JP2002525339A - Carbohydrate vaccine for viral diseases - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者のウイルス疾患を治療もしくは予防する方法であって、ウイルス疾患の間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体を、ウイルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量で患者に投与することを含む方法を提供する。また本発明は、ウイルス疾患を治療もしくは予防するためのワクチンであって、ウイルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量の、ウイルス疾患の間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体と、薬学的に許容し得る担体とを含むワクチンを提供する。   (57) [Summary] The present invention provides a method of treating or preventing a viral disease in a patient, comprising the steps of: providing a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof overexpressed during the viral disease in an amount effective to treat or prevent the viral disease. And administering to the patient at The present invention also provides a vaccine for treating or preventing a viral disease, comprising an effective amount of a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof overexpressed during a viral disease, for treating or preventing the viral disease. A vaccine comprising a body and a pharmaceutically acceptable carrier is provided.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 本出願は、１９９８年１０月１日に出願された米国仮出願第６０／１０２、６
５７号の利益を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書の開示内
容の一部とする。[0001] This application is related to US Provisional Application No. 60 / 102,6, filed October 1, 1998.
No. 57, the contents of which are hereby incorporated by reference.

【０００２】 本出願を通じて、様々な文献が括弧内に参照されている。本発明が属する技術
の水準をより完全に記述するために、これら文献の開示内容全体を本出願に参考
文献として組み込む。[0002] Throughout this application, various publications are referenced in parentheses. In order to more completely describe the state of the art to which this invention pertains, the entire disclosures of these documents are incorporated by reference into this application.

【０００３】 発明の背景 炭水化物代謝および細胞表面の発現における劇的な変化が、ウイルス感染など
の感染症に関連して観察されている。例えば、ヒトリンパ球がレトロウイルス（
例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはヒトＴリンパ球向性ウイルス
（ＨＴＬＶ−１））によるインビボおよびインビトロ感染を受けると、ルイス（
Lewis）ｙ抗原の細胞表面での発現が増大し（Adachi et al., J. exp. Med, 167
: 323, 1988）、ガングリオシドＧＭ２、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ
およびＧ３の細胞表面での発現が増大する（Sorice, et al., JAIDS, 12: 112,
1996; Misasi et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 67: 216, 1993; Furuka
wa et al., PNAS, 90: 1972, 1993; Matsuda et al., Biochem. Biophys. Acta,
1168: 123, 1993; Auci et al., J. Leukoc. Biol. 52: 282, 1992）。ＧＭ２
、ＧＤ２およびＧＭ３の発現の増大は、ヒトアデノウイルス遺伝子をトランスフ
ェクトされた細胞系もしくはハイブリッドアデノウイルスに感染した細胞系で観
察されている（Sanai et al., J. Biochem. [Tokyo] 107: 740, 1990, Jambrosi
c et al., Int. J. Cancer, 44: 1117, 1989）。[0003] dramatic changes in the expression of the background carbohydrate metabolism and cell surface of the invention have been observed in connection with infections such as viral infections. For example, if human lymphocytes are retroviral (
For example, upon in vivo and in vitro infection with human immunodeficiency virus (HIV) or human T lymphotropic virus (HTLV-1), Lewis (
Lewis) Increased expression of the y antigen on the cell surface (Adachi et al., J. exp. Med, 167
: 323, 1988), gangliosides GM2, GD2, GM1, GM1a, GD1a.
And G3 on the cell surface are increased (Sorice, et al., JAIDS, 12: 112,
1996; Misasi et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 67: 216, 1993; Furuka
wa et al., PNAS, 90: 1972, 1993; Matsuda et al., Biochem. Biophys. Acta,
1168: 123, 1993; Auci et al., J. Leukoc. Biol. 52: 282, 1992). GM2
, GD2 and GM3 have been observed in cell lines transfected with human adenovirus genes or infected with hybrid adenovirus (Sanai et al., J. Biochem. [Tokyo] 107: 740, 1990, Jambrosi
c et al., Int. J. Cancer, 44: 1117, 1989).

【０００４】 ＧＭ２、ＧＤ２およびその他のガングリオシドは、疎水性セラミド部分に結合
した複雑な炭水化物部分から成るスフィンゴ糖脂質を含むシアル酸である。炭水
化物鎖は、細胞膜の外層内に埋め込まれ、細胞外マトリクスに晒されている。Ｇ
Ｄ２などのガングリオシドのオリゴ糖部分は、ペプチド部分に連結されていても
よく、主要組織適合性分子と共同して細胞表面に呈示されると、細胞毒性Ｔリン
パ球を活性化する（Zhao and Cheung, J. Exp. Med. 182: 67, 1995）。ルイス
ｙ抗原は、糖脂質および糖タンパク質において発見された中性オリゴ糖である。
多くの数の糖脂質が、抗原呈示分子ＣＤ１ファミリーのメンバーと共同して細胞
表面に呈示されると、細胞毒性Ｔリンパ球応答を引き出すことが分かってきてい
る。[0004] GM2, GD2 and other gangliosides are sialic acids containing glycosphingolipids consisting of a complex carbohydrate moiety linked to a hydrophobic ceramide moiety. Carbohydrate chains are embedded in the outer layer of the cell membrane and are exposed to the extracellular matrix. G
Oligosaccharide moieties of gangliosides such as D2 may be linked to peptide moieties and, when presented on the cell surface in conjunction with major histocompatibility molecules, activate cytotoxic T lymphocytes (Zhao and Cheung , J. Exp. Med. 182: 67, 1995). Lewis y antigens are neutral oligosaccharides found in glycolipids and glycoproteins.
A large number of glycolipids have been shown to elicit a cytotoxic T lymphocyte response when presented on the cell surface in association with members of the antigen presenting molecule CD1 family.

【０００５】 ウイルスに感染した細胞とともに、様々なヒトの腫瘍が、ＧＭ２、ＧＤ２、お
よびルイスｙ抗原などの炭水化物の構造が発現を変化させることにより特徴付け
られている（Ragupathi, Cancer Immunol. Immunother. 43: 152, 1996に概説さ
れる）。天然に存在する抗ＧＭ２抗体を有するメラノーマの患者は、疾患のみら
れない期間および生存期間が延長されている。このように、細胞表面の炭水化物
抗原は、癌の能動および受動免疫療法に対するターゲットとして同定され、これ
らの構造物に対する免疫応答を誘導するために種々のアプローチが採用された。
これらの構造物には、全腫瘍細胞もしくは溶解された腫瘍細胞、精製された炭水
化物、ミモトープ（mimotope）、および抗イディオタイプ抗体が含まれる。精製
された炭水化物の免疫原性は、当該炭水化物の免疫原性担体タンパク質への結合
（conjugation）を介して改善することができる。[0005] A variety of human tumors, along with cells infected with the virus, have been characterized by altered expression of carbohydrate structures such as GM2, GD2, and Lewis y antigen (Ragupathi, Cancer Immunol. Immunother. 43: 152, 1996). Patients with melanoma having a naturally occurring anti-GM2 antibody have an extended period of disease-free and survival. Thus, cell surface carbohydrate antigens have been identified as targets for active and passive immunotherapy of cancer, and various approaches have been taken to elicit an immune response to these structures.
These structures include whole or lysed tumor cells, purified carbohydrates, mimotope, and anti-idiotype antibodies. The immunogenicity of the purified carbohydrate can be improved through the conjugation of the carbohydrate to an immunogenic carrier protein.

【０００６】 各ワクチンのアプローチは、初期の実験において有望であることが示され、精
製された炭水化物抗原の免疫原性Ｔ依存タンパク質担体への吸着もしくは共有結
合について、最も熱心に探求され、幾つかのワクチン例において臨床試験で有効
であることが証明された。[0006] Each vaccine approach has shown promise in early experiments, and has been most enthusiastically explored for the adsorption or covalent attachment of purified carbohydrate antigens to immunogenic T-dependent protein carriers. Vaccine examples have proven to be effective in clinical trials.

【０００７】 メラノーマ患者に能動免疫によりガングリオシドに対する体液性免疫応答を誘
導することを目的とした研究において、ＧＭ２/カルメット‐ゲラン杆菌（ＢＣ
Ｇ）ワクチンが有効であることが示された（Livingston et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 84: 2911, 1987; Livingston et al., Cancer Res. 49: 4045, 1
989）。手術後、疾患のみられない122人のメラノーマ患者における無作為研究に
おいて、ＢＣＧのみで治療された64人の患者およびＧＭ２/ＢＣＧで治療された5
8人の患者のうち、大多数の患者（86％）は、ＧＭ２ワクチン産生抗体を備えて
いることが示された。抗ＧＭ２抗体を産生する患者は、抗体を産生しない患者よ
りも疾患のみられない間期および生存期間が有意に長かった（Livingston et al
., J. Clin. Oncol. 12: 1036, 1994）。In a study aimed at eliciting a humoral immune response against gangliosides by active immunization in melanoma patients, GM2 / Calmet-Guerin bacilli (BC
G) The vaccine was shown to be effective (Livingston et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 84: 2911, 1987; Livingston et al., Cancer Res. 49: 4045, 1
989). In a randomized study of 122 melanoma patients without disease after surgery, 64 patients treated with BCG alone and 5 treated with GM2 / BCG
Of the eight patients, the majority (86%) were shown to have GM2 vaccine-producing antibodies. Patients producing anti-GM2 antibodies had significantly longer interphase and survival without disease than patients not producing antibodies (Livingston et al.
., J. Clin. Oncol. 12: 1036, 1994).

【０００８】 担体タンパク質Keyhole Limpet Hemocyanin（ＫＬＨ）に共有結合され、アジ
ュバントＱＳ−２１とともに投与されるＧＭ２を含有するワクチンにより、ヒト
において、改善された体液性免疫応答が誘導された。ＱＳ−２１は、南アメリカ
の木Quillaja saponaria Molinaの樹皮から抽出された炭水化物である。これら
一群のサポニンの単糖類の組成、分子量、アジュバント効果、および毒性につい
て記載されている（Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 1, 199
6）。ヒトにおいてＧＭ２およびＫＬＨに対して抗体を誘導するのに最適な充分
な耐量として、100μｇ用量のＱＳ−２１が研究により同定された（Livingston
et al., Vaccine 12: 1275, 1994）。A vaccine containing GM2 covalently linked to the carrier protein Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) and administered with the adjuvant QS-21 induced an improved humoral immune response in humans. QS-21 is a carbohydrate extracted from the bark of the South American tree Quillaja saponaria Molina. The composition, molecular weight, adjuvant effect, and toxicity of these groups of saponin monosaccharides are described (Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 1, 199).
6). Studies have identified a 100 μg dose of QS-21 as a well tolerated dose optimal for inducing antibodies against GM2 and KLH in humans (Livingston
et al., Vaccine 12: 1275, 1994).

【０００９】 ＱＳ−２１アジュバントの存在下でのＧＭ２−ＫＬＨ結合（conjugate）ワク
チンにより、力価が高く生存期間の長い抗ＧＭ２ IgM応答が、メラノーマ患者
で一貫して誘導された（Livingston et al., Cancer Immunol. Immunother. 43:
324, 1997）。治療を受けた患者の大多数において、ワクチンにより抗ＧＭ２
IgG抗体も誘導され、これは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒
介する能力を有している。誘導された抗体は、補体媒介性溶解およびＡＤＣＣを
介して、癌細胞に特異的に結合して死に至らしめることが示された。[0009] The GM2-KLH conjugate vaccine in the presence of the QS-21 adjuvant consistently induced a high titer and long-lived anti-GM2 IgM response in melanoma patients (Livingston et al. , Cancer Immunol. Immunother. 43:
324, 1997). In the majority of treated patients, vaccines
IgG antibodies are also induced, which have the ability to mediate antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). The induced antibodies have been shown to specifically bind to cancer cells and cause death via complement-mediated lysis and ADCC.

【００１０】 ガングリオシドに加えて、他の炭水化物抗原は、適切な担体タンパク質に結合
することにより免疫原性を備えていた。ｂ型インフルエンザ細菌由来の被膜多糖
類の、ジフテリア・トキソイドへのカップリングにより、免疫応答および防御が
有意に増大した（Eskola et al., New England J. Med. 323: 1381, 1990）。こ
の生成物は、脾性機能不全の子供および大人に使用するために、アメリカ食品医
薬品庁（U.S. Food and Drug Administration）により認可されている。同様に
、破傷風トキソイドまたは髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体の何れかに結合した
肺炎球菌の多糖類により、強い体液性免疫応答が子供に誘導された（Kayhty et
al., J. Infect. Dis. 172: 1273, 1995; Anttila et al., J. Infect. Dis., 1
77: 1614, 1998）。更に、Keyhole limpet hemocyaninに結合した合成トンプソ
ン・フリーデンライヒ（Thompson Friedenreich）腫瘍抗原を卵巣癌患者にワク
チン接種をすると、体液性IgMおよびIgG応答が誘導された（MacLean et al., J.
Immunotherapy 11: 292, 1992）。これらの研究に共通の重要は発見は、短期間
のIgM応答から長期持続型の高親和性IgG応答へのアイソタイプ・スイッチであり
、これは、炭水化物に対してＴ細胞依存性経路の活性化が起こったことを示唆し
ている。[0010] In addition to gangliosides, other carbohydrate antigens have become immunogenic by conjugation to appropriate carrier proteins. Coupling of the capsular polysaccharide from influenza b bacteria to diphtheria toxoid significantly increased the immune response and protection (Eskola et al., New England J. Med. 323: 1381, 1990). This product has been approved by the US Food and Drug Administration for use in children and adults with splenic dysfunction. Similarly, pneumococcal polysaccharides bound to either the tetanus toxoid or the outer membrane protein complex of N. meningitidis induced a strong humoral immune response in children (Kayhty et al.
al., J. Infect. Dis. 172: 1273, 1995; Anttila et al., J. Infect. Dis., 1
77: 1614, 1998). In addition, vaccination of ovarian cancer patients with synthetic Thompson Friedenreich tumor antigen conjugated to Keyhole limpet hemocyanin induced humoral IgM and IgG responses (MacLean et al., J. Chem.
Immunotherapy 11: 292, 1992). A common key finding in these studies is the finding of an isotype switch from a short-term IgM response to a long-lasting, high-affinity IgG response, which activates a T-cell dependent pathway for carbohydrates. Suggest what happened.

【００１１】 このアプローチは、炭水化物の代謝および発現が変化したウイルス感染の治療
もしくは予防のための、ガングリオシドおよび他の炭水化物系ワクチンの使用に
今日適用されている。その目的は、疾患細胞と関連のある炭水化物抗原に対する
免疫応答を同様に誘導することである。周知のメカニズムを介して、免疫系によ
り、炭水化物抗原を呈示する感染細胞もしくはウイルスを破壊し、これによりウ
イルス感染を予防するか、好ましくは感染の経路を変えることができる。This approach is currently applied to the use of gangliosides and other carbohydrate-based vaccines for the treatment or prevention of viral infections with altered carbohydrate metabolism and expression. The purpose is to induce an immune response to carbohydrate antigens associated with the diseased cells as well. Through well-known mechanisms, the immune system can destroy infected cells or viruses that present carbohydrate antigens, thereby preventing viral infection or, preferably, altering the route of infection.

【００１２】 抗体は、ウイルスに対する宿主の防御系の重要な構成要素であることが知られ
ている（Klein, Immunology, Blackwell Scientific Publications, Boston, MA
, 1990）。抗体は、ウイルスに結合し、直接的中和、補体媒介性ウイルス溶解（
virolysis）、またはFcレセプター媒介性ファゴサイトーシスによりウイルスの
感染性を除去することができる。更に抗体は、補体媒介性細胞溶解もしくは抗体
依存性細胞媒介性細胞傷害の何れかにより、ウイルス感染細胞を除去することが
できる。宿主細胞抗原のウイルス粒子への取り込みは、充分に確立された現象で
あり、ウイルス感染からの防御は、宿主細胞抗原並びにウイルスにコードされる
抗原に対する免疫学的応答により得られることが更に証明された（Schultz and
Stott, AIDS, 8: [suppl 1]: 5203, 1994）。[0012] Antibodies are known to be an important component of the host defense system against viruses (Klein, Immunology, Blackwell Scientific Publications, Boston, MA).
, 1990). Antibodies bind to the virus and directly neutralize, complement-mediated virus lysis (
virolysis) or Fc receptor-mediated phagocytosis can remove viral infectivity. In addition, antibodies can clear virus-infected cells either by complement-mediated cell lysis or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity. Incorporation of host cell antigens into viral particles is a well-established phenomenon, and it has further been demonstrated that protection from viral infection is obtained by immunological responses to host cell antigens as well as antigens encoded by the virus. (Schultz and
Stott, AIDS, 8: [suppl 1]: 5203, 1994).

【００１３】 同様に、細胞媒介性免疫は、ウイルス感染を制御する際に主要な役割を果たす
ことが知られている。重要なことに、細胞傷害性Ｔリンパ球は、抗原の発現が変
化したウイルス感染細胞を除去することができる。上述のとおり、細胞傷害性Ｔ
リンパ球は、脂質と結合しＣＤ１分子と共同して呈示されるか、あるいはペプチ
ドと結合し主要組織適合性分子と共同して呈示される炭水化物抗原を認識するこ
とができる。[0013] Similarly, cell-mediated immunity is known to play a major role in controlling viral infections. Importantly, cytotoxic T lymphocytes are able to eliminate virus-infected cells with altered antigen expression. As described above, cytotoxic T
Lymphocytes can recognize carbohydrate antigens that bind to lipids and are presented in conjunction with the CD1 molecule, or that bind to peptides and are presented in conjunction with major histocompatibility molecules.

【００１４】 本発明は、患者のウイルス疾患を治療もしくは予防する方法であって、ウイル
ス疾患の間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体を、ウ
イルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量で患者に投与することを含む方
法を提供する。一つの態様において、ウイルス疾患は、ヒト免疫不全ウイルス１
型により引き起こされる。[0014] The present invention is a method of treating or preventing a viral disease in a patient, comprising using a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof overexpressed during the viral disease to treat or prevent a viral disease. A method is provided that comprises administering to the patient an effective amount. In one embodiment, the viral disease is human immunodeficiency virus 1
Triggered by type.

【００１５】 一つの態様において、炭水化物は、ルイス（Lewis）ｙ抗原、ガングリオシド
、またはガングリオシドのオリゴ糖部分である。ガングリオシドには、ＧＭ１、
ＧＭ１ａ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、およびＧＤ２が含まれるがこれらに限定
されない。好ましい態様において、ガングリオシドはＧＭ２、ＧＤ２、またはそ
の組み合わせである。[0015] In one embodiment, the carbohydrate is a Lewis y antigen, a ganglioside, or an oligosaccharide moiety of a ganglioside. Gangliosides include GM1,
GM1a, GM2, GM3, GD1a, and GD2, but are not limited thereto. In a preferred embodiment, the ganglioside is GM2, GD2, or a combination thereof.

【００１６】 一つの態様において、分子類似体は、抗イディオタイプ抗体である。別の態様
において、分子類似体は、ペプチド・ミモトープ（mimotope）である。In one embodiment, the molecular analog is an anti-idiotype antibody. In another embodiment, the molecular analog is a peptide mimotope.

【００１７】 ある態様において、細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体は、適切なア
ジュバントとともに患者に投与される。好ましい態様において、アジュバントは
ＱＳ−２１である。In some embodiments, a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof is administered to a patient with a suitable adjuvant. In a preferred embodiment, the adjuvant is QS-21.

【００１８】 別の態様において、細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体は、免疫抗原
性担体タンパク質に吸着するか、共有結合するか、あるいは結合（conjugate）
する。好ましい態様において、担体タンパク質は、Keyhole Limpet Hemocyanin
である。In another embodiment, the cellular carbohydrate antigen or molecular analog thereof is adsorbed, covalently bound, or conjugated to an immunogenic carrier protein.
I do. In a preferred embodiment, the carrier protein is Keyhole Limpet Hemocyanin
It is.

【００１９】 更に本発明は、患者のウイルス疾患を治療もしくは予防するためのワクチンで
あって、ウイルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量の、ウイルス疾患の
間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体と、薬学的に許
容し得る担体とを含むワクチンを提供する。[0019] The present invention further provides a vaccine for treating or preventing a viral disease in a patient, the cell carbohydrate being overexpressed during the viral disease in an amount effective to treat or prevent the viral disease. A vaccine comprising an antigen or a molecular analog thereof and a pharmaceutically acceptable carrier is provided.

【００２０】 発明の詳細な説明 本発明は、患者のウイルス疾患を治療もしくは予防する方法であって、ウイル
ス疾患の間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体を、ウ
イルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量で患者に投与することを含む方
法を提供する。[0020] The invention relates to a method of treating or preventing a viral disease in a patient, a cellular carbohydrate antigen or the molecule analogs overexpressed during viral diseases, treating a viral disease Alternatively, there is provided a method comprising administering to a patient an amount effective to prevent it.

【００２１】 本発明で使用される分子類似体は、適切な宿主に投与されたときに、細胞性炭
水化物を認識する免疫応答を刺激もしくは増強する化合物と定義される。このよ
うな類似体には、ミモトープ（mimotope）および抗イディオタイプ抗体が含まれ
るがこれらに限定されない。ミモトープは、細胞性炭水化物の免疫抗原性を模倣
したペプチドである。抗イディオタイプ抗体は、抗炭水化物免疫応答を誘導する
目的で、炭水化物抗原を模倣できることが知られている。例えば、「抗イディオ
タイプ抗体ワクチン」と題した米国特許第5,792,455には、ガングリオシドＧＤ
３を模倣した抗イディオタイプ抗体が記載されており、「ＧＤ２抗原を模倣した
抗イディオタイプ抗体」と題した米国特許第5,653,977には、ガングリオシドＧ
Ｄ２抗原に対して反応性の免疫応答を引き出す抗イディオタイプモノクローナル
抗体が記載されている。これら特許の内容は、参照により本出願の開示内容の一
部とする。[0021] Molecular analogs for use in the present invention are defined as compounds that, when administered to a suitable host, stimulate or enhance an immune response that recognizes cellular carbohydrates. Such analogs include, but are not limited to, mimotope and anti-idiotype antibodies. Mimotopes are peptides that mimic the immunogenicity of cellular carbohydrates. It is known that anti-idiotype antibodies can mimic carbohydrate antigens for the purpose of inducing an anti-carbohydrate immune response. For example, U.S. Pat. No. 5,792,455 entitled "Anti-idiotype antibody vaccine" includes ganglioside GD
No. 5,653,977 entitled "Anti-idiotypic antibody mimicking the GD2 antigen", describes ganglioside G.
Anti-idiotypic monoclonal antibodies that elicit an immune response reactive to the D2 antigen have been described. The contents of these patents are incorporated herein by reference.

【００２２】 一つの態様において、細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体は、適切な
アジュバントの存在下で患者に投与される。適切なアジュバントには、ミョウバ
ンとして公知の沈降アルミニウム複塩、ＩＬ−２およびインターフェロンガンマ
などのサイトカイン、titermax、Ribi Detox、およびその他のモノホスホリル脂
質Ａ含有アジュバントなどのブロック共重合体系アジュバント、並びにＱＳ−２
１などのサポニンが含まれる。好ましい態様において、アジュバントはＱＳ−２
１である。In one embodiment, a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof is administered to a patient in the presence of a suitable adjuvant. Suitable adjuvants include precipitated aluminum double salts, known as alum, cytokines such as IL-2 and interferon gamma, block copolymer based adjuvants such as titermax, Ribi Detox, and other monophosphoryl lipid A containing adjuvants, and QS-. 2
1 and the like. In a preferred embodiment, the adjuvant is QS-2
It is one.

【００２３】 一つの態様において、ウイルス疾患は、ヒト免疫不全ウイルス１型により引き
起こされる。In one embodiment, the viral disease is caused by human immunodeficiency virus type 1.

【００２４】 一つの態様において、細胞性炭水化物抗原は、ルイス（Lewis）ｙ抗原、ガン
グリオシド、またはガングリオシドのオリゴ糖部分である。本発明に適用し得る
ガングリオシドには、ＧＭ１、ＧＭ１ａ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、およびＧ
Ｄ２が含まれるがこれらに限定されない。好ましい態様において、ガングリオシ
ドはＧＭ２、ＧＤ２、またはその組み合わせである。In one embodiment, the cellular carbohydrate antigen is a Lewis y antigen, a ganglioside, or an oligosaccharide moiety of a ganglioside. Gangliosides applicable to the present invention include GM1, GM1a, GM2, GM3, GD1a, and G
D2, but not limited thereto. In a preferred embodiment, the ganglioside is GM2, GD2, or a combination thereof.

【００２５】 一つの態様において、細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体は、免疫抗
原性担体タンパク質に吸着するか、共有結合するか、あるいは結合（conjugate
）する。In one embodiment, the cellular carbohydrate antigen or molecular analog thereof is adsorbed, covalently bound, or conjugated to an immunogenic carrier protein.
).

【００２６】 ガングリオシド結合（conjugate）ワクチンについての記載がある。例えば、L
ivingston and Helling,「ガングリオシド−ＫＬＨのＱＳ−２１との結合ワクチ
ン」、特許協力条約（ＰＣＴ）出願番号：ＰＣＴ/ＵＳ９４/００７５７、国際公
開番号：ＷＯ/９４/１６７３１を参照されたい。その内容は、参照により本出願
の開示内容の一部とする。There are descriptions of ganglioside conjugate vaccines. For example, L
See ivingston and Helling, "Vaccines Conjugating Ganglioside-KLH to QS-21", Patent Cooperation Treaty (PCT) Application No .: PCT / US94 / 00757, International Publication No .: WO / 94/16731. The contents of which are incorporated herein by reference.

【００２７】 本発明の好ましい態様において、結合ガングリオシドはＧＭ２、ＧＤ２、また
はその組み合わせである。In a preferred embodiment of the present invention, the binding ganglioside is GM2, GD2, or a combination thereof.

【００２８】 結合ガングリオシドもしくはそのオリゴ糖部分の種々の有効量が、本発明によ
り使用され得る。当業者であれば、簡単な滴定実験を行って、有効な免疫処置に
必要な量を決定することができる。このような滴定実験の一例として、種々の量
の結合ガングリオシドもしくはその結合オリゴ糖部分を、適切なアジュバントと
、あるいはアジュバントなしで患者に注入して、その後免疫応答を検査すること
が挙げられる。[0028] Various effective amounts of the bound ganglioside or oligosaccharide moiety thereof can be used according to the present invention. One skilled in the art can perform simple titration experiments to determine the amount required for effective immunization. One example of such a titration experiment is to inject various amounts of the bound ganglioside or bound oligosaccharide moiety thereof into a patient, with or without an appropriate adjuvant, and then examine the immune response.

【００２９】 一つの態様において、結合ガングリオシドもしくはその結合オリゴ糖部分の有
効量は、約１μｇ〜約500μｇである。In one embodiment, the effective amount of the bound ganglioside or its linked oligosaccharide moiety is from about 1 μg to about 500 μg.

【００３０】 別の態様において、結合ガングリオシドもしくはその結合オリゴ糖部分の有効
量は、約50μｇ〜約90μｇである。一つの態様において、結合ガングリオシドも
しくはその結合オリゴ糖部分の有効量は、約70μｇである。[0030] In another embodiment, the effective amount of the bound ganglioside or the linked oligosaccharide moiety is from about 50 μg to about 90 μg. In one embodiment, the effective amount of a bound ganglioside or a linked oligosaccharide moiety is about 70 μg.

【００３１】 別の態様において、結合ガングリオシドもしくはその結合オリゴ糖部分の有効
量は、約１μｇ〜約10μｇである。特定の態様において、結合ガングリオシドも
しくはその結合オリゴ糖部分の有効量は、約７μｇ〜約10μｇである。一つの態
様において、結合ガングリオシドもしくはその結合オリゴ糖部分の有効量は、約
７μｇである。[0031] In another embodiment, the effective amount of the conjugated ganglioside or conjugated oligosaccharide moiety is from about 1 μg to about 10 μg. In certain embodiments, an effective amount of a bound ganglioside or a linked oligosaccharide moiety thereof is from about 7 μg to about 10 μg. In one embodiment, the effective amount of a bound ganglioside or a linked oligosaccharide moiety is about 7 μg.

【００３２】 更に、アジュバントの有効量も、同様にして、即ち、何れの量が有効であるか
を決めるため種々の量のアジュバントを細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類
似体と投与し、免疫応答を検査することにより決定することができる。アジュバ
ントとしてＱＳ−２１を使用した場合、ＱＳ−２１の有効量も同様に決定するこ
とができる。In addition, an effective amount of an adjuvant may be administered in a similar manner, that is, administering various amounts of the adjuvant with a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof to determine which is effective. It can be determined by inspection. When QS-21 is used as an adjuvant, the effective amount of QS-21 can be determined similarly.

【００３３】 好ましい態様において、ＱＳ−２１の有効量は、約10μｇ〜約200μｇである
。一つの態様において、ＱＳ−２１の有効量は約100μｇである。別の態様にお
いて、ＱＳ−２１の有効量は約200μｇである。In a preferred embodiment, the effective amount of QS-21 is from about 10 μg to about 200 μg. In one embodiment, the effective amount of QS-21 is about 100 μg. In another embodiment, the effective amount of QS-21 is about 200 μg.

【００３４】 好ましい態様において、細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体は、免疫
抗原性タンパク質に結合している。本発明で使用される免疫抗原性タンパク質は
、炭水化物もしくはその分子類似体に結合したときに、患者の炭水化物に対する
免疫応答を刺激もしくは増強するポリペプチドである。別の態様において、免疫
抗原性タンパク質は、Keyhole Limpet Hemocyaninもしくはその誘導体である。
更に本発明は、細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体が、Keyhole Limpet
HemocyaninもしくはKeyhole Limpet Hemocyaninの誘導体に結合した上記ワクチ
ンを提供する。[0034] In a preferred embodiment, the cellular carbohydrate antigen or molecular analog thereof is conjugated to an immunogenic protein. An immunogenic protein used in the present invention is a polypeptide that, when bound to a carbohydrate or a molecular analog thereof, stimulates or enhances the patient's immune response to the carbohydrate. In another embodiment, the immunogenic protein is Keyhole Limpet Hemocyanin or a derivative thereof.
Further, the present invention provides a method for producing a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof, comprising the steps of:
The vaccine is provided which is conjugated to a derivative of Hemocyanin or Keyhole Limpet Hemocyanin.

【００３５】 Keyhole Limpet Hemocyaninは、周知のタンパク質である。Keyhole Limpet He
mocyaninの誘導体は、モノリン脂質Ａ、非イオン系ブロック共重合体、Keyhole
Limpet Hemocyaninに対するサイトカインなどの少なくとも一の免疫学的アジュ
バントの直接結合により作成され得る。サイトカインは、当業者に周知である。
アジュバント特性を備えたサイトカインには、インターロイキン２およびインタ
ーフェロンγが含まれる。Keyhole Limpet Hemocyaninに結合して、Keyhole Lim
pet Hemocyaninの誘導体を形成し得る、当該分野で既知のその他のサイトカイン
も存在する。Keyhole Limpet Hemocyanin is a well-known protein. Keyhole Limpet He
Derivatives of mocyanin are monophospholipid A, nonionic block copolymer, Keyhole
It can be made by direct conjugation of at least one immunological adjuvant, such as a cytokine, to Limpet Hemocyanin. Cytokines are well known to those skilled in the art.
Cytokines with adjuvant properties include interleukin 2 and interferon gamma. Binding to Keyhole Limpet Hemocyanin, Keyhole Lim
There are also other cytokines known in the art that can form derivatives of pet Hemocyanin.

【００３６】 ある態様において、ガングリオシドは、還元的アミノ化、次いでセラミドアル
ケン構造のアルデヒドへの酸化プロセスにより免疫原性タンパク質に結合（conj
ugate）する。別の態様において、ガングリオシドの結合（conjugation）は、Ke
yhole Limpet Hemocyaninのアミノリシル基を介して起こる。In one embodiment, the ganglioside is bound to the immunogenic protein by a process of reductive amination followed by oxidation of the ceramide alkene structure to an aldehyde (conj
ugate). In another embodiment, the conjugation of gangliosides is Ke
It occurs through the aminolysyl group of yhole Limpet Hemocyanin.

【００３７】 本発明において、還元的アミノ化に加えて、種々の他の結合（conjugation）
技術が使用され得る。結合技術には、化学的リンカー基が含まれるが、当該炭水
化物の免疫原性に負の影響を及ぼしてはいけない。In the present invention, in addition to reductive amination, various other conjugations
Techniques can be used. Conjugation techniques include chemical linker groups, but must not negatively affect the immunogenicity of the carbohydrate.

【００３８】 本明細書で使用する適切なアジュバントは、炭水化物もしくはその分子類似体
と共に、あるいは結合した炭水化物もしくは結合したその分子類似体と共に投与
すると、患者の当該炭水化物に対する免疫応答を刺激もしくは増強するアジュバ
ントである。ある態様において、アジュバントはＱＳ−２１である。本発明に適
用可能なその他の既知のアジュバントも存在する。本発明に従って同様に使用さ
れ得る、ＱＳ−２１のクラスもしくはＱＳ−２１様の化学物質が存在し得る。Suitable adjuvants for use herein are adjuvants that, when administered with a carbohydrate or a molecular analog thereof, or a conjugated carbohydrate or a conjugated molecular analog thereof, stimulate or enhance a patient's immune response to the carbohydrate. It is. In some embodiments, the adjuvant is QS-21. There are other known adjuvants applicable to the present invention. There may be QS-21 class or QS-21-like chemicals that may also be used in accordance with the present invention.

【００３９】 更に本発明は、ウイルス疾患を治療もしくは予防するためのワクチンであって
、ウイルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量の、ウイルス感染の間に過
剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体と、薬学的に許容し得
る担体とを含むワクチンを提供する。[0039] The present invention further provides a vaccine for treating or preventing a viral disease, wherein the vaccine comprises an effective amount of a cellular carbohydrate antigen or overexpressed during viral infection to treat or prevent the viral disease. There is provided a vaccine comprising the molecular analog and a pharmaceutically acceptable carrier.

【００４０】 本発明のある態様において、患者はヒトである。In one embodiment of the invention, the patient is a human.

【００４１】 ある態様において、細胞性炭水化物抗原は、ルイス（Lewis）ｙ抗原、ガング
リオシド、またはガングリオシドのオリゴ糖部分である。In some embodiments, the cellular carbohydrate antigen is a Lewis y antigen, a ganglioside, or an oligosaccharide moiety of a ganglioside.

【００４２】 更に本発明は、患者がウイルス疾患に罹患していて、当該ワクチンの投与によ
り患者に引き起こされる免疫応答がウイルス疾患を有効に治療する場合、当該ワ
クチンを投与された患者に対して、ウイルス疾患の間に過剰発現される細胞性炭
水化物抗原を認識する免疫応答を刺激もしくは増大するためのワクチンであって
、患者に抗炭水化物性免疫応答を刺激もしくは増大するのに有効な量の当該炭水
化物もしくはその分子類似体と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含むワクチンを
提供する。Further, the present invention provides a method for treating a viral disease, wherein the patient has a viral disease and the immune response elicited by the administration of the vaccine effectively treats the viral disease. A vaccine for stimulating or increasing an immune response that recognizes a cellular carbohydrate antigen that is overexpressed during a viral disease, wherein the carbohydrate is effective in stimulating or increasing a patient's anti-carbohydrate immune response. Alternatively, a vaccine comprising a molecular analog thereof and a pharmaceutically acceptable excipient is provided.

【００４３】 更に本発明は、患者がウイルス疾患に罹患しやすい状態で、当該ワクチンの投
与により患者に引き起こされる免疫応答がウイルス疾患を有効に予防する場合、
当該ワクチンを投与された患者に対して、ウイルス疾患の間に過剰発現される細
胞性炭水化物抗原を認識する免疫応答を刺激もしくは増大するためのワクチンで
あって、患者に抗炭水化物性免疫応答を刺激もしくは増大するのに有効な量の当
該炭水化物もしくはその分子類似体と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含むワク
チンを提供する。Further, the present invention provides a method for administering a vaccine, wherein the immune response elicited by the patient effectively prevents the viral disease in a state where the patient is susceptible to the viral disease.
A vaccine for stimulating or increasing an immune response that recognizes a cellular carbohydrate antigen that is overexpressed during a viral disease in a patient receiving the vaccine, wherein the vaccine stimulates an anti-carbohydrate immune response in the patient Alternatively, there is provided a vaccine comprising an effective amount to increase the carbohydrate or its molecular analog, and a pharmaceutically acceptable excipient.

【００４４】 更に本発明は、ウイルスもしくはウイルス感染細胞がその表面にガングリオシ
ドを有しているウイルス疾患のためのワクチンを提供する。The invention further provides a vaccine for a viral disease in which the virus or virus-infected cells have gangliosides on their surface.

【００４５】 更に本発明は、患者がウイルス疾患に罹患していて、当該ワクチンの投与によ
り患者に生産される抗体がウイルス疾患を有効に治療する場合、患者の抗体生産
を刺激もしくは増大するのに有効な量の、免疫原性タンパク質に結合したガング
リオシドもしくはそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬学的に許容
し得る賦形剤とを含むワクチンであって、ガングリオシドを認識する抗体の生産
を、当該ワクチンを投与された患者に刺激もしくは増大するのに有効な量のワク
チンを患者に投与することを具備する、ウイルス疾患に罹患している患者のウイ
ルス疾患を治療するための方法を提供する。Further, the present invention provides a method for stimulating or increasing antibody production in a patient when the patient has a viral disease and the antibody produced by the administration of the vaccine effectively treats the viral disease. Production of an antibody comprising an effective amount of a ganglioside or oligosaccharide moiety thereof bound to an immunogenic protein, an effective amount of an adjuvant, and a pharmaceutically acceptable excipient, wherein the vaccine recognizes a ganglioside. Administering to the patient an amount of the vaccine effective to stimulate or augment the patient to which the vaccine has been administered, for treating a viral disease in a patient suffering from the viral disease. I do.

【００４６】 更に本発明は、患者がウイルス疾患に罹患しやすい状態で、当該ワクチンの投
与により患者に生産される抗体がウイルス疾患を有効に予防する場合、患者の抗
体生産を刺激もしくは増大するのに有効な量の、免疫原性タンパク質に結合した
ガングリオシドもしくはそのオリゴ糖部分と、有効量のアジュバントと、薬学的
に許容し得る賦形剤とを含むワクチンであって、ガングリオシドを認識する抗体
の生産を、当該ワクチンを投与された患者に刺激もしくは増大するのに有効な量
のワクチンを患者に投与することを具備する、ウイルス疾患に罹患しやすい患者
のウイルス疾患を予防するための方法を提供する。Further, the present invention provides a method for stimulating or increasing antibody production in a patient in a condition where the patient is susceptible to the viral disease and the antibody produced by the administration of the vaccine effectively prevents the viral disease. A vaccine comprising an effective amount of a ganglioside or oligosaccharide moiety thereof bound to an immunogenic protein, an effective amount of an adjuvant, and a pharmaceutically acceptable excipient, wherein the antibody comprises an antibody that recognizes a ganglioside. Provided is a method for preventing a viral disease in a patient susceptible to the viral disease, comprising administering to the patient an amount of the vaccine effective to stimulate or increase production of the vaccine in the patient. I do.

【００４７】 更に本発明は、ガングリオシドもしくはそのオリゴ糖部分が、Keyhole Limpet
HemocyaninもしくはKeyhole Limpet Hemocyaninの誘導体に結合（conjugate）
した、上記ワクチンを使用する方法を提供する。更に本発明は、アジュバントが
ＱＳ−２１である上記ワクチンを使用する方法を提供する。Further, the present invention relates to a method for preparing a ganglioside or an oligosaccharide portion thereof, which comprises
Conjugate to derivative of Hemocyanin or Keyhole Limpet Hemocyanin
And a method of using the above vaccine. The invention further provides a method of using the above vaccine wherein the adjuvant is QS-21.

【００４８】 更に本発明は、ウイルスもしくはウイルス感染細胞が、その表面上にガングリ
オシドを有するウイルス疾患を治療もしくは予防するための上記ワクチンを使用
する方法を提供する。The present invention further provides a method of using the above vaccine for treating or preventing a viral disease in which a virus or a virus-infected cell has gangliosides on its surface.

【００４９】 本発明の目的において、「薬学的に許容し得る賦形剤」は、任意の標準的な薬
学的賦形剤を意味する。適切な賦形剤の例は、当該分野で周知であり、リン酸塩
緩衝液、Polysorb 80を含有するリン酸塩緩衝液、水、油/水エマルジョン等のエ
マルジョン、および種々のタイプの湿潤剤などの任意の標準的な薬学的賦形剤を
含み得るが、これらに限定されない。[0049] For the purposes of the present invention, "pharmaceutically acceptable excipient" means any standard pharmaceutical excipient. Examples of suitable excipients are well known in the art and include phosphate buffers, phosphate buffers containing Polysorb 80, water, emulsions such as oil / water emulsions, and various types of wetting agents. And any standard pharmaceutical excipient such as, but not limited to.

【００５０】 本発明のワクチンは、皮内、皮下、および筋内に投与され得る。当業者に周知
の他の方法を使用してもよい。The vaccine of the present invention can be administered intradermally, subcutaneously, and intramuscularly. Other methods known to those skilled in the art may be used.

【００５１】 好ましい態様において、本発明は、患者の抗体生産を刺激もしくは増大するの
に有効な量の免疫原性タンパク質に結合したガングリオシドもしくはそのオリゴ
糖部分と、有効量のアジュバントと、薬学的に許容し得る賦形剤とを含むワクチ
ンであって、ガングリオシドを認識する抗体の生産を、当該ワクチンを投与され
た患者に刺激もしくは増大するのに有効な量のワクチンを患者に投与することを
具備し、当該投与が２箇所以上の部位に有効量を投与することを含む、ガングリ
オシドを認識する抗体の生産を患者に刺激もしくは増大するための方法を提供す
る。「２箇所以上の部位に有効量を投与する」とは、有効量を２以上の部分に分
割し、各部分を患者の異なる部位に投与することを意味する。特定の態様におい
て、当該投与は３つの部位に投与することを含む。In a preferred embodiment, the present invention provides a method for administering a ganglioside or oligosaccharide moiety thereof conjugated to an immunogenic protein in an amount effective to stimulate or increase antibody production in a patient, an effective amount of an adjuvant, A vaccine comprising an acceptable excipient comprising administering to the patient an amount of the vaccine effective to stimulate or increase the production of antibodies that recognize gangliosides to the patient to whom the vaccine has been administered. Thus, there is provided a method for stimulating or increasing the production of an antibody recognizing a ganglioside in a patient, which administration comprises administering an effective amount to two or more sites. "Administering an effective amount to two or more sites" means that the effective amount is divided into two or more portions and each portion is administered to a different site in the patient. In certain embodiments, the administering comprises administering to three sites.

【００５２】 本発明は、下記の実験の詳細な説明から更に理解されるでしょう。しかし当業
者であれば、議論されている特定の方法および結果が、下記の特許請求の範囲に
完全に記載される本発明を単に説明するものであることが容易に理解されるでし
ょう。The present invention will be further understood from the following detailed description of experiments. However, one of ordinary skill in the art will readily appreciate that the specific methods and results discussed are merely illustrative of the invention as fully set forth in the following claims.

【００５３】 実験の詳細な説明 ＨＩＶ−１感染細胞に結合する抗体のフローサイトメトリー解析 約10⁶ ＨＩＶ感染細胞もしくはコントロール細胞を、まず約50μＬの抗炭水
化物抗体（〜５μｇ/ｍＬ）を用いて、約20分間、４℃で、ＰＢＳ/１％ ＦＢＳ
/0.1％ アッセイ緩衝液で洗ったアジ化ナトリウム（アッセイ緩衝液）中で染色
し、次いで、20分間、４℃で、フィコエリトリン結合レポーター抗体で染色する
。細胞をアッセイ緩衝液で洗い、４℃で一晩、ＰＢＳ/１％ ＦＢＳ/１％ ホル
ムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターで解析する。ＧＤ２−およびＧＭ
２−陽性メラノーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−３１は、抗ＧＭ２抗体および抗ＧＤ２
抗体を用いたアッセイにおいて、ポジティブ・コントロールとして使用すること
ができる。Detailed Description of the Experiment Flow Cytometry Analysis of Antibodies that Bind to HIV-1 Infected Cells About 10 ⁶ HIV infected cells or control cells were first purified using about 50 μL of anti-carbohydrate antibody (〜5 μg / mL). Approximately 20 minutes at 4 ° C in PBS / 1% FBS
Stain in sodium azide (assay buffer) washed with /0.1% assay buffer, then stain with phycoerythrin binding reporter antibody for 20 minutes at 4 ° C. The cells are washed with assay buffer, fixed at 4 ° C. overnight with PBS / 1% FBS / 1% formaldehyde and analyzed on a flow cytometer. GD2- and GM
The 2-positive melanoma cell line SK-MEL-31 contains anti-GM2 antibodies and anti-GD2
In an assay using an antibody, it can be used as a positive control.

【００５４】 抗体は、モノクローナル抗体、精製された超免疫イムノグロブリン、または高
レベルの炭水化物反応性抗体を含有することが既知の、天然産生もしくは能動免
疫法により誘導されたヒトもしくは動物血清の何れであってもよい。ＨＩＶ−１
感染細胞は、ＨＩＶ−１感染適格細胞系またはフィトヘマグルチニン刺激性ヒト
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の何れでもよい。ＨＩＶ−１ウイルスは、実験室
適合Ｘ４ウイルスおよび一次Ｒ５、Ｘ４、およびＲ５Ｘ４単離物を含んでいても
よい。Antibodies can be either monoclonal antibodies, purified hyperimmune immunoglobulins, or human or animal sera derived from naturally occurring or active immunization methods known to contain high levels of carbohydrate-reactive antibodies. There may be. HIV-1
The infected cells can be either HIV-1 infected cell lines or phytohemagglutinin-stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). HIV-1 viruses may include laboratory compatible X4 viruses and primary R5, X4, and R5X4 isolates.

【００５５】 ＨＩＶ−１感染細胞の補体媒介性溶解 補体を介した細胞毒性アッセイは、４時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイにより行われ
る。２×10⁶細胞を、100μCi Na₂ ⁵¹CrO₄（New England Nuclear, Boston, MA）
を用いて、ＣＯ₂インキュベーター内で37℃で１時間、10％ＦＣＳ ＲＰＭＩ中
で標識する。細胞を２回洗い、96ウェル丸底プレート（Corning, New York, NY
）内の10⁴細胞/ウェルを標識し、ＣＯ₂インキュベーター内で37℃で１時間、血
清、抗体と、もしくは培養液のみとインキュベートする。細胞を洗い、37℃で４
時間、１：４の希釈でヒト補体（Sigma）とインキュベートする。プレートを500
ｇで５分間回転させ、各ウェルの上清の一部125μＬを、放出された⁵¹Ｃｒを測
定するために収集する。全てのアッセイは、３回行い、１％ ＮＰ−４０（Sigm
a）の最大放出、および補体なしでの自然放出についてのコントロール・ウェル
を含む。ＧＤ２−およびＧＭ２−ポジティブメラノーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−３
１は、抗ＧＭ２抗体および抗ＧＤ２抗体を用いたアッセイにおいて、ポジティブ
・コントロールのターゲット細胞として使用することができる。 Complement-mediated cytolytic assay of HIV-1-infected cells via complement lysis is performed by a 4 hour ⁵¹ Cr release assay. 2 × 10 ⁶ cells were transferred to 100 μCi Na ₂ ⁵¹ CrO ₄ (New England Nuclear, Boston, Mass.)
And labeling in 10% FCS RPMI for 1 hour at 37 ° C. in a CO ₂ incubator. The cells were washed twice and 96-well round bottom plates (Corning, New York, NY
) Were labeled with 10 ⁴ cells / well in 1 hour at 37 ° C. in a CO ₂ incubator and incubated serum, an antibody, or culture medium only. Wash cells, 4 at 37 ° C
Incubate with human complement (Sigma) at a 1: 4 dilution for a time. 500 plates
Spin at g for 5 minutes and collect a 125 μL aliquot of the supernatant from each well for measurement of released ⁵¹ Cr. All assays were performed in triplicate and 1% NP-40 (Sigm
Includes control wells for maximum release of a) and spontaneous release without complement. GD2- and GM2-positive melanoma cell lines SK-MEL-3
1 can be used as a positive control target cell in an assay using an anti-GM2 antibody and an anti-GD2 antibody.

【００５６】 ある溶解のパーセンテージは、以下のとおり計算される： ％細胞毒性＝（実験の放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×100The percentage of lysis is calculated as follows:% cytotoxicity = (experimental release−spontaneous release) / (maximum release−spontaneous release) × 100

【００５７】 抗体は、モノクローナル抗体、精製された超免疫イムノグロブリン、または高
レベルの炭水化物反応性抗体を含有することが既知の、天然産生もしくは能動免
疫法により誘導されたヒトもしくは動物血清の何れであってもよい。ＨＩＶ−１
感染細胞は、ＨＩＶ−１感染適格細胞系またはＰＢＭＣの何れでもよい。ＨＩＶ
−１ウイルスは、実験室適合Ｘ４ウイルスおよび一次Ｒ５、Ｘ４、およびＲ５Ｘ
４単離物を含んでいてもよい。Antibodies can be either monoclonal antibodies, purified hyperimmune immunoglobulins, or human or animal sera derived from naturally occurring or active immunization methods known to contain high levels of carbohydrate-reactive antibodies. There may be. HIV-1
The infected cells can be any of the HIV-1 infected cell lines or PBMCs. HIV
-1 virus is a laboratory compatible X4 virus and primary R5, X4, and R5X
4 isolates.

【００５８】 抗炭水化物抗体依存性細胞を介した細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイ ＰＭＢＣを、４×10⁶細胞/ｍＬの濃度で、熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ
培養液（アッセイ培養液）中に懸濁する。次いで、これらの細胞をＡＤＣＣアッ
セイでエフェクターとして使用する前に、一晩37℃でインキュベートする。翌日
、ターゲット細胞を、アッセイでの使用に先立って、Na₂ ⁵¹CrO₄（２×10⁶細胞に
対して100μCi）を用いて、約３時間、ＲＰＭＩ 1640アッセイ培養液中で標識
する。各ウェルにおいて、10⁴個の⁵¹Cr標識されたターゲット細胞を、種々の希
釈の血清もしくは濃度の抗体と、150μＬの全アッセイ体積で、37℃で30分間プ
レインキュベートする。次に、10⁶ＰＢＭＣを50μＬアッセイ培養液に添加し、
プレートを300ｇで５分間遠心分離し、37℃で４時間インキュベートする。次い
で、プレートを300ｇで遠心分離し、細胞上清の一部100μＬを収集する。⁵¹Crの
放出を、Wallac 1470ガンマカウンターを用いて検出する。 Anti-Carbohydrate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Assay PMBC was assayed at a concentration of 4 × 10 ⁶ cells / mL with RPMI supplemented with heat-inactivated FBS.
Suspend in culture solution (assay culture solution). These cells are then incubated at 37 ° C. overnight before using them as effectors in the ADCC assay. The next day, target cells are labeled with Na ₂ ⁵¹ CrO ₄ (100 μCi for 2 × 10 ⁶ cells) in RPMI 1640 assay medium for about 3 hours prior to use in the assay. In each well, 10 ^{4 51} Cr-labeled target cells, and the antibodies of the serum or concentration of various dilutions in total assay volume of 150 [mu] L, preincubated for 30 minutes at 37 ° C.. Next, 10 ⁶ PBMC was added to the 50 μL assay culture,
The plate is centrifuged at 300g for 5 minutes and incubated at 37 ° C for 4 hours. The plate is then centrifuged at 300 g and a portion of 100 μL of the cell supernatant is collected. Release of ⁵¹ Cr is detected using a Wallac 1470 gamma counter.

【００５９】 全てのアッセイは、３回行い、１％ ＮＰ−４０（Sigma）の最大放出、およ
び補体なしでの自然放出についてのコントロール・ウェルを含む。All assays are performed in triplicate and include control wells for maximal release of 1% NP-40 (Sigma) and spontaneous release without complement.

【００６０】 ある溶解のパーセンテージは、以下のとおり計算される： ％細胞毒性＝（実験の放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×100The percentage of lysis is calculated as follows:% cytotoxicity = (experimental release−spontaneous release) / (maximum release−spontaneous release) × 100

【００６１】 抗体は、モノクローナル抗体、精製された超免疫イムノグロブリン、または高
レベルの炭水化物反応性抗体を含有することが既知の、天然産生もしくは能動免
疫法により誘導されたヒトもしくは動物血清の何れであってもよい。ＨＩＶ−１
感染細胞は、ＨＩＶ−１感染適格細胞系またはＰＢＭＣの何れでもよい。ＨＩＶ
−１ウイルスは、実験室適合Ｘ４ウイルスおよび一次Ｒ５、Ｘ４、およびＲ５Ｘ
４単離物を含んでいてもよい。ＧＤ２−およびＧＭ２−ポジティブメラノーマ細
胞系ＳＫ−ＭＥＬ−３１は、抗ＧＭ２抗体および抗ＧＤ２抗体を用いたアッセイ
において、ポジティブ・コントロールのターゲット細胞として使用することがで
きる。Antibodies can be monoclonal antibodies, purified hyperimmune immunoglobulins, or human or animal sera derived from naturally occurring or active immunization methods known to contain high levels of carbohydrate-reactive antibodies. There may be. HIV-1
The infected cells can be any of the HIV-1 infected cell lines or PBMCs. HIV
-1 virus is a laboratory compatible X4 virus and primary R5, X4, and R5X
4 isolates. The GD2- and GM2-positive melanoma cell lines SK-MEL-31 can be used as positive control target cells in assays using anti-GM2 and anti-GD2 antibodies.

【００６２】 ＨＩＶ−１中和アッセイ ウイルス中和は、指示細胞としてフィトヘマグルチニン刺激性ＰＢＭＣを用い
、終点としてｐ24抗原の産生を測定して評価する。洗浄によりマイトジェンを除
去する前に、ＰＢＭＣをＰＨＡで48時間刺激する。抗体を、２倍の連続希釈でウ
イルスおよび/または細胞と１時間37℃で結合させる。次いで、ウイルスを４×1
0⁶/ｍＬの濃度でＰＢＭＣに添加し、その培養物を７日間インキュベートする。
その培養物の上清を収集し、ＥＬＩＳＡによりｐ24濃度を測定する前に、１％ E
mpigen洗浄剤で処理する。Leu 3a ＨＩＶ−１抑制性モノクローナル抗体（Becto
n Dickinson）は、ポジティブ・コントロールとして使用することができる。 HIV-1 Neutralization Assay Virus neutralization is evaluated by using phytohemagglutinin-stimulated PBMC as the indicator cell and measuring the production of p24 antigen as the endpoint. PBMCs are stimulated with PHA for 48 hours before mitogen is removed by washing. The antibodies are allowed to bind to the virus and / or cells in two-fold serial dilutions for 1 hour at 37 ° C. Then the virus was added 4 × 1
0 was added at a concentration of ⁶ / mL in PBMC, incubating the culture for 7 days.
The supernatant of the culture was collected and 1% E before the determination of p24 concentration by ELISA.
Treat with mpigen detergent. Leu 3a HIV-1 inhibitory monoclonal antibody (Becto
n Dickinson) can be used as a positive control.

【００６３】 抗体は、モノクローナル抗体、精製された超免疫イムノグロブリン、または高
レベルの炭水化物反応性抗体を含有することが既知の、天然産生もしくは能動免
疫法により誘導されたヒトもしくは動物血清の何れであってもよい。ＨＩＶ−１
ウイルスは、実験室適合Ｘ４ウイルスおよび一次Ｒ５、Ｘ４、およびＲ５Ｘ４単
離物を含んでいてもよい。Antibodies can be monoclonal antibodies, purified hyperimmune immunoglobulins, or human or animal sera derived from naturally occurring or active immunization methods known to contain high levels of carbohydrate-reactive antibodies. There may be. HIV-1
Viruses may include laboratory compatible X4 viruses and primary R5, X4, and R5X4 isolates.

【００６４】 臨床グレードのガングリオシド結合ワクチンの調製 化学的性質および製造 薬物 ［名称および入手源］ 固有名： ＧＭ２−ＫＬＨ 化学名： １１³NeuAc-GgOse₃Cer-keyhole limpet hemocyanin（KLH）Preparation of Clinical Grade Ganglioside-Conjugated Vaccine Chemical Properties and Manufacturing Drug [Name and Source] Specific name: GM2-KLH Chemical name: 11 ³ NeuAc-GgOse ₃ Cer-keyhole limpet hemocyanin (KLH)

【００６５】 製造者：Progenics Pharmaceuticals, Inc., 777 Old Saw Mill River Road,
Tarrytown, New York 10591, United States of AmericaManufacturer: Progenics Pharmaceuticals, Inc., 777 Old Saw Mill River Road,
Tarrytown, New York 10591, United States of America

【００６６】 ［ＧＭ２の調製に使用した原料］原料 供給先 グレード アセトン ＢＤＨ ＡＣＳ アンモニア溶液 ＢＤＨ ＡＣＳ クロロホルム ＢＤＨ ＡＣＳ エタノール Commercial Alcohol Ltd. - - - エチルエーテル ＢＤＨ ＡＣＳ メタノール ＢＤＨ ＡＣＳ ２−プロパノール Fisher UN1219 ＡＣＳ 水 Travanol洗浄用滅菌水 塩化カルシウム Fisher 認証(Certified) （無水−20メッシュ顆粒） 硫化ジメチル Aldrich 99％ ＋ ＧＭ２ Fidia - - - 酸素 Linde UN1072 ＵＳＰ シリカゲル E Merck Kieselgel 60H Art 7736 シアノホウ化水素 Aldrich 95％純粋 ナトリウム ＴＬＣプレート E Merck Kieselgel 60H F254[Raw Materials Used for Preparing GM2] Raw material destination grade acetone BDH ACS ammonia solution BDH ACS chloroform BDH ACS ethanol Commercial Alcohol Ltd.---Ethyl ether BDH ACS methanol BDH ACS 2-propanol Fisher UN1219 ACS Water washing with Travanol Sterile water for use Calcium chloride Fisher Certified (anhydrous-20 mesh granules) Dimethyl sulfide Aldrich 99% + GM2 Fidia---Oxygen Linde UN1072 USP silica gel E Merck Kieselgel 60H Art 7736 Hydrogen cyanoborohydride Aldrich 95% pure sodium TLC plate E Merck Kieselgel 60H F254

【００６７】 ［結合(conjugation)法に使用した原料］原料 供給先 グレード Keyhole limpet hemocyanin Perimmune, Inc. ＵＳＰ （KLH） Rockville, MD デオキシコール酸、ナトリウム塩 Aldrich 分析(Analytical) （DOC）（一水塩）98％ エチレンジアミン四酢酸 Aldrich ＡＣＳ オルトリン酸水素二ナトリウム ＢＤＨ 分析 （無水）（Na₂HPO₄） 塩化ナトリウム（NaCl） ＢＤＨ 分析 オルトリン酸二水素カリウム ＢＤＨ 分析 （KH₂PO₄） 水酸化ナトリウム（NaOH） ＢＤＨ 分析 トリス(ヒドロキシメチル)アミノ Sigman ――― メタンヒドロクロライド シアノホウ化水素ナトリウム Aldrich ――― （NaBH₃CN） セファロース CL-4B Pharmacia ――― 窒素ガス（濾過） Medigas ――― ＧＭ２アルデヒド Progenics ―――[Raw Materials Used for Conjugation Method] Raw material supplier grade Keyhole limpet hemocyanin Perimmune, Inc. USP (KLH) Rockville, MD Deoxycholic acid, sodium salt Aldrich Analysis (DOC) (monohydrate) ) 98% ethylenediaminetetraacetic acid Aldrich ACS Disodium hydrogen orthophosphate BDH analysis (anhydrous) (Na ₂ HPO ₄ ) Sodium chloride (NaCl) BDH analysis Potassium dihydrogen orthophosphate BDH analysis (KH ₂ PO ₄ ) Sodium hydroxide (NaOH) BDH analysis Tris (hydroxymethyl) amino Sigman ――― Methanehydrochloride Sodium cyanoborohydride Aldrich ――― (NaBH ₃ CN) Sepharose CL-4B Pharmacia ――― Nitrogen gas (filtration) Medigas ――― GM2 aldehyde Progenics ― ―

【００６８】 ［展開(development)化学的性質］ ＧＭ２およびＧＭ２アルデヒドに関するデータ： ＧＭ２およびＧＭ２アルデヒドの構造は、¹Ｈ ＮＭＲスペクトロスコピー、薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＦＡＢ−ＭＳ、およびＦＴ−ＩＲにより特性
決定した。構造式 分子式 分子量 ＧＭ２−ガングリオシド （化合物＃１） GalNAｃB1−4GaLB1−4GlcB1− Ｃ₆₇Ｈ₁₂₁Ｏ₂₆Ｎ₃ Ｍ−１＝1382 固形 1CerNeu5Aca2 I³NeuAc−GgOse₃Cer Ｃ₆₉Ｈ₁₂₅Ｏ₂₆Ｎ₃ Ｍ−１＝1410 （酸） ＴＬＣ： Rf＝0.21（65：35：8 CHCL₃−CH₃OH−H₂O） Rf＝0.60（5：4：1 CHCL₃−CH₃OH−0.2％CaCl₂水溶液） Rf＝0.2（7：1：1 (CH₃)₂CHOH−NH₄OH−H₂O）Development chemistry Data for GM2 and GM2 aldehyde: The structure of GM2 and GM2 aldehyde was determined by ¹ H NMR spectroscopy, thin layer chromatography (TLC), FAB-MS, and FT-IR. Characterized. Structure Molecular formula Molecular weight GM2- ganglioside (compound _{# 1) GalNAcB1-4GaLB1-4GlcB1- C 67 H 121} O 26 N 3 M-1 = 1382 Solid _{^{1CerNeu5Aca2 I 3 NeuAc-GgOse 3 Cer}} C 69 H 125 O 26 N 3 M- 1 = 1410 (acid) TLC: Rf = 0.21 (65: 35: 8 CHCL ₃ —CH ₃ OH—H ₂ O) Rf = 0.60 (5: 4: 1 CHCL ₃ —CH ₃ OH—0.2% CaCl ₂ aqueous solution) Rf = 0.2 (7: 1: 1 (CH 3) 2 CHOH-NH 4 OH-H 2 O)

【００６９】構造式 分子式 分子量 物理化学的性質 ＧＭ２−アルデヒド Ｃ₅₃Ｈ₉₃Ｏ₂₇Ｎ₃ 1204.29 クリームホワイト、無 臭、 （化合物＃２） 非晶質固体[0069] Structure Molecular formula Molecular weight physicochemical properties GM2- aldehyde _{C 53 H 93 O 27 N 3} 1204.29 Cream White, no odor, (Compound # 2) an amorphous solid

【００７０】構造データ ¹ H (DMSO-d₆:D₂)δ:9.48(d,1H,J=2,0Hz), 4.79(d,1H,J=8.5Hz,III-1), 4.26(d,1
H,J=8.0Hz,II-1), 4.19(d,1H,J=8,0Hz,I-1), 2.54(dd,1H,A-3e), 1.88(s,3H,Ac)
, 1.78(s,3H,Ac), 0.85(t,3H,J=6.6Hz,CH₃). FT-IR(KBr Cast,CM^-1)：3439,3420,2952,2923,2851,1634,1070（おそらくgem di
ol） TLC Rf=0.5（5：4：1 CHCL₃−CH₃OH−0.2％CaCl₂水溶液） Structure data ¹ H (DMSO-d ₆ : D ₂ ) δ: 9.48 (d, 1 H, J = 2, 0 Hz), 4.79 (d, 1 H, J = 8.5 Hz, III-1), 4.26 (d , 1
H, J = 8.0Hz, II-1), 4.19 (d, 1H, J = 8,0Hz, I-1), 2.54 (dd, 1H, A-3e), 1.88 (s, 3H, Ac)
, 1.78 (s, 3H, Ac), 0.85 (t, 3H, J = 6.6Hz, CH ₃ ). FT-IR (KBr Cast, CM ^-1 ): 3439,3420,2952,2923,2851,1634,1070 (Probably gem di
ol) TLC Rf = 0.5 (5 : 4: 1 CHCL 3 -CH 3 OH-0.2% CaCl 2 solution)

【００７１】ＫＬＨおよびＧＭ２−ＫＬＨに関するデータ： Keyhole limpet hemocyanin（ＫＬＨ）は、多数の低分子サブユニットから構
成される大きくて複雑なタンパク質である。ＫＬＨは、Keyhole limpet mollusk
（Megathura crenulata）から抽出、精製される。 Data for KLH and GM2-KLH: Keyhole limpet hemocyanin (KLH) is a large and complex protein composed of a number of small subunits. KLH is Keyhole limpet mollusk
(Megathura crenulata).

【００７２】 化合物 セファロース CL-4B 等電点電気泳動 レゾルシノール−ゲル クロマトグラフィー （等電点） ＨＣｌ 分子量（ダルトン） ＧＭ２モル/蛋白質モ ル ＫＬＨ 全分子(2)：＞2×10⁶ マルチバンド サブユニット：2-7×10⁵ pH 4.65〜pH 6 GM2-KLH 全分子(2)：＞2×10⁶ マルチバンド 200−1400 サブユニット：2-7×10⁵ pH 4.65〜pH 6 Compound Sepharose CL-4B isoelectric focusing resorcinol-gel chromatography (isoelectric point) HCl molecular weight (Daltons) GM2 mol / protein mol KLH Total molecule (2):> 2 × 10 ⁶ multi-band subunit: 2-7 × 10 ⁵ pH 4.65 to pH 6 GM2-KLH Total molecule (2):> 2 × 10 ⁶ Multiband 200-1400 Subunit: 2-7 × 10 ⁵ pH 4.65 to pH 6

【００７３】ＧＭ２−ＫＬＨ製造フローチャート ステップ１−ＧＭ２の精製： ＧＭ２（ＦＩＤＩＡ） ↓ シリカゲルカラムクロマトグラフィー １．65：35 クロロホルム−メタノール ２．65：35：4 クロロホルム−メタノール−水 ↓ 製造過程ＱＣ １．ＴＬＣ ↓ ステップ２−ＧＭ２アルデヒド（化合物＃２）の合成： ＧＭ２（化合物＃１） ↓ （１）Ｏ₃、ＭｅＯＨ ↓ （２）ＣＨ₃ＳＣＨ₃ ↓ ＧＭ２アルデヒド（化合物＃２、gem diol） ↓ 製造過程のテスト： １．ＴＬＣ ↓ ステップ３−ＧＭ２アルデヒドのＫＬＨへの結合： 発熱物質フリーの無菌ＫＬＨ ↓ 4:1(w/w)の比率でＫＬＨをＧＭ２アルデヒドに添加する ↓ 室温で３分間振盪しながらインキュベートする ↓ 1:1(w/w)の比率でNaBH₃CNをＧＭ２アルデヒド/ＫＬＨ混合物に添加する ↓ 反応混合物を室温で一晩、次いで40℃で４日間穏やかに攪拌する ↓ ステップ４−前記結合物（conjugate）のダイアフィルトレーション（diafiltra
tion） 結合物を以下のものに対してダイアフィルトレーションする： −ＰＢＳ ｐＨ7.5 −ＴＲＩＳ/ＥＤＴＡ ｐＨ7.75 −ＴＲＩＳ/ＥＤＴＡ/0.05％ ＤＯＣ ｐＨ7.75 −ＴＲＩＳ/ＥＤＴＡ ｐＨ7.5 ＰＢＳ ｐＨ7.5 結合物をAmicon濾過ユニットから無菌的に取り出す ↓ 遠心分離する ↓ 結合物を無菌濾過する 製造過程のＱＣテスト： １．BioRadタンパク質アッセイ ２．セファロースゲル濾過 ３．等電点電気泳動（ＩＥＦ） ↓ 結合物の濃度を１mg/mLに無菌的に調整する ↓ 結合物を１mLの発熱物質フリー滅菌バイアルに注入し、２〜８℃で保存する ↓ 最終ＱＣテスト： １．酵素免疫法（ＥＩＡ） ２．ＬＡＬ発熱物質アッセイ ３．BioRadタンパク質アッセイ ４．レゾルシノール−ＨＣｌアッセイ ５．ウサギ発熱物質テスト ６．一般的な安全テスト ７．無菌テスト ８．シアン化物に対する不純物テスト GM2-KLH Production Flowchart Step 1—Purification of GM2 : GM2 (FIDIA) ↓ Silica gel column chromatography 1.65: 35 chloroform-methanol 2.65: 35: 4 chloroform-methanol-water ↓ Production process QC TLC ↓ Step 2-Synthesis of GM2 aldehyde (Compound # 2): GM2 (Compound # 1) ↓ (1) O ₃ , MeOH ↓ (2) CH ₃ SCH ₃ ↓ GM2 aldehyde (Compound # 2, gem diol) ↓ Production Testing the process: TLC ↓ Step 3-Binding of GM2 aldehyde to KLH: Sterile pyrogen free KLH ↓ Add KLH to GM2 aldehyde in a ratio of 4: 1 (w / w) ↓ Incubate with shaking at room temperature for 3 minutes ↓ 1 Add NaBH ₃ CN to the GM2 aldehyde / KLH mixture at a ratio of 1: 1 (w / w) ↓ Stir the reaction mixture overnight at room temperature and then gently for 4 days at 40 ° C. ↓ Step 4-Conjugate Diafiltra
diafiltration of the conjugate against:-PBS pH 7.5-TRIS / EDTA pH 7.75-TRIS / EDTA / 0.05% DOC pH 7.75-TRIS / EDTA pH 7.5 PBS pH 7. 5 Aseptically remove the conjugate from the Amicon filtration unit ↓ Centrifuge ↓ Sterile filter the conjugate QC test during production: BioRad protein assay 2. 2. Sepharose gel filtration Isoelectric focusing (IEF) ↓ Aseptically adjust the concentration of the conjugate to 1 mg / mL ↓ Inject the conjugate into a 1 mL pyrogen-free sterile vial and store at 2-8 ° C ↓ Final QC test: 1. 1. Enzyme immunoassay (EIA) 2. LAL pyrogen assay BioRad protein assay 4. Resorcinol-HCl assay Rabbit pyrogen test 6. General safety test 7. Sterility test Impurity test for cyanide

【００７４】 ＧＭ２−ＫＬＨ結合物の製造方法 ＧＭ２−ＫＬＨ結合物の製造は、４ステップで行われる： １．購入（incoming）ＧＭ２（ウシ由来）の精製（化合物＃１） ２．ＧＭ２アルデヒドの合成（化合物＃２） ３．ＧＭ２アルデヒドのＫＬＨへの結合 ４．結合物のダイアフィルトレーションMethod for Producing GM2-KLH Conjugate The production of GM2-KLH conjugate is performed in four steps: 1. Purification of incoming GM2 (from bovine) (compound # 1) 2. Synthesis of GM2 aldehyde (Compound # 2) 3. Binding of GM2 aldehyde to KLH Diafiltration of conjugate

【００７５】 ステップ１：ＧＭ２の精製（化合物＃１） 名称：ＧＭ２ガングリオシド 略称：II³NeuAc−GgOse₃CerStep 1: Purification of GM2 (Compound # 1) Name: GM2 ganglioside Abbreviation: II ³ NeuAc-GgOse ₃ Cer

【００７６】 出発物質であるＧＭ２ガングリオシド（ウシ由来）は、ＦＩＤＩＡにより供給
される。全てのガラス製品は、蒸留アセトン、次いで蒸留エタノールで洗い、使
用前に18時間乾燥（130℃）させた。シリカゲル（30.5ｇ, Kieselgel 60H, Art
7736, E. Merck）のカラム（Michel−Miller S 795-10）を、溶媒として65：35
クロロホルム：メタノールを用いて75 psi（SSI Model 300 Lo pump）で充填
する。ＧＭ２(200 mg)を、65：35 クロロホルム：メタノール濃縮溶液として添
加し、この溶媒で、次いで65：35：4 クロロホルム−メタノール−水で溶出を
行う。分画をＴＬＣにより分析する（Ｒｆ 0.6、５：４：１ クロロホルム−
メタノール−0.2％ CaCl₂水溶液）。ＧＭ２含有分画を集め蒸発させて、クリー
ムホワイトの非晶質固体を得る。The starting material GM2 ganglioside (from bovine) is supplied by FIDIA. All glassware was washed with distilled acetone and then with ethanol and dried (130 ° C.) for 18 hours before use. Silica gel (30.5g, Kieselgel 60H, Art
7736, E. Merck) (Michel-Miller S 795-10) using 65:35 as solvent.
Fill with chloroform: methanol at 75 psi (SSI Model 300 Lo pump). GM2 (200 mg) is added as a concentrated solution of 65:35 chloroform: methanol and eluted with this solvent followed by 65: 35: 4 chloroform-methanol-water. The fractions are analyzed by TLC (Rf 0.6, 5: 4: 1 chloroform-
Methanol-0.2% CaCl ₂ aqueous solution). The GM2 containing fractions are collected and evaporated to give a cream white amorphous solid.

【００７７】 この原料（化合物＃１）についての製造過程のテストには、このガングリオシ
ドの同一性および純度を確認するため、¹Ｈ ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）が含まれる。製造過程のテスト結果は、展開(developmental)化
学的性質に記載された詳細を満たしていなければならない。この原料が純粋でな
いと分かった場合、上記精製を繰り返す。In-process tests for this material (Compound # 1) include ¹ H NMR and thin layer chromatography (TLC) to confirm the identity and purity of the ganglioside. In-process test results must meet the details described in the development chemistry. If this material is found to be impure, the above purification is repeated.

【００７８】 ステップ２：ＧＭ２アルデヒドの合成（化合物＃２） 全てのガラス製品は、蒸留メタノールですすぎ、使用前に18時間乾燥（130℃
）させた。精製されたＧＭ２ガングリオシド（化合物＃１）(40 mg)の蒸留メタ
ノール（10 mL）溶液を−15℃（ドライアイス−エタノール）で攪拌し、その溶
液にオゾンガス（Orec O3V10-0 ozonator）を７分間通す。次いで、反応をＴＬ
Ｃ（5：4：1 クロロホルム−メタノール−0.2％ CaCl₂水溶液）でチェックしな
がらその溶液にアルゴン流を通過させる。次に、減圧下で溶媒を除去し、得られ
た物質を蒸留メタノールに溶解する。この溶液に硫化メチル（200 mL）を添加し
、反応混合物を室温で１時間攪拌する。次に、溶媒を除去し、残渣をエチルエー
テル（４×25 mL）で洗う。得られた白色固体（化合物＃２）を、残存する溶媒
を除去するため15分間真空中で乾燥させた後、これ以降の結合ステップで直接使
用する。Step 2: Synthesis of GM2 aldehyde (Compound # 2) All glassware is rinsed with distilled methanol and dried for 18 hours (130 ° C.) before use
). A solution of the purified GM2 ganglioside (compound # 1) (40 mg) in distilled methanol (10 mL) was stirred at −15 ° C. (dry ice-ethanol), and ozone gas (Orec O3V10-0 ozonator) was added to the solution for 7 minutes. Let it through. The reaction is then
C - passing a stream of argon to the solution while checking in (5: 4: 1 chloroform-methanol -0.2% CaCl ₂ solution). Next, the solvent is removed under reduced pressure, and the obtained substance is dissolved in distilled methanol. To this solution is added methyl sulfide (200 mL) and the reaction mixture is stirred at room temperature for 1 hour. Then the solvent is removed and the residue is washed with ethyl ether (4 × 25 mL). The resulting white solid (Compound # 2) is dried in vacuo for 15 minutes to remove residual solvent before being used directly in subsequent coupling steps.

【００７９】 得られたアルデヒドの不安定な性質のため、ＴＬＣによってのみ慣用的に化合
物＃２を同定する。典型的なラン（run）のＴＬＣにより、少量のスフィンガニ
ンもしくはフィトスフィンゴシン類似体（化合物＃１と同じRf値）および少量の
還元糖（Rf 0.32）の存在が一般に示される。Because of the labile nature of the aldehyde obtained, compound # 2 is routinely identified only by TLC. A typical run of TLC generally indicates the presence of a small amount of a sphinganine or phytosphingosine analog (the same Rf value as compound # 1) and a small amount of a reducing sugar (Rf 0.32).

【００８０】 ステップ３：ＧＭ２アルデヒドのＫＬＨへの結合 全操作は、クラス100生物学的安全キャビネットで行われる。Step 3: Binding GM2 aldehyde to KLH All operations are performed in a class 100 biological safety cabinet.

【００８１】 ＫＬＨタンパク質（160 mg）を無菌的に測り取って、凍結乾燥されたＧＭ２ア
ルデヒドおよびマグネチック・スターラーバーを有するフラスコに添加する。そ
の溶液を、ＧＭ２アルデヒドの全てが溶液になるまで室温で３分間穏やかに攪拌
する。The KLH protein (160 mg) is aseptically weighed and added to a flask with lyophilized GM2 aldehyde and a magnetic stir bar. The solution is gently stirred at room temperature for 3 minutes until all of the GM2 aldehyde is in solution.

【００８２】 シアノホウ化水素ナトリウム（NaBH₃CN）(40 mg)を、ＧＭ２アルデヒド/ＫＬ
Ｈ溶液に添加した後、そのフラスコを、無菌フィルター針を備えた栓で密封する
。その溶液を穏やかに攪拌し、次に室温で一晩インキュベートする。更にその溶
液を40℃で４日間インキュベートする。Sodium cyanoborohydride (NaBH ₃ CN) (40 mg) was added to GM2 aldehyde / KL
After addition to the H solution, the flask is sealed with a stopper equipped with a sterile filter needle. The solution is gently agitated and then incubated at room temperature overnight. The solution is further incubated at 40 ° C. for 4 days.

【００８３】 ステップ４：糖結合物（glycoconjugate）（ＧＭ２−ＫＬＨ）のダイアフィル
トレーション： YM-30フィルターを備えた、発熱物質フリーの滅菌済みAmicon限外濾過ユニッ
トに無菌的に、ＧＭ２/ＫＬＨ反応バイアルの内容物を移す。濾過された窒素を
、Amiconユニットに対して16 psiの操作圧力を提供するために使用する。次いで
、以下の発熱物質フリーの無菌緩衝液もしくは発熱物質を少量含む無菌緩衝液に
対して連続してダイアフィルトレーションする： １．ＰＢＳ ｐＨ7.5（無菌、発熱物質フリー）の２回の全交換 ２．ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ ｐＨ7.75（無菌、少量の発熱物質）の２回の
全交換 ３．0.5％デオキシコール酸（ＤＯＣ）を含むＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ7.75（無
菌、少量の発熱物質）の２回の全交換 ４．ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ ｐＨ7.75（無菌、少量の発熱物質）の４回の
全交換 ５．ＰＢＳ ｐＨ7.5（無菌、発熱物質フリー）の３回の全交換Step 4: Diafiltration of glycoconjugate (GM2-KLH): GM2 / KLH aseptically in a sterile, pyrogen-free Amicon ultrafiltration unit equipped with a YM-30 filter. Transfer the contents of the reaction vial. The filtered nitrogen is used to provide an operating pressure of 16 psi for the Amicon unit. Subsequently, diafiltration is performed continuously against the following pyrogen-free sterile buffers or sterile buffers containing small amounts of pyrogens: 1. 2 total exchanges of PBS pH 7.5 (sterile, pyrogen free) Two total exchanges of TRIS-HCl, EDTA pH 7.75 (sterile, small amount of pyrogen) 3. 2 of TRIS-HCl pH 7.75 (sterile, small amount of pyrogen) containing 0.5% deoxycholic acid (DOC) 3. total exchange of times 4. 4 total exchanges of TRIS-HCl, EDTA pH 7.75 (sterile, small amount of pyrogen) All three changes of PBS pH7.5 (sterile, pyrogen free)

【００８４】 次に、糖結合物を濾過ユニットから無菌的に取り出し、2000 rpmで30分間遠心
分離する。次いでその上清を、0.22 mm低タンパク質結合フィルターを用いて無
菌的に濾過する。Next, the sugar conjugate is aseptically removed from the filtration unit and centrifuged at 2000 rpm for 30 minutes. The supernatant is then aseptically filtered using a 0.22 mm low protein binding filter.

【００８５】 糖結合物のサンプルを得、以下の製造過程のＱＣテストを行う： １．セファロースゲル濾過 ２．等電点電気泳動（ＩＥＦ） ３．BioRadタンパク質アッセイA sample of the sugar conjugate is obtained and subjected to the following in-process QC test: Sepharose gel filtration 2. 2. Isoelectric focusing (IEF) BioRad protein assay

【００８６】 タンパク質アッセイの結果に基づき、無菌の発熱物質フリーのＰＢＳ緩衝液（
ｐＨ7.5）を用いて糖結合物の最終体積を調整し、タンパク質濃度を１mg/mLにす
る。Based on the results of the protein assay, a sterile pyrogen-free PBS buffer (
Adjust the final volume of the conjugate using pH 7.5) to bring the protein concentration to 1 mg / mL.

【００８７】 次いで、クラス100生物学的安全キャビネット内で、ゴム栓の付いた、２mLの
滅菌済み、発熱物質フリーの透明な、ホウケイ酸血清バイアルに、最終的な糖結
合物を0.1 mLの過剰体積とともに1.0 mL注ぎ、２〜８℃で保存する。この充填操
作の間、フード内の作業場近くで２つの血液寒天プレートを最低30分間空気に晒
すことにより、充填領域内の空気をモニタリングする。次に、これらプレートを
37℃のインキュベーターに移し、１〜２日間インキュベートする。次に、細菌コ
ロニーもしくは真菌コロニーについてプレートを検査する。The final sugar conjugate was then added to a 2 mL sterile, pyrogen-free, clear, borosilicate serum vial with a rubber stopper in a Class 100 biological safety cabinet with 0.1 mL of excess sugar conjugate. Pour 1.0 mL with volume and store at 2-8 ° C. During this filling operation, the air in the filling area is monitored by exposing the two blood agar plates to air near the workplace in the hood for a minimum of 30 minutes. Next, these plates
Transfer to 37 ° C incubator and incubate for 1-2 days. The plate is then inspected for bacterial or fungal colonies.

【００８８】 その生成物は、製造者により標識を付され、その標識は品質管理部により確認
される。その後、生成物を２〜８℃で保存する。The product is labeled by the manufacturer and the label is confirmed by the quality control department. Thereafter, the product is stored at 2-8 ° C.

【００８９】 ＧＭ２−ＫＬＨの各ロットは、以下の最終品質管理テストを通過する： １．酵素免疫法（ＥＩＡ） ２．ＬＡＬ発熱物質アッセイ ３．BioRadタンパク質アッセイ ４．レゾルシノール−ＨＣｌ 炭水化物アッセイ ５．ウサギ発熱物質テスト ６．一般的な安全テスト ７．無菌テスト ８．シアン化物に対する不純物テストEach lot of GM2-KLH passes the following final quality control tests: 1. Enzyme immunoassay (EIA) 2. LAL pyrogen assay BioRad protein assay 4. Resorcinol-HCl carbohydrate assay Rabbit pyrogen test 6. General safety test 7. Sterility test Impurity test for cyanide

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 31/04 31/04 Ｆターム(参考） 4C084 AA19 MA02 NA05 ZA33 ZA34 ZB112 ZB352 4C086 AA01 AA02 BC69 MA01 MA02 MA04 MA58 MA59 NA05 ZA33 ZA34 ZB11 ZB35 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI theme coat ゛ (reference) A61P 29/00 A61P 29/00 31/04 31/04 F term (reference) 4C084 AA19 MA02 NA05 ZA33 ZA34 ZB112 ZB352 4C086 AA01 AA02 BC69 MA01 MA02 MA04 MA58 MA59 NA05 ZA33 ZA34 ZB11 ZB35

Claims (17)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 患者のウイルス疾患を治療もしくは予防する方法であって、
ウイルス疾患の間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体
を、ウイルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量で患者に投与することを
含む方法。1. A method for treating or preventing a viral disease in a patient, comprising:
A method comprising administering to a patient a cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof that is overexpressed during a viral disease in an amount effective to treat or prevent the viral disease. 【請求項２】 前記患者がヒトである請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said patient is a human. 【請求項３】 前記ウイルス疾患が、ヒト免疫不全ウイルス１型により引き
起こされる請求項１に記載の方法。3. The method of claim 1, wherein said viral disease is caused by human immunodeficiency virus type 1. 【請求項４】 前記炭水化物が、ルイス（Lewis）ｙ抗原、ガングリオシド
、またはガングリオシドのオリゴ糖部分である請求項１に記載の方法。4. The method of claim 1, wherein the carbohydrate is a Lewis y antigen, a ganglioside, or an oligosaccharide moiety of a ganglioside. 【請求項５】 前記ガングリオシドが、ＧＭ１、ＧＭ１ａ、ＧＭ２、ＧＭ３
、ＧＤ１ａ、もしくはＧＤ２、またはそれらの組み合わせである請求項４に記載
の方法。5. The method of claim 5, wherein the ganglioside is GM1, GM1a, GM2, GM3.
5. The method of claim 4, wherein the method is GD1a, GD1a, or GD2, or a combination thereof. 【請求項６】 前記ガングリオシドが、ＧＭ２もしくはＧＤ２またはその組
み合わせである請求項４に記載の方法。6. The method of claim 4, wherein said ganglioside is GM2 or GD2 or a combination thereof. 【請求項７】 前記細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体が、担体タ
ンパク質に結合している請求項１に記載の方法。7. The method of claim 1, wherein said cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof is bound to a carrier protein. 【請求項８】 前記担体タンパク質が、Keyhole Limpet Hemocyaninもしく
はその誘導体である請求項７に記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the carrier protein is Keyhole Limpet Hemocyanin or a derivative thereof. 【請求項９】 前記細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体が、適切な
アジュバントとともに患者に投与される請求項１に記載の方法。9. The method of claim 1, wherein said cellular carbohydrate antigen or a molecular analog thereof is administered to a patient with a suitable adjuvant. 【請求項１０】 前記アジュバントが、ＱＳ−２１である請求項９に記載の
方法。10. The method of claim 9, wherein said adjuvant is QS-21. 【請求項１１】 前記ウイルス疾患が、ヒト免疫不全ウイルス１型により引
き起こされる請求項６に記載の方法。11. The method of claim 6, wherein said viral disease is caused by human immunodeficiency virus type 1. 【請求項１２】 前記ガングリオシドもしくはそのオリゴ糖部分が、Keyhol
e Limpet Hemocyaninもしくはその誘導体に結合されている請求項１１に記載の
方法。12. The method according to claim 12, wherein the ganglioside or its oligosaccharide moiety is Keyhol.
12. The method of claim 11, wherein the method is conjugated to e Limpet Hemocyanin or a derivative thereof. 【請求項１３】 前記結合ガングリオシドもしくはそのオリゴ糖部分が、ア
ジュバントＱＳ−２１とともに投与される請求項１２に記載の方法。13. The method of claim 12, wherein said conjugated ganglioside or oligosaccharide moiety thereof is administered with an adjuvant QS-21. 【請求項１４】 前記分子類似体が、抗イディオタイプ抗体である請求項１
に記載の方法。14. The method of claim 1, wherein the molecular analog is an anti-idiotype antibody.
The method described in. 【請求項１５】 前記分子類似体が、ペプチド・ミモトープ（mimotope）で
ある請求項１に記載の方法。15. The method of claim 1, wherein said molecular analog is a peptide mimotope. 【請求項１６】 患者のウイルス疾患を治療もしくは予防するためのワクチ
ンであって、ウイルス疾患を治療もしくは予防するのに有効な量の、ウイルス疾
患の間に過剰発現される細胞性炭水化物抗原もしくはその分子類似体と、薬学的
に許容し得る担体とを含むワクチン。16. A vaccine for treating or preventing a viral disease in a patient, comprising an effective amount of a cellular carbohydrate antigen or a carbohydrate antigen overexpressed during the viral disease, for treating or preventing the viral disease. A vaccine comprising a molecular analog and a pharmaceutically acceptable carrier. 【請求項１７】 前記炭水化物が、ルイス（Lewis）ｙ抗原、ガングリオシ
ド、またはガングリオシドのオリゴ糖部分である請求項１６に記載のワクチン。17. The vaccine according to claim 16, wherein the carbohydrate is a Lewis y antigen, a ganglioside, or an oligosaccharide moiety of a ganglioside.