JP2002527055A - ヒトアンキリンファミリータンパク質 - Google Patents

ヒトアンキリンファミリータンパク質

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JP2002527055A JP2000575893A JP2000575893A JP2002527055A JP 2002527055 A JP2002527055 A JP 2002527055A JP 2000575893 A JP2000575893 A JP 2000575893A JP 2000575893 A JP2000575893 A JP 2000575893A JP 2002527055 A JP2002527055 A JP 2002527055A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトアンキリンファミリータンパク質（ANFP）と、ANFPを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ANFPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒト・アンキリンファミリー・タンパク質の核酸配列およびアミノ
酸配列、並びに自己免疫異常／炎症性疾患、細胞増殖異常症及び小胞輸送障害の
診断、治療並びに予防におけるこれらの配列の利用法に関するものである。
【０００２】 （発明の背景） 細胞には、細胞内区画を互いに結合させる細胞骨格及び細胞質膜が含まれる。
これらの区画に結合する脂質膜と細胞骨格との間の結合には、スペクトリン、ア
ンキリン及び複合的な膜タンパク質が関与する。スペクトリンは、細胞骨格の主
要な構成要素であり、骨格タンパク質として機能する。同様に、アンキリンは、
アクチン−スペクトリン部分を膜に繋ぐように機能し、細胞骨格と膜の区画との
間の相互作用を調節する。種々のアンキリンのアイソフォームは、種々の細胞器
官に特異的であり、この相互作用の特異性をもたらす。また、アンキリンには、
細胞周期及び分化の際に細胞骨格の再構築を可能とする細胞シグナルに応答可能
な調節ドメインが含まれる。（Lambert, S.及びV. Bennertt (1993) Eur, J. Bi
ochem, 211:1-6）。
【０００３】 アンキリンは、3つの基本的な構造的構成要素を有する。アンキリンのN末端部
は、33のアミノ酸モチーフの繰返し、アンキリンリピートからなり、それは特異
的タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。モチーフにおける多様な領域は
、特異的なタンパク質の結合を担い、種々のアンキリンリピートは、チューブリ
ン、陰イオン交換タンパク質、電位作動性のナトリウムチャネル、Na−/K+-ATP
アーゼ及びneurofascinへの結合に関与する。また、アンキリンモチーフは、NF-
κ-B並びに酵母筋サイクルタンパク質CDC10、SW14及びSW16等の転写因子で見ら
れる。Drosophilaノッチ並びにC. elegans LIN-12及びGLP-1等の組織の分化に関
与するタンパク質にもアンキリン様リピートが含まれる。Lexら（1990; Nature
344:36-42）は、アンキリン様リピートが「組込み」アンキリンとして機能し、複
合的な膜タンパク質、チューブリン及び他のタンパク質に対する結合部位を形成
することを提案している。
【０００４】 アンキリンの中心ドメインは、スペクトリンの結合に必要とされる。このドメ
インは、主にスペクトリンの結合を担う酸性領域及び塩基性領域からなる。C末
端ドメインはアンキリンの機能を調節する。C末端欠失アンキリン、タンパク質2
.2は、膜及びスペクトリン結合の増大を示す構成的に活性なアンキリンとして作
用する。C末端ドメインは、アンキリンファミリーメンバの間で多岐にわたり、
組織特異性の選択的スプライシングによって酸性又は塩基性の修飾されたC末端
が生じる（Lambert, 前出）。
【０００５】 3つのアンキリンタンパク質、ANK1、ANK2及びANK3の組織特異性並びに細胞内
局在パターンがこれまでに説明されている。ANK1、赤血球タンパク質2.1は、赤
血球を循環性のせん断応力から保護し、赤血球独特の両凹形状を維持するのに役
立つ。ANK1の欠乏は、遺伝性球状赤血球症（HS）等の遺伝性の溶血性貧血及びPe
rkinje細胞の損失を含む神経変性障害と関連づけられてきた。ANK2は主要な神経
組織アンキリンである。2つの選択的スプライスバリアントがANK2遺伝子から生
成される。成人において発現される脳アンキリンI（brank1）は、N末端及び中心
ドメインにおいてANK1と類似するが、完全に非類似の調節ドメインを有する。早
期のニューロンの形態、brank2には、スペクトリン結合性及び調節ドメインの間
の付加的なモチーフが含まれる。C. elegansにおけるアンキリンホモログunc-44
は、ANK2に類似の選択的スプライスバリアントを生成する。unc-44遺伝子におけ
る変異は、軸索の成長の方向に影響を及ぼす（Otsuka, A.J. et al. (1995) J.
Cell Biol. 129:1081-1092）。
【０００６】 ANK3は4つのアンキリン・アイソフォーム（G100、G119、G120及びG195）から
なり、それらは細胞区画に局在し、また小胞輸送に関与する。AnkG119はゴルジ
に関連し、切詰められたN末端ドメインを有し、C末端調節ドメインを欠く。AnkG 120 及びAnkG100はマクロファージにおける遅発性エンドリソソーム(endolysosom
es)に関連し、N末端アンキリンリピートを欠くが、ANK1及びANK2のスペクトリン
結合性及び調節ドメインの両方の特性を含む。AnkG195はトランス-ゴルジネット
ワーク（TGN）に関連する。これらのアンキリン・アイソフォームは、ゴルジ複
合体を介するタンパク質の輸送を媒介するスペクトリン複合体の一部である。ス
ペクトリン-アンキリン・アダプタ・タンパク質輸送系（SAATS）が、ERからゴル
ジを超えて輸送される小胞への膜タンパク質の選択的離隔に対して提案されてい
る。このモデルにおいて、ゴルジ、TGN及び細胞質膜内の輸送は、アンキリン・
アイソフォームを含めたSAATSタンパク質成分の交換に関係し、小胞カーゴの最
終的な宛先を特定及び識別する（DeMatteis, M.A. and J.S. Morrow (1998) Cur
r. Opin. Cell Biol. 10:542-549）。
【０００７】 新規なヒト・アンキリンファミリー・タンパク質及びそれらをコードするポリ
ヌクレオチドの開示は、自己免疫異常／炎症性疾患、細胞増殖障害及び小胞輸送
障害の診断、予防並びに治療に役立つ新たな組成物を提供して当業者の要求を満
たすものである。
【０００８】 （発明の要約） 本発明は、新規のヒトアンキリンファミリータンパク質（ANFP）及びANFPをコ
ードするポリヌクレオチドの発見、並びに自己免役異常／炎症性疾患、細胞増殖
異常症、及び小胞輸送障害の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使
用に関する。
【０００９】 本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含む実質的に精製さ
れたポリペプチドを提供する。
【００１０】 更に本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列と少なくとも９０
％以上のアミノ酸配列同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。本
発明はまた、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配を含むポリペプチドをコ
ードする単離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はま
た、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離さ
れ精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。
【００１１】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離
され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、SEQ ID NO:1また
はその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
相補的な配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】 本発明はまた、SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチドと、SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドと少なくとも７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有す
る単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、SE
Q ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相
補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】 本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列の相補体を、サンプルの少なくとも１
つのポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を
形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを
含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレ
オチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様で
は、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。
【００１４】 本発明は更に、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを
提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれる。
【００１５】 本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現
ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からその
ポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。
【００１６】 本発明はまた、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を有する実質的に
精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に提供する
。
【００１７】 更に本発明は、SEQ ID NO:1またはその断片の配列を含むポリペプチドと結合
する精製された抗体、並びにそのポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアン
タゴニストを提供する。
【００１８】 本発明はまた、ANFPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者に、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を有する実質的に
精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に効果的な
量投与することを含む、ANFPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療また
は予防方法を提供する。
【００１９】 本発明はまた、ANFPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者に、SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドのアンタゴニストを効果的な量投与することを含む、ANFPの発現または活性
の増大に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。
【００２０】 （本発明の記載について） 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。
【００２１】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００２２】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。
【００２３】 定義 「ANFP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒ
ツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳動物）から得られる実
質的に精製されたANFPのアミノ酸配列を指す。
【００２４】 用語「アゴニスト」は、ANFPと結合したとき、ANFPの効果を増大する、或いは
その持続時間を延長する分子を指す。このアゴニストには、ANFPに結合してその
効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の分子を含み得る。
【００２５】 「アレル変異配列」は、ANFPをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異
配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異mRNA若しく
は変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらな
い場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝子には、アレル形が存在しな
いもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変
異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は
、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じ
る。
【００２６】 ANFPをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或
いは置換が起こっても、ANFPと同じポヌクレオチド或いはANFPの機能特性の少な
くとも１つを備えるポリペプチドである。この定義には、ANFPをコードするポリ
ヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座ではない位置でアレル変異配列と不
適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及びANFPをコードするポリヌクレ
オチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に検出可能な或いは
検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント
変化を生じANFPと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を
含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にANFPの活性が保
持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両
親媒性についての類似性に基づいて成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミ
ノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸
は、リジン及びアルギニンを含み得り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭
基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン
、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロ
シンを含みうる。
【００２７】 用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリ
ペプチド、タンパク質配列、それらの任意の断片、天然の分子または合成された
分子を指す。ANFPの断片である「断片」及び「免疫原性断片」、「抗原性断片」
は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も好ましくはアミノ酸
１４個の長さであり、ANFPのある生物学的活性または免疫学的活性を保持する。
ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列であるが、
アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に関連する完全で元の
ままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。
【００２８】 「増幅」は、核酸配列の追加的な複製を生成することに関連する。増幅は、一
般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行わ
れる。
【００２９】 「アンタゴニスト」は、ANFPと結合したとき、ANFPの生物学的または免疫学的
活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮する分子を指す。アンタ
ゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはANFPの効果を減少させるの他
の分子である。
【００３０】 用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びＦ(ab')2及びそれらの断片
などの、無傷の分子及びＦｖ断片を指す。ANFPポリペプチドと結合する抗体は、
抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて
調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化す
るのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から引き出
されたり、化学的に合成され得り、必要に応じて担体プロテインと結合すること
も可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清
アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペットヘモニアン（KLH）を含
む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００３１】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子のフラグメント（即ちエピ
トープ）を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化する
のに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質
上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得
る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出
すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３２】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的な核酸配列を含
む全ての組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞に
よって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。
「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現
はセンス鎖を指す。
【００３３】 用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的機
能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」とは、天然或いは組
換え体のANFP、合成のANFPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物
或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力のことである
。
【００３４】 用語「相補的」及び「相補性」は、許容の塩と許容の温度条件の下で、塩基対
の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することを指す。例えば、配列「
Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２つの一本鎖分子間の
相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、或いは一本鎖間に完全
な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。核酸鎖間の相補性の程
度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える
。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（PN
A）分子の設計若しくは使用において特に重要である。
【００３５】 「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を
含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む
任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液、無菌組成物を
含み得る。ANFP若しくはANFPの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組
成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは
、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合可能である。ハイ
ブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、NaCl）及び界面活性剤
（例えば、SDS）、その他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精
子DNAなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００３６】 「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するために再配列された核酸配列
であって、XL-PCRTM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５'及び／または３
'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或いはGELVIEW 断片構築システム
（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの構築のためのコンピュータプログラ
ムを用いて２つ以上のインサイトクローン社の重複配列から構築された核酸配列
を指す。延長及び構築の両方によってコンセンサス配列に構築されるものもある
。
【００３７】 用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」は、ノーザン分析によるAN
FPをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、サンプル内のANFP
をコードする核酸の存在を示すことから、ANFPをコードするポリヌクレオチドか
らの転写物の発現と相関性を有すること指す。
【００３８】 「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が欠如するアミノ酸配
列若しくは核酸配列の変化を指す。
【００３９】 本明細用語「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の
化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキ
ル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオ
チドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少なくとも
１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリ
ペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する、グリ
コシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修
飾されたものである。
【００４０】 「類似性」とは、相補性の程度を表す用語である。これには、部分的類似性と
完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも言える。同一の配
列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも部分的に阻止する
部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全に相補的な配列と
標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低下させた条件の下
ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッ
ティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に同
様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を低下させた条件の
下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これ
は、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合が特異的（即ち、
選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条件の下では非特異
的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性ともいえない（例え
ば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特異的結合
が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合は、実質
的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイゼーショ
ンしない。
【００４１】 句「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ酸配列或いは核
酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。この百分率同一性
は、例えば、MEGALIGNプログラム(DNASTAR)など電子装置を用いて決定可能であ
る。このMEGALIGNプログラムは、様々な方法、例えば、クラスター方法に従って
、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可能である(例えば、Higgi
ns, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene73:237-244.を参照)。クラスターアルゴリ
ズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各クラスターに分類する。これら
のクラスターは、組によって整列され、次ぎにグループに分けられる。２つのア
ミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと配列Ｂの百分率類似性は、配列
Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基
数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもので除し、それに１００を掛ける
ことによって得られる。２つのアミノ酸配列間の低い類似性或いは非類似性のギ
ャップは、百分率類似性の決定には含まれない。核酸配列間の百分率同一性はま
た、クラスター法或いはJotun Hein法などの当分野で周知の別の方法によってカ
ウント或いは計算することも可能である(例えば、Hein. J. (1990) Methods Enz
ymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同一性はまた、例えば、ハイブリダイゼ
ーションの条件を変えるなどの当分野で周知の別の方法によって決定することも
可能である。
【００４２】 「ヒト人工染色体（HAC）」は、６kb〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得り、
安定した***染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色
体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参照）。
【００４３】 用語「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せ
るために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子である。
【００４４】 「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な一本鎖と塩基対を
形成して結合する全てのプロセスである。
【００４５】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間の水素結合の
形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである。ハイブリダ
イゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成される
か、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルタ
ー、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する
任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成され得る。
【００４６】 用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子の配列に対して、１個以上の
アミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸
配列の変化を指す。
【００４７】 「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などと関
係する症状のことである。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼ
すサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現によ
って特徴づけられ得る。
【００４８】 本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌ
クレオチドのアレイのことである。
【００４９】 本明細書のマイクロアレイの記述における「エレメント」或いは「アレイエレ
メント」とは、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌク
レオチドのことである。
【００５０】 用語「変調」とは、ANFPの活性の変化のことである。変調の例として、ANFPの
タンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的
特性或いは免疫学的特性の変化がある。
【００５１】 句「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖のセ
ンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のDNA或いはRNAと、
またペプチド核酸（PNA）や任意のDNA様物質、RNA様物質も指す。本明細書にお
いて「断片（またはフラグメント）」とは、（例えば、同じゲノム内の任意の別
の配列とは異なる）SEQ ID NO:2を特別に同定する独特のポリヌクレオチド配列
の領域を含む核酸配列のことである。例えば、SEQ ID NO:2は、ハイブリダイゼ
ーション及び増幅技術に有用であり、更に、関連ポリヌクレオチド配列からSEQ
ID NO:2を区別する類似性の検査にも有用である。SEQ ID NO:2の断片は、少なく
ともヌクレオチド１５〜２０個の長さである。この断片に対応するSEQ ID NO:2
の正確な長さ及びSEQ ID NO:2の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一
般的な技術の１つを用いて日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場
合、完全長のポリペプチドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結
合部位などの構造的ドメイン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。
【００５２】 用語「機能的に関係した」または「機能的に結合した」とは、機能的に関係す
る核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロモータが制御
する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する或いは機能的
に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は近接して同じ
読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝子要素は、ポ
リペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリペプチドの発
現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。
【００５３】 用語「オリゴヌクレオチド」とは、PCR増幅、ハイブリダイゼーション、或い
はマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さは少なくとも６
ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５から３０ヌクレオ
チドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチドである。本明細
書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義される「アンプ
リマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じである。
【００５４】 「ペプチド核酸」（PNA）とは、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチ
ドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチド
を含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この末端のリジンにより
、この組成物が溶解性を有する。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結
合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞において寿命を
延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63
を参照）。
【００５５】 用語「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。ANFPをコードす
る核酸若しくはその断片、ANFP自体を含むと推測される生物学的サンプルには、
体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、
細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムDNA，RNA，cDNAと、組織又
は組織プリント等も含まれ得る。
【００５６】 用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質或いはペプ
チドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用のことである。
この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまり
エピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、
抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「
Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペプチドが存在
するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識
Ａの量が減少する。
【００５７】 用語「厳密な（stringent）条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載さ
れたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な
条件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分
野で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホル
ムアミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで
厳密性を高めることができる。
【００５８】 用語「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれてから、単離或
いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している構成
要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上
の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。
【００５９】 「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００６０】 「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁
気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を含
む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポリヌクレオチドや
ポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャネル、孔などの様々な表面形態を
有する。
【００６１】 「形質転換」とは、外来DNAが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのこ
とである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条
件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を
挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス
感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子
照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導
入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部とし
て複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時
間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【００６２】 「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配列である。この変
異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置換されたアミノ酸
が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が含まれる。稀では
あるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「非保存的」変異も
含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿入、或いはその両
方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥＴＭソフトウエアを用
いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換
、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。
【００６３】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる用語「変異配列」とは、ANFPに
関連したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、
「スプライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ
変異配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、mRNAプロセシング中
のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなった
り、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わったり
、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチ
ド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多
形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列にお
ける変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基が
異なる「１つのヌクレオチド多形性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば
、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。
【００６４】 （発明） 本発明は、新規のヒトアンキリンファミリータンパク質（ANFP）及びANFPをコ
ードするポリヌクレオチドの発見に基づき、自己免役異常／炎症性疾患、細胞増
殖異常症、及び小胞輸送障害の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の
使用に関する。
【００６５】 本発明のANFPをコードする核酸は、核酸及び／またはアミノ酸配列のアライン
メント用のコンピュータ検索によって、回腸組織cDNAライブラリ（SINTNOT13）
のインサイトクローン1808075において同定された。コンセンサス配列であるSEQ
ID NO:2は、インサイトクローン1931340F6 (COLNTUT03)、3030695H1 (HEARFET0
2)、1221844T1 (NEUTGM01)、1818075F6及び1818075H1 (SINTNOT13)の核酸配列の
重複及び／または伸長によって導き出された。
【００６６】 一実施例では、本発明は、図１Ａ−図１Ｄに示されているSEQ ID NO:1のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ANFPはアミノ酸２６０個の長さであり
、T218及びT225における２個の潜在カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、S66、T
74、T139における３個の潜在プロテインキナーゼCリン酸化部位と、Y186におけ
る１個の潜在チロシンキナーゼリン酸化部位とを有する。PFAMによって、残基G1
24からH151までと、R157からN184までと、G190からT217までの３つのアンキリン
反復モチーフが同定された。図２に示されているように、ANFPは、ラットアンキ
リン(GI 1841966; SEQ ID NO:3)、及びヒト脳アンキリン2 (brank-2; GI 29491;
SEQ ID NO:4)と化学的及び構造的な類似性を有する。ANFPは、ラットアンキリ
ンと２３％、brank-2と２２％の同一性を有する。詳細には、ANFPの残基A98から
N244までの領域では、ラットアンキリン及びbrank-2とそれぞれ３１％の同一性
を有する。SEQ ID NO:2のヌクレオチドの約582から約641までの断片が、SEQ ID
NO:2の同定、及びSEQ ID NO:2と関連配列とを区別するハイブリダイゼーション
及び増幅技術に有用である。
【００６７】 ノーザン分析により、この配列が種々のライブラリにおいて発現し、少なくと
もその５０％が癌に関連し、２３％が免疫応答に関連するすることが示された。
特筆すべきは、ANFPが、生殖組織、造血／免疫組織、胃腸組織において発現する
ことである。
【００６８】 また本発明は、ANFPの変異体を含む。好適なANFPの変異体は、ANFPの機能的若
しくは構造的特性の少なくとも一つを有し、ANFPアミノ酸配列と少なくとも約８
０％、より好適には少なくとも約９０％、最も好適には少なくとも約９５％のア
ミノ酸配列同一性を有する。
【００６９】 本発明はまた、ANFPをコードするポリヌクレオチド包含する。特定の実施例で
は、本発明は、ANFPをコードするSEQ ID NO: 2の配列を有するポリヌクレオチド
配列を含む。
【００７０】 更に本発明は、ANFPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ANFPをコードするポリヌクレ
オチド配列と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも約８５％、最も好適
には少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定
の実施態様では、SEQ ID NO: 2と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも
約８５％、最も好適には約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID
NO: 2の変異配列を包む。上記した任意のポリヌクレオチド変異配列は、ANFPの
機能的若しくは構造的特徴の少なくとも一つを有するアミノ酸配列をコードし得
る。
【００７１】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るANFPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のANFPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【００７２】 ANFPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された厳
密な条件の下で、自然発生のANFPのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが
望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用
を有するANFP又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有
益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを
選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高め
ることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ANFP及びその誘
導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転
写物を作ることにある。
【００７３】 本発明はまた、ANFP及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を
完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野
で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れ
の中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ANFPまたはその任意の断片
をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００７４】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:2またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配
列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.
152:399-407; 及び Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.を参
照)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約
７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満の塩
化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは
約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムで
ある。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低いハイ
ブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは５０
％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーションにな
る。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７℃以
上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメータ
ーには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの
薬品の濃度、キャリアDNAの含有の有無があり、当分野の技術者には周知である
。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えることができる
。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７５０ｍＭ
の塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のSDSで行う。より
好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭの
クエン酸三ナトリウム、１％のSDS、３５％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ
の変性サケ***DNA（ssDNA）で行う。最も好適な実施例では、温度が４２℃で、
２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のSDS、
５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのssDNAで行う。これらの条件の有用
な変更は、当分野の技術者には明らかである。
【００７５】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗
浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度
を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例
えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。
洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２
℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過
程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリ
ウム、０．１％SDSで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が４
２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．
１％SDSで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で、１
５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％SDSで
行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかである。
【００７６】 当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施
例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断
片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin E
lmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway N
J）、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみ
られるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素
が用いられる。好ましくは、Hydra マイクロディスペンサー(Robbins Scientifi
c, Sunnyvale CA)及びMICROLAB2200 liquid transfer system（Hamilton, Reno,
NV）、Peltier Thermal Cycler200（PTC200；MJ Research, Watertown MA）、A
BI CATALYST 800 (Perkin-Elmer) を用いて自動化する。次に、ABI 373または37
7 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシークエン
シングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)、当分野で周知の方法を用
いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズ
ムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molec
ular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (19
95) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856
-853.を参照)。
【００７７】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のPCR法をベースにした種
々の方法を用いてANFPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素
などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する１つの方法
では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクタ
ー内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する。（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR
Methods Applic 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に
伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳
型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する。（
例えば、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res. 16:8186を参照）。キャプ
チャPCR法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に
隣接するDNA断片のPCR増幅を含む。（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）PCR Me
thods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及
びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本
鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未
知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic A
cids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMTERFIN
DERライブラリを用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能である（Clontech, Palo A
lto CA）。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロ
ン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法で
は、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software（National Bi
osciences社, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが
２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で
鋳型に対してアニールするよう設計される。
【００７８】 完全長cDNAのスクリーニングのときは、大きなcDNAを含むようにサイズが選択
されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd（T）ライブラリが完全
な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する配列を含むもの
が多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブ
ラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【００７９】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR
産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、
キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマ
ー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色
素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。
出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER 及び SEQUENCE NAVI
GATOR, Perkin-Elmerを参照）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローデ
ィングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ
制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在し
ない場合もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【００８０】 本発明の別の実施例では、ANFPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、適切な宿主細胞内にANFP、その断片または機能
的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的に
同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り
、これらの配列をANFPのクローン化及び発現に利用可能である。
【００８１】 種々の目的でANFPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセシング及び／または発現の調節が含
まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混合
や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオチ
ド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定方向
突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシ
ル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が可能
である。
【００８２】 別の実施例によれば、ANFPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてANFP自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:
202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ
（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にANFPのアミノ酸配列または任意のそ
の一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタン
パク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプ
チドを作ることが可能である。
【００８３】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei
ns, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York, NYを参照)
。
【００８４】 生物学的に活性なANFPを発現させるために、ANFPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含
む。これらの要素には、ベクター及びANFPをコードするポリヌクレオチド配列に
おけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻
訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様
々である。特定の開始シグナルによって、ANFPをコードする配列のより効果的な
翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン
及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ANFPをコードする配列及びその
開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる
転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、
コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければ
ならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから
得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含
めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (19
94) Results Probl. Cell Differ. 201−18-162.を参照)。
【００８５】 当業者に周知の方法を用いて、ANFPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in
vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる。(
例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及び
Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wi
ley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章、16章を参照)。
【００８６】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ANFPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌など
の微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス
、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR３２２プラスミド）
で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用され
る宿主細胞によって限定されるものではない。
【００８７】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ANFPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ANFPを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にANFPをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺
伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スク
リーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングさ
れた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば
、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を
参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のANFPが必要な場合は、ANFPの発
現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発す
るT5またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【００８８】 ANFPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種の
ベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用
可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内
への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列
を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Methods
Enzymol.153:51-794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.
を参照) 植物系もANFPの発現に使用可能である。ANFPをコードする配列の転写は、例え
ば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、
或いはTMV（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー
配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或いは
病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である
。（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）Mc
Graw Hill NY, pp.191-196を参照）。
【００８９】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にANFPをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にANFPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いること
が可能である。
【００９０】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約６kb〜１０MbのHACs
を作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または
ベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:3
45-355.を参照)。
【００９１】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるANFPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ANFPをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。
【００９２】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシド、ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（cANFPsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子
、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載さ
れている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad
. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clon
tech）、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS，ルシフェラーゼ及びその基質ル
シフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（GFP）(Clon
tech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォ
ーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定
したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.A.他（19
95）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参照）。
【００９３】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ANFPをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ANFPをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がANFPをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【００９４】 一般に、ANFPをコードする核酸配列を含み、ANFPを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパ
ク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベース
の技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、
これらに限定されるものではない。
【００９５】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるAN
FPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。ANFP上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul
. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene
Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (
1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。
【００９６】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ANFPをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション
、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別
法として、ANFPをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成
するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であ
り市販されているこのようなベクターを、T7，T3，またはSP6などの好適なRNAポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプロ
ーブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmac
ia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH
）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター
、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含
まれる。
【００９７】 ANFPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用され
るその配列及び／またはそのベクターによる。ANFPをコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するANFPの分泌を誘
導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【００９８】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タ
ンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の
活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ
ロセシングを確実にするために選択される。
【００９９】 本発明の別の実施例では、ANFPをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラAN
FPタンパク質が、ANFPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質
（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6−Hi
s、FLAG、c−mc、赤血球凝集素（HA）が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マ
ルトース、フェニルアルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、
金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG
、c−mc、及び赤血球凝集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的
に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タン
パク質の免疫親和性の精製ができる。また、ANFPをコードする配列と異種タンパ
ク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺
伝子操作すると、ANFPが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質
の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販
されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる
。
【０１００】 本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽
出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したANFPの合成が可能である。こ
れらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコ
ードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、好ましくは３５Ｓメチオニンで
ある放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１０１】 ANFPの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば431Aペプチ
ドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。ANFPの種々の
断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。
【０１０２】 （治療） ANFPのある領域とアンキリンファミリータンパク質のある領域との間に、例え
ば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、
ANFPの発現は、生殖組織、造血／免疫組織、胃腸組織、自己免役異常／炎症性疾
患、癌と密接な関係がある。従って、ANFPは、自己免役異常／炎症性疾患、細胞
増殖異常症、及び小胞輸送障害においてある役割を果たすと考えられる。ANFPの
発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ANFPの発現または活性
を低下させることが望ましい。また、ANFPの発現または活性の低下に関連する疾
患の治療においては、ANFPの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１０３】 従って、一実施例において、ANFPの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、患者にANFPまたはその断片や誘導体を投与することが可
能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、自己免役異常／
炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不
全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘
息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自
己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED）、気管支炎、胆
嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫
、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、
糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過
好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜
炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リ
ウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身
性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー
症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真
菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、細
胞増殖異常症が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑
液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモ
グロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、
リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、
骨髄、脳、***、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、
卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮
の癌などが含まれ、また、小胞輸送障害も含まれ、その中には嚢胞性線維症、グ
ルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血症、糖尿病、尿崩
症、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、潰瘍性大腸炎、胃
潰瘍、十二指腸潰瘍が含まれる。
【０１０４】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むANFPの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ANFPまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１０５】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むANFPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたANFPを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも
可能である。
【０１０６】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むANFPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ANFPの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１０７】 更なる実施例では、ANFPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または
予防のために、患者にANFPのアンタゴニストを投与することが可能である。この
ような疾患の例には、上記した疾患が含まれるが、それらに限定するものではな
い。一実施態様では、ANFPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして
、或いはANFPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運
搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１０８】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むANFPの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ANFPをコードする
ポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与することも可能であ
る。
【０１０９】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１１０】 ANFPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたANFPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてANFPと特異的に結合するものを同定が可能である。ANFP
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含ま
れる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、
二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１１１】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、ANFPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum
が特に好ましい。
【０１１２】 ANFPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望まし
いのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或い
はペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と
同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む。
ANFPアミノ酸の短い伸展部は、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメ
ラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１１３】 ANFPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler,
G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. Met
hods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030
; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。
【０１１４】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
ANFP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。
【０１１５】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。
【０１１６】 ANFPに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF（ab'）に断
片と、F（ab'）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab
断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライ
ブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速
且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:12
75-1281を参照）。
【０１１７】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ANFP
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性ANFPエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することがで
きる(Pound、前出)。
【０１１８】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、A
NFP抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状
態の下でANFP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったも
のである。多数のANFPエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体
試薬の測定値Ｋａは、ANFP抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のANFP
エピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定
値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ANFP抗体
複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好まし
い。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ANFPが抗体から最
終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類
似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A
Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer,
A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons
, New York NY)。
【０１１９】 ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、あるダウンス
トリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なく
とも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的
な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、ANFP抗体複合体を沈殿させなけ
ればならない処理に適している。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価
、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Cat
ty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。
【０１２０】 本発明の別の実施例では、ANFPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、ANFPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに
好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、ANFPをコードする
ポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相
補的分子または断片は、ANFPの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使
用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ANFPをコードする配列の制
御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１２１】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてANFPをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。
【０１２２】 ANFPをコードする遺伝子は、ANFPをコードするポリヌクレオチド又はその断片
を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによ
って止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はア
ンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。DNAの中に組み入れられな
い場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわ
れるまでmRNA分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以
上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持
続し得る。
【０１２３】 上記した通り、遺伝子の発現は、ANFPをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA或いはRNA、PNA）を
設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開始部位から
−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適である場合と
同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。三重らせ
ん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のため
に十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式DNAを用いる最近の治療の
進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: Huber, B.E.
及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing
Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、
転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止する
ように設計できる。
【０１２４】 酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いる
ことができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分
子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。
例えば、ANFPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触
媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１２５】 任意の潜在的RNA標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵ
Ａ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャ
ニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む
標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いRNA配
列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価
することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを
用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテ
ストすることによって評価することが可能である。
【０１２６】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでANFPをコードするDNA配列の
転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポ
リメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能で
ある。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作
製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１２７】 RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くする
ことができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキ
ング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よ
りむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限
定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレ
アーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、
及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく
、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）など
の従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大する
ことができる。
【０１２８】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr
o、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。
【０１２９】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。
【０１３０】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、ANFP、ANFPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はANFPの
インヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類
以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。
このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが
含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又
はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１３１】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１３２】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。
【０１３３】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１３４】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。
【０１３５】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。
【０１３６】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。
【０１３７】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１３８】 局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用
いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１３９】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。
【０１４０】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。
【０１４１】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。ANFPの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１４２】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。
【０１４３】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。
【０１４４】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばANFP又はその
断片、ANFPの抗体、ANFPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど
の活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED５０（服
用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはLD５０（服用に対して集団
の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験におけ
る標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬
用量比は治療指数であり、LD５０／ED５０と示すことができる。高い治療指数を
示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデー
タが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このよ
うな組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED５０を含む血
中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の
感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１４５】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。
【０１４６】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１４７】 （診断） 別の実施例では、ANFPに特異的に結合する抗体が、ANFPの発現によって特徴付
けられる疾患の診断、またはANFPやANFPのアゴニストまたはアンタゴニスト、イ
ンヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる
。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。
ANFPの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織か
ら採取されたものからANFPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾を
して或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性
の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いら
れるが、その内の幾つかは上記した。
【０１４８】 ANFPを測定するためのELISA，RIA，及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分
野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのANFPの発現を診断する元とな
るものを提供する。正常或いは標準的なANFPの発現の値は、複合体の形成に適し
た条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者から採取した体液ま
たは細胞とANFPに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複
合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（photometric）が好まし
い。被験者のANFPの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値
と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターと
なる。
【０１４９】 別の実施例によれば、ANFPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、疾
患と相関し得るANFPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出及び定量す
る。この診断アッセイを用いて、ANFPの不在、存在、及び過度の発現を調べ、治
療中のANFPレベルの制御を監視する。
【０１５０】 ある実施形態では、ANFPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションに
よって、ANFPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'調
節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異
性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブがANFPを
コードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コー
ドする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１５１】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ANFPをコードする任意の配
列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブリ
ダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:2の配
列、或いはANFP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム
配列に由来し得る。
【０１５２】 ANFPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作
製方法には、ANFP及びANFP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプロ
ーブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクタ
ーは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適
な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合
成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或
いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系によ
ってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレ
ポーターの集団によって標識され得る。
【０１５３】 ANFPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ANFPの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には
、自己免役異常／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（AIDS
）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロ
イド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免
疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（APECED
）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎
、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅
斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、
橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ラ
イター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフ
ィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大
腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及
び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が
含まれ、また、細胞増殖異常症が含まれ、その中には日光性角化症及びアテロー
ム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症
、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに
腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、
副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、
肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、
精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、また、小胞輸送障害も含まれ、その中には
嚢胞性線維症、グルコース‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血
症、糖尿病、尿崩症、高／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、
潰瘍性大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍が含まれる。ANFPをコードするポリヌクレ
オチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜
系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、ELISA式ア
ッセイ、及び変異ANFPの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織
を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは
量的方法は、当分野では周知である。
【０１５４】 特定の形態において、ANFPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、
特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ANFPをコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと
較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のANFPをコードするヌクレオチド
配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッ
セイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、
特定の治療効果を推定することが可能である。
【０１５５】 ANFPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あ
るいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出され
た体液或いは細胞と、ANFPをコードする配列或いはその断片とを結合させること
により達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得
た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの
値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な
値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の
値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１５６】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。
【０１５７】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。
【０１５８】 ANFPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、
酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくは
ANFPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはANFPをコードするポリヌクレ
オチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝
子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや低い厳密性条
件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び／または定量のため用いることが可
能である。
【０１５９】 ANFPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ
、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するELISA式のアッセイを用いる
ことによって加速された。
【０１６０】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。
【０１６１】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、ANFPをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌Ｐ１生成
物或いは単一染色体cDNAライブラリである。（例えば、Harrington, 1.3. 他 (1
997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及
びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイ
トで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のANFPをコードする遺伝子
の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような
疾患と関係するDNAの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を
用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検出
することもある。
【０１６２】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色***置の違いを検出することも
ある。
【０１６３】 本発明の別の実施例では、ANFP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。ANFPとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成
は計測されることもある。
【０１６４】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、ANFP、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたANFPが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたANFPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１６５】 別の実施例では、ANFPと結合可能な中和抗体がANFPと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、ANFPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。
【０１６６】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にANFPをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。
【０１６７】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本
発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示
目的であって本発明を限定するものではない。
【０１６８】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願第09／
172,977号を引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１６９】 （実施例） １ cDNAライブラリーの作製 SINTONOT13ライブラリーは、25歳のアジア人女性の全結腸切除術及び一次的回
腸瘻形成の際に採取された小腸組織から単離したRNAを用いて作製した。病理学
的には、遠心縁から上行結腸までの結腸粘膜に関わる中位に活性な慢性潰瘍性大
腸炎を示していた。患者の病歴には、貧血症及び抑うつ障害があった。家族歴に
は、高脂血症、抑うつ障害、悪性頚部腫瘍及びウイルス肝炎が含まれていた。
【０１７０】 冷凍組織をPolytron homogenizer（PT-3000; Brinkmann Instruments, Westbu
ry, NY）を用いて、グアニジニウムイソチオリアネート溶液中でホモジナイズ及
び溶解した。その溶解物を、BL8-70M超遠心分離機（Beckmann Instruments）でS
W28ロータを用いて、5.7MのCsClクッションにおいて、25,000 rpmの回転速度で
周囲温度で18時間かけて遠心分離した。RNAを酸性フェノールで抽出し、酢酸ナ
トリウム及びエタノールを用いて沈殿させ、RNAを含まない水に再懸濁させ、DN
アーゼで処理した。前述のように、RNAを酸性フェノール及びで抽出し、沈澱さ
せた。ポリ（A+）RNAをOLIGOTEX kit（QIAGEN, Inc., Chatsworth CA）を用いて
単離した。
【０１７１】 ポリ（A+）RNAは、SUPERSCRIPT Plasmid System （Life Technologies）にお
ける推奨プロトコルに従ってcDNAの合成及びライブラリーの作製のために使用し
た。cDNAをSEPHAROSE CL4Bカラム（Pharmacia Amersham Biotech, Inc., Palo A
lto CA）上で分画し、400bpを超える大きさのcDNAをpINCY（Incyte Pharmaceuti
cals）に結び付け、その後、DH5αTMコンピテント細胞（Life Technologies）に
形質転換した。
【０１７２】 ２ cDNAクローンの単離 プラスミドDNAはその細胞から放出され、これをREAL Prep 96 Plasmid kit（Q
IAGEN, Inc.）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の点を変更
した。（１）25mg/lのカルベニシリン及び0.4%のグリセロールを含む1mlの滅菌T
errific Broth （Life Technologies）において細菌を培養した。（２）培溶液
を19時間インキュベートした後、この細胞を0.3mlの溶解バッファーに溶解した
。（３）イソプロパノール沈殿を行った後、プラスミドDNAのペレットを0.1mlの
蒸留水に再懸濁した。そのDNAサンプルを4℃で保管した。
【０１７３】 ３ 配列決定および分析 配列決定のためのcDNAは、ABI CATALYST 800（Perkin-Elmer）、又はHYDRA マ
イクロディスペンサー（Robbins Scientific）、又はMICROLAB 2200（Hamilton
）システムとPTC-2000 thermal cyclers（MJ Research）とを組合せて用いて準
備した。cDNAは、ABI PRISM 373若しくは377 配列決定システム（Perkin-Elmer
）並びに標準的なABIプロトコル、塩基対呼び出しソフトウェア、及びキットを
用いて配列決定した。一実施態様においては、MEGABACE 1000 DNA配列決定シス
テム（Molecular Dynamics）を用いてcDNAの配列決定を実施した。別の実施態様
においては、ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle swquencing ready reaction
kit（Perkin-Elmer）を用いてcDNAの増幅および配列決定を行った。また別の実
施態様においては、Amersham Pharmacia Biotech社の溶液および色素を用いてcD
NAの配列決定を実施した。ESTに対する読み枠は、標準的な方法（Ausubel, 1997
, 前出, unit 7.7のレビュー）を用いて決定した。DNA配列の幾つかを選択して
、本実施例の５に記載した方法で伸長した。
【０１７４】 cDNA、伸長物、及びショットガン配列決定から得られたポリヌクレオチド配列
は、当業者に周知のアルゴリズムを利用するソフトウェアプログラムを組合せて
用いて構築および分析した。表１には、利用したソフトウェアプログラム、説明
、引用文献、及び閾値パラメータをまとめた。表１の第1列は用いたツール、プ
ログラム、及びアルゴリズムであり、第2列はそれらの簡単な説明であり、第3列
は引用文献（それらの全てはここで言及することにより本明細書の一部とする）
であり、第4列は2つの配列間の一致の程度の評価に用いた適切なスコア、確率値
、及び他のパラメータである（確率値が高いほど相同性が高い）。配列は、MACD
NASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineering）及びLASERGENEソフト
ウェア（DNASTAR）を用いて分析した。
【０１７５】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST、動的計画法、及びジヌクレオチド最
近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー
、及びpolyA配列を取除き、多義性の塩基対をマスクすることによって実施した
。次に、配列をBLAST、FASTA、及びBLIMPSに基づいたプログラムを用いてGenBan
kの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、及び真核生物のデータベースやBLOCK
Sデータベース等の公共のデータベースでから選択した配列に対して問合わせて
注釈を得た。Phred、Phrap、及びConsedに基づいたプログラムを用いて配列を完
全長のポリヌクレオチドに構築し、GeneMark、BLAST、及びFASTAに基づいたプロ
グラムを用いて読取り枠に対してスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチ
ド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、続いてその完全長
のポリヌクレオチド配列をGenBankデータベース（前述）、SwissProt、BLOCKS、
PRINTS及びProsite等のデータベースに問い合わせることによって分析した。HMM
は、遺伝子ファミリーのコンセンサス1次構造を解析する確率的アプローチであ
る（例えば、Eddy, S.R. (1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6:361-365を参照）。
【０１７６】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築および分析のための上
述のプログラムは、SEQ ID NO:2からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも
使用した。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約20から約4000までのヌク
レオチドの断片については、前述の「発明」のセクションで説明した。
【０１７７】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合している膜と、標識さ
れたヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Sambrookら
、前出, ch.7；並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4および16.参照）。
【０１７８】 BLASTを使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQTM データベース（Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA）のようなヌクレオチ
ドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は、多くの膜
をベースとしたハイブリダイゼーションに比べてより高速である。さらにコンピ
ュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは類似の何
れとして分類されるかを決定することができる。検索の基準は、以下で定義され
る積スコア(product score)である。 （配列同一性%×最大BLASTスコア%）／100 積スコアは、2つの配列間の類似度および配列一致の長さの両方を考慮に入れる
。例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、積
スコア70の場合は正確な一致となる。類似の分子は通常15〜40間の積スコアを示
す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでは関連した分
子として同定される。
【０１７９】 ノーザン分析の結果は、ANFDをコードする転写物が発生したライブラリーの割
合の分布として報告される。分析には、器官／組織並びに疾病によるcDNAライブ
ラリの分類が含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内
分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾病／障害／
症状のカテゴリーには、癌、炎症／心的外傷、細胞増殖、神経、及び貯留(poole
d)が含まれる。各カテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリーを数
えて、カテゴリー全体にわたるライブラリーの合計数で割った。各組織に特異的
な発現ならびに疾病、疾患、若しくは症状に特異的な発現の割合を発明の詳細な
説明に示した。
【０１８０】 ５ ANFDをコードするポリヌクレオチドの伸長 SEQ ID NO:2の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片を伸長してこの
断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて作り出した。一方のプ
ライマーは既知の断片の5'の延長を開始するために合成し、他方のプライマーは
既知の断片の3'の延長を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGO 4.
06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の適切なプログラムを用いて
、約22〜30個のヌクレオチドからなる長さであって50%以上のGC含有物を有し、
且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにcDNAから設計した。
ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体を生ずるようなヌクレオチドの
如何なる伸長も回避した。
【０１８１】 選択されたヒトcDNAライブラリーを用いてこの配列を伸長した。2段階以上の
伸長が必要であるか、又は望ましい場合には、プライマーの付加的或いはネスト
化した組を設計する。
【０１８２】 周知の方法を利用したPCR法で高い忠実度の増幅を実施した。PCRは、PTC-200
thermal cycler （MJ Research, Inc.）用いて96ウェルプレートにおいて行っ
た。反応混合液には、DNA鋳型、200nmolの各プライマーと、Mg2+、(NH4)2SO4、
及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Taq DNAポリメラーゼ（Ame
rsham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Technologies）と、Pfu DN
Aポリメラーゼ（Stratagene）とが含まれる。プライマーの組PCI A及びPCI Bに
対して以下のパラメータを用いた。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 60℃で1分間 ステップ4 68℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す ステップ6 68℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 或いは、プライマーの組T7及びSK+に対して以下のパラメータを用いた。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 57℃で1分間 ステップ4 68℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す ステップ6 68℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 各ウェルのDNA濃度は、0.5μlの希釈していないPCR生成物及び1X TEに溶解し
た100μlのPICOGREEN定量試薬（0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eu
gene OR）を不透明な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各ウェ
ルに分配し、DNAが試薬と結合可能なようにして測定した。このプレートをFluor
oskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンして、サンプルの
蛍光を計測し、またDNA濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlの一定分量を1
%のアガロースミニゲル上での電気泳動法によって解析し、何れの反応物が配列
の伸長に成功したかを決定する。
【０１８３】 伸長したヌクレオチドを脱塩および濃縮し、384ウェルプレートに移し、CviJI
コレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI
）で消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結する前に
音波処理またはせん断を実施した。ショットガン配列決定のために、消化したヌ
クレオチドを低濃度（0.6〜0.8%）のアガロースゲル上に分離し、断片を切除し
、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New
England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia
Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部
位のオーバーハングを満たし、更にコンピテントE.coli細胞に形質移入した。形
質移入した細胞を抗生物質を含む培地で選択し、個々のコロニーを選択してLB/2
X carb培養液の384ウェルプレートに37℃で終夜培養した。
【０１８４】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した
。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で１５秒 ステップ3 60℃で1分間 ステップ4 72℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す ステップ6 72℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 前述のようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）でDNAを定量化した。DNA回収
率の低いサンプルは、上記の条件で再度増幅した。サンプルを20%のジメチルス
ルホキシド(dimethysulphoxide)（1:2, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy trans
fer sequencingプライマー並びにDYENAMIC DIRECTキット（Amersham Pharmacia
Biotech）若しくはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reac
tion kit（Perkin-Elmer）を用いて配列決定した。
【０１８５】 同様に、SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を使用し、上記手順、5’伸長用に設
計されたオリゴヌクレオチド、及び適切なゲノムライブラリーを用いて5’調節
配列が得られる。
【０１８６】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:2から得られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、
ゲノムDNA、又はmRNAをスクリーニングする。約20の塩基対からなるオリゴヌク
レオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片にも概ね
同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06プライマー解析ソフトウ
ェア（National Biosciences）のような当技術分野のソフトウエアを用いて設計
し、50pmolの各オリゴマー、250μCiの[γ-32P]アデノシン3リン酸 （Amersham
Pharmacia Biotech）、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston
MA）を結びつけることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SEPH
ADEX G-25超微細分子サイズ排除デキストランビーズカラム（Amersham Pharmaci
a Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分107カウントの標識されたプローブ
を含むアリコットを、以下のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst
I、Xba1、又はPvu II（DuPont NEN）の中の1つで消化されたヒトゲノムDNAの典
型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析に用いる。
【０１８７】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜（NyA
NFDlus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーション
は40℃で16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、0.1xクエン酸ナ
トリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件
下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。XOMAT-ARフィルム（Eastman Koda
k, Rochester NY）をブロットに対して数時間かけて露光した後にハイブリダイ
ゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０１８８】 ７ マイクロアレイ 化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の
表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Baldeschweiler
, 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定の
アレイを用いて、熱、UV、化学的もしくは機械的結合プロシージャを利用して、
基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。標準的なアレイは、手製
で或いは手近な方法及び機械を用いて製作でき、また任意の適切な数のエレメン
トを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを取
除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを判定する。マイクロアレ
イ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相補性の度合及び相対的な
存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析することにより評価する。
【０１８９】 完全長cDNA、発現された配列タグ（ESTs）、又はそれらの断片は、マイクロア
レイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、当業者
に周知のLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）のようなソフトウェアを用いて選択
可能である。本発明のヌクレオチド配列の1つに対応する完全長cDNA、EST、若し
くはそれらの断片を、又は本発明に関連するcDNAライブラリーから無作為に選択
されたものを、例えばスライドガラスのような適切な基板に配置する。そのcDNA
を、例えばUV架橋の後に熱的および化学的に処置し、さらに乾燥することによっ
て、スライドガラスに固定する（例えば、Schena, M.ら (1995) Science 270:46
7-470; 並びにShalon, D.ら(1996) Genome Res. 6:639-645参照）。蛍光プロー
ブを作製し、基板上のエレメントとのハイブリダイゼーションに用いる。基板は
前述の方法によって解析する。
【０１９０】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ANFDをコードする配列に相補的な配列、或いはその任意の一部を、自然発生AN
FDの発現を検出し、低下させる、即ち抑制するために用いる。約15〜約30塩基対
を含むオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより
大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法が用いられる。OLIGO 4.06
ソフトウェア及びANFDのコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを
設計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特な5’配
列から設計してコーディング配列へのプロモーターの結合を防止するために用い
る。翻訳を抑制するために、相補的なオリゴヌクレオチドを設計してANFDをコー
ドする転写物へのリボソームの結合を防ぐ。
【０１９１】 ９ ANFDの発現 ANFDの発現及び精製は、細菌またはウイルスに基づく発現系を用いて実施され
る。細菌におけるANFDの発現の場合、抗菌性の耐性遺伝子とcDNAの転写レベルを
高める誘導性のプロモーターとを含む適切なベクターにcDNAをサブクローニング
する。このようなプロモーターの例としては、以下に限定しないが、lacオペレ
ーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及
びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが挙げられる。組換えベクターを、BL
21(DE3)などの適切な細菌性の宿主に形質転換する。抗生物質耐性菌が、イソプ
ロピルβ−Dチオガラクトピラノシド（IPTG）での誘発によりANFDを発現する。
真核生物の細胞におけるANFDの発現は、昆虫または哺乳動物の細胞株に、一般に
バキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体ウイ
ルス（AcMNPV）を感染させることによって行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同的組換え又は転移プラスミド中間体を含む細菌媒介の遺
伝子転移の何れかによって、ANFDをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染
力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高レベルのcDNAの転写が
行われる。多くの場合、組換え型バキュロウイルスは、Spodoptera frugiperda
（Sf9）昆虫細胞の感染に用いられるが、場合によっては、ヒト肝細胞の感染に
も用いられる。後者の感染には、バキュロウイルスに対する更なる遺伝的変更が
必要となる。（例えば、Engelhard. E. K.ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 91:3224-3227; Sandig, V.ら(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945を参照）。
【０１９２】 殆どの発現系において、ANFDは、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ（G
ST）、またはFLAG若しくは6-His等のペプチドエピトープ標識で融合タンパク質
として合成され、粗製の細胞溶解物からの組換え型融合タンパク質の親和性ベー
スの精製を迅速に1段階で行うことができる。Schistosoma japonicumからの26キ
ロダルトンの酵素のGSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した条件
の下で固定化されたグルタチオにおける融合タンパク質の精製が可能となる（Am
ersham Pharmacia Biotech）。精製の後に、特定の操作部位においてANFDからGS
T部分をタンパク分解的に切断可能である。8個のアミノ酸のペプチドであるFLAG
により、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いて免疫親和
性の精製が可能となる（Eastman Kodak）。6個の連続したヒスチジン残基のスト
レッチである6-Hisによって、金属キレート樹脂（QIAGEN）における精製が可能
となる。タンパク質の発現及び精製の方法については、Ausubelが（1995年, 前
出, ch 10 and 16）論じている。これらの方法によって得られた精製されたANFD
を、以下のアッセイで直接用いることができる。
【０１９３】 １０ ANFD活性の実証 ANFP活性は、タンパク質−タンパク質複合体を形成する能力に関係し、それは
NIH3T3マウス線維芽細胞の成長特性を調節する能力によって測定される。ANFPを
コードするcDNAを、適切な真核生物の発現ベクターにサブクローニングする。こ
のベクターを周知の方法でNIH3T3細胞に形質移入する。形質移入された細胞と形
質移入されていない細胞とを、定量化可能な特性について比較する。その定量可
能な特性としては、培地における高密度までの成長、基板に対する細胞の付着の
低下、細胞形態の変化及び免疫不全のマウスに注入したときの腫瘍を誘発する能
力が挙げられる。ANFPの活性は、ANFPを形質移入したNIH3T3における細胞形態の
変化の頻度又は成長の増大の程度に比例する。
【０１９４】 １１ 機能的アッセイ ANFDの機能は、哺乳類細胞培養系における生理学的に高められたレベルでのAN
FDをコードする配列の発現によってアッセイする。高レベルでcDNAを発現する強
力なプロモーターを含む哺乳類の発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。
選り抜きのベクターには、pCMV SPORT（Life Technologie）及びpCR3.1 （Invit
rogen, Carlsbad, CA）が含まれ、その各々にはサイトメガロウイルスプロモー
ターが含まれる。5〜10μgの組換えベクターを、リポソーム製剤或いは電気穿孔
法によって、好ましくは内皮若しくは造血由来のヒト細胞株に一過性に形質移入
する。また、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgの付加的なプラス
ミドを同時形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と
形質移入されていない細胞とを区別することができ、また組換えベクターからの
cDNAの発現を確実に予測できる。選り抜きの標識タンパク質には、緑色蛍光タン
パク質（GFP; Clontech）、CD64、又はCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。自
動化されたレーザー光学に基づいた技術であるフローサイトメトリー（FCM）を
用いて、GFP又はCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、また細胞の
特性（例えば、アポトーシスの状態）を評価する。FCMによって、先行する或い
は同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取込みを検出及び定量化する。これ
らの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって測定される核DNA内
容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取込み量の低下によって測定されるDNA
合成の下方制御、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面および細胞
内のタンパンク質の発現の変化、並びにフルオレセイン結合アネキシンVタンパ
ク質の細胞表面への結合によって測定される原形質膜組成の変化が含まれる。フ
ローサイトメトリーの方法については、Ormerod, M. G.の (1994) Flow Cytomet
ry, Oxford, New York, NYに記載されている。
【０１９５】 遺伝子発現におけるANFDの影響は、ANFDをコードする配列並びにCD64若しくは
CD64-GFPの何れかが形質移入された高度に精製された細胞集合を用いて評価する
ことができる。CD64及びCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免
疫グロブリンG（IgG）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞を、ヒ
トIgG若しくはCD64の抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて、形質転換
されていない細胞から分離することができる（DYNAL, Lake Success, NY）。mRN
Aは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。ANFD及び目的とす
る他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で
解析することが可能である。
【０１９６】 １２ ANFD特異的抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）（例えば、Harrington, M.G. (19
90) Methods Enzymol. 182:488-495参照）、或いは他の精製技術を使用して実質
的に精製されたANFDを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化して
抗体を生成する。
【０１９７】 或いは、ANFDのアミノ酸配列をLASERGENE software（DNASTAR）を用いて解析
して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成し、これ
を用いて当業者に知られた方法により抗体を産生させる。C-末端付近または親水
性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択方法の詳細については当
業者の文献に記載されている（例えば、Ausubel, 1995, 前出, ch.11参照）。
【０１９８】 通常、15残基の長さのオリゴペプチドを、fmoc法の化学作用を利用するABI 431
A Peptide Synthesizer（Perkin-Elmer）を用いて合成し、MBS（N-maleimidoben
zoyl-N-hydroxysuccinimide ester）を用いた反応によりKLH(Sigma, St.Louis,
MO)に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ausubel前出 参照）。ウサ
ギをフロイント完全アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫化す
る。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、1%
BSAでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素
標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検
査される。
【０１９９】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ANFDの精製 ANFDに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより、
自然発生或いは組換えANFDを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、ANFD抗体を、CNBr-活性化セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）のよ
うな活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製す
る。結合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。
【０２００】 ANFDを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ANFDを優先的に吸着
させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファー
）でそのカラムを洗浄する。抗体／ANFD結合を***させる条件下（例えば、pH2
〜3のバッファー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカ
オトロープ(chaotrope)）でカラムを溶出させ、ANFDを回収する。
【０２０１】 １４ ANFDと相互作用する分子の同定 125I Bolton-Hunter試薬を用いて、ANFD或いはその生物学的に活性な断片を標
識する（例えば、Bolton, A.E. 及び W.M. Hunter (1973) Biochem.J.133:529参
照）。マルチウエルプレートのウエル内に予め配置した候補分子を、標識したAN
FDと共にインキュベートし、洗浄し、標識したANFD複合体を有する任意のウエル
をアッセイする。種々のANFD濃度で得られたデータを用いて、ANFDと候補分子と
の会合、親和性、及び数についての値を計算する。
【０２０２】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に記載した方
法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を特定の好適
実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実施例に過度
に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本発明の実施
のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明ら
かであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。
【０２０３】 （表の簡単な説明） 表１は、ANFPの解析に用いたプログラム及びその説明、引用文献、閾値パラメ
ーターを示す。
【表１】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ANFPのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す。こ
のアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineer
ing. S. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｂ】 ANFPのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す。こ
のアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineer
ing. S. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｃ】 ANFPのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す。こ
のアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineer
ing. S. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１Ｄ】 ANFPのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す。こ
のアラインメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineer
ing. S. San Francisco CA）を用いて作成した。
【図２】 LASERGENEソフトウェア(DNASTAR, Madison WI)のマルチシーケンスアラインメ
ントプログラムを用いて作成した、ANFP (インサイトクローン番号：1808075; S
EQ ID NO:1)と、ラットアンキリン(GI 1841966; SEQ ID NO:3)と、ヒト脳アンキ
リン2 (GI 29491; SEQ ID NO:4)との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB07 BB46 BB50 BB51 CB01 FB01 FB02 FB08 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA06 DA02 EA02 GA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA17 BA01 BA02 BA22 BA44 CA18 NA14 ZB02 ZB07 ZB11 ZB21 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA22 EA50 FA72 FA74

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1またはその断片のアミノ酸配列を有する実質
    的に精製されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配
    列同一性を有する実質的に精製された変異体。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチド或いはその断片をコードする単離
    され精製されたポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌ
    クレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
  5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
    ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
    され精製されたポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプル内の少なくとも一つの核酸とハ
    イブリダイズさせて、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
    と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプル内の前記ポリヌクレオチドの
    存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出法。
  8. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチド
    の増幅過程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の検出法。
  9. 【請求項９】 SEQ ID NO:2またはその断片のポリヌクレオチド配列を有
    する単離され精製されたポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリ
    ヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列
    。
  11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも一つの断片を
    含む発現ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
  15. 【請求項１５】 好適な医療用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
  17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
  18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
  19. 【請求項１９】 ANFPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療また
    は予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を
    含む、ANFPの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。
  20. 【請求項２０】 ANFPの発現または活性の増大に関連する疾患の治療また
    は予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程
    を含む、ANFPの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法
    。
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