JP2002526756A - Method for measuring protein-protein interaction in living cells - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 (a) 異種の第一接合体と異種の第二接合体を含む細胞を用意し、ここで、異種の第一接合体は検出可能な基に接合した興味ある第一タンパク質からなり、かつ異種の第二接合体は、細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質に接合した興味ある第二タンパク質からなる；次いで(b) 内部構造に対する検出可能な基の結合の有無を検出し、結合の存在が、興味ある第一及び第二タンパク質が互いに特異的に結合していることを示すことからなる、生細胞におけるタンパク質-タンパク質相互作用の検出方法。この発明の別の観点は、上記融合タンパク質をエンコードする核酸、かかる融合タンパク質を含み発現する細胞、上記方法の実施に有用なキット、及び上記方法の実施のためのスクリーニングツールとして有用な核酸ライブラリーを含む。この発明は、既知の結合対の結合を破壊又は阻害する能力について化合物をスクリーニングし、それによってその競合阻害剤を同定するのに有用である。この発明は、既知の興味あるタンパク質に結合する化合物を同定するために、興味ある他のタンパク質のライブラリーに対して興味あるひとつの既知のタンパク質をスクリーニングするのに有用である。   (57) [Summary] (a) providing a cell containing a heterologous first conjugate and a heterologous second conjugate, wherein the heterologous first conjugate comprises a first protein of interest conjugated to a detectable group and The second conjugate comprises a second protein of interest conjugated to a protein that specifically binds to an internal structure within the cell; and (b) detects the presence or absence of a detectable group on the internal structure and binds. A method for detecting a protein-protein interaction in a living cell, wherein the presence of the protein indicates that the first and second proteins of interest are specifically bound to each other. Another aspect of the invention is a nucleic acid encoding the fusion protein, a cell containing and expressing the fusion protein, a kit useful for performing the method, and a nucleic acid library useful as a screening tool for performing the method. including. The invention is useful for screening compounds for their ability to disrupt or inhibit the binding of a known binding pair, thereby identifying their competitive inhibitors. The invention is useful for screening one known protein of interest against a library of other proteins of interest to identify compounds that bind to a known protein of interest.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 この発明は、国立健康研究所の認可GM-48113及びGM-51457の下で政府のサポー
トで行った。政府は、この発明に対するある種の権利を有する。発明の分野 この発明は、生細胞における2つの異なるタンパク質間の結合、又は同じタン
パク質によるオリゴマーの形成を検出又は決定する方法、加えてそのような方法
を実施するのに有用な細胞及びキットに関する。発明の背景 タンパク質の互いの結合、又は競合阻害剤によるタンパク質の別のタンパク質
への結合崩壊は、一般的には生体外で測定される。このような結合アッセイは、
細胞内を含む生体内の結合事象のモデルとして一般的に用いられている。このよ
うな技術は十分に確立されているが、生体外結合条件は、結合事象が細胞内で生
じる際に導入される膨大な変数を制御していない。新しい治療分子の開発には、
新しい結合パートナー又は既知の結合パートナーの阻害剤のスクリーニングが重
要であるので、細胞内の結合を測定する技術の開発は極めて重要である。 「プルダウン(pull down)」アッセイが知られている。これは、興味ある一対
のタンパク質の結合を、生体外で抗体との共沈殿物を形成し、次いでこうして形
成された凝集物を遠心分離で落として、つまり「プルダウン」することによって
測定する。この技術の欠点は、生体外で行われ、実質的に非特異的な結合が生じ
ることである。[0001] This invention was made with government support under National Institutes of Health approval GM-48113 and GM-51457. The government has certain rights in this invention. FIELD OF THE INVENTION This invention relates to methods for detecting or determining the binding between two different proteins in living cells, or the formation of oligomers by the same protein, as well as cells and kits useful for performing such methods. BACKGROUND OF THE INVENTION The binding of proteins to each other, or the disruption of a protein to another protein by a competitive inhibitor, is generally measured in vitro. Such a binding assay
It is commonly used as a model for binding events in vivo, including in cells. Although such techniques are well established, in vitro binding conditions do not control the enormous variables introduced when binding events occur in cells. To develop new therapeutic molecules,
As the screening of new binding partners or inhibitors of known binding partners is important, the development of techniques for measuring intracellular binding is of great importance. "Pull down" assays are known. It measures the binding of a pair of proteins of interest by forming a coprecipitate with the antibody in vitro and then centrifuging, or "pulling down," the aggregates thus formed. A disadvantage of this technique is that it occurs in vitro and results in substantially non-specific binding.

【０００２】 酵母「2ハイブリッド(two hybrid)」技術は、選択可能であるか又は検出可能
なタンパク質の転写を誘発する一対の転写因子を用いる。この技術は、酵素-基
質の相互作用の試験を含む幾つかの状況に適用され、拡張されている[R.Sikorsk
i及びR.Peters, Science 281, 1822-1823 (1998年9月18日)]。一般に、第一ハイ
ブリッドは、興味ある第一タンパク質と転写因子のひとつで形成される。第二ハ
イブリッドは、興味ある第二タンパク質と別の転写因子で形成される。興味ある
タンパク質が2つ結合している場合には、次いで、2つの転写因子が結合し、検出
可能であるか又は選択可能なタンパク質の転写が開始される。この技術の利点は
結合が細胞で生じることであり、異なる「2ハイブリッド」細胞でライブラリー
の種々のメンバーを挿入し、そこでライブラリー転写産物を発現させることによ
って、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングに容易に適用することが
できる。この技術の欠点は転写因子の使用が制限されることで、結合反応は狭い
範囲でなければならず、一般には酵母で実施される。結合事象は、細胞核で生じ
なければならない。 したがって、生細胞で実施でき、生細胞内の種々の位置で実施でき、かつコン
ビナトリアルライブラリーのスクリーニングに容易に適用することができる、タ
ンパク質-タンパク質の相互作用のスクリーニングについて新たな方法が必要と
されている。[0002] Yeast "two hybrid" technology uses a pair of transcription factors that trigger the transcription of a selectable or detectable protein. This technique has been applied and extended to several situations, including testing enzyme-substrate interactions [R. Sikorsk
i and R. Peters, Science 281, 1822-1823 (September 18, 1998)]. Generally, a first hybrid is formed of a first protein of interest and one of the transcription factors. A second hybrid is formed of the second protein of interest and another transcription factor. If the two proteins of interest are bound, then the two transcription factors bind and initiate transcription of the detectable or selectable protein. The advantage of this technique is that binding occurs in the cell, which facilitates screening of combinatorial libraries by inserting different members of the library in different "two-hybrid" cells and expressing the library transcripts there. Can be applied. The disadvantage of this technique is the limited use of transcription factors, the binding reaction must be in a narrow range and is generally performed in yeast. The binding event must occur in the cell nucleus. Thus, there is a need for new methods for screening protein-protein interactions that can be performed in living cells, can be performed at various locations within living cells, and can be easily applied to combinatorial library screening. ing.

【０００３】発明の要約 この発明の第一の観点は、生細胞におけるタンパク質-タンパク質相互作用の
検出方法である。この方法は、(a)検出可能な基に接合した興味ある第一タンパ
ク質からなる異種の第一接合体(conjugate)と、細胞内の内部構造に特異的に結
合するタンパク質に接合した興味ある第二タンパク質からなる異種の第二接合体
を含む細胞を用意し、次いで(b)内部構造に対する検出可能な基の結合の有無を
検出し、結合の存在が、興味ある第一及び第二タンパク質が互いに特異的に結合
していることを示すことからなる。 興味あるタンパク質は、同じか異なっていてもよい。興味あるタンパク質は、
特異的な結合対のメンバーであってもよい。好ましくは、検出可能な基はタンパ
ク質であり、興味ある第一タンパク質と検出可能な基はともに融合タンパク質か
らなる。好ましくは、異種の第二接合体も融合タンパク質である。望ましい場合
には、細胞は、いずれか又は双方の融合タンパク質をエンコードする核酸を含み
発現してもよく、あるいは異種構築物は、細胞に外来で与えてもよい。細胞は、
真核細胞であることが好ましい。[0003] The first aspect of the Summary of the Invention The present invention, proteins in living cells - a method for detecting protein interactions. This method comprises the steps of (a) connecting a heterologous first conjugate consisting of a first protein of interest conjugated to a detectable group, and an interesting first conjugate conjugated to a protein that specifically binds to an internal structure within the cell. A cell containing a heterologous second conjugate consisting of two proteins is prepared, and then (b) the presence or absence of a detectable group binding to the internal structure is detected. To indicate that they are specifically bound to each other. The proteins of interest can be the same or different. The proteins of interest are
It may be a member of a specific binding pair. Preferably, the detectable group is a protein and both the first protein of interest and the detectable group consist of a fusion protein. Preferably, the heterologous second conjugate is also a fusion protein. If desired, the cells may contain and express nucleic acids encoding either or both fusion proteins, or the heterologous construct may be provided exogenously to the cells. The cells are
Preferably, it is a eukaryotic cell.

【０００４】 この発明の別の観点は、上記融合タンパク質をエンコードする核酸、このよう
な融合タンパク質を含み発現する細胞、上記方法を実施するのに有用なキット、
及び上記方法を実施するためのスクリーニング手段として有用な核酸ライブラリ
ーを含む。 この発明は、既知の結合対の結合を崩壊又は阻害する能力について化合物をス
クリーニングし、それによってその競合阻害剤を同定するのに有用である。この
発明は、興味ある既知のタンパク質に結合する化合物を同定するために、興味あ
る他のタンパク質のライブラリーに対して既知の興味あるタンパク質の1つをス
クリーニングするのに有用である。 この発明の前記及び他の目的及び観点は、ここにある図面及び後述の明細書に
詳細に説明する。[0004] Another aspect of the invention is a nucleic acid encoding the fusion protein, cells containing and expressing such a fusion protein, kits useful for performing the above methods,
And a nucleic acid library useful as a screening means for performing the above method. The invention is useful for screening compounds for their ability to disrupt or inhibit the binding of a known binding pair, thereby identifying their competitive inhibitors. The invention is useful for screening one known protein of interest against a library of other proteins of interest to identify compounds that bind to the known protein of interest. The above and other objects and aspects of the present invention will be described in detail in the drawings herein and the following specification.

【０００５】図面の簡単な説明 図１ GFP-標識したCaMKIIa及びCaMKIIbの細胞局在及び可動性。 図１Ａ GFP-標識したCaMKIIのイソ型のドメイン組織の概要図。触媒ドメイン
(C)、調節ドメイン(R)、可変性ドメイン(V)及びオリゴマー化ドメイン(A)を示し
ている。 図１Ｂ GFP-標識したCaMKIIのイソ型の自己リン酸化。CaMKIIa、GFP-CaMKIIa
及びGFP-CaMKIIbに関する、ベースライン(左)、カルシウム/CaM-依存性(中央)及
びバースト(右)の自己リン酸化活性の比較。翻訳されたGFPのみを対照として含
めた。 図１Ｃ 発現されたCaMKII又はGFP-CaMKIIタンパク質量に対して修正された相
対的なキナーゼ活性(³²P導入及び³⁵S-Met導入の比率として測定)。黒いバーは、
高度なCa²⁺/CAM中の³²P-ATPとの30秒のインキュベーション後のCaMKIIの自己リ
ン酸化を示す。明るい色のバーは、高カルシウム中で30秒後、及びEGTA中で120
秒後のカルシウム非依存性の「バースト」自己リン酸化を示す。 図１Ｄ 生海馬のCA1-CA3ニューロンで発現されるGFP-標識したCaMKIIa(左)及
びCaMKIIb(右)の共焦画像。CaMKIIbが樹状枝で増強しているが、GFP-CaMKIIaが
細胞体及び主要な枝にわたって均一に分布していることに留意のこと。 図１Ｅ 生RBL-細胞で発現されるGFP-標識したCaMKIIa(左)及びCaMKIIb(右)の
共焦画像。GFP-CaMKIIbの皮質染色と不均一な内部染色、及びGFP-CaMKIIaの均一
な分布に留意のこと。 図１Ｆ GFP-CaMKIIa及びGFP-CaMKIIbについて算出される拡散係数の比較。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG . 1 Cellular localization and mobility of GFP-labeled CaMKIIa and CaMKIIb. FIG. 1A Schematic representation of the domain organization of the GFP-labeled CaMKII isoform. Catalytic domain
(C), regulatory domain (R), variable domain (V) and oligomerization domain (A). FIG. 1B. Autophosphorylation of the GFP-labeled CaMKII isoform. CaMKIIa, GFP-CaMKIIa
Comparison of baseline (left), calcium / CaM-dependent (center) and burst (right) autophosphorylation activity for GFP and GFP-CaMKIIb. Only translated GFP was included as a control. FIG. 1C Relative kinase activity relative to the amount of CaMKII or GFP-CaMKII protein expressed (measured as the ratio of ³² P transduction and ³⁵ S-Met transduction). The black bar is
9 shows the autophosphorylation of CaMKII after 30 seconds incubation with ³² P-ATP in advanced Ca ²⁺ / CAM. The light-colored bar shows after 30 seconds in high calcium and 120 in EGTA.
2 shows calcium-independent “burst” autophosphorylation after 2 seconds. FIG. 1D Confocal images of GFP-labeled CaMKIIa (left) and CaMKIIb (right) expressed in CA1-CA3 neurons in the raw hippocampus. Note that CaMKIIb is enhanced in dendritic branches, but GFP-CaMKIIa is uniformly distributed across the cell body and major branches. FIG. 1E Confocal images of GFP-labeled CaMKIIa (left) and CaMKIIb (right) expressed in live RBL-cells. Note the cortical and heterogeneous internal staining of GFP-CaMKIIb and the homogeneous distribution of GFP-CaMKIIa. FIG. 1F Comparison of diffusion coefficients calculated for GFP-CaMKIIa and GFP-CaMKIIb.

【０００６】 図２ 生細胞におけるタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための「プ
ルアウト(Pull-Out)」結合アッセイの開発。 図２Ａ プル-アウト結合アッセイの原理。タンパク質Xとタンパク質Yとの結
合相互作用は、誘導性原形質膜結合ドメイン(PM-ドメイン)でタンパク質Xを、GF
Pでタンパク質Yを標識して測定できる。2つのタンパク質の有意な画分が互いに
結合する場合には、薬剤添加により、GFPを原形質膜に標的化させる。対照的に
、サイトゾルの分布は、タンパク質XとYが互いに結合しない場合に変化しないま
まである。 図２Ｂ プル-アウト結合アッセイで誘導性のPM-ドメインとして用いられる最
小のホルボールエステル結合ドメインの特性。GFPとホルボールエステル結合ド
メインとの融合タンパク質は、ホルボールエステルを加えてサイトゾルから原形
質膜に引き寄せることができる。左、ホルボールエステル添加前の融合タンパク
質の分布。右、ホルボールエステル添加後の融合タンパク質の分布。下、ホルボ
ールエステル添加前後の細胞全域の蛍光強度の光スキャン。 図２Ｃ ほとんど全てのCaMKIIa分子がオリゴマーの一部であることの論証。P
M-CaMKIIa及びGFP-CaMKIIaの同時発現を伴う細胞へのホルボールエステルの添加
は、GFP-CaMKIIaのほぼ完全な原形質膜の転位をもたらす。 図２Ｄ 発現されるGFP自体がホルボールエステルの添加で影響を及ぼされて
いないことを示す対照の測定。較正バーは、10μmである。FIG. 2. Development of a “Pull-Out” binding assay to study protein-protein interactions in living cells. FIG. 2A Principle of the pull-out binding assay. The binding interaction between protein X and protein Y is based on the inducible plasma membrane binding domain (PM-domain) that binds protein X, GF
It can be measured by labeling protein Y with P. If significant fractions of the two proteins bind to each other, drug addition targets GFP to the plasma membrane. In contrast, the cytosolic distribution remains unchanged when proteins X and Y do not bind to each other. FIG. 2B. Characteristics of the smallest phorbol ester binding domain used as an inducible PM-domain in a pull-out binding assay. The fusion protein of GFP and phorbol ester binding domain can be attracted from the cytosol to the plasma membrane with the addition of phorbol ester. Left, distribution of fusion protein before addition of phorbol ester. Right, distribution of fusion protein after addition of phorbol ester. Bottom, optical scan of fluorescence intensity across the cell before and after phorbol ester addition. FIG. 2C Demonstration that almost all CaMKIIa molecules are part of the oligomer. P
Addition of phorbol ester to cells with co-expression of M-CaMKIIa and GFP-CaMKIIa results in almost complete translocation of the plasma membrane of GFP-CaMKIIa. FIG. 2D Control measurements showing that the expressed GFP itself was not affected by the addition of phorbol ester. The calibration bar is 10 μm.

【０００７】 図３ CaMKIIaは、CaMKIIbより大きなオリゴマーを形成する。 図３Ａ 生細胞におけるCaMKIIa及びCaMKIIbオリゴマーの大きさを測定するた
めのアッセイの概略図。 図３Ｂ 生体外翻訳によって測定される発現したGFP-CaMKIIa及びPM-CaMKIIa
濃度の比較定量。発現されるタンパク質の相対濃度は、生体外で翻訳したタンパ
ク質に³⁵S-Metを導入して比較した。同じRNAを、生体外翻訳及び細胞のRNAトラ
ンスフェクションに用いた。 図３Ｃ 10％より下の希釈についてのみ、PM-CaMKIIaは、原形質膜にGFP-CaMK
IIaを転位するための能力を失い始める。希釈は、比率を低下させてPM-CaMKIIa
及びGFP-CaMKIIaにRNAを混合して行った。上部と中央、原形質膜は1:1及び1:5の
希釈で依然としてほぼ最大である。下部、原形質膜転位は、1:40の希釈で著しく
低下する。較正バーは10μmである。 図３Ｄ ホルボールエステル添加後の3つの異なる希釈物の光スキャンプロフ
ィル。 図３Ｅ 相対的な原形質膜転位を測定するのに用いられる定量分析の概略図。
I_pre及びDPMは、それぞれPMAの添加前後に測定する。 図３Ｆ 発現されるPM-CaMKII及びGFP-CaMKIIの比率を低下させた、CaMKIIa及
びCaMKIIbの相対的な原形質膜転位のプロット。各ポイントは、少なくとも10回
の実験の平均である。無地の曲線は2セットのデータに最適であり、破線(dashed
line)は信頼区間を示す。CaMKIIaに対して13.5サブユニット、CaMKIIbに対して
4.2サブユニットの平均を想定して、最良の適合性が得られた。FIG. 3 CaMKIIa forms larger oligomers than CaMKIIb. FIG. 3A is a schematic diagram of an assay for measuring the size of CaMKIIa and CaMKIIb oligomers in living cells. FIG. 3B Expressed GFP-CaMKIIa and PM-CaMKIIa measured by in vitro translation
Comparative quantification of concentration. The relative concentrations of the expressed proteins were compared by introducing ³⁵ S-Met into the translated protein in vitro. The same RNA was used for in vitro translation and RNA transfection of cells. FIG. 3C Only for dilutions below 10%, PM-CaMKIIa shows GFP-CaMK
Start losing the ability to translocate IIa. Dilution reduces PM-CaMKIIa
And GFP-CaMKIIa mixed with RNA. Top and middle, plasma membrane is still almost maximal at 1: 1 and 1: 5 dilutions. Lower, plasma membrane translocation is significantly reduced at a dilution of 1:40. The calibration bar is 10 μm. FIG. 3D Optical scan profiles of three different dilutions after phorbol ester addition. FIG. 3E Schematic of quantitative analysis used to measure relative plasma membrane translocation.
I _pre and DPM are measured before and after the addition of PMA, respectively. FIG. 3F Plot of relative plasma membrane translocation of CaMKIIa and CaMKIIb with reduced ratio of expressed PM-CaMKII and GFP-CaMKII. Each point is the average of at least 10 experiments. The solid curve is best for two sets of data and is dashed (dashed
(line) indicates a confidence interval. 13.5 subunit for CaMKIIa, for CaMKIIb
Assuming an average of 4.2 subunits, the best fit was obtained.

【０００８】 図４ アクチン細胞骨格にCaMKIIa/bヘテロ-オリゴマーを標的化するための1
以上のCaMKIIbサブユニットの必要条件。 図４Ａ 主としてCaMKIIaのヘテロ-オリゴマーへのCaMKIIbの挿入は、推計学
上のプロセスである。発現されたPM-CaMKIIbの比率を低下させた、GFP-CaMKIIa
の相対的な原形質膜転位のプロット。各ポイントは、少なくとも10回の実験の平
均である。破線は、推計学上のPM-CaMKIIbのヘテロ-オリゴマーへの挿入につい
て予想される曲線を示す(p = 1-(R/(R+1))^N、Rは希釈比率、かつNはサブユニッ
ト数；PM-ドメインはほぼ可逆性の膜結合相互作用を誘導するので、オリゴマー
当たりに1つのPM-ドメインで転位の誘導には十分であると思われた)。 図４Ｂ 主としてCaMKIIbを有するヘテロ-オリゴマーへのCaMKIIaの挿入は、
推計学上のプロセスである。発現されるPM-CaMKIIbの比率を低下させた、GFP-Ca
MKIIaの相対的な原形質膜転位のプロット。各ポイントは、少なくとも10回の実
験の平均である。CaMKIIbオリゴマーへのPM-CaMKIIaの推計学上の挿入について
推測される曲線は、データの適合性と重複する。 図４Ｃ CaMKIIbの希釈を増した関数としてプロットしたGFP-CaMKIIaの相対的
な皮質転位。相対的な皮質局在は、D_PM/I_AV [D_PMはPMとサイトゾルとの強度の相
違であり、I_AVは特定細胞の平均的な蛍光強度]として定義する。各ポイントは、
少なくとも10回の実験の平均である。 図４Ｄ CaMKIIbからGFP-CaMKIIaへの希釈の増大の関数としての拡散係数にお
ける変化の測定。GFP-CaMKIIaの見かけの拡散係数は、CaMKIIbのCaMKIIaに対す
る比率が1:2〜1:9に低下したので、0.2〜1mm²/sに増した。もっとも上部の左右
のデータポイントは、それぞれGFP-CaMKIIb及びCaMKIIaの拡散係数を示す。FIG. 4. One for targeting CaMKIIa / b hetero-oligomer to the actin cytoskeleton
Requirements for the above CaMKIIb subunit. FIG. 4A Insertion of CaMKIIb primarily into the hetero-oligomer of CaMKIIa is a stochastic process. GFP-CaMKIIa with reduced proportion of PM-CaMKIIb expressed
Plot of relative plasma membrane translocation of. Each point is the average of at least 10 experiments. The dashed line shows the expected curve for insertion of PM-CaMKIIb into the hetero-oligomer on the stochastic (p = 1- (R / (R + 1)) ^N , where R is the dilution ratio and N is Number; one PM-domain per oligomer appeared to be sufficient to induce translocation, since PM-domains induce nearly reversible membrane-bound interactions). FIG. 4B Insertion of CaMKIIa into hetero-oligomers with predominantly CaMKIIb
It is a stochastic process. GFP-Ca with reduced proportion of PM-CaMKIIb expressed
Plot of relative plasma membrane translocation of MKIIa. Each point is the average of at least 10 experiments. The curve inferred for the stochastic insertion of PM-CaMKIIa into the CaMKIIb oligomer overlaps with the fit of the data. FIG. 4C Relative cortical translocation of GFP-CaMKIIa plotted as a function of increasing dilution of CaMKIIb. Relative cortical localization is defined as D _PM / I _AV [D _PM is the difference in intensity between PM and cytosol, I _AV is the average fluorescence intensity of a particular cell]. Each point is
Average of at least 10 experiments. FIG. 4D Measurement of change in diffusion coefficient as a function of increasing dilution from CaMKIIb to GFP-CaMKIIa. The apparent diffusion coefficient of GFP-CaMKIIa increased to 0.2-1 mm ² / s as the ratio of CaMKIIb to CaMKIIa decreased from 1: 2 to 1: 9. The top left and right data points show the diffusion coefficients for GFP-CaMKIIb and CaMKIIa, respectively.

【０００９】好ましい具体例の詳細な説明 この発明を実施するのに用いられる「検出可能な基」又は「検出可能なタンパ
ク質」は、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びアポエクオリンのような、その類似体
及び誘導体を含む蛍光タンパク質を包含する。緑色蛍光タンパク質は、クラゲの
エクオリア・ビクトリア(Aequorea victoria)から得られ、微生物、植物、昆虫
及び哺乳動物細胞の広範囲にわたって発現される[A.Crameriら、Nature Biotech
. 14, 315-319(1996)]。いかなる検出可能な基も用いられ、他の適当な検出可能
な基には、他の発蛍光団又は蛍光インジケーター、例えばアビジン、ストレプト
アビジン及びレセプターのリガンド結合ドメインのようないずれかの結合ドメイ
ンとの融合標識が含まれる。発蛍光団又は興味あるインジケーターへのビオチン
もしくは他のリガンドの結合は、デキストランマトリクス又は他のリンカーシス
テムを用いて成し得ることができる。検出可能なタンパク質は、FLASH技術での
ように特異的に発蛍光団に結合するタンパク質であってもよい。蛍光性の検出可
能な基(蛍光性タンパク質及び別の発蛍光団分子に結合するタンパク質の双方を
含む)が、現在好ましい。[0009] DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED "detectable group" used in practicing the present invention in the embodiment or "detectable protein", such as green fluorescent protein (GFP) and apoaequorin, analogs thereof And fluorescent proteins, including derivatives. Green fluorescent protein is obtained from the jellyfish Aequorea victoria and is widely expressed in microbial, plant, insect and mammalian cells [A. Crameri et al., Nature Biotech.
14, 315-319 (1996)]. Any detectable group may be used, other suitable detectable groups include other fluorophores or fluorescent indicators, such as avidin, streptavidin and any binding domain, such as the ligand binding domain of the receptor. A fusion label is included. Binding of biotin or other ligand to the fluorophore or indicator of interest can be accomplished using a dextran matrix or other linker system. The detectable protein may be a protein that specifically binds to the fluorophore, as in FLASH technology. Fluorescent detectable groups, including both fluorescent proteins and proteins that bind to another fluorophore molecule, are presently preferred.

【００１０】 ここで用いられる「内部構造」は、細胞内に含有される個別で、不連続の同定
し得る成分に関する。細胞の構成部分に適用されるような用語「構造」は公知[
例えばR.Dyson, Cell Biology: A Molecular Approach, 10頁(第2版、1978)参照
]であり、用語「内部構造」は、鞭毛及び繊毛のような外部構造を除くことを意
図する。このような内部構造は、一般に細胞が含有する細胞の解剖学上の構造で
ある。内部構造の例には、サイトゾル又は核外の細胞質に位置する構造(「細胞
質構造」とも呼ばれる)、及び核内に位置する構造(「核構造」とも呼ばれる)の
双方が含まれる。核膜を含む核自体は、内部構造である。核外の細胞質に位置す
る構造が、現在好ましい。つまり、用語「内部構造」は、詳細には、タンパク質
、脂質、炭水化物、核酸等及びその誘導体を含む、不均一に分布しているいずれ
かの細胞成分を含むことを意図する。[0010] As used herein, "internal structure" refers to discrete, discrete, identifiable components contained within a cell. The term "structure" as applied to a component of a cell is known [
See, for example, R. Dyson, Cell Biology: A Molecular Approach, page 10 (2nd edition, 1978)
] And the term “internal structure” is intended to exclude external structures such as flagella and cilia. Such an internal structure is generally an anatomical structure of a cell contained by the cell. Examples of internal structures include both structures located in the cytosol or cytoplasm outside the nucleus (also called "cytoplasmic structures") and structures located in the nucleus (also called "nuclear structures"). The nucleus itself, including the nuclear envelope, is an internal structure. Structures located in the extranuclear cytoplasm are presently preferred. That is, the term "internal structure" is specifically intended to include any heterogeneously distributed cellular component, including proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids, etc. and derivatives thereof.

【００１１】 ここで用いられるような「ライブラリー」は、同時に又は連続して、ともに用
いることができる形態で集合もしくは集まった異なる化合物、一般的には有機化
合物の集合体に関する。化合物は、小さな有機化合物又はタンパク質及びペプチ
ドを含む生物ポリマーであってもよい。化合物は、中間体として核酸によってエ
ンコードされ産生されてもよい。核酸の集合体は、ライブラリーとしても言及さ
れる。核酸ライブラリーが用いられる場合、それは「コンビナトリアルライブラ
リー」又は「コンビナトリアルケミストリーライブラリー」として一般的に知ら
れているランダムもしくは部分的にランダムなライブラリーであってもよく、又
はゲノムライブラリーもしくはcDNAライブラリーのような特定の細胞又は生物か
ら得られるライブラリーであってもよい。小さい有機分子は、コンビナトリアル
ケミストリー技術によっても生産することができる。したがって、一般的には、
このようなライブラリーは有機化合物からなり、制限されたオリゴマー、非オリ
ゴマーもしくはその組合わせを含むがこれに限定されない。非オリゴマーには、
広範囲の有機分子、例えば複素環、芳香族化合物、脂環式、脂肪族化合物及びそ
の組合わせのような、ステロイド、抗生物質、酵素阻害剤、リガンド、ホルモン
、薬剤、アルカロイド、オピオイド、ベンゾジアゼピン、テルペン、プロフィリ
ン(prophyrin)、毒素、触媒ならびにその組み合わせが含まれる。オリゴマーは
、ペプチド(つまりオリゴペプチド)及びタンパク質、DNA及びRNAのようなオリゴ
ヌクレオチド(用語「オリゴヌクレオチド」も、ここで単に「ヌクレオチド」と
して言及する)、オリゴ糖、ポリ脂質、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリユレア、ポリエーテル、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミド
、ホスホンアミド、ホスファイト、ホスフィンアミド等のようなポリ(ホスホラ
ス誘導体)、スルホン、スルホネート、スルファイト、スルホンアミド等のよう
なポリ(硫黄誘導体)(リンと硫黄の誘導体については、多くの部分に示されるヘ
テロ原子はC、H、N、O又はS及びその組合わせに結合する)を含む[例えば、Still
らの米国特許第5,565,324号、Ellmanらの米国特許第5,284,514号、Fodorらの米
国特許第5,445,934号参照(ここに挙げた米国特許の開示は全てその全部を引用す
ることによってここに導入される)]。As used herein, “library” refers to a collection of different compounds, generally organic compounds, assembled or assembled in a form that can be used together, either simultaneously or sequentially. The compound may be a small organic compound or a biological polymer including proteins and peptides. Compounds may be encoded and produced by nucleic acids as intermediates. The collection of nucleic acids is also referred to as a library. If a nucleic acid library is used, it may be a random or partially random library commonly known as a `` combinatorial library '' or `` combinatorial chemistry library '', or a genomic library or cDNA It may be a library obtained from a specific cell or organism, such as a library. Small organic molecules can also be produced by combinatorial chemistry techniques. Therefore, in general,
Such libraries consist of organic compounds and include, but are not limited to, restricted oligomers, non-oligomers or combinations thereof. Non-oligomers include:
A wide range of organic molecules such as steroids, antibiotics, enzyme inhibitors, ligands, hormones, drugs, alkaloids, opioids, benzodiazepines, terpenes, such as heterocycles, aromatics, alicyclics, aliphatics and combinations thereof. , Prophyrins, toxins, catalysts and combinations thereof. Oligomers include peptides (i.e., oligopeptides) and oligonucleotides such as proteins, DNA and RNA (the term "oligonucleotide" is also referred to herein simply as "nucleotide"), oligosaccharides, polylipids, polyesters, polyamides, polyurethanes. Poly (phosphorus derivative) such as polyurea, polyether, phosphate, phosphonate, phosphoramide, phosphonamide, phosphite, phosphinamide, etc .; and poly (sulfur derivative) such as sulfone, sulfonate, sulfite, sulfonamide, etc. And the sulfur derivatives, the heteroatoms shown in many parts are attached to C, H, N, O or S and combinations thereof.
See U.S. Pat.No. 5,565,324, Ellman et al., U.S. Pat.No. 5,284,514, and Fodor et al., U.S. Pat.No. 5,445,934, the disclosures of all of which are hereby incorporated by reference in their entirety. ].

【００１２】 ここで用いられるような「核酸」は、DNAとRNAの双方に関する。 ここで用いられるような「タンパク質」は、タンパク質フラグメント又はペプ
チドを含むことを意図する。つまり、用語「タンパク質」は、特に「興味あるタ
ンパク質」又は特異的な結合対のメンバーであるタンパク質を参照して、(簡潔
にする目的で)「タンパク質又はそのフラグメント」の表現で同義で用いられる
。タンパク質フラグメントは、二次又は三次構造を想定してもよいし、想定しな
くてもよい。タンパク質フラグメントは、50、100もしくは200ペプチドまで又は
それ以上の長さ、相当するタンパク質の全長までの、2、3、5又は10ペプチドの
いかなる長さであってもよい。 ここで用いられるような「特異的に結合する」及び「特異的な結合」は、立体
特異的結合、静電気的結合又は親水性結合の相互作用を含むが、これに限定され
ない。したがって、特異的に結合する、及び特異的な結合は、結合が認められる
細胞内の他のタンパク質又は結合パートナーに比較して、結合パートナー間の見
かけの結合親和性が少なくとも2倍もしくは3倍(つまり、2もしくは3倍)大きいこ
とによって示される。“Nucleic acid” as used herein relates to both DNA and RNA. "Protein" as used herein is intended to include protein fragments or peptides. That is, the term "protein" is used synonymously in the expression "protein or fragment thereof" (for the sake of brevity), with particular reference to "proteins of interest" or proteins that are members of specific binding pairs. . A protein fragment may or may not assume a secondary or tertiary structure. Protein fragments can be any length of 2, 3, 5 or 10 peptides, up to 50, 100 or 200 peptides or more, up to the full length of the corresponding protein. As used herein, "specifically binds" and "specific binding" include, but are not limited to, stereospecific binding, electrostatic binding, or hydrophilic binding interactions. Thus, specific binding, and specific binding, is at least two or three times the apparent binding affinity between the binding partners compared to other proteins or binding partners in the cell where binding is observed ( (Two or three times).

【００１３】 「特異的な結合対」は、特異的に互いに結合している分子対(例えばタンパク
質対)に関する。特異的に互いに結合する分子対は、同じか異なっていてもよく
、特異的な結合対のメンバーとして言及される。特異的な結合対のメンバーであ
るタンパク質は、特異的な結合対のメンバーであることがあらかじめ立証されて
いるタンパク質又は特異的な結合対の推測上のメンバーであるタンパク質であっ
てもよい。後者の例には、cDNA又はコンビナトリアルライブラリーの生成物のよ
うなライブラリーのメンバー、又は天然に存在する(例えばcDNA生成物又はゲノ
ムDNAライブラリー)か、もしくは天然に存在しない(例えばコンビナトリアル)結
合パートナーを同定することが望ましい場合には、結合パートナーが依然として
同定されていないタンパク質が含まれる。 ここで用いられるような「転位」は、タンパク質又は接合体(融合タンパク質
含む)の細胞内でのある物理的な分布から、細胞内の別の異なる物理的な分布へ
の分布における変化に関する。好ましくは、転位は、均一又は不均一な分布のい
ずれかから不均一な分布に対するものである。転位は、不均一な分布から均一な
分布に対するものであってもよい。“Specific binding pair” refers to a pair of molecules (eg, a pair of proteins) that are specifically bound to each other. The pairs of molecules that specifically bind to each other may be the same or different and are referred to as members of the specific binding pair. A protein that is a member of a specific binding pair may be a protein that has been previously proven to be a member of a specific binding pair or a protein that is a putative member of a specific binding pair. Examples of the latter include members of a library, such as a cDNA or a product of a combinatorial library, or naturally occurring (e.g., a cDNA product or genomic DNA library) or non-naturally occurring (e.g., a combinatorial) binding. Where it is desirable to identify a partner, proteins for which a binding partner has not yet been identified are included. "Translocation" as used herein relates to a change in the distribution of a protein or conjugate (including a fusion protein) from one physical distribution in a cell to another different physical distribution in a cell. Preferably, the dislocations are from either a uniform or non-uniform distribution to a non-uniform distribution. The dislocations may be from a non-uniform distribution to a uniform distribution.

【００１４】 上記のように、この発明は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出する方法
を提供する。この方法は、最初に、異種の第一接合体と異種の第二接合体を含む
細胞を用意することからなる。異種の第一接合体は、検出可能な基に接合した興
味ある第一タンパク質からなる。異種の第二接合体は、細胞内の内部構造に特異
的に結合するタンパク質に接合した興味ある第二タンパク質(興味ある第一タン
パク質と同じ又は異なっていてもよい)からなる。内部構造に特異的に結合する
タンパク質の結合は、即時であってもよく、誘導されてもよく(後述のとおり)、
又は予め局在しているか、もしくは興味ある内部構造に永久的に位置しているタ
ンパク質の場合に事前の結合であってもよい。2つの接合体は、約1又は10nM〜約
1又は10mMの全濃度で細胞にそれぞれ存在することが好ましい。 内部構造に対する検出可能な基の結合の有無を検出し、次いで、結合の存在は
、興味ある第一及び第二タンパク質が互いに特異的に結合していることを示す。
検出は、用いられる検出基に応じていかなる適当な手段によってもよいが、好ま
しくは検出可能な基は蛍光基であり、検出は、手動で行われ得る光学もしくは可
視的なリーディングで、自動装置によって又はそれらの組合わせで行われる。As described above, the present invention provides a method for detecting a protein-protein interaction. The method comprises first providing a cell containing a heterologous first conjugate and a heterologous second conjugate. A heterologous first conjugate consists of a first protein of interest conjugated to a detectable group. A heterologous second conjugate consists of a second protein of interest (which may be the same or different from the first protein of interest) conjugated to a protein that specifically binds to an internal structure within the cell. Binding of a protein that specifically binds to an internal structure may be immediate or induced (as described below),
Alternatively, it may be a pre-binding in the case of a protein that is pre-localized or permanently located in an internal structure of interest. The two conjugates are from about 1 or 10 nM to about
Preferably, it is present in the cells at a total concentration of 1 or 10 mM, respectively. Detecting the presence or absence of a detectable group attached to the internal structure, then the presence of the bond indicates that the first and second proteins of interest are specifically bound to each other.
Detection may be by any suitable means, depending on the detection group used, but preferably the detectable group is a fluorescent group, and detection is by optical or visible reading, which can be performed manually, by automated equipment. Or a combination thereof.

【００１５】 望ましい場合には、異種の第二接合体は、さらに検出可能な基を含むことがで
きる。検出可能な基は、好ましくは、異種の第一接合体に位置する検出可能な基
とは異なり、異なる波長で蛍光を発する。例えば、検出可能な基は、双方とも緑
色蛍光タンパク質、さらに単純には異なる波長で蛍光を発する緑色蛍光タンパク
質の異なる変異体であってもよい。 異種の接合体のいずれか又は両方を、エレクトロポレーション又はリポフェク
ションのようないずれかの適当な手段で細胞に直接導入することができる。ある
いは、異種接合体が融合タンパク質である際に、融合タンパク質をエンコードす
る核酸の発現を制御して引き起こす適当なプロモーターセグメントを含む核酸(
一般にはDNA)を、細胞に安定的(例えばプラスミドとして)に導入してもよい。ま
た、融合タンパク質のいずれか又は双方を、このようにして細胞に導入してもよ
い。 この発明で結合事象は、直接又は間接的な結合事象であってもよい。間接的な
結合事象は、中間体、又は架橋結合、分子又は接合体を介して媒介される事象で
ある。このような架橋分子の供与は、転位を誘導するシグナルであり得る(後述)
。例えば、架橋分子は、FK506及びサイクロスポリンの共有接合体であり、FKBP1
2とサイクロフィリン(cyclophilin)(ともに伝統的なサイトゾルタンパク質)の間
接的な結合を互いに引き起こすことができる。FKBP12又はサイクロフィリンのい
ずれかを修飾して、例えばタンパク質を脂質化するか、又はトランスメンブラン
タンパク質のトランスメンブランドメインとの融合タンパク質を形成することに
よって原形質膜に結合させることができる。If desired, the heterologous second conjugate can further include a detectable group. The detectable group preferably fluoresces at a different wavelength, unlike the detectable group located on the heterologous first conjugate. For example, the detectable groups may be different variants of the green fluorescent protein, both of which fluoresce at different wavelengths, more simply green fluorescent protein. Either or both heterologous conjugates can be introduced directly into cells by any suitable means, such as electroporation or lipofection. Alternatively, when the heterozygote is a fusion protein, a nucleic acid containing an appropriate promoter segment that controls and causes the expression of the nucleic acid encoding the fusion protein (
(Generally DNA) may be introduced into cells stably (eg, as a plasmid). Also, either or both of the fusion proteins may be introduced into cells in this manner. In the present invention, the binding event may be a direct or indirect binding event. An indirect binding event is an event that is mediated through an intermediate or a cross-link, a molecule or a conjugate. Donation of such a cross-linking molecule can be a signal that induces rearrangement (described below).
. For example, the bridging molecule is a covalent conjugate of FK506 and cyclosporin, FKBP1
2 and cyclophilin (both traditional cytosolic proteins) can cause indirect binding to each other. Either FKBP12 or cyclophilin can be modified to bind to the plasma membrane, for example, by lipidating the protein or forming a fusion protein of the transmembrane protein with the transmembrane domain.

【００１６】 この発明の実施に用いられる細胞は一般的には真核細胞であり、酵母、植物又
は動物細胞であってもよい。酵母と動物細胞、特に哺乳動物細胞が、現在好まし
い。植物細胞の例には、シロイヌナズナ(arabidopsis)、タバコ、トマト及びポ
テトの植物細胞が含まれるが、これに限定されない。動物細胞の例には、ヒト、
サル、チンパンジー、ラット、ネコ、イヌ及びマウスの細胞が含まれるが、これ
に限定されない。 上記のいかなる内部構造も、内部構造への検出可能な基の結合が、検出可能な
基が内部構造に結合しない際に細胞から異なる検出可能なシグナルを生じる限り
、この発明の実施に用いることができる。ある好ましい具体例において、内部構
造は、細胞の細胞質に含有される。内部構造の例には、原形質膜、細胞骨格(ア
クチン細胞骨格、チューブリン細胞骨格、中間フィラメント、焦点接着(focal a
dhesion)を含むがこれに限定されない)、セントロメア、核、ミトコンドリア、
小胞体、液胞、ゴルジ装置及び葉緑体が含まれるが、これに限定されない。好ま
しくは、内部構造は、原形質膜であるか又は皮質細胞骨格のいずれかである。[0016] The cells used in the practice of this invention are generally eukaryotic cells, and may be yeast, plant or animal cells. Yeast and animal cells, especially mammalian cells, are presently preferred. Examples of plant cells include, but are not limited to, Arabidopsis, tobacco, tomato and potato plant cells. Examples of animal cells include human,
Includes, but is not limited to, monkey, chimpanzee, rat, cat, dog and mouse cells. Any of the above internal structures may be used in the practice of this invention, as long as the attachment of the detectable group to the internal structure results in a different detectable signal from the cell when the detectable group does not bind to the internal structure. it can. In certain preferred embodiments, the internal structure is contained in the cytoplasm of the cell. Examples of internal structures include the plasma membrane, cytoskeleton (actin cytoskeleton, tubulin cytoskeleton, intermediate filaments, focal adhesion (focal a
dhesion), centromere, nucleus, mitochondria,
Includes, but is not limited to, endoplasmic reticulum, vacuole, Golgi apparatus and chloroplast. Preferably, the internal structure is either the plasma membrane or the cortical cytoskeleton.

【００１７】 この発明の好ましい具体例において、内部構造に特異的に結合するタンパク質
は、転位可能なタンパク質である。この具体例において、方法は、検出工程の前
に、異種の第二接合体の転位を誘導する工程をさらに含む。転位の誘導は、いず
れかの適当な手段、例えば物理的又は化学的シグナルの供与(例えば、ホルボー
ルエステルのような化合物の供与)によって行うことができる。かかるタンパク
質は、サイトゾルタンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、アダプター
タンパク質、細胞骨格タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、GTP-結合タンパク
質、原形質膜タンパク質、原形質膜関連タンパク質、β-アレスチン(arrestin)
及び視覚性アレスチン(内部構造に特異的に結合するそのフラグメント含む)から
なる群から選択することができる。好ましくは、タンパク質は、内部構造に特異
的に結合するタンパク質キナーゼCのイソ型又はそのフラグメント、例えばC1ド
メインフラグメント又はC2ドメインフラグメントであり、ここで、導入シグナル
はホルボールエステルの供与である。さらに、転位の導入は、次に転位を誘導す
るシグナル化工程を誘導するレセプターアゴニストを用いて、グルタメートレセ
プター、β-アドレナリンレセプター、又はPAFレセプターのようなレセプターの
刺激によって導入され得る。最終的に、多くのタンパク質は、上記のような架橋
分子を用いることによってタンパク質を転位させるように修飾され得る。In a preferred embodiment of the invention, the protein that specifically binds to an internal structure is a transposable protein. In this embodiment, the method further comprises, prior to the detecting step, inducing translocation of the heterologous second conjugate. Induction of the rearrangement can be performed by any suitable means, for example, by providing a physical or chemical signal (eg, providing a compound such as a phorbol ester). Such proteins include cytosolic protein kinases, protein phosphatases, adapter proteins, cytoskeletal proteins, cytoskeletal-associated proteins, GTP-binding proteins, plasma membrane proteins, plasma membrane-associated proteins, β-arrestin
And visual arrestin (including fragments thereof that specifically bind to internal structure). Preferably, the protein is an isoform of protein kinase C or a fragment thereof, such as a C1 domain fragment or a C2 domain fragment, that specifically binds to an internal structure, wherein the transduction signal is the donation of a phorbol ester. In addition, translocation can be introduced by stimulation of a receptor, such as a glutamate receptor, a β-adrenergic receptor, or a PAF receptor, with a receptor agonist that then induces a signaling step that induces transposition. Finally, many proteins can be modified to translocate proteins by using cross-linking molecules as described above.

【００１８】 上記のように、この発明のひとつの具体例で、興味ある第一及び第二タンパク
質は、特異的な結合対のメンバーからともになっていてもよい。この具体例で、
発明は、検出工程前に細胞に試験化合物を供与する工程をさらに含んでいてもよ
い。ここで、内部構造への検出可能な基の結合の不在は、試験化合物が特異的な
結合対のメンバーの結合を阻害していることを示す。ペプチド、オリゴヌクレオ
チド、発現したタンパク質、小さな有機分子、既知の薬剤及びその誘導体、天然
又は非天然の化合物等を含む、いかなる試験化合物も用いることができる。試験
化合物の供与は、化合物が別の方法では膜に透過し得ない際にはエレクトロポレ
ーション又はリポフェクチン、又は(試験化合物がタンパク質である場合に)試験
化合物をエンコードして発現する異種の核酸を細胞に導入することによるような
直接供与を含むいかなる適当な手段によるものであってもよい。このような方法
は、既知の結合対の結合を崩壊する新しい化合物についての化合物のライブラリ
ーをスクリーニングするのに有用である。 この方法は、異なる濃度で構築物の結合親和性を測定するか、又は(特異的な
結合対のメンバーが同じである際に)形成されたオリゴマーの大きさを確立する
ために、いずれかの構築物の濃度を変えて結合親和性を定量的に決定するのに用
いることができる。As noted above, in one embodiment of the invention, the first and second proteins of interest may be made up of members of a specific binding pair. In this specific example,
The invention may further comprise the step of providing a test compound to the cells prior to the detecting step. Here, the absence of detectable group binding to the internal structure indicates that the test compound is inhibiting the binding of a specific binding pair member. Any test compound can be used, including peptides, oligonucleotides, expressed proteins, small organic molecules, known drugs and derivatives thereof, natural or unnatural compounds, and the like. The donation of the test compound may include electroporation or lipofectin when the compound cannot otherwise permeate the membrane, or (if the test compound is a protein) a heterologous nucleic acid that encodes and expresses the test compound. By any suitable means, including direct donation, such as by introduction into a cell. Such methods are useful for screening libraries of compounds for new compounds that disrupt the binding of known binding pairs. This method measures the binding affinity of the construct at different concentrations or establishes the size of the oligomer formed (when the specific binding pair members are the same) Can be used to quantitatively determine the binding affinity by varying the concentration of

【００１９】 また上記されるように、この発明の別の具体例では、方法は、さらに(c)興味
あるタンパク質のライブラリーを用いて工程(a)及び(b)を多数繰り返す工程を含
む。ここで、興味ある第一及び第二タンパク質のひとつは同一性を維持し、興味
ある他の第一及び第二タンパク質(可変性タンパク質又はスクリーンされるタン
パク質)はライブラリーの異なるメンバーで置換され、ライブラリーが、興味あ
る第一又は第二タンパク質のひとつに特異的に結合するタンパク質についてスク
リーンされる。工程の繰り返しによって、連続して、同時に又は連続的かつ同時
に行うことができる。変えられる興味あるタンパク質の供与は、化合物が別の方
法では膜に透過し得ない際にはエレクトロポレーション又はリポフェクチン、又
は(試験化合物がタンパク質である場合に)可変性タンパク質をエンコードして発
現する異種の核酸を細胞に導入することによるような直接供与を含むいかなる適
当な手段によるものであってもよい。このような方法は、既知のタンパク質への
結合について新しい候補物の化合物のライブラリーをスクリーンするのに有用で
ある。 この発明は、細胞及び興味あるタンパク質(例えば特異的な結合対のメンバー
であるタンパク質)内の内部構造に特異的に結合するタンパク質からなる融合タ
ンパク質、加えてかかる融合タンパク質をエンコードする核酸及びかかる核酸を
含んで発現する細胞(つまり、核酸は細胞で操作でき、融合タンパク質をエンコ
ードする核酸セグメントに操作的に結合している調節配列を含む)を提供する。
同様に、この発明は、特異的な結合対のメンバーのような、検出可能な基である
タンパク質と興味あるタンパク質からなる融合タンパク質を提供する。As also noted above, in another embodiment of the invention, the method further comprises (c) repeating steps (a) and (b) multiple times using a library of the protein of interest. Here, one of the first and second proteins of interest maintains identity and the other first and second proteins of interest (variable or screened proteins) are replaced by different members of the library, The library is screened for proteins that specifically bind to one of the first or second proteins of interest. By repeating the process, it can be performed continuously, simultaneously or continuously and simultaneously. Altered donation of a protein of interest encodes and expresses electroporation or lipofectin, or (if the test compound is a protein) a variable protein when the compound cannot otherwise permeate the membrane It may be by any suitable means, including direct donation, such as by introducing a heterologous nucleic acid into a cell. Such methods are useful for screening libraries of new candidate compounds for binding to known proteins. This invention relates to fusion proteins consisting of proteins that specifically bind to internal structures in cells and proteins of interest (e.g., proteins that are members of specific binding pairs), as well as nucleic acids encoding such fusion proteins and such nucleic acids (Ie, the nucleic acid can be engineered in the cell and contains regulatory sequences operably linked to the nucleic acid segment encoding the fusion protein).
Similarly, the invention provides fusion proteins consisting of a protein that is a detectable group, such as a member of a specific binding pair, and a protein of interest.

【００２０】 ある具体例で、生細胞内でのタンパク質-タンパク質の相互作用を検出するの
に有用なキットは、(a)第一の融合タンパク質をエンコードする核酸を含み発現
する上記の細胞(融合タンパク質は細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパ
ク質と興味ある第一タンパク質からなる)と、(b)発現カセットを含む細胞用のベ
クターとからなる。発現カセットは、細胞で操作可能で、検出可能なタンパク質
をエンコードする核酸に操作的に結合するプロモーターを含み、検出可能なタン
パク質をエンコードする核酸に隣合って位置するスプライス部位を有する。そこ
で、興味ある第二タンパク質をエンコードする異種の核酸がそこに挿入され、第
二の融合タンパク質をエンコードする核酸セグメントを産生することができる。
第二の融合タンパク質は、検出可能なタンパク質と興味ある第二タンパク質から
なる。別の具体例では、生細胞内でのタンパク質-タンパク質の相互作用を検出
するのに有用なキットは、(a)第一融合タンパク質をエンコードする核酸を含み
発現する上記の細胞(融合タンパク質は、検出可能なタンパク質と興味ある第一
タンパク質からなる)と、(b)発現カセットを含む細胞用のベクターとからなる。
発現カセットは、上記のように、細胞で操作でき、細胞内での内部構造に特異的
に結合するタンパク質をエンコードする核酸と操作的に結合するプロモーターを
含む。発現カセットは、同様に細胞内での内部構造に特異的に結合するタンパク
質(上記のとおり；好ましくは上記の転位可能なタンパク質)をエンコードする核
酸に隣合って位置するスプライス部位を有するので、興味ある第二タンパク質を
エンコードする異種の核酸をそこに挿入し、第二の融合タンパク質をエンコード
する核酸セグメントを産生することができる。第二の融合タンパク質は、細胞内
の内部構造に特異的に結合するタンパク質と興味ある第二のタンパク質とからな
る。このようなキットは、いずれかの適当な形態で提供することができ、一般的
には適当な指示とともに包装される。いかなるベクターも用いることができるが
、ベクターはプラスミドベクターであることが一般的である。In certain embodiments, kits useful for detecting protein-protein interactions in living cells include the above-described cells (fusion) containing and expressing (a) a nucleic acid encoding a first fusion protein. The protein comprises a protein that specifically binds to an internal structure in a cell and a first protein of interest), and (b) a vector for a cell containing an expression cassette. The expression cassette is operable in a cell, includes a promoter operably linked to the nucleic acid encoding the detectable protein, and has a splice site located adjacent to the nucleic acid encoding the detectable protein. Thus, a heterologous nucleic acid encoding a second protein of interest can be inserted therein to produce a nucleic acid segment encoding a second fusion protein.
The second fusion protein consists of a detectable protein and a second protein of interest. In another embodiment, a kit useful for detecting protein-protein interactions in living cells comprises a cell as described above comprising (a) a nucleic acid encoding a first fusion protein and expressing said nucleic acid (where the fusion protein is Consisting of a detectable protein and a first protein of interest) and (b) a vector for cells containing an expression cassette.
The expression cassette, as described above, includes a promoter operable in a cell and operably linked to a nucleic acid encoding a protein that specifically binds to an internal structure in the cell. Expression cassettes are also interesting because they have a splice site located next to the nucleic acid encoding a protein that also specifically binds to internal structures within the cell (as described above; preferably the transposable protein described above). A heterologous nucleic acid encoding a second protein can be inserted therein to produce a nucleic acid segment encoding a second fusion protein. The second fusion protein consists of a protein that specifically binds to an internal structure in the cell and a second protein of interest. Such kits can be provided in any suitable form, and are generally packaged with appropriate instructions. Although any vector can be used, the vector is generally a plasmid vector.

【００２１】 キットの上記のような使用において、ベクターはある具体例で用いられ、上記
のような核酸ライブラリー源から、多くの個別の核酸からなる核酸ライブラリー
生成物を生じる。この個別の核酸それぞれは、興味あるタンパク質(ライブラリ
ー源によってエンコードされる)と検出可能なタンパク質とからなる融合タンパ
ク質をエンコードし、個別の核酸それぞれによってエンコードされる興味あるタ
ンパク質はライブラリーの他の核酸によってエンコードされる興味あるタンパク
質とは異なる。ベクターにおいて、ライブラリー生成物は多くの細胞を形質転換
するのに用いることができ、次いでライブラリー構成物を上記のようにしてスク
リーンすることができる。 上記の代替的な具体例では、ベクターは、上述の核酸ライブラリー源から、多
数の個別の核酸からなる核酸ライブラリー生成物を得るのに用いられる。個別の
核酸それぞれは、興味あるタンパク質(ライブラリー源由来)と上記の細胞内の内
部構造に特異的に結合するタンパク質(好ましくは上記の転位可能なタンパク質)
とからなる融合タンパク質をエンコードし、ここで個別の核酸それぞれによって
エンコードされる興味あるタンパク質は、ライブラリーの他の核酸によってエン
コードされる興味あるタンパク質とは異なる。また、ライブラリー生成物は、ベ
クターで、多くの細胞を形質転換又はトランスフェクトするのに用いることがで
き、こうしてライブラリー構成物を上記のようにしてスクリーンすることができ
る。In such uses of the kit, vectors are used in certain embodiments to generate a nucleic acid library product consisting of many individual nucleic acids from a nucleic acid library source as described above. Each individual nucleic acid encodes a fusion protein consisting of the protein of interest (encoded by the library source) and a detectable protein, and the protein of interest encoded by each individual nucleic acid is Different from the protein of interest encoded by the nucleic acid. In a vector, the library product can be used to transform many cells, and the library constructs can then be screened as described above. In the alternative embodiment described above, the vector is used to obtain a nucleic acid library product consisting of a number of individual nucleic acids from the nucleic acid library source described above. Each individual nucleic acid is a protein of interest (from a library source) and a protein that specifically binds to an internal structure in the cell (preferably a transposable protein as described above)
Wherein the protein of interest encoded by each individual nucleic acid is different from the protein of interest encoded by other nucleic acids in the library. Also, the library product can be used to transform or transfect many cells with the vector, and the library constructs can be screened as described above.

【００２２】 前記の具体例のいずれかにおいて、ライブラリーのスクリーニングは、従来の
技術にしたがって行うことができる。一般的には、スクリーニングは、異なる細
胞群にプール(ライブラリーメンバーのサブセット)をトランスフェクトし、興味
あるタンパク質を発現させて行われるであろう。これにより、興味あるタンパク
質と相互作用する結合パートナーを含むプールを同定することができる。結合パ
ートナーを有するプールは、次いで興味あるタンパク質に結合するライブラリー
の個々のメンバー(例えば個々のcDNA配列)が同定されるまで、再度サブプールに
分割することができる。 この発明を、以下の限定されない実施例で詳細に説明する。In any of the above embodiments, screening of the library can be performed according to conventional techniques. Generally, screening will be performed by transfecting the pool (a subset of the library members) into a different population of cells and expressing the protein of interest. This allows the identification of pools containing binding partners that interact with the protein of interest. Pools with binding partners can then be subdivided into subpools until individual members of the library (eg, individual cDNA sequences) that bind to the protein of interest are identified. The present invention is described in detail by the following non-limiting examples.

【００２３】実施例 Ca²⁺/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII (CaMKII)は、ニューロンで
は高濃度で、大部分の他の細胞型では低濃度で発現する偏在性キナーゼである。
以前の研究は、CaMKIIが長期間の増強作用の必須媒介物であり、シナプス形成(s
ynaptic plasticity)の他の形態であることを示唆した[Braun及びSchulman, 199
5; Soderling, 1993参照]。さらに、CaMKII活性は、樹状構造の安定化に重要な
役割を有している可能性がある[Wu及びCline, 1998]。α-イソ型CaMKIIの重大な
ニューロンの機能は、CaMKIIaを欠損しているか又は変異したCaMKIIaを発現する
マウスを研究して直接立証された。CaMKIIa欠損マウスならびに自律的に活性で
あるか、もしくは自己リン酸化を欠いたCaMKIIaを発現するトランスジェニック
マウスは、長期間損なわれた増強作用ならびに空間的な知識と記憶における欠損
を示した[Chapmanら、1995；Glazewskiら、1996；Gordonら、1996；Mayfordら、
1996；Mayfordら、1995；Silvaら、1992；Gieseら、1998]。 EXAMPLE Ca ²⁺ / calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) is a ubiquitous kinase that is expressed at high levels in neurons and at low levels in most other cell types.
Previous studies have shown that CaMKII is an essential mediator of long-term potentiation and that synapse formation (s
ynaptic plasticity) [Braun and Schulman, 199
5; Soderling, 1993]. In addition, CaMKII activity may have an important role in stabilizing dendritic structures [Wu and Cline, 1998]. The critical neuronal function of α-isotype CaMKII was directly established by studying mice that lack CaMKIIa or express mutated CaMKIIa. CaMKIIa-deficient mice, as well as transgenic mice expressing CaMKIIa that are autonomously active or lack autophosphorylation, show long-term impaired potentiation and deficits in spatial knowledge and memory [Chapman et al. Gladzewski et al., 1996; Gordon et al., 1996; Mayford et al., 1995;
1996; Mayford et al., 1995; Silva et al., 1992; Giese et al., 1998].

【００２４】 CaMKIIαのみならずCaMKIIβが中枢神経系で顕著なイソ型であるので、問題は
、CaMKIIαとCaMKIIβがニューロン機能の調節で異なる役割を有しているか否か
ということである。2つのイソ型間のこのような機能の相違は、細胞型の特異的
なシグナルプロセスに関する我々の理解に直接影響するであろう。なぜなら、Ca
MKIIαとCaMKIIβの相対的な発現は、種々の脳領域及び種々の発生段階で著しく
異なるからである。例えば、α及びβサブユニットの比率は成人の前脳及び小脳
それぞれで約3:1〜1:4であるが、生後10日のマウスでは、前脳のa:b比は1:1であ
る[Miller及びKennedy, 1985]。構造的な基礎において、組換えCaMKIIαならび
に精製した脳のCaMKIIは約8〜12サブユニットを有するオリゴマーを形成するこ
とが示されている[Kanasekiら、1991、Bennettら、1983]。CaMKIIβとCaMKIIα
は、全体的にドメイン構成が類似しており、相当する自己リン酸化コンセンサス
配列を有する。CaMKIIβのカルモジュリン結合親和性がCaMKIIαのそれよりわず
かに高いとしても、Ca²⁺/CaMによる種々のCaMKIIイソ型の調節及び自己リン酸化
は全体に類似している[Miller及びKennedy, 1985；De Koninck及びSchulman, 19
98；GuptaRoy及びGriffith, 1996]。これらの類似性にもかかわらず、CaMKIIβ
がそれ自体でオリゴマーを形成するかどうか[Yamauchiら、1989]、CaMKIIαとCa
MKIIβが同時に発現した際にヘテロ-オリゴマーを形成するか否か[Kanasekiら、
1991]及び2つのイソ型は細胞内で特異的に局在しているか否か[Scholzら、1988
；Nomuraら、1997]が、議論されている。Since CaMKIIα as well as CaMKIIβ are prominent isoforms in the central nervous system, the question is whether CaMKIIα and CaMKIIβ have different roles in regulating neuronal function. Such functional differences between the two isoforms will directly affect our understanding of cell type specific signaling processes. Because Ca
This is because the relative expression of MKIIα and CaMKIIβ is significantly different in different brain regions and different stages of development. For example, the ratio of α and β subunits is approximately 3: 1 to 1: 4 in adult forebrain and cerebellum, respectively, whereas in postnatal mice, the forebrain a: b ratio is 1: 1. [Miller and Kennedy, 1985]. On a structural basis, recombinant CaMKIIα as well as purified brain CaMKII have been shown to form oligomers with about 8-12 subunits [Kanaseki et al., 1991, Bennett et al., 1983]. CaMKIIβ and CaMKIIα
Have a similar overall domain organization and a corresponding autophosphorylation consensus sequence. Even though the calmodulin binding affinity of CaMKIIβ is slightly higher than that of CaMKIIα, the regulation and autophosphorylation of various CaMKII isoforms by Ca ²⁺ / CaM are entirely similar [Miller and Kennedy, 1985; De Koninck And Schulman, 19
98; GuptaRoy and Griffith, 1996]. Despite these similarities, CaMKIIβ
Whether it forms oligomers on its own [Yamauchi et al., 1989], CaMKIIα and Ca
Whether MKIIβ forms hetero-oligomers when co-expressed [Kanaseki et al.
1991] and whether the two isoforms are specifically localized in cells [Scholz et al., 1988
Nomura et al., 1997].

【００２５】 ここで、緑色蛍光タンパク質(GFP)を標識したCaMKIIα及びCaMKIIβのイソ型
を用いて、細胞下局在とCaMKIIαとCaMKIIβのオリゴマー化を研究する。樹状突
起及び糸状足ならびに皮質細胞骨格は、発現したCaMKIIβに一次的なドッキング
部位であることが分かった。対照的に、発現したCaMKIIαは、細胞体とプロセス
で均一に分布し、大部分が突起を欠いていた。しかし、同一細胞で発現した際に
、CaMKIIβはCaMKIIαを樹状突起と皮質細胞に標的化した。生体外結合研究にお
いて、この標的化は、CaMKIIβとF-アクチンとの直接的な結合相互作用によるこ
とが示唆された。 GFP-ベースのタンパク質-タンパク質の相互作用アッセイ(プル-アウト結合ア
ッセイ)を次いで開発し、生細胞におけるCaMKIIα及びCaMKIIβのイソ型の結合
相互作用を研究した。単独で発現した際に、CaMKIIbは、平均的な大きさがCaMKI
Iaホモ-オリゴマーについて測定される約13個のサブユニットよりかなり小さい
ホモ-オリゴマーを形成することが分かった。同時発現した際には、CaMKIIbイソ
型は、CaMKIIa又はCaMKIIbオリゴマーのいずれかに十分に等しく導入した(逆も
しかり)。細胞骨格へのCaMKIIaオリゴマーの最大標的化の半分は、少なくとも15
％のCaMKIIbが同一細胞中に存在する場合に達せられた。これは、約13個のサブ
ユニットを有するCaMKIIa/bヘテロ-オリゴマーをF-アクチンに結合するのに、Ca
MKIIbの少数のサブユニットが必要であることを示唆している。我々の研究は、C
aMKII活性のシナプスの局在化は、CaMKIIb F-アクチンのドッキングモジュール
の相対的な発現によって制御されることを示唆している。Here, subcellular localization and oligomerization of CaMKIIα and CaMKIIβ are studied using CaMKIIα and CaMKIIβ isoforms labeled with green fluorescent protein (GFP). Dendrites and filamentous feet and cortical cytoskeleton were found to be primary docking sites for expressed CaMKIIβ. In contrast, expressed CaMKIIα was uniformly distributed in cell bodies and processes, and largely lacked protrusions. However, when expressed in the same cells, CaMKIIβ targeted CaMKIIα to dendritic and cortical cells. In vitro binding studies suggested that this targeting was due to a direct binding interaction between CaMKIIβ and F-actin. A GFP-based protein-protein interaction assay (pull-out binding assay) was then developed to study CaMKIIα and CaMKIIβ isoform binding interactions in living cells. When expressed alone, CaMKIIb has an average size of CaMKI
It was found to form homo-oligomers much smaller than the approximately 13 subunits measured for Ia homo-oligomers. When co-expressed, CaMKIIb isoforms were introduced equally well into either CaMKIIa or CaMKIIb oligomers (or vice versa). Half of the maximal targeting of CaMKIIa oligomers to the cytoskeleton is at least 15
% Of CaMKIIb was present in the same cell. It binds CaMKIIa / b hetero-oligomers with about 13 subunits to F-actin,
This suggests that a small number of subunits of MKIIb are required. Our study is C
This suggests that synaptic localization of aMKII activity is controlled by the relative expression of the docking module of CaMKIIb F-actin.

【００２６】 １. 方 法 a. CaMKII融合構築物のクローニング ラットのCaMKIIα、β及びβ'のcDNAは、Dr. Howard Schulmanから寛大に贈与
された。GFP-CaMKIIαベクターの構築は、先に記載された[Shen及びMeyer, 1998
]。GFPのないCaMKIIαの生体外転写ベクターを得るために、CaMKIIα cDNAをPCR
で増幅し、生体外転写ベクター dSHiro 3 にクローンした。DNAシーケンシング
を行って、PCRエラーを除いた。GFP-CaMKIIb及びCaMKIIbも、同様のPCRストラテ
ジを用いてベクターSHiro 3 及びdSHiro 3にクローンした。PM-GFP又はCys-GFP
の構築は、先に記載された[Oanceaら、1998]。PM-CaMKIIα及びβは、同じSHiro
3ベクター中でGFP配列をCaMKIIα及びβのコード化配列で置換して得た。 b. 生体外翻訳 SP6 RNAポリメラーゼを用いる生体外翻訳は、市販のキットを用いて製造者の
プロトコルにしたがって行った(TNT結合網状赤血球溶解システム、Promega)。生
体外転写反応は、鋳型としてmRNAを用いて行った。異なる翻訳タンパク質の相対
的なモル濃度は、³⁵S-メチオニン導入を用いる測定と、各タンパク質におけるメ
チオニン数の計測によって算出した。非-放射活性メチオニンは、CaMKIIと自己
リン酸化アッセイ用の融合構築物を得るために用いた。1. Methods a. Cloning of CaMKII Fusion Construct Rat CaMKII α, β and β 'cDNAs were kindly provided by Dr. Howard Schulman. The construction of the GFP-CaMKIIα vector was described previously [Shen and Meyer, 1998.
]. PCR of CaMKIIα cDNA to obtain an in vitro transcription vector of CaMKIIα without GFP
And cloned into an in vitro transcription vector dSHiro3. DNA sequencing was performed to eliminate PCR errors. GFP-CaMKIIb and CaMKIIb were also cloned into the vectors SHiro 3 and dSHiro 3 using the same PCR strategy. PM-GFP or Cys-GFP
Has been described previously [Oancea et al., 1998]. PM-CaMKIIα and β are the same SHiro
The GFP sequence was obtained by replacing the coding sequence of CaMKIIα and β in 3 vectors. b. In vitro translation In vitro translation using SP6 RNA polymerase was performed according to the manufacturer's protocol using a commercially available kit (TNT coupled reticulocyte lysis system, Promega). The in vitro transcription reaction was performed using mRNA as a template. The relative molar concentrations of the different translated proteins were calculated by measurement using ³⁵ S-methionine introduction and by counting the number of methionine in each protein. Non-radioactive methionine was used to obtain fusion constructs for CaMKII and autophosphorylation assays.

【００２７】 c. CaMKII及びGFP融合タンパク質のCa²⁺依存性及び非依存性の自己リン酸化 CaMKIIの自己リン酸化アッセイは、先に記載されているようにして行った[Han
sonら、1994]。手短に言えば、CaMKIIのイソ型と融合構築物は、50mM PIPES (pH
7.0)、10mM MgCl₂、500mM CaCl₂、600nM カルモジュリン、50mg/ml BSA及び200
mM[g-³²p]ATP(6000cpm/pmol)を含む25mlの反応物で30℃で自己リン酸化した。Ca ²⁺ 依存性の自己リン酸化反応は、反応混合物に生体外翻訳産物を加えて開始し、
30秒後にEDTA(最終濃度16.7mM)を加えて停止した。Ca²⁺-非依存性の自己リン酸
化の程度を測定するためには、高度なCa²⁺で30秒の反応の後に、加えたEGTA(最
終濃度3.3mM)の存在下で120秒間二次インキュベーションした。対照実験で、3.3
mM EGTAを最初の反応混合物に含めた。次いで、反応混合物をSDS-PAGEで分析し
、蛍光画像分析に付した。バンドの濃度を測定し、上記のようにして³⁵S-メチオ
ニンを用いる別の生体外翻訳反応で測定したキナーゼ量で修正した。C. Ca of CaMKII and GFP fusion proteins²⁺Autophosphorylation of independent and independent autophosphorylation of CaMKII was performed as described previously [Han
son et al., 1994]. Briefly, CaMKII isoforms and fusion constructs are 50 mM PIPES (pH
 7.0), 10mM MgCl_Two, 500 mM CaCl_Two, 600 nM calmodulin, 50 mg / ml BSA and 200
mM [g-³²Autophosphorylation was performed at 30 ° C. with a 25 ml reaction containing [p] ATP (6000 cpm / pmol). Ca ²⁺ The dependent autophosphorylation reaction is initiated by adding an in vitro translation product to the reaction mixture,
Thirty seconds later, EDTA (final concentration 16.7 mM) was added to stop. Ca²⁺-Independent autophosphate
To measure the degree of²⁺After 30 seconds of reaction with
A secondary incubation was performed for 120 seconds in the presence of a final concentration of 3.3 mM). In a control experiment, 3.3
mM EGTA was included in the first reaction mixture. The reaction mixture was then analyzed by SDS-PAGE.
And fluorescence image analysis. Measure the band concentration and proceed as above³⁵S-Metio
Corrected with the amount of kinase measured in another in vitro translation reaction using nin.

【００２８】 d. 生体外転写及びRNAプロセシング 生体外転写とRNAプロセシングは、前に記載されているようにして行った[Yoko
e及びMeyer, 1996；Shen及びMeyer, 1998]。手短に言えば、SP6 RNAポリメラー
ゼを用いる生体外転写は、市販のキットを用いて製造者のプロトコルにしたがっ
て行った(mMESSAGE mMACHINE^TM, Ambion)。EDTA 10mMを用いて反応を終結した。
RNAはカラムクロマトグラフィーで精製し(RNeasy カラム、Qiagen)、次いでポリ
Aテイルを付加した。ポリアデニル化は、40mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl₂、
2.5mM MnCl₂、250mM NaCl、0.25mg/μl RNA、250mM ATP、5単位のポリ(A)ポリメ
ラーゼ(Life Technologies)を含む反応混合物50μl中で37℃で30分行った。反応
は、EDTA 20mMを加えて終結した。未導入のATPと塩は、RNeasyカラムにmRNAを用
いて除いた。溶出物を乾燥し、mRNAをエレクトロポレーション緩衝液(5mM KCl、
125mM NaCl、20mM HEPES(pH 7.4)及び10mM グルコース)に1μg/μlで溶解した。D. In vitro transcription and RNA processing In vitro transcription and RNA processing were performed as described previously [Yoko
e and Meyer, 1996; Shen and Meyer, 1998]. Briefly, in vitro transcription using SP6 RNA polymerase was performed according to the manufacturer's protocol using a commercially available kit (mMESSAGE mMACHINE ^™ , Ambion). The reaction was terminated with 10 mM EDTA.
RNA is purified by column chromatography (RNeasy column, Qiagen) and then
A tail was added. For polyadenylation, 40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl ₂ ,
The reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes in a 50 μl reaction mixture containing 2.5 mM MnCl ₂ , 250 mM NaCl, 0.25 mg / μl RNA, 250 mM ATP, 5 units of poly (A) polymerase (Life Technologies). The reaction was terminated by adding 20 mM EDTA. ATP and salts not introduced were removed using mRNA on the RNeasy column. The eluate was dried and the mRNA was added to electroporation buffer (5 mM KCl,
It was dissolved at 1 μg / μl in 125 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7.4) and 10 mM glucose).

【００２９】 e. 細胞培養とエレクトロポレーション RBL 2H3細胞は、20％のウシ胎児血清(Life Technologies, Gaithersburg, MD)
を追加したダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で5％CO₂とともに37℃で維持した。
細胞をガラスカバースリップ上に5ｘ10⁴細胞/cm²でプレートし、最低3時間、カ
バースリップに接着させた。生後2〜4日のラットから得た海馬ニューロンをRyan
及びSmith(1995)に記載されているようにして培養し、プレートしてから10日〜3
週間後に用いた。エレクトロポレーションには、付着性の細胞用に組立てた少量
のエレクトロポレーション装置を用いた[Teruel及びMeyer, 1997]。ニューロン
のトランスフェクションには、改良型の装置と緩衝条件を用いた。トランスフェ
クション後、エレクトロポレーション緩衝液を同じ培養培地で置換した。E. Cell Culture and Electroporation RBL 2H3 cells were obtained from 20% fetal bovine serum (Life Technologies, Gaithersburg, MD).
Were maintained at 37 ° C. with 5% CO _{2 in} Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) supplemented with.
Cells were plated on glass coverslips at 5 × 10 ⁴ cells / cm ² and allowed to adhere to the coverslips for a minimum of 3 hours. Hippocampal neurons obtained from 2-4 day old rats were Ryan
And 10 days to 3 days after plating and plating as described in Smith (1995).
Used after a week. Electroporation used a small amount of electroporation device assembled for adherent cells [Teruel and Meyer, 1997]. Modified equipment and buffer conditions were used for transfection of neurons. After transfection, the electroporation buffer was replaced with the same culture medium.

【００３０】 f. FM 4-64を用いるプレシナプス末端の機能的な標識 機能的なプレシナプス末端は、FM 4-64 (N-(3-トリエチルアンモニウムプロピ
ル)-4-(6-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)ヘキサトリエニル)ピリジニウム、ジブ
ロミド；Molecular Probes)を用いて可視化した。FM 4-64 (Henkel及びBetz, 19
95)は構造及び性質においてFM 1-43に類似しているが、その長い波長放射スペク
トルによって、緑色蛍光タンパク質との接合物における二重チャンネルの蛍光顕
微鏡により適当である[Ziv及びSmith, 1996]。イメージチェンバー中の食塩水を
高カリウム溶液(100mM KCl、20mM HEPES、1.5mM CaCl₂、30mM NaCl、1.5mM MgCl ₂ 、(pH 7.4)及び6μMのFM 4-64)で20秒間置換して、FM4-64を用いて細胞をロー
ドし、5〜10分間食塩溶液に戻した。標識した範囲のデジタル画像を集めた後、
同じ高カリウム溶液に戻して細胞を再刺激した。活性プレシナプス末端の空間的
な分布は、次いで弁別画像から決定することができる。F. Functional Labeling of Presynaptic Terminals Using FM 4-64 The functional presynaptic terminals were identified as FM 4-64 (N- (3-triethylammonium propyl).
) -4- (6- (4- (diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium, dib
Lomide; Molecular Probes). FM 4-64 (Henkel and Betz, 19
95) is similar in structure and properties to FM 1-43, but has a longer emission spectrum.
Fluorescence of dual channels in conjugates with green fluorescent protein
More appropriate by microscopy [Ziv and Smith, 1996]. The saline solution in the image chamber
High potassium solution (100 mM KCl, 20 mM HEPES, 1.5 mM CaCl_Two, 30 mM NaCl, 1.5 mM MgCl _Two , (PH 7.4) and 6 μM of FM 4-64) for 20 seconds, and the cells were loaded with FM 4-64.
And returned to the saline solution for 5-10 minutes. After collecting the digital images of the labeled area,
The cells were restimulated by returning to the same high potassium solution. Spatial of active presynaptic terminals
The appropriate distribution can then be determined from the discrimination image.

【００３１】 g. 拡散分析 拡散係数は、光漂白(photobleach)域を焦点を合わせたレーザーパルスによっ
て生じさせ、蛍光リカバリーを連続的な二次元ガウス分布に適合させる分析を用
いて決定した。パルス前の分布に対する漂白パルス後の蛍光分布の画像比を、分
析に用いた。この分析は、漂白幅の低下と漂白半径の増加を同時に追跡する。質
量保存を仮定すれば、得られる蛍光分布は、 F_n(x,y) = 1-(Fo^*a_o ²/a_n ²)^* exp(−((x−x_o) ²＋(y−y_o) ²)/a_n ²) [x及びyはピクセル座標、a_nは第nの画像の漂白直径の半径、及びF_n(x,y)は局所
的な相対的蛍光強度]によって適合した。二乗の適合性ルーチン(square fit rou
tine)を、時系列で全ての画像にガウスプロフィルを同時に適合するのに用いた
。近似の拡散係数を、次いで半径a_n対 時間の二乗のグラフから決定した。拡散
係数は、このグラフの勾配から直接得ることができる(Dy/Dx = 4^*D；Dは拡散係
数[Shen及びMeyer, 1998])。G. Diffusion analysis The diffusion coefficient was determined using an analysis in which a photobleach zone was generated by a focused laser pulse and the fluorescence recovery was fitted to a continuous two-dimensional Gaussian distribution. The image ratio of the fluorescence distribution after the bleaching pulse to that before the pulse was used for the analysis. This analysis simultaneously tracks the decrease in bleach width and the increase in bleach radius. Assuming conservation of mass, the resulting fluorescence _{distribution, F n (x, y)} = 1- (Fo * a o 2 / a n 2) * exp (- ((x-x o) 2 + (y- ^{_{y o) 2) / a n}} 2) [x and y are pixel coordinates, a _n is the radius of the bleaching diameter of the image of the n, and F _n (x, y) is the local relative fluorescence intensity] adapted by did. Square fit rou
tine) was used to fit a Gaussian profile to all images simultaneously in time series. The diffusion coefficient of the approximation, then were determined from a graph of the square of the radius a _n versus time. The diffusion coefficient can be obtained directly from the slope of this graph (Dy / Dx = 4 ^* D; D is the diffusion coefficient [Shen and Meyer, 1998]).

【００３２】 h. ヘテロ-オリゴマーへのCaMKIIbサブユニットの推計学上の挿入についてのモ
デル算出 ヘテロ-オリゴマーへの1以上のサブユニットのランダム挿入を有する確率は、
[1-(サブユニットが挿入されていない確率)]である。挿入がない確率は、(R/(R
＋1))^N [RはCaMKIIbに対するGFP-CaMKIIaの比率及びNはサブユニット数]である
。 i. 免疫蛍光 NIH-3T3、RBL細胞及び海馬ニューロンは、ガラスのカバースリップ上で培養し
、GFP-CaMKIIb融合構築物をエンコードするmRNAを用いてトランスフェクトした
。トランスフェクションから7〜8時間後、細胞をPBS (1.2mM KH₂PO₄、8.1mM Na₂ HPO₄、138mM NaCl及び2.7mM KCl(pH 7.4))中の4％パラホルムアルデヒドを用い
て10分4℃で固定した。NIH-3T3細胞とRBL細胞は、PBS中の0.1％トリトンを用い
て5分4℃で透過することができた。海馬ニューロンは、0.1％トリトンを用いて1
0分4℃で透過することができた。F-アクチンの染色には、ローダミンファロイジ
ン(Molecular Probes)を1:300の希釈で、室温で30分細胞とインキュベートした
。後-シナプス(post-synaptic)密度の染色には、海馬ニューロンをモノクローナ
ルPSD-95抗体(Cat.# 05-428、Upsate Biotechnology, Lake Placid, NY)と1:200
の希釈で一晩4℃で、次いで、二次的なCy3標識抗マウス抗体(Cat.# 115-165-062
、Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)とともに室温で1時間インキュベー
トした。細胞をPBSで3回洗浄し、緩衝したグリセロール増強培地を用いてカバー
スリップをガラススライドに載せた。H. Model Calculations for Statistical Insertion of CaMKIIb Subunits into Hetero-oligomer The probability of having random insertion of one or more subunits into a hetero-oligomer is
[1- (probability that subunit is not inserted)]. The probability of no insertion is (R / (R
+1)) ^N [R is the ratio of GFP-CaMKIIa to CaMKIIb and N is the number of subunits]. i. Immunofluorescence NIH-3T3, RBL cells and hippocampal neurons were cultured on glass coverslips and transfected with mRNA encoding the GFP-CaMKIIb fusion construct. 7-8 hours after transfection, cells were _{PBS (1.2mM KH 2 PO 4,} 8.1mM Na 2 HPO 4, 138mM NaCl and 2.7mM KCl (pH 7.4)) 10 min with 4% paraformaldehyde in 4 Fixed at ° C. NIH-3T3 cells and RBL cells were able to permeate for 5 minutes at 4 ° C. using 0.1% Triton in PBS. Hippocampal neurons were tested using 0.1% Triton 1
Permeation was possible at 0 ° C for 4 minutes. For staining of F-actin, rhodamine phalloidin (Molecular Probes) was incubated with the cells at a dilution of 1: 300 for 30 minutes at room temperature. For post-synaptic density staining, hippocampal neurons were incubated with monoclonal PSD-95 antibody (Cat. # 05-428, Upsate Biotechnology, Lake Placid, NY) at 1: 200.
Overnight at 4 ° C., then a secondary Cy3-labeled anti-mouse antibody (Cat. # 115-165-062
, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) for 1 hour at room temperature. Cells were washed three times with PBS and coverslips were mounted on glass slides using buffered glycerol-enhanced media.

【００３３】 j. 線維芽細胞のトランスフェクションとウエスタンブロッティングアッセイ NIH-313細胞は、ディッシュ当たり1.0ｘ10⁵の密度で35mmのディッシュにプレ
ートし、5％CO₂を含有する湿性雰囲気中で37℃で一晩培養した。1.5〜2.2μgのp
SRa-CaMKIIbもしくはpSRa-CaMKIIaを用いて細胞をトランスフェクトするか、又
は製造者の指示にしたがってリポフェクチンプラス(GIBCO/BRL)を用いてpSRa-Ca
MKIIbとpSRa-CaMKIIaで同時に細胞をトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョンから48時間後に細胞を回収して、10mM Tris-HCl、50mM KCl、0.1mM EGTA、0
.1％トリトン、2mM PMSF及び5μg/mlアプロチニン、ロイペプチン及びペプスタ
チンを室温で10分用いて抽出し、4℃で30分30,000ｘgで遠心分離した。種々の細
胞抽出画分をSDS-ポリアクリルアミドゲル(12％)で電気泳動して解析し、ニトロ
セルロースに移し、モノクローナル抗-CaMKIIa又は抗-CaMKIIb抗体(GIBCO/BRL)
を用いてブロットした。西洋わさびのペルオキシダーゼに接合した二次抗体を用
いて膜をブロットし、ECL(Amercham)で可視化した。J. Fibroblast Transfection and Western Blotting Assay NIH-313 cells were plated at a density of 1.0 × 10 ⁵ per dish in 35 mm dishes and incubated at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% CO _2. Cultured overnight. 1.5-2.2μg p
Transfect cells with SRa-CaMKIIb or pSRa-CaMKIIa, or pSRa-Ca using Lipofectin Plus (GIBCO / BRL) according to the manufacturer's instructions.
Cells were transfected simultaneously with MKIIb and pSRa-CaMKIIa. Cells were harvested 48 hours after transfection and 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 0.1 mM EGTA, 0 mM
.1% Triton, 2 mM PMSF and 5 μg / ml aprotinin, leupeptin and pepstatin were extracted using room temperature for 10 minutes and centrifuged at 4 ° C. for 30 minutes at 30,000 × g. Various cell extract fractions were analyzed by electrophoresis on SDS-polyacrylamide gel (12%), transferred to nitrocellulose, and monoclonal anti-CaMKIIa or anti-CaMKIIb antibody (GIBCO / BRL)
Was blotted using. The membrane was blotted using a secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase and visualized by ECL (Amercham).

【００３４】 k. 「プルアウト」タンパク質-タンパク質相互作用 ポリアデニル化mRNAは、上記のようにして調製した。多くの実験でmRNA種を混
合し、一般的には全体で1μg/μlの最終濃度でエレクトロポレーションに用いた
。相対的な翻訳効率は、鋳型として同じmRNAを用いる生体外翻訳反応で個別に決
定した。トランスフェクトしたRBL又はNIH 3T3細胞の画像は、エレクトロポレー
ションから8〜12時間後にZeiss共焦顕微鏡で取り込んだ。1μMのPMAを加え、単
細胞の画像を同じ形態で取り込んだ。PMAの添加前後に画像を取り込み、NIH-画
像ソフトウエアを用いて分析した。原形質膜転位因子は、D_PM/I_preとして定義し
た(図２Ｅ)。K. “Pull out” protein-protein interaction Polyadenylation mRNA was prepared as described above. In many experiments, mRNA species were mixed and used for electroporation, typically at a final concentration of 1 μg / μl total. The relative translation efficiencies were individually determined in an in vitro translation reaction using the same mRNA as a template. Images of transfected RBL or NIH 3T3 cells were acquired on a Zeiss confocal microscope 8-12 hours after electroporation. 1 μM PMA was added and single cell images were captured in the same form. Images were captured before and after PMA addition and analyzed using NIH-Image software. The plasma membrane transposable element was defined as D _PM / I _pre (FIG. 2E).

【００３５】 ２． 結 果 a. 発現したCaMKllbは樹状枝と皮質細胞で増強されるが、CaMKllaは増強しない CaMKlla対CaMKllbのイソ型の細胞局在は、GFPを用いてCaMKll融合タンパク質
を構築することによって研究した(図１Ａ)。初期の研究は、GFP-CaMKlla構築物
がペプチド基質をリン酸化できるのみならず、スレオニン286でそれ自体を自己
リン酸化できることを示している[Shen及びMeyer, 1998]。機能的に完全なGFP-C
aMKllに付加的な特徴は、二次カルシウム-非依存性自己(independent aut)の保
持である(図１Ｂ及び１Ｃ)。 GFP-標識したCaMKlla又はbのイソ型が培養した海馬ニューロンで発現した際に
、CaMKllaは、細胞体と主要なプロセスでかなり均一(図１Ｄ、左)であったが、
細い枝構造では最小限にしか存在しなかった。逆に、CaMKllbは、樹状枝ならび
に皮質細胞で著しい増強を示した(図１Ｄ、右)。RBL-細胞で発現した際に、CaMK
llaはサイトゾルでほぼ均一に分布し、CaMKllbは異なる皮質局在を有した(図１
Ｅ、右)。 2つのイソ型の区別的な分布は、CaMKllbが、CaMKllaを生じない細胞で特異的
な結合相互作用を有していることを示唆している。[0035] 2. Results a. Expressed CaMKllb is enhanced in dendritic branches and cortical cells, but not CaMKlla. The cellular localization of CaMKlla versus CaMKllb isoforms was studied by constructing a CaMKll fusion protein using GFP. (FIG. 1A). Early studies have shown that not only can the GFP-CaMKlla construct phosphorylate peptide substrates, but also autophosphorylate itself with threonine 286 [Shen and Meyer, 1998]. Functionally complete GFP-C
An additional feature of aMKll is the retention of secondary calcium-independent aut (FIGS. 1B and 1C). When GFP-labeled CaMKlla or b isoforms were expressed in cultured hippocampal neurons, CaMKlla was fairly uniform in the cell body and major processes (FIG. 1D, left)
There was minimal presence in the thin branch structure. Conversely, CaMKllb showed significant enhancement in dendritic as well as cortical cells (FIG. 1D, right). When expressed in RBL-cells, CaMK
lla was almost uniformly distributed in the cytosol, and CaMKllb had different cortical localization (Fig. 1).
E, right). The differential distribution of the two isoforms suggests that CaMKllb has a specific binding interaction in cells that do not produce CaMKlla.

【００３６】 CaMKllbがCaMKllaよりも多くの結合相互作用を有しているか否かを、GFP- CaM
Kllbの光漂白後の位置的な蛍光リカバリーをGFP-CaMKllaのそれと比較すること
によって直接的に試験した。直径2μmのレーザー光漂白スポットを短いレーザー
パルスで細胞中に生じ、蛍光リカバリーを迅速な共焦画像でモニターした。CaMK
llaではなくCaMKllbが結合相互作用を受けている仮説に一致して、光漂白後のリ
カバリーは、CaMKllbに対する場合と比較してCaMKllaにかなり迅速であった。こ
れは、CaMKllbについて算出された平均的な拡散係数はCaMKlla の係数よりも5倍
低いことによって定量的に示された(図１Ｆ、分析について記載する上記方法参
照)。それにもかかわらず、レーザー漂白パルスから15秒後のタイムスケールでG
FP-CaMKllb蛍光の大部分が回復したので、CaMKllbの結合相互作用は可逆性であ
った。また、これらの測定は、単独で発現したCaMKllaはごく限られたサイトゾ
ルの結合相互作用を有する極めて可動性のタンパク質であるが、CaMKllbは樹状
構造と皮質構造に可逆性の様式で結合していることを示唆している。Whether CaMKllb has more binding interactions than CaMKlla was determined by GFP-CaM
The positional fluorescence recovery after photobleaching of Kllb was tested directly by comparing it with that of GFP-CaMKlla. A 2 μm diameter laser light bleached spot was generated in the cells with a short laser pulse, and the fluorescence recovery was monitored with a rapid confocal image. CaMK
Consistent with the hypothesis that CaMKllb but not lla undergoes a binding interaction, recovery after photobleaching was much faster for CaMKlla compared to CaMKllb. This was quantified by the fact that the average diffusion coefficient calculated for CaMKllb was 5 times lower than that for CaMKlla (FIG. 1F, see above method for analysis). Nevertheless, G on the time scale 15 seconds after the laser bleach pulse
The binding interaction of CaMKllb was reversible, as most of the FP-CaMKllb fluorescence was restored. In addition, these measurements indicate that CaMKlla, expressed alone, is a very mobile protein with very limited cytosolic binding interactions, whereas CaMKllb binds to dendritic and cortical structures in a reversible manner. Suggests that

【００３７】 b. CaMKllbは、樹状突起で増強されるF-アクチンドッキングモジュールである CaMKllbによって標的化される樹状枝と細胞皮質における構造はどのようなも
のか？著しく強調した染色によって、CaMKllbは樹状突起で増強されることが示
唆された。実際、後-シナプスタンパク質に対する抗体PSD-95は、GFP-CaMKllbと
PSD-95との明らかな同時局在を示した(データ示さず)。右パネルの矢印は、PSD-
95とGFP-CaMKllbが高度に増強したと考えられる樹状突起を示す。ニューロンに
は、発達中の樹状突起を暗示した枝様糸状足にGFP-CaMKllbの増強された染色を
示すものもあった[Ziv及びSmith, 1996]。このような糸状足の樹の拡大画像を右
パネルに示す。 抗PSD-95抗体とGFP-CaMKllbでマークされる樹状突起は成熟した後-シナプス末
端に相当することが、GFP-CaMKllbの分布を機能的なプレ-シナプス末端の分布と
比較して確認された。末端は、二重復極プロトコルを用いて蛍光シナプス小胞マ
ーカーFM4-64でマークした[Ziv及びSmith, 1996；方法参照]。このタイプの同時
局在研究は、このような糸状足の樹のリバイン(livine)中で行うことができるの
で、ニューロンの固定中に生じ得る人工物は除くことができる。GFP-CaMKllbの
分布を活性なプレシナプス末端の位置に対して比較すると、重ねた画像から、GF
P-CaMKllbとロードされたFM4-64のマークされた並列した局在が示された(示さず
)。これは、CaMKllbが実際に成熟した樹状突起で多いことを示す。逆に、均一に
分布したGFP-CaMKllaは、活性なシナプス近くで多くなかった(示していない)。B. CaMKllb is an F-actin docking module enhanced by dendrites What is the structure in dendritic branches and cell cortex targeted by CaMKllb? Significantly enhanced staining suggested that CaMKllb was enhanced in dendrites. In fact, the antibody PSD-95 against the post-synaptic protein is GFP-CaMKllb
It showed obvious co-localization with PSD-95 (data not shown). The arrow on the right panel is PSD-
95 shows dendrites considered to be highly enhanced by GFP-CaMKllb. Some neurons also showed enhanced staining for GFP-CaMKllb in the branch-like filamentous feet that suggested developing dendrites [Ziv and Smith, 1996]. An enlarged image of such a filamentous foot tree is shown in the right panel. Dendrites marked with anti-PSD-95 antibody and GFP-CaMKllb correspond to post-mature-synaptic terminals, confirming the distribution of GFP-CaMKllb by comparing it to the distribution of functional pre-synaptic terminals. Was. The ends were marked with the fluorescent synaptic vesicle marker FM4-64 using a dual reversal protocol [Ziv and Smith, 1996; see methods]. This type of co-localization study can be performed in the livine of such a filamentous foot tree, so that artifacts that can arise during the fixation of neurons can be eliminated. Comparing the distribution of GFP-CaMKllb against the position of the active presynaptic terminal, the GF
Marked parallel localization of P-CaMKllb and loaded FM4-64 was shown (not shown).
). This indicates that CaMKllb is actually abundant in mature dendrites. Conversely, uniformly distributed GFP-CaMKlla was less abundant near active synapses (not shown).

【００３８】 アクチンは樹状突起と細胞皮質にかなり多いので[Fisherら、1998；Landis及
びReese, 1983、Caceresら、1983]、樹状突起へのCaMKllbの局在は、F-アクチン
とCaMKllbとの直接又は間接的な結合相互作用によって媒介されていることが考
えられる。FM4-64を試験した。これは、CaMKllbが成熟した樹状突起に多いこと
を示唆する。逆に、均一に分布したGFP-CaMKllaは、活性なシナプス近くで多く
なかった(データ示さず)。 アクチンは樹状突起と細胞皮質にかなり多いので[Fisherら、1998；Landis及
びReese, 1983、Caceresら、1983]、樹状突起へのCaMKllbの局在は、F-アクチン
とCaMKllbとの直接又は間接的な結合相互作用によって媒介されていることが考
えられる。2つのモデル細胞系におけるCaMKllbとF-アクチンの潜在的な同時局在
化は、ポリマー化アクチン(F-アクチン)用のマーカーとしてローダミン-ファロ
イジンを用いて試験した。皮質F-アクチン構造が優勢なRBL-細胞で、皮質ローダ
ミン-ファロイジンは、GFP-CaMKllbとほぼ同時に局在化した。ほぼ同じ完全な重
複が、アクチン張線維が豊富なNIH-3T3細胞でも認められた(データ示さず)。こ
れは、アクチン細胞骨格のCaMKllbの同時局在化が細胞型に特異的ではないこと
を示唆している。Since actin is quite abundant in dendrites and cell cortex [Fisher et al., 1998; Landis and Reese, 1983, Caceres et al., 1983], the localization of CaMKllb to dendrites is similar to that of F-actin and CaMKllb. May be mediated by a direct or indirect binding interaction of FM4-64 was tested. This suggests that CaMKllb is abundant in mature dendrites. Conversely, uniformly distributed GFP-CaMKlla was less abundant near active synapses (data not shown). Since actin is quite abundant in dendrites and cell cortex [Fisher et al., 1998; Landis and Reese, 1983, Caceres et al., 1983], the localization of CaMKllb to dendrites is either direct or direct between F-actin and CaMKllb. It is possible that they are mediated by indirect binding interactions. Potential co-localization of CaMKllb and F-actin in two model cell lines was tested using rhodamine-phalloidin as a marker for polymerized actin (F-actin). Cortical rhodamine-phalloidin localized almost simultaneously with GFP-CaMKllb in RBL-cells with predominant cortical F-actin structure. Approximately the same complete duplication was also observed in NIH-3T3 cells rich in actin tension fibers (data not shown). This suggests that co-localization of CaMKllb in the actin cytoskeleton is not cell type specific.

【００３９】 生細胞におけるF-アクチンとのCaMKllbの同時局在化についてのさらなる支持
は、アクチンを復極する薬剤ラトランキュリン(latrunculin)での処理前後の細
胞を比較して得られた[Spectorら、1989](データ示さず)。RBL-細胞(上部)と線
維芽細胞(下部)では、ラトランキュリンの添加で皮質におけるほぼ完全な損失な
らびにGFP-CaMKllbの張線維染色がもたらされた。 次いで、発現したCaMKllbが精製F-アクチンに直接結合できるか否かを生化学
的に決定した。実際に、Met-³⁵S標識したCaMKllbは、アクチンをポリマー化する
ことによって有効に沈降させることができる。逆に、CaMKllaは、同じアッセイ
を用いるポリマー化したアクチンによってはあまり沈降性でない。これは、生細
胞で認められるアクチン細胞骨格とのCaMKllbの同時局在化は、CaMKllbとF-アク
チンとの直接的かつ可逆性の結合相互作用の結果であることを示唆している。Further support for the co-localization of CaMKllb with F-actin in living cells was obtained by comparing cells before and after treatment with the actin depolarizing drug latrunculin [Spector et al. 1989] (data not shown). In RBL-cells (top) and fibroblasts (bottom), the addition of latrunculin resulted in almost complete loss in the cortex as well as tension fiber staining of GFP-CaMKllb. Then, it was determined biochemically whether the expressed CaMKllb could directly bind to purified F-actin. In fact, Met- ³⁵ S-labeled CaMKllb can be effectively precipitated by polymerizing actin. Conversely, CaMKlla is less sedimentable with polymerized actin using the same assay. This suggests that the co-localization of CaMKllb with the actin cytoskeleton found in living cells is the result of a direct and reversible binding interaction between CaMKllb and F-actin.

【００４０】 c. CaMKllaは、CaMKllbとの同時発現時に樹状突起に標的化される 次いで、同じ細胞におけるCaMKlla とCaMKllbの同時発現がそれぞれの局在化
に影響を及ぼすか否かを試験した。イソ型双方の有効な同時発現は、RNAトラン
スフェクション法を用いて可能にされた。この試みでは、大量の翻訳許容性のRN
A分子をマイクロポレーションによって付着細胞のサイトゾルに直接導入する[Te
ruel及びMeyer, 1997；Yokoe及びMeyer, 1996]。こうして、異なるタンパク質を
エンコードするRNAを混合し、それぞれをトランスフェクトした細胞内で所定の
比率で発現させることができる。厳密に言えば、GFP-CaMKllaが海馬ニューロン
中で(GFP-標識のない)CaMKllbとともに発現される際に、GFP-CaMKllaは同一の樹
状突起及び皮質構造と結合した(データ示さず)。GFP-CaMKllaの大部分の皮質局
在化は、CaMKllb存在下のRBL-細胞中でも認められた。逆に、類似した量のGFP-C
aMKllbと一緒の(GFP-標識のない)CaMKllaの発現は、GFP-CaMKllbの皮質局在化に
影響しなかった(データ示さず)。上記の同じ同時局在化プロトコルを用いて、GF
P-CaMKlla間の著しい同時局在化、CaMKllbとの同時発現及び抗PSD-95抗体も見出
された(示さず)。生ニューロンで、CaMKllbと同時発現したGFP-CaMKllaは、プレ
シナプスマーカーFM4-64に並列してマークされた局在化を示した(示さず)。C. CaMKlla is targeted to dendrites upon co-expression with CaMKllb Next, it was tested whether co-expression of CaMKlla and CaMKllb in the same cells affected their localization. Effective co-expression of both isoforms was enabled using the RNA transfection method. In this attempt, a large number of translation-permissive RNs
A molecule is directly introduced into the cytosol of adherent cells by microporation [Te
ruel and Meyer, 1997; Yokoe and Meyer, 1996]. Thus, RNAs encoding different proteins can be mixed and expressed at a predetermined ratio in transfected cells. Strictly speaking, when GFP-CaMKlla was expressed together with CaMKllb (without GFP-labeling) in hippocampal neurons, GFP-CaMKlla bound to the same dendritic and cortical structures (data not shown). Most cortical localization of GFP-CaMKlla was also observed in RBL- cells in the presence of CaMKllb. Conversely, similar amounts of GFP-C
Expression of CaMKlla (without GFP-labeling) with aMKllb did not affect cortical localization of GFP-CaMKllb (data not shown). Using the same colocalization protocol described above, GF
Significant co-localization between P-CaMKlla, co-expression with CaMKllb and anti-PSD-95 antibody were also found (not shown). In live neurons, GFP-CaMKlla co-expressed with CaMKllb showed a marked localization in parallel with the presynaptic marker FM4-64 (not shown).

【００４１】 CaMKllaの局在に対するCaMKllbのこの影響は、生化学的に確認することができ
るか？NIH-3T3細胞の洗浄抽出方法を用いて、アクチンの多いペレット画分中にC
aMKllb及び/又はCaMKllaが見出されるか否かを試験した。この抽出プロトコルは
、アクチン及びアクチン結合タンパク質が著しく多いことを示している[Egelhof
fら、1991]。GFP-標識なしで発現したCaMKllb及びCaMKllaのイソ型を、これらの
測定に用いた。生体内データと一致して、単独で発現した際のCaMKllaはアクチ
ンペレットがほとんどないが、CaMKllbはアクチンペレット中にかなり多かった(
データ示さず)。両方のイソ型がともに発現した際に、CaMKllaの有意な画分がア
クチン細胞骨格画分中で見出された。考え合わせると、これらの研究は標的化機
序と一致しており、これによって、十分量のCaMKllbとともに発現する場合にCaM
KllaがF-アクチンに局在化される。 CaMKllbはアクチン細胞骨格にCaMKllaをどのように標的化しているか？考えら
れる仮説は、CaMKllaはそれ自体では細胞骨格の結合相互作用を受けないが、CaM
Kllbに結合すると、次いでその複合体をF-アクチンに固定するというものである
。この異種CaMKll標的化機序を理解するには、CaMKllaとCaMKllbの結合相互作用
とオリゴマー化について幾つかの重要な問題を明らかにしなければならない：1.
CaMKllbはそれ自体でオリゴマーを形成できるか、そして形成する場合、CaMKll
aによって形成されるものと比較して、これらのオリゴマーはどれくらい大きい
か？、2. 同時発現したCaMKllaとCaMKllbのイソ型は生細胞中でヘテロ-又はホモ
-オリゴマーに会合するか？、3． ヘテロオリゴマーを形成する場合、CaMKllbの
CaMKllaオリゴマーへの導入は、推計学上のプロセスとして生じるのか？、そし
て4． CaMKllaをアクチン細胞骨格に標的化するには、CaMKlla に対するCaMKllb
の比はどの程度の最小比が必要か？Can this effect of CaMKllb on CaMKlla localization be confirmed biochemically? Using the washing extraction method of NIH-3T3 cells, C in the actin-rich pellet fraction
It was tested whether aMKllb and / or CaMKlla were found. This extraction protocol indicates that actin and actin binding proteins are significantly more abundant [Egelhof
f et al., 1991]. CaMKllb and CaMKlla isoforms expressed without GFP-labeling were used for these measurements. Consistent with in vivo data, CaMKlla, when expressed alone, had few actin pellets, but CaMKllb was significantly higher in actin pellets (
Data not shown). A significant fraction of CaMKlla was found in the actin cytoskeleton fraction when both isoforms were expressed together. Taken together, these studies are consistent with a targeting mechanism that allows CaM to be expressed when expressed with sufficient CaMKllb.
Klla is localized to F-actin. How does CaMKllb target CaMKlla to the actin cytoskeleton? A possible hypothesis is that CaMKlla itself does not undergo cytoskeletal binding interactions, but CaM
Upon binding to Kllb, the complex is then immobilized on F-actin. To understand this heterologous CaMKll targeting mechanism, several key issues regarding the binding interaction and oligomerization of CaMKlla and CaMKllb must be addressed: 1.
Can CaMKllb form oligomers on its own, and if so, CaMKllb
How large are these oligomers compared to those formed by a? 2. The co-expressed CaMKlla and CaMKllb isoforms are hetero- or homologous in living cells.
-Do they associate with oligomers? , 3. When forming a hetero-oligomer, CaMKllb
Does the introduction into CaMKlla oligomers occur as a stochastic process? And 4. To target CaMKlla to the actin cytoskeleton, use CaMKllb versus CaMKllb
Is the minimum ratio required?

【００４２】 d. オリゴマー形成は、GFP-ベースの「プル-アウト」結合アッセイを用いる生
細胞で研究することができる ホモ- 対ヘテロ-オリゴマー形成の問題に取り組むために、生細胞でのタンパ
ク質-タンパク質結合相互作用を定量的に研究するアッセイを開発した(「プル-
アウト」結合アッセイ、図２Ａ)。ストラテジは、薬剤の添加に応じて原形質膜
に転位するタンパク質ドメイン(PM-ドメイン)を用いることであった。用意した
タンパク質Xとタンパク質Yとの潜在的な結合相互作用は、次いでタンパク質Xに
このPM-ドメインを、タンパク質YにGFP-標識を融合させて研究することができる
(逆もしかり)。次に、両方の融合タンパク質を同一細胞中で発現させ、その結合
相互作用を研究することができる。1. 最初のサイトゾルのGFP-タンパク質Yが
薬剤添加後に依然としてサイトゾル性である場合には、タンパク質Xとタンパク
質Yとに有意な結合相互作用は生じない。2. 薬剤添加で原形質膜にGFP-タンパ
ク質Yの転位(加えて、非蛍光のPM-タンパク質)がもたらされる場合、タンパク質
XとYは互いに結合する。D. Oligomer formation can be studied in living cells using a GFP-based “pull-out” binding assay. To address the problem of homo-versus hetero-oligomer formation, protein- An assay was developed to quantitatively study protein binding interactions (see Pull-
"Out" binding assay, Figure 2A). The strategy was to use a protein domain (PM-domain) that translocates to the plasma membrane in response to drug addition. The potential binding interaction between the prepared protein X and protein Y can then be studied by fusing this PM-domain to protein X and a GFP-tag to protein Y.
(And vice versa). Next, both fusion proteins can be expressed in the same cell and their binding interactions studied. 1. If the initial cytosolic GFP-protein Y is still cytosolic after drug addition, there is no significant binding interaction between protein X and protein Y. 2. If drug addition results in translocation of GFP-protein Y to the plasma membrane (plus non-fluorescent PM-protein)
X and Y combine with each other.

【００４３】 このようなPM-ドメインとして、タンパク質キナーゼCの最初のホルボール-エ
ステル結合ドメインを用いた。この小さな6kDaのドメインは、ホルボールエステ
ル添加後に原形質膜にほぼ不可逆的に結合する最初のサイトゾルタンパク質であ
る[Oanceaら、1998]。このドメインの明確な特性を図２Ｂに示す。ホルボールエ
ステル添加前に、GFPとホルボールエステル結合ドメインとの融合タンパク質は
サイトゾルタンパク質で(左パネル)、これは、ホルボールエステル添加後にサイ
トゾルから原形質膜に「引っ張られる」(右パネル)。この転位プロセスは1分以
内に起こり、原形質膜に局在化したホルボールエステルと融合タンパク質との拡
散依存性で高度に親和性の結合相互作用によって媒介される[Oanceaら、1998]。
可視性の核に局在化したGFP融合タンパク質も、核孔を通した拡散が遅いために
、かなりゆっくりと原形質膜に転位することが注目される。The first phorbol-ester binding domain of protein kinase C was used as such a PM-domain. This small 6 kDa domain is the first cytosolic protein that binds irreversibly to the plasma membrane after addition of the phorbol ester [Oancea et al., 1998]. The distinct characteristics of this domain are shown in FIG. 2B. Prior to phorbol ester addition, the fusion protein between GFP and the phorbol ester binding domain was a cytosolic protein (left panel), which was "pulled" from the cytosol to the plasma membrane after phorbol ester addition (right panel). ). This translocation process occurs in less than a minute and is mediated by a diffusion-dependent, high-affinity binding interaction between the fusion protein and the phorbol ester localized at the plasma membrane [Oancea et al., 1998].
It is noteworthy that the GFP fusion protein localized in the visible nucleus also translocates to the plasma membrane rather slowly due to slow diffusion through the nuclear pore.

【００４４】 このPM-ドメインは、発現したCaMKllaイソ型の大部分がオリゴマー状態で存在
するか否かを決定するために最初に用いた。生体内でのオリゴマー化を試験する
ために、PM-標識したCaMKllaとGFP-CaMKllaを同一細胞中で発現した(図２Ｃ、左
)。予想されたように、ホルボールエステルの添加で、最初のサイトゾルのGFP-C
aMKllaの原形質膜への著しい転位がもたらされた(図２Ｃ、右)。ホルボールエス
テル添加前後の分布におけるこの変化は、ホルボールエステル添加前後の細胞中
の蛍光強度を比較するラインプロフィル分析でかなり定量的に測定することがで
きる(図５Ｃ、下)。対照実験で、GFPのみを発現させ、ホルボールエステル添加
後にGFPの原形質膜転位がないことを認めた(図２Ｄ)。大部分のGFP- CaMKllaがP
M-CaMKllaによって原形質膜に引っ張られているとの知見は、発現したCaMKllaの
大部分がオリゴマー状態で細胞に存在することを示唆している。This PM-domain was initially used to determine if the majority of the expressed CaMKlla isoform was present in an oligomeric state. To test in vivo oligomerization, PM-labeled CaMKlla and GFP-CaMKlla were expressed in the same cells (FIG. 2C, left
). As expected, the addition of phorbol ester resulted in the first cytosolic GFP-C
A significant translocation of aMKlla to the plasma membrane resulted (FIG. 2C, right). This change in distribution before and after phorbol ester addition can be measured fairly quantitatively by line profile analysis comparing fluorescence intensity in cells before and after phorbol ester addition (FIG. 5C, bottom). In a control experiment, only GFP was expressed, and it was confirmed that there was no plasma membrane translocation of GFP after addition of phorbol ester (FIG. 2D). Most GFP-CaMKlla is P
The finding that M-CaMKlla is pulled by the plasma membrane suggests that most of the expressed CaMKlla is present in cells in an oligomeric state.

【００４５】 e. CaMKllbホモ-オリゴマーは、CaMKllaホモ-オリゴマーよりも極めて小さい CaMKllaが8〜12サブユニットを有するホモ-オリゴマーであることが提案され
ているが、CaMKllbがオリゴマーを形成する場合に、これらの可能性あるオリゴ
マーがどれくらい大きいかが議論されている[Yamauchiら、1989]。生細胞におけ
るCaMKllaとCaMKllbの見かけのオリゴマーの大きさを測定するために、PM-CaMKl
lの量を低下させてGFP-CaMKllを発現し、原形質膜へホルボールエステルが誘導
する転位を測定した(予想されるオリゴマー転位プロセスの概略図を図３Ａに示
す)。PM-ドメインに関してホルボールエステルが誘導する原形質膜親和性はかな
り不可逆性であるので、PM-CaMKllaのサブユニットは、CaMKllaオリゴマーの原
形質膜転位を誘導するのに1つで十分であると思われる。上記のとおり、RNAトラ
ンスフェクション法によって、同一細胞中の2つのCaMKll融合タンパク質量を定
量的に滴定することができる。2つのマイクロポレートされたRNA種それぞれの発
現レベルを決定するために、³⁵S-Met存在下の同一のRNAの生体外翻訳によって翻
訳されたタンパク質の濃度を同時に測定した(図３Ｂ)。E. CaMKllb homo-oligomer is much smaller than CaMKlla homo-oligomer CaMKlla has been proposed to be a homo-oligomer having 8 to 12 subunits, but when CaMKllb forms an oligomer, It has been debated how large these potential oligomers are [Yamauchi et al., 1989]. To determine the apparent oligomer size of CaMKlla and CaMKllb in living cells, use PM-CaMKl
The phorbol ester-induced translocation to the plasma membrane was measured by decreasing the amount of l to express GFP-CaMKll (a schematic diagram of the expected oligomer translocation process is shown in Figure 3A). Since the plasma membrane affinity induced by phorbol esters with respect to the PM-domain is quite irreversible, only one subunit of PM-CaMKlla is sufficient to induce plasma membrane translocation of CaMKlla oligomers. Seem. As described above, the amount of two CaMKll fusion proteins in the same cell can be quantitatively titrated by the RNA transfection method. To determine the expression level of each of the two microporated RNA species, the concentration of the protein translated by in vitro translation of the same RNA in the presence of ³⁵ S-Met was measured simultaneously (FIG. 3B).

【００４６】 図３Ｃは、同時発現したPM-CaMKllaの希釈の増加におけるGFP-CaMKlla原形質
膜転位を示す。左の画像はホルボールエステル添加前の分布、右の画像は添加後
の分布を示す。興味深いことに、ホルボールエステルが誘導した原形質膜への標
的化は、PM-CaMKllaがGFP-CaMKlla の3％未満に希釈された際に依然として測定
できた。原形質膜転位の連続的な低下は、蛍光ライン強度トレースでより明確に
見ることができる(図３Ｄ)。PM-CaMKlla希釈の増加におけるホルボールエステル
介在性の原形質膜の標的化の損失は、ホルボールエステル添加前の平均的なサイ
トゾルの蛍光強度(I_pre)でGFP-CaMKllaの相対的な原形質膜蛍光強度(DPM)を割る
ことによって、分析した(図６Ｅ)。0のDPM/I_pre比は原形質膜転位が起きないこ
とを示し、3までのDPM/I_pre比はPM-GFP構築物自体に認められる転位に相当する
。 この分析に基づけば、GFP-CaMKllaに対するPM-CaMKllaの希釈比の低下におい
て相対的な原形質膜転位を示す滴定曲線を得ることができる(図３Ｆ)。原形質膜
の標的化の50％低下は、14個のGFP-CaMKlla当たりに1つのPM-CaMKllaの近似の希
釈比で認められた。ポアソン分布モデルは、Nサブユニットを有するオリゴマー
へ少なくとも1つのサブユニットを導入するための確率(p)は、p = 1−(R/(R＋1)
) ^N [Rは希釈比率]であることを予測するであろう。このモデルを用いると、デ
ータに最も良好な適合性は、N = 13.5で得られた。これは、精製CaMKllaについ
ての12サブユニットの先の予測とかなり一致している[Kanasekiら、1991；Yamau
chiら、1989]。FIG. 3C shows GFP-CaMKlla plasma membrane translocation at increasing dilution of co-expressed PM-CaMKlla. The left image shows the distribution before addition of the phorbol ester, and the right image shows the distribution after addition. Interestingly, phorbol ester-induced targeting to the plasma membrane could still be measured when PM-CaMKlla was diluted to less than 3% of GFP-CaMKlla. A continuous decrease in plasma membrane translocation can be seen more clearly in the fluorescence line intensity trace (FIG. 3D). Phorbol ester-mediated loss of plasma membrane targeting in increasing PM-CaMKlla dilution was due to the relative intensity of GFP-CaMKlla in average cytosolic fluorescence intensity (I _pre ) prior to phorbol ester addition. Analyzed by dividing plasma membrane fluorescence intensity (DPM) (FIG. 6E). A DPM / I _pre ratio of 0 indicates that no plasma membrane translocation occurs, and a DPM / I _pre ratio of up to 3 corresponds to the transposition found in the PM-GFP construct itself. Based on this analysis, a titration curve showing the relative plasma membrane translocation in decreasing the dilution ratio of PM-CaMKlla to GFP-CaMKlla can be obtained (FIG. 3F). A 50% reduction in plasma membrane targeting was observed at an approximate dilution of 1 PM-CaMKlla per 14 GFP-CaMKlla. The Poisson distribution model states that the probability (p) for introducing at least one subunit into an oligomer having N subunits is p = 1− (R / (R + 1)
) ^N [R is the dilution ratio]. Using this model, the best fit to the data was obtained with N = 13.5. This is in good agreement with the previous prediction of 12 subunits for purified CaMKlla [Kanaseki et al., 1991; Yamau
chi et al., 1989].

【００４７】 次に、CaMKllbがオリゴマーを形成するか否かを決定するために同じ試みを用
いた。GFP-CaMKllbは皮質と内部F-アクチンの局在化を部分的に有するが、この
結合相互作用は可逆性で、より多くの明らかな原形質膜局在化がPM-標識CaMKllb
へのホルボールエステルの添加によって誘導され得る。これを用いてホルボール
エステルによりGFP-CaMKllbの原形質膜転位の増加を誘発し、GFP- CaMKllbに対
するPM-CaMKllbの希釈比の低下において相対的な原形質膜転位に関し滴定曲線を
得た。興味深いことに、CaMKllbオリゴマーの見かけの平均的な大きさは4.2で、
a-イソ型の大きさよりかなり小さかった(図３Ｆ)。つまり、これらの生体内測定
は、見かけの大きさがCaMKllaによって形成されるものより極めて小さいとして
も、CaMKllbがオリゴマーを形成できることを明らかに示している。CaMKllbオリ
ゴマーのこの見かけの大きさは、バキュロウイルスをトランスフェクトしたSf9
細胞から精製したCaMKllbが同じ方法で発現したCaMKllaよりもかなり小さかった
との我々の知見と一致した[Kang Shenによる未発表の結果]。Next, the same approach was used to determine whether CaMKllb formed an oligomer. Although GFP-CaMKllb has partial cortical and internal F-actin localization, this binding interaction is reversible, and more apparent plasma membrane localization is due to PM-labeled CaMKllb.
To phorbol esters. This was used to induce an increase in plasma membrane translocation of GFP-CaMKllb by phorbol ester, and a titration curve was obtained for the relative plasma membrane translocation in decreasing the dilution ratio of PM-CaMKllb to GFP-CaMKllb. Interestingly, the apparent average size of the CaMKllb oligomer is 4.2,
It was much smaller than the size of the a-isoform (FIG. 3F). Thus, these in vivo measurements clearly show that CaMKllb can form oligomers, even though the apparent size is much smaller than that formed by CaMKlla. This apparent size of the CaMKllb oligomer is due to the baculovirus-transfected Sf9
Consistent with our findings that CaMKllb purified from cells was significantly smaller than CaMKlla expressed in the same way [unpublished results by Kang Shen].

【００４８】 f. CaMKlla及びbは、推計学上のヘテロ-オリゴマーを形成する CaMKllbに対するCaMKllaの相対的な発現は異なるタイプのニューロンによって
かなり変化しうるので、次に、ホモ-オリゴマー形成に比較したヘテロ-オリゴマ
ー形成の効率の程度を決定した。図３に記載したような同じ希釈の試みを、ここ
ではヘテロ-オリゴマーについて行った。図４Ａに算出されたラインプロットは
、推計学上の挿入機序に関するGFP-CaMKllaオリゴマーへのPM-CaMKllbの挿入に
ついて予測される曲線を示す(破線曲線)。GFP-CaMKllaに対するPM-CaMKllbの比
率の低下に関して測定される相対的な原形質膜転位は、推測される推計学上の挿
入機序とかなり適合した。次に、一定濃度のCaMKllbでPM-CaMKlla融合タンパク
質を希釈して、GFP-CaMKllbオリゴマーへのPM-CaMKll1aの挿入について同じ測定
を行った(図４Ｂ)。推計学上の挿入機序について算出した曲線は、合わせた曲線
と重なる。 また、この滴定の試みは、CaMKllaとCaMKllbのイソ型が同時に同じ場所で発現
される際に、推計学上の確率でいずれかのイソ型の挿入に混合オリゴマーを形成
することを示唆している。これは、ニューロン中の大部分のCaMKllオリゴマーが
、局所的に翻訳されるCaMKllb対CaMKllaの相対的な発現レベルによって定義され
る種々のCaMKllb画分を含むことも示唆している。生理学的な状況には、細胞骨
格のドッキング部位に依然として有効にCaMKllを標的化するためには、次に、ど
れくらい多くのCaMKllbイソ型が主としてCaMKllaヘテロオリゴマーに挿入されな
ければならないかを知ることが重要である。F. CaMKlla and b form stochastic hetero-oligomers Next, the relative expression of CaMKlla relative to CaMKllb can be significantly altered by different types of neurons, and was then compared to homo-oligomerization. The degree of efficiency of hetero-oligomer formation was determined. The same dilution attempt as described in FIG. 3 was performed here for the hetero-oligomer. The calculated line plot in FIG. 4A shows the expected curve for insertion of PM-CaMKllb into GFP-CaMKlla oligomer for the stochastic insertion mechanism (dashed curve). The relative plasma membrane translocations measured for the reduced ratio of PM-CaMKllb to GFP-CaMKlla were fairly compatible with the putative stochastic insertion mechanism. Next, the same measurement was performed for the insertion of PM-CaMKllla into the GFP-CaMKllb oligomer by diluting the PM-CaMKlla fusion protein with a constant concentration of CaMKllb (Fig. 4B). The curve calculated for the stochastic insertion mechanism overlaps with the combined curve. The titration attempt also suggests that when CaMKlla and CaMKllb isoforms are simultaneously expressed in the same location, a stochastic probability forms mixed oligomers at the insertion of either isoform. . This also suggests that most CaMKllb oligomers in neurons contain different CaMKllb fractions defined by the relative expression levels of locally translated CaMKllb versus CaMKlla. In a physiological context, in order to still effectively target CaMKll to the docking site in the cytoskeleton, it is next to know how many CaMKllb isoforms must be inserted primarily into CaMKlla hetero-oligomers is important.

【００４９】 g. アクチン細胞骨格にCaMKllヘテロ-オリゴマーを標的化するためには、少数
のCaMKllbイソ型で十分である 先の研究はCaMKllaとCaMKllbのオリゴマー形成を詳細に吟味するのに有用であ
るが、アクチン細胞骨格にCaMKlla/bヘテロ-オリゴマーを標的化するのに個々の
又は多数のCaMKllbサブユニットが必要であるかどうかを分析しなかった。同じR
NA希釈ストラテジを用いて、GFP-CaMKllaのCaMKllbに対するどの比率で細胞骨格
局在化が生じるかを決定した。RBL-細胞において明らかな皮質アクチン細胞骨格
のCaMKllbの局在化を、このアッセイで用いた(図４Ｃ)。CaMKllbは、原形質膜に
GFP-CaMKllaを標的化するのにPM-CaMKll構築物よりも有効でないが、皮質アクチ
ン細胞骨格への50％の転位は約6.5：1のGFP-CaMKlla：CaMKllbの比率を要した。
CaMKllaイソ型は約13個のサブユニットを含むので、これは、アクチン細胞骨格
にCaMKlla/bヘテロ-オリゴマーを標的化するには少数のCaMKllbサブユニットで
十分であることを示唆している。G. A Few CaMKllb Isoforms Are Sufficient to Target CaMKll Hetero-Oligomers to the Actin Cytoskeleton The Previous Studies Are Useful to Investigate the CaMKlla and CaMKllb Oligomerization Did not analyze whether individual or multiple CaMKllb subunits were required to target CaMKlla / b hetero-oligomers to the actin cytoskeleton. Same R
The NA dilution strategy was used to determine at what ratio of GFP-CaMKlla to CaMKllb cytoskeletal localization occurs. Localization of CaMKllb in the cortical actin cytoskeleton apparent in RBL-cells was used in this assay (FIG. 4C). CaMKllb is on the plasma membrane
Although less effective than the PM-CaMKll construct in targeting GFP-CaMKlla, 50% translocation to the cortical actin cytoskeleton required a GFP-CaMKlla: CaMKllb ratio of about 6.5: 1.
Since the CaMKlla isoform contains about 13 subunits, this suggests that a small number of CaMKllb subunits are sufficient to target the CaMKlla / b hetero-oligomer to the actin cytoskeleton.

【００５０】 CaMKllbによるCaMKllaの細胞骨格の標的化を理解する第二の独立した試みでは
、拡散係数の測定によってヘテロ-オリゴマーの結合相互作用を測定した。図１
Ｆに示すように、GFP-CaMKllaはGFP-CaMKllbより5倍は早い見かけの拡散を有す
る。次いで、CaMKllbへのGFP-CaMKllaの希釈増加における拡散係数を測定した。
皮質細胞骨格への局在化の結果と同様に、CaMKllb濃度がGFP-CaMKllaの15％を越
える際にCaMKllaの拡散係数は50％まで低下した(図４Ｄ)。また、これらの測定
は、CaMKllbが、アクチン細胞骨格にかなり多数のCaMKllaイソ型を局在させるこ
とができる有効な標的化ドメインであることを示している。In a second independent attempt to understand the targeting of the CaMKlla cytoskeleton by CaMKllb, the hetero-oligomer binding interaction was measured by measuring the diffusion coefficient. FIG.
As shown in F, GFP-CaMKlla has an apparent diffusion 5 times faster than GFP-CaMKllb. Next, the diffusion coefficient in increasing dilution of GFP-CaMKlla into CaMKllb was measured.
Similar to the result of localization to the cortical cytoskeleton, the diffusion coefficient of CaMKlla decreased to 50% when the CaMKllb concentration exceeded 15% of GFP-CaMKlla (FIG. 4D). These measurements also indicate that CaMKllb is an effective targeting domain that can localize a significant number of CaMKlla isoforms to the actin cytoskeleton.

【００５１】 ３. 参照文献 3. References

【００５２】 前記はこの発明の例示であり、発明を限定するものではない。この発明は、請
求の範囲、それに含まれる請求の範囲と等価なものによって定義される。The above description is an exemplification of the present invention, and does not limit the present invention. The invention is defined by the following claims, with equivalents of the claims to be included therein.

【００５３】[0053]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 GFP-標識したCaMKIIa及びCaMKIIbの細胞局在及び可動性を示す。FIG. 1 shows the cellular localization and mobility of GFP-labeled CaMKIIa and CaMKIIb.

【図２】 生細胞におけるタンパク質-タンパク質相互作用を研究するための「プルアウ
ト」結合アッセイの開発を示す。FIG. 2 shows the development of a “pull-out” binding assay for studying protein-protein interactions in living cells.

【図３】 CaMKIIaがCaMKIIbより大きなオリゴマーを形成することを示す。FIG. 3 shows that CaMKIIa forms larger oligomers than CaMKIIb.

【図４】 アクチン細胞骨格にCaMKIIa/bヘテロ-オリゴマーを標的化するための1以上のC
aMKIIbサブユニットの必要条件を示す。FIG. 4. One or more Cs for targeting CaMKIIa / b hetero-oligomers to the actin cytoskeleton
Shows the requirements for the aMKIIb subunit.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 15/09 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 1/48 37/00 １０３ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 37/00 １０３ 5/00 Ａ (71)出願人 230 Ｎｏｒｔｈ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｄｒｉｖｅ，Ｐ．Ｏ．Ｂ ｏｘ 90083，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ 27712 Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA10 BA80 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA12 EA04 GA14 GA18 HA11 HA20 4B063 QA08 QA11 QA20 QQ27 QQ44 QQ53 QQ79 QR41 QR56 QR66 QR77 QR80 QS05 QS36 QS39 QX02 QX10 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90Y AA91Y AB01 AC14 AC16 BA02 BA03 BA05 BB01 BC03 BC07 BD50 CA24 CA29 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA40 DA89 EA50 FA74 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 C12Q 1/02 15/09 1/48 Z C12Q 1/02 G01N 33/53 Y 1/48 37/00 103 G01N 33/53 C12N 15/00 A 37/00 103 5/00 A (71) Applicant 230 North Building, Research Drive, P.E. O. Box 90083, Durham, NC 27712 The United States of America F term (reference) 4B024 AA01 AA11 AA20 BA10 BA80 CA04 CA07 DA01 DA02 DA05 DA12 EA04 GA14 GA18 HA11 HA20 4B06QQAQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ have had as as as as as long as I am as follows. QS39 QX02 QX10 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90Y AA91Y AB01 AC14 AC16 BA02 BA03 BA05 BB01 BC03 BC07 BD50 CA24 CA29 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA40 DA89 EA50 FA74

Claims (45)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 (a) 異種の第一接合体と異種の第二接合体を含む細胞を
用意し、 ここで、異種の第一接合体は検出可能な基に接合した興味ある第一タンパク質
からなり、かつ 異種の第二接合体は、細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質に接合
した興味ある第二タンパク質からなる；次いで (b) 内部構造に対する検出可能な基の結合の有無を検出し、結合の存在が、興
味ある第一及び第二タンパク質が互いに特異的に結合していることを示す ことからなる、タンパク質-タンパク質相互作用の検出方法。1. A cell comprising a heterologous first conjugate and a heterologous second conjugate, wherein the heterologous first conjugate is a first protein of interest conjugated to a detectable group. And the heterologous second conjugate comprises a second protein of interest conjugated to a protein that specifically binds to an internal structure within the cell; then (b) the presence or absence of a detectable group attached to the internal structure Detecting the protein-protein interaction, wherein the presence of the binding indicates that the first and second proteins of interest are specifically bound to each other. 【請求項２】 検出可能な基がタンパク質であり、第一タンパク質及び検出
可能な基がともに融合タンパク質からなる請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the detectable group is a protein, and wherein the first protein and the detectable group both comprise a fusion protein. 【請求項３】 細胞が、融合タンパク質をエンコードする核酸を含み発現す
る請求項１に記載の方法。3. The method of claim 1, wherein the cells contain and express a nucleic acid encoding the fusion protein. 【請求項４】 第二の異種接合体が融合タンパク質である請求項１に記載の
方法。4. The method according to claim 1, wherein the second heterozygote is a fusion protein. 【請求項５】 細胞が、融合タンパク質をエンコードする核酸を含み発現す
る請求項５に記載の方法。5. The method of claim 5, wherein the cell contains and expresses a nucleic acid encoding the fusion protein. 【請求項６】 興味ある第一及び第二タンパク質が、ともに特異的な結合対
のメンバーからなる請求項１に記載の方法。6. The method of claim 1, wherein the first and second proteins of interest both comprise members of a specific binding pair. 【請求項７】 さらに、検出工程前に細胞に試験化合物を供与する工程から
なり、ここで、内部構造への検出可能な基の結合の不在は、試験化合物が特異的
な結合対のメンバーの結合を阻害していることを示す請求項６に記載の方法。7. The method of claim 6, further comprising the step of providing the test compound to the cell prior to the detecting step, wherein the absence of binding of the detectable group to the internal structure indicates that the test compound is a member of a specific binding pair member. 7. The method of claim 6, wherein the method inhibits binding. 【請求項８】 さらに、(c)興味あるタンパク質のライブラリーを用いて工
程(a)及び(b)を多数繰り返す工程からなり、ここで、興味ある第一及び第二タン
パク質のひとつは同一性を維持し、興味ある他の第一及び第二タンパク質はライ
ブラリーの異なるメンバーで置換され、ライブラリーが、興味ある第一又は第二
タンパク質のひとつに特異的に結合するタンパク質についてスクリーンされる請
求項１に記載の方法。8. The method further comprises (c) repeating steps (a) and (b) a number of times using a library of proteins of interest, wherein one of the first and second proteins of interest has the identity And the other first and second proteins of interest are replaced with different members of the library, and the library is screened for proteins that specifically bind to one of the first or second proteins of interest. Item 1. The method according to Item 1. 【請求項９】 ライブラリーが、コンビナトリアルライブラリーである請求
項８に記載の方法。9. The method according to claim 8, wherein the library is a combinatorial library. 【請求項１０】 ライブラリーが、cDNAライブラリーの発現産物からなる請
求項８に記載の方法。10. The method according to claim 8, wherein the library comprises an expression product of a cDNA library. 【請求項１１】 異種の第二接合体が、検出可能な基をさらに含む請求項１
に記載の方法。11. The heterologous second conjugate further comprises a detectable group.
The method described in. 【請求項１２】 細胞が真核細胞である請求項１に記載の方法。12. The method according to claim 1, wherein the cell is a eukaryotic cell. 【請求項１３】 細胞が酵母、植物又は動物細胞である請求項１に記載の方
法。13. The method according to claim 1, wherein the cell is a yeast, plant or animal cell. 【請求項１４】 細胞が哺乳動物細胞である請求項１に記載の方法。14. The method according to claim 1, wherein the cells are mammalian cells. 【請求項１５】 内部構造が、細胞核又は細胞核に含有される構造物である
請求項１に記載の方法。15. The method according to claim 1, wherein the internal structure is a cell nucleus or a structure contained in the cell nucleus. 【請求項１６】 内部構造が細胞の細胞質に含有される請求項１に記載の方
法。16. The method according to claim 1, wherein the internal structure is contained in the cytoplasm of the cell. 【請求項１７】 内部構造が、原形質膜、細胞骨格、セントロメア、核、ミ
トコンドリア、小胞体、液胞、ゴルジ装置及び葉緑体からなる群から選択される
請求項１に記載の方法。17. The method of claim 1, wherein the internal structure is selected from the group consisting of plasma membrane, cytoskeleton, centromere, nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, vacuole, Golgi apparatus, and chloroplast. 【請求項１８】 内部構造が、原形質膜又は皮質細胞骨格からなる群から選
択される請求項１に記載の方法。18. The method of claim 1, wherein the internal structure is selected from the group consisting of a plasma membrane or a cortical cytoskeleton. 【請求項１９】 内部構造に特異的に結合するタンパク質が転位可能なタン
パク質であり、方法が、検出工程前に異種の第二接合体の転位を誘導する工程を
さらに含む請求項１に記載の方法。19. The method of claim 1, wherein the protein that specifically binds to an internal structure is a transposable protein, and the method further comprises the step of inducing translocation of the heterologous second conjugate prior to the detecting step. Method. 【請求項２０】 第一タンパク質が転位可能なタンパク質であり、方法が、
検出工程前に第一タンパク質の転位を誘導する工程をさらに含む請求項１に記載
の方法。20. The method according to claim 19, wherein the first protein is a transposable protein.
2. The method of claim 1, further comprising the step of inducing translocation of the first protein prior to the detecting step. 【請求項２１】 内部構造に特異的に結合するタンパク質が、サイトゾルタ
ンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、アダプタータンパク質、細胞骨
格タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、GTP-結合タンパク質、原形質膜タンパ
ク質、原形質膜関連タンパク質、β-アレスチン及び視覚性アレスチン、ならび
に内部構造に特異的に結合するそのフラグメントからなる群から選択される請求
項１に記載の方法。21. A protein that specifically binds to an internal structure is a cytosolic protein kinase, a protein phosphatase, an adapter protein, a cytoskeletal protein, a cytoskeletal-related protein, a GTP-binding protein, a plasma membrane protein, or a plasma membrane-related protein. 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of proteins, β-arrestin and visual arrestin, and fragments thereof that specifically bind to internal structures. 【請求項２２】 内部構造に特異的に結合するタンパク質が、内部構造に特
異的に結合するタンパク質キナーゼCのイソ型又はそのフラグメントである請求
項２１に記載の方法。22. The method according to claim 21, wherein the protein that specifically binds to the internal structure is an isoform of protein kinase C that specifically binds to the internal structure or a fragment thereof. 【請求項２３】 内部構造に特異的に結合するタンパク質が、C1ドメイン及
びC2ドメインからなる群から選択されるタンパク質キナーゼCのフラグメントで
ある請求項２２に記載の方法。23. The method according to claim 22, wherein the protein that specifically binds to the internal structure is a fragment of protein kinase C selected from the group consisting of a C1 domain and a C2 domain. 【請求項２４】 興味ある第一及び第二タンパク質が同一である請求項１に
記載の方法。24. The method of claim 1, wherein the first and second proteins of interest are the same. 【請求項２５】 興味ある第一及び第二タンパク質が異なる請求項１に記載
の方法。25. The method of claim 1, wherein the first and second proteins of interest are different. 【請求項２６】 細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質と特異的
な結合対のメンバーであるタンパク質とからなる融合タンパク質。26. A fusion protein comprising a protein that specifically binds to an internal structure in a cell and a protein that is a member of a specific binding pair. 【請求項２７】 請求項２６に記載の融合タンパク質をエンコードする核酸
。27. A nucleic acid encoding the fusion protein according to claim 26. 【請求項２８】 請求項２７に記載の核酸を含み発現する細胞。28. A cell containing and expressing the nucleic acid according to claim 27. 【請求項２９】 検出可能な基であるタンパク質と転位可能なタンパク質と
からなる融合タンパク質。29. A fusion protein comprising a protein that is a detectable group and a transposable protein. 【請求項３０】 請求項２９に記載の融合タンパク質をエンコードする核酸
。30. A nucleic acid encoding the fusion protein according to claim 29. 【請求項３１】 請求項３０に記載の核酸を含み発現する細胞。A cell comprising and expressing the nucleic acid according to claim 30. 【請求項３２】 (a)第一の融合タンパク質をエンコードする核酸を含み発
現する細胞(融合タンパク質は細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質
と興味ある第一タンパク質からなる)と、 (b)発現カセットを含む細胞用のベクター とからなり、 発現カセットは、細胞で操作可能で、検出可能なタンパク質をエンコードする核
酸に操作的に結合するプロモーターを含み、 この発現カセットが、さらに検出可能なタンパク質をエンコードする核酸に隣合
って位置するスプライス部位を含み、興味ある第二タンパク質をエンコードする
異種の核酸がそこに挿入され、第二の融合タンパク質をエンコードする核酸セグ
メントを産生することができ、 第二の融合タンパク質が、検出可能なタンパク質と興味ある第二のタンパク質と
からなる、 生細胞内でのタンパク質-タンパク質の相互作用を検出するのに有用なキット。32. (a) a cell containing and expressing a nucleic acid encoding a first fusion protein (the fusion protein comprises a protein that specifically binds to an internal structure in the cell and a first protein of interest); b) a vector for a cell comprising an expression cassette, the expression cassette comprising a promoter operable in the cell and operably linked to a nucleic acid encoding a detectable protein, wherein the expression cassette is further detectable. A heterologous nucleic acid encoding a second protein of interest can be inserted therein to produce a nucleic acid segment encoding a second fusion protein. The second fusion protein comprises a detectable protein and a second protein of interest, Protein in the inner - kit useful for detecting protein interactions. 【請求項３３】 ベクターがプラスミドである請求項３２に記載のキット。33. The kit according to claim 32, wherein the vector is a plasmid. 【請求項３４】 (a) 第一の融合タンパク質をエンコードする核酸を含み
発現する細胞(融合タンパク質は検出可能なタンパク質と興味ある第一タンパク
質からなる)と、 (b) 発現カセットを含む細胞用のベクター とからなり、 発現カセットは、細胞で操作可能で、細胞内の内部構造に特異的に結合するタン
パク質をエンコードする核酸に操作的に結合するプロモーターを含み、 この発現カセットが、細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質をエンコ
ードする核酸に隣合って位置するスプライス部位をさらに含み、興味ある第二タ
ンパク質をエンコードする異種の核酸がそこに挿入され、第二の融合タンパク質
をエンコードする核酸セグメントを産生することができ、 第二の融合タンパク質が、細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質と興
味ある第二のタンパク質とからなる、 生細胞内でのタンパク質-タンパク質の相互作用を検出するのに有用なキット。34. (a) cells containing and expressing a nucleic acid encoding a first fusion protein (the fusion protein comprises a detectable protein and a first protein of interest); and (b) cells containing an expression cassette. The expression cassette comprises a promoter operable in a cell and operably linked to a nucleic acid encoding a protein that specifically binds to an internal structure in the cell. It further includes a splice site located adjacent to the nucleic acid encoding the protein that specifically binds to an internal structure, into which a heterologous nucleic acid encoding a second protein of interest is inserted to encode a second fusion protein A second fusion protein capable of producing a nucleic acid segment, wherein the second fusion protein specifically binds to an internal structure within the cell. A kit comprising a protein and a second protein of interest, useful for detecting protein-protein interactions in living cells. 【請求項３５】 ベクターがプラスミドである請求項３４に記載のキット。35. The kit according to claim 34, wherein the vector is a plasmid. 【請求項３６】 個別の多数の核酸からなり、個別の核酸それぞれが、興味
あるタンパク質と検出可能なタンパク質とからなる融合タンパク質をエンコード
しており、個別の核酸それぞれでエンコードされる興味あるタンパク質がライブ
ラリーの他の核酸によってエンコードされる興味あるタンパク質と異なる、核酸
ライブラリー。36. An individual nucleic acid comprising a plurality of individual nucleic acids, each individual nucleic acid encoding a fusion protein comprising a protein of interest and a detectable protein, wherein the protein of interest encoded by each individual nucleic acid is A nucleic acid library that differs from the protein of interest encoded by other nucleic acids in the library. 【請求項３７】 検出可能なタンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は蛍光基
に特異的に結合するタンパク質からなる請求項３６に記載の核酸ライブラリー。37. The nucleic acid library according to claim 36, wherein the detectable protein comprises a green fluorescent protein or a protein that specifically binds to a fluorescent group. 【請求項３８】 ライブラリーがcDNAライブラリーである請求項３６に記載
の核酸ライブラリー。38. The nucleic acid library according to claim 36, wherein the library is a cDNA library. 【請求項３９】 ライブラリーがコンビナトリアルライブラリーである請求
項３６に記載の核酸ライブラリー。39. The nucleic acid library according to claim 36, wherein the library is a combinatorial library. 【請求項４０】 個別の多数の核酸からなり、個別の核酸それぞれが、興味
あるタンパク質と細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質とからなる融
合タンパク質をエンコードしており、個別の核酸それぞれでエンコードされる興
味あるタンパク質がライブラリーの他の核酸によってエンコードされる興味ある
タンパク質と異なる、核酸ライブラリー。40. An individual nucleic acid comprising a plurality of individual nucleic acids, each individual nucleic acid encoding a fusion protein comprising a protein of interest and a protein that specifically binds to an internal structure in a cell, A nucleic acid library, wherein the protein of interest encoded by is different from the protein of interest encoded by other nucleic acids in the library. 【請求項４１】 細胞内の内部構造に特異的に結合するタンパク質が、転位
可能なタンパク質である請求項４０に記載の核酸ライブラリー。41. The nucleic acid library according to claim 40, wherein the protein that specifically binds to an internal structure in a cell is a transposable protein. 【請求項４２】 内部構造に特異的に結合するタンパク質が、内部構造に特
異的に結合するタンパク質キナーゼCのイソ型又はそのフラグメントである請求
項４０に記載の核酸ライブラリー。42. The nucleic acid library according to claim 40, wherein the protein that specifically binds to the internal structure is an isoform of protein kinase C that specifically binds to the internal structure or a fragment thereof. 【請求項４３】 内部構造に特異的に結合するタンパク質が、C1ドメイン及
びC2ドメインからなる群から選択されるタンパク質キナーゼCのフラグメントで
ある請求項４０に記載の核酸ライブラリー。43. The nucleic acid library according to claim 40, wherein the protein that specifically binds to an internal structure is a fragment of protein kinase C selected from the group consisting of a C1 domain and a C2 domain. 【請求項４４】 ライブラリーがcDNAライブラリーである請求項４０に記載
の核酸ライブラリー。44. The nucleic acid library according to claim 40, wherein the library is a cDNA library. 【請求項４５】 ライブラリーがコンビナトリアルライブラリーである請求
項４０に記載の核酸ライブラリー。45. The nucleic acid library according to claim 40, wherein the library is a combinatorial library.