JP2002526421A - 癌細胞に差別的に発現する癌ワクチン設計のための遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫応答を生成するワクチンを設計するため、標的細胞において、差別的に発現される遺伝子を利用する。該方法は、ｇｐ１００黒色腫細胞に対し免疫応答を誘導するための、およびＨＥＲ−２⁺細胞に対し免疫応答を誘導するための組成物および方法を提供する。患者におけるこれらの細胞の存在と関連する異常を治療しそして予防する、癌ワクチンおよび養子免疫療法もまた提供される。該方法は、適切な遺伝子または癌ワクチン、抗体、タンパク質、ポリペプチド、抗原提示細胞または免疫エフェクター細胞を投与することにより、実施することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、参照により本明細書に援用する１９９８年１０月５日付け米国仮出
願Ｎｏ．６０／１０３，２２０に基づいて、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に
より優先権を主張する。

【０００２】

【発明の属する技術分野】

本発明は、分子生物学、細胞生物学及び免疫学の分野に属する。より具体的に
は、本発明は抗原性タンパク質及びポリペプチドを同定するのに機能的ゲノムを
利用する。

【０００３】

【従来の技術】

発明の背景 多くの研究者達は、腫瘍細胞を絶滅するための抗腫瘍細胞反応を作り出すこと
を望み、抗原特異なＴ細胞の反応を引き出そうと努力をしてきた。今までに４種
類の腫瘍抗原が同定された。即ち腫瘍細胞により過剰に発現された自己タンパク
質である分化抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７のようなウイルス抗原、ＭＡＧＥに
代表される腫瘍／精巣ファミリーの抗原及びｒａｓ又はｐ５３などのような変異
タンパク質である。分化抗原の中で、大多数はメラノーマ関連抗原で、細胞毒性
Ｔ細胞の目標として良好な候補である肺ガン、前立腺ガン、乳ガン又は結腸ガン
で過剰発現した自己抗原を同定しようとしたが成功していない。こうして、今ま
で行なわれたガン免疫療法の試みの大多数はメラノーマの治療であり、他の悪性
疾病で苦しむ患者に提供できる免疫療法は数少ない。本発明では、メラノーマ以
外での悪性疾病及び他の病変についての同定した腫瘍抗原が少ないことに関する
制約の解決を目的とするものである。 発明の開示 本発明では目標細胞において差別的に発現した遺伝子を用いてワクチンを設計
する。

【０００４】 本発明は、目標細胞から単離した転写物の発現レベルと対照細胞のそれを比較
して推定される抗原を同定する方法及び目標細胞と対照細胞を比較したときに過
剰発現又は他にない発現をした転写物を同定する方法を提供する。タグに相当す
るｃＤＮＡの配列を単離し、そのタンパク質産物を同定する。そのタンパク質が
免疫原性であれば、ガンワクチン又は養子免疫療法に関して有用となる。表現型
分析から抗原タンパク質を同定することを追求したこれまでの技法とは異なり、
本発明の方法は抗原同定に機能的ゲノム科学を応用する。

【０００５】 本発明はまた、これまで被験者に免疫反応を誘導する能力が認められていない
が、被験者の目標細胞にて独特な発現又は過剰発現する抗原タンパク質の効果量
を被験者に与えることにより、目標細胞に対する免疫反応を高めて被験者の目標
細胞に対する免疫反応を誘導する方法を提供する。

【０００６】 この方法につきここで例証し、ｇｐ１００メラノーマ細胞に対して免疫反応を
誘起する組成物及び方法を提供する。更なる具体例として、ＨＥＲ−２⁺細胞に
対する免疫反応を惹起する組成物及び方法をここで提供する。更に被験体に存在
するこれらの細胞の存在に関する状態を治療し防止するガンワクチン及び養子免
疫療法を提供する。この方法においては、適切な遺伝子又はガンワクチン、抗体
、タンパク質、ポリペプチド、抗体提示細胞又は免疫エフェクター細胞を投与し
て行なうことができる。

【０００７】

【発明の実施の態様】

種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書につき引用を確認して参考文献
に収載した。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書は、本発明に関係
する現在の技術を十分に説明するために参照して組み入れる。

【０００８】 本発明を実施するには、他に示さない限り分子生物、微生物、細胞生物及び組
換えＤＮＡの従来技術を採用するが、それらは現技術での技能の範囲内となる。
例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：
Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２^nd ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９
）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯ
ＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（１９８７）；ｔｈｅ
ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲ
ＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．
Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））；ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ
ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））である。 定義 明細書及び請求項で使用するとき、単数形“ａ"，“ａｎ"及び“ｔｈｅ"は前
後で明らかに他のことを示さなければ複数の意味を含む。例えば、“a ｃｅｌｌ
"は混合物を含めた細胞の複数性を含む。

【０００９】 ここで使用するとき、単語“含んでいる"は組成物及び方法は列挙した要素を
含むということで他の成文を除外するわけではない。“から本質的に成る"を組
成物及び方法を定義するときに用いた場合は、組合せにいかなる重要な意味をも
つ他の要素も除外するという意味である。そして、ここで定義した要素から本質
的に成る組成物とは、単離や精製法で生じる痕跡量の混入物及びりん酸緩衝食塩
水、防腐剤などの医薬品で許容されたキャリアーなどを除外するものではない。
“から成る"は他成分の痕跡以上及び本発明の組成物を投与する際の基本的方法
の段階は除外する。これら変遷的語句の各々で規定した態様は本発明の範囲に含
まれる。

【００１０】 ここで用いるとき、第一ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとが以下に
示した関係のいずれかの関係を有すれば、もう一つ（一番目）のポリヌクレオチ
ド“に相当する"ことになる。 １）第二ポリヌクレオチドが第一ポリヌクレオチドを含み、第二ポリヌクレオチ
ドが遺伝子産物のコードをしている。 ２）第二ポリヌクレオチドがｃＤＮＡ、ＲＮＡ，ゲノムＤＮＡ又はこれらいずれ
かのポリヌクレオチド断片中における第一ポリヌクレオチドの５'又は３'側にあ
る。例えば、第二のポリヌクレオチドが第一及び第二ポリヌクレオチドを含む遺
伝子の断片であるとき。第一及び第二ポリヌクレオチドがタンパク質又は抗体な
どのような遺伝子産物をコードする遺伝子の成分であるという点でそれらが関連
するとき。しかし、第二ポリヌクレオチドが第一ポリヌクレオチドを含む或いは
重複することは、ここで用いた“に相当する"の定義内に含まれるためには必要
ではない。例えば、第一ポリヌクレオチドは第二ポリヌクレオチドの３'非翻訳
領域の断片、例えばプロモーター配列でありうる。第一及び第二ポリヌクレオチ
ドは遺伝子産物をコードする遺伝子の断片でありうる。第二ポリヌクレオチドは
遺伝子のエキソンであり、第一ポリヌクレオチドは遺伝子のイントロンでありう
る。 ３）第二ポリヌクレオチドは第一ポリヌクレオチドの補体である。

【００１１】 細胞の“遺伝子型"は細胞の遺伝的構成及び／又はその遺伝子発現プロフィル
という。細胞の遺伝子型の調整は、補足ＤＮＡ又はＲＮＡをエピソーム又はレシ
ピエント細胞の染色体ＤＮＡの不可欠な部分として導入して達成できる。遺伝子
型はまた遺伝子発現を制御する薬剤を用いて特有遺伝子の発現レベル、例えばｍ
ＲＮＡ量を変化させて調整できる。

【００１２】 “データベース"とはヌクレオチド及びペプチド配列を含めた配列の集積を表
し、言い換えれば生物標準物質の集合を表す。 “天然の"又は“自然の"抗原はポリペプチド、タンパク質又はエピトープを含
む断片で、それは自然の生物源から単離したもので、抗原受容体、特に被験者の
Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合できる。

【００１３】 “抗原"という語句は技術的にはよく理解されているが、免疫原性である物質
即ち免疫原と共に免疫的無感応又はアネルギーをもたらす物質即ちアネルゲンを
含む。

【００１４】 ここで、天然の抗原或いは野生型抗原とも呼ばれる“自己抗原"は抗原性ペプ
チドで、抗原に自己寛容である被験体では少しの反応を惹起するか或いはなにも
免疫反応を起こさない。自己抗原の例としてはヒトメラノーマ抗原ｇｐ１００が
ある。

【００１５】 “腫瘍関連抗原"又は“ＴＡＡ"は、腫瘍に関連する或いは腫瘍に特異的な抗原
を呼ぶ。知られているＴＡＡｓの例はｇｐ１００，ＭＡＲＴ及びＭＡＧＥである
。

【００１６】 語句“ポリヌクレオチド"及び“核酸分子"は任意の長さのヌクレオチド重合体
を言うが、相互交換的に用いる。ポリヌクレオチドはデオキシヌクレオチド、リ
ボヌクレオチド及び／又はそれらの類似物を含む。ヌクレオチドはいかなる三次
元構造もとり、既知又は未知の機能を果たす。語句“ポリヌクレオチド"は例え
ば一重、二重鎖及び三重螺旋分子、遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロ
ン、ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ，リボザイム、ｃＤＮＡ，組換えポリヌクレ
オチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離Ｄ
ＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ，核酸プローブ及びプライマーを含む。核酸分
子はまた修飾核酸分子を含む。

【００１７】 “オリゴヌクレオチド"は一重又は二重鎖ＤＮＡの約５〜約１００個のポリヌ
クレオチドを称する。オリゴヌクレオチドはまたオリゴマ又はオリゴとして知ら
れ、遺伝子から単離或いは技術的に知られた方法で化学的に合成される。

【００１８】 語句“ｃＤＮＡ"は相補的ＤＮＡであり、細胞又は生物中に存在するｍＲＮＡ
分子から逆転写酵素のような酵素でｃＤＮＡにされたものである。“ｃＤＮＡラ
イブラリー"は細胞や生物に存在する全てのｍＲＮＡ分子の収集物で、逆転写酵
素によりｃＤＮＡ分子へ変換され、“ベクター"に挿入されたものである。

【００１９】 語句“遺伝的に修飾された"は、外来遺伝子又は核酸配列を含んでいること及
び／又は発現し、引き続いて細胞の遺伝子型又は表現型或いはその子孫に修飾を
加えることを意味する。言い換えれば、その語句は細胞の内在性ヌクレオチドへ
の付加、欠失又は***を意味する。

【００２０】 ここで使用するとき、“発現"はポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写された後
、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳される過程を言う。ポリヌクレ
オチドが遺伝子ＤＮＡに由来する場合、適切な真核生物ホストを選択すれば、発
現はｍＲＮＡのスプライシングを含む。発現に求められる調節要素にはＲＮＡポ
リメラーゼを結合するプロモーター配列及びリボソーム結合用の転写開始配列を
含む。例えば細菌発現ベクターはｌａｃプロモーター、転写開始用Ｓｈｉｎｅ−
Ｄａｌｇａｒｎｏ配列及び開始コドンＡＵＧ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．
（１９８９）ｓｕｐｒａ）を含む。同様に、真核生物発現ベクターはＲＮＡポリ
メラーゼＩＩ用の異種又は相同プロモーター、ダウンストリームポリアデニル化
信号、開始コドンＡＵＧ及びリボソーム脱離用の終結コドンを含む。この様なベ
クター類は市販されているのを入手するか、技術的に良く知られている方法に記
述された配列で組み立てるが、例えば一般的なベクターを構築するのは以下に記
述した方法である。

【００２１】 “配列タグ"又は“タグ"又は“ＳＡＧＥタグ"は短オリゴヌクレオチドで、遺
伝子転写産物の一定の位置に生じる明確なヌクレオチド配列を含んでいる。タグ
の長さは一般的には約２０ヌクレオチド以下で、好ましくは９〜１５ヌクレオチ
ド、更に好ましくは１０ヌクレオチドである。タグは、相当する転写産物及びそ
れが転写された遺伝子を同定する際に使える。タグは更に外来ヌクレオチドを含
むことができ、配列タグの同定及び有用性を促進する。そのような補助的配列に
は、制限エンドヌクレアーゼ解裂部位及び配列決定及びクローニング用のよく知
られたプライマー配列が含まれるが、それだけに限らない。

【００２２】 語句“ペプチド"はその広い意味では二つかそれ以上のアミノ酸、アミノ酸類
似物又はペプチド模倣体のサブユニットを有する化合物を称する。サブユニット
はペプチド結合で結合されている。他の具体例では、サブユニットは他の結合、
例えばエステル、エーテルなどの結合で接続されていてもよい。ここで使用する
とき語句“アミノ酸"は天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸で、グリシンと
Ｄ又はＬ光学両異性体及びアミノ酸類似物とペプチド模倣体を含んでいる。３つ
又はそれ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短ければ普通オリゴペプチ
ドと言われる。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは普通ポリペプチド又はタンパ
ク質と言う。

【００２３】 “プライマー"は短いポリヌクレオチドで、通常は目的の試料に存在する可能
性がある目標物又は“鋳型"に目的物と交雑により結合する遊離３'−OH基を有し
、目標物と相補性のポリヌクレオチドの重合を促進する。“ポリメラーゼ連鎖反
応"（“ＰＣＲ"）は“アップストリーム"及び“ダウンストリーム"プライマー、
ＤＮＡポリメラーゼ及び典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素などの重合触媒か
らなる“プライマーの対"又は“プライマーの組"を用いて目標ポリヌクレオチド
の多数の複写を作る反応である。ＰＣＲの方法は技術的によく知られており、例
えば“ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ"（Ｍ．ＭａｃＰｈ
ｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））で学べる。ポリヌクレオチドの多数
の複写を生産するＰＣＲ又は遺伝子クローニングの全工程は、ここではまとめて
“複製"と称する。プライマーはサザーン又はノザーンブロット分析のような交
雑反応においてプローブとして使える。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上述
。

【００２４】 “プロモーター"はＤＮＡ分子上の領域であり、そこにＲＮＡポリメラーゼが
結びついて転写を開始する。オペロンでは、プロモーターは通常オペレーター末
端に隣接しているが、オペレーターの外側に位置している。プロモーターのヌク
レオチド配列はそれに付着する酵素の性質及びＲＮＡ合成速度を決定する。

【００２５】 相互交換的で、単数又は複数形で使う語句“ガン"、“新生物"及び“腫瘍"は
ホスト生物に対し細胞が病的になる悪性形質転換を生じた細胞を称する。初期ガ
ン細胞（これは悪性形質転換部位の近隣から得た細胞）は確立された手法で容易
に非ガン性細胞と見分けられる。

【００２６】 語句“異常に発現した"は細胞又は組織の中のヌクレオチド配列が他の細胞又
は組織と比較して過剰発現又は抑制発現を起こしたものを称する。 “遺伝子運送媒体"は、ホスト細胞に挿入ポリヌクレオシドを送達することが
できる全ての分子と定義する。遺伝子運送媒体の例としてリポソーム、バキュロ
ウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスなどのウイルス類、バクテリオフ
ァージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター及び他の組換え媒体などが技術的
によく使用され、種々の真核及び原核ホストで発現することも記述されており、
遺伝子治療及びタンパク質生産や発現に使うことができる。

【００２７】 語句“ウイルスベクター"は組換えで作られたウイルス又はウイルス粒子と定
義されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｖｏにおいてホ
スト細胞へ送達されるポリヌクレオチドを含んでいる。ウイルスベクターの例で
はレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスベクター及びその他で
ある。遺伝子移転にレトロウイルスが介在するときは、ベクター構成物はレトロ
ウイルスゲノム又はその部分及び治療遺伝子を含んで成り立っているポリヌクレ
オチドを言う。ここで用いるとき“レトロウイルス介在遺伝子移転"又は“レト
ロウイルス形質導入"は同じ意味を示し、細胞へ入り込んだウイルスによりその
ゲノムをホスト細胞ゲノムに組み込むことにより遺伝子又は核酸配列をホスト細
胞に安定に移転する過程を言う。ウイルスは通常の感染や変化を行い異なる細胞
の表面受容体や細胞へ入るリガンドに結合して、ホスト細胞に進入することがで
きる。

【００２８】 “ハイブリダイゼーション"は一つかそれ以上のポリヌクレオチドが反応して
、ヌクレオチド残基の塩基間を水素結合により安定化して複合体を作る反応を言
う。水素結合はワトソン−クリック塩基対化、フーグスティーン結合又は他の配
列特異な仕方で生じる。複合体は二つの鎖の二重構造、三つ又はそれ以上の鎖の
多重鎖複合体、単一自己ハイブリダイゼーション鎖又はこれらの任意の組合せを
含んでいる。ハイブリダイゼーション反応は，ＰＣＲ反応の開始又はリボザイム
によるポリヌクレオチドの酵素的解裂などのより広い過程の一段階を構成してい
る。

【００２９】 ハイブリダイゼーション反応は異なる“厳密性（ストリンジェンシー）"の条
件下で実施することができる。一般的に、低い厳密性ハイブリダイゼーション反
応は１０×ＳＳＣで約４０℃又は同等なイオン強度／温度の溶液で行なう。中程
度の厳格性ハイブリダイゼーションは典型的には６×ＳＳＣで約５０℃、強い厳
密性ハイブリダイゼーション反応は一般的に１×ＳＳＣで約６０℃にて実施する
。

【００３０】 二つの一重鎖ポリヌクレオチド間の逆平行立体配置でハイブリダイゼーション
が起こる場合、反応を“アニーリング"と呼び、これらのポリヌクレオチドを“
相補的"と記述する。二重鎖ポリヌクレオチドでも第一のポリヌクレオチドの一
つと第二がハイブリダイゼーションすればもう一つのポリヌクレオチドに対し“
相補的"又は“相同性"であり得る。“相補性"又は“相同性"（一つのポリヌクレ
オリドが他に相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対の法則
により、互いに水素結合を形成すると思われる相手の鎖における塩基の割合に基
づいて定量化できる。

【００３１】 ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド又はポリペプ
チド領域）がもう一つの配列との“配列同一性"が一定パーセント（例えば８０
％、８５％、９０％又は９５％）であれば、それらを整列して二つの配列を比較
したとき塩基（又はアミノ酸）がねのパーセントだけ同じであることを意味する
。この整列及びパーセント相同性又は配列同一性は技術的に知られているソフト
ウエアプログラムを用いて決定できる。例えばＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯ
ＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．
７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載されている。好ましくは整列にデフォ
ルトパラメータを用いる。好ましい整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォ
ルトパラメータを使っている。特に好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮ及びＢＬ
ＡＳＴＰで、以下のデフォルトパラメータを用いている：Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏ
ｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；
ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧ
Ｈ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｔａｎｔ，ＧｅｎＢ
ａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらの
プログラムの詳細は次ぎのインターネットアドレスで見ることができる：ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉｂｉｎ／ＢＬＡＳ
Ｔ。

【００３２】 語句“免疫エフェクター細胞"は、抗原を結合して免疫反応を仲介することが
できる細胞を言う。これらの細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、モノサイト、マクロファー
ジ、ＮＫ細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）で、例えばＣＴＬ系統、ＣＴ
Ｌクローン及び腫瘍、炎症性或いは他の浸潤物からのＣＴＬｓを含むが、それに
限らない。ある病態組織は特定の抗原を発現し、これらの抗原に特異なＣＴＬｓ
が同定されている。例えば、メラノーマの約８０％はＧＰ−１００として知られ
る抗原を発現する。

【００３３】 ここで使用するとき語句“Ｔ−リンパ球"は表現型ＣＤ３⁺のリンパ球の名称で
、典型的には抗ＣＤ３モノクロナール抗体と適切な標識手法との組合せにより検
出できる。また本発明のＴリンパ球は一般的にＣＤ４，ＣＤ８又は両方に陽性で
ある。

【００３４】 ここで使用するとき、語句“サイトカイン"は成長又は増殖など、細胞に種々
の影響を及ぼす数多くの因子を称する。本発明の実施では、単独又は組合せで使
用するサイトカインの非制限的な例では、インターロイキン−２（ＩＬ−２），
幹細胞因子（ＳＣＦ），インターロイキン３（ＩＬ−３），インターロイキン−
６（ＩＬ−６），インターロイキン１２（ＩＬ−１２），Ｇ−ＣＳＦ，顆粒球−
マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），インターロイキン−１α（
ＩＬ−１α）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１），ＭＩＰ−１α、白血球
阻害因子（ＬＩＦ），ｃ−キットリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びｆ
ｌｔ３リガンドが含まれる。本発明はまた、一つ又はそれ以上のサイトカインを
培養液から特定して除去した培養条件を含む。サイトカインは市販のものが利用
できるが、発売元の例としてはＧｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）
，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ），Ａ
ｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ），Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ及び
Ｉｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）がある。必ずしもいつも明らかに述べ
ないが、野生型又は精製サイトカイン（例えば組換えで生産又はそれの突然変異
タンパク質）と同様な生物活性を有する分子は、本発明の意図及び範囲内で使用
するものである。

【００３５】 “共刺激性分子"は、抗原提示細胞及びＴ細胞の表面で発現した受容体−リガ
ンド対間の相互作用に関与している。一つの受容体−リガンド対の典型例は、Ｄ
Ｃｓ表面のＢ７共刺激性分子とその対向受容体ＣＤ２８又はＴ細胞上のＣＴＬＡ
−４（Ｆｒｅｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：９
０９−９１１；Ｙｏｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．９０：２２９）である。他の重要な共刺激性分子にはＣＤ４０，ＣＤ５４
，ＣＤ８０，ＣＤ８６がある。

【００３６】 語句“抗原提示細胞"又は“ＡＰＣｓ"は、もとのままの全細胞とともに一つ又
はそれ以上の抗原で、好ましくはクラスＩ ＭＨＣ分子と関連して提示を誘起す
ることができる他の分子を含む。適したＡＰＣｓの例としては以下で検討するが
、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、β２−ミクログロブリンに複合体化した
精製ＭＨＣクラスＩ分子のような全細胞及び養育抗原提示細胞を含むがこれに限
らない。

【００３７】 樹状細胞（ＤＣｓ）は強力な抗原提示細胞である。ＤＣｓはＴ細胞の活性や増
殖に必要な全ての信号を提供することが示されてきた。これらの信号は二つの型
に分類できる。第一の型は免疫反応に特異性を与えるが、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３
（“ＴＣＲ／ＣＤ３"）複合体とＡＰＣｓ表面上の主要組織適合遺伝子複合体（
“ＭＨＣ"）クラスＩ又はＩＩタンパク質が提示する抗原性タンパク質との間の
相互作用を通じて仲介する。この相互作用はＴ細胞活性を起こすには必要ではあ
るが十分ではない。実際、信号の第二型がなければ信号の第一型はＴ細胞アネル
ギーを起こす。共刺激性信号と呼ばれる信号の第二型は抗原特異でもＭＨＣ拘束
でもなくて、Ｔ細胞の全増殖応答及びＴ細胞エフェクター機能の誘起を第一型信
号の存在下で導く。ここで使用するとき、“樹状細胞"はパルス化樹状細胞を含
むが、それに限らずフォスター細胞又は樹状細胞ハイブリッドも含む。

【００３８】 “ナイーブ"細胞は、今まで抗原にさらされたことがない細胞である。 “培養する"は、細胞又は生物を種々の培養基の中又は上でにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖することを意味する。培地で細胞が成長した子孫は親細胞と完
全には同一（形態的、遺伝的又は表現型的に）ではないと解釈されている。“拡
大した"とは全ての細胞の増殖又は***を意味する。

【００３９】 “被験体"は脊椎動物、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトである。哺乳
類には、ネズミ科の動物、類人猿、ヒト、飼育動物、スポーツ用動物及びペット
類を含むが、これに限らない。

【００４０】 語句“主要組織適合遺伝子複合体"又は“ＭＨＣ"は細胞表面分子をコードして
いて、Ｔ細胞への抗原提示及び迅速な移植組織拒絶において必要とされる遺伝子
の複合体である。ヒトではＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としてもよく知られてい
る。ＭＨＣ複合体によりコードされるタンパク質は“ＭＨＣタンパク質"として
知られ、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子に分類されている。クラスＩＭＨ
Ｃ分子は、β２−ミクログロブリンと非共有結合的に会合したＭＨＣの中にコー
ドした鎖から成る膜ヘテロダイマータンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ分子は
殆ど全ての有核細胞により発現し、ＣＤ８⁺Ｔ細胞への抗原提示において機能す
ることが示された。クラスＩ分子はヒトにおけるＨＬＡ−Ａ，−Ｂ及び−Ｃを含
む。クラスＩＩ ＭＨＣ分子はまた非共有結合で会合しているα及びβ鎖から成
る膜ヘテロダイマータンパク質を含む。クラスＩＩ ＭＨＣはＣＤ４⁺Ｔ細胞へ
の抗原提示に関与することが知られていて、ヒトにおいてはＨＬＡ−ＤＰ，−Ｄ
Ｑ及びＤＲを含む。語句“ＭＨＣ拘束"はＴ細胞の一つの特徴を称し、そのＴ細
胞は抗原が処理され、生じた抗原性ペプチドが自己クラスＩ又はクラスＩＩＭＨ
Ｃ分子のどちらかと連携し、展示された後にはじめて抗原を認識することができ
る。ＭＨＣの同定及び比較の方法は技術的にはよく知られており、Ａｌｌｅｎ
ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎ．４０：２５〜３２；Ｓａ
ｎｔａｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎ．３７
：３９〜５０；Ｈｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎ
ｔｉｇｅｎｓ ５０：４０１〜４１５に記述されている。

【００４１】 語句“ペプチド"はその広い意味で使われ、二つ又はそれ以上のサブユニット
のアミノ酸、アミノ酸類似物又はペプチド模擬体の化合物を称する。サブユニッ
トはペプチド結合で接続していてよい。他の具体例では、サブユニットは他の例
えばエステル、エーテルなどの結合で接続している。ここで用いるとき語句“ア
ミノ酸"は、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を言い、グリシン及びＤ又
はＬの光学異性体両方、アミノ酸類似体及びペプチド模擬体を言う。三つ又はそ
れ以上のアミノ酸のペプチドはペプチド鎖が短ければ通常オリゴペプチドと呼ぶ
。ペプチドが長ければペプチドは普通ポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる。

【００４２】 “対照"は実験で比較の目的で用いる一方の被験体或いは試料である。対照に
は“陽性"又は“陰性"があり得る。例えば、実験の目的が遺伝子の変化した発現
レベルとガンの特有型との比較を測定する場合、好ましくは一般に陽性対照（変
化発現を負い及びその病気に特有の症候を示している被験体又は被験体からの試
料）と陰性対照（変化発現及びこれらの病気の臨床症候を示さない被験体又は被
験体からの試料）を用いる。

【００４３】 “ホスト細胞"又は“レシピエント細胞"は、ベクター又は体外の核酸分子、ポ
リヌクレオチド及び／又はタンパク質の導入用のレシピエントになり得る又はで
あった個々の細胞又は細胞培養物を含むことを意味する。またそれは単細胞の子
孫を含むことを意味し、子孫は自然的、偶発的又は意図的変異があるので必ずし
も完全に元の親細胞と同一（形態学的に又はゲノム的に又は全ＤＮＡ相補体）で
ある必要はない。細胞は原核或いは真核であり、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞
及びマウス、ラット、類人猿又はヒトなど哺乳類細胞を含むが、これに限らない
。“抗体"は抗原に結合することができる免疫グロブリン分子である。ここで用
いるとき、この語句は生来の免疫グロブリン分子に限らず、抗イディオタイプ抗
体、変異体、断片、融合タンパク質、ヒト化タンパク質及び必要とする特異性の
抗原認識部位を含んだ免疫グロブリンの修飾体を含んでいる。

【００４４】 “抗体複合体"は抗体（上で述べた）及びその結合相手又はリガンドの組合せ
である。 語句“単離した"はポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質
、抗体又はその断片で自然界では通常結合している構成物、細胞質及びその他か
ら分離することを意味する。技術の熟練者にはすぐ分かるが、非天然由来のポリ
ヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はその断片は天然
では生じる相手から区別するための“単離"は必要としない。加えて、“濃縮し
た"、“分離した"又は“希釈した"ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド
、タンパク質、抗体又はその断片は、濃度又は容積あたりの分子数が天然由来の
相手方の“濃縮した"より大きく、“分離した"より少ない場合、その天然由来の
相手方から区別できる。天然由来の相手方とはその主な配列で異なるか、例えば
そのグリコシル化パターンで異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド
、タンパク質、抗体又はその断片は、天然由来の相手側とはその主な配列又はグ
リコシレーションパターンのような特長により区別できるので単離した形である
必要はない。ここで開示した発明の一つ一つについては明らかにはしないが、下
に開示した組成物及び適切な条件の個々についての上述具体例の全てを、本発明
が提供していると理解されたい。従って、非天然由来のポリペプチドについては
単離した天然由来のポリペプチドとは別個の具体例で提供する。細菌細胞で産生
したタンパク質は、天然で生産した真核細胞から単離した天然由来タンパク質と
は別の具体例で提供した。

【００４５】 “単離した"又は“濃縮した"細胞の集団は天然では会合している細胞や物質か
ら“実質的に遊離"している。“実質的に遊離"又は“実質的純粋"は少なくとも
集団の５０％、望ましくは少なくとも７０％，更に望ましくは少なくとも８０％
で、更に好ましくは少なくとも９０％が望ましい細胞型である。

【００４６】 “組成"は、活性成分と例えばアジュバントのような活性又は不活性な（例え
ば検出可能薬剤、固体担体又は標識）他の化合物又は組成物との組合せを意味す
る。

【００４７】 “薬剤組成物"は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏに
おける診断や治療用に適した組成物を構成している活性成分と活性や不活性のキ
ャリアーとの組合せを含む。

【００４８】 ここで使用するとき、語句“薬剤で許容されているキャリアー"は、りん酸緩
衝食塩溶液、水及び水中油型又は油中水型のようなエマルション及び種々の湿潤
剤など全ての標準的薬剤キャリアーを含む。また組成物は安定剤及び防腐剤も含
むことができる。キャリアーの例としては、安定化剤及びアジュバントがある。
参照：Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５ｔ
ｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））。

【００４９】 “効果量"は有用な又は望ましい結果をもたらすのに充分な量である。効果量
は一回またはそれ以上の投与、貼付又は服用において与えられる量である。 本発明では、ワクチン及び養子免疫療法に使用する推定抗原性ペプチドの同定
に際しての迅速で効果ある方法を提供する。発明者は、目標細胞において通常細
胞と比較して差別的発現をするこれまで特性化されている及び特性化されていな
いタンパク質が免疫療法に使用できることを見出した。推定抗原は目標細胞にお
いて遺伝子発現を行なうポリヌクレオチドの一組、及び対照細胞において遺伝子
発現を行なうポリヌクレオチドの一組を得ることにより同定した。ポリヌクレオ
チドの組同士につき配列同一性及び発現レベルを比較した。通常細胞に比較して
目標細胞で独特な発現又は過剰発現をするポリヌクレオチドを推定ワクチンの候
補とした。免疫原性はタンパク質又はそのペプチド断片の抗体を誘起し、又はナ
イーブ免疫エフェクター細胞を教化して、次いで被験体中の抗原（エピトープ）
の細胞を溶解させる能力により確認する。抗原（又はエピトープ）への免疫反応
は、抗原特異な（エピトープ特異）抗体の生産、抗原（エピトープ）に特異的に
結合する分子を表面に発現する免疫細胞の生産を含むが、これだけに限らない。
所与の抗原（エピトープ）への免疫反応が誘起されたかどうかを測定する方法は
技術的によく知られている。例えば、抗原特異抗体は技術的に知られた種々の免
疫アッセイ法で、これには限らないが例えば、試料中の抗体を固定化抗原（又は
エピトープ）に結合し、検出できるように標識した第二の抗体（例えば酵素標識
マウス抗ヒトＩｇ抗体）を検出するＥＬＩＳＡ法を用いて検出する。抗原に特異
的な免疫エフェクター細胞は、技術的に熟練した人であれば知っている種々なア
ッセイ法、これに限らないが例えばＦＡＣＳ，ＣＴＬｓの場合には⁵¹ＣＲ放出ア
ッセイ法又は³Ｈ−チミジン取り込みアッセイ法など、どれでも検出できる。

【００５０】 “目標細胞"は、これらに限らないが腫瘍細胞、薬剤耐性腫瘍細胞、血管新生
を促す腫瘍細胞、脱分化細胞、分化した細胞、アポトーシス細胞、過増殖細胞、
病原体に感染した細胞又は病原体に感染した薬剤耐性細胞を含んでいる。一つの
見方は、目標細胞はこれまでに特にＴ細胞による溶解作用に高感受性又は抗体に
反応性があると確認された細胞である。

【００５１】 本発明の方法で利用する細胞を得ることができるガンは癌腫、肉腫、白血病及
び神経系の細胞由来のガンを含む。これらはこれに限らないが、星状細胞腫、乏
突起膠腫、髄芽腫及び原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）のような脳腫瘍、膵管性
腺癌のような膵臓腫瘍、小型及び大型細胞性腺癌、扁平上皮細胞癌及び気管支肺
胞癌などの肺腫、上皮性腺癌及びこれら腫瘍の肝臓転移などの直腸腫瘍、ヘパト
ーマ及び肝管癌などの肝臓腫瘍、管性及び小葉腺癌、子宮頚部の扁平及び腺癌及
び子宮や卵巣上皮性腺癌などの女性生殖系腫瘍、前立腺腺癌などの前立腺腫瘍、
遷移性扁平細胞癌などの膀胱腫瘍、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫（結節性及びまん性）
、形質細胞腫及び急性や慢性白血病などの細網内皮系の腫瘍（ＲＥＳ）、メラノ
ーマなどの皮膚腫瘍、軟組織肉腫及び平滑筋肉腫などの軟組織腫瘍などを含む。

【００５２】 腫瘍細胞は癌患者から切除、生検又は内視鏡採取により得られる。細胞は直接
、冷凍保存又は培養基で維持又は増殖する。腫瘍及び患者の血液又は血液画分は
細胞の共培養の前に無菌状態を確認する試験を徹底して行なう。標準無菌試験は
技術面では熟練者が充分知っているので詳細はここには記述しない。腫瘍細胞は
ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養でき、細胞系が作成できる。信頼性ある確立した短期間
培養及び種々の腫瘍から少なくとも１０⁸個の細胞を得る条件についてはＤｉｌ
ｌｍａｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４：６５〜６９に記
述されている。この代わりとして、腫瘍細胞は使用前に標準の機械的方法にて生
検した試料から分散させることができる。

【００５３】 腫瘍細胞は技術的に公知のどの方法によっても得られる。次ぎの方法は熟練者
が用いている方法の例である。無菌手法を用い、患者から切除した固体状腫瘍（
１０〜３０ｇ）を５ｍｍ³に切断し、０．０１％ヒアルロニダーゼ４型、０．０
０２％ＤＮＡｓｅＩ型、０．１％コラゲナーゼIV型、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン
、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地に浸漬する。この混合物を室温で６〜２４時間攪拌した後
、粗いワイヤー格子で未消化組織断片を除去する。得られた腫瘍懸濁液を４００
×ｇで１０分間遠心分離する。ペレットをＣａ²⁺又はＭｇ²⁺又はフェノールレッ
ドなしのＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した後、ＨＢＳＳに再び
懸濁しＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ傾斜液に通す。生きている腫瘍細胞、リン
パ球及び単球を含んだ傾斜液の界面を取り出し更に２回ＨＢＳＳで洗浄する。取
り出した細胞は１０％ＤＭＳＯを含む型適合のヒト血清中に凍結して保存する。 単数又は複数形で使用する語句“新生物細胞"、“腫瘍細胞"又は“ガン細胞"
は、ホスト生物に病的である悪性形質転換した細胞を称する。初期ガン細胞（そ
れは悪性形質転換部位の近辺から得た細胞）は良く確立した手法、特に組織学的
試験により非ガン性細胞とは容易に区別できる。ここで用いたガン細胞の定義は
、初期ガン細胞だけでなくガン細胞原型から由来した全ての細胞を含む。これは
転移したガン細胞及びガン細胞から由来のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物及び細胞株を
含む。固形腫瘍として明らかなガンの型について言うと、“臨床で検知可能"腫
瘍とは腫瘍の大きさで検知できるもので、例えばＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像
処理（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波又は触診のような手法による。生化学的又は免疫
的所見のみではこの定義には不十分である。

【００５４】 上記の方法を用い、乳ガン細胞系から単離して得た、差別的発現をしたポリヌ
クレオチドを正常乳細胞系と比較した。加えて、ＨＬＡ−Ａ２拘束ｇｐ１００＋
メラノーマ細胞系から単離して得た、差別的発現をしたポリヌクレオチドとＨＬ
Ａ−Ａ２拘束正常米良の際とから分離したタグを比較した。これらの分析で、ガ
ン細胞中で差別的に発現した種々な転写物を同定したが、その幾つかは前に同定
されているｇｐ１００（メラノーマ中）及びＨＥＲ−２（乳ガン中）のような腫
瘍関連抗原に相当した。しかし、多くの他の転写物はガン細胞で差別的発現をし
たものと同定された。これら転写物に相当する遺伝子を同定した。これらの遺伝
子にコードされたポリペプチドは、ポリペプチドを単離したガン細胞に対する免
疫反応（Ｔ細胞又は抗体仲介）を誘発する遺伝子であった。興味あることに、ペ
プチド（ｃｄｃ−関連タンパク質キナーゼ活性及びインテグリンアルファー３）
は以前単離され同定されているが、これまでに免疫的に機能することについては
知られてはいない。コードされるポリペプチド及びタンパク質は、こうして差別
的に発現した遺伝子を発現するガン細胞の除去へと導く抗腫瘍細胞反応を作り出
すのに利用できる。本発明はガン分野に限らず、目標細胞（悪性、良性、ウイル
ス感染、異常又は存在しなくてよい細胞）中の全ての差別的に発現した遺伝子又
はコードする遺伝子又はコードするタンパク質は、目標細胞の除去を目的とする
目標細胞に向けた免疫反応を誘発するワクチンとして使用する予定である。

【００５５】 かくして、本発明は、治療を必要とする被験体に、差別的発現をする抗原又は
ＭＨＣ分子との関連において、該抗原を発現する細胞の効果的量又は該抗原に対
して教育された免疫エフェクター細胞の効果量を含むワクチンの効果量を導入す
ることにより、差別的発現をする抗原又はマーカーを発現する目標細胞に対して
免疫反応を惹起する方法を提供する。具体例の一つでは、細胞はメラノーマ細胞
で、ｃｄｃ２関連プロテインキナーゼを発現する（以下“ｃｄｃ２タンパク質"
という、その配列は技術的に知られており、アクセス番号Ｎｏ．Ｍ６５８２０（
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ）及びＮｉｎｏｍｉｙａ−Ｔｓｕｊｉ ｅｔ
ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：９００６〜９０１０）で提供されている
。ここで使われたように、機能的に等価のポリヌクレオチド及びタンパク質はこ
こに記述された方法に用いることができる。

【００５６】 語句“ｃｄｃ２−関連プロテインキナーゼ活性を有するポリペプチド"は当技
術分野で報告された配列を有するポリペプチドだけに限らず、類似体、対立遺伝
子変種及び上述のＮｉｎｏｍｙａ−Ｔｓｕｊｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）のｃ
ｄｃ２タンパク質配列と比較して保存的なアミノ酸置換体を有するポリペプチド
を含む。これら類似物の例として、デフォルトパラメータで走らせた配列整列プ
ログラム分析で測定したｃｄｃ−関連プロテインキナーゼ活性を有する技術的に
は既知のポリヌクレオチド配列で生産されたポリペプチドだけではなく、配列に
対し中程度又は代わりに高厳密条件でハイブリダイゼーションしたもの又は配列
整列プログラムをデフォルトパラメータで走らせて測定したとき、既知の配列に
対し少なくとも７５％又はより好ましく少なくとも８０％或いはより好ましく少
なくとも９０％又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を持つものも含む
。

【００５７】 また本発明の範囲には、ｃｄｃ２タンパク質類似物の生物活性断片、対立遺伝
子変種及び保存されたアミノ酸置換体を有するポリペプチドも入る。これらの断
片は、既知の配列及び化学合成法を用いて又はその代わりに制限酵素消化、精製
及びホスト細胞での発現を含んだ組換え手法を用いても作成できる。Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）上記。

【００５８】 別個の具体例では、細胞は乳ガン細胞又はＨＥＲ−２抗原を発現する細胞で、
抗原はヒトインテグリンアルファ−３鎖タンパク質（以下“インテグリンアルフ
ァ−３とうい，その配列はアクセス番号Ｍ５９９１１（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）及びＴａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ｊ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏ．１１５：２５７〜２６６）である。ここで使用した如く、語句“
ヒトインテグリンアルファ−３鎖タンパク質活性を有するポリペプチド"は、当
技術分野で既知の配列を有するポリペプチド及びポリヌクレオチドにコードされ
るポリペプチドに限らず、類似体、対立遺伝子変種及び公表された配列に比べた
ときに保存されたアミノ酸置換体を有するポリペプチドも含む。これら類似物の
例は、インテグリンアルファ−３活性を有するポリペプチド（ポリヌクレオチド
配列により生産された）だけでなく、配列に中程度又は高厳密性の条件下ハイブ
リダイゼーションしたもの或いは配列整列プログラムをデフォルトパラメータで
走らせて測定したとき技術的に既知の配列に対し少なくとも７５％，より好まし
くは少なくとも8０％又はより好ましくは少なくとも９０％又は更に好ましくは
少なくとも９５％相同性がある配列も含む。

【００５９】 また、本発明の範囲内には、インテグリンアルファ−３タンパク質類似物の生
物活性断片、対立遺伝子変種及び保存されたアミノ酸置換基を有するポリペプチ
ドがある。これらの断片は、技術的には知られているインテグリンアルファ−３
配列及び化学的合成法を使って生成できるが、その代わりとして制限酵素消化、
精製及びホスト細胞での発現を含めた組換え手法を用いてもできる。Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）前出。

【００６０】 本発明は、更に適切な細胞に対する免疫反応を誘起する方法として、上記方法
で同定した被験体に対する抗原を含むガンワクチンの効果量を被験体に投与する
方法を提供する。ここで使用したとき、ガンワクチンには抗原をコードするポリ
ヌクレオチド又はそのエピトープ断片又は抗原又はエピトープを含むがこれに限
らない。それはまた抗原又はエピトープに対してＴ細胞を活性化して抗原又はエ
ピトープを提示させる細胞又は組成物を含む。これらの例は、ＭＨＣ分子との関
連でエピトープを提示する抗原提示マトリックス又は樹状細胞を含むが、これに
限らない。これらの方法は、サイトカイン又は被験体への共刺激性分子の効果量
を共投与することにより更に調整できる。これは細胞を被験体と接触させたり、
被験体にサイトカイン又は共刺激性分子タンパク質の効果量を投与するか、遺伝
子配送媒体又はホスト細胞中に入れたサイトカイン或いは共刺激性分子について
の遺伝子コード領域の効果量を投与して達成する。

【００６１】 上記の方法を他の既知の抗腫瘍治療又は今後見出されるであろう治療と適切に
組合せる。 本発明は、さらに抗原のエピトープを細胞表面に発現する抗原提示細胞と共に
ナイーブ免疫エフェクター細胞を培養して、上記の方法で同定した抗原を発現す
る細胞を溶解できるように教育された抗原特異免疫エフェクター細胞の集団を産
生する方法を提供する。本発明の特定の態様では、抗原はメラノーマ細胞のよう
なｇｐ１００抗原を発現する細胞を処理するためのｃｄｃ−２プロテインキナー
ゼタンパク質である。個別の具体例では、抗原は乳癌細胞のようなＨＥＲ−２抗
原を発現する細胞の処理用のインテグリンアルファ−３である。免疫エフェクタ
ー細胞をこれらの細胞、例えばメラノーマ又は乳癌細胞の増殖を処理又は防止す
るため又は被験体での該細胞の存在が関与する症状を緩和するために投与する。

【００６２】 本発明により、上記方法で投与した免疫エフェクター細胞及び／又は抗原提示
細胞は遺伝子的に調整されていてサイトカイン及び／又は共刺激性分子を発現す
ることが意図される。その代わりとしては、サイトカイン及び／又は共刺激性分
子の効果量を含んでいる組成物をＡＰＣｓ及び／又は免疫エフェクター細胞と共
に投与する。

【００６３】 本発明は更に上記細胞又は集団及びキャリアーを提供するが、キャリアーは薬
剤として許容されているキャリアー又は固体担体を含むが、これに限らない。実
質的に精製した及び精製したこれら細胞の集団も更に提供する。

【００６４】 具体例の一つとして、本方法にはこの細胞をサイトカイン又は共刺激性分子タ
ンパク質と接触させることも含まれる。これは、この細胞をサイトカイン又は共
刺激性分子タンパク質と接触させることや、遺伝子運送媒体又はホスト細胞中の
サイトカイン又は／又は共刺激性分子用をコードする遺伝子を投与することで達
成できる。これらの方法を適切に他の既知抗腫瘍治療法又はこれから見出す治療
法と組み合わせる。

【００６５】 本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施できる。ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでは、本方法は新規抗腫瘍治療法を試験するアッセイ法を提供する。ｉ
ｎ ｖｉｖｏでは、この方法は新規抗腫瘍治療法を試験する便利な動物モデルを
提供する。ヒト被験者で実施する場合、本方法は抗腫瘍治療での予防法又は治療
法になる。

【００６６】 本発明は更に上記ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、細胞又は細胞の
集団及びキャリアーを提供し、キャリアーには薬剤許容キャリアー又は固体担体
を含むが、これに限らない。更にこれらを実質的精製したもの及び精製したもの
も本発明により提供される。

【００６７】 本発明は、Ｔ細胞の活性が望まれる具体例には限らず、例えば自己免疫傷害、
アレルギー及び同種移植片拒絶などのＴ細胞アネルギーの誘導までも含む。 更に提供されるものに、上で同定した分子、またはその作用薬或いは拮抗剤と
同じ機能を有する他の生物剤、タンパク質及び小分子の選択法がある。

【００６８】 次ぎの例は例証を行なったものだが、これに限定されない。 ポリヌクレオチド断片又は発現タグ 本発明の方法の実施は、発現した遺伝子のポリヌクレオチド断片の分析を含む
。ポリヌクレオチドは目標細胞及び対照細胞から、当技術分野で既知の方法を用
いて得る。差別的に発現したポリヌクレオチドを同定する多くの方法が技術的に
知られているが、それぞれがこれらのポリヌクレオチドを供給するのに用いるこ
とができる。ここで用いた語句“ポリヌクレオチド"は、ＳＡＧＥタグ（以下に
記述する）並びに定量的／比較遺伝子発現データを生じる方法で得た他の核酸を
共に含む。その方法にはｃＤＮＡサブトラクション、差別的展示及び発現配列タ
グ（ＥＳＴ）法を含むが、それに限らない。ｃＤＮＡサブトラクション又は差別
的展示に基づく手法は、二つの細胞型の間にある遺伝子発現の相違を比較するの
に実に有効である。（Ｈｅｄｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ
３０８：１４９およびＬｉａｎ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ（１９９２）Ｓｉｅｎ
ｃｅ２５７：９６７に記載）。発現配列タグ（ＥＳＴ）法(Ａｄａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６５１に記述)はノザーンブロッ
ティング法、ＲＮａｓｅ保護及び逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）前記；Ａｌｗｉｎｅ，
ｅｔ ａｌ（１９７７）ＰＮＡＳ ７４：５３５０；Ｚｉｎｎ，et ａｌ．（１
９８３）Ｃｅｌｌ ３４：８６５；Ｖｅｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２３７：４１５）と同じように遺伝子発見におけるもう一つの価値あ
る手段である。

【００６９】 更に、サブトラクション展示をリアルタイムＰＣＴ及び発現の差分析（ｒｅｐ
ｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）と組
み合わせる方法が利用できる（Ｌｉｓｉｔｉｓｙｎ ａｎｄ Ｗｉｇｌｅｒ（１
９９５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２９１〜３０４）。

【００７０】 好ましい方法は発現した遺伝子に相当する配列タグを使用するＳｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ又はＳＡＧＥ（Ｕ．Ｓ Ｐ
ａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６９５，９３７参照）で、下記の実施例で用いた。簡単
に述べると、発現遺伝子に相当する配列タグは、先ずメラノーマ細胞系又は乳癌
細胞系から得たｃＤＮＡにより調製した。

【００７１】 ｃＤＮＡの小さな断片を、一回で多くの転写物を切断する制限エンドヌクレア
ーゼを用いて作りだした。好ましくは４−塩基対認識部位酵素を用いた。一つ以
上の制限酵素を逐次的又は並行して用いた。切離したｃＤＮＡを、プライマーに
付けた標識を利用し捕集媒体へ結合して単離した。

【００７２】 単離した限定ヌクレオチド配列タグは二つのｃＤＮＡプールに分離した。各プ
ールは適切な制限エンドヌクレアーゼを用いてリンカーへ連結した。最初のオリ
ゴヌクレオチドリンカーは、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション用の最初
の配列を含み、二番目のオリゴヌクレオチドリンカーはＰＣＲプライマーハイブ
リダイゼーション用の他の配列を含む。加えて、リンカーは更に第二の制限エン
ドヌクレアーゼ部位を含んでいる。リンカーは連結生成物を第二の制限酵素で切
離すように設計されているので、限定ヌクレオチド配列タグを有するリンカーを
切り離す結果になる（例えば、制限エンドヌクレアーゼ解裂部位の３'）。

【００７３】 同一配列を有したリンカーに連結した限定タグのプール又は異なる配列を有す
るリンカーに連結した限定ヌクレオチドタグの二つのプールは、互いの“尾部（
末端）−尾部（末端）"で無作為に連結していた。リンカーから最も遠いｃＤＮ
Ａタグの部分を“尾部"と言う。これは第一の制限エンドヌクレアーゼ部位を上
流（５'）に有し、第一の制限エンドヌクレアーゼ部位を下流（３'）に有し、一
つの第二制限エンドヌクレアーゼ部位を上流および下流に有し、及び上流および
下流に一つの第二制限認識部位および一つの増幅プライマーハイブリダイゼーシ
ョン部位を含むリンカーオリゴヌクレオチドを有するジタグ（連結した尾部同士
）を作り出した。他の制限エンドヌクレアーゼはジタグのアップストリーム及び
ダウンストリーム部位、他の制限酵素認識部位及びジタグの増幅プライマーハイ
ブリダイゼーションアップストリーム及びダウンストリーム部位の両方を含むリ
ンカーオリゴヌクレオチドを切離す。換言すると、ジタグは第一の制限エンドヌ
クレアーゼ部位、第二の制限エンドヌクレアーゼ解裂部位及びリンカーのそれぞ
れに隣接している。

【００７４】 ジタグは特異的に各リンカーの一つの鎖とハイブリダイゼーションするＰＣＲ
用のプライマーを利用して増幅した。増幅したＰＣＲ生産物の第一の制限エンド
ヌクレアーゼによる解裂でジタグの単離ができ、その後の連結反応により接続が
できる。ジタグ又は連結物の増幅が行なわれたかどうかの分析は標準配列決定法
で実施した。連結物の生成後、多数タグは配列分析用のベクターにクローン化で
きる。またその代わりとしてジタグ又は連結物はクローニングせず、技術的熟練
者に既知の方法で直接配列決定した。

【００７５】 配列からのタグは配列データベースと比較したが、例えばコンピュータ法を用
いて既知配列と試料配列を合わせた。 コンピュータによる分析 ポリヌクレオチドの情報を得た後、二つ又はそれ以上の細胞型間で独特に又は
差別的に発現した遺伝子に相当するポリヌクレオチドを同定するために分析する
。発現した遺伝子を明らかにし同定するには以前に同定し、蓄積してある配列情
報を用いて上述した方法で実施するのは本発明の範囲内である。この情報は個人
的、公開で利用可能及び市販で利用可能なデータベースから得る事ができる。

【００７６】 例えば、試料細胞中に存在する一つの遺伝子産物の存在に対して依存する表現
型を得るために細胞又は組織を選択したが、その細胞は活性がｉｎ ｖｉｔｒｏ
のアッセイ法で測定できる生物的因子を分泌する細胞、特異な抗原又を認識する
細胞毒性Ｔ細胞で溶解される細胞や抗原を認識する抗体で染色する細胞であり、
選択後は選択した表現型の極値を示したり、理想的には他の全ての点や表現型特
性で合致する試料細胞を同定するために更に選択した。例えば、同一の個体から
由来したように合致する細胞は組織適合の相違についての検討は最小限になる。

【００７７】 理想的に、選択した表現型を顕著に表す試料細胞（“Ａ"と“Ｂ"という）を２
例及び表現型を全然持たない試料細胞（“Ｃ"と“Ｄ"という）の２例を選択した
。本発明の方法を用いて各細胞試料からのライブラリー形式であるポリヌクレオ
チドを単離し、それらの比表現につき記述した。各々のライブラリーにつき配列
決定し、配列に関する情報及び幾つかの具体例での比発現を機能的に関連あるプ
ログラム、例えばＣｏｍｐａｒｅ Ｒｅｐｏｒｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＡＧ
Ｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄｒ．Ｋｅｎ Ｋｉｎｚｌｅｒ ａｔ Ｊｏｈｎｓ Ｈ
ｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙを通して利用可能）に集積する。Ｃｏｍｐ
ａｒｅ Ｒｅｐｏｒｔはポリヌクレオチド配列の表作成及び試料（Ａ，Ｂ，Ｃ，
上述）についてライブラリー当たりのポリヌクレオチドの限定数（凡そ２５，０
００）に対し標準化したそれらの量を提供する。これを次いでＭＳ−ＡＣＣＥＳ
Ｓへ直接導入するか或いは最初にＥｘｃｅｌ ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔにデータ
を複写してからＭＳ−ＡＣＣＥＳＳへ追加操作で移した。ＳＹＢＡＳＥ又はＯｒ
ａｃｌｅなどの他のプログラムはポリヌクレオチド数の比較ができるのでＭＳ−
ＡＣＣＥＳＳの代替法として使用できる。ソフトウェアを強化する場合にこれら
の追加機能を組み込むように設計できる。これらの機能は標準Ｂｏｏｌｅａｎ，
代数学及びテキストリサーチ操作に存在し、種々の組合せで適用するとポリヌク
レオチドの巨大な入力の1群を、特に限定した目的のポリヌクレオチドの取扱い
やすいサブセットに低減できる。

【００７８】 研究者は、群内にある特定ポリヌクレオチドの総数を組み合わせて、一つかそ
れ以上の課題含んだ群を（例えば、ＧｒｏｕｐＮｏｒｍａｌ＝Ｎｏｒｍａｌ１＋
Ｎｏｒｍａｌ２；ＧｒｏｕｐＴｕｍｏｒ＝ＰｒｉｍａｒｙＴｕｍｏｒ１＋Ｔｕｍ
ｏｒＣｅｌｌＬｉｎｅ）を作りだせる。追加の特性値を同様に群中の各タグ毎に
計算する（例えば、平均総数、最小総数、最大総数）。研究者は群間のそれぞれ
のタグ総数比、例えば各ポリヌクレオチドについての平均ＧｒｏｕｐＮｏｒｍａ
ｌ総数と平均ＧｒｏｕｐＴｕｍｏｒ総数の比を計算する。研究者は群間でのタグ
の観測値の差についての有意差を統計で計算する。

【００７９】 ＭＳ−ＡＣＣＥＳＳ内のポリヌクレオチドを同定する際に、試料細胞中のその
量に基づいてポリヌクレオチドタグを分類するための照合を行なう。Ｑｕｅｒｙ
報告からの出力は、ソーティング規準及び種々の試料細胞におけるその量にかな
っている特定ポリヌクレオチド（配列で）を一覧表とする。

【００８０】 分類は、目的の遺伝子生産物（及び相当するポリヌクレオチド）は表現型を示
さない試料中より選択した表現型を顕著に展示する試料中の方で量が多いという
原則に基づいている。

【００８１】 例えば、試料Ａ及びＢに１０又はそれ以上のレベルで存在し、試料Ｃ及びＤに
１以下であるオリヌクレオチドを同定するために照合したとき、検索の結果は５
つの異なるポリヌクレオチドが分類の規準に合致するから５つの遺伝子候補につ
き表現型を持たないＣ及びＤのような試料に転移したとき表現型を与えるかどう
かを決定する試験をしなさいと答える。

【００８２】 より厳密な分類規準にすると、より効果的な分類になる。かくして試料Ａ及び
Ｂでは５複製又はそれ以上、試料Ｃ及びＤで５複製より少ないポリヌクレオチド
を求めると多くの候補が出る。しかし、試料が表現型の極値を示すので差を増加
できる場合には（試料Ａ及びＢで約１０より多く、試料Ｃ及びＤで１より少ない
）同定される候補の数は限られる。

【００８３】 遺伝子産物がどの程度の量があれば表現型を与えるかについての予備知識は、
分類パラメータの一式を随意に選択でき、データ分析実施及び同定と候補試験が
できるので必須ではない。求める候補が見出せない場合、選り分けの規準を低下
させて（即ち差を減少させる）、見出した新しい候補を試験できる。選り分けと
試験の繰り返しで、最後には望ましい候補の発見に成功する。

【００８４】

【表１】 -------------------------------------------------------------------- サイクル数 選り分けの規準 候補の数 評価する候補の数 -------------------------------------------------------------------- １ ≧１０試料ＡとＢ １０ １０ ≦１ 試料ＣとＢ （最小差＝１０ｘ） -------------------------------------------------------------------- ２ ≧５ 試料ＡとＢ ３０ ２０^* ≦２ 試料ＣとＤ （最小差＝２．５ｘ） -------------------------------------------------------------------- ３ ≧５ 試料ＡとＢ ８０ ５０＃ ≦５ 試料ＣとＤ （最小差＝１ｘ） --------------------------------------------------------------------^* ３０の候補の内、１０はサイクル１で既に評価済みで、評価する必要なのは２
０候補だけ。 ＃８０の候補の内、３０は既に評価済みなので（１０はサイクル１で，２０はサ
イクル２で）評価が必要なのは５０だけ。 表現型を与えるのに遺伝子産物がどの程度の量（ポリヌクレオチドの量）必要
であるかの知識が厳密選り分け規準の合理的な利用を可能にし、求める遺伝子が
一握りの候補内に絞られ、研究過程を大きく加速する。

【００８５】 特定の表現型を与えるのに必要な遺伝子産物の必要量を決めるのは、問題とす
る特定の表現型及びその表現型を測定するアッセイ法の感度に依存する。 例えば、発明者は５０００分の１の頻度（２５，０００のライブラリーサイズ
に対し標準化したＳＡＧＥタグの５複写）が抗原特異Ｔ細胞による溶解に感受性
を与える試料細胞内の腫瘍抗体の充分な発現に相関する一方、２５，０００分の
１の頻度は溶解に対して感受性が弱い細胞と相関することを見出した。

【００８６】 こうして腫瘍抗原を追跡するのに、試料細胞中で溶解に対して感受性がある５
？及び試料中で溶解に対して感受性がない？１の選別規準を用いることができる
。

【００８７】 従って、Ｑｕｅｒｙ Ｒｅｐｏｒｔから個々のポリヌクレオチド配列をプログ
ラムへ登録し、既知の遺伝子と合致するか又は新規なものかを決定する（合致な
し＝ＮＭ）。

【００８８】 Ｑｕｅｒｙ Rｅｐｏｒｔから特定の配列に相当するｃＤＮＡを取り上げ、そ
れら個々につき適切な生物的アッセイ法で試験をし、表現型を与えるかを決定す
る。既知の遺伝子に相当する候補の中で、それらの候補につき相補的ＤＮＡｓを
得るのは比較的簡単な仕事で、それらにつき個々に表現型を展示しない細胞に転
移したときに特定表現型を与えるかどうかを測定する。既知の遺伝子がどれも表
現型を与えない場合は、Ｑｕｅｒｙ Ｒｅｐｏｒｔの合致なしの配列に相当する
ｃＤＮＡをＰＣＲで取り出し、新規ｃＤＮＡ個々の表現型供与能力につき試験す
る。ここまで作り上げた仮定が正当であれば（即ち、単一遺伝子産物が表現型を
与えることが可能である。選別規準は望ましい候補を排除するような厳しすぎる
ものではないこと。）、Ｑｕｅｒｙ Ｒｅｐｏｒｔの候補の一つに相当するｃＤ
ＮＡは表現型を与えることが見出せて、研究は終了である。しかし表現型を与え
る候補を見出せない場合は選別パラメータの厳格さをゆるめて“より広い網を投
げて"、上記の試験を試してより多い候補を捕らえる必要がある。

【００８９】 具体例の一つでは、ポリヌクレオチド又は遺伝子配列を配列データベースと比
較することもでき、例えば試料の配列を既知の配列と合せるにはコンピュータ法
を利用する。配列の一致性は、例えばＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ
．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０、ｓｅｃｔｉｏｎ７．７
．１８，Ｔａｂｌｅ７．７．１に記述された技術的には知られている配列整列プ
ログラムで試料の配列比較をして決定する。好ましい整列プログラムはＡＬＩＧ
Ｎ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏ
ｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）があり、デフォルトパラメータを好
んで使うが、それは以下である。ミスマッチ＝２；オープンギャップ＝０；エク
ステンドギャップ＝２。二つのヌクレオチドの整列についての他の好ましいプロ
グラムはＢＬＡＳＴプログラムで、デフォルトパラメータは以下である。オープ
ンギャップ＝５０；エクステンションギャップ−２ペナルティ；ギャップ×ドロ
ップオフ＝０；エクスペクト＝１０；ワードサイズ＝１１。ＢＬＡＳＴプログラ
ムは以下のインターネットアドレスで入手可能である：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ。

【００９０】 代わりとしては、タグ配列は６つのリディングフレームに翻訳できる；全ての
可能なリーディングフレームの予測ペプチド配列はタンパク質データベースに蓄
積してある各配列と比較する。前述の整列化プログラムの一つ又はそれ以上で説
明した相同性の程度を決定するパラメータは技術面で充分確立している。それら
はｐ値及びパーセント配列同一性を含むがそれに限らない。ｐ値は偶然に整列化
ができる確率である。単一整列化の際、ｐ値はＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１
９９０）ＰＮＡＳ８７：２２４６に従って計算できる。複数整列化の場合、ｐ値
はＢＬＡＳＴでプログラム化したような発見的手法を用いて計算できる。パーセ
ント配列同一性は、疑問配列及び既知配列が最善の整列したときその間における
核酸又はアミノ酸が合致した数の比で定義される。タグ配列は、共通する長さの
整列化領域の配列同一性が３０％より少ない、より好ましくは２０％より少なく
、更に好ましくは１０％より少ないとき、既知のいずれの配列とも実質的相同性
に欠けるとみなす。 より大きな断片の同定及びオープンリーディングフレーム 対照細胞と比較したとき目標細胞における独自な発現又は過剰発現タグは、本
発明の方法で用いることができると推定される抗原である。技術的に熟練した者
であれば目的のタグを含む或いはそれに相当する大きなポリヌクレオチド、遺伝
子又はｃＤＮＡを単離できる５つの方法をここで開示する。ＲＡＣＥ−ＰＣＲ手法 ポリペプチド又はタンパク質をコードし、本発明の転写産物に相当する遺伝子
又はｃDNAを単離する一つの方法は５'−ＲＡＣＥ−ＰＣＲ手法である。この手法
では、特に重要であるコード配列を含むポリ−ＡｍＲＮＡをまず開示した配列へ
のハイブリダイゼーションで同定し、次いでここで開示した配列を含む３'−プ
ライマーで逆転写する。新たに合成したｃＤＮＡ鎖は、好ましくは５'末端に便
利なクローニング制限部位を含む既知の配列のアンカープライマーでタグする。
タグしたｃＤＮＡは３'−プライマー（又はコード領域の内部配列に対する入れ
子状態プライマー共有配列相同性）及び５'アンカープライマーである。増幅は
、増幅特異性を最適化する種々の厳密性レベルの条件下で行なわれる。５'ＲＡ
ＣＥ−ＰＣＲは市販キット（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｃｌｏｔｅｃｈから入手可能）を用い、製造者手引きに従って容易に実
施できる。既知の遺伝子又はＥＳＴｓの同定 加えて、近隣ＥＳＴ配列を仮の遺伝子に組み入れてＥＳＴｓの複雑性を低減す
るデータベースが存在する。例えば、ＴＩＧＲはヒトＥＳＴｓを仮のヒト共通配
列用の時期を推定できる臨時ＴＨＣに組み込む。ＴＨＣデータベースはＥＳＴｓ
単独と比較してより明確な帰属をすることができる。ＥＳＴｓをどの生物からも
隣接配列に組み入れることができるソフトウエアプログラム（ＴＩＧＲアセンブ
ラー及びＴＩＧＥＭ ＥＳＴアセンブリーマシーン及びコンティグ組立てプログ
ラム（参照、Ｈｕａｎｇ，Ｘ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３３：２１〜２３
））が存在する。ＳＡＧＥ転写物又はタグでプローブすることによるライブラリーからのｃＤＮＡ の単離 代わりとして、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２７０：４８４に記載された手法に従って、試料調製物からのｍＲＮＡを用
いてＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓベクター中でｃＤＮＡライブラリーを構築する。Ｚ
ＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ）は製造者の
プロトコルに従って使用する。２５０〜２０００のプラークを含むプレート板を
オリゴヌクレオチドプローブと標準プローブに、Ｒｕｐｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（
１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：３１０４に記述した通りで、以前記
述した条件の内でハイブリダイゼーション温度だけは室温に下げてハイブリダイ
ゼーションした。洗浄は６×標準食塩−クエン酸塩０．１％ＳＤＳ中で３０分間
室温にて実施した。プローブはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐ−Ａ
ＴＰで標識した。３'指向ＰＣＲ反応による部分的ｃＤＮＡ（３'断片）の単離 この手法はＰｏｌｙａｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９：３
００に記述されたプロトコルの修正である。端的には、この手法はＰＣＲ反応に
おいてＳＡＧＥタグを用いるので、得られたＰＣＲ産物は重要なＳＡＧＥタグと
共に付加的ｃＤＮＡを含有しており、その長さはｃＤＮＡの３'末端に関するタ
グの位置で明らかになる。ＰＣＲ反応が行なったそのような転写産物から由来し
たｃＤＮＡ産物は多くの応用面で使用できる。

【００９１】 所与のタグに相当するｃＤＮＡを発現すると思われる源からのＲＮＡは、初め
にいずれかの標準ｃＤＮＡプロトコルを用いて二重鎖ｃＤＮＡに転換する。ＳＡ
ＧＥライブラリー構築用のｃＤＮＡを生成する際に用いた同じ条件を、第一の鎖
合成を行なうのに修正オリゴ−ｄＴプライマーを用いる場合を除いて採用できる
。例えば、組成が５'−Ｂ−ＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣ
ＡＣＧＡ（３０）−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であるオリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーション用及びポリ−Ａ末端（尾部）からの準備用の３'末
端におけるポリ−Ｔの広がり、次に引き続くＰＣＲ段階で用いるＭ１３準備部位
、ストレプトアビジン被覆磁気粒子からｃＤＮＡを捕捉する５'ビオチン標識（
Ｂ）及びストレプトアビジン被覆磁気粒子からｃＤＮＡを放出する際のＡｓｃＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。理論的には、ＰＣＲプライマーへの
ハイブリダイゼーションができる充分な大きさのＤＮＡ領域であれば、エンドヌ
クレアーゼを認識する他のどの８塩基対と共に使用できる。

【００９２】 このもの又は同様な修正オリゴ−ｄＴプライマーを用いて構築したｃＤＮＡは
、Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５，６９５，９３７に記載されてあるように、唯一のアダプ
ターがｃＤＮＡプールに連結しているアダプター連結のところまで正確に処理さ
れる。アダプター連結後、ｃＤＮＡはストレプトアビジン−被覆磁気粒子から放
出され、ｃＤＮＡ増幅用の鋳型として用いられる。

【００９３】 種々のＰＣＲプロトコルは、３'修正オリゴ−ｄＴプライマー及びＳＡＧＥタ
グの中でＰＣＲ準備部位を用いることにより採用することができる。使用したＳ
ＡＧＥタグ由来ＰＣＲプライマーは、タグの５'延長部がアダプター配列に指令
して長さを変化させることができる。ｃＤＮＡ産物は種々の応用面で利用可能で
ある。

【００９４】 この手法は更に調節できる：（１）修正オリゴ−ｄＴプライマーの長さ及び／
又は内容の変更；（２）ＳＡＧＥプロトコル内で以前採用した以外のアダプター
連結；（３）ストレプトアビジン磁気粒子上に保持した鋳型からＰＣＲを行なう
；及び（４）非−オリゴ−ｄＴに基づくプライマーによる最初の鎖ｃＤＮＡ合成
を準備する。遺伝子捕集物質の単離又は修正した遺伝子捕集手法 この技術用の試薬及び製造者手引きは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である
。簡単に言うと、方向性ｃＤＮＡ挿入を含む単鎖ファージミドの複雑な集団を、
目標配列に相補的なビオチン化オリゴヌクレオチドプローブと溶液中でハイブリ
ダイゼーションすることで目標配列を濃縮する。ハイブリダイゼーション物はス
トレプトアビジン被覆擬似磁気粒子で捕集する。磁石で擬似磁気粒子を溶液から
取り出し、非ハイブリダイゼーションの単鎖ＤＮＡｓを残す。次いで、捕らえた
目標の単鎖ＤＮＡはビオチン化オリゴヌクレオチドから放出させる。放出後、ｃ
ＤＮＡクローンは更に非ビオチン化目標オリゴヌクレオチドを用いて濃縮し、単
鎖の目標から二重鎖ＤＮＡへ特異的に転換の準備をする。引き続いての形質転換
し、プレートに塗布すると、典型的にはコロニーの２０％〜１００％が目的のｃ
ＤＮＡクローンを表す。望ましいｃＤＮＡクローンを同定するには、コロニーを
溶液ハイブリダイゼーション用に上述した³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドを用いた
コロニーハイブリダイゼーション法又はその代替であるＤＮＡ配列決定法と共通
配列を決定するために多くのクローンから得た全ての配列の整列化などを用いて
選別を行なう。 免疫原性の確認 推定の抗原と同定した遺伝子又は遺伝子断片を分離した後、抗原の組換え生産
用に適切なホストベクター系で発現し、免疫原性を確認する方法に用いる。これ
らの方法は下に示す。 ポリヌクレオチドを含む運送媒体 抗原をコードしたポリヌクレオチドは種々な遺伝子配送で細胞へ送達すること
ができる。本発明のポリヌクレオチドはクローニング又は発現ベクターに入れる
ことができる。これらのベクターは（特に発現ベクター）順次、細胞中への配送
及び／又は進入を容易にすると思われる多くの形に操作することができる。

【００９５】 これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質及びポリペプチドを生産する
ホストベクター系を獲得するのに有効である。これらの発現ベクターはホスト生
物中でエピソーム又は染色体ＤＮＡの必須な部分として複製されなければならな
い。適切な発現ベクターとして、プラスミド、ウイルスベクター、アデノウイル
ス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、コスミドなどを含む。アデノウイル
スベクターはそれらの発現が高レベルであることやｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ両方で細胞の形質転換が効果的であることから特に遺伝子を組織へｉｎ
ｖｉｖｏで導入するのに有効である。核酸が例えば原核細胞又は真核細胞及び
ホスト細胞複製物などの適切なホスト細胞へ挿入されると、タンパク質は組換え
的に生産することができる。適切なホスト細胞はベクターに依存するが、良く知
られた方法で構築した哺乳類細胞、動物細胞、ヒト細胞、類人猿細胞、昆虫細胞
、酵母細胞及び細菌細胞を含む。参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８
９）上記。細胞に外部核酸を挿入するのにウイルスベクターを使用するのに加え
て、核酸は、細菌細胞についての形質変換など技術的に良く知られている方法で
ホスト細胞に挿入することができる；哺乳類細胞にはりん酸カルシウム沈殿を用
いた感染；又はＤＥＡＥ−デキストラン；電気窄孔；又は微量注入がある。この
方法については上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）を参照。こう
して本発明はまたホスト細胞を提供する。例えば哺乳類細胞、動物細胞（ラット
又はマウス）、ヒト細胞又はタンパク質、オリペプチド又は抗体をコードしたポ
リヌクレオチドを含む細菌細胞などの原核細胞がある。

【００９６】 ベクターをｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療で用いる場合、
薬剤に許容されているベクターが好ましく、複製不能なレトロウイルス又はアデ
ノウイルスベクターがある。本発明の核酸を含んでいる薬剤に許容されているベ
クターは、挿入ポリヌクレオチドが一時的又は安定した発現をするように更に調
製できる。ここで用いるとき、“薬剤で許容されているベクター"は、分割する
細胞に選択的に目標を定め、核酸を導入する能力を有するベクター又は配送媒体
を含むがこれに限らない。このようなベクターの例としては“複製不能"ベクタ
ーで、ウイルスタンパク質を生産する能力がないことと定義され、感染したホス
ト細胞でのベクターの拡大が不可能である。複製不能レトロウイルスベクターの
例としてはＬＮＬ６がある。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９８０〜９９０。遺伝子マーカーのレトロウイルス介在
伝達用の複製不能レトロウイルスを用いる方法論は良く確立されている。Ｃｏｒ
ｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ８６：８９１２；Ｂｏｒｄｉｇｎｏ
ｎ（１９８９）ＰＮＡＳ８６：８９１２：８９１２〜５２；Ｃｕｌｖｅｒ（１９
９１９ＰＮＡＳ８８：３１５５；及びＲｉｌｌ（１９９１）Ｂｌｏｏｄ７９（１
０）：２６９４〜７００。

【００９７】 一般的に、本発明で採用した細胞の遺伝的修正は、本発明のペプチドをコード
している配列を含んだポリヌクレオチドを含有するベクターを導入して成し遂げ
られる。非ウイルス系と共にウイルスを含む種々で異なる遺伝子伝達ベクターが
使用できる。

【００９８】 本発明のポリヌクレオチドを送達する非ウイルス性媒体は技術的に広い種類が
知られていて、本発明の中に包含される。発明のポリヌクレオチドはＤＮＡその
ものだけが細胞へ送達される。ＷＯ９７／４０１６３。代わりとして、発明のポ
リヌクレオチドは細胞へ様々な手段で種々の物質（輸送の形）と共に送達される
が、物質にはカチオン性脂質、生体適合高分子として天然高分子及び高分子、リ
ポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ
、金属粒子及び細菌を含むが、これに限らない。輸送媒体はミクロ粒子の形をと
る。これら種々の物質の混合物又は抱合体が輸送媒体として使える。発明のポリ
ヌクレオチドはこれらの種々の輸送形と非共有的又は共有的に結合できる。

【００９９】 非ウイルスベクター部類に入るものは原核生物プラスミド及び真核生物プラス
ミドである。本発明のポリヌクレオチドをその中にクローン化した非ウイルスベ
クター（例えばクローニング及び発現ベクター）は、組換えポリペプチドの発現
用と共に本発明のポリヌクレオチドの源として使用できる。クローニングベクタ
ーはそれらが含有するポリヌクレオチドの複製コピーを得るために、または将来
の回収用貯蔵庫の中にポリヌクレオチドを保存する手段として使用できる。発現
ベクター（及びそれらの発現ベクターを含有するホスト細胞）は,それらが含有
するポリヌクレオチドから産生するポリペプチドを得るために使うことができる
。それらはまた、使用できるように結合したポリヌクレオチドでコードしたポリ
ペプチドを発現することが望ましい場合、個体に対し発現ベクターにコードした
ポリペプチドを経由して免疫反応を引き出すために使える。適切なクローニング
及び発現ベクターは技術的に既知であるもの全てを含み、例えば細菌、哺乳類、
酵母及び昆虫発現系で使用するものである。特定のベクター及び適切なホスト細
胞は技術的には良く知られており、ここで詳細に記述する必要はない。例えば、
Ｇａｃｅａ ａｎｄ Ｒａｍｊｉ，Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ（１９９４）を参照。

【０１００】 クローニング及び発現ベクターは典型的に選択可能な標識（例えば、ベクター
で形質転換したホスト細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードした遺伝
子）を含有しているが、そのような標識遺伝子はホスト細胞に共導入される他、
ポリヌクレオチド配列で搬送できる。選択できる遺伝子が導入されたホスト細胞
のみが選択的条件下では生き残りそして／又は成長する。典型的な選択遺伝子は
（ａ）抗生物質又は他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトト
レキサートその他ヘの抵抗性を与える、（ｂ）栄養要求性欠損を補う、又は（Ｃ
）混合培地では得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適
切な標識遺伝子の選択はホスト細胞に依存するが、異なるホストに対する適切な
遺伝子は技術的には既知である。クローニング及び発現ベクターはまた典型的に
ホストにより認識さる複製系を含有している。

【０１０１】 適切なクローニングベクターは標準手法により構築されるか、技術的に利用で
きる数多くのクローニングベクターから選択できる。選択したクローニングベク
ターは使用されるホスト細胞により変化するが、有用なクローニングベクターは
一般的に自己複製の能力を有し、特異な制限エンドヌクレアーゼに対する単一目
標を持ち、及び／又はベクターを保有するクローン選択に使える標識用の遺伝子
を保有している。適切な例はプラスミド及び細菌ウイルス、例えばｐＵＣ１８，
ｐＵＣ１９，Ｂｌｕｅｃｒｉｐｔ（例えばｐＢＳ ＳＫ＋）及びその誘導体であ
るｍｐ１８，ｍｐ１９，ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９，ＣｏｌＥ１，ｐＣＲ１，ＲＰ
４，ファージＤＮＡｓ及びｐＳＡ３及びｐＡＴ２８のようなシャトルＤＮＡｓで
ある。これら及び多くの他のクローニングベクターは市販者であるＢｉｏＲａｄ
，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、利用可能である
。ここで提供した実施例でもまたクローニングベクターの例を提供する。

【０１０２】 発現ベクターは一般的に複製可能なポリヌクレオチド構成体で、目的のポリペ
プチドをコードしたポリヌクレオチドを保有している。目的のポリペプチドをコ
ードしたポリヌクレオチドはプロモーター、エンハンサー及びターミネーターな
ど、適切に転写する制御要素に結合することにより働く。発現（即ち翻訳）には
また、一つ又はそれ以上の翻訳の制御要素、リボソーム結合部位、翻訳開始部位
及び停止コドンなどが通常必要とされる。コードしたポリヌクレオチドが結合し
、またシグナルペプチドをコードしたポリヌクレオチド配列を含んだポリペプチ
ドは細胞膜を貫通及び／又は留まり或いは細胞から分泌される。酵母、鳥類及び
哺乳類細胞を含む真核生物での発現に適した発現ベクターは技術的には数多く知
られている。哺乳類の発現ベクターの例には、細菌中のベクターの増殖を容易に
する原核生物の配列及び真核細胞で発現する一つかそれ以上の真核生物転写単位
の両方を含む。真核生物の細胞の転写に適した哺乳類発現ベクターの例としては
、ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ，ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ，ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ，ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ，ｐＳＶ２ｇｐｔ，ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐＲＳＶｎｅｏ及びｐＨｙｇ由
来ベクターがある。代わりとして、ウイルスの誘導体で、ウシパピローマウイル
ス（ＢＰＶ−１）又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ｐＨＥＢ，ｐＲＥＰ
由来ベクター）は哺乳類細胞における発現で使用できる。酵母系での発現ベクタ
ーの例としては、ＹＥＰ２４，ＹＩＰ５，ＹＥＰ５１，ＹＥＰ５２，ＹＥＳ２及
びＹＲＰ１７があり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの構成物の導入において有効
なクローニング及び発現媒体である。Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｏｕｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ｐ
．８３。昆虫細胞での発現するにはバキュロウイルス発現ベクターとしては、ｐ
ＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２，ｐＶＬ１３９３及びｐＶＬ９４１），ｐＡ
ｃＵＷ由来ベクター及びｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクターを含む。

【０１０３】 ウイルスベクターには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニア
ウイルスのようなポックスウイルスやアデノ関連ウイルスを含むパルボウイルス
のようなＤＮＡウイルスベクター及びレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスベ
クターを含むがこれらに限らない。レトロベクターにはマウス白血病ウイルス及
びヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルスを含む。Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ
ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：２６３〜２６７。

【０１０４】 本発明のポリヌクレオチドをレトロウイルスゲノムの一部として含む複製不能
レトロウイルスを用いることができる。そのようなベクターについては詳細に記
述されている。（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：４２３９；Ｋｏｌｂｅｒｇ，Ｒ．（１９９２）Ｊ．ＮＩＨ Ｒ
ｅｓ．４：４３；Ｃｏｒｎｅｔｔａ， ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈｕｍ．Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２：２１５）。

【０１０５】 本発明の遺伝的修飾した有用なアデノウイルス及びアデノ関連ウイルスベクタ
ーは、既に技術的に知られた方法に従って生産できる（例えば、Ｋａｒｌｓｓｏ
ｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＥＭＢＯ５：２３７７；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２
）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：５
３３〜５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；ＧＥＮＥ ＴＡＲＧＥ
ＴＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（１９９２）ｅｄ．Ａ．
Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）
。幾つかの異なる方法が実施可能である。

【０１０６】 本発明の方法として用いることができるウイルスベクターにつき記載している
追加の参考文献は以下の如くである：Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｆｉｅｌ
ｄｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｒａｖｅ
ｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６７９〜１７２１、１９９０）；
Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．１０９〜１２８ ｉｎ ＭＥＴＨＯＤ
Ｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ７：ＧＥＮＥ ＴＲＡ
ＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ｍｕｒｒｙ
，Ｅ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１
９９１）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ９：１９０〜１９９，Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａ Ａｃｔａ Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ ６８：１４５〜１５９；Ｓｃｈｎｅｉ
ｄｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｎｃｈ（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８：１９
３７〜１９４２；Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３：１４７〜１５４； Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，ＷＯ
９５／００６５５（５ Ｊａｎｕａｒｙ １９９５）；Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅ
ｒｓｏｎ ＷＯ ９５／１６７７２（２２ Ｊｕｎｅ １９９５）；Ｄｅｎｅｆ
ｌｅ，ｅｔ ａｌ．ＷＯ ９５／２３８６７（８ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９
５）；Ｈａｄｄａｄａ，ｅｔ ａｌ． ＷＯ ９４／２６９１４（２４ Ｎｏｖ
ｅｍｂｅｒ １９９４）；Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，ｅｔ ａｌ．ＷＯ ９５／
２５０７１（１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９５）。 データベース及び高処理量の選別法 本発明のポリヌクレオチドの配列はまた、コンピュータに基づく方法を用いて
試料配列と既知配列を合わせて未知及び既知配列の比較をする際に用いることが
できる。こうして、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの配列をインター
ネットで利用する応用面を含み、コンピュータデータベース又はコンピュータ読
み取り形式に提供する。

【０１０７】 そのようなデータベースについては線型検索が使える。その代わりとして、ポ
リヌクレオチド配列は独特の数的表現に変換することができる。比較については
ハードウエア及びソフトウエア又は双方の組合せにおいて実施される。好ましく
は、発明のこれらの面は、プロセッサー、データ記憶システム（揮発性及び不揮
発性メモリー及び／又は記憶素子を含む）、少なくとも一つの入力装置及び少な
くとも一つの出力装置を含むプログラムの可能なコンピュータで走らせるコンピ
ュータプログラムにて実施する。配列及び以前発生したポリヌクレオチドと既知
及び／又は未知配列用のコードを含むデータ入力は、一つ又はそれ以上の入力装
置を通してデータ記憶システムに一時的または永久的に記憶する。プログラムコ
ードは入力データにも応用し、上記の機能を実施して出力情報を作出する。出力
の情報は一つ又はそれ以上の出力装置に既知の方式で行なう。

【０１０８】 ここに記述した手順を実施する目的で、これらのコンピュータプログラムはそ
れぞれコンピュータで記憶媒体又は装置を読み取るときコンピュータを環境設定
し操作できるように、、好ましくは一般的又は特別の目的のプログラム可能コン
ピュータにより読み取れる記憶媒体又は装置に（例えば、ＲＯＭ又は磁気ディス
ク）記憶させる。創意に富んだシステムでは、コンピュータプログラムで構成し
たコンピュータ可読記憶媒体として実装するように考慮され、そこでは記憶装置
がここに記述した機能を実行するために特定し、予め決めたやり方でコンピュー
タを稼動させる。

【０１０９】 本発明のポリヌクレオチドはまた高処理量選別法での使用における支援担体に
吸着させることもできる。例えばＰＣＴ ＷＯ９７／１０３６５は抗濃度オリゴ
ヌクレオチドチップの作成を開示している。またＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ
．５，４０５，７８３；５，４１２，０８７；及び５，４４５，９３４を参照。
この方法を用い、プローブを誘導体化ガラス表面で合成する。光防止化ヌクレオ
シドホスホラミダイトをガラス表面に結合した後、選択的に写真平板用マスクを
通して光分解して脱保護し、二番目の保護ヌクレオシドホスホラミダイトと反応
する。結合／脱保護の工程を望むプローブができるまで繰り返す。

【０１１０】 遺伝子の発現レベルは核酸試料をプローブ修飾チップに曝すことで測定する。
抽出した核酸は、好ましくは増幅段階において例えば蛍光タグにて標識する。標
識した試料のハイブリダイゼーションは適当な厳格レベルで行なう。プローブ−
核酸ハイブリダイゼーションの程度は、例えば共焦点顕微鏡などの検出装置で測
定する。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５７８，８３２及び５，６３１，
７３４を参照；得られた測定結果が直接に遺伝子発現レベルと相関している。

【０１１１】 チップアッセイから得た結果はコンピュータソフトウェアプログラムを用いて
基準分析を行なう。例えばＥＰ７１７，１１３ Ａ２及びＷＯ ９５・２０６８
１を参照。ハイブリダイゼーションデータをプログラムに読み込み、目標遺伝子
の発現レベルを計算する。この図形を、この細胞型での遺伝子発現レベルの存在
するデータセットと比較する。

【０１１２】 例えば、データベース及びデータベースを用いる方法により発現レベルが識別
できると共に新規ペプチドを同定する方法が提供される。その代わりとしては、
データベース及び方法は普通の細胞（この場合は対照細胞）と新生物細胞（即ち
、試験細胞）を識別するのに使用できる。また、この方法により患者又は異なる
被験体又は遺伝子発現の異なる部分から生検した新生物細胞間について、可能性
ある治療剤の投与前後における差を識別できる。この方法は薬剤の毒性及び効能
を分析するのに使用できると共に、薬で影響されると期待される又は種々の多薬
剤耐性遺伝子など薬の処置の結果で過剰発現すると考えられるタンパク質の範疇
を選択して観察するのにも使用できる。データベースの他の有用性は試験細胞の
発生様相、ウイルスや細菌感染の影響、細胞周期、腫瘍抑制遺伝子又はその欠損
、細胞型での多型及び調節遺伝子の効果などであるが、これに限らない。 本発明のポリヌクレオチド含有ホスト細胞 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するホスト細胞を提供する。本発
明のポリヌクレオチドを含有するホスト細胞はポリヌクレオチドの組換え複製及
び本発明のペプチド組換え産生において有用である。その代替としては、本発明
のポリヌクレオチドを含むホスト細胞はここに記述した方法により被験体に対し
免疫反応を誘起するのに用いることができる。

【０１１３】 本発明のポリヌクレオチドの組換え複製及び本発明のペプチドの組換え産生に
適したホスト細胞は原核性または真核性でありうる。ホスト細胞は技術的にも知
られており、ここで詳細に説明する必要はない。原核性ホストには細菌細胞であ
る大腸菌、枯草菌及びマイコバクテリア類が含まれる。真核性ホストの中には酵
母、昆虫、鳥類、植物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（又は線虫）及び哺乳類が入る。こ
れらの細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は望みの配列をコード
した遺伝子の増幅などに応じての適切に修正した従来の栄養培地で培養する。

【０１１４】 ホスト細胞が抗原提示細胞である場合、それらはガンワクチンとして或いは腫
瘍浸透リンパ球のような免疫エフェクター細胞の集団を増加するのに使用でき、
養子性免疫療法に用いることができる。

【０１１５】 これらの具体策では、単離した細胞はＡＰＣｓである。ＡＰＣｓは樹状細胞（
ＤＣｓ），単球／マクロファージ、Ｂリンパ球又は必要なＭＨＣ／共刺激性分子
を発現する他の細胞型を含むが、これに限らない。

【０１１６】 ＤＣｓ又は他のＡＰＣｓの形質導入効率は発現する腫瘍抗原に特異な蛍光抗体
を用いて免疫蛍光法で評価できる。（Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０：２７６〜２８６）。その代替として、抗体を基質と
反応すると着色した産物を生じる酵素（例えばＨＲＰ）に接合させることができ
る。ＡＰＣｓで発現する抗原性ポリペプチドの実際の量はＥＬＩＳＡで評価でき
る。

【０１１７】 ＤＣｓ又は他のＡＰＣｓのＩｎ ｖｉｖｏ形質導入は、本発明のポリヌクレオ
チドを含むウイルスベクターを静脈、筋内、腹腔内又は経皮送達などの異なる経
路で投与して実施する。利用できる一つの方法は、総用量１×１０¹⁰〜１×１０ ¹² ｉ．ｕ．を用いたＡｄベクターの多数部位での経皮送達である。ｉｎ ｖｉｖ
ｏでの形質導入のレベルは、ＡＰＣ標識に対する抗体で共染色して凡そを評価で
きる。染色工程は、投与した部位からの生検試料につき行うか、リンパ節からの
排液又はＡＰＣｓ（特にＤＣｓ）が移転した他の器官につき行うことができる。
Ｃｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１２２
〜１１２８；Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ８：１３５５〜１３６３。注射した部位又は形質導入ＡＰＣｓが転移し
た他の器官で発現する抗原の量は組織ホモジネートにつきＥＬＩＳＡで評価でき
る。

【０１１８】 ＡＰＣｓは、電気窄孔法、りん酸カルシウム沈降法又はカチオン性脂質／プラ
スミドＤＮＡ複合体ようなｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏの非ウイルス遺伝
子輸送法で形質導入ができる。Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ４：１７〜２５。形質導入したＡＰＣｓは従
ってホストへは、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内又は腹腔内経路の投与され送達
される。

【０１１９】 ＤＣｓ又は他のＡＰＣｓのｉｎ ｖｉｖｏでの形質導入は、静脈内、筋肉内、
鼻腔内、腹腔内、又は皮下経路の投与でカチオン性脂質／プラスミドＤＮＡ複合
体で送達して実施する。また皮膚への遺伝子銃送達又はそのままのプラスミドＤ
ＮＡ注入はＤＣｓ形質導入を導く。Ｃｏｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１２２〜１１２８；Ｒａｚ ｅｔ ａｌ．（１９９４
）ＰＮＡＳ９１：９５１９〜９５２３。プラスミドＤＮＡの筋肉内送達はまた免
疫にも使用できる。Ｒｏｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ８：１４５１〜１４５８。

【０１２０】 形質導入効率及び導入遺伝子発現のレベルは上述したウイルスベクターの例と
同様に評価できる。 幾つかの具体策では、免疫エフェクター及び／又はＡＰＣｓを遺伝的に修飾し
てある。標準遺伝子転移を用いると、共刺激性分子及び／又は刺激性サイトカイ
ン用の遺伝子コード化は免疫エフェクター細胞の増殖の前と同時に又はその後に
挿入できる。 抗体 また本発明で提供されるものは、本発明のペプチド及び／又はポリペプチドと
複合体を特異に生成することができる抗体がある。語句“抗体"にはポリクロナ
ール抗体及びモノクロナール抗体が含まれる。抗体にはマウス、ラット又はヒト
抗体が含まれるが、これに限らない。抗体は、本発明のペプチド／ポリペプチド
及び本発明のペプチド／ポリペプチドを発現するＡＰＣｓを同定したり精製する
のに有効である。それらは、本発明の抗原によりＴ細胞の活性を阻害するのに役
立つ。従って、Ｔ細胞と接触して抗原に対して生じる抗体の効果量によりＴ細胞
活性化を阻害する方法を本発明では提供した。これらの方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ
及びｅｘ ｖｉｖｏで行なうことができる。

【０１２１】 ポリクロナール及びモノクロナール抗体を産生する実験方法は、それらが相当
する核酸配列の推定と共に技術的に知られている。参照Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）上述及びＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）上
述。本発明のモノクロナール抗体は、タンパク質又はその断片を動物、例えばマ
ウス又はウサギに導入して生物的に生産できる。動物の抗体産生細胞を単離し、
骨髄腫細胞又はヘテロ骨髄腫細胞と融合してハイブリッド細胞又はハイブリドー
マを作成する。従って、本発明は本発明のモノクロナール抗体を産生するハイブ
リドーマも提供するものである。

【０１２２】 こうして、タンパク質又はその断片及び良く知られた方法を用いて技術的に熟
知した者であればタンパク質又はポリペプチドに結合する能力を有する抗体を手
に入れればハイブリドーマ細胞及び本発明の抗体を生産し、選別することは可能
である。

【０１２３】 試験をしたモノクロナール抗体がペプチド又はポリペプチドと結合すれば、試
験をした抗体と本発明のハイブリドーマがもたらした抗体は同等である。適切で
ない試験でなければ、抗体が本発明のモノクロナール抗体として同じ特異性をも
つかどうかは、試験をした抗体が本発明の普通の反応性であるモノクロナール抗
体とペプチド又はポリペプチドとの反応を妨害するかどうかを測定して決定がで
きる。もし試験をした抗体が本発明のモノクロナール抗体とが競争して本発明の
モノクロナール抗体の結合の減少を示せば、二つの抗体は同一か密接な関係のエ
ピトープに結合している。その代わりでは、本発明のモノクロナール抗体と普通
の反応性であるタンパク質を前培養して、試験をしたモノクロナール抗体の抗原
との結合能を阻害されるかどうかで決定できる。試験をしたモノクロナール抗体
が阻害されたら、本発明のモノクロナール抗体としてそれは同じか密接に関連し
たエピトープ特異性を持つ公算が高い。

【０１２４】 語句“抗体"はまた、全てのイソタイプの抗体も含むことになる。モノクロナ
ール抗体の特殊なイソタイプは初期融合から選択して直接調製するか、二次的に
異なるイソタイプのモノクロナール抗体を分泌する親ハイブリドーマからＳｔｅ
ｐｌｅｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ８２：８６５３又はＳｐｉ
ｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ７４：３
０７に記述してある同胞選択法を用いてクラススイッチ変種を単離することで調
製できる。

【０１２５】 本発明はまた上述のポリクロナール及びモノクロナール抗体の生物的活性断片
を提供する。これら“抗体断片"はその抗原又は免疫原との結合選択する能力を
維持している。そのような抗体断片は（１）Ｆａｂ，（２）Ｆａｂ'，（３）Ｆ
（ａｂ'）２，（４）Ｆｖ，及び（５）ＳＣＡ（単鎖抗体）を含むことができる
が、これに限らない。

【０１２６】 “生物的活性抗体断片"の独特な例は、抗体のＣＤＲ領域である。これらの断
片の作成法は技術的に知られている。参照例、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ
（１９８８）上述。

【０１２７】 本発明の抗体はまたキメラ抗体及びヒト化抗体を作りだす際に修飾が可能であ
る（Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４（３）：
２１４）。キメラ抗体は、抗体の重鎖及び軽鎖の種々のドメインが一つ以上の種
から得たＤＮＡによりコードされている抗体である。

【０１２８】 本発明のモノクロナール抗体の特異性を備えたモノクロナールを分泌する他の
ハイブリドーマの単離は、技術的に通常の技能者であれば抗イディオタイプ抗体
を生産することで実施できる。Ｈｅｒｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２３２：１００。抗イディオタイプ抗体は、目的のハイブリドーマによ
り生産されたモノクロナール抗体上に存在する独特な決定基を認識する抗体であ
る。

【０１２９】 二つのハイブリドーマのモノクロナール抗体間でのイディオタイプ同一性は、
二つの抗体は同じエピトープ決定基の認識に関しては同じことを示唆する。こう
して、モノクロナール抗体のエピトープ決定基に対する抗体を用いて同じエピト
ープ特異性のモノクロナール抗体を発現する他のハイブリドーマを同定すること
が可能である。

【０１３０】 またエピトープを模したモノクロナール抗体を生産するのに抗イディオタイプ
技術を用いることができる。例えば、最初のモノクロナール抗体につき作成した
抗イディオタイプモノクロナール抗体は、第一のモノクロナール抗体に結合する
エピトープの鏡像である超可変領域にある結合ドメインを有することができる。
こうして、この例では抗イディオタイプモノクロナール抗体はこれらの抗体を生
産する際の免疫法として使うことができる。“エピトープ"は、抗体又はＴ細胞
抗原受容体により特異的に認識される分子の一部である。これは“抗原決定基"
又は“抗原領域"とも呼ばれている。エピトープ決定基は通常、アミノ酸又は糖
側鎖などの分子の化学的活性表面群で、通常特異な三次元構造特性と特異な電荷
特性を有している。

【０１３１】 本発明の抗体は検出可能剤又は標識と結合できる。標識や標識法は技術的に普
通の技能者であれば知っていて、多種の異なるものがある。 抗体と低分子量ハプテンの結合はアッセイ法の感度を向上することができる。
ハプテンは、二番目の方法で特異的に検出できる。例えば、ハプテンとしてはビ
オチン（アビジンと反応する）、ジニトロフェノール、ピリドキサール及びフル
オレセインがあり、特異な抗ハプテン抗体と反応する。参照Ｈａｒｌｏｗ ａｎ
ｄ Ｌａｎｅ（１９８８）上述。

【０１３２】 本発明のモノクロナール抗体は多くの異なるキャリアーと結合することができ
る。こうして、本発明は抗体及び他の活性又は不活性な物質を含む組成物を提供
する。良く知られたキャリアーの例では、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロ
ース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトがある。キャリアーの
性質は本発明の目的に応じて溶解性でもあり非溶解性でもあるうる。これらに関
する技術的熟練者はモノクロナール抗体の結合用の適したキャリアーを知ってい
るか又は日常の実験により確認することができる。抗体、その断片又は抗体を生
産する細胞系を含んだ組成物は本発明の範囲に包含される。これらの組成物を薬
剤として使用する場合、それらは薬剤で許容されているキャリアート組み合わせ
て用いられる。 抗原性ペプチドを含むホスト細胞 本発明は、更に本発明の抗原性ペプチドを含む単離したホスト細胞を提供する
。幾つかの具体例では、これらのホスト細胞は本発明のペプチドの一つ又はそれ
以上をＭＨＣ分子と関連する細胞の表面において提示する。即ち、本発明の抗原
性ペプチドは細胞表面ＭＨＣ分子に結合する結果、ペプチドは免疫エフェクター
細胞により認識される。本発明のポリペプチドを提示する単離したホスト細胞で
ＭＨＣ分子と関連しているものはガンワクチン或いは教育された抗特異免疫エフ
ェクター細胞の集団を増殖し単離する際に有効である。免疫エフェクター細胞、
例えば細胞毒性Ｔ細胞は抗原提示細胞と共にナイーブ免疫エフェクター細胞を培
養することで生産されるが、これはＭＨＣ分子に関連したポリペプチドをＡＰＣ
ｓの表面に提示する。集団は技術的に知られた方法を用いて精製できる。例えば
ＦＡＣＳ分析又はＦＩＣＯＬＬ^TM勾配法がある。免疫エフェクター細胞を発生さ
せ培養するこの方法は、それで生じた集団とともに発明者が寄与し発明したもの
である。細胞と薬剤許容キャリアーを含む薬剤組成物は養子免疫治療法において
有効である。ｉｎ ｖｉｖｏで投与する前に、免疫エフェクター細胞については
ｉｎ ｖｉｔｒｏで目標細胞を溶解する能力を選別する。 ペプチドを含む抗原提示マトリックス 本発明の抗原エピトープは、抗原提示マトリックス中で、ＣＤ４＋又はＣＤ８
＋Ｔ細胞活性化に必要な共刺激分性子があるかないかに拘わらずＭＨＣ Ｃｌａ
ｓｓＩ又はＣｌａｓｓＩＩ分子により提示される（結合して）。共刺激性分子が
存在するかどうかは抗原提示マトリックスの意図した利用法に依存する。

【０１３３】 抗原提示マトリックスはＡＰＣの表面のものと共に合成抗原提示マトリックス
を含む。抗原提示マトリックスは固体担体の形体である。本発明での使用に適し
たＡＰＣｓは外来ペプチド又はタンパク質又はＴ細胞に対する内生抗体を、抗原
提示分子であるＭＨＣ分子などと共に提示することができる。ＡＰＣｓはマクロ
ファージ、樹状細胞、ＣＤ４０−活性化Ｂ細胞、抗原特異Ｂ細胞、ウイルス感染
細胞及び遺伝的修飾細胞を含むが、これに限らない。ＡＰＣｓは種々な源から得
られ、それには末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血又はその画分で、混合集団
、腎臓細胞、骨髄細胞、腫瘍滲出リンパ球、白血球除去血輸血で得た細胞、リン
パ節、例えば腫瘍から排出したリンパ節を含むが、これに限らない。適切な提供
者は免疫性を与えた提供者、非免疫性（ナイーブ）提供者、処置した又はしない
提供者である。“処置した"提供者とは一つ又はそれ以上生物的修飾物に曝露し
たことがある。ＡＰＣ'ｓはｉｎ ｖｉｔｒｏで一つかそれ以上の生物的修飾物
で処置することができる。 ＡＰＣは一般的に、生きた状態であるが、また、放射線照射、マイトマイシン
Ｃ処理、減弱、または化学的に固定されているものであってもよい。さらに、Ａ
ＰＣは全細胞である必要はない。その代わりＡＰＣの小胞調製を用いてもよい。 ＡＰＣは遺伝的に修飾されていてもよく、すなわち、通常発現しないであろう
または通常、より低いレベルで発現するであろう、ポリペプチドまたはＲＮＡ分
子を発現するような組換えポリヌクレオチドでトランスフェクションされていて
もよい。ポリヌクレオチドの例には、限定されるわけではないが、ＭＨＣ分子；
Ｂ７などの補助的刺激分子；および本発明のペプチドまたはポリペプチドをコー
ドするものが含まれる。

【０１３４】 通常、哺乳動物において、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＡＰＣとして機能しない細胞を
、ＡＰＣとして機能するような方式で修飾してもよい。適切に修飾すると、非常
に多様な細胞がＡＰＣとして機能することが可能である。こうした細胞の例は、
昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）またはスポドプテ
ラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞；および里親（ｆｏｓｔｅｒ）細胞、例えばヒ
ト細胞株Ｔ２である。例えば、１つまたはそれ以上のＭＨＣ分子などの抗原提示
ポリペプチド、所望により、またＢ７などの補助分子の合成を指示する発現ベク
ターを、これらの細胞に導入し、これらの細胞表面上の、抗原提示分子、および
所望により補助分子または機能するそれらの一部の発現を達成してもよい。ある
いは、それ自身を細胞膜に挿入することが可能な抗原提示ポリペプチドおよび補
助分子を用いてもよい。例えば、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（Ｇ
ＰＩ）−修飾ポリペプチドは、それ自身を細胞膜に挿入することが可能である。
Ｈｉｒｏｓｅら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５０：５８
２−６１４；およびＨｕａｎｇら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：６０７−
６１３。補助分子には、限定されるわけではないが、補助的刺激抗体、例えば、
ＣＤ２８、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に特異的な抗体；限定されるわけではない
が、Ｂ７．１およびＢ７．２を含む、補助的刺激分子；ＩＣＡＭ−１およびＬＦ
Ａ−３などの接着分子；並びにＦａｓリガンドおよびＣＤ７０などの生存分子が
含まれる。例えば、ＰＣＴ公告第ＷＯ ９７／４６２５６号を参照されたい。

【０１３５】 里親抗原提示細胞は、ＡＰＣとして特に有用である。里親ＡＰＣは、ヒト細胞
株１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２に由来し、Ｔ２と称され、該細胞は、抗原プロセシング
経路において、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子と内因性ペプチドの関連を制限する
突然変異を含む。Ｚｗｅｅｒｉｎｋら（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １
５０：１７６３−１７７１。これは、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８⁺ ＣＴＬに対す
る抗原提示に必要とされる、遺伝子ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ１、およびＬＭ
Ｐ２を含むＭＨＣクラスＩＩ領域中の大きなホモ接合体欠失による。事実上、「
空の」ＭＨＣクラスＩ分子のみが、これらの細胞の表面上に提示される。培地に
添加された外因性ペプチドは、該ペプチドが対立遺伝子特異的結合モチーフを含
む限り、これらのＭＨＣ分子に結合する。これらのＴ２細胞は、本明細書におい
て、「里親」ＡＰＣと称される。これらは本発明と組み合わせ、単数または複数
の抗原を提示するのに用いてもよい。

【０１３６】 特定の組換えＭＨＣ対立遺伝子を用いたＴ２細胞の形質導入は、ＭＨＣ制限プ
ロフィールの再方向付け（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）を可能にする。組換え対立
遺伝子に適応させたライブラリーは、アンカー残基が内因性対立遺伝子に対する
効率的な結合を妨げるであろうため、優先的にこれらにより提示されるであろう
。

【０１３７】 ＭＨＣ分子の高レベル発現は、ＡＰＣをＣＴＬに対し、より認識しやすくする
。強力な転写プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）を用い、Ｔ２細胞にお
いて、目的のＭＨＣ対立遺伝子を発現すると、より応答性が高いＡＰＣを生じる
（より高濃度の応答性ＭＨＣ・ペプチド複合体が細胞表面上にあることによる可
能性が最も高い）。

【０１３８】 あるいは、合成抗原提示マトリックスを用い、単数または複数のエフェクター
細胞に抗原を提示してもよい。合成マトリックスには、固体支持体、例えばビー
ズまたはプレート上に固定された、抗原提示分子、好ましくはＭＨＣクラスＩま
たはＭＨＣクラスＩＩ分子を含んでもよい。共に固定されていてもまたは可溶性
であってもよい補助分子が存在してもよく、該分子には、限定されるわけではな
いが、補助的刺激抗体、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に特異的
な抗体；限定されるわけではないが、Ｂ７．１およびＢ７．２を含む、補助的刺
激分子；ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３などの接着分子；並びにＦａｓリガンド
およびＣＤ７０などの生存分子を含む分子である。補助分子の一部もまた、その
機能が維持される限り、用いてもよい。固体支持体には、金属またはプラスチッ
ク、多孔物質、微小ビーズ、マイクロタイタープレート、赤血球、およびリポソ
ームが含まれる。例えば、国際特許公告第ＷＯ ９７／４６２５６号；およびＷ
Ｏ ９７／３５０３５号を参照されたい。 抗原提示マトリックスが、細胞表面
上にあれ合成支持体上にあれ、免疫エフェクター細胞の活性化を達成するような
方式で、免疫エフェクター細胞に抗原を提示することが可能であるかどうか決定
するための方法が、当業に知られ、そして例えば、エフェクター細胞による³Ｈ
−チミジン取り込み、エフェクター細胞によるサイトカイン産生、および細胞溶
解性⁵¹Ｃｒ放出アッセイが含まれる。

【０１３９】 いくつかの態様において、本発明の抗原性ペプチドは、該ペプチドがＣＤ４＋
またはＣＤ８＋ Ｔ細胞上のＴＣＲにより結合されるように、クラスＩまたはク
ラスＩＩ ＭＨＣ分子中で、抗原提示マトリックス上に提示されるが、該抗原提
示マトリックスは、Ｔ細胞の活性化に必要とされる１つまたはそれ以上の補助的
刺激分子を欠く。これらの抗原提示マトリックスは、Ｔ細胞アネルギー（無応答
性）を誘導し、そして免疫応答を減少させるまたは抑制させるための、本明細書
に記載される方法に有用である。抗原提示マトリックスが、Ｔ細胞アネルギーを
達成するような方式で、免疫エフェクター細胞に抗原を提示することが可能であ
るかどうか決定するための方法が、当業に知られる。

【０１４０】 以下は、ＡＰＣを単離するための２つの基本的なアプローチの簡潔な説明であ
る。これらのアプローチは、（１）血液から骨髄前駆細胞（ＣＤ３４⁺）を単離
し、そしてＡＰＣに分化させるよう刺激すること；または（２）末梢血からあら
かじめ拘束されている（ｐｒｅｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ＡＰＣを収集することを伴
う。第一のアプローチでは、患者をＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインで処置し、
末梢血中に循環するＣＤ３４⁺幹細胞の数を増加させなければならない。

【０１４１】 ＡＰＣを単離するための第二のアプローチは、すでに血中に循環している、比
較的多数のあらかじめ拘束されているＡＰＣを収集することである。拘束されて
いるＡＰＣをヒト末梢血から単離するための以前の技術は、メトリザマイド勾配
および接着／非接着工程（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌら（１９９０）ＰＮＡＳ ８
７：７６９８−７７０２）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら
（１９９４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：９９６−１００３）；および蛍
光活性化細胞分取技術（Ｔｈｏｍａｓら（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：６８４０−５２）などの物理的方法の組み合わせを伴ってきている。 多数の細胞を互いに分離するための１つの技術は、向流遠心分離エルトリエーシ
ョン（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）（ＣＣＥ）として知られる。本技術では、細胞
を同時に、遠心分離および流速が一定して増加する緩衝液の洗い出し流に供する
。緩衝液の一定して増加する向流は、主に細胞の大きさに基づく、分画的細胞分
離を導く。

【０１４２】 本発明の１つの側面において、ＡＰＣは、ネズミ、サルまたはヒトなどの哺乳
動物の白血球分画から単離されてもよい、あらかじめ拘束されている、または成
熟した樹状細胞である（例えばＷＯ ９６／２３０６０を参照されたい）。白血
球分画は、哺乳動物の末梢血由来であってもよい。本方法は、以下の工程：（ａ
）ロイコフェレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）などの当業に知られる方
法により哺乳動物供給源から得た白血球分画を提供し；（ｂ）工程（ａ）の白血
球分画を、向流遠心分離エルトリエーションにより、４つまたはそれ以上の下位
分画に分離し、（ｃ）工程（ｂ）の１つまたはそれ以上の分画における単球を、
カルシウムイオノホア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３またはＧＭ−ＣＳＦおよ
びＩＬ−４と接触させることにより、単球の樹状細胞への変換を刺激し、（ｄ）
工程（ｃ）の樹状細胞濃縮分画を同定し、そして（ｅ）工程（ｄ）の濃縮分画を
、好ましくは約４℃で収集する工程を含む。樹状細胞濃縮分画を同定する１つの
方法は、蛍光活性化細胞分取による。白血球細胞分画を、他のサイトカイン、例
えば組換え（ｒｈ）ｒｈＩＬ−１２、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、またはｒｈＩＬ−４の
存在下で、カルシウムイオノホアで処理してもよい。白血球細胞分画の細胞は、
緩衝液中で洗浄し、そして分離工程の前にＣａ⁺⁺／Ｍｇ⁺⁺不含培地に懸濁しても
よい。白血球分画は、ロイコフェレーシスにより得てもよい。樹状細胞は、以下
のマーカー：ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＢ７．２の少なくとも１つが
存在し、そして同時に以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、５６、５
７、およびＣＤ１９、２０が存在しないことにより、同定することが可能である
。これらの細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体は、商業的に入手可
能である。

【０１４３】 より具体的には、該方法は、ロイコフェレーシスから白血球および血小板の濃
縮収集物を収集し、その後、向流遠心分離エルトリエーション（ＣＣＥ）により
分画化することを必要とする。Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら（１９９１）Ｊ． Ｃｌ
ｉｎ． Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ． ６：４８−５３。細胞試料を特別のエルトリエ
ーションローター中に置く。その後、ローターを一定の速度、例えば３０００ ｒｐｍで回転させる。ローターが望ましい速度に達したら直ちに、加圧空気を用
い、細胞の流速を調節する。エルトリエーター中の細胞を、同時に、遠心分離お
よび流速が一定して増加する緩衝液の洗い出し流に供する。これは、それだけで
はないが主に細胞の大きさの相違に基づく、分画的細胞分離を生じる。

【０１４４】 ＡＰＣの品質コントロール、並びに、より具体的にはＤＣ収集および培養中の
それらの活性化の成功の確認は、単球および樹状細胞亜集団両方と共に、存在し
うる混入Ｔリンパ球をモニターする、同時マルチカラーＦＡＣＳ解析に依存する
。これは、ＤＣが以下のマーカー：ＣＤ３（Ｔ細胞）；ＣＤ１４（単球）；ＣＤ
１６、５６、５７（ＮＫ／ＬＡＫ細胞）；ＣＤ１９、２０（Ｂ細胞）を発現しな
いという事実に基づく。同時に、ＤＣは、血中に循環しているとき、大量のＨＬ
Ａ−ＤＲ、有意なＨＬＡ−ＤＱおよびＢ７．２を発現する（がＢ７．１はほとん
どまたはまったく発現しない）（さらに、ＤＣは、単球および好中球によっても
また発現される、Ｌｅｕ Ｍ７およびＭ９骨髄球マーカーを発現する）。

【０１４５】 収集されたら直ちに、ＤＣリッチ／単球ＡＰＣ分画（通常、１５０から１９０
）をプールし、そして将来の使用のため、凍結保存しても、または直ちに短期間
培養に置いてもよい。 あるいは、樹状細胞を上方制御（活性化）する、および
単球を活性化樹状細胞表現型に変換するための方法を報告してきているものもあ
る。本方法は、単球を活性化樹状細胞に変換するのに、培地へのカルシウムイオ
ノホアの添加を伴う。カルシウムイオノホアＡ２３１８７を、例えば２４−４８
時間の培養期間の最初に添加すると、プールされた「単球およびＤＣ」分画の均
一な活性化および樹状細胞表現型変換が生じた：特色として、活性化集団は、均
一に、ＣＤ１４（Ｌｅｕ Ｍ３）陰性になり、そしてＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ｄ
Ｑ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１、およびＢ７．２を上方制御する。

【０１４６】 特定の組み合わせのサイトカインは、カルシウムイオノホアで達成される活性
化／変換の増幅（または部分的置換）に用いられ、成功してきている：これらの
サイトカインには、限定されるわけではないが、精製または組換えヒト（「ｒｈ
」）ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＩＬ−２、およびｒｈＩＬ−４が含まれる。各サイ
トカインは、単独で加えられた際、最適上方制御には不適切である。

【０１４７】 免疫エフェクター細胞 本発明は、ＡＰＣを含む、上述の抗原提示マトリックスを使用し、抗原特異的
免疫エフェクター細胞の濃縮集団の産生を刺激する。したがって、本発明は、本
発明の抗原性ペプチドに特異的な、教育された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）抗原特異的
免疫エフェクター細胞が濃縮された細胞集団を提供する。これらの細胞は、天然
（内因性）抗原上の抗原性決定基（エピトープ）と交差反応する（該決定基に特
異的に結合する）ことが可能である。いくつかの態様において、天然抗原は、腫
瘍細胞の表面上にあり、そして本発明の、教育された抗原特異的免疫エフェクタ
ー細胞は、腫瘍細胞の増殖を抑制する。ＡＰＣを用いる場合、抗原特異的免疫エ
フェクター細胞は、培養中に死ぬＡＰＣ細胞の犠牲のうえに拡大する（ｅｘｐａ
ｎｄ）。未処置免疫エフェクター細胞を、他の細胞により教育する方法は、本質
的に、Ｃｏｕｌｉｅ（１９９７）Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ３：２
６１−２６８に記載される。

【０１４８】 上述のように調製されたＡＰＣを、未処置免疫エフェクター細胞と混合する。
好ましくは、細胞は、サイトカイン、例えばＩＬ２の存在下で培養してもよい。
樹状細胞は、強力な免疫刺激サイトカイン、例えばＩＬ−１２を分泌するため、
最初のそして続く拡大過程中に、補足サイトカインを添加することが必要でない
可能性がある。いずれにしても、培養条件は、抗原特異的免疫エフェクター細胞
がＡＰＣよりはるかに速い速度で拡大する（すなわち増殖する）ようなものであ
る。ＡＰＣおよび所望によるサイトカインの多数の注入を行い、抗原特異的細胞
の集団をさらに拡大してもよい。

【０１４９】 １つの態様において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。別個の態様にお
いて、免疫エフェクター細胞を、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１１またはＩＬ−１３
をコードする導入遺伝子での形質導入により、遺伝的に修飾してもよい。導入遺
伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで導入するた
めの方法は、当業に周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）上記を参照さ
れたい。

【０１５０】 本発明の方法に使用するのに適したエフェクター細胞集団は、自己のものでも
または同種異系のものでもよいが、好ましくは自己のものである。エフェクター
細胞が同種異系のものである場合、好ましくは、該細胞は使用前に同種異系応答
性細胞を枯渇させる。これは、例えば、同種異系エフェクター細胞およびレシピ
エント細胞集団を混合し、そして適切な時間、これらをインキュベーションし、
その後ＣＤ６９⁺細胞を枯渇させる、または同種異系応答性細胞を不活性化する
、または同種異系応答性細胞集団でアネルギーを誘導することによるものを含め
、いかなる既知の手段により達成してもよい。

【０１５１】 ハイブリッド免疫エフェクター細胞もまた、用いてもよい。免疫エフェクター
細胞ハイブリッドは当業に知られ、そして多様な刊行物に記載されてきている。
例えば、国際特許出願第ＷＯ ９８／４６７８５号；および第ＷＯ ９５／１６
７７５号を参照されたい。

【０１５２】 エフェクター細胞集団は、分離されない細胞、すなわち混合集団、例えばＰＢ
ＭＣ集団、全血、およびそれらに匹敵するものを含んでもよい。エフェクター細
胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づく陽性選択、細胞表面マーカーの発現
に基づく陰性選択、１つまたはそれ以上の抗原を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏまたは
ｉｎ ｖｉｖｏでの刺激、１つまたはそれ以上の生物学的修飾因子を用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの処理、１つまたはそれ以上の抗原または
生物学的修飾因子を用いた減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）刺激、あるいはこれ
らのいずれでもよいものまたはすべての組み合わせにより、操作してもよい。 エフェクター細胞は、限定されるわけではないが、ＰＢＭＣ、全血または混合集
団を含むそれらの一部、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球搬出法
（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）により得られる細胞、生検組織、リンパ節、例
えば腫瘍由来のリンパ節排出液（ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｄｒａｉｎｉｎｇ）を
含む、多様な供給源から得てもよい。適切なドナーには、免疫ドナー、非免疫（
未処置）ドナー、処理または未処理ドナーが含まれる。「処理」ドナーは、１つ
またはそれ以上の生物学的修飾因子に曝露されているものである。「未処理」ド
ナーは、１つまたはそれ以上の生物学的修飾因子に曝露されていないものである
。

【０１５３】 エフェクター細胞を抽出し、そして培養する方法は周知である。例えば、エフ
ェクター細胞は、白血球搬出法、連続流細胞分離装置を用いた機械的血漿交換に
より、得てもよい。例えば、リンパ球および単球は、限定されるわけではないが
、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ^TM勾配上の分離、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上の分離
、またはエルトリエーションを含む、いかなる既知の方法により、軟膜から単離
してもよい。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ^TMの濃度を調整し、望ましい集団、
例えばＴ細胞が濃縮された集団を得てもよい。親和性に基づく他の方法が知られ
、そしてこれらを用いてもよい。これらには、例えば蛍光活性化細胞分取（ＦＡ
ＣＳ）、細胞接着、磁気ビーズ分離、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
親和性に基づく方法は、細胞表面マーカーに特異的であり、そしてＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州マナ
サス）を含む、多様な商業的供給源から入手可能な、抗体、またはその一部を利
用してもよい。親和性に基づく方法は、あるいは、細胞表面受容体のリガンドま
たはリガンド類似体（ａｎａｌｏｇ）を利用してもよい。

【０１５４】 エフェクター細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づいた１つまたはそれ
以上の分離プロトコルに供してもよい。例えば、限定されるわけではないが、「
分化集団（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」細胞表
面マーカー、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ、ＣＤ４５、ＣＤ
Ｄ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ
２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０Ｌ；リンパ球活性化に関連する他のマーカ
ー、例えばリンパ球活性化遺伝子３産物（ＬＡＧ３）、情報伝達リンパ球活性化
分子（ＳＬＡＭ）、Ｔ１／ＳＴ２；ケモカイン受容体、例えばＣＣＲ３、ＣＣＲ
４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５；ホーミング受容体、例えばＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、
ＣＬＡ、ＣＤ１４６，ａ４ｂ７、ａＥｂ７；活性化マーカー、例えばＣＤ２５、
ＣＤ６９およびＯＸ４０；並びにＣＤ１により提示されるリポグリカンを含む、
１つまたはそれ以上の細胞表面ポリペプチドの発現に基づく陽性選択に、細胞を
供してもよい。エフェクター細胞集団は、非Ｔ細胞および／または特定のＴ細胞
サブセットを枯渇させるため、陰性選択に供してもよい。陰性選択は、限定され
るわけではないが、Ｂ細胞マーカー、例えばＣＤ１９およびＣＤ２０；単球マー
カーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６を含む、多様な分子の細胞表面発現に
基づき、行ってもよい。

【０１５５】 エフェクター細胞集団は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、１つま
たはそれ以上の生物学的修飾因子に対する曝露により、操作してもよい。適切な
生物学的修飾因子には、限定されるわけではないが、サイトカイン、例えば、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ；非特異
的修飾因子、例えば植物凝集素（ＰＨＡ）、ホルボールエステル、例えばホルボ
ールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、コンカナバリン−Ａ、およびイオノマ
イシン；細胞表面マーカーに特異的な抗体、例えば抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＩＬ
２受容体、抗ＣＤ２８；例えばリンホタクチンを含むケモカインが含まれる。生
物学的修飾因子は、天然供給源から得られる天然因子、組換えＤＮＡ技術により
産生される因子、化学的に合成されるポリペプチドまたは他の分子、あるいは天
然因子の機能上の活性を有するいかなる誘導体であってもよい。１つ以上の生物
学的修飾因子を用いる場合、曝露は、同時でもまたは連続でもよい。

【０１５６】 本発明は、本発明のペプチドに特異的な抗原特異的細胞が濃縮されたＴ細胞で
あってもよい、免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供する。「濃縮」により
、細胞集団が、少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約５００倍、そ
してさらにより好ましくは少なくとも約５０００倍またはそれ以上、元来の天然
細胞集団から濃縮されている細胞集団を意味する。抗原特異的細胞を含む濃縮細
胞集団の比率は、実質的に異なっていてもよく、抗原特異的細胞が１０％未満か
ら１００％であってもよい。細胞集団は、少なくとも５０％、好ましくは少なく
とも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そしてさらにより好ましくは少
なくとも９０％の、本発明のペプチドに特異的な抗原特異的免疫エフェクター細
胞を含む場合、該集団は「実質的に純粋」であると言われる。抗原特異的である
パーセントは容易に測定することが可能であり、例えば、エフェクター細胞集団
（例えばＴ細胞集団）を本発明の抗原性ペプチドを提示する抗原提示マトリック
スに曝露する、³Ｈ−チミジン取り込みアッセイによる。

【０１５７】 本発明の組成物 本発明はまた、上述のペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示
マトリックス、ベクター、細胞、抗体およびそれらの断片のいずれでもよいもの
、および許容しうる固体または液体キャリアーを含む組成物も提供する。組成物
を薬学的に用いる場合、これらを診断および療法使用のため「薬学的に許容しう
るキャリアー」と組み合わせる。これらの組成物はまた、本発明の診断および免
疫調節法のための医薬品の調製にも用いてもよい。

【０１５８】 診断および療法有用性 本発明は、ペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示マトリックス、および宿主
細胞（ＡＰＣおよび教育された免疫エフェクター細胞を含む）、すなわち本発明
の免疫調節剤を用いた、診断および免疫調節法を提供する。

【０１５９】 診断法 本発明は、本発明の抗原性ペプチドエピトープを用いた診断法を提供する。該
方法を用い、本発明の抗原性ペプチドエピトープに結合する、抗原特異的ＣＤ４ ⁺ またはＣＤ８⁺ Ｔ細胞の存在を検出してもよい。

【０１６０】 本発明の診断法は：（１）本発明の抗原性ペプチドエピトープの有効性を予測
するアッセイ；（２）本発明の抗原性ペプチドエピトープに特異的な免疫エフェ
クター細胞の前駆体頻度（すなわち存在および数）を決定するアッセイ；および
（３）本発明の抗原性エピトープが本発明の免疫調節法に用いられた場合の有効
性を決定するアッセイを含む。

【０１６１】 本発明の診断法は、一般的に、本発明の抗原性エピトープおよび免疫エフェク
ター分子、例えばＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺ Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の
表面上のＴＣＲの間に起こる特異的な結合を可能にするのに適した条件下で、そ
して十分な時間、行う。「適切な条件」および「十分な時間」は、一般的に、特
異的な結合に適した条件および時間である。適切な条件は、約４℃および約４０
℃の間、好ましくは約４℃および約３７℃の間で、緩衝溶液中で、そして５およ
び９の間のｐＨ範囲で起こる。多様な緩衝溶液が当業に知られ、本発明の診断法
に用いてもよく、そして限定されるわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水が含
まれる。結合および応答のための十分な時間は、一般的に、本発明の抗原性ペプ
チドエピトープに対する試料の曝露後、約１秒および約２４時間の間であるであ
ろう。

【０１６２】 いくつかの態様において、本発明は、本発明の抗原性ペプチドエピトープの有
効性を予測する診断アッセイを提供する。これらの態様のいくつかにおいて、明
示されたＴ細胞エピトープを用い、あらかじめ、ｉｎ ｖｉｖｏワクチン試験の
予測される有効性を決定するため、腫瘍およびウイルス病原体を臨床的に性質決
定する。これは、明示されたＴ細胞エピトープを刺激因子として用いる、患者末
梢血単核細胞の単純な増殖アッセイにより、達成することが可能である。応答を
引き出すペプチドは、その患者に対する、発展しうる（ｖｉａｂｌｅ）ワクチン
候補である。

【０１６３】 他の態様において、本発明の抗原性ペプチドエピトープに特異的であり、そし
てしたがって活性化される可能性がある、休止（未処置）免疫エフェクター細胞
前駆体頻度（すなわち存在および数）を決定するアッセイが提供される。これら
の態様において、表面に本発明の抗原性ペプチドエピトープを持つ抗原提示細胞
を用い、生物学的試料における、該エピトープに特異的に結合する、免疫エフェ
クター細胞の存在を検出する。機能アッセイを用い、抗原特異的免疫エフェクタ
ー細胞を決定（し、そして定量化）する。

【０１６４】 他の態様において、本発明の免疫調節法を含む、免疫調節法が、本発明の抗原
性エピトープに対する免疫応答を調節する有効性。これらの診断アッセイはまた
、免疫療法剤の有効性を評価するまたはモニターするのにも有用である。これら
の態様のいくつかにおいて、該方法は、活性化ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺ Ｔ細胞で
あってもよく、抗原性ペプチドエピトープに対する曝露の結果、活性化されまた
はアネルギー化されている、免疫エフェクター細胞の検出を可能にする。本発明
の既定の抗原性ペプチドエピトープに対する結合の結果として、活性化されまた
はアネルギー化されているＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺ Ｔ細胞の存在に関し、被験者
由来の細胞を含む試料を試験してもよい。いくつかの態様において、該方法は：
（ａ）クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合している本発明の抗原性ペ
プチドエピトープを表面上に提示する固定抗原提示マトリックスと、生物学的試
料を、該ペプチドに特異的な抗原受容体を表面上に持つ免疫エフェクター細胞の
結合を可能にし、それにより抗原特異的免疫エフェクター細胞を固定するのに適
した条件下で、そして十分な時間、接触させ；そして（ｂ）固定免疫エフェクタ
ー細胞を、検出可能に標識された、免疫エフェクター細胞に特異的に結合する分
子、例えば抗体と接触させる工程を含む。他の態様において、該方法は：（ａ）
クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合している本発明の抗原性ペプチド
エピトープを表面上に提示する固定抗原提示マトリックスと、生物学的試料を、
該ペプチドに特異的な抗原受容体を表面上に持つ免疫エフェクター細胞の結合を
可能にし、それにより抗原特異的免疫エフェクター細胞を固定するのに適切な条
件下で、そして十分な時間、接触させ；そして（ｂ）固定免疫エフェクター細胞
に対し、機能アッセイを行う段階を含む。固定抗原提示マトリックスは、限定さ
れるわけではないが、プレート、チップおよびビーズを含む、固体支持体上に固
定された抗原提示マトリックスであってもよい。免疫エフェクター細胞が、本発
明の固定抗原性ペプチドエピトープに結合したら直ちに、限定されるわけではな
いが、ＣＤ４、ＣＤ８、および活性化Ｔ細胞に特異的な細胞表面マーカーを含む
、特徴的な細胞表面分子に基づき、標識してもよい。免疫エフェクター細胞集団
に特異的な多様な細胞表面マーカーが当業者に知られ、そして多くの刊行物に記
載されてきている。例えばＴＨＥ ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ ＡＮＴＩＧＥＮ ＦＡ
ＣＴＳ ＢＯＯＫ， Ｂａｒｃｌａｙら監修， １９９５， Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらのマーカーに対する抗体は、とりわけ、Ｂ
ｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから、商業的に入手可能である。固定免疫エフェ
クター細胞はまた、既定の活性化またはアネルギー状態にある既定のＴ細胞種に
特異的な細胞質ゾル中のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の存在により、特徴
付けることも可能である。特徴的なｍＲＮＡは、限定されるわけではないが、ポ
リメラーゼ連鎖反応を含む、いかなる既知の方法により、検出してもよい。検出
可能に標識された、細胞表面マーカーに対する抗体を、特異的な結合を可能にす
るのに適した条件下で、そして十分な時間、固定免疫エフェクター細胞と接触さ
せてもよい。必要または望ましい場合、標識細胞を非結合標識から物理的に除去
してもよいし、または過剰な非結合標識を不活性化してもよい。免疫エフェクタ
ー細胞上の細胞表面マーカーに特異的な抗体の必要条件は、該抗体が特異的に結
合し、そして該抗体がＴＣＲおよび固定抗原性ペプチドエピトープの間の結合に
干渉しないことである。

【０１６５】 使用してもよい標識は当業者に知られ、そして限定されるわけではないが、伝
統的な標識物質、例えばフルオロフォア、放射性同位体、発色団、および磁気粒
子が含まれる。酵素標識は、限定されるわけではないが、ルシフェラーゼ；緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、例えばアエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅ
ａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来のＧＦＰ、または当業に知られるいかなる多様なＧ
ＦＰでもよいもの；ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼを含む。例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら監修、１９８７
、および定期的な改訂）を参照されたい。直接または間接的に、標識を検出する
いかなるアッセイも、本発明に使用するのに適している。アッセイには、比色、
蛍光定量、または発光アッセイ、ラジオイムノアッセイまたは他の免疫学的アッ
セイが含まれる。

【０１６６】 免疫調節法 本発明は、個体において、免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の免疫
調節法は、被験者において、免疫応答の誘導または増加を生じる方法と共に、抑
制または減少を生じる方法も含み、そして本発明の有効量のペプチド（またはい
かなる免疫調節剤でもよいもの）を、該ペプチドに対する免疫応答（またはその
欠失）に対し望ましい影響を生じる、処方中および／または条件下で、被験者に
投与することを含む。本発明の免疫調節法は、ワクチン法、養子免疫療法、およ
びＴ細胞無応答性、またはアネルギーを誘導する方法を含む。

【０１６７】 本発明の方法に使用するための「免疫調節剤」は、免疫応答を調節する分子、
巨大分子複合体、または細胞であり、そして：本発明の抗原性ペプチドまたはエ
ピトープのみ、あるいは本明細書に記載される多様な処方のいずれでもよい処方
中の該ペプチドまたはエピトープ；本発明の抗原性ペプチドまたはエピトープを
含むポリペプチド；本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；（単数または複数の補助的刺激分子の存在下または非存在下での）Ａ
ＰＣおよび合成抗原提示マトリックスを含む、抗原提示マトリックス上の、クラ
スＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合している、本発明の抗原性ペプチド；
単数または複数の別の分子または巨大分子構造に、共有または非共有的に複合体
化している、本発明の抗原性ペプチド；および本発明のペプチドに特異的な、教
育された抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む。

【０１６８】 Ｔ細胞活性化を評価する、多様な方法が知られる。ＣＴＬ活性化は、限定され
るわけではないが、トリチウム化チミジン取り込み（ＤＮＡ合成の指標）、およ
び例えばコロニーの同定による、成長または増殖に関する集団の検査を含む、い
かなる既知の方法により、検出してもよい。あるいは、テトラゾリウム塩ＭＴＴ
（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテト
ラゾリウムブロミド）を添加してもよい。Ｍｏｓｓｍａｎ（１９８３）Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３； ＮｉｋｓおよびＯｔｔ
ｏ（１９９０）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３０：１４０−１
５１。生存細胞のミトコンドリアに見出されるコハク酸デヒドロゲナーゼは、Ｍ
ＴＴをホルマザン・ブルーに変換する。したがって、濃い青色は、代謝的に活性
である細胞を示すであろう。さらに別の態様において、放射標識、例えばトリチ
ウム化チミジンの取り込みをアッセイし、細胞の増殖を示してもよい。同様に、
タンパク質合成は、³⁵Ｓ−メチオニンの取り込みにより、示すことが可能である
。さらに別の態様において、細胞傷害性および細胞殺傷アッセイ、例えば古典的
なクロム放出アッセイを使用し、エピトープ特異的ＣＴＬ活性化を評価してもよ
い。ＣＤ４⁺ Ｔ細胞の活性化を検出するため、限定されるわけではないが、サイ
トカイン産生；および例えばトリチウム化チミジン取り込みによる増殖の測定を
含む、いかなる多様な方法を用いてもよい。

【０１６９】 標識標的細胞からの⁵¹Ｃｒの放出は、生物学的試料における、ペプチド特異的
ＣＴＬの数を評価するのに用いることが可能な、標準的なアッセイである。腫瘍
細胞、または本発明のＡＰＣを標的として、約２００μＣｉのＮａ２⁵¹ＣｒＯ４
で、３７℃で６０分間放射標識した後、洗浄する。その後、Ｔ細胞および標的細
胞（〜１ ｘ １０⁴／ウェル）を、９６ウェルＵ底プレート中で、多様なエフ
ェクター対標的比で混合する。プレートを１００ ｘ ｇで５分間、遠心分離し
、細胞接触を開始し、そして５％ ＣＯ２と共に３７℃で４−１６時間インキュ
ベーションする。上清中の⁵¹Ｃｒの放出を測定し、そしてＴ細胞の非存在下で（
陰性コントロール）、または０．１％ ＴＲＩＴＯＮ^TMＸ−１００と（陽性コン
トロール）インキュベーションした標的と比較する。例えば、Ｍｉｓｈｅｌｌお
よびＳｈｉｉｇｉ監修， ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ
ＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８０）Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏ．を参照されたい。

【０１７０】 本発明のペプチドの処方は、望ましい結果に応じ、異なるであろう。一般的に
、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子により、抗原提示マトリックス上に提
示されるペプチドは、適切な補助的刺激分子と共に、該ペプチドに対する免疫応
答の誘導を生じるであろう。Ｔリンパ球において、アネルギー（または無応答性
）状態は、表面上に適切なＭＨＣ分子を含むが、適切な補助的刺激分子を欠く抗
原提示マトリックス（ＡＰＣであってもよい）による抗原の提示により、誘導す
ることが可能である。本明細書に記載される多様な処方のいずれを用いてもよい
。

【０１７１】 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子搬送ビヒクル中で、または続いて、コー
ドされるポリペプチドを組換え的に転写し、翻訳し、そしてプロセシングする、
宿主細胞に挿入することにより、投与してもよい。薬学的に許容しうるキャリア
ー中の本発明のポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞は、有効なワクチン措置の
ため、適切でそして有効な量のアジュバント、サイトカインまたは補助的刺激分
子と組み合わせてもよい。いくつかの態様において、宿主細胞はＡＰＣ、例えば
樹状細胞である。宿主細胞は、サイトカイン、補助的刺激分子のいずれかまたは
両方の有効量をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、さらに修飾
してもよい。

【０１７２】 本発明の方法は、被験者にサイトカインまたは補助的刺激分子の有効量を共投
与することにより、さらに修飾してもよい。 意図される目的に有効として、本明細書に提供される剤を、本発明の免疫調節
法で治療しようとする疾患を有する被験者、またはこうした疾患を発展させやす
いまたは発展させる危険性がある個体に投与してもよい。剤を、マウス、ラット
またはヒト患者などの被験者に投与する際、剤を薬学的に許容しうるキャリアー
に添加し、そして被験者に全身または局所投与してもよい。療法量は経験的に決
定してもよいし、そして治療しようとする病変または異常、治療しようとする被
験者並びに療法の有効性および毒性により、異なるであろう。

【０１７３】 本発明のペプチドまたは免疫エフェクター細胞の量は、部分的に、意図される
効果に応じ、異なるであろうし、そして究極的に、医師または獣医師の判断によ
る。考慮すべき要因には、治療しようとする状態、投与経路、および処方の性質
、哺乳動物の体重、表面面積、年齢、および全身状態、並びに投与しようとする
特定のペプチドが含まれる。本発明のペプチドの適切な有効用量は、一般的に、
約０．０００１μｍｏｌ／ｋｇ体重ないし約１０００μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲
にある。総用量は、単回用量または多数回用量、例えば１日２ないし６回として
、投与してもよい。例えば、７５ ｋｇの哺乳動物（例えばヒト）には、用量範
囲は約２．２５μｍｏｌ／ｋｇ／日であろうし、そして典型的な用量はペプチド
約１００μｍｏｌである可能性がある。別個の多数回用量が指示される場合、治
療は、典型的には、１日４回まで投与される、本発明のペプチド２５μｍｏｌで
ある可能性がある。別の投与措置では、本発明のペプチドを１日おきに、または
週１回または２回、投与してもよい。本発明の免疫エフェクター細胞の適切な有
効用量は、一般的に、投与当たり、約１０²ないし約１０⁹細胞の範囲内にある。
細胞を１回投与し、その後、臨床反応、例えば疾患症状または腫瘍塊の減少をモ
ニターしてもよい。投与は、例えば月単位で反復してもよいし、または適切なよ
うに反復してもよい。当業者は適切な投与措置が、医師または獣医師の判断によ
るであろうことを認識するであろう。

【０１７４】 ｉｎ ｖｉｖｏの投与は、１回用量、治療経過に渡る連続的または断続的投与
であってもよい。最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に周知
であり、そして療法に用いられる組成物、療法の目的、治療しようとする標的細
胞、および治療しようとする被験者によって異なるであろう。治療する医師によ
り選択された用量レベルおよびパターンで、単回または多数回投与を行ってもよ
い。適切な投薬処方および剤を投与する方法は、以下に見出すことが可能である
。

【０１７５】 本発明の剤および組成物は、医薬品の製造において用いてもよいし、そして慣
用法に一致した投与、例えば薬剤組成物中の活性成分により、ヒトおよび他の動
物を治療するために用いてもよい。

【０１７６】 より詳細には、本明細書において活性成分とも称される本発明の剤は、鼻腔、
局所（経皮、エアロゾル、頬側および舌下を含む）、非経口（皮下、筋内、静脈
内および皮内を含む）および肺を含む、いかなる適切な経路により、療法のため
、投与してもよい。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、並びに治
療しようとする疾患または異常によって異なるであろうこともまた、認識される
であろう。

【０１７７】 癌治療および予防のためのワクチン １つの態様において、本発明の免疫調節法は、癌治療のためのワクチンを含む
。これらのワクチンは、罹患した個体の治療と共に、再発（または疾患に対する
家族性の遺伝的素因（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）をもつ患者における疾患
の確立）に対する予防的療法にもなるであろう。癌を経験したことがまったくな
い個体の接種は、ほとんどの場合、高親和性ペプチドが免疫原性であるようであ
り、機能するＴ細胞レパトアの欠陥は、あるとしても比較的まれである可能性が
あることが示唆されるため、腫瘍抗原特異的ＣＴＬ応答がまだ引き出されていな
くても、予防的療法として非常に成功すると期待される。Ｓｅｔｔｅら（１９９
４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：５５８６−５５９２。マウスでは、適切
なエピトープを用いたワクチン接種は、確立された腫瘍を除くだけでなく、そう
でなければ致死的な用量の腫瘍細胞の接種後の腫瘍再確立に対しても防御する。
Ｂｙｓｔｒｙｎら（１９９３）上記。

【０１７８】 ワクチンアジュバントにおける最近の進歩は、ペプチドが免疫系に最大の影響
を与えるように、ペプチド投与の有効な手段を提供する。Ｄｅｌ−Ｇｉｕｄｉｃ
ｅ（１９９４）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０：１０６１−１０６６。これらの
ペプチドワクチンは、一般的に、慣用的な療法に不反応性である、転移性腫瘍を
治療するのに非常に価値があるであろう。劣性癌遺伝子のホモ接合体欠失から生
じる腫瘍は、体液（抗体）応答による除去に、より感受性が低く、そしてしたが
って、細胞性ＣＴＬ応答を引き出すことにより、より効果的に治療されるであろ
う。

【０１７９】 養子免疫療法 抗原特異的免疫エフェクター細胞の拡大された集団および本発明のＡＰＣは、
養子免疫療法措置において、そしてワクチンとして使用を見出す。

【０１８０】 養子免疫療法は、１つの側面において、上述のように、ＡＰＣと未処置免疫エ
フェクター細胞を培養することにより作成された、教育された抗原特異的免疫エ
フェクター細胞の実質的に純粋な集団を、被験者に投与することを伴う。いくつ
かの態様において、ＡＰＣは樹状細胞である。

【０１８１】 １つの態様において、本明細書に記載される養子免疫療法は、自己のものであ
る。この場合、ＡＰＣは、単一の被験者から単離された親細胞を用い、作成され
る。拡大された集団はまた、その被験者から単離されたＴ細胞を使用する。最後
に、抗原特異的細胞の拡大された集団を、同一の患者に投与する。

【０１８２】 さらなる態様において、ＡＰＣまたは免疫エフェクター細胞は、有効量の刺激
性サイトカイン、例えばＩＬ−２または補助的刺激分子と共に投与される。 実験実施例１ ｇｐ１００特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による溶解に対する感受性
が異なる黒色腫細胞株をＳＡＧＥ解析に供し、どのＳＡＧＥタグが、溶解に感受
性でない細胞株に存在しないかまたはより少ないのと対照的に、溶解に感受性で
ある細胞株中で共有されるかを決定した。以下の表２は、黒色腫細胞株の表現型
およびＳＡＧＥ解析に関し示す。

【０１８３】 表２ ＳＡＧＥ解析に用いた黒色腫細胞株の表現型

【０１８４】

【表２】

【０１８５】 １０のＳＡＧＥタグが分類規準に一致し、そしてＢＡ１およびＡ３７５（溶解
に感受性でないもの）と同定される細胞株よりも、６２４ｍｅｌおよび１３００
ｍｅｌ（溶解に感受性であるもの）と同定される細胞株に、より高いレベルで存
在することが見出された。ｇｐ１００ ｍＲＮＡの異なるスプライシング型に対
応する、２つの異なるタグが同定されたが、さらに、ｃｄｃ２関連プロテインキ
ナーゼに対応するタグを含む、８つの他のタグ配列が見出された（表３）。ｇｐ
１００は、先に、患者由来Ｔ細胞の標的と同定されたが、ｃｄｃ２関連プロテイ
ンキナーゼもまた、患者由来免疫エフェクター細胞または抗体の標的である可能
性があるとは報告されてきていない。

【０１８６】 表３ 黒色腫瘍細胞株ＳＡＧＥデータの比較

【０１８７】

【表３】

【０１８８】 実験実施例２ ＦＡＣＳ解析により判断されるような、抗ＨＥＲ−２抗体に対する異なる免疫
応答性を示す、黒色腫および乳癌細胞株をＳＡＧＥ解析に供し、そしてより低い
平均蛍光シグナルを示す細胞株でより少ないＳＡＧＥタグのいずれが、高い平均
蛍光シグナルを示す細胞株で共有されるかを決定した。４つのＳＡＧＥタグが分
類規準に一致し、そして細胞株ＭＤＡ−４６８、ＳＫ２８、ＢＡ１、ＮＭ４５５
および１３００ｍｅｌ（より弱い蛍光シグナルを示すもの）より、細胞株２１Ｐ
Ｔおよび２１ＭＴ（強い蛍光シグナルを示すもの）に、より高いレベルで存在す
ることが見出された。ＨＥＲ−２に対応する１つのタグが同定されたが、さらに
、インテグリン・アルファ−３に対応するタグを含む、３つの他のタグ配列が見
出された。ＨＥＲ−２は、先に、患者由来Ｔ細胞の標的と同定されたが、インテ
グリン・アルファ−３もまた、患者由来免疫エフェクター細胞または抗体の標的
である可能性があるとは報告されてきていない。したがって、インテグリン・ア
ルファ−３をコードする遺伝子または対応する遺伝子産物またはそのペプチド断
片を用い、インテグリン・アルファ−３を差別的に発現する標的細胞に対する免
疫応答を誘発してもよい。インテグリン・アルファ−３を本実施例に用いるが、
差別的に発現される単数または複数の遺伝子（ＳＡＧＥにより同定されるもの）
および対応するタンパク質またはペプチド断片いずれを用い、抗標的細胞免疫応
答を誘発してもよい。

【０１８９】 表４ 抗体により認識される抗原の同定

【０１９０】

【表４】

【０１９１】 本発明は上記の態様と組み合わせ、記載されるが、前述の説明および以下の実
施例は、本発明を例示し、そして本発明の範囲を限定しないことが意図されるこ
とを理解すべきである。例えば、上述の組成物および／または方法のいずれを既
知の療法または組成物と組み合わせてもよい。他の側面、利点および本発明の範
囲内の修飾は、本発明が関係する当業の当業者に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ及び図１Ｂはｇｐ１００特異細胞毒性Ｔリンパ球による溶
解に対する細胞系の比感受性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ ４Ｃ０８７ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ニコレット，チャールズ・エイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州01752， マールボロ，ベガ・ロード 52 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 CB17 DA12 DA13 DA36 DA78 FB03 4B024 AA01 AA11 AA20 BA21 CA01 CA04 DA03 EA04 GA11 HA17 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ53 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 4C084 AA13 BA35 DA01 MA02 MA66 NA05 NA14 ZB26 4C085 AA03 AA38 BB01 EE01 EE06 FF13 FF24 4C087 AA01 BB65 CA12 MA02 MA05 NA05 NA14 ZB26

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的細胞中でユニークにまたは過剰に発現されるが、これま
   で患者中で免疫応答を誘導する能力を持つことは知られていなかった抗原性ペプ
   チドの有効量を患者に送達し、該標的細胞に対する免疫応答をひきおこすことか
   らなる。患者中の標識細胞に対する免疫応答を誘導する方法。
2. 【請求項２】 ペプチドをアミノ酸配列として送達する請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ペプチドを抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドとし
   て送達する請求項１の方法。
4. 【請求項４】 ユニークにまたは過剰に発現されるポリヌクレオチドが次の
   方法で同定される請求項１の方法： (a) 標的細胞中で遺伝子発現を代表するポリヌクレオチドのセットを得； (b) コントロール細胞中で遺伝子発現を代表するポリヌクレオチドのセットを
   得； (c) コントロールに比べて標的細胞中でユニークにまたは過剰に発現するポリ
   ヌクレオチドを同定し；そして (d) 患者に免疫応答を引き起こすことができるユニークにまたは過剰に発現す
   るポリヌクレオチドを同定する。
5. 【請求項５】 さらに、サイトカインおよび／または補助刺激分子の有効量
   を患者に投与することを含む、請求項１の方法。
6. 【請求項６】 ポリヌクレオチドが遺伝子送達ビヒクル中にいれて患者に投
   与される請求項３の方法。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドが、宿主細胞中に入れて患者に投与される
   請求項３の方法。
8. 【請求項８】 宿主細胞が抗原提示細胞である請求項３の方法。
9. 【請求項９】 さらに、サイトカインおよび／または補助刺激分子の有効量
   を患者に投与することを含む、請求項７または８の方法。
10. 【請求項１０】 標的細胞中でユニークにまたは過剰に発現されるが、これ
    まで患者中で免疫応答を誘導する能力を持つことは知られていなかった抗原性ペ
    プチドに対して高められた免疫エフェクター細胞の有効量を患者に投与し、それ
    により標的細胞に対する免疫応答をひきおこすことからなる、標的細胞に対する
    患者の免疫応答を増大させる方法。
11. 【請求項１１】 ユニークにまたは過剰に発現されるポリヌクレオチドが次
    の方法で同定される請求項１０の方法： (a) 標的細胞中で遺伝子発現を代表するポリヌクレオチドのセットを得； (b) コントロール細胞中で遺伝子発現を代表するポリヌクレオチドのセットを
    得； (c) コントロールに比べて標的細胞中でユニークにまたは過剰に発現するポリ
    ヌクレオチドを同定し；そして (d) 患者に免疫応答を引き起こすことができるユニークにまたは過剰に発現す
    るポリヌクレオチドを同定する。
12. 【請求項１２】 さらに、サイトカインおよび／または補助刺激分子の有効
    量を患者に投与することを含む、請求項１０の方法。
13. 【請求項１３】 免疫エフェクター細胞が細胞毒性Ｔリンパ球である請求項
    １０の方法。