JP2002525041A

JP2002525041A - 連鎖球菌性Ｃβタンパク質組成物

Info

Publication number: JP2002525041A
Application number: JP2000570287A
Authority: JP
Inventors: カレンオー．ロング−ロウ，; ミランエス．ブレイク，
Original assignee: ノースアメリカンワクチン，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2002-08-13
Also published as: PL347058A1; NO20011381D0; NO20011381L; AU6049599A; CA2343051A1; CZ2001951A3; EP1114143A4; HUP0103502A2; SK3482001A3; WO2000015760A1; EP1114143A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、オプソニン貪食性機構に関与せずに、補体単独を用いて殺菌性であるグラム陽性細菌に対する抗体を惹起するタンパク質フラグメントまたはペプチド（図１に示されるアミノ酸配列の８２８〜１０２７位間の少なくとも８アミノ酸のペプチド配列を含む免疫原性ＩｇＧ結合ドメインを含む）ならびにそれを含むワクチンおよび結合体に関する。本発明はまた、このタンパク質フラグメントまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、このようなポリヌクレオチド分子を含むベクターおよびこのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明は、実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフラグメントおよび／もしくは変異体を得るためのプロセスに関する。本発明はまた、動物において免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、薬学的に受容可能なキャリア中の治療的に有効な量の本発明のワクチンを動物に投与する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、補体単独を有する、グラム陽性細菌（すなわち、その活性はオプソ
ニン貪食性機構に依存しない）に対して殺菌性である抗体を惹起するタンパク質
フラグメントまたはペプチドに関する。本発明はまた、Ｂ群連鎖球菌β抗原のフ
ラグメントならびにヒトＩｇＡに結合する能力が低減したかまたは排除されたそ
の変異体に関する。これらのフラグメントは、Ｂ群連鎖球菌に対する結合体ワク
チンを処方するために有用な免疫学的特性を保持する。本発明はまた、Ｂ群連鎖
球菌Ｃβタンパク質ならびにその変異体および／またはフラグメントの単離およ
び精製に関する。

【０００２】（関連する技術）連鎖球菌は、それらの細胞壁多糖の抗原性および構造に基づいていくつかの群
に整列されている、大きくかつ多様なグラム陽性細菌のセットである（Ｌａｎｃ
ｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５７：５７１−５９５（１９３
３）；Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ
．ａｎｄＭｅｄ．３８：４７３−４７８（１９３８））。これらの群の２つは
、重篤なヒト感染と関連づけられている。Ａ群連鎖球菌に分類されているものは
、最も一般的な細菌であり、そして「ストレプ喉（ｓｔｒｅｐｔｈｒｏａｔ）
」を引き起こす生物である。Ａ群連鎖球菌の生物はまた、リウマチ熱、連鎖球菌
インペチゴ、および敗血症のより重篤な感染と関連づけられている。

【０００３】Ｂ群連鎖球菌は、１９７０年代初期までは標準的な医学テキスト中ではヒト病
原体としては知られていなかった。その時点以降、研究により、Ｂ群連鎖球菌が
、重要な周産期の病原であることが、米国ならびに発展途上国の両方において示
されている（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｌ．およびＨａａｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ
ｏｆｔｈｅＣｅｎｔｒａｌＮｅｒｖｏｕｓＳｙｓｔｅｍ，Ｒａｖｅｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，ＮｅｗＹｏｒｋ、３１３−３３３頁（１９９１））
。誕生から最初の２ヶ月の間の全身性Ｂ群連鎖球菌感染は、１０００人の新生児
あたり３人の新生児に罹患し（Ｄｉｌｌｏｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｊｒ．ら、Ｊ．Ｐｅｄ
ｉａｔ．１１０：３１−３６（１９８７））、毎年米国において１１，０００症
例を生じる。これらの感染は、先天性肺炎、敗血症、および髄膜炎の症状を引き
起こす。実質的な数のこれらの幼児が死亡するか、または永久的な神経学的後遺
症を有する。さらに、これらのＢ群連鎖球菌感染は、高い妊娠関連罹患率に関連
づけられ得、これは、毎年ほぼ５０，０００人の女性に生じる。その他、Ｂ群連
鎖球菌感染の危険性を有する者は、先天的に、化学療法的に、またはその他の手
段のいずれかにより、免疫応答を変更されている者を含む。

【０００４】Ｂ群連鎖球菌は、さらに、細菌の莢膜多糖に基づいて少なくとも９の異なる型
（例えば、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩ
Ｉ）に分類され得る。最も病原的に重要なこれらの異なる型は、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、およびＶ型莢膜多糖を有する連鎖球菌である。これらの４つの型の
Ｂ群連鎖球菌は、全ての報告された症例の９０％を超える症例を表す。これらの
種々の多糖の型の各々の構造は、解明されており、そして特徴づけられている（
Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２：１２５８−
１２６３（１９８３）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．５８：１１２−１２０（１９８０）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：２９３１−２９３５（１９
８０）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１７
９３−１７９８（１９８３）；Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６２：８２６２−８２６７（１９８７））。多くの他のヒト細菌病原
体において見出されているように、Ｇ群連鎖球菌の莢膜多糖が、ワクチンとして
使用された場合、これらの細菌による感染に対して非常に効果的な、効力のある
防御を提供することが確認されている。これは、最初にＬａｎｃｅｆｉｅｌｄ（
Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４２：１６２−１
７０（１９７５））により、そしてより最近では、Ｋａｓｐｅｒおよびその共同
研究者の多数の研究（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
１９：１１８０−１１８５（１９８８）；Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ
．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４０：８１−８６（１９７９）；Ｋａｓｐｅｒ，Ｄ
．Ｌ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４９：３２７−３３９（１９７９）；Ｍａｄ
ｏｆｆ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：２８６−２９２（１
９９４）；Ｍａｒｑｕｅｓ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１
５９３−１５９９（１９９４）；Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１４２８−１４３３（１９９０）；Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｍ．
Ｒ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：４７６０−４７６６（１９９３）；
Ｗｙｌｅ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２６：５１４−５２２（
１９７２））において記録された。しかし、多くの他の莢膜多糖ワクチン（Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３９−４４（１９
７２）；Ｇｏｌｄ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５６：１５３６−１
５４７（１９７５）；Ｇｏｌｄ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３６Ｓ
；Ｓ３１−Ｓ３５（１９７７）；Ｇｏｌｄ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄ
ｉｓ．１３８：７３１−７３５（１９７８）；Ｍａｋｅｌａ，Ｐ．Ｒ．Ｈ．ら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３６：Ｓ４３−５０（１９７７）；Ｐｅｌｔｏｌ
ａ，Ａ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ６０：７３０−７３７（１９７７）；Ｐｅ
ｌｔｏｌａ，Ｈ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９７：６８６−６９１（１
９７７））とほぼ同様に、純粋なＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、およびＩＩＩ型莢膜炭水化
物から処方されたワクチンは、比較的弱い免疫原であり、そして１８ヶ月齢未満
の子供においてほとんど効力を有さない（Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．およびＫａｓｐ
ｅｒ，Ｄ．Ｌ．、Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．７：４５８−４６７（１９８５）；
Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１１８０−１１
８５（１９８８）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３２２：１８５７−１８６０（１９９０））。これらの純粋な多糖は、Ｔ細胞依
存性抗原として分類される。なぜなら、それらは、Ｔリンパ球を欠失する動物に
おいて類似の免疫学的応答を誘導するからである（Ｈｏｗａｒｄ，Ｊ．Ｇ．ら、
Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６１４−６２６（１９７１））。これらの多糖
は、二次ブースター応答を誘発しないと考えられる。なぜなら、それらは、Ｔ細
胞と相互作用しないからであり、それゆえ、種々のサイトカインを分泌すること
による引き続く「ヘルパー応答」を誘発しないからである。この理由により、ワ
クチンとしての多糖のそれぞれの連続する投与は、一定量の抗体を放出させる一
方、Ｔ細胞依存性抗原は、それが投与されるたびに、ますます増加する濃度の抗
体を誘発する。

【０００５】ＧｏｅｂｅｌおよびＡｖｅｒｙは、１９３１年に、純粋な多糖をタンパク質に
共有結合することにより、それらが、多糖単独を使用することによっては達成さ
れ得ないその多糖に対する免疫応答を誘発し得ることを見出した（Ａｖｅｒｙ，
Ｏ．Ｔ．およびＧｏｅｂｅｌ，Ｗ．Ｆ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５４：４３７−
４４７（１９３１）；Ｇｏｅｂｅｌ，Ｗ．Ｆ．およびＡｖｅｒｙ，Ｏ．Ｔ．、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５４：４３１−４３６（１９３１））。これらの観察は、現
在の結合体ワクチン技術を開始しそしてその基礎を形成した。多数の研究が、そ
の後続き、これらは、多糖がワクチンとして投与される前にタンパク質に結合し
た場合、多糖に対する免疫応答が、Ｔ非依存性応答から、Ｔ依存性応答に変化す
ることを示す。総説については、Ｄｉｃｋ，Ｗ．Ｅ．，Ｊｒ．およびＢｅｕｒｒ
ｅｔ，Ｍ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃ
ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅａｎｔｉｇｅｎｓ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔ
ｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｇｙ．Ｃｒｕｓｅら編
、４８〜１１４頁（１９８９）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．およびＳｏｏｄ，
Ｒ．Ｋ．，Ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｅｅ，Ｙ．Ｃ．およびＬｅｅ，Ｒ．Ｔ．
編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，３２５−３７１頁（１
９９４）；およびＲｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｂ．およびＳｃｈｎｅｅｒｓｏｎ，Ｒ．
，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：８２１−８３２（１９９０）を参照のこ
と。現在、これらの多糖タンパク質結合体ワクチンのほとんどは、周知のタンパ
ク質（例えば、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドまたはそれらの変
異体）とともに処方される。これらのタンパク質は、元々使用された。なぜなら
、それらは、既に、ヒトへの使用のために認可されており、そして充分に特徴づ
けられていたからである。しかし、ますます多くの多糖がこれらのタンパク質に
結合され、ワクチンとして使用されるにつれ、同じタンパク質を使用する種々の
ワクチン間での干渉が目立ってきた。例えば、いくつかの異なる多糖が、破傷風
毒素に結合され、連続的に与えられた場合、最初に投与された多糖結合体に対す
るその免疫応答は、最後に投与されたものよりもずっと大きい。しかし、その多
糖の各々が、異なるタンパク質に結合され、そして連続的に投与された場合、そ
の多糖の各々に対する免疫応答は、同じであろう。担体抑制は、この観察された
現象を記載するために使用される用語である。この問題を克服するための１つの
アプローチは、タンパク質および多糖を、それらが同じ生物から由来するように
マッチさせることである。

【０００６】Ｂ群連鎖球菌を分類しそして亜群化するために使用される種々の抗原のうち、
１つは、Ｉｂｃ抗原として知られるタンパク質であった。このタンパク質抗原は
、最初に、ＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＥａｇｏｎによって１９７１年に記載され
（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｗ．およびＥａｇｏｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．４：５９６−６０４（１９７１））、そしてαおよびβと名付けら
れる２つの異なるタンパク質からできていることが知られていた。その後、Ｉｂ
ｃ抗原は、Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄおよびその共同研究者によって感染のマウスモ
デルにおいてワクチン抗原として使用された場合、有効であることが示された（
Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４２：１６５−１
７９（１９７５））。

【０００７】Ｂ群連鎖球菌のβ抗原（Ｃβ）タンパク質のその単離、精製、および機能的特
徴づけは、Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらによって達成された（Ｒｕｓｓｅｌ−
Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｊ．およびＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ，Ｅ．Ｃ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１６０：１４７６−１４８４（１９８４）；Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓ，
Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１４６７−１４７５（１９８４））
。

【０００８】種々のＧＢＳ株由来の表面タンパク質のＩｇＡ結合活性を試験するにあたり、
Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓらは、最初に、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００
界面活性剤法を使用してＣβタンパク質を抽出した（Ｒｕｄｄｅｌｌ−Ｊｏｎｅ
ｓ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１４６７−１４７５（１９８４
））。それらは、ＩｇＡ結合活性と一貫して関連づけられる１３０ｋＤのタンパ
ク質を同定したが、そのタンパク質は、常に、より小さなタンパク質に汚染され
ており、そのうちのいくらかのみがＩｇＡに結合したに過ぎなかった。彼らは、
これらのより低分子量のタンパク質が、特徴づけられていない細菌プロテアーゼ
からの分解産物であると予想した。Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓらは、タンパク質
分解活性を、ホットＳＤＳにおいてＣβタンパク質を抽出することによって低減
し、次いで、そのタンパク質をＳＤＳゲルクロマトグラフィーによって精製した
。彼らは、実質的に純粋なタンパク質を得たが、この方法は、最終的な産物を、
細菌多糖への引き続く結合のために充分な量および純度で提供しなかった。

【０００９】Ｍａｄｏｆｆらは、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣβタンパク質の電気溶出
を使用してＣβタンパク質を得た（Ｍａｄｏｆｆら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
．６０（１２）：４９８９−４９９４（１９９２））。この方法はまた、スケー
ルアップには役立たなかった。Ｊｅｒｌｓｒｏｍら（１９９６）は、Ｃβタンパ
ク質フラグメントを過剰発現した細胞において産生された封入体からＣβタンパ
ク質のフラグメントを得た（Ｊｅｒｌｓｒｏｍら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
６４（７）：２７８７−２７９３（１９９６））。その封入体をまず、８Ｍ尿素
中で可溶化した。次いで、その得られる上清を、ＭｏｎｏＱ（登録商標）イオン
交換カラムを使用してＦＰＬＣに供した。収量および純度は、詳細に記載されな
かったが、いくらかの程度の精製が、単に封入体を単離することによって達成さ
れたようである。

【００１０】Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓらは、Ｃβタンパク質の特性の１つが、ヒトＩｇＡ
免疫グロブリン特異的に結合することであることを実証した。ＩｇＡ分子上の結
合部位は、この免疫グロブリンの重鎖のＦｃ部分に局在していた。彼らは、さら
に、Ｃβタンパク質が、推定分子量１３０ｋＤを有する単一のポリペプチドから
なることを示した。Ｃβタンパク質の発現を担う遺伝子をクローニングし（Ｃｌ
ｅａｔ，Ｐ．Ｈ．およびＴｉｍｍｉｓ，Ｋ．Ｎ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
５５：１１５１−１１５５（１９８７））、そしてＴｉｍｍｉｓによって率いら
れるグループによって配列決定された（Ｊｅｒｌｓｒｏｍ，Ｐ．Ｇ．ら、Ｍｏｌ
ｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：８４３−８４９（１９９１））。彼らの後の研
究は、ＩｇＡ結合活性が、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位で始まり
、そしてＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位でおわることによって規定さ
れる遺伝子の７４６ｂｐのＤＮＡフラグメントに帰せられ得ることを実証した。

【００１１】以前に述べたように、１９７５年のＬａｎｃｅｆｉｅｌｄの研究は、Ｉｂｃ抗
原が、Ｂ群連鎖球菌感染のマウスモデルにおいて有効なワクチン抗原であること
を示した（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４２：
１６５−１７９（１９７５））。Ｉｂｃ抗原のαまたはβタンパク質成分が、こ
の産生を担うことは、その時点では明確ではない。Ｍａｄｏｆｆらは、この問題
に光を照らし、そしてワクチンとして使用した精製されたＣβタンパク質が、こ
のタンパク質を発現するＢ群連鎖球菌での実験的な感染から幼児マウスを防御す
ることを実証した（Ｍａｄｏｆｆ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６
０：４９８９−４９９４（１９９２））。Ｍａｄｏｆｆらはまた、彼らがＩＩＩ
型連鎖球菌莢膜多糖をＣβタンパク質に結合させた場合、このワクチンが、幼児
マウスを、ＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌（Ｃβを発現しない）またはＩｂ型Ｂ群連鎖球
菌（Ｃβを発現するが、ＩＩＩ型莢膜多糖を欠く）のいずれかへの感染から防御
することを示した（Ｍａｄｏｆｆ、Ｌ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９４：２８６−２９２（１９９４））。従って、このＣβタンパク質結合体ワク
チンは、いくつかの機能に役立つ：その多糖は、多糖莢膜に対する防御的抗体を
惹起し、そしてＣβタンパク質は、そのタンパク質に対する防御的抗体を惹起し
、さらに、多糖に対する免疫応答を、Ｔ非依存性応答からＴ依存性応答へと改変
した。

【００１２】この多糖Ｃβタンパク質結合体ストラテジーは、マウスにおいて良好に働く。
しかし、明らかに、その目的は、ヒトをＢ群連鎖球菌感染から防御することであ
る。この同じストラテジーをヒトにおいて使用することにおける唯一の警告は、
Ｃβタンパク質が、ヒトＩｇＡ免疫グロブリンに非特異的に結合することである
（ＣβはマウスＩｇＡに特異的に結合しない）。ＣβのこのヒトＩｇＡ結合活性
は、ヒトに対する多糖Ｃβタンパク質結合体ワクチンの効力を減少させ得る。な
ぜなら、ＩｇＡに結合した抗原は、抗原特異的抗体応答が生成されないほど迅速
にシステムからクリアされ得るからである。さらに、Ｃβタンパク質上の潜在的
に防御的なエピトープは、ヒトＩｇＡがＣβ分子に結合するときに、隠され得る
。従って、ＩｇＡ結合能を欠くが、天然の構造をできるだけ保持する変異体Ｃβ
タンパク質を得ることは有利である。

【００１３】この目的を意に留めて、いくつかのグループが、Ｃβタンパク質のＩｇＡ結合
領域を決定することを試みた。ＢｒａｄｙおよびＢｏｙｌｅ（Ｉｎｆｅｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．５７：１５７３−１５８１（１９８９））は、ＩｇＡのＦｃ領域に結合
しないＢ群連鎖球菌β抗原の特定の形態を同定した。ＢｒａｄｙおよびＢｏｙｌ
ｅはまた、かれらの研究において試験した特定の株が、抗原の低分子量の形態を
分泌したことを観察した。ＨＧ８０６は、ヒトＩｇＡ−Ｆｃ結合を示さなかった
およそ３８ｋＤの形態を分泌した。２つの他の株、２ＡＲおよびＤＬ４７１Ｂは
、およそ５５ｋＤおよび５３ｋＤの形態を、それぞれ分泌した。しかし、これら
の形態は、ＩｇＡ−Ｆｃ結合を示した。

【００１４】さらに、Ｊｅｒｌｓｔｒｏｍら（Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：８４
３−８４９（１９９１））は、Ｃβタンパク質のサブフラグメントが、ＩｇＡに
結合し得るＣβタンパク質の２つの領域を同定するために融合タンパク質として
発現された実験を使用した。これらの実験は、ＩｇＡ結合ドメインを、Ｃβタン
パク質の、７４７ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＨｐａＩフラグメントおよび１４６１ｂｐ
のＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに局在化した。

【００１５】米国特許第５，５９５，７４０号および同第５，７６６，６０６号は、このド
メインを包含するより大きな領域を欠失し、そしてＩｇＡに結合しないＣβタン
パク質の欠失変異体を記載する。さらに、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５３１
９は、Ｃβタンパク質の１２アミノ酸ドメインを記載し、この変異体は、ＩｇＡ
結合が低減したかまたは排除されている。

【００１６】（発明の要旨）本発明は、グラム陽性細菌に対して殺菌性である抗体を、補体単独を用いて惹
起する（すなわち、その活性がオプソニン貪食性（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙ
ｔｏｔｉｃ）機構依存性ではない）タンパク質フラグメントまたはペプチドに関
する。

【００１７】本発明はまた、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）β抗原に関連するタンパク質フラグメ
ントまたはペプチドに関し、この抗原はこのタンパク質の免疫原性ＩｇＧ結合ド
メインを含む。好ましくは、このタンパク質フラグメントまたはペプチドによる
結合ＩｇＡは、減少するかはまたは排除される。

【００１８】特に、本発明は、プロリンリッチ領域を含むタンパク質フラグメントまたはペ
プチドに関し、ここで少なくとも３番目毎の残基がプロリンである。好ましい実
施態様において、このタンパク質フラグメントまたはペプチドは、式：−［Ｐ−
Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂］_r−または−［Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ］_rを有す
る連続する（反復）アミノ酸配列を含み、ここでＹ₁は酸性アミノ酸残基または
塩基性アミノ酸残基のいずれかを表し、Ｙ₂は中性アミノ酸を表し、そしてｒは
１〜５の範囲であり得る整数である。より好ましくは、Ｙ₁はＤまたはＫであり
、そしてＹ₂はＶまたはＬである。より好ましくはまた、ｒは４である。最も好
ましくは、Ｙ₂は、疎水性アミノ酸である。

【００１９】本発明はまた、式Ｘ−Ｙ−Ｚを有する本発明のタンパク質フラグメントまたは
ペプチドに関し、ここでＸは、図１（配列番号２）（野生型Ｃβタンパク質）の
アミノ酸８２７と１０２７との間の少なくとも８個の連続するアミノ酸残基を表
し、ＹはＸに結合される水素あるいはＸに結合される図１（配列番号２）のＮ末
端配列またはそのＮ末端フラグメントもしくは変異体を表し、そしてＺは、Ｘに
結合される水素あるいはＸに結合される図１（配列番号２）のＣ末端配列または
そのＣ末端フラグメントもしくは変異体を表し、ただし、Ｙに存在する場合、図
１（配列番号２）のアミノ酸１〜１６４の少なくとも１つは非野生型であり、た
だし、さらに、このタンパク質は図１（配列番号２）のアミノ酸配列のＮ末端フ
ラグメントもしくはＣ末端フラグメントの少なくとも１つである。

【００２０】本発明はまた、上記の本発明のペプチドまたはタンパク質フラグメントに関し
、ここで、ＹはＡ−Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂−Ｂを含むアミ
ノ酸を表し、ここでＡは図１（配列番号２）に示される配列のアミノ酸１〜１６
４またはそのＮ末端フラグメントを含み、Ｂはアミノ酸１７７から開始しそして
Ｘに結合されるアミノ酸で終止する配列を表し、そしてＸ₁−Ｘ₁₂は、各々、Ａ
ｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、結合、およ
び図１（配列番号２）に示される配列の対応する位置に見出される野生型アミノ
酸からなる群より独立して選択され、ここでこのアミノ酸位置は、このタンパク
質をコードするネイティブのアミノ酸配列の最初のアミノ酸から番号付けられ、
ただし、Ｘ₁からＸ₁₂（両端を含む）の少なくとも１つは、野生型アミノ酸とは
異なる。

【００２１】本発明はまた、本発明のペプチドまたはタンパク質フラグメントをコードする
ポリヌクレオチド分子、ならびにこのようなポリヌクレオチド分子を含むベクタ
ー、およびこのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。

【００２２】本発明はまた、莢膜ポリサッカリドに共有結合した本発明のペプチドまたはタ
ンパク質フラグメントを含む結合体に関する。あるいは、このペプチドまたはタ
ンパク質フラグメントは、ポーリンタンパク質、プロテオソーム、または他のキ
ャリアタンパク質と結合体化または複合体化され得る。

【００２３】本発明はまた、本発明のペプチドまたはタンパク質フラグメントおよび薬学的
に受容可能なキャリアを含むワクチンに関する。

【００２４】本発明はまた、動物において免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、本
発明のワクチンを動物に有効量で投与する工程を包含する。

【００２５】本発明はまた、実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフラグメントおよび
／もしくは変異体を得るためのプロセスに監視、この方法は以下の工程：（ａ）細胞抽出物においてＣβタンパク質を得る工程；（ｂ）このＣβタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、そしてこ
のＣβタンパク質含有画分を収集する工程；（ｃ）このＣβタンパク質含有画分をプールし、そして希釈する工程；ならび
に（ｄ）この希釈したＣβタンパク質含有画分をリガンドアフィニティークロマ
トグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーに供し、そしてその画分を収集
する工程、を包含し；それにより、実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフ
ラグメントおよび／もしくは変異体が得られる。

【００２６】本発明はさらに、Ｃβタンパク質またはフラグメントおよび／もしくは変異体
を、細菌細胞から得るためのプロセスに関し、この細菌細胞はこのＣβタンパク
質またはそのフラグメントおよび／もしくは変異体をコードするヌクレオチド配
列でトランスフェクトされており、ここでこの細胞は、このＣβタンパク質また
はそのフラグメントおよび／もしくは変異体を過剰発現する。

【００２７】本発明はまた、Ｃβタンパク質を天然に産生する細菌細胞から、Ｃβタンパク
質を得るためのプロセスに関する。

【００２８】（好ましい実施態様の詳細な説明）本発明の抗原性タンパク質フラグメントおよびペプチドは、補体単独を用いた
連鎖球菌を殺傷し得る抗体を惹起することが見出された。この殺菌活性は、細菌
が白血球内で殺傷されるオプソニン貪食性とは異なり、それに対して特異的な抗
体を用いての、グラム陽性細菌では全く観察されていない。事実、Ｃβタンパク
質を発現する連鎖球菌夾膜ポリサッカリドによって惹起された抗体は、白血球が
存在しない場合、連鎖球菌を殺傷しない。

【００２９】Ｃβタンパク質の抗原性特徴の調査は、グラム陽性細菌のなかで共有される特
徴を有する抗原性領域の発見をもたらした。Ｃβタンパク質のこの領域のアミノ
酸配列に基づくタンパク質フラグメントおよびペプチドに対して惹起された抗体
は、殺菌活性を有しており、この活性は、オプソニン貪食性機構に依存しない。
従って、本発明は、補体単独でグラム陽性細菌に対して殺菌性（すなわち、オプ
ソニン貪食性機構に依存しない活性）である抗体を惹起するタンパク質フラグメ
ントまたはペプチドに関する。

【００３０】本発明の抗原性のタンパク質フラグメントおよびペプチドは、ネイティブタン
パク質のＣ末端におけるグラム陽性アミノ酸配列に由来し、そして細菌細胞壁に
包埋されていると考えられる。ネイティブな細菌タンパク質において、本発明の
タンパク質フラグメントおよびペプチドに対応する抗原性領域は、細胞***事象
の間に抗体結合に曝露される。１個の細菌が、２つの細菌を形成することを開始
する領域において、細胞壁が小片に***し、そして再形成される。この領域は、
中隔面として知られている。***時の間、この領域において、抗原性領域が、補
体の抗体結合および活性化のために利用可能であることは正確である。共焦点顕
微鏡の結果（実施例１３）は、そのタンパク質フラグメントに対して生成された
抗体が中隔面の領域に特異的に結合し、そしてより多くの抗体が、非***性の細
胞ではなく、能動的に***する細胞へと結合することを明らかに示す。ＦＡＣＳ
ｃａｎ分析の結果は、これらの結果を確認し、そしてこの観察に対するさらなる
証拠を追加した。さらに、Ｃｏｌｅｍａｎらは、以前に類似の観察を行っていた
。

【００３１】Ｃｏｌｅｍａｎらは、コロイド金免疫標識を用いて、Ｂ群連鎖球菌における免
疫グロブリン結合部位およびＣβ抗原を研究した。Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８：３３２−３４０（１９９０）。コロイド金を、Ｉｇ
Ａと結合体化させて、ＩｇＡ結合特性を特徴付け、そしてＩｇＧと結合体化させ
て、ＩｇＧ結合を特徴付けた。Ｃｏｌｅｍａｎらの電子顕微鏡写真は、非免疫性
ヒトＩｇＡ結合が細菌表面に渡って分布しているが、抗Ｃβ特異的ＩｇＧ結合が
、***中の細菌細胞の中隔面を規定する領域に局在化していたことを示した。

【００３２】従って、本発明の１つの課題は、Ｃβタンパク質における特定の部位がこの特
有の殺菌活性を行い得る抗体を惹起することを担うか否かを決定することであっ
た。そのような部位の同定によって、Ｂ群連鎖球菌についてのワクチンにＣβタ
ンパク質が含まれていることを確実にすることができる。

【００３３】特に、本発明は、プロリンリッチ領域を含むタンパク質フラグメントまたはペ
プチドに関する。ここで、少なくとも３残基ごとにプロリンが存在し、そしてそ
のタンパク質フラグメントまたはペプチドに対して惹起された抗体は、補体単独
を用いて、グラム陽性細菌に対して殺菌性である。好ましい実施態様において、
本発明は、以下の式を有する連続的な（反復された）アミノ酸配列を含むタンパ
ク質フラグメントまたはペプチドに関する：−［Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂］ _r −または−［Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ］_r−（ここで、Ｙ₁は、酸性アミノ
酸残基もしくは塩基性アミノ酸残基のいずれかを表し、Ｙ₂は、中性アミノ酸を
表し、そしてｒは、１〜５の整数である）。より好ましくは、Ｙ₁は、Ｄまたは
Ｋであり、そしてＹ₂はＶまたはＬである。より好ましくはまた、ｒは４である
。最も好ましくは、Ｙ₂は疎水性アミノ酸である。

【００３４】別の実施態様において、このタンパク質フラグメントまたはペプチドは、以下
の式を有する連続的（反復された）アミノ酸配列を含む：−［Ｐ−Ｄ−Ｙ₃−Ｐ
−Ｋ−Ｌ］_r−または−［Ｋ−Ｌ−Ｐ−Ｄ−Ｙ₃−Ｐ］_r−（ここで、Ｙ₃は、Ｖま
たはＡを表す）。より好ましくは、Ｙ₃は、Ｖである。より好ましくはまた、ｒ
は少なくとも３である。

【００３５】別の実施態様において、このタンパク質フラグメントもしくはペプチドは、式
−［Ｓ−Ｐ−Ｋ−Ｙ₄−Ｐ−Ｅ−Ａ−Ｐ−Ｙ₅−Ｖ−Ｐ−Ｅ］_r−を有する連続的
（反復）アミノ酸配列を包含する。ここで、Ｙ₄は、ＴまたはＡを表し、そして
Ｙ₅は、ＨまたはＲを表す。より好ましくはＹ₄は、Ｔであり、そしてＹ₅はＨで
ある。また、より好ましくは、ｒは少なくとも３である。

【００３６】本発明はまた、本発明のペプチドまたはタンパク質フラグメントに関し、これ
らは、上記の抗体を誘発し得る免疫原性ＩｇＧ結合ドメインを含む。好ましくは
、このタンパク質フラグメントもしくはペプチドによるＩｇＡ結合が減少もしく
は除去されている。好ましい実施態様において、このドメインは、少なくとも８
アミノ酸の配列のペプチド配列を、図１に示したアミノ酸配列（配列番号２）の
およそ８２８位とおよそ１０２７位との間に含む。

【００３７】別の好ましい実施態様において、本発明は、式Ｙ−Ｘ−Ｚを有するアミノ酸配
列を含む、本発明のペプチドもしくはタンパク質フラグメントに関する。ここで
、Ｘは、図１（配列番号２）のアミノ酸８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含
む）の間の少なくとも８個の連続するアミノ酸残基を表し、Ｙは、Ｘに結合した
、水素もしくは図１（配列番号２）のＮ末端アミノ酸配列、またはそのＮ末端フ
ラグメントおよび／もしくは変異体を表し、そしてＺは、水素もしくはＸに結合
した図１（配列番号２）のＣ末端アミノ酸配列またはそのＣ末端フラグメントお
よび／もしくは変異体を表し、ただし、図１（配列番号２）のアミノ酸１〜１６
４の少なくとも１がＹに存在する場合、非野生型であり、そしてさらに、そのタ
ンパク質は、図１のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端フラグメントもしくは
Ｃ末端フラグメントの少なくとも１つである。より好ましくは、Ｙは、少なくと
も、図１（配列番号２）のアミノ酸１〜１７６を含まない。また、より好ましく
は、Ｚは、図１（配列番号２）の少なくともアミノ酸９０１を含む。また、より
好ましくは、本発明のペプチドもしくはタンパク質フラグメントは、配列番号３
１のアミノ酸配列ではない。また、より好ましくは、本発明のペプチドもしくは
タンパク質フラグメントは、それぞれ、Ｂ群連鎖球菌株２ＡＲ、ＤＬ４７１Ｂま
たはＨＧ８０６から分泌される、およそ５５ｋＤのポリペプチドでも、およそ５
３ｋＤのポリペプチドでも、およそ３８ｋＤのポリペプチドでもない。

【００３８】好ましくは、エピトープ性配列Ｘは、以下からなる群より選択される：ＰＰＫ
ＴＰＤＶＰ（配列番号３２）、ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号３３）、ＫＬＰＤＶ
ＰＫＬ（配列番号３４）、ＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号３５）、ＫＬＰＤＡＰＫ
Ｌ（配列番号３６）、ＡＰＫＬＰＤＧＬ（配列番号３７）、ＥＴＰＤＴＰＫＩ（
配列番号３８）、ＲＴＶＲＬＡＬＧ（配列番号３９）、およびＧＧＧＴＶＲＶＦ
（配列番号４０）。好ましい実施態様において、Ｘは、図１（配列番号２）のア
ミノ酸８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含む）の間の８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０または２１個の連続す
るアミノ酸残基の任意の１つを表す。

【００３９】別の実施態様において、本発明は、図１（配列番号２）に示される配列のアミ
ノ酸８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含む）の間のアミノ酸配列の任意の８
個の連続する残基からなるアミノ酸配列を含む、ペプチドもしくはタンパク質フ
ラグメントに関する。より好ましくは、８つの連続する残基は、以下からなる群
より選択される：ＰＰＫＴＰＤＶＰ（配列番号３２）、ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列
番号３３）、ＫＬＰＤＶＰＫＬ（配列番号３４）、ＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号
３５）、ＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号３６）、ＡＰＫＬＰＤＧＬ（配列番号３７
）、ＥＴＰＤＴＰＫＩ（配列番号３８）、ＲＴＶＲＬＡＬＧ（配列番号３９）、
およびＧＧＧＴＶＲＶＦ（配列番号４０）。

【００４０】別の実施態様において、本発明は、式Ｙ−Ｘ−Ｚを有するタンパク質フラグメ
ントもしくはペプチドに関する。ここで、Ｘは、図１（配列番号２）のアミノ酸
８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含む）の間の任意の２０個の連続するアミ
ノ酸残基を表し、Ｙは、Ｘに結合した、水素もしくは図１（配列番号２）のＮ末
端アミノ酸配列、またはそのＮ末端フラグメントおよび／もしくは変異体を表し
、そして、そしてＺは、水素もしくはＸに結合した図１（配列番号２）のＣ末端
アミノ酸配列またはそのＣ末端フラグメントおよび／もしくは変異体を表し、た
だし、図１（配列番号２）のアミノ酸１〜１６４の少なくとも１がＹに存在する
場合、非野生型であり、そしてさらに、そのタンパク質は、図１のアミノ酸配列
（配列番号２）のＮ末端フラグメントもしくはＣ末端フラグメントの少なくとも
１つである。より好ましくは、Ｘは、以下からなる群より選択される：ＳＰＫＴ
ＰＥＡＰＫＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰ（配列番号４１）、ＰＥＡＰＫＩＰＥＰＰＫ
ＴＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号４２）、ＫＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰ
ＫＬ（配列番号４３）、ＰＰＫＴＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号
４４）、ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号４５）およびＫ
ＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号４６）。また、より好まし
くは、Ｙは、少なくとも、図１（配列番号２）のアミノ酸１〜１７６を含まない
。

【００４１】別の実施態様において、本発明は、図１（配列番号２）に示される配列のアミ
ノ酸８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含む）の間のアミノ酸配列の任意の２
０個の連続する残基を含む、ペプチドもしくはタンパク質フラグメントに関する
。より好ましくは、２０の残基は、以下からなる群より選択される：ＳＰＫＴＰ
ＥＡＰＫＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰ（配列番号４１）、ＰＥＡＰＫＩＰＥＰＰＫＴ
ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号４２）、ＫＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫ
Ｌ（配列番号４３）、ＰＰＫＴＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号４
４）、ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号４５）およびＫＬ
ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号４６）。

【００４２】別の実施態様において、本発明は、式Ｙ−Ｘ−Ｚを有するペプチドもしくはタ
ンパク質フラグメントに関する。ここで、Ｘは、図１（配列番号２）のアミノ酸
８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含む）の間の少なくとも２１個のの連続す
るアミノ酸残基を表し、Ｙは、Ｘに結合した、水素もしくは図１（配列番号２）
のＮ末端アミノ酸配列、またはそのＮ末端フラグメントおよび／もしくは変異体
を表し、そしてＺは、水素もしくはＸに結合した図１（配列番号２）のＣ末端ア
ミノ酸配列またはそのＣ末端フラグメントおよび／もしくは変異体を表し、ただ
し、図１（配列番号２）のアミノ酸１〜１６４の少なくとも１がＹに存在する場
合、非野生型であり、そしてさらに、そのタンパク質は、図１のアミノ酸配列（
配列番号２）のＮ末端フラグメントもしくはＣ末端フラグメントの少なくとも１
つである。より好ましくは、Ｘは、図１（配列番号２）に示す配列のアミノ酸８
２８とアミノ酸１０２７と（両端含む）の間のアミノ酸配列からなる。また、よ
り好ましくは、Ｙは、少なくとも、図１（配列番号２）のアミノ酸１〜１７６を
含まない。

【００４３】別の実施態様において、本発明は、図１（配列番号２）に示される配列のアミ
ノ酸８２８とアミノ酸１０２７と（両端を含む）の間のアミノ酸配列の少なくと
も２１個の連続する残基からなるアミノ酸配列を含む、ペプチドもしくはタンパ
ク質フラグメントに関する。より好ましくは、本発明のペプチドもしくはタンパ
ク質フラグメントは、アミノ酸配列ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤ
ＡＰＫＬ（配列番号４７）からなるアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、本発
明のペプチドもしくはタンパク質フラグメントは、図１に示す配列（配列番号２
）のアミノ酸８２８とアミノ酸１０２７と（両端含む）間のアミノ酸配列からな
るアミノ酸配列を含む。

【００４４】Ｊｅｒｌｓｏｒｏｅｍ，Ｐ．Ｇ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｏ．５：
８４３−８４９（１９９１）の番号付け体系を図１において、および他の場所に
おいて、本発明の配列を参照する際に利用してきたが、本発明のペプチド、タン
パク質フラグメントおよび核酸はまた、Ｈｅｄｅｎ、Ｌ−Ｏ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４８１−１４９０（１９９１）において開示されるよ
うな野生型Ｃβタンパク質配列に関することが留意されるべきである。

【００４５】ＪｅｒｌｓｔｏｒｅｍらおよびＨｅｄｅｎらによって開示される配列は、互い
に関連するマイナーな変種のみを示すが、２つのアミノ酸の相違は、本発明に包
含される変種の例として特に留意される。図１に示すＪｅｒｌｓｔｏｅｒｍらの
配列は、８７８位にＬｙｓを示すが、Ｈｅｄｅｎらの配列における対応するアミ
ノ酸はＧｌｕである。また、Ｊｅｒｌｓｔｒｏｅｍら、は、ＰＶＤＰＫＬ（配列
番号５１）の３つの完全反復を示すが、Ｈｅｄｅｎらは、その６つの残基の配列
の２つのみの完全反復を示す（Ｈｅｄｅｎらの配列の「３番目」の反復はＨｅｒ
ｌｓｔｒｏｅｍらの配列の８９７位に対応するＶａｌの代わりにＡｌａを有する
）。そのような変種は、本明細書に記載されるような反復配列を読む場合の、Ｄ
ＮＡポリメラーゼの「揺れ」またはスリップ鎖合成に起因し得る。従って、本発
明のタンパク質および核酸は、ＪｅｒｌｓｏｔｒｏｅｍらおよびＨｅｄｅｎらに
よって開示される配列間に存在するようなそのようなマイナーな変種を包含する
。

【００４６】図１（配列番号２）に示す野生型Ｃβ配列のおよそアミノ酸残基１６３とおよ
そアミノ酸残基１７６との間に位置するＣβタンパク質の領域の変異は、ＩｇＡ
結合特性を減じたかまたは除去したが、その抗原性の大部分を維持するようにそ
の三次元構造を充分に保持するタンパク質フラグメントもしくはペプチドを生じ
る（実施例４および実施例５）。この領域のアミノ酸の置換もしくは欠失は、Ｉ
ｇＡ結合を減ずるかまたは除去するが、そのタンパク質の抗原性を維持する。従
って、ＩｇＡを結合しないタンパク質を完成するようにＣβポリペプチドのアミ
ノ酸配列を変更し得る。ＩｇＡ結合を除去する適切なアミノ酸置換としては、異
なる特性を有するアミノ酸で、１つ以上の残基を置換することを包含する。例え
ば、強力な親水性アミノ酸は、強力な疎水性アミノ酸に置き換えられ得る。一緒
にグループ化され得るアミノ酸としては、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕおよびＩｌｅ、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒ、酸性残基Ａｓｐおよび
Ｇｌｕ、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ、なら
びに芳香族残基ＰｈｒおよびＴｙｒが挙げられる。従って、当業者は，ＩｇＡ結
合を減ずるかまたは除去するために、Ｃβタンパク質におけるおよその残基１６
３と残基１７６との間の領域において適切なアミノ酸置換もしくは欠失を決定す
る方法を理解する。

【００４７】さらに、アミノ酸変化が、機能に対して有意に有害な効果を有するようである
ことについての指針は、Ｂｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ
ｔｈｅＭｅｓｓａｇｅｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌ
ｅｒａｎｃｅｔｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、
Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において見出され得
る。

【００４８】従って、別の局面において、本発明はまた、上記し、かつＩｇＡ結合を欠くペ
プチドもしくはタンパク質フラグメントに関し、特に、Ｙは、Ａ−Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂−Ｂを含むアミノ酸配列を表し、ここで、Ａは、
図１に示す配列（配列番号２）のアミノ酸１〜１６４を含むか、またはそのＮ末
端フラグメントを含み、Ｂは、アミノ酸１７７に始まり、そしてＸに結合したア
ミノ酸で終わる配列を表し、そしてＸ₁〜Ｘ₁₂は、互いに独立して、Ａｌａ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、結合および図１に示
す配列（配列番号２）の対応する位置において見出される野生型アミノ酸からな
る群より選択される。ここで、アミノ酸の位置は、タンパク質をコードするネイ
ティブのアミノ酸配列の第一のアミノ酸から番号付けされる。ただし、Ｘ₁〜Ｘ₁ ₂ の（両端含む）少なくとも１つは、野生型アミノ酸以外である。

【００４９】本発明はまた，上記し、かつＩｇＡ結合を欠くペプチドもしくはタンパク質フ
ラグメントに関し、特に、Ｙは、Ａ−Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁ ₂ −Ｂを含むアミノ酸配列を表す。特に好ましい実施態様において、アミノ酸Ｘ₇ およびＸ₁₂は、Ａｌａ（配列番号３）である。別の好ましい実施態様において、
アミノ酸Ｘ₄およびＸ₁₁はＰｒｏである（配列番号４）。別の好ましい実施態様
において、アミノ酸Ｘ₇は、Ｔｈｒであり、そしてアミノ酸Ｘ₁₂は、Ｌｅｕであ
る（配列番号５）。より好ましい実施態様において、アミノ酸Ｘ₅、Ｘ₇、Ｘ₈、
Ｘ₁₀、Ｘ₁₁およびＸ₁₂は各々、結合で置き換えられる（配列番号６）。

【００５０】好ましい実施態様において、本発明のタンパク質フラグメントおよびペプチド
は、実質的に純粋である。

【００５１】ＣβのＩｇＡ結合活性は、Ｃβの二量体化を必要とし得る。従って、ＣβのＩ
ｇＧ結合領域が上記のように変異されていない場合でさえも、二量体化に必要と
考えられる、Ｃβの領域の変異は、ＩｇＡを結合し得ない形態のＣβを生じ得る
。残基７２９から図１に示す配列（配列番号２）のＣ末端までのＣβ部分の欠失
は、Ｃβの二量体化を除去する。この知見を支持する実験の結果は表１に見出さ
れ得る。Ｃβのいくつかのフラグメントを、２つの異なるベクターの各々に挿入
した。表に示した配列が外側にむく括弧の前または後に存在する場合、これは、
Ｃβ配列がそのフラグメントのその末端においてはさらに伸長しないこと、すな
わち、ベクターに挿入されたヌクレオチド配列がＣβ配列の示されたアミノ酸の
みでかつそれ以外をコードしないことを示す。表に示した配列が省略記号（．．
．）の前または後に存在する場合、これは、そのフラグメントのその末端におい
てＣβ配列の残りもまた、そのベクターに含まれることを示す。その表の上半分
に示すペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ベクターｐＴＯＰＥまたはベ
クターｐＥＴ１７ｂのいずれかに挿入した。これらのベクターの両方は、Ｔ７プ
ロモーターから、挿入されたフラグメントの発現を可能にし、そして両方が、φ
１０キャプシドタンパク質Ｎ末端のフラグメントからその挿入物によってコード
されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質を生成する。しかし、ｐＥＴ１７ｂは
、φ１０タンパク質の８アミノ酸のみをコードするが、ｐＴＯＰＥは、φ１０タ
ンパク質の２８８のアミノ酸フラグメントをコードする。

【００５２】

【表１】表１に示すように、ｐＥＴ１７ｂから生成されたＣβの特定のフラグメントは
、ＩｇＡ結合の減少を示すが、ｐＴＯＰＥによって生成された同じフラグメント
は、ＩｇＡを結合し得る。試験したフラグメントは、二量体化に関与すると予測
されるＣβの領域を欠くが、推定のＩｇＡ結合ドメインにおける変異を何ら含ま
ない（表１の末尾に示すベクターｐＥＴ２４ｂに挿入されたＣβフラグメントは
、推定の二量体化領域を含むが、それにもかかわらず、上記のようにＩｇＡ結合
ドメインにおける変異に起因するＩｇＡ結合の減少を示すことに留意のこと）。
これらのＣβフラグメントは、ｐＴＯＥから生成される場合にＩｇＡに結合する
ことが推測される。なぜなら、φ１０タンパク質の２８８アミノ酸フラグメント
がＣβフラグメントの二量体化を可能にするからである。これは、φ１０キャプ
シドタンパク質が通常オリゴマーを形成するという事実に起因し得る；従ってオ
リゴマー化を担う領域は、挿入されたＣβフラグメントの二量体化を可能にし、
従ってＩｇＡ結合を可能にする。従って、本発明はまた、Ｃβの二量体化ドメイ
ンにおいて変異を有するペプチドまたはタンパク質フラグメントに関し、ここで
、その変異Ｃβタンパク質は、ＩｇＡを結合し得ない。当然、野生型のＣβタン
パク質の抗原性をできるだけ多く維持するペプチドまたはフラグメントを結合す
る非ＩｇＡを生成する目的において、Ｃβの二量体化は、妨害されるべきではな
い。

【００５３】好ましい実施態様では、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配列の少なく
とも１つのアミノ酸残基５２１〜５４１は、（ａ）欠失されたか、または（ｂ）
改変されたかのいずれかであり、その結果、このタンパク質は、ＣβがＥ，ｃｏ
ｌｉで産生された場合、この領域で切断されない。より好ましい実施態様では、
図１（配列番号２）に示される配列のアミノ酸残基５３３から５４１の少なくと
も１つは、（ａ）欠失されたか、または（ｂ）改変されたかのいずれかである。
よりずっと好ましい実施態様では、アミノ酸残基５３７および５３８の少なくと
も１つが（ａ）欠失されたか、または（ｂ）改変されたかのいずれかである。も
ちろん、当業者は、他の適切なアミノ酸置換を、慣用の実験によって、およびｖ
ｏｎＨｅｉｊｎｅ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：４６８３−
４６９０（１９８６）による文献に参照することにより決定し得る。

【００５４】Ｃβタンパク質は、野生型の状態では、膜結合型であるので、上記のＣβタン
パク質、変異体、および／またはフラグメントの精製を、Ｃβタンパク質の膜貫
通ドメインの疎水性残基を除去することにより改善することが可能である（この
膜貫通ドメインは、図１（配列番号２）に示された配列の残基１０９５から１１
２７に相当する）。これは、疎水性残基（図１（配列番号２）に示される配列の
残基１１０８〜１１１６）に代わって非疎水性残基を置換することによるか、ま
たはそれら疎水性残基の欠失によって達成され得る。膜結合型Ｃβの精製は界面
活性剤の使用を必要とするが、一方、疎水性膜貫通領域を欠く変異体Ｃβは、界
面活性剤を使用することなく精製され得る。従って、本発明はまた、膜貫通ドメ
インを構成する９つの疎水性残基が欠失されたか、または非疎水性アミノ酸によ
って置換されている、ペプチドまたはペプチドフラグメントに関する。

【００５５】Ｅ．ｃｏｌｉからのＣβタンパク質の産生は、問題があり得る。なぜなら、こ
のタンパク質は、特定の領域で切断されるからである。これは、おそらく、Ｅ．
ｃｏｌｉシグナルペプチダーゼによってである。この切断は、短縮型タンパク質
を生じる。これは、ワクチンにとって理想的ではないかもしれない。なぜなら、
それは、野生型Ｃβタンパク質の抗原性エピトープを欠き得るからである。切断
部位は、配列分析によって、およびマトリクス補助レーザー脱離開始飛行時間（
ｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｅｄｔｉｍｅｏｆｆ
ｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））に
よって推定されている。切断部位は、図１（配列番号２）に示されるアミノ酸配
列のアミノ酸残基５３８位と５３９位との間にある（アラニンの後およびグルタ
ミンの前）。このシグナルペプチダーゼ認識部位は、図１（配列番号２）に示さ
れたアミノ酸配列の残基５２１位と５４１位との間に位置した２０アミノ酸スト
レッチ内に位置する。従って、この領域を欠失させることにより、このタンパク
質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて首尾よく産生され得る。さらに、シグナルペプチダ
ーゼが非常に厳密な配列特異性を有するので、シグナルペプチダーゼ認識配列の
変化（この領域における単一の保存的なアミノ酸置換さえも含む）は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉによるタンパク質の切断を除去し得る。このシグナルペプチダーゼによる切
断のために必要とされる認識配列は、ＧｌｕＬｅｕＩｌｅＬｙｓＳｅｒＡｌａＧ
ｌｎＧｌｎＧｌｕ（配列番号１１）であると考えられ、これは、図１（配列番号
２）に示される配列のアミノ酸残基５３３〜５４１に相当する。欠失または非保
存的置換のいずれかのこの配列のセリンまたはアラニン残基のいずれかによる変
化は、シグナルペプチダーゼによる切断を除去することが期待される。もちろん
、理想的には、Ｃβ配列の変異誘発は、免疫原性応答を惹起する目的のために、
野生型抗原の三次構造を保持するために最小限に保たれる。

【００５６】本発明はまた、本発明のペプチドおよびタンパク質フラグメントをコードする
ポリヌクレオチド分子、これらヌクレオチド分子を含むベクター、およびそのベ
クターで形質転換された宿主細胞に関する。

【００５７】本発明はまた、細胞宿主における本発明のタンパク質フラグメントおよびペプ
チドの発現に関する。本発明のタンパク質またはペプチドをクローニングおよび
発現するために使用され得る原核生物宿主は、当該分野で周知である。このよう
な宿主細胞で複製するベクターもまた周知である。

【００５８】好ましい原核生物宿主としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、
Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓなどの属の細菌が挙げられるが、こ
れらに限定されない。２つのこのような原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１
０ＢおよびＤＨ５αＦ’ＩＱ（ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入
手可能）である。本発明のタンパク質フラグメントおよびポリペプチドをクロー
ニングおよび発現するための最も好ましい宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である。このＥ．ｃｏｌｉは
、ＤＥ３ファージに対して溶原性である。

【００５９】本発明はまた、本発明のペプチドおよびタンパク質フラグメントをコードする
単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主
細胞、および組換え技術による本発明のタンパク質またはポリペプチドの産生に
関する。

【００６０】宿主細胞は、核酸分子を取り込み、そして本発明のタンパク質フラグメントま
たはペプチドを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、組換え構築物は、
感染、形質導入、トランスフェクション、および形質転換の周知の技術を用いて
宿主細胞に導入され得る。ポリヌクレオチドは、単独または他のポリヌクレオチ
ドと共に導入され得る。このような他のポリヌクレオチドは、独立して導入され
得るか、同時導入され得るか、本発明のポリヌクレオチドに結合して導入され得
る。

【００６１】従って、例えば、ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカ
ーを含むベクターに結合され得る。ベクター構築物は、上述の技術によって宿主
細胞に導入され得る。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物（例えば、リン酸
カルシウム沈殿）中または荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入される。エ
レクトロポレーションがまた、ポリヌクレオチドを宿主に導入するために使用さ
れ得る。このベクターがウイルスである場合、それは、インビトロでパッケージ
ングされ得るか、またはパッケージング細胞に導入され得、そしてパッケージン
グされたウイルスが細胞に形質導入され得る。本発明のこの局面に従って、ポリ
ヌクレオチドを作製するため、およびポリヌクレオチドを細胞に導入するために
適切な広範な種々の技術は、当業者に周知であり、かつ慣用的である。このよう
な技術は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に詳細に概説される。これは、こ
れらの技術を詳述する多くの実験室マニュアルの例示である。

【００６２】本発明のこの局面に従って、このベクターは、例えば、プラスミドベクター、
一本鎖もしくは二本鎖ファージベクター、または一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡ
もしくはＤＮＡウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、ＤＮＡお
よびＲＮＡを細胞に導入するための周知の技術によって、ポリヌクレオチド（好
ましくは、ＤＮＡ）として細胞に導入され得る。ベクターはまた、ファージおよ
びウイルスベクターの場合、周知の感染および形質導入技術によって、パッケー
ジングされたウイルスまたはカプセル化されたウイルスとして細胞に導入され得
、そして好ましくは、（実際に）導入される。ウイルスベクターは、複製能を有
し得るか、または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、
補完宿主細胞においてのみ生じる。

【００６３】特定の点においてベクターの中で好ましいのは、本発明のタンパク質フラグメ
ントまたはペプチドの発現のためのベクターである。一般に、このようなベクタ
ーは、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主における
発現について有効なシス作用制御領域を含む。適切なトランス作用因子は、宿主
によって供給されるか、または補完ベクターによって供給されるか、または宿主
への導入の際にベクターそれ自体によって供給されるかのいずれかである。

【００６４】この点において特定の好ましい実施態様では、ベクターは、特異的な発現を提
供する。このような特異的な発現は、誘導性の発現であり得るか、または特定の
細胞タイプのみにおける発現であり得るか、または誘導性かつ細胞特異的の両方
であり得る。誘導性ベクターの中で特に好ましいのは、操作が容易である環境要
因（例えば、温度および栄養添加剤）により発現について誘導され得るベクター
である。本発明のこの局面に適切な種々のベクターは、原核生物宿主および真核
生物宿主における使用のための構成的発現ベクターおよび誘導性発現ベクターを
含み、これらは、周知であり、そして当業者に慣用的に用いられる（米国特許第
５，４６４，７５８号）操作された宿主細胞は、従来の栄養培地中で培養され得る。この栄養培地は、
特に、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅のために適
切なように改変され得る。発現について選択された宿主細胞を用いて以前に使用
された培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、一般に、当業者に周知のように
、本発明のタンパク質フラグメントまたはペプチドの発現のために適切である。

【００６５】多くの種々の発現ベクターは、本発明のタンパク質フラグメントまたはペプチ
ドを発現するために使用され得る。このようなベクターとしては、以下が挙げら
れる：染色体由来ベクター、エピソーム由来ベクター、ウイルス由来のベクター
（例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウ
イルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイ
ルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来、ならびにそれらの組
み合わせに由来のベクター（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝
子エレメントに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））。
これらは全て、本発明のこの局面に従う発現のために使用され得る。一般に、宿
主中でポリヌクレオチドを維持または増殖するために、またはポリペプチドまた
はタンパク質を発現するために、適切な任意のベクターは、この点について発現
のために使用され得る。

【００６６】適切なＤＮＡ分子は、種々の周知および慣用の技術のいずれかによってベクタ
ーに挿入され得る。一般に、発現のためのＤＮＡ分子は、１つ以上の制限エンド
ヌクレアーゼでＤＮＡ配列および発現ベクターを切断し、次いで制限フラグメン
トを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して共に結合することにより発現ベクターに
結合する。このために用いられ得る制限および連結のための手順は、周知であり
、そして当業者に慣用である。この点について適切な手順、および代替の技術を
用いる発現ベクターを構築するために適切な手順は、これらもまた周知であり、
当業者に慣用であり、上述したＳａｍｂｒｏｏｋらに非常に詳細に記載される。

【００６７】発現ベクター中に挿入されたＤＮＡ分子は、適切な発現制御配列（例えば、ｍ
ＲＮＡ転写を指向するプロモーターを含む）に作動可能に連結される。このよう
なプロモーターの代表としては、単に数個の周知のプロモーターを列挙すると、
λファージＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプ
ロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、およびレトロ
ウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。言及していない多数のプロモータ
ーが、本発明のこの局面における使用のために適切であることが周知であり、そ
して本明細書中の考察および実施例によって提示される様式で当業者によって容
易に利用され得ることが理解される。

【００６８】一般に、発現構築物は、転写開始および終止部位、および転写された領域にお
いて、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現された成熟転
写物のコード部分は、最初に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻訳されるポリペプチドの
末端に適切に位置する終止コドンを含む。

【００６９】さらに、この構築物は、発現を生じさせるだけでなく、調節する制御領域を含
み得る。一般に、多くの一般に使用される手順によれば、このような領域は、転
写を制御することにより作動する（例えば、とりわけ、リプレッサー結合部位お
よびエンハンサー）。

【００７０】増殖および発現のためのベクターは、一般に、選択マーカーを含む。このよう
なマーカーもまた、増幅のために適切であり得るか、またはこのベクターは、こ
の目的のためにさらなるマーカーを含み得る。この点において、発現ベクターは
、好ましくは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために、
１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。好ましいマーカーとしては、真核生物細
胞培養についてジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、そしてＥ．
ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養についてテトラサイクリンまたはアンピシリン耐
性遺伝子が挙げられる。

【００７１】本明細書中の他の箇所で記載されるような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切な
プロモーター、および他の適切な制御配列を含むベクターは、所望のポリペプチ
ドまたはタンパク質のその中での発現に適切な種々の周知の技術を用いて、適切
な宿主に導入され得る。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）が挙げられる。多くの種々の発現構築物のための宿主
が周知であり、そして当業者は、本開示により、本発明のこの局面に従うタンパ
ク質またはフラグメントを発現するための宿主を容易に選択し得る。

【００７２】より詳細には、本発明はまた、１つ以上の上述の配列を含む組換え構築物（例
えば、発現構築物）を含む。この構築物は、本発明のこのような配列が挿入され
ているベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。配列は
、順方向または逆方向に挿入され得る。この点について特定の好ましい実施態様
では、この構築物は、この配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロ
モーターを含む）さらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターは、当
業者に公知であり、そして本発明で使用するのに適した多くの市販のベクターが
存在する。

【００７３】本発明はまた、ヒトＩｇＡへの結合能を低下したまたは除去した、ポリペプチ
ドまたはタンパク質の濃縮に関するので、従って、本発明は、インビトロでの変
異誘発方法を用いて、本発明のタンパク質フラグメントまたはペプチドを生成す
ることに関する。多数のインビトロ変異誘発方法が、当業者に周知である；いく
つかを例示として本明細書中に提供する。

【００７４】このような１つの方法は、適切な制限酵素でプラスミドを部分的または完全の
いずれかで消化し、次いでこれら末端を連結して再度プラスミドを生成すること
により、プラスミド中に挿入されたポリヌクレオチド分子に欠失または挿入を導
入する。非常に短い欠失が、まず制限部位でプラスミドを切断し、次いで各末端
で少数の塩基群を除去する制御されたヌクレアーゼ消化に線状ＤＮＡを供するこ
とにより、作製され得る。正確な挿入もまた、二本鎖オリゴヌクレオチドリンカ
ーを１つの制限部位で切断されたプラスミドに連結することにより作製され得る
。

【００７５】化学的方法がまた、一本鎖ポリヌクレオチド分子に変異を導入するために使用
され得る。例えば、シトシン残基での１つの塩基対の変化は、亜硫酸水素塩のよ
うな化学物質を用いて作製され得る。この化学物質は、シトシンをウラシルに脱
アミン化し、それにより、ＧＣ塩基対をＡＴ塩基対に変換する。好ましくは、Ｄ
ＮＡ分子に沿った任意の決定された部位での全ての可能なクラスの塩基対変化が
なされ得るように、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発が、使用される。本技術
は、一般に、目的の一本鎖ヌクレオチド配列に相補的な（１つ以上のミスマッチ
を除く）オリゴヌクレオチドのアニーリングを包含する。ミスマッチのオリゴヌ
クレオチドは、次いで、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、一方の鎖の配列中
に所望の変化を含む二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。配列の変化は、当然、この変
化が遺伝子のコード領域においてなされる場合、アミノ酸の欠失、置換、または
挿入を生じ得る。この二本鎖ポリヌクレオチドは、次いで、適切な発現ベクター
中に挿入され得、そして従って、変異体ポリペプチドが生成され得る。上記のオ
リゴヌクレオチド特異的変異誘発は、当然、ＰＣＲを介して実行され得る。この
ような系の例は、実施例４で使用したＥｘ−Ｓｉｔｅ（登録商標）ＰＣＲ部位特
異的変異誘発技術（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）である。

【００７６】Ｅｘ−Ｓｉｔｅ（登録商標）ＰＣＲ部位特異的変異誘発技術を用いて、いくつ
かの異なるオリゴヌクレオチドを、目的の領域においてＤＮＡ配列中に異なる変
化を誘導させた。１つの特定の例では、重複プライマーを得た。両プライマーは
、図１（配列番号２）に示される配列中でアミノ酸１７０および１７５でリジン
をアラニンに変化させるのに必要な配列を含んだ（表１）。順方向プライマー（
Ｃβ６１３と称する）は、以下の配列（配列番号６）を有し：

【００７７】

【化２】そして逆方向プライマーは、（Ｃβ６４２Ｒと称する）は、以下の配列を有した
：

【００７８】

【化３】（この置換は、太字で示される）。これらのオリゴヌクレオチドを、ｐＮＶ２２
２鋳型（これは、ｐＳＰ７６ベクターに挿入されたＣβ遺伝子からなる）と合わ
せた。ＰＣＲを実施し、そしてこの産物を連結し、そしてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５
α株に導入し、それにより、変異体Ｃβ遺伝子を含むクローンを生成した。

【００７９】以下のベクターは市販されており、これらは、本発明の実施において使用され
得る。細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱ
Ｅ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐ
ｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクター
、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅから入手可能）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）；ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９、およびｐＰＲＯＥＸ−１（ＬＴＩから入手可能）；ならびにｐＴＯ
ＰＥ、ｐＥＴ１７ｂ、およびｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ）がある。これらのベクターは、本発明のこの局面に従って使用
するために当業者に利用可能である、多くの市販のかつ周知のベクターの例示と
して単に列挙される。宿主において本発明のポリヌクレオチド、タンパク質フラ
グメント、またはペプチドの例えば、導入、維持、増殖、または発現に適切な任
意の他のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの局面において使用され得る
ことが、理解される。

【００８０】プロモーター領域は、候補プロモーターフラグメント（すなわち、プロモータ
ーを含み得るフラグメント）を導入するために、制限部位の下流にプロモーター
領域を欠くレポーター転写単位（例えば、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写単位）を含むベクターを用いて、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。周知であるように、ＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位で
のプロモーター含有フラグメントのベクターへの導入は、ＣＡＴ活性の生成を生
じ、これは、標準的なＣＡＴアッセイによって検出され得る。このために適切で
あるベクターは、周知であり、そして容易に入手可能である。２つのこのような
ベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。従って、本発明のポリヌ
クレオチドの発現のためのプロモーターは、周知および容易に入手可能であるプ
ロモーターのみならず、レポーター遺伝子を使用して前述の技術によって容易に
得られ得るプロモーターもまた含む。

【００８１】本発明に従うポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適切な公知の細菌
プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、
Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ、ＰＬプロモーター
、ならびにｔｒｐプロモーターがある。

【００８２】宿主細胞における発現のために適切なベクターおよびプロモーターの選択は、
周知の手順であり、そして発現ベクターの構築、宿主へのベクターの導入、およ
び宿主における発現のための必要な技術は、当該分野において慣用的である。

【００８３】本発明はまた、上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核
生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。

【００８４】宿主細胞における構築物は、組換えＤＮＡ配列によってコードされた遺伝子産
物を生成するために、従来の様式で使用され得る。あるいは、本発明のタンパク
質フラグメントまたはペプチドは、従来のペプチド合成機によって合成により生
成され得る。

【００８５】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度へのこの宿主株の増殖の後、選
択されたプロモーターが誘導性である場合、それは、適切な手段（例えば、温度
変化、または化学的誘導物質への曝露）によって誘導され、そして細胞は、さら
なる期間の間培養される。

【００８６】細胞は、代表的には、次いで、遠心分離によって採取され、物理的手段または
化学的手段によって破砕され、そして得られた粗抽出物は、さらなる精製のため
に保持される。

【００８７】タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、任意の従来の方法（凍結
−解凍の繰り返し、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含す
る）によって破砕され得る；このような方法は、当業者に周知である。

【００８８】好ましくは、ペプチドは、固相ペプチド合成の周知の方法を用いて調製され得
る。用語「ペプチド」とは、１００以下のアミノ酸を有するものが意図される。
タンパク質は、１００より多くのアミノ酸からなる。好ましくは、ペプチドは、
８〜５０アミノ酸を含む。

【００８９】別の局面では、本発明は、本発明のタンパク質およびポリペプチドを単離およ
び精製する方法に関する。本発明のタンパク質およびポリペプチドを精製する方
法は、大量の実質的に純粋なタンパク質を生じることが発見された。「実質的に
純粋」とは、本発明のプロセスによって得られたタンパク質またはポリペプチド
が少なくとも８５％純粋であり、核酸およびポリサッカリドの混入は無視し得る
程度であることを意図する。本発明の方法の１つの利点は、それが規模の増減に
対応可能である（ｓｃａｌｅａｂｌｅ）ということである。すなわち、この方法
は、大量のタンパク質の精製に容易に適応し得る。精製において用いられるカラ
ムは、多容量／濃度のサンプルを受容し、あるカラムから次のカラムへサンプル
をアプライするために濃縮工程よりも希釈工程を使用し、そして両カラムともに
、移動相として同じ緩衝液を使用する。さらに、この精製方法は、組換えＥ．ｃ
ｏｌｉおよび天然の連鎖球菌の両方から得られたＣβタンパク質変異体および／
またはフラグメントの精製に適用可能である。

【００９０】さらに、精製におけるプロテアーゼインヒビターおよび界面活性剤の使用は、
イオン交換カラムおよびヘパリンカラムを使用する精製を許容し、生成物の分解
を最小化する。最終的に、生成物の収率は、以前に使用されたゲル濾過カラムク
ロマトグラフィー手順によって得られる収率よりも高い（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏ
ｎｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１４６７〜１４７５（１９８４）：Ｍ
ａｄｏｆｆら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９（１）：２０４〜２１０（１９
９１））。なぜなら、より大きな量のサンプルが、同時に処理され得るからであ
る。この大規模プロセスはまた、精製に関与する操作時間を最小化する。

【００９１】本発明は、実質的に純粋なＣβタンパク質、またはそのフラグメントおよび／
もしくは変異体を得るためのプロセスに関し、これは、以下の工程：（ａ）細胞抽出物中のＣβタンパク質を得る工程；（ｂ）このＣβタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、そしてＣ
βタンパク質含有画分を収集する工程；（ｃ）このＣβタンパク質含有画分をプールし、そして希釈する工程；および（ｄ）この希釈したＣβタンパク質含有画分をリガンドアフィニティークロマ
トグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーに供し、そして画分を収集する
工程；を包含し、それによって、実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフラグメン
トおよび／もしくは変異体が、得られる。

【００９２】好ましい実施態様において、アニオン交換媒体が、使用される。より好ましく
は、このアニオン媒体は、第３級アミン、第４級アンモニウム、第４級アルキル
アミン、第４級アルキルアルカノールアミン、ジエチルアミノエチル、ジエチル
−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル、トリメチルアミノヒドロキシプロ
ピル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジルアンモニ
ウムおよびジメチルエタノールアミンからなる群より選択される官能基を有する
。なおより好ましくは、この官能基は、第４級アンモニウム基である。最も好ま
しくは、この第４級アンモニウム基は、トリメチルアミノメチル基である。

【００９３】好ましい実施態様において、イオン交換媒体は、固体支持体材料（例えば、ア
ガロース、デキストラン、セルロースおよびポリスチレンからなる群より選択さ
れる）上に固定化された上記の官能基を含む。より好ましくは、この固体支持体
材料は、ビーズ形態である。最も好ましくは、この固体支持体材料は、架橋され
たアガロースである。

【００９４】好ましい実施態様において、リガンド−アフィニティー媒体が、使用される。
好ましくは、リガンド−アフィニティー媒体のリガンドは、ヘパリン様分子であ
る。より好ましくは、このヘパリン様分子は、グリコサミノグリカンである。よ
り好ましくは、このヘパリン様分子は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、
ケラタン硫酸およびヒアルロネートからなる群より選択される。最も好ましくは
、このヘパリン様分子は、ヘパリンである。

【００９５】好ましい実施態様において、リガンド−アフィニティー媒体は、固体支持体材
料（例えば、アガロース、デキストラン、セルロースおよびポリスチレンからな
る群より選択される）上に固定化されたリガンドを含む。より好ましくは、この
固体支持体材料は、ビーズ形態である。最も好ましくは、この固体支持体材料は
、架橋されたアガロースである。

【００９６】別の実施態様において、Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／もし
くは変異体を含む画分は、ゲル濾過クロマトグラフィーに供される。より好まし
くは、このゲル濾過媒体は、架橋されたアリルデキストラン／Ｎ，Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミドコポリマーである。

【００９７】好ましい実施態様において、Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／
もしくは変異体は、両性界面活性剤を含む緩衝液中でイオン交換クロマトグラフ
ィーまたはリガンドアフィニティークロマトグラフィーに供される。好ましくは
、この両性界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ（３−（（３−コラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート）である。またより好ましくは、こ
の両性界面活性剤は、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ（Ａｌｂｒｉｇｈｔ＆Ｗ
ｉｌｓｏｎＡｍｅｒｉｃａｓＩｎｃ．，ＧｌｅｎＡｌｌｅｎ，ＶＡから入
手可能であるアルキルジメチルアミンベタイン）である。最も好ましくは、この
両性界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネ
ート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡからのＺｗｉｔｔｅｒｇ
ｅｎｔ（登録商標））のｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラ
デシルおよびｎ−ヘキサデシル誘導体からなる群より選択される。より好ましく
は、この界面活性剤は、約１％〜約１０％の濃度である。最も好ましくは、この
界面活性剤の濃度は、約５％である。

【００９８】好ましい実施態様において、Ｃβタンパク質、そのフラグメントおよび／また
は変異体は、プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液中の第１の媒体上でクロマ
トグラフィーに供される。好ましくは、このプロテアーゼインヒビターは、セリ
ンプロテアーゼインヒビターである。より好ましくは、このプロテアーゼインヒ
ビターは、ＤＦＰ、ＰＭＳＦおよびＡＰＭＳＦからなる群より選択される。最も
好ましくは、このプロテアーゼインヒビターは、４−（２−アミノエチル）ベン
ゼンスルホニルフルオリド・ＨＣｌ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｒｉｓ，ＩＮからのＰＥＦＡＢ
ＬＯＳＣまたはＰＥＦＡＢＬＯＣＰＬＵＳ、これはまたチラミンを含み得る
）である。

【００９９】好ましい実施態様において、第１のクロマトグラフィー媒体からのＣβタンパ
ク質またはそのフラグメントおよび／もしくは変異体を含む溶出物は、第２の媒
体上でのリガンドアフィニティークロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグ
ラフィーの前に、約１０％〜約２０％の両性界面活性剤を含む緩衝液を用いて約
３倍希釈される。

【０１００】好ましい実施態様において、Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／
もしくは変異体は、塩勾配を含む溶出物を適用することによって第１または第２
のクロマトグラフィー媒体から溶出される。より好ましくは、この塩勾配は、約
０．０Ｍ、約０．０５Ｍ、０．０７５Ｍ、および０．０９Ｍの塩の段階を含む段
階勾配である。最も好ましくは、この塩勾配は、約０．０Ｍ〜約０．１Ｍの塩の
直線勾配である。より好ましくは、この塩は、ＮａＣｌまたはＫＣｌである。最
も好ましくは、この塩は、ＮａＣｌである。

【０１０１】好ましい実施態様において、実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフラグ
メントもしくは変異体を得るプロセスは、約７．０〜約８．０のｐＨで実施され
る。より好ましくは、このプロセスは、約７．６〜約７．８のｐＨで実施される
。

【０１０２】好ましい実施態様において、この溶出物は、約０．１％〜約１．０％の両性界
面活性剤をさらに含む。より好ましくは、この溶出物は、約０．５％の両性界面
活性剤を含む。

【０１０３】別の好ましい実施態様において、Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよ
び／もしくは変異体は、このＣβタンパク質またはそのフラグメントおよび／も
しくは変異体をコードするヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトされる細
菌細胞から得られる。ここで、この細胞は、このＣβタンパク質またはそのフラ
グメントおよび／もしくは変異体を過剰発現する。より好ましくは、この細菌細
胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。最も好ましくは、このＣβタンパク質またはそ
のフラグメントもしくは変異体は、以下：（ａ）この細胞を破壊する工程；（ｂ）約２０％（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＭＣａＣｌ₂の濃度までエタ
ノール／ＣａＣｌ₂を添加することによってこの細胞から非タンパク様材料を沈
殿させる工程：（ｃ）沈殿した非タンパク様材料を除去して溶液を得る工程；（ｄ）約８０％（ｖ／ｖ）の濃度までエタノールを添加することによってこの
溶液からタンパク質を沈殿させ、そして沈殿したタンパク質を収集する工程；お
よび（ｅ）約３％〜約７％の両性界面活性剤を含む緩衝溶液中でこの沈殿したタン
パク質を再懸濁する工程、によって得られる。

【０１０４】別の好ましい実施態様において、Ｃβタンパク質は、このＣβタンパク質を天
然に産生する細菌細胞から得られる。より好ましくは、この細菌細胞は、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞である。最も好ましくは、こ
のＣβタンパク質は、以下：（ａ）約３％〜約７％の両性界面活性剤を含む緩衝液中で細菌細胞を煮沸して
、溶液を得る工程；（ｂ）この溶液を氷浴中で冷却する工程；（ｃ）ＣａＣｌ₂／エタノールの***液を添加して、約２０％エタノール（ｖ
／ｖ）／約０．１ＭＣａＣｌ₂の濃度を与える工程；（ｄ）沈殿した非タンパク様材料を除去して溶液を得る工程；（ｅ）約８０％（ｖ／ｖ）の濃度までエタノールを添加することによってタン
パク質をこの溶液から沈殿させて、そしてこの沈殿したタンパク質を収集する工
程；および（ｆ）約３％〜約７％の両性界面活性剤を含む緩衝溶液中でこの沈殿したタン
パク質を再懸濁する工程、によって得られる。

【０１０５】本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアとともに本発明のタンパク質フラ
グメントまたはペプチドを含むワクチンに関する。１つの局面において、本発明
は、補体単独を有するグラム陽性細菌に対して殺菌性である抗体を誘導するタン
パク質フラグメントまたはペプチドに関する。すなわち、この活性は、オプソニ
ン貪食性（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｅ）機構に依存しない。本発明のこれ
らのタンパク質フラグメントおよびペプチドは、減少した細胞免疫性を有する患
者（例えば、化学療法患者および白血病患者）において有用であるワクチンの生
成に対して特に十分に適している。

【０１０６】本明細書中に記載される連鎖球菌のプロリンリッチ領域は、グラム陽性細菌の
特徴であるので、本発明のワクチンは、以下を含むがこれらに限定されない他の
グラム陽性細菌に対する免疫応答を惹起するために有用であることが予測される
：

【０１０７】

【化４】好ましい実施態様において、タンパク質フラグメントまたはペプチドは、ポリ
サッカリドに結合体化される。本発明の結合体は、還元的アミノ化により、ポリ
サッカリドの還元末端基をタンパク質の第１級アミノ基（例えば、リジン残基の
アミノ基）に反応することによって形成され得る。このポリサッカリドは、タン
パク質の第１級アミノ基のいずれかまたはすべてに結合体化され得る。還元基は
、選択的加水分解もしくは特異的酸化切断、または両方の組合せによって形成さ
れ得る。好ましくは、このタンパク質フラグメントまたはペプチドは、Ｊｅｎｎ
ｉｎｇｓら、米国特許第４，３５６，１７０号の方法（これは、過ヨウ素酸塩を
用いるポリサッカリドの制御された酸化に続いて、本発明のタンパク質の還元的
アミノ化を含む）によってポリサッカリドに結合体化される。

【０１０８】好ましい実施態様において、ポリサッカリドは、Ｉａ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型お
よびＶ型から選択されるＢ群連鎖球菌被膜ポリサッカリドの１つである。Ｂａｋ
ｅｒ，Ｃ．Ｊ．およびＫａｓｐｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．７：
４５８〜４６７（１９８５）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．３１９：１１８０〜１１８５（１９８８）；Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｎ
ｅｗ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２：１８５７〜１８６０（１９９０）を参照
のこと。ワクチンはまた、Ｂ群被膜ポリサッカリドＩａ型に結合体化された本発
明のタンパク質フラグメントまたはペプチド（タンパク質−Ｉａ）；Ｂ群被膜ポ
リサッカリドＩＩ型に結合体化された本発明のタンパク質フラグメントまたはペ
プチド（タンパク質−ＩＩ）；Ｂ群被膜ポリサッカリドＩＩＩ型に結合体化され
た本発明のタンパク質フラグメントまたはペプチド（タンパク質−ＩＩＩ）；お
よびＢ群被膜ポリサッカリドＶ型に結合体化された本発明のタンパク質フラグメ
ントまたはペプチド（タンパク質−Ｖ）からなる群より選択される１つ以上のタ
ンパク質フラグメントまたはペプチド−ポリサッカリド結合体を含む組合せワク
チンであり得る。最も好ましくは、このワクチンは、タンパク質−Ｉａ、タンパ
ク質−ＩＩ、タンパク質−ＩＩＩおよびタンパク質−Ｖを含む組合せワクチンで
ある。このような組合せワクチンは、Ｉａ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型およびＩ
ｂ型のＢ群連鎖球菌に対する抗体を誘導する（Ｉｂ型Ｂ群連鎖球菌もまた、Ｃβ
を発現するので）。さらに、ポリサッカリドに対する組合せワクチンの免疫応答
は、Ｔ依存性応答である。

【０１０９】本発明のワクチンは、被膜ポリサッカリドに共有的に結合体化された本発明の
ペプチドまたはタンパク質フラグメントを含む結合体を含み得る。あるいは、こ
のペプチドまたはタンパク質フラグメントは、ポーリンタンパク質、プロテオソ
ームまたは他のキャリアタンパク質と結合体化または複合体化され得る。米国特
許第５，４３９，８０８号（これは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の外膜
Ｂ群ポーリンの調製のための方法を記載する）、およびＷＯ９５／０３０６９（
これは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＰ２ポーリンの調製を記載する）を参
照のこと。

【０１１０】本発明のワクチンは、投与の経路に依存して有効な量で１つ以上のタンパク質
フラグメントもしくはペプチドワクチンまたは結合体ワクチンを含む。投与の皮
下経路または筋肉内経路が好ましいが、本発明のワクチンはまた、腹腔内経路ま
たは静脈内経路によって投与され得る。当業者は、任意の特定の処置プロトコル
のために投与されるべき量が、過度に実験することなく容易に決定され得ること
を理解する。各結合体に関して、適切な量は、体重１ｋｇあたり２マイクログラ
ムのタンパク質フラグメントまたはペプチド〜体重１ｋｇあたり１００マイクロ
グラムのタンパク質フラグメントまたはペプチドの範囲内にあると予測される。
好ましい実施態様において、ワクチンは、約２μｇのタンパク質フラグメントま
たはペプチドあるいは等価量のタンパク質フラグメントもしくはペプチド−ポリ
サッカリド結合体を含む。別の好ましい実施態様において、ワクチンは、約５μ
ｇのタンパク質フラグメントまたはペプチドあるいは等価量のタンパク質フラグ
メントもしくはペプチド−ポリサッカリド結合体を含む。

【０１１１】本発明のワクチンは、経口投与のためにカプセル、液体溶液、懸濁液もしくは
エリキシルのような形態で、または溶液もしくは懸濁液のような滅菌液体形態で
使用され得る。任意の不活性キャリア（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理
食塩水、あるいはタンパク質フラグメントもしくはペプチドまたは結合体ワクチ
ンが適切な溶解度特性を有する任意のこのようなキャリア）が、好ましく使用さ
れる。ワクチンは、単回用量調製物の形態またはマスワクチン接種プログラムの
ために使用され得る複数用量フラスコであり得る。参考は、ワクチンを調製およ
び使用する方法について、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔ
ｏｎ、ＰＡ，Ｏｓｏｌ（編）（１９８０）；およびＮｅｗＴｒｅｎｄｓａｎ
ｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＶａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｌｅｒら（編
），ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰａｒｋＰｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ
（１９７８）に対してなされる。

【０１１２】本発明のワクチンはさらに、タンパク質特異的抗体の生成を増強するアジュバ
ントを含み得る。このようなアジュバントには、種々のオイル処方物（例えば、
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ））、ステアリルチロシン（ＳＴ、米国特
許第４，２５８，０２９号を参照のこと）、ＭＤＰとして公知のジペプチド、サ
ポニン（米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）、水酸化アルミニウム
およびリンパ性サイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。

【０１１３】フロイントアジュバントは、免疫原性物質と混合される鉱油および水のエマル
ジョンである。フロイントアジュバントは強力であるが、これは通常，ヒトに投
与されない。代わりに、アジュバントミョウバン（水酸化アルミニウム）または
ＳＴが、ヒトに対する投与に使用され得る。タンパク質フラグメントもしくはペ
プチドワクチンまたはその結合体ワクチンは水酸化アルミニウム上に吸収され得
、そこから注射後にゆっくりと放出される。このワクチンはまた、Ｆｕｌｌｅｒ
ｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号に従うリポソーム内にカプセル化され
得る。

【０１１４】別の好ましい実施態様において、本発明は、記載される方法に従って生成され
た本発明のワクチンを、免疫応答を誘導するに有効な量で、動物に投与する工程
を包含する、その動物において免疫応答を誘導する方法に関する。

【０１１５】ここで一般的に本発明を記載したが、同一のものは、以下の実施例に対する参
照を通じてより容易に理解される。これらの実施例は、例示によって提供され、
そしてこれは、特に示されない限り、本発明を限定することを意図しない。

【０１１６】（実施例）（実施例１）（Ｃβをコードする遺伝子のクローニングおよび発現）Ｃβタンパク質上のＩｇＡ結合部位を位置付けるために、２つのオリゴヌクレ
オチドを合成した。第１のオリゴヌクレオチド（オリゴ１）は、成熟タンパク質
の５’末端に対応し、そして配列（配列番号８）５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧ
ＴＧＡＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＡＴ−３’（これは、ＢａｍＨＩ部位を含
む）を有する。第２のオリゴヌクレオチドは、この遺伝子の３’末端のちょうど
短く、そして配列（配列番号９）５’−ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴ
ＣＣＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＡ−３’を有し、そしてＸｈｏｌ部位を含む。この
遺伝子の３’末端に対するオリゴヌクレオチドを、多くのグラム陽性細胞壁タン
パク質において見出されるＬＰＸＴＧモチーフを除くように選択した。この配列
モチーフは、これらの組織細胞壁タンパク質のプロセシングに関与し、そして最
終的にペプチドグリカンに共有的に結合するようになるこれらのタンパク質の一
部であることが示されている（Ｎａｖａｒｒｅ，Ｗ．Ｗ．およびＳｃｈｎｅｅｗ
ｉｎｄ，Ｏ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１１５〜１２１（１９
９４）；Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，Ｏ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：１０３〜１
０６（１９９５））。鋳型としてＣβタンパク質の遺伝子を含むＡ９０９株Ｂ群
連鎖球菌由来の染色体ＤＮＡ、および標準的ＰＣＲ手順を使用して、約３．２ｋ
ｂの生成物を、１％アガロースゲル上で電気泳動した場合に観察されるように生
成した。Ｃβタンパク質遺伝子を含むＰＣＲ生成物を、エンドヌクレアーゼ制限
酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。このＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ
フラグメントは、カルボキシル末端の最後の３３アミノ酸を除くＣβタンパク質
全体についての配列（推定ＩｇＡ結合部位を含む）を含んだ。次いで、このＤＮ
Ａフラグメントを、標準的なＴ４リガーゼ手順を使用して、適切に制限されたＴ
７発現プラスミドｐＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｏｓｏｎ
ＷＩ）へ連結した。次いで、このプラスミドを、製造業者に示唆されたプロトコ
ル（Ｎｏｖａｇｅｎ．Ｉｎｃ．）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３
）へ形質転換した。このプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、５０μｇ／ｍｌ
カルベニシリンを含むＬＢプレート上で選択した。これらのプレートを、３７℃
で一晩インキュベートした。形質転換体コロニーを、ＩＰＴＧで飽和したニトロ
セルロースフィルター上に注意深く乗せた。３０分後、この細菌を、このフィル
ターを室温で１５分間クロロホルム蒸気チャンバ中に置くことによって溶解した
。

【０１１７】このフィルターをチャンバから取り出した後、これらを、２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、６Ｍ尿素および０．５ＭＮａＣｌで以前に飽和した
Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）３ＭＭフィルター上に、コロニー側を上にして（ｃ
ｏｌｏｎｙ−ｓｉｄｅｕｐ）置いた。１５分後、これらのフィルターを、ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中で精製ヒトＩｇＡと
ともに１時間インキュベートした。次いで、これらのフィルターを、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ（登録商標）中で再洗浄し、そしてヤギ抗ヒトＩｇＡアルカリホスファ
ターゼ結合体（ＣａｐｐｅｌＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ
Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用して標準的な手順によって展開した（Ｂｌａｋ
ｅ，Ｍ．Ｓ．ら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６：１７５〜１７（１９
８４））。高いＩｇＡ結合活性を実証するいくつかのコロニーを選択し、そして
３０℃で、カルベニシリンを含む１ｍｌＬＢブロス中で一晩増殖させた。次い
で、これらの培養物を、新鮮なＬＢ−カルベニシリンブロスで１〜１００に希釈
し、そしてさらに６時間３０℃でインキュベートした。次いで、発現を、ＩＰＴ
Ｇの添加によって誘導し、そしてこの培養物をさらに２時間３０℃で続けた。こ
の細胞を、遠心分離によって回収し、水中に再懸濁し、そして数回の凍結−解凍
サイクルに供した。この細胞をもう一度遠心分離によって回収し、そして上清を
これらのＩｇＡ結合活性の試験のために保存した。

【０１１８】（実施例２）（ＣβのＩｇＡ結合ドメインの同定）一旦、組換えＣβタンパク質を生成する特定の安定なプラスミドが活性化され
、そして発現されたタンパク質がヒトＩｇＡを結合すると、Ｎｏｖａｔｏｐｅ（
登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）のストラテジーと同様の
ストラテジーを利用して、ＣβのＩｇＡ結合領域を位置付けた。この手順を、製
造業者の指示書に従って実施した。簡潔には、Ｃβ遺伝子を含む精製したプラス
ミドを、ＤＮａｓｅＩでランダムに切断し、そして２％低融点アガロースゲル
中で電気泳動した。１００〜３００塩基対の間のサイズに対応するＤＮＡのフラ
グメントをこのゲルから切り出し、精製し、そしてＴＥ緩衝液中で再懸濁した。
単一のｄＡを、推奨された反応混合物を使用してフラグメントに添加し、そして
このフラグメントを、単一のｄＴの末端を含んだｐＥＴＯＰＥＴベクターへ連結
した。標準的な連結手順の後、このプラスミドをコンピテントＮｏｖａＢｌｕｅ
（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）へ形質転換し、そして５０μｇ／
ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上にプレートした。これらのプレート
を、３７℃で一晩インキュベートした。この形質転換体コロニーを、実施例１に
記載されるようにＩｇＡ結合活性について試験した。いくつかのクローンを、Ｉ
ｇＡに対するこれらの結合に基づいて選択した。これらのクローンの各々由来の
細菌を、新鮮なＬＢプレート上に別々に接種し、そして以前のようにそれらのＩ
ｇＡ結合能について再試験した。プラスミド調製物を、標準的手段によって各々
から作製し、そして配列決定した。

【０１１９】クローン化Ｃβタンパク質遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を、記載さ
れるように、変性二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型を使用してジデオキシ法によって
決定した（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ
．（１９９３））。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＩＩキット（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔ
ｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を、
製造業者の指示書に従って使用した。Ｃβ遺伝子の一部を含むように得られたＤ
ＮＡの最小フラグメントを、図１に示す。この配列の翻訳は、図１（配列番号２
）に示される成熟Ｃβタンパク質のアミノ酸１０１〜２３０に対応する。このＤ
ＮＡフラグメントをさらに短くする試みは、いかなるＩｇＡ結合活性も与えなか
った。

【０１２０】（実施例３ＥＬＩＳＡ阻害アッセイ：ペプチド結合研究）Ｃβタンパク質のこの領域内に含まれるアミノ酸配列に対応するいくつかの合
成ペプチドを作製した。ペプチドを、ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）でＮＭＰ
ｔ−ブトキシカルボニル化学を用いて合成し、そして脱保護した。樹脂のサンプ
ル由来のペプチドを、アニソールの存在下でＨＦでの処理により、樹脂からはず
した（０℃／１時間）。これらのペプチドの分取精製をＣ１８カラム（２．１４
内径×３０ｃｍ）（Ｄｙｎａｍａｘ−Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用
いて行った。このペプチドを、ＷａｔｅｒｓＰｉｃｏｔａｇｓｙｓｔｅｍ（
Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてＰＴＣアミノ酸分析により定量
した。この合成ペプチドを、通常、溶出プロファイル全体の７５〜８５％からな
る主要ピークとしてＣ１８カラムから溶出した。精製ペプチドのアミノ酸組成は
、ペプチドを合成するために使用した配列とよく一致した。これらのペプチドを
ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにおいて用いて、以下の通り、精製Ｃβタンパク質に対
するヒトＩｇＡの結合をブロックした。０．０２％アジ化物含有０．１Ｍ炭
酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に２．０μｇ／ｍｌの濃度で、精製Ｃβを１ウェル
あたり０．１ｍｌ添加することにより、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−
ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅＩＩＦ，ＶａｎｇａｒｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ，Ｎｅｐｔｕｎｅ，ＮＪ）を感作した。このプレートを、室温で一晩インキュ
ベートした。このプレートを、０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３
５、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．０２％アジ化物で、５回
洗浄した。精製ヒトＩｇＡミエローマタンパク質をＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓから購入し、０．５％Ｂｒｉｊ３５含有ＰＢＳで希釈してプレ
ートに加え、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを前の通り再び
洗浄し、そして二次抗体アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＡ（Ｔ
ａｇｏＩｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）をＰＢＳ−Ｂｒｉｊ中に希釈
してプレートに加え、そして室温で１時間インキュベートした。このプレートを
前の通り洗浄し、そして０．１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭＭｇＣｌ₂、
０_.１ｍＭＺｎＣｌ₂、０．０２％アジ化物（ｐＨ９．８）中のｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ１０４（登録商標）ホスフェート基質）（１
ｍｇ／ｍｌ）を添加した。このプレートを、３７℃で１時間インキュベートし、
そして４０５ｎｍで吸光度を、Ｅｌｉｄａ−５マイクロタイタープレートリーダ
ー（Ｐｈｙｓｉｃａ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）を用いて測定した。コントロー
ルウェルは、１次抗体および／または二次抗体のいずれかを欠如していた。これ
を、ヒトＩｇＡミエローマタンパク質の力価を得るために行った。このことによ
って、ＥＬＩＳＡアッセイにおける半最大読みとり値（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａ
ｌｒｅａｄｉｎｇ）を与えた。この力価を阻害ＥＬＩＳＡにおいて使用した。
マイクロタイタープレートを感作し、そして前の通りに洗浄した。精製合成ペプ
チドを添加し、そしてＰＢＳ−Ｂｒｉｊ中で希釈した。次いで、半最大読みとり
値を与えたヒトＩｇＡミエローマタンパク質の希釈物を添加した。次いで、この
混合物を、室温で１時間インキュベートした。このプレートを再び洗浄し、そし
て結合体化二次抗体を記載のように添加した。次いで、このプレートを処理し、
そして記載のように読みとった。阻害のパーセントを以下のように算定する：１−（添加したペプチドありでのＥＬＩＳＡ値）／（添加したペプチドなしで
のＥＬＩＳＡ値）。このＥＬＩＳＡアッセイにおいて阻害されたこのペプチドは、配列Ａｓｎ−Ｈｉ
ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１０）を含んでいた。これは、
ＣβのＩｇＡ結合ドメインの少なくとも一部分がこの配列を含むタンパク質の領
域内に含まれていたことを示唆した。

【０１２１】（実施例４Ｃβをコードする遺伝子のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）ＩｇＡ結合活性に対するＣβタンパク質中のこの領域の重要性を確認し、そし
て最終的にワクチン処方物において使用する変異タンパク質を作製し始めるため
に、Ｅｘ−Ｓｉｔｅ（登録商標）ＰＣＲ部位特異的変異誘発プロトコル（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によって開発された）の改変法
を用いた。使用したテンプレートは、ｐＮＶ２２２と呼ばれるプラスミドであっ
た。このプラスミドは、ｐＳＰ７６ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ
，ＷＩ）に挿入されたＣβ遺伝子からなった。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル２９２ＤＮＡ合成機（Ｆｏｓｔ
ｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。オリゴヌクレオチドを、１５分ごとに穏や
かに混合しながら、１．５ｍｌの水酸化アンモニウムで２時間処理することによ
りカラムから手動で取り出した。それらを、５５℃で１６〜１８時間脱保護した
。脱保護の後、それらを乾燥させ、そして直接使用したか、またはオリゴヌクレ
オチド精製カラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣ
ｉｔｙ，ＣＡ）を用いて精製した。いくつかの異なるオリゴヌクレオチドを作製
して、目的の領域におけるＤＮＡ配列の異なる変化を誘導した。その例は、以下
の通りである。この特定の例におけるプライマーは重複プライマーであり、その
両方が、図１に示される配列（配列番号２）においてアミノ酸１７０および１７
５でリジンをアラニンに変更することが必要な配列を含んでいた。この正方向プ
ライマー（Ｃβ６１３と表される）は、配列（配列番号６）５’−ＧＴＴＧＡ
ＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＧＡＡＴＣＡＣ
ＡＡＡＴＧＡＡＧ−３’を有し、そして逆方向プライマー（Ｃβ６４２Ｒ
と表される）は、配列（配列番号７）５’−ＧＡＴＴＣＣＣＧＣＴＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＧＡＣＴＴＴＴ
ＴＴＧ−３’（置換を下線で示す）を有した。この反応条件は、以下の通りであ
る：１０ｎｇｐＮＶ２２２テンプレート、１５ｐｍｏｌの各プライマー、１ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ、１×Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５；１０ｍＭＫＣｌ；１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２ｍＭＭ
ｇＳＯ₄；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００；０．１ｍ
ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、１０単位のＶｅｎｔポリメラーゼ
、およびＨ₂Ｏを１００μｌまで。この反応物を、ＰＣＲＧｅｍ１０ワックス
ビーズとともに、ＨｏｔＳｔａｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌ
ｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）により調製した。この反応系を、Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）サーモサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）中で、以下の条件下で行った：９４℃で５
分を１サイクル；９４℃で３０秒、３７℃で２分、７２℃で１０分を１０サイク
ル；９４℃で３０秒、５５℃で２分、７２℃で１０分を３０サイクル；および７
２℃で１２分を１サイクル。この反応物を、１０単位のＤｐｎＩを用いて３７℃
で３０分間処理して、テンプレートＤＮＡを破壊し、次いで、ＰｆｕＩポリメラ
ーゼを用いて温度７２℃で６０分間処理して、任意の残りの突出（ｏｖｅｒｈａ
ｎｇ）を埋めた。この反応物を、１×Ｖｅｎｔポリメラーゼ緩衝液および０．３
８ｍＭｄＡＴＰ中に１：４．６で希釈した。希釈した反応物を、２５℃で２４
時間連結し、そしてコンピテントＤＨ５α細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に形質転換した。選択したコロニーを、３ｍｌのＬＢ
＋カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）中で、３７℃で１６〜１８時間増殖させた。
ＤＮＡを、ＱＩＡｓｐｉｎ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏ
ｒｔｈ，ＣＡ）を用いて調製した。このクローンを、０．８％アガロースゲル上
でインサートのサイズについて分析し、次いで、配列決定した。次いで、選択し
たコロニーを、１００ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）中、３７℃
で１６〜１８時間増殖させた。ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）チップ１０
０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて調製した。次いで、
それらを、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化し、そして０．８％アガロースゲル上
で泳動して、変異した領域を分離した。２３００ｂｐのフラグメントを単離し、
そしてＧｅｎｅ−ＣｌｅａｎＳｐｉｎＫｉｔ（登録商標）（Ｂｉｏ１０１
，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いてゲルから精製した。発現ベクターｐＥＴ２４ａ
（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびネイティブなＣβ遺伝子からなるｐＮＶ３
４と名付けたクローンを、やはりＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化し、そして０．
８％アガロースゲル上で泳動した。ｐＥＴベクターおよび残りのＣβ遺伝子を含
む大きなバンド（６３００ｂｐ）を単離し、そしてＧｅｎｅ−ＣｌｅａｎＳｐ
ｉｎＫｉｔ（登録商標）（Ｂｉｏ１０１）を用いてゲルから精製した。これ
らの２つのフラグメントを４℃で２４時間にわたり連結し、そしてコンピテント
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。選択したコロニーを、３ｍｌのＬＢ＋
カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）中で、３７℃で１６〜１８時間増殖させた。Ｄ
ＮＡを、ＱＩＡｓｐｉｎ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製し、
そしてクローンを、０．８％アガロースゲル上でインサートのサイズについて分
析した。

【０１２２】変異Ｃβタンパク質をコードするクローンもまた構築した。ここで、２つのグ
ルタミニル残基を、プロリニル残基で置換し、そしてＣβ遺伝子における欠失を
生じさせ、このことにより、目的の領域において６アミノ酸欠失を生じた（表１
）。

【０１２３】ＩｇＡ結合活性が欠如したか、または減少したが、抗βａｇ抗血清となお反応
したＣβタンパク質を発現するクローンを選択し（実施例５）、そして１００ｍ
ｌのＬＢ＋カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）中で、３７℃で１６〜１８時間増殖
させた。これらのクローンに由来するプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（登録
商標）チップ１００（Ｑｉａｇｅｎ）用いて調製し、そして変異したＣβ遺伝子
を完全に配列決定した。

【０１２４】（実施例５Ｃβ変異体によるＩｇＡ結合のウェスタンブロットおよびＥＬＩ
ＳＡ分析）Ｃβタンパク質をコードする遺伝子における変異が、Ｃβ抗原性を維持しなが
ら、ＩｇＡ結合を減少させたか、またはこれを除去したか否かを決定するために
、変異した遺伝子によりコードされたタンパク質を発現し、そしてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。２つのウェスタンブロットを各サ
ンプルに対して作製し、そして精製ヒトＩｇＡミエローマタンパク質または過免
疫ウサギ抗βａｇタンパク質抗血清のいずれかと反応させた。図１に示した配列
（配列番号２）におけるアミノ酸１７０および１７５でリジンをアラニンに変更
したＣβタンパク質を発現するクローンが、ＩｇＡ結合活性をほとんど有さない
が、このタンパク質が抗Ｃβ抗血清と反応する能力は高く維持された。ＩｇＡ結
合活性はまた、Ｃβタンパク質（ここで、２つのグルタミニル残基はプロリニル
残基で置換される）を発現するクローンおよび６つのアミノ酸欠失を有するＣβ
タンパク質をコードするクローン（表１）においてほとんど実質的に排除された
が、抗Ｃβ抗血清との反応性は両方維持された。６つのアミノ酸欠失を有するク
ローンについてのデータは、Ｃβタンパク質のＩｇＡ結合活性を担う残基がタン
パク質のこの領域内に位置し、そしてこの領域内の他の可能な変異がＩｇＡ結合
活性に影響を及ぼすことを示唆した。

【０１２５】競合阻害ＥＬＩＳＡを用いて、Ｃβタンパク質上にある配列改変の抗原性変化
／構造的変化の量をより正確に決定した。０．０２％アジ化物含有０．１Ｍ
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に２．０μｇ／ｍｌの濃度で、精製Ｃβを１ウェ
ルあたり０．１ｍｌ添加することにより、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ
−ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅＩＩＦ，ＶａｎｇａｒｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ，Ｎｅｐｔｕｎｅ，ＮＪ）を感作した。このプレートを室温で一晩インキュ
ベートした。このプレートを、０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３
５、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．０２％アジ化物で、５回
洗浄した。Ｃβタンパク質に対する過免疫ウサギ抗血清を０．５％Ｂｒｉｊ
３５含有ＢＰＳで希釈してプレートに加え、そして室温で１時間インキュベート
した。プレートを前の通り再び洗浄し、そして二次抗体アルカリホスファターゼ
結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＴａｇｏＩｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ
Ａ）をＰＢＳ−Ｂｒｉｊ中に希釈してプレートに加え、そして室温で１時間イン
キュベートした。このプレートを前の通り洗浄し、そして０．１Ｍジエタノー
ルアミン、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭＺｎＣｌ₂、０．０２％アジ化物
（ｐＨ９．８）中のｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ１０４（登
録商標）ホスフェート基質）（１ｍｇ／ｍｌ）を添加した。このプレートを、３
７℃で１時間インキュベートし、そして４０５ｎｍでの吸光度を、Ｅｌｉｄａ−
５マイクロタイタープレートリーダー（Ｐｈｙｓｉｃａ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ
Ｙ）を用いて測定した。コントロールウェルは、１次抗体および／または二次抗
体のいずれかを欠如していた。これを、ウサギ抗Ｃβタンパク質の力価を得るた
めに行った。このことによって、ＥＬＩＳＡアッセイにおける半最大読みとり値
を与えた。この力価を阻害ＥＬＩＳＡにおいて使用した。マイクロタイタープレ
ートを感作し、そして前の通りに洗浄した。精製Ｃβタンパク質またはＣβタン
パク質の変異体を添加し、そしてＰＢＳ−Ｂｒｉｊ中で希釈した。次いで、半最
大読みとり値を与えたウサギ抗Ｃβタンパク質の希釈物を添加した。次いで、こ
の混合物を、室温で１時間インキュベートした。このプレートを再び洗浄し、そ
して結合体化二次抗体を記載のように添加した。次いで、このプレートを処理し
、そして記載のように読みとった。阻害のパーセントを以下のように算定する：１−（添加したタンパク質ありでのＥＬＩＳＡ値）／（添加したタンパク質な
しでのＥＬＩＳＡ値）。このアッセイにおいて、連鎖球菌由来の野生型Ｃβタンパク質の阻害を、組換え
Ｃβタンパク質およびグルタミニルからプロリニルへの変異体と比較し、共に、
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された（データは示さず）。このアッセイは、Ｃβタ
ンパク質の組換え体における膜貫通領域がないことを検出するに十分鋭敏である
。しかし、野生型配列を含む組換えＣβタンパク質を、ＩｇＡ結合活性を欠如す
る置換変異体と比較する場合、抗原性の差異は、最小限である。このことは、こ
のような置換変異体が、Ｃβタンパク質の抗原性特徴の大部分を維持するが、所
望でないＩｇＡ結合活性を欠如することを示唆する。

【０１２６】（実施例６Ｅ．ｃｏｌｉ由来の組換えＣβタンパク質の初期分離）細胞ペーストを、氷冷細胞破壊緩衝液（５ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）、ｐＨ７
．６〜７．８（５ｍＭＤＴＴを含む）、０．２ｍｇ／ｍｌＥＤＴＡおよびＰ
ＥＦＡＢＬＯＣＰＬＵＳ（登録商標）ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ
））中に再懸濁した。細胞懸濁物を、Ｓｔａｎｓｔｅｄ（登録商標）細胞破壊機
に２回通し、次いで、１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を、デカン
トし、そして非タンパク質物質を、エタノール／ＣａＣｌ₂を終濃度２０％エタ
ノール／０．１ＭＣａＣｌ₂まで添加することによって沈澱させた。

【０１２７】タンパク質を１０，０００ｇで３０分間で遠心分離によって清澄化した後に、
最終８０％エタノールで沈澱させ、次いで、５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登
録商標）３，１４、２５ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）および５ｍＭＤＴＴ（ｐＨ
７．６〜７．８）を含む緩衝液中に溶解した。

【０１２８】（実施例７Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに由来するＣβタンパク質の初期分離
）ネイティブＣβタンパク質を、５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３
，１４、および２５ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ７．６〜７．８）を含む緩
衝液中で細菌を煮沸することにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａ
ｃｔｉａｅの膜から取り出した。煮沸後、懸濁物を氷浴中で０℃〜１０℃まで冷
却し、次いで、エタノール／ＣａＣｌ₂の冷却（０℃〜４℃）溶液を、終濃度２
０％エタノール／０．１ＭＣａＣｌ₂まで添加した。この溶液を遠心分離によ
り清澄化し、その後に、タンパク質を８０％エタノールで上清から沈澱させた。
タンパク質を、５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）、２５ｍＭＴｒｉ
ｓ（ＨＣｌ）、５ｍＭＤＴＴおよび「ＰＥＦＡＢＬＯＣＰＬＵＳ」Ｐｒｏｔ
ｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（ｐＨ７．６〜７．
８）を含む緩衝液中に再溶解した。

【０１２９】（実施例８Ｃβタンパク質の精製）必要に応じて、５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）／Ｔｒｉｓ緩衝液
中のこのタンパク質濃度を、ＰｈａｒｍａｃｉａＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａ
ｎｃｅＱ（登録商標）カラム（１．６×２０ｃｍ）にアプライする前に、０．
５〜０．８ｍｇ／ｍｌの間にするべきである。直線塩勾配を用いて、Ｃβタンパ
ク質を溶出する場合、用いた勾配は、２５ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）／０．５％
Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３，１４（ｐＨ７．６〜７．８）中の０
〜０．１ＭＮａＣｌであった。このＴｒｉｓ／Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録
商標）緩衝液中で０、５０、７５、および９０ｍＭＮａＣｌでの段階勾配もま
た適用し得、そしてこのＣβタンパク質は、７５ｍＭＮａＣｌで溶出し得る。
あるいは、５０ｍＭＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ（ＨＣｌ）／０．５％Ｚｗｉｔｔｅ
ｒｇｅｎｔ（登録商標）緩衝液中でカラムを洗浄後、Ｃβタンパク質を、Ｔｒｉ
ｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ７．６〜７．８）中の６０ｍＭＮａＣｌ／０．６％ＣＨ
ＡＰＳを用いて溶出した。Ｃβタンパク質を、カラムにアプライする総タンパク
質を増やして、低塩濃度で溶出する。

【０１３０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、Ｑ（登録商標）カラムからのＣβ画分を同定した
。これらの画分をプールし、そしてプロテアーゼインヒビターＰＥＦＡＢＬＯＣ
ＰＬＵＳ（登録商標）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加した。次いで、このタンパク質プールを、３倍
に（すなわち、１部のタンパク質プールに対して２部の希釈液（ｖ／ｖ）（１５
％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）、２５ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）およ
び５ｍＭＤＴＴ（ｐＨ７．６〜７．８）を含む））希釈した。次いで、このタ
ンパク質を、ＰｈａｒｍａｃｉａＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅヘパリン
セファロース（登録商標）カラム（１．６×２０ｃｍ）にアプライした。Ｃβタ
ンパク質を直線塩勾配（２５ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）／０．５％Ｚｗｉｔｔ
ｅｒｇｅｎｔ（登録商標）中で０〜０．１ＭＮａＣｌ）を用いて溶出した。概
して、Ｃβタンパク質は、Ｑ（登録商標）カラムで用いるものと同じ緩衝液およ
び勾配条件を利用して、ヘパリンカラムから溶出され得る。図１０は、Ｑ（登録
商標）カラムおよびヘパリンカラムの溶出プロファイルを示す。図３Ａおよび３
Ｂは、精製データおよび対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す。

【０１３１】第２のクロマトグラフィー分離においてゲル濾過カラムを用いる場合、Ｃβタ
ンパク質を含むＱ（登録商標）カラムからの画分を、終濃度８０％エタノールま
で無水エタノールを加えて、沈澱させた。沈澱したタンパク質を遠心分離により
採取し、そして最小容量の２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１ＭＮａＣｌ、５ｍＭＤ
ＴＴ（ｐＨ８．０）（１０％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）を含む）中
に再溶解した。再溶解したサンプルを、ゲル濾過カラム（同じ緩衝液（組換えタ
ンパク質についてはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）およびＤＴＴを含めず
、ネイティブタンパク質の精製については０．５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（
登録商標）を含ませた）で予備平衡化した）にアプライした。

【０１３２】（実施例９Ｃβタンパク質のプロテアーゼ消化およびフラグメントの単離）ダルベッコＰＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）中の精製Ｃβタンパク質（６．０〜８．０ｍｇ／ｍｌ）を、２
０ｍＭＣａＣｌ₂中の１０ｍｇ／ｍｌサーモライシンストック溶液（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を０．
０２５ｍｌ添加することにより、消化した。この反応混合物を、一定に攪拌しな
がら６０℃で一晩インキュベートした。次いで、プロテアーゼ活性を、１０ｍＭ
ＥＤＴＡを添加することにより停止させた（図４Ａおよび４Ｂ）。

【０１３３】最初に、サーモライシンにより生成されたペプチドフラグメントＴ１およびＴ
２（見かけの分子量は、それぞれ、３５ｋＤおよび２５ｋＤ）を、電気泳動によ
り分離し、ニトロセルロースに転写し、ポンソーＳで染色し、次いで、アセトニ
トリル中でこの膜を溶解して回収した（図５）。膜を溶解した後、ペプチドフラ
グメントを氷冷アセトンで沈澱させ、そして遠心分離により採取した。遠心分離
の後、このペプチド沈澱物を、ＰＢＳに溶解し、そしてＦｕｓｃｏら、Ａｄｖ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ４１８：８４１−８４５（１９９７）の方法により
、殺菌活性の阻害についてアッセイした。アセトン沈殿したタンパク質のアリコ
ートはまた、ＳＤＳゲル上で泳動して、タンパク質回収を確認した。

【０１３４】続く消化のためのタンパク質量を増加させるために、サーモライシンフラグメ
ントを８０％終濃度エタノールで沈澱させ、そして遠心分離により採取した。こ
のペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓ（ＨＣｌ）／１０ｍＭＣａＣｌ₂、１０％
グリセロール（ｐＨ７．２）１〜３ｍｌ中に再溶解し、そして１０ｍＭＴｒ
ｉｓ（ＨＣｌ）／１０ｍＭＣａＣｌ₂（ｐＨ７．２）で平衡化したセファクリ
ル（登録商標）−１００カラム（１．６×４０ｃｍ）にアプライした（図６）。

【０１３５】単離したペプチドフラグメントＴ１を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｙｓｔｏ
ｌｙｔｉｃｕｍ由来のエンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、さらに消化し
た。Ａｒｇ−Ｃ消化を、殺菌活性の阻害についてアッセイした。Ｒ１およびＲ２
と表されるフラグメントを、後ほどＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ（登録商標）７４（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてＭｏｎｏＰ（登録
商標）カラム上で等電点電気泳動することにより分離した（図７）。

【０１３６】分離していないサーモライシンフラグメントＴ１およびＴ２を用いた殺菌活性
の阻害は、３６μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で５０％の阻害を示した。サーモラ
イシンフラグメントＴ１およびＴ２を分離し、そして電気泳動およびウェスタン
転写により回収した場合、殺菌活性の５０％阻害は、Ｔ１およびＴ２フラグメン
トについて、それぞれ１５μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌで生じた。Ｔ１およ
びＴ２ペプチドは、それぞれ１８μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌで、１００％
阻害を生じた。Ａｒｇ−Ｃ消化後のＴ１ペプチドの収量は、最小であった。Ａｒ
ｇ−Ｃ消化フラグメントのタンパク質濃度は、決定しなかった。しかし、殺菌活
性の５０％阻害は、サンプルの１：５０希釈物を用いて得た。この活性を、ゲル
濾過により分離したＴ１ペプチド画分と比較した。このＴ１画分は、２．５μｇ
／ｍｌにおいて５０％阻害を示した。

【０１３７】サーモライシン消化に由来する２つの主要なペプチドフラグメントＴ１および
Ｔ２（見かけの分子量は３５ｋＤおよび２５ｋＤの付近）についてのＮ末端配列
データは、トリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得、これを１０ｍＭＣＡ
ＰＳ／１０％メタノールにおいてＰＶＤＦ膜に転写し、そして１％酢酸中の０
．１％ポンソーＳで染色し、５％酢酸で脱色し、そしてボルテックスしながら
水で徹底的に洗浄した。十分に乾燥したＰＶＤＦ片を切り出し、そしてＭＡＢ
ｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ（登録商標）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に配列決定す
るために送った。

【０１３８】サーモライシン消化産物の配列分析結果は、Ｔ１についてのＮ末端が、ＶＥＱ
ＤＱＰＡＰＩＰＥＮＳＥ（配列番号５２）であったことを示した。Ｔ２ペプチド
については、Ｎ末端は、ＬＡＡＮＥＮＮＱＱＫＩＥＬＴＶ（配列番号５３）であ
った。Ｔ１ペプチドフラグメントは、Ｔ２ペプチドフラグメントよりＣβタンパ
ク質のＣ末端に近い（図８）。

【０１３９】（実施例１０ペプチド合成）ＣｈｉｒｏｎＭｉｍｏｔｏｐｅｓＭｕｌｔｉｐｉｎＮｏｎ−Ｃｌｅａｖ
ａｂｌｅＰｅｐｔｉｄｅＫｉｔ（ＣｈｉｒｏｎＭｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｒａ
ｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を用いて、Ｃβ変異ホロタンパク質（ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ）のペプチドを合成した。キットとともに供給されるコンピュータープログラ
ムは、４アミノ酸残基の重複配列を有する連続する８マーペプチドの生成を補助
して、抗体結合のだいたいの領域を決定した。キットマニュアルにより推奨され
るように、ペプチド合成にはＦＭＯＣ保護アミノ酸を、そしてアミノ酸活性化に
ついてはＤＩＣ／ＨＯＢｔを利用した。側鎖保護基をはずし、そしてＮ末端のペ
プチドをアセチル化した。８マーペプチドを利用して得た予備ＥＬＩＳＡ結果は
、抗体結合領域を示した。重複配列を有する２０マーペプチドを合成し、そして
最初の結果を確認するために使用した。

【０１４０】２４マーペプチド配列、ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ
（配列番号４７）もまた、固相ペプチド合成により合成し、切断し、そして精製
して、複数ｍｇ規模でペプチドを得た（Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ，ＲｏｃｋｆｅｌｌｅｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ
）。このペプチドを、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイにおいて使用した。

【０１４１】ＥＬＩＳＡに関しては、ミモトープピン（ｍｉｍｏｔｏｐｅｐｉｎ）を２％
ＢＳＡ／ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ポリオキシエチレンソル
ビタン）（ＰＢＳＴ）中で３０分間ブロックした。少なくともＰＢＳＴを５回交
換してピンを洗浄した後、ピンを０．０５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中でポリクロ
ーナルウサギ抗体５２．２の１：２０，０００希釈物中で１．５時間穏やかに攪
拌した。ピンを再びＰＢＳ−Ｔを少なくとも５回交換して洗浄し、その後、０．
２％ウシ胎仔血清／ＰＢＳ−Ｔ中でアルカリホスファターゼ結合体化抗ウサギ
抗体の１：２０００希釈物中で攪拌した。

【０１４２】ＥＬＩＳＡプレートを、ジエタノールアミン緩衝液中でＳＩＧＭＡ１０４（
登録商標）ホスフェート基質（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で発色させた。プレートを、室温で１時間一定に
攪拌しながら発色させ、次いで、プレートリーダーで４０５ｎｍで読みとった。

【０１４３】ＥＬＩＳＡの結果は、ほとんどの抗体結合がこのタンパク質のＣ末端付近に位
置する反復配列に指向されたことを示した。この反復配列は、ＰＤＶＰＫＬＰＤ
ＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号４７）としてＣβタンパク質に存
在する。８マー配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号３３）、ＫＬＰＤＶＰＫＬ（配
列番号３４）、ＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号３５）、ＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番
号３６）は、ほとんどの抗体結合を誘起した（図９Ａ）。より少ない程度には、
いくらかの抗体結合活性は、８マー配列ＥＴＰＤＴＰＫＩ（配列番号３８）、Ｒ
ＴＶＲＬＡＬＧ（配列番号３９）、およびときおりＧＧＧＴＶＲＶＦ（配列番号
４０）に対して指向した。抗体結合を確認するために合成した（二連で）２０マ
ーペプチドは以下であった：ＳＰＫＴＰＥＡＰＫＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰ（配列
番号４１）、ＰＥＡＰＫＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号４２）、Ｋ
ＩＰＥＰＰＫＴＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬ（配列番号４３）、ＰＰＫＴＰＤＶＰ
ＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号４４）、ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶ
ＰＫＬＰＤ（配列番号４５）、およびＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫ
Ｌ（配列番号４６）（図９Ｂ）。

【０１４４】（実施例１１）（Ｃβタンパク質および合成ペプチドによる阻害ＥＬＩＳＡ）ポリクローナルウサギ抗体５２．２が０．１ｍｇ／ｍｌ組換えＣβタンパク質
を含む０．０５％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中にある１：２０，０００希釈物２０ｍｌ
を、室温で３０分間インキュベートし、その後、上記のように抗体結合について
ピンをアッセイした。ＥＬＩＳＡの結果は、配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号３
３）、ＫＬＰＤＶＰＫＬ（配列番号３４）、ＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号３５）
、およびＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号３６）のピンへの抗体結合の阻害を示した
。しかし、いくらかの抗体結合活性が、配列ＲＴＶＲＬＡＬＧ（配列番号３９）
を用いて生じた（データを示さず）。

【０１４５】合成ペプチドＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号
４７）を使用する阻害実験において、８マーピンおよび２０マーピンをＢＳＡ中
でブロックした。同時に、５２．２抗ｂａｇウサギ抗体が０．０５％ＢＳＡ／０
．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−ＰＢＳ中にある１：２０，０００希釈物２０ｍ
ｌを、３０分間、（０．１ｍｇ／ｍｌ）合成ペプチド（Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ
ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒＵｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ、ＮＹ）とともにインキュベートし、その後、上記のように抗体結合
についてピンをアッセイした。１組の重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）２０マーが、
合成ペプチドに曝露されていない抗体についてのポジティブコントロールとして
働いた。

【０１４６】ＥＬＩＳＡの結果は、配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号３３）、ＫＬＰＤＶＰ
ＫＬ（配列番号３４）、ＶＰＫＬＰＤＶＰ（配列番号３５）、およびＫＬＰＤＡ
ＰＫＬ（配列番号３６）のピンに対する抗体結合の阻害を示した。また、抗体結
合が、配列ＥＴＰＤＴＰＫＩ（配列番号３８）を用いて、そしていくらか少なく
、ＲＴＶＲＬＡＬＧ（配列番号３９）を用いて観察された。２０マーピンへの抗
体結合は、同様に阻害された。ポジティブコントロールピンは、比較のために抗
体結合を示した（図１０）。

【０１４７】（実施例１２）（Ｃβ上の特定の反復アミノ酸配列が抗体結合を惹起することを確立するため
の殺菌阻害アッセイ）ウサギを、破傷風トキソイドと結合した合成ペプチドを用いてワクチン接種し
、Ｃβ上の領域に対する特異的抗体を生成した。配列ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬ
ＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号４８）に対して指向される特異的抗体を得
そして精製した。これは、ＧＢＳ（Ｂ群連鎖球菌）Ｉｂ型を殺傷することを示し
得た。この殺傷を、ネイティブのＣβホロタンパク質に対するウサギ抗血清の殺
菌活性と比較した。

【０１４８】（材料および方法）（キャリアタンパク質へのペプチドの結合）ペプチドを、ＲｏｃｋｆｅｌｌｅｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｏｔｅｉｎ
ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙによって、ＡＢＩ４３０Ａペプチ
ド合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、
ＣＡ）でＮＭＰｔ−ブトキシカルボニル化学を使用して合成した。このペプチ
ドを、アニソールの存在下でＨＦでの処理により（０℃／１時間）脱保護しそし
て樹脂から取り出した。各ペプチドの予備精製を、Ｃ１８カラム（２．１４内径
×３０ｃｍ）（Ｄｙｎａｍａｘ−Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用し
て実施した。このペプチドを、ＰＴＣアミノ酸分析によって、ＷａｔｅｒｓＰ
ｉｃｏｔａｇシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して定量
した。この合成ペプチドは、全溶出プロフィールのうちの９５％を超えるものか
らなる主なピークとして、Ｃ１８カラムから溶出した。精製したペプチドのアミ
ノ酸組成は、この配列と良く一致した。ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ（登録商標）ＤＥＲＰＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して
実行した質量スペクトル分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、マトリクスとしてα−
ヒドロキシケイ皮酸（ペプチド質量２６７７ｋＤが示された。これは、計算分子
量約２６５８ｋＤと良く一致する）を使用して線形様式で実行した。

【０１４９】合成ペプチドＳＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番
号４９）（Ｓｅｒ−ペプチドと命名）約２６ｍｇを脱イオン水１．５ｍｌに溶解
し、シトラコン酸無水物６０μｌを室温で３０分間隔で１５μｌアリコートとし
て添加することによって、シトラコン化した（Ａｔａｓｓｉ，Ｍ．Ｚ．およびＨ
ａｂｅｅｂ，Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．「Ｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｉｔｈｃｉｔｒａｃｏｎｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ」Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第ＸＸＶ巻、ＥｎｚｙｍｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅＢ
部、Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．およびＴｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．Ｎ．編、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、５４６〜５３３頁（１９７２））。
この反応混合物を、５ＭＮａＯＨでの滴定により８を超えるｐＨに維持した。
この反応はシトラコン酸無水物の最終添加後に１時間続いた。次いで、溶液を、
０．２ＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．５）に対して、１００ＭＷＣＯ透析チューブ
を使用して徹底的に透析した。

【０１５０】次いで、このペプチド上のセリン残基を暗い場所で室温で１０分間、過ヨウ素
酸ナトリウム２．２ｍｇを使用して酸化した（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．お
よびＳｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｃｏｎｊｕｇａｔｉ
ｏｎｏｆｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅｇｒｏｕｐｓｔｏｐｅｐｔｉｄｅｓ
ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｖｉａｐｅｒｉｏｄａｔｅｏｘｉｄａｔｉｏ
ｎｏｆａ２ａｍｉｎｏ−ａｌｃｏｈｏｌ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔ
ｏｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｔＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｓｅｒｉｎｅ」
、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．３：１３８〜１４６（１９９２））。
この反応を、一定に撹拌しつつ室温でエチレングリコールを添加することにより
クエンチし、次いでまた、０．２ＭＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．５）に対して徹底
的に透析した。

【０１５１】精製した破傷風トキソイドモノマー（ＳｔａｔｅｎｓＳｅｒｕｍｉｎｓｔｉ
ｔｕｔ、ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎＳ．、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
（登録商標）２００上で再びクロマトグラフィーにかけた。このセリンペプチド
を、１３ｍｇシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する還元的アミン化により、
１５ｍｇ破傷風トキソイドに結合させた。この反応は、３７°で一晩続いた。次
いで、これを、クエン酸水（ｐＨ４．２）に対して徹底的に透析して、このペプ
チドのリジン残基上の保護基を除去した。約８ｍｇの生成物を回収した（非結合
ペプチドを含んだ重量決定）。結合を、ペプチド、破傷風トキソイド、および結
合後のペプチドと破傷風トキソイドとの混合物のアリコートを注入することによ
って、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）ペプチドカラムを使用するＨＰＬＣにより
モニターした。さらに、１２，０００〜１４，０００ＭＷＣＯ透析チューブを用
いて透析して非結合ペプチドを除いた結合体を、ＥＬＩＳＡによりアッセイした
。マイクロタイタープレートを、１μｇのＳｅｒ−ペプチド結合体を用いて、４
℃で一晩コートした。ポリクローナルウサギ５２．２一次抗体を、ＰＢＳ−Ｔ中
で１：２，０００で使用し、続いて、二次抗体であるアルカリホスファターゼヤ
ギ抗ウサギ結合体（ＩＣＮ、ＣｏｓｔａＭｅｓａ、ＣＡ）をＰＢＳ−Ｔ中で１
：２０，０００希釈で使用した。このＥＬＩＳＡプレートを、１Ｍジエタノール
アミン緩衝液／０．５ｍＭＭｇＣｌ₂（ｐＨ９．８）中のＳＩＧＭＡ１０４
（登録商標）Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ基質で発色させた。このプレートを、プレー
トリーダー（ＤｙｎｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉ
ｌｌｙ、ＶＡ）上で４０５ｎｍで読み取った。

【０１５２】（Ｓｅｒ−ペプチド抗体）ニュージーランド白色ウサギを、フロイント完全アジュバント中の結合ペプチ
ドおよび非結合ペプチド両方の混合物１００μｇ用量を使用して０日目に免疫し
た。２１日目および４２日目に、ウサギを再び、フロイント不完全アジュバント
中の１００μｇ用量で免疫した。ウサギを、５１日目に採血した。ウサギ抗血清
を得る際に、ＥＬＩＳＡを、２μｇ／ｍｌＣβタンパク質で９６ウェルＥＬＩ
ＳＡプレートをコートし、次いでこのＳｅｒ−ペプチド抗体を、１：１０００か
ら開始して重複２倍希釈物を用いて、力価を得るまで希釈することによって、実
行した。

【０１５３】さらに、その抗体結合の特異性を評価するために、Ｃβ分子全体のうちの８マ
ーを示すミモトープピンを、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔ中で３０分間ブロックし
た。洗浄後、ピンをｓｅｒ−ペプチド抗体の１：２０，０００希釈物とともに１
．５時間インキュベートした。ピンを、再び洗浄し、次いで１：２，０００のア
ルカリホスファターゼ抗ウサギ抗体中で１．５時間インキュベートした。ＥＬＩ
ＳＡプレートを、１Ｍジエタノールアミン緩衝液／０．５ｍＭＭｇＣｌ₂（ｐ
Ｈ９．８）中のＳＩＧＭＡ１０４（登録商標）Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ基質で発
色させた。このプレートを、プレートリーダー上で４０５ｎｍで読み取った。

【０１５４】（Ｓｅｒ−ペプチドウサギ抗体の精製）３０ｍｇ破傷風トキソイドを、０．２ＭＮａＨＣＯ₃／０．５ＭＮａＣｌ
（ｐＨ８．３）７ｍｌに溶解し、そしてペリスタポンプを使用して室温で４時間
還流することによって、５ｍｌＨｉＴｒａｐ（登録商標）ＮＨＳ活性化アフィ
ニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上に結合
させた。洗浄および失活後、製造業者により推奨されるように、このカラムをＰ
ＢＳで平衡化し、次いで、ｓｅｒ−ペプチドウサギ血清２０ｍｌをこのカラムに
通した。ボイド画分をプールし、そしてＣβのＮ末端配列およびＣ末端配列を示
すミモトープピンを使用してアッセイした。イムノグロブリンＧを、Ｉｍｍｕｎ
ｏｐｕｒｅ（登録商標）Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を
使用してさらに精製した。低ｐＨ緩衝液中でこのカラムから溶出した画分を、５
ｍｌＨｉＴｒａｐ（登録商標）脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、ＮＪ）上で中和し、そして脱塩し、その後、再び、ＣβのＮ末端お
よびＣ末端を示したミモトープピンに対する抗体結合特異性を試験した。

【０１５５】（Ｓｅｒ−ペプチド抗体の殺菌活性）抗体および補体媒介性殺菌活性を、Ｆｕｓｃｏら「Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙｅｌｉｃｉｔｅｄｂｙｔｈｅｂｅｔａＣｐｒｏ
ｔｅｉｎｏｆＧｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉｃｏｎｓｔｒａ
ｓｔｅｄｗｉｔｈｃａｐｓｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」Ａ
ｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ＡｎｄＢｉｏｌ．４１８：８４１〜８４５（１９９７
）のアッセイに従って、導いた。比較を、以下による殺傷を用いて行った：（１
）ネイティブＣβタンパク質に対する抗体、（２）破傷風トキソイドカラムに対
して精製されたＳｅｒ−ペプチド抗体、および（３）破傷風カラム次いでプロテ
インＧカラムに対して精製されたＳｅｒ−ペプチド抗体。ペプチドＰＤＶＰＫＬ
ＰＤＶＰＫＬＰＤＶＰＫＬＰＤＡＰＫＬ（配列番号４８）を使用して、これらの
Ｓｅｒ−ペプチド抗体の殺菌活性を阻害した。

【０１５６】（プローブであるＳｅｒ−ペプチド抗体結合に対するＧＢＳコロニーリフト）ＧＢＳコロニーを、チョコレート寒天プレートから丸いニトロセルロースシー
トへリフトし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで、破傷風精製
したＳｅｒ−ペプチド抗体（１：１０，０００希釈および１：２０，０００希釈
）または破傷風およびプロテインＧ精製したＳｅｒ−ペプチド抗体（１：３００
０希釈および１：６０００希釈）のいずれかとともに、１．５時間インキュベー
トした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中での数回の洗浄の後、このニトロセ
ルロースシートを、ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ結合体とともに１．５
時間インキュベートし、次いで、基質緩衝液（０．１ＭＴｒｉｓ／０．１Ｍ
ＮａＣｌ／１ｍＭＭｇＣｌ₂）中で洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質を使用
して発色させた（Ｂｌａｋｅ，Ｍ．Ｓ．ら「Ａｒａｐｉｄｓｅｎｓｉｔｉｖ
ｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓｏｎｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６：
１７５〜１７９（１９８４））。

【０１５７】（結果および考察）（キャリアタンパク質へのペプチドの結合）このＳｅｒ−ペプチド上のリジン残基をシトラコン化して、これらのペプチド
が破傷風トキソイドに対して結合せず、互いに結合することを防ぐことが、必要
である。透析後、ＥＬＩＳＡは、この５２．２抗体が、この破傷風−Ｓｅｒ−ペ
プチド結合体を認識したことを示した。

【０１５８】（Ｓｅｒ−ペプチド抗体）Ｃβの８マーミモトープ配列に対するこのＳｅｒ−ペプチド抗体のＥＬＩＳＡ
の結果は、この抗体が、Ｃβのカルボキシ末端を示すピンのブロック上でのみ、
配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号５０）を認識したことを示した。ＣβのＮ末端
部分に向かって位置するいくつかの配列もまた、このＥＬＩＳＡにおいてポジテ
ィブシグナルを示した。破傷風結合体に対して惹起された抗体は、ＣβのＮ末端
配列と交差反応し、そしてこの反応は、破傷風アフィニティーカラムにこの抗血
清を通過させることによって、除去された。

【０１５９】（Ｓｅｒ−ペプチド抗体の精製）Ｎ末端配列への抗体結合を、一旦抗血清を破傷風カラムに通過させて、除去し
た。抗体は、配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列５０）に特異的に結合した。プロテイ
ンＧカラム上でのＳｅｒ−ペプチド抗体のさらなる精製により、ＩｇＧがさらに
精製され、そして配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列５０）に対するアフィニティーが
維持された。

【０１６０】（Ｓｅｒ−ペプチド抗体の殺菌活性）５０％の細菌の生存が、ネイティブＣβに対する５２．２抗体について、１：
５５００より大きな抗血清希釈物で生じた（図１２）。同様に、５０％の生存が
、Ｓｅｒ−ペプチドについて、約１：８０００の希釈物で生じ、このことは、破
傷風カラムを通過したかしていないかに関わらなかった（図１３）。興味深いこ
とに、破傷風カラムおよびプロテインＧカラムに対して精製した抗血清は、殺菌
活性を惹起しなかった。この現象は、プロテインＧカラム上での精製の間にこれ
らのタンパク質を溶出するために使用した酸性条件に起因する構造的変化に帰せ
られ得、これにより、補体活性化が阻害された。

【０１６１】（プローブであるＳｅｒ−ペプチド抗体に対するＧＢＳコロニーリフト）図１４は、破傷風カラムのみ、ならびに破傷風カラムの次にプロテインＧカラ
ムによって精製した抗血清を使用する、ＧＢＳＩｂに上でのＳｅｒ−ペプチド
抗体結合を示す。いずれの場合においても、抗体結合が、両方の調製物について
、ＧＢＳを殺傷するプロテインＧ精製した抗体の能力がないことを示す結果にも
関わらず、生じた。

【０１６２】（要旨）Ｃβタンパク質由来の合成ペプチド配列を、破傷風トキソイドに結合させた。
これは、この結合体を用いてワクチン接種したウサギにおいて、抗体応答を惹起
した。この抗血清を破傷風カラムまたは破傷風カラムの次にプロテインＧアフィ
ニティーカラムに対して精製した後、この抗体は、ミモトープに対するＥＬＩＳ
Ａにより測定した場合に、配列ＰＤＶＰＫＬＰＤ（配列番号５０）に特異的に結
合した。

【０１６３】この抗血清の抗体および補体媒介性殺菌活性を測定し、そしてＣβハロタンパ
ク質に対する抗血清と比較した。破傷風カラムに対して精製したＣβペプチドに
対する抗血清は、Ｃβホロタンパク質に対する抗血清による殺傷と類似した、殺
菌アッセイにおける殺傷を示した。抗体は、細胞***の間にこのグラム陽性生物
のペプチドグリカン層に浸潤して、細胞溶解を生じる補体活性を可能にすると考
えられる。

【０１６４】（実施例１３）（Ｓｅｒ−ペプチド抗体結合）（緒言）グラム陽性細菌の多くの細胞壁結合タンパク質は、いくつかの共通の特徴を有
する。その最も顕著な特徴は、これらのタンパク質のカルボキシ末端に近接した
ＬＰＸＴＧ配列の存在である。このモチーフは、十分に特徴付けられており、そ
してこれらの細胞壁タンパク質が細胞壁に共有結合されるのは、この配列を介し
てである。すなわち、酵素がこの配列をそのＴ−Ｇ間で切断し、次いで、このタ
ンパク質が、そのスレオニン残基上のカルボキシル基を介してペプチドグリカン
のペプチド架橋に結合するように進める。グラム陽性細菌のこれらの細胞壁タン
パク質の別の共通の特徴は、ＬＰＸＴＧ配列のアミノ末端側の直前の領域が、多
数のプロリル残基を含むことである。プロリル残基は、その独特の配列の故に、
タンパク質中にキンクを生じる。従って、これらの細胞壁タンパク質上のこの高
プロリル領域は、ペプチドグリカン層の内外を編み込む領域であると仮定されて
いる。しかし、この理論についての直接の証拠は、何も示されていない。抗Ｓｅ
ｒ−ペプチド抗体が補体の存在下で結合しそして細胞死を生じるのは、Ｃβタン
パク質上のまさにこの領域である。以前に述べたように、どのようにこのまれな
活性が生じ得るかという理論は、この抗体が、中隔面での細胞***の間にＣβの
この領域に結合し、ここで、ペプチドグリカンが破壊され、そして再建されると
いうものである。この理論についてのさらなる証拠を得るために、共焦点顕微鏡
法およびＦＡＣＳｃａｎ分析を使用して、どこで、そして、いつ、このＳｅｒ−
ペプチドに対する抗体がＣβタンパク質を発現する連鎖球菌生物に結合したかを
決定した。

【０１６５】（材料および方法）（共焦点顕微鏡（ＣＬＳＭ）分析）：ＣＬＳＭを使用して、破傷風カラムに対
して精製したＢ群連鎖球菌に対するウサギ抗体（抗Ｓｅｒ−ペプチド）の結合を
研究した。Ｂ群連鎖球菌Ｈ３６Ｂ株の細菌細胞を、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブ
ロスにて増殖させ、そしてこの増殖の異なる段階でサンプルを採取した。増殖の
段階を、６００ｎｍでこのサンプルの光学密度を測定することによって決定した
。次いで、細胞を２％パラホルムアルデヒドに固定し、そしてアリコートを顕微
鏡のスライド上で乾燥させた。このスライドを、５％の正常ヤギ血清でコートし
た。サンプルを、ウサギ抗体（抗Ｓｅｒ−ペプチド）の１：５００希釈物ととも
に２時間インキュベートし、洗浄し、そしてウサギＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合
体化ヤギ抗血清（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と
ともにインキュベートした。このサンプルを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｌｄ（登録商標
）封入（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）培地（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を有するカバーガラスでカバーし、そ
してＢｉｏＲａｄ１０２４ＣＬＳＭ中で二重波長レーザーにより試験した。

【０１６６】（ＦＡＣＳｃａｎ分析）：ＦＡＣＳｃａｎ分析を、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅ
ｎｓｏｎＦＡＣＳｃａｎ（ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ、
ＮＣ）を使用して、増殖の異なる段階で得た細菌細胞のサンプルに対して実施し
た。Ｂ群連鎖球菌Ｈ３６Ｂ株の細菌細胞を、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスに
て増殖させ、そしてこの増殖の異なる段階でサンプルを採取した。増殖の段階を
、６００ｎｍでこのサンプルの光学密度を測定することによって決定した。この
細菌細胞を２％パラホルムアルデヒドに固定し、洗浄し、そして抗Ｓｅｒ−ペプ
チド抗血清または破傷風吸着採血前血清のいずれかとともに、１時間インキュベ
ートした。細胞を３回洗浄し、そしてウサギＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合体化ヤ
ギ抗血清（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）とともに
１時間インキュベートした。細菌細胞をＰＢＳで３回洗浄し、臭化エチジウムに
より対比染色し、ｄｉｌｕｅｎｔ２緩衝液（Ｊ＆ＳＭｅｄｉｃａｌＡｓｓ
ｏｃｉａｔｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）で容量１ｍｌまで増やした。こ
のデータを、Ｆｌｏ−Ｊｏプログラム（ＴｒｅｅＳｔａｒＣｏｒｐ．、Ｓａ
ｎＣａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用して分析した。

【０１６７】（結果）（共焦点顕微鏡（ＣＬＳＭ）分析）：ＣＬＳＭ分析は、抗Ｓｅｒ−ペプチドは
、連鎖球菌細胞間の小さい領域に結合したことを示した。この抗体は、活発的に
***中の細胞（すなわち、対数増殖期間のサンプル）により多く結合し、そして
その培養物が定常期に入ると、さらに示されるように、より少なく結合した（以
下を参照のこと）。これらのデータは、このＳｅｒ−ペプチド抗体は、ペプチド
グリカンが流体状態（すなわち、***中の中隔面）にある領域のＣβタンパク質
上のこの領域にのみ接近するという考えを支持する。どの領域においても、細菌
がＳｅｒ−ペプチド抗体に完全に覆われたことは観察されなかった。

【０１６８】（ＦＡＣＳｃａｎ分析）：ＦＡＣＳｃａｎ分析についてのデータは、図１５に
示され得る。ｘ軸は、細菌サンプルを採取した培養開始以来経過した時間である
。ｙ¹軸は、そのサンプル中の細菌の数を示す、サンプルのＯＤ６００である。
ｙ²軸は、レッド蛍光（臭化エチジウムはすべての細菌を染色する）と比較した
グリーン蛍光の量（すなわち、Ｓｅｒ−ペプチド抗体結合）である。理解され得
るように、この培養の開始時には、非常にわずかなＳｅｒ−ペプチド抗体しか細
胞に結合しない。これが、一晩培養から定常期の細胞を新鮮な培養培地へ希釈す
る時間である。２時間までに、この連鎖球菌は、ＯＤ６００の増加により示され
るように、***し始め、そして増殖し始め、そして同時に、結合したｓｅｒ−ペ
プチド抗体の量の増加が観察される。抗体結合のピークは、対数期の間（４〜６
時間の間）のこの培養物の最も活性な部分と一致する。８時間後、この培養物は
、細菌の***が遅くなりそして停止する、定常期に入る。定常期のサンプリング
された細菌は、Ｓｅｒ−ペプチド抗体に結合せず、そしてこの培養の最初に見出
された生物と類似した。これらのデータは、もとの理論が正しいこと；Ｓｅｒ−
ペプチド抗体が結合するエピトープが、活性な細胞***に間にのみ、そして比較
的小さい領域（すなわち、これらの***中の細胞の中隔面）においてのみ曝露さ
れることを、さらに確認する。このような中隔***領域はまた、グラム陽性細菌
の細胞膜を露出させ、Ｓｅｒ−ペプチド抗体により活性化された補体成分が細菌
細胞膜での接近を妨害されないことを可能にして、細胞の溶解を完了する。

【０１６９】前記は特定の実施態様を述べたが、本発明がそのようには制限されないことが
、理解される。種々の改変が、そのような改変が為され得ること、そして本発明
の範囲（前記の特許請求の範囲により規定される）内であると意図されることが
、当業者に思い浮かぶ。本明細書中に引用されたすべての特許、特許出願、およ
び刊行物は、本明細書においてその全体が参考として援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、野生型Ｃβ１（Ｊｅｒｌｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．Ｇ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｒｏｌ．５：８４３−８４９（１９９１））のＤＮＡ配列および推
定アミノ酸配列を示す。図２、３および４に示されるＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩ
部位が同定される。

【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、Ｑ（登録商標）カラム（１．６×２０ｃｍ）
およびヘパリンカラム（１．６×２０ｃｍ）クロマトグラフィーについての、以
下の条件下でのタンパク質溶出プロフィールを示す：流速−５ｍｌ／分；減衰−
０．２；および勾配−０〜０．１ＭＮａＣｌ／０．５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅ
ｎｔ（登録商標）／２５ｍＭトリス（ＨＣＬ）、ｐＨ７．６〜７．８、１０ｍｌ
／画分。

【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、Ｑ（登録商標）カラム（１．６×２０ｃｍ）
およびヘパリンカラム（１．６×２０ｃｍ）クロマトグラフィーについての、以
下の条件下での溶出プロフィールを示す：流速−５ｍｌ／分；減衰−０．２；お
よび勾配−０〜０．１ＭＮａＣｌ／０．５％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録
商標）／２５ｍＭトリス（ＨＣＬ）、ｐＨ７．６〜７．８、１０ｍｌ／画分。

【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、Ｃβタンパク質精製データおよび対応する調製物のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを示す。図３Ａは、Ｑ（登録商標）カラムおよびヘパリンカラムに
おけるＣβタンパク質の精製を図示する。

【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、Ｃβタンパク質精製データおよび対応する調製物のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを示す。図３Ｂは、Ｑ（登録商標）カラムおよびＳ−３００ゲル濾
過カラムにおけるＣβタンパク質の精製を示す。

【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、Ｃβタンパク質のサーモリシン消化を図示する。図４Ａ
は、トリシンゲル上の見かけの分子量が３５ｋＤおよび２５ｋＤである得られた
フラグメントの消化パターンを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、Ｃβタンパク質のサーモリシン消化を図示する。図４Ｂ
は、抗体５２．２でプローブしたウエスタントランスファーであり、主なフラグ
メントが抗体と反応したことを示す。

【図５】図５は、ウエスタントランスファーおよび続くニトロセルロースメンブレンの
溶解によるＣβタンパク質フラグメントの分離および回収を示す。アリコートを
、ＳＤＳゲル上で泳動して、タンパク質回収を確認した。

【図６Ａ】図６は、Ｓｅｐｈａｃｌｙｌ（登録商標）−１００におけるゲル濾過によって
分離された、サーモリシン消化Ｃβタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図６Ｂ】図６は、Ｓｅｐｈａｃｌｙｌ（登録商標）−１００におけるゲル濾過によって
分離された、サーモリシン消化Ｃβタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図７】図７は、Ｔ１ペプチドのＡｒｇ−ＣフラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図８】図８は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のネイティブのＣβタンパク質の配列
を示す。Ｎ末端配列分析は、サーモリシン生成フラグメントＴ１およびＴ２が開
始する位置を示した（配列決定されたＮ末端区画は下線を付されている）。Ａｒ
ｇ−Ｃによる理論的なＴ１フラグメント消化を丸によって示す。

【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、８マーおよび２０マーのミモトープに結合す
る抗体のグラフ表示である。二連の実験を、各結合実験の間に洗浄しながら、各
ミモトープを用いて行った。

【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、８マーおよび２０マーのミモトープに結合す
る工程のグラフ表示である。二連の実験を、各結合実験の間に洗浄しながら、各
ミモトープを用いて行った（２つの棒）。いくらかの変動性は、不完全な洗浄に
起因する。

【図１０】図１０は、図８のアミノ酸８８０〜９０６に対応する合成ペプチドに抗体を予
め暴露することによる、２０マーのミモトープへの抗体結合の阻害のグラフ表示
である。図９Ｂにおける実験の２０マーについての１組のデータ（白抜き棒）は
、この合成ペプチドに暴露されていない抗体についてのポジティブコントロール
として含まれる。

【図１１】図１１は、Ｃβタンパク質およびそのサーモリシン消化フラグメントによる殺
菌性阻害のグラフ表示である。

【図１２】図１２は、ネイティブのＣβタンパク質に対する抗体を使用する殺菌アッセイ
におけるＢ群連鎖球菌性Ｉｂの生存のグラフ表示である。

【請求項１３】図１３は、Ｃβタンパク質に対するＳｅｒペプチド抗体を使用する殺菌アッセ
イにおけるＢ群連鎖球菌性Ｉｂの生存のグラフ表示である。

【請求項１４】図１４は、破傷カラム単独、および破傷風カラムに次いでプロテインＧカラム
によって精製した抗血清を使用する、Ｂ群連鎖球菌性Ｉｂコロニーリフト上で結
合するＳｅｒペプチド抗体を示す。

【請求項１５】図１５は、Ｂ群連鎖球菌性Ｉｂ増殖およびＳｅｒペプチド抗体結合の相関のグ
ラフ表示である。Ｓｅｒペプチド抗体結合は、誘導増殖期の間で開始し、そして
対数増殖期の間にピークになる。細菌は定常期に達し、そして***するので、抗
体結合は、０まで減少する。

【図１６】図１６は、ウサギ抗体５２．２結合、および重複する８マーのミモトープピン
（Ａｒｇ−Ｃ消化Ｒ２ペプチドフラグメントの配列を示す）への結合の阻害のグ
ラフ表示である。詳細には、棒グラフは、最高の抗体親和性を有する（未吸着）
配列およびミモトープに対して抗体５２．２を阻害するインタクトなＣβタンパ
ク質の能力（吸収）を有する配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/18 Ｃ０７Ｋ 14/315 1/22 19/00 14/315 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:46） (31)優先権主張番号６０／１５４，０１７ (32)優先日平成11年９月15日(1999．9．15) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブレイク，ミランエス．アメリカ合衆国メリーランド 20759，フルトン，ビューフォートドライブ 8521 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 CE08 CE11 CE12 DA01 4B065 AA01X AA49Y AA57X AA87X AB01 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 AA04 BB12 DD22 EE01 EE05 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA41 CA11 DA86 EA31 FA72 FA74 GA01 GA23 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフラグメントおよ
び／もしくは変異体を得るためのプロセスであって、以下の工程：（ａ）細胞抽出物において該Ｃβタンパク質を得る工程；（ｂ）該Ｃβタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、そして該Ｃ
βタンパク質含有画分を収集する工程；（ｃ）該Ｃβタンパク質含有画分をプールし、そして希釈する工程；ならびに（ｄ）該希釈したＣβタンパク質含有画分をリガンドアフィニティークロマト
グラフィーに供し、そして該画分を収集する工程；を包含し、それにより、実質的に純粋なＣβタンパク質またはそのフラグメン
トおよび／もしくは変異体が得られる、プロセス。
【請求項２】前記イオン交換クロマトグラフィーが、トリメチルアミノメ
チル基を含むアニオン交換媒体を利用して行われる、請求項１に記載のプロセス
。
【請求項３】前記リガンドアフィニティークロマトグラフィーが、ヘパリ
ンリガンドを含むリガンドアフィニティー媒体を利用して行われる、請求項１に
記載のプロセス。
【請求項４】前記Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／もしく
は変異体が、約５％の両イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中でクロマトグラ
フィーに供される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】前記Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／もしく
は変異体を含有する前記イオン交換クロマトグラフィー由来の前記プールされた
画分が、リガンドアフィニティークロマトグラフィーの前に、約１０％〜約２０
％の両イオン性界面活性剤を含有する緩衝液で、約３倍希釈される、請求項１に
記載のプロセス。
【請求項６】前記Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／もしく
は変異体が、前記イオン交換クロマトグラフィーまたはリガンドアフィニティー
クロマトグラフィーの間に、塩勾配を含む溶離液を適用することによって媒体か
ら溶出される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】前記溶離液が約０．５％の両イオン性界面活性剤を含む、請
求項６に記載のプロセス。
【請求項８】前記Ｃβタンパク質またはそのフラグメントおよび／もしく
は変異体が、細菌細胞から得られ、該細菌細胞は該Ｃβタンパク質またはそのフ
ラグメントおよび／もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列でトランスフ
ェクトされており、ここで該細胞が、該Ｃβタンパク質またはそのフラグメント
および／もしくは変異体を過剰発現する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】請求項８に記載のプロセスであって、前記Ｃβタンパク質お
よび／またはそのフラグメントもしくは変異体が、以下の工程：（ａ）前記細胞を破壊する工程；（ｂ）約２０％（ｖ／ｖ）エタノール／約０．１ＭＣａＣｌ₂の濃度までエ
タノール／ＣａＣｌ₂を添加することによって非タンパク質様物質を該細胞から
沈殿させる工程；（ｃ）該沈殿した非タンパク質様物質を除去して、溶液を得る工程；（ｄ）約８０％（ｖ／ｖ）の濃度までエタノールを添加することによって該溶
液からタンパク質を沈殿させ、そして該沈殿したタンパク質を収集する工程；な
らびに（ｅ）約１％〜約１０％の両イオン性界面活性剤を含有する緩衝溶液中に、該
沈殿したタンパク質を再懸濁する工程、によって得られる、プロセス。
【請求項１０】前記Ｃβタンパク質が、該Ｃβタンパク質を天然に産生す
る細菌細胞から得られる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】請求項１０に記載のプロセスであって、前記Ｃβタンパク
質が、以下の工程；（ａ）約１％〜約１０％の両イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中で前記細
菌細胞を煮沸して、溶液を得る工程；（ｂ）氷浴中で該溶液を冷却する工程；（ｃ）エタノール／ＣａＣｌ₂の***液を添加することによって、該細胞から
非タンパク質様物質を沈殿させて、約２０％エタノール／約０．１ＭＣａＣｌ ₂ の濃度を得る工程；（ｄ）該沈殿した非タンパク質様物質を除去して、溶液を得る工程；（ｅ）約８０％（ｖ／ｖ）の濃度までエタノールを添加することによって、該
溶液からタンパク質を沈殿させ、そして該沈殿したタンパク質を収集する工程；
ならびに（ｆ）約１％〜約１０％の両イオン性界面活性剤を含有する緩衝溶液中に、該
沈殿したタンパク質を再懸濁する工程；によって得られる、プロセス。
【請求項１２】プロリンリッチ領域を含むタンパク質フラグメントまたは
ペプチドをコードする単離された核酸分子であって、ここで、少なくとも３番目
毎に残基がプロリンであり、そしてここで該タンパク質フラグメントまたはペプ
チドに対して惹起された抗体が、補体単独を有するグラム陽性細菌に対して殺菌
性である、単離された核酸分子。
【請求項１３】前記タンパク質フラグメントまたはペプチドが、式−［Ｐ
−Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂］_r−または−［Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ−Ｙ₁−Ｙ₂−Ｐ］_rを有
する連続する（反復）アミノ酸配列を含み、ここでＹ₁は酸性残基または塩基性
残基のいずれかを表し、Ｙ₂は中性アミノ酸を表し、そしてｒは１〜５の整数で
ある、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】前記タンパク質フラグメントまたはペプチドが、式−［Ｐ
−Ｄ−Ｙ₃−Ｐ−Ｋ−Ｌ］_r−または−［Ｋ−Ｌ−Ｐ−Ｄ−Ｙ₃−Ｐ］_r−を有する
連続する（反復）アミノ酸を含み、ここでＹ₃はＶまたはＡを表し、そしてｒは
１〜５の整数である、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】前記タンパク質フラグメントまたはペプチドが、式−［Ｓ
−Ｐ−Ｋ−Ｙ₄−Ｐ−Ｅ−Ａ−Ｐ−Ｙ₅−Ｖ−Ｐ−Ｅ］_r−を有する連続する（反
復）アミノ酸配列を含み、ここでＹ₄はＴまたはＡを表し、Ｙ₅はＨまたはＲを表
し、そしてｒは１〜５の整数である、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】式Ｘ−Ｙ−Ｚを有するタンパク質フラグメントまたはペプ
チドをコードする単離された核酸分子であって、ここでＸは、図１（配列番号２
）のアミノ酸８２７と１０２８との間の少なくとも８個の連続するアミノ酸残基
を表し、ＹはＸに結合された水素あるいは図１（配列番号２）のＮ末端アミノ酸
配列またはそのＮ末端フラグメントおよび／もしくは変異体を表し、そしてＺは
Ｘに結合された水素あるいは図１（配列番号２）のＣ末端アミノ酸配列またはそ
のＣ末端フラグメントおよび／もしくは変異体を表し、そしてここで、該タンパ
ク質フラグメントまたはペプチドは、ヒトＩｇＡ免疫グロブリンのＦｃ領域に結
合せず、ただし、該タンパク質は図１（配列番号２）のアミノ酸配列のＮ末端フ
ラグメントもしくはＣ末端フラグメントの少なくとも１つであり、ただし、該タ
ンパク質フラグメントまたはペプチドは、Ｂ群連鎖球菌株ＨＧ８０６によって分
泌される約３８ｋＤポリペプチドではなく、さらに、ただし、図１（配列番号２
）のアミノ酸１〜１６４の少なくとも１つは、Ｙに存在する場合、非野生型であ
る、単離された核酸分子。
【請求項１７】前記Ｙが少なくとも、配列番号２のアミノ酸１〜１７６を
含まない、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】前記Ｚが少なくとも、配列番号２のアミノ酸９０１を含む
、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１９】前記Ｘが以下：【化１】からなる群より選択される、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２０】前記Ｘが、配列番号２のアミノ酸８２８と１０２７との間
の任意の８〜２１個の連続するアミノ酸残基を表す、請求項１６に記載の核酸分
子。
【請求項２１】前記Ｘが、配列番号２に示される配列のアミノ酸８２８と
１０２７との間のアミノ酸配列を表す、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２２】請求項１２または１６に記載のポリヌクレオチド分子を含
む、ベクター。
【請求項２３】請求項２２に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞
。
【請求項２４】請求項１２または請求項１６に記載の核酸分子によってコ
ードされる、タンパク質フラグメントまたはペプチド。
【請求項２５】請求項２４に記載のタンパク質フラグメントまたはペプチ
ドを含む、タンパク質フラグメント−ポリサッカリド結合体またはペプチド−ポ
リサッカリド結合体。
【請求項２６】薬学的に受容可能なキャリアとともに、少なくとも１つの
請求項２４に記載のタンパク質フラグメントまたはペプチドを含む、ワクチン。
【請求項２７】前記タンパク質フラグメントまたはペプチドが、Ｂ群連鎖
球菌性莢膜ポリサッカリドＩａ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＶ型からなる群より
選択されるポリサッカリドに結合体化される、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２８】請求項２７に記載のタンパク質フラグメント−ポリサッカ
リド結合体またはペプチド−ポリサッカリド結合体を少なくとも２つ含む、混合
ワクチン。
【請求項２９】哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、薬学
的に受容可能なキャリアとともに、哺乳動物において免疫応答を誘導するに十分
な量の請求項２４に記載のタンパク質フラグメントまたはペプチドを少なくとも
１つ含むワクチンを投与する工程を包含する、方法。