JP2002524528A - ヘッジホッグ様ポリペプチドによる肺組織の調節、およびそれに関する製剤および使用方法 - Google Patents
ヘッジホッグ様ポリペプチドによる肺組織の調節、およびそれに関する製剤および使用方法Info
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Abstract
Description
である。高等生物の物理的複雑性は、細胞内因性系統および細胞外因性シグナリ
ングの相互作用による胚形成中に生じる。誘導的な相互作用は、身体計画(body
plan)の初期造形からの脊椎動物発生における胚パターニング(patterning)、器
官系のパターニング、組織分化中の種々の細胞タイプの産生に不可欠である(Dav
idson, E.,(1990) Development 108:365-389; Gurdon, J. B.,(1992) Cell 68:1
85-199; Jessell, T. M. et al.,(1992) Cell 68:257-270)。発達上の細胞相互
作用の効果は様々である。通常、反応性細胞は、誘導されていないおよび誘導さ
れた状態の反応性細胞と異なる誘導細胞により細胞分化の一つの経路から別の経
路へ変化される(誘導)。細胞が近隣細胞を誘導する場合もあり(同質誘導)、
細胞が近隣細胞の分化を抑制する場合もある。初期発生における細胞相互作用は
連続的であるので、二つの細胞タイプ間の初期誘導により多様性の進行性増幅が
生じるかもしれない。さらに、誘導相互作用は、胚だけでなく成熟細胞中でも生
じ、形態発生パターンの確立および維持並びに分化の誘導に作用し得る(J.B. Gu
rdon(1992) Cell 68:185-199)。
動物の発生中多くの重要な短期および長期パターニング過程を媒介する。ハエに
おいてシグナルヘッジホッグ遺伝子は、体節および成虫原基パターニングを調節
する。対照的に、脊椎動物では、ヘッジホッグ遺伝子系統群は、左右非対称、CN
S中の極性、体節および肢節、器官形成、軟骨形成および***形成の調節に関す
る。
ogaster)における遺伝子スクリーニングにより同定された(Nusslein-Volhard, C
. and Wieschaus, E.(1980) Nature 287, 795-801)。このスクリーニングにより
、胚および幼生発生に影響を与える多くの突然変異が同定された。1992年および
1993年、ショウジョウバエヘッジホッグ(hh)遺伝子の分子の性質が報告され(C.
F., Lee et al.(1992) Cell 71, 33-50)、その後多くのヘッジホッグ相同体が様
々の脊椎動物種から単離された。ショウジョウバエおよび他の無脊椎動物では一
つのヘッジホッグ遺伝子だけが発見されたのに対し、脊椎動物には多くのヘッジ
ホッグ遺伝子が存在する。
領域、およびより発散性のC末端領域からなる。分泌経路中のシグナル配列開裂
に加えて(Lee, J.J. et al.(1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al.(1992) G
enes Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al.(1994) Development 120:3339-3353)
、ヘッジホッグ前駆体タンパク質は、C末端部分中の保存配列に依存する内部自
己タンパク質分解開裂を受ける(Lee et al.(1994) Science 266:1528-1537; Por
ter et al.(1995) Nature 374:363-366)。この自己開裂により、19kDのN末端ペ
プチドおよび26−28kDのC末端ペプチドが生じる(Lee et al.(1992) supra; Taba
ta et al.(1992) supra; Chang et al.(1994) supra; Lee et al.(1994) supra;
Bumcrot, D.A., et al.(1995) Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et al
.(1995) supra; Ekker, S.C. et al.(1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J.
et al.(1995) Development 121:2349-2360)。N末端ペプチドは、合成される細
胞表面と強く結合して存在するのに対し、C末端ペプチドは、インビトロおよび
インビボの両方で自由に拡散できる(Lee et al.(1994) supra; Bumcrot et al.(
1995) supra; Mart’, E. et al.(1995) Development 121:2537-2547; Roelink,
H. et al.(1995) Cell 81:445-455)。興味深いことに、内部開裂の正常な位置
で正確に終了するRNAによりコードされるHHの切断形態はインビトロで(Porter e
t al.(1995) supra)およびインビボで(Porter, J.A. et al.(1996) Cell 86, 21
-34)拡散できるので、細胞表面のN末端の保持は自己開裂に依存する。生化学的
研究により、HH前駆体タンパク質の自己タンパク質分解開裂は、続いて求核置換
において開裂される内部チオエステル中間体を通して進行する。求核試薬は、N
−ペプチドのC末端に共有結合する小さい脂肪親和性分子であると考えられ(Port
er et al.(1996) supra)、細胞表面に結合する働きをする。生物学的意味は深い
。結合の結果、高い局所濃度のN末端ヘッジホッグペプチドがヘッジホッグ産生
細胞の表面上で産生される。ショウジョウバエおよび脊椎動物における短期およ
び長期ヘッジホッグシグナリング活性に必要十分なのはこのN末端ペプチドであ
る(Porter et al.(1995) supra; Ekker et al.(1995) supra; Lai et al.(1995)
supra; Roelink, H. et al.(1995 Cell 81:445−455; Porter et al.(1996) su
pra; Fietz, M.J. et al.(1995) Curr. Biol. 5:643−651;Fan,C.−M.et al.(19
95) Cell 81:457-465; Mart’ E., et al.(1995) Nature 375:322-325; Lopez-M
artinez et al.(1995) Curr. Biol 5:791-795; Ekker. S.C. et al.(1995) Deve
lopment 121:2337-2347; Forbes, A.J. et al.(1996) Development 122:1125-11
35)。
ング工程に関係する。初期の胚中の体節極性の確立においては直接媒介されると
考えられる短期効果を有するのに対し、成虫原基のパターニングにおいては二次
シグナルの誘導により長期効果を誘発する。
た(表1参照)。これらの遺伝子のうち、Shhは近隣の組織をパターン化するシ
グナルの供給源である異なる形成中心で発現されるので、実験的関心の多くを受
けてきた。最近の証拠により、Shhはこれらの相互作用に関係することが示され
る。
の相互作用は、下流エフェクターの活性化および抑制を含むカスケードを開始さ
せ、その最終的な結果は、例えば遺伝子の転写または翻訳における検出可能な変
化である。ヘッジホッグシグナリングの転写標的は、パッチ物遺伝子自身(Hidal
go and Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Marigo et al., 1996)および
ショウジョウバエキュビタスインターラプタス(cubitus interruptus)(Ci)遺伝
子の脊椎動物相同体であるGLI遺伝子(Hui et al.(1994) Dev Biol 162:402-413)
である。パッチ物遺伝子発現は、Shhに反応性の肢節芽および神経板の細胞中で
誘発されるようである(Marigo et al.(1996) Development 122:1225-1233)。GLI
遺伝子は、亜鉛フィンガーDNA結合領域を有する推定転写因子をコードする(Oren
ic et al.(1990) Genes & Dev 4:1053-1067; Kinzler et al.(1990) Mol Cell B
iol 10:634-642)。GLI遺伝子の転写は、肢節芽中でヘッジホッグに応じてアップ
レギュレートされることが報告されているのに対し、GLI3遺伝子の転写は、ヘッ
ジホッグの誘導に応じてダウンレギュレートされる(Marigo et al.(1996) Devel
opment 122:1225-1233)。さらに、Ciの上昇したレベルは、ヘッジホッグ活性が
なくても、パッチ物(ptc)および他のヘッジホッグ標的遺伝子を活性化するのに
十分であることが示されている。
ない場合に比較して肺組織中の細胞の増殖率を変化させる(促進または抑制する
)のに有効な量で、例えば、インビトロまたはインビボで、組織をヘッジホッグ
治療物、ptc治療物、またはFGF−10治療物(以下に記載される)と異所的に接触
させることにより、肺組織、またはその細胞の成長状態を調節する方法に関する
。本発明の方法は、例えば、肺組織の上皮細胞および/または間葉細胞の成長状
態を調節するために使用でき、病気状態の予防のための養生の一部として、また
は現存する病気状態または肺組織への他の損傷の治療において有用であるかもし
れない。
療物は好ましくは、少なくともヘッジホッグタンパク質の生物活性細胞外部分を
含むヘッジホッグ部分を含むポリペプチドであり、例えばヘッジホッグ部分には
ヘッジホッグタンパク質のN末端半分の少なくとも50,100,または150の(隣接す
る)アミノ酸残基が含まれる。好ましい実施の形態において、ヘッジホッグ部分
には、ヘッジホッグタンパク質の細胞外領域の19kd断片に対応するヘッジホッグ
タンパク質の少なくとも一部が含まれる。
18または20のいずれかのヘッジホッグタンパク質と少なくとも60,75,85,または9
5パーセント同一のアミノ酸配列を有するが、これらの配列表エントリーと同一
の配列もまた本発明の方法において有用であると考えられる。ヘッジホッグタン
パク質は、ストリンジェントな条件下で配列番号1−9または19のいずれかの核酸
配列にハイブリッド形成する核酸によりコードでき、例えばヘッジホッグ部分は
脊椎動物ヘッジホッグ遺伝子、特にヒトヘッジホッグ遺伝子によりコードできる
。
ル成分、例えばコレステロールまたはその誘導体により修飾される。
ミトイル、ステアロイル、およびアラキドイルからなる群より選択されるような
一つ以上の脂肪酸成分により修飾される。
と再結合して、ヘッジホッグ遺伝子のコード配列と機能的に結合した異種転写調
節配列を提供する遺伝子活性化構成物を施用することにより行うことができる。
をコードする遺伝子治療構成物を施用することにより行うことができる。例えば
、遺伝子治療構成物は、組換えウィルス粒子、リポソーム、およびポリカチオン
性核酸結合因子からなる群より選択される組成物で提供される。
とができる。ptc治療物の例は、パッチ物タンパク質と結合し有糸***のパッチ
物媒介抑制を解除する小さい有機分子であり、例えばパッチ物に結合しヘッジホ
ッグ媒介パッチ物シグナル導入を模倣する分子、パッチ物に結合しパッチ物依存
遺伝子発現を調節する分子である。例えば、パッチ物へのptc治療物の結合によ
り、パッチ物および/またはgli発現がアップレギュレートされる。
細胞内タンパク質の局在、タンパク質間結合および/または酵素活性を変化させ
ることにより、ヘッジホッグ媒介パッチ物シグナル導入を誘発する小さい有機分
子でもよい。例えば、ptc治療物は、ヘッジホッグタンパク質、パッチ物タンパ
ク質またはパッチ物の細胞内シグナル導入経路に関するタンパク質の発現のレベ
ルを変化させ得る。
るタンパク質の発現およびヘッジホッグ媒介シグナルを弱めるタンパク質の発現
を抑制するアンチセンス構成物である。アンチセンス構成物は好ましくは、約20
−30ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、少なくとも50パーセント
のGC含量を有する。
うなタンパク質キナーゼA(PKA)の抑制因子である。PKA抑制因子は、サイクリッ
クAMP類似体でもよい。PKA抑制因子の例には、N-[2-((p-ブロモシンナミル)アミ
ノ)エチル]-5-イソキノリンスルホンアミド、1-(5-イソキノリン-スルホニル)-2
-メチルピペラジン、KT5720、8-ブロモ-cAMP、ジブチリル-cAMPおよびPKA熱安定
性抑制因子アイソフォームαが含まれる。別のPKA抑制因子の例は、一般式:
るように、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル(例え
ばカルボキシル、エステル、ホルメート、またはケトン)、チオカルボニル(例
えばチオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート)、アミノ、アシル
アミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、スルフェート、スルホネート、スル
ホンアミド、−(CH2)m−R8、−(CH2)m−OH、−(CH2)m−O−低級アルキル、−(CH2 )m−O−低級アルケニル、−(CH2)n−O−(CH2)m− R8、−(CH2)m−SH、−(CH2)m −S−低級アルキル、−(CH2)m−S−低級アルケニル、−(CH2)n−S−(CH2)m−R8
を示す、または R1およびR2は、Nとともに複素環(置換されたまたは置換されていない)を形
成し、 R3は、存在しないかまたは低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、
カルボニル(例えばカルボキシル、エステル、ホルメート、またはケトン)、チ
オカルボニル(例えばチオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート)
、アミノ、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、スルフェート、ス
ルホネート、スルホンアミド、−(CH2)m−R8、−(CH2)m−OH、−(CH2)m−O−低
級アルキル、−(CH2)m−O−低級アルケニル、−(CH2)n−O−(CH2)m− R8、−(CH2 )m−SH、−(CH2)m−S−低級アルキル、−(CH2)m−S−低級アルケニル、−(CH2)n −S−(CH2)m−R8のようなイソキノリン環への一つ以上の置換基を示し、 R8は、置換されたまたは置換されていないアリール、アラルキル、シクロアル
キル、シクロアルケニル、または複素環を示し、 nおよびmは、それぞれの存在について独立して、0または1から6までの範囲の
整数である。
傷治癒または他の再構成をコントロールし、肺移植を増加することができる。
、少なくともfgf−10タンパク質の生物活性細胞外部分を含むfgf−10部分を含む
ポリペプチドであり、例えばfgf−10部分にはfgf−10タンパク質の少なくとも50
,100または150の(隣接する)アミノ酸残基が含まれ、好ましくは配列番号24に
示されるようにヒトfgf−10タンパク質である。
パク質と少なくとも60,75,85,または95パーセント同一のアミノ酸配列を有する
が、配列番号24と同一の配列もまた本発明の方法において有用であると考えられ
る。fgf−10部分は、ストリンジェントな条件下で配列番号23の核酸配列にハイ
ブリッド形成する核酸によりコードでき、例えばfgf−10部分は脊椎動物fgf−10
遺伝子、特にヒトfgf−10遺伝子によりコードできる。
結合して、fgf−10遺伝子のコード配列と機能的に結合した異種転写調節配列を
提供する遺伝子活性化構成物を施用することにより行うことができる。
ードする遺伝子治療構成物を施用することにより行うことができる。例えば、遺
伝子治療構成物は、組換えウィルス粒子、リポソーム、およびポリカチオン性核
酸結合因子からなる群より選択される組成物で提供される。
製されたヘッジホッグ、ptcまたはfgf−10治療物の試料に関する。例えば、その
ような製剤には、ヘッジホッグタンパク質の生物活性断片を含むヘッジホッグポ
リペプチド配列を含むポリペプチドであって、吸入により肺組織へ施用するため
に調製されたポリペプチドが含まれてもよい。
、wtマウス肺は、はっきりした葉(矢印)が生じるのに分岐した様々の時間を有
する。(b)気管および食道は、分離した管である。(c)肺のレベルにおける断面図
は、枝分かれおよび切れ込みを示す。(d)12.5dpcにおいて、Shh-不完全肺は、切
れ込みまたは続く広い枝分かれを受けることができなかった。(e)気管および食
道は、気管食道隔膜に融合したままである。(f)突然変異肺は、一度だけ枝分か
れした。(g)18.5dpcにおいて、wtでは気嚢形成が進行し、呼吸表面は血管と密接
に結合している。(h)血管化の乏しい突然変異肺の枝分かれまたは成長はほとん
どないが、遠位上皮先端における気嚢形成は明らかである(矢印)。(i)18.5dpc
により、野生型の肺は、誘導気道および呼吸細気管支を確立した。(j)対照的に
、同じ状態の突然変異肺においては、枝分かれは大きく減少する。小数の主枝(
矢印)および気嚢(矢じり)だけが存在する。(k)野生型においては、気管およ
び食道は分離している。気管は円柱細胞により内側をおおわれ、食道は重層上皮
により内側をおおわれる。(l)気嚢は立方細胞からなる。(m)突然変異体において
、気道および食道は、融合してフィステルを形成している。円柱および重層上皮
への分化は明らかである。(n)独特な気嚢の立方上皮である。終末細気管支と呼
吸表面との間の限界線が示される。(o)18.5dpcの野生型肺の近位肺上皮は、クラ
ーラ細胞中でCCSPを発現し、(p)遠位上皮のタイプII肺胞細胞中でSP-Cを発現す
る。(q)CCSPおよび(r)SP-Cは、突然変異体中の正確な近位−上皮領域において発
現される。棒線は1mm(g,hのみ)または10μmを示し、(a,d,g,h)は下面図であり、
他はすべて横断面図である。省略:t−気管、e−食道、l−肺、h−心臓、s−胃
、mb−主かん気管支、b−気管支、tb−終末細気管支、a−気嚢。
示される遺伝子の発現を、野生型11.5および12.5、およびShh突然変異体12.5dpc
胚から取り出した肺により全量のビブラトム(vibratome)切片で調べた。
はいずれもアルシアン青染色により示されるように気管の周りに軟骨質の環を示
す。(b)野生型の肺においては一層の平滑筋が誘導上皮を囲むのに対して、突然
変異体の肺の間葉は筋肉に分化しない(右のパネル)。棒線は10mmを示す。
と内臓の間葉との間の相互作用に強く依存する。細胞間相互作用は、分枝形態形
成の機能的基礎を形成し、細胞外マトリクス、細胞性レセプター、およびペプチ
ド成長因子のような形態形成シグナリング分子を含む多くの媒介物質の活性によ
り起こる。分子調節シグナル、および特に分子形態形成および肺損傷/修復にお
ける転写因子の役割は、損傷の治療のための情報の重要な供給源である。さらに
、肺は出生後発達を続けるので、組織損傷または修復あるいは両方により放出さ
れる代替の形態形成シグナルの時機を失した活性化は、正常の形態形成を潜在的
に逸脱させ、新生児肺病の構造および機能異常特性が生じるかもしれない。
あることが示される。例えばShhヌル(null)突然変異体において、気管および食
道は完全に分離せず、一次肺芽の形成後に枝分かれおよび発達しないために肺は
痕跡嚢を形成する。興味深いことに、気道上皮の正常な近位−遠位の分化が起こ
り、これによりShhが分化の発生に必要でないことが示される。さらに、Shhの間
葉の発現した下流標的の多くの転写は起こらない。これらの結果により、上皮由
来のShhが肺の分枝形態形成において重要であることが強調され、肺の形態形成
、病気および修復におけるヘッジホッグの役割が確立され、SHHは通常インビボ
で肺間葉細胞の増殖を調節することが示される。
持のコントロールに使用できるという発見に関する。添付の実施例に記載される
ように、ヘッジホッグタンパク質は、肺間葉細胞および上皮細胞の増殖および分
化に関係し、肺組織の形成および維持を調節する初期シグナルを提供する。本発
明は、例えばインビトロまたはインビボのいずれかで肺組織の成長状態を調節す
る方法を提供する。通常、本発明の方法は、肺組織、または肺に由来する細胞を
、例えばヘッジホッグ治療物が十分なヘッジホッグ作用物質またはヘッジホッグ
拮抗物質であるか否かに依存して肺組織の微小構造の形成を誘発または抑制する
細胞により非毒性応答を産生するある量のヘッジホッグ治療物(以下で定義され
る)と接触させる工程を含む。本発明の方法は、培養組織または無傷の組織また
は器官の一部において分散する肺細胞上で行ってもよい。さらに、本発明の方法
は、培養液中で提供される細胞(インビトロ)、または動物全体における細胞(
インビボ)上で行ってもよい。
調節できることは、少なくとも一部は、これらのタンパク質が遺伝子発現のパッ
チ物媒介調節および該タンパク質により媒介される他の物理的効果に拮抗する(
直接または間接的に)能力による。細胞表面タンパク質であるパッチ物遺伝子産
物は、位置情報を伝えるタンパク質であるモルフォゲンのWntおよびDpp/BMP系統
群のメンバーの転写を抑制する経路によりシグナルを出すことが知られている。
脊椎動物におけるCNSの発達および肢節のパターニングにおいて、ヘッジホッグ
の誘発は、パッチ物により与えられるこの抑制を和らげ(解除し)、特定の遺伝
子プログラムを発現させる。
おける突然変異は、遺伝性皮膚癌の原因となり、散在性皮膚ガンの一因となり得
ることが報告された。例えば、Hahn et al.(1996) Cell 86:841-851; and Johns
on et al.(1996) Science 272:1668-1671参照。母斑性基底細胞癌(NBCC)はヒト
パッチ物遺伝子における突然変異により起こることの証明により、後胚発生にお
いてパッチ物が果たす役割の例が提供される。これらの観察により、パッチ物の
一つの活性が、ヘッジホッグからの増殖シグナルを抑制することにより作用する
腫瘍抑制遺伝子であることが理解される。以下に示される本発明者の観察より、
肺組織の増殖および分化の維持におけるヘッジホッグ/パッチ物経路についての
潜在的な新しい役割が明らかになる。したがって、本発明は、例えば以下に記載
される薬物スクリーニングアッセイから同定される、パッチ物シグナリングにお
けるヘッジホッグタンパク質の効果を模倣することができる他の因子の使用を考
慮する。
トロールする、胚の肺に存在するヘッジホッグ調節網の重要な構成要素であるこ
とが示される。したがって、本出願人は、fgf-10活性の作用物質および拮抗物質
を考慮する。
集める。
ように、天然発生ヘッジホッグタンパク質の効果を模倣するまたは強化する(作
用する)あるいは抑制する(弱める)ことにより肺細胞の増殖/分化状態を調節
することができる、様々の形態のヘッジホッグポリペプチド、並びに偽ペプチド
を称する。野生型ヘッジホッグタンパク質の活性を模倣するまたは強化するヘッ
ジホッグ治療物は、「ヘッジホッグ作用物質」である。逆に、野生型ヘッジホッ
グタンパク質の活性を抑制するヘッジホッグ治療物は、「ヘッジホッグ拮抗物質
」である。
質およびそのペプチド断片の製剤が含まれ、作用物質および拮抗物質形態のいず
れも明細書の内容のように明らかになるであろう。
型ヘッジホッグタンパク質により媒介される誘導発生に特異的に作用または拮抗
する、全長ヘッジホッグポリペプチドの断片を称する。ヘッジホッグ生物活性断
片は好ましくは、ヘッジホッグタンパク質の可溶性細胞外部分であり、溶解度は
生理学的親和性の溶液に関する。生物活性断片の例は、国際特許出願公開第95/1
8856号および同第96/17924号に記載されている。
接触させることにより誘導されるシグナル導入に関する関連膜内外タンパク質の
系統群を称する。例えば、哺乳類ptc系統群には、ptc1およびptc2が含まれる。
以下に示される参考文献に加えて、Takabatake et al.(1997) FEBES Lett 410:4
85および例えばptc2のGenBank AB000847参照。文脈から明らかでなければ、ptc1
(または単にptc)に関連して記載される実施の形態は、ptc2のような他のptc相
同体を含む同等の実施の形態も称することが理解されるであろう。
るパッチ物シグナリングにおけるヘッジホッグタンパク質の効果を模倣する、ま
たは(ii)パッチ物シグナリングを活性化するまたは強化する因子を称する。他の
実施の形態において、ptc治療物は、ヘッジホッグ拮抗物質でもよい。Ptc治療物
は、例えば、ペプチド、核酸、炭水化物、小さい有機分子、または天然産物抽出
物(またはその分画)でもよい。
の効果を適切に模倣するまたは弱める因子を称する。そのような因子にはまた、
fgf−10レセプターに結合しfgf−10シグナリングを抑制するまたは苦しめる小さ
い有機分子が含まれる。
は間接的に、肺細胞、間葉細胞または上皮細胞の増殖を誘発するものである。逆
に、ptc、ヘッジホッグまたはfgf−10治療物の「反増殖性」形態は、例えば分化
した表現型を促進または維持するまたはそうでなければ休止を促進することによ
り、好ましくは非毒性様式で肺細胞の増殖を抑制するものである。
ペプチドは通常、パッチ物媒介細胞周期停止を解除するタンパク質の形態であり
、例えばポリペプチドは、肺組織における天然発生ヘッジホッグタンパク質の効
果を模倣する。増殖性ptc治療物には、パッチ物媒介細胞周期停止を解除する他
の因子が含まれ、細胞外または細胞内で作用する。
もしれない。そのような因子は、例えばパッチ物に結合するヘッジホッグのよう
にパッチ物タンパク質のシグナル導入経路を抑制する小さい分子、並びに刺激お
よび/または強化する因子でもよい。
細胞を称する。
自発的に転換した細胞、すなわち細胞中で不定数の***により成長する能力を獲
得した細胞を称する。形質転換された細胞は、成長のコントロールを失ったこと
に関し、新生、退生および/または増殖性のような用語により特徴付けられる。
により変化され、細胞中で不定数の***により成長する能力を有する細胞を称す
る。
以外の動物を意味する。
、例えば、所望の投薬養生法の一部として施用された場合に、細胞増殖率および
/または細胞の分化の状態に変化を起こし、治療される障害または化粧用の目的
について臨床上許容できる基準に従う量で肺細胞の増殖を産生する(または抑制
する場合もある)製剤中のヘッジホッグポリペプチドの量を称する。
有する二つのポリペプチド配列間の配列類似性を称する。相同性および同一性は
、比較のために並べられたそれぞれの配列中の位置を比較することにより測定で
きる。比較された配列中の位置が同じアミノ酸残基により占められている場合、
ポリペプチドはその位置で同一であるといえる;相当する部位が同じアミノ酸(
例えば同一の)または類似するアミノ酸(例えば立体および/または電子の性質
において類似する)により占められている場合、分子はその位置で相同であると
いえる。配列間の相同性または同一性のパーセンテージは、配列により共有され
る一致するまたは相同の位置の数の相関関係である。「関連しない」または「相
同でない」配列は、ここに開示されるヘッジホッグ配列と40パーセント未満の同
一性、好ましくは25パーセント未満の同一性を共有する。
、関心のある配列が対応するといわれる関連配列に同一または相同であることを
意味する。
う用語は、本明細書に亘り相互に交換して使用され、通常、ポリペプチドをコー
ドするDNAが適切な発現構成物中に挿入されて宿主細胞を形質転換するために使
用され異種タンパク質を産生する組換えDNA技術により産生されるポリペプチド
を称する。すなわち、ポリペプチドは異種核酸から発現される。
チドをコードする第一のアミノ酸配列と、hhタンパク質のいずれの領域とも異な
り実質的に相同でない領域を示す第二のアミノ酸配列との融合である。キメラタ
ンパク質は、第一のタンパク質を発現する生体中で見られる(異なるタンパク質
中にもかかわらず)外的領域を指してもよいし、異なる種の生体により発現され
るタンパク質構造の「種間」、「遺伝子間」等の融合でもよい。通常、融合タン
パク質は、一般式(X)n-(hh)m-(Y)nによって表すことができ、hhはヘッジホッグ
タンパク質の全てまたは一部を示し、XおよびYはそれぞれ独立してヘッジホッグ
配列と接するポリペプチド鎖として天然には見られないアミノ酸配列を示し、m
は1以上の整数であり、それぞれのnは互いに無関係に0または1以上の整数であ
る(nおよびmは好ましくは5または10以下である)。
または予防に対し広い適用性を有する。通常、本発明の方法は、治療される肺組
織の成長状態を効果的に変化させるためにある量のptc、ヘッジホッグまたはfgf
−10治療物を動物に投与する工程を含むことで特徴付けることができる。投与お
よび投薬養生の様式は、標的肺組織の表現型および所望の効果に依存して変化す
る。同様に、以下にさらに詳細に記載されるように、特定のptc、ヘッジホッグ
またはfgf−10治療物、例えば作用物質または拮抗物質の使用は、治療される肺
組織中の細胞の増殖が妨げられることが所望であるかまたは意図されるか否かに
依存する。
はその擬似物を使用して肺組織の増殖をコントロールする薬剤および方法を提供
する。本発明はまた、本発明の薬剤を使用することにより、組織の間葉細胞およ
び上皮細胞の増殖をコントロールする方法に関する。
たは移植における養生法の一部として使用してもよい。ここに開示される本発明
の方法および組成物はまた、肺組織を苦しめる増殖性の癌性疾病の治療を提供す
る。例えば、本発明の方法を使用して、肺組織を含む任意の外科手術と組み合わ
せることが所望な創傷治癒過程をコントロールすることができる。
長を促進するよりも抑制することができる。例えば、ここに開示されるある組成
物は、様々の増殖性または新生状態の治療または予防に適用してもよい。本発明
の方法は、例えば肺癌細胞の成長および転移の抑制に使用される治療または予防
に適用することができる。例えば、本発明のptc、ヘッジホッグおよびfgf−10治
療物の抑制形態は、小細胞肺癌(SCLC)、並びに腺癌、肺細胞癌および扁平上皮癌
のような非小細胞肺癌(NSCLC)のための治療プログラムの一部として使用しても
よい。
胸膜滲出により特徴付けられるリウマチ性肺疾患を治療することができる。その
ような肺(肺性)の症状発現は、慢性関節リウマチの成体形および幼形の両方で
起こる。
炎、膵嚢胞性繊維炎およびぜん息、および気管支痙攣のような呼吸器系統の病気
、または膵嚢胞性繊維炎、強直性脊椎炎、サルコイドーシス、珪肺症、好酸球性
肉芽腫、結核、および肺感染のような他の先端間質性肺疾病の合併症としての肺
組織への損傷を治療する、またはそのつらさを減少させることができる。
息、気腫、慢性気管支炎、塵肺、呼吸窮迫症候群、特発性肺繊維症および一次肺
高血圧から生じる肺組織への損傷を治療するまたは予防することができる。
肺、ベリウム症、および産業性気管支炎のような職業性の肺疾病の治療または予
防に使用することができる。
じ得る、喫煙のある健康因果関係を扱うことができる。
の両方において効果的である。本発明が適用される動物被験者は、ペットとして
または商業目的のために飼育される、ヒトに飼われる動物および家畜にまで広が
る。実施例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギである。
増殖を調節する方法を提供する。
よび/または分化を調節することができる。
心臓−肺移植治療は、あるヒトの疾患の治療において確立されている。本発明の
方法を使用して、半ビボにおいて肺組織の組織構造を維持する、およびある実施
の形態においてインビトロである肺組織の成長を促進することができる。本発明
の方法はまた、インビボにおける肺移植の「生着率」を改善するために使用でき
る。
り産生されたタンパク質および合成化学を含む様々の技術のいずれかにより産生
できる。ヘッジホッグ治療物のポリペプチド形態は、好ましくは、例えば天然発
生ヘッジホッグタンパク質またはその断片に一致する配列を有する、脊椎動物生
体からの脊椎動物ヘッジホッグタンパク質に由来する。しかしながら、ヘッジホ
ッグポリペプチドは、任意の後生動物有機体中で発生するヘッジホッグタンパク
質(またはその断片)に一致できることが認識されるであろう。
ルタンパク質、高度に保存されたN末端領域、およびより発散性のC末端領域によ
り特徴付けられる。分泌経路におけるシグナル配列開裂に加えて(Lee, J.J. et
al.(1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al.(1992) Genes Dev. 2635-2645; C
hang, D.E. et al.(1994) Development 120:3339-3353)、ヘッジホッグ前駆体タ
ンパク質は、C末端部分における保存された配列に依存する内部自己タンパク質
分解開裂を自然に受ける(Lee et al.(1994) Science 266:1528-1537; Porter et
al.(1995) Nature 374:363-366)。この自己開裂により、19kDのN末端ペプチド
および26-28kDのC末端ペプチドが生じる(Lee et al.(1992) supra; Tabata et a
l.(1992) supra; Chang et al.(1994) supra; Lee et al.(1994) supra; Bumcro
t, D.A., et al.(1995) Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et al.(1995)
supra; Ekker, S.C. et al.(1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et al.
(1995) Development 121:2349-2360)。N末端ペプチドは、内部で合成された細胞
の表面にしっかりと結合したままであるのに対し、C末端ペプチドは、インビト
ロおよびインビボの両方で自由に拡散できる(Lee et al.(1994) supra; Bumcrot
et al.(1995) supra; Mart’, E. et al.(1995) Development 121:2537-2547;
Roelink, H. et al.(1995) Cell 81:445-455)。内部開裂の正常な位置で正確に
終了するRNAによりコードされるヘッジホッグの切断形態はインビトロで(Porter
et al.(1995) supra)およびインビボで(Porter, J.A. et al.(1996) Cell 86,
21-34)拡散性であるので、N末端ペプチドの細胞表面での維持は自己開裂に依存
性である。生化学的研究により、ヘッジホッグ前駆体タンパク質の自己タンパク
質分解開裂は、続いて求核置換により開裂される内部チオエステル中間体により
進行することが示された。求核試薬は、N−ペプチドのC末端に共有結合し(Porte
r et al.(1996) supra)細胞表面につなぐ、小さい脂肪親和性分子、さらに特定
するとコレステロールであると考えられる。
ッジホッグ遺伝子(配列番号19)のパラログ(paralog)のような少なくとも4つの
メンバーが含まれる。ここでデザートヘッジホッグ(Dhh)、ソニックヘッジホッ
グ(Shh)およびインディアンヘッジホッグ(Ihh)と称されるこれらのメンバーの3
つは、魚、鳥、および哺乳類を含むすべての脊椎動物において存在するようであ
る。ここでティギー−ウィンクル(tiggie-winkle)ヘッジホッグ(Thh)と称される
第四のメンバーは、魚に特有のようである。添付の配列表によれば(表1も参照
)、ニワトリのShhポリペプチドは配列番号1によりコードされる;マウスのDhh
ポリペプチドは配列番号2によりコードされる;マウスのIhhポリペプチドは配
列番号3によりコードされる;マウスのShhポリペプチドは配列番号4によりコ
ードされる;ゼブラフィッシュのShhポリペプチドは配列番号5によりコードさ
れる;ヒトのShhポリペプチドは配列番号6によりコードされる;ヒトのIhhポリ
ペプチドは配列番号7によりコードされる;ヒトのDhhポリペプチドは配列番号
8によりコードされる;およびゼブラフィッシュのThhは配列番号9によりコー
ドされる。
は、前駆形態(pro-form)、全長成熟形態、および多くの処理を受けたそれらの断
片を含む多くの異なる形態で天然に存在するようである。前駆形態には、細胞外
領域の局部分泌のためのN末端シグナルペプチドが含まれるのに対し、全長成熟
形態にはこのシグナル配列はない。
り、タンパク質の生物学的活性断片を生ずる。例えば、ソニックヘッジホッグは
追加のタンパク質分解プロセシングを受けて、約19kDaおよび約27kDaの二つのペ
プチドを生じ、19kDaの断片は成熟タンパク質のタンパク質分解N末端部分に一致
する。
、脂肪酸等のような脂肪親和性成分の糖化および/または付加のような翻訳後修
飾をされてもよいが、細菌により産生された(例えば修飾されていない)形態の
タンパク質は、天然タンパク質の特定の生物活性を保持したままである。本発明
のヘッジホッグポリペプチドの生物活性断片が産生され、例えば国際特許出願公
開第95/18856号および同第96/17924号に詳細に記載されている。
在する。「脂肪親和基」という用語は、ヘッジホッグポリペプチドに結合してい
る場合において、高い炭化水素含量を有ししたがって脂質相に対して高い親和力
を有する基を称する。脂肪親和基は、例えば約7から約30までの炭素を有する比
較的長鎖のアルキルまたはシクロアルキル(好ましくはn-アルキル)でもよい。
アルキル基は、ヒドロキシまたは第1アミン「テール(tale)」で終了してもよい
。さらに説明するために、脂肪親和性分子には、脂肪酸、ステロール、エステル
およびアルコール、他の脂質分子のような天然発生および合成芳香族および非芳
香族成分、アダマンタンおよびバックミンスターフラーレンのようなかご形構成
物、およびベンゼン、ペリレン(perylen)、フェナントレン、アントラセン、ナ
フタリン、ピレン(pyrene)、クリセン、およびナフタセンのような芳香族炭化水
素が含まれる。
うな一つ以上のステロール成分により修飾される。例えば、国際特許出願公開第
96/17924号参照。ある実施の形態において、ヘッジホッグポリペプチドが天然発
生N末端タンパク質分解断片に一致する場合には、コレステロールは好ましくは
、C末端グリシンに付加される。
ミトイル、ステアロイル、またはアラキドイルのような脂肪酸成分により修飾さ
れてもよい。例えば、Pepinsky et al.(1998) J Biol. Chem 273:14037参照。
酸付加により示されるこれらの効果に加えて、ヘッジホッグ遺伝子産物の少なく
とも特定の生物活性は、タンパク質の他の部位における脂肪親和性成分によるタ
ンパク質の誘導および/またはコレステロールまたは脂肪酸以外の成分により強
化され得る。本発明のある態様は、タンパク質の天然処理形態のN末端またはC末
端残基以外の部位で修飾される、および/またはC末端においてステロールまた
はN末端において脂肪酸以外の脂肪親和性成分によりそのような末端残基におい
て修飾されるヘッジホッグポリペプチドの製剤の使用に関する。
肪酸および他の脂質およびリン脂質成分、ロウ、コレステロール、イソプレノイ
ド、テルペンおよびアダマンタンやバックミンスターフラーレンを含む多脂環式
炭化水素、ビタミン、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール
、(C1−C18)−アルキルリン酸ジエステル、−O−CH2−CH(OH)−O−(C12−C18)−
アルキル、および特にピレン誘導体との複合体である。脂肪親和性成分は、本発
明における使用に適切な脂肪親和性色素でもよく、ジフェニルヘキサトリエン、
ナイルレッド(Nile Red)、N−フェニル−1−ナフチルアミン、プロダン(Prodan)
、ラウロダン(Laurodan)、ピレン、ペリレン、ローダミン、ローダミンB、テト
ラメチルローダミン、テキサスレッド(Texas Red)、スルホローダミン、1,1’−
ジドデシル−3,3,3’,3’テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸、オクタ
デシルローダミンBおよびMolecular Probes Inc.から得られるBODIPY色素を含む
がそれに限定されない。
ルアダマント−1−イルアセチル、3−メチル−3−ブロモ−1−アダマンチルアセ
チル、1−デカリンアセチル、ショウノウアセチル、カンファンアセチル、ノル
アダマンチルアセチル、ノルボルナンアセチル、ビシクロ[2.2.2.] −オクト−5
−エンアセチル、1−メトキシビシクロ[2.2.2.] −オクト−5−エン−2−カルボ
ニル、シス−5−ノルボルネン(norbornene) −エンド−2,3−ジカルボニル、5−
ノルボルネン−2−イルアセチル、(1R) −(−) −ミルテンテーンアセチル(myrt
entaneacetyl)、2−ノルボルナンアセチル、アンチ−3−オキソ−トリシクロ[2.
2.1.0<2,6>] −ヘプタン−7−カルボニル、デカノイル、ドデカノイル、ドデシ
ノイル、テトラデカジエノイル、デシノイルまたはドデシノイルを含む脂肪族カ
ルボニル基群が含まれる。
方法で疎水性成分に結合されてもよい。
定性を高めるために(例えば半ビボにおける貯蔵寿命およびインビボにおけるタ
ンパク質分解に対する抵抗性)、修飾されたhhポリペプチドを産生してもよい。
そのような修飾されたペプチドは、例えばアミノ酸置換、欠失、または付加によ
り産生できる。修飾されたヘッジホッグポリペプチドには、例えば変化した糖化
、コレステロール化、プレニル化等の、天然発生ヘッジホッグタンパク質に関し
て変化した翻訳後プロセシングによるものが含まれてもよい。
で配列番号1−7の一つ以上に示されるヘッジホッグコード配列にハイブリッド形
成するヌクレオチド配列によりコードできるポリペプチドである。DNAハイブリ
ダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、例えば、約45℃にお
ける6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、その後50℃における2.0
×SSCによる洗浄が当業者に知られている、またはCurrent Protocols in Molecu
lar Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6に見ることができ
る。例えば、洗浄段階における塩濃度は、50℃における約2.0×SSCの低ストリン
ジェンシーから50℃における約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまでから選択し
てもよい。さらに、洗浄段階における温度は、約22℃における低ストリンジェン
シー条件から約65℃における高ストリンジェンシー条件まで増加してもよい。
ク質についての遺伝子は、当該技術においてよく知られる技術を使用してmRNAま
たはゲノムDNAサンプルから得られる。例えば、ヘッジホッグタンパク質をコー
ドするcDNAは、胚細胞を含む、例えばヒト細胞のような哺乳類細胞などの細胞か
らトータルmRNAを単離することにより得られる。二本鎖cDNAをトータルmRNAから
調製し、その後多くの既知の技術の一つを使用して適切なプラスミドまたはバク
テリオファージベクターに挿入することができる。ヘッジホッグタンパク質をコ
ードする遺伝子もまた、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を使用してクロー
ン化できる。
なくとも60%相同または同一、より好ましくは70%相同または同一、および最も
好ましくは80%相同または同一のアミノ酸配列を含むヘッジホッグポリペプチド
をコードする。配列番号8−14の一つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約90
%、より好ましくは約95%、および最も好ましくは約98−99%相同または同一の
ポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明の範囲内である。
ペプチドは、配列番号8−14のいずれかにより示されるアミノ酸配列と少なくと
も60%相同または同一、より好ましくは70%相同または同一および最も好ましく
は80%相同または同一である。配列番号8−14からなる群より選択される配列と
少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なく
とも約98−99%相同または同一であるポリペプチドもまた、本発明の範囲内であ
る。唯一の必要条件は、ヘッジホッグポリペプチドが肺細胞の成長を調節するこ
とができるということである。
するDNAを適切な発現ベクター中に挿入し、次に宿主細胞を形質転換させるため
に異種タンパク質を産生する組換えDNA技術により産生される本発明のポリペプ
チドを称する。さらに、組換えヘッジホッグ遺伝子に関して「に由来する」とい
う用語は、天然のヘッジホッグタンパク質のアミノ酸配列、またはそれに類似す
る、タンパク質の天然発生形態の置換および欠失(切断を含む)を含む突然変異
により産生されるアミノ酸配列を有するタンパク質である「組換えタンパク質」
の意味の範囲内に含まれることが意図される。
ペプチドの変異体形態を使用して行うことができる。
的技術または化学的合成により産生することができる。例えば、本発明のポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクターによりトラ
ンスフェクションされた宿主細胞を適切な条件下で培養して、ペプチドを発現さ
せることができる。ポリペプチドヘッジホッグは、細胞の混合物および組換えヘ
ッジホッグポリペプチドを含有する培地から分泌および単離されてもよい。ある
いは、組換えヘッジホッグ遺伝子および採収され、溶解されてタンパク質が単離
された細胞から、シグナルペプチド配列を除去することにより、ペプチドを細胞
質に保持してもよい。細胞培養には、宿主細胞、培地および他の副産物が含まれ
る。細胞培養に適切な培地は当該技術においてよく知られている。組換えヘッジ
ホッグポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフ
ィ、限外濾過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的な抗体による免疫
親和力精製を含むタンパク質を精製するための当該技術において知られる技術を
使用して、細胞培養培地、宿主細胞、または両方から単離することができる。好
ましい実施の形態において、組換えヘッジホッグポリペプチドは、ヘッジホッグ
/GST融合タンパク質のような、精製を容易にする領域を含有する融合タンパク
質である。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞でもよい。
ードする核酸を、原核細胞、真核細胞、または両方のいずれかにおける発現に適
切なベクター中にライゲーションすることにより産生できる。本発明のヘッジホ
ッグポリペプチドの組換え形態を産生するための発現ベクターには、プラスミド
および他のベクターが含まれる。例えば、ヘッジホッグポリペプチドの発現に適
切なベクターには、以下のタイプのプラスミドが含まれる:大腸菌のような原核
細胞中の発現のためのpBR322-由来プラスミド、pEMBL-由来プラスミド、pEX-由
来プラスミド、pBTac-由来プラスミドおよびpUC-由来プラスミド。
る。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、遺伝子構成
物のS.セレビシアエ(cerevisiae)中への導入において有用なクローニングおよび
発現媒体である(例えば、ここに引用されるBroach et al.(1983) in Experimen
tal Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p.83
参照)。これらのベクターは、pBR322 oriの存在により大腸菌中で、および酵母
2ミクロンプラスミドの複製決定因子によりS.セレビシアエ中で複製できる。さ
らに、アンピシリンのような薬剤耐性マーカーを使用してもよい。例としての実
施の形態において、ヘッジホッグポリペプチドは、配列番号1−7に示されるヘッ
ジホッグ遺伝子の一つのコード配列をサブクローニングにより産生される発現ベ
クターを使用して組換えにより産生される。
の原核配列、および真核細胞中で発現される一つ以上の真核転写ユニットの両方
が含まれる。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr
、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neoおよびpHyg由来ベクターは、真核細胞
のトランスフェクションに適切な哺乳類発現ベクターの例である。これらのベク
ターのいくつかは、pBR322のような細菌性プラスミドからの配列により修飾され
て、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬剤耐性選択を容易にす
る。あるいは、ウシ乳頭腫ウィルス(BPV-1)、またはエプステイン−バーウィル
ス(pHEBo、pREP-由来およびp205)のようなウィルスの誘導体は、真核細胞中のタ
ンパク質の一過性発現に使用できる。宿主生体のプラスミドおよび形質転換の調
製において使用される様々の方法は、当該技術においてよく知られている。原核
細胞および真核細胞のための他の適切な発現系、並びに一般的な組換え方法は、
Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. By Sambrook, Fritsch
and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and
17参照。
ッグポリペプチドを発現させることが所望かもしれない。そのようなバキュロウ
ィルス発現系の例には、pVL-由来ベクター(例えばpVL1392、pVL1393およびpVL9
41)、pAcUW-由来ベクター(例えばpAcUW1)、およびpBlueBac-由来ベクター(
例えばβ-gal含有pBlueBacIII)が含まれる。
変異体のようなヘッジホッグタンパク質の一部のみを発現させることが所望であ
る場合、発現されるのが所望である配列を含有するオリゴヌクレオチド断片に開
始コドン(ATG)を加える必要があるかもしれない。N末端位置におけるメチオニン
は、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)を使用することにより酵素開裂で
きることが当該技術においてよく知られている。MAPは、大腸菌(Ben-Bassat et
al.(1987) J. Bacteiol. 169:751-757)およびネズミチフス菌からクローン化さ
れ、そのインビトロにおける活性が、組換えタンパク質において示された(Mille
r et al.(1987) PNAS 84:2718-1722)。したがって、所望なら、MAPを産生する宿
主(例えば大腸菌またはCM89またはS.セレビシアエ)中でヘッジホッグ由来ポリ
ペプチドを発現させることによりインビボで、または精製されたMAPを使用する
ことによりインビトロで(例えばMiller et al., supraの方法)、N末端メチオ
ニンの除去を達成することができる。
ドするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部に組み込んでもよい。融合タン
パク質もまた、タンパク質の発現を促進し、したがって本発明のヘッジホッグポ
リペプチドの発現に使用できることは広く認識されている。例えば、ヘッジホッ
グポリペプチドはグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST−融合)タンパク質
として産生できる。例えばグルタチオン−誘導基質を使用することによって、そ
のようなGST−融合タンパク質によりヘッジホッグポリペプチドの容易な精製が
可能になる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel
et al.(N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)参照)。別の実施の形態において、ポ
リ−(His)/エンテロキナーゼ開裂部位配列のような純粋リーダー配列をコードす
る融合遺伝子を使用して、ヘッジホッグタンパク質(例えば前駆形態)のN末端
において天然に発生するシグナル配列を置換することにより、Ni2+金属樹脂を使
用するアフィニティクロマトグラフィによりポリ(His)−ヘッジホッグタンパク
質の精製を可能にすることができる。その後純粋リーダー配列を、エンテロキナ
ーゼによる処理によって除去してもよい(例えば、Hochuli et al.(1987) J. Ch
romatography 411:177; and Janknecht et al. PNAS 88:8972参照)。
プチド配列をコードする様々のDNA断片の結合は、ライゲーションのための平滑
末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素分解、適切な相補末
端の充填、所望でない結合を防止するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、お
よび酵素によるライゲーションを使用する従来技術により行われる。別の実施の
形態において、融合遺伝子は自動DNA合成装置を含む従来技術により合成できる
。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅は、その後アニーリングされてキメラ遺伝子
配列を産生する二つの続発性遺伝子断片間に相補的懸垂を生じさせるアンカープ
ライマーを使用して行うことができる(例えば、Current Protocols in Molecul
ar Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992参照)。
ル、イソプレノイド、脂質、ホスフェート、アセチル基等のような他の化学成分
との共有結合または凝集結合を形成することによりヘッジホッグ誘導体を産生し
てもよい。ヘッジホッグタンパク質の共有誘導体は、化学成分をタンパク質のア
ミノ酸側鎖上またはポリペプチドのN末端あるいはC末端における官能基に結合さ
せることにより調製できる。
合物の細胞表面への局在を強める、天然にタンパク質と関連する配列以外の成分
を含むように産生されてもよい。例えば、テトラペプチド配列R-G-D-S(Pierschb
acher et al.(1984) Nature 309:30-3; and Kornblihtt et al.(1985) EMBO 4:1
755-9)のようなフィブロネクチン「タイプ−III 反復」に由来する配列をヘッ
ジホッグポリペプチドに加えることにより、結合ECM成分によるキメラ分子の細
胞への結合を補助することができる(Ruoslahti et al.(1987) Science 238:491-
497; Pierschbacheret al.(1987) J. Biol. Chem. 262:17294-8.; Hynes(1987)
Cell 48:549-54; and Hynes(1992) Cell 69:11-25)。
リペプチドとの融合タンパク質の形態で提供されなければ、他の細胞性タンパク
質、特に通常ヘッジホッグポリペプチドと結合する他の細胞外または細胞表面結
合タンパク質から分離される、またはそれらを実質的に有しない。「他の細胞性
または細胞外タンパク質を実質的に有しない」(ここで「汚染タンパク質」とも
称される)または「実質的に純粋な製剤」あるいは「精製された試料」という用
語は、20%未満(乾燥重量により)の汚染タンパク質を有し、好ましくは5%未
満の汚染タンパク質を有するヘッジホッグポリペプチドの製剤を含むものとして
定義される。「精製された」とは、示された分子が、他のタンパク質のような他
の生物高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。ここで用い
たように「精製された」という用語は、好ましくは、存在する同じタイプの生物
高分子が乾燥重量で少なくとも80%、より好ましくは重量で95−99%の範囲、お
よび最も好ましくは重量で少なくとも99.8%であることを意味する(しかし、水
、緩衝剤、および特に他の小分子、特に5000未満の分子量を有する分子は存在し
てもよい)。ここで用いたように「純粋な」という用語は、上述の「精製された
」と同じ数値の制限を有する。
ペプチドには、配列番号10−18または20のいずれかに示されるアミノ酸配列のす
べてまたは一部、またはそれに相同の配列が含まれてもよい。本発明のヘッジホ
ッグタンパク質の好ましい断片は、天然タンパク質のN末端およびC末端タンパク
質分解断片に一致する。ヘッジホッグポリペプチドの生物活性断片は、国際特許
出願公開第95/18856号および同第96/17924号に詳細に記載されている。
療物には、ヘッジホッグポリペプチドの少なくとも50の(隣接する)アミノ酸残
基、より好ましくは少なくとも100の(隣接する)、およびより好ましくは少な
くとも150の(隣接する)残基が含まれる。
19kDaの分子量を有する成熟タンパク質のN末端断片である。
番号16の28−202残基、および配列番号17の23−198残基にほぼ一致するN末端断
片が含まれる。「ほぼ一致する」とは、関心のある配列が、関連配列と長さにお
いて多くても20のアミノ酸残基が異なることを意味し、より好ましくは多くても
5、10または15のアミノ酸が長さにおいて異なる。
ペプチドには、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、
配列番号13または配列番号14に示されるアミノ酸配列のすべてまたは一部、ある
いはそれに相同な配列が含まれてもよい。本発明のヘッジホッグタンパク質の好
ましい断片は、成熟タンパク質のN末端およびC末端タンパク質分解断片に一致す
る。ヘッジホッグポリペプチドの生物活性断片は、国際特許出願公開第95/18856
号および同第96/17924号に詳細に記載されている。
るアミノ酸配列が含まれる;(i)Aは、配列番号21の1−168残基により示されるア
ミノ酸配列のすべてまたは一部を示す;Bは、配列番号21の169−221残基により
示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を示す;(ii)Aは、配列
番号15の24−193残基により示されるアミノ酸配列のすべてまたは一部を示す;B
は、配列番号15の194−250残基により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つの
アミノ酸残基を示す;(iii)Aは、配列番号13の25−193残基により示されるアミ
ノ酸配列のすべてまたは一部を示す;Bは、配列番号13の194−250残基により示
されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を示す;(iv) Aは、配列番
号11の23−193残基により示されるアミノ酸配列のすべてまたは一部を示す;Bは
、配列番号11の194−250残基により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのア
ミノ酸残基を示す;(v) Aは、配列番号12の28−197残基により示されるアミノ酸
配列のすべてまたは一部を示す;Bは、配列番号12の198−250残基により示され
るアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を示す;(vi) Aは、配列番号16
の29−197残基により示されるアミノ酸配列のすべてまたは一部を示す;Bは、配
列番号16の198−250残基により示されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ
酸残基を示す;または(vii) Aは、配列番号17の23−193残基により示されるアミ
ノ酸配列のすべてまたは一部を示す;Bは、配列番号17の194−250残基により示
されるアミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸残基を示す。ある好ましい実施
の形態において、AおよびBはともに隣接するポリペプチド配列により示される配
列を示し、Aは、配列表中の対応するエントリーにより示される配列の少なくと
も25、50、75、100、125または150の(隣接する)アミノ酸を示し、Bは、アミノ
酸配列の少なくとも5、10、または20の(隣接する)アミノ酸残基を示し、Aおよ
びBはともに好ましくは配列表のエントリーに一致する隣接配列を示す。例えば
、上述される配列表エントリーからの好ましい断片に一致する断片のような他の
ヘッジホッグからの同様の断片も考えられる。好ましい実施の形態において、ヘ
ッジホッグポリペプチドには、コレステロールにより誘導されるC末端グリシン
(または他の適切な残基)が含まれる。
コードする核酸の対応断片から組換えにより産生されるペプチドをスクリーニン
グすることにより得られる。さらに、断片は従来のメリーフィールド固相f-Moc
またはt-Boc化学法のような当該技術において知られる技術を使用して化学的に
合成してもよい。例えば、本発明のヘッジホッグポリペプチドは、断片のオーバ
ーラップのない所望の長さの断片に任意に分離することができる、または好まし
くは所望の長さのオーバーラッピング断片に分離することができる。断片を産生
し(組換えによりまたは化学的合成により)、テストしてそれらのペプチド断片
のどれが野生型(例えば「真正」)ヘッジホッグタンパク質の作用物質または拮
抗物質として作用することができるかを同定することができる。例えば、Roman
et al.(1994) Eur J Biochem 222:65-73には、長いタンパク質からの短い、オー
バーラッピング合成ペプチドを使用する競合結合測定を使用して結合領域を同定
することが記載されている。
を変化させるまたはタンパク質に関連する酵素活性を不活性化する突然変異によ
り、タンパク質分解開裂に抵抗性のバージョンのタンパク質のような、真正ヘッ
ジホッグタンパク質の相同体が含まれる。本発明のヘッジホッグ相同体には、真
正タンパク質と異なる方法で翻訳後修飾されたタンパク質が含まれる。ヘッジホ
ッグタンパク質の誘導体の例には、N糖化部位のない(例えば非糖化タンパク質
を産生するため)、コレステロール化のための部位のない、および/またはN末
端および/またはC末端配列のないポリペプチドが含まれる。
または安定性(例えば半ビボにおける貯蔵寿命およびインビボにおけるタンパク
質分解に対する抵抗性)を高めるような目的のためでもある。そのような修飾さ
れたペプチドは、天然発生形態のタンパク質の少なくとも一つの活性を保持する
ように設計された場合、ここでより詳述されるヘッジホッグポリペプチドの機能
等価物と考えられる。そのような修飾されたペプチドは、例えばアミノ酸置換、
欠失、または付加により産生できる。
び/または等電子の突然変異)、アミノ酸のある分離置換は、生じた分子の生物
学的活性に大きな影響を与えずに行えることが合理的に予想できることは当該技
術においてよく知られている。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸の
系統群の中で起こる。遺伝的にコードされるアミノ酸は、4つの系統群に分けら
れる:(1)酸性=アスパラテート、グルタメート;(2)塩基性=リシン、ア
ルギニン、ヒスチジン;(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4
)非荷電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、ト
レオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、
ときに芳香族アミノ酸として共に分類される。同様に、アミノ酸レパートリーは
、(1)酸性=アスパラテート、グルタメート;(2)塩基性=リシン、アルギ
ニン、ヒスチジン;(3)脂肪族=グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イ
ソロイシン、セリン、トレオニンで、セリンおよびトレオニンは必要に応じて脂
肪族ヒドロキシルとして別に分類される;(4)芳香族=フェニルアラニン、チ
ロシン、トリプトファン;(5)アミド=アスパラギン、グルタミン;および(
6)硫黄含有=システインおよびメチオニンに分類できる(例えば、Biochemist
ry, 2nd ed., Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1981参照)。ペプチド
のアミノ酸配列における変化が機能性ヘッジホッグ相同体(例えば野生型形態を
擬態するまたは拮抗する作用をするという意味で機能性の)を生じるか否かは、
野生型タンパク質に類似する方法で細胞中に応答を産生する、またはそのような
応答を競合的に抑制する突然変異体ペプチドの能力を査定することにより、容易
に測定できる。1つ以上の置換がなされたポリペプチドは、同じ方法で容易にテ
ストできる。
きることが明確に予想される。ある実施の形態において、本発明は、無作為配列
突然変異誘発により産生されるヘッジホッグポリペプチドの使用を考慮に入れる
。当該技術において知られるように、そのような方法は、点突然変異体および切
断突然変異体の産生に都合がよく、ヘッジホッグタンパク質のレセプターに結合
する機能のある潜在的突然変異体配列(例えば相同体)の同定に特に有用である
。そのような無作為配列ライブラリをスクリーニングする目的は、例えば作用物
質または拮抗物質のいずれかとして作用できる新しいヘッジホッグ相同体を産生
することである。説明のために、ヘッジホッグ相同体は、本発明の方法によって
処理することにより、パッチ物のような同種レセプターへのより有効な結合を提
供し、さらにヘッジホッグと関連する活性の少なくとも一部を保持することがで
きる。したがって、組換えに由来する相同体は、タンパク質の天然発生形態に関
して増加した効力を有するように産生することができる。同様に、ヘッジホッグ
相同体は本発明の組換え法により産生することにより、拮抗物質として作用する
ことができる、すなわち例えば他の細胞がマトリクス成分(例えばレセプター)
への結合を模倣することができるが、生物学的応答を誘発せず、したがって真正
ヘッジホッグまたはヘッジホッグ作用物質の作用を抑制することができる。さら
に、本発明の方法によるヘッジホッグのある領域の操作は、細胞外マトリクスに
由来するおよび/または細胞外マトリクス成分に結合する他のタンパク質の部分
を取り込むような、融合タンパク質において使用するためにより適切な領域を提
供できる。
.(1994) J Med Chem 37:1233の記事には、1990年代初期の無作為配列ライブラリ
ーの技術の一般的な状態が記載されていることを示す。特に、Gallop et alは12
39ページで、「類似体のライブラリーのスクリーニングは、活性のある配列の最
小サイズを測定し、結合に対し臨界であり置換を受けないこれらの残基の同定を
促進する」と述べる。さらに、Landner et al.の国際特許出願公開第90/02809号
、Goeddel et al.の米国特許第5,223,408号、およびMarkland et al.の国際特許
出願公開第92/15679号には、すばやくスクリーニングすることによりヘッジホッ
グポリペプチドの特定の活性を保持する突然変異体/断片を同定できるヘッジホ
ッグ突然変異体のライブラリを作製するために当業者が利用できる特定の技術が
示されている。これらの技術は当該技術の例であり、関連する突然変異体/断片
の大きいライブラリを産生し分析して、過度の実験をせずに特定の突然変異体を
単離できることを示す。Gustin et al.(1993) Virology 193:653、およびBass e
t al.(1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:309-314にも、ヘ
ッジホッグポリペプチドの遺伝的突然変異体を産生するための方法として適用で
きる当該技術からの他の技術の例が記載される。
も、ヘッジホッグタンパク質のラージスケールの突然変異誘発により、等価生物
学的活性を有する突然変異体が広く配置されるということが無作為配列の突然変
異誘発から明らかである。さらに、臨界残基の前もっての理解または知識の必要
性を全て除去する徹底的な分析により、無作為配列技術によって数10億の異なる
突然変異体をスクリーニングすることができる。
ついてアミノ酸配列を、好ましくは可能な限り最高の相同性を得るように、整合
する。そのような突然変異体の母集団には、例えば一つ以上の種からのヘッジホ
ッグ相同体が含まれてもよい。整合された配列のそれぞれの位置に見られるアミ
ノ酸を選択して、無作為配列の変性セットを作成する。好ましい実施の形態にお
いて、ヘッジホッグ突然変異体のふ入りライブラリを、核酸レベルで無作為配列
突然変異誘発により産生し、ふ入り遺伝子ライブラリによりコードする。例えば
、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素でライゲーションする
ことにより、潜在的なヘッジホッグ配列の変性セットは、個々のポリペプチドと
して、またはヘッジホッグ配列のセットを内部に含有するより大きい融合タンパ
ク質のセット(例えばファージ表示について)として発現可能である。
列である突然変異体の配列を分析することは、配列相同性に関して整合すること
ができる。特定の突然変異体の整合された配列からのアミノ酸の存在または不存
在は、実際のまたは人工的な、関連配列の選択された一致する長さに関連する。
およびエキソン3の一部のコードされた配列(例えば成熟タンパク質のN末端の
約221残基)の整合によって、一般式:
れぞれ、ヒト、マウス、ニワトリまたはゼブラフィッシュShhクローンの1つに
おける該位置で生じるアミノ酸でもよい、またはライブラリを拡大するため、そ
れぞれのXは、それらの位置のそれぞれにおいて天然に見られるアミノ酸につい
ての保存的置換であるアミノ酸残基の中から選択されてもよい。例えば、Xaa(1)
は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、TyrまたはTrpを示す;Xaa(2)は、Arg、His
、またはLysを示す;Xaa(3)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、SerまたはThrを示す
;Xaa(4)は、Gly、Ala、Leu、Ile、SerまたはThrを示す;Xaa(5)は、Lys、Arg、
His、AsnまたはGlnを示す;Xaa(6)は、Lys、ArgまたはHisを示す;Xaa(7)は、Se
r、Thr、Tyr、TrpまたはPheを示す;Xaa(8)は、Lys、ArgまたはHisを示す;Xaa(
9)は、Met、Cys、SerまたはThrを示す;Xaa(10)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、
SerまたはThrを示す;Xaa(11)は、Leu、Val、Met、ThrまたはSerを示す;Xaa(12
)His、Phe、Tyr、Ser、Thr、MetまたはCysを示す;Xaa(13)は、Gln、Asn、Glu、
またはAspを示す;Xaa(14)は、His、Phe、Tyr、Thr、Gln、Asn、GluまたはAspを
示す;Xaa(15)は、Gln、Asn、Glu、Asp、Thr、Ser、MetまたはCysを示す;Xaa(1
6)は、Ala、Gly、Cys、Leu、ValまたはMetを示す;Xaa(17)は、Arg、Lys、Met、
Ile、Asn、Asp、Glu、Gln、Ser、ThrまたはCysを示す;Xaa(18)は、Arg、Lys、M
et、またはIleを示す;Xaa(19)は、Ala、Gly、Cys、Asp、Glu、Gln、Asn、Ser、
ThrまたはMetを示す;Xaa(20)は、Ala、Gly、Cys、Asp、Asn、GluまたはGlnを示
す;Xaa(21)は、Arg、Lys、Met、Ile、Asn、Asp、GluまたはGlnを示す;Xaa(22)
は、Leu、Val、MetまたはIleを示す;Xaa(23)は、Phe、Tyr、Thr、HisまたはTrp
を示す;Xaa(24)は、Ile、Val、LeuまたはMetを示す;Xaa(25)は、Met、Cys、Il
e、Leu、Val、ThrまたはSerを示す;Xaa(26)は、Leu、Val、Met、ThrまたはSer
を示す。さらに広いライブラリにおいては、Xは任意のアミノ酸から選択されて
もよい。
ンのそれぞれの整合により、一般式:
X」はそれぞれ、野生型クローンの一つ中の対応する位置において生じるアミノ
酸でもよく、保存的置換であるアミノ酸残基を含んでもよく、それぞれのXは任
意のアミノ酸残基でもよい。例として実施の形態において、Xaa(1)は、Gly、Ala
、Val、Leu、Ile、Pro、PheまたはTyrを示す;Xaa(2)は、Gly、Ala、Val、Leuま
たはIleを示す;Xaa(3)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Lys、HisまたはArgを示
す;Xaa(4)は、Lys、ArgまたはHisを示す;Xaa(5)は、Phe、Trp、Tyrまたはアミ
ノ酸ギャップ(gap)を示す;Xaa(6)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ileまたはアミノ酸
ギャップを示す;Xaa(7)は、Asn、Gln、His、ArgまたはLysを示す;Xaa(8)は、G
ly、Ala、Val、Leu、Ile、SerまたはThrを示す;Xaa(9)は、Gly、Ala、Val、Leu
、Ile、SerまたはThrを示す;Xaa(10)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Serまたは
Thrを示す;Xaa(11)は、Ser、Thr、GlnまたはAsnを示す;Xaa(12)は、Met、Cys
、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、SerまたはThrを示す;Xaa(13)は、Gly、Ala、Val
、Leu、IleまたはProを示す;Xaa(14)は、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa(15)は
、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa(16)は、Gly
、Ala、Val、Leu、Ile、PheまたはTyrを示す;Xaa(17)は、Arg、HisまたはLysを
示す;Xaa(18)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、SerまたはThrを示す;Xaa(19)は
、ThrまたはSerを示す;Xaa(20)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、AsnまたはGlnを
示す;Xaa(21)は、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa(22)は、AspまたはGluを示す
;Xaa(23)は、SerまたはThrを示す;Xaa(24)は、Glu、Asp、GlnまたはAsnを示す
;Xaa(25)は、GluまたはAspを示す;Xaa(26)は、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa
(27)は、Gly、Ala、Val、LeuまたはIleを示す;Xaa(28)は、Gly、Ala、Val、Leu
、Ile、ThrまたはSerを示す;Xaa(29)は、Met、Cys、Gln、Asn、Arg、Lysまたは
Hisを示す;Xaa(30)は、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa(31)は、Trp、Phe、Tyr
、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa(32)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr
、TyrまたはPheを示す;Xaa(33)は、Gln、Asn、AspまたはGluを示す;Xaa(34)は
、AspまたはGluを示す;Xaa(35)は、Gly、Ala、Val、LeuまたはIleを示す;Xaa(
36)は、Arg、HisまたはLysを示す;Xaa(37)は、Asn、Gln、ThrまたはSerを示す
;Xaa(38)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、MetまたはCysを示す;Xaa(
39)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、ThrまたはSerを示す;Xaa(40)は、Arg、His
またはLysを示す;Xaa(41)は、Asn、Gln、Gly、Ala、Val、LeuまたはIleを示す
;Xaa(42)は、Gly、Ala、Val、LeuまたはIleを示す;Xaa(43)は、Gly、Ala、Val
、Leu、Ile、Ser、ThrまたはCysを示す;Xaa(44)は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile
、ThrまたはSerを示す;およびXaa(45)は、AspまたはGluを示す。
産生できる多くの方法がある。変性遺伝子配列の化学的合成を自動DNA合成装置
中で行うことができ、次に合成遺伝子を適切な発現ベクター中にライゲーション
する。遺伝子の変性セットの目的は、1つの混合物中で、潜在的なヘッジホッグ
配列の所望のセットをコードする全ての配列を提供することにある。変性オリゴ
ヌクレオチドの合成は、当該技術においてよく知られている(例えば、Narang,
SA(1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al.(1981) Recombinant DNA, Proc 3r
d Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier p
p273-289; Itakura et al.(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al
.(1984) Science 198:1056; Ike et al.(1983) Nucleic Acid Res. 11:477参照
)。そのような技術は、他のタンパク質の定方向進化(directed evolution)に使
用されてきた(例えば、Scott et al.(1990) Science 249:386-390; Roberts et
al.(1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al.(1990) Science 249:404-406; C
wirla et al.(1990) PNAS 87:6378-6382; 並びに米国特許第5,223,409号、同第5
,198,346号、および同第5,096,815号参照)。
ング、およびある特性を有する遺伝子産物についてのcDNAライブラリのスクリー
ニングについて、当該技術において様々の技術が知られている。そのような技術
は通常、ヘッジホッグ相同体の無作為配列突然変異誘発により産生される遺伝子
ライブラリの急速なスクリーニングに適合できるであろう。大きい遺伝子ライブ
ラリのスクリーニングに最も広く使用されている技術は、通常、遺伝子ライブラ
リを複製可能な発現ベクター中にクローニングし、生じたベクターのライブラリ
により適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子
をコードするベクターの相対的に容易な単離を促進する条件下で、無作為配列遺
伝子を発現させる、各工程を含む。以下に記載される説明のための分析はそれぞ
れ、無作為配列突然変異誘発技術により産生される多数の変性ヘッジホッグ配列
のスクリーニングに必要なように高処理量分析に基づいて分析できる。
(例えばライブラリのポリペプチドはすべてシグナル配列を含むが膜内外または
細胞質領域は含まない)、例えば肺間葉または上皮細胞のような肺細胞と共培養
できる真核細胞のトランスフェクションに使用する。無作為配列ライブラリを発
現させる細胞により分泌される機能性ヘッジホッグタンパク質は、隣接する肺細
胞に拡散し、増殖のような特定の生物学的応答を誘発する。増殖の検出のパター
ンは、勾配関数に類似し、肺細胞に関して増殖因子として活性のあるヘッジホッ
グ相同体を産生する細胞の単離を可能にする(通常は分泌の数回の反復後)。同
様に、ヘッジホッグ拮抗物質は、同様の方法で、機能性拮抗物質を産生する細胞
により培養培地に加えられる野生型ヘッジホッグの効果から隣接する細胞を保護
できる(例えば増殖を抑制する)ことによって分泌できる。
。他の真核細胞を、無作為配列ヘッジホッグ遺伝子ライブラリでトランスフェク
ションし、マイクロタイタープレートのウェルに適合できる細胞培養インサート
(例えばCollaborative Biomedical Products, Catalog #40446)中で培養する
。細胞培養インサートをウェル中に配置し、インサート中で細胞により分泌され
る組換えヘッジホッグ相同体を、インサートの有孔の底部を通って拡散させマイ
クロタイタープレートのウェル中で標的細胞に接触させる。ヘッジホッグタンパ
ク質の機能性形態が標的細胞中で例えば増殖などの測定可能な応答を産生するの
に十分な時間の後、インサートを除去し、標的細胞における突然変異体ヘッジホ
ッグタンパク質の効果を測定する。活性に対し陽性を示すウェルに対応するイン
サートからの細胞を分離し、数個のインサート上で再び培養し、この工程を活性
のあるクローンが同定されるまで繰り返す。
またはウィルス粒子表面上で表示し、特定の細胞またはウィルス粒子がこの遺伝
子産物によりヘッジホッグ結合成分(例えばパッチ物タンパク質または他のヘッ
ジホッグレセプター)と結合する能力を、「パニングアッセイ(panning assay)
」で検出する。そのようなパニング工程は、胚から培養された細胞上で行うこと
ができる。例えば、遺伝子ライブラリは、細菌細胞の表面膜タンパク質について
の遺伝子中にクローニングすることができ、生じた融合タンパク質をパニングに
より検出する(Ladner et al.,国際特許出願公開第88/06630号; Fuchs et al.(1
991) Bio/Technology 9:1370-1371; and Goward et al.(1992) TIBS 18:136-140
)。同様に、ヘッジホッグに結合する蛍光標識された分子を使用して、潜在的に
機能性のヘッジホッグ相同体を示すことができる。細胞を、蛍光顕微鏡下で視覚
的に調べ分離することができる、または、細胞の形態が差し支えなければ、蛍光
活性化細胞選別機により分離することができる。
タンパク質として発現させる。例えば、繊維状ファージ系において、外来性ペプ
チド配列を感染性ファージの表面上で発現させることができ、これにより二つの
重要な利益が与えられる。第一に、これらのファージは非常に高い濃度で親和性
マトリクスに適用することができるので、多数のファージを一度にスクリーニン
グすることができる。第二に、それぞれの感染性ファージは表面上で組換え遺伝
子産物を表示するので、特定のファージが低収率で親和性マトリクスから回収さ
れる場合、ファージをもう1ラウンドの感染により増幅することができる。ほぼ
等しい大腸菌繊維状ファージのM13、fd、およびf1の群は、ファージ表示ライブ
ラリにおいて最もよく使用され、ファージgIIIまたはgVIII被覆タンパク質のい
ずれかを使用してウィルス粒子の最終的なパッケージングを混乱させることなく
融合タンパク質を産生できる(Ladner et al.国際特許出願公開第90/02909号; G
arrard et al.,国際特許出願公開第92/09690号; Marks et al.(1992) J. Biol.
Chem. 267:16007-16010; Griffths et al.(1993) EMBO J 12:725-734; Clackson
et al.(1991) Nature 352:624-628; and Barbas et al.(1992) PNAS 89:4457-4
461)。
Catalog number 27-9400-01)は、ヘッジホッグ組換えライブラリの発現およびス
クリーニングに使用するために容易に変更することができる。例えば、RPASキッ
トのpCANTAB 5ファージミドは、ファージgIIIコートタンパク質をコードする遺
伝子を含有する。ヘッジホッグ組換え遺伝子ライブラリをgIIIシグナル配列に近
接するファージミド中にクローニングして、gIII融合タンパク質として発現させ
ることができる。ライゲーションの後、ファージミドを使用してコンピテント大
腸菌TGI細胞を形質転換することができる。その後形質転換された細胞をM13KO7
ヘルパーファージで感染させ、ファージミドおよび候補ヘッジホッグ遺伝子イン
サートを奪回する。生じた組換えファージは、特定の候補ヘッジホッグをコード
するファージミドDNAを含有し、対応する融合コートタンパク質の一つ以上の複
製を示す。ヘッジホッグレセプターを結合することができる、ファージにより表
示された候補ヘッジホッグタンパク質を、パニングにより選択し集積する。例え
ば、ファージライブラリをパッチ物タンパク質を発現する細胞に適用し、結合し
ていないファージを細胞から洗い流す。その後結合したファージを単離し、組換
えファージが野生型gIIIコートタンパク質の少なくとも一つの複製を発現する場
合は、大腸菌を感染させる能力を保持している。したがって、連続的な大腸菌の
再感染、およびパニングにより、ヘッジホッグ相同体が非常に豊富になり、作用
物質および拮抗物質を分化させるためにさらなる生物学的活性についてスクリー
ニングすることができる。
ク質の非常に大きいライブラリを産生する潜在性を有する。このサイズの無作為
配列ライブラリは、ファージ表示のような高処理量スクリーニング分析を使用し
ても技術的にスクリーニングが困難かもしれない。この問題を克服するために、
ランダムライブラリ中の非機能性タンパク質が非常に高い割合になるのを防止し
機能性タンパク質の頻度だけを高め、従って配列スペースの有用なサンプリング
の達成に必要とされる複雑性を減少する、回帰的集合突然変異誘発(REM)という
新しい技術が最近開発された。REMは、適切な選択またはスクリーニング方法が
使用される場合に、ライブラリ中で機能性突然変異体の頻度を高めるアルゴリズ
ムである(Arkin and Yourvan, 1992, PNAS USA 89:7811-7815; Yourvan et al.,
1992, Parallel Problem Solving from Nature, 2., In Maenner and Manderic
k, eds., Elsevir Publishing Co., Amsterdam, pp. 401-410; Delgrave et al.
, 1993, Protein Engineering 6(3):327-331)。
ドまたは非ペプチド因子のような、本発明のヘッジホッグポリペプチドとヘッジ
ホッグレセプターとの結合を破壊することができる擬似体を産生する。したがっ
て、上述のような突然変異誘発性技術もまた、例えば本発明のヘッジホッグポリ
ペプチドと他の細胞外マトリクス成分との結合に関する細胞間相互作用に関係す
るヘッジホッグタンパク質の決定因子を位置付けるのに有用である。説明のため
に、パッチ物のようなヘッジホッグレセプターの分子認識に関係する本発明のヘ
ッジホッグポリペプチドの臨界残基を決定し使用して、真正ヘッジホッグタンパ
ク質と前記成分との結合を競合的に抑制するヘッジホッグ由来偽ペプチドを産生
することができる。例えば、スキャンニング突然変異誘発を使用して他の細胞外
タンパク質の結合に関係する本発明のヘッジホッグタンパク質のそれぞれのアミ
ノ酸残基を位置付けることにより、相互作用を促進するヘッジホッグタンパク質
のそれらの残基を模倣する偽ペプチド化合物を産生できる。次にそのような擬似
体を使用して、ヘッジホッグタンパク質の正常な機能を妨げることができる。例
えば、そのような残基の加水分解不可能なペプチド類似物は、ベンゾジアゼピン
(例えば、Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R.Mars
hall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、アゼピン(例
えば、Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R.Marshall ed
., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、置換されたガマラク
タムリング(Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R.Marsha
ll ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)、ケト−メチレンペプ
チド擬態物(Ewensin et al.(1986) J Med Chem 29:295;およびEwenson et al.
in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Pept
ide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、β−ターンジペ
プチドコア(Nagai et al.(1985) Tetrahedron Lett 26:647;およびSato et al.
(1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231)、およびβ−アミノアルコール(Gor
don et al.(1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419;およびDann et al.(19
86) Biochem Biophys Res Commun 134:71)を使用して産生できる。
調節配列に機能できるように結合されたヘッジホッグポリペプチドをコードする
核酸を含有する発現ベクターを使用して産生できる。機能できるように結合され
たとは、ヌクレオチド配列を発現させるような様式でヌクレオチド配列が調節配
列に結合されることを意味する。調節配列は既知の技術であり、ヘッジホッグポ
リペプチドを直接発現するために選択される。したがって、転写調節配列という
用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロールエレメントを
含む。そのような調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)に記載されている
。例えば、機能できるように結合されるとDNA配列の発現をコントロールする配
列である、様々の発現コントロール配列のいずれも、これらのベクター中で使用
して、ヘッジホッグポリペプチドをコードするDNA配列を発現することができる
。そのような有用な発現コントロール配列には、例えば、モロニーマウス白血病
ウィルスのLTRのようなウィルス性LTR、SV40の初期および後期プロモーター、ア
デノウィルスまたはサイトメガロウィルスの即初期プロモーター、lac系、trp系
、TACまたはTRC系、T7 RNAポリメラーゼにより発現が行われるT7プロモーター、
λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質
に対するコントロール領域、3−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵
素に対するプロモーター、例えばPho5のような酸性ホスファターゼのプロモータ
ー、酵母α−交配因子のプロモーター、バキュロウィルス系の多角体プロモータ
ーおよび原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウィルスの遺伝子の発現をコ
ントロールすることが知られている他の配列、およびそれらの様々の組合せが含
まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および/または
発現されるのが所望であるタンパク質の種類などの因子に依存し得ることを理解
すべきである。さらに、ベクターのコピー数、該コピー数をコントロールする能
力および抗生物質標識のようなベクターによりコードされる他のタンパク質の発
現も考慮に入れなければならない。
子構成物はまた、遺伝子治療プロトコルの一部として使用することにより、ヘッ
ジホッグポリペプチドの作用または拮抗形態をコードする核酸を供給することが
できる。したがって、本発明の別の態様は、特に肺組織中でヘッジホッグポリペ
プチドの異所性発現を起こす細胞タイプ中において、インビボにおけるヘッジホ
ッグポリペプチドのトランスフェクションをするための発現ベクターを特徴とす
る。
インビボにおいて細胞に組換え遺伝子を効果的に供給できる任意の製剤または組
成物で投与してもよい。アプローチには、組換えレトロウィルス、アデノウィル
ス、アデノ関連ウィルス、およびI型単純ヘルペスウィルスを含むウィルスベク
ター、または組換え細菌あるいは真核プラスミド中へのヘッジホッグコード配列
の挿入が含まれる。ウィルスベクターは細胞を直接トランスフェクションする;
プラスミドDNAは、例えば、カチオン性リポソーム(リポフェクチン)または誘
導体(例えば、接合抗体)、ポリリシン接合体、グラマシジンS、人工ウィルス
エンベロープまたは他のそのような細胞間キャリア、並びに遺伝子構成物の直接
注入またはインビボで行われるCaPO4析出の補助により、供給することができる
。適切な標的細胞の形質導入は遺伝子治療における重要な最初の段階を示すので
、特定の遺伝子供給系の選択は、意図した標的の表現型および例えば局部的また
は全身的な投与の経路のような要因に依存することが認識されよう。さらに、イ
ンビボにおけるヘッジホッグ発現の形質導入のために提供される特定の遺伝子構
成物は、例えば以下に記載される半ビボの組織培養系において使用するためのよ
うな、インビトロにおける細胞の形質導入にも有用であることが認識されるであ
ろう。
グポリペプチドの特定の形態をコードする核酸、例えばcDNAを含有するウィルス
ベクターの使用によるものである。細胞をウィルスベクターで感染させることに
は、標的とされる細胞の大部分が核酸を受容できるという利点がある。さらに、
例えばウィルスベクター内に含まれるcDNAにより、ウィルスベクター内でコード
された分子は、ウィルスベクター核酸を吸収した細胞中において有効に発現され
る。
において外因性遺伝子を、特にヒトに移入するために選択される組換え遺伝子供
給系であると考えられている。これらのベクターは、遺伝子を細胞中に効率的に
供給し、移入された核酸は、宿主の染色体DNA中に安定して組み込まれる。レ
トロウィルスを使用するための主な必須条件は、特に野生型ウィルスが細胞個体
群中に拡散する可能性に関して、それらの使用の安全性を確保することにある。
複製欠陥レトロウィルスのみを産生する特殊細胞系統(「パッケージング細胞」
と称される)の開発により、遺伝子治療にレトロウィルスを使用することが多く
なり、欠陥レトロウィルスは遺伝子治療目的のための遺伝子移入に使用するため
に明確に特徴付けられている(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271参照)。した
がって、レトロウィルスコード配列の一部(gag、pol、env)がヘッジホッグポ
リペプチドをコードする核酸により置換されて、レトロウィルスが複製欠陥とな
った組換えレトロウィルスを構成することができる。次に、この複製欠陥レトロ
ウィルスを、標準技術によりヘルパーウィルスを使用することによって標的細胞
を感染させるのに使用できるウィルス粒子中にパッケージングする。組換えレト
ロウィルスを産生し、そのようなウィルスで細胞をインビトロまたはインビボで
感染させるプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,
F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-
9.14および他の標準実験室用マニュアルに見ることができる。適切なレトロウィ
ルスの例には、当業者によく知られているpLJ、pZIP、pWEおよびpEMが含まれる
。環境栄養性および両栄養性レトロウィルス系の両方の調製に適切なパッケージ
ングウィルス系統の例には、Crip、Cre、2およびAmが含まれる。インビトロおよ
び/またはインビボで肺細胞を含む多くの異なる種類の細胞中に様々な遺伝子を
導入するためにレトロウィルスが使用されてきた(例えば、Eglitis, et al. (1
985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-
6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al.
(1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-6
47; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et
al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国特許第4,868,116号; 米国特許第4
,980,286号; 国際特許出願公開第89/07136号; 国際特許出願公開第89/02468号;
国際特許出願公開第89/05345号; および国際特許出願公開第92/07573号参照)。
することにより、レトロウィルスのおよびその結果としてレトロウィルスに基づ
くベクターの感染スペクトルを制限できることが示されている(例えば、国際特
許出願公開第93/25234号および同第94/06920号参照)。例えば、レトロウィルス
ベクターの感染スペクトルを変化させる方法には:ウィルス性envタンパク質に
細胞表面抗原に特異的な抗体を結合させる(Roux et al. (1989) PNAS 86:9079-
9083; Julan et al. (1992) J.Gen Virol 73:3251-3255; and Goud et al. (198
3) Virology 163:251-254);またはウィルス性envタンパク質に細胞表面レセプ
ターリガンドを結合させる(Neda et al. (1991) J Biol Chem 266:14143-14146
)工程が含まれる。結合は、タンパク質または他の成分(例えば、envタンパク
質をアシアログリコプロテインに転換するためのラクトース)との化学的架橋の
形態でもよく、並びに融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体/env融合タンパク
質)の産生によってもよい。この技術は、感染をある組織の種類に制限するかま
たは方向付けるのに有用であるが、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに転
換させるためにも使用することができる。
ジホッグ遺伝子の発現をコントロールする組織または細胞特異的転写調節配列を
使用することによりさらに増すことができる。
由来ベクターを使用する。アデノウィルスのゲノムを操作して、関心のある遺伝
子産物をコードし発現するが、正常な溶菌ウィルスの生活周期における複製能力
に関して不活性にすることができる。例えば、Berkner et al. (1988) Bio Tech
niques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; and Rosenfeld
et al. (1992) Cell 68:143-155参照。アデノウィルス株Adタイプ5 dl324また
はアデノウィルスの他の株(例えば、Ad2、Ad3、Ad7等)に由来する適切なアデ
ノウィルスベクターが当業者によく知られている。組換えアデノウィルスは、あ
る環境において、肺細胞を含む様々な細胞の種類を感染させるために使用できる
という点で有益である(Rosenfeld et al.(1992) cited supra)。さらに、ウィル
ス粒子は、精製および濃度に対して比較的安定で耐性があり、上記のように、感
染性のスペクトルに影響を与えるように変化させることができる。さらに、導入
されたアデノウィルスDNA(およびその中に含まれる外来性DNA)は、宿主細胞の
ゲノム中に組み込まれないがエピソームのままであり、したがって、導入された
DNAが宿主ゲノム(例えば、レトロウィルスDNA)中に組み込まれる場合に挿入突
然変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題を避けることができる。さらに、
外来性DNAについてのアデノウィルスゲノムの環境収容力は、他の遺伝子供給ベ
クターに関して大きい(8キロベースまで)(Berkner et al. Cited supra; Haj
-Ahmand and Graham (1986) J.Virol. 57:267)。現在使用されており、したが
って本発明に好ましいほとんどの複製欠陥アデノウィルスベクターは、ウィルス
性E1およびE3遺伝子のすべてまたは一部を欠失しているが、アデノウィルス遺伝
子物質の約80%を保持している(例えば、Jones et al. (1979) Cell 16:683; B
erkner et al., supra; and Graham et al. in Methods in Molecular Biology,
E.J.Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol.7.pp.109-127参照)。挿
入されたヘッジホッグ遺伝子の発現は、例えば、E1Aプロモーター、主要後期プ
ロモーター(MLP)および関連リーダー配列、E3プロモーター、または外因的に加
えられたプロモーター配列の制御下にあることができる。
て動物の組織中でヘッジホッグタンパク質を発現させてもよい。遺伝子を移入さ
せるほとんどのウィルスによらない方法は、高分子の吸収および細胞内輸送のた
めに哺乳類細胞により使用される正常な機構によるものである。好ましい実施の
形態において、本発明のウィルスによらない遺伝子供給系は、標的細胞によるヘ
ッジホッグポリペプチド遺伝子の取込みのための飲食作用経路による。この種の
遺伝子供給系の例には、リポソーム由来系、ポリリシン接合体、および人工ウィ
ルス性エンベロープが含まれる。
給系は、それぞれが当該技術においてよく知られている多くの方法のいずれによ
っても患者中に導入できる。例えば、遺伝子供給系の薬剤は、例えば静脈注射に
より全身に導入でき、遺伝子供給媒体、レセプター遺伝子の発現をコントロール
する転写調節配列による細胞型または組織型発現、またはそれらの組合せにより
提供されるトランスフェクションの特異性から、標的細胞中のタンパク質の特異
的形質導入が主として起こる。他の実施の形態において、組換え遺伝子の初期供
給は、動物中への導入について完全に限局化されており、より制限されている。
例えば、遺伝子供給媒体は、カテーテルにより(米国特許第5,328,470号参照)
または定位挿入により(例えばChen et al.(1994) PNAS 91:3054-3057)により
導入できる。ヘッジホッグ発現構成物は、例えばDev et al.((1994) Cancer Tre
at Rev 20:105-115)により記載される技術を使用するエレクトロポレーションに
より、遺伝子治療構成物中で皮膚細胞へ供給することができる。
成ってもよい、または遺伝子供給媒体が内部に埋め込まれている緩効性基質を含
んでもよい。あるいは、完全な遺伝子供給系が、例えばレトロウイルスベクター
のような組換え細胞から無傷で産生できる場合、薬剤は遺伝子供給系を産生する
一つ以上の細胞を含んでもよい。
ゲノムDNAによる相同組換えにより、内因性遺伝子の転写調節配列を変化させる
「遺伝子活性化」構成物でもよい。例えば、遺伝子活性化構成物は、ヘッジホッ
グ遺伝子の内因性プロモーターを、異種プロモーター、例えば、ヘッジホッグ遺
伝子の構成性発現を起こすまたは遺伝子の正常な発現パターンとは異なる条件下
で遺伝子の誘発性発現を起こす異種プロモーターに置換することができる。パッ
チ物シグナリング経路における他の遺伝子を同様に標的とすることができる。遺
伝子活性化構成物の様々な異なる形態も利用できる。例えば、トランスカリオテ
ィックセラピーズ社(Transkaryotic Therapies, Inc)の国際特許出願公開第93/0
9222号、同第95/31560号、同第96/29411号、同第95/31560号および同第94/12650
号参照。
チド配列は、(1)組換えを指示する内因性ヘッジホッグ遺伝子のいくつかの部分
(エキソン配列、イントロン配列、プロモーター配列等)からのDNAおよび(2)遺
伝子活性化構成物の組換えの際にゲノムヘッジホッグ遺伝子のコード配列に機能
できるように結合される異種転写調節配列、から成ってもよい。ヘッジホッグ産
生細胞の培養組織の産生に使用するために、該構成物はさらに、細胞中のノック
アウト(knockout)構成物の存在を検出するレポーター遺伝子を含んでもよい。
機能できるように結合して異種調節配列を提供するような位置で細胞のゲノムDN
Aと統合する。そのような挿入は、同種組換え、すなわちゲノムDNAにハイブリッ
ド形成する内因性ヘッジホッグ遺伝子配列と相同であり、ゲノム配列と再結合し
て該構成物をゲノムDNAの対応する位置に組み込む活性化構成物の組換え領域に
より起こる。
側配列を含む、ゲノム遺伝子配列と実質的に同一のまたは実質的に相補的な配列
を有する遺伝子活性化構成物の断片(すなわち一部)を称し、ゲノム配列と標的
トランスジーン構成物との間の同種組換えを促進できる。
の間の同種組換え後に内因性染色***置に組み込まれる活性化構成物の一部を称
する。
たは誘発性プロモーター)、エンハンサー、負の調節要素、遺伝子座コントロー
ル領域、転写因子結合部位、またはそれらの組合せを含む、様々な要素の1つ以
上を含んでもよい。インビボで標的遺伝子の発現をコントロールするために使用
できるプロモーター/エンハンサーには、サイトメガロウイルス(CMV)プロモー
ター/エンハンサー(Karasuyama et al., 1989, J. Exp. Med. 169:13)、ヒト
β−アクチンプロモーター(Gunning et al. (1987) PNAS 84:4831-4835)、マ
ウス乳癌ウイルス長端反復配列(MMTV LTR)中に存在するグルココルチコイド誘発
性プロモーター(Klessig et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4:1354-1362)、モ
ロニーマウス白血病ウイルス(MuLV LTR)の長端反復配列(Weiss et al. (1985)
RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ne
w York)、SV40初期または後期領域プロモーター(Bernoist et al. (1981) Nat
ure 290:304-310; Templeton et al. (1984) Mol. Cell Biol., 4:817; and Spr
ague et al. (1983) J.Virol., 45:773)、ニワトリ肉腫ウイルス(RSV)の3’長
端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell, 22:787-
797)、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモーター/エンハンサ
ー(Wagner et al. (1981) PNAS 82:3567-71)、および単純ヘルペスウイルスLA
Tプロモーター(Wolfe et al. (1992) Nature Genetics, 1:379-384)が含まれ
るがこれに限定されない。
トShh遺伝子の5’側領域の部分を増幅し、以下の断片を産生する。
まれ、AsuIIおよびClaI制限部位が接する。プライマー2は、プライマー1中に
存在する3’非コード領域に隣接する5’非コード領域の一部を含む。ヘッジホッ
グ遺伝子配列には、XhoIIおよびBamHI制限部位が接する。精製されたアンプリマ
ー(amplimer)を、適切なそれぞれの酵素で切断する。
MVプロモーター配列のちょうど3’側で開裂するAsuIIで切断する。プライマー1
のAsuII/ClaI断片を、pcDNAベクターのAsuII開裂部位にライゲーションする。Cl
aI/AsuIIライゲーションにより、適切に挿入されたプライマー1の3’端でAsuII
部位が破壊される。
部位にライゲーションする。上述のように、BamHI/XhoIIライゲーションにより
、適切に挿入されたプライマー2の5’端でBamHI部位が破壊される。
のサイズを測定する。プライマー1およびプライマー2配列の両方が適切に挿入
されたコロニーをさらに増幅し、AsuIIおよびBamHIで切断し、以下の遺伝子活性
化構成物を産生する。
遺伝子がコード配列の前にCMVプロモーターを挿入することを可能にする組換え
領域を提供する。他の異種プロモーター(または転写調節配列)を、同様の方法
によりゲノムヘッジホッグ遺伝子に挿入してもよい。
ール要素を欠失して例えば発現を活性化する、または正のコントロール要素を除
去して例えば標的遺伝子の発現を抑制するだけである。
。そのような組成物は、例えば、パッチ物に結合するまたはそのシグナル形質導
入活性を変化させる化合物、パッチ物シグナル経路に関係するタンパク質(例え
ば細胞内)の結合および/または酵素活性を変化させる化合物、およびヘッジホ
ッグタンパク質、パッチ物タンパク質またはパッチ物の細胞内シグナル形質導入
経路に関係するタンパク質の発現のレベルを変化させる化合物により産生できる
。
ッグおよび/またはパッチ物タンパク質の正常な細胞機能、特に増殖の病因およ
び/または様々の肺細胞の分化および肺組織の維持における役割の作用物質また
は拮抗物質である、小さい有機分子のような薬についてのスクリーニングに使用
できる分析系の産生が容易になる。ある実施の形態において、分析により、ヘッ
ジホッグポリペプチドとパッチ物のようなヘッジホッグレセプターとの間の結合
を変化させる化合物の能力が評価される。他の実施の形態において、分析は、パ
ッチ物タンパク質のシグナル形質導入活性を変化させるテスト化合物の能力を評
価するだけである。この方法で、活性において増殖性であるおよび反増殖性であ
る、様々のヘッジホッグおよび/またはptc治療物を同定できる。様々の分析フ
ォーマットが十分であり、本発明の明細書を考慮して、当業者により理解される
であろう。
プログラムにおいて、所定の時間に調べられる化合物の数を最大にするために高
処理量分析が所望である。精製されたまたは半精製されたタンパク質に由来する
ような、無細胞系において行われる分析は、しばしば「一次」スクリーニングと
称され、実施されて、テスト化合物により媒介される分子標的における変化の急
速な発達および相対的に容易な検出を可能にする。さらに、テスト化合物の細胞
毒性および/または生物学的利用性の効果は通常インビトロ系において無視する
ことができ、その代わり分析は、レセプタータンパク質との結合親和性の変化に
おいて明らかである、分子標的ヘの薬の効果に主として集中される。
ある化合物を、通常ヘッジホッグタンパク質を結合させることができる条件下で
、ヘッジホッグレセプタータンパク質(例えば細胞発現パッチ物レセプター)お
よびヘッジホッグタンパク質を含む混合物と接触させる。次に該混合物に、テス
ト化合物を含む組成物を加える。レセプター/ヘッジホッグ複合体の検出および
定量により、レセプタータンパク質とヘッジホッグポリペプチドとの間の複合体
形成を抑制する(または強化する)テスト化合物の効力を測定する方法が提供さ
れる。様々の濃度のテスト化合物を使用して得られるデータから容量−応答曲線
を作成することにより化合物の効力を評価できる。さらに、対照分析を行って、
比較のための基線を提供することもできる。対照分析において、単離されたおよ
び精製されたヘッジホッグポリペプチドをレセプタータンパク質に加え、レセプ
ター/ヘッジホッグ複合体の形成をテスト化合物の非存在下で定量する。
ed)との結合を破壊するものである。
培養液中のある肺細胞によりテストすることにより評価することができる。
ポリペプチドは、パッチ物タンパク質から産生できる。したがって、スクリーニ
ング分析の例には、例えばヒトパッチ物遺伝子(GenBank U43148)または他の脊椎
動物供給源(ニワトリのパッチ物についてGenBankアクセス番号U40074およびマ
ウスのパッチ物についてU46155参照)、並びにショウジョウバエ(GenBankアクセ
ス番号M28999)または他の無脊椎動物供給源から得ることができるパッチ物タン
パク質のすべてまたは適切な部分が含まれる。パッチ物タンパク質は、スクリー
ニング分析において、全タンパク質(好ましくは細胞の表面で発現される)、あ
るいは例えば実質的な細胞該領域(例えばヘッジホッグ依存性シグナル形質導入
の潜在的な拮抗物質でもある、ヒトパッチ物タンパク質のAsn120-Ser438および
/またはArg770-Trp1027残基に対応する)の一つまたは両方のようなヘッジホッ
グポリペプチドに結合する全長タンパク質の断片として、提供することができる
。例えば、パッチ物タンパク質は、例えば細胞該領域の一つの製剤または非構成
的リンカーにより共有結合される細胞該領域の両方の製剤として、可溶性形態で
提供できる(例えば、Huston et al.(1988) PNAS 85:4879;および米国特許第5,0
91,513号参照)。他の実施の形態において、タンパク質は、リポソーム製剤の一
部として提供できるまたは細胞の表面で発現できる。パッチ物タンパク質は、例
えば異種細胞において異所的に発現される組換え遺伝子に由来してもよい。例え
ば、タンパク質を、標準組換えDNA技術により、卵母細胞、哺乳類細胞(例えばC
OS、CHO、3T3等)、または酵母細胞上で発現させてもよい。これらの組換え細胞
は、レセプター結合、シグナル形質導入または遺伝子発現分析に使用できる。Ma
rigo et al.(1996) Development 122:1225-1233には、ツメガエル卵母細胞中で
異所的に発現される雛鳥(chick)パッチ物タンパク質へのヒトヘッジホッグの結
合分析が示される。Marigo et al.の分析系は、本発明の薬スクリーニング分析
に適合できる。該参考文献に記載されるように、Shhは、選択的な、飽和できる
、量依存性の方法でパッチ物タンパク質に結合し、したがってパッチ物はShhに
対するレセプターであることが示される。
様々の技術により検出できる。例えば、複合体の形成の変化は、免疫学的検定に
よりまたはクロマトグラフィー検出により、例えば、放射性同位元素標識された
、蛍光標識された、または酵素標識されたヘッジホッグポリペプチドのような検
出可能に標識されたタンパク質を使用して定量できる。
ペプチドを固定して、タンパク質の一つの複合されていない形態からのレセプタ
ー/ヘッジホッグ複合体の分離を容易にし、並びに分析の自動化に対応すること
が所望である。ある実施の形態において、タンパク質をマトリクスに結合させる
領域を加える融合タンパク質を提供できる。例えば、グルタチオン−S−トラン
スフェラーゼ/レセプター(GST/レセプター)融合タンパク質を、グルタチオンセ
ファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン由来マ
イクロタイタープレート上に結合し、その後例えば35S標識されたヘッジホッグ
ポリペプチドのようなヘッジホッグポリペプチドとテスト化合物とを結合させ、
わずかにストリンジェントな条件が所望であるが、例えば塩およびpHについて生
理的な条件のような、複合体形成に資する条件下でインキュベートしてもよい。
インキュベーション後、ビーズを洗浄して結合していないヘッジホッグポリペプ
チドを除去し、マトリクスビーズ結合の放射性同位元素標識を直接(例えばシン
チラント(scintillant)中に配置されたビーズ)、またはレセプター/ヘッジホ
ッグ複合体を解離した後上澄中で測定する。あるいは、複合体をビーズから解離
し、SDS-PAGEゲルにより分離し、ビーズ分画中で見られるヘッジホッグポリペプ
チドのレベルを標準電気泳動技術を使用してゲルから定量してもよい。
にも利用できる。例えば、ヘッジホッグレセプタータンパク質の可溶性部分は、
ビオチンとストレプタビジン(streptavidin)との結合を利用して固定することが
できる。例えば、ビオチン化(biotinylated)レセプター分子を、当該分野におい
てよく知られる技術(例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockfold,
IL)を使用してビオチン−NHS(N−ヒドロキシ−スクシミド)から調製し、スト
レプタビジン被覆された96穴プレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定でき
る。あるいは、ヘッジホッグレセプターと反応性であるがヘッジホッグ結合を妨
げない抗体をプレートのウェルに誘導し、抗体結合によりウェル中にレセプター
を捕捉する。上述のように、ヘッジホッグポリペプチドおよびテスト化合物の製
剤をプレートのレセプターが存在するウェル中でインキュベートし、ウェル中に
捕捉されたレセプター/ヘッジホッグ複合体を定量できる。そのような複合体を
検出する方法の例には、GST−固定された複合体について上述されたものに加え
て、ヘッジホッグポリペプチドと反応性の、またはレセプタータンパク質と反応
性のおよびヘッジホッグポリペプチドとの結合と競合する抗体を使用する複合体
の免疫検出;並びにヘッジホッグポリペプチドと関連する酵素活性の検出に依存
する酵素結合分析が含まれる。後者の例において、酵素を化学的に結合しまたは
ヘッジホッグポリペプチドとの融合タンパク質として提供してもよい。説明のた
めに、ヘッジホッグポリペプチドを化学的に架橋するまたは遺伝的にアルカリ性
ホスファターゼと融合し、複合体中に捕捉されたヘッジホッグポリペプチドの量
を、例えばパラニトロフェニルホスフェートのような酵素の色素基質により評価
してもよい。同様に、ヘッジホッグポリペプチドおよびグルタチオン−S−トラ
ンスフェラーゼを含む融合タンパク質を提供し、1−クロロ−2,4−ジニトロベン
ゼンを使用してGST活性を検出することにより複合体形成を定量する(Habig et a
l(1974) J Biol Chem 249:7130)。
方法について、ここに記載される抗ヘッジホッグ抗体のような、タンパク質に対
する抗体を使用してもよい。あるいは、複合体中で検出されるタンパク質は、ヘ
ッジホッグポリペプチドまたはヘッジホッグレセプター配列に加えて、抗体が容
易に入手できる(例えば市販の供給源から)第二のポリペプチドを含む融合タン
パク質の形態で「エピトープ標識」されてもよい。例えば、上述されるGST融合
タンパク質は、GST成分に対する抗体を使用して結合の定量に使用してもよい。
他の有用なエピトープ標識には、c-mycからの10残基配列を含むmyc−エピトープ
(例えばEllison et al.(1991) J Biol Chem 266:21150-21157参照)、並びにpF
LAGシステム(International Biotechnologies, Inc.)またはpEZZ−タンパク質A
システム(Pharamacia, NJ)が含まれる。
可溶性形態で提供できない場合、リポソーム小胞を使用してレセプターの操作可
能で単離可能な供給源を提供してもよい。例えば、パッチ物タンパク質の真正お
よび組換え形態を、人工脂質小胞中で(例えばホスファチジルコリンリポソーム
)または細胞膜由来小胞中で再構成してもよい(例えばBear et al.(1992) Cell
68:809-818; Newton et al.(1983) Biochemistry 22:6110-6117; and Reber et
al.(1987) J Biol Chem 262:11369-11374参照)。
ンパク質の容易に入手できる供給源によって、小分子作用物質/拮抗物質等を同
定するための細胞に基づく分析を生ずることが容易になる。組換えライブラリを
スクリーニングするための上述される細胞に基づく分析と同様に、例えばヘッジ
ホッグ誘発に感受性であるパッチ物発現細胞または他の肺由来細胞のような、ヘ
ッジホッグ誘発に感受性である細胞をヘッジホッグタンパク質および関心のある
テスト物質と接触させ、テスト物質の存在および非存在下で標的細胞により細胞
への単一の結合からヘッジホッグ誘発応答における調節までについて分析を行っ
てもよい。無細胞分析と同様に、ヘッジホッグ活性に統計的に重大な変化(抑制
または強化)を産生する物質を同定できる。
はリポソーム製剤中でパッチ物および平滑物タンパク質の結合を破壊する物質が
示される。
されて異所的にパッチ物を発現する細胞を、薬スクリーニング分析に使用しても
よい。例として、例えばツメガエル卵母細胞、COS細胞または酵母細胞などの、
低レベルのパッチ物タンパク質を発現するまたはパッチ物タンパク質を発現しな
い細胞を、標準技術を使用して遺伝的に修飾することにより異所的にパッチ物タ
ンパク質を発現させることができる(Marigo et al., supra参照)。
ー結合分析に使用し、ヘッジホッグ結合の作用物質または拮抗物質を同定するこ
とができる。結合分析は、全細胞を使用して行うことができる。さらに、本発明
の組換え細胞を処理して、ヘッジホッグ依存性シグナル経路に関連するタンパク
質をコードする他の異種遺伝子を含ませることができる。例えば、一つ以上の平
滑物、costal-2および/または融合物の遺伝子産物を反応細胞中でパッチ物と共
発現させ、ヘッジホッグシグナル形質導入カスケードの機能的再構成に感受性の
ものを分析することができる。
してもよい。真正および組換え起源からの洗浄抽出物から精製されたパッチ物タ
ンパク質を、人工脂質小胞中で(例えばホスファチジルコリンリポソーム)、ま
たは細胞膜由来小胞中で再構成してもよい(例えば、Bear et al.(1992) Cell 6
8:809-818; Newton et al.(1983) Biochemistry 22:6110-6117; and Reber et a
l.(1987) J Biol Chem 262:11369-11374参照)。生じたリポソームの層状構造お
よびサイズを、電子顕微鏡検査により特徴付けることができる。再構成された膜
中のパッチ物タンパク質の外的配位は、例えば免疫電子顕微鏡検査により示すこ
とができる。パッチ物を含有するリポソームおよび候補物質の存在下で該タンパ
ク質を有しないリポソームのヘッジホッグタンパク質結合活性を比較して、ヘッ
ジホッグ−パッチ物相互作用の潜在的なモジュレーターを同定することができる
。
製された供給源として(天然または組換え起源の)、またはタンパク質を発現し
標的細胞と共培養される細胞/組織の形態で、提供することができる。単一の結
合が(誘発よりも)分析において示されるヘッジホッグ活性である、無細胞分析
と同様に、タンパク質を、例えば蛍光、酵素または放射性同位元素のような上述
の技術のいずれかにより標識してもよく、あるいは免疫学的検定により検出して
もよい。
性のモジュレーター、すなわち作用物質または拮抗物質を同定することができる
。テスト物質と接触されたパッチ物発現細胞において、第二メッセンジャーまた
は遺伝子発現における変化のような、細胞内シグナルにおける変化を検出するこ
とにより、パッチ物シグナリングに対する候補作用物質および拮抗物質を同定す
ることができる。
セリン/トレオニンキナーゼ融合物(fu)およびcostal-2、平滑物および融合物の
サプレッサーの遺伝子産物を含む、パッチ物により媒介されるシグナル形質導入
に関係する。
化および抑制を含むカスケードを推進し、その最終的な結果は、例えば遺伝子の
転写または翻訳における検出可能な変化である。パッチ物シグナリングの潜在的
な転写標的は、パッチ物自身(Hidalgo and Ingham, 1990 Development 110, 291
-301; Marigo et al.,1996)およびショウジョウバエキュビタスインターラプタ
ス遺伝子の脊椎動物相同体であるGLI遺伝子(Hui et al.(1994) Dev Biol 162:40
2-413)である。パッチ物遺伝子発現は、Shhに反応性の肢節芽および神経板の細
胞中で誘発されるようである(Marigo et al.(1996) PNAS; Marigo et al.(1996)
Development 122:1225-1233)。GLI遺伝子は、亜鉛フィンガーDNA結合領域を有
する推定転写因子をコードする(Orenic et al.(1990) Genes & Dev 4:1053-1067
; Kinzler et al.(1990) Mol Cell Biol 10:634-642)。GLI遺伝子の転写は、肢
節芽中でヘッジホッグに応じてアップレギュレートされることが報告されている
のに対し、GLI3遺伝子の転写は、ヘッジホッグの誘導に応じてダウンレギュレー
トされる(Marigo et al.(1996) Development 122:1225-1233)。パッチ物シグナ
リングに応じてこれらの遺伝子をアップまたはダウンレギュレートする原因であ
る標的遺伝子から、例えばパッチ物またはGLI遺伝子から転写調節配列を選択し
、そのようなプロモーターをレセプター遺伝子に機能できるように結合すること
により、特定のテスト化合物がパッチ物シグナリング経路を変化させる能力に感
受性である転写に基づく分析を導くことができる。したがって、レセプター遺伝
子の発現により、分化/休止のptc誘発の作用物質または拮抗物質として作用す
る化合物の開発に有用なスクリーニングツールが提供される。
ントの上述されるカスケードの最終段階を測定する。したがって、分析の一つの
実施の形態を行う場合、レポーター遺伝子構成物を標的細胞中に挿入し、ptcシ
グナリングに依存する検出シグナルを産生する。標的遺伝子の転写調節配列中に
存在するptcシグナリングに応じる潜在的な調節要素を同定するために、標準的
技術を使用して標的遺伝子のゲノムクローンの枝分れ欠失を構成することができ
る。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.
(eds.) Greene Publishing Associates,(1989); 米国特許第5,266,488号; Sato
et al.(1995) J Biol Chem 270:10314-10322; and Kube et al.(1995) Cytokine
7:1-7参照。遺伝子の5’−側領域からのDNA断片の枝分れ群を、ルシフェラーゼ
遺伝子のようなレポーター遺伝子の上流に配置し、パッチ物発現細胞中でレポー
ター遺伝子発現を指示する能力について分析する。レポーター遺伝子構成物によ
り一時的にトランスフェクションされた宿主細胞を、ヘッジホッグの存在および
非存在下でレポーター遺伝子の発現の誘発について示し、パッチ物依存性シグナ
リングに応答する調節配列を測定することができる。
入し、ヘッジホッグタンパク質による誘発によって産生される第二メッセンジャ
ーに依存する検出シグナルを産生する。通常、レポーター遺伝子構成物には、ヘ
ッジホッグ依存性検出シグナルを提供するレポーター遺伝子の発現レベルを有す
る、ヘッジホッグ活性に反応する一つ以上の転写調節要素と機能できるように結
合しているレポーター遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子からの転写の量は、
適切であると当業者に知られる任意の方法を使用して測定してもよい。例えば、
レポーター遺伝子からのmRNA発現を、RNAse保護またはRNAに基づくPCRを使用し
て検出し、あるいはレポーター遺伝子のタンパク質産物を、特有な染色または固
有の活性により同定してもよい。次にレポーター遺伝子からの発現の量を、テス
ト化合物(またはヘッジホッグ)の非存在下における同じ細胞中の発現の量と比
較するまたは標的レポータータンパク質を有しない実質的に同一の細胞中におけ
る転写の量と比較する。転写の量における統計的なまたはそうではなく有意の相
違により、テスト化合物はある様式においてパッチ物タンパク質のシグナル形質
導入を変化させる、例えばテスト化合物が潜在的なptc治療物であることが示さ
れる。
ーの遺伝子産物は、該産物に関係する固有の活性により検出される。例えば、レ
ポーター遺伝子は、酵素活性により色、蛍光、または発光に基づく検出シグナル
を生じる遺伝子産物をコードし得る。他の好ましい実施の形態において、レポー
ターまたはマーカー遺伝子は、選択的な成長利点を提供する、例えば、レポータ
ー遺伝子は、細胞生存度を高め、細胞栄養要求量を軽減し、および/または薬に
対する耐性を提供する。
子は、所望の転写調節配列を含むまたは他の所望の特性を示す遺伝子との融合遺
伝子の形態の構成物中に含まれてもよい。レセプター遺伝子の例には、CAT(ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(Alton and Vapnek(1979), N
ature 282: 864-869)ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼのような他
の酵素検出系;ホタルルシフェラーゼ(deWet et al.(1987), Mol. Cell. Biol.
7:725-737);細菌性ルシフェラーゼ(Engebrecht and Silverman(1984), PNAS 1:
4154-4158; Baldwin et al.(1984), Biochemistry 23: 3663-3667);アルカリ
性ホスファターゼ(Toh et al.(1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-238, Hall et
al.(1983) J. Mol. Appl. Gen. 2:101);ヒト胎盤分泌されたアルカリ性ホスフ
ァターゼ(Cullen and Malim(1992) Methods in Enzymol. 216:362-368)が含まれ
るがこれに限定されない。
ー、エンハンサー、およびレプレッサーおよびアクチベーター結合部位が含まれ
るがこれに限定されない。適切な転写調節要素は、パッチ物形質導入経路の修飾
後に発現が誘発される遺伝子の転写調節領域に由来してもよい。転写コントロー
ル要素が由来する好ましい遺伝子の特性には、停止細胞中の低いまたは検出でき
ない発現、細胞外シミュレーションの数分以内の転写レベルにおける急速な誘発
、一過性のおよび新しいタンパク質合成と独立した誘発、新しいタンパク質合成
を必要とする転写のその後の停止、および短い半減期を有するこれらの遺伝子か
ら転写されたmRNAが含まれるがこれに限定されない。
ウムの動員のような検出工程において直接測定し、リン脂質代謝またはアデニル
酸シクラーゼ活性を定量する、例えばリン脂質加水分解IP3、DAGまたはcAMPを測
定する。例えば、最近の研究により、タンパク質キナーゼA(PKA)はヘッジホッグ
/パッチ物シグナリングの可能な成分であることが示された(Hammerschmidt et
al.(1996) Genes & Dev 10:647)。高いPKA活性は、これらの系においてヘッジホ
ッグシグナリングを弱めることが示された。PKAが直接下流に作用するのかまた
はヘッジホッグシグナリングと同時に作用するのかは明らかでないが、ヘッジホ
ッグシグナリングはPKA活性の抑制により起こり得る。したがって、PKA活性の検
出により、即時分析についての潜在的な読出しが提供される。
び有機化合物を含む、様々のPKA抑制因子が当該技術において知られている。例
えば、ptc治療物は、一般式:
るように、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル(例え
ばカルボキシル、エステル、ホルメート、またはケトン)、チオカルボニル(例
えばチオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート)、アミノ、アシル
アミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、スルフェート、スルホネート、スル
ホンアミド、−(CH2)m−R8、−(CH2)m−OH、−(CH2)m−O−低級アルキル、−(CH2 )m−O−低級アルケニル、−(CH2)n−O−(CH2)m− R8、−(CH2)m−SH、−(CH2)m −S−低級アルキル、−(CH2)m−S−低級アルケニル、−(CH2)n−S−(CH2)m−R8
を示す、または R1およびR2は、Nとともに複素環(置換されたまたは置換されていない)を形
成し、 R3は、存在しないかまたは低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、
カルボニル(例えばカルボキシル、エステル、ホルメート、またはケトン)、チ
オカルボニル(例えばチオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート)
、アミノ、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、スルフェート、ス
ルホネート、スルホンアミド、−(CH2)m−R8、−(CH2)m−OH、−(CH2)m−O−低
級アルキル、−(CH2)m−O−低級アルケニル、−(CH2)n−O−(CH2)m− R8、−(CH2 )m−SH、−(CH2)m−S−低級アルキル、−(CH2)m−S−低級アルケニル、−(CH2)n −S−(CH2)m−R8のようなイソキノリン環への一つ以上の置換基を示し、 R8は、置換されたまたは置換されていないアリール、アラルキル、シクロアル
キル、シクロアルケニル、または複素環を示し、 nおよびmは、それぞれの存在について独立して、0または1から6までの範囲の
整数である。
ンアミド(H-89; Calbiochem Cat. No. 371963)である。
m Cat. No. 371955)である。
明の方法は、例えば8-ブロモ-cAMPまたはジブチリル-cAMP
ができる。
ソフォームα;例えば、Calbiochem Cat. No. 539488, and Wen et al.(1995) J
Biol Chem 270:2041参照)。
標準脂質抽出技術を使用して、イノシトール脂質を抽出し分析できる。3つのイ
ノシトール脂質(IP1、IP2、IP3)のすべての水溶性の誘導体もまた、放射性同位
元素標識技術またはHPLCを使用して定量できる。
グ刺激またはその欠失に対する応答かもしれない。反応細胞中のカルシウム流量
は、標準技術を使用して測定できる。適切なカルシウム指示薬、蛍光、生物発光
、金属、またはCa++感受性マイクロ電極の選択は、細胞の種類および研究下のイ
ベントの大きさおよび時定数に依存する(Borle(1990) Environ Health Perspect
84:45-56)。Ca++検出の方法の例として、標準方法を使用して、細胞にCa++感受
性蛍光色素fura-2またはindo-1を充填し、蛍光光度計を使用してCa++における任
意の変化を測定する。
グが所望かもしれない。例として、セリン/トレオニンキナーゼをコードするシ
ョウジョウバエ遺伝子融合物(fu)は、ヘッジホッグシグナリングにおける潜在的
な下流標的として同定された(Preat et al., 1990 Nature 347, 87-89; Therond
et al. 1993, Mech. Dev. 44. 65-80)。化合物がセリン/トレオニンキナーゼ
活性化を変化させる能力は、リン酸化セリンまたはトレオニン残基に対する抗体
を使用するコロニー免疫ブロット法を使用してスクリーニングできる(Lyons and
Nelson (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7426-7430)。例えば、市販さ
れているそれらの残基のリン酸化における増加を測定するホスホセリンおよびホ
スホトレオニン特異的抗体などの、そのような分析を行うための試薬は市販され
ている。
路に関係するタンパク質の発現を抑制するアンチセンス分子である。説明のため
に、融合物、costal-2、平滑物および/またはGli遺伝子のような、パッチ物シ
グナルに関係するタンパク質の発現を抑制することにより、パッチ物シグナル経
路が細胞の増殖を抑制する能力が変化される、例えば、強化されるまたは抑制さ
れる。
ッグタンパク質、パッチ物、またはパッチ物媒介シグナル形質導入に関係するタ
ンパク質をコードする細胞性mRNAおよび/またはゲノムDNAと特異的にハイブリ
ッド形成する(例えば結合する)、オリゴヌクレオチドプローブまたはその誘導
体の投与またはインサイチュでの産生を称する。ハイブリダイゼーションは、例
えば転写および/または翻訳を抑制することにより前記タンパク質の発現を抑制
する。結合は、通常の塩基対相補性によるか、または例えばDNA二重鎖への結合
の場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用によってもよい。通常
、「アンチセンス」治療物とは、当該技術において通常使用される技術の範囲を
称し、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存する任意の治療物を含んで
もよい。
mRNAの少なくとも独特の一部に相補的であるRNAを産生する発現プラスミドとし
て供給できる。あるいは、アンチセンス構成物は、半ビボで産生され、細胞内に
導入されると標的遺伝子のmRNAおよび/またはゲノム配列とハイブリッド形成す
ることにより発現を抑制するオリゴヌクレオチドプローブである。そのようなオ
リゴヌクレオチドプローブは好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌ
クレアーゼおよび/またはエンドヌクレアーゼに耐性であり、したがってインビ
トロで安定である修飾されたオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドとして使用するための核酸分子の例は、DNAのホスホルアミデート(ph
osphoramidate)、ホスホチオエート(phosphothioate)およびメチルホスホネート
類似体である(米国特許第5,176,996号;同第5,264,564号;および同第5,256,77
5号参照)。さらに、アンチセンス治療物において有用なオリゴマーを作製する
ための一般的方法は、例えば、Van der Krol et al.(1988) Biotechniques 6:95
8-976; and Stein et al.(1988) Cancer Res 48:2659-2668により示されている
。
多くのことを考慮に入れなければならない:(1)オリゴは、50%以上のGC含量
を有する;(2)3以上のGが続く配列を避ける;および(3)オリゴヌクレオチ
ドは25−26mer以下の長さである。アンチセンスオリゴヌクレオチドをテストす
る場合、不適当に組み合わせた対照を作製できる。対照は、塩基の同じ割合を保
存するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドに一致する配列順序を逆にする
ことにより産生できる。
の抑制を模倣する、パッチ物の発現を抑制するアンチセンス構成物でもよい。ア
ンチセンス構成物の例には、
存するであろう。小さい有機分子およびペプチド断片を化学的に合成し、薬剤/
化粧品としての使用に適切な純粋な形態で提供できる。天然抽出の産物は、当該
技術において知られる技術により精製できる。例えば、Cox et al.の米国特許第
5,286,654号には、分泌されたタンパク質の天然発生形態を精製する方法が記載
されており、ヘッジホッグポリペプチドの精製に適合できる。ヘッジホッグポリ
ペプチドの組換え供給源もまた、利用できる。例えば、ヘッジホッグポリペプチ
ドをコードする遺伝子は、特に国際特許出願公開第95/18856号および同第96/179
24号により知られる。
またはfgf-10治療物の効果的な量を測定できる。
、最も好ましくは適切な組成物の形態で施用される。適切な組成物としては、全
身的なまたは局所的な薬の投与に通常使用される全ての組成物が挙げられる。薬
学的に許容できるキャリアは、活性成分と作用しないように、実質的に挿入しな
ければならない。適切な挿入キャリアには、水、アルコールポリエチレングリコ
ール、鉱油または石油ゲル、プロピレングリコール等が含まれる。
ホッグまたはfgf-10治療物の効果的な量を、投与に所望な製剤の形態に依存して
多様な形態を取り得る、薬学的に許容できるキャリアと完全な添加物に化合する
。これらの薬剤組成物は、特に、経口的、直腸的、経皮的、または非経口注入に
よる投与に適切な単一の投薬形態であることが所望である。例えば、経口投薬形
態の組成物の調製においては、懸濁液、シロップ、エリキシルおよび溶液のよう
な経口液状試料の場合には例えば水、グリコール、油、アルコール等のような任
意の通常の薬剤媒質を;粉末、丸剤、カプセル、および錠剤の場合にはデンプン
、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等のような固体キャリアを使用しても
よい。投与が容易なので、錠剤およびカプセルは最も利点のある経口投薬ユニッ
ト形態を示し、この場合固体の薬剤キャリアが目立って使用されている。非経口
組成物については、例えば溶解性を促進するために他の成分が含まれていても、
キャリアは通常少なくとも大部分に無菌水を含む。注射可能な溶液は、例えばキ
ャリアが食塩水、グルコース溶液または食塩とグルコースの混合溶液を含むよう
に調製してもよい。注射可能な懸濁液を調製してもよく、この場合適切な液体キ
ャリア、懸濁物質などを使用してもよい。使用の直前に液体形態の薬剤に変化さ
れる固体形態の薬剤も含まれる。経皮投与に適切な組成物においては、キャリア
は必要に応じて、皮膚上に重大な有害効果をもたらさない性質の適切な添加物を
小さい割合で必要に応じて組み合わせた、貫入増強薬および/または適切な加湿
薬を含む。
中にまたは体内で可溶性のフィルムまたは固体キャリア等の中に被包し、後に放
出する、好ましくは活性成分を持続放出する他の方法により、局所的に投与でき
る。
、チンキ、ペースト、軟膏、軟膏剤、粉末、液体または半液体製剤等のような局
所施用治療に通常使用される全ての組成物が挙げられる。窒素、二酸化炭素、フ
レオンのような噴射剤を有する、またはポンプスプレーのような噴射剤、滴剤、
ローション剤、またはスワブにより施用できる濃縮組成物のような噴射剤を有し
ないエアロゾルにより、前記組成物を施用してもよい。特定の組成物において、
軟膏剤、クリーム、ペースト、ゼリー、軟膏等のような半固体の組成物が、都合
よく使用される。
態に調製することは、特に利点がある。本明細書および請求の範囲で用いたよう
に投薬ユニット形態とは、投薬の単位として適切な物質的に分離したユニットを
称し、あらかじめ決められた量の活性成分を含有しているそれぞれのユニットは
、必要な薬剤キャリアと共に所望の治療効果を産生するように計画されている。
そのような投薬ユニット形態の例は、錠剤(溝のついたまたは被覆された錠剤を
含む)、カプセル、丸剤、粉末の小包、オブラート、注射可能な溶液または懸濁
液、茶さじ一杯、テーブルスプーン一杯等、およびそれらの特定の集まりである
。
用途に使用できる。好ましくは低アレルギー性でpHがコントロールされた、当該
技術において知られる化粧品組成物が特に好ましく、化粧水、パック、ローショ
ン、皮膚乳液または乳液状のローションを含む。製剤は、ptc、ヘッジホッグま
たはfgf-10治療物のほかに、そのような製剤中で通常使用される成分を含有する
。そのような成分の例は、油、脂肪、ロウ、界面活性剤、湿潤薬、肥厚薬、抗酸
化剤、粘性安定剤、キレート剤、緩衝剤、防腐薬、香水、染料、低級アルカノー
ル等である。所望なら、例えば抗炎症薬、抗菌薬、抗真菌薬、消毒剤、ビタミン
、日焼け止め、抗生物質、または他の抗座瘡薬のような、さらなる成分を組成物
中に混合してもよい。
およびラノリンのようなロウ;液体パラフィン、セレシン、およびスクアレンの
ような炭化水素;ステアリン酸およびオレイン酸のような脂肪酸;セチルアルコ
ール、ステアリルアルコール、ラノリンアルコール、およびヘキサデカノールの
ようなアルコール;およびミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピ
ルおよびステアリン酸ブチルのようなエステルが含まれる。界面活性剤の例とし
ては、ステアリン酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラ
ウリルエーテルホスフェート、N-アシルグルタミン酸ナトリウムのような陰イオ
ン性界面活性剤;塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウムおよび塩化ステ
アリルトリメチルアンモニウムのような陽イオン性界面活性剤;塩酸アルキルア
ミノエチルグリシン溶液およびレシチンのような両性電解質の界面活性剤;およ
びグリセリンモノステアレート、ソルビタンモノステアレート、ショ糖脂肪酸エ
ステル、プロピレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンオレイル
エーテル、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンココナット脂肪酸モノエタノール
アミド、ポリオキシプロピレングリコール(例えば商標「プルロニック」の下で
販売される物質)、ポリオキシエチレンヒマシ油、およびポリオキシエチレンラ
ノリンのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。湿潤薬の例には、グリセリ
ン、1,3-ブチレングリコール、およびプロピレングリコールが含まれる;低級ア
ルコールの例は、エタノールおよびイソプロパノールを含む;肥厚薬の例には、
キサンタンガム、ヒドキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、
ポリエチレングリコールおよびナトリウムカルボキシメチルセルロースが含まれ
る;抗酸化剤の例には、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニ
ソール、没食子酸プロピル、クエン酸およびエトキシキンが含まれる;キレート
剤の例には、エデト酸二ナトリウムおよびエタンヒドロキシ二リン酸が含まれる
;緩衝剤の例には、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂、およびリ
ン酸水素二ナトリウムが含まれる;および防腐薬の例は、メチルパラヒドロキシ
ベンゾエート、エチルパラヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸、サリチル酸
および安息香酸である。
で特に0.1%から5%までおよびさらに特定すると0.2%から2.5%までの活性成分、例
えばptc、ヘッジホッグまたはfgf-10治療物を、組成物中に混合する。軟膏また
はクリームにおいて、キャリアは例えば1%から20%まで、特に5%から15%までの湿
潤薬、0.1%から10%まで特に0.5%から5%までの肥厚薬および水からなる;または
前記キャリアは、70%から99%まで、特に20%から95%までの界面活性剤、および0%
から20%まで、特に2.5%から15%までの脂肪;または80%から99.9%まで特に90%か
ら99%までの肥厚薬;または5%から15%までの界面活性剤、2%から15%までの湿潤
薬、0%の80%までの油、非常に少量(<2%)の防腐薬、色素および/または香水、お
よび水からなってもよい。化粧水においては、キャリアは例えば、2%から10%ま
での低級アルコール、0.1%から10%まで特に0.5%から1%までの界面活性剤、1%か
ら20%まで、特に3%から7%までの湿潤薬、0%から5%までの緩衝剤、水および少量(
<2%) の防腐薬、染料および/または香水からなる。皮膚乳液においては、キャリ
アは通常、10%から50%までの油、1%から10%までの界面活性剤、50%から80%まで
の水および0%から3%までの防腐薬および/または香水からなる。前記の製剤にお
いて、すべての%記号は重量パーセンテージによる重量を称する。
たはfgf-10治療物がリポソーム含有組成物中に調製されることを特徴とするもの
である。リポソームは、例えばホスファチジルコリン、エタノールアミンおよび
セリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラズマロゲン、ホスファチジ
ン酸およびセレブロシドなどの極性脂質のような両親媒性分子により形成される
人工小胞である。適切な両親媒性分子が水または水溶液中で膨張して、通常、水
性物質により互いに分離される多くの二重層からなる多層構造の液体結晶を形成
する場合に、リポソームが形成される(粗リポソームとも称される)。水性物質
を被包する単一の二重層からなることが知られているリポソームの別の種類は、
単層小胞と称される。脂質の膨張中に水溶性物質が水相に含まれていると、それ
らは、脂質二重層の間の水層中に捕捉される。
、分子層の間の水性の空間に被包される。有機擬態物のようなptc、ヘッジホッ
グまたはfgf-10治療物の脂溶性活性成分は、極性の頭部基が層から水溶性の空間
中に突き出すかもしれないが、脂質層中に主として組み込まれる。これらの化合
物の被包は、多くの方法により達成できる。最もよく使用される方法には、有機
溶媒からの蒸発によりリン脂質の薄いフィルムをフラスコの壁面上にキャストす
ることが含まれる。このフィルムを適切な水性媒質中に分散させると、多層リポ
ソームが形成される。適切な音波破砕をすると、粗リポソームは、より小さくて
同様に閉じた小胞を形成する。
せることにより組み込まれる。その後被包されない化合物を、遠心分離、クロマ
トグラフィ、透析または他の適切であると知られる方法により除去する。脂溶性
の活性成分は通常、フィルムをキャストする前に有機溶媒中にリン脂質とともに
溶解させることにより組み込まれる。脂質相中の物質の溶解度を超えないまたは
存在量が脂質に結合可能な量を超えない場合には、上述の方法により調製された
リポソームは通常、脂質二重層中で結合した物質の大部分を含有する;被包され
ない物質からのリポソームの分離は必要ではない。
方法は、ここに引用される欧州特許第A-253,619号に記載される方法である。こ
の方法において、被包された活性成分を含有する単一の二重層化したリポソーム
を、脂質成分を有機媒質中に溶解し、脂質成分の有機溶液を圧力下で水溶性成分
中に注入し同時に高速ホモジナイザまたは混合方法で有機成分と水溶性成分とを
混合することにより調製すると、リポソームが自然に形成される。
したリポソームは直接使用してもよい、または局所施用に適切な薬学的に許容で
きるキャリア中で使用してもよい。リポソームの粘性は、例えばキサンチンガム
、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび
それらの混合物のような、適切な肥厚薬を1つ以上加えることにより増加できる
。水溶性成分は、水のみからなってもよい、または電解質、緩衝系および例えば
防腐剤のような他の成分を含有してもよい。使用できる適切な電解質には、アル
カリ金属およびアルカリ土類金属の塩のような金属塩が含まれる。好ましい金属
塩は、塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムである。電解質の濃
度は、0mMから260mMまで、好ましくは5mMから160mMまで変化してもよい。水溶性
成分を、有機成分の注入中に大きな乱れをもたらすことにより均質化するために
適合できる適切な容器中に配置する。2つの成分の均質化は、容器内で行うこと
ができる、あるいは、水溶性および有機成分を、容器外に配置された混合装置中
に別々に注入してもよい。後者の場合には、リポソームは混合装置中で形成され
、その後採集するために別の容器に移す。
ポリエチレングリコールのような適切な非毒性の薬学的に許容できる溶媒、およ
び該溶媒中に溶解できる適切なリン脂質からなる。使用できる適切なリン脂質に
は、例えば、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソホスファチジル
コリンおよびホスファチジルグリセロールが含まれる。他のリン脂質添加物を使
用して、リポソームの特性を選択的に修飾してももよい。そのような他の添加物
の例には、ステアリルアミン、ホスファチジン酸、トコフェノール、コレステロ
ールおよびラノリン抽出物が含まれる。
そのような他の成分の例には、トコフェノール、ブチル化ヒドロキシアニソール
、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビルパルミテートおよびアスコルビル
オレエートが含まれる。安息香酸、メチルパラベンおよびプロピルパラベンのよ
うな防腐剤を加えてもよい。
含有する、例えば硬膏剤、包帯、包帯剤、ガーゼパッド等のカバーを使用しても
よい。ある場合には、治療製剤を含有する局所製剤をしみ込ませた、硬膏剤、包
帯、包帯剤、ガーゼパッド等を使用してもよい。
態の説明のためにのみ含まれており、本発明を制限することを意図しない以下の
実施の形態を参照することにより、さらに容易に理解されるであろう。
とにより発生する[参考文献1参照]。前腸内胚葉の二つの腹側芽が下にある臓側
中胚葉へ膨出するとともに発生が開始する。それらは伸びて、正確な不変の位置
で側枝を出し、一次気道およびそれぞれの肺の葉を確立する。二又分枝により、
気道がさらに拡大する。移植研究により、上皮分枝の誘発における気管支間葉の
重要性が示されたが、上皮シグナリングの重要性はほとんど研究されていない。
モルフォゲンソニックヘッジホッグ(Shh)は、前腸内胚葉中で広く発現され、分
枝が発生している肺の遠位上皮において特異的にアップレギュレートされる[参
考文献2参照]。Shhの異所発現は、分枝を妨げ、増殖を増加させ、局所Shhシグ
ナリングが肺発生を調節することが示される[参考文献2参照]。本発明者はここ
で、Shhは呼吸器系の発達に不可欠であることを報告する。Shhヌル突然変異体に
おいて、気管および食道は完全に分離せず、一次肺芽の形成後に枝分かれおよび
発達しないために肺は痕跡嚢を形成する。興味深いことに、気道上皮の正常な近
位−遠位の分化が起こり、これによりShhが分化の発生に必要でないことが示さ
れる。さらに、Shhの間葉の発現した下流標的の多くの転写は起こらない。これ
らの結果により、上皮由来のShhが肺の分枝形態形成の調節において重要である
ことが強調される。
(3)。胚マウス発生の10.5日***後(dpc)において、野生型(wt)子孫の肺は、
左および右の芽からなる[参考文献1参照]。12.5dpcまでに、気管上皮は前腸の
上皮成分から腹側に分離し、二つの肺芽は肺葉の一次気道に生じるいくつかの側
枝を形成した(図1a-c)。対照的に、食道および気管内チューブは、Shh突然変
異体で密接に結合したままであり(図1d,e)、左および右の芽は形成されるが、
枝分かれしないかまたは以上内地の分枝点を一つ有する(図1f)。野生型の肺は
、器官培養中で相当な成長および分枝を受ける。しかしながら、Shh突然変異体
からの肺の移植片培養において、気管支間葉細胞は、内胚葉から分離し、上皮は
成長できない、または広く枝分かれすることができない(データは図示せず)。
分枝形態形成における欠陥は、他のShh発現器官(すなわち消化管)と独立して
おり、観察された分枝表現型は通常分枝工程と関連するShhシグナリングの不存
在を反映していると本発明者は結論を出した。
測定するために、15.5dpc(データは図示せず)および18.5dpc(図1g,h)におい
て取り出した肺を調べた。このとき、5つの良好に発達した葉が野生型において
明らかであり(4つは右、1つは左)、高度に枝分かれした気道は分枝上皮ネット
ワークである呼吸樹を形成する(図1i,k,l)。肺胞嚢におけるガス交換を媒介す
るために、呼吸表面は十分に脈管化されている(図1g)。対照的に、Shh突然変
異体は、少数の大きい、脈管化の乏しい気道を有する痕跡呼吸器のみを形成する
(図1h)。気管および食道は、非常に接近して並置されているので、それらのチ
ューブはいくつかの共通の上皮を共有し(図1e)、消化管および気道のフィステ
ル様融合が形成され、ヒト病理学においてよく記載される致死異常が反映される
[参考文献4,5参照](図1j,m)。
観察できる。最も近位では、肺上皮は主かん気管支に特有の円柱上皮を形成し(
図1m)、末端で分化した分泌クラーラ細胞についての標識であるCCSP[参考文献
6参照]を発現する(図1q)。より遠位では、上皮は細気管支で観察されるよう
に円柱上皮および立方上皮の混合物からなり(図1n)、対応してタイプII肺胞細
胞標識であるSP-C[参考文献7参照]を発現する肺胞気嚢が形成される(図1r)。
得る肺の形成に不可欠である、前腸内胚葉の局所形態形成、気管食道隔膜の形成
、肺の切れ込みおよび呼吸樹の産生という三つの異なるイベントに不可欠である
。
移植の研究により、出芽は多くの異なる供給源から間葉により持続されるのに対
し、気管支間葉だけは器官型分枝形態形成を誘発できることが示される[参考文
献8参照]。上皮におけるShhの必要性により、発現の調節は間葉シグナリングに
対する相互上皮応答であるかもしれない。
に、ヘッジホッグシグナリングの一般的な標的を認識するプローブ(図2a-eおよ
びデータは図示せず)、または肺形態形成に特に関係する遺伝子(図2f-k)との
ジゴキシゲニンインサイチュハイブリダイゼーションを行った。Shh突然変異体
は発達が妨げられ肺出芽において通常遅れを示すので、12.5dpcにおけるこれら
の標識の発現を11.5dpcおよび12.5dpcにおいて採集された野生型の胚と比較した
。
コードするのに対し、Gli遺伝子は、ヘッジホッグシグナリングの転写媒介物質
をコードする[参考文献9参照]。Ptc-1およびGli-1はいずれも、Shhが肺におい
て異所的に発現される場合にアップレギュレートされ、これにより、胚の他の場
所と同様に、ここでShhシグナリングの転写標的であることが示される[参考文献
9,10参照]。このモデルと矛盾せず、Ptc-1およびGli-1は通常、遠位分枝点にお
いて最高レベルで野生型の胚の間葉中で発現され、上皮Shh発現を反映する[参考
文献10参照](図2a,c)。Shh突然変異体において、両方の遺伝子の基底レベル
の発現のみが検出される(図2a,c)。間葉中でより広範囲の発現を示すGli-3も
また、ダウンレギュレートされる(図2e)。対照的に、上皮中でより高いレベル
で発現されるPtc-2および通常間葉中で一様に発現されるGli-2は、変化しない(
図2b,d)。これらのデータは、上皮ではなく肺間葉が、Shhシグナリングの直接
的な細胞標的であるらしいことを示す。さらに、Gli-1およびGli-3転写の調節は
、肺形態形成の重要な態様であるかもしれないことが示される。Gli-1突然変異
体は肺表現型を有しないので、Shh表現型を単にGli-1転写活性が無いことに帰す
ることはできない[参考文献10参照]。転写後工程により無脊椎動物におけるGl
i(Ci)活性が調節されるとすれば[参考文献11参照]、Gli-2が発現されるが転写
後に不活性化されることを除外することはできない。Gli遺伝子は、Gli-3突然変
異体において観察される比較的弱い小葉形成不全により明らかなように、肺発達
にはっきりと関係しているが[参考文献10参照]、Gli作用の全範囲を明らかに
することが化合物突然変異体の産生に必要かもしれない。
系統群メンバーの発現を調節することが示される[参考文献11参照]。肺におい
て、Bmp-4は、上皮の最遠位の先端において強く発現される。異所的発現により
、上皮増殖が減少し、枝分かれが破壊され、気道における遠位細胞タイプの分化
が縮小される[参考文献12参照]。Shh突然変異体において、Bmp4は、正常な位
置であるが高レベルで発現され(図2f)、これは強化されたBmp4シグナリングは
分枝におけるブロックの一因となり得ることを示す。Wnt-7bは、通常肺上皮中で
発現され、正常な枝分かれに必要であるのに対し(S. Lee, W. Cardoso, B. Parr
& A. McMahon; 未公表)、Wnt-2は下にある間葉中で発現されて上皮の維持にお
いてある役割を示す[参考文献2参照]。Shh突然変異体において、Wnt-7b発現は
変化しないが(図2g)、Wnt-2発現はダウンレギュレートされる(図2h)。この
観察は、肺間葉はShhシグナリングの一次標的であるというモデルをさらに支持
し、間葉シグナリングはShh突然変異体において異常であることを示す。しかし
ながら、Wnt-2突然変異体において肺の発達におけるWnt-2の役割については報告
されていない[参考文献13参照]。
ーブとして発達する左および右の芽の形成後の枝分かれを停止し、近位上皮構成
物にのみ分化する[参考文献14参照]。初期出芽後の枝分かれの停止は、Shh突
然変異体の暗示であるが、Shh突然変異体において主として影響を受けないその
後の形態形成および分化においてはっきりとした違いがある。Fgf10は枝分かれ
の形成前に間葉細胞中で発現され、培養液中で肺上皮の枝分かれを誘発するとい
う最近の観察により、推定リガンドとしての役割が指摘される[参考文献15参
照]。Shh突然変異体において、FGF-R2の発現は変化しない(図2I)。対照的に、
野生型の胚では肺上皮から離れて間葉の小さいパッチ物に強く局在するFgf10は
(図2jの矢印)、突然変異体の肺中の上皮に隣接する間葉中で広く発現される。
これらの結果により、ShhはFgf10発現に必要ではないことが示される。さらに、
ShhシグナリングはFgf10発現の場所を遠位間葉に制限するかもしれない。Fgf10
発現の場所の調節におけるShhについてのそのような抑制的役割は、遺伝子導入
研究により支持される[参考文献16参照]。Fgf10発現の変化した位置はその後
枝分かれを崩壊させる興味のある可能性は、まだ測定されていない。
フェクターである。消化管において、HNF-3bは、肺を含む上皮中で広く発現さ
れるのに対し、Nkx-2.1は、肺上皮および少数の他の内胚葉誘導体に特異的に発
現される[参考文献17参照]。Nkx2.1を欠失するマウスは、嚢胞性の枝分かれし
ていない肺を発達させ、これはNkx2.1が肺の形態形成に不可欠であることを示す
[参考文献17参照]。両方の遺伝子の発現は、Shh突然変異体の肺の上皮におい
て変化されないが、これはこの器官においてそれらの発現はShhシグナリング経
路と独立していることを示す(図2kおよびデータは図示せず)。
分化を分析した。たとえ無秩序でも、突然変異体において軟骨輪の形成が起こる
のに対し(図3a)、通常近位上皮に沿う平滑筋の層は存在しない(図3b)。Shh
は平滑筋の形成に必要であるという観察は、以前の研究と一致する[参考文献1
8参照]。
り特定するとマウスの肺中の分枝形態形成のコントロールにおける重要な因子と
してShhが確立される。肺上皮における発達および枝分かれの遺伝的コントロー
ルは、分枝点における上皮および間葉の相互作用を含む複雑な工程のようであり
、この器官におけるShhシグナリングの下流標的は主に間葉で発現した遺伝子で
あることも示される。
伝子に対し同型接合性のマウスは、報告されているものと同一の表現型を示す[
参考文献19参照]。
方法で修飾した[参考文献20参照]。
者の使用説明書に従い行った。
試薬に対する数多くの同等物を認識するかまたは日常的な実験を用いて確認でき
る。そのような同等物は、本発明の範囲内にあると考えられる。
Claims (21)
- 【請求項1】 肺組織、またはそれに由来する細胞の成長状態を調節する方
法であって、該組織を、肺組織の増殖率を変化させるのに効果的な量の作用物質
と異所的に接触させる工程を含み、該作用物質が、ヘッジホッグ治療物、ptc治
療物およびfgf-10治療物からなる群より選択されることを特徴とする方法。 - 【請求項2】 肺組織の形成、または維持あるいは機能遂行を誘発する方法
であって、肺組織を、新しい肺組織の形成を誘発するのに効果的な量の作用物質
と接触させる工程を含み、該作用物質が、ヘッジホッグ治療物、ptc治療物およ
びfgf-10治療物からなる群より選択されることを特徴とする方法。 - 【請求項3】 前記肺組織が培養液中にあり、前記作用物質が細胞培養添加
物として提供されることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 前記細胞が動物中で処理され、前記作用物質が治療組成物と
して該動物に投与されることを特徴とする請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 前記作用物質がヘッジホッグ治療物であることを特徴とする
請求項1記載の方法。 - 【請求項6】 前記ヘッジホッグ治療物が、ヘッジホッグタンパク質の少な
くとも生物活性細胞外部分のヘッジホッグポリペプチド配列を含むポリペプチド
であることを特徴とする請求項5記載の方法。 - 【請求項7】 前記ポリペプチドが、前記ヘッジホッグタンパク質のN末端
半分の少なくとも50アミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項8】 前記ポリペプチドが、前記ヘッジホッグタンパク質の細胞外
領域の少なくとも100アミノ酸を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項9】 前記ポリペプチドが、前記ヘッジホッグタンパク質の細胞外
領域の19kdの断片に対応するヘッジホッグタンパク質の少なくとも一部を含むこ
とを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項10】 前記ヘッジホッグタンパク質が、脊椎動物生体の遺伝子に
よりコードされることを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項11】 前記ポリペプチドが、配列番号21の一般式に示されるヘ
ッジホッグポリペプチド配列を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項12】 前記ポリペプチドが、配列番号22の一般式に示されるヘ
ッジホッグポリペプチド配列を含むことを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項13】 前記ヘッジホッグタンパク質が、ヒトヘッジホッグ遺伝子
によりコードされることを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項14】 前記ヘッジホッグポリペプチド配列が、配列番号9、配列
番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番
号15および配列番号16からなる群より選択されるヘッジホッグタンパク質の
アミノ酸配列に少なくとも60%同一であることを特徴とする請求項6記載の方法
。 - 【請求項15】 前記ヘッジホッグポリペプチド配列が、ストリンジェント
な条件下で配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配
列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群より選択される配列にハイブ
リッド形成するヌクレオチド配列によりコード可能であることを特徴とする請求
項6記載の方法。 - 【請求項16】 前記ヘッジホッグポリペプチド配列が、配列番号9、配列
番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番
号15および配列番号16からなる群より選択されるヘッジホッグタンパク質の
アミノ酸配列であることを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項17】 前記ヘッジホッグポリペプチド配列が、ソニックヘッジホ
ッグタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項6記載の方法。 - 【請求項18】 前記作用物質が、ptc治療物であることを特徴とする請求
項1記載の方法。 - 【請求項19】 前記ptc治療物が、パッチ物タンパク質に結合し、パッチ
物により媒介される有糸***の抑制を解除する小さい有機分子であることを特徴
とする請求項18記載の方法。 - 【請求項20】 前記ptc治療物が、パッチ物に結合し、ヘッジホッグによ
り媒介されるパッチ物シグナル導入を模倣することを特徴とする請求項18記載
の方法。 - 【請求項21】 前記ptc治療物が、小さい有機分子であることを特徴とす
る請求項20記載の方法。
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---|---|---|---|---|
US6713065B2 (en) * | 1997-02-10 | 2004-03-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of using hedgehog proteins to modulate hematopoiesis and vascular growth |
US6639051B2 (en) * | 1997-10-20 | 2003-10-28 | Curis, Inc. | Regulation of epithelial tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
WO2000015246A2 (en) * | 1998-09-11 | 2000-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Regulation of lung tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
JP2003501395A (ja) * | 1999-06-08 | 2003-01-14 | ローランティス・リミテッド | 治療的使用 |
US7498304B2 (en) | 2000-06-16 | 2009-03-03 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
US7708998B2 (en) | 2000-10-13 | 2010-05-04 | Curis, Inc. | Methods of inhibiting unwanted cell proliferation using hedgehog antagonists |
JP5196700B2 (ja) * | 2000-10-13 | 2013-05-15 | キュリス,インコーポレイテッド | ヘッジホッグアンタゴニスト、それらに関する方法及び利用 |
CA2561221C (en) | 2004-03-26 | 2016-09-20 | Curis, Inc. | Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof |
EP1773871B1 (en) | 2004-06-17 | 2014-10-15 | Thrasos Innovation, Inc. | Tdf-related compounds and analogs thereof |
JP2009508532A (ja) | 2005-09-20 | 2009-03-05 | スラソス セラピューティックス インコーポレーテッド | Tdf関連化合物およびその類似体 |
WO2010027802A2 (en) | 2008-08-25 | 2010-03-11 | New York University | Methods for treating diabetic wounds |
US9279011B2 (en) * | 2009-05-05 | 2016-03-08 | The Johns Hopkins University | Phosphopeptides as melanoma vaccines |
CA3111806A1 (en) | 2010-06-17 | 2011-12-22 | New York University | Therapeutic and cosmetic uses and applications of calreticulin |
WO2015073691A1 (en) | 2013-11-14 | 2015-05-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for treating cancer by activation of bmp signaling |
WO2019048898A1 (en) | 2017-09-05 | 2019-03-14 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6610656B1 (en) * | 1993-12-30 | 2003-08-26 | President And Fellows Of Harvard College | Method of promoting chondrocyte differentiation with hedgehog related polypeptides |
US5789543A (en) * | 1993-12-30 | 1998-08-04 | President And Fellows Of Harvard College | Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins and uses related thereto |
US7060450B1 (en) * | 1993-12-30 | 2006-06-13 | President And Fellows Of Harvard College | Screening assays for agonists and antagonists of the hedgehog signaling pathway |
US6165747A (en) * | 1993-12-30 | 2000-12-26 | President & Fellows Of Harvard College | Nucleic acids encoding hedgehog proteins |
US20030186357A1 (en) * | 1993-12-30 | 2003-10-02 | Philip W. Ingham | Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins, and uses related thereto |
US6884775B1 (en) * | 1993-12-30 | 2005-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for regulating skeletogenic formation |
US6271363B1 (en) * | 1993-12-30 | 2001-08-07 | President & Fellows Of Harvard College | Nucleic acids encoding hedgehog proteins |
NZ278765A (en) | 1993-12-30 | 1998-05-27 | Harvard College | Vertebrate proteins involved in spatial arrangements of differentiated tissues called hedgehog proteins, their production and use |
US6261786B1 (en) * | 1993-12-30 | 2001-07-17 | Imperial Cancer Res. Technology | Screening assays for hedgehog agonists and antagonists |
JPH09509574A (ja) | 1994-02-25 | 1997-09-30 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 脊索によって発現されるヘッジホッグ、Vhh−1、の脊椎動物相同体をコードするDNA、及びこれらの使用 |
US5681278A (en) * | 1994-06-23 | 1997-10-28 | Cormedics Corp. | Coronary vasculature treatment method |
ATE299529T1 (de) * | 1994-10-07 | 2005-07-15 | Univ Leland Stanford Junior | Ptc gene und ihre verwendung |
US6429354B1 (en) * | 1994-10-07 | 2002-08-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Patched genes and uses related thereto |
US6946257B1 (en) * | 1994-10-07 | 2005-09-20 | Regents Of The University Of California | Patched genes and uses related thereto |
US6027882A (en) * | 1994-10-07 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Patched genes and their use for diagnostics |
US6281332B1 (en) | 1994-12-02 | 2001-08-28 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Hedgehog-derived polypeptides |
US6713065B2 (en) | 1997-02-10 | 2004-03-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of using hedgehog proteins to modulate hematopoiesis and vascular growth |
US6639051B2 (en) | 1997-10-20 | 2003-10-28 | Curis, Inc. | Regulation of epithelial tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
US6432970B2 (en) * | 1998-04-09 | 2002-08-13 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Inhibitors of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
US6867216B1 (en) * | 1998-04-09 | 2005-03-15 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Inhibitors of hedgehog signal pathways, compositions and uses related thereto |
WO1999052534A1 (en) | 1998-04-09 | 1999-10-21 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Use of steroidal alkaloid derivatives as inhibitors of hedgehog signaling pathways |
WO2000015246A2 (en) * | 1998-09-11 | 2000-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Regulation of lung tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
WO2000018428A2 (en) | 1998-09-11 | 2000-04-06 | Biogen, Inc. | Hedgehog and patched antagonists for inhibiting cell and tissue growth and differentiation and uses therefor |
WO2001019800A2 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Curis, Inc. | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
US6552016B1 (en) * | 1999-10-14 | 2003-04-22 | Curis, Inc. | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
US6613798B1 (en) * | 2000-03-30 | 2003-09-02 | Curis, Inc. | Small organic molecule regulators of cell proliferation |
EP1294752A2 (en) | 2000-06-16 | 2003-03-26 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
US7498304B2 (en) * | 2000-06-16 | 2009-03-03 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
US7708998B2 (en) * | 2000-10-13 | 2010-05-04 | Curis, Inc. | Methods of inhibiting unwanted cell proliferation using hedgehog antagonists |
JP5196700B2 (ja) | 2000-10-13 | 2013-05-15 | キュリス,インコーポレイテッド | ヘッジホッグアンタゴニスト、それらに関する方法及び利用 |
-
1999
- 1999-09-10 WO PCT/US1999/020500 patent/WO2000015246A2/en active IP Right Grant
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-
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-
2012
- 2012-08-30 US US13/599,879 patent/US20130085096A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6009059690, Ying Litingtung, nature genetics, 19980910, Vol. 20 No. 1, Pages 58−61 * |
JPN6009059692, Saverio Bellusci, Development, 1997, Vol. 124, Pages 53−63 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2000015246A3 (en) | 2000-07-20 |
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