JP2002524029A - Ｄｅａｄボックスタンパク質ファミリーの遺伝子、その発現産物および使用 - Google Patents

Ｄｅａｄボックスタンパク質ファミリーの遺伝子、その発現産物および使用

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アヴェンティス・リサーチ・ウント・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、既知のＤＥＡＤボックスタンパク質に相同であり、ＲＮＡヘリカーゼに対応し、そして繊毛虫類から得ることが可能な、２つの新規核酸（Ｈｃ１およびＨｃ２）の調製に関する。本発明はまた、組換えＤＮＡ技術を用いた、適切な標的細胞への該新規核酸の挿入にも、そして転写および翻訳を制御するための、その使用にも関する。さらに、本発明は、新規タンパク質を産生するための新規核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写に、そして治療および診断におけるその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、発現産物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、好ましく
はＤＥＡＤボックス（ｂｏｘ）タンパク質ファミリー由来のＲＮＡヘリカーゼ（
ＲＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅｓ）をコードする、繊毛虫類（ｃｉｌｉａｔｅｓ）由
来の新規核酸の調製、およびその使用に関する。
【０００２】 細胞ＲＮＡは異なる二次および三次構造で細胞に存在し、そしてさらに、多く
のＲＮＡ結合タンパク質がＲＮＡのさらなる構造形成を提供し、ＲＮＡ構造の調
節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、細胞過程、例えばプレｍＲＮＡスプライシング
、ＲＮＡ輸送またはタンパク質翻訳に必須の機能を有する。いわゆるＤＥＡＤタ
ンパク質ファミリー由来のタンパク質は、とりわけ、これらの調節過程に関与す
る。本タンパク質スーパーファミリーのメンバーは、特徴的に、いくつかの相同
タンパク質配列、いわゆる「タンパク質ボックス（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｏｘｅｓ
）」を含み、モチーフとして高度に保存されたテトラペプチドＡｓｐ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ａｓｐ、一文字コードでＤＥＡＤにちなんで名付けられている。本タン
パク質スーパーファミリーは、特に、ＲＮＡヘリカーゼを含む。
【０００３】 ＤＥＡＤタンパク質に特徴的なタンパク質配列は、進化において高度に保存さ
れている（図１を参照されたい）。 ＤＥＡＤスーパーファミリーは、多様なサブファミリーに分割され、これらは
その配列モチーフにしたがい、ＤＥＡＤ、ＤＥＡＨまたはＤＥｘＨサブファミリ
ーと称される。ファミリーメンバーはすべて、ＡＴＰ結合およびＲＮＡ結合機能
を有し、そしてまたＡＴＰ加水分解および大部分はＲＮＡヘリカーゼ機能を有す
る（図２）。およそ３００のアミノ酸を含み、そして多様な長さの非保存アミノ
酸配列が隣接する保存領域は、ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーの多様な
メンバーの特徴である（Ｓｃｈｍｉｄ Ｓ．Ｒ．， Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｐ．，
Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９１ １１：３４６３−３４７１）。
【０００４】 いわゆる相同ボックス（保存モチーフと同義）のうちの１つが「ＤＥＡＤ」ボ
ックスであり、これらの相同ボックスは保存領域内に位置する。相同ボックスは
、ＤＥＡＤボックスファミリーメンバーに対し、構造的類似性だけでなく、機能
上の類似性も与える。相同ボックスを考慮すると（図２を参照されたい）、ＤＥ
ＡＤボックスタンパク質は推定上のＡＴＰ依存ＲＮＡヘリカーゼであり、該ヘリ
カーゼは複数の細胞過程（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）に関与し、
そしてＲＮＡ分子の二次構造修飾と関連している（Ｆｕｌｌｅｒ−Ｐａｃｅ Ｆ
．Ｖ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９４ ４：２７１−２７４，
Ｐａｕｓｅ Ａ．， Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｎ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓ
ｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １９９３ ３：９５３−９５９）。ヘリカーゼ依存過程
は：翻訳開始、核およびミトコンドリアＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡ輸送、
リボソーム集合（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ）およびスプライセオソ
ーム集合（ａｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、ｍＲＮＡ安定化およ
びｍＲＮＡ分解に関し、同様に記載されてきている（Ｉｏｓｔ Ｉ．， Ｄｒｅ
ｙｆｕｓ Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９４ ３７２：１９３−１９６）。
【０００５】 細胞過程、好ましくはタンパク質生合成の背景における、ＤＥＡＤ相同ボック
スに対応するＲＮＡヘリカーゼの機能は、これらの酵素が、特に薬学的応用、農
学的応用またはバイオテクノロジー上の応用および分析的応用のため使用される
のを可能にする。
【０００６】 重要な薬学的応用は、細菌、寄生虫およびウイルスヘリカーゼまたは病原性真
菌に由来するヘリカーゼを特異的に阻害するが、ヒトヘリカーゼに対する阻害効
果をまったく持たない物質の開発である。こうしたヘリカーゼは、ほとんどが必
須の酵素であるため、これらの酵素の特異的阻害により、病原体（細菌、真菌、
寄生虫／原生動物、ウイルス）の破壊を達成することが可能である。Ｍｉｓｓｅ
ｌらによると、ＤＥＡＤボックスタンパク質の遺伝子をスイッチオフすると、特
定の原生動物（トリパノゾーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア
属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、クリチジア属（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ））の生長の
減少をもたらす（Ｍｉｓｓｅｌ Ａ．， Ｓｏｕｚａ Ａ．Ｅ．， Ｎｏｒｓｋ
ａｕ Ｇ．， Ｇｏｒｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｕ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
１９９７ １７：４８９５−９０３）。マラリア病原体である熱帯熱マラリア原
虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｓｉｐａｒｕｍ）において、ヘリカーゼはタ
ンパク質翻訳、有糸***およびＤＮＡ修復を調節する（Ｔｈｅｌｕ Ｊ， Ｂｕ
ｒｎｏｄ Ｊ， Ｂｒａｃｃｈｉ Ｖ， Ａｍｂｒｏｉｓｅ−Ｔｈｏｍａｓ Ｐ
， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９４ １３：１１０９−１１１５）。ヘ
リカーゼは、酵母において、翻訳の開始のため、スプライセオソームにおいて、
細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）およびリボソーム集合において、必須である
。したがって、例えば、ＤＥＡＤボックスタンパク質ＲＯＫ１は酵母の生存能力
、プレｒＲＮＡプロセシングおよび有糸***性増殖に必須である。ＲＯＫ１のス
イッチオフは１８Ｓ ｒＲＮＡ合成を遮断する（Ｖｅｎｅｍａ Ｊ．， Ｂｏｕ
ｓｑｕｅｔ−Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ Ｃ．， Ｇｅｌｕｇｎｅ Ｊ．Ｐ．， Ｃａ
ｉｚｅｇｕｅｓ−Ｆｅｒｒｅｒ Ｍ．， Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ， Ｍｏｌ Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７ １７：３３９８−３４０７）。
【０００７】 ゲノムが配列決定されているすべての「陽性鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａ
ｎｄｅｄ）」ＲＮＡウイルスのおよそ８０％は、少なくとも１つの推定上のヘリ
カーゼをコードする。例はＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３、ヒトコロナウイルス（ｈ
ｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）およびアデノ関連ウイルスのヘリカーゼ、
およびワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）ヘリカーゼである
（Ｋａｄａｒｅ Ｇ．， Ｈａｅｎｎｉ Ａ．Ｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９
７：２５８３−２５９０）。ウイルスヘリカーゼの役割である可能性があるのは
（ｉ）複製中の校正、（ｉｉ）ＲＮＡをほどきそしてＲＮＡポリメラーゼの背後
でのループ形成を妨げることによる転写開始、（ｉｉｉ）翻訳開始である。ワク
シニアウイルスヘリカーゼは、ウイルスの生活環に必須であり、そして核酸特異
的である。
【０００８】 少なくともいくつかのヘリカーゼは、非常に特異的に活性化される可能性があ
るという証拠がある。したがって、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のＤｐ
ｂＡ（Ｆｕｌｌｅｒ−Ｐａｃｅ Ｆ．Ｖ．， Ｎｉｃｏｌ Ｓ．Ｍ．， Ｒｅｉ
ｄ Ａ．Ｄ．， Ｌａｎｄ Ｄ．Ｐ．， ＥＭＢＯ Ｊ １９９３ １２：３６
１９−３６２６）および酵母由来のＳｌｔ２２（Ｘｕ Ｄ．， Ｎｏｕｒａｉｎ
ｉ Ｓ．， Ｆｉｅｌｄ Ｄ．， Ｔａｎｇ Ｓ．Ｊ．， Ｆｒｉｅｓｅｎ Ｊ
．Ｄ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９６ ３８１：７０９−７１６）は活性化に特異
的なＲＮＡリガンドを必要とする。
【０００９】 さらにＤＥＡＤボックスタンパク質は、疾患との関連で記載されている。癌細
胞における特定の遺伝子（Ｎ−ｍｙｃ）の増幅は、ＤＥＡＤボックスタンパク質
がＮ−ｍｙｃと共に増幅されるという事実に結び付けられており、本タンパク質
の癌細胞の変性における役割を指摘する（Ｇｅｏｒｇｅ Ｒ．Ｅ．， Ｋｅｎｙ
ｏｎ Ｒ．Ｍ．， ＭｃＧｕｃｋｉｎ Ａ．Ｇ．， Ｍａｌｃｏｌｍ Ａ．Ｊ．
， Ｐｅａｒｓｏｎ Ａ．Ｄ．， Ｌｕｎｅｃ Ｊ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １
９９６ １２：１５８３−７）。ＲＮＡヘリカーゼの突然変異は、ヴェルナー症
候群−未成熟加齢−（Ｗｅｌｎｅｒ‘ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ｐｒｅｍａｔｕｒ
ｅ ａｇｉｎｇ）（Ｙｕ Ｃ．， Ｏｓｈｉｍａ Ｊ．， Ｗｉｊｓｍａｎ Ｅ
．Ｍ．， Ｎａｋｕｒａ Ｊ．ら， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９７
６０：３３０−３４１）および色素性乾皮症（ｘｅｒｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍ
ｅｎｔｏｓｕｍ）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．， Ｋｕｒａｏｋａ Ｉ．， Ｓ
ａｉｌｏ Ｍ．， Ｎａｋａｔｓｕ Ｙ．， Ｔａｎａｋａ Ａ．ら， Ｈｕｍ
ａ Ｍｕｔ １９９７ ９：３２２−３３１）と関連付けられている。さらに、
ＤＥＡＤボックスタンパク質および結合組織疾患の間に関連がある可能性が仮定
されてきている（Ｖａｌｄｅｚ Ｂ．Ｃ．， Ｈｅｎｎｉｎｇ Ｄ．， Ｐｅｒ
ｌａｋｙ Ｌ．， Ｂｕｓｃｈ Ｒ．Ｋ．， Ｂｕｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｂｉｏｐｈｉｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９７ ２３４：３３５−３
４０）。さらに、ＤＮＡ修復不全およびＸＮＰ／ＡＴＲ−Ｘ遺伝子のヘリカーゼ
ドメインにおける突然変異の間の関連が知られている（Ｖｉｌｌａｒｄ Ｌ．，
Ｌｏｓｓｉ ＡＭ， Ｃａｒｄｏｓｏ Ｃ， Ｐｒｏｕｄ Ｖ， Ｃｈｉａｒ
ｏｎｉ Ｐ， Ｃｏｌｌｅａｕｘ Ｌ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｃ， Ｆｏｎｔｅ
ｓ Ｍ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９７ ４３：１４９−１５５）。
【００１０】 ヒト由来または多様な病原体由来のヘリカーゼに加え、植物由来のヘリカーゼ
もまた、非常に興味深い。植物由来のいくつかのＤＥＡＤボックスタンパク質が
知られてきている（Ｌｏｒｋｏｖｉｃ Ｚ．Ｊ．， Ｈｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｇ．
， Ｏｅｌｍｕｌｌｅｒ Ｒ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７ １
７：２２５７−２２６５およびＡｕｂｏｕｒｇら， Ｇｅｎｅ １９９７ １９
９（１−２）：２４１−２５３）。これらのタンパク質は植物以外の生物由来の
ＤＥＡＤボックスタンパク質に構造的に類似であるが、それにもかかわらずこれ
らはサブグループを形成する（図３）。図３は、多様な生物由来の、ＤＥＡＤボ
ックスタンパク質ファミリーの最もよく性質決定されているメンバーの１つであ
る、多様なｅｌＦＡ４の系統発生的関係を示す。植物タンパク質は、動物真核生
物由来のｅｌＦＡ４より、はるかによく互いに密接に関連している。農業産生に
対し興味深い適用は、経済的に適切なタンパク質のタンパク質発現を増加させる
ための、植物特異的ＲＮＡヘリカーゼの活性の刺激である。この場合、植物に固
有のヘリカーゼを刺激すること、または有用な植物における異種性植物様ヘリカ
ーゼを発現すること、いずれかが可能である。
【００１１】 したがって、好ましくはＲＮＡヘリカーゼをコードする新規核酸を提供するの
が本発明の目的である。 該目的は、ＲＮＡヘリカーゼをコードし、そして繊毛虫類、特に好ましくはテ
トラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ
）から得ることが可能な核酸を提供することにより、達成される。本発明の核酸
は、ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリー由来の発現産物をコードし、そして
したがってまたＲＮＡヘリカーゼもコードする。
【００１２】 本発明による発現産物、好ましくはＤＥＡＤタンパク質スーパーファミリー由
来のタンパク質は、保存モチーフ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｏｔｉｆｓ）を有し
、該モチーフのうち１つの保存モチーフはアミノ酸配列ＤＥＡＤを含むものであ
る。好ましくは、該タンパク質はＲＮＡヘリカーゼ活性およびＡＴＰアーゼ活性
を含む。
【００１３】 本発明はしたがって、配列番号１３または配列番号１５に示される核酸配列を
有するＲＮＡヘリカーゼあるいはその機能的な変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｖａｒｉａｎｔ）をコードする核酸、および少なくとも８ヌクレオチドを有する
、好ましくは少なくとも１５または２０ヌクレオチドを有する、特に少なくとも
１００ヌクレオチドを有する、特に少なくとも３００ヌクレオチドを有するその
一部（以下、「本発明の核酸」と称される）に関する。
【００１４】 配列番号１３に示される核酸配列を有する本発明の核酸（以下「Ｈｃ１」）は
、配列番号１４に示されるアミノ酸配列をコードする。 配列番号１５に示される核酸配列を有する本発明の核酸（以下「Ｈｃ２」）は
、配列番号１６に示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１５】 大腸菌における本発明の核酸の発現は、ＲＮＡヘリカーゼのものと類似の酵素
活性を示す発現産物を導いた。本発明に一致したさらなる実験は、特に、例えば
図１に示される配列番号１４および配列番号１６に、特徴的な相同ボックスが存
在するため、該核酸がＲＮＡヘリカーゼをコードする核酸であることを立証した
。
【００１６】 好ましい態様において、本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは二
本鎖ＤＮＡであり、そして特にＲＮＡヘリカーゼをコードする核酸配列を有する
ＤＮＡである。
【００１７】 「機能的な変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は
、本発明にしたがい、記載される相同ボックスを有するＲＮＡヘリカーゼに機能
上関連する核酸を意味する。
【００１８】 より広い意味で、「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」という用語は、本発明にし
たがい、およそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特におよそ９０％、そして特
におよそ９５％の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、特に配列同一性（ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する核酸を意味する。
【００１９】 本発明の核酸の部分は、例えば、個々のエピトープを調製するために、さらな
る機能的な変異体を同定するためのプローブとして、またはアンチセンス核酸と
して、用いてもよい。例えば、少なくともおよそ８ヌクレオチドの核酸は、アン
チセンス核酸として適しており、少なくともおよそ１５ヌクレオチドの核酸は、
ＰＣＲ法におけるプライマーとして適しており、少なくともおよそ２０ヌクレオ
チドの核酸は、さらなる変異体を同定するのに適しており、そして少なくともお
よそ１００ヌクレオチドの核酸は、プローブとして適している。
【００２０】 特に、本発明の核酸を、Ｈｃ１またはＨｃ２自体あるいは関連する核酸とハイ
ブリダイズする相補的および／またはアンチセンス核酸を構築するため、使用す
ることが可能である。相補的および／またはアンチセンス核酸を標的細胞に導入
すると、関連するＲＮＡヘリカーゼまたは関連する発現産物の発現が妨げられる
。
【００２１】 本発明の核酸から得ることが可能なアンチセンス核酸は、したがって、遺伝子
発現の特異的な制御のため用いてもよい。この場合、既知の方法にしたがい、そ
の後細胞で転写されるアンチ遺伝子（ａｎｔｉ−ｇｅｎｅ）で標的細胞をトラン
スフェクションしてもよいし、またはマイクロインジェクションにより、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ合成したアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを標的細胞に導入してもよ
い。標的ｍＲＮＡのコード領域に相補的なアンチセンスＲＮＡは遺伝子発現を阻
害することが可能であることが知られている。
【００２２】 ｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡにより形成される二重鎖は、ＲＮアーゼ（
ＲＮＡｓｅｓ）による迅速な分解の影響を受けやすい。 議論されたアンチセンス技術による転写および翻訳の阻害はまた、植物細胞に
おいても成功している（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ Ａ．Ｒ．ら Ｎａｔｕｒｅ
１９８８ ３３３：８６６）。
【００２３】 さらなる好ましい態様において、本発明の核酸は、１つまたはそれ以上の非コ
ード配列および／またはポリ（Ａ）配列を含む。非コード配列は、発現産物、好
ましくはＲＮＡヘリカーゼの調節された発現のための、例えば、イントロン配列
または制御配列、例えばプロモーター配列またはエンハンサー配列である。
【００２４】 さらなる態様において、本発明の核酸は、したがって、ベクター、好ましくは
発現ベクターまたは遺伝子治療に有効であるベクターに含まれる。 発現ベクターは、例えば、原核または真核発現ベクターであってもよい。大腸
菌における発現のための原核発現ベクターの例は、発現されたタンパク質が、Ｎ
ｉ2+−ＮＴＡカラムを用い、好都合に精製されるのを助長する、Ｎ末端Ｍｅｔ−
Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグをコードする、Ｔ７発現ベクターｐＧＭ１０またはｐＧＥ
Ｘ−４Ｔ−１ ＧＳＴ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。サッカ
ロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
における発現に適した真核発現ベクターの例は、例えばベクターｐ４２６Ｍｅｔ
２５またはｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇら（１９９４） Ｎｕｃｌ． Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２， ５７６７）であり、一方、昆虫細胞における発
現に適したベクターは、例えばＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９またはＥＰ−Ｂ１−
０５４９７２１に開示されるようなバキュロウイルスベクター（ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ）であり、そして哺乳動物細胞における発現に適した
ベクターは、例えばＳＶ４０ベクターである。これらのベクターは、一般的に入
手可能である。
【００２５】 一般的に、発現ベクターはまた、宿主細胞に適した制御配列、例えば大腸菌に
おける発現のためのｔｒｐプロモーター（例えばＥＰ−Ｂ１−０１５４１３３を
参照されたい）、酵母における発現のためのＡＤＨ−２プロモーター（Ｒｕｓｓ
ｅｌら（１９８３）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８， ２６７４）
、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス・ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈ
ｅｄｒｉｎ）プロモーター（例えばＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９を参照されたい
）あるいは初期ＳＶ４０プロモーターまたは例えばＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウ
イルス； Ｌｅｅら（１９８１） Ｎａｔｕｒｅ， ２１４， ２２８）由来の
ＬＴＲプロモーターも含む。
【００２６】 この方式で得た組換えタンパク質は、適切な方法（例えばアフィニティークロ
マトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ）を用い精製し、そして溶解する（グアニ
ジン、尿素）。タンパク質の性質決定および酵素活性の測定は、確立されたアッ
セイの助けをかりて行う（ＲＮＡ結合、ＡＴＰアーゼ活性、ヘリカーゼ活性）。
【００２７】 遺伝子治療に有効なベクターの例はウイルスベクター、好ましくはアデノウイ
ルスベクター、特に複製不全（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）
アデノウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクター、例えば２つの挿
入末端反復（ＩＴＲ）配列のみからなるアデノ関連ウイルスベクターである。
【００２８】 適切なアデノウイルスベクターの例は、ＭｃＧｒｏｒｙ， Ｗ．Ｊ．ら（１９
８８） Ｖｉｒｏｌ． １６３， ６１４； Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ．ら（１９
８２） “Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ， Ｙ．監修）中， １８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー； Ｃｈｒｏｂｏｃｚ
ｅｋ， Ｊ．ら（１９９２） Ｖｉｒｏｌ． １８６， ２８０； Ｋａｒｌｓ
ｓｏｎ， Ｓ．ら（１９８６） ＥＭＢＯ Ｊ．， ５， ２３７７またはＷＯ
９５／００６５５に記載されている。
【００２９】 適切なアデノ関連ウイルスベクターの例は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ．（１９
９２） Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １
５８， ９７； ＷＯ ９５／２３８６７； Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｒ．Ｊ．（
１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３， ３８２２； ＷＯ ９５／２３８６
７； Ｃｈｉｏｒｉｎｉ， Ｊ．Ａ．ら（１９９５） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ６， １５３１またはＫｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ．（１９９４）
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５， ７９３に記載されている。
【００３０】 遺伝子治療に有効なベクターはまた、本発明の核酸をリポソームと複合体化す
ることによっても得ることが可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ．ら（１９
８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８４， ７
４１３； Ｂｅｈｒ， Ｊ．Ｐ．ら（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ６９８２； Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｊ．Ｈ
．ら（１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ２５５０または
Ｇａｏ， Ｘ． ＆ Ｈｕａｎｇ， Ｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１８９， １９５に記載されるような脂質混合物
は、この目的に適している。陽性純電荷が残り、そしてＤＮＡが完全にリポソー
ムに複合体化されるような比で、リポソームの表面上にＤＮＡをイオン的に結合
させることにより、リポソームを調製する。
【００３１】 本発明の核酸は、例えば化学的に、例えばホスホトリエステル法（例えばＵｈ
ｌｍａｎ， Ｅ． ＆ Ｐｅｙｍａｎ， Ａ．（１９９０） Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０， ５４３， Ｎｏ．４を参照されたい）により、配
列番号１３および配列番号１５に開示される配列に基づき、または配列番号１４
および配列番号１６に開示されるペプチド配列に基づき、そして遺伝暗号を利用
し、合成してもよい。
【００３２】 本発明の核酸自体および変異体を得るさらなる可能性は、適切なプローブ（例
えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．第二版，ニューヨーク州
コールドスプリングハーバー）を用い、適切な遺伝子ライブラリーから、該核酸
を単離することである。適切なプローブの例は、およそ１００ないし１０００ヌ
クレオチドの長さを有する、好ましくはおよそ２００ないし５００ヌクレオチド
の長さの、特におよそ３００ないし４００ヌクレオチドの長さのものであり、そ
して図４および６に示される核酸配列から誘導することができる、一本鎖ＤＮＡ
断片である。
【００３３】 本発明はさらに、タンパク質合成に特異的に影響を及ぼすための、本発明の核
酸の使用に関する。 実験により、ヘリカーゼ活性が増加すると標的ＲＮＡがほどけるのが亢進する
ことが示される。これにより、標的ＲＮＡがタンパク質などの結合パートナー、
特にリボソーム翻訳のための、またはデグラドソーム（ｄｅｇｒａｄｏｓｏｍｅ
）による分解のための酵素または酵素複合体に利用可能になる。これにより、標
的ＲＮＡ次第で、ａ）翻訳増加そしてしたがってタンパク質生合成の増加、ｂ）
デグラドソームによるより速い分解そしてしたがってタンパク質生合成の減少が
もたらされる。ヘリカーゼ活性の阻害は、デグラドソームによる分解を阻害し、
そしてタンパク質生合成の減少を導く可能性がある。これは重要な生合成過程が
、ヘリカーゼの選択的阻害または活性化により、特異的に制御される可能性があ
るという知見に基づく。
【００３４】 本目的のため、記載されるように、適切な標的生物において、核酸を組換え方
式で発現した。 本発明の核酸、好ましくはＨｃ１は、好ましくはヒトおよび寄生虫由来の多様
な真核ＲＮＡヘリカーゼの傑出したモデルである（図３Ａ）。Ｈｃ１と、問題と
される真核ヘリカーゼの遺伝的関係は、Ｈｃ１を用いた実験から、他の真核ヘリ
カーゼ（例えばヒト）の構造および機能に関し、結論を導くのに十分に近い。図
３Ａは、Ｈｃ１と比較した多様な生物由来のいくつかのヘリカーゼの遺伝的関係
を示す。特に驚くべきことは、Ｈｃ１並びにヒトおよびマウス由来の哺乳動物ヘ
リカーゼの間の大きな構造的類似性、並びにＨｃ１および既知のウイルスヘリカ
ーゼの間の大きな構造的相違である。
【００３５】 図３Ｂに示される系統発生的研究に基づき、本発明の核酸、好ましくはＨｃ２
は、好ましくは植物由来の、多様な真核ＲＮＡヘリカーゼの傑出したモデルであ
ることが立証される。図３Ｂは、Ｈｃ２と比較した多様な生物由来のいくつかの
ＲＮＡヘリカーゼの遺伝的関係を示す。特に驚くべきことは、Ｈｃ２および植物
由来のＲＮＡヘリカーゼの間の大きな構造的類似性である。Ｈｃ２の組換え発現
により、特に植物由来のヘリカーゼ並びにその構造および機能を調べるための、
そしてこれらの重要な酵素の適切な阻害剤または活性化剤を開発するためのモデ
ルとして、この新規酵素を使用することが可能になる。このように、ホウレンソ
ウ（ｓｐｉｎａｃｈ）由来のＰＲＨ７５に関し、本酵素が活性化されるために非
常に特異的なＲＮＡリガンドを必要とすることが仮定されてきている（Ｌｏｒｋ
ｏｖｉｃ Ｚ．Ｊ．， Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｒ．Ｇ．， Ｏｅｌｍｕｌｌｅｒ
Ｒ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７（４）：２２５７−２２６５（１９
９７））。
【００３６】 本発明はしたがって、さらに、（既知の方法にしたがった過剰発現により）適
切なタンパク質の生合成を潜在的に増加させるための、適切な有用植物における
、本発明の核酸、好ましくはＨｃ２の特定の異種性発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ
ｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に関する。
【００３７】 本発明の核酸、好ましくはＨｃ２は、組換えＤＮＡ技術により、植物に導入し
てもよい。用いてもよい方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の助けをかりた異質の（ｆ
ｏｒｅｉｇｎ）遺伝子の導入である。これは、既知の方式で、細菌ゲノムに異質
の遺伝子を導入することを伴う。標的植物の感染により、異質の遺伝子を含む細
菌遺伝子の、植物ゲノムへの安定した組込みがもたらされる（Ｃｈｉｌｔｏｎ
Ｍ．Ｄ．ら， Ｃｅｌｌ １９７７ １１：２６３， Ｂａｒｔｏｎ Ｋ．Ａ．
ら， Ｃｅｌｌ １９８３ ３２：１０３３）。双子葉植物の形質転換のため、
本方法を使用することが好ましい。既知の方法、例えばリン酸カルシウム沈澱、
ＰＥＧ処理、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）また
はこれらの方法の組み合わせを、単子葉植物の形質転換に使用してもよい（Ｐｏ
ｔｒｙｋｕｓ Ｉ．ら， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９８５ １９９：１
８３； Ｌｏｒｚ Ｈ．ら， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９８５ １９９
：１７８； Ｆｒｏｍｍ Ｍら， Ｎａｔｕｒｅ １９８６ ３１９：７９１；
Ｕｃｈｉｍｉｙａ Ｈ．ら， Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９８６ ２０
４：２０４）。いわゆる遺伝子銃の助けをかりて、植物細胞に異質のＤＮＡを導
入することもまた可能である（Ｋｌｅｉｎ Ｔ．Ｍ．ら， Ｎａｔｕｒｅ １９
８７ ３２７：７０）。
【００３８】 本発明はさらに、分子生物学における選択マーカーとしての核酸の使用に関す
る。慣用的には、抗生物質が選択マーカーとして用いられる。分子生物学的に修
飾された生物は、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を持つ。該生物は、耐性
遺伝子（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ）のキャリアーのみが生長することが
可能であるように、抗生物質含有培地で増殖させる。同様に、ヘリカーゼ遺伝子
を「耐性遺伝子」として用いてもよい。ネズミ細胞におけるヘリカーゼ遺伝子の
過剰発現は、これらの細胞に、そうでなければ毒性の物質、レフルノミド（ｌｅ
ｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）の耐性を与えることが示されてきている（Ｍｕｌｌｎｅｒ
ら、特許出願ＤＰＡ １９５４５１２６．０）。したがって、本発明の核酸を分
子生物学における選択マーカーとして使用することが可能であり、ここで本発明
の核酸は記載されるような適切なベクターを用い細胞に導入され、そしてヘリカ
ーゼの過剰発現のため、細胞が耐性である適切な物質、例えばレフルノミドを用
い選択する。
【００３９】 本発明はさらにまた、配列番号１４および配列番号１６に示されるようなアミ
ノ酸配列を有する発現産物、好ましくはポリペプチドおよびポリペプチド断片（
Ｈｃ１およびＨｃ２によりコードされる）自体、またはその機能的な変異体、並
びに少なくとも６アミノ酸を有する、好ましくは少なくとも１２アミノ酸を有す
る、特に少なくとも６５アミノ酸を有する、そして特にＨｃ１の２５７アミノ酸
およびＨｃ２の２５５アミノ酸を有するその一部（以下、「本発明のポリペプチ
ド」と称する）にも関する。例えば、長さおよそ６−１２アミノ酸、好ましくは
長さおよそ８アミノ酸のポリペプチドは、キャリアーとカップリングされた後、
特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製するのに用いられるエ
ピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を含むことができる（この点に関しては、例えばＵ
Ｓ ５，６５６，４３５を参照されたい）。長さが少なくともおよそ６５アミノ
酸であるポリペプチドはまた、キャリアーなしに、ポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体を調製するのに直接用いてもよい。
【００４０】 本発明によれば、「機能的な変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ
）」という用語は、本発明のペプチドに機能上関連する、すなわちＲＮＡヘリカ
ーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。変異体はまた、対立遺伝子変異体あ
るいは他のヒト細胞または組織に由来するポリペプチドも意味する。
【００４１】 より広い意味で、該用語はまた、図５および７に示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドと、およそ７０％、好ましくはおよそ８０％、殊におよそ９０％
、特におよそ９５％の配列相同性、特に配列同一性を持つポリペプチドも意味す
る。これらはさらにまた、およそ１−６０、好ましくはおよそ１−３０、殊にお
よそ１−１５、特におよそ１−５アミノ酸の範囲の、ポリペプチドの欠失も含む
。さらに、これらはまた、上述の本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質も
含み、該融合タンパク質は、すでにそれ自体ＲＮＡヘリカーゼの機能を有する、
または融合部分が除去された後のみ、特定の機能を獲得することが可能である。
特に、これらは、およそ１−２００、好ましくはおよそ１−１５０、殊におよそ
１−１００、特におよそ１−５０アミノ酸の、特に非ヒト配列の部分を有する融
合タンパク質を含む。非ヒトペプチド配列の例は、原核ペプチド配列、例えば大
腸菌ガラクトシダーゼまたはいわゆるヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔ
ａｇ）、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグ由来のものである。いわゆるヒス
チジンタグを含む融合タンパク質は、特に好都合に、金属イオン含有カラムを介
し、例えばＮｉ2+−ＮＴＡカラムを介し、発現されたタンパク質を精製するのに
適している。「ＮＴＡ」はキレート化剤ニトリロトリ酢酸（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｍ
ｂＨ、ヒルデン）を表す。
【００４２】 本発明のポリペプチドの部分は、例えば、抗体に特異的に認識されることが可
能なエピトープに相当する。 既知のヘリカーゼと比較することにより、本発明のポリペプチドがいわゆるＤ
ＥＡＤスーパータンパク質ファミリーのメンバーであることが見出された。図１
は、この種類のＲＮＡヘリカーゼに特徴的である保存モチーフを示す。これらの
モチーフはすべてファミリー内で高度に保存され、そしてまた本発明のポリペプ
チドにも見られる。
【００４３】 本発明のポリペプチドは、例えば、本発明の核酸を、当業者に一般的に知られ
る方法を用い、すでに上に記載されたように、適切な発現系で発現させることに
より、調製される。本発明はしたがってまた、適切な宿主細胞で発現され、そし
て適切な場合、単離されている、本発明の核酸を用い、本発明のポリペプチドを
調製するための方法にも関する。
【００４４】 特に、ポリペプチドの前記部分はまた、古典的なペプチド合成（メリフィール
ド法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ））により合成することも可
能である。これらは、本発明のポリペプチドの、他の機能的な変異体を入手する
機会を得る目的のための、適切な遺伝子発現ライブラリーのスクリーニングに用
いることが可能な、抗血清を得るのに特に適している。
【００４５】 本発明はさらにまた、ポリペプチドの上述の部分がそれ自体免疫原性であるか
、または免疫原性にすることが可能であるか、または適切なキャリアー、例えば
ウシ血清アルブミンとカップリングさせることにより、増加した免疫原性を有す
る、本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体にも関する。
【００４６】 抗体はポリクローナルまたはモノクローナルいずれかである。やはり本発明の
側面であるその調製は、例えば一般的に知られる方法にしたがい、哺乳動物、例
えばウサギを、適切な場合、例えばフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’
ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）および／または水酸化アルミニウムゲルの存在下で、本
発明のポリペプチドまたはその前記部分で免疫することにより、達成される（例
えば，Ｄｉａｍｏｎｄ， Ｂ．Ａ．ら（１９９１） Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １３４４を参照されたい
）。免疫学的反応により、動物において生成されたポリクローナル抗体を、その
後、一般的に知られる方法を用い、血液から容易に単離し、そして例えばカラム
クロマトグラフィーを介し、精製してもよい。
【００４７】 モノクローナル抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｗｉ
ｎｔｅｒ， Ｇ． ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ
， ３４９， ２９３）の既知の方法を用い、調製してもよい。
【００４８】 本発明はさらにまた、本発明の核酸または本発明のポリペプチド、および適切
な場合、適切な添加剤または賦形剤を含む薬剤、並びに、癌、自己免疫疾患、特
に多発性硬化症または慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉ
ｔｉｓ）、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーま
たはＩＶ型アレルギー、関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性およ
び慢性感染性疾患および／または糖尿病を治療するための、および／または細胞
の代謝、特に免疫抑制と関連した、特に移植と関連した前記代謝および／または
遺伝病、特にヴェルナー症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症および結合組織
疾患に影響を及ぼすための薬剤を製造するための方法であって、該薬剤において
、本発明の核酸、例えばいわゆるアンチセンス核酸、または本発明のポリペプチ
ドが薬学的に許容しうる添加剤および／または賦形剤と共に処方される、前記方
法にも関する。
【００４９】 本発明の核酸を裸の形で（ｉｎ ｎａｋｅｄ ｆｏｒｍ）、または遺伝子治療
に有効な上述のベクターの１つの形で、またはリポソームと複合体化している形
で含む薬剤は、ヒトにおける遺伝子治療適用に特に適している。
【００５０】 適切な添加剤および／または賦形剤の例は、生理学的塩化ナトリウム溶液、安
定化剤、プロテイナーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤などである。 本発明はさらにまた、本発明の核酸、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗
体、および適切な場合、適切な添加剤および／または賦形剤を含む診断剤、並び
に癌、自己免疫疾患、特に多発性硬化症または慢性関節リウマチ、アルツハイマ
ー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまたはＩＶ型アレルギー、
関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性および慢性感染性疾患および
／または糖尿病を診断するための、および／または細胞の代謝、特に免疫状態、
特に移植と関連した前記代謝を解析するための、および／または遺伝病、特にヴ
ェルナー症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症および結合組織疾患を解析する
ための診断剤を調製するための方法であって、該診断剤において、適切な添加剤
および／または賦形剤を、本発明の核酸、本発明のポリペプチドまたは本発明の
抗体に添加する、前記方法にも関する。例えば、本発明にしたがい、本発明の核
酸を用い、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく診断剤（例えばＥＰ−０２００３６２
に記載されるようなＰＣＲ診断剤）またはノーザンブロットに基づく診断剤を調
製してもよい。これらの試験は、本発明の核酸と、相補的な対鎖、通常、対応す
るｍＲＮＡの前記対鎖との特異的なハイブリダイゼーションに基づく。これに関
連して、本発明の核酸はまた、例えばＥＰ ００６３８７９に記載されるように
、修飾してもよい。一般的に知られる方法を用い、本発明のＤＮＡ断片を、適切
な試薬、例えば放射能的にα−Ｐ３２−ｄＡＴＰで、または非放射能的にビオチ
ンで、標識し、そして好ましくは、例えばセルロースまたはナイロンからなる適
切な膜に結合している単離ＲＮＡと該ＤＮＡ断片をインキュベーションすること
が好ましい。ハイブリダイゼーションおよび膜への結合の前に、例えばアガロー
スゲル電気泳動を用い、単離ＲＮＡを大きさにしたがい分画化することが、さら
に好都合である。この方法だと、各組織試料由来の調べるＲＮＡの量が同一であ
る場合、プローブにより特異的に標識されているｍＲＮＡの量を決定することが
可能である。
【００５１】 別の診断剤は、本発明のポリペプチド、または上にさらに詳細に記載されてき
ているその免疫原性部分を含む。好ましくは、例えば自己免疫抗体と反応するこ
とを可能にするため、例えばニトロセルロースまたはナイロンからなる固相に結
合している、ポリペプチドまたはその部分を、調べるべき体液、例えば血液とｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで接触させてもよい。抗体・ペプチド複合体をその後、例えば標
識抗ヒトＩｇＧまたは標識抗ヒトＩｇＭ抗体を用い、検出してもよい。標識は、
例えば、呈色反応を触媒する酵素、例えばペルオキシダーゼである。自己免疫抗
体の存在、および存在するこれらの抗体の量は、したがって、呈色反応を介し、
容易にそして迅速に検出することが可能である。
【００５２】 別の診断剤は、本発明の抗体自体を含む。これらの抗体を用い、例えば容易に
そして迅速にヒト組織試料を調べ、問題のポリペプチドが存在するかどうか決定
してもよい。この場合、本発明の抗体は、例えば既に上に記載されているような
酵素で標識されている。特異的な抗体・ペプチド複合体をそれにより、容易にそ
して、酵素呈色反応を介するのと同じくらい迅速に、検出することが可能である
。
【００５３】 本発明はまた、機能上の相互作用因子、例えば阻害剤または刺激剤を同定する
ためのアッセイであって、本発明の核酸、本発明のポリペプチドまたは本発明の
抗体、および適切な場合、適切な添加剤および／または賦形剤を含む、前記アッ
セイにも関する。
【００５４】 機能上の相互作用因子を同定するための適切なアッセイの例は、いわゆる２−
ハイブリッド系（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ． ＆ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ， Ｒ．（
１９８４） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １０， ２８６）であ
る。本アッセイにおいて、細胞、例えば酵母細胞を、本発明のポリペプチドおよ
び既知のタンパク質、例えば大腸菌Ｇａｌ４またはＬｅｘＡ由来のＤＮＡ結合ド
メインを含む融合タンパク質を発現する、および／または未知のポリペプチドお
よび、例えばＧａｌ４、ヘルペスウイルスＶＰ１６またはＢ４２由来の転写活性
化ドメインを含む融合タンパク質を発現する、１つまたはそれ以上の発現ベクタ
ーで、形質転換またはトランスフェクションする。さらに、該細胞はレポーター
遺伝子、例えば、ＬｅｘＡプロモーター／オペレーターなどの制御配列により、
または酵母に存在するいわゆる上流活性化配列（ＵＡＳ）により調節されている
、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子、「緑色蛍光タンパク質」または酵母アミノ酸生合成遺
伝子Ｈｉｓ３またはＬｅｕ２を含む。未知のポリペプチドは、例えば、遺伝子ラ
イブラリー、例えばヒト遺伝子ライブラリー由来のＤＮＡ断片にコードされる。
通常、上述の発現ベクターは、酵母において直接ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーを
調製するのに用いられ、したがってアッセイはその直後に行うことが可能である
。
【００５５】 例えば、形質転換された酵母が、本発明のポリペプチドおよびＬｅｘＡ ＤＮ
Ａ結合ドメインからなる融合タンパク質を発現するように、本発明の核酸を、酵
母発現ベクター中で、ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸上に、機
能上の単一体にクローン化する。別の酵母発現ベクターにおいて、形質転換され
た酵母が、未知のポリペプチドおよびＧａｌ４転写活性化ドメインからなる融合
タンパク質を発現するように、ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリー由来のｃＤＮＡ断片
を、Ｇａｌ４転写活性化ドメインをコードする核酸上に、機能上の単一性をもっ
てクローン化する。２つの発現ベクターで形質転換され、そして例えば、Ｌｅｕ
２である酵母は、さらに、Ｌｅｕ２をコードし、そしてＬｅｘＡプロモーター／
オペレーターにより調節される核酸を含む。本発明のポリペプチドおよび未知の
ポリペプチドの間で、機能上の相互作用が起こる場合、Ｇａｌ４転写活性化ドメ
インは、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを介し、ＬｅｘＡプロモーター／オペレ
ーターに結合し、その結果、後者が活性化されそしてＬｅｕ２遺伝子が発現され
る。これはその後、Ｌｅｕ２−酵母が、ロイシンをまったく含まない最小培地上
で増殖することを可能にする。
【００５６】 アミノ酸生合成遺伝子の代わりにＬａｃＺレポーター遺伝子または緑色蛍光タ
ンパク質レポーター遺伝子を用いた場合、転写活性化は青色または緑色蛍光コロ
ニーが形成されることにより検出することが可能である。青色または蛍光色はそ
の後、分光計で、例えば青色の場合、５８５ ｎＭで容易に定量化することが可
能である。
【００５７】 この方法だと、本発明のポリペプチドと相互作用するポリペプチドに関し、容
易にそして迅速に、遺伝子発現ライブラリーをスクリーニングすることが可能で
ある。発見された新規ポリペプチドをその後、単離し、そしてさらなる性質決定
に供してもよい。
【００５８】 ２−ハイブリッド系を適用する別の可能性は、他の物質、例えば化学的化合物
を用い、本発明のポリペプチドおよび既知のまたは未知のポリペプチドの間の相
互作用に影響を及ぼすことである。この方法だと、治療剤として使用することが
可能な、新規の、価値ある、化学的に合成可能な活性化合物を、容易に発見する
ことも可能である。本発明は、したがって、ポリペプチド様相互作用因子（ｐｏ
ｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）を発見するための方
法に向けられるだけでなく、上述のタンパク質・タンパク質複合体と相互作用す
ることが可能な物質を発見するための方法にも拡張される。本発明によれば、こ
うしたペプチド様相互作用因子、およびまた化学的相互作用因子は、したがって
、阻害性または刺激性効果を有することが可能である、機能上の相互作用因子を
意味する。最も重要な配列の説明 配列番号１３は、Ｈｃ１の核酸配列を示す。
【００５９】 配列番号１４は、配列番号１３に対応するアミノ酸配列を示す。 配列番号１５は、Ｈｃ２の核酸配列を示す。 配列番号１６は、配列番号１５に対応するアミノ酸配列を示す。
【００６０】 以下の実施例は、実施例に記載される産物および態様に、前記発明を制限する
ことなく、本発明をさらに例示するのに役立つ。
【００６１】
【実施例】
本発明につながる実際の研究は、主に微生物学、分子生物学および組換えＤＮ
Ａ技術における確立された既知の方法に基づく。
【００６２】
【実施例１】：テトラヒメナ・テルモフィラの培養 テトラヒメナ・テルモフィラ、株Ｂ１８６８ＩＶを、５００ ｍｌフラスコ中
のＰＰＹＳ培地（１０ ｇ／ｌ プロテオース・ペプトンＮｏ．３、ＤＩＦＣＯ
、１ ｇ／ｌ 酵母エキス、ＤＩＦＣＯ、１０ ｍｇ クエン酸ナトリウム、２
４．３ ｍｇ ＦｅＣｌ3）に接種し（１００，０００細胞／ｍｌ ＰＰＹＳ）
、そして２５℃および１００−１５０ ｒｐｍで２−３日間、細胞密度がおよそ
１００万／ｍｌになるまでインキュベーションした。
【００６３】
【実施例２】：ｍＲＮＡ単離 Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＆ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）にしたがい、テトラ
ヒメナ・テルモフィラ、株Ｂ１８６８ＩＶの震蕩培養２００ ｍｌから総ＲＮＡ
を単離した。本目的のため、チオシアン酸グアニジン／ザルコシル／ベータ・メ
ルカプトエタノールの存在下で、２００万の細胞を溶解した。酢酸ナトリウムお
よびクロロホルム／イソアミルアルコール／フェノール（２５：２４：１）を添
加した後、混合物をよく混合し、氷上で１５分間インキュベーションし、そして
その後１０，０００ ｘ ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。１体積のイソプロ
パノールを水性相に添加し、その後−２０℃で少なくとも３０分間置く。遠心分
離（１０分間、１０，０００×ｇ、４℃）によりＲＮＡペレットを得る。その後
、ペレットを２回洗浄し、乾燥しそしてＤＥＰＣ水に再懸濁する。５５−６０℃
で１０−１５分間のインキュベーションした後、ＲＮＡを−８０℃で保存するこ
とが可能である。総ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）・セファロース（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ ｍＲＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｋｉｔ ＃Ｋ１０４０−２）を介し、ｍ
ＲＮＡを精製する。
【００６４】
【実施例３】：ｃＤＮＡの調製 ＣＬＯＮＴＥＣＨ（ＣａｐＦｉｎｄｅｒTM ＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒ
ｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＃Ｋ１０５１−１）にしたがい、ｍＲ
ＮＡをｃＤＮＡに転写した。
【００６５】
【実施例４】：特定の遺伝子断片の増幅 特定の遺伝子断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の補助で増幅した。標準
的ＰＣＲ混合物は、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、５０ ｍＭ
ＫＣｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％ ゼラチン、７５μＭ ｄ
ＮＴＰ、０．３ ｎｇの各プライマー、０．５ μｌのｃＤＮＡ、０．５ Ｕの
Ｔａｑポリメラーゼを含む。
【００６６】 Ｈｃ１断片を増幅するのに、プライマー （２）５’−ＧＴＴＣＴＡＣＣｎＡＴＴＣＴＧＴＧ−３’および （３）５’−ＡＣｎＧＧＴＴＣｎＧＧＴＡＡＧＡＣ−３’を用い、Ｈｃ２断片を
増幅するのに、プライマー （４）５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣｎＡＣｎＡＧＡＧＡＡｎＴｎＧＣＴ−３’
および （８）５’−ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＣｎＡＴＴＣＴＧＴＧ−３’を
用いた。ここでｎはいかなるヌクレオチドでもよい。ＰＣＲプログラムは、５分
間９５℃、９５℃／３７秒−５０℃／３７秒−７２℃／３７秒−３０サイクルで
あった。
【００６７】
【実施例５】：断片のクローニングおよび配列決定 ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分画化する。特定の断片を切
除し、そしてＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い精製
する。クローニングには精製断片を直接使用する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｏｒ
ｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ＃Ｋ２０００−０１）。陽性ク
ローンを震蕩培養で増殖させ、そしてＱＩＡＧＥＮ Ｍａｘｉ−Ｐｒｅｐ Ｋｉ
ｔを用い、プラスミドＤＮＡを精製する。ＡｂｉＰｒｉｓｍ Ｍｏｄｅｌ ３７
７自動化配列決定装置を用い、配列決定を行う。組換え発現 遺伝子Ｈｃ１およびＨｃ２断片を適切なベクター、好ましくはｐＧＥＸ−４Ｔ
−１ ＧＳＴ融合ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にクローン
化する。本目的のため、適切なプライマーを用い、ＰＣＲによりテトラヒメナ・
テルモフィラｃＤＮＡからＨｃ１およびＨｃ２を調製する。標準的ＰＣＲ混合物
は、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、５０ ｍＭ ＫＣｌ、１．
５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％ ゼラチン、７５μＭ ｄＮＴＰ、０．３
ｎｇの各プライマー、０．５ μｌのｃＤＮＡ、０．５ ＵのＴａｑポリメラ
ーゼを含む。Ｈｃ１断片を増幅するのに、プライマー （２Ａ）５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＴＴＣ
ＴＧＴＧＡＡＴＡＴＡ ３’； （３Ａ）５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＴＣＧ ＧＧＴ ＡＡ
Ｇ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＣＴ−３’を用い、Ｈｃ２断片を増幅
するのに、プライマー （７Ａ）５’ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＴＣＧＣＴＡＴ
ＧＣＡＡＡＴＣＧＡＡ ３’ （８Ａ）５’ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＴＴＣＴ
ＧＴＧＧＡＣＡＴＡＧ ３’を用いた。プライマー（２Ａ）はＮｏｔＩ切断部位
を含み、プライマー（３Ａ）はＢａｍＨＩ切断部位を含み、プライマー（７Ａ）
はＥｃｏＲＩ切断部位を含み、そしてプライマー（８Ａ）はＮｏｔＩ切断部位を
含む。ＰＣＲプログラムは、５分間９５℃、９５℃／３７秒−５０℃／３７秒−
７２℃／３７秒−３０サイクルであった。
【００６８】 １％アガロースゲルを介し、クローン化しようとする断片を精製し（ＱＩＡｇ
ｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、そしてＮｏｔＩおよびＢａｍ
ＨＩ（Ｈｃ１）またはＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（Ｈｃ２）を用いた消化により
、クローン化する末端を調製する。ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ（Ｈｃ１）または
ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ（Ｈｃ２）を用いた消化により、ベクターｐＧＥＸ−
４Ｔ−１を同様に調製する。ベクターおよび挿入物を１６℃で一晩連結し、コン
ピテントＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）大腸菌細胞の形質転換に連結
混合物を使用する。陽性クローンを選択し、そしてタンパク質発現に用いる。構
築物ｐＧＥＸ−Ｈｃ１またはｐＧＥＸ−Ｈｃ２は、Ｈｃ１の２５７アミノ酸（２
８．３ ｋＤａ）およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（２４ ｋＤａ）
からなる、またはＨｃ２の２５５アミノ酸（２８．１ ｋＤａ）およびグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ（２４ ｋＤａ）からなる融合タンパク質の翻訳を
可能にする。融合タンパク質は該タンパク質ファミリーのメンバーを特徴付ける
すべての相同ボックス（ＤＥＡＤ、ＳＡＴ、…）を含む。組換えタンパク質発現
には、一晩培養をＩＰＴＧで誘導し、そしてグルタチオン・セファロース４Ｂを
用いまたはグルタチオン・セファロース４Ｂカラムを介し、バッチ処理で、上清
から融合タンパク質を精製する。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをトロン
ビンで切断する。本目的のため、例えば、１００μｇのＧＳＴ融合タンパク質を
、１ ｘ ＰＢＳ中のトロンビン・プロテイナーゼ１単位と、２２℃で１６時間
インキュベーションする。例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３
０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、ゲル濾過を介し、Ｈ
ｃ１またはＨｃ２の遺伝子産物を除去する。ＢｉｏＲａｄゲル濾過クロマトグラ
フィー標準（参照番号１５１−１９０１）を標準として用いてもよい。
【００６９】
【実施例６】：ＡＴＰアーゼ活性 活性は参考文献に記載されるように、例えばＪａｒａｍｉｌｌｏら， Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９１ １１：５９９２； Ｒｏｚｅｎら， Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０ １０：１１３４， Ｌａｄｏｍｅｒｙ Ｍ．
ら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９９７， ２５：９６５−９７３ま
たはＤｏｎｇ Ｆ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ １９９６， ９３：１４４５６−１４４６１または特許ＰＣＴ／ＵＳ９７
／０１６１４にしたがい、測定する。具体的な実施例は以下に記載される。ＡＴ
Ｐアーゼ活性を測定するための反応混合物は、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ、ｐ
Ｈ ７、１ ｍＭ ジチオスレイトール、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μＭ ＡＴ
Ｐおよび総体積５０μｌ中の０．２μｌの３２Ｐ−ＡＴＰを含む。反応混合物を
３７℃に加熱し、そしてＨｃ１またはＨｃ２を添加する。３７℃で３０分置いた
後、５０ ｍＭ ＨＣｌおよび５ ｍＭ Ｈ3ＰＯ4中の７％活性炭４００μｌを
添加することにより、反応を停止する。試料を混合し、そして１３，０００ ｒ
ｐｍで１５分間遠心分離する。上清中の放出放射能をシンチレーションカウンタ
ー中で測定する。
【００７０】
【実施例７】：ヘリカーゼ活性 Ｈｃ１またはＨｃ２のヘリカーゼ活性は、二本鎖ＲＮＡの解離によりモニター
することが可能である。基質は、１本の鎖が、例えば３２Ｐで標識されている、
いかなるＲＮＡオリゴマーであってもよい。反応混合物は、１０μｌ混合物中に
、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の３２Ｐ標識ヘリカーゼ基質、多様な濃度の
Ｈｃ１またはＨｃ２、２ ｍＭ ＡＴＰ、５ ｍＭ ジチオスレイトールおよび
５０μｇのウシ血清アルブミンを含む。反応は３７℃で３０分間行い、そして加
熱により停止させる。
【００７１】 反応混合物を１６ ｃｍ ｘ １８ ｃｍの１２％非変性ポリアクリルアミド
ゲルに適用し、そして２５ ｍＡの定電流で分画化する。ゲルを真空乾燥し、そ
してフィルム（例えばＫｏｄａｋ ＲＰＸＲＰ−５フィルム、−７０℃）に曝露
する。
【００７２】
【実施例８】：アンチセンス ＤＮＡ Ｈｃ１、Ｈｃ２断片あるいはＨｃ１またはＨｃ２に相同なＤＮＡ配列
あるいはＨｃ１、Ｈｃ２または相同体の配列の一部と反対のＲＮＡ鎖を、アンチ
センス鎖として用いてもよい。通常、望ましいアンチセンス配列および選択マー
カー、例えばネオマイシン、アンチセンスＲＮＡの発現を調節するプロモーター
、およびＲＮＡ安定化配列を持つプラスミドを構築する。トランスフェクション
配列を細胞で転写し、そして転写物を標的ＤＮＡとハイブリダイズする。一方、
マイクロインジェクションにより、細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ合成配列を導入する
ことも可能である。
【００７３】 オリゴヌクレオチドを使用することもまた考えられる。これらは、合成により
調製してもまたはＨｃ１、Ｈｃ２または相同体の制限消化により生成してもどち
らでもよい。オリゴヌクレオチドは非常に純粋でなければならない。これは２−
５回の凍結乾燥により達成される。純粋なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＨＥ
ＰＥＳ緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．４中に取る。
【００７４】
【実施例９】：ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーの新規メンバーを検出す
るための遺伝子プローブ 適切な生物から新規ＤＥＡＤボックスタンパク質を単離するため、Ｈｃ１およ
びＨｃ２断片を用いる。本目的のため、特定の遺伝子断片を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ ＃１６３６ ０９０にしたがい、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の補
助で増幅し、そして同時にジゴキシゲニンで標識する。クローン化Ｈｃ１または
Ｈｃ２断片のプラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いる。ＰＣＲ混合物は、
ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＃１６３６ ０９０）、２０μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ
ｄＧＴＰ、２００ μＭ ｄＣＴＰ、１３０μＭ ｄＴＴＰ、７０μＭ ＤＩＧ
−１１−ｄＵＴＰ、０．３ ｎｇの各プライマー、１００ ｐｇのプラスミドＤ
ＮＡ、２．６ ＵのＴａｑポリメラーゼを含む。
【００７５】 Ｈｃ１断片を増幅するのに、プライマー （２）５’−ＧＴＴＣＴＡＣＣｎＡＴＴＣＴＧＴＧ−３’および （３）５’−ＡＣｎＧＧＴＴＣｎＧＧＴＡＡＧＡＣ−３’を用い、Ｈｃ２断片を
増幅するのに、プライマー （４）５’−ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣｎＡＣｎＡＧＡＧＡＡｎＴｎＧＣＴ−３’
および （８）５’−ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＣｎＡＴＴＣＴＧＴＧ−３’を
用いた。
【００７６】 ＰＣＲプログラムは、５分間９５℃、９５℃／３７秒−５０℃／３７秒−７２
℃／３７秒−３０サイクルであった。 標識断片を含むＰＣＲ反応混合物をハイブリダイゼーション研究に直接使用す
る。本目的のため、ＰＣＲ産物を９５℃で１０分間変性させ、そしてその後、ハ
イブリダイゼーション溶液ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ 参照１６０３５５８）を添加する（濃度２μｌ／ｍｌ）。低
ストリンジェンシーでの適切な生物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
、本ハイブリダイゼーション溶液を用いる（ハイブリダイゼーション温度３０−
５０℃）。
【００７７】
【実施例１０】：抗体 組換え方式で発現されたタンパク質を適切な方法により精製し、そして適切な
生物、例えばラットまたはウサギにおいて、ポリクローナル抗体を生成する目的
のため用いる。本目的のため、融合タンパク質を、例えば、まずグルタチオン・
セファロースを介し、そしてその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介し精製する。融合タン
パク質を含むバンドをゲルから切除し、粉砕し、そして例えばウサギまたはラッ
トに注入する。得られた抗血清をＩｇＧカラムに通過させ、そして低ｐＨで１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８中に抗体を溶出する。２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ ７．９、１２ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ、２ ｍＭ
ジチオスレイトール、１７％ グリセロール、１００ ｍＭ ＫＣｌに対し透
析する。
【００７８】
【実施例１１】：新規ＤＥＡＤボックスタンパク質を単離するための抗体の使用 先の項に記載されるように得られた抗体を、適切な生物から新規ＤＥＡＤボッ
クスタンパク質を単離する目的のため用いる。本目的のため、抗体を適切なマト
リックス、例えばセファデックスＧ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に共有カップリ
ングする。セファデックスを用い、例えばＢｉｏＲａｄカラム１．５ ｘ １０
ｃｍまたは２．５ ｘ １０ ｃｍを装填し、そして該カラムを２０ ｍｌの
緩衝液Ａ（０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０
０５ Ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ４０、ｐＨ ８．０）で平衡化する。続い
て、３．０ ｇのプロテインＡ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃ
Ｌ−４Ｂ）をカラムに適用する。４℃で一晩放置する。カラムに抗体溶液を適用
し、そして４℃で、流速〜１００ ｍｌ／時間で滴下させる。その後カラムを何
度か：２５０ ｍｌの緩衝液Ａ（に０．５％ ＮＰ４０を加えたもの）で、その
後１２５ ｍｌの０．１ Ｍ ホウ酸緩衝液、ｐＨ ９．０で、その後１２５
ｍｌのホウ酸緩衝液、ｐＨ ８．０で、その後１２５ ｍｌの０．２ Ｍ トリ
エタノールアミン、ｐＨ ８．２で洗浄する。架橋によって、プロテインＡ−セ
ファロースに抗体のＦｃ領域をカップリングさせる。その後、特異的に、緩衝液
Ｂ（０．１５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、１ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ ｐＨ ８．０、１０％ グリセロール、１０％ ＮＰ−４０）で一度、
緩衝液Ｃ（０．０５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ Ｍ ＬｉＣｌ、１ ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０、１０％ グリセロール）で一度、そして緩衝液Ｄ（
０．０１ Ｍ Ｐｉｐｅｓ、５ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０、１０％ グリセロール）で一度、カラムを再び洗浄する。非架橋抗体を
クエン酸緩衝液で溶出させる。０．０２％ ＮａＮ3を含むホウ酸緩衝液、ｐＨ
８．０中でカラムを保存する。
【００７９】 新規ＤＥＡＤボックスタンパク質を単離するため、適切な生物由来の細胞溶解
物を抗体カラムに適用する。カラムを何度か洗浄し、そして結合タンパク質を適
切な緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８中のグリシン、ｐＨ ３で溶出
させる。
【００８０】
【実施例１２】：有用な植物における過剰発現 遺伝子Ｈｃ１およびＨｃ２断片は、有用な植物で異種性発現させてもよい。遺
伝子導入は、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により仲介してもよい。典型的なＡ．ツ
メファシエンスベクター（Ｔｉプラスミド）は、アグロバクテリウムにおける複
製を可能にする複製起点（ｏｒｉ Ａｇｒｏ）、大腸菌における機能的な複製を
確実にする複製起点ｏｒｉ Ｅ． ｃｏｌｉ、複数の耐性遺伝子、例えばカナマ
イシンおよびスペクチノマイシンに対するもの、異質の遺伝子を導入するための
挿入部位、および遺伝子導入において、異質の遺伝子の始まりおよび終わりの認
識を確実にする、指示されるＴ−ＤＮＡ隣接配列を含む。Ａ．ツメファシエンス
をＴｉプラスミドで形質転換する。
【００８１】 有用な植物を感染させるため、前記植物の葉盤（ｌｅａｆ ｄｉｓｋ）に穴を
あけ、そして浅い皿（ぺトリ皿）に入れる。続いて、組換えアグロバクテリウム
の溶液を添加し、そして数分後、フィーダー細胞を含む培地（例えば濾紙）上に
葉盤を移す。葉盤の端の損傷細胞は、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染
を導く因子を放出する。２−３日後、アグロバクテリウムを破壊する抗生物質（
例えばセフォタキシム）を含む芽刺激培地上に葉盤を移し、そして２−３週間培
養する。
【００８２】 芽を根誘導培地上に移し、そしてさらに２−３週間後、土に植える。
【００８３】
【実施例１３】：診断プローブ ＲＮＡヘリカーゼに特徴的な相同ボックスを含む、遺伝子Ｈｃ１またはＨｃ２
断片あるいは相同遺伝子断片あるいはそれらの一部（少なくとも長さ２０塩基対
）を、診断プローブとして使用してもよい。本目的のため、ＤＮＡ断片を適切な
マトリックス（例えばナイロン膜、チップ）上に固定する。患者のｍＲＮＡを精
製し、そして例えばＭＭＬＶ逆転写酵素による、３７℃２時間の逆転写を介し、
ｃＤＮＡに転写する。同時にｃＤＮＡを、例えば３２Ｐまたはジゴキシゲニンで
標識する。適切なハイブリダイゼーション緩衝液、例えばＤＩＧ ＥａｓｙＨｙ
ｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ 参照１６０３５５８）中でｃＤ
ＮＡを希釈し、そしてストリンジェントな条件下で固定化ＤＮＡとハイブリダイ
ズさせる。
【００８４】
【実施例１４】：選択マーカー 遺伝子Ｈｃ１およびＨｃ２断片を、分子生物学における選択マーカーとして使
用してもよい。マウス細胞におけるＲＮＡヘリカーゼの過剰発現は、前記細胞に
対する物質レフルノミドの耐性を与えることが示されてきている（Ｍｕｌｌｎｅ
ｒ特許）。Ｈｃ１またはＨｃ２を選択マーカーとして用いるため、Ｈｃ１または
Ｈｃ２および発現しようとする遺伝子を含む発現ベクターを構築する。発現しよ
うとする遺伝子は、ヘリカーゼ遺伝子の近くまたは内部に位置してもよい。該ベ
クターを用い、適切な宿主細胞を形質転換する（例えばｐＧＥＸベクターへのク
ローニングおよび大腸菌への導入）。発現しようとする遺伝子がＨｃ遺伝子の近
くに位置する際、ベクターがうまく導入された場合、形質転換体はレフルノミド
に耐性になる。連結が成功しているかは、例えば青／白スクリーニングを介し、
確認しなければならない。発現しようとする遺伝子がＨｃ遺伝子の内部に位置す
る際、連結が成功した場合、Ｈｃ遺伝子が破壊され、そしてベクターがうまく導
入された場合、形質転換体はレフルノミドの耐性を失う。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＤＥＡＤタンパク質スーパーファミリーのタンパク質の保存領域（相
同ボックス）を図式的に示す。領域の間の数は、相同ボックスの間のアミノ酸で
の距離を示す。
【図２】 図２は、Ｆｕｌｌｅｒ Ｐａｃｅ Ｆ．Ｖ．（１９９４）上記にしたがい、発
現タンパク質の保存領域およびその既知の機能を図式的に記載する。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、Ｈｃ１およびＨｃ２の系統発生樹を記載し、そして進化
上の関連を確立する。これらの図は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ Ｄ．Ｇ．， Ｓｈａｒｐ Ｐ．Ｍ．， ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）， Ｖ
ｏｌ．５， Ｎｏ．２， １５１−１５３）の補助で、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ
．のプログラム：Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（Ｍｏｄｕｌ ＭｅｇＡｌｉｇｎ ３．１
．７）を用い、用意した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年６月９日（２０００．６．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【請求項８】 請求項１−６の１つに記載の核酸を調製するための方法で
あって、核酸が化学的に合成される、またはプローブを用い遺伝子ライブラリー
から単離される、前記方法。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月１９日（２０００．８．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ａ６１Ｐ 19/02 ４Ｃ０８６ 17/00 19/10 ４Ｈ０４５ 19/02 25/28 19/10 29/00 １０１ 25/28 31/00 29/00 １０１ 35/00 31/00 37/00 35/00 37/06 37/00 37/08 37/06 43/00 １０５ 37/08 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ミュルナー，シュテファン ドイツ連邦共和国デー−40764 ランゲン フェルト，ハーゲブッテンヴェーク 21 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA20 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA07 BA43 CA01 CA11 GA11 4B050 CC03 DD11 EE10 LL01 LL03 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ02 QQ08 QQ21 QQ44 QQ46 QQ53 QQ95 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS26 QS33 QS34 QX01 4C084 AA02 AA06 AA13 BA02 CA53 DC50 NA14 ZA152 ZA162 ZA452 ZA892 ZA962 ZA972 ZB072 ZB082 ZB132 ZB152 ZB212 ZB262 ZB322 ZC352 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA15 ZA16 ZA45 ZA89 ZA96 ZA97 ZB07 ZB08 ZB13 ZB15 ZB21 ZB26 ZB32 ZC35 4H045 AA11 BA10 BA14 CA20 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 FA10 FA71 FA74 【要約の続き】

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＲＮＡヘリ
    カーゼまたはその機能的な変異体をコードする核酸、および少なくとも８ヌクレ
    オチドを有するその一部であって、配列番号１３が本請求項の一部である、前記
    核酸。
  2. 【請求項２】 配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＲＮＡヘリ
    カーゼまたはその機能的な変異体をコードする核酸、および少なくとも８ヌクレ
    オチドを有するその一部であって、配列番号１５が本請求項の一部である、前記
    核酸。
  3. 【請求項３】 核酸がＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは二本鎖ＤＮＡであ
    る、請求項１および２に記載の核酸。
  4. 【請求項４】 請求項１ないし３に記載の核酸であって、そして繊毛虫類
    （ｃｉｌｉａｔｅｓ）から得ることが可能な、前記核酸。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載の核酸であって、そしてテトラヒメナ・テ
    ルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）から得ること
    が可能な、前記核酸。
  6. 【請求項６】 請求項１ないし５に記載の核酸から得ることが可能な、Ｄ
    ＮＡアンチセンス鎖およびＲＮＡアンチセンス鎖。
  7. 【請求項７】 核酸がベクター、好ましくは発現ベクターまたは遺伝子治
    療に有効なベクターに含まれる、請求項１ないし６の１つに記載の核酸。
  8. 【請求項８】 請求項１−６の１つに記載の核酸を調製するための方法で
    あって、核酸が化学的に合成される、またはプローブを用い遺伝子ライブラリー
    から単離される、前記方法。
  9. 【請求項９】 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドまたはその機能的な変異体、および少なくとも６アミノ酸を有するその一部。
  10. 【請求項１０】 配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプ
    チドまたはその機能的な変異体、および少なくとも６アミノ酸を有するその一部
    。
  11. 【請求項１１】 請求項９または１０に記載のポリペプチドを調製するた
    めの方法であって、適切な宿主細胞において、請求項１ないし６の１つに記載の
    核酸を発現することを含む、前記方法。
  12. 【請求項１２】 請求項９または１０に記載のポリペプチドに対する抗体
    。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の抗体を産生するための方法であって
    、請求項９または１０に記載のポリペプチドで哺乳動物を免疫し、そして適切な
    場合、生成された抗体を単離することを含む、前記方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１ないし６の１つに記載の核酸あるいは請求項９
    または１０に記載のポリペプチド、および適切な場合、薬学的に許容しうる添加
    剤および／または賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）を含む、薬剤。
  15. 【請求項１５】 癌、自己免疫疾患、特に多発性硬化症または慢性関節リ
    ウマチ、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまた
    はＩＶ型アレルギー、関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性および
    慢性感染性疾患および／または糖尿病を治療するための、および／または細胞の
    代謝、特に免疫抑制と関連した、特に移植と関連した前記代謝および／または遺
    伝病、特にヴェルナー症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症および結合組織疾
    患に影響を及ぼすための薬剤を産生するための方法であって、請求項１−６の１
    つに記載の核酸あるいは請求項９または１０に記載のポリペプチドあるいは請求
    項１２に記載の抗体を、薬学的に許容しうる添加剤および／または賦形剤と共に
    処方することを含む、前記方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１−６の１つに記載の核酸あるいは請求項９また
    は１０に記載のポリペプチドあるいは請求項１２に記載の抗体、および適切な場
    合、適切な添加剤および／または賦形剤を含む、診断剤。
  17. 【請求項１７】 癌、自己免疫疾患、特に多発性硬化症または慢性関節リ
    ウマチ、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまた
    はＩＶ型アレルギー、関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性および
    慢性感染性疾患および／または糖尿病を診断するための、および／または細胞の
    代謝、特に免疫状態、特に移植と関連した前記代謝を解析するための、および／
    または遺伝病、特にヴェルナー症候群、ブルーム症候群、色素性乾皮症および結
    合組織疾患を解析するための診断剤を調製するための方法であって、薬学的に許
    容しうるキャリアーを請求項１−６の１つに記載の核酸あるいは請求項９または
    １０に記載のポリペプチドあるいは請求項１２に記載の抗体に添加することを含
    む、前記方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１−６の１つに記載の核酸あるいは請求項９また
    は１０に記載のポリペプチドあるいは請求項１２に記載の抗体、および適切な場
    合、適切な添加剤および／または賦形剤を含む、機能上の相互作用因子を同定す
    るためのアッセイ。
  19. 【請求項１９】 機能上の相互作用因子を同定するための、請求項１−６
    の１つに記載の核酸あるいは請求項９または１０に記載のポリペプチドの使用。
  20. 【請求項２０】 ＲＮＡヘリカーゼの変異体を検出するための、請求項１
    −６の１つに記載の核酸の使用であって、前記核酸を用い遺伝子ライブラリーを
    スクリーニングし、そして発見された変異体を単離することを含む、前記使用。
  21. 【請求項２１】 タンパク質生合成に影響を及ぼすための、請求項１−６
    の１つに記載の核酸あるいは請求項９または１０に記載のポリペプチドの使用。
  22. 【請求項２２】 ｍＲＮＡ分解の阻害および／またはｍＲＮＡ分解の刺激
    および／またはｍＲＮＡの安定化のための、請求項２１に記載の、核酸およびポ
    リペプチドの使用。
  23. 【請求項２３】 有用な植物における異種性発現のための、請求項２１に
    記載の、核酸およびポリペプチドの使用。
  24. 【請求項２４】 分子生物学における選択マーカーとしての、請求項１−
    ６の１つに記載の核酸あるいは請求項９または１０に記載のポリペプチドの使用
    。
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