JP2002527056A - Materials and methods for modification of plant cell wall polysaccharides - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物細胞壁多糖類の合成と関連する新規に単離したポリヌクレオチドとポリペプチドが、この様な配列を含んでなる遺伝子構築物と共に提供される。植物中の多糖含有量の調節用のこの様な構築物を用いる方法も、この様な構築物を含んでなる形質転換植物と共に開示される。   (57) [Summary] Newly isolated polynucleotides and polypeptides associated with the synthesis of plant cell wall polysaccharides are provided, along with a genetic construct comprising such a sequence. Methods of using such constructs for regulating polysaccharide content in plants are also disclosed, as well as transformed plants comprising such constructs.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は植物における細胞壁多糖の含有量と組成物の修正（ｍｏｄｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）の分野に関する。特に、本発明は植物細胞壁多糖類の合成に関わる酵
素と、その様な酵素をコード化するヌクレオチド配列に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the modification of cell wall polysaccharide content and composition in plants (modifica).
Tion). In particular, the present invention relates to enzymes involved in the synthesis of plant cell wall polysaccharides, and nucleotide sequences encoding such enzymes.

【０００２】 （発明の背景） 植物細胞は堅い細胞壁を有することを特徴とする。これらの細胞壁は主として
、多糖として知られる様々な直鎖または分枝ポリマーと結合した単糖モノマーの
ポリマーで構成される。最も豊富な単糖モノマーはグルコースであり、最も豊富
なポリマーはセルロースである。セルロースはβ−１，４結合グルコースモノマ
ーからなる直鎖の非分枝ポリマーである。植物細胞壁に見出される他の多糖類に
は、グルコース以外の糖を含み得る側鎖を有するβ−１，４結合グルコースモノ
マーからなる多糖のグループであるヘミセルロースが含まれる。これらの側鎖に
はキシロース、フコース、アラビノース、およびガラクトースが含まれることが
多い。ペクチンも植物細胞壁に見出される他の型の多糖である。ペクチンは酸性
多糖類であり、一般的に主としてガラクツロン酸およびラムノース糖モノマー類
で構成される。アミロースは細胞壁の主成分とは普通は見られない付加的な一般
的な植物多糖である。アミロースは構造ポリマーとしてというよりはむしろ、主
としてグルコースの貯蔵材料として作用する。しかしながら、アミロースは主と
してα−１，４−結合グルコースモノマーで構成されるので、生化学および生理
学的観点からは関連するポリマーであると考えられる。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Plant cells are characterized by having a rigid cell wall. These cell walls are mainly composed of polymers of monosaccharide monomers combined with various linear or branched polymers known as polysaccharides. The most abundant monosaccharide monomer is glucose and the most abundant polymer is cellulose. Cellulose is a linear, unbranched polymer composed of β-1,4 linked glucose monomers. Other polysaccharides found in plant cell walls include hemicellulose, a group of polysaccharides consisting of β-1,4-linked glucose monomers having side chains that can contain sugars other than glucose. These side chains often include xylose, fucose, arabinose, and galactose. Pectin is another type of polysaccharide found in plant cell walls. Pectin is an acidic polysaccharide, generally composed mainly of galacturonic acid and rhamnose sugar monomers. Amylose is an additional common plant polysaccharide that is not normally found in the major components of the cell wall. Amylose acts primarily as a storage material for glucose, rather than as a structural polymer. However, amylose is considered to be a relevant polymer from a biochemical and physiological point of view, since it is mainly composed of α-1,4-linked glucose monomers.

【０００３】 植物多糖類には用途が多い。酢酸セルロース等のある種のプラスチック、およ
びレーヨン等の合成繊維はセルロースから製造される。さらに、いくつかの生分
解性プラスチックおよび消化生医薬カプセルの他、医療用充填剤および食品の繊
維添加剤も植物多糖類から製造される。[0003] Plant polysaccharides have many uses. Certain plastics, such as cellulose acetate, and synthetic fibers, such as rayon, are made from cellulose. In addition, some biodegradable plastics and digestive biopharmaceutical capsules, as well as medical fillers and food fiber additives, are made from plant polysaccharides.

【０００４】 食品において、多糖類は食品の質に重大な影響を及ぼす。細胞壁はにんじんの
しゃきしゃき感に寄与し、一方、モモおよびトマトなどの果実を柔らかくするに
は細胞壁の分解が必要である。トウモロコシではアミロースを増加させることが
家畜の餌として望ましいが、人が消費するには望ましくなく、細胞壁の強度が増
すと消化性が悪くなる。木材等の繊維作物では、セルロースが最も関心のあるポ
リマーである。構造木材の品質の基本的評価基準である木材密度は、本質的にセ
ルロース含有量の尺度である。紙パルプ工業では、セルロースの収率で効率が評
価される。明らかに、木材中のセルロース含有量を増加させる能力が重要な経済
目標である。[0004] In foods, polysaccharides have a significant effect on food quality. The cell wall contributes to the crispness of carrots, while the softening of fruits such as peaches and tomatoes requires degradation of the cell wall. In corn, it is desirable to increase amylose as a feed for livestock, but it is not desirable for human consumption, and as the strength of the cell wall increases, digestibility deteriorates. In fiber crops such as wood, cellulose is the polymer of most interest. Wood density, a fundamental measure of the quality of structural wood, is essentially a measure of the cellulose content. In the pulp and paper industry, efficiency is evaluated by the yield of cellulose. Clearly, the ability to increase the cellulose content in wood is an important economic goal.

【０００５】 植物細胞壁多糖類を作り上げる糖類は植物の光合成器官で生産される。そのよ
うに生産された糖類は通常、グルコースとフルクトースからなる二糖であるスク
ロースに変換される。スクロースは糖モノマーを必要とする植物全体のあらゆる
場所に輸送される。従って、光合成器官はしばしばソースと呼ばれ、大量の糖モ
ノマーを必要とする組織はシンクと呼ばれる。植物の活発に生長している領域は
、新しい細胞壁合成が大量の糖モノマーを必要とするので一般にシンク組織であ
る。[0005] The sugars that make up plant cell wall polysaccharides are produced in the photosynthetic organs of plants. The saccharides so produced are usually converted to sucrose, a disaccharide consisting of glucose and fructose. Sucrose is transported throughout the plant where sugar monomers are needed. Thus, photosynthetic organs are often called sources, and tissues that require large amounts of sugar monomers are called sinks. The actively growing area of the plant is generally a sink tissue because new cell wall synthesis requires large amounts of sugar monomers.

【０００６】 輸送されたスクロースが目的地であるシンクに到着すると、要求されるどんな
種類の糖モノマーにでも変換されなければならない。植物細胞壁を作る糖モノマ
ーは主として５−または６−炭素糖である。異なった糖は一般にヒドロキシル基
の立体特異性配向で区別される。植物はイソメラーゼまたはエピメラーゼ等の様
々な酵素を含み、これらのヒドロキシル基の配向を速やかに変えることができる
。さらに、１個の炭素を糖モノマーに付加えたり、取り去ることのできる酵素が
多くある。その結果、植物が細胞壁合成のために必要などのような種類にも自由
に相互に変換（ｉｎｔｅｒ−ｃｏｎｖｅｒｔ）できる糖モノマー類の単一プール
ができあがる。[0006] When the transported sucrose reaches the destination sink, it must be converted to any type of sugar monomer required. The sugar monomers that make up the plant cell wall are mainly 5- or 6-carbon sugars. Different sugars are generally distinguished by the stereospecific orientation of the hydroxyl group. Plants contain various enzymes, such as isomerase or epimerase, which can rapidly change the orientation of these hydroxyl groups. In addition, there are many enzymes that can add or remove one carbon to a sugar monomer. The result is a single pool of sugar monomers that can be freely inter-converted by the plant as needed for cell wall synthesis.

【０００７】 植物多糖類はこの様にして生化学的にも生理学的にも相互に関係している。全
てのポリマーが同じ糖モノマーのプールで競合し、全ての糖モノマーは他のタイ
プに自由に相互変換できる。任意のあるポリマーの分解は任意の他のもののため
の構築材料を提供する。従って、あるポリマーの変化を操作する試みは他のポリ
マーに多面的な効果を有する。[0007] Plant polysaccharides are thus biochemically and physiologically interrelated. All polymers compete for the same pool of sugar monomers, and all sugar monomers are free to interconvert to other types. Degradation of any one polymer provides a building material for any other. Thus, attempts to manipulate changes in one polymer have pleiotropic effects on other polymers.

【０００８】 細胞壁合成速度は、糖モノマーが壁のポリマーに対する構築ブロックとして利
用できる程度と、これらの構築ブロックをポリマーに重合する酵素の両者に依存
する。セルロース、ヘミセルロースおよびペクチン等の主要な細胞壁ポリマーの
合成に直接関わる酵素は、細胞壁合成速度に深く影響し得る。基質が利用できる
程度が制限される場合、ソース−シンクの関係が細胞壁合成を制限することに重
要な役割を果たすと考えられる。ポリマー分解酵素は、新しい所望のポリマーの
構築の使用のために不必要なポリマーから糖モノマーを遊離させることができる
。糖類を１つの形態から他の形態へ異性化させる酵素は、糖をどのような種類に
でも必要なものに変換することができる。細胞壁多糖の異なった型のそれぞれは
同じ糖モノマープールで効率よく競合し、それぞれが任意の他のポリマーのモノ
マーの潜在的なソースを示す。[0008] The rate of cell wall synthesis depends both on the extent to which sugar monomers are available as building blocks for the polymer of the wall and on the enzymes that polymerize these building blocks into polymers. Enzymes directly involved in the synthesis of key cell wall polymers such as cellulose, hemicellulose and pectin can have a profound effect on the rate of cell wall synthesis. Where the extent of substrate availability is limited, source-sink relationships may play an important role in limiting cell wall synthesis. Polymerases can release sugar monomers from unwanted polymers for use in building new desired polymers. Enzymes that areomerize sugars from one form to another can convert sugars to whatever type is needed. Each of the different types of cell wall polysaccharides compete effectively for the same sugar monomer pool, each representing a potential source of monomer for any other polymer.

【０００９】 セルロース生合成に最終的にかかわる工程には、比較的少数の酵素が含まれる
。セルロースシンターゼ（ＣＥＬ）は、スクロースシンターゼ（ＳＵＳ：アーマ
ー（Ａｍｏｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９
３５３−９３５７（１９９５））およびアネキシン（ＡＮＸ：クラーク（Ｃｌａ
ｒｋ）およびルー（Ｒｏｕｘ）、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１０９：１１３３−１
１３９、１９９５）をも含む巨大な膜結合複合体の一部として機能すると考えら
れている。この酵素複合体は活性化グルコースをセルロースポリマーに重合する
。グルコースはＵＴＰ−グルコース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラ
ーゼとしても知られるＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＵＧＰ）により
活性化される。これらの酵素はグルコースからセルロースの生合成に十分である
と考えられている。これらの工程以外では、グルコースの利用できる程度がセル
ロース生合成で最も重要な速度制限工程である様に思われる。[0009] The final steps involved in cellulose biosynthesis involve a relatively small number of enzymes. Cellulose synthase (CEL) is a sucrose synthase (SUS: Amor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9).
353-9357 (1995)) and annexin (ANX: Clark (Cla)
rk) and Roux, Plant Phys. 109: 1133-1
139, 1995) are thought to function as part of a large membrane-bound complex. This enzyme complex polymerizes the activated glucose into a cellulose polymer. Glucose is activated by UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP), also known as UTP-glucose-1-phosphate uridyl transferase. These enzymes are believed to be sufficient for the biosynthesis of cellulose from glucose. Beyond these steps, the availability of glucose appears to be the most important rate limiting step in cellulose biosynthesis.

【００１０】 グルコースは殆どの植物で主としてアミロースとして貯蔵される。植物は日常
的にアミロースを貯蔵し、必要に応じアミロースを分解してグルコースモノマー
を遊離する。グルコース貯蔵の効率を阻害すると、またはアミロースからグルコ
ースの遊離を増加させると、セルロース生合成のためのグルコースモノマーの利
用度を増加させることができる。グルコースのアミロースとしての貯蔵の速度制
限酵素は、ＡＴＰ−グルコース−１−ホスフェートアデニルトランスフェラーゼ
としても知られているＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）である
（イグレシアス（Ｉｇｌｅｓｉａｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１
１０８１−１０８６、１９９３）。逆に、アミロースからのグルコースを遊離に
最も関連する酵素はアミラーゼ（ＡＭＡ：カワゴエ（Ｋａｗａｇｏｅ）およびデ
ルマー（Ｄｅｌｍｅｒ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９：６
３−８７、１９９７）である。[0010] Glucose is stored in most plants primarily as amylose. Plants routinely store amylose and degrade amylose to release glucose monomers as needed. Inhibiting the efficiency of glucose storage or increasing the release of glucose from amylose can increase the availability of glucose monomers for cellulose biosynthesis. The rate limiting enzyme for storage of glucose as amylose is ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP), also known as ATP-glucose-1-phosphate adenyltransferase (Iglesias et al . , J. Biol. Chem. 268: 1
1081-1086, 1993). Conversely, the enzymes most involved in releasing glucose from amylose are amylase (AMA: Kawagoe and Delmer), Genetic Engineering 19: 6.
3-87, 1997).

【００１１】 これらの酵素は経済的に有用なセルロースの生合成の変化のエンジニアリング
に重要であることは明らかである。さらに、植物細胞壁多糖生合成に影響を与え
る点で有用な他の酵素も多い。セルロース生合成に関与する可能性のある他の酵
素には１，４−β−セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、カルネキシ
ン、セロビオースエピメラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、セルラーゼＡ、
デキストランスクラーゼ、インベルターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホグル
コムターゼ、スクロースホスフェートシンターゼ、スクロースホスホリラーゼ、
ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼおよびＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナー
ゼが含まれる。ヘミセルロース生合成に関与すると考えられている酵素にはβ−
グルカナーゼ、アラビナンシンターゼ、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、
ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、１，３−および１，４−β−グルカナ
ーゼ、１，３−および１，４−β−グルコシダーゼ、マンノース−６−ホスフェ
ートイソメラーゼ、ｎＤＰ−ヘキソースピロホスホリラーゼ、キシログルカンエ
ンドトランスグリコシダーゼおよびキシログルカンシンターゼが含まれる。ペク
チン生合成に関与すると思われる酵素にはα−ガラクトシダーゼ、β−グルクロ
ニダーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、グルクロノシルトランスフェラーゼ、
ペクチンメチル−エステラーゼ、ポリガラクツロナーゼおよびＵＤＰ−ヘキソー
ス−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼが含まれる。アミロース生合
成に関与すると考えられる酵素にはα−グルコシダーゼ、アミロペクチン６−グ
ルカノハイドロラーゼ、アミロペクチン分枝グリコシルトランスフェラーゼ、β
−アミラーゼ、分枝酵素、イヌロスクラーゼ、イソアミラーゼ、イソマルターゼ
、レバンスクラーゼ、スターチホスホリラーゼおよびスターチシンターゼが含ま
れる。５−炭糖類の相互変換に関与すると思われる酵素には２−デヒドロ−３−
デオキシ−グルコキナーゼ、アルデヒドリダクターゼ、アラビノースイソメラー
ゼ、Ｄ−アラビニトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ−キシルロースリダクターゼ、エ
ンド−１，４−β−キシラナーゼ、エキソ−１，４−βキシラナーゼ、Ｌ−アラ
ビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−キシロキナーゼ、ホスホ−リ
ブロキナーゼ、リボース５−ホスフェートイソメラーゼ、リブロース−３−エピ
メラーゼ、リブロース−ホスフェート−４−エピメラーゼ、トランスアルドラー
ゼ、トランスケトラーゼ、キシロースイソメラーゼおよびキルロキナーゼが含ま
れる。６−炭糖類の相互変換に関与すると思われる酵素には６−ホスホ−フラク
ト−１−キナーゼ、６−ホスホ−フラクト−２−キナーゼ、トレハロースホスフ
ェートシンターゼ、アルドラーゼ、アルドース１−エピメラーゼ、Ｄ−フラクト
キナーゼ、Ｄ−ガラクトキナーゼ、フラクトース１，６−ジホスファターゼ、グ
ルコノラクトナーゼ、グルコース１−ホスファターゼ、グルコース６−ホスファ
ターゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコース−ホスフェ
ートイソメラーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、トレハレース、ト
レハロースホスファターゼおよびＵＤＰ−ガラクトースデヒドロゲナーゼが含ま
れる。[0011] It is clear that these enzymes are important in engineering changes in the biosynthesis of economically useful cellulose. In addition, many other enzymes are useful in affecting plant cell wall polysaccharide biosynthesis. Other enzymes that may be involved in cellulose biosynthesis include 1,4-β-cellobiohydrolase, β-glucosidase, calnexin, cellobiose epimerase, cellobiose phosphorylase, cellulase A,
Dextransucrase, invertase, phosphodiesterase, phosphoglucomutase, sucrose phosphate synthase, sucrose phosphorylase,
UDP-glucose 4-epimerase and UDP-glucose dehydrogenase are included. Enzymes thought to be involved in hemicellulose biosynthesis include β-
Glucanase, arabinan synthase, GDP-fucose pyrophosphorylase,
GDP-mannose pyrophosphorylase, 1,3- and 1,4-β-glucanase, 1,3- and 1,4-β-glucosidase, mannose-6-phosphate isomerase, nDP-hexose pyrophosphorylase, xyloglucan endotransglycosidase And xyloglucan synthase. Enzymes thought to be involved in pectin biosynthesis include α-galactosidase, β-glucuronidase, exopolygalacturonase, glucuronosyltransferase,
Pectin methyl-esterase, polygalacturonase and UDP-hexose-1-phosphate uridyl transferase are included. Enzymes considered to be involved in amylose biosynthesis include α-glucosidase, amylopectin 6-glucanohydrolase, amylopectin branched glycosyltransferase, β
-Amylases, branching enzymes, inulosucrase, isoamylase, isomaltase, levansucrase, starch phosphorylase and starch synthase. Enzymes believed to be involved in the interconversion of 5-carbohydrates include 2-dehydro-3-
Deoxy-glucokinase, aldehyde reductase, arabinose isomerase, D-arabinitol dehydrogenase, D-xylulose reductase, endo-1,4-β-xylanase, exo-1,4-β xylanase, L-arabinose isomerase, L- Librokinase, L-xylokinase, phospho-librokinase, ribose 5-phosphate isomerase, ribulose-3-epimerase, ribulose-phosphate-4-epimerase, transaldolase, transketolase, xylose isomerase and quillokinase. Enzymes believed to be involved in the interconversion of 6-carbohydrates include 6-phospho-fructo-1-kinase, 6-phospho-fructo-2-kinase, trehalose phosphate synthase, aldolase, aldose 1-epimerase, D-fructokinase , D-galactokinase, fructose 1,6-diphosphatase, gluconolactonase, glucose 1-phosphatase, glucose 6-phosphatase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, glucose-phosphate isomerase, hexokinase, phosphoglucomutase, trehalase, trehalose Phosphatase and UDP-galactose dehydrogenase are included.

【００１２】 植物細胞壁多糖類の生合成経路に関与する酵素のいくつかをコード化するＤＮ
Ａ配列がある種の植物から単離されているが、広い範囲の植物種中の多くの酵素
をコード化する遺伝子はまだ同定されていない。従って、植物中における細胞壁
多糖の含有量と組成の修正に有用な材料に対する技術が依然として必要とされて
いる。[0012] DN encoding some of the enzymes involved in the biosynthetic pathway of plant cell wall polysaccharides
Although the A sequence has been isolated from certain plants, genes encoding many enzymes in a wide range of plant species have not yet been identified. Thus, there remains a need for techniques for materials useful for modifying the content and composition of cell wall polysaccharides in plants.

【００１３】 （発明の概要） 簡単に言えば、本発明はユーカリおよびマツから単離された、細胞壁多糖の合
成に関わる酵素をコード化するポリヌクレオチドを提供する。この様な配列を含
む遺伝構築物と、この様な構築物を使用するための方法も、細胞壁多糖含有量と
組成が変更された形質転換植物と共に提供される。SUMMARY OF THE INVENTION Briefly, the present invention provides a polynucleotide encoding an enzyme involved in the synthesis of cell wall polysaccharides isolated from eucalyptus and pine. Genetic constructs containing such sequences and methods for using such constructs are also provided with transformed plants having altered cell wall polysaccharide content and composition.

【００１４】 一つの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは（ａ）配列番号：１−２
９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−
１４３および１４９−９０８で表される配列；（ｂ）配列番号：１−２９、５７
−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３お
よび１４９−９０８で表される配列の相補体；（ｃ）配列番号：１−２９、５７
−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３お
よび１４９−９０８で表される配列の反転相補体；（ｄ）配列番号：１−２９、
５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４
３および１４９−９０８で表される配列の反転配列；および（ｅ）上記（ａ）−
（ｄ）の配列に対して４０％、６０％、７５％または９０％のいずれかの同一性
を有するヌクレオチドの配列からなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含んで
なる。[0014] In one embodiment, the isolated polynucleotide comprises (a) SEQ ID NO: 1-2.
9, 57-80, 105, 107, 109-113, 119-129, 139-
143 and 149-908; (b) SEQ ID NOs: 1-29, 57
-80, 105, 107, 109-113, 119-129, 139-143 and the complement of the sequence represented by 149-908; (c) SEQ ID NOs: 1-29, 57
Inverted complements of the sequences represented by -80, 105, 107, 109-113, 119-129, 139-143 and 149-908; (d) SEQ ID NOs: 1-29;
57-80, 105, 107, 109-113, 119-129, 139-14
3 and 149-908; and (e) the above (a)-
(D) a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences having any of 40%, 60%, 75% or 90% identity to the sequence.

【００１５】 別な態様では、本発明のポリヌクレオチドでコード化される単離されたポリペ
プチドが提供される。一つの実施態様では、この様なポリペプチドは配列番号：
３０−５６、８１−１０４、１０６、１０８、１１４−１１８、１２９−１３８
および１４４−１４８からなる群より選ばれたアミノ酸配列、およびその変異体
を含む。[0015] In another aspect, there is provided an isolated polypeptide encoded by a polynucleotide of the invention. In one embodiment, such a polypeptide is SEQ ID NO:
30-56, 81-104, 106, 108, 114-118, 129-138
And amino acid sequences selected from the group consisting of 144-148, and variants thereof.

【００１６】 他の態様では、本発明は本発明のポリヌクレオチドを単独で、または１個以上
の本発明のポリヌクレオチド配列の組み合せ、または１個以上の既知のポリヌク
レオチドの組み合せのいずれかを含んでなる遺伝子構築物を、この様な構築物を
含んでなる形質転換細胞と共に提供する。In another aspect, the invention includes a polynucleotide of the invention, either alone or in combination with one or more polynucleotide sequences of the invention, or in combination with one or more known polynucleotides. Is provided together with a transformed cell comprising such a construct.

【００１７】 関連する態様では、本発明は５’−３’方向に遺伝子プロモーター配列、本発
明のポリヌクレオチドまたはその変異体によってコード化される酵素の機能性部
分を少なくともコードしている読み取り枠、および遺伝子終結配列を含んでなる
遺伝子構築物を提供する。読み取り枠はセンスまたはアンチセンス方向のいずれ
の方向を向いていても良い。上記ポリヌクレオチドまたは非コード領域に相補性
であるヌクレオチド配列によりコード化される酵素をコードする遺伝子の非コー
ド領域を含んでなる遺伝子構築物も、遺伝子プロモーター配列および遺伝子終結
配列と共に提供される。遺伝子プロモーターおよび終結配列はホスト植物中で機
能性であることが好ましい。遺伝子プロモーターおよび終結配列が本来の酵素遺
伝子の配列であることが最も好ましいが、コザク（Ｋｏｚａｋ）配列やオメガ（
Ｏｍｅｇａ）エンハンサー等のエンハンサー、およびアグロバクテリウム ツメ
ファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリ
ンシンターゼ終結配列を有する、または有さないカリフラワーモザイクウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター等の当該技術分野で一般的に用いられているその他の配
列も本発明で有用である。１個以上の所望の組織の発現を目的として、組織特異
性プロモーターを使用してもよい。好ましい実施態様では、遺伝子プロモーター
配列は木部で転写される。遺伝子構築物はさらに、形質転換細胞の同定用のマー
カーを含んでよい。In a related aspect, the invention provides a reading frame encoding at least a functional portion of an enzyme encoded by a gene promoter sequence, a polynucleotide of the invention or a variant thereof in the 5′-3 ′ direction, And a gene construct comprising a gene termination sequence. The reading frame may be oriented in either the sense or antisense direction. Gene constructs comprising a non-coding region of a gene encoding an enzyme encoded by the polynucleotide or a nucleotide sequence complementary to the non-coding region are also provided, along with a gene promoter sequence and a gene termination sequence. Preferably, the gene promoter and termination sequence are functional in the host plant. Most preferably, the gene promoter and termination sequence are those of the original enzyme gene, but Kozak and Omega (
Omega) enhancers such as enhancers, and Agrobacterium claw
Fashiensu (Agrobacterium tumefaciens) nopaline synthase terminator having the sequence, or other sequence which is generally used in the art, such as cauliflower mosaic (CMV) promoter without also useful in the present invention. A tissue-specific promoter may be used for the expression of one or more desired tissues. In a preferred embodiment, the gene promoter sequence is transcribed in xylem. The genetic construct may further include a marker for identification of the transformed cell.

【００１８】 別な態様では、本発明の遺伝子構築物を含んでなる形質転換植物細胞が、この
様な形質転換細胞を含んでなる植物、および果実、種子および他の生産物、誘導
体またはこの様な森林植物の子孫と共に提供される。本発明のポリヌクレオチド
で形質転換された形質転換植物の栄養体も本発明に含まれる。本明細書で用いる
「栄養体」と言う用語は、切断を含む有性または無性の再生または繁殖で用いら
れる植物の任意の部分を意味する。In another embodiment, the transformed plant cells comprising the genetic constructs of the present invention comprise plants comprising such transformed cells, and fruits, seeds and other products, derivatives or such Provided with progeny of forest plants. A vegetation of a transformed plant transformed with the polynucleotide of the present invention is also included in the present invention. As used herein, the term "vegetative body" refers to any part of a plant used in sexual or asexual regeneration or propagation, including cutting.

【００１９】 植物品種、特に植物育成権（Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｅｒｓ’Ｒｉｇｈｔ）に
よる登録可能な植物品種は本発明から除外し得る。ある植物が「植物種」と見な
される必要がないのは、単にそのゲノム内に植物細胞又はその祖先に導入された
形質導入遺伝子を安定して含むためである。[0019] Plant varieties, in particular those plant types that can be registered under Plant Breeders' Right, can be excluded from the invention. A plant need not be considered a “plant species” simply because its genome stably contains the transgene introduced into the plant cell or its ancestor.

【００２０】 また別な態様では、植物等のある生物の多糖含有量と組成を調節する方法が提
供され、この様な方法には植物のゲノム中に本発明の遺伝子構築物を安定して組
み込む方法が含まれる。好ましい実施態様では、標的植物は好ましくはユーカリ
、マツ、アカシア、ポプラ、スイートガム、チークおよびマホガニ種からなる群
から選ばれ、より好ましくはマツおよびユーカリ種からなる群から選ばれ、最も
好ましくはユーカリプトス グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄ
ｉｓ）およびパイノス ラディエータ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）からなる
群から選ばれた木材植物である。関連する態様では、セルロース含有量が変化し
た植物を生産する方法が提供され、その方法は植物細胞を本発明の遺伝子構築物
で形質転換して形質転換細胞を提供し、その形質転換細胞を再生および成熟植物
の生育と関連する条件で培養することを含む。In another aspect, there is provided a method of regulating the polysaccharide content and composition of an organism, such as a plant, comprising stably incorporating the genetic construct of the present invention into the genome of the plant. Is included. In a preferred embodiment, the target plant is preferably selected from the group consisting of eucalyptus, pine, acacia, poplar, sweet gum, teak and mahogany species, more preferably from the group consisting of pine and eucalyptus species, most preferably eucalypt. Su Grandis ( Eucyaptus grand)
is ) and a pinus radiator ( Pinus radiata ). In a related aspect, there is provided a method of producing a plant having an altered cellulose content, the method comprising transforming a plant cell with a genetic construct of the invention to provide a transformed cell, regenerating the transformed cell and Including culturing under conditions related to the growth of mature plants.

【００２１】 更に別な態様では、本発明は植物のゲノム中に本発明の遺伝子構築物を安定し
て組み込むことを含んでなる植物中におけるポリペプチドの活性を修正する方法
を提供する。好ましい実施態様では、標的植物は好ましくはユーカリ、マツ、ア
カシア、ポプラ、スイートガム、チークおよびマホガニ種からなる群から選ばれ
、より好ましくはマツおよびユーカリ種からなる群から選ばれ、最も好ましくは ユーカリプトス グランディス およびパイノス ラディエータからなる群から選
ばれた木材植物である。In yet another aspect, the invention provides a method for stabilizing a genetic construct of the invention in a plant genome.
For modifying the activity of a polypeptide in a plant comprising incorporating
I will provide a. In a preferred embodiment, the target plants are preferably eucalyptus, pine,
Selected from the group consisting of Cassia, Poplar, Sweet Gum, Teak and Mahogani species
, More preferably selected from the group consisting of pine and eucalyptus species, most preferably Eucalyptus grandis andPinos radiatorSelected from the group consisting of
It is a stripped wood plant.

【００２２】 本発明の上記およびその他の特徴、並びにそれらを得る方法が明らかになり、
本発明は以下のより詳細な説明を参照して最も良く理解されると思われる。本明
細書に開示された全ての参考文献は、あたかもそれぞれが個別に取り入れられた
かの様に、その全体が参照して本明細書に取り入れられる。The above and other features of the present invention, as well as methods for obtaining them, are apparent,
The present invention will be best understood with reference to the following more detailed description. All references disclosed herein are incorporated herein by reference in their entirety, as if each were individually incorporated.

【００２３】 （詳細な説明） 上記に概説した様に、セルロースはグルコースの重合により、β−１，４結合
グルコースモノマーを含む直鎖の分枝のないポリマーになる（カワゴエ（Ｋａｗ
ａｇｏｅ）およびデルマー（Ｄｅｌｍｅｒ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ、１９：６３−８７、１９９７）。セルロースは構造上、および産業上
の双方の観点のから最も重要な細胞壁多糖である。他の多糖類も健全な細胞壁の
他、多くの他の工業的用途で必須のものである。DETAILED DESCRIPTION As outlined above, cellulose becomes a linear, unbranched polymer containing β-1,4-linked glucose monomers by polymerization of glucose (Kawagoe (Kaw).
agoe) and Delmer, Genetic Engineer
ring , 19: 63-87, 1997). Cellulose is the most important cell wall polysaccharide from both a structural and industrial point of view. Other polysaccharides are essential in many other industrial uses as well as in healthy cell walls.

【００２４】 通常はグルコースモノマーはいくつかの酵素の作用によりアミロースの形で植
物中に貯えられ、ＡＧＰで触媒される貯蔵の速度制限段階を用いる（イグレシア
ス（Ｉｇｌｅｓｉａｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０８１−１０
８６）。グルコースモノマーはこの貯蔵ポリマーから酵素ＡＭＡの作用で遊離す
る。遊離モノマーは酵素ＵＧＰの作用で活性化され、セルロースシンターゼ酵素
複合体の作用でセルロースマクロ結晶構造に重合する。純粋なＣＥＬ酵素はイン
ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でβ−１，４−グルコース結合を形成することが知
られているが、植物細胞壁の構造の基礎である巨大ポリマーの重合に十分である
ことは示されていない。この後者の作用にはホロ酵素複合体が必要である様に思
われる。ホロ酵素はＳＵＳ酵素とＡＮＸと組み合わされたＣＥＬ酵素を含むと信
じられており、複合体全体が細胞膜に組み込まれ、植物細胞膜の電子顕微鏡で見
ると「ロゼット」構造を形成している（アリオリ（Ａｒｉｏｌｉ）ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２７９：７１７−７２０、１９９８）。Normally, glucose monomers are stored in plants in the form of amylose by the action of several enzymes and use a rate-limiting step of AGP-catalyzed storage (Iglesias et al . , J. Biol. Chem. 268: 1081-10
86). Glucose monomers are released from this storage polymer by the action of the enzyme AMA. The free monomer is activated by the action of the enzyme UGP and polymerizes into a cellulose macrocrystalline structure by the action of the cellulose synthase enzyme complex. Pure CEL enzyme is in
Although it is known to form a beta-1,4-glucose bonds in vitro (in vitro), it has not been shown to be sufficient for the polymerization of large polymers is the basis of the structure of plant cell walls. This latter action appears to require the holoenzyme complex. The holoenzyme is believed to include the CEL enzyme combined with the SUS enzyme and ANX, and the entire complex is incorporated into the cell membrane, forming a "rosette" structure when viewed under electron microscopy of the plant cell membrane (Arioli ( Arioli) et al., Scie
nce 279: 717-720,1998).

【００２５】 セルロース合成は細胞中の糖モノマーに対する非常に大きなシンクを示すので
、セルロース合成速度の変化は他の植物多糖類の合成に重大な影響を持ち得る。
逆に、他の植物多糖類合成速度の変化は、セルロース合成に使用し得る糖プール
に重大な影響を及ぼしうる。従って、任意の単一ポリマーの合成の変化は、植物
細胞壁多糖、および一般の多糖類の含有量と組成の双方に影響し得る。Since cellulose synthesis represents a very large sink for sugar monomers in cells, changes in the rate of cellulose synthesis can have a significant effect on the synthesis of other plant polysaccharides.
Conversely, changes in the rate of synthesis of other plant polysaccharides can have a significant effect on the sugar pool that can be used for cellulose synthesis. Thus, changes in the synthesis of any single polymer can affect both plant cell wall polysaccharides, and the content and composition of common polysaccharides.

【００２６】 植物多糖含有量の定量、定性的な変化は光刺激、低カルシウムレベルおよび機
械的ストレス等の外部因子により誘導されることが知られている。細胞壁多糖の
合成は病原体の感染によっても誘導される。It is known that the quantification and qualitative change of the plant polysaccharide content is induced by external factors such as light stimulation, low calcium level and mechanical stress. Cell wall polysaccharide synthesis is also induced by pathogen infection.

【００２７】 本発明の方法と材料を用いて、細胞壁多糖合成に関与する酵素群をコード化す
る遺伝子のコピーを付加的に標的植物のゲノム中に組み込むことにより、植物の
多糖含有量を増加することも減少することもできる。同様に、多糖含有量の増加
または減少は、標的植物をこの様な遺伝子のアンチセンスコピーで形質転換する
ことによっても得られる。さらに、細胞壁多糖の生合成経路中の異なった酵素を
コード化する遺伝子コピーの数を操作して、合成された各多糖の相対量を変化さ
せ、その結果組成の変わった細胞壁の形成を導くこともできる。多糖組成の変化
は例えば、製紙用木材加工に有利である。Using the methods and materials of the present invention, the polysaccharide content of the plant is increased by additionally incorporating into the genome of the target plant a copy of the gene encoding a group of enzymes involved in cell wall polysaccharide synthesis. Can also be reduced. Similarly, an increase or decrease in polysaccharide content can be obtained by transforming a target plant with an antisense copy of such a gene. In addition, manipulating the number of gene copies encoding different enzymes in the biosynthetic pathway of cell wall polysaccharides to alter the relative amount of each synthesized polysaccharide, thereby leading to the formation of an altered cell wall composition Can also. Changes in the polysaccharide composition are advantageous, for example, in wood processing for papermaking.

【００２８】 本発明のポリヌクレオチドが森林植物資源、すなわちユーカリプトス グラン
ディスおよびパイノス ラディエータから単離されたが、それらは従来の合成技
術を用いて別途合成し得る。特に、本発明の単離ポリヌクレオチドには、その用
語が本明細書に記載される配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、
１０９−１１３、１３９−１４３および１４９−９０８で同定される配列からな
る群から選ばれた配列；配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１
０９−１１３、１３９−１４３および１４９−９０８で同定される配列の相補配
列；配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１
９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で同定される配列の逆相補配
列；任意の上記ポリヌクレオチドの少なくとも特定された数の連続残基（ｘ−ｍ
ｅｒｓ）；任意の上記ポリヌクレオチドに対応する拡張配列；任意の上記ポリヌ
クレオチドに対応するアンチセンス配列；および任意の上記ポリヌクレオチドの
変異体を含んでなるポリヌクレオチドを含む。The polynucleotide of the present invention is a forest plant resource, that is, Eucalyptus grand
Although isolated from the Diss and Pinos radiators , they can be synthesized separately using conventional synthetic techniques. In particular, the isolated polynucleotides of the present invention include SEQ ID NOS: 1-29, 57-80, 105, 107, whose terms are described herein.
Sequences selected from the group consisting of the sequences identified by 109-113, 139-143 and 149-908; SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 1
Complementary sequences of the sequences identified as 09-113, 139-143 and 149-908; SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 11
A reverse complement of the sequences identified at 9-129, 139-143 and 149-908; at least the specified number of contiguous residues ( x- m
ers); an extension sequence corresponding to any of the above polynucleotides; an antisense sequence corresponding to any of the above polynucleotides; and a polynucleotide comprising a variant of any of the above polynucleotides.

【００２９】 他の実施態様では、本発明は配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０
７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８の
ＤＮＡ配列でコード化された単離ポリペプチドを提供する。配列番号：１−２２
、２４−２８、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３および１１９−１
４３でコード化された予想されるアミノ酸配列は、本願の出願時で入手可能であ
った最良の情報に基づき、配列番号：３０―５６、８１―１０４、１０６、１０
８、１１４―１１８、１２９−１３８および１４４−１４８それぞれに提供され
る。本発明はまた、開示された配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重のため、
本発明のポリペプチドによりコード化された物と同じであるポリペプチドをコー
ド化するポリヌクレオチドを含む。この様なポリヌクレオチドは本明細書に開示
されたポリヌクレオチドと「縮重的に同等」であると言われる。In other embodiments, the present invention provides SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 10
7, 109-113, 119-129, 139-143 and 149-908. SEQ ID NOs: 1-22
, 24-28, 57-80, 105, 107, 109-113 and 119-1
The predicted amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 43 was based on the best information available at the time of filing this application, based on SEQ ID NOs: 30-56, 81-104, 106,
8, 114-118, 129-138 and 144-148, respectively. The invention also differs from the disclosed sequences, but due to the degeneracy of the genetic code,
Includes polynucleotides that encode a polypeptide that is the same as the one encoded by the polypeptide of the present invention. Such polynucleotides are said to be "degenerately equivalent" to the polynucleotides disclosed herein.

【００３０】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはＤＮＡおよびポリペプチドの
類似性検索により推定同定された。付録の配列リストで、配列番号：１−２９、
５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４
３および１４９−９０８はポリヌクレオチド配列であり、配列番号：３０―５６
、８１−１０４、１０６、１０８、１１４−１１８、１２９−１３８および１４
４−１４８はポリペプチド配列である。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドは、細胞壁多糖合成に関与することが知られている酵素群に対し類似性を
示した。本発明のポリヌクレオチドの推定同一性が以下の表１に示される。The polynucleotides and polypeptides of the present invention were putatively identified by DNA and polypeptide similarity searches. In the sequence listing in the Appendix, SEQ ID NOs: 1-29,
57-80, 105, 107, 109-113, 119-129, 139-14
3 and 149-908 are polynucleotide sequences, SEQ ID NOs: 30-56
, 81-104, 106, 108, 114-118, 129-138 and 14
4-148 is the polypeptide sequence. The polynucleotides and polypeptides of the present invention have shown similarities to a group of enzymes known to be involved in cell wall polysaccharide synthesis. The putative identities of the polynucleotides of the present invention are shown in Table 1 below.

【００３１】[0031]

【表１】 [Table 1]

【００３２】[0032]

【表２】 [Table 2]

【００３３】[0033]

【表３】 [Table 3]

【００３４】[0034]

【表４】 [Table 4]

【００３５】 本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」と言う用語はデオキシリボヌクレ
オチドまたはリボヌクレオチド塩基の単一または二重鎖ポリマーを意味し、ＤＮ
ＡおよびＨｎＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子を含む対応するＲＮＡ分子、センスおよ
びアンチセンス鎖の両方を含み、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組み替えＤＮＡ
の他、完全または部分合成ポリヌクレオチドを含む。ＨｎＲＮＡ分子はイントロ
ンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１：１で対応する。ｍＲＮＡ分子はイントロン
が切り出されているＨｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチド
は遺伝子全体、またはその任意の部分から構成されていてもよい。作動性アンチ
センスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドを含んでいてもよく、従っ
て「ポリヌクレオチド」の定義にはこの様な作動性アンチセンス断片が含まれる
。The term “polynucleotide” as used herein refers to a single or double stranded polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotide bases, and
A and corresponding RNA molecules, including HnRNA and mRNA molecules, including both sense and antisense strands, cDNA, genomic DNA and recombinant DNA
And fully or partially synthetic polynucleotides. HnRNA molecules contain introns and generally correspond 1: 1 with DNA molecules. mRNA molecules correspond to HnRNA and DNA molecules from which introns have been excised. The polynucleotide may be composed of the entire gene or any part thereof. An operative antisense polynucleotide may include the corresponding polynucleotide, and thus the definition of "polynucleotide" includes such operative antisense fragments.

【００３６】 本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、完全長タンパク質を含
む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、アミノ酸残基は共有ペプチド結合で結合して
いる。本発明のポリペプチドは天然の精製生産物であるか、または組み替え技術
を用いて部分的または完全に生産される。The term “polypeptide” as used herein includes amino acid chains of any length, including full length proteins, wherein the amino acid residues are linked by covalent peptide bonds. The polypeptides of the present invention may be natural purified products or may be partially or completely produced using recombinant techniques.

【００３７】 本明細書で用いる「相補体」、「逆相補体」および「逆配列」という用語は、
以下の例で最も良く示される。配列５’ＡＧＧＡＣＣ３’では、相補体、逆相補
体および逆配列は以下の通りである： 相補体 ３’ＴＣＣＴＧＧ５’ 逆相補体 ３’ＧＧＴＣＣＴ５’ 逆配列 ５’ＣＣＡＧＧＡ３’。As used herein, the terms “complement”, “reverse complement” and “reverse sequence”
This is best illustrated by the following example. In the sequence 5′AGGACC3 ′, the complement, reverse complement and reverse sequence are as follows: Complement 3′TCCTGG5 ′ Reverse complement 3′GGTCCT5 ′ Reverse sequence 5′CCAGGA3 ′.

【００３８】 本明細書で用いる「変異体」と言う用語は、本発明の配列に対し少なくとも約
４０％の、より好ましくは少なくとも約６０％の、さらにより好ましくは少なく
とも約７５％の、最もこのましくは少なくとも約９０％の同一残基（ヌクレオチ
ドまたはアミノ酸のいずれか）を有する任意の配列を網羅するものである。同一
残基の割合は比較する２個の配列を整列し、整列した部分中の同一残基の数を調
べ、その数を本発明の、または問題の配列の全長さで割って１００をかけて決め
られる。As used herein, the term “variant” refers to at least about 40%, more preferably at least about 60%, even more preferably at least about 75%, and most preferably at least about 40%, of a sequence of the invention. Preferably, it covers any sequence having at least about 90% identical residues (either nucleotides or amino acids). The percentage of identical residues is determined by aligning the two sequences to be compared, examining the number of identical residues in the aligned portion, dividing the number by the total length of the sequence of the present invention or the problem, and multiplying by 100. I can decide.

【００３９】 ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を整列し、一般に使用できるコン
ピューターアルゴリズムを用いて特定の領域の同一ヌクレオチドの割合を他のポ
リヌクレオチドに対して決定する。ポリヌクレオチド配列を整列し類似性を同定
するための代表的な２種類のアルゴリズムはＢＬＡＳＴＮとＦＡＳＴＡアルゴリ
ズムである。ポリペプチド配列の類似性はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調
べることができる。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰソフトウエアの双方は／ｂ
ｌａｓｔ／ｅｘａｃｕｔａｂｌｅｓ／のＮＢＣＩ匿名ＦＴＰサーバ（ｆｔｐ：／
／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上で利用できる。文書に記載されたパラ
メーターをデフォルトするように設定されたアルゴリズムと共に配布されるＢＬ
ＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）は、本発
明による変異体の決定に用いるのに好ましい。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ
を含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用は、ＵＲＬｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈ
ｔｍｌのＮＣＢＩ’ｓインターネットウエブサイト、およびアルトシュール、ス
テフェン．Ｆ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．）ら、「割れ目付きＢ
ＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新生タンパク質データベース検索プログラ
ム」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９
７に記載されている。コンピューターアルゴリズムＦＡＳＴＡはインターネット
上でフィップサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／
ｆａｓｔａ／で利用できる。文書に記載されたパラメーターをデフォルトするよ
うに設定されたアルゴリズムと共に配布されるバージョン２．０４（１９９６年
２月）は本発明による変異体の決定に使用するのに好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴ
リズムの使用はピアソンＷＲ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ）およびリップマンＤＪ（
Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ）、「生物学的配列解析の改良されたツール」、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４―２４４８、１９８８、
およびピアソンＷＲ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ）、「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＲＡ
との迅速かつ高感度配列比較」、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３
：６３−９８、１９９０に記載されている。The sequences of the polynucleotides or polypeptides are aligned and the percentage of identical nucleotides in a particular region determined relative to other polynucleotides using commonly available computer algorithms. Two representative algorithms for aligning polynucleotide sequences and identifying similarities are the BLASTN and FASTA algorithms. Polypeptide sequence similarity can be determined using the BLASTP algorithm. Both BLASTN and BLASTP software are / b
NBCI anonymous FTP server at last / exactables / ( ftp: //
/ Ncbi. nlm. nih. gov ). BL distributed with algorithm set to default documented parameters
ASTN algorithm version 2.0.6 (September 16, 1998) is preferred for use in determining variants according to the present invention. BLASTN and BLASTP
The use of the BLAST family of algorithms, including the URL http: // w
ww. ncbi. nlm. nih. gov / BLAST / newblast. h
tml NCBI's internet website, and Altsur, Stephen. F (Altschul, Stephen F.) et al.
LAST and PSI-BLAST: a search program for nascent protein databases ", Nucleic Acid Res . 25: 3389-3402, 199
7. The computer algorithm FASTA is available on the Internet at the Fip site ftp: // ftp. virginia. edu / pub /
available at fasta / . Version 2.04 (February 1996) distributed with algorithms set to default documented parameters is preferred for use in determining variants according to the present invention. The use of the FASTA algorithm is described in Pearson WR and Lippman DJ (
Lipman DJ), "An Improved Tool for Biological Sequence Analysis", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA , 85: 2444-2448, 1988,
And Pearson WR, "FASTP and FASRA
Rapid and Sensitive Sequence Comparison with ", Method in Enzymol . 183
: 63-98, 1990.

【００４０】 以下の実行パラメーターが、本発明のポリヌクレオチドのＥ値と同一性割合に
寄与するＢＬＡＳＴＮを用い整列および同一性を決定するのに好ましい：ユニッ
クス実行コマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ−ｐ ｂｌａｓｔｎ−ｄ ｅｍｂｌｄｂ−
ｅ １０−Ｇ ０−Ｅ ０−ｒ １−ｖ ３０−ｂ ３０−ｉ ｑｕｅｒｙｓｅ
ｑ−ｏ ｒｅｓｕｌｔｓ；およびパラメーターは：−ｐプログラム名 ［ストリ
ング］；−ｄデータベース ［ストリング］；−ｅ期待値（Ｅ）［リアル］；−
Ｇ ギャップを開くコスト（ゼロはデフォルト挙動を起動）［整数］；−Ｅ ギ
ャップを延長するコスト（ゼロはデフォルト挙動を起動）［整数］；−ｒ ヌク
レオチド整合に対する結果（ｂｌａｓｔｎのみ）［整数］；−ｖ 一列の表示数
（Ｖ）［整数］；−ｂ 表示する整列数（Ｂ）［整数］；−ｉクエリーファイル
［ファイルイン］；ｏ−Ｂｌａｓｔレポート出力ファイル[ファイルアウト]オプ
ショナルである。The following execution parameters are preferred for determining alignment and identity using BLASTN, which contributes to the E value and percent identity of the polynucleotides of the invention: Unix execution command: blastall-p blastn-d embldb-
e 10-G 0-E 0-r 1-v 30-b 30-i query
q-results; and parameters are: -p program name [string]; -d database [string]; -e expected value (E) [real];-
G Cost of opening gap (zero triggers default behavior) [integer]; -E Cost of extending gap (zero triggers default behavior) [integer]; -r Result for nucleotide match (blastn only) [integer]; -V Number of lines to be displayed (V) [integer]; -b Number of lines to be displayed (B) [integer]; -i query file [file in]; o-Blast report output file [file out] Optional.

【００４１】 以下の実行パラメーターが、ポリペプチド配列のＥ値と同一性の割合に寄与す
るＢＬＡＳＴを用いる整列および同一性決定に好ましい。ＢＬＡＳＴＰでは、以
下の実行パラメーターが好ましい：ｂｌａｓｔａｌｌ−ｐ ｂｌａｓｔｐ−ｄ
ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ−ｅ １０−Ｇ ０−Ｅ ０−ｖ ３０−ｂ ３０−ｉ
ｑｕｅｒｙｓｅｑ−ｏ ｒｅｓｕｔｓ；およびパラメーターは：−ｐプログラ
ム名［ストリング］；−ｄデータベース［ストリング］；−ｅ期待値（Ｅ）［リ
アル］；−Ｇ ギャップを開くコスト（ゼロはデフォルト挙動を起動）［整数］
；−Ｅ ギャップを延長するコスト（ゼロはデフォルト挙動を起動）［整数］；
−ｖ １列の表字数（ｖ）［整数］；−ｂ 表示の整列数（ｂ）［整数］；−Ｉ
クエリーファイル［ファイルイン］；−ｏ ＢＬＡＳＴレポート出力ファイル［
ファイルアウト］オプショナルである。The following operating parameters are preferred for alignment and identity determination using BLAST, which contribute to the percent E and identity of the polypeptide sequences. For BLASTP, the following execution parameters are preferred: blastall-p blastp-d
swsprotdb-e 10-G 0-E 0-v 30-b 30-i
queryseq-o results; and parameters are: -p program name [string]; -d database [string]; -e expected value (E) [real]; -G cost of opening a gap (zero activates default behavior) integer]
The cost of extending the -E gap (zero activates default behavior) [integer];
-V Number of characters in one column (v) [integer]; -b Number of display alignment (b) [integer]; -I
Query file [File In]; -o BLAST report output file [
File Out] is optional.

【００４２】 ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ又は同様なアルゴリズムで作製した
クエリー配列による１個以上のデータエース配列に対する「ヒット」は、配列の
同様な部分を整列し同定する。このヒットは類似性の程度と配列の重複の長さの
順に並べられる。データーベース配列に対するヒットは、一般にクエリー配列の
配列長さの一部分のみへの重複を表す。A “hit” to one or more Dataace sequences by a query sequence generated by BLASTN, BLASTP, FASTA or a similar algorithm aligns and identifies similar parts of the sequence. The hits are ordered by degree of similarity and length of sequence overlap. Hits against the database sequence generally represent an overlap in only a portion of the sequence length of the query sequence.

【００４３】 ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムはまた、整列に対する「期待」値
を生成する。期待値（Ｅ）は、あるサイズのデーターベースを検索する場合、あ
る数の連続配列に対して偶然「期待」し得るヒット数を示す。期待値は、好まし
いＥＭＢＬデータベース等のデータベースに対するヒットが真の類似性を示すか
否か決定するための有為の閾値として用いられる。例えば、あるヒットに対して
割り当てられた０．１のＥ値は、ＥＭＢＬのサイズのデーターベースにおいて、
配列の整列した部分にわたって、同様な得点で０．１の整合を単に偶然に得られ
ると期待し得ることを意味すると解釈される。この基準により、配列の整列され
整合した部分は９０％の同一である確率を有する。整列され整合した部分にわた
り０．０１以下のＥ値を有する配列では、ＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴ
リズムを用いてＥＭＢＬデーターベースで偶然に整合する確率は１％以下である
。The BLASTN and FASTA algorithms also generate “expected” values for alignment. The expected value (E) indicates the number of hits that can be “expected” by chance for a certain number of continuous sequences when searching a database of a certain size. The expected value is used as a significant threshold to determine whether a hit against a database such as the preferred EMBL database indicates true similarity. For example, an E value of 0.1 assigned to a hit is a database of the size of the EMBL,
Interpretation is meant to mean that a match of 0.1 with similar scores over aligned portions of the sequence could simply be expected to be obtained. By this criterion, the aligned and matched portions of the sequence have a 90% probability of being identical. For sequences having an E value of less than or equal to 0.01 over aligned and matched portions, the probability of an accidental match in the EMBL database using the BLASTN or FASTA algorithm is less than 1%.

【００４４】 ある実施態様によれば、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれを参照にした「
変異」ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれよりも同数以
下の配列を有し、本発明のポリヌクレオチドと比較して０．０１以下のＥ値を生
成する配列を含むことが好ましい。すなわち、変異ポリヌクレオチドは少なくと
も、パラメーターをデフォルトするように設定されたＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳ
ＴＡアルゴリズムを用いて０．０１以下のＥ値を有すると測定される、本発明の
ポリヌクレオチドと同じである９９％の確率を有する任意の配列である。好まし
い実施態様によれば、変異ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドと同数
以下の核酸を有する配列であり、パラメーターをデフォルトするように設定され
たＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて０．０１以下のＥ値を有
すると測定される、本発明のポリヌクレオチドと同一である少なくとも９９％の
確率を有する。According to one embodiment, the reference to each of the polynucleotides of the invention,
A "mutated" polynucleotide preferably comprises a sequence having the same number or less of each of the polynucleotides of the invention and producing an E value of 0.01 or less compared to the polynucleotide of the invention. That is, the mutant polynucleotide is at least a BLASTN or FAS set to default parameters.
Any sequence with a 99% probability of being the same as a polynucleotide of the invention, measured using the TA algorithm to have an E value of 0.01 or less. According to a preferred embodiment, the mutant polynucleotide is a sequence having the same number of nucleic acids or less as the polynucleotide of the present invention, and has an E value of 0.01 or less using a BLASTN or FASTA algorithm set to default parameters. Has at least a 99% probability of being identical to a polynucleotide of the present invention, which is determined to have

【００４５】 また、変異ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドと厳密な条件下でハ
イブリダイゼーションする。本明細書で用いる「厳密な条件」とは、６Ｘ ＳＣ
Ｃ、０．２％ＳＤＳ溶液で予備洗浄し、６５℃で６Ｘ ＳＣＣ、０．２％ＳＤＳ
中で終夜ハイブリダイゼーションし、その後６５℃で１Ｘ ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ中で３０分間２回洗浄、６５℃で０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＳＣ中で３
０分間２回洗浄することを意味する。In addition, the mutant polynucleotide hybridizes with the polynucleotide of the present invention under strict conditions. As used herein, “strict conditions” refers to 6X SC
C, prewash with 0.2% SDS solution, 6X SCC, 0.2% SDS at 65 ° C
Hybridization overnight at 65 ° C. in 1 × SSC, 0.1% S
Wash twice in DS for 30 min, 0.2X SSC at 65 ° C, 3 in 0.1% SSC
It means to wash twice for 0 minutes.

【００４６】 本発明はまた、開示された配列とは異なるが、遺伝子コードのずれの結果とし
て本発明のポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドと類似の酵素活
性を有するポリペプチドをコード化する配列を含む。従って、保存置換の結果と
して配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１
９−１２９、１３９−１４３および１４９―９０８で表されるポリヌクレオチド
配列とは異なる配列、またはこれらの配列の相補体、逆配列、または逆相補配列
を含んでなるポリヌクレオチドが本発明の範囲内にあると考えられるか、本発明
に含まれる。さらに、全配列長さの１０％以下のアミノ酸の欠失および／または
挿入の結果として配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−
１１３、１１９―１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で表されるポリ
ヌクレオチド配列とは異なる配列、または相補体、逆相補体、または逆配列を含
んでなるポリヌクレオチドが本発明の範囲内であると考えられ、本発明に含まれ
る。同様に、全配列長さの１０％以下のアミノ酸の置換、挿入および／または欠
失の結果として配列番号：３０−５６、８１−１０４、１０６、１０８、１１４
−１１８、１２９−１３８および１４４−１４８で表されるポリペプチド配列と
は異なる配列を含んでなるポリペプチドが、変異ポリペプチドが細胞壁多糖合成
経路で活性を有するならば、本発明の範囲内であると考えられ、本発明に含まれ
る。The present invention also provides a sequence that encodes a polypeptide that differs from the disclosed sequences, but has similar enzymatic activity to the polypeptide encoded by a polynucleotide of the present invention as a result of a shift in the genetic code. including. Therefore, as a result of the conservative substitution, SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 11
Sequences different from the polynucleotide sequences represented by 9-129, 139-143 and 149-908, or polynucleotides comprising the complements, reverse sequences, or reverse complement sequences of these sequences are within the scope of the present invention. Or included in the present invention. Further, as a result of deletion and / or insertion of 10% or less amino acids of the entire sequence length, SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-
Sequences different from the polynucleotide sequences represented by 113, 119-129, 139-143, and 149-908, or polynucleotides comprising complements, reverse complements, or reverse sequences, are within the scope of the invention. And are included in the present invention. Similarly, SEQ ID NOs: 30-56, 81-104, 106, 108, 114 as a result of substitutions, insertions and / or deletions of 10% or less amino acids of the entire sequence length.
Polypeptides comprising sequences different from the polypeptide sequences represented by -118, 129-138 and 144-148 are within the scope of the present invention if the mutant polypeptide has activity in the cell wall polysaccharide synthesis pathway. And are included in the present invention.

【００４７】 配列番号：３０−５６、８１−１０４、１０６、１０８、１１４−１１８、１
２９−１３８および１４４−１４８で表されるポリペプチド配列の変異体であっ
て、変異体が記載のポリペプチドの活性と異なる活性レベルを有する場合も本発
明に含まれる。特定の実施態様では、本発明のスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）
ポリペプチドの変異体が提供され、そのＮ−末端セリン燐酸化部位が例えば部位
特異的突然変異誘発により（ＡｓｐまたはＧｌｕなどの）酸性アミノ酸で置換さ
れている。ナカイ（Ｎａｋａｉ）らはこの方法で突然変異したＳＵＳポリペプチ
ドが野性型ＳＵＳに比べて活性が増加していることを示した（ナカイ（Ｎａｋａ
ｉ）ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：１３３７−１３４１、
１９９８）。従って、本発明のＳＵＳポリペプチドのこの様な変異体をコード化
するポリヌクレオチドがセルロース生産を増加させるための形質転換植物として
用いられる。SEQ ID NOs: 30-56, 81-104, 106, 108, 114-118, 1
Variants of the polypeptide sequences represented by 29-138 and 144-148, wherein the variant has an activity level that differs from the activity of the described polypeptide are also included in the invention. In certain embodiments, the sucrose synthase (SUS) of the invention
Variants of the polypeptide are provided wherein the N-terminal serine phosphorylation site has been replaced with an acidic amino acid (such as Asp or Glu), for example, by site-directed mutagenesis. Nakai et al. Have shown that SUS polypeptides mutated in this manner have increased activity compared to wild-type SUS (Nakai et al.
i) et al., Plant Cell Physiol . 39: 1337-1341,
1998). Thus, a polynucleotide encoding such a variant of the SUS polypeptide of the present invention is used as a transformed plant to increase cellulose production.

【００４８】 本発明のポリヌクレオチドは様々なライブラリーから単離するか、公知の技術
を用いて合成することができる。例えば、ポリヌクレオチドは自動オリゴヌクレ
オチド合成装置（例えばベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）オリゴ１０００Ｍ ＤＮ
Ａ合成装置）を用いて合成され、５０ｍｅｒ以上の核酸のポリヌクレオチド断片
を得ることができる。次に複数のこの様なポリヌクレオチド断片を分子生物学で
公知のＤＮＡ鎖操作技術を用いて連結する。従来の例示的なポリヌクレオチド合
成技術の一つに、例えば８０個の核酸を有する単一鎖ポリヌクレオチド断片の合
成が含まれ、その断片を８５個の核酸でなる合成相補核酸断片にハイブリダイゼ
ーションし、５個の核酸のオーバーハングを生産する。次の断片は反対の鎖にオ
ーバーハングされた５ヌクレオチドと同様の方法で合成されてよい。２つの部分
をハイブリダイゼーションする場合、「粘着性」末端により適切な連結が保証さ
れる。この様にして、本発明の完全なポリヌクレオチドがインビドロで合成し得
る。[0048] The polynucleotides of the present invention can be isolated from various libraries or synthesized using known techniques. For example, polynucleotides may be synthesized on an automated oligonucleotide synthesizer (eg, Beckman Oligo 1000M DN).
A synthesizer) to obtain a polynucleotide fragment of a nucleic acid of 50 mer or more. A plurality of such polynucleotide fragments are then ligated using DNA chain manipulation techniques known in molecular biology. One conventional exemplary polynucleotide synthesis technique involves the synthesis of a single-stranded polynucleotide fragment having, for example, 80 nucleic acids, and the fragment is hybridized to a synthetic complementary nucleic acid fragment of 85 nucleic acids. Produces 5 nucleic acid overhangs. Subsequent fragments may be synthesized in a manner similar to 5 nucleotides overhanged on the opposite strand. When the two parts are hybridized, a "sticky" end ensures proper ligation. In this way, the complete polynucleotide of the invention can be synthesized in vitro .

【００４９】 配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９
−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で同定されるポリヌクレオチド
のいくつかは、天然発生のポリペプチドをコード化する遺伝子の完全なコード領
域を現していないので「部分」配列と呼ばれる。本明細書に開示される部分ポリ
ヌクレオチド配列を用いて、例えば本発明のポリヌクレオチドに基づきハイブリ
ダイゼーションプローブを用いるＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングによ
り、または本発明のポリヌクレオチドに基づくプライマーによるＰＣＲ増幅を用
いて、様々な種や生物に対する完全な長さの遺伝子を得ることもできる。この様
にして、公知の方法を用いて本発明のポリヌクレオチドを対応するｍＲＮＡの上
流および下流に延長することができると同時に、完全な遺伝子のプロモーターお
よびエンハンサー領域を含む対応するゲノムＤＮＡを同定することが可能である
。従って本発明は、完全な長さの遺伝子を含む機能性ポリペプチドをコード化す
る配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９
−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で表される配列、または特定の
配列のうちの１つの変異体を含んでなる単離ポリヌクレオチドを含む。この様な
延長されたポリヌクレオチドは約５０〜約４、０００個の核酸または塩基対長、
好ましくは約４、０００個以下の核酸または塩基対長、さらにより好ましくは約
３、０００個以下の核酸または塩基対長、さらにより好ましくは２０００個以下
の核酸または塩基対長を有する。ある場合は、本発明の延長されたポリヌクレオ
チドは約１、８００個以下の核酸または塩基対長、好ましくは約１，６００個以
下の核酸または塩基対長、より好ましくは約１、４００個以下の核酸または塩基
対長、さらにより好ましくは約１、２００個以下の核酸または塩基対長、最も好
ましくは約１、０００個以下の核酸または塩基対長を有する。SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 119
Some of the polynucleotides identified at -129, 139-143, and 149-908 do not represent the complete coding region of the gene encoding the naturally occurring polypeptide, and are therefore referred to as "partial" sequences. Using the partial polynucleotide sequences disclosed herein, for example, by screening a DNA expression library using hybridization probes based on the polynucleotides of the invention, or using PCR amplification with primers based on the polynucleotides of the invention To obtain full-length genes for various species and organisms. In this manner, the polynucleotides of the invention can be extended upstream and downstream of the corresponding mRNA using known methods, while identifying the corresponding genomic DNA, including the promoter and enhancer regions of the complete gene. It is possible. Accordingly, the invention provides SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 119 encoding functional polypeptides including full length genes.
-129, 139-143 and 149-908, or an isolated polynucleotide comprising a variant of one of the specified sequences. Such extended polynucleotides can have from about 50 to about 4,000 nucleic acids or base pairs in length,
Preferably it has no more than about 4,000 nucleic acids or base pairs, even more preferably no more than about 3,000 nucleic acids or base pairs, even more preferably no more than 2000 nucleic acids or base pairs. In some cases, the extended polynucleotides of the invention have no more than about 1,800 nucleic acids or base pairs in length, preferably no more than about 1,600 nucleic acids or base pairs in length, and more preferably no more than about 1,400. Of nucleic acids or base pairs, even more preferably no more than about 1,200 nucleic acids or base pairs, most preferably no more than about 1,000 nucleic acids or base pairs.

【００５０】 本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号：１−２９、５７−８０、１０５
、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９
０８として同定される任意のポリヌクレオチドの少なくとも特定の数の連続残基
（ｘ−ｍｅｒｓ）、この様な配列の相補体、逆配列、および逆相補体、ならびに
その変異体を含んでなるポリヌクレオチドを含む。同様に、本発明のポリペプチ
ドは配列番号：３０−５６、８１−１０４、１０６、１０８、１１４−１１８、
１２９−１３８および１４４−１４８として同定される任意のポリペプチドの少
なくとも特定の数の連続残基（ｘ−ｍｅｒｓ）ならびにその変異体を含んでなる
ポリペプチドを含む。本明細書で用いられる「ｘ−ｍｅｒ」と言う用語は、特定
の「ｘ」の値を参照して、配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、
１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８として
同定される任意のポリヌクレオチド、または配列番号：３０−５６、８１−１０
４、１０６、１０８、１１４−１１８、１２９−１３８および１４４−１４８と
して同定されるポリペプチドの少なくとも特定の数（「ｘ」）の連続残基を含ん
でなる配列を言う。好ましい実施態様によれば、ｘの値は好ましくは２０；より
好ましくは少なくとも４０；さらにより好ましくは少なくとも６０；最も好まし
くは少なくとも８０である。従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは２０−ｍｅｒ、４０−ｍｅｒ、６０−ｍｅｒ、８０−ｍｅｒ、１００−ｍ
ｅｒ、１２０−ｍｅｒ、１５０−ｍｅｒ、１８０−ｍｅｒ、２２０−ｍｅｒ、２
５０−ｍｅｒ、３００−ｍｅｒ、４００−ｍｅｒ、５００−ｍｅｒまたは６００
−ｍｅｒの、配列番号：１−９０８で同定されるポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、またはその変異体を含む。The polynucleotides of the present invention may also include SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105
, 107, 109-113, 119-129, 139-143 and 149-9.
Polynucleotides comprising at least a specified number of contiguous residues ( x- mers) of any polynucleotide identified as 08, complements, reverse sequences, and reverse complements of such sequences, and variants thereof including. Similarly, the polypeptides of the present invention may comprise SEQ ID NOs: 30-56, 81-104, 106, 108, 114-118,
Includes polypeptides comprising at least a specified number of contiguous residues ( x- mers) of any polypeptide identified as 129-138 and 144-148, as well as variants thereof. As used herein, the term “ x- mer” refers to SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, with reference to a particular “ x ” value.
Any polynucleotide identified as 109-113, 119-129, 139-143 and 149-908, or SEQ ID NOs: 30-56, 81-10
A sequence comprising at least a specified number (" x ") of contiguous residues of a polypeptide identified as 4, 106, 108, 114-118, 129-138, and 144-148. According to a preferred embodiment, the value of x is preferably 20; more preferably at least 40; even more preferably at least 60; most preferably at least 80. Thus, the polynucleotides and polypeptides of the present invention may be 20-mer, 40-mer, 60-mer, 80-mer, 100-m
er, 120-mer, 150-mer, 180-mer, 220-mer, 2
50-mer, 300-mer, 400-mer, 500-mer or 600
-Mer, including the polynucleotide or polypeptide identified by SEQ ID NOs: 1-908, or a variant thereof.

【００５１】 配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９
−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８に相補的なおよび／または対応
するポリヌクレオチドプローブおよびプライマー、およびこれらの配列の変異体
も、本発明に含まれる。この様なオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー
は実質的に関心のあるポリヌクレオチドに相補的である。本明細書で用いる「オ
リゴヌクレオチド」と言う用語は、一般に６〜６０のヌクレオチドを含むポリヌ
クレオチド配列の比較的短い断片を言い、ハイブリダイゼーションアッセイに使
用されるプローブとポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡの増幅用に使用されるプ
ライマーの双方を含む。SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 119
Polynucleotide probes and primers complementary to and / or corresponding to -129, 139-143 and 149-908, and variants of these sequences are also included in the invention. Such oligonucleotide probes and primers are substantially complementary to the polynucleotide of interest. As used herein, the term "oligonucleotide" refers to a relatively short fragment of a polynucleotide sequence, generally comprising 6 to 60 nucleotides, for use in hybridization assays with probes and the amplification of DNA by the polymerase chain reaction. Includes both primers used for

【００５２】 オリゴヌクレオチドプローブまたはプラマーまたはその相補体が配列番号：１
−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３
９−１４３および１４９−９０８で表される配列の一つの範囲内、または特定の
配列の一つの変異体に含まれる場合、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライ
マーは、配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、
１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８として表される配列の１
個を含む本発明のポリヌクレオチドに「対応する」と説明される。The oligonucleotide probe or pramer or its complement is SEQ ID NO: 1.
-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 119-129, 13
Within one of the sequences represented by 9-143 and 149-908, or within one variant of a particular sequence, the oligonucleotide probes or primers are SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113,
One of the sequences represented as 119-129, 139-143 and 149-908
Are described as "corresponding to" the polynucleotides of the present invention.

【００５３】 適当なヌクレオチド挿入および／または欠失を有して最適に整列し比較される
１本の鎖のヌクレオチドが、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％〜
９５％、より好ましくは少なくとも９８％〜１００％の他の鎖のヌクレオチドと
対になる場合、２本の単一鎖配列は実質的に相補性であると言われる。あるいは
、最初のＤＮＡ鎖が厳密なハイブリダイゼーション条件下で第２のＤＮＡ鎖と選
択的にハイブリダイゼーションする場合、実質的な相補性が存在する。相補性を
決定するための厳密なハイブリダイゼーション条件には約１Ｍ以下、より一般的
には約５００ｍＭより少ない、好ましくは約２００ｍＭより少ない塩条件が含ま
れる。ハイブリダイゼーション温度は５℃の低さでも良いが、一般には約２２℃
より高くであり、より好ましくは約３０℃より高く、最も好ましくは約３７℃よ
り高い。ＤＮＡ断片が長いほど、特定のハイブリダイゼーションのためにより高
いハイブリダイゼーション温度が必要になる。ハイブリダイゼーションの厳密性
はプローブ組成、有機溶剤の存在および塩基不整合の程度等の他の因子で影響さ
れるので、パラメーターの組み合せはいずれか一つのみの絶対的な尺度より重要
である。植物由来のＤＮＡまたは植物材料を含む試料または生産物は、ゲノムＤ
ＮＡまたは試料中に存在するＲＮＡからｃＤＮＡを調製して導かれるＤＮＡのい
ずれかである。The optimally aligned and compared single-strand nucleotides with appropriate nucleotide insertions and / or deletions are at least 80%, preferably at least 90%,
Two single-stranded sequences are said to be substantially complementary when paired with 95%, more preferably at least 98% -100%, of the nucleotides of the other strand. Alternatively, substantial complementarity exists when the first DNA strand selectively hybridizes to the second DNA strand under stringent hybridization conditions. Stringent hybridization conditions for determining complementarity include salt conditions of about 1 M or less, more usually less than about 500 mM, and preferably less than about 200 mM. The hybridization temperature can be as low as 5 ° C, but is generally about 22 ° C.
Higher, more preferably higher than about 30 ° C, and most preferably higher than about 37 ° C. The longer the DNA fragment, the higher the hybridization temperature required for a particular hybridization. Since the stringency of hybridization is affected by other factors such as probe composition, the presence of organic solvents and the degree of base mismatch, the combination of parameters is more important than any one absolute measure. A sample or product containing plant-derived DNA or plant material is
Either NA or DNA derived from preparing cDNA from RNA present in the sample.

【００５４】 ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションに加えて、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリダイゼーション分析も可能である。最初の場合は、発現遺伝
子由来のｍＲＮＡが試料のｍＲＮＡ由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの代わり
に検出される。第二の場合は、ＲＮＡプローブが使用されうる。さらに標的配列
に特異的にハイブリダイゼーションするＤＮＡの人工アナログも用いられる。In addition to DNA-DNA hybridization, DNA-RNA or RN
A-RNA hybridization analysis is also possible. In the first case, mRNA from the expressed gene is detected instead of genomic DNA or cDNA from the sample mRNA. In the second case, an RNA probe can be used. In addition, artificial analogs of DNA that specifically hybridize to the target sequence are also used.

【００５５】 特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマー
は本発明のポリヌクレオチド配列に相補性である少なくとも約６個の連続残基、
より好ましくは少なくとも約１０個の連続残基、および最も好ましくは少なくと
も約２０個の連続残基を含む。本発明のプローブまたはプライマーは長さで約８
〜１００個の塩基対、または好ましくは長さで約１０〜５０個の塩基対、または
より好ましくは長さで約１５〜４０個の塩基対由来であり得る。プローブは公知
の方法を用い、公知のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの厳密性、アニー
ルおよび融解温度、およびループ形成の可能性および他の因子を考慮して容易に
選択することが可能である。プローブを設計するに適した、特にＰＣＲプライマ
ーを設計するに適したツールとソフトウエアはインターネット、例えばＵＲＬｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｒｉｚｏｎｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒ／で入手可能
である。ＰＣＲプライマーを設計するために好ましい技術も、ディッフェンバッ
ハ ＣＷ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ）およびディクスラー ＧＳ（Ｄｙｋ
ｓｌｅｒ ＧＳ）、ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９５年に開示されてい
る。In certain embodiments, the oligonucleotide probe and / or primer comprises at least about 6 contiguous residues that are complementary to a polynucleotide sequence of the invention.
More preferably, it contains at least about 10 contiguous residues, and most preferably at least about 20 contiguous residues. The probes or primers of the present invention are approximately 8 in length.
It may be from -100 base pairs, or preferably about 10-50 base pairs in length, or more preferably about 15-40 base pairs in length. Probes can be readily selected using known methods, taking into account known stringency of DNA-DNA hybridization, annealing and melting temperatures, and the potential for loop formation and other factors. Tools and software suitable for designing probes, especially for designing PCR primers, are available on the Internet, eg, at URL h
http: // www. horizonpress. com / pcr / . Preferred techniques for designing PCR primers are also described in Diffenbach CW and Dixler GS (Dyk
sler GS), PCR primers : Laboratory Manual , CSHL Pres
, Cold Spring Harbor, NY, 1995.

【００５６】 本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドプローブまた
はプライマーはキットの形で提供される。この様なキットは一般に複数のＤＮＡ
またはオリゴヌクレオチドプローブを含み、各プローブはポリヌクレオチド配列
に特異的である。本発明のキットは、配列番号：１−２９、５７−８０、１０５
、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９
０８で同定されるポリヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチドに対応
する１個以上のプローブまたはプライマーを含み得る。A plurality of oligonucleotide probes or primers corresponding to the polynucleotide of the present invention are provided in the form of a kit. Such kits generally contain multiple DNA
Or oligonucleotide probes, each probe being specific for a polynucleotide sequence. The kit of the present invention comprises SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105
, 107, 109-113, 119-129, 139-143 and 149-9.
One or more probes or primers corresponding to a polynucleotide of the invention comprising the polynucleotide sequence identified at 08 may be included.

【００５７】 一つの実施態様では、本発明は本発明のポリヌクレオチドまたはその変異体で
コード化されるポリペプチドの、少なくとも機能性部分に対する読み取り枠コー
ドを含む遺伝子を提供する。本明細書で用いられるポリペプチドの「機能性部分
」は、代謝工程に影響する必須の活性部位、すなわち１個以上の反応物を結合し
得る、または反応速度を改善または制御し得る分子の部分を含む部分である。機
能性部分は公知のプロトコールを用い、突然変異誘発を標的にすることと修飾タ
ンパク質生成物のスクリーニングにより決定できる。通常、機能性部分は１０〜
２０個のアミノ酸であるが、より短いこともより長いこともあり得る。活性部位
は１個所以上のペプチド鎖上に存在する異なった部分で作られていても良く、通
常は高い基質特異性を示す。本明細書で用いる「ポリヌクレオチドでコード化さ
れるポリペプチド」と言う用語は、本発明の部分単離ＤＮＡ配列を含むヌクレオ
チド配列でコード化されるポリペプチドを含む。In one embodiment, the invention provides a gene comprising an open reading frame code for at least a functional portion of a polypeptide encoded by a polynucleotide of the invention or a variant thereof. As used herein, a “functional portion” of a polypeptide is an essential active site that affects metabolic processes, ie, the portion of the molecule that can bind one or more reactants or improve or control the rate of a reaction. It is a part containing. Functional moieties can be determined by targeting mutagenesis and screening modified protein products using known protocols. Usually, the functional part is 10 ~
20 amino acids, but could be shorter or longer. The active site may be made up of different parts present on one or more peptide chains and usually shows high substrate specificity. The term "polynucleotide-encoded polypeptide" as used herein includes polypeptides encoded by nucleotide sequences, including partially isolated DNA sequences of the present invention.

【００５８】 読み取り枠はセンスまたはアンチセンス配向にある遺伝構築物に挿入され、野
性型植物と比較して遺伝子構築物を有する標的植物の形質転換によりポリペプチ
ドの量または構造に変化を生じる。センス配向の読み取り枠を含んでなる遺伝子
構築物による形質転換は一般に選ばれた遺伝子の発現が変化する結果となるが、
アンチセンス配向の読み取り枠を含んでなる遺伝子構築物による形質転換でも、
一般に選ばれた遺伝子の発現が変化する結果となる。センスまたはアンチセンス
配向いずれかの本発明の読み取り枠を含んでなる遺伝子構築物で形質転換された
植物群は、当業者に公知の技術を用いて問題とする遺伝子の発現の増加または減
少のためにスクリーニングされ、所望の表現型を有する植物を単離することがで
きる。The open reading frame is inserted into the genetic construct in a sense or antisense orientation, resulting in a change in the amount or structure of the polypeptide upon transformation of the target plant with the genetic construct as compared to a wild-type plant. Transformation with a genetic construct comprising an open reading frame for sense orientation generally results in altered expression of the selected gene,
In transformation with a gene construct comprising an open reading frame in the antisense orientation,
This generally results in altered expression of the selected gene. Plants transformed with a genetic construct comprising an open reading frame of the invention in either the sense or antisense orientation can be used to increase or decrease expression of the gene in question using techniques known to those of skill in the art. Plants that have been screened and have the desired phenotype can be isolated.

【００５９】 あるいは、多糖類の生合成に関わる遺伝子の発現は、遺伝子構築物で本発明の
読み取り枠の一部をセンスまたはアンチセンス配向のいずれか中に挿入すること
により阻害される。この様な部分は完全な長さである必要はなく、本発明のポリ
ヌクレオチドの好ましくは少なくとも２５残基、より好ましくは少なくとも５０
残基を含んでなる。完全な読み取り枠に対応するより長い部分、または完全な長
さのポリヌクレオチドも使用し得る。標的遺伝子を阻害するに十分な配列の類似
性があれば、読み取り枠の部分は内因性配列と正確に同じである必要はない。従
って、ある種から由来する配列を異なった種の遺伝子の発現を阻害するために使
用しても良い。Alternatively, the expression of genes involved in polysaccharide biosynthesis is inhibited by inserting a portion of the open reading frame of the invention into either the sense or antisense orientation in the genetic construct. Such portions need not be full length; preferably at least 25 residues, more preferably at least 50 residues of the polynucleotide of the invention.
The residue. Longer portions corresponding to the full reading frame, or full length polynucleotides, may also be used. The portion of the open reading frame need not be exactly the same as the endogenous sequence, provided that there is sufficient sequence similarity to inhibit the target gene. Thus, sequences derived from one species may be used to inhibit expression of a different species of gene.

【００６０】 第二の実施態様では、本発明の遺伝子構築物は本発明のポリヌクレオチドでコ
ード化されるポリペプチドをコードする遺伝子の非コード領域を含むポリヌクレ
オチド、またはこの様な非コード領域に相補的であるポリヌクレオチド配列を含
んでなる。この様な構築物に用いられて有用である非コード領域の例には、イン
トロンおよび５’−非コードリーダー配列が含まれる。標的植物のこの様な遺伝
子構築物による形質転換により、植物で合成される多糖の量が協同抑制プロセス
により減少する結果となるが、これは例えばナポリ（Ｎａｐｏｌｉ）ら（Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ２：２７９−２９０、１９９０）およびドカルバロ・ニエベル（
ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｎｉｅｂｅｌ）ら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ７：３４７
−３５８、１９９５）により議論された方法と類似している。In a second embodiment, the genetic construct of the invention comprises a polynucleotide comprising the non-coding region of the gene encoding the polypeptide encoded by the polynucleotide of the invention, or is complementary to such a non-coding region. The polynucleotide sequence of interest. Examples of non-coding regions useful for use in such constructs include introns and 5'-non-coding leader sequences. The transformation with such gene constructs of the target plant, the amount of polysaccharide is synthesized in plants results in reduced by cooperating suppression process, which is for example Naples (Napoli) et (Pla
nt Cell 2: 279-290, 1990) and Docarbalo Niebel (
de Carvalho Niebel) et al. ( Plant Cell 7: 347)
-358, 1995).

【００６１】 また、多糖合成の制御は適当な配列またはサブ配列（例えばＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）をリボザイム構築物に挿入することによって行われる（マッキンチレ ＣＬ
（ＭａＩｎｔｙｒｅ ＣＬ）、マナース ＪＭ（Ｍａｎｎｅｒｓ ＪＭ）、Ｔｒ
ａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．５（４）：２５７−２６２、１９９６）。リボザイ
ムは２つの領域に相補的であるハイブリダイゼーション領域を含み、各領域は本
発明のポリヌクレオチドの一つでコード化されるｍＲＮＡ分子中で少なくとも５
個の連続するヌクレオチドを含む合成ＲＮＡ分子である。リボザイムは高い特異
性のエンドヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡを自動触媒で開裂する。In addition, the control of polysaccharide synthesis may be controlled by using an appropriate sequence or
A) is inserted into a ribozyme construct (Mackinchile CL
(MaIntyre CL), Manners JM, Tr
ansgenic Res . 5 (4): 257-262, 1996). Ribozymes contain hybridization regions that are complementary to two regions, each region having at least 5 regions in an mRNA molecule encoded by one of the polynucleotides of the invention.
A synthetic RNA molecule containing a number of consecutive nucleotides. Ribozymes have high specificity of endonuclease activity and cleave mRNA autocatalytically.

【００６２】 本発明の遺伝子構築物はさらに、遺伝子の発現を制御する被転写ＤＮＡ配列に
結合して作用する遺伝子プロモーター配列と遺伝子終結配列を含んでなる。遺伝
子プロモーター配列は一般に被転写ＤＮＡ配列の５’末端に位置し、ＤＮＡ配列
の転写開始に用いられる。遺伝子プロモーター配列は一般に遺伝子の５’非コー
ド領域に見出されるが、読み取り枠の下流、イントロン中（リュールセン ＫＲ
（Ｌｕｅｈｒｓｅｎ ＫＲ）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２５：８１−
９３、１９９１）、または例えば植物防御遺伝子中等のコード領域中（ダグラス
（Ｄｏｕｇｌａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：１７６７−１７７５、１９９１
）に存在しても良い。構築物がセンス配向の読み取り枠を含む場合は、遺伝子プ
ロモーター配列も読み取り枠の翻訳を開始する。アンチセンス配向の読み取り枠
または非コード領域のいずれかを含んでなるＤＮＡ構築物では、遺伝子プロモー
ター配列はＲＮＡポリメラーゼ結合部位を有する転写開始部位のみから構成され
る。[0062] The gene construct of the present invention further comprises a gene promoter sequence and a gene termination sequence that act by binding to a transcribed DNA sequence that controls gene expression. Gene promoter sequences are generally located at the 5 'end of the DNA sequence to be transcribed and are used to initiate transcription of the DNA sequence. The gene promoter sequence is generally found in the 5 'non-coding region of the gene, but in the intron, downstream of the open reading frame (Rulesen KR
(Luehrsen KR), Mol. Gen. Genet . , 225: 81-
93, 1991) or in coding regions such as, for example, in plant defense genes (Douglas et al., EMBO J. , 10: 1767-1775, 1991).
) May be present. If the construct contains an open reading frame in the sense orientation, the gene promoter sequence will also initiate translation of the reading frame. In DNA constructs comprising either an open reading frame or a non-coding region in the antisense orientation, the gene promoter sequence consists solely of a transcription initiation site having an RNA polymerase binding site.

【００６３】 本発明のＤＮＡ構築物に用いられて有用である様々な遺伝子プロモーター配列
は当技術で公知である。プロモーターが標的ホスト中で機能性である場合、遺伝
子プロモーター配列、および遺伝子終結配列も標的植物ホストに対して内因性で
あるか、または外因性であり得る。例えば、プロモーターおよび終結配列は他の
植物種、植物ウイルス、バクテリアプラスミド等由来であってもよい。遺伝子プ
ロモータおよび終結配列が本発明の配列そのもの由来であることが好ましい。[0063] Various gene promoter sequences that are useful for use in the DNA constructs of the present invention are known in the art. If the promoter is functional in the target host, the gene promoter sequence, and the gene termination sequence, can also be endogenous or exogenous to the target plant host. For example, promoters and termination sequences may be derived from other plant species, plant viruses, bacterial plasmids, and the like. It is preferred that the gene promoter and termination sequence be derived from the sequence itself of the invention.

【００６４】 プロモーターの選択に影響する因子には構築物の所望の組織特異性と、転写お
よび翻訳のタイミングが含まれる。例えば、３５Ｓカリフラワーモザイクウイル
ス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーター等の構成プロモータは植物のあらゆる部分で
酵素活性に影響すると思われる。組織特性プロモーターの使用の結果、関心のあ
る組織のみで所望のセンスまたはアンチセンスＲＮＡが生産される。誘導性プロ
モーター配列を用いる遺伝子構築物により、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始
速度を光、熱、嫌気性ストレス、栄養条件の変化等の外部刺激により調節するこ
とができる。一時的に制御されたプロモーターを使用して、形質転換細胞の発育
中の特定の時間にＲＮＡポリメラーゼ結合および開始速度の調整を行うことがで
きる。問題の酵素遺伝子由来の本来のプロモーター、またはユーカリまたはマツ
等の被形質転換生物中の特定の組織を目標とする遺伝子由来のプロモーターを用
いることが好ましい。本発明に用いられて有用な遺伝子プロモーターの他の例に
は、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）および
チュア（Ｃｈｕａ）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１７４−１８１,１９８９）
により参照されたものが含まれる。Factors affecting the choice of promoter include the desired tissue specificity of the construct and the timing of transcription and translation. For example, constitutive promoters such as the 35S cauliflower mosaic virus (CaMV35S) promoter are likely to affect enzyme activity in all parts of the plant. The use of a tissue specific promoter results in the production of the desired sense or antisense RNA only in the tissue of interest. Gene constructs using inducible promoter sequences allow the rate of RNA polymerase binding and initiation to be regulated by external stimuli such as light, heat, anaerobic stress, and changes in nutritional conditions. Temporally regulated promoters can be used to regulate RNA polymerase binding and initiation rates at specific times during the development of transformed cells. It is preferred to use the native promoter from the enzyme gene in question, or a gene from a gene that targets a particular tissue in the transformed organism such as eucalyptus or pine. Other examples of gene promoters useful in the present invention include mannopine synthase (mas), octopine synthase (ocs), and Chua et al. ( Science 244: 174-181, 1989).
Included are those referenced by.

【００６５】 被転写ＤＮＡ配列の３’に位置する遺伝子終結配列は、遺伝子プロモーター配
列と同じ遺伝子、または異なった遺伝子から得られる。アグロバクテリウム ツ
メファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端等の公知の多くの遺伝子終
結配列が本発明に用いられて有用である。しかしながら、好ましい遺伝子終結配
列は本来の酵素遺伝子、または被形質転換標的種由来のものである。The gene termination sequence located 3 ′ of the DNA sequence to be transcribed can be obtained from the same gene as the gene promoter sequence or from a different gene. Agrobacterium Tu
Mefashiensu Bruno Many gene end sequences of known 3 'end or the like of the nopaline synthase gene are useful used in the present invention. However, preferred gene termination sequences are from the native enzyme gene or from the target species to be transformed.

【００６６】 本発明の遺伝子構築物はまた、植物細胞で有効な選択マーカーを含み、本発明
の構築物を含む形質転換細胞を検出することができる。公知のこの様なマーカー
は１つ以上の毒素に対する抵抗性を与える。このようなマーカーの一例は、通常
は適度な濃度で植物細胞に毒性のある抗生物質であるカナマイシンまたはハイグ
ロマイシンに対し、その発現により抵抗性が与えられるＮＰＴＩＩ遺伝子である
（ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、ワイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、Ａお
よびＨ編集、植物分子生物学の方法、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９８８）。従って、問題の抗生物質を含む培地
で生育させる能力により、形質転換細胞を同定することができる。または、形質
転換細胞中における所望の構築物の存在を、サザンおよびウエスタンブロット等
の公知の他の技術により測定することができる。The genetic construct of the present invention also contains a selectable marker effective in plant cells, and can detect transformed cells containing the construct of the present invention. Known such markers confer resistance to one or more toxins. One example of such a marker is the NPTII gene, whose expression confers resistance to the antibiotics kanamycin or hygromycin, which are normally toxic to plant cells at moderate concentrations (Rogers et al., Weissbach, A and H Editing, Methods of Plant Molecular Biology , Academic Press Inc.
, San Diego, CA, 1988). Thus, transformed cells can be identified by their ability to grow on media containing the antibiotic in question. Alternatively, the presence of the desired construct in the transformed cells can be measured by other known techniques such as Southern and Western blot.

【００６７】 被転写配列が転写開始部位を欠く場合、それが遺伝子構築物にさらに含まれる
。If the transcribed sequence lacks a transcription start site, it is further included in the gene construct.

【００６８】 本発明の遺伝子構築物の成分を結合して作用させる技術は公知であり、例えば
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより報告される（分子クローニング、実
験室マニュアル、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、ＮＹ、１９８９）ように１個以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成
リンカーの使用が含まれる。本発明の遺伝子構築物は、少なくとも一つの複製系
、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を有するベクターに結合し、それにより各操作
後に得られた構築物をクローン化、配列決定し、操作の正しさを決定することが
できる。[0068] Technical to act by binding to components of the genetic constructs of the invention are known, for example, reported by Sambrook (Sambrook) al (Molecular Cloning, actual
Laboratory Manual , CSHL Press: Cold Spring Harbor
r, NY, 1989) including the use of synthetic linkers containing one or more restriction endonuclease sites. The gene construct of the present invention is ligated into a vector having at least one replication system, for example E. coli , whereby the construct obtained after each operation is cloned, sequenced and the correctness of the operation is determined. can do.

【００６９】 本発明の遺伝子構築物を、単子葉類（例えば草、コーン、イネ、カラスムギ、
コムギおよびオオムギ）および双子葉類（例えばアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ）、タバコ、マメ、アルファルファ、カシ、ユーカリ、カエデ）、お
よび裸子植物（例えばスコットランドパイン；アロネン（Ａｒｏｎｅｎ）、Ｆｉ
ｎｎｉｓｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ．Ｐａｐｅｒｓ、Ｖｏｌ．５９５、１９９６
参照）、トウヒ（エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１
：８４−８９、１９９３年）およびカラマツ（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ ２７：２０１−２０７、１９９１）等の様々な植物の形
質転換に用いてもよい。好ましい実施態様では、本発明の遺伝子構築物が木材植
物を形質転換するのに用いられる。ここで木材植物とは、その幹が何年も生存し
、木質組織の追加により毎年直径が太くなる樹木または潅木と定義される。好ま
しくは、標的植物はユーカリおよびマツ種からなる群より選ばれ最も好ましくは ユーカリプトス グランディス およびパイノス ラディエータからなる群より選
ばれる。本発明のＤＮＡ構築物で形質転換されて有用である他の種には、パイノ
ス バンクシアナ（Ｐｉｎｕｓ ｂａｎｋｓｉａｎａ）、パイノス ブルイタ（ Ｐｉｎｕｓ ｂｒｕｉｔａ ）、パイノス カリバエア（Ｐｉｎｕｓ ｃａｒｉｂ
ａｅａ）、パイノス カラウサ（Ｐｉｎｕｓ ｃｌａｕｓａ）、パイノス コン
トルタ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、パイノス コウルテリ（Ｐｉｎｕｓ
ｃｏｕｌｔｅｒｉ）、パイノス エチナラ（Ｐｉｎｕｓ ｅｃｈｉｎａｒａ）
、パイノス エルダリカ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｄａｒｉｃａ）、パイノス エリオ
チ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉ）、パイノス ジェフレイ（Ｐｉｎｕｓ ｊｅ
ｆｆｒｅｙｉ）、パイノス ランベルチアナ（Ｐｉｎｕｓ ｌａｍｂｅｒｔｉａ
ｎａ）、パイノス モンチコラ（Ｐｉｎｕｓ ｍｏｎｔｉｃｏｌａ）、パイノス
ニグラ（Ｐｉｎｕｓ ｎｉｇｒａ）、パイノス パルストラス（Ｐｉｎｕｓ
ｐａｌｕｓｔｒｕｓ）、パイノス ピナスター（Ｐｉｎｕｓ ｐｉｎａｓｔｅｒ
）、パイノス ポンデロサ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、パイノス レ
シノサ（Ｐｉｎｕｓ ｒｅｓｉｎｏｓａ）、パイノス リジダ（Ｐｉｎｕｓ ｒ
ｉｇｉｄａ）、パイノス セロチナ（Ｐｉｎｕｓ ｓｅｒｏｔｉｎａ）、パイノ
ス ストロバス（Ｐｉｎｕｓ ｓｔｒｏｂｕｓ）、パイノス シルベストリス（ Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ）、パイノス タエダ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅ
ｄａ）、パイノス ビルギニアサ（Ｐｉｎｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）等のマ
ツ類；アビエス アマビリス（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ）、アビエス バ
ルサメア（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）、アビエス コンコラー（Ａｂｉｅ
ｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ）、アビエス グランディス（Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉ
ｓ）、アビエス ラシオカルパ（Ａｂｉｅｓ ｌａｓｉｏｃａｒｐａ）、アビエ
ス マグニフィカ（Ａｂｉｅｓ ｍａｇｎｉｆｉｃａ）、アビエス プロセラ（ Ａｂｉｅｓ ｐｒｏｃｅｒａ ）、カマエシパリス ラウソニオナ（Ｃｈａｍａｅ
ｃｙｐａｒｉｓ ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ）、カマエシパリス ノートカテンシス
（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）、カマエシパリス
チオイデス（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｔｈｙｏｉｄｅｓ）、フニペラス
ビルギニアナ（Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ラリックス
デシダス（Ｌａｒｉｘ ｄｅｃｉｄｕａ）、ラリックス ラリシア（Ｌａｒｉｘ
ｌａｒｉｃｉａ）、ラリックス レプトレピス（Ｌａｒｉｘ ｌｅｐｔｏｌｅ
ｐｉｓ）、ラリックス オクシデントリス（Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｕｃｉｄｅｎｔ
ａｌｉｓ）、ラリックス シベリカ（Ｌａｒｉｘ ｓｉｂｅｒｉｃａ）、リボセ
ドラス デクレンス（Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ ｄｅｃｕｒｒｅｎｓ）、ピセア
アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）、ピセア エンゲルマンニ（Ｐｉｃｅａ
ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ）、ピセア グラウサ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、ピ
セア マリアナ（Ｐｉｃｅａ ｍａｒｉａｎａ）、ピセア プンゲナス（Ｐｉｃ
ｅａ ｐｕｎｇｅｎｓ）、ピセア ルーベンス（Ｐｉｃｅａ ｒｕｂｅｎｓ）、 ピセア シッチェンシス （Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、シュードスタ
ッガ メンジエシ（Ｐｓｅｕｄｏｓｔｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、セクオイ
ア ギガンテア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｇｉｇａｎｔｅａ）、セクオイア センペル
ビレンス（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、タキシオディウム デ
ィスチカム（Ｔａｘｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、ツガ カナデンシス（ Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ ）、ツガ ヘテロフィラ（Ｔｓｕｇａ ｈｅ
ｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、ツガ メルテンシアナ（Ｔｓｕｇａ ｍｅｒｔｅｎｓ
ｉａｎａ）、ツジャ オシデンタリス（Ｔｈｕｊａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ
）、ツジャ プリカタ（Ｔｓｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）等の他の裸子植物；およ
びユーカリプトス アルバ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ａｌｂａ）、ユーカリプト
ス バンクロフチ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ）、ユーカリ
プトス ボチロイデス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ）、ユー
カリプトス ブリッジゲシアナ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｒｉｄｇｅｓｉａｎ
ａ）、ユーカリプトス カロフィラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｌｏｐｈｙｌ
ｌａ）、ユーカリプトス カマルドゥエンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｍ
ａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、ユーカリプトス シトリオドラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕ
ｓ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、ユーカリプトス カラドカリックス（Ｅｕｃａｌ
ｙｐｔｕｓ ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ）、ユーカリプトス コッシフェラ（Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｃｏｃｃｉｆｅｒａ）、ユーカリプトス クルチシ（Ｅｕｃａ
ｌｙｐｔｕｓ ｃｕｒｔｉｓｉｉ）、ユーカリプトス ダルリムプレアナ（Ｅｕ
ｃａｌｙｐｔｕｓ ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ）、ユーカリプトス デグルプタ
（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｇｌｕｐｔａ）、ユーカリプトス デラガテンシ
ス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ）、ユーカリプトス デ
ィバーシコラー（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ユーカ
リプトス ドゥンニ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ）、ユーカリプトス
フィシフォラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｆｉｃｉｆｏｌｉａ）、ユーカリプト
ス グロブラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリプトス
ゴンフォセフォラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ）、 ユーカリプトス グンニ （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｕｎｎｉｉ）、ユーカリプ
トス ヘンリー（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｈｅｎｒｙｉ）、ユーカリプトス ラ
エボピナエ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｌａｅｖｏｐｉｎｅａ）、ユーカリプトス
マカルツリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ）、ユーカリプ
トス マクロリンカ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ）、ユ
ーカリプトス マクラタ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｃｕｌａｔａ）、ユーカ
リプトス （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ）、ユーカリプトス
メガカルパ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍｅｇａｃａｒｐａ）、ユーカリプトス
メリオドラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ）、ユーカリプトス
ニコリー（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｃｈｏｌｉｉ）、ユーカリプトス ニ
テンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ）、ユーカリプトス ノバ−アン
グリカ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ）、ユーカリプトス
オブリキア（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕａ）、ユーカリプトス オ
ブツシフロラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ）、ユーカリプ
トス オレアデス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）、ユーカリプトス
パウシフロラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ）、ユーカリプ
トス ポリブラクティア（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ）、 ユーカリプトス レグナンス （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｇｎａｎｓ）、ユー
カリプトス レシニフェラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ）、 ユーカリプトス ロブスタ （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｏｂｕｓｔａ）、ユーカ
リプトス ルジス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｕｄｉｓ）、ユーカリプトス サ
リグナ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓａｌｉｇｎａ）、ユーカリプトス シデロキ
シロン（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ）、ユーカリプトス
スツアルチアナ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｔｕａｒｔｉａｎａ）、ユーカリプ
トス テルチコルニス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ）、 ユーカリプトス トレリアナ （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ）
、ユーカリプトス ウルニゲラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｎｉｇｅｒａ）、 ユーカリプトス ウロピラ （Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）、ユ
ーカリプトス ボミナリス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｖｏｍｉｎａｌｉｓ）、ユ
ーカリプトス ビリディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｖｉｒｉｄｉｓ）、ユーカ
リプトス ワンド（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｗａｎｄｏ）およびユーカリプトス
ヨウマンニ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｙｏｕｍａｎｎｉ）等のユーカリが上記
種のハイブリッドと共に含まれるが、それに限定されない。[0069] The genetic constructs of the present invention can be used in monocotyledons (eg, grass, corn, rice, oat,
Wheat and barley) and dicotyledons (eg,Arabidopsis(Arabid
opsis), Cigarettes, beans, alfalfa, oak, eucalyptus, maple),
And gymnosperms (eg, Scottish pine; Aronen)Fi
nnish Forest Res. PapersVol. 595, 1996
See, spruce (Ellis et al.,Biotechnology 11
: 84-89, 1993) and Larch (Huang et al.).In
Vitro Cell 27: 201-207, 1991)
It may be used for quality conversion. In a preferred embodiment, the genetic construct of the present invention is
Used to transform the product. Here, a wood plant is a tree whose stem has survived for many years.
, Defined as trees or shrubs that increase in diameter each year due to the addition of woody tissue. Like
Alternatively, the target plant is selected from the group consisting of eucalyptus and pine species, most preferably Eucalyptus grandis andPinos radiatorSelected from the group consisting of
Devour. Other species that are usefully transformed with the DNA constructs of the present invention include:Paino
Su Bankciana(Pinus banksia),Pinos Bruita( Pinus bruita ),Pinos Karibaea(Pinus carib
aea),Pinos Carousa(Pinus clausa),Pinos Con
Torta(Pinus control),Pinos Kourteli(Pinus
coulteri),Pinos Echinara(Pinus echinara)
,Pinos Eldarica(Pinus eldarica),Pinos Elio
H(Pinus ellioti),Pinos Jeffrey(Pinus je
ffreyi),Pinos Lambertian(Pinus lambertia
na),Pinos monticola(Pinus monticola),Pinos
Nigra(Pinus nigra),Pinos pulse truss(Pinus
palustrus),Pinos Pinaster(Pinus pinaster
),Pinos Ponderosa(Pinus ponderosa),Pinos Les
Shinosa(Pinus resinosa),Pinos Rigida(Pinus r
igida),Pinos Serotona(Pinus serotina),Paino
Sustrobus(Pinus strobus),Pinos Silvestris( Pinus sylvestris ),Pinos Taeda(Pinus tae
da),Pinos Birginiasa(Pinus virginiana) Etc.
Species;Abies Amabilis(Abies amabilis),Abies Ba
Lusamea(Abies balsamea),Abies Concorr(Abie
s concolor),Avies Grandis(Abies grandi
s),Avies Laciocarpa(Abies lasiocarpa),Avier
Su Magnifica(Abies magnifica),Avies Procera( Abies processera ),Kamaeciparis lausoniona(Chamae
cyparis lawsoniona),Kamaesiparis Note Cathensis
(Chamaecyparis notokatensis),Kamaeciparis
Thioides(Chamaecyparis thyoides),Juniperus
Bil Guiana(Huniperus virginiana),Larix
Decidas(Larix decade),Larix Laricia(Larix
laricia),Larix Leptorepis(Larix leptole
pis),Larix Occidentris(Larix occudent
alis),Larix Siberica(Larix siberica),Ribose
Doras Declenth(Libosedrus decurrens),Pisea
Abies(Picea abies),Pisea Engelmanni(Picea
engelmanni),Pisea Grausa(Picea glauca),Pi
Sea Mariana(Picea mariana),Pisea Pungenas(Pic
ea pungens),Pisea Rubens(Picea rubens), Pisea Sitchensis (Picea sitchensis),Pseudosta
Ggga menziesi(Pseudostuga menziesii),Secoy
A Gigantea(Sequoia gigantea),Sequoia Sempel
Vilens(Sequoia sempervirens,Taxiodium de
Isticum(Taxodium distichum),Tsuga Canadensis( Tsuga canadensis ),Tsuga heterophylla(Tsuga he
terophylla),Tsuga Mertensiana(Tsuga mertens
iana),Tsuja Occidentalis(Thuja accidentalis
),Tsuja Prikata(Tsuja Plicata)) And other gymnosperms; and
AndEucalyptus Aruba(Eucalyptus alba),Eucalyptus
Su Bancroft(Eucalyptus bancroftii),eucalyptus
Putos botiloides(Eucalyptus botyroides),You
Calyptos Bridge Gesiana(Eucalyptus bridgegesian
a),Eucalyptus calophila(Eucalyptus calophyl
la),Eucalyptus Camarduensis(Eucalyptus cam
aldulensis),Eucalyptus citriodora(Eucalyptu
s citridora),Eucalyptus Caladocalix(Eucal
yptus cladocalyx),Eucalyptus cosifera(Euc
alyptus coccifera),Eucalyptus Kurtish(Euca
liptus curtisii),Eucalyptus Dallim Preana(Eu
calyptus dallrympleana),Eucalyptus degrupta
(Eucalyptus degrupta),Eucalyptos de lagatensi
S(Eucalyptus delagensis),Eucalyptus de
Iversicolar(Eucalyptus diversity),Yuka
Liptos Dunni(Eucalyptus dunnii),Eucalyptus
Fisifola(Eucalyptus ficifolia),Eucalyptus
Sglobras(Eucalyptus globulus),Eucalyptus
Gonfosefola(Eucalyptus gomphocephala), Eucalyptus Gunni (Eucalyptus gunnii),Eucalyptus
Toss Henry(Eucalyptus henryi),Eucalyptus la
Ebopinae(Eucalyptus laevopinea),Eucalyptus
Makartsuri(Eucalyptus macarthurii),Eucalyptus
Toss Macrolinka(Eucalyptus macrohyncha),You
-Calyptos Macrata(Eucalyptus maculata),Yuka
Liptos(Eucalyptus marginata),Eucalyptus
Mega Calpa(Eucalyptus megacarpa),Eucalyptus
Meliodora(Eucalyptus melliodora),Eucalyptus
Nicolie(Eucalyptus nicholii),Eucalyptus
Tense(Eucalyptus nitrens),Eucalyptus Nova Ann
Glica(Eucalyptus nova-anglica),Eucalyptus
Obrikia(Eucalyptus obliqua),Eucalyptus
Bussiflora(Eucalyptus obtusiflora),Eucalyptus
Toss Oleades(Eucalyptus orades),Eucalyptus
Pausiflora(Eucalyptus pauciflora),Eucalyptus
Toss Polybractia(Eucalyptus polybractea), Eucalyptus Regnance (Eucalyptus regnans),You
Calyptos Resinifera(Eucalyptus resinifera), Eucalyptus Robusta (Eucalyptus robusta),Yuka
Liptos Lugis(Eucalyptus rudis),Eucalyptus
Ligna(Eucalyptus salina),Eucalyptus sideroki
Shillong(Eucalyptus sideroxylon),Eucalyptus
Stuartiana(Eucalyptus sturtiana),Eucalyptus
Toss Telco Cornis(Eucalyptus terecicornis), Eucalyptus toleriana (Eucalyptus torelliana)
,Eucalyptus Urnigella(Eucalyptus urnigera), Eucalyptus Uropira (Eucalyptus urophylla),You
-Calyptos bominaris(Eucalyptus vominalis),You
-Calyptos Viridis(Eucalyptus viridis),Yuka
Liptos Wand(Eucalyptus wando)andEucalyptus
Youmanni(Eucalyptus youumani) Is the above eucalyptus
Included with, but not limited to, species hybrids.

【００７０】 上記に述べた様に、本発明の遺伝子構築物で植物を形質変換することにより、
植物中で多糖合成が変化する結果となる。例えば、センス配向の酵素ＣＥＬをコ
ード化する読み取り枠を含んでなる遺伝子構築物を導入することにより、植物中
でセルロース生産が増加する。同様に、アンチセンス配向のＣＥＬをコード化す
る読み取り枠、あるいはＣＥＬ遺伝子の非コード（非翻訳）領域遺伝子いずれか
を含んでなる遺伝子構築物で植物を形質転換することにより、形質転換植物のセ
ルロース含有量が減少する結果となる。As mentioned above, by transforming plants with the genetic constructs of the present invention,
This results in altered polysaccharide synthesis in the plant. For example, introduction of a gene construct comprising an open reading frame encoding the sense orientation enzyme CEL increases cellulose production in plants. Similarly, by transforming a plant with a gene construct comprising either an open reading frame encoding CEL in the antisense orientation, or a non-coding (untranslated) region gene of the CEL gene, the transformed plant is treated with cellulose. The result is a reduced volume.

【００７１】 標的植物のゲノム中へ遺伝子構築物を安定して組み込む技術は公知であり、ア
グロバクテリウム ツメファシエンス媒介導入、エレクトロポーレーション、プ
ロトプラスト融合、生殖器官中への注入、未成熟胚芽中への注入、高速プロジェ
クタイル導入等が含まれる。技術の選択は被形質転換標的植物に依存する。例え
ば、双子葉植物、およびある種の単子葉植物および裸子植物は、例えばベバン（
Ｂｅｖａｎ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１２：８７１１−８７２
１、１９８４）により報告されている様にアグロバクテリウム Ｔｉプラスミド
技術により形質転換される。本発明の遺伝子構築物導入の標的には葉組織等の組
織、播種細胞、プロトプラスト、種子、胚芽、***領域、子葉、胚軸等が含まれ
る。ユーカリおよびマツを形質転換する好ましい方法は花粉（例えばアロネン（
Ａｒｏｎｅｎ）、Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓ．Ｐａｐｅｒｓ、５９
５：５３、１９９６参照）または容易に再生し得る胚芽組織を用いる生物的方法
である。[0071] The techniques incorporated by stabilizing the gene construct into the genome of the target plant are known, A
Includes G. tumefaciens- mediated transfer, electroporation, protoplast fusion, injection into reproductive organs, injection into immature embryos, high-speed projectile transfer, and the like. The choice of technique will depend on the target plant to be transformed. For example, dicotyledonous plants, and certain monocotyledonous and gymnosperm plants, for example, bevan (
Bevan) ( Nucleic Acid Res ., 12: 8711-872).
1, 1984) by Agrobacterium Ti plasmid technology. Targets for introducing the gene construct of the present invention include tissues such as leaf tissues, seeded cells, protoplasts, seeds, germs, division areas, cotyledons, hypocotyls, and the like. A preferred method of transforming eucalyptus and pine is pollen (eg, Aronene (
Aronen), Finnish Forest Res. Papers , 59
5:53, 1996) or an easily regenerated germ tissue.

【００７２】 細胞が形質転換されると、ゲノム内に組み込まれた本発明の遺伝子構築物を有
する細胞を上記のカナマイシン耐性マーカ等のマーカーを用いて選び出すことが
できる。次いで形質転換細胞を適当な培地で培養し、公知の方法を用いて完全な
植物とする。プロトプラストの場合は、適当な浸透圧条件で細胞壁を再生させる
。種子または胚芽の場合は、適当な発芽またはカルス開始培地を用いる。例えば
、適当な再生培地が用いられる。植物の再生は多くの種で十分に確立されている
。森林樹木の再生に関しては、トロペ ＴＡ（Ｔｈｒｏｐｅ ＴＡ）編集、植物
のインビトロ胚芽再生（農業における現在の植物科学およびバイオテクノロジー
）Ｖｏ．２０、第１２章、ｐｐ４７１−５４０、１９９５年中のダンスタン（Ｄ
ｕｎｓｔａｎ）ら、「木材植物における体性胚芽形成」参照。ハリモミ再生のた
めの特別なプロトコールはロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）らにより議論されている
（レーデンバウ Ｋ（Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ Ｋ）ら、Ｓｙｎｓｅｅｄ：穀物改
良のための合成種子の応用、第２３章、ｐｐ４２７−４４９、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ：［ｎ．ｐ．］、１９９３年中の「トウヒの体性胚芽形成」参照）。得られた
形質転換植物を公知の方法で有性または無性で再生し、形質転換植物の子孫を得
ることができる。Once the cells have been transformed, cells having the gene construct of the present invention integrated into the genome can be selected using a marker such as the kanamycin resistance marker described above. Next, the transformed cells are cultured in an appropriate medium to obtain a complete plant using a known method. In the case of protoplasts, the cell wall is regenerated under appropriate osmotic conditions. For seeds or germs, use an appropriate germination or callus initiation medium. For example, an appropriate regeneration medium is used. Plant regeneration is well established in many species. Regarding the regeneration of forest trees, edit Tropé TA (Trope TA), plant
In vitro embryo regeneration (current plant science and biotechnology in agriculture) Vo. 20, Chapter 12, pp 471-540, Dunstan in 1995 (D
unstan) et al., "Somatic embryogenesis in woody plants". A specific protocol for rehabilitation is discussed by Roberts et al. (Redenbaugh K. et al., Syntheed: Grain Modification ).
Application of Synthetic Seeds for Goodness, Chapter 23, pp. 427-449, CRC Pres
s: [n. p. ], 1993, "Somatic Embryogenesis of Spruce"). The resulting transformed plant can be regenerated sexually or asexually by a known method to obtain progeny of the transformed plant.

【００７３】 上記で議論した様に、標的植物細胞におけるＲＮＡの生成をプロモーター配列
、または標的植物ホストのゲノム中に組み込まれたポリヌクレオチドの機能性コ
ピーまたは組み込み部位の数を選択して制御することができる。標的植物を１個
以上の本発明の遺伝子構築物で形質転換し、１個以上の細胞壁多糖酵素の活性を
調節し、１個以上の組織中の酵素活性に影響を与えるか、１回以上の発現時おけ
る酵素活性に影響を与えることが可能である。同様に、遺伝子構築物を組み込ん
で、本発明のポリヌクレオチドでコード化されるポリペプチドをコードする１個
以上の読み取り枠、またはこの様なポリペプチドをコード化する遺伝子の１個以
上の非コード領域を含ませることができる。本発明のポリヌクレオチドを、細胞
壁多糖合成に関与するポリペプチドをコード化する他の既知の配列と組み合せて
用いることもできる。この様にして、非木材植物中の細胞壁多糖の生合成経路を
修飾し、新しいタイプの木材植物を作製することができる。As discussed above, controlling the production of RNA in a target plant cell by selecting a promoter sequence, or the number of functional copies or integration sites of a polynucleotide integrated into the genome of the target plant host. Can be. A target plant is transformed with one or more gene constructs of the invention to modulate the activity of one or more cell wall polysaccharide enzymes and to affect the activity of the enzyme in one or more tissues or to express one or more times. It is possible to influence the enzymatic activity over time. Similarly, one or more open reading frames encoding a polypeptide encoded by a polynucleotide of the present invention, or one or more non-coding regions of a gene encoding such a polypeptide, incorporating a genetic construct. Can be included. The polynucleotides of the present invention can also be used in combination with other known sequences encoding polypeptides involved in cell wall polysaccharide synthesis. In this way, a new type of wood plant can be produced by modifying the biosynthetic pathway of cell wall polysaccharides in non-wood plants.

【００７４】 以下の例は説明のため提供されるものであり、本発明を限定するものではない
。The following examples are offered by way of illustration and not limitation of the invention.

【００７５】 例１ ユーカリプトス グランディスからｃＤＮＡクローンの単離と特徴づけ ユーカリプトス グランディス ｃＤＮＡ発現ライブラリー（花、葉、篩部、
根、種子、芽および木部を含む様々な組織由来）を構築し以下の様にスクリーニ
ングした。 Example 1 Isolation and characterization of a cDNA clone from Eucalyptos grandis Eucalyptos grandis cDNA expression library (flower, leaf,
(Derived from various tissues including roots, seeds, buds and xylem) and screened as follows.

【００７６】 チャン（Ｃｈａｎｇ）らのプロトコール（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １１：１１３−１１６、１９９３）を若干
変更した方法を用いて植物組織からｍＲＮＡを抽出した。特に、試料をＣＰＣ−
ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．０；２５ｍＭ ＥＤＴＡ
；２．０Ｍ ＮａＣｌ；２％ＣＴＡＢ；２％ ＰＶＰおよび０．０５％Ｓｐｅｒ
ｍｉｄｉｎｅ^*３ＨＣｌ）に溶解し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）で抽出した。ｍＲＮＡをエタノールで沈殿させ、ＲＮＡ調製物全体をＰ
ｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて精製した。メーカーのプロトコールに従って、ｃＤＮ
Ａ発現ライブラリーを精製ｍＲＮＡから逆転写酵素合成により構築し、続いて得
られたｃＤＮＡクローンをＺＡＰ発現ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）を用いてＬａｍｄａ ＺＡＰ中に挿入した。得られたｃＤＮＡをＧｉｇａｐ
ａｃｋ ＩＩパッケージ抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、５μｌ連結混
合物由来の試料ＤＮＡ １μｌを用いてパッケージした。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｍ
ＲＦ細胞およびＸＬＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、Ｅｘ−Ａｓｓ
ｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によりライブラリーのマス切
開を行った。切開したファージミドをＮＺＹブロス（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で希釈し、Ｘ−ｇａｌとイソプロピオチオ−β−
ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上に散布した
。The protocol of Chang et al. ( Plant Molecular)
Biology Reporter 11: 113-116, 1993) was used to extract mRNA from plant tissues using a slightly modified method. In particular, the sample was CPC-
RNAXB (100 mM Tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA
2.0 M NaCl; 2% CTAB; 2% PVP and 0.05% Sper;
medium ^* 3HCl) and chloroform: isoamyl alcohol (2
4: 1). The mRNA is precipitated with ethanol and the entire RNA preparation is
oly (A) Quik mRNA isolation kit (Stratagene, LaJ
Olla, CA). CDN according to the manufacturer's protocol
A expression library was constructed from purified mRNA by reverse transcriptase synthesis, and the resulting cDNA clones were subsequently cloned into a ZAP expression cDNA synthesis kit (Stratagen).
Inserted into Lamda ZAP using e). Gigap
Ack II package extract (Stratagene) was used and packaged with 1 μl of sample DNA from the 5 μl ligation mixture. XL1-Blue M
Ex-Ass using RF cells and XLOLR cells (Stratagene)
Mass excision of the library was performed with ist helper phage (Stratagene). The dissected phagemid was used for NZY broth (Gibco BRL, Ga
diluted with X-gal and isopropiothio-β-
Sprayed on LB-kanamycin agar plates containing galactoside (IPTG).

【００７７】 ＤＮＡミニプレップ用にプレートし選び出したコロニー中、９９％は配列決定
に適した挿入体を含んでいた。陽性コロニーをカナマイシンを含むＮＸＹブロス
中で培養し、ｃＤＮＡをアルカリ分解とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿
で精製した。１％アガロースゲルを染色体汚染用の配列決定テンプレートをスク
リーニングするために用いた。Ｔｕｒｂｏ Ｃａｔａｌｙｓｔ８００装置（Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いてメーカーのプロトコールに従い
染料プライマー配列を調製した。Of the colonies plated and selected for DNA miniprep, 99% contained inserts suitable for sequencing. Positive colonies were cultured in NXY broth containing kanamycin and cDNA was purified by alkaline digestion and polyethylene glycol (PEG) precipitation. A 1% agarose gel was used to screen sequencing templates for chromosome contamination. Turbo Catalyst800 device (Pe
rkin Elmer / Applied Biosystems Divisi
on, Foster City, Calif.) according to the manufacturer's protocol.

【００７８】 陽性クローン用のＤＮＡ配列をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｐｒｉｓｍ３３７シーケンサーを用
いて得た。最初に５’末端、ある場合には３’末端からも、ｃＤＮＡクローンの
配列決定を行った。あるクローンでは、サブクローン断片を用いて内部配列が得
られた。サブクローニングを制限マッピングの標準法を用い、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ベクターにサブクローンして行った。The DNA sequence for the positive clone was obtained from Perkin Elmer / Applied
Obtained using a Biosystems Division Prism 337 sequencer. First, cDNA clones were sequenced from the 5 'end, and in some cases also from the 3' end. In some clones, internal sequences were obtained using subclone fragments. Subcloning was performed using the standard method of restriction mapping, pBluescript.
This was performed by subcloning into the ipt II SK + vector.

【００７９】 決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号：２、３、６、７、９、１２−１５、１８
、１９、２１、２３、２６、２８、２９、５７、５８、６０−６６、７１−７３
、７８、７９、１０５、１０７、１１９−１２８、１３９、１４１、１４２、１
４９−１６１、１８６−１９５、１９７、１９８、２０５−２３３、２５２−２
５６、２６４、２７３−２９３、３１９−３３０、３６６、３７３−３７７、３
８２−３８５、３９０−３９３、３９９−４３４、４７９−５０３、５０７−５
１２、５２２−５２８、５３１−５４７、５５２−５５４、５５６−５７３、５
８７−５８９、５９２−６１２および６１２−７７１で提供される。The determined cDNA sequences are shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 6, 7, 9, 12-15, and 18.
, 19, 21, 23, 26, 28, 29, 57, 58, 60-66, 71-73
, 78, 79, 105, 107, 119-128, 139, 141, 142, 1
49-161, 186-195, 197, 198, 205-233, 252-2
56, 264, 273-293, 319-330, 366, 373-377, 3
82-385, 390-393, 399-434, 479-503, 507-5
12, 522-528, 531-547, 552-554, 556-573,5
87-589, 592-612 and 612-771.

【００８０】 例２ パイノス ラディエータ由来のｃＤＮＡクローンの単離と特徴づけ 高スループットスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離 パイノス ラディエータ ｃＤＮＡ発現ライブラリー（培養細胞、***組織束
、篩部、花粉嚢、根、実生、芽、円錐体および木部を含む様々な組織由来）を構
築し、上記例１の通りスクリーニングした。陽性クローンのＤＮＡ配列を前方お
よび逆転プライマーを用いてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｐｒｉｓｍ ３７７シーケンサー上で得
た。決定されたｃＤＮＡ配列は配列番号：１、４、５、８、１０、１１、１６、
１７、２０、２２、２４、２５、２７、５９、６７−７０、７４−７７、８０、
１０９−１１３、１４０、１４３、１６２−１８５、１９６、１９９−２０４、
２３４−２５１、２５７−２６３、２６５−２７２、２９４−３１８、３３１−
３６５、３６７−３７２、３７８−３８２、３８６−３８９、３９４−３９８、
４３５−４８１、５０４−５０６、５１３−５２１、５２９、５３０、５４８−
５５１、５５５、５７４−５８６、５９０、５９１、６１３−６２０および７７
２−９０８で提供される。[0080] Example 2 Painosu Radieta isolated Painosu Radieta cDNA expression library of cDNA clones by isolation and characterization high-throughput screening of cDNA from clone (cultured cells, meristems bundle, phloem, pollen sacs, roots, seedlings, From various tissues including buds, cones and xylem) and screened as in Example 1 above. The DNA sequence of the positive clone was analyzed using Perkin Elmer / Applied Bi using forward and reverse primers.
Obtained on an osystems Division Prism 377 sequencer. The determined cDNA sequence has SEQ ID NO: 1, 4, 5, 8, 10, 11, 16,
17, 20, 22, 24, 25, 27, 59, 67-70, 74-77, 80,
109-113, 140, 143, 162-185, 196, 199-204,
234-251, 257-263, 265-272, 294-318, 331-
365, 365-372, 378-382, 386-389, 394-398,
435-481, 504-506, 513-521, 529, 530, 548-
551, 555, 574-586, 590, 591, 613-620 and 77
2-908.

【００８１】 例３ ポリヌクレオチドおよびアミノ酸分析 上記の決定されたｃＤＮＡ配列をＥＭＢＬデータベース（１９９９年５月更新
）中の既知の配列と比較し整列させた。特に、配列番号：１−２９、５７−８０
、１０５、１０７、１０９−１１１、１１５−１２５、１３５−１３９および１
４５−９０４で同定されるポリヌクレオチドを、以下の実行パラメータに設定さ
れたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）
を用いてＥＭＢＬデータベース中のポリヌクレオチドと比較した：Ｕｎｉｘ実行
コマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ−ｐ ｂｌａｓｔｎ−ｄ ｅｍｂｌｄｂ−ｅ１０−
ＧＯ−Ｅ０−ｒｌ−ｖ３０−ｂ３０−ｉ ｑｕｅｒｙｓｅｑ−ｏｒｅｓｕｌｔｓ
。重複配列の複数の整列を信頼できるコンセンサス配列を構築するために用いた
。他の植物または非植物種由来の既知の配列に対する類似性に基づいて、配列番
号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−１１３、１１９−１２９
、１３９−１４３および１４９−９０８として同定された本発明の単離ポリヌク
レオチドを上記表１に示す酵素をコード化するものとして同定した。 Example 3 Polynucleotide and Amino Acid Analysis The above determined cDNA sequences were compared and aligned with known sequences in the EMBL database (updated May 1999). In particular, SEQ ID NOs: 1-29, 57-80
, 105, 107, 109-111, 115-125, 135-139 and 1
45-904, using the BLASTN algorithm version 2.0.6 (September 16, 1998) set to the following running parameters:
Compared to the polynucleotides in the EMBL database using: Unix execution command: blastall-p blastn-d embldb-e10-
GO-E0-rl-v30-b30-i queryseq-results
. Multiple alignments of overlapping sequences were used to construct reliable consensus sequences. Based on similarities to known sequences from other plant or non-plant species, SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-113, 119-129
139-143 and 149-908 were identified as encoding the enzymes shown in Table 1 above.

【００８２】 配列番号５８、６０、６２、６４、６５、６７−７０、７２、７４、７５、７
７、７８、８０、１０５、１０７、１１９−１２１、１２３−１２８および１３
９−１４３のｃＤＮＡ配列を、上記のコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮ
を用いてＥＭＢＬデーターベース中の配列に対し４０％未満の同一性を有すると
決定した。配列番号：５７、５９、６６、７９および１２２のｃＤＮＡ配列を、
上記のＢＬＡＳＴＮを用いてＥＭＢＬデーターベース中の配列に対し６０％未満
の同一性を有すると決定した。配列番号６１、７１、７３および７６のｃＤＮＡ
配列を、上記のＢＬＡＳＴＮを用いてＥＭＢＬデーターベース中の配列に対し７
５％未満の同一性を有すると決定した。配列番号６３のｃＤＮＡ配列を、上記の
ＢＬＡＳＴＮを用いてＥＭＢＬデーターベース中の配列に対し９０％未満の同一
性を有すると決定した。SEQ ID NOs: 58, 60, 62, 64, 65, 67-70, 72, 74, 75, 7
7, 78, 80, 105, 107, 119-121, 123-128 and 13
The cDNA sequence of 9-143 was converted to the computer algorithm BLASTN described above.
Was determined to have less than 40% identity to sequences in the EMBL database. The cDNA sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 66, 79 and 122 are
It was determined to have less than 60% identity to sequences in the EMBL database using BLASTN as described above. CDNA of SEQ ID NOs: 61, 71, 73 and 76
Sequences were compared to sequences in the EMBL database using BLASTN as described above.
It was determined to have less than 5% identity. The cDNA sequence of SEQ ID NO: 63 was determined to have less than 90% identity to the sequence in the EMBL database using BLASTN as described above.

【００８３】 例４ セルロース生合成遺伝子の機能の同定 ユーカリプトス グランディス由来のＵＰＧ（配列番号：２３）およびＳＵＳ
（配列番号：４９）、およびパイノス ラディエータ由来のＵＧＰ（配列番号：
２４）に対するコード領域を含む配列を含むセンス構築物を発現ベクターｐＥＴ
１６ｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）中に挿入した。得られた構築物を大腸菌 ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（
Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ）中に形質転換し、ＩＰＴＧの添加により組み替えタンパク
質を生産するように誘導した。Ｎｉ²⁺カラムクロマトグラフィー（ヤンクネヘト
（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ
、８８：８９７２−８９７６、１９９１）を用いて精製タンパク質が得られた。
精製タンパク質それぞれに対する酵素分析により、試験した遺伝子に対する予期
した基質特異性と酵素活性が示された。 Example 4 Identification of the Function of Cellulose Biosynthesis Gene UPG from Eucalyptus grandis (SEQ ID NO: 23) and SUS
(SEQ ID NO: 49), and UGP from Pinos radiator (SEQ ID NO:
24) a sense construct comprising the sequence containing the coding region for the expression vector pET
16b (Clontech Laboratories Inc., Palo
Alto, CA). The resulting construct was transformed into E. coli XL1-Blue (
(Stratgene) and induced to produce the recombinant protein by the addition of IPTG. Ni ²⁺ column chromatography (Janknecht et al ., Proc. Natl. Acad. Sci., USA
, 88: 8972-8976, 1991).
Enzyme analysis on each of the purified proteins showed the expected substrate specificity and enzymatic activity for the genes tested.

【００８４】 ＵＧＰに対する酵素アッセイを、公開された方法（ペン（Ｐｅｎｇ）およびチ
ャン（Ｃｈａｎｇ）、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３２９［１、２］：１５３−１５
８、１９９３）を用いて行った。表２に示すデータは、カツベ（Ｋａｔｓｕｂｅ
）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３０：８５４６−８５５１、１９９１）およびナカノ
（Ｎａｋａｎｏ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：５２８−５３２、１９８９
）によるデータと比較して発現タンパク質に対する酵素活性を示した。Enzyme assays for UGP were performed using published methods (Peng and Chang, FEBS Lett ., 329 [1,2]: 153-15).
8, 1993). The data shown in Table 2 was obtained from Katsube
( Biochem ., 30: 8546-8551, 1991) and Nakano et al. ( J. Biochem. 106: 528-532, 1989).
) Shows the enzymatic activity on the expressed protein in comparison with the data according to the above.

【００８５】[0085]

【表５】 [Table 5]

【００８６】 ＳＵＳ（スクロースシンターゼ）に対する酵素分析をセブコワ（Ｓｅｂｋｏｖ
ａ）らの方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０８：７５−８３、１９９５
）を用いて行った。表３に示すデータは発現タンパク質の酵素活性を示す。Ｅ．
グランディスのＫ_M ^{スクロース}をデルマー（Ｄｅｌｍｅｒ、Ｄ．Ｐ．、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４７：３８２２−３８２８、１９７２）およびナカイら（
Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ、ＢｉｏＳｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、
６１：１５００−１５０３）により報告されたデータと比較した。[0086] Enzyme analysis for SUS (sucrose synthase) was performed using Sebkov
a) et al. (Plant Physiol., 108: 75-83, 1995).
). The data shown in Table 3 shows the enzymatic activity of the expressed protein. E. FIG.
The K _M ^sucrose grandis Delmar (Delmer, D.P., J.Bi
ol. Chem. , 247: 3822-3828, 1972) and Nakai et al. (
Nakai et al, BioSci. Biotech, Biochem. ,
61: 1500-1503).

【００８７】[0087]

【表６】 [Table 6]

【００８８】 ユーカリプトス グランディス由来のセルロースシンターゼ（ＳＥＬ；配列番
号：５０）に対するコード領域配列を含むセンス構築物をタンパク質発現ベクタ
ーｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に挿入し
た。得られた構築物を哺乳動物２９３Ｔ細胞（ドブリッジＲＢ（ＤｕＢｒｉｄｇ
ｅ ＲＢ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７［１］：３７９−３８７、１
９８７）に形質移入し、組み替えタンパク質をＩＰＴＧを添加して誘導した。タ
ンパク質を膜から可溶化し、ＣＥＬ活性レベルをクドリッカ Ｋ（Ｋｕｄｌｉｃ
ｋａ Ｋ）およびブラウン ＰＭ Ｊｒ（Ｂｒｏｗｎ ＰＭ Ｊｒ．）の報告通
りに測定した（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．、１１５：６４３−６５６、１９９７）
。活性の陽性対照として、天然のＣＥＬ酵素をムングビーン（ビグナ ラディア
タ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ））植物から可溶化した。Ｖ．ラディアタのＣ
ＥＬ活性の測定されたレベルを図１に示す。ユーカリプトス ＣＥＬ発現クロー
ンで形質移入した哺乳動物２９３Ｔ細胞で見出されたＣＥＬ活性レベルは、Ｖ．
ラディアタから得られたものと類似していることが見出された（図２）。ＣＥＬ
活性は非形質移入対照２９３Ｔ細胞では見られなかった。A sense construct containing the coding region sequence for cellulose synthase from Eucalyptus grandis (SEL; SEQ ID NO: 50) was inserted into the protein expression vector pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA). The resulting construct was transformed into mammalian 293T cells (Dubridge RB).
e RB) et al . , Mol. Cell. Biol . , 7 [1]: 379-387, 1
987), and the recombinant protein was induced by adding IPTG. The protein is solubilized from the membrane and the level of CEL activity is reduced by Kudlica K (Kudlic K).
ka K) and Brown PM Jr. ( Plant Phys ., 115: 643-656, 1997).
. As a positive control for activity, natural CEL enzyme was added to Mung Bean ( Vigna Radia).
It was solubilized from the other (Vigna radiata)) plant. V. Radiata C
The measured levels of EL activity are shown in FIG. Eucalyptol scan CEL activity level found in mammalian 293T cells transfected with CEL expression clone, V.
It was found to be similar to that obtained from Radiata (FIG. 2). CEL
No activity was seen in untransfected control 293T cells.

【００８９】 例５ 多糖生合成を変化させるセルロースシンセターゼ（ＣＥＬ）遺伝子の利用 タバコ植物のパイノス ラディエータ ＣＥＬ遺伝子による形質転換は以下の
様に行われた。パイノス ラディエータ由来のＣＥＬのコード領域（配列番号：
８）を含むポリヌクレオチドを含むセンスおよびアンチセンス構築物を含んでな
る遺伝子構築物が構築され、公開された方法（アン Ｇ（Ａｎ Ｇ）、エバート
ＰＲ（Ｅｂｅｒｔ ＰＲ）、ミトラ Ａ（Ｍｉｔｒａ Ａ）、ハ ＳＢ（Ｈａ
ＳＢ）、「バイナリーベクター」、ゲルビン ＳＢ（Ｇｅｌｖｉｎ ＳＢ）お
よびシルペルート ＲＡ（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ ＲＡ）編集、Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８）を用いて直
接形質転換によりアグロバクテリウム ツメファシエンス中に挿入された。セン
スポリヌクレオチドの構築物はｐＡＲＴ７プラスミド中に挿入されたＰＫＢ−Ｃ
ＭＶプラスミドｃＤＭＡをクローンニングし、続いてｐＡＲＴ７ベクター由来の Ｎｏｔ Ｉ消化３５Ｓ−Ｉｎｓｅｒｔ−ＯＣＳ ３’−ＵＴＲ断片をｐＡＲＴ２７
植物発現ベクター中にクローニングして作製された（クリーブ Ａ（Ｃｌｅａｖ
ｅ Ａ）「クローンＤＮＡの植物遺伝子中への有効な組み込みを導くＴ−ＤＮＡ
組織化構造を有する多用途バイナリーベクター」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：１２０３−１２０７、１９９２）。形質転換構築
物の存在と完全性は、制限消化とＤＮＡ配列決定により証明された。[0089]Example 5 Use of cellulose synthetase (CEL) gene to alter polysaccharide biosynthesis Tobacco plantPinos radiator Transformation by CEL gene is as follows
It was done like that.Pinos radiatorCoding region of CEL (SEQ ID NO:
8) does not include sense and antisense constructs comprising the polynucleotide comprising
Gene constructs have been constructed and published (Ann G, Evert
 PR (Ebert PR), Mitra A (Mitra A), C SB (Ha
 SB), "binary vector", Gelvin SB (Gelvin SB)
And Sylperroot RA editing,Plant
Molecular Biology Manual, Kluwer Acad
e.m. Publishers: Dordrecht, 1988).
By transfectionAgrobacterium tumefaciensInserted inside. Sen
The construction of the polynucleotide is based on the PKB-C inserted into the pART7 plasmid.
The MV plasmid cDMA was cloned and subsequently derived from the pART7 vector. Not The digested 35S-Insert-OCS 3'-UTR fragment was digested with pART27.
It was prepared by cloning into a plant expression vector (Cleav A (Cleav A).
e A) "T-DNA leading to efficient integration of cloned DNA into plant genes"
Versatile binary vector with organized structure ",Plant Molecul
ar Biology 20: 1203-1207, 1992). Transformation construction
The presence and integrity of the product was verified by restriction digestion and DNA sequencing.

【００９０】 タバコ（ニコチアナ タバカム ｃｖ．サンサム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａ
ｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ））葉の切片を、ホルシュ（Ｈｏｒｓｈ）らの
方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１、１９８５）を用いてセン
スおよびアンチセンスＣＥＬ構築物で形質転換する。適当なＣＥＬ構築物を含む
形質転換植物はサザンブロット実験で確認される。形質転換植物中でのパイノス
ＣＥＬの発現は、ＣＥＬセンスおよびアンチセンス構築物で作られた独立の形
質転換植物ライン由来の全ＲＮＡを単離することにより確認された。ＲＮＡ試料
をノーザーンブロット実験で解析し、各形質転換ラインにおける形質転換遺伝子
の発現レベルを決定する。Tobacco ( Nicotiana Tabacam cv. Santiana ( Nicotiana ta)
bacum cv. Samsun) leaf sections are transformed with the sense and antisense CEL constructs using the method of Horsh et al. ( Science 227: 1229-1231, 1985). Transformed plants containing the appropriate CEL construct are identified in Southern blot experiments. Expression of Pinos CEL in transformed plants was confirmed by isolating total RNA from independent transformed plant lines made with CEL sense and antisense constructs. The RNA samples are analyzed in a Northern blot experiment to determine the level of expression of the transformed gene in each transformation line.

【００９１】 パイノス ＣＥＬ遺伝子と内因性タバコＣＥＬ遺伝子でコード化されるＣＥＬ
酵素の全活性を、ＣＥＬセンスおよびアンチセンス構築物により作られた各形質
転換植物ライン毎に解析する。粗タンパク質抽出物を各形質転換植物から調製し
、ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３０
６：７４５−７５０、１９９５）およびピア（Ｐｅａｒ）らの方法（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１２６３７−１２６４２、１９９
６）を用いて解析する。CEL encoded by the Pinos CEL gene and the endogenous tobacco CEL gene
The total activity of the enzyme is analyzed for each transformed plant line created by the CEL sense and antisense constructs. Crude protein extracts were prepared from each transformed plant and prepared according to the method of Robertson et al. ( Biochem . J. , 30).
6: 745-750, 1995) and the method of Pear et al . ( Proc.
Natl. Acad. Sci. USA , 93: 12637-12642, 199.
Analyze using 6).

【００９２】 形質転換タバコ植物中のセルロースの濃度をスミス（Ｓｍｉｔｈ）およびハリ
ス（Ｈａｒｉｓ）の方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．、１０７：１３９９−１４０
９、１９９５）を用いて測定する。簡単に言えば、平均３８日齢のタバコ植物全
体を液体窒素中で凍結し、乳鉢および乳棒で微粉末にすり潰す。空のベクター形
質転換対照植物ライン、ＣＥＬに対するセンス構築物を含む少なくとも１個の独
立の形質転換植物ライン、およびＣＥＬに対するアンチセンス構築物を含む少な
くとも１個の独立の形質転換植物ライン由来の１００ｍｇの凍結粉末のセルロー
ス含有量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗａｒｒｉｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ
Ｗａｌｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）製のグルカン評価キットを用い、メーカーが
提供するプロトコールを用いて測定する。The concentration of cellulose in the transformed tobacco plants was determined by the method of Smith and Haris ( Plant Phys ., 107: 1399-140).
9, 1995). Briefly, whole 38 day old tobacco plants are frozen in liquid nitrogen and ground into a fine powder with a mortar and pestle. 100 mg frozen powder from an empty vector transformed control plant line, at least one independent transformed plant line containing a sense construct against CEL, and at least one independent transformed plant line containing an antisense construct against CEL The cellulose content of Megazyme (Warriwood, New South)
Measurement is performed using a glucan evaluation kit manufactured by Wales, Australia and using a protocol provided by the manufacturer.

【００９３】 配列番号：１−９０８が付属の配列リストに示される。記号「ｎ」および「Ｘ
ａａ」を含む付属の配列リストに用いられるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の
コードは、ＷＩＰＯ標準ＳＴ２５（１９８８）、付録２、表１に従っている。[0093] SEQ ID NOs: 1-908 are shown in the accompanying sequence listing. The symbols "n" and "X"
The nucleotide and amino acid sequence codes used in the accompanying sequence listing, including "aa", are in accordance with WIPO Standard ST25 (1988), Appendix 2, Table 1.

【００９４】 理解を明確にする目的で本発明を例示と例によってある程度詳細に説明してき
たが、特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることを意図した本発明の範
囲から逸脱することなく変更及び修正することができる。Although the present invention has been described in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, changes may be made without departing from the scope of the invention, which is intended to be limited only by the scope of the appended claims. And can be modified.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は陽性対照のムングビーン（Ｖ．ラディアタ）における天然のＣＥＬ酵素
活性レベルを示す。FIG. 1 shows the level of native CEL enzyme activity in the positive control Mung Bean ( V. Radiata ).

【図２】 図２は非形質移入２９３Ｔ細胞と比較した、Ｅ．グランディス ＣＥＬで形質
移入された哺乳動物２９３Ｔ細胞中におけるＣＥＬ酵素活性レベルを示す。FIG. 2. Comparison with untransfected 293T cells . Figure 5 shows CEL enzyme activity levels in mammalian 293T cells transfected with Grandis CEL.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AA03 AB03 AD08 CA17 CA19 CB03 CD12 CD13 CD14 4B024 AA08 BA07 CA04 CA07 CA09 CA20 DA01 DA03 DA06 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD13 EE01 LL05 4B065 AA26X AA89X AA89Y AA93X AB01 AC14 AC20 BA02 BD50 CA27 CA53 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID , IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (Reference) 2B030 AA02 AA03 AB03 AD08 CA17 CA19 CB03 CD12 CD13 CD14 4B024 AA08 BA07 CA04 CA07 CA09 CA20 DA01 DA03 DA06 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD13 EE01 LL05 4B065 AA26X AA89X AA89Y AA9353 AB01 AC20

Claims (19)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 （１）配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、
１０９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で表さ
れる配列；（２）配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−
１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で表される配列
の相補体；（３）配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０９−
１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で表される配列
の反転相補体；（４）配列番号：１−２９、５７−８０、１０５、１０７、１０
９−１１３、１１９−１２９、１３９−１４３および１４９−９０８で表される
配列の反転配列；（５）上記（１）−（４）で表される配列と比較して０．０１
以下の期待値（「Ｅ」）を生成するヌクレオチド配列；（６）上記（１）−（４
）で表されるヌクレオチド配列に対し少なくとも５０％の同一性を有するヌクレ
オチド配列；（７）厳密なハイブリダイゼーション条件下で上記（１）−（４）
で表される配列とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列；（８）上記（
１）−（４）で表される配列の２００−ｍｅｒであるヌクレオチド配列；（９）
上記（１）−（４）で表される配列の１００−ｍｅｒであるヌクレオチド配列；
（１０）上記（１）−（４）で表される配列の４０−ｍｅｒであるヌクレオチド
配列；（１１）上記（１）−（４）で表される配列の２０−ｍｅｒであるヌクレ
オチド配列；（１２）上記（１）−（４）で表される配列に対し縮重的に同等で
あるヌクレオチド配列；並びに（１３）上記（１）−（４）で表される配列の対
立遺伝子変異体であるヌクレオチド配列からなる群から選ばれたヌクレオチド配
列を含んでなる単離ポリヌクレオチド。(1) SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107,
Sequences represented by 109-113, 119-129, 139-143, and 149-908; (2) SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-
113, 119-129, 139-143 and the complement of the sequence represented by 149-908; (3) SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 109-
Inverted complements of the sequences represented by 113, 119-129, 139-143 and 149-908; (4) SEQ ID NOs: 1-29, 57-80, 105, 107, 10
Inverted sequences of the sequences represented by 9-113, 119-129, 139-143 and 149-908; (5) 0.01 sequence as compared with the sequences represented by the above (1) to (4)
A nucleotide sequence that produces the following expected value (“E”); (6) the above (1)-(4)
)) A nucleotide sequence having at least 50% identity to the nucleotide sequence represented by (7); (7) above under stringent hybridization conditions
(8) a nucleotide sequence that hybridizes with the sequence represented by
1) a nucleotide sequence that is a 200-mer of the sequence represented by (4); (9)
A nucleotide sequence that is a 100-mer of the sequence represented by (1) to (4) above;
(10) a nucleotide sequence which is a 40-mer of the sequence represented by the above (1)-(4); (11) a nucleotide sequence which is a 20-mer of the sequence represented by the above (1)-(4); (12) a nucleotide sequence which is degenerately equivalent to the sequence represented by the above (1) to (4); and (13) an allelic variant of the sequence represented by the above (1) to (4) An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: 【請求項２】 請求項１に記載されたヌクレオチド配列の１０個の連続的な
残基に対し相補性である少なくとも１０個の連続的な残基を含んでなる単離され
たオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー。2. An isolated oligonucleotide probe comprising at least 10 contiguous residues complementary to 10 contiguous residues of the nucleotide sequence according to claim 1 or Primer. 【請求項３】 請求項２の複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライ
マーを含んでなるキット。3. A kit comprising the plurality of oligonucleotide probes or primers of claim 2. 【請求項４】 その上に複数のポリヌクレオチドが記録されてなる保存培地
であって、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは請求項１または２に記録された
ヌクレオチド配列を含む保存培地。4. A storage medium comprising a plurality of polynucleotides recorded thereon, wherein at least one of the polynucleotides comprises the nucleotide sequence recorded in claim 1 or 2. 【請求項５】 請求項１のポリヌクレオチドを含んでなる構築物。5. A construct comprising the polynucleotide of claim 1. 【請求項６】 請求項５記載の構築物を含んでなる形質転換細胞。6. A transformed cell comprising the construct according to claim 5. 【請求項７】 ５’−３’の方向に （ａ）遺伝子プロモーター配列； （ｂ）（１）請求項１のヌクレオチド配列でコード化されるポリペプチドの少
なくとも機能性部分をコードするポリヌクレオチド；および（２）請求項１に記
載された配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列でコード化されるポリペ
プチドをコードする遺伝子の非コード領域を含むポリヌクレオチドの少なくとも
１つを含むポリヌクレオチド配列；並びに （ｃ）遺伝子終結配列 を含んでなる構築物。7. In the 5′-3 ′ direction: (a) a gene promoter sequence; (b) (1) a polynucleotide encoding at least a functional part of the polypeptide encoded by the nucleotide sequence of claim 1; And (2) a polynucleotide sequence comprising at least one polynucleotide comprising a non-coding region of a gene encoding a polypeptide encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence of claim 1; (C) a construct comprising a gene termination sequence 【請求項８】 ポリヌクレオチドがセンス配向である請求項７記載の構築物
。8. The construct of claim 7, wherein the polynucleotide is in a sense orientation. 【請求項９】 ポリヌクレオチドがアンチセンス配向である請求項７記載の
構築物。9. The construct according to claim 7, wherein the polynucleotide is in an antisense orientation. 【請求項１０】 遺伝子プロモーター配列が植物ホスト中で機能性であり、
木部中で転写される請求項７記載の構築物。10. The gene promoter sequence is functional in a plant host,
The construct of claim 7 transcribed in xylem. 【請求項１１】 請求項７項記載の構築物を含んでなる形質転換植物細胞。11. A transformed plant cell comprising the construct according to claim 7. 【請求項１２】 請求項１１項記載の形質転換植物細胞、またはその一部も
しくは胎芽もしくは子孫を含んでなる植物。12. A plant comprising the transformed plant cell according to claim 11, or a part or embryo or progeny thereof. 【請求項１３】 植物の多糖含有量、多糖組成および多糖の構造のうちの１
つ以上を調節する方法であって、植物のゲノム中に請求項１項のポリヌクレオチ
ドを安定して組み込むことを含んでなる方法。13. The polysaccharide content, polysaccharide composition and polysaccharide structure of a plant.
A method of regulating one or more of the above, comprising stably incorporating the polynucleotide of claim 1 into the genome of a plant. 【請求項１４】 植物がユーカリおよびマツ種からなる群から選ばれる請求
項１３記載の方法。14. The method according to claim 13, wherein the plant is selected from the group consisting of eucalyptus and pine species. 【請求項１５】 請求項７記載の構築物を植物のゲノムに安定して組み込む
ことを含む請求項１３記載の方法。15. The method of claim 13, comprising stably integrating the construct of claim 7 into the genome of a plant. 【請求項１６】 変化した多糖含有量、変化した多糖組成および変化した多
糖構造のうち一つ以上を有する植物を生産する方法であって、 （ａ）植物細胞を請求項７の構築物で形質転換して形質転換細胞を与え、；そ
して （ｂ）再生および成熟植物成長によい条件下に形質転換細胞を培養する ことを含んでなる方法。16. A method for producing a plant having one or more of an altered polysaccharide content, an altered polysaccharide composition, and an altered polysaccharide structure, comprising: (a) transforming a plant cell with the construct of claim 7; Providing the transformed cells; and (b) culturing the transformed cells under conditions favorable for regeneration and mature plant growth. 【請求項１７】 植物ゲノムの中に請求項７の構築物を安定して組み込んで
含んでなる植物において、多糖生合成経路に関わるポリペプチドの活性を修正す
るための方法。17. A method for modifying the activity of a polypeptide involved in a polysaccharide biosynthesis pathway in a plant comprising the construct of claim 7 stably integrated into the plant genome. 【請求項１８】 （ａ）配列番号：３０−５６、８１−１０４、１０６、１
０８、１１４−１１８、１２９−１３８、および１４４−１４８の配列；（ｂ）
（ａ）の配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する配列；（ａ）の配列に対
し少なくとも７０％の同一性を有する配列；並びに（ａ）の配列に対し少なくと
も９０％の同一性を有する配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含んでな
る単離ポリペプチド。(A) SEQ ID NOs: 30-56, 81-104, 106, 1
08, 114-118, 129-138, and 144-148; (b)
A sequence having at least 50% identity to the sequence of (a); a sequence having at least 70% identity to the sequence of (a); and having at least 90% identity to the sequence of (a). An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of sequences. 【請求項１９】 請求項１の単離されたポリヌクレオチド配列によりコード
化された単離ポリペプチド。19. An isolated polypeptide encoded by the isolated polynucleotide sequence of claim 1.