JP2002524040A - Novel genes in the control of hematopoiesis - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＳＣＭ３、ＳＣＭ２６、及びＳＣＭ１１３という、３つの新規遺伝子、それをコードする領域、遺伝子産物、該遺伝子の応用、ＤＮＡ産物、並びに、該遺伝子又はその断片を含むベクター及び形質転換細胞を提供する。ＳＣＭ３、ＳＣＭ２６、及びＳＣＭ１１３のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列も本発明によって開示される。 (57) [Summary] The present invention provides three novel genes, SCM3, SCM26, and SCM113, a region encoding the same, a gene product, an application of the gene, a DNA product, and a vector containing the gene or a fragment thereof. And a transformed cell. The polynucleotide and polypeptide sequences of SCM3, SCM26, and SCM113 are also disclosed by the present invention.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】[Industrial applications]

本発明は、造血の制御に関与する３つの新規遺伝子の核酸配列およびアミノ酸
配列に関するものである。The present invention relates to nucleic acid sequences and amino acid sequences of three novel genes involved in hematopoiesis control.

【０００２】[0002]

【従来の技術】[Prior art]

造血（hamatopoiesis; hemopoiesisと互換的に使用される）は、多能性幹細胞
が系統を限定された(lineage-restricted)子孫を生じるプロセスである。造血幹
細胞（ＨＳＣ）は、他の幹細胞を産生して、血液細胞及び免疫系細胞の全範囲を
生じさせる造血系で唯一の細胞である。ヒトでは、骨髄および可動化(mobilized
)末梢血からのＣＤ３４^＋Ｔｈｙ−１^＋Ｌｉｎ^- 細胞がＨＳＣに高度に富んでい
る（Murray et al., Blood Cells, 20:354-370 (1995a); Murray et al., Blood
, 85:368-378 (1995b)）。この細胞集団は自己再生及び長期の多系統分化が可能
で、自家移植に成功裏に使用されている（Gazitt et al., Blood, 86:381-389 (
1995))。ＨＳＣは自己再生し、多能性であるので、遺伝子治療の理想的な候補で
ある。遺伝子治療は、種々の遺伝病、腫瘍性疾患又は感染症に対する新しい治療
様式であって、ＨＳＣから派生した全ての成熟細胞における欠陥を矯正する潜在
能力をもっている。Hematopoiesis (hamatopoiesis; used interchangeably with hemopoiesis) is the process by which pluripotent stem cells give rise to lineage-restricted progeny. Hematopoietic stem cells (HSCs) are the only cells in the hematopoietic system that produce other stem cells and give rise to a full range of blood cells and immune system cells. In humans, bone marrow and mobilized
) CD34 ⁺ Thy-1 ⁺ Lin ⁻ cells from peripheral blood are highly enriched in HSCs (Murray et al., Blood Cells, 20: 354-370 (1995a); Murray et al., Blood
, 85: 368-378 (1995b)). This cell population is capable of self-renewal and long-term multilineage differentiation and has been successfully used for autologous transplantation (Gazitt et al., Blood, 86: 381-389 (
1995)). HSCs are self-renewing and pluripotent, making them ideal candidates for gene therapy. Gene therapy is a new treatment modality for various genetic, neoplastic or infectious diseases, with the potential to correct defects in all mature cells derived from HSCs.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】[Problems to be solved by the invention]

造血の分子レベルでの根本原理の理解はいまだ乏しい。ＨＳＣが系統を限定さ
れた子孫を生じさせるプロセスがよりよく理解されたならば、移植及び遺伝子治
療のためのＨＳＣの利用が容易になるであろう。これを達成するために、造血細
胞の増殖と分化を制御する分子経路が研究されてきた。本発明は、この目的のた
めに、候補となるＨＳＣ調節遺伝子の同定およびそれらの造血に対する影響の確
認に関するものでる。Understanding the fundamental principles of hematopoiesis at the molecular level is still poor. If the process by which HSCs give rise to lineage-restricted progeny is better understood, the use of HSCs for transplantation and gene therapy will be easier. To achieve this, the molecular pathways controlling hematopoietic cell proliferation and differentiation have been studied. The present invention for this purpose relates to the identification of candidate HSC regulatory genes and the identification of their effect on hematopoiesis.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】 本発明においては、ＣＤ３４^＋Ｔｈｙ−１^＋幹細胞からｃＤＮＡライブラリー
を構築し、特性決定を行った。ｃＤＮＡライブラリーの配列解析により、造血に
おいてある役割を果たすかもしれない多くの新規蛋白質が明らかになった。候補
となる造血幹細胞（ＨＳＣ）調節遺伝子の富化のために、ＲＮＡ発現のプロファ
イリングを行い、ＨＳＣでの発現が富化されたｃＤＮＡを選択し、他の分化血液
細胞タイプと比較する。新規遺伝子産物の全長をコードするＨＳＣ富化遺伝子を
レトロウィルスの発現ベクター中にサブクローニングし、これを用いて、単離し
たばかりのＨＳＣ中で遺伝子産物を過剰発現させる。３種の新規ＨＳＣ調節遺伝
子およびそれらがコードする蛋白質が同定される。新規ｃＤＮＡの各々を、ＨＳ
Ｃ中で、それらの分化子孫に比して、富化させる。過剰発現されたときには、そ
れは幹細胞の分化を阻害する。Means for Solving the Problems In the present invention, a cDNA library was constructed from CD34 ⁺ Thy-1 ⁺ stem cells, and their characteristics were determined. Sequence analysis of cDNA libraries has revealed a number of novel proteins that may play a role in hematopoiesis. For enrichment of candidate hematopoietic stem cell (HSC) regulatory genes, RNA expression profiling is performed, and cDNA enriched for HSC expression is selected and compared to other differentiated blood cell types. The HSC-enriched gene encoding the full length of the novel gene product is subcloned into a retroviral expression vector and used to overexpress the gene product in the freshly isolated HSC. Three novel HSC regulatory genes and the proteins they encode are identified. Each of the new cDNAs was
In C, they are enriched relative to their differentiated progeny. When overexpressed, it inhibits stem cell differentiation.

【０００５】 本発明は、ＨＳＣの調節にかかわる３つの新規遺伝子（以下ＳＣＭ２６、ＳＣ
Ｍ３およびＳＣＭ１１３という）を開示する。[0005] The present invention relates to three novel genes (hereinafter, SCM26, SC
M3 and SCM113).

【０００６】 第一の具体化態様においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番
号４のアミノ酸配列、配列番号４の残基１−２３９からなるアミノ酸配列、配列
番号４の残基２４０−５４３からなるアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列
および上に列挙した配列に機能上均等なアミノ酸配列からなる群から選ばれたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列に関する
ものである。[0006] In a first embodiment, the present invention provides an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence consisting of residues 1-239 of SEQ ID NO: 4, the residue of SEQ ID NO: 4 240-543, an isolated polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and the amino acid sequence functionally equivalent to the sequences listed above. It is.

【０００７】 第二の具体化態様においては、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列
、配列番号３のポリヌクレオチド配列、配列番号５のポリヌクレオチド配列およ
び少なくとも８５％が上記開示のポリヌクレオチド配列と一致するポリヌクレオ
チド配列からなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ配列に関す
るものである。一態様において、単離されたポリヌクレオチド配列はこれらポリ
ヌクレオチド配列の相補体から成っていても良い。[0007] In a second embodiment, the invention relates to a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and at least 85% of the polynucleotide sequence disclosed above. And an isolated DNA sequence comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of polynucleotide sequences that match In one aspect, the isolated polynucleotide sequences may consist of the complement of these polynucleotide sequences.

【０００８】 第三の具体化態様においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチド、配列番号２のアミノ酸残基２６−４０を含むポリペプチド、配列番
号２のアミノ酸残基２５−８２を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸残基
１４７−１５７を含むポリペプチド、配列番号２のアミノ酸残基２６６−２７５
を含むポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号
４のアミノ酸残基１−２３９を含むポリペプチド、配列番号４のアミノ酸残基２
４０−５４３を含むポリペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドまたは上記開示のポリペプチドと少なくとも８５％が一致するポリペプチドか
らなる群から選ばれた一員を含む単離ポリペプチドに関する。好ましい一面にお
いては、該単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６のアミノ酸配列を、または
それと９５％が一致するアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。他の一面にお
いては、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基２６−４０、配列番号２のアミノ
酸残基２５−８２、配列番号２のアミノ酸残基１４７−１５７、配列番号２のア
ミノ酸残基２６６−２７５および少なくとも９７％がそれらに一致するポリペプ
チドからなる群から選ばれた一員を含む単離ポリペプチドに関する。さらなる一
面においては、本発明は、上に列挙したポリペプチドのいずれかをコードするＤ
ＮＡ配列に関する。[0008] In a third embodiment, the invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a polypeptide comprising amino acid residues 26-40 of SEQ ID NO: 2, amino acid residue 25 of SEQ ID NO: 2 Polypeptide comprising -82, polypeptide comprising amino acid residues 147-157 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues 266-275 of SEQ ID NO: 2
A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a polypeptide comprising amino acid residues 1-239 of SEQ ID NO: 4, amino acid residue 2 of SEQ ID NO: 4
40-543, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or an isolated polypeptide comprising a member selected from the group consisting of polypeptides at least 85% identical to the polypeptide disclosed above. In a preferred aspect, the isolated polypeptide comprises a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, or 95% identical thereto. In another aspect, the invention relates to amino acid residues 26-40 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues 25-82 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues 147-157 of SEQ ID NO: 2, amino acid residues of SEQ ID NO: 2 266-275 and at least 97% of the isolated polypeptides comprise a member selected from the group consisting of the polypeptides corresponding thereto. In a further aspect, the present invention relates to a D-protein encoding any of the above-listed polypeptides.
For the NA sequence.

【０００９】 第四の具体化態様においては、本発明は、本発明の請求にかかわるポリヌクレ
オチド配列の一つを導入したベクターに関する。好ましい一面においては、該ベ
クターはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターまたはアデノ関連ベ
クターである。さらなる好ましい一面においては、該ベクターを含む宿主細胞が
請求の対象となる。好ましい宿主細胞は、造血細胞、とくにヒトＣＤ３４^＋細胞
である。In a fourth embodiment, the present invention relates to a vector into which one of the polynucleotide sequences according to the claims of the present invention has been introduced. In a preferred aspect, the vector is a retrovirus vector, an adenovirus vector or an adeno-associated vector. In a further preferred aspect, a host cell comprising the vector is claimed. Preferred host cells are hematopoietic cells, especially human CD34 ⁺ cells.

【００１０】 第五の具体化態様においては、本発明は、造血幹細胞の亜集団を含むＣＤ３４ ^＋ 細胞の集団を得て、それらＣＤ３４^＋細胞中へ、開示した本発明のポリペプチ
ドをコードする本発明のポリヌクレオチド配列を導入し、該ポリペプチドを過剰
発現する遺伝的に修飾された幹細胞の亜集団を得て、該遺伝的に修飾された幹細
胞の亜集団を対象に投与して、そこで造血幹細胞の有効量を増加させることから
なる、対象哺乳動物において造血幹細胞の有効量を増加させる方法に関する。さ
らなる一面においては、本発明は、遺伝的修飾の前かまたは後に造血幹細胞を選
択する工程を包含する。さらに別の一面では、本発明は、遺伝的修飾の前かまた
は後に造血ＣＤ３４^＋細胞の集団を培養する工程を包含する。[0010] In a fifth embodiment, the present invention relates to a CD34 comprising a subpopulation of hematopoietic stem cells. ⁺ Obtaining a population of cells,⁺Polypeptides of the disclosed invention into cells
The polynucleotide sequence of the invention encoding the
Obtaining a sub-population of the genetically modified stem cells to be expressed;
A subpopulation of vesicles is administered to the subject, which increases the effective amount of hematopoietic stem cells.
A method for increasing the effective amount of hematopoietic stem cells in a target mammal. Sa
In one aspect, the invention provides for the selection of hematopoietic stem cells before or after genetic modification.
Selecting step. In yet another aspect, the present invention provides that the method comprises:
Later hematopoietic CD34⁺Culturing the population of cells.

【００１１】 第六の具体化態様においては、本発明は、造血幹細胞の亜集団を含むＣＤ３４ ^＋ 細胞の集団を得て、そのＣＤ３４^＋細胞の集団中へ本発明のポリヌクレオチド
配列を導入し、そのＣＤ３４^＋細胞の集団中へ第二のポリヌクレオチド配列（該
第二のポリヌクレオチド配列は治療用遺伝子をコードしている）を導入し、遺伝
的に修飾された細胞（該細胞は、本発明のポリヌクレオチド配列および該治療用
遺伝子を過剰発現でき、治療用遺伝子を発現しうる細胞の有効量が野生型細胞と
比較して増加される）を得て、それら遺伝的に修飾された細胞を対象哺乳動物に
投与することからなる、遺伝的に修飾された細胞の有効量を増加させる方法に関
する。[0011] In a sixth embodiment, the invention relates to a CD34 comprising a subpopulation of hematopoietic stem cells. ⁺ Obtaining a population of cells and obtaining their CD34⁺Polynucleotides of the invention into a population of cells
The sequence was introduced and its CD34⁺A second polynucleotide sequence (such as
The second polynucleotide sequence encodes a therapeutic gene).
A cell that has been modified by the method according to claim 1, wherein said cell comprises a polynucleotide sequence of the invention and said therapeutic
The effective amount of cells capable of overexpressing the gene and expressing the therapeutic gene differs from wild-type cells.
The genetically modified cells in the target mammal.
Administering to a subject a method of increasing the effective amount of genetically modified cells.
I do.

【００１２】 第七の具体化態様においては、本発明は、造血細胞源からＣＤ３４^＋細胞を単
離し、それらＣＤ３４^＋細胞中へ請求にかかわるポリヌクレオチド配列を含むベ
クターを導入し（それにより、該細胞の集団は該ベクターによって遺伝的に修飾
される）、該修飾細胞の増殖を維持するのに十分な量の少なくとも１種のサイト
カインの存在下に該修飾ＣＤ３４^＋細胞を培養し、該ポリヌクレオチドが過剰発
現されて、分化が阻害される細胞を選択することからなる、インビトロ（生体外
）で哺乳動物の造血幹細胞の分化を阻害する方法に関する。好ましい一面におい
ては、哺乳動物造血細胞はヒトのものである。他の好ましい一面では、ベクター
の導入の前かまたは後に、さらにつぎの表現型Ｔｈｙ−１^＋、ＣＤ３４^＋Ｔｈｙ
−１^＋、ＣＤ３４^＋Ｔｈｙ−１^＋Ｌｉｎ^- またはＣＤ３４^＋Ｔｈｙ−１^＋ＣＤ３
８^- に基づいてＣＤ３４^＋細胞を選択する。好ましい一面においては、該哺乳動
物造血幹細胞の分化を阻害する方法は、請求にかかわるポリヌクレオチド配列を
含むベクターをＣＤ３４^＋細胞に導入し、該細胞の集団を該配列によって遺伝的
に修飾し、該細胞中で該ポリヌクレオチド配列を発現させ、分化を阻害すること
を含む。該方法はインビトロまたはインビボ（生体内）の方法であってよい。In a seventh embodiment, the present invention provides a method for isolating CD34 ⁺ cells from a hematopoietic cell source and introducing a vector comprising the claimed polynucleotide sequence into the CD34 ⁺ cells, whereby A population of cells is genetically modified by the vector), culturing the modified CD34 ⁺ cells in the presence of at least one cytokine in an amount sufficient to maintain the growth of the modified cells, And a method of inhibiting the differentiation of mammalian hematopoietic stem cells in vitro (in vitro), comprising selecting cells whose overexpression is to inhibit differentiation. In one preferred aspect, the mammalian hematopoietic cells are human. In another preferred aspect, before or after the introduction of the vector, a further phenotype of Thy-1 ⁺ , CD34 ⁺ Thy.
-1 ⁺ , CD34 ⁺ Thy-1 ⁺ Lin ^- or CD34 ⁺ Thy-1 ⁺ CD3
Select CD34 ⁺ cells based on 8 ⁻ . In one preferred aspect, the method of inhibiting differentiation of a mammalian hematopoietic stem cell comprises introducing a vector comprising the claimed polynucleotide sequence into a CD34 ⁺ cell, genetically modifying a population of the cell with the sequence, Expressing said polynucleotide sequence in a cell to inhibit differentiation. The method may be an in vitro or in vivo method.

【００１３】 第八の具体化態様においては、本発明は、請求にかかわるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に適した
条件下で培養し、該宿主細胞培養から該ポリペプチドを回収する工程を包含する
本発明のポリペプチドの製造法に関する。[0013] In an eighth embodiment, the invention relates to a method of culturing a host cell comprising a polynucleotide sequence encoding a polypeptide according to the claims, under conditions suitable for expression of said polypeptide. The present invention relates to a method for producing the polypeptide of the present invention, comprising a step of recovering the polypeptide from the culture.

【００１４】 第九の具体化態様においては、本発明は、請求にかかわるポリペプチドに結合
する抗体に関する。さらに、本発明は、請求にかかわるポリペプチドに対する抗
体を調製し、哺乳動物造血細胞の集団を該抗体に暴露させ、該細胞を該抗体に結
合させ、結合した細胞を選択することからなる、哺乳動物造血幹細胞またはその
子孫を同定・確認する方法に関する。In a ninth embodiment, the invention relates to an antibody that binds to the claimed polypeptide. Further, the present invention comprises preparing an antibody against the claimed polypeptide, exposing a population of mammalian hematopoietic cells to the antibody, binding the cells to the antibody, and selecting the bound cells. The present invention relates to a method for identifying and confirming animal hematopoietic stem cells or their progeny.

【００１５】 本明細書で述べるすべての刊行物および特許出願は、この発明が関連する当業
者の技術水準を示すものである。本明細書で引用したすべての刊行物および特許
出願は、それらの全体を、引用によって、ここに挿入するものとする。この明細
書を通じて、単数形（ａ，ａｎ，ｔｈｅ）は、文脈からそうではないことが明ら
かでないかぎり、複数表示をも含むものとする。 本発明の他の目的、特徴、長所および側面は、当業者にとっては、以下の説明
から明らかとなるであろう。しかしながら、以下の説明および特定の実施例は、
本発明の好ましい具体化態様を示してはいるが、単に説明のために示したもので
あるにすぎないことを了解されたい。開示した発明の精神、範囲内での種々の変
更、修飾が、開示を読めば、当業者にとって容易に明らかとなるであろう。All publications and patent applications mentioned herein are indicative of the state of the art to which this invention pertains. All publications and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Throughout this specification, the singular forms (a, an, the) also include the plural unless the context clearly indicates otherwise. Other objects, features, advantages and aspects of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the following description. However, the following description and specific examples
While preferred embodiments of the present invention have been shown, it should be understood that they have been presented by way of example only. Various changes and modifications within the spirit and scope of the disclosed invention will become readily apparent to those skilled in the art upon reading the disclosure.

【００１６】 添付の図は、本発明のいくつかの具体化態様を示している。それらは説明のた
めのものであるに過ぎず、本明細書においてそれ以外の方法で開示されている本
発明を限定するものではない。The accompanying figures illustrate some embodiments of the present invention. They are for illustration only and do not limit the invention disclosed otherwise herein.

【００１７】 図１は、ＭＩＥベクターを示す。ｃＤＮＡ（大きい矢印）をポリリンカーに挿
入する。転写は５’ＬＴＲから進められる。ＥＧＦＰは選択マーカーとして含ま
せてある。FIG. 1 shows the MIE vector. Insert the cDNA (large arrow) into the polylinker. Transcription proceeds from the 5 'LTR. EGFP is included as a selectable marker.

【００１８】 図２は、ＳＣＭ２６のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示し
ており、配列番号１に相当する。クローンＳＣＭ２６中の挿入ｃＤＮＡは、長さ
が１３１６ヌクレオチドであり、１８残基のポリＡ^＋尾部を含んでいる。５１位
の最初のフレーム内メチオニンから始まり、１０８６位のＴＧＡ停止コドンに終
わる３４５個のアミノ酸の単一の長いオープンリーディングフレームがある。Ｓ
ＣＭ２６は、図３に示されている通り、推定される単一のシグナルペプチド配列
ならびに細胞外アミノ末端および細胞内ＣＯＯＨ末端という細胞表面配置をとら
せる７つの膜貫通ドメインをコードしている。ノーザンブロット分析は、２つの
ＳＣＭ２６転写産物を示す。一方の転写産物は１．５ｋｂであり、第二の転写産
物は２．４ｋｂである。ここで配列決定したｃＤＮＡクローンは、小さい方の転
写産物に相当するものであるが、本発明は、２．４ｋｂ転写産物のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列にも関するものである。FIG. 2 shows the nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of SCM26, corresponding to SEQ ID NO: 1. The inserted cDNA in clone SCM26 is 1316 nucleotides in length and contains an 18-residue polyA ⁺ tail. There is a single long open reading frame of 345 amino acids starting from the first in-frame methionine at position 51 and ending at the TGA stop codon at position 1086. S
CM26 encodes a putative single signal peptide sequence and seven transmembrane domains that assume a cell surface configuration of extracellular amino terminus and intracellular COOH terminus, as shown in FIG. Northern blot analysis shows two SCM26 transcripts. One transcript is 1.5 kb and the second transcript is 2.4 kb. Although the cDNA clone sequenced here corresponds to the smaller transcript, the present invention also relates to the polynucleotide sequence encoding the 2.4 kb transcript polypeptide.

【００１９】 図３において、ＡはＳＣＭ２６および予測シグナルペプチドおよび７つの膜貫
通領域の疎水性プロットを示す。ＢはＳＣＭ２６蛋白質の膜内での予測されるト
ポロジーを示す。ＣはＳＣＭ２６蛋白質がＣＤ３４^＋細胞中で富化されているこ
とを示す。In FIG. 3, A shows the hydrophobicity plot of SCM26 and the predicted signal peptide and the seven transmembrane regions. B shows the predicted topology of the SCM26 protein in the membrane. C indicates that the SCM26 protein is enriched in CD34 ⁺ cells.

【００２０】 図４は、ＳＣＭ３のヌクレオチド配列を示し、配列番号３に相当する。ＳＣＭ
３ｃＤＮＡは、２９９０ヌクレオチドを含み、ポリＡ尾部で終わっている。予測
されるオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８２に始まり、ヌクレオ
チド１７１０で終わり、アミノ酸５４３個からなる蛋白質をコードしている。FIG. 4 shows the nucleotide sequence of SCM3, which corresponds to SEQ ID NO: 3. SCM
The 3 cDNA contains 2990 nucleotides and ends with a poly A tail. The predicted open reading frame encodes a protein consisting of 543 amino acids, beginning at nucleotide 82 and ending at nucleotide 1710.

【００２１】 図５は、ＳＣＭ３蛋白質の特異的特徴を示している、この蛋白質は、アミノ酸
７２にｍｙｂ因子に結合すると予測される領域および９つのＣ２−Ｈ２ファミリ
ーのジンクフィンガー領域を含んでいる。FIG. 5 shows the specific characteristics of the SCM3 protein, which contains a region predicted to bind to the myb factor at amino acid 72 and nine C2-H2 family zinc finger regions.

【００２２】 図６は、２０２７個のヌクレオチドを有し、ヌクレオチド７２から１８８９ま
でのオープンリーディングフレームをもち、６０７アミノ酸からなる予測蛋白質
をコードするＳＣＭ１１３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す（配列
番号５）。FIG. 6 shows the nucleotide and amino acid sequence of SCM113, which has 2027 nucleotides, has an open reading frame from nucleotides 72 to 1889, and encodes a predicted protein consisting of 607 amino acids (SEQ ID NO: 5). .

【００２３】 図７は、液体培養で増殖させ、ＳＣＭ３をコードするポリヌクレオチド配列を
導入した遺伝的修飾細胞の増殖維持を示す。FIG. 7 shows the growth maintenance of genetically modified cells grown in liquid culture and transfected with a polynucleotide sequence encoding SCM3.

【００２４】[0024]

【発明の実施の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

３種の新規ｃＤＮＡが、造血幹細胞（ＨＳＣ）中で富化されることが認められ
る。これらの新規遺伝子をＳＣＭ２６、ＳＣＭ３およびＳＣＭ１１６として開示
し、それぞれ図２、図４および図６に示す。本明細書において、「遺伝子」なる
語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡセグメントを意味する；それは、
コード領域に前後する領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコード
セグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）をも包含する。It is observed that three new cDNAs are enriched in hematopoietic stem cells (HSC). These novel genes are disclosed as SCM26, SCM3 and SCM116 and are shown in FIGS. 2, 4 and 6, respectively. As used herein, the term "gene" refers to a DNA segment involved in the production of a polypeptide chain;
Also encompasses regions surrounding the coding region (leaders and trailers) and intervening sequences (introns) between the individual coding segments (exons).

【００２５】 本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６に示したアミノ酸配列、配列
番号４の残基１−２３９のアミノ酸配列、配列番号４の残基２４０−５４３のア
ミノ酸配列、およびこれらに機能上均等なアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードする単離ポリヌクレオチドを包含する。The present invention provides an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, an amino acid sequence of residues 1-239 of SEQ ID NO: 4, an amino acid sequence of residues 240-543 of SEQ ID NO: 4, And an isolated polynucleotide encoding a polypeptide having a functionally equivalent amino acid sequence thereto.

【００２６】 「単離（された）」なる語は、核酸であれ、アミノ酸配列であれ、もとの環境
から取り除かれまたは分離され、少なくとも６０％、好ましくは７５％、より好
ましくは９０％、とくに好ましくは９５％が自然界では付随していた他の成分で
はない分子をいう。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、均一とい
えるまで精製されていることが好ましい。The term “isolated”, whether a nucleic acid or amino acid sequence, has been removed or separated from its original environment and has at least 60%, preferably 75%, more preferably 90%, Particularly preferably, it refers to a molecule in which 95% is not another component which has been associated in nature. The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably purified to homogeneity.

【００２７】 「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドおよびそれらの断片または部分ならびにゲノム起源または合成起源のＤＮＡま
たはＲＮＡをいい、センス鎖およびアンチセンス鎖を包含する。ＤＮＡの「コー
ド配列」またはある特定の蛋白質を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な
調節配列の制御下に置かれたときに転写され、蛋白質に翻訳されるＤＮＡ配列で
ある。本明細書では、「ポリペプチド」なる語は、蛋白質なる語と互換的に使用
されている。“Nucleic acid sequence” refers to oligonucleotides, nucleotides or polynucleotides and fragments or portions thereof, as well as DNA or RNA of genomic or synthetic origin, and includes the sense and antisense strands. A "coding sequence" of DNA or a nucleotide sequence "encoding a particular protein" is a DNA sequence that is transcribed and translated into a protein when placed under the control of appropriate regulatory sequences. As used herein, the term "polypeptide" is used interchangeably with the term protein.

【００２８】 「機能上均等」なる表現は、図２、４、６に示したＤＮＡ配列の少なくとも一
部により規定されている配列の蛋白質に関連して使用されている。この表現は、
類似の生物学的機能および類似のまたは改善された特異的活性ならびに類似のア
ミノ酸配列を有する蛋白質を意味している。２つのポリペプチドまたはポリヌク
レオチドの間の「類似性」または「一致性(identity)」は、一方のポリペプチド
のアミノ酸配列および保守的又は保存的(conserved) アミノ酸置換体(substitut
es) を第二のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。類似性は
、当該技術分野で周知の手順、たとえばＢＬＡＳＴプログラム（National Cente
r for Biological Informationの Basic Local Alignment Search Tool）によっ
て決定できる。本発明は、配列番号２、４、６のポリペプチドまたはそれらの断
片に少なくとも７５％が一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する
ものである。一致性の度合いは、少なくとも８５％が配列番号２、４、６に示し
た蛋白質またはそれらの断片と一致していることが好ましく、より好ましくは少
なくとも９０％、とくに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なく
とも９７％、もっとも好ましくは少なくとも９９％である。The expression “functionally equivalent” is used in relation to a protein whose sequence is defined by at least a portion of the DNA sequence shown in FIGS. This expression is
A protein having a similar biological function and a similar or improved specific activity and a similar amino acid sequence is meant. "Similarity" or "identity" between two polypeptides or polynucleotides refers to the amino acid sequence and conservative or conserved amino acid substitutions of one of the polypeptides.
es) with the sequence of the second polypeptide. Similarity can be determined by procedures known in the art, such as the BLAST program (National Cente).
r It can be determined by Basic Local Alignment Search Tool of Biological Information. The invention encompasses polypeptides having an amino acid sequence that is at least 75% identical to the polypeptide of SEQ ID NOs: 2, 4, 6 or fragments thereof. As for the degree of identity, it is preferable that at least 85% matches the protein shown in SEQ ID NO: 2, 4, or 6 or a fragment thereof, more preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, and still more preferably. Is at least 97%, most preferably at least 99%.

【００２９】 本明細書において用いた「一致性」なる語は、基準ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドと同じ塩基の百分率からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
いう。たとえば、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも９０％
一致するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、基準ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを構成する塩基または残基の９０％において一致するポリヌクレオ
チド塩基またはアミノ酸残基をもち、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチド
配列を構成する塩基または残基の１０％において異なる塩基または残基を有しう
る。配列一致性の百分率を計算する一つの方法は、最適となるように整列させた
２つの配列を比較窓で比較し、両配列で同じ核酸塩基（たとえばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ
、ＵまたはＩ）が出てくる位置の数を求めて、一致する位置の数を得て、一致位
置の数を比較窓中の位置の数（すなわち窓のサイズ）で除し、１００を乗じて、
配列一致性の百分率を求めることによる。The term “identity” as used herein refers to a polynucleotide or polypeptide consisting of the same percentage of bases as a reference polynucleotide or polypeptide. For example, at least 90% of the reference polynucleotide or polypeptide
A matching polynucleotide or polypeptide has a polynucleotide base or amino acid residue that matches at 90% of the bases or residues that make up the reference polynucleotide or polypeptide, and the bases or amino acids that make up the polynucleotide or polypeptide sequence. 10% of the residues may have different bases or residues. One method of calculating the percent sequence identity is to compare two optimally aligned sequences in a comparison window and to compare the same nucleobase (eg, A, T, C, G) in both sequences.
, U or I), obtain the number of matching positions, divide the number of matching positions by the number of positions in the comparison window (ie, the size of the window), and multiply by 100. hand,
By determining the percentage of sequence identity.

【００３０】 アミノ酸配列に関連して用いる「断片」なる語は、図２、５または６に示した
配列の一部であって、図２、５または６のアミノ酸配列に類似している少なくと
も１０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも５０のアミノ酸残基、さらに好ま
しくは１００のアミノ酸残基、とくに好ましくは２００のアミノ酸残基を有する
配列を意味する。The term “fragment” as used in reference to an amino acid sequence is a portion of the sequence shown in FIG. 2, 5 or 6, wherein at least 10 Of amino acid residues, preferably at least 50 amino acid residues, more preferably 100 amino acid residues, particularly preferably 200 amino acid residues.

【００３１】 バリアント、すなわち断片ポリペプチドおよび断片基準ポリペプチドは、アミ
ノ酸配列において、１つ以上の置換、付加、欠失、切断(truncation)（これらは
任意の組合せで存在していてもよい）によって相違していてよい。好ましいバリ
アントとしては、保守的アミノ酸置換によって基準ポリペプチドと異なるものが
ある。かかる置換は、所与のアミノ酸が性格の類似する他のアミノ酸によって置
換されるものである。以下の非限定的リストは保守的置換（類似）であると考え
られる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン、ｂ）グルタミン酸とアスパラ
ギン酸、ｃ）アスパラギンとグルタミン、ｄ）アルギニンとリジン、ｅ）イソロ
イシン、ロイシン、メチオニンおよびバリンおよびｆ）フェニルアラニン、チロ
シンおよびトリプトファン。とくに高度に好ましいのは、それが相違を示すもと
の基準ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を保持しているバリアントで
ある。Variants, ie, fragment polypeptides and fragment reference polypeptides, are characterized by one or more substitutions, additions, deletions, truncations in the amino acid sequence, which may be present in any combination. May be different. Preferred variants include those that differ from a reference polypeptide by conservative amino acid substitutions. Such substitutions are those in which a given amino acid is replaced by another amino acid of similar character. The following non-limiting list is considered to be conservative substitutions (similar): a) alanine, serine and threonine, b) glutamic acid and aspartic acid, c) asparagine and glutamine, d) arginine and lysine, e) isoleucine, Leucine, methionine and valine and f) phenylalanine, tyrosine and tryptophan. Particularly preferred are those variants that retain the same biological function and activity as the reference polypeptide from which they differ.

【００３２】 本出願の意味する範囲内での「生物学的機能」は、広義に解すべきである。そ
れは、本出願において開示されている特定の機能を包含するが、それらに限定さ
れるものではない。さらに、生物学的機能は、ポリペプチドが生理学的意味合い
で、すなわち生体の一部として、示すもののみではなく、非生理学的環境、たと
えばインビトロ試験系において果たしうる機能をも包含する。たとえば、ＳＣＭ
３遺伝子産物の生物学的機能は、本出願における意味の範囲内では、実施例５で
本質的に記載した通りの液体培養アッセイで測定した細胞増殖を改善する能力で
ある。本出願における意味でのＳＣＭ３遺伝子産物の生物学的機能の他の例は、
実施例８で本質的に記載した通りの造血始原細胞の骨髄性分化を阻害する能力で
ある。“Biological function” within the meaning of the present application should be understood in a broad sense. It includes, but is not limited to, the specific features disclosed in this application. In addition, biological function includes not only what the polypeptide indicates in a physiological sense, ie, as part of a living body, but also includes functions that can be performed in a non-physiological environment, eg, an in vitro test system. For example, SCM
The biological function of the three gene products is, within the meaning of the present application, the ability to improve cell proliferation as measured in a liquid culture assay essentially as described in Example 5. Other examples of the biological function of the SCM3 gene product in the sense of the present application are:
Ability to inhibit myeloid differentiation of hematopoietic progenitor cells essentially as described in Example 8.

【００３３】 本発明は、本発明のポリペプチド、とりわけ配列番号２、４、６のアミノ酸配
列およびそれらの断片をコードするが、ヌクレオチドのコード配列において変異
を有する縮重ポリヌクレオチドＤＮＡ配列を包含する。当該技術分野において周
知の通り、遺伝暗号の縮重は、種々の核酸配列、ＤＮＡおよびＲＮＡが同一の蛋
白質をコードすることを可能にする。たいていの場合、あるアミノ酸は２つ以上
の同義コドンによってコードされる。たとえばアミノ酸アラニンは、ＧＣＵ、Ｇ
ＣＣおよびＧＣＡによってコードされる。本発明は、図２、図５または図６に示
したポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドを包含する。かかるヌ
クレオチド変異体は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または付加を有して
いてもよく、コードされている蛋白質と機能上均等な交互代替性ポリヌクレオチ
ド配列である。これに関連して、「コードする」とは、生物学的諸プロセスにお
いて明確に規定されたヌクレオチド（たとえばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、その他のＲ
ＮＡ分子）配列またはアミノ酸配列を有し、かつそれに由来する生物学的性質を
有する他の重合体および高分子の合成のための鋳型として働く、核酸中の、たと
えば染色体またはｍＲＮＡ中の遺伝子などの、特定のヌクレオチド配列の固有の
性質をいう。たとえば、ある遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの転写および翻
訳が細胞または他の生体系において蛋白質を生じるならば、その遺伝子は蛋白質
をコードしている。ある遺伝子またはｃＤＮＡの、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ
と一致し、普通はそれが配列表に示されるコード鎖と、転写のための鋳型として
利用される非コード鎖とはともに、その遺伝子またはｃＤＮＡの蛋白質その他の
産物をコードしていると言うことができる。ある蛋白質をコードする核酸は、遺
伝暗号の縮重のために異なるヌクレオチド配列を有するが、その蛋白質の同一の
アミノ酸配列をコードするいずれの核酸をも包含する。蛋白質をコードする核酸
およびヌクレオチド配列は、イントロンを含んでいてよい。The present invention encompasses degenerate polynucleotide DNA sequences which encode the polypeptides of the present invention, particularly the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6, and fragments thereof, but which have mutations in the nucleotide coding sequence. . As is well known in the art, the degeneracy of the genetic code allows various nucleic acid sequences, DNA and RNA, to encode the same protein. In most cases, certain amino acids are encoded by more than one synonymous codon. For example, the amino acid alanine is GCU, G
Coded by CC and GCA. The present invention includes polynucleotides that encode variants of the polypeptide shown in FIG. 2, FIG. 5, or FIG. Such nucleotide variants may have one or more nucleotide deletions, substitutions or additions, and are alternate surrogate polynucleotide sequences that are functionally equivalent to the encoded protein. In this context, “encode” refers to a well-defined nucleotide (eg, rRNA, tRNA, other RRNA) in a biological process.
NA molecule), such as a gene in a nucleic acid, such as a chromosome or mRNA, which serves as a template for the synthesis of other polymers and macromolecules having a sequence or amino acid sequence and having biological properties derived therefrom. Refers to the unique properties of a particular nucleotide sequence. For example, a gene encodes a protein if transcription and translation of mRNA produced by the gene produces the protein in a cell or other biological system. The nucleotide sequence of a gene or cDNA is mRNA;
And that it usually encodes the gene or cDNA protein or other product, together with the coding strand shown in the sequence listing and the non-coding strand used as a template for transcription. Can be. Nucleic acids encoding a protein include any nucleic acids that have different nucleotide sequences due to the degeneracy of the genetic code, but that encode the same amino acid sequence of the protein. Nucleic acid and nucleotide sequences encoding a protein may include introns.

【００３４】 本明細書で広義に用いているＳＣＭ遺伝子は任意の種、特に好ましくは、ヒト
を含む哺乳動物、マウスおよびニワトリ、最も特にヒトから得られ、天然、合成
または組換えのいずれの源から得られたものでもよい、実質的に精製されたＳＣ
Ｍペプチドのアミノ酸配列に関するものである。ＳＣＭの発現なる語は、本開示
においては、広く、本発明のポリヌクレオチド配列の発現を意味するために用い
ている。このようにして発現されたポリペプチドをＳＣＭ蛋白質という。The SCM gene used broadly herein is obtained from any species, particularly preferably mammals, including humans, mice and chickens, most particularly humans, and can be of any source, natural, synthetic or recombinant. Substantially purified SC, which may be obtained from
It relates to the amino acid sequence of the M peptide. The term SCM expression is used broadly in this disclosure to mean expression of a polynucleotide sequence of the invention. The polypeptide expressed in this manner is called an SCM protein.

【００３５】 本発明は、さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５のポリヌクレオチド
配列、それらの断片および少なくとも８５％がそれらに一致する配列を含む単離
ＤＮＡ配列を包含する。単離された複数の核酸配列は、緊縮（ストリンジェント
）条件下で図２、４または６の配列とハイブリダイズしうるならば、実質的に類
似している。また、単離された核酸配列は、それらが配列番号１、３、５の配列
またはそれらの断片の配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９７％、もっとも好ましく
は９９％一致するならば、実質的に類似であると考えられる。好ましい一具体化
態様においては、該断片は、配列番号４の残基１−２３９のアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチド、その変異体およびそれらに相補的な配列を包含する。
他の好ましい一具体化態様にあっては、該断片は、配列番号４の残基２４０−５
４３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、その変異体およびそれらに
相補的な配列を包含する。The present invention further encompasses the isolated DNA sequences comprising the polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, fragments thereof and at least 85% sequences corresponding thereto. An isolated nucleic acid sequence is substantially similar if capable of hybridizing under stringent conditions to the sequences of FIG. 2, 4 or 6. Also, the isolated nucleic acid sequences may have at least 85%, preferably at least 90%, the sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or fragments thereof.
More preferably at least 95%, even more preferably 97%, and most preferably 99%, if they match, they are considered substantially similar. In one preferred embodiment, the fragment includes a polynucleotide encoding the amino acid sequence of residues 1-239 of SEQ ID NO: 4, variants thereof and sequences complementary thereto.
In another preferred embodiment, the fragment comprises residues 240-5 of SEQ ID NO: 4.
Includes polynucleotides encoding 43 amino acid sequences, variants thereof and sequences complementary thereto.

【００３６】 ヌクレオチド配列について「断片」なる語を用いるとき、この語は、図２、４
または６に示した配列の一部を含み、少なくとも３０、５０、７５、８０、１０
０またはより多くのヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００、３００、４０
０、５００、６００またはより多くのヌクレオチド、さらに好ましくは８００、
１０００、１５００、２０００またはより多くのヌクレオチドからなるヌクレオ
チド配列を意味する。具体的に図２（ＳＣＭ２６）のヌクレオチド配列の断片に
ついて言えば、その断片は少なくとも１００のヌクレオチド、好ましくは５００
のヌクレオチド、より好ましくは８００のヌクレオチド、とくに好ましくは少な
くとも１０００のヌクレオチドを有するであろう。具体的に図４（ＳＣＭ３）の
ヌクレオチド配列の断片について言えば、その断片は少なくとも１５００のヌク
レオチド、好ましくは２０００のヌクレオチド、とくに好ましくは少なくとも２
５００のヌクレオチドを有するであろう。具体的に図６（ＳＣＭ１１３）のヌク
レオチド配列の断片について言えば、その断片は少なくとも１０００のヌクレオ
チド、好ましくは１５００のヌクレオチド、とくに好ましくは少なくとも２００
０のヌクレオチドを有するであろう。When using the term “fragment” for a nucleotide sequence, the term is used in FIG.
Or at least 30, 50, 75, 80, 10
0 or more nucleotides, preferably at least 200, 300, 40
0, 500, 600 or more nucleotides, more preferably 800,
A nucleotide sequence consisting of 1000, 1500, 2000 or more nucleotides is meant. Referring specifically to the fragment of the nucleotide sequence of FIG. 2 (SCM26), the fragment is at least 100 nucleotides, preferably 500
Of nucleotides, more preferably 800 nucleotides, particularly preferably at least 1000 nucleotides. Referring specifically to the fragment of the nucleotide sequence of FIG. 4 (SCM3), the fragment is at least 1500 nucleotides, preferably 2000 nucleotides, particularly preferably at least 2 nucleotides.
Will have 500 nucleotides. Referring specifically to the fragment of the nucleotide sequence of FIG. 6 (SCM113), the fragment is at least 1000 nucleotides, preferably 1500 nucleotides, particularly preferably at least 200 nucleotides.
Will have zero nucleotides.

【００３７】 本発明はさらに、上に開示したポリヌクレオチドの相補体からなる単離ポリヌ
クレオチドを提供する。相補体なる語は、許容条件下での塩基対合によるポリヌ
クレオチドの結合に関するもので、たとえば「ＡＧＴ」なる配列は相補配列であ
る「ＴＣＡ」に結合する。ポリヌクレオチド配列が緊縮条件下で基準配列、すな
わち配列番号１、３または６もしくはそれらの一部とハイブリダイズすることが
とくに好ましい。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション
を緩衝食塩水中で５０°と６０℃との間で行うという条件である。ハイブリダイ
ゼーションに用いるＤＮＡは、常法によって調製でき、当業界において周知の操
作によって同定可能なプローブを形成することを目標としている。The present invention further provides an isolated polynucleotide consisting of the complement of the above disclosed polynucleotide. The term complement refers to the binding of polynucleotides by base pairing under permissive conditions, for example, the sequence "AGT" binds to the complementary sequence "TCA". It is particularly preferred that the polynucleotide sequence hybridizes under stringent conditions to the reference sequence, ie, SEQ ID NO: 1, 3, or 6, or a portion thereof. Stringent hybridization conditions are such that hybridization is performed between 50 ° and 60 ° C. in buffered saline. DNA used for hybridization can be prepared by a conventional method, and it is aimed at forming an identifiable probe by an operation well known in the art.

【００３８】 通常、所定のイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融解温度（Ｔ_m
）よりも約５〜２０℃低い条件が選択される。Ｔ_m は、標的配列の５０％が相補
性プローブとハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨのもとで）
である。ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡは、常法によって調製でき、当
業界において周知の操作によって同定可能なプローブを形成することを目標とし
ている。Typically, at a given ionic strength and pH, the thermal melting temperature (T _m) for a particular sequence
A condition of about 5 to 20 ° C. lower than that of ()) is selected. _Tm is the temperature (under a given ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to the complementary probe.
It is. DNA used for hybridization can be prepared by a conventional method, and it is aimed at forming an identifiable probe by an operation well known in the art.

【００３９】 アンチセンスなる語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（センス鎖）に対して
相補性であるヌクレオチド配列を意味する。本発明は更に相補的またはアンチセ
ンスポリヌクレオチドを含む。The term antisense refers to a nucleotide sequence that is complementary to a specific DNA or RNA sequence (sense strand). The invention further includes complementary or antisense polynucleotides.

【００４０】 本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、それらの断片、それらに機
能上均等なポリペプチドからなる群から選ばれた予測アミノ酸配列を有する単離
ポリペプチドに関する。一般に、ポリペプチド断片は、図２、５または６のポリ
ペプチド配列と一致する少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５
０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、とくに好まし
くは少なくとも２００個のアミノ酸からなる配列を有しうる。具体的には、つぎ
の好ましい、しかし限定を意味するものではないポリペプチド断片が挙げられる
：配列番号４のアミノ酸残基１−２３９を含むポリペプチド；配列番号４のアミ
ノ酸残基２４０−５４３を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残基２６−
４０を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸残基２５−８２を含むポリペプ
チド；配列番号２のアミノ酸残基１４７−１５７を含むポリペプチド；および配
列番号２のアミノ酸残基２６６−２７５を含むポリペプチド。The present invention relates to an isolated polypeptide having a predicted amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, fragments thereof, and polypeptides functionally equivalent thereto. Generally, a polypeptide fragment will have at least 10 amino acids, preferably at least 5 amino acids, consistent with the polypeptide sequence of FIG.
It may have a sequence consisting of 0 amino acids, more preferably at least 100 amino acids, particularly preferably at least 200 amino acids. Specific examples include the following preferred, but not limiting, polypeptide fragments: a polypeptide comprising amino acid residues 1-239 of SEQ ID NO: 4; amino acid residues 240-543 of SEQ ID NO: 4. A polypeptide comprising; amino acid residue 26- of SEQ ID NO: 2;
A polypeptide comprising amino acid residues 25-82 of SEQ ID NO: 2; a polypeptide comprising amino acid residues 147-157 of SEQ ID NO: 2; and a polypeptide comprising amino acid residues 266-275 of SEQ ID NO: 2. peptide.

【００４１】 図２、５または６の機能上均等なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が
保守的または非保守的アミノ酸残基によって置換されているものまたは１つ以上
のアミノ酸残基が置換基を含んでいるものといった変異体である。保守的置換と
は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の相互の置換；ヒ
ドロキシ残基ＳｅｒとＴｈｒとの相互交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換；
アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換；
および芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間の置換である。The functionally equivalent polypeptide of FIG. 2, 5 or 6 has one or more amino acid residues replaced by conservative or non-conservative amino acid residues or one or more amino acid residues. Variants such as those containing a substituent. A conservative substitution is a mutual substitution between the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu and Ile; a substitution between the hydroxy residues Ser and Thr; a substitution between the acidic residues Asp and Glu;
Substitution between the amide residues Asn and Gln; exchange of the basic residues Lys with Arg;
And the substitution between the aromatic residues Phe and Tyr.

【００４２】 さらに、本発明は、図２、５、６に示したポリペプチド配列、それらの断片お
よびそれらに機能上均等なポリペプチドと少なくとも７５％の一致性を有するポ
リペプチド配列を対象とする。一具体化態様では、それらポリペプチドは、図２
、５、６に示したアミノ酸配列または図５のアミノ酸残基１−２３９または２４
０−５４３を含む断片と少なくとも８５％の一致性、好ましくは少なくとも９０
％の一致性、より好ましくは少なくとも９５％の一致性、さらに好ましくは少な
くとも９７％の一致性、とくに好ましくは少なくとも９９％の一致性を有する。Further, the present invention is directed to the polypeptide sequences shown in FIGS. 2, 5, and 6, fragments thereof, and polypeptide sequences having at least 75% identity to polypeptides functionally equivalent thereto. . In one embodiment, the polypeptides are represented in FIG.
5, amino acid residues 1-239 or 24 of FIG.
At least 85% identity to the fragment containing 0-543, preferably at least 90%
%, More preferably at least 95%, even more preferably at least 97%, particularly preferably at least 99%.

【００４３】 ＳＣＭをコードする配列を構築物として宿主細胞へ導入してもよいが、好まし
い一具体化態様では、ＳＣＭコード配列をベクター中に配置する。「ベクター」
なる語は、新規な遺伝子またはＤＮＡセグメントを細胞内へ運ぶために用いる物
質（媒体）を意味する。ベクターは、挿入されたコード配列の転写および翻訳の
ために必要な要素を含んでいる。構築物またはベクター中に含まれる好ましいポ
リヌクレオチドは、ＳＣＭ３、ＳＣＭ２６、ＳＣＭ１１３をコードする配列およ
びそれらに対して少なくとも８５％の一致性、好ましくはそれらに対して少なく
とも９０％の一致性をもつ機能上均等な配列である。ベクターの構築に用いる方
法は、既知であって、種々の刊行物中に記載されている。とくに、適当なベクタ
ーを構築する手法が、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
.Y. (1989)中でかなり詳細に解説されている。Although the sequence encoding the SCM may be introduced into the host cell as a construct, in one preferred embodiment, the SCM coding sequence is located in a vector. "vector"
The term refers to the substance (vehicle) used to carry a novel gene or DNA segment into a cell. Vectors contain the necessary elements for the transcription and translation of the inserted coding sequence. Preferred polynucleotides contained in the constructs or vectors are SCM3, SCM26, SCM113 encoding sequences and functionally equivalent with at least 85% identity thereto, preferably at least 90% identity thereto. Array. The methods used for the construction of the vectors are known and have been described in various publications. In particular, a technique for constructing an appropriate vector is described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man.
ual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
It is described in considerable detail in .Y. (1989).

【００４４】 ベクターとしては、バキュロウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、ア
デノ関連ウィルスおよび単純ヘルペスウィルスなどのウィルスベクター；バクテ
リオファージ；コスミド；プラスミドベクター；合成ベクター；および当業界に
おいて一般的に用いられるその他の組換えベヒクルが挙げられるが、これらに限
定されるものではない。好ましい一具体化態様にあっては、調節配列に機能可能
に連結されたポリペプチドを包含する。調節配列は、プロモーター、エンハンサ
ー、ポリアデニル化シグナル、および他の発現調節因子を含む。プロモーターは
原核生物または真核生物のプロモーターであってよい。ベクターはさらに、カル
ボキシ末端アミノ酸の３’に位置するポリアデニル化シグナルを含む。プロモー
ターとポリヌクレオチドを機能可能に連結導入できるクローニング部位との両者
を含むベクターは当業界で周知である。かかるベクターは、インビトロおよびイ
ンビボでＲＮＡを転写でき、Stratagene社（La Jolla, CA）および Promega Bio
tech社（Madison, WI）などの供給源から商業的に入手可能である。具体例とし
ては、Stratagene社からのｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸｔ１および Pharmacia
社からのｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＰＶおよびｐＳＶＫ３が挙げられる。発現お
よび／またはインビトロ転写を最適化するために、転写または翻訳のレベルで発
現に干渉したり、発現を減少させるかもしれない潜在的に余分な不適切な代替的
翻訳開始コドンまたは他の配列を排除するために、クローンの５’および／また
は３’非翻訳部を除去、付加または改変することが必要な場合がある。他の方法
として、発現を増強するために、共通のリボソーム結合部位を開始コドンの５’
に直接挿入することができる。誘導的調節系および構成的調節配列はともに、種
々の細胞タイプにおいて機能することが当業界で既知である。[0044] Vectors include viral vectors such as baculovirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus and herpes simplex virus; bacteriophages; cosmids; plasmid vectors; Replacement vehicles include, but are not limited to. One preferred embodiment includes a polypeptide operably linked to a regulatory sequence. Regulatory sequences include promoters, enhancers, polyadenylation signals, and other expression control elements. The promoter may be a prokaryotic or eukaryotic promoter. The vector further contains a polyadenylation signal located 3 'of the carboxy-terminal amino acid. Vectors containing both a promoter and a cloning site into which a polynucleotide can be operably linked are well known in the art. Such vectors are capable of transcribing RNA in vitro and in vivo, and are available from Stratagene (La Jolla, CA) and Promega Bio
It is commercially available from sources such as tech (Madison, WI). Specific examples include pSG, pSV2CAT, pXt1, and Pharmacia from Stratagene.
PMSG, pSVL, pBPV and pSVK3 from the company. In order to optimize expression and / or in vitro transcription, potentially extra inappropriate alternative translation initiation codons or other sequences that may interfere with or reduce expression at the level of transcription or translation. In order to eliminate, it may be necessary to remove, add or modify the 5 'and / or 3' untranslated portions of the clone. Alternatively, a common ribosome binding site may be added 5 ′ of the start codon to enhance expression.
Can be inserted directly into Both inducible regulatory systems and constitutive regulatory sequences are known in the art to function in various cell types.

【００４５】 好ましいベクターとしては、レトロウィルスベクター（Coffin et al., “Ret
roviruses”, (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press第９章第４３７−
４７３頁参照）である。本発明で有用なベクターは、当該技術分野ですでに教示
されている操作によって組換え的に製出できる。ＷＯ９４／２９４３８、ＷＯ９
７／２１８２４およびＷＯ９７／２１８２５は、レトロウィルスパッケージング
プラスミドおよびパッキング細胞系の構築を記載している。ベクターの例として
は、ｐＣＭＶ６ｂおよびｐＣＭＶ６ｃ（Chiron Corp.)、ｐＳＦＦＶ−Ｎｅｏお
よびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｓｋ＋などの哺乳動物発現ベクターが挙げられる
。有用なレトロウィルスベクターの、限定を意味するものではない例は、マウス
、鳥類または霊長類レトロウィルスから導かれたものである。普通のレトロウィ
ルスはモロニーマウス白血病ウィルスに基づいたもの（ＭｏＭＬＶベクター）で
ある。他のＭｏＭＬＶ由来ベクターとしては、Ｌｍｉｌｙ、ＬＩＮＧＦＥＲ、Ｍ
ＩＮＧＦＲおよびＭＩＮＴが挙げられる（Chang et al., Blood 92:1-11 (1998)
）。さらなるベクターとしては、ギボンサル白血病ウィルス（ＧＡＬＶ）および
モロニーマウス肉腫ウィルス（ＭｏＭＳＶ）および脾臓フォーカス形成ウィルス
（ＳＦＦＶ）に基づいたものがある。マウス幹細胞ウィルス（ＭＥＳＶ）由来の
ベクターとしては、ＭＥＳＶ−ＭｉＬｙ（Agarwal et al., J. of Virology, 72
:3720-3728(1998)）が挙げられる。レトロウィルスベクターには、レンチウィル
スに基づいたベクターが含まれ、限定を意味するものではない例として、ヒト免
疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）に基づいたベクターが挙げられ
る。宿主の範囲、代替的細胞表面受容体の使用などの親レトロウィルスの特定の
性質を利用すべく、新規なベクター系が引き続いて開発されている。本発明は特
定のレトロウィルスベクターに限定されるものではなく、いかなるレトロウィル
スベクターをも包含しうる。とくに好ましいベクターとしては、２つの長い末端
反復配列およびパッケージシグナルに相当するマウスウィルスからのＤＮＡを含
むものである。一具体化態様にあっては、該マウスウィルスベクターはＭｏＭＬ
ＶまたはＭＳＣＶに由来するものである。Preferred vectors include retroviral vectors (Coffin et al., “Ret.
roviruses ”, (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press Chapter 9, Chapter 437-
473). Vectors useful in the present invention can be produced recombinantly by procedures already taught in the art. WO94 / 29438, WO9
7/21824 and WO 97/21825 describe the construction of retroviral packaging plasmids and packing cell lines. Examples of vectors include mammalian expression vectors such as pCMV6b and pCMV6c (Chiron Corp.), pSFFV-Neo and pBluescript-Sk +. Non-limiting examples of useful retroviral vectors are those derived from a mouse, bird or primate retrovirus. A common retrovirus is based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV vector). Other MoMLV-derived vectors include Lmily, LINGFER, M
INGFR and MINT (Chang et al., Blood 92: 1-11 (1998)
). Additional vectors include those based on the gibbon monkey leukemia virus (GALV) and Moloney murine sarcoma virus (MoMSV) and spleen focus-forming virus (SFFV). As a vector derived from mouse stem cell virus (MESV), MESV-MiLy (Agarwal et al., J. of Virology, 72)
: 3720-3728 (1998)). Retroviral vectors include lentivirus-based vectors, non-limiting examples of which include vectors based on the human immunodeficiency viruses (HIV-1 and HIV-2). New vector systems are continually being developed to take advantage of certain properties of the parent retrovirus, such as the range of the host and the use of alternative cell surface receptors. The present invention is not limited to a particular retroviral vector, but may include any retroviral vector. Particularly preferred vectors are those containing the two long terminal repeats and the DNA from the mouse virus corresponding to the package signal. In one embodiment, the mouse virus vector is MoML
V or MSCV.

【００４６】 レトロウィルスベクター構築物を製出するに当たっては、ウィルスのｇａｇ、
ｐｏｌおよびｅｎｖ配列をウィルスから除去して、外来ＤＮＡ配列挿入のための
空間をつくりだすのが普通である。外来ＤＮＡによってコードされた遺伝子は、
通常、長い末端反復配列（ＬＴＲ）中の強力なウィルスプロモーターの制御下に
発現される。適切な制御調節配列の選択は、使用する宿主細胞に依存するが、選
択は当業者の技術の範囲内である。ＬＴＲのプロモーターに加えて多くのプロモ
ーターが知られている。限定を意味するものではない例として、ファージラムダ
ＰＬプロモーター、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、
モロニーマウス肉腫ウィルス（ＭＭＳＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）また
は脾臓フォ−カス形成ウィルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域プロモーター；グランザ
イムＡプロモーター；グランザイムＢプロモーター；ＣＤ３４プロモーターおよ
びＣＤ８プロモーターが挙げられる。さらに、誘導的または多重(multiple)制御
因子を用いることができる。In producing a retroviral vector construct, viral gag,
It is common to remove pol and env sequences from the virus to create space for insertion of foreign DNA sequences. The gene encoded by the foreign DNA is
It is usually expressed under the control of a strong viral promoter in the long terminal repeat (LTR). The choice of the appropriate regulatory control sequence depends on the host cell used, but the choice is within the skill of the art. Many promoters are known in addition to LTR promoters. Non-limiting examples include the phage lambda PL promoter, the human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter,
Moloney mouse sarcoma virus (MMSV), Rous sarcoma virus (RSV) or spleen focus-forming virus (SFFV) U3 region promoter; Granzyme A promoter; Granzyme B promoter; CD34 promoter and CD8 promoter. In addition, inducible or multiple regulators can be used.

【００４７】 かかる構築物は、パッキング細胞系によってｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ機能
がトランスにもたらされるならば、ウィルス粒子中に効率的にパックされること
ができる。それゆえ、ベクター構築物をパッケージング細胞中に導入するときに
は、細胞によって産生されたｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ蛋白質がベクターＲＮ
Ａと会合して、感染性のビリオンを生じ、これらは培地中へ分泌される。このよ
うにして産生されたウィルスは、標的細胞に感染し、そのＤＮＡ中へ組み込まれ
るが、それは必須のパッケージング配列を欠いているので、感染性のウィルス粒
子を産生しない。現在使用されているパッキング細胞系のほとんどは、各々に必
要なコード配列の一つを含む別々のプラスミドによってトランスフェクトされて
おり、複製コンピテントウィルスが産生されうる前に、多重組換え事象が必要で
ある。これに代えて、パッケージング細胞系にプロウィルスを含有させる。（感
染細胞のゲノムＤＮＡ中へいったん組み込まれたときの逆転写されたＲＮＡのＤ
ＮＡ形態）。プロウィルスは能力が劣っているので、感染性ウィルスを組み立て
るのに必要なすべての蛋白質を産生できても、それ自身のＲＮＡはウィルス中に
パッケージされえない。その代わり、組換えウィルスから産生されたＲＮＡはパ
ッケージされる。それゆえ、パッケージング細胞から放出されたウィルス株は、
組換えウィルスのみを含んでいる。レトロウィルスパッケージング系統の例とし
ては、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、ＰＥ５０１、ＰＧ１３、ΨＣＲＩＰ、ＲＤ１１４
、ＧＰ７Ｃ−ｔＴＡ−Ｇ１０、ＰｒｏＰａｋ−Ａ（ＰＰＡ−６）およびＰＴ６７
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。以下を参照されたい：Mill
er et al., Mol. Cell Biol. 6:2895 (1986); Miller et al., Biotechniques 7
:980 (1989); Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460 (1988); Pe
ar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396 (1993); Rigg et al.,V
irology 218 (1996));および Finer et al., Blood 83:43-50 (1994)。Such a construct can be efficiently packed into viral particles provided that the gag, pol and env functions are provided in trans by the packing cell line. Therefore, when introducing the vector construct into the packaging cell, the gag-pol and env proteins produced by the cell are transformed into the vector RN.
A associates with A to produce infectious virions, which are secreted into the medium. The virus thus produced infects the target cell and integrates into its DNA, but does not produce infectious viral particles because it lacks essential packaging sequences. Most of the currently used packing cell lines have been transfected with separate plasmids, each containing one of the necessary coding sequences, requiring multiple recombination events before a replication competent virus can be produced. It is. Alternatively, the packaging cell line contains the provirus. (D of reverse transcribed RNA once integrated into genomic DNA of infected cells
NA form). Because the provirus is less capable, it can produce all the proteins needed to assemble an infectious virus, but its own RNA cannot be packaged into the virus. Instead, the RNA produced from the recombinant virus is packaged. Therefore, the virus strain released from the packaging cells,
Contains only recombinant virus. Examples of retroviral packaging strains include PA12, PA317, PE501, PG13, @CRIP, RD114
, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6) and PT67
But are not limited to these. See: Mill
er et al., Mol.Cell Biol. 6: 2895 (1986); Miller et al., Biotechniques 7
: 980 (1989); Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460 (1988); Pe
Natl.Acad.Sci. USA 90: 8392-8396 (1993); Rigg et al., V
irology 218 (1996)); and Finer et al., Blood 83: 43-50 (1994).

【００４８】 さらに、好ましいベクターとしては、アデノウィルスベクター（Frey, B. M.e
t al., Blood, 91:2781 (1998)およびＷＯ９５／２７０７１参照）およびアデノ
関連ウィルスベクター（Chatterjee et al., Current Topics in Microbiol.and
Immunol., 218:61-73, 1996 参照）が挙げられる。下記も参照されたい： Stem
Cell Biology and Gene Therapy (Quesenberry ら編）, John Wiley & Sons, 1
998中の Shenk, Chapter 6, 161-178, Breakefield et al., Chapter 8, 201-23
5; Kroner-Lux et al., Chapter 9, 235-256 およびＵＳ特許第５６９３５３１
号および第５６９１１７６号。アデノウィルス由来ベクターの使用は、それらが
***しない細胞を感染することができず、レトロウィルスＤＮＡと異なり、アデ
ノウィルスＤＮＡは標的細胞のゲノム中に組み込まれないから、ある状況下では
有利でありうる。さらに、外来ＤＮＡを担持する能力が、アデノウィルスベクタ
ーではレトロウィルスベクターよりずっと大きい。アデノ関連ウィルスベクター
がもう一つの有用な送達系である。このウィルスのＤＮＡは非***細胞中へ組み
込まれることができ、アデノ関連ウィルスベクターを用いて多数のポリヌクレオ
チドが成功裏に種々の細胞タイプ中へ導入されている。Further, preferred vectors include adenovirus vectors (Frey, BMe
etal., Blood, 91: 2781 (1998) and WO 95/27071) and adeno-associated virus vectors (Chatterjee et al., Current Topics in Microbiol.and
Immunol., 218: 61-73, 1996). See also: Stem
Cell Biology and Gene Therapy (ed. By Quesenberry et al.), John Wiley & Sons, 1
Shenk, Chapter 6, 161-178, Breakefield et al., Chapter 8, 201-23 in 998
5; Kroner-Lux et al., Chapter 9, 235-256 and US Pat. No. 5,693,531.
No. and 5,691,176. The use of adenovirus-derived vectors may be advantageous in some situations because they cannot infect cells that do not divide and, unlike retroviral DNA, adenoviral DNA does not integrate into the genome of target cells. In addition, the ability to carry foreign DNA is much greater with adenovirus vectors than with retroviral vectors. Adeno-associated viral vectors are another useful delivery system. The viral DNA can be integrated into non-dividing cells, and a number of polynucleotides have been successfully introduced into various cell types using adeno-associated virus vectors.

【００４９】 一具体化態様では、構築物またはベクターは、つぎの２つ以上の異種核酸配列
を含む：ａ）本発明のポリペプチドをコードする核酸配列およびｂ）１つ以上の
追加の核酸配列。追加の核酸配列は、選択マーカー、構造遺伝子、治療用遺伝子
、リボザイムまたはアンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドであること
が好ましい。[0049] In one embodiment, the construct or vector comprises two or more heterologous nucleic acid sequences: a) a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the invention and b) one or more additional nucleic acid sequences. Preferably, the additional nucleic acid sequence is a polynucleotide encoding a selectable marker, a structural gene, a therapeutic gene, a ribozyme or an antisense sequence.

【００５０】 選択マーカーは、成功裏の遺伝的修飾をモニターするためおよびＤＮＡが組み
込まれた細胞の選択のために、構築物またはベクターに含有させることができる
。限定を意味するものではない例として、Ｇ１４８またはハイグロマイシンなど
の薬剤耐性マーカーが挙げられる。さらに、たとえばマーカーがＨＳＶ−ｔｋ遺
伝子であるような、負の選択を用いてもよい。この遺伝子は、アシクロビル、ガ
ンシクロビルなどの薬剤に対して細胞を感受性にする。たとえば蛍光活性化細胞
選別（ＦＡＣＳ）法によってＳＣＭの過剰発現を選択するために、細胞表面マー
カーを用いて選択を行うこともできる。通例ＮｅｏＲ（ネオマイシン／Ｇ１４８
耐性）遺伝子が用いられるが、標的細胞中にすでに存在してはいない遺伝子配列
の任意の便利なマーカー遺伝子を使用することができる。さらに、限定を意味す
るものではない例として、低親和性神経増殖因子（ＮＧＦＲ）、増強蛍光グリー
ン蛋白質（ＥＦＧＰ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）、細菌ｈｉｓ
Ｄ遺伝子、マウスＣＤ２４遺伝子（ＨＳＡ）、マウスＣＤ８ａ（ｌｙｔ）遺伝子
、ピューロマイシンまたはフレオマイシンに対する抵抗性を付与する細菌遺伝子
、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。A selectable marker can be included in the construct or vector to monitor for successful genetic modification and to select for cells that have incorporated the DNA. Non-limiting examples include drug resistance markers such as G148 or hygromycin. In addition, a negative selection may be used, for example, where the marker is the HSV-tk gene. This gene sensitizes cells to drugs such as acyclovir and ganciclovir. Selection can also be performed using cell surface markers, for example, to select for overexpression of SCM by fluorescence activated cell sorting (FACS). Usually NeoR (neomycin / G148
Resistance) gene can be used, but any convenient marker gene of the gene sequence that is not already present in the target cell can be used. Further non-limiting examples include low affinity nerve growth factor (NGFR), enhanced fluorescent green protein (EFGP), dihydrofolate reductase gene (DHFR), bacterial his
D gene, mouse CD24 gene (HSA), mouse CD8a (lyt) gene, a bacterial gene that confers resistance to puromycin or phleomycin, and β-galactosidase.

【００５１】 遺伝子治療においては、生体内で異種の遺伝物質を発現する細胞が使用される
。先天性遺伝病の場合、該遺伝物質は、正常蛋白質の遺伝子であることが好適で
ある。さらに、該遺伝子は、防護性蛋白質のものであってもよく、または該遺伝
子は、リボソームまたはアンチセンス配列などの防護性ＲＮＡをコードしていて
もよい。遺伝子治療は、生体内であってよく、対象者にベクターを投与して、宿
主細胞がその場で形質転換されるようにしてもよく、または標的細胞をインビト
ロで形質転換したのち対象者中へ導入する生体外のものでもよい。In gene therapy, cells that express heterologous genetic material in a living body are used. In the case of a congenital genetic disease, the genetic material is preferably a gene of a normal protein. Further, the gene may be of a protective protein, or the gene may encode a protective RNA, such as a ribosome or an antisense sequence. Gene therapy can be in vivo, by administering the vector to a subject so that the host cells are transformed in situ, or by transforming the target cells in vitro and then into the subject. It may be an ex vivo one to be introduced.

【００５２】 構造遺伝子は、遺伝子全体であっても、遺伝子の機能上活性な断片のみであっ
てもよい。構造遺伝子としては、たとえば、細胞の分化を調節する遺伝子または
患者における欠損のある内在性遺伝子から生じる欠損を補償しうる治療用遺伝子
が挙げられる。治療用遺伝子は、感染因子の産生または機能に拮抗するもの、病
的過程に拮抗するもの、宿主の遺伝体質を改善するもの、または組織移植を容易
にするものであってよい。治療用遺伝子または遺伝子配列の具体例は、アデノシ
ンデアミナーゼ欠乏（ＡＤＡ）；鎌状赤血球貧血；リコンビナーゼ（組換え酵素
）欠乏；リコンビナーゼ調節遺伝子欠乏；ＨＩＶの治療に効果的なものであり、
たとえばアンチセンスまたはトランス優性ＲＥＶ遺伝子または単純ヘルペスウィ
ルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）を担持している遺伝子である。The structural gene may be the entire gene or only a functionally active fragment of the gene. Structural genes include, for example, genes that regulate cell differentiation or therapeutic genes that can compensate for deficiencies arising from defective endogenous genes in patients. The therapeutic gene may be one that antagonizes the production or function of the infectious agent, one that antagonizes a pathological process, one that improves the genetic constitution of the host, or one that facilitates tissue transplantation. Specific examples of therapeutic genes or gene sequences are those that are effective in treating adenosine deaminase deficiency (ADA); sickle cell anemia; recombinase (recombinase) deficiency; recombinase-regulated gene deficiency;
For example, an antisense or transdominant REV gene or a gene carrying the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk).

【００５３】 ヒトの患者の場合、治療用遺伝子は、高い相同性を示し、ヒトで生物学的に同
一または均等な機能を示す密接に関連した種の遺伝子も、それが受容者において
不都合な免疫反応を生じなければ、使用できるけれども、通常はヒト起源のもの
である。第二のポリヌクレオチドは、新規な抗原または薬剤抵抗性の遺伝子をコ
ードしていてもよく、または癌性細胞を特異的に殺すのに有効な毒素またはアポ
トーシス誘発物質をコードしていてもよく、あるいは癌性造血細胞に対する特異
的自殺遺伝子が含まれていてもよい。In human patients, the therapeutic gene shows high homology, and genes of closely related species that show biologically identical or equivalent function in humans also have adverse immune effects in the recipient. It can be used if it does not produce a reaction, but is usually of human origin. The second polynucleotide may encode a novel antigen or drug resistance gene, or may encode a toxin or apoptosis-inducing substance effective to specifically kill cancerous cells, Alternatively, it may contain a suicide gene specific for cancerous hematopoietic cells.

【００５４】 核酸配列または治療用遺伝子の治療上の有効量は、投与して、所望の結果を達
成するのに必要な期間にわたっての有効な量である。この量は、対象者の性、年
齢、体重などを含む（ただし、これらに限定されない）種々の因子に応じて変わ
りうる。A therapeutically effective amount of a nucleic acid sequence or therapeutic gene is an amount that is effective over the period required to administer and achieve the desired result. This amount can vary depending on various factors, including, but not limited to, the sex, age, weight, etc. of the subject.

【００５５】 追加のポリヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列と同じベクターに乗せて宿主細胞に導入しても、追加のポリヌクレ
オチド配列を第二のベクターに乗せて宿主細胞に導入してもよい。好ましい一具
体化態様においては、ＳＣＭをコードする核酸配列と同じベクターに選択マーカ
ーを含ませる。他の具体化態様では、ベクターは、ＳＣＭをコードするポリヌク
レオチド、選択マーカーおよび治療用遺伝子を含む少なくとも３つのコード配列
を含む。The additional polynucleotide sequence may be introduced into the host cell on the same vector as the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention, or the additional polynucleotide sequence may be placed on the second vector May be introduced. In one preferred embodiment, the selectable marker is included in the same vector as the nucleic acid sequence encoding SCM. In another embodiment, the vector comprises at least three coding sequences, including a polynucleotide encoding a SCM, a selectable marker and a therapeutic gene.

【００５６】 本発明の宿主標的細胞は哺乳動物細胞であり、これらには、ヒト、マウス、サ
ル、家畜、スポーツ用動物、ペット、他の実験用齧歯動物および実験動物が包含
されるが、これらに限定されるものではない。とくに好ましい動物はヒト、マウ
スおよびウサギである。好ましい細胞は、造血、筋肉、上皮、神経、肝、胎児お
よび骨幹細胞などの種々の細胞タイプの幹細胞、とくにＨＳＣである。幹細胞は
自己再生***をすることができ、分化された子孫を与える。それらまたはそれら
の子孫は、生体内治療のための移植可能性を含んでいる。造血幹細胞は多能であ
り、インビトロでＣＡＦＣ活性の存在によって定義することもできる。一般的に
はつぎを参照されたい：Potten C.S. 編、Stem Cells, Academic Press, 1997;S
tem Cell Biology and Gene Therapy, Quesenberry et al.編、John Wiley & So
ns Inc., 1998;および Gage et al., Ann. Rev. Neurosci. 18:159-192, 1995。The host target cells of the present invention are mammalian cells, including humans, mice, monkeys, livestock, sports animals, pets, other laboratory rodents and experimental animals, It is not limited to these. Particularly preferred animals are humans, mice and rabbits. Preferred cells are stem cells of various cell types, such as hematopoietic, muscle, epithelial, neuronal, hepatic, fetal and bone stem cells, especially HSCs. Stem cells are capable of undergoing self-renewal division and provide differentiated progeny. They or their progeny include transplantability for in vivo treatment. Hematopoietic stem cells are pluripotent and can also be defined in vitro by the presence of CAFC activity. See generally: Potten CS, Stem Cells, Academic Press, 1997; S
tem Cell Biology and Gene Therapy, Quesenberry et al. Ed., John Wiley & So
ns Inc., 1998; and Gage et al., Ann. Rev. Neurosci. 18: 159-192, 1995.

【００５７】 とくに好ましい宿主細胞としては、造血細胞が挙げられる。これらの細胞は、
造血幹細胞、赤血球、好中球、単球、血小板、マスト細胞、好酸球および好塩基
球、ＢおよびＴリンパ球およびＮＫ細胞ならびにそれぞれの系列始原細胞を包含
する。Ｔ細胞は、リンパ球の一つのタイプとして定義され、造血幹細胞から発生
すると考えられている。胸腺細胞、ヘルパーＴ細胞、インデューサーＴ細胞、サ
プレッサーＴ細胞またはＴ細胞のその他のいずれかの部分集合を含めて、多くの
タイプのＴ細胞がある。本明細書で使用した前駆または始原細胞なる語は、もは
や幹細胞ではないがいまだ最終的に分化した細胞とはなっていない細胞集団を指
す。前駆細胞なる語に関連してのリンパ系、骨髄系または赤血球系なる語は、該
前駆細胞が成熟してそれになりうる潜在的細胞集団を指す。ヒトの造血幹細胞、
Ｔ細胞およびリンパ系、骨髄系または赤血球系の始原細胞は、とくに好ましい宿
主細胞である。Particularly preferred host cells include hematopoietic cells. These cells are
Includes hematopoietic stem cells, erythrocytes, neutrophils, monocytes, platelets, mast cells, eosinophils and basophils, B and T lymphocytes and NK cells and their lineage progenitor cells. T cells are defined as one type of lymphocyte and are thought to arise from hematopoietic stem cells. There are many types of T cells, including thymocytes, helper T cells, inducer T cells, suppressor T cells or any other subset of T cells. As used herein, the term progenitor or progenitor cells refers to a cell population that is no longer a stem cell but has not yet become a terminally differentiated cell. The terms lymphoid, myeloid or erythroid in connection with the term progenitor cells refer to a potential cell population in which the progenitor cells can mature and become. Human hematopoietic stem cells,
T cells and progenitor cells of the lymphoid, myeloid, or erythroid lineages are particularly preferred host cells.

【００５８】 造血細胞および幹細胞を取得する方法は、当業界において周知であり、ここで
は詳細に繰り返すことはしない。一般に、幹細胞および始原細胞の単離方法は、
身体の造血組織中の、とくに骨髄中の、他の細胞からの単離を包含する。骨髄か
らの幹細胞および始原細胞は、造血細胞の総数のごく小さいパーセンテージを構
成しているだけである。幹細胞は、骨髄細胞の約０．０１〜約０．１％の範囲内
にあると思われる。骨髄細胞は、腸骨、胸骨、脛骨、大腿棘(femora spine)およ
びその他の骨腔(bone cavities)から得ることできる、その他の造血幹細胞源と
しては、胚卵黄嚢、胎児肝、胎児および成人脾、成人末梢血および臍帯血を含む
血液が挙げられる（To et al., Blood 89:2233-2258 (1997)）が、これらに限定
されるものではない。[0058] Methods for obtaining hematopoietic cells and stem cells are well known in the art and will not be repeated here in detail. Generally, methods for isolating stem cells and progenitor cells include:
Includes isolation from other cells in the body's hematopoietic tissue, especially in the bone marrow. Stem cells and progenitor cells from the bone marrow make up only a small percentage of the total number of hematopoietic cells. Stem cells appear to be in the range of about 0.01 to about 0.1% of bone marrow cells. Bone marrow cells can be obtained from the iliac, sternum, tibia, femora spine and other bone cavities; other sources of hematopoietic stem cells include embryonic yolk sac, fetal liver, fetal and adult spleen And blood including adult peripheral blood and cord blood (To et al., Blood 89: 2233-2258 (1997)).

【００５９】 骨髄の単離のためには、骨を洗うために適当な溶液を用いることができ、ウシ
胎児血清または他の天然因子を許容できる低濃度、通常は約５〜２５ｍＭの緩衝
剤と共に補足した塩溶液が挙げられるが、これに限定されるものではない。緩衝
剤としては、ＨＥＰＥＳ、燐酸塩および乳酸塩緩衝剤が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。骨髄は、常法に従って骨から吸引することもできる。For the isolation of bone marrow, a suitable solution can be used to wash the bone, with fetal bovine serum or other natural factors at an acceptably low concentration, usually about 5-25 mM with buffer. Supplementary salt solutions include, but are not limited to. Buffers include, but are not limited to, HEPES, phosphate and lactate buffers. Bone marrow can also be aspirated from bone according to conventional methods.

【００６０】 造血細胞を他の細胞から分離するやり方は、本発明にとって重要ではない。種
々の操作を採用することができ、物理的分離、抗体被覆磁気ビーズを用いての磁
気的分離、アフィニティークロマトグラフィー、およびモノクローナル抗体に結
合させたまたはモノクローナル抗体と共に使用する細胞毒性物質などが挙げられ
る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の使用も包含され、そこでは、特定の抗原
の染色のレベルに基づいて細胞を分離することができる。これらの手法は当業者
にとっては周知であり、ＵＳ特許第５０６１６２０号、第５４０９８２１３号、
第５６７７１３６号、および第５７５０３９７号ならびに Yau et al., Exp. He
matol, 18:219-222 (1990)を含む種々の文献に記載されている。The manner in which hematopoietic cells are separated from other cells is not critical to the invention. Various procedures can be employed, including physical separation, magnetic separation using antibody-coated magnetic beads, affinity chromatography, and cytotoxic substances bound to or used with the monoclonal antibody. . Also included is the use of fluorescence activated cell sorting (FACS), where cells can be separated based on the level of staining for a particular antigen. These techniques are well known to those skilled in the art and are described in US Pat. Nos. 5,061,620, 5,409,213,
Nos. 5,677,136 and 5,750,397 and Yau et al., Exp.
matol, 18: 219-222 (1990).

【００６１】 細胞分離または選択の順序は本発明にとって重要でなく、遺伝的修飾に先立っ
て、または遺伝的修飾の後で、特定の細胞タイプを分離すればよい。最初に粗分
離によって、続いて正のおよび／または負の選択を用いて、細胞を分離するのが
好ましい。ヒトでは、富化造血幹細胞集団の表面抗原発現を、ＣＤ３４⁺ Ｔｈｙ
−１⁺ Ｌｉｎ^- によって確認できる。他の富化表現型として、つぎのものが挙げ
られるが、これらに限定されるものではない：ＣＤ２^-、ＣＤ３^-、ＣＤ４^-、Ｃ
Ｄ８^-、ＣＤ１０^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１５^-、ＣＤ１９^-、ＣＤ２０^-、ＣＤ３３^-
、ＣＤ３４^-、ＣＤ３８^lo/-、ＣＤ４５ＲＡ^-、ＣＤ５９^+/- 、ＣＤ７１^-、ＣＤ
Ｗ１０９^-、グリコホリン、ＡＣ１３３⁺ 、ＨＬＡ−ＤＲ^+/- 、ｃ−ｋｉｔ⁺ お
よびＥＭ⁺ 。Ｌｉｎ^-は、少なくとも１つの系統特異性マーカー、たとえばＣＤ
２、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ５６の発現の欠如に基づいて選択された細胞集
団を意味する。富化ＨＳＣ集団の単離および確認のために用いる発現マーカーの
組合せは、種々の因子に依存して変化しうるし、他の発現マーカーが入手できる
ようになったときにも変わりうる。The order of cell separation or selection is not critical to the invention, and the particular cell type may be separated prior to or after the genetic modification. Preferably, the cells are separated first by crude separation followed by positive and / or negative selection. In humans, the surface antigen expression of the enriched hematopoietic stem cell population was determined to be CD34 ⁺ Thy.
-1 ⁺ Lin ^- it can be confirmed by. Other enriched phenotypes include, but are not limited to: CD2 ⁻ , CD3 ⁻ , CD4 ⁻ , C
^{D8 -, CD10 -, CD14 -} , CD15 -, CD19 -, CD20 -, CD33 -
^{, CD34 -, CD38 lo / -} , CD45RA -, CD59 +/-, CD71 -, CD
W109 ^{-, glycophorin, AC133 +, HLA-DR +/-} , c-kit + and EM ^+. Lin ^- has at least one strain-specific marker, such as CD
2, means a cell population selected based on the lack of expression of CD3, CD14 and CD56. The combination of expression markers used for the isolation and confirmation of the enriched HSC population can vary depending on various factors, and may vary as other expression markers become available.

【００６２】 ヒトＣＤ３４⁺ Ｔｈｙ−１⁺ Ｌｉｎ^- に類似の性質をもつマウスＨＳＣは、ｋ
ｉｔ⁺ Ｔｈｙ−１．１^loＬｉｎ^-/loＳｃａ−１⁺ （ＫＴＬＳ）によって同定・確
認できる。他の表現型は周知である。ＣＤ３４の発現をＴｈｙ−１についての選
択と組合せるとき、およそ５％より少ない系統拘束（前駆）細胞からなる組成物
を単離することができる（ＵＳ特許第５０６１６２０号）。Mouse HSCs with properties similar to human CD34 ⁺ Thy-1 ⁺ Lin ⁻
It can be identified and confirmed by it ⁺ Thy-1.1 ^lo Lin- ^{/ lo} Sca-1 ⁺ (KTLS). Other phenotypes are well known. When CD34 expression is combined with selection for Thy-1, compositions consisting of less than approximately 5% lineage committed (progenitor) cells can be isolated (US Pat. No. 5,061,620).

【００６３】 ＣＤ３４が胸腺細胞とも呼ばれるもっとも未成熟のＴ細胞の表面で発現される
ことおよびこれらの細胞がＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８抗原の
細胞表面発現を欠くことが示されている。ＣＤ４５ＲＡも有用なＴ細胞マーカー
である。もっとも周知のＴ細胞マーカーはＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）である。
現在、２つのタイプの定義されたＴＣＲ、すなわちＴＣＲ−２（αおよびβポリ
ペプチドからなる）とＴＣＲ−１（δおよびγポリペプチドからなる）がある。
Ｂ細胞は、たとえばＣＤ１９およびＣＤ２０の発現によって選択できる。骨髄性
細胞は、たとえばＣＤ１４、ＣＤ１５およびＣＤ１６の発現によって選択できる
。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６およびＣＤ１６の発現によって選択できる。赤血球は、
グリコホリンＡの発現によって同定・確認できる。骨髄性細胞、樹状細胞または
リンパ性細胞に分化できる前駆細胞が富化された組成物は、表現型ＣＤ４５ＲＡ ⁺ ＣＤ３４⁺ Ｔｈｙ−１⁺ およびＣＤ４５ＲＡ⁺ ＣＤ１０⁺ Ｌｉｎ^‐ ＣＤ３４⁺ をも含む。当業者ならば、種々の細胞タイプのための他の有用なマーカーを知っ
ている。[0063] CD34 is expressed on the surface of the most immature T cells, also called thymocytes
That these cells are CD1, CD2, CD3, CD4 and CD8 antigens
It has been shown to lack cell surface expression. CD45RA is a useful T cell marker
It is. The most well-known T cell marker is the T cell antigen receptor (TCR).
Currently, there are two types of defined TCRs, TCR-2 (α and β poly).
And TCR-1 (comprising δ and γ polypeptides).
B cells can be selected, for example, by expression of CD19 and CD20. Myeloid
Cells can be selected for example by expression of CD14, CD15 and CD16
. NK cells can be selected for by expression of CD56 and CD16. Red blood cells
It can be identified and confirmed by the expression of glycophorin A. Myeloid cells, dendritic cells or
Compositions enriched for progenitor cells capable of differentiating into lymphoid cells have the phenotype CD45RA ⁺ CD34⁺ Thy-1⁺ And CD45RA⁺ CD10⁺ Lin^- CD34⁺ Including. One skilled in the art knows other useful markers for various cell types
ing.

【００６４】 ひとたび宿主細胞を集めて、随意に分離したならば、増殖を維持するのに十分
な増殖因子の組合せを含む適当な培地中でそれらの細胞を培養する。培養なる語
は、種々の培地上または培地中での細胞の増殖をいう。培養で増殖した細胞の子
孫は親細胞と完全には同一でなくてもよい（形態的、遺伝的または表現型的のい
ずれかで）ことを了解されたい。幹細胞および造血細胞の培養法は当業者に周知
であり、これらの方法の若干をここに簡単に述べる。任意の適当な容器を使用で
き、これらは商業的売主から容易に入手できる。播種レベルは、とくに限定され
ず、使用する細胞のタイプに依存する。一般に、播種レベルは１ｍｌ当たり少な
くとも細胞１０個、より普通には１ｍｌ当たり少なくとも細胞１００個であり、
通常１ｍｌ当たり１０⁶ 以下である。[0064] Once the host cells have been collected and optionally isolated, they are cultured in a suitable medium containing a combination of growth factors sufficient to maintain growth. The term culture refers to the growth of cells on or in various media. It is to be understood that the progeny of a cell grown in culture may not be completely identical to the parent cell (either morphologically, genetically or phenotypically). Methods for culturing stem cells and hematopoietic cells are well known to those skilled in the art, and some of these methods are briefly described here. Any suitable container can be used and these are readily available from commercial vendors. The seeding level is not particularly limited and depends on the type of cells used. Generally, the seeding level is at least 10 cells per ml, more usually at least 100 cells per ml,
Usually, it is 10 ⁶ or less per 1 ml.

【００６５】 種々の培地を使用でき、限定を意味しない例として、イスコーヴの改良ダルベ
ッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｘ−ｖｉｖｏ１５およびＲＰＭＩ−１６４０がある。こ
れらは、諸々の売主から商業的に入手できる。それらの処方に、種々の栄養素、
増殖因子、たとえばサイトカインなどを補足してもよい。一般に、サイトカイン
なる語は、成長・増殖を誘導するなど、細胞に種々の効果を及ぼす多くの因子の
いずれかをいう。サイトカイン類は、ヒト起源のものであっても、対象とする細
胞に対して活性であるときには、他の種に由来するものであってもよい。その定
義の範囲に含まれるのは、たとえば組換え手段によって製造された、野生型また
は精製サイトカインに類似の生物学的活性を有する分子、およびサイトカイン因
子受容体に結合し、天然サイトカイン因子と類似の細胞応答を誘発する分子であ
る。A variety of media can be used and non-limiting examples include Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), X-vivo15 and RPMI-1640. These are commercially available from various sellers. In their formula, various nutrients,
Growth factors, such as cytokines, may be supplemented. In general, the term cytokine refers to any of a number of factors that exert various effects on cells, such as inducing growth and proliferation. Cytokines may be of human origin or from other species when active on the cell of interest. Included within its definition are molecules, for example, produced by recombinant means, having a biological activity similar to a wild-type or purified cytokine, and those which bind to a cytokine factor receptor and have a similar activity to a native cytokine factor. A molecule that elicits a cellular response.

【００６６】 培地は血清不含でもよく、適当量の血清、たとえばウシ胎児血清、自家血清ま
たは血漿を補足してもよい。細胞および細胞産物をヒトで使用する場合には、培
地は血清不含かまたは自家血清または自家血漿を補足するのが好ましい。（Lans
dorp et al., J. Exp. Med. 175:1501 (1992) および Petzer et al., PNAS 93:
1470 (1996)）。The medium may be serum-free and may be supplemented with an appropriate amount of serum, such as fetal calf serum, autologous serum or plasma. When cells and cell products are used in humans, the medium is preferably serum-free or supplemented with autologous serum or autologous plasma. (Lans
dorp et al., J. Exp.Med. 175: 1501 (1992) and Petzer et al., PNAS 93:
1470 (1996)).

【００６７】 培地に補足するのに使用しうる成分の、限定を意味するものではない例は、ト
ロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（
ＫＬ、幹細胞因子（ＳＣＦ）またはＳｔｌとしても知られている）、ＩＬ−１、
ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、（可溶性ＩＬ−６受容体）、ＩＬ−１１、ＩＬ
−１２などのインターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ
）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、白血病阻害因子
（ＬＩＦ）、ＭＩＰ−１αおよびエリトロポエチン（ＥＰＯ）である。これらの
化合物は単独であるいは組合せて使用してよく、好ましい濃度範囲は、発表され
ている技術から容易に求めることができる。マウス幹細胞を培養するときには、
好ましい、しかし限定を意味するものではない培地として、ｍＩＬ−３、ｍＩＬ
−６およびｍＳＣＦが挙げられる。Non-limiting examples of components that can be used to supplement the medium include thrombopoietin (TPO), Flt3 ligand (FL), c-kit ligand (
KL, also known as stem cell factor (SCF) or Stl), IL-1,
IL-2, IL-3, IL-6, (soluble IL-6 receptor), IL-11, IL
-12, such as interleukin (IL), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF
), Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), leukemia inhibitory factor (LIF), MIP-1α and erythropoietin (EPO). These compounds may be used alone or in combination, and the preferred concentration range can be easily determined from published techniques. When culturing mouse stem cells,
Preferred, but not limiting, media are mIL-3, mIL
-6 and mSCF.

【００６８】 当業者ならば、これらの化合物の培養中の濃度範囲を知っている。本発明を限
定する意味ではないが、ＴＰＯの一般的な好ましい範囲は、約０．１ｎｇ／ｍＬ
〜約５００μｇ／ｍＬであり、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬがよ
り好ましく、約５．０ｎｇ／ｍＬ〜約３００ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。ＦＬ
およびＫＬの各々の好ましい濃度範囲は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ
／ｍＬであり、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬがより好ましい。ＩＬ
−６は培地に含有させるべき好ましい因子であり、好ましい濃度範囲は約０．１
ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬであり、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／
ｍＬがより好ましい。ＩＬ−６とＩＬ−６受容体との共有結合複合体であるハイ
パーＩＬ−６を培養中に用いてもよい。Those skilled in the art know the range of concentrations of these compounds during culture. Without intending to limit the invention, a generally preferred range of TPO is about 0.1 ng / mL.
From about 1.0 ng / mL to about 1000 ng / mL, more preferably from about 5.0 ng / mL to about 300 ng / mL. FL
And KL preferably range from about 0.1 ng / mL to about 1000 ng.
/ ML, with about 1.0 ng / mL to about 500 ng / mL being more preferred. IL
-6 is a preferable factor to be contained in the medium, and the preferable concentration range is about 0.1
ng / mL to about 500 ng / mL, from about 1.0 ng / mL to about 100 ng / mL.
mL is more preferred. Hyper-IL-6, a covalent complex of IL-6 and IL-6 receptor, may be used during culture.

【００６９】 他の分子を培地に添加でき、たとえばフィブロネクチンやレトロネクチン（商
標）（日本国滋賀県大津市の宝酒造により商業的に製造されている）などの接着
分子である。フィブロネクチンなる語は全身を通じて見出される糖蛋白質を指し
ており、それがコラーゲンと複合体を形成する結合組織においてその濃度がとく
に高い。Other molecules can be added to the medium, for example, adhesion molecules such as Fibronectin and RetroNectin ™ (manufactured commercially by Takara Shuzo, Otsu, Shiga, Japan). The term fibronectin refers to a glycoprotein found throughout the body, whose concentration is particularly high in connective tissues that form a complex with collagen.

【００７０】 さらなる一面においては、本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチ
ドを含有する宿主細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、宿主培
養から該ポリペプチドを回収することによって製造できる。培養で増殖した宿主
細胞からポリペプチドを得る方法は、当業界において周知である。In a further aspect, the polypeptide of the present invention is obtained by culturing a host cell containing the polynucleotide of the present invention under conditions suitable for expression of the polypeptide, and recovering the polypeptide from the host culture. Can be manufactured by Methods for obtaining polypeptides from host cells grown in culture are well known in the art.

【００７１】 本発明において、遺伝的修飾法は、哺乳動物細胞（とくにヒト幹細胞および造
血細胞）中への異種または外来遺伝子の移入または核酸移入からなるいずれの遺
伝的修飾法をも包含するものとする。この用語は、形質導入（インビトロまたは
インビボでの宿主または供与体（ドナー）から受容体（レシピエント）への宿主
ＤＮＡのウィルス介在性移入）、トランスフェクション（単離ウィルスＤＮＡゲ
ノムによる細胞の形質転換）、リポソーム介在性移入、電気穿孔、燐酸カルシウ
ムトランスフェクションまたは共沈殿などを包含するが、これらに限定されるも
のではない。形質導入法としては、細胞とプロデューサー細胞との直接的共培養
（Bregni et al., Blood 80:1418-1422 (1992)）または適当な増殖因子およびポ
リカチオンを用いたまたは用いないウィルス上澄みのみとの培養（Xu et al., E
xp. Hemat. 22:223-230 (1994)）が挙げられる。In the present invention, the genetic modification method includes any genetic modification method comprising transferring a heterologous or foreign gene or nucleic acid into mammalian cells (particularly, human stem cells and hematopoietic cells). I do. The terms include transduction (virus-mediated transfer of host DNA from a host or donor (donor) to an acceptor (recipient) in vitro or in vivo), transfection (transformation of cells with an isolated viral DNA genome). ), Liposome-mediated transfer, electroporation, calcium phosphate transfection or co-precipitation, but are not limited thereto. Transduction methods include direct co-culture of cells with producer cells (Bregni et al., Blood 80: 1418-1422 (1992)) or only viral supernatant with or without appropriate growth factors and polycations. Culture (Xu et al., E
xp. Hemat. 22: 223-230 (1994)).

【００７２】 好ましい一具体化態様においては、上記のごときレトロウィルスベクターで宿
主細胞を形質導入処理する。感染されうる宿主細胞の範囲は、ウィルスエンベロ
ープ蛋白質によって定まる。組換えウィルスを用いて、パッケージング細胞によ
って提供されたｅｎｖ蛋白質によって認識される実質的に任意の他の細胞タイプ
を感染させることができ、その結果、形質導入細胞中へウィルスゲノムが組み込
まれ、外来遺伝子産物が安定に取り込まれる。一般に、ＭｏＭＬＶのマウス同種
指向性ｅｎｖは、噛歯動物細胞の感染を可能ならしめ、両種指向性ｅｎｖは、噛
歯類細胞、鳥類細胞およびヒト細胞を含む若干の霊長類細胞の感染を可能ならし
める。ＭｏＭＬＶ系とともに使用するための細胞系の両種指向性パッケージング
は、当業界で既知であり、商業的に入手可能である。これらには、ＰＡ１２、Ｐ
Ａ３１７、ΨＣＲＩＰおよびＦＬＹＡ１３が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。（Miller et al., Mol. Cell Biol. 5:431-437 (1985); Mill et a
l., Mol. Cell Biol. 6:2895-2902 (1986);および Danos et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988) 参照）。最近、水泡性口内炎ウィルスか
らのＧ糖蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）が、ＭｏＭＬＶｅｎｖ蛋白質に置き代わってきて
いる。（Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037 (1993); お
よびＷＯ９２／１４８２９参照）。ヒト細胞の感染を可能ならしめる他種指向性
ベクター系も存在している。上記のようにして得られた遺伝的に修飾された細胞
は、直ちに使用してもよく、増殖させてもよく、またはたとえば液体窒素の温度
で凍結させて長期間保存し、解凍して使用することもできる。それらの細胞は、
当業界において周知の方法により保存できる。遺伝的に修飾された細胞をいった
ん解凍したのち、さらに増殖させてもよい。増殖因子および／または幹細胞の増
殖および分化に関連するストロマ細胞を用いることによるＨＳＣ増殖法は、当業
者には周知である（ＵＳ特許第５７４４３６１号）。In a preferred embodiment, the host cells are transduced with a retroviral vector as described above. The range of host cells that can be infected is determined by the viral envelope proteins. The recombinant virus can be used to infect virtually any other cell type recognized by the env protein provided by the packaging cell, resulting in integration of the viral genome into the transduced cells, Foreign gene products are stably incorporated. In general, the mouse allotrophic env of MoMLV allows the infection of rodent cells, and the amphotropic env allows the infection of some primate cells, including rodent cells, bird cells and human cells. Exercising. Ampotropic packaging of cell lines for use with the MoMLV system is known in the art and is commercially available. These include PA12, P
A317, @CRIP and FLYA13, but are not limited to these. (Miller et al., Mol. Cell Biol. 5: 431-437 (1985); Mill et a
l., Mol. Cell Biol. 6: 2895-2902 (1986); and Danos et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 6460-6464 (1988)). Recently, the G glycoprotein from vesicular stomatitis virus (VSV-G) has replaced the MoMLVenv protein. (See Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037 (1993); and WO 92/14829). There are also other tropic vector systems that allow infection of human cells. The genetically modified cells obtained as described above may be used immediately, grown or used, for example, frozen at liquid nitrogen temperature, stored for a long time, and thawed. You can also. Those cells are
It can be stored by methods well known in the art. Once the genetically modified cells have been thawed, they may be further expanded. HSC expansion methods by using growth factors and / or stromal cells involved in stem cell expansion and differentiation are well known to those skilled in the art (US Pat. No. 5,744,361).

【００７３】 遺伝的に修飾された細胞の使用法としては、インビトロおよびインビボの応用
が挙げられる。一応用法において、本発明は、さらに、亜集団の造血幹細胞を含
むＣＤ３４^＋細胞の集団を得て；そのＣＤ３４^＋細胞の集団に本発明のポリヌク
レオチド配列を導入し；該ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド
を過剰発現する遺伝的に修飾された幹細胞の亜集団を得て；該遺伝的に修飾され
た細胞の亜集団を哺乳動物に投与し、そこで造血幹細胞の有効量を増大させるこ
とを包含する、対象体における造血細胞、とくに幹細胞の有効量を増加させる方
法に関する。造血細胞を得る方法は、すでに先に開示した。遺伝的修飾の前また
は後に、先に述べた種々の既知手法を用いて、ＨＳＣを選択することができる。
一例として、造血細胞は、上に開示したごとき表現型の発現に基づいて単離でき
る。好ましい一具体化態様においては、ポリヌクレオチドをベクターに導入する
。本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するのに任意の遺伝的修飾法を用
いうるが、形質導入が遺伝的修飾の好ましい方法である。Uses of the genetically modified cells include in vitro and in vivo applications. In one application, the invention further comprises obtaining a population of CD34 ⁺ cells comprising a subpopulation of hematopoietic stem cells; introducing the polynucleotide sequence of the invention into the population of CD34 ⁺ cells; encoded by the polynucleotide. Obtaining a subpopulation of genetically modified cells overexpressing the polypeptide; administering the subpopulation of genetically modified cells to a mammal, thereby increasing an effective amount of hematopoietic stem cells. To increase the effective amount of hematopoietic cells, particularly stem cells, in a subject. Methods for obtaining hematopoietic cells have already been disclosed above. Before or after the genetic modification, HSCs can be selected using the various known techniques described above.
As an example, hematopoietic cells can be isolated based on phenotypic expression as disclosed above. In one preferred embodiment, the polynucleotide is introduced into a vector. Although any genetic modification may be used to introduce the polynucleotides of the present invention into host cells, transduction is the preferred method of genetic modification.

【００７４】 「有効量または有効用量」とは、有益なまたは望ましい結果を生じるのに十分
な量である。有効量は、１回以上の投与で投与すればよい。有効量の決定は、当
業者の能力の範囲内のことである。本発明のとくに好ましい対象は、一般に、ヒ
ト、マウス、ウサギなどの哺乳動物を包含し、とくに好ましいのはヒトである。
本発明のポリヌクレオチドを含有する遺伝的に修飾された細胞の投与は、常法、
たとえば注射、経口投与、吸入などによって行いうる。修飾細胞の投与に当たっ
て、適当な担体または希釈剤を含めてもよい。修飾細胞およびそれらの子孫を含
有する試料を採取し、試験して、形質転換効率を求めることができる。ＣＤ３４ ^＋ 細胞の集団を、宿主細胞の遺伝的修飾の前かまたは後に培養してもよい。An “effective amount or effective dose” is sufficient to produce a beneficial or desired result.
Amount. An effective amount may be administered in one or more administrations. Determination of the effective amount
This is within the capabilities of the trader. Particularly preferred objects of the present invention are generally
And mammals such as mice, rabbits, etc., and particularly preferred are humans.
Administration of the genetically modified cells containing the polynucleotide of the present invention can be performed by a conventional method.
For example, it can be performed by injection, oral administration, inhalation and the like. When administering modified cells
And suitable carriers or diluents may be included. Including modified cells and their progeny
A sample having the transformation can be collected and tested to determine the transformation efficiency. CD34 ⁺ The population of cells may be cultured before or after genetic modification of the host cell.

【００７５】 本明細書で用いた「過剰発現」なる語は、当該ポリペプチドをコードする核酸
発現による宿主細胞の遺伝的修飾によりもたらされた本発明のポリペプチドの発
現に関するものである。とくに好ましいのは、ＳＣＭ３、ＳＣＭ２６、ＳＣＭ１
１３およびそれらと８５％の一致性をもつ機能上均等なポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドである。過剰発現は、ここで請求しているＳＣＭ蛋白質に機
能上均等なまたは同一のポリペプチドの発現が普通には欠けている細胞内で起こ
りうるし、または、ここで請求しているＳＣＭ蛋白質に機能上均等なまたは同一
のポリペプチドを内因的に発現している細胞で起こりうる。過剰発現は任意の細
胞タイプの中で起こりうるが、とくに好ましい宿主細胞としては、造血細胞、と
くにＨＳＣおよびＴ細胞が挙げられる。たとえば、ＨＳＣは、ＳＣＭ蛋白質と機
能上均等なまたは同一のポリペプチドの内因性レベルの発現を有しうるが、宿主
細胞は、ＳＣＭ蛋白質をコードし、それを発現しうる本発明の核酸配列を含むよ
うに遺伝的に修飾されないであろう。The term “overexpression”, as used herein, relates to the expression of a polypeptide of the invention resulting from the genetic modification of a host cell by expression of a nucleic acid encoding the polypeptide. Particularly preferred are SCM3, SCM26, SCM1
13 and a polynucleotide encoding a functionally equivalent polypeptide with 85% identity thereto. Overexpression can occur in cells that normally lack expression of a polypeptide functionally equivalent or identical to the SCM protein claimed herein, or can be functionally equivalent to the SCM protein claimed herein. It can occur in cells that endogenously express an equivalent or identical polypeptide. Overexpression can occur in any cell type, but particularly preferred host cells include hematopoietic cells, especially HSCs and T cells. For example, an HSC may have an endogenous level of expression of a polypeptide that is functionally equivalent or identical to a SCM protein, while a host cell encodes a SCM protein and encodes a nucleic acid sequence of the invention capable of expressing the same. Will not be genetically modified to include.

【００７６】 本明細書で用いた「野生型」細胞は、宿主細胞の細胞タイプであるが、本発明
のＳＣＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝的に修飾
されておらず、過剰発現という結果にならない。ＳＣＭ蛋白質の過剰発現は、当
業界で周知の種々の方法によって測定できる。好ましい方法としては、ＦＡＣＳ
によるマーカー遺伝子、とくにＥＧＦＰの測定が挙げられる。As used herein, a “wild-type” cell is a cell type of a host cell that has not been genetically modified to contain a polynucleotide encoding an SCM polypeptide of the invention, and Does not result in expression. Overexpression of the SCM protein can be measured by various methods well known in the art. The preferred method is FACS
Measurement of marker genes, especially EGFP.

【００７７】 該方法は、上記したように、ＣＤ３４⁺ 細胞の集団に治療用遺伝子、アンチセ
ンス遺伝子またはリボザイムをコードする第二のポリヌクレオチド配列の導入を
ももたらしうる。他の応用面では、本発明は遺伝子修飾された細胞の有効量を増
大させる方法に関する。本発明のポリヌクレオチドを過剰発現する宿主細胞、と
くに造血幹細胞は、治療上有用である。細胞の分化が阻害され、結果として未分
化幹細胞が増殖する。未分化幹細胞の増殖は、生体外かまたは生体内の幹細胞量
を増加させ、それによってより速やかな組織植え付け（移植）を可能ならしめる
可能性を秘めている。これは、対象体における遺伝的に修飾された細胞の提示の
増加という結果となりうる。The method can also result in the introduction of a second polynucleotide sequence encoding a therapeutic gene, antisense gene or ribozyme into the population of CD34 ⁺ cells, as described above. In another application, the invention is directed to a method of increasing the effective amount of a genetically modified cell. Host cells overexpressing the polynucleotides of the invention, particularly hematopoietic stem cells, are therapeutically useful. Cell differentiation is inhibited, and as a result, undifferentiated stem cells proliferate. Proliferation of undifferentiated stem cells has the potential to increase the amount of stem cells in vitro or in vivo, thereby enabling faster tissue implantation (transplantation). This can result in increased presentation of the genetically modified cells in the subject.

【００７８】 遺伝的に修飾された宿主細胞は、ＳＣＭ蛋白質の過剰発現に十分な期間にわた
って維持される。適当な期間は、とりわけ使用する細胞タイプに依存するであろ
うが、当業者ならば容易に決定できる。一般に、本発明の遺伝的に修飾された細
胞は、宿主細胞の生涯にわたってＳＣＭ蛋白質を過剰発現しうる。造血細胞の場
合には、その期間が１〜４５日の範囲内であることが好ましく、より好ましくは
１〜３０日の範囲内、なお好ましくは１〜２０日の範囲内、さらに好ましくは１
〜１０日の範囲内、とくに好ましくは１〜５日の範囲内である。The genetically modified host cell is maintained for a period of time sufficient for overexpression of the SCM protein. The appropriate period will depend, inter alia, on the cell type used, but can be readily determined by one skilled in the art. Generally, the genetically modified cells of the present invention may overexpress the SCM protein for the life of the host cell. In the case of hematopoietic cells, the period is preferably in the range of 1 to 45 days, more preferably in the range of 1 to 30 days, still more preferably in the range of 1 to 20 days, even more preferably 1 to 45 days.
It is within the range of 10 days, particularly preferably within the range of 1 to 5 days.

【００７９】 本発明のさらなる応用は、本発明のポリヌクレオチド配列をＣＤ３４^＋細胞に
導入し；ＣＤ３４^＋細胞の集団を遺伝的に修飾し；それらの細胞中で該ポリヌク
レオチド配列を発現させ；該遺伝的に修飾された細胞の分化を阻害することを包
含する、哺乳動物造血幹細胞の分化を阻害する方法に関する。ポリヌクレオチド
がＳＣＭ３、ＳＣＭ２６、ＳＣＭ１１３またはそれらに機能上均等なポリペプチ
ドをコードしていることが好ましい。[0079] A further application of the present invention is to introduce a polynucleotide sequence of the present invention into CD34 ⁺ cells; genetically modify a population of CD34 ⁺ cells; express the polynucleotide sequence in those cells; The present invention relates to a method of inhibiting the differentiation of a mammalian hematopoietic stem cell, comprising inhibiting the differentiation of a genetically modified cell. Preferably, the polynucleotide encodes SCM3, SCM26, SCM113 or a polypeptide functionally equivalent thereto.

【００８０】 上で論じたように、幹細胞は多能性であり、自己再生できる。分化とは、細胞
が自己再生する潜在能力の制限であると定義され、細胞の機能能力の変化を伴う
。分化を「阻害する」なる表現は、本発明の文脈では広義に用いられており、分
化の阻止のみならず、分化の変化をも意味する。分化は、当業界において周知の
方法によって求めることができ、これらとしては、定義された分化状態の細胞に
関連する表面マーカーの分析が挙げられる。本発明を限定する意味はないが、通
常、分化が少なくとも約１０％まで、好ましくは約１５％まで、より好ましくは
約２０％まで、とくに好ましくは約３０％またはそれ以上まで遅らせられ、より
少ない細胞が特定の分化マーカーを発現する。かかるマーカーとしては、たとえ
ば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ４０、Ｃ
Ｄ４１およびＣＤ９４が挙げられる。好ましい一具体化態様においては、分化が
少なくとも約１５％より大きい程度まで、好ましくは２０％より大きい程度まで
遅らせられ、より少ない細胞がＣＤ１４マーカーを発現する。As discussed above, stem cells are pluripotent and capable of self-renewal. Differentiation is defined as the limitation of the cell's ability to self-renew and involves a change in the functional capacity of the cell. The expression "inhibiting" differentiation is used broadly in the context of the present invention and means not only the inhibition of differentiation but also a change in differentiation. Differentiation can be determined by methods well known in the art, including the analysis of surface markers associated with cells in a defined differentiation state. Although not meant to limit the invention, usually the differentiation is delayed by at least about 10%, preferably up to about 15%, more preferably up to about 20%, particularly preferably up to about 30% or more, and less Cells express specific differentiation markers. Such markers include, for example, CD4, CD8, CD13, CD14, CD19, CD36, CD40, C
D41 and CD94. In a preferred embodiment, differentiation is delayed to at least about 15%, preferably to about 20%, and less cells express the CD14 marker.

【００８１】 哺乳動物造血幹細胞の分化を阻害する該方法は、また、造血細胞、とくにＣＤ
３４^＋細胞をかかる細胞の源から単離し、それらの細胞に本発明のポリヌクレオ
チドを導入し、それにより細胞を遺伝的に修飾することを含んでいてもよい。さ
らに、該ポリヌクレオチドをベクター、好ましくはレトロウィルスベクターに導
入し、形質導入によって宿主細胞を遺伝的に修飾することが好ましい。しかしな
がら、上に説明した種々のベクター系をこの方法で用いうることを強調しておき
たい。いったん細胞を遺伝的に修飾したならば、修飾された細胞の増殖を維持す
るのに十分な量の少なくとも１種のサイトカインの存在下でそれらを培養し、コ
ードされているポリペプチドが過剰発現され、分化が阻害されている修飾細胞を
選択する。The method of inhibiting differentiation of a mammalian hematopoietic stem cell may also comprise hematopoietic cells, particularly CD
34 ⁺ cells were isolated from such cells source, introducing a polynucleotide of the invention to those cells, thereby the cells may involve genetically modifying. Furthermore, it is preferred to introduce the polynucleotide into a vector, preferably a retroviral vector, and to genetically modify the host cell by transduction. However, it should be emphasized that the various vector systems described above can be used in this way. Once the cells have been genetically modified, they are cultured in the presence of at least one cytokine in an amount sufficient to maintain the growth of the modified cells, and the encoded polypeptide is overexpressed. Select the modified cells whose differentiation is inhibited.

【００８２】 本発明は、さらに、本発明のポリペプチドに結合する抗体を包含する。本明細
書で用いたＳＣＭ抗体なる語は、ＳＣＭ蛋白質へ特異的に結合するのに十分な特
異性を維持している天然または組換えの、合成または天然由来の抗体またはその
断片を包含する。ＳＣＭ抗体は、ＳＣＭ蛋白質に結合するモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体であってよい。これに関連して、該抗体は、造血細胞、とく
に幹細胞を選択的に認識する。抗体の生産のためには、種々の対象宿主をＳＣＭ
３、２６または１１３もしくはそれらの断片または変異体の注射によって免疫す
ればよい。一般的な抗体製造手法は既知であり、蛋白質測定のための種々のプロ
トコールも、酵素結合免疫吸着検定法および蛍光活性化細胞選別法を含めて、既
知である。図２、４または６に示した蛋白質を用いて抗体を生じさせることがで
きるが、ＳＣＭ２６の蛋白質配列がもっとも好ましい。本発明においては、周知
の手法を用いて、ＳＣＭ２６のアミノ酸残基２６−４０に対するポリクローナル
抗血清をウサギで生成させる。アフィニティークロマトグラフィーによりペプチ
ド特異性抗体を精製し、野生型繊維芽細胞またはＳＣＭ２６を発現するレトロウ
ィルスベクターで形質導入した繊維芽細胞の免疫ブロットに使用する（図３）。
同じ抗体を使用して、肝溶解産物、ＣＤ３４^＋細胞または末梢血白血球を調べる
（図３）。さらに、細胞表面ＳＣＭ２６蛋白質を検出するのに有用でありうる抗
体を産生させるために、ＳＣＭ２６の細胞外領域を用いてもよい；かかる断片は
、図２に示したアミノ酸配列の２５−８２、１４７−１５７および２６６−２７
５のアミノ酸配列を含む。The present invention further includes antibodies that bind to a polypeptide of the present invention. As used herein, the term SCM antibody includes natural or recombinant, synthetic or naturally-derived antibodies or fragments thereof that maintain sufficient specificity to specifically bind to a SCM protein. The SCM antibody may be a monoclonal or polyclonal antibody that binds to the SCM protein. In this context, the antibodies selectively recognize hematopoietic cells, especially stem cells. For the production of antibodies, various target hosts are
Immunization may be by injection of 3, 26 or 113 or a fragment or variant thereof. General antibody production techniques are known, and various protocols for measuring proteins are also known, including enzyme-linked immunosorbent assays and fluorescence-activated cell sorting. Antibodies can be raised using the proteins shown in FIGS. 2, 4 or 6, with the SCM26 protein sequence being most preferred. In the present invention, a polyclonal antiserum against amino acid residues 26-40 of SCM26 is generated in rabbits using well known techniques. The peptide-specific antibodies are purified by affinity chromatography and used for immunoblotting of wild-type fibroblasts or fibroblasts transduced with a retroviral vector expressing SCM26 (FIG. 3).
The same antibody is used to examine liver lysates, CD34 ⁺ cells or peripheral blood leukocytes (FIG. 3). In addition, the extracellular region of SCM26 may be used to raise antibodies that may be useful for detecting cell surface SCM26 protein; such fragments may be found in the amino acid sequence shown in FIG. -157 and 266-27
5 amino acid sequences.

【００８３】 抗体、とくにモノクローナル抗体を選択することは、特定の細胞系統および／
または分化の段階に関連したマーカーを同定するのにとくに有用である。それら
の抗体は固体の支持体に付着でき、粗分離を可能ならしめる。採用する分離手法
は、集めるべき画分の生存度の維持が極大となるものであるべきである。それゆ
え、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体のみならず、幹細胞、とく
に造血幹細胞またはそれらの子孫を同定・確認する方法をも包含する。これは、
本発明のポリペプチドに対する抗体を調製し、その抗体を精製し、造血細胞の集
団をその抗体に暴露させて、暴露された細胞が抗体に結合することを許容し、つ
ぎに結合した細胞を選択することからなる。抗体の調製および精製を包含する手
法は当業界で周知であり、これらの手法は日常業務ベースで行われる。Antibodi
es: A Laboratory Manual, Harlow et al.編 (1987)を参照されたい。The selection of antibodies, particularly monoclonal antibodies, depends on the particular cell line and / or
Or it is particularly useful for identifying markers associated with the stage of differentiation. The antibodies can be attached to a solid support, allowing for crude separation. The separation technique employed should be one that maximizes the viability of the fractions to be collected. Therefore, the present invention includes not only antibodies that bind to the polypeptide of the present invention, but also methods for identifying and confirming stem cells, particularly hematopoietic stem cells or their progeny. this is,
Preparing an antibody against a polypeptide of the invention, purifying the antibody, exposing a population of hematopoietic cells to the antibody, allowing the exposed cells to bind to the antibody, and then selecting the bound cells It consists of doing. Techniques involving antibody preparation and purification are well known in the art, and these techniques are performed on a routine basis. Antibodi
es: A Laboratory Manual, edited by Harlow et al. (1987).

【００８４】 ここに記載した方法によって得られた遺伝的に修飾された細胞は、さらに、自
家または同種セッティングに用いることができ、そこでは、随意に増殖させた修
飾細胞をつぎにたとえば骨髄移植、移植容易化または免疫再構成に使用する。The genetically modified cells obtained by the methods described herein can be further used in autologous or allogeneic settings, where the optionally grown modified cells are then used, eg, for bone marrow transplantation, Used for transplant ease or immune reconstitution.

【００８５】 さらに、造血細胞集団の機能性組成物の測定のための種々のインビトロおよび
インビボアッセイが周知である。（Quesenberry et al.（編） Stem Cell Biolo
gy and Gene Therapy, Wiley-Liss Inc. 1998 - 第５章Hematopoietic Stem Cel
ls: Proliferation, Purification and Clinical Applications, pgs 133-160
を参照されたい）。これらのアッセイの、限定を意味するものではない例を、以
下に簡単に記載する。長期培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）アッセイは、ストロマ細
胞単層上で細胞集団を約５週間培養し、つぎに２週間の半固体培地培養で、保持
されたクローン原性細胞の頻度を検定することを含む（Sutherland et al., Blo
od 74:1563 (1989)）。コロニー形成単位培養（ＣＦＵ−Ｃ）アッセイは、試料
の単位体積当たりのコロニー形成単位の数として細胞カウントを使用することを
含む。このアッセイは、血清および増殖因子を補足した半固体培地で速やかに成
熟する前駆細胞のクローン増殖を測定するために使用される。増殖を刺激するた
めに用いた増殖因子に応じて、成熟したおよび／または原始的前駆細胞を判断す
ることができる。玉石(cobblestone) 領域形成コロニー（ＣＡＦＣ）アッセイは
、ストロマ細胞単層および増殖因子／血清補足培地により維持された長寿命前駆
細胞のクローン増殖を測定する。適切なストロマ単層上で、骨髄性およびリンパ
性系統への多分化能細胞を判定できる。（Young et al., Blood 88:1619 (1996)
）。ＳＣＩＤ−ｈｕ骨アッセイは、骨髄再構成活性をもつ細胞の増殖および多系
統分化を測定する。これらの細胞は、臨床移植において永続性のある植え付けに
寄与しそうである。ＳＣＩＤ−ｈｕ胸腺アッセイは、胸腺細胞への増殖および分
化を測定する。骨髄再構成前駆細胞およびより成熟したＴ系統前駆細胞の両者を
測定できる。In addition, various in vitro and in vivo assays for determining the functional composition of a hematopoietic cell population are well known. (Quesenberry et al. (Eds.) Stem Cell Biolo
gy and Gene Therapy, Wiley-Liss Inc. 1998-Chapter 5 Hematopoietic Stem Cel
ls: Proliferation, Purification and Clinical Applications, pgs 133-160
Please refer to). Non-limiting examples of these assays are briefly described below. The Long-Term Culture Initiation Cell (LTCIC) assay involves culturing a population of cells on a stromal cell monolayer for about 5 weeks and then assessing the frequency of retained clonogenic cells in a 2-week semi-solid medium culture. Including (Sutherland et al., Blo
od 74: 1563 (1989)). The colony forming unit culture (CFU-C) assay involves using the cell count as the number of colony forming units per unit volume of sample. This assay is used to measure the clonal expansion of progenitor cells that mature rapidly in semi-solid media supplemented with serum and growth factors. Depending on the growth factors used to stimulate proliferation, mature and / or primitive progenitor cells can be determined. The cobblestone area forming colony (CAFC) assay measures the clonal expansion of long-lived progenitor cells maintained by stromal cell monolayers and growth factor / serum supplemented media. On a suitable stroma monolayer, pluripotent cells into myeloid and lymphoid lineages can be determined. (Young et al., Blood 88: 1619 (1996)
). The SCID-hu bone assay measures the proliferation and multilineage differentiation of cells with bone marrow reconstituting activity. These cells are likely to contribute to permanent implantation in clinical transplants. The SCID-hu thymus assay measures proliferation and differentiation into thymocytes. Both bone marrow reconstituted progenitor cells and more mature T lineage progenitor cells can be measured.

【００８６】 本発明の実施には、とくに断らない限り、当業者の技術の範囲内である細胞生
物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの慣用の手法を採用する。これらの手
法は、現行の文献に十分に開示されており、とくに Sambroo, Fritsch and Mani
atis編 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, 1989; Methods in Enzymologyのシリーズ (Academic P
ress, Inc.); および Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al. 編(19
87)を参照できる。The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of cell biology, molecular biology, cell culture, immunology and the like which are within the skill of the art. These techniques are well-disclosed in the current literature, especially in Sambroo, Fritsch and Mani
atis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2nd Ed., Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, 1989; Methods in Enzymology series (Academic P
ress, Inc.); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al. (ed.
87).

【００８７】 この明細書に述べたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する当業
者の技術水準を示すものであって、本発明が関連する技術の水準をより十分に記
載するために、ここに引用したすべての刊行物および特許出願の全体を引用によ
ってここに挿入するものとする。All publications and patent applications mentioned in this specification are indicative of the state of the art to which this invention pertains, and are intended to more fully describe the state of the art to which this invention pertains. The entire contents of all publications and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference.

【００８８】 以上全般的に記載した本発明は、以下の実施例を参照すればより容易に理解さ
れるであろう。それら実施例は、本発明のいくつかの具体化態様を説明するため
にここに含めたのであり、いかなる意味でも本発明を限定せんとするものではな
い。The invention described generally above can be more readily understood with reference to the following examples. The examples are included to illustrate some embodiments of the present invention and are not intended to limit the invention in any way.

【００８９】[0089]

【実施例】【Example】

実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの構築 インフォームドコンセントののち、ヒトドナーをシクロホスファミドプラス顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で処置し、ＣＤ３４⁺ Ｔ
ｈｙ−１⁺ 造血幹細胞（ＨＳＣ）を末梢血へ移動させる。複数のドナ−からのＨ
ＳＣを合わせる。アフェレーシスののち、ＣＤ３４⁺ Ｔｈｙ−１⁺ ＨＳＣ幹細胞
を、Gazitt et al., Blood, 86:381-389 (1995) が記載している通りのフロー選
別法によって精製する。全ＲＮＡを、ＲＮＡ−Ｓｔａｔ（Tel-Test B Inc., Fri
endswood, Texas ）を用いて＞１０⁷ のＨＳＣから精製する。全ＲＮＡからオリ
ゴｄＴ（Pharmacia Biotech ）でポリＡ⁺ ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡの合成に用
いる（ストラタジーン社の一方向ｃＤＮＡ合成キット）。このキットを用いて生
じた各々のｃＤＮＡ分子は、５’末端にＥｃｏＲＩ付着末端を、３’末端にＸｈ
ｏＩ付着末端を有する。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素（ストラタジーン）
で消化したラムダＺＡＰｅｘｐｒｅｓｓにそのｃＤＮＡを定方向にクローニング
する。結合したｃＤＮＡ／ラムダＺＡＰを、ギガパックＩＩＩゴールド（ストラ
タジーン）を用いてパッケージし、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦの細胞（ストラタジ
ーン）にトランスフェクションする。計０．５ｘ１０⁶ の独立クローンを製出す
る。ラムダファージを集め、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージおよびＳＯＬＲ
株の大腸菌を用い、ストラタジーンの推奨プロトコールに従って、インビボでｐ
ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）へと切り出す。Example 1 Construction of a cDNA Library After informed consent, human donors were treated with cyclophosphamide plus granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and CD34 ⁺ T
Hy-1 ⁺ hematopoietic stem cells (HSC) are transferred to peripheral blood. H from multiple donors
Match SC. After apheresis, CD34 ⁺ Thy-1 ⁺ HSC stem cells are purified by flow sorting as described by Gazitt et al., Blood, 86: 381-389 (1995). Total RNA was prepared using RNA-Stat (Tel-Test B Inc., Fri.
endswood, Texas) using a purified from> 10 ⁷ HSC. Poly A ⁺ RNA is purified from total RNA using oligo dT (Pharmacia Biotech) and used for cDNA synthesis (Stratagene's one-way cDNA synthesis kit). Each cDNA molecule generated using this kit has an EcoRI cohesive end at the 5 ′ end and an Xh at the 3 ′ end.
It has an oI cohesive end. EcoRI and XhoI restriction enzymes (Stratagene)
The cDNA is directionally cloned into lambda ZAPexpress digested with. The bound cDNA / lambda ZAP is packaged using Gigapack III Gold (Stratagene) and transfected into XL1-Blue MRF cells (Stratagene). A total of 0.5 × 10 ⁶ independent clones are produced. Lambda phage were collected, ExAssist helper phage and SOLR
In vivo, strain p. In vivo was used according to the recommended protocol of Stratagene,
Cut out to BlueScript (pBS).

【００９０】 キアゲン９６ウエル系、ＥｃｏＲＩプラスＸｈｏＩによる制限消化によりラン
ダムクローンをミニ調製し、電気泳動すると、０．５−５．０ｋｂにサイズ範囲
があって、平均サイズ２．３ｋｂの挿入片が示される。１０，０００のミニプレ
ップクローンを、Ｔ３プライミングされた（すなわち５’末端）ダイターミネー
ター配列決定反応を用いて配列決定し、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＰＥ
アプライドバイオシステムズ）で処理する。配列データを、ＢＬＡＳＴＸおよび
ＢＬＡＳＴＮ（Basic Local Alignment Search Tool）でのジーンバンク(GenBan
k) に対しての検索によって解析する。多数のクローンが、完全に新規であるか
またはＥＳＴとのみ相同性をもつと確認される。Mini-preparation of random clones by restriction digestion with a Qiagen 96-well line, EcoRI plus XhoI, followed by electrophoresis, showed inserts with a size range of 0.5-5.0 kb and an average size of 2.3 kb. It is. 10,000 miniprep clones were sequenced using a T3 primed (ie, 5 ′ end) dye terminator sequencing reaction and the ABI377 automated sequencer (PE
Applied Biosystems). The sequence data was stored in a Gene Bank (GenBan) using BLASTX and BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool).
Analyze by searching for k). A number of clones are confirmed to be completely new or only homologous to EST.

【００９１】 発現プロファイリングを用いて、ＨＳＣで特異的に発現されるｃＤＮＡ配列を
同定する。完全に新規であるかまたは発現された配列タグ（標識）（ＥＳＴ）と
のみ相同性をもつと確認されたクローンのｃＤＮＡ挿入片を、Ｔ３およびＴ７プ
ライマーを用いてのＰＣＲによって増幅し、Ｓｙｎｔｅｎｉ社へ送り、マイクロ
ドットアレイを生成させる。マイクロドットアレイプローブを、Ｓｙｎｔｅｎｉ
により推奨されている標準プロトコールを用いて、可動化された末梢血ＣＤ３４ ⁺ 細胞から精製したＲＮＡから合成し、Ｃｙ３で標識し、また末梢血細胞（ＰＢ
Ｌ）ＲＮＡまたはＣＤ１１ｂＲＮＡまたはＣＤ４ＲＮＡまたはＣＤ１９ＲＮＡか
ら合成し、Ｃｙ５で標識する。ＣＤ３４プローブおよびＰＢＬプローブを混合し
、マイクロドットアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄ののち、マイクロアレイを走査して、各ｃＤＮＡへのプローブの結合の強
度を求める。ハイブリダイゼーション、洗浄および走査は、Ｓｙｎｔｅｎｉで行
われる。プローブの結合は、遺伝子発現レベルに比例する。生の結合データを、
マイクロアレイ上でＳｙｎｔｅｎｉの対照エレメントへのプローブ結合をモニタ
ーすることによって比較対照する；これは、２つのプローブの蛍光標識の差を明
らかにする。２つの結合強度の比、均衡差次的発現（ＢＤＥ）は、相対的遺伝子
発現レベルの定量的測定値を与える。表１は、３つの独立した実験でのＳＣＭ３
の差次的発現を示す。ＳＣＭ２６およびＳＣＭ１１３について、類似の結果が観
察される（データは示さず）。Using expression profiling, cDNA sequences that are specifically expressed in HSCs
Identify. Completely new or expressed sequence tags (labels) (ESTs)
CDNA inserts of clones identified as having only homology were identified as T3 and T7 plasmids.
Amplified by PCR using primers and sent to Synteni, Inc.
Generate a dot array. Microdot array probe was used with Synteni
Mobilized peripheral blood CD34 using the standard protocol recommended by ⁺ Synthesized from RNA purified from cells, labeled with Cy3, and collected from peripheral blood cells (PB
L) RNA or CD11bRNA or CD4 RNA or CD19 RNA
And labeling with Cy5. Mix CD34 and PBL probes
And hybridize to a microdot array. Hybridization and
After washing and washing, the microarray is scanned to determine the strength of probe binding to each cDNA.
Ask for degrees. Hybridization, washing and scanning are performed at Synteni
Will be Probe binding is proportional to gene expression level. The raw join data,
Monitor probe binding to control elements of Synteni on microarray
By contrast; this reveals the difference between the fluorescent labels of the two probes.
Make it easy. The ratio of the two binding strengths, the balanced differential expression (BDE), is the relative gene
Provides a quantitative measure of expression levels. Table 1 shows SCM3 in three independent experiments.
Shows the differential expression of Similar results were observed for SCM26 and SCM113.
(Data not shown).

【００９２】[0092]

【表１】 [Table 1]

【００９３】 解析により、末梢血細胞（ＰＢＬ）中でよりも幹細胞中でより多く発現される
１０１の新規ｃＤＮＡを同定・確認でき、これらのｃＤＮＡを選ばれたｃＤＮＡ
と名付ける。選ばれたｃＤＮＡは、幹細胞中で少なくとも２倍発現されている（
ＢＤＥ＞２．０）ものと定義し、ＰＢＬ細胞中での発現は低い。対照ｃＤＮＡ、
ＣＤ３４、ｆｌｋ２（胎児肝キナーゼ）およびＫＩＴ（幹細胞因子または別名Ｓ
ｌ（スチール）因子またはｃ−Ｋｉｔリガンド）は、ＨＳＣ中で優先的に発現さ
れることが知られており、これは転写産物イメージングによって確認される。The analysis allows identification and confirmation of 101 novel cDNAs that are more highly expressed in stem cells than in peripheral blood cells (PBL), and these cDNAs were identified as selected cDNAs.
Name it. The selected cDNA is expressed at least twice in stem cells (
(BDE> 2.0) and low expression in PBL cells. Control cDNA,
CD34, flk2 (fetal liver kinase) and KIT (stem cell factor or aka S
l (steal) factor or c-Kit ligand) is known to be preferentially expressed in HSCs, which is confirmed by transcript imaging.

【００９４】 １０１の選ばれたｃＤＮＡに優先順位をつけるために、２つのアプローチをと
る：配列解析を用いて、それらの新しい分類を確認し、さらに転写産物イメージ
ング実験を行って、末梢血細胞の部分集合中での発現レベルを調べる。ＣＤ３４ ⁺ 細胞に特異的なプローブを用いてマイクロドットアレイを解析し、Ｔ細胞（Ｃ
Ｄ３⁺）、Ｂ細胞（ＣＤ１９⁺）または骨髄性細胞（ＣＤ１１ｂ⁺）と比較する。
優先度の高いｃＤＮＡは、新規であることが確認され、ＨＳＣに限定された発現
を有していた（すなわち、ＰＢＬ、Ｂ、Ｔおよび骨髄性細胞中では相対的に低い
発現）。３つのクローンをここでＳＣＭ２６、ＳＣＭ３およびＳＣＭ１１３と同
定する。各クローンのｃＤＮＡ挿入片を図２、４および６に示す。それは配列番
号１、３および５に相当する。To prioritize the 101 selected cDNAs, two approaches were taken.
: Use sequence analysis to identify these new classifications, and then transcript images
A running experiment is performed to determine the level of expression in a subset of peripheral blood cells. CD34 ⁺ The microdot array is analyzed using a cell-specific probe, and T cells (C
D3⁺), B cells (CD19⁺) Or myeloid cells (CD11b)⁺).
High-priority cDNA was confirmed to be novel and expressed in HSC restricted
(Ie, relatively low in PBL, B, T and myeloid cells)
Expression). The three clones are now identical to SCM26, SCM3 and SCM113.
Set. The cDNA inserts for each clone are shown in FIGS. It is array number
Nos. 1, 3 and 5.

【００９５】 実施例２：ベクターの構築 ｃＤＮＡ挿入片をｐＢＳから、ＭＳＣＶに基づいたレトロウィルスベクター（
Hawley et al., Gene Therapy, 1:136-138(1994)）にサブクローニングする。ｃ
ＤＮＡ挿入片をベクターＭＩＥ中へサブクローニングする（図１参照）。ＭＩＥ
は、ＭＩＮＧＦＲ（Cheng et al., Blood 92:83-92 (1998)）から、神経増殖因
子受容体（ＮＧＦＲ）遺伝子を除去し、それに代えて７０７ｂｐのＮｃｏＩ平滑
ＢｓｐＩ断片上のエンハンストグリーン蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）遺伝子で置換す
ることによって構築する。ＮＧＦＲ遺伝子は、ＣｌａＩで制限消化し、付着末端
を埋め、つぎにＮｃｏＩで消化して置換する。ＥＧＦＰはｐＥＧＦＰ−１（クロ
ンテック）から単離し、ジーンバンク寄託番号Ｕ５５７６１をもっている。ＭＩ
Ｅベクターは、必須成分ＬＴＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰをもっている。ｃＤＮＡ挿
入片を、ＭＩＥのＥｃｏＲＩ部位に、ＳＣＭ３、ＳＣＭ２６およびＳＣＭ１１６
のいずれかのコード領域のＰＣＲおよびＰＣＲ２へのクローニング、ＥｃｏＲＩ
消化によるＰＣＲ２からの除去およびＭＩＥへのライゲーションによって、クロ
ーニングする。これが、ＬＴＲ介在遺伝子発現を与え、リボソームエントリー部
位（ＩＲＥＳ）が、１つの転写一次産物からの関心の対象である遺伝子およびＥ
ＧＦＰ蛋白質の両者の同時翻訳を可能にする。ＥＧＦＰの発現は、形質導入細胞
のＦＡＣＳによる選択を可能にする。Example 2 Construction of Vectors The cDNA insert was converted from pBS into an MSCV-based retroviral vector (
Hawley et al., Gene Therapy, 1: 136-138 (1994)). c
The DNA insert is subcloned into the vector MIE (see FIG. 1). MIE
Removes the nerve growth factor receptor (NGFR) gene from MINGFR (Cheng et al., Blood 92: 83-92 (1998)) and replaces it with an enhanced green fluorescent protein (NcoI blunt BspI fragment of 707 bp) on the NcoI smooth BspI fragment. (EGFP) gene. The NGFR gene is digested with ClaI to fill in sticky ends, then digested with NcoI and replaced. EGFP was isolated from pEGFP-1 (Clontech) and has Genebank accession number U55761. MI
The E vector has the essential component LTR-IRES-EGFP. The cDNA insert was inserted into the EcoRI site of MIE at SCM3, SCM26 and SCM116.
Cloning of any coding region into PCR and PCR2, EcoRI
Cloning by removal from PCR2 by digestion and ligation to MIE. This gives LTR-mediated gene expression, where the ribosome entry site (IRES) is the gene of interest and E from one transcript primary product.
Enables simultaneous translation of both GFP proteins. Expression of EGFP allows transduction cells to be selected by FACS.

【００９６】 配列番号３の全体のコード領域を含むＳＣＭ３ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲによっ
て増幅し、停止コドンがあとに続くフレーム内赤血球凝集素（ＨＡ）標識（５’
ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＣ−
配列番号７）を含む３’プライマ−をＭＩＥベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブク
ローニングする。さらに、ＳＣＭ３遺伝子の３’および５’切断（トランケーシ
ョン）を行う。５’末端はＤＮＡ結合領域を欠いている。この断片は、図２のヌ
クレオチド残基８１〜ヌクレオチド残基７８３に示されている。３’断片は、ヌ
クレオチド残基７８４〜ヌクレオチド残基１７１０のジンクフィンガードメイン
である。５’および３’断片を含むベクターを、上記の通りにして、３’断片に
ついては５’ＰＣＲプライマーがフレーム内ＡＴＧ開始コドンを含むことを除い
て、ＳＣＭ３の全長で構築する。ＨＡ標識および抗ＨＡ抗体を用いて、ウエスタ
ンブロットにより蛋白質の発現を追跡する。配列番号１の全体のコード領域を含
むＳＣＭ２６ｃＤＮＡ断片を、ｐＢＳから、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩでの消化に
よりクローニングする。ＭＩＥをＥｃｏＲＩで消化し、付着末端を埋め、つぎに
ＸｈｏＩで消化する。ＳＣＭ２６断片を、平滑／ＸｈｏＩ切断ＭＩＥにライゲー
トする。配列番号５の全コード領域を含むＳＣＭ１１３ｃＤＮＡを、ＳＣＭ３に
ついて記載した通りにして、ＭＩＥにクローニングする。An SCM3 cDNA fragment containing the entire coding region of SEQ ID NO: 3 was amplified by PCR and the in-frame hemagglutinin (HA) tag (5 ′) followed by a stop codon
TAC CCC TAC GAC GTG CCC GAC TAC GCC-
The 3 'primer containing SEQ ID NO: 7) is subcloned into the EcoRI site of the MIE vector. Further, 3 ′ and 5 ′ truncation of the SCM3 gene is performed. The 5 'end lacks a DNA binding region. This fragment is shown at nucleotide residue 81 to nucleotide residue 783 in FIG. The 3 'fragment is a zinc finger domain from nucleotide residue 784 to nucleotide residue 1710. Vectors containing the 5 'and 3' fragments are constructed as described above with the full length of SCM3, except that for the 3 'fragment, the 5' PCR primer contains an in-frame ATG start codon. Protein expression is followed by Western blot using HA label and anti-HA antibody. The SCM26 cDNA fragment containing the entire coding region of SEQ ID NO: 1 is cloned from pBS by digestion with SmaI and XhoI. MIE is digested with EcoRI to fill in cohesive ends and then digested with XhoI. The SCM26 fragment is ligated into the blunt / XhoI cut MIE. The SCM113 cDNA containing the entire coding region of SEQ ID NO: 5 is cloned into MIE as described for SCM3.

【００９７】 実施例３：レトロウィルス感染 ノランラボラトリ−ズから入手したＲＶパッケージング細胞系ｐｈｏｅｎｉｘ
（Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7(12):1405-1413, 1995）に標準的ト
ランスフェクションプロトコール（プロメガ）を用いて感染させることによって
レトロウィルスベクターを製出する。４８時間後、ウィルス上澄みを集める。Example 3 Retroviral Infection RV Packaging Cell Line Phoenix from Nolan Laboratories
Retrovirus vectors are produced by infecting (Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7 (12): 1405-1413, 1995) using a standard transfection protocol (Promega). After 48 hours, collect the virus supernatant.

【００９８】 インフォームドコンセントに続いて、７．５または１０．０μｇ／ｋｇ／日の
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で５−６日間可動化させた正常成人ドナ
ーから白血球搬出試料を得る。ＣＤ３４⁺ 細胞を、白血球搬出試料から、ＳｙＳ
ｔｅｍｉｘ社（Palo Alto, CA）でＩｓｏｌｅｘ３００ＳＡまたは３００Ｉ（Bax
ter Healthcare Corp., Deerfield Ill.）を用いて、Young et al., Blood, 88:
1619-1631, (1996) 記載のようにして、当業界で周知の方法によって、富化させ
る。Following informed consent, leukocyte export samples are obtained from normal adult donors mobilized for 5-6 days with 7.5 or 10.0 μg / kg / day of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) . CD34 ⁺ cells were isolated from leukocyte export samples using SyS
Tekix (Palo Alto, CA) sells Isolex 300SA or 300I (Bax
ter Healthcare Corp., Deerfield Ill.) using Young et al., Blood, 88:
1619-1631, (1996), enriched by methods well known in the art.

【００９９】 ＣＤ３４⁺ 細胞を、１ｍｌ当たり細胞２ｘ１０⁶ 個の割合で、血清不含ｅｘ
ｖｉｖｏ１５培地（BioWhittaker, Walkerville, MD）中１０ｍＬ培養で４８時
間３７℃、５％ＣＯ₂ のもとで培養する。培養には、Luens et al., Blood, 91(
4):1206-1215 (1998) に記載されている通り、ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ（R &D
Systems, Minneapolis, MN）；ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ（SyStemix, Palo Al
to CA）；Ｆｌｔ３−Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬ（SyStemix, Palo Alto CA）；およ
びＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍＬを補足する。４８時間後、細胞を４０００ｒｐｍで
３７℃で５分間遠心分離し、すぐ上に記載したのと同じ培地に再懸濁させる。細
胞を、同体積のレトロウィルス上澄みを含むフィブロネクチン断片ＣＨ−２９６
（ＦＮ）（BioWhittaker, Walkerville, MD ）被覆プレート（１０μｇ／ｍＬ）
に加え、ポリブレンも硫酸プロタミンも加えずに、３７℃で５％ＣＯ₂ 中で２０
時間培養する。（Hanenburg et al., Human Gene Therapy, 8:2193-2206, 1997
）。細胞を洗い、さらに７２時間、ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ；ＳＣＦ、１００
ｎｇ／ｍＬ；Ｆｌｔ３−Ｌ、１００ｎｇ／ｍＬおよびＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍＬ
を補足した血清不含ｅｘ ｖｉｖｏ１５培地（BioWhittaker, Walkerville, MD
）とともにインキュベートする。インキュベーション後、ＣＤ３４⁺ 細胞または
若干の場合にはＥＧＦＰを発現するＴｈｙ−１⁺ 細胞をフローサイトメトリーに
より精製し、下記の種々の機能アッセイに付す。対照は、並行培養においてＥＧ
ＦＰのみを含むＭＩＥベクターにより形質導入した細胞からなる。[0099] CD34 ⁺ cells were serum-free ex at a rate of 2 × 10 ⁶ cells / ml.
Cultivate in a 10 mL culture in vivo 15 medium (BioWhittaker, Walkerville, MD) for 48 hours at 37 ° C., 5% CO ₂ . Cultures include Luens et al., Blood, 91 (
4): 1206-1215 (1998), TPO, 100 ng / mL (R & D
Systems, Minneapolis, MN); SCF, 100 ng / mL (SyStemix, Palo Al
Supplement with Flt3-L, 100 ng / mL (SyStemix, Palo Alto CA); and IL-6, 20 ng / mL. After 48 hours, cells are centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes at 37 ° C. and resuspended in the same medium as described immediately above. Cells were harvested with the fibronectin fragment CH-296 containing the same volume of retroviral supernatant.
(FN) (BioWhittaker, Walkerville, MD) coated plate (10 μg / mL)
In addition, no polybrene or protamine sulfate was added at 37 ° C. in 5% CO ₂ for 20 minutes.
Incubate for hours. (Hanenburg et al., Human Gene Therapy, 8: 2193-2206, 1997
). Wash cells and add TPO, 100 ng / mL; SCF, 100
ng / mL; Flt3-L, 100 ng / mL and IL-6, 20 ng / mL
Ex vivo 15 medium supplemented with serum (BioWhittaker, Walkerville, MD)
). After incubation, CD34 ⁺ cells or, in some cases, Thy-1 ⁺ cells expressing EGFP are purified by flow cytometry and subjected to various functional assays described below. The control was EG in parallel culture.
Consists of cells transduced with the MIE vector containing only FP.

【０１００】 レトロウィルスによる形質導入は、ほとんど壊変のないＥＧＦＰの安定な構成
的発現（少なくとも６週間）という結果になる。これは、増殖培養に続いての細
胞の蛍光活性化選別（ＦＡＣＳ）によって確認される。ＳＣＭ３および２６の発
現が、ウエスタンブロッティングによって確認される。Transduction with retrovirus results in stable constitutive expression of EGFP with little decay (at least 6 weeks). This is confirmed by fluorescence activated sorting (FACS) of cells following growth culture. Expression of SCM3 and 26 is confirmed by Western blotting.

【０１０１】 実施例４：細胞選別 細胞を抗ＣＤ３４−ＡＰＣＭｏＡｂまたはアイソタイプ対照（Becton Dickins
on）により染色する。染色緩衝液はＨＢＳＳ／２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およ
び１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳで、５μｇ／ｍＬの抗Ｔｈｙ−１（ＧＭ２０１
）ＰＥ−複合ＭｏＡｂとともに氷上に２０分間置く。細胞をＳＢで２回洗い、つ
ぎに沃化プロピジウム（１０μｇ／ｍＬ）含有ＳＢ中に再懸濁させる。ＦＡＣＳ
ＴＡＲプラスセルソーター（Becton Dickinson, San Jose, CA）上で細胞を選別
する。ＥＧＦＰの蛍光をＦＩＴＣチャネルで検出する。ＣＤ３４⁺ およびＣＤ３
４^- 領域ならびにＴｈｙ−１⁺ およびＴｈｙ−１^- を、アイソタイプ対照を用い
て定める。ＥＧＦＰ⁺ 領域からの細胞集団を、沃化プロピジウム取込みが高く、
ＣＤ３４⁺ 細胞（またはＣＤ３４⁺ 細胞のＴｈｙ−１⁺ 部分集合）表面で電子的
ゲート開閉をする細胞を除去後、選別する。選別細胞の再解析により、ＥＧＦＰ ⁺ Ｔｈｙ−１⁺ 細胞選別後、ＥＧＦＰ ＣＤ３４⁺ が９０％以上、Ｔｈｙ−１⁺
が６０％〜９５％の純度が示される。Example 4 Cell Sorting Cells were sorted for anti-CD34-APCP MoAb or isotype control (Becton Dickins
on). Staining buffers were HBSS / 2% fetal calf serum (FCS) and
And 10 mmol / L HEPES, 5 μg / mL anti-Thy-1 (GM201
) Place on ice with PE-conjugated MoAb for 20 minutes. Wash cells twice with SB
And resuspended in SB containing propidium iodide (10 μg / mL). FACS
Sort cells on TAR Plus Cell Sorter (Becton Dickinson, San Jose, CA)
I do. EGFP fluorescence is detected on the FITC channel. CD34⁺And CD3
4^-Region and Thy-1⁺And Thy-1^-Using the isotype control
Determined. EGFP⁺Cell populations from the region, with high propidium iodide uptake,
CD34⁺Cells (or CD34⁺Thy-1 of cells⁺Subset) electronic on the surface
After removing the cells that open and close the gate, they are sorted. By reanalyzing the sorted cells, EGFP ⁺ Thy-1⁺After cell sorting, EGFP CD34⁺Is 90% or more, and Thy-1⁺
Indicates a purity of 60% to 95%.

【０１０２】 実施例５；液体培養アッセイ 選別後、血球計数器を用いて細胞を計数し、４０，０００または６０，０００
個の細胞を、ＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬ
（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するｅｘ ｖｉｖｏ
１５培地中、細胞濃度０．２ｘ１０⁶ ／ｍＬでインキュベ−トする。３、６、１
０、１４および２１日目に、生存および死滅細胞の数を、トリパンブルー排除に
よって計数する。これらの方法は、当業界において周知である。つぎに、細胞を
０．２ｘ１０⁶ ／ｍＬでプレーティングする。Example 5 Liquid Culture Assay After sorting, cells were counted using a haemocytometer and 40,000 or 60,000
Cells were analyzed using TPO (100 ng / mL), SCF (100 ng / mL), FL
(100 ng / mL), ex vivo containing IL-6 (20 ng / mL)
Incubate at a cell concentration of 0.2 × 10 ⁶ / mL in 15 media. 3, 6, 1
On days 0, 14, and 21, the number of live and dead cells is counted by trypan blue exclusion. These methods are well-known in the art. Next, cells are plated at 0.2 × 10 ⁶ / mL.

【０１０３】 ＳＣＭ３の発現は、２週間の培養後の細胞増殖に正の効果をもつ。ＳＣＭ３の
過剰発現は、最初の７日間の培養の間はほとんど効果をもたないが、１４日目ま
でに、ＳＣＭ発現細胞の培養液は、増強された生存度および増殖を示す。この効
果は２か月間続く。ＳＣＭ３発現細胞は増殖し続けるが、対照細胞は増殖を停止
した（図７）。６週間の液体培養ののち、クローン原性細胞（ＣＦＵ−Ｃ）の数
を求める（実施例６）。ＳＣＭ３を過剰発現する細胞は、対照細胞と比較してＣ
ＦＵ−Ｃの頻度が２０倍に増強される。SCM3 expression has a positive effect on cell proliferation after 2 weeks of culture. Overexpression of SCM3 has little effect during the first 7 days of culture, but by day 14, cultures of SCM expressing cells show enhanced viability and proliferation. This effect lasts for two months. SCM3-expressing cells continued to grow, while control cells stopped growing (FIG. 7). After 6 weeks of liquid culture, the number of clonogenic cells (CFU-C) is determined (Example 6). Cells overexpressing SCM3 have a higher C
The frequency of FU-C is increased 20-fold.

【０１０４】 実施例６：ＣＦＵ−Ｃアッセイ ＳＣＭ３、ＳＣＭ１１３またはＳＣＭ２６の過剰発現が前駆細胞の増殖に及ぼ
す影響を調べるために、ＥＧＦＰ発現細胞または対照細胞を選別し、ＣＦＵ−Ｃ
アッセイにかける。このアッセイは、造血増殖因子（コロニー刺激因子およびイ
ンターロイキン類）の存在下に半固体培地（メチルセルロース）中に懸濁させた
細胞から成長するコロニー（クローン原性細胞）を数えるものである。クローン
原性細胞（ＣＦＵ−Ｃ）の計数は、前駆細胞含量を求めるために広く実施されて
いるアッセイである。Example 6: CFU-C Assay To examine the effect of overexpression of SCM3, SCM113 or SCM26 on progenitor cell proliferation, EGFP expressing cells or control cells were sorted and CFU-C
Run the assay. This assay counts colonies (clonogenic cells) that grow from cells suspended in semi-solid medium (methylcellulose) in the presence of hematopoietic growth factors (colony stimulating factors and interleukins). Counting clonogenic cells (CFU-C) is a widely practiced assay for determining progenitor cell content.

【０１０５】 ＣＦＵ−Ｃアッセイは、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）；ＩＬ−６（１０ｎｇ／
ｍＬ）；ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）；およびＥＰＯ（２Ｕ／ｍＬ）を補足した
ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４２３０メチルセルロース（Stem Cell Technologies
Inc., Vancouver, Canada V5Z4J7）を用いる。選別細胞を３５ｍｍ皿にプレーテ
ィングし、各実験条件について３枚の皿からの平均をとる。コロニーをＣＦＵ−
Ｍ（骨髄性様）、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球性様）またはＣＦＵ−Ｍｉｘ（混合）とし
て分類する。The CFU-C assay included IL-3 (10 ng / mL); IL-6 (10 ng / mL).
MethoCult H4230 methylcellulose (Stem Cell Technologies) supplemented with SCF (100 ng / mL); and EPO (2 U / mL).
Inc., Vancouver, Canada V5Z4J7). The sorted cells are plated in 35 mm dishes and averaged from three dishes for each experimental condition. Colonies are CFU-
Classify as M (myeloid-like), CFU-E (erythroid-like) or CFU-Mix (mixed).

【０１０６】 ＳＣＭ３の過剰発現は、ＣＦＵ−Ｃ頻度のわずかな減少をきたす。７つの異な
る実験において一貫して観察されたのは、ＣＦＵ−Ｍの数の３０％の減少（差は
有意）、ＣＦＵ−Ｅの数の減少（差は有意ではない）およびより原始的なＣＦＵ
−ＭＩＸの減少なしの数である。Overexpression of SCM3 results in a slight decrease in CFU-C frequency. Consistently observed in seven different experiments were a 30% reduction in the number of CFU-M (the difference was significant), a reduction in the number of CFU-E (the difference was not significant) and a more primitive CFU.
-Number without MIX reduction.

【０１０７】 ＳＣＭ１１３の過剰発現の結果は、全ＣＦＵ−Ｃの４０％の減少で、赤血球性
および骨髄性系統ともに有意である。ＳＣＭ２６の過剰発現はまた、単一系統の
コロニーの数の減少という結果になる：赤血球性コロニーは３０％の減少、骨髄
性コロニーは２倍に減少。これとは対照的に、ＳＣＭ２６の過剰発現は、ＣＦＵ
−Ｃアッセイにおける混合タイプのコロニーの数を２倍増加させる（差は有意）
。データは示さない。The result of overexpression of SCM113 is significant for both erythroid and myeloid lineages with a 40% reduction in total CFU-C. Overexpression of SCM26 also results in a reduction in the number of colonies of a single lineage: erythroid colonies are reduced by 30% and myeloid colonies are reduced by a factor of 2. In contrast, overexpression of SCM26 resulted in CFU
Increase the number of mixed-type colonies in the -C assay by two-fold (the difference is significant)
. Data not shown.

【０１０８】 実施例７：ＣＦＵＣの二次コロニーへの再プレーティング 生物学的潜在能力をさらに評価するために、メチルセルロースからの細胞を集
め、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）；ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）；ＳＣＦ（１０
０ｎｇ／ｍＬ）；およびＥＰＯ（２Ｕ／ｍＬ）を含有する二次培養中へプレーテ
ィングする。１４日間の培養後、皿を２ｘ燐酸緩衝生理食塩水（ダルベッコ）で
洗うことによって細胞をメチルセルロースから集め、上記の通りのメチルセルロ
ース培養中へ１００００細胞／皿で再プレーティングする。ＳＣＭ３の過剰発現
は、対照細胞と比較して、二次コロニーの数を４．７倍増加させる。ＳＣＭ２６
およびＳＣＭ１１３についても同様の結果が見られる。ＳＣＭ１１３の発現は、
再プレーティング効率を平均４．５倍だけ増大させた。Example 7: Replating of CFUC into secondary colonies To further evaluate biological potential, cells from methylcellulose were collected and IL-3 (10 ng / mL); IL-6 (10 ng) / ML); SCF (10
0 ng / mL); and plated into subcultures containing EPO (2 U / mL). After 14 days of culture, cells are harvested from methylcellulose by washing the dishes with 2x phosphate buffered saline (Dulbecco) and replated at 10,000 cells / dish into methylcellulose culture as described above. Overexpression of SCM3 increases the number of secondary colonies by 4.7-fold compared to control cells. SCM26
A similar result is seen for SCM113 and SCM113. The expression of SCM113 is
The replating efficiency was increased by an average of 4.5 times.

【０１０９】 実施例８：メチルセルロースまたは液体培養後の細胞の表現型解析 ＣＦＵ−Ｃアッセイおよび１４日間の液体培養ののち、ＳＣＭ３の過剰発現が
骨髄性分化に与える影響をＦＡＣＳを用いて評価する。細胞を集め、分化マーカ
ー（細胞表面マーカー、ＣＤ１４、ＣＤ１３およびＣＤ３３、Barclay et al.,T
he Leucocyte Antigen Facts Book, Acadmic Press, pp. 132, 130, 174 (1993)
に記載されている通り）の発現を知るために染色する。Becton Dickinson, Mon
oclonal Antibody Source Book - Becton Dickinson Immunocytometry Systems
- San Jose, CA 95131-1807発行）も参照されたい。Example 8: Phenotypic analysis of cells after methylcellulose or liquid culture After CFU-C assay and 14 days liquid culture, the effect of SCM3 overexpression on myeloid differentiation is assessed using FACS. Cells were collected and differentiation markers (cell surface markers, CD14, CD13 and CD33, Barclay et al., T
he Leucocyte Antigen Facts Book, Acadmic Press, pp. 132, 130, 174 (1993)
(As described in). Becton Dickinson, Mon
oclonal Antibody Source Book-Becton Dickinson Immunocytometry Systems
-San Jose, CA 95131-1807).

【０１１０】 ＳＣＭ３の発現は、造血前駆細胞の骨髄性分化を阻害するという結果になる（
表２）。平均して、ＳＣＭ３の過剰発現は、骨髄性マーカー（ＣＤ１４、表２、
およびＣＤ１３、データは示さず）を発現する細胞の百分率および絶対数におい
て２倍の減少をきたす。これは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−３、ＳＣＦ、
ＥＰＯの存在下でのメチルセルロース中で、またはＴＰＯ、Ｆｌｔ３、ＣＳＦ、
ＩＬ−６の存在下での液体培養液中で２または３週間培養したのちに認められる
（差は有意）。絶対的発現レベル（蛍光の平均）も減少させられる（データは示
さず）。ＳＣＭ２６およびＳＣＭ１１３についても類似の結果が見られる。The expression of SCM3 results in inhibiting myeloid differentiation of hematopoietic progenitor cells (
Table 2). On average, overexpression of SCM3 is associated with myeloid markers (CD14, Table 2,
And CD13, data not shown) resulting in a two-fold reduction in the percentage and absolute number of cells expressing. This is GM-CSF, IL-6, IL-3, SCF,
In methylcellulose in the presence of EPO or TPO, Flt3, CSF,
It is observed after 2 or 3 weeks of culture in liquid culture in the presence of IL-6 (the difference is significant). Absolute expression levels (average of fluorescence) are also reduced (data not shown). Similar results are seen for SCM 26 and SCM 113.

【０１１１】[0111]

【表２】 [Table 2]

【０１１２】 表２は、ＳＣＭ３、ＳＣＭ１１３、ＳＣＭ２６およびＳＣＭ３のアミノ酸残基
２４０−５４３の過剰発現のある細胞表面でのＣＤ１４⁺ の発現に関するデータ
を示している。ＣＤ１４発現減少倍率は、対照ＭＩＥベクターのみで形質導入し
た細胞に対して示されている。Table 2 shows data for CD14 ⁺ expression on the cell surface with overexpression of amino acid residues 240-543 of SCM3, SCM113, SCM26 and SCM3. The fold reduction in CD14 expression is shown for cells transduced with the control MIE vector alone.

【０１１３】 実施例９：ＳＣＩＤ−骨アッセイ 上記のごとき形質導入細胞を、照射ＳＣＩＤ−ｈｕマウスに注射する。ＳＣＩ
Ｄ骨アッセイを、Murray et al., Blood, 85:368, 1995に記載されている通りに
行う。Ｃ．Ｂ．−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスを、ヒト胎児骨移植片のレシピ
エントとして用いる。ＳＣＩＤ−ｈｕ骨モデルにおいてドナー再構成をもたらす
ＳＣＭ３、ＳＣＭ２６またはＳＣＭ１１３発現細胞または対照細胞の用量を求め
るために、限界希釈分析を実施する。胎児骨移植片を、細胞注射のすぐ前に全身
照射（３５０ｒａｄ）を受けたマウスに、移植片当たり５，０００、１０，００
０および３０，０００個という細胞用量で注射する。細胞は、ＥＧＦＰ発現につ
いて選別していない。注射から６週間後、骨移植片を回収し、骨髄細胞を集め、
ＥＧＦＰの蛍光および当業界において周知の方法によって、ドナー細胞の植え付
けを解析する。Example 9: SCID-bone assay Transduced cells as described above are injected into irradiated SCID-hu mice. SCI
The D bone assay is performed as described in Murray et al., Blood, 85: 368, 1995. C. B. -17 scid / scid mice are used as recipients of human fetal bone grafts. A limiting dilution analysis is performed to determine the dose of SCM3, SCM26 or SCM113 expressing cells or control cells that result in donor reconstitution in the SCID-hu bone model. Fetal bone grafts were administered to mice receiving total body irradiation (350 rad) immediately prior to cell injection at 5,000, 10,000,
Inject at 0 and 30,000 cell doses. Cells have not been sorted for EGFP expression. Six weeks after injection, bone grafts were collected, bone marrow cells were collected,
Analyze donor cell seeding by EGFP fluorescence and methods well known in the art.

【０１１４】 実施例１０：ＳＣＭ抗体の産生 配列番号２のアミノ酸残基２５−８２に相当するＳＣＭ２６の断片に対するポ
リクローナル抗体を、当業界において周知の方法により、生成させ、ウサギを免
疫するのに用いる。（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al.編(198
7)）。Example 10 Production of SCM Antibodies A polyclonal antibody against a fragment of SCM26 corresponding to amino acid residues 25-82 of SEQ ID NO: 2 is generated and used to immunize rabbits by methods well known in the art. . (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al. Ed. (198
7)).

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 ＭＩＥベクターを示す。FIG. 1 shows the MIE vector.

【図２】 ＳＣＭ２６のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示す。FIG. 2 shows the nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of SCM26.

【図３】 Ａは、ＳＣＭ２６および予測シグナルペプチドおよび７つの膜貫通領域の疎水
性プロットを示す。Ｂは、ＳＣＭ２６蛋白質の膜内での予測されるトポロジーを
示す。Ｃは、ＳＣＭ２６蛋白質がＣＤ３４^＋細胞中で富化されていることを示す
。FIG. 3A shows a hydrophobicity plot of SCM26 and the predicted signal peptide and seven transmembrane regions. B shows the predicted topology of the SCM26 protein in the membrane. C indicates that the SCM26 protein is enriched in CD34 ⁺ cells.

【図４】 ＳＣＭ３のヌクレオチド配列を示す。FIG. 4 shows the nucleotide sequence of SCM3.

【図５】 ＳＣＭ３蛋白質の特異的特徴を示す。FIG. 5 shows the specific characteristics of the SCM3 protein.

【図６】 ２０２７個のヌクレオチドを有し、ヌクレオチド７２から１８８９までのオー
プンリーディングフレームをもち、６０７アミノ酸からなる予測蛋白質をコード
するＳＣＭ１１３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。FIG. 6 shows the nucleotide and amino acid sequence of SCM113, which has 2027 nucleotides, has an open reading frame from nucleotides 72 to 1889, and encodes a predicted protein consisting of 607 amino acids.

【図７】 液体培養で増殖させ、ＳＣＭ３をコードするポリヌクレオチド配列を導入した
遺伝的修飾細胞の増殖維持を示す。FIG. 7 shows the maintenance of growth of genetically modified cells grown in liquid culture and transfected with a polynucleotide sequence encoding SCM3.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 シレンコ・オクサーナ・イバニブナ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94002ベルモント，オーク・ノール・ドラ イブ 1816番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 DA03 EA02 GA11 GA18 GA27 HA13 HA14 HA17 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA24 BB01 BC01 BD50 CA24 CA43 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA22 CA53 ZA51 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 5/00 B G01N 33/53 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), E A (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ , LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW F-term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 DA03 EA02 GA11 GA18 GA27 HA13 HA14 HA17 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA24 BB01 BC01 BD50 CA24 CA43 CA44 CA02 A01A53A13A53A

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記からなる群から選ばれた配列を含むポリペプチドをコー
ドする単離されたポリヌクレオチド配列： ａ）配列番号２のアミノ酸配列； ｂ）配列番号４のアミノ酸配列； ｃ）配列番号４の残基１−２３９のアミノ酸配列； ｄ）配列番号４の残基２４０−５４３のアミノ酸配列； ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；および ｆ）上記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の配列に機能上均等なアミノ酸配
列。1. An isolated polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising a sequence selected from the group consisting of: a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; c) the sequence Amino acid sequence of residues 1-239 of SEQ ID NO: 4; d) amino acid sequence of residues 240-543 of SEQ ID NO: 4; e) amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; and f) a), b), c), d above A) an amino acid sequence that is functionally equivalent to the sequence of e). 【請求項２】 該機能上均等なアミノ酸配列が上記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）
またはｅ）の配列と少なくとも８５％が一致する請求項１の単離されたポリヌク
レオチド。2. The method according to claim 1, wherein said functionally equivalent amino acid sequence is a), b), c) or d).
Or the isolated polynucleotide of claim 1, which at least 85% matches the sequence of e). 【請求項３】 下記からなる群から選ばれたヌクレオチド配列を含む単離さ
れたＤＮＡ配列： ａ）配列番号１のポリヌクレオチド配列； ｂ）配列番号３のポリヌクレオチド配列； ｃ）配列番号５のポリヌクレオチド配列； ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の断片；および ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％
が一致するポリヌクレオチド配列。3. An isolated DNA sequence comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: a) a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; b) a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 3; c) a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 5. D) a fragment of the polynucleotide sequence of a), b) or c); and e) at least 85% of the polynucleotide sequence of a), b), c) or d).
A polynucleotide sequence that matches 【請求項４】 下記からなる群から選ばれた一員を含む単離されたポリペプ
チド： ａ）配列番号２のアミノ酸配列； ｂ）配列番号４のアミノ酸配列； ｃ）配列番号４の残基１−２３９のアミノ酸配列； ｄ）配列番号４の残基２４０−５４３のアミノ酸配列； ｅ）配列番号６のアミノ酸配列；および ｆ）上記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のポリペプチドと少なくとも８５
％が一致するポリペプチド。4. An isolated polypeptide comprising a member selected from the group consisting of: a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; b) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; c) residue 1 of SEQ ID NO: 4. -239 amino acid sequence; d) amino acid sequence of residues 240-543 of SEQ ID NO: 4; e) amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; and f) poly of the above a), b), c), d) or e) At least 85 with peptide
% Matched polypeptides. 【請求項５】 下記からなる群から選ばれた一員を含む単離されたポリペプ
チド： ａ）配列番号２のアミノ酸残基２６−４０； ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２５−８２； ｃ）配列番号２のアミノ酸残基１４７−１５７； ｄ）配列番号２のアミノ酸残基２６６−２７５；および ｅ）上記ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８５％が一致するポリペプ
チド。5. An isolated polypeptide comprising a member selected from the group consisting of: a) amino acid residues 26-40 of SEQ ID NO: 2; b) amino acid residues 25-82 of SEQ ID NO: 2; c. A) amino acid residues 147-157 of SEQ ID NO: 2; d) amino acid residues 266-275 of SEQ ID NO: 2; and e) a polypeptide that is at least 85% identical to a), b), c) or d) above. 【請求項６】 請求項１〜３のいずれかのポリヌクレオチド配列を含むベク
ター。6. A vector comprising the polynucleotide sequence according to claim 1. 【請求項７】 請求項６のベクターを含む宿主細胞。7. A host cell comprising the vector of claim 6. 【請求項８】 下記の工程を含む、対象哺乳動物中で造血幹細胞の有効量を
増加させる方法： ａ）亜集団の造血幹細胞を包含するＣＤ３４^＋細胞の集団を得る； ｂ）該ＣＤ３４^＋細胞の集団に請求項１または２に従ったポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列を導入する； ｃ）該ポリペプチドを過剰発現する遺伝的に修飾された幹細胞の亜集団を得る
；そして、 ｄ）該遺伝的に修飾された幹細胞の亜集団を対象哺乳動物に投与して、そこに
おいて造血幹細胞の有効量を増加させる。8. A method for increasing the effective amount of hematopoietic stem cells in a subject mammal, comprising the steps of: a) obtaining a population of CD34 ⁺ cells comprising a subpopulation of hematopoietic stem cells; b) said CD34 ⁺ cells Introducing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide according to claim 1 or 2 into a population of c) obtaining a subpopulation of genetically modified stem cells overexpressing said polypeptide; A subpopulation of genetically modified stem cells is administered to a subject mammal, where the effective amount of hematopoietic stem cells is increased. 【請求項９】 下記の工程を含む、遺伝子修飾細胞の有効量を増加させる方
法： ａ）亜集団の造血幹細胞を包含する造血ＣＤ３４^＋細胞の集団を得る； ｂ）該ＣＤ３４^＋細胞の集団に請求項１または２に従ったポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列を導入する； ｃ）該ＣＤ３４^＋細胞の集団に第二のポリヌクレオチド配列を導入し、ここに
該第二のポリヌクレオチドは治療用遺伝子を含む； ｄ）遺伝的に修飾された細胞を得、ここに該細胞は請求項１に従ったポリペプ
チド配列および該治療用遺伝子を発現することができ、治療用遺伝子を発現しう
る細胞の有効量が野生型細胞と比較して増加させられている；および ｅ）それら遺伝的に修飾された細胞を対象哺乳動物に投与する。9. A method for increasing the effective amount of a genetically modified cell comprising the steps of: a) obtaining a population of hematopoietic CD34 ⁺ cells including a subpopulation of hematopoietic stem cells; b) providing a population of said CD34 ⁺ cells. Introducing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide according to claim 1 or 2; c) introducing a second polynucleotide sequence into said population of CD34 ⁺ cells, wherein said second polynucleotide is therapeutic. D) obtaining a genetically modified cell, wherein said cell is capable of expressing a polypeptide sequence according to claim 1 and said therapeutic gene, and capable of expressing a therapeutic gene. And e) administering the genetically modified cells to a subject mammal. 【請求項１０】 下記の工程を含む、インビトロで哺乳動物造血幹細胞の分
化を阻害する方法： ａ）造血細胞源からＣＤ３４^＋細胞を単離する； ｂ）請求項１または２のいずれかのポリヌクレオチド配列を含むベクターをそ
れらＣＤ３４^＋細胞に導入し、それにより、該ベクターによって該細胞の集団を
遺伝的に修飾する； ｃ）それら修飾されたＣＤ３４^＋細胞を、それら修飾されたＣＤ３４^＋細胞の
増殖を維持するのに十分な量の少なくとも１種のサイトカインの存在下に培養す
る；および ｄ）コードされているポリペプチドが過剰発現され、それによって分化が阻害
されている細胞を選択する。10. A method for inhibiting the differentiation of mammalian hematopoietic stem cells in vitro comprising the steps of: a) isolating CD34 ⁺ cells from a hematopoietic cell source; b) the polymorph of claim 1 or 2 Introducing a vector comprising the nucleotide sequence into the CD34 ⁺ cells, thereby genetically modifying the population of cells with the vector; c) replacing the modified CD34 ⁺ cells with the modified CD34 ⁺ cells. Cultivate in the presence of an amount of at least one cytokine sufficient to maintain proliferation; and d) Select cells in which the encoded polypeptide is overexpressed, thereby inhibiting differentiation. 【請求項１１】 下記の工程を含む、哺乳動物造血幹細胞の分化を阻害する
方法： ａ）請求項１または２のいずれかのポリヌクレオチド配列を含むベクターをＣ
Ｄ３４^＋細胞に導入する； ｂ）該細胞の集団を該ポリヌクレオチド配列によって遺伝的に修飾する； ｃ）該細胞中での該ポリヌクレオチドの発現を許容する；および ｄ）該遺伝的に修飾された細胞の分化を阻害する。11. A method for inhibiting differentiation of a mammalian hematopoietic stem cell, comprising the steps of: a) converting a vector comprising the polynucleotide sequence of claim 1 or 2 into C
D34 ⁺ cells; b) genetically modifying said population of cells with said polynucleotide sequence; c) allowing expression of said polynucleotide in said cells; and d) said genetically modified Inhibit the differentiation of cells. 【請求項１２】 下記からなる、造血幹細胞またはそれらの子孫を同定する
方法： ａ）請求項４または５のいずれかのポリペプチドに対する抗体を調製する； ｂ）該抗体を精製する； ｃ）造血細胞の集団を該抗体に暴露する； ｄ）該細胞が該抗体と結合するのを許容する；および ｅ）該結合細胞を選択する。12. A method for identifying hematopoietic stem cells or their progeny, comprising: a) preparing an antibody against the polypeptide of any of claims 4 or 5; b) purifying said antibody; c) hematopoiesis Exposing a population of cells to the antibody; d) allowing the cells to bind to the antibody; and e) selecting the binding cells.