JP2002523522A - Non-derivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan receptor - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンのレセプターを含有する単離調製物、β（１，３）-グルカンを単離する方法、及び試験試料中のβ（１，３）-グルカンもしくはβ（１，３）-グルカン含有生物の量を定量するためのアッセイを提供する。 【解決手段】 β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合して、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンの一次複合体を生成するために好適な条件下で、β（１，３）-グルカンを含有する試料を該レセプターと接触させ、前記一次複合体を単離し、さらに、前記一次複合体からβ（１，３）-グルカンを単離する。 PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an isolated preparation containing a non-derivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan receptor, a method for isolating β (1,3) -glucan, and a test sample An assay is provided for quantifying the amount of β (1,3) -glucan or β (1,3) -glucan-containing organisms therein. SOLUTION: Under suitable conditions, β (1,3) -glucan binds to a protein-like receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan bound to the receptor, A sample containing 1,3) -glucan is contacted with the receptor, the primary complex is isolated, and β (1,3) -glucan is isolated from the primary complex.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

（関連技術） 本出願は、１９９８年８月２６に出願された米国特許出願第０９／１４０，１
９６号の一部継続出願である、１９９８年９月２５日に出願された米国特許出願
第０９／１６０，９２２号に基づき、優先権を主張するものであり、その全教示
を、参照のためここに取り込むこととする。(Related Art) This application is related to US patent application Ser. No. 09 / 140,1 filed on Aug. 26, 1998.
No. 09 / 160,922, filed Sep. 25, 1998, which is a continuation-in-part of U.S. Pat. No. 96, claiming priority, the entire teachings of which are incorporated by reference. It is taken here.

【０００２】[0002]

【従来の技術】[Prior art]

非誘導化水溶性β-（１，３）-グルカン（ＰＧＧグルカン、三重螺旋グルカン
（ＴＨ-グルカン）またはBetafectin^Rとして既知）は、特許方法で製造される、
新規且つ類のない水溶性グルカンである。この分子の生物学的活性は、粒状もし
くは他の可溶性β-グルカンとは明確に区別される。多くの研究所が、粒状と可
溶性形態との両方のβ-グルカンによる、アラキドン酸代謝産物の直接導入（Czo
p et al., J. Immunol. 141(9）:3170-3176(1988))、サイトカイン（Abel and C
zop, Intl. J. Immunopharmacol, 14(8）:1363-1373(1992); Doita et al., J.
Leuk. Biol. 14(2):173-183(1991)）及び酸化バースト（Cain et al., Compleme
nt 4:75-86(1987); Gallin et al., Int. J. Immunopharmacol. 14(2):173-183(
1992)）を報告している。対照的に、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンは、
酸化バースト活性（Mackin et al., FASEB J. 8: A216(1994)、サイトカイン分
泌（Putsiaka et al., Blood 82:3695-3700(1993））もしくは増殖（Wakshull e
t al., J. Cell. Biochem. suppl. 18A:22(1994)）等の白血球機能を、直接活性
化するものではない。代わりに、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンは、細
胞を、続発性刺激による活性化（Mackin et al., (1994); Brunke-Reese and Ma
ckin, FASEB J. 8:A488(1994); 及びWakshull et al., (1994)）に備えさせる。Underivatized water-soluble β- (1,3) -glucan (known as PGG glucan, triple helix glucan (TH-glucan) or Betafectin ^R ) is produced by a patented method,
It is a new and unique water-soluble glucan. The biological activity of this molecule is distinct from particulate or other soluble β-glucan. Many laboratories have developed direct transduction of arachidonic acid metabolites by both particulate and soluble forms of β-glucan (Czo
p et al., J. Immunol. 141 (9): 3170-3176 (1988)), cytokines (Abel and C
zop, Intl. J. Immunopharmacol, 14 (8): 1363-1373 (1992); Doita et al., J.
Leuk. Biol. 14 (2): 173-183 (1991)) and oxidative burst (Cain et al., Compleme
nt 4: 75-86 (1987); Gallin et al., Int.J. Immunopharmacol. 14 (2): 173-183 (
1992)). In contrast, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan is
Oxidative burst activity (Mackin et al., FASEB J. 8: A216 (1994), cytokine secretion (Putsiaka et al., Blood 82: 3695-3700 (1993)) or proliferation (Wakshull e
etal., J. Cell. Biochem. suppl. 18A: 22 (1994)) and do not directly activate leukocyte functions. Instead, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan activates cells by secondary stimulation (Mackin et al., (1994); Brunke-Reese and Ma
ckin, FASEB J. 8: A488 (1994); and Wakshull et al., (1994)).

【０００３】 β-グルカンの生物学的活性は、標的細胞上に位置する特異的レセプターを通
して仲介される。研究者の幾つかのグループが、結合して、粒状β-グルカン調
製物（例えば、Zymosan様粒子；Goldman（Immunology 63(2):319-324(1988);Exp
. Cell. Res. 174(2):481-490(1988); Engstad and Robertsen, Dev. Comp. Imm
unol. 18(5):397-408(1994); Muller et al., Res. Immunol. 145:267-275 (199
4)）;Czop, Advances in Immunol. 38:361, 398(1986); の食菌作用を仲介する
レセプターを記載し、これらのレセプター（Czop and Kay, J. Exp. Med. 173:1
511-1520(1991); Szabo et al., J. Biol. Chem. 270:2145-2151(1995））を部
分的に特徴付けしている。白血球相補レセプター３（ＣＲ３、ＭＡＣ １または
ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８としても既知）は、粒状と可溶性との両方のβ-グルカン
、並びに他の多糖類（Thornton et al., J. Immunol. 156:1235-1246(1996)）に
結合することが報告されている。可溶性アミノ化β-グルカン調製物は、マウス
の腹膜マクロファージに結合することが示され（Konopski et al., Biochem. Bi
ophys. Acta 1221:61-65(1994)）、リン酸化β-グルカン誘導体は、単核細胞細
胞系列に結合することが報告されている（Muller et al., J. Immunol. 156:341
8-3425(1996)）。[0003] The biological activity of β-glucan is mediated through specific receptors located on target cells. Several groups of researchers have joined together to form granular β-glucan preparations (eg, Zymosan-like particles; Goldman (Immunology 63 (2): 319-324 (1988); Exp.
Cell. Res. 174 (2): 481-490 (1988); Engstad and Robertsen, Dev. Comp.Imm
unol. 18 (5): 397-408 (1994); Muller et al., Res. Immunol. 145: 267-275 (199
4)); Czop, Advances in Immunol. 38: 361, 398 (1986);
511-1520 (1991); Szabo et al., J. Biol. Chem. 270: 2145-2151 (1995)). Leukocyte complementation receptor 3 (also known as CR3, MAC1 or CD11b / CD18) is both a particulate and soluble β-glucan, as well as other polysaccharides (Thornton et al., J. Immunol. 156: 1235-1246). (1996)). Soluble aminated β-glucan preparations have been shown to bind to mouse peritoneal macrophages (Konopski et al., Biochem. Bi
Acta 1221: 61-65 (1994)), phosphorylated β-glucan derivatives have been reported to bind to mononuclear cell lines (Muller et al., J. Immunol. 156: 341).
8-3425 (1996)).

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】[Problems to be solved by the invention]

残念ながら、各グループは、その起源、調製方法、純度及び特徴が大幅に異な
るβ-グルカン調製物を使用している。さらに、これらのβ-グルカンと標的細胞
との間の相互作用の生物学及び生物化学を特徴付けるために、異なる細胞タイプ
及び種、一次と株化の両方の細胞系列、及び異なる機能読み出しが使用されてい
る。然るに、Czopによって記載されたレセプターがＣＲ３でないことは明らかで
ある（Szabo et al. (1995)）が、これらの研究者によって記載された多様なレ
セプターの間の関係は定義されていない。Unfortunately, each group uses β-glucan preparations that differ greatly in their origin, method of preparation, purity and characteristics. In addition, different cell types and species, both primary and established cell lines, and different functional reads are used to characterize the biology and biochemistry of the interaction between these β-glucans and target cells. ing. Thus, it is clear that the receptor described by Czop is not CR3 (Szabo et al. (1995)), but the relationship between the various receptors described by these investigators has not been defined.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]

本発明は、非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンが、ラットのＮＲ８３
８３マクロファージに位置する新規なレセプターを特異的に活性化するとの発見
に関連する。ここに記載するとおり、放射性同位元素標識された、非誘導化水溶
性β（１，３）-グルカンを、ラットＮＲ８３８３細胞から誘導された膜レセプ
ターへの、このβ-グルカンの結合を測定するために使用した。非誘導化水溶性
β（１，３）-グルカンのレセプターは、タンパク質であり、膜への特定且つ飽
和可能な結合を示し、可溶性β-グルカンのサブクラスについて高度に選択的で
ある。ここに記載した研究結果は、この、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンのレセプターを特徴付け、粒状または可溶性β-グルカンについて周知のβ-グ
ルカンレセプターと明確に区別し、その一方で、非誘導化水溶性β（１，３）-
グルカンの生物学的活性の機構についての、重要な情報を明らかにするものであ
る。The present invention is based on the finding that underivatized, water-soluble beta- (1,3) -glucan is derived from rat NR83.
Related to the discovery that it specifically activates a novel receptor located on 83 macrophages. As described herein, radiolabeled, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan was used to measure the binding of this β-glucan to a membrane receptor derived from rat NR8383 cells. Used for Receptors for underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan are proteins, exhibit specific and saturable binding to membranes, and are highly selective for soluble β-glucan subclasses. The findings described here characterize this receptor for underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan and clearly distinguish particulate or soluble β-glucan from the well-known β-glucan receptor, while And derivatized water-soluble β (1,3)-
It reveals important information about the mechanism of glucan biological activity.

【０００６】 本発明は、ここに記載したレセプターを含有する単離調製物に関する。さらに
、本発明は、β（１，３）-グルカン並びにβ（１，３）-グルカン含有生物を、
単離、濃縮、もしくは精製する方法に関し、さらに、試験試料中のβ（１，３）
-グルカンもしくはβ（１，３）-グルカン含有生物の量を定量するためのアッセ
イにも関する。試験試料は、流体もしくは固体であってよく、動物由来（例えば
、血液、血清、血漿、尿、便、粘膜、痰、胆汁、腹水、創傷分泌物、腟排出物、
滑液、脳脊髄液、腹膜洗浄液、肺洗浄液、眼液(ocular fluid）、唾液もしくは
全組織抽出物等の生物学的流体；あるいはまた、試験試料は、皮膚もしくは他の
組織等の固形標本）；植物由来（植物組織、植物組織抽出物、果実もしくは果実
抽出物、種子もしくは種子抽出物、樹液、もしくはホモジナート）；微生物由来
；ウィルス細胞；菌細胞；組織培養物；環境由来；食物由来；または発酵工程由
来の複合物を含む多様な起源のものであって良い。[0006] The present invention is directed to isolated preparations containing the receptors described herein. Further, the present invention provides a β (1,3) -glucan and a β (1,3) -glucan-containing organism,
The present invention relates to a method for isolating, concentrating, or purifying, and further comprises: β (1,3)
It also relates to an assay for quantifying the amount of -glucan or β (1,3) -glucan-containing organisms. The test sample may be fluid or solid and may be of animal origin (eg, blood, serum, plasma, urine, stool, mucosa, sputum, bile, ascites, wound secretions, vaginal discharge,
Biological fluids such as synovial fluid, cerebrospinal fluid, peritoneal lavage fluid, lung lavage fluid, ocular fluid, saliva or whole tissue extract; or, alternatively, test samples are solid specimens such as skin or other tissues) Plant-derived (plant tissue, plant tissue extract, fruit or fruit extract, seed or seed extract, sap, or homogenate); microorganism-derived; virus cells; fungal cells; tissue culture; environment-derived; food-derived; It can be of a variety of origins, including complexes from the fermentation process.

【０００７】 本発明の方法においては、ここに記載のレセプターは、試験試料から、β（１
，３）-グルカン及び／またはβ（１，３）-グルカン含有生物を捕捉もしくは精
製するために使用されている。前記β（１，３）-グルカンレセプターもしくは
試験試料は、固相もしくは流体相に連結もしくは結合可能である。試験試料は、
試験試料中に存在しうるあらゆるβ（１，３）-グルカンがレセプターに結合し
；そこで得られるβ（１，３）-グルカンとレセプターとの複合体（“一次複合
体”）を単離することができ、よってβ（１，３）-グルカンを単離することの
ために好適な条件下でレセプターと接触させられる。別の実施態様では、一次複
合体の存在がβ（１，３）-グルカンまたはβ（１，３）-グルカン含有生物の存
在を示すため、試験試料中のβ（１，３）-グルカンまたはβ（１，３）-グルカ
ン含有生物を検出するために、一次複合体を検出することも可能である。別の実
施態様では、試験試料中のβ（１，３）-グルカンの量が、放射性同位元素標識
された非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンとレセプターとの複合体の量に反
比例するため、β（１，３）-グルカンの存在は競争アッセイにより検出可能で
あり、ここでは放射性同位元素標識された非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンとレセプターとが、試験試料と共にインキュベートされる。試験試料中のβ（
１，３）-グルカン（またはβ（１，３）-グルカン含有生物）の存在は、菌感染
または菌汚染を示す。これらの方法及びアッセイ、並びにキットに使用可能な抗
体もまた、本発明の範囲内である。In the method of the present invention, the receptor described herein comprises a β (1
, 3) -glucan and / or β (1,3) -glucan-containing organisms. The β (1,3) -glucan receptor or test sample can be linked or bound to a solid or fluid phase. The test sample is
Any β (1,3) -glucan that may be present in the test sample binds to the receptor; the resulting complex of β (1,3) -glucan and receptor (“primary complex”) is isolated. Thus, the β (1,3) -glucan is contacted with the receptor under conditions suitable for isolating β (1,3) -glucan. In another embodiment, the presence of the primary complex indicates the presence of β (1,3) -glucan or a β (1,3) -glucan-containing organism, so that β (1,3) -glucan or To detect β (1,3) -glucan-containing organisms, it is also possible to detect the primary complex. In another embodiment, the amount of β (1,3) -glucan in the test sample is reduced by the amount of radiolabeled, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan and receptor complex. Due to the inverse proportion, the presence of β (1,3) -glucan can be detected by a competition assay, wherein the radiolabeled underivatized water-soluble β (1,3) -glucan and the receptor are tested. Incubate with sample. Β in the test sample
The presence of 1,3) -glucan (or organisms containing β (1,3) -glucan) indicates bacterial infection or bacterial contamination. Antibodies that can be used in these methods and assays, and kits, are also within the scope of the invention.

【０００８】 本発明はまた、シグナル伝達経路を変化させる（例えば活性化もしくは不活性
化する）方法、例えばレセプター・ポジティブ細胞、すなわち非誘導化水溶性β
（１，３）-グルカンのレセプターを含有する細胞において、一以上の転写制御
因子のモジュレーションを経るものにも関連する。本発明の一の実施態様におい
ては、シグナル伝達経路が、ＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ-６及び／またはＡＰ-１の転
写制御因子ファミリーからの一以上の転写制御因子によってモジュレーションも
しくは制御される。[0008] The present invention also provides methods of altering (eg, activating or inactivating) a signal transduction pathway, eg, receptor positive cells, ie, inducible water soluble β
It is also related to cells that contain a (1,3) -glucan receptor that undergo modulation of one or more transcription factors. In one embodiment of the invention, the signaling pathway is modulated or controlled by one or more transcription factors from the NF-κB, NF-IL-6 and / or AP-1 transcription factor family.

【０００９】 本発明の方法により変化されうる、別のシグナル伝達経路には、ras／raf-１
／ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）経路、Ｇ-蛋白質／ホスホリパーゼＣ／プロテイン
キナーゼＣ経路、非-Ｇ-蛋白質／ホスホリパーゼＣ／プロテインキナーゼＣ経路
、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ホスホリパーゼＡ経路、Ｇ-蛋白質／ホスホリパーゼ
Ｄ／ホスファチジン酸経路、ｃ-ＡＭＰ-依存経路、ｃ-Ｊｕｎ Ｎ-末端キナーゼ
（ＪＮＫ、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）としても既知）経路
、ＩκＢキナーゼα（ＩＫＫα）経路、蛋白質チロシンキナーゼ経路、及び酸素
ラジカル経路が含まれる。各経路において、シグナル経路の好適な活性化物質ま
たは指示薬は、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、そのレセプターへの
結合によって活性化され、この結合のモジュレーションが、対応するシグナル伝
達を変化させることができる。Another signaling pathway that can be altered by the method of the invention is ras / raf-1
/ MAP kinase (ERK) pathway, G-protein / phospholipase C / protein kinase C pathway, non-G-protein / phospholipase C / protein kinase C pathway, JAK / STAT pathway, phospholipase A pathway, G-protein / phospholipase D / Phosphatidic acid pathway, c-AMP-dependent pathway, c-Jun N-terminal kinase (also known as JNK, stress-activated protein kinase (SAPK)) pathway, IκB kinase α (IKKα) pathway, protein tyrosine kinase pathway, and oxygen Radical pathways are involved. In each pathway, a suitable activator or indicator of the signaling pathway is activated by the binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor, and modulation of this binding results in the corresponding signal The transmission can be varied.

【００１０】 本発明の方法によれば、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプター
の活性は、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンもしくは非誘導化水溶性β（
１，３）-グルカン活性を擬態する物質の結合によって活性化され、これにより
シグナル伝達工程が活性化されて、一以上の転写制御因子（例えば、ＮＦ-κＢ
、ＮＦ-ＩＬ-６及び／またはＡＰ-１の転写制御因子ファミリーからのもの）が
活性化される。これらの転写制御因子もしくは、転写因子活性化の経路中の酵素
（ここでは“経路酵素”と呼称）の活性化は、結合したシグナル伝達経路の活性
化を測定するために使用可能である。レセプターの活性化は、他の事項に加え、
レセプターコンフォメーションにおける変化、リガンド-レセプター複合体の生
成、またはリガンド-レセプター複合体の変化を含みうる。レセプターの活動は
、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの結合及び活性化能を擬態する物質、
例えばグルカンの別の型によって開始可能である。独特の実施態様では、転写制
御因子が、リガンド結合の結果として活性化される。別の実施態様では、転写制
御因子の活性は、レセプターに結合する（然るに非誘導化水溶性β（１，３）-
グルカンが排除される）が、レセプターを活性化する能力には欠ける物質によっ
て部分的または完全に低減される。According to the method of the present invention, the activity of the receptor for the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan is determined by comparing the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan or the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan. (
It is activated by the binding of a substance that mimics 1,3) -glucan activity, thereby activating the signal transduction process and allowing one or more transcriptional regulators (eg, NF-κB
, NF-IL-6 and / or from the transcription factor family of AP-1) are activated. Activation of these transcription factors or enzymes in the pathway of transcription factor activation (referred to herein as "pathway enzymes") can be used to measure activation of the associated signaling pathway. Activation of the receptor, among other things,
It may include a change in receptor conformation, formation of a ligand-receptor complex, or a change in a ligand-receptor complex. The activity of the receptor is a substance that mimics the binding and activation ability of underivatized water-soluble β (1,3) -glucan,
For example, it can be initiated by another type of glucan. In a unique embodiment, the transcription factor is activated as a result of ligand binding. In another embodiment, the activity of the transcription factor is binding to the receptor (but not underivatized water soluble β (1,3)-).
Glucan is eliminated) but is partially or completely reduced by substances that lack the ability to activate the receptor.

【００１１】 本発明はまた、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターへの結合
を変化（例えば増大または低減）させる物質を同定するためのアッセイに関する
。前記アッセイには、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンがそのレセプター
に結合するために好適な条件下で、放射性同位元素標識された、非誘導化水溶性
β（１，３）-グルカンと、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプター
と、及び被験物質とを混合する工程が含まれる。被験物質存在下における非誘導
化水溶性β（１，３）-グルカンのそのレセプターへの結合の程度は、測定され
、被験物質の非存在下における結合の程度と比較され；結合の程度の差により、
前記物質が非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのそのレセプターへの結合を
変化させることが示される。前記物質の存在下における結合程度の増大は、前記
物質が、結合を促進、即ち延長または増強している、または非誘導化水溶性β（
１，３）-グルカンのレセプターのアゴニストであることを示す。前記物質の存
在下における結合程度の減少は、前記物質が、結合を縮小、即ち短縮または減少
させている、または非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターのアン
タゴニストであることを示す。本発明はまた、ここに記載のアッセイによって同
定された物質にも関し、よって、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカン活性の
アゴニスト及びアンタゴニストにも関する。[0011] The present invention also relates to assays for identifying substances that alter (eg, increase or decrease) the binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor. The assay includes a radioisotope-labeled, underivatized, aqueous soluble β (1,3) under conditions suitable for the underivatized, aqueous, soluble β (1,3) -glucan to bind to its receptor. Mixing the -glucan, the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan receptor, and the test substance. The extent of binding of the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor in the presence of the test substance is measured and compared to the extent of binding in the absence of the test substance; By
The substances are shown to alter the binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor. An increase in the degree of binding in the presence of the substance indicates that the substance promotes, ie, prolongs or enhances, the binding, or the inducible water soluble β (
It is an agonist of 1,3) -glucan receptor. A decrease in the degree of binding in the presence of the substance indicates that the substance has reduced, ie, shortened or reduced, binding or is an antagonist of a non-derivatized, water-soluble β (1,3) -glucan receptor. Show. The present invention also relates to substances identified by the assays described herein, and thus to agonists and antagonists of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan activity.

【００１２】 本発明はまた、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが細胞シグナル伝達経
路に及ぼす作用、例えば転写制御因子の活性化を変化（例えば増加または減少）
させる物質を同定するための新規なアッセイにも関する。このアッセイには、非
誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのそのレセプターへの結合が起こる条件（
すなわち非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、非誘導化水溶性β（１，３
）-グルカンのレセプターに結合するために好適な条件）の下で、非誘導化水溶
性β（１，３）-グルカンと、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプタ
ーと、及び被験物質とを混合する工程が含まれる。非誘導化水溶性β（１，３）
-グルカンのそのレセプターへの結合により、該レセプターが活性化され、これ
が今度は、転写制御経路のそれぞれのシグナル伝達経路において、ＮＦ-κＢ、
ＮＦ-ＩＬ-６及び／またはＡＰ-１ファミリーからのもしくは酵素等の、一以上
の転写制御因子のモジュレーションによって例示もしくは測定される通りシグナ
ル伝達を活性化する。被験物質の存在下での、選択された転写制御因子もしくは
経路酵素の活性化の程度を測定し、被験物質の非存在下における、選択された転
写制御因子もしくは経路酵素の活性化の程度と比較する。活性化の程度の差異に
より、前記物質が、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、転写制御因子も
しくは経路酵素の活性化に及ぼす作用を変化させることが示される。前記物質の
存在下における転写制御因子もしくは経路酵素の活性化における増大は、前記物
質が、活性化を促進、即ち延長または増強していることを示す。前記物質の存在
下における転写制御因子もしくは経路酵素の活性化の減少は、前記物質が、活性
化を縮小、即ち短縮または減少させていることを示す。[0012] The invention also relates to the effect of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan on cell signaling pathways, eg, altering (eg, increasing or decreasing) the activation of transcriptional regulators.
It also relates to novel assays for identifying substances to be effected. The assay includes conditions under which binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor occurs (
That is, the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan is replaced by the underivatized water-soluble β (1,3)
) Under conditions suitable for binding to -glucan receptors, underivatized water-soluble β (1,3) -glucan, underivatized water-soluble β (1,3) -glucan receptor, And a step of mixing with a test substance. Underivatized water-soluble β (1,3)
-Glucan binding to its receptor activates the receptor, which in turn in each signaling pathway of the transcriptional regulatory pathway, NF-κB,
Activates signaling as exemplified or measured by the modulation of one or more transcription factors, such as from the NF-IL-6 and / or AP-1 family or enzymes. Measure the degree of activation of the selected transcription factor or pathway enzyme in the presence of the test substance and compare it with the degree of activation of the selected transcription factor or pathway enzyme in the absence of the test substance I do. The difference in the degree of activation indicates that the substance alters the effect of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan on the activation of transcriptional regulators or pathway enzymes. An increase in the activation of a transcription factor or pathway enzyme in the presence of the substance indicates that the substance promotes, ie, prolongs or enhances, the activation. A decrease in the activation of a transcription factor or pathway enzyme in the presence of the substance indicates that the substance has reduced, ie, shortened or reduced, activation.

【００１３】 本発明のアッセイ及び方法は、感染症、炎症、自己免疫疾患、虚血再灌流障害
、癌、喘息及び過敏性疾患の治療に使用される物質及び薬剤を同定するために使
用可能である。ここに記載のアッセイ及び方法はまた、非誘導化水溶性ベータ-
（１，３）-グルカン作用を延長もしくは擬態する薬剤を同定するために使用可
能であり、これにより、例えば炎症、造血、感染症の予防及び治療、血小板生成
、末梢血液前駆体細胞援動及び創傷治癒等の非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-
グルカンが使用可能なあらゆる治療もしくは予防向けの応用において使用可能で
ある。これらの物質もしくは薬剤は、例えばグルカンのそのレセプターへの結合
を延長すること、もしくはその効果によって、非誘導化水溶性ベータ-（１，３
）-グルカンの作用を増大させる働きをする。The assays and methods of the present invention can be used to identify substances and agents used in the treatment of infectious diseases, inflammation, autoimmune diseases, ischemia-reperfusion injury, cancer, asthma and hypersensitivity diseases. is there. The assays and methods described herein may also include underivatized aqueous soluble beta-
It can be used to identify agents that prolong or mimic (1,3) -glucan action, such as, for example, inflammation, hematopoiesis, prevention and treatment of infectious diseases, platelet production, peripheral blood precursor cell support and Derivatized water-soluble beta- (1,3)-for wound healing
Glucan can be used in any therapeutic or prophylactic application where it can be used. These substances or agents can be used, for example, by prolonging the binding of glucan to its receptor, or by its effect, by derivatizing water-soluble beta- (1,3
)-Works to increase the action of glucan.

【００１４】 本発明はまた、これらに限定されるものではないが、非誘導化水溶性ベータ-
（１，３）-グルカンのレセプター上での非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グ
ルカンの結合部位について設計されたペプチドもしくは有機小分子にも関する。
一つの実施態様においては、こうした物質もしくは薬剤は、非誘導化水溶性β（
１，３）-グルカンレセプターと結合するレセプター結合部位の活性を擬態し、
よってレセプターへの結合に利用可能なβ（１，３）-グルカンの量を減少させ
、シグナル伝達などの下流の出来事の活性化を減ずるように設計可能である。本
発明はまた、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカン活性の、その結合及び非誘
導化水溶性β（１，３）-グルカンの活性化に関するアゴニストもしくは擬剤、
例えばグルカンの別の型にも関する。あるいはまた、前記物質もしくは薬剤は、
レセプター結合部位に結合し、これを非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンに
よる結合に利用不可能とするように設計可能であるため、本発明は、非誘導化水
溶性β（１，３）-グルカン結合活性のアンタゴニストにも関する。The present invention also includes, but is not limited to, non-derivatized water-soluble beta-
It also relates to peptides or small organic molecules designed for the binding site of underivatized, water-soluble beta- (1,3) -glucan on the (1,3) -glucan receptor.
In one embodiment, such a substance or agent is a non-derivatized water soluble β (
Mimics the activity of the receptor binding site that binds to the 1,3) -glucan receptor,
Thus, it can be designed to reduce the amount of β (1,3) -glucan available for binding to the receptor and reduce the activation of downstream events such as signal transduction. The present invention also provides an agonist or mimetic of the binding of underivatized water-soluble β (1,3) -glucan activity, and the activation of underivatized water-soluble β (1,3) -glucan,
For example, it relates to another type of glucan. Alternatively, the substance or drug is
The present invention provides a non-derivatized, water-soluble β (1 , 3) -Glucan binding activity.

【００１５】 ここに記載の研究は、多くの領域に応用を有する。例えば。これは非誘導化水
溶性β（１，３）-グルカン製造方法のモニタリング及び市販用発売のための製
品特徴付けにおいて、流体中のβ-グルカンの測定し、非誘導化水溶性β（１，
３）-グルカンのレセプターと相互作用する物質の構造−活性関係を検定及び決
定するために使用可能である。さらに、この研究は、薬剤及び小分子を含む多様
な物質の、多形核白血球、単核細胞、マクロファージ及び上皮細胞などのレセプ
ターポジティブ細胞への標的を定めた送達にも応用を有する。ここに記載の結果
はまた、精製スキームにおいてはレセプターポジティブ細胞及びレセプターネガ
ティブ細胞の両方について、並びにアンチレセプター抗体の生成においては診断
目的に使用可能である。さらにまた、本発明の方法及びアッセイは、試験試料中
のβ（１，３）-グルカンの、特異的且つ高度に感受性の検出を可能にし、高価
な装備もしくは熟練した人員を要せずに真菌血症の診断及び菌汚染の検出を容易
にする。[0015] The work described herein has applications in many areas. For example. This involves monitoring β-glucan in fluids and monitoring non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan production methods and product characterization for commercial launch.
3)-Can be used to assay and determine structure-activity relationships of substances that interact with glucan receptors. In addition, this work has application in the targeted delivery of diverse substances, including drugs and small molecules, to receptor-positive cells such as polymorphonuclear leukocytes, mononuclear cells, macrophages, and epithelial cells. The results described here can also be used for both receptor positive and receptor negative cells in the purification scheme, and for diagnostic purposes in the generation of anti-receptor antibodies. Furthermore, the methods and assays of the present invention allow for the specific and highly sensitive detection of β (1,3) -glucan in a test sample, and without the need for expensive equipment or skilled personnel, Diagnosis of blood and detection of bacterial contamination are facilitated.

【００１６】 本発明の、前述の、及び他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に示したよう
に、以下の、本発明の好ましい実施態様のより詳細な説明から明確になるであろ
う。[0016] The foregoing and other objects, features and advantages of the invention will be apparent from the following more particular description of preferred embodiments of the invention, as illustrated in the accompanying drawings. .

【００１７】[0017]

【発明の実施の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

本発明は、非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカン（１９９２年８月２１
日に出願された米国特許出願第０７／９３４，０１５号を参照のこと。その教示
は、ここに参照のため取り込むこととする。）がラットのＮＲ８３８３マクロフ
ァージに位置する新規なレセプターに特異的に結合するとの発見に関連する。非
誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンはまた、米国特許出願第０８／４００
，４８８号、同０８／４３２，３０３号、同０７／９３４，０１５号及び同０８
／４６９，２３３号並びに、米国特許公報第５，３２２，８４１号、同５，４８
８，０４０号、同５，５３２，２２３号及び同５，７８３，５６９号にも記載さ
れている（これら全ての教示を、参照のためここに取り込むこととする）。ここ
に記載の研究結果は、この、非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカン（ＴＨ
-グルカンとしても既知）のレセプターを特徴付け、周知のβ-グルカンレセプタ
ーと明確に区別する一方で、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの生物学的
活性の機構についての、重要な情報を明らかにするものである。The present invention relates to a non-derivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan (August 21, 1992
See U.S. patent application Ser. No. 07 / 934,015, filed on even date. That teaching is incorporated herein by reference. ) Specifically binds to a novel receptor located on rat NR8383 macrophages. Underivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan is also disclosed in US patent application Ser.
, 488, 08 / 432,303, 07 / 934,015 and 08
/ 469,233 and U.S. Patent Publications Nos. 5,322,841 and 5,48.
Nos. 8,040, 5,532,223 and 5,783,569 (all of these teachings are incorporated herein by reference). The results of the study described here demonstrate that this underivatized, water-soluble beta- (1,3) -glucan (TH
(Also known as -glucan), while clearly distinguishing it from the well-known β-glucan receptor, while providing important information about the mechanism of biological activity of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan. It clarifies important information.

【００１８】 非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンのレセプターは、主としてラット
ＮＲ８３８３マクロファージ、とりわけ槽マクロファージ中に位置する。ここに
用いる通り、“レセプター”は従来のレセプター分子並びに結合部位を包含する
ことを企図するが、こうした結合部位が、それ自体の作用を有することができ、
または第二の分子もしくは結合部位を活性化して効果（第二部位の“アンマスキ
ング”としても既知;Sandberg et al., Infect. Immun. 63(7):2625-2631(1995)
）を生み出すためである。ここに用いるとおり、“レセプター”はまた、非誘導
化水溶性β（１，３）-グルカンに対して親和性を有する化合物を包含すること
を企図するが、これらの化合物は、レセプター擬剤もしくはレセプターアナログ
であってよく、天然の産出源から単離可能、あるいは科学的もしくは合成により
に産出可能である。“ＮＲ８３８３レセプター”、“ＮＲ８３８３細胞上のレセ
プター”及び“ＮＲ８３８３細胞由来のレセプター”なる語は、上述のレセプタ
ーを意味し、これは以下に説明するＮＲ８３８３細胞上に同定されるレセプター
の、所定の特徴、例えば蛋白様組成、膜との結合、所定の結合親和性、温度感受
性、β−グルカン選択性、トリプシン感受性及び／または転写因子の活性化等を
有する。レセプター（ここでは、“蛋白質レセプター”もしくは“蛋白様レセプ
ター”とも呼称）は、ＮＲ８３８３細胞並びに他のタイプの細胞上に存在可能で
あり、単離（即ち、細胞から分離）することも可能である。ＮＲ８３８３細胞に
ついては、例えば、Helmke, R. J. et al., In Vitro Cell Bevelop. Biol. 23:
567-574(1987); Helmke, R.J. et al., In Vitro Cell Develop. Biol. 25:44-4
8(1989)が参照される。The receptor for underivatized, water-soluble beta- (1,3) -glucan is mainly located in rat NR8383 macrophages, especially tank macrophages. As used herein, "receptor" is intended to encompass conventional receptor molecules as well as binding sites, but such binding sites may have their own actions,
Or activating a second molecule or binding site (also known as "unmasking" the second site; Sandberg et al., Infect. Immun. 63 (7): 2625-2631 (1995)).
). As used herein, “receptor” is also intended to include compounds that have an affinity for underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan, provided that these compounds are receptor mimetics or It can be a receptor analog and can be isolated from a natural source or can be produced scientifically or synthetically. The terms "NR8383 receptor", "receptor on NR8383 cells" and "receptor derived from NR8383 cells" refer to the above-mentioned receptors, which are certain characteristics of the receptors identified on NR8383 cells described below. For example, it has a protein-like composition, binding to a membrane, a predetermined binding affinity, temperature sensitivity, β-glucan selectivity, trypsin sensitivity, and / or activation of a transcription factor. Receptors (also referred to herein as "protein receptors" or "protein-like receptors") can be present on NR8383 cells as well as other types of cells and can be isolated (ie, separated from cells). . For NR8383 cells, see, for example, Helmke, RJ et al., In Vitro Cell Bevelop. Biol. 23:
567-574 (1987); Helmke, RJ et al., In Vitro Cell Develop. Biol. 25: 44-4
8 (1989).

【００１９】 三重螺旋構造をとる、標識非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、ＮＲ８
３８３細胞におけるレセプターへの結合は、特異的且つ飽和可能であり、二部位
モデルによって、４５pM及び１７０pMの親和性で行われた。さらに、Ｒ８３８３
細胞における、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターへの結合は
、４℃もしくは３７℃のいずれにおいても起こった。標識した非誘導化水溶性β
（１，３）-グルカン（ＴＨ-グルカン）と、低分子量（ＬＭＷ）-グルカン（約
８，０００−１２０，０００ダルトン）及び極高分子量（ＶＨＭＷ）-グルカン
（およそ１，０００，０００ダルトンより大）、並びに三重螺旋構造をとる非標
識非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンとは、競争的にＮＲ８３８３レセプタ
ーに結合したが、スクレログルカンはしなかった。非誘導化水溶性β（１，３）
-グルカンのＮＲ８３８３細胞上のレセプターへの結合は、トリプシンを用いた
予備処理によって破壊されるが、結合活性の回復は蛋白質合成に依存しており、
ＮＲ８３８３が蛋白質であることを示した。ＮＲ８３８３細胞においては、ＬＭ
Ｗ-グルカン及びＶＨＭＷ-グルカン（スクレログルカンではない）がＮＦ-κＢ-
様因子の活性化を誘発したが、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、ＭＡ
ＰキナーゼＪＮＫ及びシグナルサムキナーゼＩＫＫαのプロテインキナーゼを刺
激した一方でＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２もしくはｐ３８のプロテインキナーゼ
は刺激しなかった。以下の実施例中に記載したとおり、ＮＲ８３８３細胞中のレ
セプターのこれらの特徴は、他の、既に同定された非誘導化水溶性β（１，３）
-グルカンレセプターとは、親和性、温度感受性、β-グルカン選択性及びトリプ
シン感受性において相違する。したがって、ＮＲ８３８３細胞のレセプターは、
非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、これまで同定されていなかったレセ
プターを表す。したがって、本発明は、ここに記載した蛋白様レセプターを含有
する単離調製物であって、これは、三重螺旋型の非誘導化水溶性β（１，３）-
グルカン等の非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンであるリガンドに結合（例
えば、特異的及び選択的に）するものである。NR8, a non-labeled, water-insoluble β (1,3) -glucan having a triple helix structure
Binding to the receptor in 383 cells was specific and saturable, and was performed at 45 pM and 170 pM affinities by the two-site model. In addition, R8383
Binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to the receptor in cells occurred at either 4 ° C. or 37 ° C. Labeled underivatized water soluble β
(1,3) -glucan (TH-glucan), low molecular weight (LMW) -glucan (about 8,000-120,000 daltons) and very high molecular weight (VHMW) -glucan (approximately 1,000,000 daltons) Large), as well as unlabeled, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan having a triple helix structure, but competitively bound to the NR8383 receptor, but not scleroglucan. Underivatized water-soluble β (1,3)
-The binding of glucan to the receptor on NR8383 cells is disrupted by pretreatment with trypsin, but the recovery of binding activity is dependent on protein synthesis,
NR8383 was shown to be a protein. In NR8383 cells, LM
W-glucan and VHMW-glucan (but not scleroglucan) are NF-κB-
, Which induces the activation of mitochondrial-like factors, but is inactivated by water-soluble β (1,3) -glucan
The protein kinases of the P kinase JNK and the signal sum kinase IKKα were stimulated while the MAP kinases ERK1 / 2 or p38 were not. As described in the examples below, these characteristics of the receptor in NR8383 cells are similar to other previously identified underivatized, aqueous soluble β (1,3)
-Glucan receptor differs in affinity, temperature sensitivity, β-glucan selectivity and trypsin sensitivity. Thus, the receptor for NR8383 cells is
Represents a previously unidentified receptor for underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan. Accordingly, the present invention is directed to an isolated preparation containing a proteinaceous receptor as described herein, which comprises a triple helix, non-derivatized, water-soluble β (1,3)-
It binds (eg, specifically and selectively) to a ligand that is a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan such as glucan.

【００２０】 酵母もしくは菌不溶性β（１，３）-グルカンを含むβ（１，３）-グルカンを
捕捉、濃縮または精製する方法、並びに、β（１，３）-グルカン含有微生物を
捕捉、濃縮または精製する方法が、ＮＲ８３８３細胞由来のレセプターを使用し
て、今や利用可能である。さらに、試験試料中のβ（１，３）-グルカンの量を
定量するアッセイをここに記載したが、これらのアッセイは、菌感染の診断に利
用可能である。前記アッセイ及び方法に有用なキットもまた記載した。前記方法
、アッセイ及びキットは、β（１，３）-グルカン等の可溶性β（１，３）-グル
カン及びグルカンの別の型（例えば、ＬＭＷ-グルカン、ＨＭＷ-グルカン、及び
ＶＨＭＷ-グルカン）について、上述のβ（１，３）-グルカンレセプターの親和
性を利用する。A method for capturing, concentrating, or purifying β (1,3) -glucan containing yeast or fungal insoluble β (1,3) -glucan, and capturing and concentrating β (1,3) -glucan-containing microorganisms Or methods of purification are now available using receptors from NR8383 cells. In addition, assays described herein for quantifying the amount of β (1,3) -glucan in a test sample are described herein, but these assays can be used to diagnose bacterial infection. Kits useful for the assays and methods have also been described. The methods, assays, and kits are directed to soluble β (1,3) -glucan, such as β (1,3) -glucan, and other forms of glucan (eg, LMW-glucan, HMW-glucan, and VHMW-glucan). Utilizing the affinity of the β (1,3) -glucan receptor described above.

【００２１】 本発明の方法によれば、菌またはβ（１，３）-グルカン含有生物を含有する
ことが既知もしくは想定される試料が得られる。試験試料は、液体もしくは固体
であって良く、動物由来（例えば、ほ乳類の細胞または組織）；植物細胞もしく
は組織、微生物細胞、ウィルス細胞、菌細胞、組織培養物、環境由来、食物由来
、または発酵工程由来の複合物を含む多様な起源のものであって良い。例えば、
試験試料が、菌感染が疑われる人の個体起源のものなどの動物由来である場合、
試験試料は、血液（全血、全血清または全血漿）、尿、便、粘膜、痰、胆汁、腹
水、創傷分泌物、腟排出物、滑液、脳脊髄液、腹膜洗浄液、肺洗浄液、眼液、唾
液もしくは全組織抽出物等のなどの生物学的流体であって良く、あるいはまた、
試験試料は、皮膚もしくは他の組織等の固形標本であっても良い。菌感染が疑わ
れる個体が、免疫無防備状態である場合は、好ましい試験試料は尿試料である。
試料が植物由来である場合、これは、植物組織、植物組織抽出物、果実もしくは
果実抽出物、種子もしくは種子抽出物、樹液、もしくは植物ホモジナート等の流
体もしくは固形標本であって良い。試験試料はまた、水、土壌もしくは土壌抽出
物等の環境由来、あるいは調製食品などの食物由来のものであって、菌汚染の恐
れのあるものであると良い。あるいはまた、試験試料は、発酵肉汁などの発酵工
程起源の試料であってもよい。According to the method of the present invention, a sample that is known or supposed to contain a bacterium or an organism containing β (1,3) -glucan is obtained. The test sample can be liquid or solid and derived from animals (eg, mammalian cells or tissues); plant cells or tissues, microbial cells, viral cells, fungal cells, tissue culture, environmental, food-derived, or fermented It can be of a variety of origins, including process-derived composites. For example,
If the test sample is from an animal, such as from an individual suspected of having a bacterial infection,
Test samples include blood (whole blood, whole serum or whole plasma), urine, stool, mucosa, sputum, bile, ascites, wound secretions, vaginal discharge, synovial fluid, cerebrospinal fluid, peritoneal lavage, lung lavage, eye Fluid, which may be a biological fluid such as saliva or whole tissue extract, or
The test sample may be a solid specimen such as skin or other tissue. If the individual suspected of having a bacterial infection is immunocompromised, a preferred test sample is a urine sample.
If the sample is of plant origin, it can be a fluid or solid specimen such as plant tissue, plant tissue extract, fruit or fruit extract, seed or seed extract, sap, or plant homogenate. The test sample may also be derived from the environment such as water, soil or soil extract, or derived from food such as prepared food, and may be one that may cause bacterial contamination. Alternatively, the test sample may be a sample from the fermentation process, such as a fermented broth.

【００２２】 試験試料が、蛋白質を豊富に含有する場合は、本発明のアッセイを行う前に、
標準トリクロロ酢酸もしくは過塩素酸沈降法または標準的な７０％エタノール沈
降法を使用する沈降などの脱蛋白質工程を実行可能である（Methods in Enzymol
ogy Vol. 182: Guide to Protein Purification (Deutscher, M. P., Ed., Acad
emic Press, Inc, San Diego CA, 1990）, Chapter 22, pp. 285-306)。しかし
ながら、こうした工程は、本発明の方法の実行に必要ではない。If the test sample contains abundant protein, before performing the assay of the present invention,
Deproteinization steps such as precipitation using standard trichloroacetic acid or perchloric acid precipitation or standard 70% ethanol precipitation can be performed (Methods in Enzymol
ogy Vol. 182: Guide to Protein Purification (Deutscher, MP, Ed., Acad
emic Press, Inc, San Diego CA, 1990), Chapter 22, pp. 285-306). However, such steps are not required for performing the method of the present invention.

【００２３】 本発明の方法においては、ここに記載の蛋白様レセプターは、試験試料からの
β（１，３）-グルカン及び／またはβ（１，３）-グルカン含有生物の捕捉また
は精製に使用される。In the method of the present invention, the proteinaceous receptor described herein is used for capturing or purifying β (1,3) -glucan and / or an organism containing β (1,3) -glucan from a test sample. Is done.

【００２４】 本発明のこの方法の一の態様においては、前記レセプターは固相（例えば、フ
ィルター、セルロースもしくはニトロセルロースなどの膜、プラスチック（例え
ばマイクロタイタプレート、ディップスティック）、ガラス（例えばスライド）
、ビーズ（例えば、ラテックスビーズ）、粒子、有機樹脂、もしくは非有機固相
）または流体（例えば、ＴＲＩＳ緩衝液またはリン酸緩衝液）相に連結可能であ
る。固相もしくは流体相へのレセプターの結合は、例えば空気乾燥、熱乾燥、ま
たは化学反応を含む従来法によって達成可能である。当該方法のこの態様におい
ては、試験試料を、試験試料中に存在しうるあらゆるβ（１，３）-グルカン（
もしくはβ（１，３）-グルカン含有生物）のレセプターへの結合に好適な条件
下で、固相もしくは流体相に結合したレセプターと接触させる。レセプター二結
合したβ（１，３）-グルカンもしくはβ（１，３）-グルカン含有生物は、ここ
では“一次複合体”と呼称される。一次複合体の生成は、β（１，３）-グルカ
ン、もしくはβ（１，３）-グルカン含有生物が試験試料から“捕捉”されたこ
とを示す。試験試料から“捕捉”されたβ（１，３）-グルカンもしくはβ（１
，３）-グルカン含有生物は、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンもし
くはβ（１，３）-グルカン含有生物である。In one embodiment of this method of the invention, the receptor is a solid phase (eg, a filter, a membrane such as cellulose or nitrocellulose), a plastic (eg, a microtiter plate, dipstick), a glass (eg, a slide).
, Beads (eg, latex beads), particles, organic resins, or non-organic solid phases) or fluid (eg, TRIS or phosphate buffer) phases. Binding of the receptor to the solid or fluid phase can be achieved by conventional methods including, for example, air drying, heat drying, or chemical reactions. In this embodiment of the method, the test sample is prepared using any β (1,3) -glucan (
Alternatively, β- (1,3) -glucan-containing organism) is contacted with a receptor bound to a solid phase or a fluid phase under conditions suitable for binding to the receptor. Receptor bilinked β (1,3) -glucan or β (1,3) -glucan-containing organisms are referred to herein as “primary complexes”. Formation of the primary complex indicates that the β (1,3) -glucan, or the organism containing β (1,3) -glucan, has been “captured” from the test sample. Β (1,3) -glucan or β (1) “captured” from the test sample
The (3,3) -glucan-containing organism is β (1,3) -glucan or β (1,3) -glucan-containing organism bound to a receptor.

【００２５】 本発明の別の実施態様では、試験試料は、試験試料中に固形支持体を浸すこと
、流体試験試料を固形支持体に滴下すること、もしくは固形支持体上に固形試験
試料を塗りつけることによって、固形支持体に結合（例えば吸収、被覆、結合、
共有結合による結合、親和力による結合）可能である。所望により、試験試料は
、例えば固形試験試料である場合には、固形支持体との結合に先立ち、食塩水も
しくは他の適当な生物学的緩衝液等の液体と混合可能である。試験試料を固形支
持体に結合させた（“結合試験試料”の生成）後、試験試料中に存在しうるあら
ゆるβ（１，３）-グルカンのレセプターへの結合に好適な条件下で、レセプタ
ーを結合試験試料に接触させる。結合試験試料中であらゆるβ（１，３）-グル
カンもしくはβ（１，３）-グルカン含有生物に結合したレセプターもまた、“
一次複合体”と呼称する。In another embodiment of the present invention, the test sample is immersed in a solid support in the test sample, dropped a fluid test sample on the solid support, or smeared the solid test sample on the solid support. By this, binding to the solid support (eg, absorption, coating, binding,
(Covalent bond, affinity bond). If desired, the test sample can be mixed with a liquid, such as saline or other suitable biological buffer, prior to binding to a solid support, for example, if it is a solid test sample. After the test sample has been bound to the solid support (formation of a “bound test sample”), the receptor is subjected to conditions suitable for binding any β (1,3) -glucan that may be present in the test sample to the receptor. Is contacted with the binding test sample. Receptors bound to any β (1,3) -glucan or β (1,3) -glucan-containing organism in a binding test sample are also described as “
The term "primary complex".

【００２６】 この方法のいずれの実施態様においても、生成したあらゆる一次複合体を単離
し、試験試料からβ（１，３）-グルカン（もしくはβ（１，３）-グルカン含有
生物）を得ること、の単離すること、濃縮することもしくは精製することが可能
である。一次複合体を、免疫沈降反応もしくは他の方法等の定法によって得、も
しくは単離し、濃縮もしくは精製した一次複合体を生成し、ここから定法（Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Vol. II. Ch. 10 (Ausubel, F et al.,
eds., John Wiley & Sons, 1997を参照のこと）によって濃縮もしくは精製され
たβ（１，３）-グルカン（もしくはβ（１，３）-グルカン含有生物）が分離可
能である。In any embodiment of this method, any primary complex formed is isolated and β (1,3) -glucan (or β (1,3) -glucan-containing organism) is obtained from the test sample. Can be isolated, concentrated or purified. The primary complex is obtained by a conventional method such as an immunoprecipitation reaction or other methods, or an isolated, concentrated or purified primary complex is produced, from which a conventional method (Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Vol. II.Ch. 10 (Ausubel, F et al.,
eds., John Wiley & Sons, 1997), the concentrated or purified β (1,3) -glucan (or β (1,3) -glucan-containing organism) can be separated.

【００２７】 本発明の別の実施態様では、β（１，３）-グルカン（もしくはβ（１，３）-
グルカン含有生物）が試験試料中に存在するか否かを決定するためのアッセイに
おいて、一次複合体が検出可能である。さらに、一次複合体の量が測定可能であ
って、一次複合体の濃度は、試験試料中に存在するβ（１，３）-グルカン（も
しくはβ（１，３）-グルカン含有生物）の量に比例する。β（１，３）-グルカ
ンの量の検出及び／または決定には、アンチ-β-グルカン抗体（単一クローン性
もしくは多クローン性）または抗体フラグメント等の、一次複合体と選択的に結
合する物質を使用するβ（１，３）-グルカンの検出；Limulus amebocyte lysat
eもしくはLimulus lysate Ｇ因子アッセイ（Mori, T. et al., Eur. J. Clin. C
hem. Biochem 35(7):553-560(1997); Hossai, M. A. et al., J. Clin. Lab. An
al. 11:73-77(1997); Obayashi, T. et al., J. Med. Vet. Mycology 30:275-28
0(1992)、各教示は参照のためにここに取り込むこととする）等による、β（１
，３）-グルカンによって沈降させた酵素反応の検出；β-グルカンと反応する酵
素の使用；または他の手段を含む、多様な方法が使用可能である。好ましい実施
態様では、Limulus lysate Ｇ因子アッセイを使用する。該方法の部油の好まし
い実施態様では、一次複合体は、放射性ヌクレオチド（例えばラジオイムノアッ
セイ）、染料、蛍光化合物、ビオチン及びストレプタヴィジン等のレセプター上
で検出可能な標識の使用によって検出される。所望により、一次複合体の量は、
既知のβ（１，３）-グルカン標準で生じる標準曲線と比較することができる。In another embodiment of the present invention, β (1,3) -glucan (or β (1,3)-
The primary complex is detectable in an assay to determine if a glucan-containing organism) is present in the test sample. Furthermore, the amount of the primary complex can be measured, and the concentration of the primary complex is determined by the amount of β (1,3) -glucan (or β (1,3) -glucan-containing organism) present in the test sample. Is proportional to For detecting and / or determining the amount of β (1,3) -glucan, it selectively binds to a primary complex, such as an anti-β-glucan antibody (monoclonal or polyclonal) or an antibody fragment. Of β (1,3) -glucan using a substance; Limulus amebocyte lysat
e or Limulus lysate factor G assay (Mori, T. et al., Eur. J. Clin. C
hem. Biochem 35 (7): 553-560 (1997); Hossai, MA et al., J. Clin. Lab. An
al. 11: 73-77 (1997); Obayashi, T. et al., J. Med.Vet.Mycology 30: 275-28
0 (1992), each teaching is incorporated herein for reference), etc.
A variety of methods are available, including detection of enzyme reactions precipitated by -glucan; use of enzymes that react with β-glucan; or other means. In a preferred embodiment, a Limulus lysate Factor G assay is used. In a preferred embodiment of the part of the method, the primary complex is detected by the use of a detectable label on the receptor, such as a radionucleotide (eg, a radioimmunoassay), a dye, a fluorescent compound, biotin and streptavidin. Optionally, the amount of primary complex is
It can be compared to a standard curve generated with a known β (1,3) -glucan standard.

【００２８】 本発明の別の実施態様では、競争アッセイを使用して、試験試料中に存在する
β（１，３）-グルカン（もしくはβ（１，３）-グルカン含有生物）の量を決定
することができる。例えば、標識された（例えば、放射性ヌクレオチド、染料、
または蛍光性標識によって）非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカン、また
は低分子量（ＬＭＷ）-グルカン（約８，０００−１２０，０００ダルトン、MAL
LSにより決定）、高分子量（ＨＭＷ）-グルカン（およそ２１０，０００より大
、１，０００，０００より小、MALLSにより決定）もしくは極高分子量（ＶＨＭ
Ｗ）-グルカン（およそ１，０００，０００ダルトンより大、MALLSにより決定）
等の他の可溶性β（１，３）-グルカンを、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンがその結合剤に結合するために好適な条件下で、ここに記載の蛋白様レセプタ
ー及び試験試料と共にインキュベートする。次いで、標識された非誘導化水溶性
β（１，３）-グルカンを含有する一次複合体の量が決定される。この量を、コ
ントロール試料（すなわち、非標識β（１，３）-グルカンの規定量を有する試
料）もしくは一連のコントロール試料（例えば標準曲線）中で、標識化非誘導化
水溶性β（１，３）-グルカンをレセプターと共にインキュベートすることによ
り生成する一次複合体の量と比較する。試験試料中のβ（１，３）-グルカンの
量は、標識された非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンを含有する一次複合体
の量と反比例する。In another embodiment of the invention, a competition assay is used to determine the amount of β (1,3) -glucan (or β (1,3) -glucan-containing organism) present in a test sample. can do. For example, labeled (eg, radionucleotides, dyes,
Water-soluble beta- (1,3) -glucan, or low molecular weight (LMW) -glucan (about 8,000-120,000 daltons, MAL
LS), high molecular weight (HMW) -glucan (greater than 210,000, less than 1,000,000, determined by MALLS) or very high molecular weight (VHM)
W) -glucan (approximately greater than 1,000,000 daltons, determined by MALLS)
And other soluble β (1,3) -glucans, under conditions suitable for the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to bind to its binding agent. And incubate with the test sample. The amount of the primary complex containing the labeled underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan is then determined. This amount can be determined in a control sample (ie, a sample having a defined amount of unlabeled β (1,3) -glucan) or a series of control samples (eg, a standard curve) in labeled, non-derivatized, aqueous soluble β (1, 3) Compare the amount of primary complex produced by incubating -glucan with the receptor. The amount of β (1,3) -glucan in the test sample is inversely proportional to the amount of primary complex containing labeled, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan.

【００２９】 β（１，３）-グルカンもしくはβ（１，３）-グルカン含有生物の存在の検出
及び定量は、真菌血症もしくは菌感染症の診断において有用である。固体におい
て菌感染症を診断するためには、例えば、生物学的流体試料等の試料を個体から
得る。該試料を、上述の通りβ（１，３）-グルカンの存在について調べる。試
験試料中のβ（１，３）-グルカンの存在は、菌細胞壁の構成要素の存在を示し
、よって菌の存在もしくは汚染、または感染を示す。同様に、環境由来もしくは
食物由来の試料中のβ（１，３）-グルカンの存在は、菌の存在もしくは汚染を
示す。さらに、β（１，３）-グルカンもしくはβ（１，３）-グルカン含有生物
の量の定量により、感染もしくは汚染の深刻さに関する情報を提供可能である。
本発明の方法及びアッセイは、試験試料中のβ（１，３）-グルカンの存在の正
確且つ特異的な同定を提供し、よって菌感染及び汚染の診断及び治療を容易にす
る。Detection and quantification of the presence of β (1,3) -glucan or β (1,3) -glucan-containing organisms is useful in diagnosing fungal blood or bacterial infection. To diagnose a bacterial infection in an individual, a sample, such as a biological fluid sample, is obtained from the individual. The sample is examined for the presence of β (1,3) -glucan as described above. The presence of β (1,3) -glucan in the test sample indicates the presence of a component of the fungal cell wall, and thus indicates the presence or contamination of the fungus, or infection. Similarly, the presence of β (1,3) -glucan in an environmental or food sample indicates the presence or contamination of a fungus. Further, quantification of the amount of β (1,3) -glucan or β (1,3) -glucan-containing organisms can provide information about the severity of infection or contamination.
The methods and assays of the present invention provide accurate and specific identification of the presence of β (1,3) -glucan in a test sample, thus facilitating the diagnosis and treatment of bacterial infection and contamination.

【００３０】 さらに、ここに記載の研究の結果として、非誘導化水溶性β-（１，３）-グル
カン製造方法をモニターし、生成物を特徴付けることができる。換言すれば、試
験試料は、標準的な競争レセプター結合アッセイに含めることができ、当該分子
のレセプターに対する相対的親和性に関しての特徴付けができる。この特徴付け
は、以下の特徴の幾つかもしくは全てについて、情報を得るであろう：バッチ毎
の品質、特定の型のβ（１，３）-グルカンとしての生成物の同定、及び生成物
の精製。In addition, as a result of the studies described herein, the method of producing underivatized, water-soluble β- (1,3) -glucan can be monitored and the product characterized. In other words, the test sample can be included in a standard competitive receptor binding assay, and can be characterized for the relative affinity of the molecule for the receptor. This characterization may provide information on some or all of the following characteristics: batch-to-batch quality, identification of the product as a particular type of β (1,3) -glucan, and identification of the product. Purification.

【００３１】 試験試料はまた、標準的捕捉もしくは競争アッセイに含めることができ、標準
試料と比較して構造−活性関係を明らかにすることができる。あるいはまた、試
験試料結合を、放射線同位元素標識後に直接試験することができる。試料を、非
誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンレセプター仲介アッセイにおいて試験
することもでき、これらの機能の抑制または刺激について試験する。例えば、こ
うしたアッセイは、ポリマーもしくは小分子レセプターアゴニストの発生におい
て、もしくは不適切な免疫増強を抑制するためのレセプターアンタゴニストの発
生、例えば免疫抑制治療の間に日和見菌感染の結果として起こりうる移植拒絶反
応の回避のために使用可能である。A test sample can also be included in a standard capture or competition assay and reveal structure-activity relationships as compared to a standard sample. Alternatively, test sample binding can be tested directly after radioisotope labeling. Samples can also be tested in a non-derivatized aqueous soluble beta- (1,3) -glucan receptor-mediated assay, testing for inhibition or stimulation of these functions. For example, such assays may involve the generation of polymer or small molecule receptor agonists, or the generation of receptor antagonists to suppress inappropriate immune enhancement, such as transplant rejection that may occur as a result of opportunistic infection during immunosuppressive treatment. Can be used for avoidance.

【００３２】 ここに開示した発見はまた、レセプターポジティブ細胞への様々な物質の標的
を定めた送達のために使用可能である。例えば、多様な物質が、マクロファージ
などのレセプターポジティブ細胞を標的としうる接合分子の生成のため、非誘導
化水溶性β（１，３）-グルカンに接合（例えば、化学的接合、架橋もしくは共
有結合）可能である。こうした標的を定めた送達システムは、耐性細胞内病原菌
（例えば、ミコバクテリウム、リーシュマニア、マラリア）のための抗菌剤、レ
セプターポジティブ白血病のための細胞、遺伝子治療（例えば、サイトカイン生
成の増進もしくは機能不全性酵素の置き換え）のための遺伝子、または特定の抗
体もしくはＴ細胞活性化の提示及び発生を増進するための抗原等の物質の送達を
増進するために使用可能である。The findings disclosed herein can also be used for targeted delivery of various substances to receptor positive cells. For example, a variety of substances can be conjugated (eg, chemically conjugated, cross-linked or covalently linked) to a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan to produce a conjugation molecule that can target receptor positive cells such as macrophages. ) It is possible. Such targeted delivery systems include antimicrobial agents for resistant intracellular pathogens (eg, mycobacterium, leishmania, malaria), cells for receptor-positive leukemia, gene therapy (eg, to enhance or function cytokine production). (Replacement of a deficient enzyme) or to enhance the delivery of substances such as specific antibodies or antigens to enhance the presentation and development of T cell activation.

【００３３】 非誘導化水溶性β-（１，３）-グルカンの、そのレセプターへの結合特異性に
より、レセプターポジティブ及びレセプターネガティブ（すなわち、レセプター
を含まない）の細胞両方の精製方法が提供される。例えば、非誘導化水溶性ベー
タ-（１，３）-グルカンは、固形マトリックスに付着させてアフィニティマトリ
ックスとして使用し、レセプターポジティブ細胞を陽性選択するか、レセプター
ネガティブ細胞を陰性選択することが可能である。同様に、アンチレセプター抗
体は、非誘導化水溶性β-（１，３）-グルカンの代わりに使用可能である。この
方法によって精製された細胞は、細胞療法における使用に拡張可能である。The binding specificity of underivatized, water-soluble β- (1,3) -glucan for its receptor provides a method for purifying both receptor positive and receptor negative (ie, receptor free) cells. You. For example, underivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan can be attached to a solid matrix and used as an affinity matrix to select positive for receptor positive cells or negative for receptor negative cells. is there. Similarly, anti-receptor antibodies can be used in place of underivatized, water-soluble β- (1,3) -glucan. Cells purified by this method are scalable for use in cell therapy.

【００３４】 さらにまた、本発明は、診断目的のアンチレセプター抗体の生成を可能にする
。モノクローナルもしくはポリクローナル抗体は、特殊添加もしくは精製したレ
セプター調製物を使用し、定法によって製造可能である。したがって、本発明は
また、非誘導化水溶性β-（１，３）-グルカンのレセプターに結合する抗体にも
関する。例えば、記載のレセプターに結合するポリクローナル及びモノクローナ
ル抗体は、本発明の範囲内である。マウス、ハムスター、ヤギまたはウサギ等の
ほ乳類を、免疫抗原形態のレセプター（すなわち、抗体反応を誘発することので
きるレセプターの抗原性部分）を用いて免疫化可能である。免疫抗原性を与える
ための技術には、例えば、担体への接合または当業界において周知の別の技術が
含まれる。抗原は、補助剤の存在下で投与可能であり、免疫化の進行は、血清も
しくは血漿中の抗体滴定量の検出によりモニター可能である。標準ＥＬＩＳＡも
しくは他のイムノアッセイを、抗原としての免疫抗原と共に使用して、抗体のレ
ベルを検定可能である。ここに記載の蛋白様レセプターに対する抗体は、例えば
、Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, 1997)に記載のもの
等の定法によって製造可能である。こうした抗体は、疾患病理学（例えば潜在的
菌感染もしくは白血病への反応）を反映する、レセプターポジティブもしくはレ
セプターポジティブ細胞の数における変化を同定するために使用可能である。[0034] Furthermore, the present invention allows the production of anti-receptor antibodies for diagnostic purposes. Monoclonal or polyclonal antibodies can be produced by conventional methods using specially added or purified receptor preparations. Accordingly, the present invention also relates to antibodies that bind to the receptor for underivatized, water-soluble β- (1,3) -glucan. For example, polyclonal and monoclonal antibodies that bind to the described receptors are within the scope of the invention. Mammals such as mice, hamsters, goats or rabbits can be immunized with a receptor in the form of an immunogenic antigen (ie, an antigenic portion of the receptor capable of eliciting an antibody response). Techniques for conferring immunogenicity include, for example, conjugation to a carrier or other techniques well known in the art. The antigen can be administered in the presence of an adjuvant, and the progress of the immunization can be monitored by detecting antibody titers in serum or plasma. Standard ELISA or other immunoassays can be used with the immunizing antigen as an antigen to assay for antibody levels. Antibodies to the protein-like receptors described herein can be produced by standard methods such as those described in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, 1997). Such antibodies can be used to identify changes in the number of receptor-positive or receptor-positive cells that reflect disease pathology (eg, response to latent bacterial infection or leukemia).

【００３５】 本発明はまた、レセプターポジティブ細胞、すなわち、ここに記載の非誘導化
水溶性β-（１，３）-グルカンのレセプターを含有する細胞における、例えば転
写制御因子もしくはシグナル伝達酵素（経路酵素）の調整による、シグナル伝達
経路のモジュレーション（例えば、活性化もしくは不活性化）の方法にも関する
。本発明の一の実施態様においては、転写制御因子が、ＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ-
６及び／またはＡＰ-１ファミリーの転写制御因子由来のものである。例えば、
転写制御因子は、ＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ-６及び／またはＡＰ-１であってよい。The present invention also relates to the use of, for example, transcription factors or signaling enzymes (receptors) in receptor-positive cells, ie, cells containing the receptor for the underivatized, water-soluble β- (1,3) -glucan described herein. (Modification of an enzyme) to modulate (eg, activate or inactivate) a signal transduction pathway. In one embodiment of the present invention, the transcription factor is NF-κB, NF-IL-
6 and / or from the AP-1 family of transcriptional regulators. For example,
The transcription factor may be NF-κB, NF-IL-6 and / or AP-1.

【００３６】 本発明の方法によれば、非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンのレセプ
ターの活性は、非誘導化水溶性ベータ-（１，３）-グルカンの結合によって活性
化され、それでシグナル伝達経路（例えば、酵素のカスケードから成る）が活性
化され、そのため転写制御因子（例えば、ＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ-６及び／また
はＡＰ-１ファミリー由来）によって制御される。レセプターの活性化は、他と
共にレセプター型の変化、リガンド−レセプター複合体の生成、もしくはリガン
ド−レセプター複合体の変化を含むことができる。According to the method of the present invention, the activity of the receptor for underivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan is activated by the binding of underivatized water-soluble beta- (1,3) -glucan. This activates a signal transduction pathway (eg, consisting of a cascade of enzymes) and is thus regulated by transcription factors (eg, from the NF-κB, NF-IL-6 and / or AP-1 families). Receptor activation can include, among other things, a change in receptor type, formation of a ligand-receptor complex, or a change in a ligand-receptor complex.

【００３７】 あるいはまた、レセプターの活性は、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカン
（例えば別の型のグルカン）の結合及び活性化能を擬態する物質によって活性化
可能である。独自の実施態様では、転写制御因子もしくは経路酵素は、リガンド
結合の結果として活性化される。別の実施態様では、転写制御因子もしくは経路
酵素の活性は、レセプターに結合する（然るに非誘導化水溶性β（１，３）-グ
ルカンが排除される）が、レセプターを活性化する能力には欠ける物質によって
部分的または完全に低減される。Alternatively, the activity of the receptor can be activated by a substance that mimics the ability to bind and activate non-derivatized, water-soluble β (1,3) -glucan (eg, another type of glucan). In a unique embodiment, the transcription factor or pathway enzyme is activated as a result of ligand binding. In another embodiment, the activity of the transcriptional regulator or pathway enzyme is binding to the receptor (though derivatized water-soluble β (1,3) -glucan is eliminated), but the ability to activate the receptor is reduced. Partially or completely reduced by the missing material.

【００３８】 本発明の方法によって変化可能な別のシグナル伝達経路には、as／raf-１／Ｍ
ＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）経路、Ｇ-蛋白質／ホスホリパーゼＣ／プロテインキナ
ーゼＣ経路、非-Ｇ-蛋白質／ホスホリパーゼＣ／プロテインキナーゼＣ経路、Ｊ
ＡＫ／ＳＴＡＴ経路、ホスホリパーゼＡ経路、Ｇ-蛋白質／ホスホリパーゼＤ／
ホスファチジン酸経路、ｃ-ＡＭＰ-依存経路、ｃ-Ｊｕｎ Ｎ-末端キナーゼ（Ｊ
ＮＫ、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）としても既知）経路、Ｉ
κＢキナーゼα（ＩＫＫα）経路、蛋白質チロシンキナーゼ経路、及び酸素ラジ
カル経路が含まれる。各経路において、シグナル経路の好適な活性化物質または
指示薬は、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、そのレセプターへの結合
によって活性化され、この結合のモジュレーションが、対応するシグナル伝達を
変化させることができる。Another signaling pathway that can be altered by the methods of the invention includes as / raf-1 / M
AP kinase (ERK) pathway, G-protein / phospholipase C / protein kinase C pathway, non-G-protein / phospholipase C / protein kinase C pathway, J
AK / STAT pathway, phospholipase A pathway, G-protein / phospholipase D /
Phosphatidic acid pathway, c-AMP-dependent pathway, c-Jun N-terminal kinase (J
NK, also known as stress-activated protein kinase (SAPK)) pathway, I
The κB kinase α (IKKα) pathway, the protein tyrosine kinase pathway, and the oxygen radical pathway are included. In each pathway, a suitable activator or indicator of the signaling pathway is activated by the binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor, and modulation of this binding results in the corresponding signal The transmission can be varied.

【００３９】 本発明はまた、例えば転写制御因子もしくは経路酵素の活性化等の、シグナル
伝達経路上での非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの作用を変化させる物質
を同定するための新規なアッセイにも関する。このアッセイには、非誘導化水溶
性β（１，３）-グルカンの、そのレセプターへの結合が起こる条件（すなわち
、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンのレセプターに結合するために好適な条件）下で、非誘導化水溶性β（１，３
）-グルカンと、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターと、及び被
験物質とを混合する工程が含まれる。非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの
そのレセプターへの結合が、レセプターを活性化し、これが今度はＮＦ-κＢ、
ＮＦ-ＩＬ-６及び／またはＡＰ-１ファミリーのものなどの転写制御因子に示さ
れるようにシグナル伝達経路を活性化する。被験物質の存在下での、選択された
転写制御因子もしくは経路酵素の活性化の程度を測定し（例えば、実施例にある
ように、転写制御因子に特異的な放射線同位元素胸式ＤＮＡオリゴヌクレオチド
を使用）、被験物質の非存在下における、選択された転写制御因子もしくは経路
酵素の活性化の程度と比較する。活性化の程度の差異が、前記物質が、非誘導化
水溶性β（１，３）-グルカンの、転写制御因子もしくは経路酵素の活性化に及
ぼす作用を変化させることを示す。前記物質の存在下における転写制御因子もし
くは経路酵素の活性化における増大は、前記物質が、活性化を促進、即ち延長ま
たは増強していることを示す。前記物質の存在下における転写制御因子もしくは
経路酵素の活性化の減少は、前記物質が、活性化を縮小、即ち短縮または減少さ
せていることを示す。The present invention is also directed to identifying substances that alter the action of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan on signal transduction pathways, such as activation of transcriptional regulators or pathway enzymes. It also relates to a novel assay for. The assay includes conditions under which binding of the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor occurs (ie, underivatized water-soluble β (1,3) -glucan is underivatized water soluble β (1,3) -glucan). Under conditions suitable for binding to β (1,3) -glucan receptors, underivatized, aqueous soluble β (1,3
) -Glucan, a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan receptor, and a test substance. The binding of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to its receptor activates the receptor, which in turn causes NF-κB,
Activates signaling pathways as shown by transcription factors such as those of the NF-IL-6 and / or AP-1 families. The degree of activation of the selected transcription factor or pathway enzyme in the presence of the test substance is determined (eg, as described in the Examples, radioisotope breast DNA oligonucleotides specific for the transcription factor). ) And the degree of activation of the selected transcription factor or pathway enzyme in the absence of the test substance. The difference in the degree of activation indicates that the substance alters the effect of underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan on the activation of transcriptional regulators or pathway enzymes. An increase in the activation of a transcription factor or pathway enzyme in the presence of the substance indicates that the substance promotes, ie, prolongs or enhances, the activation. A decrease in the activation of a transcription factor or pathway enzyme in the presence of the substance indicates that the substance has reduced, ie, shortened or reduced, activation.

【００４０】 既述の方法及びアッセイにおいて有用なキットについてもまた、本発明におい
ては考慮される。こうしたキットは、主に、固相、検出可能な標識、β（１，３
）−グルカン結合剤、及び／または標識された非誘導化水溶性β（１，３）-グ
ルカン等の当該方法及びアッセイについて記載された構成要素及び試薬を含む。
位置の実施態様においては、該キットは、ここに記載のレセプターをβ（１，３
）−グルカン結合剤として含む。好ましい実施態様においては、β（１，３）−
グルカン結合剤は、フィルター、セルロースもしくはニトロセルロースなどの膜
、プラスチック支持体（例えばマイクロタイタプレート、ディップスティック）
、ガラス支持体（例えばスライド）、ビーズ（例えば、ラテックスビーズ）、粒
子、有機樹脂、または他の有機もしくは非有機の固相に結合する。[0040] Kits useful in the methods and assays described above are also contemplated in the present invention. Such kits mainly include solid phase, detectable label, β (1,3
) -Glucan binders and / or components and reagents described for the methods and assays, such as labeled underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan.
In one embodiment, the kit comprises a receptor described herein comprising a β (1,3
) -Glucan binder. In a preferred embodiment, β (1,3)-
Glucan binders include filters, membranes such as cellulose or nitrocellulose, plastic supports (eg microtiter plates, dipsticks)
Bound to glass supports (eg, slides), beads (eg, latex beads), particles, organic resins, or other organic or non-organic solid phases.

【００４１】 下記の実施例は、本発明を詳説する目的に応じたものであり、本発明の範囲に
制限を加えるものではない。 ここに記載した全ての参考文献の教示は、参照のためここに取り込むこととす
る。The following examples are for purposes of illustrating the invention in detail and do not limit the scope of the invention. The teachings of all references mentioned herein are incorporated herein by reference.

【００４２】[0042]

【実施例】【Example】

（実施例１：材料及び方法） Ａ．材料 Ham's F-12組織培養培地は、Life Technologies (Grand Island, NY)より購入
し；ウシ胎児の血清（fcs）及びリポ多糖類（LPS、血清型0128:B12）は、Sigma
(St. Louis, MO)より購入し；ＴＨ-グルカン、低分子量グルカン（ＬＭＷ-グル
カン、約８，０００−１２０，０００ダルトン）、高分子量グルカン（ＨＭＷ-
グルカン、およそ２１０，０００より大、１，０００，０００より小）、極高分
子量グルカン、（ＶＨＭＷ-グルカン、およそ１，０００，０００ダルトンより
大）は、米国特許第５，６２２，９３９号公報、同５，７８３，５６９号公報、
及び同５，８１７，６４３号公報に記載の方法によりAlpha-Beta Technology, I
nc.において調製し；スクレログルカン（ACTIGUM^TM）は、Sanofi Bio-Industrie
s (Paris, France)より入手した。この報告書のアッセイに使用したスクレログ
ルカンは、穏やかな蟻酸加水分解、中和、及びゲル浸透クロマトグラフィーにお
けるサイズフラクションによって変性し、ＴＨ-グルカンと同等の流体力学的体
積とした。全てのβ-グルカン試料は、Limulus amoebocyte lysateアッセイによ
り、内毒素汚染について陰性と判定された。他の全ての試薬等級の材料は、Sigm
aもしくはBoehringer Mamheim (Indianapolis, IN)から購入した。GST融合タン
パク質ATF-2、ELK-1、c-junは、New England Biolabs (Beverly, MA)より入手し
；アンチ-ERK1/2、-p38、-JNK、及び-IKKα抗体、並びにGST融合タンパク質IκB
αは、Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Santa Cruz, CA)より入手した。NR8383
細胞については、例えば、Helmke, R. J. et al., In Vitro Cell Develop. Bio
l. 23;567-574 (1987); Helmke, R. J. et al., In Vitro Cell Develop. Biol.
25;44-48 (1989)をを参照のこと。分子量は、MALLSによって決定した。Example 1 Materials and Methods Materials Ham's F-12 tissue culture medium was purchased from Life Technologies (Grand Island, NY); fetal calf serum (fcs) and lipopolysaccharide (LPS, serotype 0128: B12) were purchased from Sigma.
(St. Louis, MO); TH-glucan, low molecular weight glucan (LMW-glucan, about 8,000-120,000 daltons), high molecular weight glucan (HMW-
Glucans (greater than about 210,000, less than 1,000,000), very high molecular weight glucans (VHMW-glucan, greater than about 1,000,000 daltons) are disclosed in US Pat. No. 5,622,939. No. 5,783,569,
And Alpha-Beta Technology, I by the method described in US Pat. No. 5,817,643.
scleroglucan (ACTIGUM ^™ ) was purchased from Sanofi Bio-Industrie.
s (Paris, France). The scleroglucan used in the assay of this report was denatured by mild formic acid hydrolysis, neutralization, and size fractionation in gel permeation chromatography to a hydrodynamic volume equivalent to TH-glucan. All β-glucan samples were tested negative for endotoxin contamination by the Limulus amoebocyte lysate assay. All other reagent grade materials are available from Sigm
a or purchased from Boehringer Mamheim (Indianapolis, IN). GST fusion proteins ATF-2, ELK-1, c-jun were obtained from New England Biolabs (Beverly, MA); anti-ERK1 / 2, -p38, -JNK, and -IKKα antibodies, and GST fusion protein IκB
α was obtained from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). NR8383
For cells, see, for example, Helmke, RJ et al., In Vitro Cell Develop. Bio
l. 23; 567-574 (1987); Helmke, RJ et al., In Vitro Cell Develop. Biol.
25; 44-48 (1989). Molecular weight was determined by MALLS.

【００４３】 Ｂ． ³Ｈ-ＴＨ-グルカンの調製 ＴＨ-グルカン（Alpha-Beta Technology, Worcester, MA）を、ＮａＩＯ₄（１
０mg/ml；Sigma）と共に、化膿素を含まない滅菌（SPF）水中で、室温にて７２
時間インキュベートした。０．５mlのエチレングリコールの添加により過ヨウ素
酸塩をクエンチした。酸化ＴＨ-グルカンを、SPF水に対して透析した後、１００
mCiのＮａＢ³Ｈ₄（New England Nuclear, Boston, MA）で還元的に標識した。³
Ｈ-ＴＨ-グルカンを、透析及び限外濾過によってトリチウム原子を含む低分子量
分解生成物から分離した。標識生成物の純度を、ゲル浸透クロマトグラフィーに
よって検定した。B. Preparation of ³ H-TH-glucan TH-glucan (Alpha-Beta Technology, Worcester, MA) was converted to NaIO ₄ (1
0 mg / ml; Sigma) in purulent, sterile (SPF) water at room temperature for 72 hours.
Incubated for hours. The periodate was quenched by the addition of 0.5 ml of ethylene glycol. After dialysis of oxidized TH-glucan against SPF water, 100
Reductively labeled with mCi of NaB ³ H ₄ (New England Nuclear, Boston, Mass.). ^Three
H-TH-glucan was separated from low molecular weight degradation products containing tritium atoms by dialysis and ultrafiltration. The purity of the labeled product was assayed by gel permeation chromatography.

【００４４】 Ｃ．ＮＲ８３８３全細胞結合アッセイ NR8383細胞を、標準組織培養技術を用いて、１５％のウシの胎児の血清を含有
するHam's F-12培地（F-12/fcs）中で成長させた。細胞を、掻爬及び遠心分離（
４００×g、５分間、室温）によって、およそ３×１０⁵細胞／mlの細胞密度で採
取した。細胞をPBS中に再懸濁させ、³Ｈ-ＴＨ-グルカン（最終的に１μg/ml）及
び、図に示したとおり食塩水もしくは競合物のいずれかと混合した。細胞濃度は
、０．２５−１．０×１０⁶細胞／ウェル／２００μlであった。結合反応を、６
０分間、３７℃にて進行させた。インキュベート時間の終点で、細胞を、遠心分
離により２×２５０μlのPBS洗浄し、０．１NのＮａＯＨで溶解させ、液体シン
チレーション計数により放射能を測定した。C. NR8383 whole cell binding assay NR8383 cells were grown in Ham's F-12 medium (F-12 / fcs) containing 15% fetal calf serum using standard tissue culture techniques. Cells are scraped and centrifuged (
400 × g, 5 minutes, room temperature) at a cell density of approximately 3 × 10 ⁵ cells / ml. Cells were resuspended in PBS and mixed with ³ H-TH-glucan (1 μg / ml final) and either saline or competitors as indicated. Cell concentration was 0.25-1.0 × 10 ⁶ cells / well / 200 μl. The binding reaction is
Proceed for 0 minutes at 37 ° C. At the end of the incubation period, cells were washed by centrifugation with 2 × 250 μl of PBS, lysed with 0.1 N NaOH, and radioactivity was measured by liquid scintillation counting.

【００４５】 NR8383細胞への³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合の用量依存を、３．３×１０⁶NR8383細
胞／mlを、１０００倍過剰の非標識ＴＨ-グルカンを用いて（非特異的結合）も
しくは用いずに（特異的結合）、³Ｈ-ＴＨ-グルカンの濃度を徐々に増加させて
（図１に示すとおり）、３５０μlのHank's 緩衝食塩水（Ｃａ⁺⁺／Ｍｇ⁺⁺無し；
ＨＢＳＳ^-）中、６０分間、４℃にてインキュベートすることによって検定した
。細胞を、遠心分離によりHBSS^-中で二度濯ぎ、細胞ペレットを溶解させ、液体
シンチレーション計数により放射能を測定した。予備実験により、結合レベル平
衡に６０分間で達することが示された。これらの実験においては、４℃のインキ
ュベート温度を使用して、リガンド／レセプター内在化の工程を抑制し、結合平
衡データの分析を容易にした。インキュベート培地の試料は、インキュベートの
終点にて、遊離の³Ｈ-ＴＨ-グルカンの測定のためにとっておいた。特異的結合
を、全結合と非特異的結合との差として算出した。データを、等式： Ｂ₁＝Σ｛Ｂ_max1Ｌ／（Ｌ＋Ｋｄ₁）]＋Ｂ_max2[Ｌ／（Ｌ＋Ｋｄ₂）] [Ｂ₁は、標識リガンド結合の全量を表し、Ｌは、標識リガンドの濃度を表し、Ｂ _max は、部位ｎの最大結合能を表し、Ｋｄ_nは、部位ｎに得られた解離定数である
] により、非線形回帰分析（Kaleidagraph, Synergy, Reading, PA）による二部位
／二親和性モデルに当てはめた。To NR8383 cells^ThreeThe dose dependence of H-TH-glucan binding was 3.3 × 10⁶NR8383 thin
Vesicles / ml with 1000-fold excess of unlabeled TH-glucan (non-specific binding)
(Specific binding)^ThreeBy gradually increasing the concentration of H-TH-glucan
(As shown in FIG. 1), 350 μl of Hank's buffered saline (Ca⁺⁺/ Mg⁺⁺None;
HBSS^-)) For 60 minutes at 4 ° C.
. Cells are centrifuged into HBSS^-Rinse twice in cell, dissolve cell pellet
Radioactivity was measured by scintillation counting. Preliminary experiments show that
Equilibrium was shown to be reached in 60 minutes. In these experiments, a 4 ° C ink was used.
Using the incubation temperature, the process of ligand / receptor internalization is suppressed and binding
Analysis of equilibrium data. Samples of the incubation medium are
At the end point, free^ThreeSet aside for measurement of H-TH-glucan. Specific binding
Was calculated as the difference between total binding and non-specific binding. The data is given by the equation: B₁= Σ ｛B_max1L / (L + Kd₁)] + B_max2[L / (L + Kd_Two)] [B₁Represents the total amount of labeled ligand binding, L represents the concentration of labeled ligand, B _max Represents the maximum binding capacity of site n, and Kd_nIs the dissociation constant obtained at site n
], Two sites by nonlinear regression analysis (Kaleidagraph, Synergy, Reading, PA)
/ Fit to bi-affinity model.

【００４６】 Ｄ．NR8383細胞のトリプシン化 細胞を上述の通り採取し、５mMのEDTAを含有する滅菌PBS中に再懸濁させた。
細胞を、別々の試験管に分け入れ、再度遠心分離にかけた後、０．２５％のトリ
プシン（w/v）含有もしくは非含有の１mlのPBS/EDTA中に再懸濁させた。細胞を
、３５℃にて４５分間インキュベートした。インキュベート時間の終点において
、０．５mlの大豆トリプシン抑制剤（０．２５％、w/v）を添加し、次いで１０m
lのF-12/fcsを添加した。細胞を、上記の通り遠心分離にかけ、０．７mlのPBS中
に再懸濁させるか、または結合活性のアッセイに即座にかけるため、シクロヘキ
シミド（１μg/ml）を含有もしくは非含有の１０mlのF-12/fcs中に再懸濁させ、
さらに２４時間インキュベートした。結合活性のアッセイのために、細胞を血球
計にて計数し、細胞数を均等にした。その後細胞を、結合反応が１００μg/mlの
非標識ＴＨ-グルカンの存在下もしくは非存在下、４℃にて行われたこと以外は
、上述の通り検定した。細胞を処理し、上述の通り放射能を測定した。D. Trypsinization of NR8383 cells Cells were harvested as described above and resuspended in sterile PBS containing 5 mM EDTA.
Cells were split into separate tubes, re-centrifuged, and resuspended in 1 ml PBS / EDTA with or without 0.25% trypsin (w / v). Cells were incubated at 35 ° C. for 45 minutes. At the end of the incubation time, 0.5 ml of soybean trypsin inhibitor (0.25%, w / v) was added, followed by 10 m
l of F-12 / fcs was added. Cells are centrifuged as above and resuspended in 0.7 ml of PBS, or 10 ml of F-ml with or without cycloheximide (1 μg / ml) for immediate assay for avidity. Resuspend in 12 / fcs,
Incubated for an additional 24 hours. For binding activity assays, cells were counted in a hemocytometer and cell numbers were equalized. The cells were then assayed as described above, except that the binding reaction was performed at 4 ° C. in the presence or absence of 100 μg / ml unlabeled TH-glucan. Cells were processed and radioactivity was measured as described above.

【００４７】 Ｅ． ラクトシルセラミドへの結合 ラクトシルセラミドへの、³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合を、上述（米国特許出願第
０８／９９０，１２５号、代理人事件整理番号（attorney docket no.）ABY97-0
4、１９９７年１２月１２日出願；その教示は、参照のため、ここにその全体を
取り込むこととする）の通り測定した。端的には、ラクトシルアミド（Sigma Ch
emical Co.）を１mg/mlにてエタノールに溶解させた。３例のアリコート（２０
μl）を、９６-ウェルのポリスチレンプレート（Coster）に塗布し、空気乾燥さ
せた。プレートを、PBS中１％のゼラチン（w/v）３００μlと共に３７℃にて１
−２時間インキュベートすることでブロックした。その後プレートを、PBSで濯
いだ（２×２００μl）。PBSもしくは非標識多糖類のいずれかを、各ウェルに５
０ミクロリットル添加し、プレートを３７℃にて平衡させた後、³Ｈ-ＴＨ-グル
カンを添加した（１μ/ml、最終的に１００μl）。プレートを１−２時間、３７
℃にてインキュベートし、２００μlのPBSで二度濯いだ。放射能を、１５０μl
のSolvable^TM(Du Pont NEN Wilmington, DE)に溶解させて計測した。E. Binding to lactosylceramide ³ H-TH-glucan binding to lactosylceramide was described above (US patent application Ser. No. 08 / 990,125, attorney docket no. ABY97-0).
4, filed December 12, 1997; the teachings of which are incorporated herein by reference in their entirety). Briefly, lactosylamide (Sigma Ch)
emical Co.) was dissolved in ethanol at 1 mg / ml. Three aliquots (20
μl) was applied to a 96-well polystyrene plate (Coster) and allowed to air dry. Plates are incubated at 37 ° C. with 300 μl of 1% gelatin (w / v) in PBS for 1 hour.
Blocked by incubating for 2 hours. The plate was then rinsed with PBS (2 × 200 μl). Add either PBS or unlabeled polysaccharide to each well for 5 minutes.
After adding 0 microliter and equilibrating the plate at 37 ° C., ³ H-TH-glucan was added (1 μ / ml, finally 100 μl). Plates for 1-2 hours, 37
C. and rinsed twice with 200 .mu.l of PBS. 150 μl of radioactivity
And dissolved in Solvable ^™ (Du Pont NEN Wilmington, DE).

【００４８】 Ｆ． 免疫沈降／キナーゼアッセイ NR8383細胞の、F-12＋０．１％fcs中、５×１０６細胞/ml×２mlの６ウェルプ
レート分を、一晩インキュベートした。その後細胞をLPS（１μg/ml）もしくは
ＴＨ-グルカン（３μg/ml）のいずれかと共に、規定時間、３７℃にてインキュ
ベートした。細胞を氷上におき、ウェルから掻爬して１０mlの氷温PBSに加えた
。細胞を４００×gにて５分間、４℃にて遠心分離にかけ、その後１mlのPBS中に
４℃で再懸濁させた。細胞を再度遠心分離させ、１μg/mlのロイペプチン、アプ
ロチニン、ペプスタチン、１mMのNaVO₄、１mMのPMSFを含有し、１０分間４℃に
てインキュベートした後、１５，０００×gにて２０分間遠心分離したリーシス
緩衝液（２０mMのTris pH７．４、１３７mMのNaCl、２mMのEDTA、２５mMのb-グ
リセロホスファート、２mMのNaピロホスファート、１０％のグリセリン、１％の
Triton X-100）中に再度懸濁させた。タンパク質含量を、Bradfordアッセイ（Pi
erce）によって測定した。同等のタンパク質負荷（１００−５００μg）を、予
め下記の通りキナーゼ特異的抗体（図参照）と結合させたタンパク質Ａセファロ
ースビーズ（Pierce）に加えた。免疫沈降反応混合物を、２−４時間、回転させ
つつ４℃にてインキュベートした。その後ビーズを１mlのリーシス緩衝液で３回
、１mlのキナーゼ反応緩衝液（２５mM HEPES pH７．４、２５mM ｂ-グリセロリ
ン酸塩、２５mM MgCl₂、２mM NaVO₄）で１回洗浄し、最後に２mMのDTTを含有す
る５０μlのキナーゼ反応緩衝液中に再懸濁させた。その後、２０μlのビーズ、
２２μlの反応混合物（２０μlキナーゼ反応緩衝液、１μl １mM ATP、１μl/10
μCi g-³²P-ATP）、０．５μlの２μg/mlキナーゼ基質を混合することにより、
キナーゼ反応が開始された。反応を、１５−２０分間室温にて進行させた後、１
０μlのLaemmli緩衝液を４回添加し、５分間煮沸することによって終了させた。
試料を遠心分離し、反応混合物のアリコートを１０％ SDS-PAGE上に流し、次い
でオートラジオグラフィーを行った。F. Immunoprecipitation / Kinase Assay A 6-well plate of NR8383 cells in F-12 + 0.1% fcs at 5 × 10 6 cells / ml × 2 ml was incubated overnight. The cells were then incubated with either LPS (1 μg / ml) or TH-glucan (3 μg / ml) for a specified time at 37 ° C. Cells were placed on ice, scraped from the wells and added to 10 ml ice-cold PBS. The cells were centrifuged at 400 × g for 5 minutes at 4 ° C. and then resuspended in 1 ml of PBS at 4 ° C. The cells were centrifuged again, containing 1 μg / ml leupeptin, aprotinin, pepstatin, 1 mM NaVO ₄ , 1 mM PMSF, incubated for 10 minutes at 4 ° C., and then centrifuged at 15,000 × g for 20 minutes Lysis buffer (20 mM Tris pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM b-glycerophosphate, 2 mM Na pyrophosphate, 10% glycerin, 1%
Triton X-100). The protein content was determined by the Bradford assay (Pi
erce). An equivalent protein load (100-500 μg) was added to Protein A Sepharose beads (Pierce) previously conjugated to a kinase-specific antibody (see figure) as described below. The immunoprecipitation reaction mixture was incubated at 4 ° C. with rotation for 2-4 hours. The beads were then washed three times with 1 ml lysis buffer, once with 1 ml kinase reaction buffer (25 mM HEPES pH 7.4, 25 mM b-glycerophosphate, 25 mM MgCl ₂ , 2 mM NaVO ₄ ) and finally 2 mM Resuspended in 50 μl of kinase reaction buffer containing DTT. Then 20 μl beads,
22 μl reaction mixture (20 μl kinase reaction buffer, 1 μl 1 mM ATP, 1 μl / 10
μCig- ³² P-ATP), by mixing 0.5 μl of 2 μg / ml kinase substrate.
The kinase reaction has begun. The reaction was allowed to proceed for 15-20 minutes at room temperature,
Termination was achieved by adding 0 μl of Laemmli buffer four times and boiling for 5 minutes.
Samples were centrifuged and aliquots of the reaction mixture were run on a 10% SDS-PAGE followed by autoradiography.

【００４９】 キナーゼ特異的抗体を、下記の通り、予めタンパク質Ａセファロースビーズに
結合させた。ビーズは１mlのリーシス緩衝液中で二度洗浄し、遠心分離（１５，
０００×g、３０秒間）し、０．５体積のリーシス緩衝液中に再懸濁させた。ビ
ーズ懸濁液２０ミクロリットルを、ミクロフュージ管に分け入れ、２μl（約０
．４μg）の抗体を添加した。ビーズ／抗体混合物を、細胞溶解物の添加前に、
２０−３０分間氷温でインキュベートした。The kinase-specific antibody was previously bound to protein A Sepharose beads as described below. The beads were washed twice in 1 ml lysis buffer and centrifuged (15,
000 × g for 30 seconds) and resuspended in 0.5 volume of lysis buffer. 20 microliters of the bead suspension is divided into microfuge tubes, and 2 μl (approximately
. 4 μg) of the antibody was added. The bead / antibody mixture is added prior to the addition of the cell lysate.
Incubated at ice temperature for 20-30 minutes.

【００５０】 Ｇ．電気泳動移動度転移アッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay）（
EMSA） EMSAを、主にAdams, et al., J. Leuk. Biol. 62(6):865-873(1997)に記載の
通り行った。端的には、下記の通り。 ・細胞刺激 LPS（１μg/ml）、ＴＨ-グルカン（３μg/ml）、低分子量グルカン（ＬＭＷ-
グルカン；３もしくは３０μg/ml）、高分子量グルカン（ＶＨＭＷ-グルカン；
３μg/ml）、もしくはスクレログルカン（３μg/ml）を培地に添加し、３７℃イ
ンキュベートを０．５−１．０時間継続した。刺激の後、細胞を氷温のPBS中に
掻爬し、一度PBSで濯いだ後、核抽出に用いた。 PMNを、酸シトレートデキストロースで凝固防止したドナー血液から調製した
。１．５％のデキストラン（w/v）中に沈殿させた後、細胞を遠心分離し（４０
０×g、７分間）、自己由来血漿中に再懸濁させた。その後、細胞をFicoll勾配
（リンパ球分離培地；Organon Teknika, Durham, NC）上に積層させ、遠心分離
した（４００×g、３０分間）。ペレットから回収された細胞を、低張状態で溶
解させ、残りのRBCを除去した。残留細胞は、形態学的基準により判断して９５
％より多くが好中球であり、この後これらを、核抽出物の調製の前に上述の通り
刺激した。G. Electrophoretic Mobility Shift Assay (
EMSA) EMSA was performed mainly as described in Adams, et al., J. Leuk. Biol. 62 (6): 865-873 (1997). In short, it is as follows. -Cell stimulation LPS (1 µg / ml), TH-glucan (3 µg / ml), low molecular weight glucan (LMW-
Glucan; 3 or 30 μg / ml), high molecular weight glucan (VHMW-glucan;
3 μg / ml) or scleroglucan (3 μg / ml) was added to the medium, and incubation at 37 ° C. was continued for 0.5-1.0 hours. After stimulation, the cells were scraped into ice-cold PBS, rinsed once with PBS, and used for nuclear extraction. PMN was prepared from donor blood that was anticoagulated with acid citrate dextrose. After precipitation in 1.5% dextran (w / v), the cells were centrifuged (40
(0 × g, 7 minutes) and resuspended in autologous plasma. The cells were then layered on a Ficoll gradient (lymphocyte separation medium; Organon Teknika, Durham, NC) and centrifuged (400 xg, 30 minutes). Cells recovered from the pellet were lysed under hypotonic conditions to remove residual RBC. Residual cells were determined by morphological criteria at 95
More than% are neutrophils, after which they were stimulated as described above before the preparation of nuclear extracts.

【００５１】 ・核抽出物 EMSAのための核抽出物を、各資料に１．０−２．０×１０⁷細胞を使用して、
既述の通り調製した（Adams, et al., 1997）。全ての緩衝液に、新たにDTT（０
．５mM）、プロテアーゼインヒビターカクテル、及びホスファターゼインヒビタ
ーカクテルを補填した。タンパク質濃度を、Bradfordアッセイ(Pierce)により、
BSA基準に対して決定した。Nuclear Extract Nuclear extract for EMSA was prepared using 1.0-2.0 × 10 ⁷ cells for each sample.
Prepared as previously described (Adams, et al., 1997). Add a new DTT (0
. 5 mM), a protease inhibitor cocktail, and a phosphatase inhibitor cocktail. The protein concentration was determined by the Bradford assay (Pierce).
Determined against BSA criteria.

【００５２】 ・電気泳動移動度転移アッセイ（EMSA） 活性化した転写因子を、既述の（Adams, et al., 1997）EMSAを使用して検定
した。NF-κBコンセンサス合成二重プローブ（consensus synthetic duplex pro
be）は、既述の通りとした（Adams, et al., 1997; Lenardo, M. J. and Baltim
ore, D., Cell 58:227-229(1989)も参照のこと）。³²P-標識二重プローブを、ポ
リヌクレオチドキナーゼで調製した。標識プローブ（０．５pmol）を、３μgの
核抽出タンパク質と、１０mMのTris-HCl pH7.5、５０mMのNaCl,1mMのEDTA、１mM
のDTT、５％のグリセリン、０．０２％のβ-メルカプトエタノール、０．１−１
．０μgのポリ（dI/dC）を含有する溶液（Pharmacia）中で混合した。反応物を
２５℃にて２０分間インキュベートした後、０．５X TBE緩衝液中４％のポリア
クリルアミドゲルに通す非変性条件下で電気泳動させた。バンドが、オートラジ
オグラフィーによって映像化された。Electrophoretic mobility transfer assay (EMSA) Activated transcription factors were assayed using the EMSA described previously (Adams, et al., 1997). NF-κB consensus synthetic duplex pro
be) was as previously described (Adams, et al., 1997; Lenardo, MJ and Baltim
ore, D., Cell 58: 227-229 (1989)). ³² P-labeled dual probes were prepared with polynucleotide kinase. The labeled probe (0.5 pmol) was combined with 3 μg of nuclear extract protein, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM
DTT, 5% glycerin, 0.02% β-mercaptoethanol, 0.1-1
. Mixing was performed in a solution (Pharmacia) containing 0 μg of poly (dI / dC). The reaction was incubated at 25 ° C for 20 minutes before electrophoresis under non-denaturing conditions through a 4% polyacrylamide gel in 0.5X TBE buffer. The band was imaged by autoradiography.

【００５３】 （実施例）２：完全なＮＲ８３８３細胞への³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合 Ａ．NR8383細胞を、／mlを、１０００倍過剰の非標識ＴＨ-グルカンを用いて（
非特異的）もしくは用いずに（全）、³Ｈ-ＴＨ-グルカンの濃度を徐々に増加さ
せて、６０分間、４℃にてインキュベートした。インキュベートの終点で、非結
合放射能を洗浄により取り除き、細胞関連放射能の量を、上述のように測定した
。特異的結合を、全放射能から非特異的なものを減算することにより決定した。
結果を図１に示した。特異的結合曲線は、上述のように二部位モデルの非線形回
帰分析に適合した。図１のデータは、NR8383細胞への³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合が
、用量依存型、特異的且つ飽和可能であることを示している。リガンドの濃度が
増大するほど、NR8383細胞は、ますます多量の³Ｈ-ＴＨ-グルカンと結合した（
全）。インキュベート混合物への非標識ＴＨ-グルカンの添加により、細胞と連
合する³Ｈ-ＴＨ-グルカンの量が抑制された（非特異的）。全結合から、非特異
的結合を減算した後、特異的結合が約３０fm/１０⁶細胞にて飽和可能であること
が判明した。特異的結合曲線の非線形回帰分析は、明かな解離定数Ｋｄ１及びＫ
ｄ２がそれぞれ４５pM及び１７０pMである二部位結合モデルに適合する。結合部
位の数は、高親和性及び低親和性の部位についてそれぞれ３，２００／細胞及び
１８，０００／細胞であった。NR8383細胞について４℃にて観察された結合活性
は、ラクトシルセラミドについて観察されたものと対象を成し、４℃においては
結合活性のないことを示した（データ示さず）。Example 2: ³ H-TH-Glucan Binding to Complete NR8383 Cells A. NR8383 cells were purified using a 1000-fold excess of unlabeled TH-glucan / ml (
Nonspecific) or without (total), ³ H-TH- gradually increasing concentrations of glucan, 60 minutes, and incubated at 4 ° C.. At the end of the incubation, unbound radioactivity was removed by washing and the amount of cell-associated radioactivity was measured as described above. Specific binding was determined by subtracting non-specific from total radioactivity.
The results are shown in FIG. The specific binding curves were fitted to a two-site model nonlinear regression analysis as described above. The data in FIG. 1 shows that ³ H-TH-glucan binding to NR8383 cells is dose-dependent, specific and saturable. Higher concentration of the ligand is increased, NR8383 cells were increasingly combined with a large amount of ³ H-TH- glucan (
all). Addition of unlabeled TH-glucan to the incubation mixture suppressed the amount of ³ H-TH-glucan associated with the cells (non-specific). After subtracting the non-specific binding from the total binding, the specific binding was found to be saturable at about 30 fm / 10 ⁶ cells. Non-linear regression analysis of the specific binding curve shows clear dissociation constants Kd1 and Kd1
Fits a two-site binding model where d2 is 45 pM and 170 pM, respectively. The number of binding sites was 3,200 / cell and 18,000 / cell for high and low affinity sites, respectively. The binding activity observed at 4 ° C for NR8383 cells was comparable to that observed for lactosylceramide, indicating no binding activity at 4 ° C (data not shown).

【００５４】 Ｂ．NR8383細胞及びラクトシルセラミドへの³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合の選択性 NR8383細胞上での、³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合部位へのβ-グルカン結合の選択性
を、競争結合アッセイによって測定した。これらのアッセイでは、NR8383細胞は
、³Ｈ-ＴＨ-グルカン及び様々な濃度の非標識競争β-グルカン（ＬＭＷ-グルカ
ン、ＶＨＭＷ-グルカン；もしくはスクレログルカン）と共に、共インキュベー
トされる。非結合放射能を取り除き、細胞関連放射能の量を、上述のように測定
した。このタイプの実験の結果を、図２−４に示す（図２：ＬＭＷ-グルカン；
図３：ＶＨＭＷ-グルカン；図４：スクレログルカン）。データの点は、平均％
コントロール結合±変形の％係数を表し、ＴＨ-グルカンは、各実験にポジティ
ブコントロールとして含めた。非標識ＴＨ-グルカン、ＬＭＷ-グルカン、及びＶ
ＨＭＷ-グルカンもまた、³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合に向けて競争可能であるが、ス
クレログルカンは、試験した濃度範囲においては有効な競争対象ではなかった。B. Selectivity of ³ H-TH-glucan binding to NR8383 cells and lactosylceramide The selectivity of β-glucan binding to ³ H-TH-glucan binding sites on NR8383 cells was determined by a competitive binding assay. In these assays, NR8383 cells are co-incubated with ³ H-TH-glucan and various concentrations of unlabeled competing β-glucan (LMW-glucan, VHMW-glucan; or scleroglucan). Unbound radioactivity was removed and the amount of cell-associated radioactivity was measured as described above. The results of this type of experiment are shown in FIGS. 2-4 (FIG. 2: LMW-glucan;
FIG. 3: VHMW-glucan; FIG. 4: Scleroglucan). Data points are average%
Control binding ±% coefficient of deformation, TH-glucan was included as a positive control in each experiment. Unlabeled TH-glucan, LMW-glucan, and V
HMW-glucan can also compete for ³ H-TH-glucan binding, but scleroglucan was not an effective competitor in the concentration range tested.

【００５５】 ラクトシルセラミドは、ヒトの好中球におけるＴＨ-グルカンレセプターとし
て同定されている（米国特許出願第０８／９９０，１２５号、代理人事件整理番
号ABY97-04、１９９７年１２月１２日出願；その教示は、参照のため、ここにそ
の全体を取り込むこととする）。これら同一のβ-グルカンの、³Ｈ-ＴＨ-グルカ
ンのラクトシルセラミドへの結合に対して競争する能力を調査した。ラクトシル
セラミドを、上述の通り９６-ウェルプレート上に被覆し、様々な濃度の非標識
β-グルカン（ＬＭＷ-グルカン；ＶＨＭＷ-グルカン；スクレログルカン）の存
在下にて、³Ｈ-ＴＨ-グルカン（１μg/ml）と共にインキュベートした。ウェル
を濯ぎ、残留放射能を、上述の通り測定した。結果を図５−７に示す（図５：Ｌ
ＭＷ-グルカン；図６：ＶＨＭＷ-グルカン；図７：スクレログルカン）。非標識
ＴＨ-グルカン及びＶＨＭＷ-グルカンは、ラクトシルセラミドへの³Ｈ-ＴＨ-グ
ルカン結合の、有効な競争対象であった。NR8383細胞で得られた結果と対照的に
、ＬＭＷ-グルカンは結合を争えず、一方でスクレログルカンが有効な競争対象
であることが判明した。このデータは、NR8383レセプターがラクトシルセラミド
とは異なるβ-グルカン選択性を有することを明確に示している。Lactosylceramide has been identified as a TH-glucan receptor on human neutrophils (US Ser. No. 08 / 990,125, Attorney Docket No. ABY97-04, Dec. 12, 1997). Application; the teachings of which are incorporated herein by reference in their entirety). The ability of these same β-glucans to compete for binding of ³ H-TH-glucan to lactosylceramide was investigated. Lactosylceramide, coated onto as 96-well plates described above, unlabeled β- glucan of various concentrations in the presence of (LMW-glucan;; VHMW- glucan scleroglucan), ³ H-TH- Incubated with glucan (1 μg / ml). Wells were rinsed and residual radioactivity was measured as described above. The results are shown in FIGS. 5-7 (FIG. 5: L
MW-glucan; FIG. 6: VHMW-glucan; FIG. 7: scleroglucan). Unlabeled TH-glucan and VHMW-glucan were effective competitors for ³ H-TH-glucan binding to lactosylceramide. In contrast to the results obtained in NR8383 cells, LMW-glucan could not compete for binding, while scleroglucan proved to be an effective competitor. This data clearly shows that the NR8383 receptor has a different β-glucan selectivity than lactosylceramide.

【００５６】 Ｃ．NR8383細胞³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合活性のトリプシン選択性 NR8383細胞上では、³Ｈ-ＴＨ-グルカンレセプターがトリプシン化に感受性で
あることが判明した。NR8383細胞を、³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合活性の測定前に
トリプシンと共にインキュベートするという実験が行われた。表１には、該実験
の結果が示されている。細胞数を、結合アッセイのために標準化し、特異的結合
（全結合−非特異的結合）は、０及び２４時間の時点でのそれぞれのコントロー
ル値に標準化した。トリプシン予備処理は、非処理コントロール細胞に対して、
９６％の特異的結合を排除した。細胞を、トリプシン化の後に通常培地中で２４
時間インキュベートした場合、結合活性は、コントロールレベルを越えてほとん
ど５０％回復した。この回復は、タンパク質合成インヒビターシクロヘキシミド
（１μ/ml）によって抑制された。興味深いことに、シクロヘキシミドが非処理
のコントロール細胞に加えられる場合、結合活性が９４％減少した。これは、³
Ｈ-ＴＨ-グルカン結合活性の継続した発現のためには、不安定なタンパク質が必
要であることを示唆している。これはレセプター自体、またはタンパク質もしく
はそのｍＲＮＡのいずれかを安定化するタンパク質を表していた。それにもかか
わらず、これらの結果は、NR8383レセプターがタンパク質であって、グリコスフ
ィンゴ脂質ではないことを、強力に示している。 表１：NR8383細胞への³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合に対する、トリプシン及びシクロ
ヘキシミドの作用C. The NR8383 cells ³ H-TH- glucan binding activity of trypsin selectivity NR8383 on cells, ³ H-TH- glucan receptor was found to be sensitive to trypsinization. The NR8383 cells, experiments that incubated with trypsin was performed before the measurement of ³ H-TH- glucan binding activity. Table 1 shows the results of the experiment. Cell numbers were normalized for binding assays and specific binding (total binding-non-specific binding) was normalized to respective control values at 0 and 24 hours. Trypsin pretreatment was performed on untreated control cells.
96% of specific binding was eliminated. After trypsinization, cells are grown in normal medium for 24 hours.
When incubated for a period of time, the binding activity recovered almost 50% above control levels. This recovery was suppressed by the protein synthesis inhibitor cycloheximide (1 μ / ml). Interestingly, when cycloheximide was added to untreated control cells, binding activity was reduced by 94%. This is ³
This suggests that an unstable protein is required for continued expression of H-TH-glucan binding activity. This represented the receptor itself, or a protein that stabilized either the protein or its mRNA. Nevertheless, these results strongly indicate that the NR8383 receptor is a protein, not a glycosphingolipid. Table 1: NR8383 for ³ H-TH- glucan binding to the cell, the action of trypsin and cycloheximide

【表１】 [Table 1]

【００５７】 （実施例３：NR8383細胞中で、ＴＨ-グルカンによって開始されるシグナル伝達
現象） Ａ．NF-κB様転写因子の活性化 ヒトＰＭＮ及びネズミのＢＭＣ２．３マクロファージ上での、ラクトシルセラ
ミドを経るＴＨ-グルカン誘発シグナル伝達は、ＮＦ-κＢ様核転写因子を活性化
することが示されている（米国特許出願第０８／９９０，１２５号、代理人事件
整理番号（attorney docket no.）ABY97-04、１９９７年１２月１２日出願；そ
の教示は、参照のため、ここにその全体を取り込むこととする）。NR8383細胞及
びヒトＰＭＮにおけるＮＦ-κＢ様ＤＮＡ結合活性を活性化する、ＴＨ-グルカン
、ＬＭＷ-グルカン、ＶＨＭＷ-グルカン、及びスクレログルカンの能力を、電気
泳動移動度転移アッセイ（EMSA）を用いて比較した。細胞を、β-グルカン（コ
ントロール；LPS、１μg/ml；TH-グルカン、３μg/ml；スクレログルカン、３μ
g/ml；ＬＭＷ-グルカン、３μg/mlもしくは３０μg/ml；ＶＨＭＷ-グルカン、３
μg/ml ）と共にインキュベートした。核抽出物を、ＮＦ-κＢ活性の測定のため
、上述の通りＥＭＳＡによって調製した。ＮＲ８３８３細胞中では、ＴＨ-グル
カン、ＶＨＭＷ−グルカン、及びＬＭＷ-グルカンがＮＦ-κＢ様ＤＮＡ結合活性
を誘発するが、スクレログルカンはそうではない（データ示さず）。ＰＭＮ中で
は、ＴＨ-グルカン及びスクレログルカンがＮＦ-κＢ様ＤＮＡ結合活性を誘発す
る一方で、ＬＭＷ-グルカンはそうではない（データ示さず：ＶＨＭＷ-グルカン
は、これらの細胞では試験しなかった）。このように、ラットのＮＲ８３８３細
胞及びヒトのＰＭＮにおけるこれらの多様なβ-グルカンによって開始されるシ
グナル伝達は、³Ｈ-ＴＨ-グルカン結合を競うこれらの能力と相関する。Example 3 Signaling Phenomena Initiated by TH-Glucan in NR8383 Cells Activation of NF-κB-like transcription factor TH-glucan-induced signaling via lactosylceramide on human PMN and murine BMC2.3 macrophages has been shown to activate NF-κB-like nuclear transcription factor (US patent application Ser. No. 08 / 990,125, attorney docket no. ABY 97-04, filed Dec. 12, 1997; the teachings of which are incorporated herein by reference in their entirety. Will be included). The ability of TH-glucan, LMW-glucan, VHMW-glucan, and scleroglucan to activate NF-κB-like DNA binding activity in NR8383 cells and human PMN was determined using electrophoretic mobility transfer assay (EMSA). Compared. Cells were treated with β-glucan (control; LPS, 1 μg / ml; TH-glucan, 3 μg / ml; scleroglucan, 3 μg
g / ml; LMW-glucan, 3 μg / ml or 30 μg / ml; VHMW-glucan, 3
μg / ml). Nuclear extracts were prepared by EMSA as described above for measurement of NF-κB activity. In NR8383 cells, TH-glucan, VHMW-glucan, and LMW-glucan induce NF-κB-like DNA binding activity, whereas scleroglucan does not (data not shown). In PMN, TH-glucan and scleroglucan induce NF-κB-like DNA binding activity, whereas LMW-glucan does not (data not shown: VHMW-glucan was not tested in these cells) ). Thus, signaling initiated by these diverse β-glucans in rat NR8383 cells and human PMNs correlates with their ability to compete for ³ H-TH-glucan binding.

【００５８】 Ｂ．プロテインキナーゼの活性化 最後に、ＮＲ8383細胞においてＴＨ-グルカンによって誘発される初期シグナ
ル伝達現象を調査した。とりわけ、プロテインキナーゼアッセイにつながる免疫
沈降を利用して、ＴＨ-グルカンシグナリングにいずれのプロテインキナーゼカ
スケードが関わるのかを決定した。ＮＲ８３８３細胞を、ＬＰＳ（１μg/ml、ポ
ジティブコントロール）、ＴＨ-グルカン（３μg/ml）と共に、または添加物無
しで、３０分間３７℃にてインキュベートした。細胞を溶解させ、キナーゼ特異
的抗体で免疫沈降させ、上述の通りキナーゼアッセイを行った。等量の蛋白質を
各実験において免疫沈降に用いた。ＴＨ-グルカンはＭＡＰキナーゼ細胞外ミト
ゲン制御キナーゼ（ＥＲＫ１／２）（キナーゼ基質はＡＴＦ−２−ＧＳＴであっ
た）を活性化せず；ｐ³⁸（キナーゼ基質はＥＬＫ−１−ＧＳＴ）を活性化しなか
った（データ示さず）。対照的に、ＴＨ-グルカンは迅速且つ一時的にＭＡＰキ
ナーゼｃ−Ｊｕｎ Ｎ-末端キナーゼ（ＪＮＫ、ストレス活性化プロテインキナー
ゼもしくはＳＡＰＫとしても既知；キナーゼ基質はｃ−Ｊｕｎ−ＧＳＴであった
）を活性化した（データ示さず）。ＴＨ−グルカンもまた、迅速且つ一時的にＩ
κＢキナーゼα（ＩＫＫａ；キナーゼ基質は、ＩκＢα-ＧＳＴであった）、Ｉ
κＢaをリン酸化するキナーゼを活性化し、ＮＦ-κＢ様転写因子の活性化を引き
起こした（データ示さず）。B. Activation of Protein Kinase Finally, the initial signaling events induced by TH-glucan in NR8383 cells were investigated. In particular, immunoprecipitations leading to protein kinase assays were used to determine which protein kinase cascade is involved in TH-glucan signaling. NR8383 cells were incubated for 30 minutes at 37 ° C. with LPS (1 μg / ml, positive control), TH-glucan (3 μg / ml), or without additives. Cells were lysed, immunoprecipitated with a kinase-specific antibody, and a kinase assay was performed as described above. Equal amounts of protein were used for immunoprecipitation in each experiment. TH-glucan does not activate MAP kinase extracellular mitogen-regulated kinase (ERK1 / 2) (kinase substrate was ATF-2-GST); it activates p ³⁸ (kinase substrate ELK-1-GST) None (data not shown). In contrast, TH-glucan rapidly and transiently activates the MAP kinase c-Jun N-terminal kinase (also known as JNK, stress-activated protein kinase or SAPK; the kinase substrate was c-Jun-GST). (Data not shown). TH-glucan is also a rapid and temporary
κB kinase α (IKKa; the kinase substrate was IκBα-GST), I
Activated the kinase that phosphorylates κBa, causing activation of the NF-κB-like transcription factor (data not shown).

【００５９】 （実施例４：感染モデルにおけるＴＨ-グルカンとそのコンフォーマーとの比較
） Ａ．材料及び方法 ・ＴＨ-グルカン及びコンフォーマー ＴＨ−グルカン（Alpha-Beta Technology）及び所定のコンフォーマーを、感
染モデルにおけるその効果の研究に使用した。表２は、この研究に使用したＴＨ
-グルカンとそのコンフォーマーの分子量を示す。コンフォーマーの分子量が、G
PCカラム中の温度と共に変化しうるため、室温（２５℃）及び高温（３７℃）に
て分離したコンフォーマーを試験した。 表２：ＴＨ-グルカン及びコンフォーマーの分子量Example 4 Comparison of TH-Glucan and Its Conformer in an Infection Model Materials and Methods TH-Glucan and Conformers TH-glucan (Alpha-Beta Technology) and certain conformers were used to study their effects in infection models. Table 2 shows the TH used in this study.
-Shows the molecular weight of glucan and its conformers. The conformer has a molecular weight of G
The conformers that were separated at room temperature (25 ° C.) and elevated temperature (37 ° C.) were tested because they can vary with the temperature in the PC column. Table 2: Molecular weight of TH-glucan and conformers

【表２】 平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー／多角レーザー光拡散法（GPC/MA
LLS）によって測定した。HTH及びLTHは、ＴＨ-グルカンの試料を分画することに
より調製した。[Table 2] The average molecular weight is determined by gel permeation chromatography / polygonal laser light diffusion (GPC / MA
LLS). HTH and LTH were prepared by fractionating a sample of TH-glucan.

【００６０】 ・動物 ウィルス抗体のないWistarラットを、Charles River Breeding Laboratories
(Wilmington, MA)から購入した。動物を、National Institutes of Health guid
elinesに従って飼育し、任意に食餌及び水を与えた。ラットを、実験投入前に７
日間隔離した。ラットの体重は、実験時に１６０gから２１０gの範囲であった。Animals Animals from Wistar rats without viral antibodies were collected from Charles River Breeding Laboratories.
(Wilmington, MA). Animals from the National Institutes of Health guid
They were housed according to elines and given food and water ad libitum. Rats are allowed 7
Quarantined for days. Rat body weights ranged from 160 g to 210 g at the time of the experiment.

【００６１】 ・薬剤投与 ＴＨ-グルカン及びコンフォーマー、並びに全グルカン粒子（WGP）を、２５-
ゲージの針を使用し、細菌負荷前４８時間、２４時間及び４時間の時点及び細菌
負荷後４時間の時点で、１mg/kgにて筋内投与した。さらに、ポジティブコント
ロールとして、WGPもまた、腹膜内（IP）から５mg/kgの用量にて、細菌負荷前２
４時間及び４時間の時点で与えた。WGPは、滅菌食塩水で懸濁液とし、各注入前
に激しく攪拌した。Drug Administration TH-glucan and conformers, and whole glucan particles (WGP)
Intramuscular administration at 1 mg / kg was performed using a gauge needle at 48 hours, 24 hours and 4 hours before bacterial load and 4 hours after bacterial load. In addition, as a positive control, WGP was also administered intraperitoneally (IP) at a dose of 5 mg / kg before bacterial challenge.
It was given at 4 hours and at 4 hours. WGP was suspended in sterile saline and stirred vigorously before each injection.

【００６２】 ・細菌 S. aureusの複数抗生物質耐性の臨床分離物を、これらの研究において使用す
るために選択した。Onderdonk, A. B., et al., Infect. Immun. 60: 1642-1647
(1992).細菌を、Nutrient Broth(NB; Bifco Laboratories, Detroit, MI)中で、
８時間３７℃にて拡張させた。滅菌グリセリンを添加して最終濃度を２０％とし
、ストックアリコートを使用するまで−８０℃にて冷凍した。ストック細菌の生
存能力を測定するために、凍結ストック試料を解凍し、順次希釈して４０μlの
試料をNutrient Agar(NA; Bifco Laboratories, Detroit, MI)プレート上で平板
培養した。プレートを３７℃にて２４時間培養し、細菌コロニーを計数し、スト
ック１ml毎の細菌コロニー形成ユニット（CFU）数を算出した。in vitro研究の
ための細菌接種材料の調製のために、ストック培地を、１％硫酸デキストラン及
び最終濃度５％の硫酸バリウム（wt/vol）を含有するリン酸緩衝食塩水（PBS; G
ibco Life Technologies, Grand Island, NY）のmlあたり、所望のCFU数となる
まで希釈した。適当に希釈した細菌の０．５mlアリコートを、長さ２cm×直径０
．５cmのゼラチンカプセル（Eli-Lilly Inc., Indianapolis, IN）中に無菌状態
で入れ、カプセルを、上述の通り、ラットの腹膜腔に移植した。A multi-antibiotic resistant clinical isolate of the bacterium S. aureus was selected for use in these studies. Onderdonk, AB, et al., Infect. Immun. 60: 1642-1647
(1992) Bacteria in Nutrient Broth (NB; Bifco Laboratories, Detroit, MI)
Expanded for 8 hours at 37 ° C. Sterile glycerin was added to a final concentration of 20% and frozen at -80 <0> C until stock aliquots were used. To determine the viability of stock bacteria, frozen stock samples were thawed, serially diluted, and 40 μl samples plated on Nutrient Agar (NA; Bifco Laboratories, Detroit, MI) plates. The plate was incubated at 37 ° C. for 24 hours, bacterial colonies were counted, and the number of bacterial colony forming units (CFU) per 1 ml of the stock was calculated. For the preparation of the bacterial inoculum for in vitro studies, stock medium was prepared using phosphate buffered saline (PBS; G) containing 1% dextran sulfate and 5% barium sulfate (wt / vol) at a final concentration of 5%.
(ibco Life Technologies, Grand Island, NY) to the desired CFU number. A 0.5 ml aliquot of the appropriately diluted bacteria is 2 cm long x 0 cm diameter.
. Aseptically placed in 5 cm gelatin capsules (Eli-Lilly Inc., Indianapolis, IN) and the capsules were implanted into the peritoneal cavity of rats as described above.

【００６３】 ・手術 ラットは、ケタミン（Fort Dodge Laboratores Inc., Fort Dodge, IA）、Pro
mAce（Ayerst Laboratores Inc., Rouses Point, MY）、キシラジン（Phoenix S
cientific Inc., St. Joseph, MO）、及び食塩水（７５０mg、１０mg、１００mg
及び２０mlとする食塩水）から成る混合麻酔カクテルを、２５ゲージ針を使用し
た内科学注射（im injection）により麻酔にかけた。麻酔剤は、体重に基づいて
各ラットに適合させ、体重１g当たり０．００１９mlを投与した。麻酔剤を投与
した後、各ラットの腹を剃り、ヨウ素溶液で洗浄し、腹壁及び腹膜に１．５cmの
前側正中切開を行った。１０⁸のS. aureus CFUを含有するゼラチンカプセルを、
腹膜腔内に即座におき、切開を、断続３−０絹縫合で閉じた。手術の全継続時間
は、２分間未満であった。手術に次いで、動物を各檻に５匹ずつ飼育し、最初の
２時間は１５分毎、次の１時間には３０分毎、その後実験の継続時間中は１日に
３回モニターした。Surgery Rats were ketamine (Fort Dodge Laboratores Inc., Fort Dodge, IA), Pro
mAce (Ayerst Laboratores Inc., Rouses Point, MY), xylazine (Phoenix S
cientific Inc., St. Joseph, MO) and saline (750 mg, 10 mg, 100 mg)
And a 20 ml saline solution) were anesthetized by im injection using a 25 gauge needle. The anesthetic was adapted to each rat based on body weight and was administered at 0.0019 ml / g body weight. After administration of the anesthetic, the abdomen of each rat was shaved, washed with an iodine solution, and a 1.5 cm anterior midline incision was made in the abdominal wall and peritoneum. Gelatin capsules containing 10 ⁸ S. aureus CFU
Immediately in the peritoneal cavity, the incision was closed with intermittent 3-0 silk sutures. The total duration of the operation was less than 2 minutes. Following surgery, animals were housed 5 in each pen and monitored every 15 minutes for the first 2 hours, every 30 minutes for the next hour, and then three times a day for the duration of the experiment.

【００６４】[0064]

【発明の効果】【The invention's effect】

・血液標本抽出及び分析 動物を、Ｏ₂：ＣＯ₂（１：１）で麻酔にかけ、２mlの血液を２０ゲージの針を
付けた３mlのシリンジを使用して心臓穿刺によって２mlの血液を採取した。血液
を採取した直後に、約１．５mlが、ヘパリン（Elkins-Sinns Inc., Cherry Hill
, NJ）５ユニットを収容した１．７mlのEppendofr遠心分離管内に排出された。
その後各動物をＣＯ₂を用いて人間的に安楽死させた。正確に計数可能な血液CFU
レベルを得るためには、各動物からの二種類の濃度の血液、１：１０希釈及び非
希釈の血液を培養した。２０mlの５０℃Tryptic Soy Agar（Becton Dickinson M
icrobiology Systems, Cockeysvillw, MD）を、滅菌ペトリ皿に入れ、即座にこ
の皿に希釈血液もしくは非希釈血液の０．５mlアリコートを加え、プレートを回
転させることによって寒天中に完全に混合させた。寒天が固形化したところで、
プレートを３７℃にて４８時間インキュベートし、その後２０−２００コロニー
を含有するプレートを、コロニー列挙のために選択した。血液CFUデータを、血
液のlog CFU/mlとして表した。各試料からの残りの血液は、血液細胞計数に使用
した。全白血球細胞（9WBC）、赤血球細胞（RBC）、及び血小板（PLT）計数を、
System 9010+Hematology Analyzer (Biochem Immunosystems Inc., Allentown,
PA)にて行った。Blood sampling and analysis Animals were anesthetized with O ₂ : CO ₂ (1: 1) and 2 ml of blood was collected by cardiac puncture using a 3 ml syringe with a 20 gauge needle to obtain 2 ml of blood. . Immediately after collecting the blood, about 1.5 ml of heparin (Elkins-Sinns Inc., Cherry Hill
, NJ) were discharged into 1.7 ml Eppendofr centrifuge tubes containing 5 units.
Followed by each animal was humanely euthanized with CO _2. Blood CFU that can be accurately counted
To obtain levels, two concentrations of blood from each animal, 1:10 diluted and undiluted blood were cultured. 20 ml of 50 ° C. Tryptic Soy Agar (Becton Dickinson M
icrobiology Systems, Cockeysvillw, MD) was placed in a sterile Petri dish and immediately added to the dish with a 0.5 ml aliquot of diluted or undiluted blood and mixed thoroughly in agar by rotating the plate. When the agar solidifies,
Plates were incubated at 37 ° C. for 48 hours, after which plates containing 20-200 colonies were selected for colony enumeration. Blood CFU data was expressed as log CFU / ml of blood. The remaining blood from each sample was used for blood cell counting. Total white blood cell (9WBC), red blood cell (RBC), and platelet (PLT) counts
System 9010 + Hematology Analyzer (Biochem Immunosystems Inc., Allentown,
PA).

【００６５】 ・統計的分析 結果を、複数回の実験（２−６の実験、２０−８０の動物を含む）から得られ
たデータの平均±平均の標準誤差（SEM）で表した。非対性ｔ検定（治療グルー
プ対食塩水）を、EXCEL 5.0ソフトウェア（Microsoft Corporation, Redmond, W
A）を用いて行ったところ、差異は、ｐ＜０．０５において顕著であった。• Statistical analysis The results were expressed as the mean ± standard error of the mean (SEM) of the data obtained from multiple experiments (2-6 experiments, including 20-80 animals). An unpaired t-test (treatment group vs. saline) was performed using EXCEL 5.0 software (Microsoft Corporation, Redmond, W.)
When performed using A), the difference was significant at p <0.05.

【００６６】 Ｂ．結果 ・血液ＣＦＵレベルにおけるＴＨ-グルカン及びコンフォーマーの効果 ラットに、ＴＨ-グルカン、コンフォーマー、もしくはＷＧＰを投与し、血液
ＣＦＵをS. aureusによる負荷の４８時間後に測定した。結果を以下の表３に示
す。 表３：血液CFUレベルにおけるＴＨ-グルカン及びコンフォーマーの効果B. Results-Effect of TH-glucan and conformer on blood CFU level Rats were administered TH-glucan, conformer, or WGP, and blood CFU was measured 48 hours after S. aureus challenge. The results are shown in Table 3 below. Table 3: Effect of TH-glucan and conformer on blood CFU level

【表３】 [Table 3]

【００６７】 上記に見られるように、ＴＨ-グルカン並びにこれらの研究で試験した他の物
質で処置したラットは、細菌負荷の４８時間後には、食塩水で処置したラットよ
りも著しく低下した血液CFUレベルを示した（Ｐ＜０．０５）。血液ＣＦＵレベ
ルにおける最大の減少は、可溶性ＷＧＰ ＩＰ及びＩＭ（Ｐ＜０．００１及びｐ
＜０．０１）で処置したラットにおいて観察された。As seen above, rats treated with TH-glucan as well as the other substances tested in these studies showed significantly lower blood CFU at 48 hours post bacterial load than rats treated with saline. Levels were indicated (P <0.05). The largest reduction in blood CFU levels was due to soluble WGP IP and IM (P <0.001 and p
<0.01) was observed in rats treated.

【００６８】 ・末梢血液細胞計数におけるＴＨ-グルカンおよびコンフォーマーの効果 血液細胞計数を、S. aureus負荷の４８時間後に行った。全ＷＢＣ数量は、Ｔ
Ｈ-グルカン及び全てのコンフォーマー、並びにＷＧＰで処置したラットにおい
て上昇したが、統計上の有意性は、ＴＨ-グルカン、ＨＴＨ２５℃、ＬＴＨ２５
℃及びＬＴＨ３７℃で処置したラットにおいてのみ観察された。ＴＨ-グルカン
は、ＰＬＴ計数に何の効果も与えなかったが、ＶＨＭＷ、ＨＴＨ２５℃、もしく
はＨＴＨ３７℃（すなわち、１９０，０００より大なる分子量をもつコンフォー
マー）、またはＷＧＰ(IM)もしくはＷＧＰ（IP）で処置したラットは、著しく増
大した末梢ＰＬＴ計数を示した。ＲＢＣ値は、ＨＴＨ２５℃、ＬＭＷ及びＷＧＰ
（IP）で処置したラットにおいて僅かに上昇したことを除いて変化しなかった。
これらの結果を表４にまとめる。 表４：末梢血液細胞計数におけるＴＨ-グルカン及びコンフォーマーの効果• Effect of TH-glucan and conformer on peripheral blood cell counting Blood cell counting was performed 48 hours after S. aureus challenge. Total WBC quantity is T
Although increased in rats treated with H-glucan and all conformers, and WGP, the statistical significance was TH-glucan, HTH25 ° C, LTH25
C and LTH 37 C were observed only in rats treated. TH-glucan had no effect on PLT counting, but VHMW, HTH at 25 ° C., or HTH at 37 ° C. (ie, a conformer with a molecular weight greater than 190,000), or WGP (IM) or WGP (IP ) Showed significantly increased peripheral PLT counts. RBC values are HTH 25 ° C, LMW and WGP
No change except for a slight increase in rats treated with (IP).
These results are summarized in Table 4. Table 4: Effect of TH-glucan and conformer on peripheral blood cell counting

【表４】 ^* パーセント変化、対食塩水^** ｔ検定、ｐ＜０．０５、対食塩水[Table 4] ^* Percent change, vs. saline ^** t-test, p <0.05, vs. saline

【００６９】 ・死亡率におけるＴＨ-グルカン及びコンフォーマーの効果 これらの研究において使用したS. aureus用量は、致死感染量の５０％であっ
た。全ての動物は、CFU及び血液細胞評価のために第２日目に安楽死させられた
が、ＷＧＰ（IP）（ｐ＜０．０１）及びＬＭＷ（ｐ＜０．０５）で処置したラッ
トには、食塩水処置ラットに比べて著しく低下した死亡率が観察された。ＷＧＰ
(IM)（３１％、対食塩水４８％）及びＬＴＨ２５℃（３１％、対食塩水４８％）
で処置したラットにも僅かに死亡率の低下が見られた。ＬＴＨ３７℃処置グルー
プにおいては、僅かに高い死亡率（６３％、対食塩水４８％）が観察された。し
かしながら、これらの差異は、統計上の有意性には至らなかった。• Effect of TH-glucan and conformer on mortality The S. aureus dose used in these studies was 50% of the lethal infectious dose. All animals were euthanized on day 2 for CFU and blood cell evaluation, but were treated with rats treated with WGP (IP) (p <0.01) and LMW (p <0.05). Showed a significantly reduced mortality compared to saline-treated rats. WGP
(IM) (31%, against saline 48%) and LTH 25 ° C (31%, against saline 48%)
There was also a slight decrease in mortality in rats treated with. A slightly higher mortality (63% vs. saline 48%) was observed in the LTH 37 ° C. treated group. However, these differences did not lead to statistical significance.

【００７０】 これらの実験は、ＴＨグルカン並びにコンフォーマー（ＴＨ-グルカンの活性
を擬態する物質）が、ホスト防御を増強するために使用可能であり、よって疾患
の治療に使用可能であることを示した。コンフォーマー分子量が約１００倍変化
する（例えばＶＨＭＷに対してＬＭＷ）にも関わらず、抗感染活性が一定であっ
たことは興味深い。 本発明が、特にその好ましい実施態様について例示及び説明されている一方で
、添付の請求の範囲に定義されるように、本発明の思想及び範囲から逸脱するこ
となく、形態及び細部における様々な変形が可能であることは、当業者によって
理解されるであろう。These experiments show that TH glucan as well as conformers (substances mimicking the activity of TH-glucan) can be used to enhance host defenses and thus can be used to treat disease. Was. It is interesting to note that despite the change in conformer molecular weight of about 100-fold (eg LMW versus VHMW), the anti-infective activity was constant. While the invention has been particularly illustrated and described with respect to preferred embodiments thereof, various modifications in form and detail may be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims. It will be understood by those skilled in the art that is possible.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、³Ｈ-ＴＨ-グルカンの、ＮＲ８３８３細胞への用量依存
結合の図示である。黒丸は全結合；白丸は特異的結合；黒角は非特異的結合を示
す。FIG. 1 is a diagrammatic representation of the dose-dependent binding of ³ H-TH-glucan to NR8383 cells. Closed circles indicate total binding; open circles indicate specific binding; closed squares indicate non-specific binding.

【図２】 図２は、³Ｈ-ＴＨ-グルカンのＮＲ８３８３細胞への結合のβ-グ
ルカン選択性の図示であり、非標識競争的低分子量β-グルカンを多様な濃度で
使用する競争結合アッセイによって測定したものである。黒丸はＴＨ-グルカン
；白角は低分子量（ＬＭＷ）-グルカンを示す。FIG. 2 is an illustration of the β-glucan selectivity of ³ H-TH-glucan binding to NR8383 cells, a competitive binding assay using unlabeled competitive low molecular weight β-glucan at various concentrations. It was measured by. Closed circles indicate TH-glucan; open squares indicate low molecular weight (LMW) -glucan.

【図３】 図３は、³Ｈ-ＴＨ-グルカンのＮＲ８３８３細胞への結合のβ-グ
ルカン選択性の図示であり、非標識競争的極高分子量β-グルカンを多様な濃度
で使用する競争結合アッセイによって測定したものである。黒丸はＴＨ-グルカ
ン；白角は極高分子量（ＶＨＭＷ）-グルカンを示す。FIG. 3 is an illustration of the β-glucan selectivity of binding of ³ H-TH-glucan to NR8383 cells, showing competitive binding using unlabeled competitive ultra-high molecular weight β-glucan at various concentrations. It was measured by the assay. Closed circles indicate TH-glucan; open squares indicate very high molecular weight (VHMW) -glucan.

【図４】 図４は、³Ｈ-ＴＨ-グルカンのＮＲ８３８３細胞への結合のβ-グ
ルカン選択性の図示であり、非標識競争的β-グルカン、スクレログルカンを多
様な濃度で使用する競争結合アッセイによって測定したものである。黒丸はＴＨ
-グルカン；白角はスクレログルカンを示す。FIG. 4 is an illustration of β-glucan selectivity of binding of ³ H-TH-glucan to NR8383 cells, competition using unlabeled competitive β-glucan, scleroglucan at various concentrations. It was measured by a binding assay. Black circle is TH
-Glucan; open squares indicate scleroglucan.

【図５】 ³Ｈ-ＴＨ-グルカンのラクトシルセラミドへの結合のβ-グルカン
選択性の図示であり、非標識競争的β-グルカン、ＬＭＷ-グルカンを多様な濃度
で使用する競争結合アッセイによって測定したものである。黒丸はＴＨ-グルカ
ン；白丸はＬＭＷ-グルカンを示す。FIG. 5 is an illustration of the β-glucan selectivity of ³ H-TH-glucan binding to lactosylceramide by a competitive binding assay using unlabeled competitive β-glucan, LMW-glucan at various concentrations. Measured. Closed circles indicate TH-glucan; open circles indicate LMW-glucan.

【図６】 ³Ｈ-ＴＨ-グルカンのラクトシルセラミドへの結合のβ-グルカン
選択性の図示であり、非標識競争的β-グルカン、ＶＨＭＷ-グルカンを多様な濃
度で使用する競争結合アッセイによって測定したものである。黒丸はＴＨ-グル
カン；白丸はＶＨＭＷ-グルカンを示す。FIG. 6 is an illustration of the β-glucan selectivity of ³ H-TH-glucan binding to lactosylceramide by a competitive binding assay using unlabeled competitive β-glucan, VHMW-glucan at various concentrations. Measured. Closed circles indicate TH-glucan; open circles indicate VHMW-glucan.

【図７】 ³Ｈ-ＴＨ-グルカンのラクトシルセラミドへの結合のβ-グルカン
選択性の図示であり、非標識競争的β-グルカン、スクレログルカンを多様な濃
度で使用する競争結合アッセイによって測定したものである。黒丸はＴＨ-グル
カン；白丸はスクレログルカンを示す。FIG. 7 is an illustration of the β-glucan selectivity of ³ H-TH-glucan binding to lactosylceramide by a competitive binding assay using unlabeled competitive β-glucan, scleroglucan, at various concentrations. Measured. Closed circles indicate TH-glucan; open circles indicate scleroglucan.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デヴィッド・エス・アダムス アメリカ合衆国・マサチューセッツ・ 01609・ワーセスター・ケインズ・クロッ シング・21 Ｆターム(参考） 4H045 AA30 BA62 BA63 CA42 DA50 EA50 EA61 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL , IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor David S・ Adams USA ・ Massachusetts ・ 01609 ・ Worcester Keynes Crossing ・ 21 F-term (reference) 4H045 AA30 BA62 BA63 CA42 DA50 EA50 EA61

Claims (49)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合して
、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンの一次複合体を生成するために
好適な条件下で、β（１，３）-グルカンを含有する試料を該レセプターと接触
させる工程； ｂ）前記一次複合体を単離する工程；及び ｃ）前記一次複合体からβ（１，３）-グルカンを得る工程； を含む、試料から、β（１，３）-グルカンを単離する方法。1. a) Under conditions suitable for β (1,3) -glucan to bind to a proteinaceous receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan bound to the receptor. Contacting a sample containing β (1,3) -glucan with the receptor; b) isolating the primary complex; and c) converting β (1,3) -glucan from the primary complex. Obtaining a β (1,3) -glucan from a sample. 【請求項２】 蛋白様レセプターが、固相に連結されてなる、請求項１の
方法。2. The method according to claim 1, wherein the protein-like receptor is linked to a solid phase. 【請求項３】 固相が、フィルター、膜、ビーズ、粒子、有機樹脂、マイ
クロタイタプレート及びスライドからなる群より選択される、請求項２の方法。3. The method of claim 2, wherein the solid phase is selected from the group consisting of a filter, a membrane, a bead, a particle, an organic resin, a microtiter plate, and a slide. 【請求項４】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合して
、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンの一次複合体を生成するために
好適な条件下で、β（１，３）-グルカン含有生物を含有する試料を該レセプタ
ーと接触させる工程； ｂ）前記一次複合体を単離する工程；及び ｃ）前記一次複合体からβ（１，３）-グルカン含有生物を得る工程； を含む、試料から、β（１，３）-グルカンを単離する方法。4. a) Under conditions suitable for β (1,3) -glucan to bind to a proteinaceous receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan bound to the receptor. Contacting a sample containing a β (1,3) -glucan-containing organism with the receptor; b) isolating the primary complex; and c) isolating β (1,3)-from the primary complex. A method of obtaining a glucan-containing organism; 【請求項５】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合して
、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンの一次複合体を生成するために
好適な条件下で、β（１，３）-グルカンの存在を探査しようとする試料を、該
レセプターと接触させる工程；及び ｂ）工程ａ）において生成した一次複合体を検出する工程； を含み、一次複合体の存在が、試料中のβ（１，３）-グルカンの存在を示す、
試料中のβ（１，３）-グルカンの存在を検出する方法。5. a) Under conditions suitable for the β (1,3) -glucan to bind to a proteinaceous receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan bound to the receptor. Contacting a sample to be probed for the presence of β (1,3) -glucan with the receptor; and b) detecting the primary complex formed in step a). The presence indicates the presence of β (1,3) -glucan in the sample,
A method for detecting the presence of β (1,3) -glucan in a sample. 【請求項６】 蛋白様レセプターが、固相に結合してなる、請求項５の方
法。6. The method of claim 5, wherein the protein-like receptor is bound to a solid phase. 【請求項７】 固相が、フィルター、膜、ビーズ、粒子、有機樹脂、マイ
クロタイタプレート及びスライドからなる群より選択される、請求項６の方法。7. The method of claim 6, wherein the solid phase is selected from the group consisting of a filter, a membrane, a bead, a particle, an organic resin, a microtiter plate, and a slide. 【請求項８】 試料が、固相に結合してなる、請求項５の方法。8. The method of claim 5, wherein the sample is bound to a solid phase. 【請求項９】 固相が、フィルター、膜、ビーズ、粒子、有機樹脂、マイ
クロタイタプレート及びスライドからなる群より選択される、請求項８の方法。9. The method of claim 8, wherein the solid phase is selected from the group consisting of filters, membranes, beads, particles, organic resins, microtiter plates, and slides. 【請求項１０】 試料が、動物由来である、請求項５の方法。10. The method of claim 5, wherein the sample is from an animal. 【請求項１１】 試料が、生物学的流体である、請求項１０の方法。11. The method of claim 10, wherein the sample is a biological fluid. 【請求項１２】 試料が、植物由来である、請求項５の方法。12. The method of claim 5, wherein the sample is from a plant. 【請求項１３】 試料が、環境由来である、請求項５の方法。13. The method of claim 5, wherein the sample is from an environment. 【請求項１４】 試料が、食物由来である、請求項５の方法。14. The method of claim 5, wherein the sample is from food. 【請求項１５】 試料が、発酵由来である、請求項５の方法。15. The method of claim 5, wherein the sample is from a fermentation. 【請求項１６】 一次複合体が、検出可能な標識で検出される、請求項５
の方法。16. The primary complex is detected with a detectable label.
the method of. 【請求項１７】 検出可能な標識が、放射性ヌクレオチド、染料、蛍光化
合物、ビオチン及びストレプタヴィジンからなる群より選択される請求項１６の
方法。17. The method of claim 16, wherein said detectable label is selected from the group consisting of radionucleotides, dyes, fluorescent compounds, biotin and streptavidin. 【請求項１８】 一次複合体が、抗体で検出される、請求項５の方法。18. The method of claim 5, wherein the primary complex is detected with an antibody. 【請求項１９】 前記抗体が、β（１，３）-グルカンに対する抗体である
、請求項１８の方法。19. The method of claim 18, wherein said antibody is an antibody to β (1,3) -glucan. 【請求項２０】 前記抗体が、レセプターに対する抗体である、請求項１
８の方法。20. The antibody of claim 1, wherein said antibody is an antibody to a receptor.
Method 8. 【請求項２１】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合し
て、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカン含有生物の一次複合体を生成
するために好適な条件下で、β（１，３）-グルカン含有生物の存在を探査しよ
うとする試料を、該レセプターと接触させる工程；及び ｂ）工程ａ）において生成した一次複合体を検出する工程； を含み、一次複合体の存在が、試料中のβ（１，３）-グルカン含有生物の存在
を示す、試料中のβ（１，３）-グルカン含有生物の存在を検出する方法。21) a) Conditions suitable for the binding of β (1,3) -glucan to a proteinaceous receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan-containing organism bound to the receptor. Contacting a sample to be probed for the presence of a β (1,3) -glucan-containing organism with said receptor; and b) detecting the primary complex formed in step a). A method for detecting the presence of a β (1,3) -glucan-containing organism in a sample, wherein the presence of the primary complex indicates the presence of the β (1,3) -glucan-containing organism in the sample. 【請求項２２】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合し
て、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンの一次複合体を生成するため
に好適な条件下で、被験試料を、該レセプターと接触させる工程； ｂ）工程ａ）において生成した一次複合体を単離する工程；及び ｃ）前記一次複合体を定量する工程； を含み、試料中のβ（１，３）-グルカンの量が、一次複合体の量と相関する、
試料中のβ（１，３）-グルカンの量を定量する方法。22. a) Under conditions suitable for β (1,3) -glucan to bind to a proteinaceous receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan bound to the receptor. Contacting the test sample with the receptor; b) isolating the primary complex formed in step a); and c) quantifying the primary complex. , 3) the amount of -glucan correlates with the amount of primary complex,
A method for quantifying the amount of β (1,3) -glucan in a sample. 【請求項２３】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合し
て、レセプターに結合した、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの一次複合
体を生成するために好適な条件下で、被験試料を、該レセプター及び標識され、
非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンと接触させる工程；及び ｂ）工程ａ）において生成した一次複合体の量を測定する工程； を含み、試料中のβ（１，３）-グルカンの量が、一次複合体の量と反比例する
、試料中のβ（１，３）-グルカンの量を定量する方法。23. a) To bind β (1,3) -glucan to a protein-like receptor to form a primary complex of a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan bound to the receptor. Under suitable conditions, the test sample is labeled with the receptor and
Contacting with a non-derivatized, water-soluble β (1,3) -glucan; and b) measuring the amount of the primary complex formed in step a). A method for quantifying the amount of β (1,3) -glucan in a sample, wherein the amount of glucan is inversely proportional to the amount of the primary complex. 【請求項２４】 ａ）β（１，３）-グルカンが蛋白様レセプターに結合し
て、レセプターに結合したβ（１，３）-グルカンの一次複合体を生成するため
に好適な条件下で、個体由来の試料を、該レセプターと接触させる工程；及び ｂ）工程ａ）において生成した一次複合体を検出する工程； を含み、一次複合体の存在が、β（１，３）-グルカン含有生物による感染を示
す、β（１，３）-グルカン含有生物による感染を診断する方法。24. a) Under conditions suitable for binding β (1,3) -glucan to a proteinaceous receptor to form a primary complex of β (1,3) -glucan bound to the receptor. Contacting a sample from an individual with the receptor; and b) detecting the primary complex formed in step a), wherein the presence of the primary complex comprises β (1,3) -glucan containing A method for diagnosing infection by an organism containing β (1,3) -glucan, which indicates infection by an organism. 【請求項２５】 蛋白様レセプターと、非誘導化水溶性β（１，３）-グル
カンに対する抗体とを含む、β（１，３）-グルカンの存在の検出に有用なキッ
ト。25. A kit useful for detecting the presence of β (1,3) -glucan, comprising a proteinaceous receptor and an antibody against underivatized water-soluble β (1,3) -glucan. 【請求項２６】 ａ）非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、非誘導化
水溶性β（１，３）-グルカンの蛋白様レセプターに結合するために好適な条件
下で、放射性同位元素標識された、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンと、
非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターと、及び被験物質とを混合
する工程； ｂ）非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターへの、非誘導化水溶性
β（１，３）-グルカンの結合の程度を測定する工程；及び ｃ）工程（ｂ）で測定した結合程度と、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカン
が、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターに結合するために好適
な条件下における、被験物質の非存在下での結合程度とを比較する工程； を含み、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、非誘導化水溶性β（１，３
）-グルカンの蛋白様レセプターへの結合の程度の低減により、前記物質が、非
誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターに対して親和性を有すること
を示す、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの蛋白様レセプターに対して親
和性を有する物質を同定するためのアッセイ。26. a) Under conditions suitable for the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to bind to the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan protein-like receptor, A radiolabeled, underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan;
Mixing a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan receptor and a test substance; b) non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan receptor to a non-derivatized aqueous solution Measuring the degree of binding of the soluble β (1,3) -glucan; and c) the degree of binding measured in step (b) and the derivatized water-soluble β (1,3) -glucan are not derivatized. Comparing the degree of binding in the absence of the test substance under conditions suitable for binding to the receptor for water-soluble β (1,3) -glucan. , 3) -Glucan, derivatized water-soluble β (1,3
) -Glucan reduces the degree of binding to the proteinaceous receptor, indicating that the substance has affinity for the non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan receptor. An assay for identifying a substance having an affinity for a protein-like receptor of sex β (1,3) -glucan. 【請求項２７】 前記レセプターが、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンに対する親和性を有する化合物である、請求項２６のアッセイ。27. The assay of claim 26, wherein said receptor is a compound having affinity for underivatized, water soluble β (1,3) -glucan. 【請求項２８】 前記化合物が、レセプターアナログまたはレセプター偽
剤である、請求項２７のアッセイ。28. The assay of claim 27, wherein said compound is a receptor analog or a receptor placebo. 【請求項２９】 ａ）送達しようとする物質を、非誘導化水溶性β（１，
３）-グルカンに接合して接合分子を生成させ；及び ｂ）前記接合分子の非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、非誘導化水溶性
β（１，３）-グルカンのレセプターに結合するために好適な条件下で、前記接
合分子を投与する工程； を含み、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターを含有する細胞中
で、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、非誘導化水溶性β（１，３）-グ
ルカンのレセプターに結合し、これにより前記接合分子の物質を細胞に送達する
、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの蛋白様レセプターを含有する細胞に
物質を送達する方法。29) a) converting the substance to be delivered to a non-derivatized water-soluble β (1,
3) conjugating to -glucan to form a conjugated molecule; and b) converting the non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan of the conjugated molecule to a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan Administering the conjugated molecule under conditions suitable for binding to the receptor. In a cell containing the receptor for the non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan, β (1,3) -glucan binds to the receptor of the non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan, thereby delivering the substance of the conjugated molecule to the cell. , 3) A method for delivering a substance to cells containing a protein-like receptor for -glucan. 【請求項３０】 前記レセプターが、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンに対して親和性を有する化合物である、請求項２９の方法。30. The method of claim 29, wherein said receptor is a compound having affinity for underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan. 【請求項３１】 前記化合物が、レセプターアナログまたはレセプター偽
剤である、請求項３０の方法。31. The method of claim 30, wherein said compound is a receptor analog or a receptor placebo. 【請求項３２】 ａ）非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、非誘導化
水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターに結合するために好適な条件下で、
非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンと、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンの蛋白様レセプターと、及び被験物質とを混合する工程； ｂ）シグナル伝達経路の活性化の程度を測定する工程；及び ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化の程度と、非誘導化水溶性β（１，３）-グル
カンが、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのレセプターに結合するために
好適な条件下における、被験物質の非存在下での活性化の程度とを比較する工程
； を含み、シグナル伝達経路の活性化の程度における相違により、前記物質が、非
誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの、シグナル伝達経路の活性化に及ぼす作
用を変化させることを示す、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンのシグナル
伝達経路に対する作用を変化させる物質を同定するためのアッセイ。32. a) Under conditions suitable for the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan to bind to the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan receptor:
Mixing the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan, the underivatized water-soluble β (1,3) -glucan protein-like receptor, and a test substance; b) activity of a signal transduction pathway C) measuring the degree of activation measured in step (b) and the derivatized water-soluble β (1,3) -glucan to obtain the derivatized water-soluble β (1,3) Comparing the degree of activation in the absence of the test substance under conditions suitable for binding to the glucan receptor, the difference in the degree of activation of the signal transduction pathway Alters the effect of underivatized water-soluble β (1,3) -glucan on the activation of signal transduction pathways. Assay to identify substances that alter the effect on 【請求項３３】 活性化の程度が、前記物質のない場合よりも該物質の存
在下において高いならば、該物質が、単一の導入経路の活性化における非誘導化
水溶性β（１，３）-グルカンの作用を増強する、請求項３２のアッセイ。33. If the degree of activation is higher in the presence of the substance than in the absence of the substance, the substance is a non-derivatized water-soluble β (1, 3) The assay of claim 32, which enhances the action of -glucan. 【請求項３４】 活性化の程度が、前記物質のない場合よりも該物質の存
在下において低いならば、該物質が、単一の導入経路の活性化における非誘導化
水溶性β（１，３）-グルカンの作用を低減する、請求項３２のアッセイ。34. If the degree of activation is lower in the presence of the substance than in the absence of the substance, the substance is a non-derivatized water-soluble β (1, 3) The assay of claim 32, which reduces the effect of -glucan. 【請求項３５】 シグナル伝達経路の活性化が、少なくとも一の転写制御
因子のモジュレーションによって測定される、請求項３２のアッセイ。35. The assay of claim 32, wherein activation of the signaling pathway is measured by modulation of at least one transcription factor. 【請求項３６】 転写制御因子が、ＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ-６及び／または
ＡＰ-１ファミリーの構成員からなる群より選択される、請求項３５のアッセイ
。36. The assay of claim 35, wherein the transcription factor is selected from the group consisting of NF-κB, NF-IL-6 and / or AP-1 family members. 【請求項３７】 工程（ｂ）が、前記転写制御因子に対して特異的な³²Ｐ
標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドによって行われる、請求項３２のアッセイ。37. Step (b) is, ³² P specific for the transcription factor
33. The assay of claim 32, wherein said assay is performed with a labeled DNA oligonucleotide. 【請求項３８】 請求項３２のアッセイによって同定される物質。38. A substance identified by the assay of claim 32. 【請求項３９】 前記レセプターが、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンに対して親和性を有する化合物である、請求項３２のアッセイ。39. The assay of claim 32, wherein said receptor is a compound having affinity for underivatized, water soluble β (1,3) -glucan. 【請求項４０】 前記化合物が、レセプターアナログまたはレセプター偽
剤である、請求項３９のアッセイ。40. The assay of claim 39, wherein said compound is a receptor analog or a receptor placebo. 【請求項４１】 非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの蛋白様レセプタ
ーを含有する細胞を、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの蛋白様レセプタ
ーを結合し、活性化する物質と接触させることを含み、非誘導化水溶性β（１，
３）-グルカンの蛋白様レセプターが活性化され、これによってシグナル伝達経
路が活性化される、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンの蛋白様レセプター
を含有する細胞中のシグナル伝達経路を活性化する方法。41. A cell containing a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan protein-like receptor is bound to a non-derivatized water-soluble β (1,3) -glucan protein-like receptor, Contacting with a substance to be derivatized, wherein the derivatized water-soluble β (1,
3) -Glucan protein-like receptor is activated, thereby activating signal transduction pathway. Signal transduction pathway in cells containing non-inducible water-soluble β (1,3) -glucan protein-like receptor. How to activate. 【請求項４２】 シグナル伝達経路の活性化が、少なくとも一の転写制御
因子のモジュレーションによって測定される、請求項４１の方法。42. The method of claim 41, wherein activation of a signaling pathway is measured by modulation of at least one transcription factor. 【請求項４３】 転写制御因子が、ＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ-６及び／または
ＡＰ-１ファミリーの構成員からなる群より選択される、請求項４２の方法。43. The method of claim 42, wherein the transcription factor is selected from the group consisting of NF-κB, NF-IL-6 and / or members of the AP-1 family. 【請求項４４】 前記物質が、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンであ
る、請求項４１の方法。44. The method of claim 41, wherein said substance is a non-derivatized, water soluble β (1,3) -glucan. 【請求項４５】 前記レセプターが、非誘導化水溶性β（１，３）-グルカ
ンに対して親和性を有する化合物である、請求項４１の方法。45. The method of claim 41, wherein said receptor is a compound having affinity for underivatized, water soluble β (1,3) -glucan. 【請求項４６】 前記化合物が、レセプターアナログまたはレセプター偽
剤である、請求項４５の方法。46. The method of claim 45, wherein said compound is a receptor analog or a receptor placebo. 【請求項４７】 非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンであるリガンドに
結合する蛋白様レセプターを含有する、単離調製物。47. An isolated preparation containing a protein-like receptor that binds to a ligand that is a non-derivatized, water-soluble β (1,3) -glucan. 【請求項４８】 前記レセプターが、特異的且つ選択的にリガンドを結合
する、請求項４７の調製物。48. The preparation of claim 47, wherein said receptor specifically and selectively binds a ligand. 【請求項４９】 非誘導化水溶性β（１，３）-グルカンが、三重螺旋構造
をとる、請求項４７の調製物。49. The preparation of claim 47, wherein the underivatized, water-soluble β (1,3) -glucan adopts a triple helical structure.