JP2002525111A

JP2002525111A - 脂質障害および炎症性疾患の診断および治療のためのａｔｐ結合カセット遺伝子およびタンパク質

Info

Publication number: JP2002525111A
Application number: JP2000572359A
Authority: JP
Inventors: シユミツツ，ゲルト; クルケン，ヨヘン
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2002-08-13
Also published as: AU5980499A; EP1115865A2; WO2000018912A2; WO2000018912A3; CA2344107A1

Abstract

(57)【要約】コレステロールに駆動される粥腫発生の過程ならびに乾癬、エリテマトーデスおよび他のような炎症性疾患に病因論的に関与しているＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体タンパク質ファミリーに属する膜貫通タンパク質の活性の調節は、こうした疾患を治療するための治療手段を提供する。さらに、こうした粥腫発生および炎症の過程に関与するそれらのそれぞれの生化学的活性の本明細書で同定されるＡＢＣ輸送体タンパク質の検出は、異脂血症(dyslipidemia)、粥状硬化症もしくは乾癬およびエリテマトーデスのような炎症性疾患の診断およびモニタリングという臨床用途のための診断手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）ＨＤＬにより媒介される逆コレステロール輸送は、細胞膜の完全性および泡沫
細胞形成の「保護的」機構を提供し、そして細胞のコレステロールは、循環する
ＨＤＬもしくはその前駆体分子により取り込まれる。しかしながら、逆コレステ
ロール輸送の正確な機構は現在完全に理解されてはおらず、また、細胞のコレス
テロールの流出、および細胞表面からＨＤＬのような受容体(acceptor)粒子への
輸送の機構は未だ不明である。逆コレステロール輸送の過程においてある役割を
演じているある種の候補遺伝子産物が仮定されている［１］。アポリポタンパク
質（例えばＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＶ）、脂質輸送タンパク質（例えばＣＥ
ＴＰ、ＰＬＴＰ）および酵素（例えばＬＣＡＴ、ＬＰＬ、ＨＬ）は、リポタンパ
ク質−リポタンパク質およびリポタンパク質−細胞の相互作用においてコレステ
ロールおよびリン脂質を交換するのに不可欠である。ＳＲ−ＢＩ［２；３］、Ｈ
Ｂ１／２［４］およびＧＰＩ結合タンパク質（例えば１２０ｋＤａおよび８０ｋ
Ｄａ）［５］のような多様な原形質膜受容体、ならびに原形質膜のスフィンゴ脂
質豊富な微小ドメイン(microdomain)（小胞、いかだ(raft)）が、逆コレステロ
ール輸送、およびリン脂質の交換の過程に関与していると当然意味されている。
これらの膜の微小ドメインがどのように組織化されているかは、治療の標的の同
定のため現在の目的の焦点にある。最近の研究において、肝およびステロイド生
成(steroidogenic)組織中へのＨＤＬの取り込みのレセプターとしてのＳＲ−Ｂ
Ｉの機能が立証される可能性があり、また、この過程の有効性はリン脂質環境に
高度に依存性である［２］。

【０００２】単球／マクロファージ、ならびに粥状硬化の過程に関与する他の細胞における
コレステロールおよびリン脂質の恒常性は、粥状硬化性の血管疾患の重要な決定
子である。宿主防禦におけるマクロファージの食作用機能、組織のリモデリング
、粥腫発生性リポタンパク質ならびに膜の断片もしくは他の脂質含有粒子の取り
込みおよびリソゾームの分解は、泡沫細胞形成を回避する効果的な放出機構によ
り均衡を保たれなければならない。内在性のＡｐｏＥおよびＣＥＴＰの合成およ
び分泌により支持されるＨＤＬ媒介性の逆コレステロール輸送は、マクロファー
ジおよび他の血管細胞から過剰のコレステロールを放出するのに効果的な機構を
提供する。

【０００３】あるいは、腸粘膜細胞による低下されたコレステロールおよびトリグリセリド
／脂肪酸の吸収、ならびに胆汁への肝細胞からの増大された脂質分泌が、血漿脂
質および粥状硬化性のリポタンパク質の濃度を低下させることができる。

【０００４】（発明の要約）マクロファージの分化、ならびにアセチル化されたＬＤＬでのコレステロール
負荷およびその後のＨＤＬ₃での脱負荷(deloading)にさらされた末梢血からのヒ
ト単球で、示差的表示方法(differential display method)を用いて新たなコレ
ステロール応答遺伝子を同定した。

【０００５】最初のスクリーニングにおいて、生物学的膜を横断する溶質の移動(transloca
tion)にＡＴＰ加水分解のエネルギーを結びつけるＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット
）輸送系の迅速に増大しているファミリーの１メンバー、ＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８
）を、コレステロール感受性のスイッチとして同定した。ＡＢＣＧ１は、Ｍ−Ｃ
ＳＦ依存性の食細胞分化によりアップレギュレートされるが、しかし、発現はコ
レステロール負荷により大きく誘導され、そして、ＨＤＬ₃により分化依存性の
レベルにほとんど完全に妨害される。

【０００６】より詳細な分析において、３７種の既に特徴づけられたＡＢＣのメンバーおよ
び８種のフラグメント配列（表２）を、分化依存性の変化およびコレステロール
感受性についてＲＴ−ＰＣＲ（直線範囲）により単球／マクロファージ細胞で分
析した。

【０００７】４５種の試験されたＡＢＣ輸送体遺伝子のなかで、特徴づけられたＡＢＣ輸送
体の１８種およびフラグメント配列に基づくＡＢＣ輸送体の２種がコレステロー
ル感受性である（実施例４）。

【０００８】コレステロール感受性のＡＢＣ輸送体を新たなＡＢＣの命名法に従って命名し
、そしてそれぞれ新たな呼称および古い呼称とともに表３に列挙する。

【０００９】最も感受性の遺伝子はＡＢＣＧ１であった。ＡＢＣＧ１はショウジョウバエ白
色遺伝子(drosophila white gene)のヒト相同物である。ＡＢＣＧ１のプロモー
ターの配列決定（実施例７）は、食細胞性の分化および脂質感受性に関連する重
要な転写因子結合部位を示す。

【００１０】コレステロールの負荷およびＨＤＬ₃媒介性の脱負荷の間のマクロファージの
アンチセンス処理は、ＡＢＣＧ１をコレステロール輸送体として明確に同定し、
そして、コリン含有リン脂質（ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン）の
流出もまた調節された。ノーザンおよびウェスタンブロット分析は、コレステロ
ール輸送の阻害がより低いＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現およびＡＢＣＧ１タンパク
質のレベルと関連するというさらなる支持を提供した（実施例５）。

【００１１】細胞膜中のＡＢＣＧ１は、細胞外ドメインならびにＡＢＣＧ１配列の他の部分
の配列相同性によってもまた支持される輸送機能（例えばＬＲＰ−ＬＤＬレセプ
ター関連タンパク質）もしくはシグナル伝達および接着機能（例えばインテグリ
ン、インテグリン関連タンパク質）のいずれかを有する他の膜受容体との調節さ
れた機能的協同（例えば細胞の分化、活性化、コレステロールの負荷および脱負
荷）にあるという考慮すべき証拠が、エネルギー伝達実験（実施例３）から生じ
られた。例えば、ＡＢＣＧ１の第三の細胞外ループの領域のタンパク質配列（す
なわちアミノ酸残基５８０から６４４）は、フィブロネクチン（ａａ３１７−３
２７）、インテグリンβ５（ａａ５３８−５４７）、ＲＡＰ（ａａ１１９−１２
７）、ＬＲＰ（ａａ２８７４−２８９４）、ａｐｏＢ−１００前駆体（ａａ４３
２８−４３６９）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ａａ５４−７８）
およびグルコース輸送体（ａａ３７１−３８０）と相同性を共有する。全部のコ
レステロール感受性の輸送体の配列比較が、ＡＢＣ輸送体の機能および調節の一
般的成分(principle)としてこれを示す。

【００１２】他のコレステロール感受性遺伝子のなかでＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１）がさらに特
徴づけられた。ＡＢＣＡ１は、アポトーシス性の細胞のプロセシング(processin
g)にもまた関与するＩＬ−１β輸送体としてマウスで同定された。われわれは、
ＡＢＣＡ１がＡＢＣＧ１と同一の調節に従うことを、新たに検出されたヒトＡＢ
ＣＡ１のｃＤＮＡ配列（実施例６）に基づき、ＲＴ−ＰＣＲ（表２）およびノー
ザン分析による確認によりここで示す。

【００１３】さらに、ＡＢＣＡ１ノックアウトマウス（ＡＢＣＡ１−／−）は、大きく低下
されたレベルの血清の脂質およびリポタンパク質を示す。ＡＢＣＡ１−／−マウ
スにおける小腸の粘膜細胞でのＡＢＣＡ１の発現、および変えられたリポタンパ
ク質代謝は、ＡＢＣＡ１が脂質の腸吸収およびリンパ系への移動で大きな役割を
演じているという結論を可能にする。

【００１４】マクロファージのコレステロールの恒常性に影響を及ぼす遺伝子欠損の分析は
、調節不全にされた(dysregulated)ＡＢＣＡ１を、ＨＤＬ欠乏症候群（タンジア
ー病）に関与する遺伝子座として同定した。この疾患は高トリグリセリド血症お
よび脾腫を伴う。

【００１５】冠動脈心疾患および乾癬の早期発症に関連する、別の今までのところ記述され
ていないＨＤＬ欠乏症候群は、第１７染色体に関連するＡＢＣ配列（ＡＢＣＣ４
（ＭＲＰ３）；ＡＢＣＣ３（ＭＲＰ３）；ＡＢＣＡ５（フラグメント９０６２５
）；ＡＢＣＡ６（フラグメント１５５０５１）：１７ｑ２１−２４）の調節不全
(dysregulation)を示した。これは、第１７染色体での乾癬の予測された遺伝子
座との関連を指摘する。

【００１６】最近配列決定されたヒトＡＢＣ輸送体（ＡＢＣＡ８、実施例９）はＡＢＣＡ１
との高度の相同性を示し、そしてまたコレステロール感受性のＡＢＣ輸送体の群
に属する。

【００１７】ＡＢＣＣ５（ＭＲＰ５、ｓＭＲＰ）はＭＲＰサブファミリーの１メンバーであ
り、このサブファミリーのなかで、ＡＢＣＣ２（ＭＲＰ２、ｃＭＯＡＴ）が、ビ
リルビングルコロニド分泌に関与し［９］かつデュービン−ジョンソン症候群（
軽症の慢性抱合型高ビリルビン血症を伴う障害）の遺伝子座として同定される［
１０］肝細胞小管膜輸送体として特徴づけられた。

【００１８】さらに、ＩＬ−１βの輸送体としてのＡＢＣＡ１の同定は、リウマチ性関節炎
および敗血症ショックを包含する炎症性疾患の治療のための候補遺伝子としてこ
の遺伝子を同定する。サイトカインＩＬ−１βは、これらの疾患の病原論に関係
している広範に作用する前炎症(proinflammatory)メディエイターである。

【００１９】さらに、われわれは、ＩＬ−１β分泌の阻害剤としてのグリブリドがプロＩＬ
−１βのカスパーゼＩ（ＣａｓｐａｓｅＩ）媒介性のプロセシングおよび成熟
ＩＬ−１βの放出を阻害するのみならず、しかし、同時に、中性のスフィンゴミ
エリナーゼにより媒介されるスフィンゴミエリンからのセラミド形成を阻害しか
つそれによりヒト線維芽細胞をＧ₂期の細胞周期の停止から解放することを立証
することができた。これらのデータは、シグナル伝達および細胞の脂質代謝にお
けるＡＢＣＡ１の機能を暗示するさらなる機構を提供する。

【００２０】抗リン脂質症候群（例えばエリテマトーデス）を伴う自己免疫障害は、Ｂ細胞
およびＴ細胞の機能の調節不全、異常な抗原プロセシング、もしくは膜のリン脂
質の非対称の分布の逸脱に関連付けることができる。ＡＢＣ輸送体は、それらの
輸送機能のほかにも、生物学的膜のリン脂質の非対称性（外側小葉(leaflet)：
ＰＣ＋ＳＰＭ；内側小葉：ＰＳ＋ＰＥ）を調節するリン脂質トランスロカーゼ(t
ranslocase)、フロッパーゼ(floppase)およびスクランブラーゼ(scramblase)の
候補遺伝子である［１１］。分析されたＡＢＣ輸送体の調節不全の考慮すべき証
拠が患者の細胞に存在する。われわれは、これらのＡＢＣカセットはエリテマト
ーデスのような抗リン脂質症候群の遺伝的基礎の候補遺伝子でもまたあると結論
している。

【００２１】要約すれば、ＡＢＣ遺伝子ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＡ１、および本明細書で特定さ
れるような他のコレステロール感受性のＡＢＣ遺伝子は、診断および治療の用途
、ならびに脂質障害、粥状硬化症もしくは他の炎症性疾患の治療に使用すること
ができる薬理学的有効成分についてスクリーニングするための生化学的もしくは
細胞に基づくアッセイに使用することができる。従って、脂質障害、粥状硬化症
もしくは他の炎症性疾患の治療に使用することができる薬理学的有効成分につい
てスクリーニングするためのアッセイを提供することが、本発明の一目的である
。さらに、本発明は、これらの遺伝子および遺伝子産物のモジュレーターを同定
するためのツールを提供する。脂質障害、粥状硬化症もしくは他の炎症性疾患の
治療、または脂質障害、粥状硬化症もしくは他の炎症性疾患の治療のための医薬
の製造にこれらのモジュレーターを使用することができる。該医薬は該モジュレ
ーターのほかにも許容できかつ有用な製薬学的担体を含んで成る。略語ａａアミノ酸ＡＢＣＡＴＰ結合カセットＡＢＣＡ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー＃
ＡＢＣＢ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メン
バー＃ＡＢＣＣ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ）、メ
ンバー＃ＡＢＣＤ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤ（ＡＬＤ）、メンバー＃ＡＢＣＥ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＥ（ＯＡＢＰ）、メンバー＃ＡＢＣＦ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦ（ＧＣＮ２０）、メンバー
＃ＡＢＣＧ＃ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー
＃ＡＢＣＲヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）腹膜(rim)ＡＢＣ輸送体ＡｃＬＤＬアセチル化されたＬＤＬＡＤＰ１ＡＴＰ依存性パーミアーゼ(permease) ＡＬＤＰ副腎脳白質ジストロフィータンパク質ＡＬＤＲ副腎脳白質ジストロフィー関連タンパク質ＡｐｏＡアポリポタンパク質ＡＡｐｏＥアポリポタンパク質ＥＡＲＡアントラサイクリン耐性関連タンパク質ＡＳアンチセンスＡＴＰアデノシン三リン酸ＣＥＴＰコレステリルエステル輸送タンパク質ＣＦＴＲ嚢胞性線維症膜貫通伝導度調節物質ＣＧＴセラミドグルコキシルトランスフェラーゼＣＨコレステロールｃＭＯＡＴ小管多特異性有機陰イオン輸送体ｄｓＲＮＡ二本鎖ＲＮＡＦｒａｇｍｅｎｔ遺伝子（Ｇｅｎ）フラグメントＦＡＢＰ原形質膜脂肪酸結合タンパク質ＦＡＣＳ蛍光標示式細胞分取器ＦＡＴＰ細胞内脂肪酸結合タンパク質ＦＣＳウシ胎児血清ＦＦＡ遊離脂肪酸ＧＡＰＤＨグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ＧＣＮ２０転写開始因子２のαサブユニットをホスホリル化するタンパク質
キナーゼＧＰＩグリコシルホスファチジルイノシトールＨａＣａＴケラチノサイト細胞系ＨＤＬ高密度リポタンパク質ＨＬ肝リパーゼＨｌｙＢヘモリシン移動体(translocator)タンパク質ＢＨＭＴ１酵母重金属耐性タンパク質ＨＰＴＬＣ高性能薄層クロマトグラフィーＩＬインターロイキンＬＣＡＴレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼＬＤＬ低密度リポタンパク質ＬＰＬリポタンパク質リパーゼＬＲＰＬＤＬレセプター関連タンパク質ＭＤＲ多剤耐性ＭＲＰ多剤耐性関連タンパク質ＰＣホスファチジルコリンＰＥホスファチジルエタノールアミンＰＬリン脂質ＰＬＴＰリン脂質輸送タンパク質ＰＭＰペルオキシソーム膜タンパク質ＰＳホスファチジルセリンＲＮＡリボ核酸ＲＴ−ＰＣＲ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応ＳＤＳドデシル硫酸ナトリウムＳＬスフィンゴ脂質ｓＭＲＰ小型の形態のＭＲＰＳＰＭスフィンゴミエリンＳＲ−ＢＩスカベンジャー受容体ＢＩＳＵＲスルホニル尿素レセプターＴＡＰ抗原ペプチド輸送体ＴＧトリグリセリドＴＳＡＰＴＮＦ−α刺激されたＡＢＣタンパク質ＵＴＲ非翻訳領域

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】

【表３】

【００２５】

【表４】

【００２６】表の記述：表１：ヒト組織中のＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）、ＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１）およびＡＢＣＡ
８のＲＮＡ転写物のレベルを、複数の組織のドットブロット（ヒトＲＮＡマスタ
ーブロット（ＨｕｍａｎＲＮＡＭａｓｔｅｒＢｌｏｔ）、クロンテックラ
ボラトリーズインク（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ
．）、米国カリフォルニア州）のノーザンブロット分析により決定した。異なる
数の黒丸により発現の相対量を示す。表２：単球、単球由来マクロファージ（５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含有する血清を
含まないマクロファージ−ＳＦＭ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ＳＦＭ）培地中で３
日培養された単球）、ＡｃＬＤＬでインキュベートされた単球（１００μｇ／ｍ
ｌを用いて３日）次いでＨＤＬ₃（１００μｇ／ｍｌ）でインキュベートされた
単球におけるＡＢＣ輸送体の発現パターンを示す。発現された遺伝子を半定量的
ＰＣＲによりコレステロール感受性について試験する。既知のＡＢＣ輸送体について、染色***置および輸送される分子もまた提示する
。表３：ＡＢＣ輸送体と関連する障害を示す。染色***置およびＯＭＩＮ（ヒトにおける
オンラインのメンデル遺伝（ＯｎｌｉｎｅＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒｉ
ｔａｎｃｅｉｎＭａｎ））の関連する受け入れ番号を示す。表４：分化の間のＨａＣａＴケラチノサイト細胞におけるＡＢＣ輸送体の発現

【００２７】

【表５】

【００２８】

【表６】

【００２９】

【表７】

【００３０】

【表８】

【００３１】

【表９】

【００３２】

【表１０】

【００３３】

【表１１】

【００３４】

【表１２】

【００３５】特定の態様の記述ヒト単球由来のマクロファージのコレステロールの負荷および脱負荷の間の候補
遺伝子の同定コレステロールの負荷および／もしくは脱負荷に関与する遺伝子を発見するた
めに、インビトロアッセイを計画した。とりわけ、コレステロールにより導き出
されるヒト血液由来の単球およびマクロファージにおける遺伝子発現、ならびに
その生理学的輸送の構成(formulation)（すなわち、ＡｃＬＤＬのような多様な
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子種）を研究した。

【００３６】ＡｃＬＤＬ（培地１ｍｌあたり１００μｇタンパク質）で補充された、Ｍ−Ｃ
ＳＦを含有するがしかし血清を含まないマクロファージ培地中で、水簸されたヒ
ト単球を３日間培養し、次いで、ＨＤＬ₃（培地１ｍｌあたり１００μｇタンパ
ク質）によりＡｃＬＤＬを置き換えて１２時間コレステロールを枯渇させた。コ
レステロールの負荷／脱負荷により調節される、新たな候補遺伝子についての示
差的表示スクリーニングを実施した（実施例１）。新たなコレステロール感受性遺伝子の同定ＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）を新規コレステロール感受性遺伝子として発見した。
ＡＢＣＧ１はＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体遺伝子ファミリーに属する。
ＡＢＣＧ１はショウジョウバエ白色遺伝子のヒト類似物として最近発表された［
６−８］。

【００３７】該遺伝子は、ノーザンブロットにより確認されるとおり（実施例２）、ＡｃＬ
ＤＬ媒介性のコレステロールの負荷により強くアップレギュレートされ、また、
ＨＤＬ₃媒介性のコレステロールの脱負荷によりほとんど完全にダウンレギュレ
ートされる。末梢血の発端者から得られたヒト単球由来マクロファージからのｍ
ＲＮＡのノーザンブロット分析は、ＡｃＬＤＬとのインキュベーションに際して
のＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ形成のアップレギュレーションを明確に示す。鮮明に対
照的に、こうしたマクロファージでのＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ発現は、ＨＤＬ₃含
有培地でのインキュベーションに際して減少した。前分化の４日後のコレステロールが負荷および脱負荷された細胞におけるＡＢＣ
Ｇ１発現効果的なコレステロール負荷のためには、単球は食作用のあるマクロファージ
様細胞に分化しなければならない。この期間の間に、スカベンジャー受容体がア
ップレギュレートされ、そしてＡｃＬＤＬの取り込みを促進し、コレステリルエ
ステルの蓄積につながる。われわれは、コレステリルエステルの蓄積を示すため
、４日の前インキュベーション期間の後に、細胞をＡｃＬＤＬ（１００μｇ／ｍ
ｌ）とともに１、２および３日間インキュベートした。われわれは、負荷の２日
後に、細胞をそれぞれ１２時間、２４時間および４８時間ＨＤＬ₃で脱負荷した
。ＡＢＣＧ１は、ＡｃＬＤＬ負荷期間の間、時間依存性にアップレギュレートさ
れ、そして、ＨＤＬ₃脱負荷によりダウンレギュレートされる（実施例２および
３）。ヒト単球由来のマクロファージでのＡｃＬＤＬ攻撃後のＡＢＣＧ１のｍＲ
ＮＡ発現の時間依存性の増大を確認するために、ＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ定量のた
めのノーザンブロット分析を行い、マクロファージからのＲＮＡサンプルを対照
として第０日および第４日に収穫し、そしてマクロファージのＡｃＬＤＬ処理（
第４日に開始した）後１、２、および３日にｍＲＮＡサンプルを採取した。ノー
ザンブロット分析により、マクロファージのＡＢＣＧ１のｍＲＮＡの含有量の劇
的な増大を第５日から第７日まで検出することができた。

【００３８】この調節は細胞のコレステリルエステル含有量の変化と同一のパターンを示す
（実施例３）。コレステロールエステルの蓄積は、単球由来マクロファージにお
いて、第４日の細胞タンパク質１ｍｇあたり５ｎｍｏｌより低い基礎レベルから
第７日（すなわちＡｃＬＤＬ適用後３日）の細胞タンパク質１ｍｇあたり１２０
ｎｍｏｌまで、ＡｃＬＤＬ刺激に際して開始する。組織発現ＡＢＣＧ１は、コレステロール負荷されたマクロファージのほかにも、脳、脾
、肺、胎盤、副腎、胸腺および胎児組織中で顕著に発現される（表１）。染色***置ならびに関連する遺伝子および疾患ＡＢＣＧ１遺伝子はヒト染色体２１ｑ２２．３に位置する。この領域２１ｑ
２２．３には以下の遺伝子、すなわちインテグリンβ２（ＣＤ１８）、脳特異
的ポリペプチド１９、ダウン症候群細胞接着分子、ｄｓＲＮＡ特異的アデノシン
デアミナーゼ、シスタチオニンβ合成酵素、コラーゲンＶＩ α−２，コラーゲ
ンＸＶＩＩＩ α−１、常染色体劣性難聴およびアミロイドβ前駆体もまた配置
される。

【００３９】この染色体領域は、ダウン症候群、常染色体優性双極性感情病、および常染色
体劣性非症候性難聴に関与する他の領域に非常に接近している。抗体生成のためのＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）の細胞外ループＡＢＣＧ１の疎水性膜貫通領域の推定構造は、６個の膜貫通スパンニングドメ
イン(transmembrane spanning domain)および３個の細胞外ループ（それらの２
個はそれぞれ９および８アミノ酸長である一方、第三のものは６６アミノ酸長で
ある）を示す。

【００４０】２個の細胞内ループのより大きいものは３０アミノ酸より成る。他の遺伝子と
の第三の細胞外ループ（ＩＩＩｅｘ）の相同性についてのタンパク質データベー
スでの類似性の調査は、フィブロネクチン、インテグリンβ５、ＲＡＰ、ＬＲＰ
（ＬＤＬレセプター関連タンパク質）アポリポタンパク質Ｂ１００前駆体タンパ
ク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびグルコース輸送体の同定をも
たらした。

【００４１】フローサイトメトリー分析、エネルギー伝達実験およびウェスタンブロッティ
ングを実施するために、ＡＢＣＧ１の第三の細胞外ループ（ＩＩＩｅｘ）に対す
るポリクローナル抗血清を生成させた（実施例３を参照されたい）。ＡＢＣＧ１
のアミノ酸配列において、第三の細胞外ループ（ＩＩＩｅｘ）はアミノ酸５８０
から６４４までの６６アミノ酸を含んで成る。抗体生成のためのペプチドフラグ
メントは、ＡＢＣＧ１のポリペプチドのアミノ酸残基６１３から６２８を含んで
成る。ＡＢＣＧ１は、明らかに、内在性の配列モチーフ、ならびにＡＢＣＧ１の
機能および調節の基礎として輸送（例えばＬＲＰ、ＲＡＰ）、シグナル伝達およ
び接着（例えばインテグリン、インテグリン関連タンパク質）に関与する他の膜
受容体と相互作用する。さらに、表３に列挙された全部のＡＢＣ輸送体の配列の
比較は、遺伝子ファミリー全体の一般的本質としての他の膜受容体との機能的協
同を示す。サブファミリー分析ＡＢＣ輸送体ファミリー全体を用いた進化の関係の研究は、ＡＢＣＧ１（ＡＢ
Ｃ８）がＡＢＣＧ２（ｅｓｔ１５７４８１）と一緒に１個のサブファミリーを形
成し、また、このサブファミリーが完全な大きさの輸送体ＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１
）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＡ３（ＡＢＣ３）、ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ
）および半分の大きさの輸送体ＡＢＣＦ１（ＴＳＡＰ）に緊密に関連しているこ
とを示した。

【００４２】アリクメッツ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ）らによる最近の研究は、２１個の新たな
遺伝子を、発現された配列標識のデータベースの検索によりＡＢＣ輸送体と同定
した［１３］。ＡＢＣ輸送体ファミリーの全般的記述ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリーは、既知の最も機能
的に多様なタンパク質のいくつかを含有する。ＡＢＣファミリー（トラフィック
ＡＴＰアーゼ(traffic ATP-ase)ともまた呼ばれる）のメンバーの大部分は、Ａ
ＴＰ依存性の活性の輸送体として機能する（表３）。典型的な機能ユニットは、
一対のＡＴＰ結合ドメインおよび１組の膜貫通（ＴＭ）ドメインより成る。ＴＭ
ドメインが輸送される分子の型に対する特異性を決定し、また、ＡＴＰ結合ドメ
インが膜を通って分子を動かすためのエネルギーを供給する［１４；１５］。多
様なＡＢＣ輸送体により取り扱われる基質の種類は多数であり、そしてイオンか
らペプチドまでの範囲にわたる。特異的な輸送体は、栄養素、内在性毒素、異物
、ペプチド、アミノ酸、糖、有機／無機イオン、ビタミン、ステロイドホルモン
および薬物について見出される［１６；１７］。ＡＢＣ輸送体に関連する疾患ヒトの疾患遺伝子についての検索（表３）は、多数の以前に発見されていなか
ったＡＢＣタンパク質を提供した［１６］。ＡＢＣ輸送体中の突然変異により引
き起こされる最良に特徴づけられた疾患は嚢胞性線維症である（ＡＢＣＣ７（Ｃ
ＦＴＲ））。副腎脳白質ジストロフィーおよびツェルヴェーガー症候群のような
ペルオキシソームの代謝の遺伝性障害もまたＡＢＣ輸送体中の変化を示す。それ
らは、非常に長鎖の脂肪酸の代謝に必要なペルオキシソームのβ酸化に関与して
いる［１８］。ＡＢＣＧ１に対するアンチセンスはＨＤＬ₃へのコレステロールの流出を阻害す
るＡＢＣＧ１はコレステロール感受性の遺伝子であり、また、他のＡＢＣ輸送体
はある種の脂質輸送過程に関与していることが既知であるため、ＡＢＣＧ１がコ
レステロール、リン脂質、脂肪酸もしくはグリセロールの輸送においてある役割
を演じているのかどうかという疑問が生じる。従って、脂質の負荷および脱負荷
に対するＡＢＣＧ１の影響を試験するためのアンチセンス実験を実施した。特異
的アンチセンスオリゴヌクレオチドでのＡＢＣＧ１の阻害は、ＨＤＬ₃へのコレ
ステロールおよびホスファチジルコリンの流出を減少させた（実施例５）。他のコレステロール感受性のＡＢＣ輸送体ヒトＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１）のクローニングおよび配列決定は、コレステロー
ル感受性および組織分布についてＡＢＣＡ１を特徴づける情報を提供した（実施
例６）。別のコレステロール感受性のヒトＡＢＣ輸送体（ＡＢＣＡ８）がクロー
ン化されかつ配列決定されている（実施例８）。ＡＢＣＧ１プロモーター領域の特徴づけＡＢＣＧ１プロモーターは、食作用をもつマクロファージへの単球の分化に関
与している転写因子に特徴的な結合部位を有する。ＡＢＣＧ１の発現のコレステ
ロール感受性は、食作用の分化に関連する転写因子のパターンにより表される（
実施例７）。

【００４３】実施例実施例１コレステロール負荷および脱負荷の候補遺伝子の同定単球の単離および細胞培養単球は白血球搬出により健康な正常血液脂質の(normolipidemic)志願者の末梢
血から得、そして向流水簸法(counterflow elutriation)により精製した。単離
された単球の純度はＦＡＣＳ分析により示されるとおり９５％より大きかった。
１０×１０⁶個の単球を、５％ＣＯ₂、９５％空気の雰囲気で維持された加湿され
た３７℃のインキュベーター中で１２時間、マクロファージ培地中血清を含まな
い条件下で１００ｍｍ²直径の細胞培養皿中に植え付けた。１２時間後に、５０
ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＭ−ＣＳＦで補充された新鮮なマクロファージ培地によ
り、接着されない細胞を含有する培地を置き換えた（この培地はいかなるさらな
るインキュベーションに対しても標準培地である）。リポタンパク質の単離およびＡｃＬＤＬの調製７０Ｔｉローターを装備されたベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ−７０超遠心
分離器中、４℃で、標準的な連続超遠心分離法により、健康な志願者ドナーから
のヒト血漿からリポタンパク質を調製し、ＬＤＬ（ｄ＝１．００６ないし１．０
６３ｇ／ｍｌ）およびＨＤＬ₃（ｄ＝１．１２５ないし１．２１ｇ／ｍｌ）を得
た。全部の密度を固体のＫＢｒで調整した。５ｍＭＥＤＴＡを含有するリン酸
緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いてリポタンパク質画分を徹底的に透析する。
最終透析段階は、ＥＤＴＡの非存在下に０．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ中でであ
った。０．４５μｍ（孔径）の滅菌フィルター（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉ
ｕｓ））を通す濾過によりリポタンパク質を滅菌にした。

【００４４】無水酢酸の反復された添加によりＬＤＬをアセチル化し、次いでＰＢＳに対し
て透析した［１９］。修飾されたＬＤＬはアガロースゲル電気泳動で高められた
移動度を示した。ＡｃＬＤＬおよびＨＤＬ₃での単球−マクロファージのインキュベーション１２時間の前インキュベーション後に、１ｍｌあたり１００μｇタンパク質の
ＡｃＬＤＬ存在もしくは非存在（対照）下で細胞をさらなる３日間、培地中で成
長させた。その後、インキュベーション培地を新鮮な培地で置き換え、そして、
ＨＤＬ₃（１００μｇ／ｍｌ）の添加を伴いもしくは伴わずに別の１２時間イン
キュベートした。示差的表示記述されたようなコレステロールの負荷／脱負荷により調節されている新たな
候補遺伝子について示差的表示スクリーニングを実施した［２０；２１］。簡潔
には、多様なインキュベーションで単球から単離された全ＲＮＡ０．２μｇを、
商業的に入手可能なキット（ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＲＮＡＰＣＲコ
アキット、パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ドイツ）を使用
して、特異的に固定されたオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写した。使用され
たオリゴｄＴプライマーは、あるサブセットのｍＲＮＡが逆転写されるように、
最後から２番目の位置（３’端）の不変のＡおよび最後の位置のＡ、Ｃ、Ｇもし
くはＴより成るそれらの３’端の２個の追加のヌクレオチドを有した。ここで、
１３ｍｅｒのオリゴｄＴ（Ｔ１０１：５’Ｔ１１ＡＧ−２’）を２．５μＭ濃度
で２０μｌの反応で使用した。２．５単位のＴＡＱＤＮＡポリメラーゼおよび
１．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂を使用し、それぞれ２．５μＭの同一のオリゴｄＴお
よび自由裁量の１０ｍｅｒの上流プライマー（Ｄ２０５’−ＧＡＴＣＡＡＴＣ
ＧＣ−３’）を使用する２０μｌのＰＣＲ反応中で、ｃＤＮＡの１０分の１を増
幅した。増幅は、最後の周期の後に７２℃での５分の伸長を伴う、９４℃で３０
秒間の変性、４１℃で１分間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を
伴う４０周期であった。全部のＰＣＲ反応はパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）９６００サーモサイクラー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）、ドイツ）中で実施した。マルチフォール（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ
）ＩＩ電気泳動装置（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ドイツ）を使用す
る非変性条件下で、５％スタッキングゲルを伴う既成の(ready to use)１０％ポ
リアクリルアミドゲル（クリーンゲル（ＣｌｅａｎＧｅｌ）ラージ（Ｌａｒｇｅ
）−１０／４０ＥＴＣ、ドイツ）でＰＣＲ産物を分離した。ＤＮＡフラグメン
トは既に記述された［２２］とおりゲルの銀染色により可視化した。示差的に発現されたｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定目的のｃＤＮＡのバンドをゲルから切り取り、そしてゲル薄片を２０μｌの水
中で１０分間沸騰させることによりＤＮＡを単離した。２０μｌ体積中での後に
続くＰＣＲ反応に４μｌのアリコートを使用した。最終のｄＮＴＰ濃度がそれぞ
れ１Ｍｍであったことを除いて、上と同一のプライマーの組およびＰＣＲ条件を
使用してｃＤＮＡを再増幅した。再増幅されたｃＤＮＡを、ＡＢＣＣ８（ＳＵＲ
）ｅクローンキット（ｅＣｌｏｎｅ−Ｋｉｔ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ））を使用してｐＵＣ１８ベクター中にクローン化し、オートリード（Ａｕ
ｔｏＲｅａｄ）配列決定キット（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ドイツ
）を使用して自動蛍光ＤＮＡシークェンサーで配列決定し、そしてノーザンブロ
ット分析のプローブとして使用した［２３］。

【００４５】実施例２３日のＡｃＬＤＬインキュベーション、次いで１２時間のＨＤＬ₃インキュベー
ション後の単球およびマクロファージのノーザンブロット分析水簸された単球を２．５日間ＡｃＬＤＬ（培地１ｍｌあたり１００μｇ）とと
もにインキュベートするか、もしくは、対照としてＡｃＬＤＬの添加を伴わずに
同一時間の間分化させた。ＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）の発現は、ＡｃＬＤＬインキ
ュベーションで、分化された単球においてよりも４倍より強くアップレギュレー
トされる。ＡｃＬＤＬインキュベーション期間の後に細胞を洗浄し、そして、次
の１２時間ＨＤＬ₃とともに、もしくは対照として培地単独とともにインキュベ
ートした。ＡＢＣＧ１の発現は、ノーザンブロットにより確認されるとおり、Ｈ
ＤＬ₃インキュベーションによりほとんど完全にダウンレギュレートされ、また
、対照のインキュベーションでは穏やかにのみ減少される。効果的なコレステロ
ール負荷のためには、単球がマクロファージ様細胞に分化しなければならない。
この期間の間に、スカベンジャー受容体がアップレギュレートされ、そしてＡｃ
ＬＤＬの取り込みを促進し、コレステリルエステルの蓄積につながる。われわれ
は、ＡｃＬＤＬ依存性のコレステロール負荷に先立ち細胞を分化させるために、
細胞を標準培地中で４日間培養した。第４日に細胞を洗浄し、そして、細胞をコ
レステロールで負荷するため、ＡｃＬＤＬ（培地１ｍｌあたり１００μｇ）とと
もに、もしくは対照としてＡｃＬＤＬの非存在下で、さらなる１、２および３日
間インキュベートした。各時間点で細胞を０．１％ＳＤＳで溶解し、そして材料
および方法で記述されるとおり脂質を抽出し、また、細胞のコレステリルエステ
ルをＨＰＴＬＣ分離により測定した。細胞はＡｃＬＤＬ負荷３日後に細胞タンパ
ク質１ｍｇあたり１２０ｎｍｏｌまで時間依存性に負荷された一方、負荷されな
い細胞では、コレステリルエステルの蓄積は観察できなかった。

【００４６】ＨＤＬ₃依存性および非依存性のコレステロールの流出を識別するため、¹⁴Ｃ
−コレステロール（培地１ｍｌあたり１．５μＣｉ）の共インキュベーションを
用いて細胞にＡｃＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）を３日間適用した。細胞を洗浄し
、そしてＨＤＬ₃（１００μｇ／ｍｌ）でそれぞれ１２時間、２４時間および４
８時間脱負荷した。対照として、細胞を外因性の脂質受容体の添加を伴わずにイ
ンキュベートした。追跡期間後に、材料および方法で記述されたとおり、液体シ
ンチレーションにより培地および細胞中で¹⁴Ｃ−コレステロールの含有量を測定
した。コレステロールの流出は、総ＤＰＭ（細胞および培地中のカウント）の細
胞ＤＰＭのパーセントで表現する。ＨＤＬ₃を用いると、流出は内在性脂質受容
体としてのＨＤＬ₃の添加を伴わない流出よりもより速くかつより強い。１２時
間後、細胞のコレステロール含有量は、ＨＤＬ₃依存性の脱負荷を伴い６８％に
、また、ＨＤＬ₃非依存性の脱負荷で８６％に低下した。４８時間後、負荷され
た¹⁴Ｃ−コレステロールの３５％のみがＨＤＬ₃で処理された細胞で観察された
。対照的に、負荷された¹⁴Ｃ−コレステロールの７０％が未処理の細胞で見出さ
れた。

【００４７】ＡｃＬＤＬが適用された細胞においては、ＡＢＣＧ１のＲＮＡ発現がアップレ
ギュレートされている一方、ＡｃＬＤＬで負荷されなかった細胞ではアップレギ
ュレーションは出現しない。ＡｃＬＤＬで２日間負荷された細胞は、ＨＤＬ₃で
１２、２４および４８時間（１２ｈ；２４ｈ；４８ｈ）、ならびに外因性脂質受
容体の非存在下で脱負荷された。ＲＮＡ発現は、再度、ＨＤＬ₃で処理された細
胞で、いかなる外因性脂質受容体も伴わず処理された細胞でよりもより強くダウ
ンレギュレートされる。材料：マクロファージ培地（マクロファージ−ＳＦＭ）は、ドイツのギブコライフ
テクノロジーズ（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得
た。ヒト組換えＭ−ＣＳＦはドイツのジェンザイムディアグノスティックス（
ＧｅｎｚｙｍｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から得、また、アンチセンスホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドはドイツのバイオグノスティックス（Ｂｉｏｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ）により供給された。全部の他の化学物質はシグマ（Ｓｉｇｍａ
）から購入した。ナイロンメンブレンおよび³²Ｐ−ｄＣＴＰはドイツのアマーシ
ャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から、¹⁴Ｃ−コレステロールおよび³Ｈ−コリン塩化
物はドイツのＮＥＮから得、そして細胞培養皿はドイツのベクトンディッキン
ソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）である。全ＲＮＡの単離およびノーザンブロッティング各時間点（それぞれＡｃＬＤＬインキュベーションの前および後、ならびにＨ
ＤＬ₃インキュベーション後）で全ＲＮＡを単離した。洗浄された細胞をグアニ
ジンイソチオシアナート中で可溶化し、次いで塩化セシウムにより抽出物を沈降
させた［２４］。ノーザン分析には、６％ホルムアルデヒドを含有する１．２％
アガロースゲル中での電気泳動により１レーンあたり１０μｇの全ＲＮＡサンプ
ルを分画し、そしてナイロンメンブレン（シュライヒャーアンドシュル（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、ドイツ）にブロッティングした。
ＵＶ照射（ストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）モデル１８００、ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）で架橋した後に、メンブレンを
ＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）についてのｃＤＮＡプローブでハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はメンブレンの製造元により推奨された
とおり実施した。

【００４８】実施例３コレステロールの負荷および脱負荷後の単球およびマクロファージのウェスタン
ブロット分析ＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）のタンパク質発現は、ＡｃＬＤＬで負荷された単球由
来マクロファージでアップレギュレートされ、また、ＨＤＬ₃で脱負荷された単
球由来マクロファージでダウンレギュレートされる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レー
ンについて４０μｇの全タンパク質を用いて、材料および方法で記述されるよう
なＡＢＣＧ１に対するペプチド抗体を用いるウェスタンブロッティングを実施す
る。新しく単離された単球（第０日）および分化された単球（第４日）でＡＢＣ
Ｇ１のタンパク質発現が示される。第４日から第７日まで（５ｄ；６ｄ；７ｄ）
、単球由来マクロファージを、ＡｃＬＤＬを用いてもしくは対照としてＡｃＬＤ
Ｌを用いずに負荷した。第６日（６ｄ）からのＡｃＬＤＬで負荷された細胞を、
ＨＤＬ₃を用いて１２、２４および４８時間、ならびに外因性に添加されるＨＤ
Ｌ脂質受容体を伴わずに脱負荷した。ＡｃＬＤＬはタンパク質発現を増加させる
一方、ＨＤＬ₃は発現を再度正常レベルに低下させる。タンパク質の単離および測定各時間点で、細胞を０．１％ＳＤＳで溶解し、そしてタンパク質含有量をロウ
リ（Ｌｏｗｒｙ）ら［２５］の方法により測定した。ＡＢＣＧ１特異的抗体の生成合成ペプチド（ピネダ会社（Ｆａ．Ｐｉｎｅｄａ）、ベルリン）でのニワトリ
およびウサギの免疫感作によりＡＢＣＧ１特異的ペプチド抗体を生成させた。ペ
プチド配列は、アミノ酸ＲＥＤＬＨＣＤＩＤＥＴＣＨＦＱ（配列表の番号５３を
参照されたい）を含んで成るＡＢＣＧ１の細胞外ドメインｅｘＩＩＩのアミノ酸
残基６１３−６２８から選んだ。免疫感作の５８日後に、１０００倍希釈された
血清および１００００倍の二次ペルオキシダーゼ標識抗体を用いてウェスタンブ
ロッティングを実施した。電気泳動および免疫ブロッティングレーンあたり４０μｇの全細胞タンパク質を用いてＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を実施した。タンパク質を報告されたとおりイモビロン（Ｉｍｍｏ
ｂｉｌｏｎ）に転写した。電気ブロット後のゲルのクマシーブルー染色により転
写を確認した。５％脱脂粉乳中で最低２時間のブロッキングの後に、ブロットを
ＰＢＳ中で１５分間３回洗浄した。記述されたとおり生成された抗血清をＰＢＳ
中５％脱脂粉乳中１０００希釈で使用した。ブロットを１時間インキュベートし
た。室温でＰＢＳを用いての４回の洗浄後に、二次ペルオキシダーゼ標識ウサギ
抗ニワトリＩｇＧ抗体（１００００倍希釈された、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をＰ
ＢＳ中５％脱脂粉乳中で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの２回の洗浄後に
、ＥＣＬウェスタンブロット検出系（アマーシャムインターナショナルＰＬ
Ｃ（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰＬＣ）、英国）を用い
て免疫複合体の検出を実施した。蛍光共鳴エネルギー伝達：単球を氷上で１５分間特異的抗体で標識した（一方の抗体はビオチンにより標
識され、他方の抗体はフィコエリトリンにより標識される）。細胞を洗浄した後
に別の１５分間、Ｃｙ５結合ストレプトアビジンとともにインキュベートした。

【００４９】細胞表面上の抗体標識されたタンパク質の間の距離を、ＦＡＣＳｃａｎ（ベク
トンディッキンソン（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いてエネ
ルギー伝達により測定する。４８８ｎｍでの単一レーザー励起後のＣｙ５特異的
な発射は、ＰＥ結合抗体の近接に依存するＣｙ５の間接的励起を表す。ＰＥおよ
びＣｙ５の標識の強度ならびに二重の(dual)レーザー励起に基づく蛍光の非特異
的重なり合いについての標準化、ならびに別個に染色された対照サンプルとの比
較の後に、相対的伝達効率を計算した。

【００５０】実施例４ＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）およびＡＢＣ輸送体ファミリーの他のメンバーのコレス
テロール感受性潜在的な第二の半分の大きさのＡＢＣ輸送体を発見するために、ＡＢＣファミ
リーの他のメンバーに対するコレステロールの負荷および脱負荷の影響もまた検
討した。

【００５１】単球および単球由来のマクロファージ、ならびにコレステロールを負荷された
および脱負荷された単核食細胞で全部のヒトＡＢＣ輸送体の発現パターンを検査
するためのさらなる分析を実施した。

【００５２】別個のＰＣＲの定量的部分の発現を比較するための周期変動を伴うＲＴ−ＰＣ
Ｒにより実験を実施した。ＡＢＣ輸送体の発表された配列からプライマーの組を
生成した。ＧＡＰＤＨプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲを対照として使用した。

【００５３】数種のＡＢＣ輸送体もまたコレステロール感受性であり、これは、細胞の脂質
転送(trafficking)におけるＡＢＣ輸送体の機能をさらに支持する（表２）。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ別個のＰＣＲの定量的部分の発現を比較するための周期変動を伴うＲＴ−ＰＣ
Ｒを使用して、発現のＡｃＬＤＬ／ＨＤＬ₃感受性の調節について全部の既知の
ＡＢＣ輸送体を試験する。逆転写系（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｋｒｉｐｔｉ
ｏｎＳｙｓｔｅｍ）（プロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｏｒ
ｐ．）米国ウィスコンシン州）を使用する４０μｌの逆転写反応で１μｇの全Ｒ
ＮＡを使用した。このＲＴ反応の５μｌのアリコートを５０μｌのＰＣＲ反応で
使用した。９４℃での１．５分間の変性後に、９２．３℃４４秒間、６０．８℃
４０秒間（ある種のプライマーの組み合わせでは標準的アニーリング温度が異な
っている）、７１．５℃４６秒間、次いで７２℃で最後の５分の伸長を用いて３
５もしくはそれより少ない周期のＰＣＲを実施した。プライマーの組はＡＢＣ輸
送体の発表された配列から生成した。ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーを用いる
ＲＴ−ＰＣＲを対照として実施した。

【００５４】単球、単球由来のマクロファージ（５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含有する血
清を含まないマクロファージ−ＳＦＭ培地中で３日培養された単球）、ＡｃＬＤ
Ｌでインキュベートされた単球（１００μｇ／ｍｌで３日）次いでＨＤＬ₃（１
００μｇ／ｍｌ）でインキュベートされた単球でのＡＢＣ輸送体の発現パターン
を表２に示す。発現される遺伝子を半定量的ＰＣＲによりコレステロール感受性
について試験する。

【００５５】実施例５：アンチセンスオリゴヌクレオチド実験によるコレステロール感受性のＡＢＣＧ１
（ＡＢＣ８）輸送体遺伝子の機能分析コレステロールの負荷および脱負荷により調節されることを越えて、ＡＢＣＧ
１が脂質の負荷および脱負荷の過程に直接関与しているという疑問を取り扱うた
め、アンチセンス実験を実施した。

【００５６】多様な実験において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＤＬ₃へのコレ
ステロールおよびホスファチジルコリンの流出を減少させた。ＡｃＬＤＬでの負
荷期間の間、細胞を１７種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドとともに共
インキュベートした。コレステロールおよびリン脂質の流出を測定するため、負
荷期間中に、１．５μＣｉ／ｍｌの¹⁴Ｃ−コレステロールおよび３μＣｉ／ｍｌ
の³Ｈ−コリン塩化物を細胞に適用した。培地を交換し、そして追跡期間の間、
細胞をＨＤＬ₃とともにもしくはそれを伴わずに１２時間インキュベートした。
培地および細胞ライセート中の¹⁴Ｃ−コレステロールおよび³Ｈ−コリンの含有
量を測定し、また、総¹⁴Ｃ−コレステロールおよび³Ｈ−コリンの負荷のパーセ
ントで流出物を測定した。

【００５７】最も効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ番号２）は、コレステロ
ールおよびリン脂質の流出を、対照のアンチセンス（ＡＳ対照）で処理された細
胞に関して阻害した。それぞれ１６．７９％（５ｎｍｏｌのＡＳ）および３２．
０１％（１０ｎｍｏｌのＡＳ）のコレステロール流出の用量依存性の減少を示す
ことができた。アンチセンスのインキュベーションＡＢＣＧ１の誘導を阻害するため、ＡｃＬＤＬインキュベーション期間の間、
ＡＢＣＧ１に標的を定める３種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド、もし
くは１種の混合された(scrambled)対照アンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞
を処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の依存における単球からのコレステロール
およびホスファチジルコリンの流出の測定コレステロールおよびリン脂質の流出を測定するため、ＡｃＬＤＬインキュベ
ーションに加えて、１．５μＣｉ／ｍｌの¹⁴Ｃ−コレステロールおよび３μＣｉ
／ｍｌの³Ｈ−コリン塩化物を細胞に適用した。培地を交換し、そして、追跡期
間中に、細胞をＨＤＬ₃とともにもしくはそれを伴わずに１２時間インキュベー
トした。ブライ（Ｂｌｉｇｈ）とダイヤー（Ｄｙｅｒ）［２６］の方法に従って
脂質の抽出を実施した。培地および細胞ライセート中の¹⁴Ｃ−コレステロールお
よび³Ｈ−コリンの含有量を液体シンチレーション計数により測定し、また、記
述された［２７］とおり、総¹⁴Ｃ−コレステロールおよび³Ｈ−コリンの負荷の
パーセントで流出物を測定した。コンピュータ解析ドイツ・ハイデルベルクのＨＵＳＡＲ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｉｕｓ．ｅｍｂ
ｎｅｔ．ｄｋｆｚ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ：８０８０により提供されるプ
ログラムを使用して、ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析を実施した。

【００５８】実施例６ヒトＡＴＰ結合カセット輸送体１（ＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１））の完全なｃＤＮＡ
配列およびＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現のコレステロール感受性の調節の評価ｃＤＮＡのクローニングおよび一次タンパク質構造われわれは、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子の完全なコーディング領域を含有する６８
８０ｂｐのｃＤＮＡをクローン化した（図８）。６６０３ｂｐの読み取り枠は、
２２０ｋＤａの予測される分子量をもつ２２０１アミノ酸のタンパク質をコード
する。本タンパク質はマウスＡＢＣＡ１との整列においてアミノ酸レベルで９４
％の同一性を表し、そして従ってヒトの真正物(ortholog)とみなすことができる
。ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現の組織分布ＡＢＣＡ１の組織特異的発現を検査するため、５０種のヒト組織からのポリＡ ⁺ ＲＮＡを含有する複数の組織のＲＮＡのマスターブロットを実施した。ノーザ
ンブロット分析は全部の組織でのＡＢＣＡ１特異的シグナルの存在を立証する。
それは、主として、副腎、肝、肺、胎盤、およびこれまでに検査された全部の胎
児組織で顕著である（表１）。最も弱いシグナルは、腎、膵、下垂体、乳腺およ
び骨髄で見出される。ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現のステロールの調節コレステロールの負荷／枯渇の間の単球／マクロファージにおけるＡＢＣＡ１
の調節を決定するために、ノーザンブロット分析を実施した。プライマーＡＢＣ
Ａ１３６２２ｆ（ＣＧＴＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＧ−３’
）およびＡＢＣＡ１４６２０ｒ（ＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣ
Ａ−３’）を用いる５日分化された単球からのＲＮＡのＰＣＲ増幅由来のクロー
ン化された１０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、示差的に培養された単球のＲ
ＮＡを含有するノーザンブロットにハイブリダイズさせた（図１２）。レーン１
ないし５で見ることができるとおり、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡは、新しく単離され
た単球のインビトロ分化の間に第５日まで増大している。より長い培養は発現の
完全な喪失をもたらす。第４日に開始するステロール負荷を誘導するために細胞
をＡｃＬＤＬの存在下でインキュベートした場合（レーン６〜８）には、対照細
胞と比較してずっとより強いｍＲＮＡの蓄積を検出することができる（レーン２
〜５）。これらの細胞をコレステロール受容体としてのＨＤＬ₃とともに１２時
間、２４時間および４８時間培養した場合（レーン９〜１１）、ＡＢＣＡ１のシ
グナルは、ＤＨＬ₃の非存在下でインキュベートされた対照細胞に関して有意に
減少する（レーン１２〜１４）。一緒にすれば、これらの結果は、ＡＢＣＡ１が
、コレステロール負荷により誘導されそしてコレステロール枯渇によりダウンレ
ギュレートされるステロール感受性の遺伝子であることを示している。細胞培養末梢血単球を白血球搬出および向流水簸法（１９ＪＢＣ）により単離した。９
０％より多いＣＤ１４陽性の単核食細胞を含有する画分を得るために、細胞をプ
ールし、そして、３７℃で空気中５％ＣＯ₂中、多様な時間の間、２５Ｕ／ｍｌ
の組換えヒトＭ−ＣＳＦ（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ））を含有するマクロ
ファージＳＦＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）中でプラスチックのペトリ
皿上で培養した。細胞をＡｃＬＤＬの非存在（分化対照）、もしくはステロール
負荷を誘導するためにＡｃＬＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベー
トした。このインキュベーション後に、細胞からその受容体ＨＤＬ₃へのコレス
テロールの流出を達成するため、ＨＤＬ₃（１００μｇ／ｍｌ）で補充されたも
しくはそれを含まない新鮮な培地中で付加的な時間の間、細胞を培養した。ＲＮＡの調製およびノーザンブロット分析全細胞ＲＮＡをグアニジンイソチオシアナート溶解およびＣｓＣｌ遠心分離（
シャーグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ））により細胞から単離した。単離されたＲ
ＮＡを分光光度的に定量し、そして１５μｇのサンプルを１．２％アガロース−
ホルムアルデヒドゲルで分離し、そしてナイロンメンブレン（シュライヒャー
アンドシュル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈuｌｌ））に転写した。Ｕ
Ｖ照射（ストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）モデル１８００、スト
ラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で架橋した後に、プライマーＡＢＣＡ１
３６２２ｆおよびＡＢＣＡ１４６２０ｒを用いたＰＣＲ増幅由来の１０００
ｂｐのＤＮＡフラグメントとメンブレンをハイブリダイズさせ、はぎ取り(strip
ped)、そしてその後ヒトβ−アクチンプローブでハイブリダイズした。ＡＢＣＡ
１の組織特異的発現を決定するために、５０種のヒト組織からのポリＡ⁺ＲＮＡ
を含有する複数の組織のＲＮＡのマスターブロットをクロンテック（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）から購入した。ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのオリゴラベ
リング（Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）キットを使用してプローブを［γ−³²Ｐ
］ｄＣＴＰ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で放射標識した。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄の条件は既に記述された方法（ビルカ（Ｖｉｒｃａ））
に従って実施した。ヒトＡＢＣＡ１のｃＤＮＡクローニングヒトＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１）のｃＤＮＡを増幅するために、われわれは、マウ
スＡＢＣＡ１のｃＤＮＡの配列情報に基づき、ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライ
マーを設計した。パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）からのＲＮ
ＡＰＣＲコアキットを使用して、５日分化された単核食細胞からのおよそ１μ
ｇのＲＮＡを２０μｌの反応中で逆転写した。アンプリタックゴールド（Ａｍ
ｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ）（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）
）および以下のプライマーの組み合わせを用いて実施された１００μｌのＰＣＲ
反応でｃＤＮＡの１個のアリコートを使用した：（プライマー名は対応するマウ
スｃＤＮＡ配列中の位置を示す）：ｍＡＢＣ１−１４４ｆ（５’−ＣＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧ
Ａ−３’）およびｍＡＢＣ１−６４３ｒ（５’−ＴＡＧＣＣＴＴＧＣＡＡＡ−ＡＡＴＡＣＣＴＴＣ
ＴＧ−３’）、ｍＡＢＣ１−１２２１ｆ（５’−ＧＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＣＴＣＴＡＴＡＣＡ
ＣＣＴＧ−３’）およびｍＡＢＣ１−１９１０ｒ（５’−ＣＧＴＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣ
ＣＴＧ−３’）、ｍＡＢＣ１−３６２２ｆ（５’−ＴＣＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＡ
−３’）およびｍＡＢＣ１−４６２０ｒ（５’−ＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＴＣＴＧ
ＡＡ−３’）、ｍＡＢＣ１−５０５６ｆ（５’−ＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＧＡ
ＴＧ−３’）およびｍＡＢＣ１−５８５７ｒ（５’−ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＧ
ＧＴ−３’）、ｍＡＢＣ１−６０９３ｆ（５’−ＡＡＧＡＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＡ−ＧＴＴＣＴ
ＴＴＧ−３’）およびｍＡＢＣ１−７０５１ｒ（５’−ＣＣＣＴＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＴＴＣ
ＴＣ−３’）、ｈＡＢＣ１−５４０ｆ（５’−ＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＧＴＡＴ
Ｃ−３’）およびｈＡＢＣ１−１３００ｒ（５’−ＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡ−ＧＧＴＣＴＴＧＴＴ
ＣＡＣ−３’）、ｈＡＢＣ１−１８３１ｆ（５’−ＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧ
ＣＧ−３’）およびｈＡＢＣ１−３７０１ｒ（５’−ＡＴＡＧＧＴＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＡＴ
ＧＴ−３’）、ｈＡＢＣ１−４５３２ｆ（５’−ＧＣＴＧＣＣ−ＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡ
ＡＡＣ−３’）およびｈＡＢＣ１−５１３４ｒ（５’−ＧＣＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＧＣＴＣＣ−ＴＧ
ＧＡＴＣ−３’）、ｈＡＢＣ１−５８００ｆ（５’−ＧＡＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＧ
ＡＡ−３’）およびｈＡＢＣ１−６２５９ｒ（５’−ＣＴＴＧＡＣＡＡＣＡＣＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡ
ＡＴ−３’）。

【００５９】全部のＰＣＲ産物をｐＵＣ１８プラスミドベクターにクローン化し、そして、
ジデオキシチェーンターミネーター法および蛍光色素標識プライマーを使用して
、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＡＬＦエクスプレス（ＡＬＦｅｘｐｒｅ
ｓｓ）シークェンサーでヌクレオチド配列を決定した。

【００６０】実施例７ＡＢＣＧ１の５’端の同定われわれは、５’ＲＡＣＥのアプローチを使用してヒト単球／マクロファージ
のｍＲＮＡから得られた、クルップ（Ｃｒｏｏｐ）［６］により発表された５’
端と異なる、チェン（Ｃｈｅｎ）［７］により発表されたＡＢＣＧ１の５’端を
部分的に証明することができた。詳細には、位置２５の下流のチェン（Ｃｈｅｎ
）らによる配列はわれわれ自身のデータと一致した。対照的に、われわれの同定
された配列は、位置２５の上流の部位（チェン（Ｃｈｅｎ）［７］）で、チェン
（Ｃｈｅｎ）［７］およびクルップ（Ｃｒｏｏｐ）［６］により報告されたもの
と異なっている。配列、配列番号３２は、新たに同定された５’端、次いで位置
２５からチェン（Ｃｈｅｎ）［７］により発表された配列を示す。ＡＢＣＧ１の５’ＵＴＲの分子クローニングおよび特徴づけわれわれは、ヒトＡＢＣＧ１遺伝子の５’ＵＴＲの上流配列の全体でおよそ３
ｋｂを含有したλファージライブラリーのスクリーニングにより数種のフラグメ
ントを同定した。５’ＵＴＲおよびエキソン１の一部（上述される）を含んで成
る配列を配列番号５４に示す。

【００６１】本配列のプロモーター活性は、一過性にトランスフェクションされたＣＨＯ細
胞中でのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより証明された。

【００６２】トランスファック（ＴｒａｎｓＦａｃ）データベース（ＧＦＢ、ドイツ・ブラ
ウンシュヴァイク）から推定されるような一致された(matched)配列についての
最高の見込み比をもつプロモーター領域内の推定の転写因子結合部位。ＳＰ−１
、ＡＰ−１、ＡＰ−２およびＣＣＡＡＴ結合因子（Ｃ／ＥＢＰファミリー）の複
数の結合部位が、推定のプロモーター領域の最初の１ｋｂ内に存在する。

【００６３】加えて、アポリポタンパク質Ｂの調節に関与する転写因子結合部位を同定した
。

【００６４】実施例８ヒトＡＢＣＡ８の完全長のｃＤＮＡの特徴づけ推定のＡＢＣＡ８のコーディング配列は大きさがおよそ６．５ｋｂである。わ
れわれは、成熟ポリペプチドの推定の第二のヌクレオチド結合部位をコードする
ヒトＡＢＣＡ８のｃＤＮＡの１ｋｂのセグメントを成功裏にクローン化しかつ配
列決定した（該配列を配列表中に示す）。該ヌクレオチド配列は、既知のヒトＡ
ＢＣＡ１（ＡＢＣ１）のｃＤＮＡ配列と７３％の相同性を表す。

【００６５】われわれは、７２ｂｐのセグメントより成るクローン化された１ｋｂのコーデ
ィング領域中のもう１つの(alternative)転写物を同定した（配列表を参照され
たい）。本領域のゲノム分析は、もう１つの配列が完全なイントロンと同一であ
ることを示し、もう１つのｍＲＮＡがイントロン保持により生成されることを示
唆している。保持されるイントロンは末端前の(preterminal)終始コドンを導入
し、そして従って短縮されたＡＢＣＡ８変異体をコードすることができる。

【００６６】ＡＢＣＡ８はまたｍＲＮＡ発現のコレステロール感受性の調節も示す（表２）
。

【００６７】ＡＢＣＡ８の組織発現を表１に示す。

【００６８】実施例９ケラチノサイト細胞（ＨａＣａＴ）の分化の間のＡＢＣ輸送体の調節の特徴づけ表皮のケラチノサイトの分化は、スフィンゴ脂質（ＳＬ）、遊離脂肪酸（ＦＦ
Ａ）、コレステロール（ＣＨ）およびコレステロールスルフェート（全部は表皮
の浸透性障壁の確立に関与している）より主として構成される特殊な脂質の合成
を伴う。皮膚およびとりわけ表皮の増殖層は、生物体全体の脂質合成の最も活発
な部位の１つである。正常なヒト表皮におけるコレステロール合成はＬＤＬ非依
存性であり、そして循環するコレステロールレベルは皮膚の新たなコレステロー
ル合成に影響を及ぼさない。完全に分化した正常なヒトケラチノサイトはＬＤＬ
レセプターを欠くか、もしくは、その発現は非常に低い一方、正常なヒト表皮中
では基底細胞のみがＬＤＬレセプターを発現する。

【００６９】ケラチノサイトの分化の間には、極性のグリセロリン脂質から中性脂質（ＦＦ
Ａ、ＴＧ）への移動、およびまた長鎖の高度に飽和されたＦＦＡによる短鎖ＦＦ
Ａの置き換えも観察される。皮膚の障壁機能に最も重要な脂質はスフィンゴ脂質
であり、これは、角質層中の脂質の３分の１の源泉であり、そして、細胞内グリ
コシダーゼによるグルコシルセラミド分解およびセラミドの新たな合成の結果と
しての大きなセラミド画分より成る。

【００７０】グルコシルセラミドは細胞内で合成され、そして層状体中に貯蔵され、また、
グルコシルセラミド合成酵素の発現はヒトケラチノサイトの分化の間にアップレ
ギュレートされることが見出された。

【００７１】コレステロールスルフェートは、ケラチノサイトの分化の間にコレステロール
スルホトランスフェラーゼの作用により形成される。コレステロールスルフェー
トおよび分解する酵素、ステロイドスルファターゼは全部の生存可能な表皮層中
に存在し、顆粒層で最高レベルである。角質層を横断（内側層から外側層まで）
するコレステロールスルフェート含有量の勾配、およびコレステロールスルフェ
ートの漸進性の脱硫酸化が、それぞれ、細胞の粘着性、ならびに正常な角質層の
角化および落屑を調節する。コレステロールスルフェートはトランスグルタミナ
ーゼ１を誘導し、そして双方の因子の協同的調節が正常な角化に不可欠である。

【００７２】脂質障壁形成の最終段階は、層状体の分泌、および、同時に放出される加水分
解酵素（β−グルコセレブロシダーゼ、ホスホリパーゼ、ステロイドスルファタ
ーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ）の作用による極性の脂質のそれらの非極性
脂質生成物へのその後の分泌後プロセシングを必要とする。浸透性障壁の***は
、根底にある表皮での増大されたコレステロール、脂肪酸およびセラミドの合成
をもたらす。コレステロール、脂肪酸およびセラミドの合成に必要とされる重要
な酵素のｍＲＮＡレベルが人工的障壁***後に迅速に増大したことが示されてい
る。

【００７３】現在、ケラチノサイトにおける脂質輸送系は不十分に特徴づけられている。数
種の脂肪酸輸送関連タンパク質がケラチノサイトで同定されており（原形質膜脂
肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ）および細胞内脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ
））、それらの大部分は必須脂肪酸に対する高親和性を表す。表皮のＦＡＢＰの
発現は過増殖性および炎症性の皮膚疾患で、ケラチノサイトの分化および障壁の
***の間にアップレギュレートされている。

【００７４】われわれは、マクロファージに関するデータに基づき、数種のＡＢＣ輸送体を
ケラチノサイトでの細胞の脂質輸送の推定の候補として提案している。われわれ
は、ＨａＣａＴ細胞の分化の間の全部の既知のＡＢＣ輸送体の発現を検査した。
ヒトＨａＣａＴ細胞系は完全な表皮分化能力を有する。低カルシウム濃度（＜０
．１ｍＭ）で単層としてインビトロで成長されたケラチノサイトは、培地中のカ
ルシウム濃度を増大させる（１〜２ｍＭ）ことにより分化させることができる。
われわれは、１０％ケレックス（ｃｈｅｌｅｘ）処理されたＦＣＳ、ペニシリン
およびストレプトマイシンで補充された、比３：１で標準的ハム（Ｈａｍ）Ｆ１
２培地と混合されたカルシウムを含まないＲＭＰＩ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））培
地中でＨａＣａＴ細胞を単層として培養した。上の培地中のカルシウムの最終濃
度は０．０６ｍＭであった。細胞がコンフルエンスに達した（通常、培養の第５
日）場合に、カルシウム濃度を１．２ｍＭのレベルまで高めた。２×１０⁵／ｃ
ｍ²の密度で細胞を６０ｍｍ培養皿中で植え付けた。培地を２日ごとに置き換え
、そして細胞をそれぞれ培養物中で２４時間、４８時間、４日、６日、８日およ
び１０日後に収穫した。イソチオシアナート／塩化セシウム超遠心分離法を使用
して、ＨａＣａＴ細胞から全ＲＮＡを単離した。

【００７５】半定量的ＲＴ−ＰＣＲのアプローチを使用して、ＨａＣａＴ細胞の分化の間の
全部の既知のヒトＡＢＣ輸送体の発現を検査した（それぞれ、２４時間、４８時
間、４日、６日、８日、１０日）（表６）。ＡＢＣ輸送体の発表された配列から
プライマーの組を生成させた。ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーを対照として使
用した。ケラチノサイトの分化のマーカーとして、ＣＧＴ（セラミドグルコシル
トランスフェラーゼ）遺伝子発現を評価した。検査された輸送体の３種、ＡＢＣ
Ｂ１（ＭＤＲ１）、ＡＢＣＢ４（ＭＤＲ３）、ＡＢＣＤ３（ＰＭＰ７０）は発現
されなかった。ＡＢＣＣ６（ＭＲＰ６）、ＡＢＣＡ１（ＡＢＣ１）、ＡＢＣＤ２
（ＡＬＤＲ）およびＡＢＣＢ９（ｅｓｔ１２２２３４）は低レベルで発現された
（表６）。

【００７６】他の輸送体の大部分は、ケラチノサイトの分化の間に、二相性の発現パターン
を表したか、もしくはダウンレギュレートされた。しかしながら、コレステロー
ル、ＦＦＡおよびセラミドのバックボーンの脂質の終末のケラチノサイト脂質分
泌でのそれらの関与を暗示するＡＢＣＧ１（ＡＢＣ８）、ＡＢＣＡ８（新規）お
よびＡＢＣＣ３（ＭＲＰ３）の高発現が存在した。ペルオキシソームへの非常に
長鎖の脂肪酸の輸送を媒介する２種のペルオキシソームＡＢＣ輸送体、ＡＢＣＤ
２（ＡＬＤＲ）およびＡＢＣＤ１（ＡＬＤＰ）は、当初比較的低レベルで発現さ
れ、そしてその後、分化の間にダウンレギュレートされた。これは、ケラチノサ
イトの分化の間の非常に長鎖の脂肪酸による短鎖脂肪酸の置き換えと一致する。

【００７７】実施例１０：タンジアー病の患者の５家族のＡＢＣＡ１のｃＤＮＡの配列決定およびゲノム
構造は、ＡＢＣＡ１の遺伝子座の多様な突然変異を示した。これらの患者はＡＢ
ＣＡ１遺伝子の多様な位置に多様な突然変異を有し、それはＡＢＣＡ１のタンパ
ク質構造の変化をもたらす。これらの突然変異についてヘテロ接合性である家族
のメンバーは低下されたレベルの血清ＨＤＬを示す一方、ホモ接合性の患者は極
めて低下されたＨＤＬの血清レベルを有する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１ないし５】発明にかかる、本出願に記述されるヌクレオチドおよびタンパク質配列を示して
いる。これら配列は配列表に反復される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 29/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＷＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人Ｂａｙｅｒｗｒｋ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，ＢＲＤＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 CA12 DA01 DA02 DA03 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA87Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 BA01 BA02 BA22 ZA45 ZB11 ZC33 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号２に示されるようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能かつそれに最
低７０％同一であるポリヌクレオチド；および（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメン
トより成る群から選択されるメンバーを含んで成るポリヌクレオチド。
【請求項２】ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌク
レオチド。
【請求項３】請求項１および２のポリヌクレオチドの１種もしくはそれ以
上を含有するベクター。
【請求項４】請求項３のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項５】請求項４の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされるポリ
ペプチドを発現することを含んで成る、ポリペプチドの製造方法。
【請求項６】（ａ）配列番号２の推定されるアミノ酸配列ならびにそのフ
ラグメント、類似物および誘導体を有するポリペプチド、ならびに（ｂ）配列番号２のアミノ酸１ないしアミノ酸２２０１を含んで成るポリペプチ
ドより成る群から選択されるポリペプチド。
【請求項７】請求項６のポリペプチドに結合することが可能な抗体。
【請求項８】請求項６のポリペプチドの検出のための診断キット。
【請求項９】前記ポリペプチドのモジュレーターを検出するためのアッセ
イにおける、（ａ）配列番号１、３、４および６ないし３１に示されるようなポリヌクレオチ
ド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能かつそれに最
低７０％同一であるポリヌクレオチド；ならびに（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメン
トより成る群から選択されるメンバーを含んで成るポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチドの使用。
【請求項１０】（ａ）配列番号１、３、４および６ないし３１に示される
ようなポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能かつそれに最
低７０％同一であるポリヌクレオチド；ならびに（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメン
トより成る群から選択されるメンバーを含んで成るポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチドのモジュレーター。
【請求項１１】請求項１０のモジュレーターを含んで成る医薬。
【請求項１２】（ａ）配列番号１、３、４および６ないし３２および５４
に示されるようなポリヌクレオチド；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能かつそれに最
低７０％同一であるポリヌクレオチド；ならびに（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメン
トより成る群から選択されるメンバーを含んで成るポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチドを検出するためのアッセイ。