodes the first 76 amino acids of the E1B55K protein followed by 18 missense amino acids, resulting in a non-functional deleted E1B protein.

【００８７】 （実施例３．インビボでのマウスモデル） ０日目に、３０匹の無胸腺ヌードｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ
−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）に、各脇腹に、２００マイ
クロリットルのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の約１×１０7個の
Ｃ３３Ａ頸癌細胞を注射した。Ｃ３３Ａ細胞は、ヒト頸癌組織に由来し、そして
ｐ５３ネガティブなＲｂネガティブな遺伝子型を有する。そして、Ｃ３３Ａ細胞
を、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。この腫瘍を、６日
間増殖させ、この時点で、腫瘍は約１００ｍｍ3の触知可能なサイズに達した。
これらの動物を腫瘍サイズについて無作為化して各々５動物の６つの群にした。
各動物に、６０マイクロリットルのＰＢＳ中の２．５×１０9粒子の各異なるア
デノウイルス構築物を、Ｃ３３Ａ投与後７日目、８日目、９日目、１０日目およ
び１１日目に腫瘍内注射した。各注射を、４つの腫瘍象限の間に分けた。腫瘍の
サイズを、Ｃ３３Ａ注射後の６日目、９日目、１３日目、１６日目、２０日目、
２３日目、２７日目、３０日目および３４日目に決定した。Example 3 In Vivo Mouse Model On day 0, 30 athymic nude nu mice (Harlan-Sprague)
-Dawley, the Indianapolis IN), each flank was injected with 200 microliters of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) about 1 × 10 7 C33A cancer cells in. C33A cells are derived from human cervical cancer tissue and have a p53-negative Rb-negative genotype. Then, C33A cells were obtained from the American Type Culture Collection. The tumors were grown for 6 days, at which time the tumor reached a palpable size of approximately 100 mm 3.
These animals were randomized for tumor size into six groups of five animals each.
Each animal received 2.5 × 10 9 particles of each different adenovirus construct in 60 microliters of PBS at 7 days, 8 days, 9 days, 10 days and 11 days after C33A administration. Injection. Each injection was divided between four tumor quadrants. Tumor sizes were determined on days 6, 9, 13, 13, 20, 20 after C33A injection.
Determinations were made on days 23, 27, 30, and 34.

【００８８】 （実施例４．Ｅ１Ａｄｌ０１／０８の構築） 組換えアデノウイルスＥ１Ａｄｌ０１／０８を、移入プラスミドがインフレー
ムの欠失変異体を組み込んで、Ｅ１Ａの２８９Ｒタンパク質および２４３Ｒタン
パク質のアミノ酸１２４〜１２７を除去すること以外は、上記の実施例１の教示
に実質的に従って調製した。Example 4. Construction of E1Ad101 / 08 Recombinant adenovirus E1Ad101 / 08 was transformed with amino acids 124-127 of E1A's 289R and 243R proteins, incorporating a deletion mutant whose transfer plasmid was in-frame. Prepared substantially according to the teachings of Example 1 above, except for removal.

【００８９】 （実施例５．Ｅ１Ａｄ４３／０８の構築） 組換えアデノウイルスＥ１Ａｄｌ４３／０８を、移入プラスミドがインフレー
ムの欠失変異体を組み込んで、Ｅ１Ａの２８９Ｒタンパク質および２４３Ｒタン
パク質のアミノ酸３８〜６０およびアミノ酸１２４〜１２７を除去すること以外
は、上記の実施例１の教示に実質的に従って調製した。Example 5. Construction of E1Ad43 / 08 Recombinant adenovirus E1Ad43 / 08 was transformed with amino acids 38-60 of E1A's 289R and 243R proteins by incorporating an in-frame deletion mutant of the transfer plasmid. Prepared substantially in accordance with the teachings of Example 1 above, except that amino acids 124-127 were removed.

【００９０】 （実施例６．Ｅ２Ｆ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７の構築） 組換えアデノウイルスＥ２Ｆ−Ｅ１Ａ０１／０７とは、Ｅ２Ｆ経路応答性プロ
モーターを用いて、改変されたＥ１ａコード配列の発現を駆動する、ウイルスを
記載する。ベースのベクター（Ｅ１Ａｄｌ０１／０７）を、上記の実施例１の教
示に従って調製する。しかし、移入プラスミドを、Ｅ１ａプロモーター機能を、
Ｐａｒｒら（１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：１１４５−１１
４９）に記載されたＥ２Ｆ応答性プロモーターで置換するように改変する。Example 6 Construction of E2F-E1Ad101 / 07 Recombinant adenovirus E2F-E1A01 / 07 is a virus that uses a E2F pathway responsive promoter to drive the expression of a modified E1a coding sequence. Is described. A base vector (E1Ad101 / 07) is prepared according to the teachings of Example 1 above. However, the transfer plasmid, the E1a promoter function,
Parr et al. (1997, Nature Medicine 3: 1145-11).
The modification is performed so as to substitute the E2F-responsive promoter described in 49).

【００９１】 （実施例７．Ｅ２Ｆ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７ ｐ５３ＣＯＮ−Ｅ２Ｆ−ＲＢの
構築） 組換えアデノウイルスＥ２Ｆ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７ ｐ５３ＣＯＮ−Ｅ２Ｆ
−ＲＢは、上記の実施例９の教示に実質的に従って調製されるＥ２Ｆ−Ｅ１Ａｄ
ｌ０１／０７ベクターであり、そしてさらに、ウイルス複製のインヒビター（Ｅ
２Ｆ−Ｒｂ）の発現を駆動するｐ５３経路応答性プロモーターをコードする発現
カセットを含む。ウイルス複製のインヒビター（Ｅ２Ｆ−Ｒｂ）の発現を駆動す
るｐ５３経路応答性プロモーターをコードする発現カセットを以下の通りに調製
する。適切な制限部位を伴う、１９９５年１２月６日に公開された欧州特許出願
第９４１０８４４５．１号（公開第０ ６８５ ４９３ Ａ１号）に記載される
ような、野生型Ｅ２Ｆのアミノ酸９５〜２８６および野生型Ｒｂタンパク質のア
ミノ酸３７９〜９２８を含む融合タンパク質をコードする合成ＤＮＡ配列を、従
来の技術によって調製する。ｐ５３経路応答性プロモーター５３−ＣＯＮは、Ｓ
Ｖ４０ ＴＡＴＡボックスの上流の２つの合成ｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配
列の挿入によって構築された合成ｐ５３経路応答性プロモーターである（Ｆｕｎ
ｋら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２８６６−２８７１に記
載された通り）。ｐ５３ＣＯＮは、相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングす
ることにより構築され得、そしてｐ５３応答性プロモーターは、プラスミドｐＧ
Ｌ３−プロモータールシフェラーゼベクター（ＰｒｏＭｅｇａから市販される）
にクローニングすることにより構築され得る。この配列を、ｄｌ３０９アデノウ
イルス（ａｄｅｎｖｉｒｕｓ）のＥ３領域に相同組換えによって導入する。Example 7 Construction of E2F-E1Ad101 / 07 p53CON-E2F-RB Recombinant Adenovirus E2F-E1Ad101 / 07 p53CON-E2F
-RB is E2F-E1Ad prepared substantially according to the teachings of Example 9 above
101/07 vector, and furthermore, inhibitors of viral replication (E
An expression cassette encoding a p53 pathway responsive promoter driving the expression of 2F-Rb). An expression cassette encoding a p53 pathway responsive promoter driving expression of an inhibitor of viral replication (E2F-Rb) is prepared as follows. Amino acids 95-286 of wild-type E2F, as described in European Patent Application No. 94108445.1 published on Dec. 6, 1995 (publication No. 0 685 493 A1), with appropriate restriction sites A synthetic DNA sequence encoding a fusion protein comprising amino acids 379-928 of the wild-type Rb protein is prepared by conventional techniques. The p53 pathway responsive promoter 53-CON
A synthetic p53 pathway responsive promoter constructed by insertion of two synthetic p53 consensus DNA binding sequences upstream of the V40 TATA box (Fun
k et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2866-2871). p53CON can be constructed by annealing complementary oligonucleotides, and a p53-responsive promoter is constructed using plasmid pG
L3-promoter luciferase vector (commercially available from ProMega)
And can be constructed by cloning into This sequence is introduced into the E3 region of dl309 adenovirus by homologous recombination.

【００９２】 （実施例８．Ｅ２Ｆ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−ＳＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ） ベクターＥ２Ｆ−Ｅ１Ａｄｌ０１／０７−ＳＲＥ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを、上記の実
施例１０の教示に実質的に従って調製する。しかし、ｐ５３経路応答性プロモー
ターｐ５３ＣＯＮの代わりに、ＴＧＦ−β経路応答性プロモーター（ＳＲＥ）を
用いて、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質の発現を駆動する。ＳＲＥとは、Ｓｍａｄ
−４ ＤＮＡ結合配列（Ｚａｗｅｌら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １：６１
１−６１７に記載された通りのＧＴＣＴＡＧＡＣ）の４つの反復物を含む合成Ｔ
ＧＦ−β応答性エレメントをいう。ＳＲＥ応答性エレメントは、Ｓｍａｄ−４結
合配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、そしてプラス
ミドｐＧＬ＃３−プロモータールシフェラーゼベクター（ＰｒｏＭｅｇａから市
販される）にクローニングすることにより作製され得る。Example 8. E2F-E1Ad101 / 07-SRE-E2F-Rb The vector E2F-E1Ad101 / 07-SRE-E2F-Rb is prepared substantially according to the teachings of Example 10 above. However, instead of the p53 pathway responsive promoter p53CON, a TGF-β pathway responsive promoter (SRE) is used to drive expression of the E2F-Rb fusion protein. What is SRE?
-4 DNA binding sequence (Zawel et al. (1988) Mol. Cell 1:61).
Synthetic T containing four repeats of GTCTAGAC) as described in 1-617
Refers to a GF-β responsive element. The SRE responsive element can be made by annealing a complementary oligonucleotide encoding the Smad-4 binding sequence and cloning into the plasmid pGL # 3-promoter luciferase vector (commercially available from ProMega).

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、１．８×１０9粒子／１ｍｌの濃度で、示されたウイルス構築物に感
染させ、そしてクリスタルバイオレットで染色したＣ３３Ａ細胞の顕微鏡写真（
×１００）である。FIG. 1 shows a photomicrograph of C33A cells infected with the indicated viral construct and stained with crystal violet at a concentration of 1.8 × 10 9 particles / ml.
× 100).

【図２】 図２は、ウイルス濃度が１．８×１０8粒子／１ｍｌであったことを除いて、
図１に示した顕微鏡写真と類似の実験結果を示す。FIG. 2 shows that, except that the virus concentration was 1.8 × 10 8 particles / ml.
2 shows an experimental result similar to the micrograph shown in FIG.

【図３】 図３は、ウイルス濃度が１．８×１０7粒子／１ｍｌであったことを除いて、
図１に示した顕微鏡写真と類似の実験結果を示す。FIG. 3 shows that the virus concentration was 1.8 × 10 7 particles / ml.
2 shows an experimental result similar to the micrograph shown in FIG.

【図４】 図４は、１．８×１０9粒子／１ｍｌの濃度で、示されたウイルス構築物に感
染させ、そしてクリスタルバイオレットで染色したＭＲＣ９細胞の顕微鏡写真（
×１００）である。FIG. 4 is a photomicrograph of MRC9 cells infected with the indicated viral construct at a concentration of 1.8 × 10 9 particles / ml and stained with crystal violet (FIG.
× 100).

【図５】 図５は、ウイルス濃度が１．８×１０8粒子／１ｍｌであったことを除いて、
図４に示した顕微鏡写真と類似の実験結果を示す。FIG. 5 shows that the virus concentration was 1.8 × 10 8 particles / ml.
5 shows an experimental result similar to the micrograph shown in FIG.

【図６】 図６は、ウイルス濃度が１．８×１０8粒子／１ｍｌであったことを除いて、
図１に示した顕微鏡写真と類似の実験結果を示す。FIG. 6 shows that the virus concentration was 1.8 × 10 8 particles / ml.
2 shows an experimental result similar to the micrograph shown in FIG.

【図７】 図７は、示した種々の細胞株における感染して４８時間後のウイルスの生成を
示す棒グラフである。細胞を、１．８×１０9粒子／１ｍｌの粒子濃度で感染さ
せた。FIG. 7 is a bar graph showing virus production 48 hours post infection in the various cell lines shown. Cells were infected at a particle concentration of 1.8 × 10 9 particles / ml.

【図８】 図８は、ウイルス濃度が１．８×１０8粒子／１ｍｌであったことを除いて、
図７に示した棒グラフと類似の実験結果を示す。FIG. 8 shows that the virus concentration was 1.8 × 10 8 particles / ml.
FIG. 8 shows an experimental result similar to the bar graph shown in FIG. 7.

【図９】 図９は、Ｅ１ａメッセージ（ｍＲＮＡ）の差次的スプライシングを示すマップ
である。FIG. 9 is a map showing differential splicing of E1a messages (mRNA).

【図１０】 図１０は、Ｅ１ａコード配列における種々の変異および表現型の図示である。FIG. 10 is an illustration of various mutations and phenotypes in the E1a coding sequence.

【図１１】 図１１は、正常肺内皮細胞（パネルＡ）およびＡ５４９肺内皮腫瘍細胞（パネ
ルＢ）における細胞殺傷を達成するために必要とされる有効用量に関連するデー
タのグラフである。垂直軸は、非感染コントロールの割合を表し、そして水平軸
は、粒子／ｍｌのウイルス用量を表す。この実験を、各細胞の培養物を、６つの
異なる濃度のウイルス（１０6〜１０10ウイルス粒子）に曝すことにより行った
。これらの実験で使用したウイルスは、Ｅ１ａおよびＥ１Ｂの領域に欠失を含み
、そしてＡ／Ｃ／Ｎウイルスとよばれる（Ｗｉｌｌｓら（１９９４）Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙに記載される）、ｄｌ３０９ウイルス（黒四角）、
ｄｌ０１／０７／３０９ウイルス（黒丸）、Ｅ１Ｂｄｌ５５Ｋウイルス（白丸）
およびコントロールウイルス（白四角）であった。細胞を１時間の間ウイルスに
曝し、過剰なウイルスを洗浄し、そして感染の６日後に生存細胞の割合を、ＭＴ
Ｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、実質的に製造業
者の指示に従って決定した。破線の水平線は、細胞の５０％が生存したままであ
るレベルを表す。データによって作成された曲線と、破線の水平線との交点は、
ウイルスのＥＤ50を表す。FIG. 11 is a graph of data relating to the effective dose required to achieve cell killing in normal lung endothelial cells (Panel A) and A549 lung endothelial tumor cells (Panel B). The vertical axis represents the percentage of uninfected control and the horizontal axis represents the virus dose in particles / ml. The experiment was performed by exposing a culture of each cell to six different concentrations of virus (10 6 -10 10 virus particles). The virus used in these experiments contained a deletion in the E1a and E1B regions and was called the A / C / N virus (Wills et al. (1994) Human).
Gene Therapy), dl309 virus (closed square),
dl01 / 07/309 virus (closed circle), E1Bdl55K virus (open circle)
And control virus (open squares). The cells are exposed to the virus for 1 hour, excess virus is washed out, and 6 days after infection, the percentage of viable cells is determined by MT
Determined by the S assay (Promega, Madison, WI) essentially according to the manufacturer's instructions. The dashed horizontal line represents the level at which 50% of the cells remain alive. The intersection of the curve created by the data and the dashed horizontal line is
Representing the ED 50 of the virus.

【図１２】 図１２は、示したように、ウイルスの種々の濃度（ＤＬＤ−１については１．
８×１０6〜１．８×１０9、および正常細胞については１．８×１０7〜１．８
×１０10）でウイルス構築物に感染させた、そしてクリスタルバイオレットで染
色した、ＭＲＣ−９形質転換正常細胞（パネルＡ）およびＤＬＤ−１腫瘍細胞（
パネルＢ）の顕微鏡写真（×１００）である。各パネルにおける第１列は、ｄｌ
３０９ウイルスである。各パネルにおける第２列は、ｄｌ０１／０７／３０９ウ
イルスである。各パネルにおける第３列は、ｄｌ１１０１ウイルスである。各パ
ネルにおける第４列は、ｄｌ１１０７ウイルスである。各パネルにおける第５列
は、Ｅ１ｂｄｌ５５Ｋウイルスである。各パネルにおける第６列は、コントロー
ルウイルス（Ａ／Ｃ／Ｎ）である。パネルＡの一番上の行は、１．８×１０10粒
子／ｍｌの用量を表す。二番目の行は、１．８×１０9粒子／ｍｌの用量を表す
。三番目の行は、１．８×１０8粒子／ｍｌの用量を表す。一番下の行は、１．
８×１０7粒子／ｍｌの用量を表す。パネルＢの一番上の行は、１．８×１０9粒
子／ｍｌの用量を表す。二番目の行は、１．８×１０8粒子／ｍｌの用量を表す
。三番目の行は、１．８×１０7粒子／ｍｌの用量を表す。一番下の行は、１．
８×１０6粒子／ｍｌの用量を表す。FIG. 12 shows, as indicated, various concentrations of virus (1.
8 × 10 6 to 1.8 × 10 9 , and 1.8 × 10 7 to 1.8 for normal cells.
× 10 10 ) infected with the viral construct and stained with crystal violet, MRC-9 transformed normal cells (panel A) and DLD-1 tumor cells (panel A).
It is a microscope picture (x100) of panel B). The first column in each panel is dl
309 virus. The second row in each panel is dl01 / 07/309 virus. The third column in each panel is dl1101 virus. The fourth column in each panel is dl1107 virus. The fifth column in each panel is the E1bdl55K virus. The sixth column in each panel is the control virus (A / C / N). The top row of Panel A represents a dose of 1.8 × 10 10 particles / ml. The second row represents a dose of 1.8 × 10 9 particles / ml. The third row represents a dose of 1.8 × 10 8 particles / ml. The bottom line is 1.
Represents a dose of 8 × 10 7 particles / ml. The top row of Panel B represents a dose of 1.8 × 10 9 particles / ml. The second row represents a dose of 1.8 × 10 8 particles / ml. The third row represents a dose of 1.8 × 10 7 particles / ml. The bottom line is 1.
Represents a dose of 8 × 10 6 particles / ml.

【図１３】 図１３は、ウイルスの腫瘍内投与の抗腫瘍効果を評価するために、ヌードマウ
ス腫瘍モデル研究から得たデータのグラフである。研究の１日目に、ヌードマウ
スに５×１０6ＤＬＤ−１腫瘍細胞を皮下注射し、そして腫瘍が約２００ｍｍ3の
容積に達するまで約１２日間腫瘍を形成させた。１００μｌの容量中のｒＡｄ−
Ｃｏｎ（黒三角）；Ｅ１Ｂｄｌ５５Ｋ（白四角）、ｄｌ３０９（白丸）およびｄ
ｌ１０／０７／３０９（黒四角）の各ウイルスの２．５×１０9ウイルス粒子の
用量ならびに緩衝液コントロールとしてｖＰＢＳ（黒丸）を、１２、１３、１４
、１５および１６日目に、マウスに腫瘍内注射した。腫瘍サイズを研究の１７、
１５および３２日目に評価した。垂直軸は、平均腫瘍容積（ｍｍ3）を表し、そ
して水平軸は、研究日数を表す。FIG. 13 is a graph of data obtained from a nude mouse tumor model study to evaluate the anti-tumor effect of intratumoral administration of the virus. On the first day of the study, nude mice were injected subcutaneously with 5 × 10 6 DLD-1 tumor cells and allowed to form tumors for about 12 days until the tumor reached a volume of about 200 mm 3 . RAd- in a volume of 100 μl
Con (closed triangle); E1Bdl55K (open square), dl309 (open circle) and d
A dose of 2.5 × 10 9 virus particles of 110/07/309 (solid squares) of each virus and vPBS (solid circles) as buffer controls, 12, 13, 14
On days 15, 15 and 16, mice were injected intratumorally. 17, studying tumor size
Evaluation was made on days 15 and 32. The vertical axis represents mean tumor volume (mm 3 ) and the horizontal axis represents study days.

【図１４】 図１４は、ウイルスの静脈内全身投与の抗腫瘍効果を評価するために、ヌード
マウスモデル研究において得られたデータのグラフである。研究の１日目に、ヌ
ードマウスに５×１０6ＰＣ−３（前立腺癌腫）腫瘍細胞を皮下注射し、そして
腫瘍が約５０〜６０ｍｍ3の容積に達するまで約７日間腫瘍を形成させた。２０
０μｌの容量中のＥ１Ｂｄｌ５５Ｋ（白丸）、ｄｌ３０９（黒四角）およびｄｌ
１０／０７／３０９（黒丸）の各ウイルスの１×１０10ウイルス粒子の用量、な
らびに緩衝液コントロールとしてｖＰＢＳ（白四角）を、研究の７、８、２４、
２５および１６日目に、マウスに腫瘍内注射した。腫瘍サイズを研究の７、２１
、２９、３５および４２日目に評価した。垂直軸は、平均腫瘍容積（ｍｍ3）を
表し、そして水平軸は、研究日数を表す。FIG. 14 is a graph of data obtained in a nude mouse model study to evaluate the anti-tumor effect of intravenous systemic administration of virus. On the first day of the study, nude mice were injected subcutaneously with 5 × 10 6 PC-3 (prostate carcinoma) tumor cells and allowed to form tumors for about 7 days until the tumor reached a volume of about 50-60 mm 3 . 20
E1Bdl55K (open circles), dl309 (closed squares) and dl in a volume of 0 μl
A dose of 1 × 10 10 viral particles of each virus of 10/07/309 (closed circles), as well as vPBS (open squares) as a buffer control, was used for 7,8,24,
On days 25 and 16, mice were injected intratumorally. Tumor size studies 7, 21
, 29, 35 and 42. The vertical axis represents mean tumor volume (mm 3 ) and the horizontal axis represents study days.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 EA02 HA17 4B065 AA95X AB01 BA02 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 BA44 DA27 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 CA16 NA14 ZB26 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 15/09 C12N 15/00 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK) , ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR) , NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CZ, DE, DK, DM EE, ES, FI, GB, GD, GE, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LU, LV, MA, MD, MG , MK, MN, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UZ, VN, YU, ZAF Terms (reference) 4B024 AA01 BA80 CA03 EA02 HA17 4B065 AA95X AB01 BA02 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 BA44 DA27 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 CA16 NA14 ZB26

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 新生物細胞が混入した正常細胞の集団に、１つ以上のｐ３０
０タンパク質ファミリーメンバーおよび１つ以上のＲｂタンパク質ファミリーメ
ンバーに対する結合が不足しているが、Ｅ１ａ ＣＲ３ドメインのトランス作用
性機能を保持する、改変２８９Ｒタンパク質を発現するＥ１ａ遺伝子産物を生成
するように、該Ｅ１ａコード配列に対する改変を含む、選択的に複製する組換え
アデノウイルスを投与することによる、該集団中の該新生物細胞を除去する方法
であって、ここで、該新生物細胞は、アデノウイルスに感染しやすく、そしてア
デノウイルス複製を支持し得る、方法。Claims 1. A population of normal cells contaminated with neoplastic cells comprises one or more p30
To generate an E1a gene product expressing a modified 289R protein that lacks binding to the 0 protein family member and one or more Rb protein family members but retains the trans-acting function of the E1a CR3 domain. A method of removing said neoplastic cells in said population by administering a selectively replicating recombinant adenovirus comprising a modification to the E1a coding sequence, wherein said neoplastic cells comprise an adenovirus. A method that is susceptible to infection and can support adenovirus replication. 【請求項２】 ベクターが、アデノウイルス５型のＥ１ａ ２４３Ｒおよび
２８６Ｒのタンパク質のアミノ酸４〜２５に対応する欠失を含む、請求項１に記
載の方法。2. The method of claim 1, wherein the vector comprises a deletion corresponding to amino acids 4-25 of the E1a 243R and 286R proteins of adenovirus type 5. 【請求項３】 前記ベクターが、前記アデノウイルス５型のＥ１ａ ２４３
Ｒおよび２８９Ｒのタンパク質のアミノ酸１１１〜１２３に対応する欠失をさら
に含む、請求項２に記載の方法。3. The vector comprises the adenovirus type 5 E1a 243.
3. The method of claim 2, further comprising a deletion corresponding to amino acids 111-123 of the R and 289R proteins. 【請求項４】 前記方法が、前記選択的に複製する組換えアデノウイルスの
薬学的に受容可能な処方物を、哺乳動物に投与することを包含する、請求項１に
記載の方法。4. The method of claim 1, wherein said method comprises administering to said mammal a pharmaceutically acceptable formulation of said selectively replicating recombinant adenovirus. 【請求項５】 前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。5. The method according to claim 4, wherein said mammal is a human. 【請求項６】 ベクターが、エキソビボで幹細胞産物に投与される、請求項
１に記載の方法。6. The method of claim 1, wherein the vector is administered ex vivo to a stem cell product. 【請求項７】 １つ以上のｐ３００タンパク質ファミリーメンバーおよび１
つ以上のＲｂタンパク質ファミリーメンバーに対する結合が不足しているが、Ｅ
１ａ ＣＲ３ドメインのトランス作用性機能を保持する、改変２８９Ｒタンパク
質を発現するＥ１ａ遺伝子産物を生成するように、該Ｅ１ａコード配列に対する
改変を含む、選択的に複製する組換えアデノウイルス、および薬学的に受容可能
なキャリアを含有する、薬学的処方物。7. One or more p300 protein family members and 1
Lack of binding to one or more Rb protein family members
A selectively replicating recombinant adenovirus comprising a modification to the E1a coding sequence so as to generate an E1a gene product expressing the modified 289R protein, which retains the trans-acting function of the 1a CR3 domain; Pharmaceutical formulations containing an acceptable carrier. 【請求項８】 ベクターが、アデノウイルス５型のＥ１ａ ２４３Ｒおよび
２８６Ｒのタンパク質のアミノ酸４〜２５、ならびにＥ１ａ ２４３Ｒおよび２
８９Ｒのタンパク質のアミノ酸１１１〜１２３に対応する欠失を含む、請求項７
に記載の処方物。8. The vector comprises the amino acids 4 to 25 of the E1a 243R and 286R proteins of adenovirus type 5, and the E1a 243R and 2
8. The method of claim 7, wherein the protein comprises a deletion corresponding to amino acids 111-123 of the 89R protein.
A formulation according to claim 1. 【請求項９】 送達エンハンサーをさらに含有する、請求項８に記載の処方
物。9. The formulation of claim 8, further comprising a delivery enhancer.
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