JP2002527113A - カロテノイド生合成に関与する末端オキシダーゼをコードするｍＲＮＡを転写するｃＤＮＡ配列 - Google Patents
カロテノイド生合成に関与する末端オキシダーゼをコードするｍＲＮＡを転写するｃＤＮＡ配列Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、配列番号２に示されるＴＯＣＢ（カロテノイド生合成と関与する末端オキシダーゼ）をコードするｍＲＮＡ（メッセンジャーデオキシリボ核酸）を転写する配列番号１によって示されるｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸）配列、および、配列番号１の相補的配列、細胞、植物または植物フラグメントをトランスフォームするベクター、および植物におけるカロテノイドの産生を変更する方法に関する。
Description
【０００１】
本発明は、SEQ ID NO:2によって表されるTOCB（カロテノイド生合成関連末端(
ターミナル)オキシダーゼ）酵素をそれ自体がコードする、mRNA（メッセンジャ
ーデオキシリボ核酸）を転写する、SEQ ID NO:1によって表されるDNA（デオキシ
リボ核酸）配列に関し、また、植物の細胞、植物又はフラグメントを形質転換す
るためのベクター、並びに、植物のカロテノイド生成を調節する方法に関する。
ターミナル)オキシダーゼ）酵素をそれ自体がコードする、mRNA（メッセンジャ
ーデオキシリボ核酸）を転写する、SEQ ID NO:1によって表されるDNA（デオキシ
リボ核酸）配列に関し、また、植物の細胞、植物又はフラグメントを形質転換す
るためのベクター、並びに、植物のカロテノイド生成を調節する方法に関する。
【０００２】
カロテノイドは、植物、真菌及び細菌内で合成される親油性色素である。光合
成組織では、カロテノイドは付加的な光吸収性色素として働き、特に、一重項酸
素等のフリーラジカルに対する光防御をもたらす。
成組織では、カロテノイドは付加的な光吸収性色素として働き、特に、一重項酸
素等のフリーラジカルに対する光防御をもたらす。
【０００３】 植物及びある種の微生物において、カロテノイド生合成経路は、カロテノイド
、キサントフィル及びそれらの誘導体を提供する。これらの化合物はフィトエン
から合成されており、フィトエンは、連続的な脱水素反応によって修飾され、フ
ィトフルエン、ゼータ−カロテン、ニューロスポレン、そしてリコペンを生じる
。リコペンは、特定のケースでは蓄積し、例えばトマトの赤色素を与え、又は、
より一般的には、環化によって修飾されてアルファ−又はベータ−カロテンを形
成した形態で見出される。これらの環化カロテノイドは、ビタミンＡ前駆体であ
り、蓄積したりあるいは酸化反応によってキサンとフィルを生じたりすることが
できる。これらのキサンとフィルは、黄、ピンク、オレンジ又は赤の色素である
。
、キサントフィル及びそれらの誘導体を提供する。これらの化合物はフィトエン
から合成されており、フィトエンは、連続的な脱水素反応によって修飾され、フ
ィトフルエン、ゼータ−カロテン、ニューロスポレン、そしてリコペンを生じる
。リコペンは、特定のケースでは蓄積し、例えばトマトの赤色素を与え、又は、
より一般的には、環化によって修飾されてアルファ−又はベータ−カロテンを形
成した形態で見出される。これらの環化カロテノイドは、ビタミンＡ前駆体であ
り、蓄積したりあるいは酸化反応によってキサンとフィルを生じたりすることが
できる。これらのキサンとフィルは、黄、ピンク、オレンジ又は赤の色素である
。
【０００４】 前記フィトエンの連続的脱水素過程は、大部分の微生物においては、フィトエ
ンデサチュラーゼCRTIとして知られる単一酵素によって触媒される。植物及びシ
アノバクテリアにおいては、二つの関連酵素が存在する。一つ目は、フィトエン
デサチュラーゼ（PDS）として既知であり、フィトエンのフィトフルエンへの変
換、そしてそれからゼータ−カロテンへの変換を触媒する。二つ目は、ゼータ−
カロテンデサチュラーゼ（ZDS）として既知であり、ゼータ−カロテンのニュー
ロスポレンへの変換、そしてそれからリコペンへの変換を触媒する。これらの脱
水素反応はそれぞれ、その基質から受容体（アクセプター）への二つの電子及び
二つのプロトンの転移を必要とする。つまり、これらの脱水素反応は、構造酵素
として知られている酵素及び補助因子を必要とし、これらはレドックス反応にお
ける中間体である。
ンデサチュラーゼCRTIとして知られる単一酵素によって触媒される。植物及びシ
アノバクテリアにおいては、二つの関連酵素が存在する。一つ目は、フィトエン
デサチュラーゼ（PDS）として既知であり、フィトエンのフィトフルエンへの変
換、そしてそれからゼータ−カロテンへの変換を触媒する。二つ目は、ゼータ−
カロテンデサチュラーゼ（ZDS）として既知であり、ゼータ−カロテンのニュー
ロスポレンへの変換、そしてそれからリコペンへの変換を触媒する。これらの脱
水素反応はそれぞれ、その基質から受容体（アクセプター）への二つの電子及び
二つのプロトンの転移を必要とする。つまり、これらの脱水素反応は、構造酵素
として知られている酵素及び補助因子を必要とし、これらはレドックス反応にお
ける中間体である。
【０００５】 本発明の発明者は、カロテノイド生合成に関連する、TOCB（カロテノイド生合
成関連ターミナルオキシダーゼ）として知られる酵素をコードしている新規な遺
伝子を発見した。この酵素は、クロロプラストの膜内に位置し、PDSが正確に機
能するために必須である。
成関連ターミナルオキシダーゼ）として知られる酵素をコードしている新規な遺
伝子を発見した。この酵素は、クロロプラストの膜内に位置し、PDSが正確に機
能するために必須である。
【０００６】
このように、本発明の第一の主題は、 −SEQ ID NO:2によって表されるTOCB（カロテノイド生合成関連ターミナ
ルオキシダーゼ）酵素をコードするmRNAを転写するSEQ ID NO:1によって表され
るヌクレオチド配列、 −上述のような配列SEQ ID NO:1の修飾ヌクレオチド、特に、１つ以上の
ヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又は欠失及び／又は置換によって修飾
されたヌクレオチド からなる少なくとも１つのコード領域を含むDNA配列に関し、この修飾配列は、S
EQ ID NO:2によって表されるTOCBをそれ自体がコードするmRNAを転写するか又は
前記TOCBの修飾タンパク質をコードし、前記修飾タンパク質は、SEQ ID NO:2に
よって表されるTOCBの活性と等価な酵素活性を有する。
ルオキシダーゼ）酵素をコードするmRNAを転写するSEQ ID NO:1によって表され
るヌクレオチド配列、 −上述のような配列SEQ ID NO:1の修飾ヌクレオチド、特に、１つ以上の
ヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又は欠失及び／又は置換によって修飾
されたヌクレオチド からなる少なくとも１つのコード領域を含むDNA配列に関し、この修飾配列は、S
EQ ID NO:2によって表されるTOCBをそれ自体がコードするmRNAを転写するか又は
前記TOCBの修飾タンパク質をコードし、前記修飾タンパク質は、SEQ ID NO:2に
よって表されるTOCBの活性と等価な酵素活性を有する。
【０００７】 特に、本発明は、それぞれ、SEQ ID NO:3によって同定されるトマトTOCB及びS
EQ ID NO:4によって同定されるトウガラシTOCBのコード配列、並びに、これらの
配列を修飾することによって得られる、あらゆる誘導配列に関する。 TOCBをコードする遺伝子は、重複DNAであり、イントロン及びエクソンを含む
。前記配列SEQ ID NO:1は、TOCBをコードするmRNAを転写するDNA鎖に相当する相
補鎖（イントロンを有さない）又はcDNAである。
EQ ID NO:4によって同定されるトウガラシTOCBのコード配列、並びに、これらの
配列を修飾することによって得られる、あらゆる誘導配列に関する。 TOCBをコードする遺伝子は、重複DNAであり、イントロン及びエクソンを含む
。前記配列SEQ ID NO:1は、TOCBをコードするmRNAを転写するDNA鎖に相当する相
補鎖（イントロンを有さない）又はcDNAである。
【０００８】 「等価な酵素活性」という表現は、その酵素の一部が構造的に修飾されてもよ
いが、それでも、その基質を修飾することができることを意味する。その活性は
、実質的に、本来の酵素活性と同じである。この酵素がその活性部位に修飾を受
けることができないことは理解されるであろう。したがって、１つ以上のアミノ
酸の付加、削除又は置換によってその本来の配列になされるあらゆる修飾は、そ
の本来のタンパク質の活性がこれらの修飾によって影響されない限りは、等価な
酵素活性を生じさせると理解される。
いが、それでも、その基質を修飾することができることを意味する。その活性は
、実質的に、本来の酵素活性と同じである。この酵素がその活性部位に修飾を受
けることができないことは理解されるであろう。したがって、１つ以上のアミノ
酸の付加、削除又は置換によってその本来の配列になされるあらゆる修飾は、そ
の本来のタンパク質の活性がこれらの修飾によって影響されない限りは、等価な
酵素活性を生じさせると理解される。
【０００９】 本発明の第二の主題は、 −SEQ ID NO:1によって表される相補的ヌクレオチド配列であって、SEQ I
D NO:1の相補的配列によって転写されるmRNAと対形成することができるアンチセ
ンスmRNAを転写する配列、 −１つ以上のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又は欠失及び／又
は置換によって修飾された、上記配列の修飾ヌクレオチド配列であって、上記mR
NAと対形成することができるアンチセンスmRNAを転写する配列、 −上記ヌクレオチド配列の１つのフラグメントであって、SEQ ID NO:1の
相補的配列によってコードされるmRNAと対形成することができるアンチセンスmR
NAを転写するフラグメント からなる少なくとも１つのコード領域を含むDNA配列に関する。
D NO:1の相補的配列によって転写されるmRNAと対形成することができるアンチセ
ンスmRNAを転写する配列、 −１つ以上のヌクレオチドの変異及び／又は付加及び／又は欠失及び／又
は置換によって修飾された、上記配列の修飾ヌクレオチド配列であって、上記mR
NAと対形成することができるアンチセンスmRNAを転写する配列、 −上記ヌクレオチド配列の１つのフラグメントであって、SEQ ID NO:1の
相補的配列によってコードされるmRNAと対形成することができるアンチセンスmR
NAを転写するフラグメント からなる少なくとも１つのコード領域を含むDNA配列に関する。
【００１０】 用語「DNA」は、相補的DNA（又はcDNA）、すなわち、逆転写酵素の作用によっ
て形成されたそのDNA内のmRNAの複製であると理解される。該cDNAは、そのDNA配
列のイントロンを含まない。
て形成されたそのDNA内のmRNAの複製であると理解される。該cDNAは、そのDNA配
列のイントロンを含まない。
【００１１】 本発明では、「対形成することができる」とは、与えられたハイブリダイゼー
ション条件下において、相補的なヌクレオチド配列が対形成するという事実を意
味する。当業者は、用いられるハイブリダイゼーション条件に応じて、対にさせ
るか又はハイブリダイゼーションさせるために、その配列がどれくらいの割合の
同一性を有するべきであるのか、明確に理解できる。同様の配列のペアリングを
得るための厳しい条件は、例えば、３５℃、５０％ホルムアミド中でのハイブリ
ダイゼーションである。そのハイブリダイゼーション条件については、特に、「
Molecular Cloning, a laboratory manual, second eddition, Sambrook, Fritc
h & Maniatis, 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harb
or, New York, USA」が参照されるであろう。
ション条件下において、相補的なヌクレオチド配列が対形成するという事実を意
味する。当業者は、用いられるハイブリダイゼーション条件に応じて、対にさせ
るか又はハイブリダイゼーションさせるために、その配列がどれくらいの割合の
同一性を有するべきであるのか、明確に理解できる。同様の配列のペアリングを
得るための厳しい条件は、例えば、３５℃、５０％ホルムアミド中でのハイブリ
ダイゼーションである。そのハイブリダイゼーション条件については、特に、「
Molecular Cloning, a laboratory manual, second eddition, Sambrook, Fritc
h & Maniatis, 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harb
or, New York, USA」が参照されるであろう。
【００１２】 本発明において、「修飾ヌクレオチド配列」の表現は、１００％未満の、リフ
ァレンス配列との同一性を有する、あらゆるヌクレオチド配列を意味する。 本発明の一つの好ましい実施態様では、本発明の修飾ヌクレオチド配列は、SE
Q ID NO:1によって表されるヌクレオチド配列又はその相補的配列と、少なくと
もおよそ７０％、好ましくはおよそ８０％が同一のヌクレオチドを含む。
ァレンス配列との同一性を有する、あらゆるヌクレオチド配列を意味する。 本発明の一つの好ましい実施態様では、本発明の修飾ヌクレオチド配列は、SE
Q ID NO:1によって表されるヌクレオチド配列又はその相補的配列と、少なくと
もおよそ７０％、好ましくはおよそ８０％が同一のヌクレオチドを含む。
【００１３】 「ヌクレオチド同一性」の表現は、二つの鎖を並べたときの、それら二つの鎖
上に存在する同一ヌクレオチドの配列の比較を意味する。したがって、ヌクレオ
チドの総数を減らすことによって、同一ヌクレオチドの割合、すなわちヌクレオ
チド同一性が得られる。
上に存在する同一ヌクレオチドの配列の比較を意味する。したがって、ヌクレオ
チドの総数を減らすことによって、同一ヌクレオチドの割合、すなわちヌクレオ
チド同一性が得られる。
【００１４】 本発明の第三の主題は、第一の主題の定義のDNA配列から転写されるmRNA、特
にSEQ ID NO:1によって表されるDNA配列から転写されるmRNAに関し、前記mRNAは
、SEQ ID NO:2によって表されるTOCB酵素、又は、該酵素のフラグメント又は修
飾タンパク質をコードし、且つ、その植物内の前記酵素の活性と等価な酵素活性
を有している。
にSEQ ID NO:1によって表されるDNA配列から転写されるmRNAに関し、前記mRNAは
、SEQ ID NO:2によって表されるTOCB酵素、又は、該酵素のフラグメント又は修
飾タンパク質をコードし、且つ、その植物内の前記酵素の活性と等価な酵素活性
を有している。
【００１５】 本発明の第四の主題は、本発明の第二の主題のDNA配列から転写されるアンチ
センスmRNAに関し、これは、その本来のmRNAを構成するヌクレオチドの全部又は
一部に対して相補的なヌクレオチドを含み、前記mRNAと対形成することができる
。
センスmRNAに関し、これは、その本来のmRNAを構成するヌクレオチドの全部又は
一部に対して相補的なヌクレオチドを含み、前記mRNAと対形成することができる
。
【００１６】 「アンチセンスmRNA」の表現は、対応するmRNAの塩基配列と相補的なRNA配列
を意味し、これは、該アンチセンス配列（３’から５’方向へのリーディング）
の各塩基（又はそれらの塩基の大部分）が、３’から５’方向にリーディングし
ているmRNA配列において、対応する塩基（ＧとＣ、ＡとＵ）と対形成することが
できるという意味において相補的である。
を意味し、これは、該アンチセンス配列（３’から５’方向へのリーディング）
の各塩基（又はそれらの塩基の大部分）が、３’から５’方向にリーディングし
ているmRNA配列において、対応する塩基（ＧとＣ、ＡとＵ）と対形成することが
できるという意味において相補的である。
【００１７】 本発明の第五の主題は、SEQ ID NO:2によって表されるTOCB酵素活性を有する
タンパク質、又は、前記TOCB酵素のあらゆる修飾タンパク質、特に、１つ以上の
アミノ酸の付加及び／又は欠失及び／又は置換による修飾タンパク質、又は、該
TOCB酵素又は該酵素の修飾配列から誘導されるあらゆるフラグメントに関し、前
記フラグメント又は修飾配列は、該TOCB酵素の酵素活性と等価な酵素活性を有す
る。
タンパク質、又は、前記TOCB酵素のあらゆる修飾タンパク質、特に、１つ以上の
アミノ酸の付加及び／又は欠失及び／又は置換による修飾タンパク質、又は、該
TOCB酵素又は該酵素の修飾配列から誘導されるあらゆるフラグメントに関し、前
記フラグメント又は修飾配列は、該TOCB酵素の酵素活性と等価な酵素活性を有す
る。
【００１８】 本発明の第六の主題は、本発明の第四の主題にて定義されたアンチセンスmRNA
と植物のTOCB酵素をコードするmRNAとの間で形成される複合体に関する。
と植物のTOCB酵素をコードするmRNAとの間で形成される複合体に関する。
【００１９】 本発明の第七の主題は、本発明にかかる第一の主題に記載されたＤＮＡ配列を
含む組み換えＤＮＡであり、当該配列は、異種配列に挿入され、植物のＴＯＣＢ
酵素と等価な酵素活性を備えるＴＯＣＢ酵素の全てまたは一部をコードするｍＲ
ＮＡ配列の全てまたは一部を転写する。
含む組み換えＤＮＡであり、当該配列は、異種配列に挿入され、植物のＴＯＣＢ
酵素と等価な酵素活性を備えるＴＯＣＢ酵素の全てまたは一部をコードするｍＲ
ＮＡ配列の全てまたは一部を転写する。
【００２０】 本発明によれば、表現“異種配列(heterologous sequence)”は、酵素によっ
て切断され、結果的に、別種の活性を備えた別の配列が挿入されるあらゆる配列
を意味する。
て切断され、結果的に、別種の活性を備えた別の配列が挿入されるあらゆる配列
を意味する。
【００２１】 本発明の第八の主題は、本発明かかる第二主題に定義されたＤＮＡ配列を含む
組み換えＤＮＡであり、当該配列は、異種配列に挿入され、植物におけるＴＯＣ
Ｂ酵素をコードするｍＲＮＡと対形成することができるアンチセンスｍＲＮＡ配
列の全てまたは一部を転写する。
組み換えＤＮＡであり、当該配列は、異種配列に挿入され、植物におけるＴＯＣ
Ｂ酵素をコードするｍＲＮＡと対形成することができるアンチセンスｍＲＮＡ配
列の全てまたは一部を転写する。
【００２２】 本発明の第九の主題は、プロモーター配列および配列の転写を停止する配列の
ような、挿入された配列の発現をコントロールするのに必要な成分を含む、本発
明にかかる第七または第八の主題に定義された組み換えＤＮＡである。
ような、挿入された配列の発現をコントロールするのに必要な成分を含む、本発
明にかかる第七または第八の主題に定義された組み換えＤＮＡである。
【００２３】 本発明の第十の主題は、カロテノイド生合成を増大させるのに適した、植物を
トランスフォームするためのベクターであって、ベクターが植物細胞においてｍ
ＲＮＡを生成できるように、植物の転写の複製起点の後に、配列番号２に示され
る、カロテノイド合成に関与する酵素の全てまたは一部をコードする、本発明に
かかる第一の主題に定義されるヌクレオチド配列 配列番号１の全てまたは一部
を含むベクターに関する。
トランスフォームするためのベクターであって、ベクターが植物細胞においてｍ
ＲＮＡを生成できるように、植物の転写の複製起点の後に、配列番号２に示され
る、カロテノイド合成に関与する酵素の全てまたは一部をコードする、本発明に
かかる第一の主題に定義されるヌクレオチド配列 配列番号１の全てまたは一部
を含むベクターに関する。
【００２４】 本発明の第十一の主題は、カロテノイド生合成を低減または停止させるのに適
した、植物をトランスフォームするためのベクターであって、転写された相補鎖
が、カロテノイド合成に関与する植物のＴＯＣＢ酵素をコードするｍＲＮＡと対
形成することができるように、植物の転写の複製起点の後に、本発明にかかる第
二の主題に定義される配列番号１に相補的なヌクレオチド配列の鎖の全てまたは
一部を含むベクターに関する。
した、植物をトランスフォームするためのベクターであって、転写された相補鎖
が、カロテノイド合成に関与する植物のＴＯＣＢ酵素をコードするｍＲＮＡと対
形成することができるように、植物の転写の複製起点の後に、本発明にかかる第
二の主題に定義される配列番号１に相補的なヌクレオチド配列の鎖の全てまたは
一部を含むベクターに関する。
【００２５】 かくして本発明は、カロテノイド合成を変更するため、例えば、フィトエンの
脱水素に関与する色素の産生を増大または低減、あるいは停止するために用いら
れる。例えば、アンチセンス配列を含むベクターを用いたトランスフォーメーシ
ョンによるトマトのような果実における赤い色の阻害は、例えば一部の唐辛子の
ような、黄色に近い興味深い色を供えた果実を与える。この種の黄色いトマトは
既に存在するが、本発明は、長期の再生プログラムを必要とすることなく、また
、その結果として、おそらくは植物の他の特徴を損なうことなく、特徴的な色に
ついて系統を移行させる手段を提供する。
脱水素に関与する色素の産生を増大または低減、あるいは停止するために用いら
れる。例えば、アンチセンス配列を含むベクターを用いたトランスフォーメーシ
ョンによるトマトのような果実における赤い色の阻害は、例えば一部の唐辛子の
ような、黄色に近い興味深い色を供えた果実を与える。この種の黄色いトマトは
既に存在するが、本発明は、長期の再生プログラムを必要とすることなく、また
、その結果として、おそらくは植物の他の特徴を損なうことなく、特徴的な色に
ついて系統を移行させる手段を提供する。
【００２６】 センス配列を含むベクターを用いたトランスフォーメーションによるカロテノ
イド合成の増加は、消費者の食欲をそそる、より強い赤色のトマトを産生可能に
する。また本発明は、果実以外の、植物にも赤色を導入することができる。植物
におけるカロテノイド合成の増加は、全遺伝子、相補的ＤＮＡ遺伝子の一以上の
機能的コピーを、植物細胞中の機能的プロモーターのコントロール下に挿入する
ことによって実施することができる。
イド合成の増加は、消費者の食欲をそそる、より強い赤色のトマトを産生可能に
する。また本発明は、果実以外の、植物にも赤色を導入することができる。植物
におけるカロテノイド合成の増加は、全遺伝子、相補的ＤＮＡ遺伝子の一以上の
機能的コピーを、植物細胞中の機能的プロモーターのコントロール下に挿入する
ことによって実施することができる。
【００２７】 植物をトランスフォームしてカロテノイド合成を低減または停止するベクター
、すなわちアンチセンスベクターは、非常に短くてもよい。ある好ましい実施態
様では、少なくとも１０ベースの長さを有する相同塩基配列が選択される。塩基
配列に対する理論的上限は存在せず、植物により産生されるｍＲＮＡと同じ長さ
であってもよい。しかしながら、一部の非常に好ましい実施態様においては、１
００〜１０００ベースの長さの配列が用いられる。
、すなわちアンチセンスベクターは、非常に短くてもよい。ある好ましい実施態
様では、少なくとも１０ベースの長さを有する相同塩基配列が選択される。塩基
配列に対する理論的上限は存在せず、植物により産生されるｍＲＮＡと同じ長さ
であってもよい。しかしながら、一部の非常に好ましい実施態様においては、１
００〜１０００ベースの長さの配列が用いられる。
【００２８】 ＴＯＣＢ遺伝子が不活性である変異植物は、斑入りの外観を有することが知ら
れている。植物は緑と白である。アンチセンス戦略の適用が提案され、それは、
ｍＲＮＡの生産とそれによるＴＯＣＢタンパク質の生産を排除するために行なわ
れるものであり、斑入りの葉を有する植物、例えば観賞用植物、例えばタバコ（
Nicotiana）又はペチュニア（Petunia）又はその他の観賞用植物、を生産するた
めに行われるものとなり、これはそれ自身で遺伝子形質転換を起こし、ＴＯＣＢ
タンパク質の生産を防止するためにアンチセンス構築を受けることができるもの
となろう。
れている。植物は緑と白である。アンチセンス戦略の適用が提案され、それは、
ｍＲＮＡの生産とそれによるＴＯＣＢタンパク質の生産を排除するために行なわ
れるものであり、斑入りの葉を有する植物、例えば観賞用植物、例えばタバコ（
Nicotiana）又はペチュニア（Petunia）又はその他の観賞用植物、を生産するた
めに行われるものとなり、これはそれ自身で遺伝子形質転換を起こし、ＴＯＣＢ
タンパク質の生産を防止するためにアンチセンス構築を受けることができるもの
となろう。
【００２９】 ＤＮＡ組換え生産物は、標準的技術を用いて生産することができる。例えば、
転写されるＤＮＡ配列は、制限酵素で前記配列を含むベクターを処理して適当な
セグメントを切り出すことにより得ることができる。転写ＤＮＡ配列はまた、各
末端に制限部位を生成させるために、合成オリゴヌクレオチドを環化させ結合さ
せることにより、又はＰＣＲ（”ポリメラーゼ連鎖反応”）で合成オリゴヌクレ
オチドを用いることにより生成させることができる。ＤＮＡ配列はついで開始プ
ロモーター配列と終止配列を含むベクターにクローン化される。もし、アンチセ
ンスＤＮＡ配列を得ることが望まれるなら、クローニングは、ＤＮＡ配列切断物
を、それが切り出された鎖でのその方向に対して反対にするように実施すること
ができるであろう。
転写されるＤＮＡ配列は、制限酵素で前記配列を含むベクターを処理して適当な
セグメントを切り出すことにより得ることができる。転写ＤＮＡ配列はまた、各
末端に制限部位を生成させるために、合成オリゴヌクレオチドを環化させ結合さ
せることにより、又はＰＣＲ（”ポリメラーゼ連鎖反応”）で合成オリゴヌクレ
オチドを用いることにより生成させることができる。ＤＮＡ配列はついで開始プ
ロモーター配列と終止配列を含むベクターにクローン化される。もし、アンチセ
ンスＤＮＡ配列を得ることが望まれるなら、クローニングは、ＤＮＡ配列切断物
を、それが切り出された鎖でのその方向に対して反対にするように実施すること
ができるであろう。
【００３０】 アンチセンスＲＮＡを発現する組換え産物では、最初にマトリックス鎖であっ
た鎖は、コード鎖となり、その逆も成り立つ。組換え産物はその結果、その塩基
配列が酵素についてのｍＲＮＡの配列の全部又は一部を相補するｍＲＮＡを転写
するであろう。その結果、２つのＲＮＡ鎖は、それらの塩基配列だけでなく、そ
れらの方向でも（５’から３’）相補する。
た鎖は、コード鎖となり、その逆も成り立つ。組換え産物はその結果、その塩基
配列が酵素についてのｍＲＮＡの配列の全部又は一部を相補するｍＲＮＡを転写
するであろう。その結果、２つのＲＮＡ鎖は、それらの塩基配列だけでなく、そ
れらの方向でも（５’から３’）相補する。
【００３１】 センスＲＮＡを発現する組換え産物において、マトリックスと転写された鎖は
、植物の最初の遺伝子の方向を保持する。センスＲＮＡを発現する組換え産物は
、全体的に又は部分的にそのｍＲＮＡの配列とホモロジーのある塩基配列を有す
るｍＲＮＡを転写する。機能的酵素を発現する組換え産物において、遺伝子の全
体のコード領域は、植物で発現されることができる転写調節配列にリンクする。
、植物の最初の遺伝子の方向を保持する。センスＲＮＡを発現する組換え産物は
、全体的に又は部分的にそのｍＲＮＡの配列とホモロジーのある塩基配列を有す
るｍＲＮＡを転写する。機能的酵素を発現する組換え産物において、遺伝子の全
体のコード領域は、植物で発現されることができる転写調節配列にリンクする。
【００３２】 例えば、本発明の組換え産物は、以下のように製造することができる。転写の
ために所望の塩基配列を含む適当なベクターは、特にＴＯＣＢに相補するＤＮＡ
クローン等は、制限酵素で処理して、配列を切る。こうして得られたＤＮＡをつ
いで、所望のプロモーター配列と所望の終止配列を含む第２のベクターにクロー
ン化し、所望の場合は反対の向きにクローン化する。適当なプロモーターの中で
、構成的と考えられているプロモーターの例としてＣａＭＶウィルスの３５Ｓと
して知られているプロモーター；果実の制御に関与しているプロモーターの例と
してトマトのポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーター（Birdら、1998、Plan
t Molecular Biology、11:651-662参照）；又はこれに代えて、緑の組織で発現
されるプロモーターの例としてリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユ
ニットの遺伝子のプロモーターを挙げることができる。終止配列はノパリンシン
ターゼ遺伝子のＮＯＳターミネーターを含む。
ために所望の塩基配列を含む適当なベクターは、特にＴＯＣＢに相補するＤＮＡ
クローン等は、制限酵素で処理して、配列を切る。こうして得られたＤＮＡをつ
いで、所望のプロモーター配列と所望の終止配列を含む第２のベクターにクロー
ン化し、所望の場合は反対の向きにクローン化する。適当なプロモーターの中で
、構成的と考えられているプロモーターの例としてＣａＭＶウィルスの３５Ｓと
して知られているプロモーター；果実の制御に関与しているプロモーターの例と
してトマトのポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーター（Birdら、1998、Plan
t Molecular Biology、11:651-662参照）；又はこれに代えて、緑の組織で発現
されるプロモーターの例としてリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユ
ニットの遺伝子のプロモーターを挙げることができる。終止配列はノパリンシン
ターゼ遺伝子のＮＯＳターミネーターを含む。
【００３３】 果実の成長及び／又は成熟（ripening）の間だけ植物の酵素活性を改変するこ
とは有利であるかもしれない。構成的プロモーターの使用は、形質転換された植
物の全ての部分で酵素のレベルと活性を改変する傾向があろうが、組織に特異的
なプロモーターの使用はより選択的に遺伝子の発現を制御し、活性、例えば果実
の色を改変することになろう。その結果、例えばトウガラシで発明を実施するこ
とにより、果実の成長及び／又は成熟の間の特異的発現を可能にするであろうプ
ロモーターを使用することが適当であろう。最後に、センス又はアンチセンスＲ
ＮＡは、この場合、そこで作用することが望まれる植物器官においてのみ生産さ
れるであろう。用いることができる果実の成長及び／又は成熟の間の特異的プロ
モーターの中で、ポリガラクツロナーゼ促進プロモーター（ＷＯ−Ａ−９２／０
８７９８として公開された国際特許出願）、Ｅ８プロモーター（Dieckman & Fis
cer, 1998, EMBO, 7:3315-3320）及び果実特異的２Ａ１１プロモーター（Pearら
, 1989, Plant Molecular Biology, 13:639-651）が挙げられる。
とは有利であるかもしれない。構成的プロモーターの使用は、形質転換された植
物の全ての部分で酵素のレベルと活性を改変する傾向があろうが、組織に特異的
なプロモーターの使用はより選択的に遺伝子の発現を制御し、活性、例えば果実
の色を改変することになろう。その結果、例えばトウガラシで発明を実施するこ
とにより、果実の成長及び／又は成熟の間の特異的発現を可能にするであろうプ
ロモーターを使用することが適当であろう。最後に、センス又はアンチセンスＲ
ＮＡは、この場合、そこで作用することが望まれる植物器官においてのみ生産さ
れるであろう。用いることができる果実の成長及び／又は成熟の間の特異的プロ
モーターの中で、ポリガラクツロナーゼ促進プロモーター（ＷＯ−Ａ−９２／０
８７９８として公開された国際特許出願）、Ｅ８プロモーター（Dieckman & Fis
cer, 1998, EMBO, 7:3315-3320）及び果実特異的２Ａ１１プロモーター（Pearら
, 1989, Plant Molecular Biology, 13:639-651）が挙げられる。
【００３４】 本発明の第１２の主題は、本発明の第１０又は第１１の主題で定義されたベク
ターで形質転換された植物細胞に関する。
ターで形質転換された植物細胞に関する。
【００３５】 植物遺伝子工学の当業者は、現在、遺伝的に改変された植物を得るための種々
の技術を熟知している。植物壁が、特に細胞内への外来物の浸透に対して、特に
ＤＮＡの浸透に対して、効果的な天然の物理的バリアを構成することが知られて
いる。植物細胞へＤＮＡを導入するための種々の特異的技術は、例えばバクテリ
アAgrobacterium tumefaciensの使用、プロトプラストの電気穿孔法、裸のＤＮ
Ａのマイクロインジェクション、バイオリスティック又はパーティクルガンの使
用、又はプロトプラストの形質転換である。
の技術を熟知している。植物壁が、特に細胞内への外来物の浸透に対して、特に
ＤＮＡの浸透に対して、効果的な天然の物理的バリアを構成することが知られて
いる。植物細胞へＤＮＡを導入するための種々の特異的技術は、例えばバクテリ
アAgrobacterium tumefaciensの使用、プロトプラストの電気穿孔法、裸のＤＮ
Ａのマイクロインジェクション、バイオリスティック又はパーティクルガンの使
用、又はプロトプラストの形質転換である。
【００３６】 形質転換された細胞の効率的選択を可能にするために、所望の特性をコードす
る遺伝子に加えて、マーカー遺伝子が導入される。抗生物質に対する耐性を与え
る遺伝子が好ましくは選択されるであろう。この場合、細胞は、この抗生物質を
含む培地で培養することにより選択される。耐性遺伝子を含む細胞だけが増殖で
きる。対象の遺伝子の存在も、導入されたＤＮＡと相補するＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションにより確認することができる。
る遺伝子に加えて、マーカー遺伝子が導入される。抗生物質に対する耐性を与え
る遺伝子が好ましくは選択されるであろう。この場合、細胞は、この抗生物質を
含む培地で培養することにより選択される。耐性遺伝子を含む細胞だけが増殖で
きる。対象の遺伝子の存在も、導入されたＤＮＡと相補するＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションにより確認することができる。
【００３７】 本発明の組換え産物は、標的植物細胞へ移される。標的植物細胞は、全植物体
の一部でも良く、単離された細胞又は全植物体内で再生されることができる組織
の一部でも良い。標的植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のいかなる種から
も選ばれることができる。適当な植物は、いかなる果実産生植物も含み、特にト
マト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、トウガラシ、
ピーマン、パプリカ、カロチノイド含量を改変することが望まれる葉、花、ある
いは他のいかなる器官を有する植物、などである。
の一部でも良く、単離された細胞又は全植物体内で再生されることができる組織
の一部でも良い。標的植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のいかなる種から
も選ばれることができる。適当な植物は、いかなる果実産生植物も含み、特にト
マト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、トウガラシ、
ピーマン、パプリカ、カロチノイド含量を改変することが望まれる葉、花、ある
いは他のいかなる器官を有する植物、などである。
【００３８】 本発明の組換え産物は、本発明の植物の形質転換に適した技術を用いて、いか
なる植物を形質転換するためにも用いられることができる。単子葉植物及び双子
葉植物の細胞は、当業者に周知の種々の方法で形質転換されることができる。多
くの場合、これらの植物の細胞、特にそれが双子葉植物の細胞であるとき、培養
して、再生しその後に連続して遺伝的に改変された植物体を生成する全植物体を
生成させることができる。植物を形質転換することに適したいかなる方法も用い
ることができる。例えば、トマト及びメロンなどの双子葉植物を、Agrobacteriu
m Tiプラスミドを用いて形質転換することができる。そのような形質転換された
植物は、交配により、又は細胞又は組織培養により、再生することができる。
なる植物を形質転換するためにも用いられることができる。単子葉植物及び双子
葉植物の細胞は、当業者に周知の種々の方法で形質転換されることができる。多
くの場合、これらの植物の細胞、特にそれが双子葉植物の細胞であるとき、培養
して、再生しその後に連続して遺伝的に改変された植物体を生成する全植物体を
生成させることができる。植物を形質転換することに適したいかなる方法も用い
ることができる。例えば、トマト及びメロンなどの双子葉植物を、Agrobacteriu
m Tiプラスミドを用いて形質転換することができる。そのような形質転換された
植物は、交配により、又は細胞又は組織培養により、再生することができる。
【００３９】 本発明の第１３の主題は、本発明の第１２の主題で定義された細胞を含む、植
物、植物断片、特に果実、種子、花弁、又は葉に関する。 特にカロチノイドの生産を増加させるために、センス配列を含むベクターで、
本発明により遺伝的に改変された植物又は植物断片は、植物により生産される正
常レベルに対して、高レベルのビタミンＡ前駆体を含む。
物、植物断片、特に果実、種子、花弁、又は葉に関する。 特にカロチノイドの生産を増加させるために、センス配列を含むベクターで、
本発明により遺伝的に改変された植物又は植物断片は、植物により生産される正
常レベルに対して、高レベルのビタミンＡ前駆体を含む。
【００４０】 植物の色におけるそれらの役割に加えて、カロチノイドは、高い強度の光によ
りもたらされるかもしれない損傷に対して植物を保護する役割も有する。その結
果、遺伝子改変により高レベルのこれらのカロチノイドを含む植物は、温度の大
きな変化を伴う栽培が行なわれる領域で、大いに興味の対象である。
りもたらされるかもしれない損傷に対して植物を保護する役割も有する。その結
果、遺伝子改変により高レベルのこれらのカロチノイドを含む植物は、温度の大
きな変化を伴う栽培が行なわれる領域で、大いに興味の対象である。
【００４１】 遺伝的改変植物は、カロチノイド合成が増加するかまたは減少するかに応じて
、種々の色を呈することができる。特に、ＴＯＣＢ組換え産物は、脱飽和反応の
間に生産されたカロチノイドに関連する色、例えばリコピンレッド、また又はβ
−カロチンに関連する黄色／オレンジ色などの産物誘導体の生産を促進する又は
阻害するために用いられることができる。過剰発現センス組換え産物による、β
−カロチンの生産の促進は、黄色／オレンジ色の、あるいはβ−カロチン誘導体
により決定された色の、例えばカプソルビン又はカプサンチンの生合成によるよ
り強い赤の、トウガラシを生産することを可能にするかもしれない。得られたト
ウガラシは、消費者にとって食欲をそそるものとされるであろう。
、種々の色を呈することができる。特に、ＴＯＣＢ組換え産物は、脱飽和反応の
間に生産されたカロチノイドに関連する色、例えばリコピンレッド、また又はβ
−カロチンに関連する黄色／オレンジ色などの産物誘導体の生産を促進する又は
阻害するために用いられることができる。過剰発現センス組換え産物による、β
−カロチンの生産の促進は、黄色／オレンジ色の、あるいはβ−カロチン誘導体
により決定された色の、例えばカプソルビン又はカプサンチンの生合成によるよ
り強い赤の、トウガラシを生産することを可能にするかもしれない。得られたト
ウガラシは、消費者にとって食欲をそそるものとされるであろう。
【００４２】 本発明によって遺伝的に改変された植物の例として、より具体的には、果実産
生植物が挙げられるであろう。これらの植物の果実は、特異的な内部の色を促進
する又は強めることにより、消費者にとってより魅力的となろう。遺伝的に改変
され得る他の植物としては、ラディッシュ、カブ、ジャガイモなどの塊茎、トウ
モロコシ、コムギ、オオムギ、及びコメなどの穀類が挙げられる。
生植物が挙げられるであろう。これらの植物の果実は、特異的な内部の色を促進
する又は強めることにより、消費者にとってより魅力的となろう。遺伝的に改変
され得る他の植物としては、ラディッシュ、カブ、ジャガイモなどの塊茎、トウ
モロコシ、コムギ、オオムギ、及びコメなどの穀類が挙げられる。
【００４３】 本発明により遺伝的に改変された植物はまた、他の組換え産物、例えば、特に
果実の成熟において、他の効果を有する、組換え産物を含むことができる。例え
ば、本発明により改変された、より強い色を呈した果実は、組換え産物を、ポリ
ガラクツロナーゼやペクチンエステラーゼなどの、ある酵素を生産を阻害するも
のでも、又はエチレンの生産を干渉するものでも、含むことができる。これら２
つのタイプの組換え産物を含む果実は、連続的形質転換によっても、各々が組換
え産物の一方を含む２つの変異体の交配によっても、その後子孫から２つの組換
え産物を含むものを選択することにより、生産され得る。
果実の成熟において、他の効果を有する、組換え産物を含むことができる。例え
ば、本発明により改変された、より強い色を呈した果実は、組換え産物を、ポリ
ガラクツロナーゼやペクチンエステラーゼなどの、ある酵素を生産を阻害するも
のでも、又はエチレンの生産を干渉するものでも、含むことができる。これら２
つのタイプの組換え産物を含む果実は、連続的形質転換によっても、各々が組換
え産物の一方を含む２つの変異体の交配によっても、その後子孫から２つの組換
え産物を含むものを選択することにより、生産され得る。
【００４４】 本発明の第１４の主題は、植物により生産されるカロチノイドの正常含量に対
して、植物によるカロチノイドの生産を増加させることによる、又はカロチノイ
ドの生産を減少又は阻害することによる、植物におけるカロチノイドの生産を改
変するための方法に関し、この方法は、本発明の第１０及び第１１の主題で定義
されたベクターで形質転換される前記植物の細胞の形質転換を含む。
して、植物によるカロチノイドの生産を増加させることによる、又はカロチノイ
ドの生産を減少又は阻害することによる、植物におけるカロチノイドの生産を改
変するための方法に関し、この方法は、本発明の第１０及び第１１の主題で定義
されたベクターで形質転換される前記植物の細胞の形質転換を含む。
【００４５】 本発明の第１５の主題は、植物細胞、又は真核又は原核細胞で、カロチノイド
を生産する方法に関し、この方法は、本発明の第１０及び第１１の主題で定義さ
れたベクターで形質転換される前記植物細胞、又は真核又は原核細胞の形質転換
を含む。
を生産する方法に関し、この方法は、本発明の第１０及び第１１の主題で定義さ
れたベクターで形質転換される前記植物細胞、又は真核又は原核細胞の形質転換
を含む。
【００４６】 ＴＯＣＢ酵素をコードする組換え産物を発現する真核又は原核生物の器官によ
って生産されたβ−カロチンは、着色剤、抗酸化剤、又はビタミンＡ前駆体とし
て用いられるために抽出されることができる。
って生産されたβ−カロチンは、着色剤、抗酸化剤、又はビタミンＡ前駆体とし
て用いられるために抽出されることができる。
【００４７】 最後に、本発明は、除草性化合物を選択する方法であって、薬剤を、細胞また
は細胞膜、特に本発明の細胞と接触させ、カロテノイド生合成に関与する末端オ
キシダーゼの阻害に関連する前記細胞の膜による酸素消費の低減を調べる方法に
も関する。これを観測するのに適切な技術は、特に実施例６に記載されている。
は細胞膜、特に本発明の細胞と接触させ、カロテノイド生合成に関与する末端オ
キシダーゼの阻害に関連する前記細胞の膜による酸素消費の低減を調べる方法に
も関する。これを観測するのに適切な技術は、特に実施例６に記載されている。
【００４８】
実施例１：ＴＯＣＢ蛋白質をコードする遺伝子座のクローニングの詳細 １-変異体の単離 変異は、植物、シロイナズナ栽培品種ランドベルグ−エレクタ（Arabidopsis
thaliana cultivar landsberg-erecta）のゲノムに導入されたトランスポゾンを
使用して誘導した。
thaliana cultivar landsberg-erecta）のゲノムに導入されたトランスポゾンを
使用して誘導した。
【００４９】 この技術の概略は、論文に記載されていて（Long, D., Martin, M., Sundberg
, E., Swinburne, J., Puangsomlee P., and Coupland, G. (1993) The Maize t
ransposable element system Ac/Ds as a mutagen in Arabidosis: Indentifica
tion of an albino mutation induced by Ds insertion. Pro. Natl. Science U
SA, 10, 10370-10374）、John Innes Centre for Plant Science（Colney, Norw
ich, NR4 7UH, Nordwich, Great Britain）の Geoge Couplandの実験室内の者に
より使用されたものである。
, E., Swinburne, J., Puangsomlee P., and Coupland, G. (1993) The Maize t
ransposable element system Ac/Ds as a mutagen in Arabidosis: Indentifica
tion of an albino mutation induced by Ds insertion. Pro. Natl. Science U
SA, 10, 10370-10374）、John Innes Centre for Plant Science（Colney, Norw
ich, NR4 7UH, Nordwich, Great Britain）の Geoge Couplandの実験室内の者に
より使用されたものである。
【００５０】 ここで使用する分離体（dissociator:Ds）転位可能因子の転位は、トランスポ
アーゼ（transpoase）蛋白質（又はアクチベーター因子、Acのトランスポアーゼ
）を産生することにより引き起こした。
アーゼ（transpoase）蛋白質（又はアクチベーター因子、Acのトランスポアーゼ
）を産生することにより引き起こした。
【００５１】 Ds因子の転位を起こした植物の子孫（descendents）の中で、白色突然変異の
外観を有する複数の植物、即ち緑色色素（クロロフィル）の欠失していることに
より野生型と異なっているものが同定された。野生型の外観を有するが、その子
孫へ当該変異を伝える植物もまた、同定された。これらの植物は、ヘテロ接合体
として同定されるものであり、これは一の染色体においてのみ変異を有している
。ホモ接合体の植物は、変異体の表現系を有し、二つの相同染色体において変異
を有している。
外観を有する複数の植物、即ち緑色色素（クロロフィル）の欠失していることに
より野生型と異なっているものが同定された。野生型の外観を有するが、その子
孫へ当該変異を伝える植物もまた、同定された。これらの植物は、ヘテロ接合体
として同定されるものであり、これは一の染色体においてのみ変異を有している
。ホモ接合体の植物は、変異体の表現系を有し、二つの相同染色体において変異
を有している。
【００５２】 ２.転位因子Dsへの変異体の結合試験 この実験は、観察された変異が、当該植物の機能を修正すること、及びその野
生型の外観に必要な遺伝子内へ、Ds因子を挿入することにより引き起こされるこ
とを証明する目的で行った。
生型の外観に必要な遺伝子内へ、Ds因子を挿入することにより引き起こされるこ
とを証明する目的で行った。
【００５３】 転位可能な因子、又はトランスポゾンであるDsは、抗生物質のハイグロマイシ
ンに対する抵抗性の遺伝子を有するようにして構築する（前出の文献に記載され
ている）。白色突然変異を有する３５個のヘテロ接合体植物の子孫を、致死量の
ハイグロマイシンを含有する寒天培地上で増殖させた。ここで、当該変異を有す
る全ての植物もまた、ハイグロマイシン抵抗性である。当該変異は、当該トラン
スポゾンが有する抵抗性遺伝子と連結（associated）しているという結論が得ら
れた。
ンに対する抵抗性の遺伝子を有するようにして構築する（前出の文献に記載され
ている）。白色突然変異を有する３５個のヘテロ接合体植物の子孫を、致死量の
ハイグロマイシンを含有する寒天培地上で増殖させた。ここで、当該変異を有す
る全ての植物もまた、ハイグロマイシン抵抗性である。当該変異は、当該トラン
スポゾンが有する抵抗性遺伝子と連結（associated）しているという結論が得ら
れた。
【００５４】 抗生物質のハイグロマイシンに抵抗性の植物由来のＤＮＡの一部であって、当
該トランスポゾンに隣接するものを単離した。これは、前出の文献に記載される
逆ＰＣＲ法、又はＩＰＣＲにより行った。
該トランスポゾンに隣接するものを単離した。これは、前出の文献に記載される
逆ＰＣＲ法、又はＩＰＣＲにより行った。
【００５５】 「サザンブロット」法により、変異を有する株は、ゲノムＤＮＡにおいて変化
を有していることがわかった。この変化は、当該トランスポゾンに隣接する、単
離されたＤＮＡの部分を「プローブ」として使用すると発見された。
を有していることがわかった。この変化は、当該トランスポゾンに隣接する、単
離されたＤＮＡの部分を「プローブ」として使用すると発見された。
【００５６】 ３．遺伝子の単離 ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法を利用して、変異体において
中断された遺伝子についての、変化していない野生型のものを含む可能性のある
ゲノムＤＮＡ断片を含むクローンを単離した。
中断された遺伝子についての、変化していない野生型のものを含む可能性のある
ゲノムＤＮＡ断片を含むクローンを単離した。
【００５７】 スクリーニングしたＤＮＡライブラリーを構築した。これは刊行物、Whitelam
, G.C., Johnson, E., Peng, J., Carol P., Anderson, M.L., Cowl, J.S. & Ha
rberd, N.P. (1993) Phytochrom A null mutants of Arabidopsis display a wi
ld-type phenotype in white light. The Plant Cell 5, 757-768に記載されて
いる。
, G.C., Johnson, E., Peng, J., Carol P., Anderson, M.L., Cowl, J.S. & Ha
rberd, N.P. (1993) Phytochrom A null mutants of Arabidopsis display a wi
ld-type phenotype in white light. The Plant Cell 5, 757-768に記載されて
いる。
【００５８】 ゲノムＤＮＡクローンを、酵素EcoRIで酵素的に消化することにより得られた
制限断片の全配列を決定した。得られた配列は、３０００塩基対をカバーしてい
た。これら３０００塩基対の中で、以前に単離されていた境界断片の配列に等し
い部分が発見され、これにより単離されたＤＮＡと、トランスポゾンで中断され
た遺伝子との間の同一性が確認される。
制限断片の全配列を決定した。得られた配列は、３０００塩基対をカバーしてい
た。これら３０００塩基対の中で、以前に単離されていた境界断片の配列に等し
い部分が発見され、これにより単離されたＤＮＡと、トランスポゾンで中断され
た遺伝子との間の同一性が確認される。
【００５９】 ４．コード配列の単離及び特徴づけ cDNAライブラリーを使用したが、これはClonetech Laboratories Inc.が販売
する商業的なライブラリーである。これは、シロイナズナ（Arabidopsis thalia
na）より抽出されたｍＲＮＡを、cDNAへ変換し、そしてプラスミドベクターであ
るｐＧＡＤ１０へクローニングして調製される、cDNAライブラリーである。
する商業的なライブラリーである。これは、シロイナズナ（Arabidopsis thalia
na）より抽出されたｍＲＮＡを、cDNAへ変換し、そしてプラスミドベクターであ
るｐＧＡＤ１０へクローニングして調製される、cDNAライブラリーである。
【００６０】 このcDNAのデータライブラリーを使用し、そして通常の方法により、上記で同
定された遺伝子をプローブとして使用し、約１４００塩基対の大きさのcDNAを含
む複数のクローンを単離した。
定された遺伝子をプローブとして使用し、約１４００塩基対の大きさのcDNAを含
む複数のクローンを単離した。
【００６１】 cDNAの全配列を決定したが、これにより、このcDNAは、以前同定したゲノムＤ
ＮＡの断片内に完全に含まれることが示された。この遺伝子のコード領域（エク
ソン）及び非コード領域（イントロン）が、当該遺伝子の配列上に配置されてい
た。この遺伝子には９つのエクソンと８つのイントロンとがある。トランスポゾ
ンDsの挿入は、二番目のエクソンの開始部に同定され、従って当該遺伝子のコー
ド領域を中断している。
ＮＡの断片内に完全に含まれることが示された。この遺伝子のコード領域（エク
ソン）及び非コード領域（イントロン）が、当該遺伝子の配列上に配置されてい
た。この遺伝子には９つのエクソンと８つのイントロンとがある。トランスポゾ
ンDsの挿入は、二番目のエクソンの開始部に同定され、従って当該遺伝子のコー
ド領域を中断している。
【００６２】 このcDNA配列は、ＴＯＣＢとして知られる３９ｋＤａの潜在的蛋白質をコード
する、３５０アミノ酸のオープンリーディングフレームの前に、潜在的な開始コ
ドンを有している。blastpプログラム（Altshul et al., (1997), Gapped BLAST
and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nu
cleics Acids Res. 25, 3389-3402）を使用した相同性検索により、ミトコンド
リアの選択性オキシダーゼ（alternative oxidase）又は末端オキシダーゼ（AOX
）のファミリーのポリペプチドと、低いが顕著な相同性が発見された。他の顕著
な相同性は一切、見つからなかった。相同性は、１１１位のアミノ酸から開始さ
れ、ダイズオキシダーゼと２９％の同一性（４５％の類似性）を示している。AO
X蛋白質との相同性は低いのにも関わらず、二次構造、及び生物学的顕著性の潜
在的なドメインについてのコンピュータ検索により、当該蛋白質ＴＯＣＢとＡＯ
Ｘとの間の構造的類似性が発見された。ＡＯＸ中に発見された経膜ヘリックスド
メインは、ＴＯＣＢのペプチド配列上の類似の場所に位置しているが、これはＴ
ＯＣＢの膜の位置と、更に膜内におけるＡＯＸのものと同様の構成を示唆してい
る。更に、鉄結合部分が、ＴＯＣＢとＡＯＸとの間で保存されている。ＴＯＣＢ
蛋白質とＡＯＣ蛋白質との間の配列のアライメントにより、エクソン７と８の部
分に相当する、ＴＯＣＢ蛋白質への１９アミノ酸の挿入が示された。
する、３５０アミノ酸のオープンリーディングフレームの前に、潜在的な開始コ
ドンを有している。blastpプログラム（Altshul et al., (1997), Gapped BLAST
and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nu
cleics Acids Res. 25, 3389-3402）を使用した相同性検索により、ミトコンド
リアの選択性オキシダーゼ（alternative oxidase）又は末端オキシダーゼ（AOX
）のファミリーのポリペプチドと、低いが顕著な相同性が発見された。他の顕著
な相同性は一切、見つからなかった。相同性は、１１１位のアミノ酸から開始さ
れ、ダイズオキシダーゼと２９％の同一性（４５％の類似性）を示している。AO
X蛋白質との相同性は低いのにも関わらず、二次構造、及び生物学的顕著性の潜
在的なドメインについてのコンピュータ検索により、当該蛋白質ＴＯＣＢとＡＯ
Ｘとの間の構造的類似性が発見された。ＡＯＸ中に発見された経膜ヘリックスド
メインは、ＴＯＣＢのペプチド配列上の類似の場所に位置しているが、これはＴ
ＯＣＢの膜の位置と、更に膜内におけるＡＯＸのものと同様の構成を示唆してい
る。更に、鉄結合部分が、ＴＯＣＢとＡＯＸとの間で保存されている。ＴＯＣＢ
蛋白質とＡＯＣ蛋白質との間の配列のアライメントにより、エクソン７と８の部
分に相当する、ＴＯＣＢ蛋白質への１９アミノ酸の挿入が示された。
【００６３】 ＴＯＣＢ蛋白質のＮ末端配列は、葉緑体トランジット（transit）ペプチドの
特徴を有しているが、これはロイシン、アルギニン、及びセリン/スレオニンに
富むものである。当該トランジットペプチドの潜在能力をコンピュータで分析す
ると、葉緑体のチラコイド区画において、ＴＯＣＢの標的でありえることが示唆
された。
特徴を有しているが、これはロイシン、アルギニン、及びセリン/スレオニンに
富むものである。当該トランジットペプチドの潜在能力をコンピュータで分析す
ると、葉緑体のチラコイド区画において、ＴＯＣＢの標的でありえることが示唆
された。
【００６４】 ５．変異の同定 当該変異体の外観は、文献（Wetzel C. M., Jiang C-Z., Meehan L.J., Voyta
s D.L., Rodermel S.R. (1994) Nuclear-organelle interactions: the immutan
s variegarion mutant of Arabidopsis is plastid autonomous and impaired i
n carotenoid biosynthesis, Plant Journal 6, 161-175）にすでに記載されて
いる「無変異（immutants）」変異体のものと類似である。
s D.L., Rodermel S.R. (1994) Nuclear-organelle interactions: the immutan
s variegarion mutant of Arabidopsis is plastid autonomous and impaired i
n carotenoid biosynthesis, Plant Journal 6, 161-175）にすでに記載されて
いる「無変異（immutants）」変異体のものと類似である。
【００６５】 この「無変異」変異体（斑点対立遺伝子、前出の文献を参照）を、本発明によ
り単離されたものと異種交配させた。この異種交配の子孫は、変異体の外観を有
しているが、これは当該二つの変異が同じ遺伝子に影響するならば、予期される
結果である。従って同定された遺伝子は、ＩＭＭＵＴＡＮＳ遺伝子座の野生型に
対応し、当該得られた変異体は、当該遺伝子が中断されたもの（その産物は従っ
て不活性である）を有すると主張できる。
り単離されたものと異種交配させた。この異種交配の子孫は、変異体の外観を有
しているが、これは当該二つの変異が同じ遺伝子に影響するならば、予期される
結果である。従って同定された遺伝子は、ＩＭＭＵＴＡＮＳ遺伝子座の野生型に
対応し、当該得られた変異体は、当該遺伝子が中断されたもの（その産物は従っ
て不活性である）を有すると主張できる。
【００６６】 よって本発明の第一の主題は、これは、その酵素活性がＴＯＣＢのものと同一
又は等価である蛋白質をコードする一方、「無変異」体によりコードされる産物
には、一切、活性がないという点において、上記の変異体とは異なっている。
又は等価である蛋白質をコードする一方、「無変異」体によりコードされる産物
には、一切、活性がないという点において、上記の変異体とは異なっている。
【００６７】 実施例２：植物発現ベクター中へのトウガラシＴＯＣＢをコードするｃＤＮＡの
導入による、本発明のベクターの構築 ベクターｐＢＩ１２１(Clontech Laboratories, Inc.により販売)は、この構
築のために適したベクターである。 それは細菌Agrobacterium tumefaciensが植物ゲノム中にトランスファーでき
るＴ−ＤＮＡ領域を含む。
導入による、本発明のベクターの構築 ベクターｐＢＩ１２１(Clontech Laboratories, Inc.により販売)は、この構
築のために適したベクターである。 それは細菌Agrobacterium tumefaciensが植物ゲノム中にトランスファーでき
るＴ−ＤＮＡ領域を含む。
【００６８】 このＴ−ＤＮＡ領域は、とりわけ構成的プロモーター（ＣａＭＶウイルスから
由来する３５Ｓとして周知のプロモーター）、（ノパリンシンターゼ遺伝子の）
ＮＯＳターミネーターが引き続くＧＵＳ遺伝子を含む。ＧＵＳ遺伝子は、本発明
において興味ある遺伝子ではないので、それをＴＯＣＢをコードするｃＤＮＡで
置換する。かくしてこのｃＤＮＡは、３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネータ
ーの制御の下に配置される。
由来する３５Ｓとして周知のプロモーター）、（ノパリンシンターゼ遺伝子の）
ＮＯＳターミネーターが引き続くＧＵＳ遺伝子を含む。ＧＵＳ遺伝子は、本発明
において興味ある遺伝子ではないので、それをＴＯＣＢをコードするｃＤＮＡで
置換する。かくしてこのｃＤＮＡは、３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネータ
ーの制御の下に配置される。
【００６９】 いずれかの他の構成的若しくは非構成的プロモーター（後者の場合、それは修
飾することが所望される特性を有する器官に特異的である必要がある）、及びい
ずれかの他のターミネーターもまた使用できる。
飾することが所望される特性を有する器官に特異的である必要がある）、及びい
ずれかの他のターミネーターもまた使用できる。
【００７０】 ＴＯＣＢをコードするｃＤＮＡは、最初に細菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＫＳのＮｏｔＩ制限部位にサブクローン化された：かくしてそれは、５’Ｂ
ａｍＨＩ切断部位と３’ＳａｃＩ切断部位に隣接した。
ｐｔＫＳのＮｏｔＩ制限部位にサブクローン化された：かくしてそれは、５’Ｂ
ａｍＨＩ切断部位と３’ＳａｃＩ切断部位に隣接した。
【００７１】 このｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩでプラスミドｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＫＳから切り出す。このＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を、これらの酵素で
切断されたベクターｐＢＩ１２１中に挿入する：ＢａｍＨＩ部位は３５Ｓプロモ
ーターの３’末端でＧＵＳ遺伝子の５’末端に位置し、ＳａｃＩ部位はＧＵＳ遺
伝子の３’末端でＮＯＳターミネーターの５’末端に位置する。 ライゲーションの後、ＴＯＣＢをコードするｃＤＮＡ（それはイントロンを含
まない）でＧＵＳ遺伝子を置換したベクターｐＢＩ１２１の誘導体を選択する。
ｒｉｐｔＫＳから切り出す。このＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を、これらの酵素で
切断されたベクターｐＢＩ１２１中に挿入する：ＢａｍＨＩ部位は３５Ｓプロモ
ーターの３’末端でＧＵＳ遺伝子の５’末端に位置し、ＳａｃＩ部位はＧＵＳ遺
伝子の３’末端でＮＯＳターミネーターの５’末端に位置する。 ライゲーションの後、ＴＯＣＢをコードするｃＤＮＡ（それはイントロンを含
まない）でＧＵＳ遺伝子を置換したベクターｐＢＩ１２１の誘導体を選択する。
【００７２】 実施例３：本発明のトランスフォーム細胞を得るための植物細胞のトランスフォ
ーメーション 実施例２で得られたｐＢＩ１２１から由来する植物トランスフォーメーション
ベクターを、エレクトロポレーションによりAgrobacterium ＬＢＡ４４０４の株
中に導入する。組換え株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で選択する
。 このAgrobacteriumのトランスフォーム株を、例えばタバコ細胞といった植物
細胞のトランスフォーメーションのために使用する。
ーメーション 実施例２で得られたｐＢＩ１２１から由来する植物トランスフォーメーション
ベクターを、エレクトロポレーションによりAgrobacterium ＬＢＡ４４０４の株
中に導入する。組換え株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で選択する
。 このAgrobacteriumのトランスフォーム株を、例えばタバコ細胞といった植物
細胞のトランスフォーメーションのために使用する。
【００７３】 これを実施するために使用される方法は、いずれかの他のトランスフォーメー
ション法によって置換しても良いが、in vitroで培養されたタバコ小植物の葉の
ディスクを感染する方法である。トランスフォーム植物細胞を、カナマイシンの
存在下で選択する。Agrobacteriumを、抗生物質セフォタキシムによって除去す
る。葉のディスクを、カルスの成長を促進する植物ホルモン（オーキシン及びサ
イトカイニン）の存在下で植物培養培地で培養する。トランスフォーム細胞の増
殖から由来するカルスを、従来法により全体の植物の再生のために使用する。例
えばカルスを、サイトカイニンの存在下の植物細胞培地にトランスファーし、シ
ュートの形成を誘導する。次いでこれらのシュートを切断し、ホルモンを含まな
い培養培地にトランスファーして根を再生する。抗生物質カナマイシン（トラン
スフォーム組織の成長について選択するため）及びセフォタキシム（Agrobacter
iumを完全に除去するため）を、これらの培養段階を通じて維持する。
ション法によって置換しても良いが、in vitroで培養されたタバコ小植物の葉の
ディスクを感染する方法である。トランスフォーム植物細胞を、カナマイシンの
存在下で選択する。Agrobacteriumを、抗生物質セフォタキシムによって除去す
る。葉のディスクを、カルスの成長を促進する植物ホルモン（オーキシン及びサ
イトカイニン）の存在下で植物培養培地で培養する。トランスフォーム細胞の増
殖から由来するカルスを、従来法により全体の植物の再生のために使用する。例
えばカルスを、サイトカイニンの存在下の植物細胞培地にトランスファーし、シ
ュートの形成を誘導する。次いでこれらのシュートを切断し、ホルモンを含まな
い培養培地にトランスファーして根を再生する。抗生物質カナマイシン（トラン
スフォーム組織の成長について選択するため）及びセフォタキシム（Agrobacter
iumを完全に除去するため）を、これらの培養段階を通じて維持する。
【００７４】 トランスフォーム植物を、カナマイシンとセフォタキシムの存在下で滅菌培地
に配置し、次いで土にトランスフォーし、種を収穫するまでグリーンハウスで培
養する。トランスジーンの存在を、使用されたトランスフォーメーションベクタ
ーから由来する特異的プローブと、これらの植物のゲノムＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションにより確認した。
に配置し、次いで土にトランスフォーし、種を収穫するまでグリーンハウスで培
養する。トランスジーンの存在を、使用されたトランスフォーメーションベクタ
ーから由来する特異的プローブと、これらの植物のゲノムＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションにより確認した。
【００７５】 実施例４：カロテノイド生合成と関連する末端オキシダーゼ（ＴＯＣＢ）酵素に
相当するトウガラシ及びトマト果実のｃＤＮＡのクローニングと特徴付け 成熟ＴＯＣＢペプチドをコードするArabidopsisの「未突然変異」ｃＤＮＡ部
分を、非緊縮条件下でピーマン及びトウガラシについてのｃＤＮＡライブラリー
に対してサーチするためのプローブとして使用した。分析された全ての陽性クロ
ーンが、非翻訳３’領域中で観察される同一の配列によって示唆されるように、
同じ遺伝子から由来するように思われた。全クローンのＤＮＡ配列が、配列番号
３の下で挙げられた配列中に提示される。推定されるアミノ酸配列は、配列番号
４の下で挙げられた配列中に提示される。次いでトウガラシｃＤＮＡを、アカト
マトｃＤＮＡライブラリーから対応するｃＤＮＡを単離するために使用した（配
列番号５）。
相当するトウガラシ及びトマト果実のｃＤＮＡのクローニングと特徴付け 成熟ＴＯＣＢペプチドをコードするArabidopsisの「未突然変異」ｃＤＮＡ部
分を、非緊縮条件下でピーマン及びトウガラシについてのｃＤＮＡライブラリー
に対してサーチするためのプローブとして使用した。分析された全ての陽性クロ
ーンが、非翻訳３’領域中で観察される同一の配列によって示唆されるように、
同じ遺伝子から由来するように思われた。全クローンのＤＮＡ配列が、配列番号
３の下で挙げられた配列中に提示される。推定されるアミノ酸配列は、配列番号
４の下で挙げられた配列中に提示される。次いでトウガラシｃＤＮＡを、アカト
マトｃＤＮＡライブラリーから対応するｃＤＮＡを単離するために使用した（配
列番号５）。
【００７６】 図３は、上述の推定されるアミノ酸配列と、トウガラシ及びArabidopsisＴＯ
ＣＢの配列の間の比較を示す。 プラスチド中のターゲッティングのために使用される輸送ペプチドは、Ｎ末端
領域と仮定的な切断部位（ＡＴＲ／Ｑ−ＡＴ）に近接する領域を除いて、配列相
同性を明らかにした。しかしながら、成熟ＴＯＣＢポリペプチドは、強力な配列
相同性を有し、そのことはそれらが同じ特性を有することを意味する。
ＣＢの配列の間の比較を示す。 プラスチド中のターゲッティングのために使用される輸送ペプチドは、Ｎ末端
領域と仮定的な切断部位（ＡＴＲ／Ｑ−ＡＴ）に近接する領域を除いて、配列相
同性を明らかにした。しかしながら、成熟ＴＯＣＢポリペプチドは、強力な配列
相同性を有し、そのことはそれらが同じ特性を有することを意味する。
【００７７】 ＴＯＣＢ配列の整列比較はまた、高度に保存された親水性部分によって分離さ
れる、二つの保存的な潜在的膜貫通ドメインの存在を明らかにした。Ｎ末端ドメ
インは必須に親水性であり、長くて弱く保存されたアミノ酸部分を含む。Ｃ末端
ドメインもまた主に親水性であり、仮定的な鉄結合部位（ＥｘｘＨ）と適合する
保存的部分（ＥＡＥＨ）を含む。さらに、該領域は、ＴＯＣＢにおいて保存され
る６のシステイン残基を含む一方で、ポリペプチドの残りの部分はシステイン残
基を欠いている。
れる、二つの保存的な潜在的膜貫通ドメインの存在を明らかにした。Ｎ末端ドメ
インは必須に親水性であり、長くて弱く保存されたアミノ酸部分を含む。Ｃ末端
ドメインもまた主に親水性であり、仮定的な鉄結合部位（ＥｘｘＨ）と適合する
保存的部分（ＥＡＥＨ）を含む。さらに、該領域は、ＴＯＣＢにおいて保存され
る６のシステイン残基を含む一方で、ポリペプチドの残りの部分はシステイン残
基を欠いている。
【００７８】 これらのシステイン残基のいくつかは、タンパク質の共有結合二量体化に関与
するであろう。
するであろう。
【００７９】 実施例５：トウガラシ及びトマト中の果実の成熟の間のＴＯＣＢ遺伝子の発現 ＴＯＣＢ遺伝子の発現の機構を定義するために、全ＲＮＡを、成熟の異なる段
階で果実から抽出した。発現機構を、全ＲＮＡの逆転写、引き続きポリメラーゼ
連鎖反応によって測定した（ＲＴ−ＰＣＲ）。
階で果実から抽出した。発現機構を、全ＲＮＡの逆転写、引き続きポリメラーゼ
連鎖反応によって測定した（ＲＴ−ＰＣＲ）。
【００８０】 ＴＯＣＢ遺伝子は、トウガラシ果実の成長及び成熟を通じて発現している。さ
らに、それはカロテノイドデサチュラーゼ、つまりフィトエンデサチュラーゼ及
びゼータ−カロテンデサチュラーゼをコードする遺伝子のものと相同な発現機構
を有する。転写レベルの増大が、未成熟グリーン期と成熟グリーン期（成熟サイ
ズの果実）の間で観察され、引き続き成熟グリーン期と退廃期（着色変化の早期
に検出可能な徴候）の間でもう一つの増大が観察される。次いで転写のレベルは
、ずっと一定に維持される（赤色化期の間で僅かに減少する）。
らに、それはカロテノイドデサチュラーゼ、つまりフィトエンデサチュラーゼ及
びゼータ−カロテンデサチュラーゼをコードする遺伝子のものと相同な発現機構
を有する。転写レベルの増大が、未成熟グリーン期と成熟グリーン期（成熟サイ
ズの果実）の間で観察され、引き続き成熟グリーン期と退廃期（着色変化の早期
に検出可能な徴候）の間でもう一つの増大が観察される。次いで転写のレベルは
、ずっと一定に維持される（赤色化期の間で僅かに減少する）。
【００８１】 ＴＯＣＢ遺伝子はまた、トマトにおける果実の成長及び成熟の間で発現される
。トマトにおいては、カロテノイドデサチュラーゼ（フィトエンデサチュラーゼ
及びゼータ−カロテンデサチュラーゼ）をコードする遺伝子と相同の発現機構が
存在する。転写レベルの増大が、未成熟グリーン期と成熟グリーン期（成熟サイ
ズの果実）の間で観察され、引き続き成熟グリーン期と退廃期の間でもう一つの
より大きい増大が観察される。
。トマトにおいては、カロテノイドデサチュラーゼ（フィトエンデサチュラーゼ
及びゼータ−カロテンデサチュラーゼ）をコードする遺伝子と相同の発現機構が
存在する。転写レベルの増大が、未成熟グリーン期と成熟グリーン期（成熟サイ
ズの果実）の間で観察され、引き続き成熟グリーン期と退廃期の間でもう一つの
より大きい増大が観察される。
【００８２】 トウガラシとトマト果実のタンパク質の痕跡が所望される場合、ＴＯＣＢに対
して向けられた抗体を使用して、このポリペプチドが果実の発達の各種の段階で
見出された。これらの試験により、成熟グリーン期から退廃期までのＴＯＣＢタ
ンパク質のレベルの増大が示された。このタンパク質のレベルは、果実の成熟を
通じて高く維持された。
して向けられた抗体を使用して、このポリペプチドが果実の発達の各種の段階で
見出された。これらの試験により、成熟グリーン期から退廃期までのＴＯＣＢタ
ンパク質のレベルの増大が示された。このタンパク質のレベルは、果実の成熟を
通じて高く維持された。
【００８３】 これらの結果は、ＴＯＣＢ遺伝子が発現され、ＴＯＣＢタンパク質が果実中に
存在することを示す。カロテノイドの脱飽和に関与する構造的酵素のものと同様
な態様で、ＴＯＣＢ遺伝子は誘導され、カロテノイド合成が増大する成熟の間で
タンパク質が蓄積する。
存在することを示す。カロテノイドの脱飽和に関与する構造的酵素のものと同様
な態様で、ＴＯＣＢ遺伝子は誘導され、カロテノイド合成が増大する成熟の間で
タンパク質が蓄積する。
【００８４】 ここでの記載に存在する結果は、ＴＯＣＢがカロテノイド生合成系のエレメン
トであることを明らかにする。
トであることを明らかにする。
【００８５】 特に非効率的な若しくはあまり効率的ではないカロテノイド生合成系を有する
植物組織若しくは細胞または細菌中で、カロテノイド生合成を修正するために、
ＴＯＣＢタンパク質を使用することが考慮されても良い。ＴＯＣＢは、カロテノ
イド生合成の構造的酵素と同時に生産され、カロテノイドの生産の効率を増大す
る。
植物組織若しくは細胞または細菌中で、カロテノイド生合成を修正するために、
ＴＯＣＢタンパク質を使用することが考慮されても良い。ＴＯＣＢは、カロテノ
イド生合成の構造的酵素と同時に生産され、カロテノイドの生産の効率を増大す
る。
【００８６】 実施例６：大腸菌での発現の後に分析されるＴＯＣＢの触媒特性 Arabidopsisから得た成熟ＴＯＣＢポリペプチドをコードする領域よりなる合
成産物を、原核生物発現ベクター内に挿入した（QIAGENによって販売されるｐＱ
Ｅ３１のような、いずれかの他のベクターも同様な結果を与えるであろうと解さ
れる）。
成産物を、原核生物発現ベクター内に挿入した（QIAGENによって販売されるｐＱ
Ｅ３１のような、いずれかの他のベクターも同様な結果を与えるであろうと解さ
れる）。
【００８７】 発現ベクター中に挿入されることが企図されるコード領域は、輸送ペプチドの
切断の部位に相当するコドンに近接して機能する制限酵素を使用した切断によっ
て得ることができる。
切断の部位に相当するコドンに近接して機能する制限酵素を使用した切断によっ
て得ることができる。
【００８８】 別法として、コード領域のＰＣＲによる増幅が実施されても良い。以下のオリ
ゴヌクレオチドが、ArabidopsisＴＯＣＢの配列を増幅するために有利に使用さ
れるであろう： 5'-GCAACGATTTTGCAAGACG-3'及び 5'-TTAACTTGTAATGGATTTCTTGAG-3'。
ゴヌクレオチドが、ArabidopsisＴＯＣＢの配列を増幅するために有利に使用さ
れるであろう： 5'-GCAACGATTTTGCAAGACG-3'及び 5'-TTAACTTGTAATGGATTTCTTGAG-3'。
【００８９】 他種（トウガラシ若しくはトマトのような）においてＴＯＣＢをコードする領
域を含む他のアセンブリー産物もまた使用できる。
域を含む他のアセンブリー産物もまた使用できる。
【００９０】 これらのプラスミドは、従来法にしたがって大腸菌細胞中に導入できる。大腸
菌において組換えタンパク質を得るために、細胞を以下の条件の下で培養する：
リッチ培地中に一晩のプレカルチャーの１０ｍｌを、０．２％グリセロール、及
びプラスミドを失った細胞の生育を停止するのに必要な抗生物質の供給を含む、
Ｍ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ３４ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ２２ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ １
８ｍＭ、ＮａＣｌ ８．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．１ｍＭ、
チアミン１ｍＭ）の３００ｍｌ中に希釈する。細菌の増殖を、対数増殖期の中間
まで、好ましくは６００ｎｍで０．３の吸光度が読み取られるまで、激しく攪拌
しながら３７℃で継続する。
菌において組換えタンパク質を得るために、細胞を以下の条件の下で培養する：
リッチ培地中に一晩のプレカルチャーの１０ｍｌを、０．２％グリセロール、及
びプラスミドを失った細胞の生育を停止するのに必要な抗生物質の供給を含む、
Ｍ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４ ３４ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ２２ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ １
８ｍＭ、ＮａＣｌ ８．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．１ｍＭ、
チアミン１ｍＭ）の３００ｍｌ中に希釈する。細菌の増殖を、対数増殖期の中間
まで、好ましくは６００ｎｍで０．３の吸光度が読み取られるまで、激しく攪拌
しながら３７℃で継続する。
【００９１】 インデューサーＩＰＴＧでのこのキメラ遺伝子の誘導及び１ｍｇ／ｌのＦｅＳ
Ｏ４の添加の後、培養物を２５℃で激しく攪拌しながら３時間維持する。次いで
細胞を４℃での遠心分離により回収し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５Ｍスク
ロース、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄し、再び遠心分離する。
次いで細胞を、０．７５Ｍスクロース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５に懸濁し、リゾチーム（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を加え
て３０℃で３０分で溶解し、次いで二等量の水の添加により浸透圧ショックにか
け、その後に０℃で超音波処理する。ゆっくりした速度での遠心による標準的な
遠心分離により、非溶解細胞と破片を除去することが可能である。４℃での高速
遠心分離（例えばBechman 50 Tiローターで４００００ｒｐｍ）により、０．７
Ｍスクロース、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に懸濁された膜が生産
でき、それを４℃で維持する。
Ｏ４の添加の後、培養物を２５℃で激しく攪拌しながら３時間維持する。次いで
細胞を４℃での遠心分離により回収し、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５Ｍスク
ロース、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄し、再び遠心分離する。
次いで細胞を、０．７５Ｍスクロース、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５に懸濁し、リゾチーム（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を加え
て３０℃で３０分で溶解し、次いで二等量の水の添加により浸透圧ショックにか
け、その後に０℃で超音波処理する。ゆっくりした速度での遠心による標準的な
遠心分離により、非溶解細胞と破片を除去することが可能である。４℃での高速
遠心分離（例えばBechman 50 Tiローターで４００００ｒｐｍ）により、０．７
Ｍスクロース、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に懸濁された膜が生産
でき、それを４℃で維持する。
【００９２】 ＴＯＣＢの酵素活性を試験するために、生産された膜による酸素の消費を標準
的な酸素電極を使用して測定し、分当たり及びタンパク質のグラム当たりの消費
されたＯ２のｎｍｏｌで表す。
的な酸素電極を使用して測定し、分当たり及びタンパク質のグラム当たりの消費
されたＯ２のｎｍｏｌで表す。
【００９３】 図４に示されるように、ＮＡＤＨの添加は、コントロール膜（クローニングベ
クターでトランスフォームされた）及びＴＯＣＢを含む膜の両者で酸素の消費を
誘導する。この酸素の消費は、０．２ｍＭのプラストキノンを加えた場合に増大
する。ＫＣＮの添加は、コントロール膜における酸素の消費を著しく阻害する。
ＴＯＣＢを含む膜においては、高いシアニド抵抗性酸素消費が観察される。これ
はプラストキノン：ＴＯＣＢの酸素オキシドレダクターゼ活性を反映し、その活
性は、０．５ｍＭのｎ−プロピルガレート（ｎＰＧ）を加えることによって阻害
できる。ＫＣＮの前にコントロール膜に対するｎＰＧ（０．５ｍＭ）の添加は効
果を生ぜず、それはこの消費が、大腸菌膜における電極の正常なフローを妨げな
いことを示す（図４）。
クターでトランスフォームされた）及びＴＯＣＢを含む膜の両者で酸素の消費を
誘導する。この酸素の消費は、０．２ｍＭのプラストキノンを加えた場合に増大
する。ＫＣＮの添加は、コントロール膜における酸素の消費を著しく阻害する。
ＴＯＣＢを含む膜においては、高いシアニド抵抗性酸素消費が観察される。これ
はプラストキノン：ＴＯＣＢの酸素オキシドレダクターゼ活性を反映し、その活
性は、０．５ｍＭのｎ−プロピルガレート（ｎＰＧ）を加えることによって阻害
できる。ＫＣＮの前にコントロール膜に対するｎＰＧ（０．５ｍＭ）の添加は効
果を生ぜず、それはこの消費が、大腸菌膜における電極の正常なフローを妨げな
いことを示す（図４）。
【００９４】 この試験は、ＴＯＣＢ活性に対する化合物の阻害力を研究するために使用でき
る。かくして、インヒビターが大腸菌の内因性呼吸鎖に対して、特にＮＡＤＨを
酸化する呼吸鎖の複合体Ｉに対して効果を有さない場合に、インヒビターは制御
され得る。言うまでもなく、もし上記の場合であれば、ＮＡＤＨは複合体Ｉを経
て通過せずに、電子ドナーとしてのコハク酸で置換できる。ＴＯＣＢ活性のいず
れかのインヒビターは、カロテノイド生合成の阻害について、土を洗い流し、培
養培地を加え、直接葉に適用して、その結果ブリーチすることによって、適切な
植物において試験でき、かくして除草剤としての応用を見出すことができる。
る。かくして、インヒビターが大腸菌の内因性呼吸鎖に対して、特にＮＡＤＨを
酸化する呼吸鎖の複合体Ｉに対して効果を有さない場合に、インヒビターは制御
され得る。言うまでもなく、もし上記の場合であれば、ＮＡＤＨは複合体Ｉを経
て通過せずに、電子ドナーとしてのコハク酸で置換できる。ＴＯＣＢ活性のいず
れかのインヒビターは、カロテノイド生合成の阻害について、土を洗い流し、培
養培地を加え、直接葉に適用して、その結果ブリーチすることによって、適切な
植物において試験でき、かくして除草剤としての応用を見出すことができる。
【００９５】 記載された試験は、ＴＯＣＢ活性のインヒビター、及びその除草剤としての応
用の大規模なスクリーニングを実施するために修正できる。この場合、酸素電極
を使用する酸素消費の測定は、好ましくは他の測定方法で置換されるであろう。
用の大規模なスクリーニングを実施するために修正できる。この場合、酸素電極
を使用する酸素消費の測定は、好ましくは他の測定方法で置換されるであろう。
【００９６】 ＴＯＣＢのオキシダーゼ活性は、例えば分光光度計によって３４０ｎｍでの吸
光度を測定することによるといった、反応の間のＮＡＤＨの消費を測定すること
によって測定できる。試験の間のＮＡＤＨの消費及びＮＡＤの生産は、３４０ｎ
ｍでの吸光度の減少を生ずるはずである。別法として、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＨ
のいずれかの特異的な着色が、試験の間のＮＡＤ若しくはＮＡＤＨの変化をモニ
ターするために使用されても良い。
光度を測定することによるといった、反応の間のＮＡＤＨの消費を測定すること
によって測定できる。試験の間のＮＡＤＨの消費及びＮＡＤの生産は、３４０ｎ
ｍでの吸光度の減少を生ずるはずである。別法として、ＮＡＤ若しくはＮＡＤＨ
のいずれかの特異的な着色が、試験の間のＮＡＤ若しくはＮＡＤＨの変化をモニ
ターするために使用されても良い。
【００９７】 試験においてコハク酸が電子ドナーとして使用されるのであれば、細菌膜の呼
吸活性は、コハク酸からフマル酸への酸化を生ずるであろう。この場合、ＴＯＣ
Ｂの活性は、試験の間で変化するコハク酸及びフマル酸の濃度を測定することに
よって、ＫＣＮの存在下でモニターされても良い。
吸活性は、コハク酸からフマル酸への酸化を生ずるであろう。この場合、ＴＯＣ
Ｂの活性は、試験の間で変化するコハク酸及びフマル酸の濃度を測定することに
よって、ＫＣＮの存在下でモニターされても良い。
【００９８】 別の可能性に従って、人工的な電子ドナーが使用されても良い。この例として
、フェナジンメタスルフェート（ＰＭＳ）が挙げられる。それは、細菌膜のコハ
ク酸デヒドロゲナーゼによって酸化され得る；それは還元形態では無色であり、
酸化形態では黄色である。
、フェナジンメタスルフェート（ＰＭＳ）が挙げられる。それは、細菌膜のコハ
ク酸デヒドロゲナーゼによって酸化され得る；それは還元形態では無色であり、
酸化形態では黄色である。
【００９９】 ＴＯＣＢを含む細菌膜のサンプルは、ＫＣＮの存在下でＰＭＳを酸化する。Ｔ
ＯＣＢ活性のインヒビターは、ＰＭＳの酸化による黄色の出現を妨げるであろう
。実施するのが容易なこの試験は、マルチウェルプレートで実施されても良く、
ＴＯＣＢの活性を阻害可能な分子の大規模なスクリーニングを実施することを可
能にする。
ＯＣＢ活性のインヒビターは、ＰＭＳの酸化による黄色の出現を妨げるであろう
。実施するのが容易なこの試験は、マルチウェルプレートで実施されても良く、
ＴＯＣＢの活性を阻害可能な分子の大規模なスクリーニングを実施することを可
能にする。
【配列表】
【図１】 図１は、ＴＯＣＢのｃＤＮＡ配列と対応するアミノ酸配列を示す
。葉緑体のＮ末端の可能性のあるトランジットペプチドに下線が付されている。
切断部と思われる箇所にアステリスク（＊）が付されている。三角は、イントロ
ンの位置を示す。
。葉緑体のＮ末端の可能性のあるトランジットペプチドに下線が付されている。
切断部と思われる箇所にアステリスク（＊）が付されている。三角は、イントロ
ンの位置を示す。
【図２】 図２は、大豆のＴＯＣＢタンパクとＡＯＸタンパクの間の比較を
示す。（＋）は、類似アミノ酸を示す。枠内のアミノ酸は、予想されるトランス
メンブレンヘリックスドメイン部を形成する。鉄結合部の上に線が付されている
。
示す。（＋）は、類似アミノ酸を示す。枠内のアミノ酸は、予想されるトランス
メンブレンヘリックスドメイン部を形成する。鉄結合部の上に線が付されている
。
【図３】 図３は、トマト（Ｔ）、トウガラシ（Ｐ）およびシロイスナズナ
(Arabidopsis)（Ａ）、並びに、コンセンサス配列のアミノ酸配列のアラインメ
ントを示す。この共通配列では、保存されたアミノ酸が大文字で示され、比較的
保存されたアミノ酸が小文字で示されている。
(Arabidopsis)（Ａ）、並びに、コンセンサス配列のアミノ酸配列のアラインメ
ントを示す。この共通配列では、保存されたアミノ酸が大文字で示され、比較的
保存されたアミノ酸が小文字で示されている。
【図４】 図４は、本発明のクローニングベクターでトランスフォームされ
たコントロール細胞と、“IMMUTANS”遺伝子の産物（プラスチド末端オキシダー
ゼ）を発現する細胞に関して、単離されたE.coli細胞膜における酸素消費を示す
。
たコントロール細胞と、“IMMUTANS”遺伝子の産物（プラスチド末端オキシダー
ゼ）を発現する細胞に関して、単離されたE.coli細胞膜における酸素消費を示す
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ ４Ｂ０６５ (72)発明者 マルセル・クンツ フランス・Ｆ−38041・グルノーブル・セ デ・セルモ・ブワート・ポスタル・53Ｘ・ ジェネティーク・モレクレール・デ・プラ ンテ（番地なし）・ユニヴェルシテ・ジョ セフ・フーリエ (72)発明者 レジ・マシェ フランス・Ｆ−38041・グルノーブル・セ デ・セルモ・ブワート・ポスタル・53Ｘ・ ジェネティーク・モレクレール・デ・プラ ンテ（番地なし）・ユニヴェルシテ・ジョ セフ・フーリエ Ｆターム(参考） 2B030 AB04 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD14 4B024 AA05 AA08 BA80 CA01 CA12 DA01 FA01 GA11 GA17 4B050 CC03 DD13 EE10 LL05 4B063 QA05 QQ04 QQ23 QQ95 QR03 QR78 QS28 4B064 AB04 AC12 CA11 CA21 DA11 4B065 AA89X AA89Y AB01 AC14 BA02 CA03 CA05 CA53 CA60
Claims (16)
- 【請求項１】 −配列番号２によって記述されるＴＯＣＢ（カロテノイド生
合成に関与する末端オキシダーゼ）をコードするｍＲＮＡを転写する配列番号１
によって示されるヌクレオチド配列、 −一以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／または欠失および／
または置換により修飾された前記配列番号１の配列の修飾ヌクレオチド配列であ
って、配列番号２によって記述されるＴＯＣＢをコードするｍＲＮＡ、あるいは
、配列番号２によって示されるＴＯＣＢと等価な酵素活性を有する前記ＴＯＣＢ
の修飾タンパクをコードするｍＲＮＡを転写する修飾配列、 からなる少なくとも一つのコード領域を含むＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 −配列番号１にコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズする
ことができるアンチセンスｍＲＮＡを転写する、配列番号１の相補的ヌクレオチ
ド配列、 −一以上のヌクレオチドの変異および／または付加および／または欠失および／
または置換により修飾された前記配列の修飾ヌクレオチド配列であって、前記ｍ
ＲＮＡとハイブリダイズすることができるアンチセンスｍＲＮＡを転写する修飾
配列、 −配列番号１の相補的配列にコードされるｍＲＮＡと対形成することができるア
ンチセンスｍＲＮＡを転写する、上記ヌクレオチド配列の一つのフラグメント、
からなる少なくとも一つのコード領域を含むＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡ配列、特に配列番号１に示される相補
的ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡであって、配列番号２に記載されるＴＯＣ
Ｂ酵素、あるいは植物において当該酵素と等価な活性を備える当該酵素の修飾タ
ンパクまたはフラグメントをコードするｍＲＮＡ。 - 【請求項４】 請求項２に記載の相補的ＤＮＡ配列から転写されるアンチセ
ンスｍＲＮＡであって、本来のｍＲＮＡを構成するヌクレオチドの全体または一
部に相補的であり、かつ、前記ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるヌク
レオチドを含む、アンチセンスｍＲＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号２によって記載される本来のＴＯＣＢ酵素の活性を
備えたタンパク、あるいは、ＴＯＣＢ酵素と等価な酵素活性を有する、特に一以
上のアミノ酸の付加および／または欠失および／または置換によって修飾された
ＴＯＣＢ酵素の修飾タンパク、あるいは、ＴＯＣＢ酵素と等価な酵素活性を有す
るＴＯＣＢ酵素または当該酵素の修飾配列から誘導されたフラグメント。 - 【請求項６】 植物におけるＴＯＣＢ酵素をコードするｍＲＮＡと、請求項
４記載のアンチセンスｍＲＮＡとの間に形成される複合体。 - 【請求項７】 異種配列に挿入され、植物のＴＯＣＢ酵素と等価な酵素活性
を備えるＴＯＣＢ酵素の全てまたは一部をコードするｍＲＮＡ配列の全てまたは
一部を転写する請求項１記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項８】 異種配列に挿入され、植物におけるＴＯＣＢ酵素をコードす
るｍＲＮＡと対形成することができるアンチセンスｍＲＮＡ配列の全てまたは一
部を転写する、請求項２記載のＤＮＡ配列の全てまたは一部を含むことを特徴と
する組み換えＤＮＡ。 - 【請求項９】 プロモーター配列および転写終結配列のような、挿入された
ヌクレオチド配列の発現をコントロールするのに必要な成分を含むことを特徴と
する、請求項７または８記載の組み換えＤＮＡ。 - 【請求項１０】 カロテノイド生合成を増大させるのに適した、植物をトラ
ンスフォームするためのベクターであって、ベクターが植物細胞においてｍＲＮ
Ａを生成できるように、植物の転写の複製起点の後に、配列番号２に示される、
カロテノイド合成に関与する酵素の全てまたは一部をコードする、請求項１記載
のヌクレオチド配列である配列番号１の全てまたは一部を含むベクター。 - 【請求項１１】 カロテノイド生合成を低減または停止させるのに適した、
植物をトランスフォームするためのベクターであって、転写された相補鎖が、カ
ロテノイド合成に関与する植物のＴＯＣＢ酵素をコードするｍＲＮＡと対形成す
ることができるように、植物の転写の複製起点の後に、請求項２に記載の配列番
号１に相補的なヌクレオチド配列の鎖の全てまたは一部を含むベクター。 - 【請求項１２】 請求項１０または１１にかかるベクターでトランスフォー
ムされた植物細胞。 - 【請求項１３】 請求項１２記載の細胞を含む、植物、または果実、種子、
花弁または葉のような植物フラグメント。 - 【請求項１４】 請求項１０または１１記載のベクターを用いた、トランス
フォームされる植物の細胞のトランスフォーメーションを含む、植物により産生
されるカロテノイドの通常含量に対して、植物によるカロテノイド産生を増加す
ること、または、カロテノイド産生を低減または阻害することにより、植物にお
けるカロテノイドの産生を変更する方法。 - 【請求項１５】 請求項１０記載のベクターを用いた、トランスフォームさ
れる植物細胞、真核または原核細胞のトランスフォーメーションを含む、植物細
胞、または真核または原核細胞においてカロテノイドを産生するための方法。 - 【請求項１６】 除草性化合物を選択する方法であって、薬剤を請求項１２
記載の細胞または細胞膜と接触させ、カロテノイド生合成に関与する末端オキシ
ダーゼの阻害に関連する前記細胞の膜による酸素消費の低減を調べる方法。
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|---|---|---|---|
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| FR98/13283 | 1998-10-20 | ||
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|---|---|
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ID=9531891
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