JP2002519034A - Human oxidoreductase protein - Google Patents
Human oxidoreductase proteinInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、ヒト酸化還元酵素タンパク質（HORP）と、それを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、HORPの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides a human oxidoreductase protein (HORP) and a polynucleotide that identifies and encodes it. The present invention also provides expression vectors and host cells, antibodies, agonists and antagonists. Further, the present invention provides a method for diagnosing, treating, or preventing a disease associated with the expression of HORP.
Description
【０００１】 発明の技術分野 本発明は、ヒト酸化還元酵素タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びに
これらの配列を用いた、神経疾患及び自己免疫／炎症性疾患、生殖障害、細胞増
殖異常、内分泌障害、小胞輸送障害、平滑筋異常の診断及び治療、予防に関連す
る。[0001] Technical Field of the Invention The present invention relates to nucleic acid and amino acid sequences of human oxidoreductase protein, as well as using these sequences, neurological diseases and autoimmune / inflammatory diseases, reproductive disorders, cell proliferative disorders, endocrine disorders , Vesicle trafficking disorders, and the diagnosis, treatment and prevention of smooth muscle abnormalities.
【０００２】 発明の背景 生合成及び生分解の多くの経路には、NAD(P)+／NAD(P)Hなどの還元または酸化
補助因子に結合した酸化還元酵素（脱水素酵素または還元酵素）活性が必要であ
る(Newsholme, E.A. 及び Leech, AR. (1983) Biochemistry for the Medical S
ciences, John Wiley and Sons, Chichester, U.K. pp. 779-793.)。NADH及びNA
DPHは、規範的に保存されたアミノ酸配列モチーフに結合する(Scrutton, N.S.
他 (1990) Nature, 343:38-43.)。還元酵素の活性は、NADH及びNADPHの同時酸化
で基質と補助因子との間の電子の伝達を触媒する。逆脱水素反応は、NAD+及びNA
DP+の還元を触媒する。電子の伝達は、NADH及びFADH2などの分子の酸化で生じる
電子が様々な酵素の作用によって一連の電子伝達体に伝達される一般的な細胞内
プロセスである。これらの電子伝達体は、細胞内の様々な還元反応の電子供与体
として作用したり、或いは電子伝達鎖に従って他の電子伝達体にそれらの電子を
伝達することもある。電子がこの鎖を通る時の酸化電位の変化によって、細胞が
使用できるエネルギーが生成される。[0002] Many routes background biosynthesis and biodegradation of the invention, NAD (P) + / NAD (P) oxidoreductase linked to reduction or oxidation cofactor such as H (dehydrogenase or reductase) Activity is required (Newsholme, EA and Leech, AR. (1983) Biochemistry for the Medical S
ciences , John Wiley and Sons, Chichester, UK pp. 779-793.). NADH and NA
DPH binds to canonically conserved amino acid sequence motifs (Scrutton, NS
(1990) Nature, 343: 38-43.). The activity of the reductase catalyzes the transfer of electrons between the substrate and the cofactor upon simultaneous oxidation of NADH and NADPH. The reverse dehydrogenation reaction involves NAD + and NA
Catalyzes the reduction of DP + . Electron transfer is a common intracellular processes electrons generated by the oxidation of molecules such as NADH and FADH 2 are transferred to a series of electron carriers by the action of various enzymes. These electron carriers may act as electron donors for various reduction reactions in the cell, or transfer their electrons to other electron carriers according to the electron transport chain. Changes in the oxidation potential as electrons pass through this chain create energy that can be used by cells.
【０００３】 ミトコンドリアの電子伝達鎖または呼吸鎖は、ミトコンドリア膜の一連の酵素
複合体で構成される。この伝達鎖は、これらの複合体内の一連の酸化還元中心（
redox center）（電子伝達体）によるNADHから酸素への電子の伝達、及びこの酸
化とATP合成の共役（酸化的リン酸化）に関与する。ATPは、エネルギーが必要な
多くの細胞反応を起こすための一次エネルギー源となる。呼吸鎖の重要な酵素複
合体には、NADH依存性ユビキノン酸化還元酵素、コハク酸塩であるユビキノン酸
化還元酵素、チトクロムｃ1−ｂ酸化還元酵素、チトクロムｃ酸化酵素、ATP合成
酵素がある。これらの複合体は、サイトゾル側に分布するコハク酸塩であるユビ
キノン酸化還元酵素を除いて、ミトコンドリア膜の内側の基質側に分布する。NA
DH依存性ユビキノン酸化還元酵素がNADHから電子を受取り、それらをフラビン分
子及び幾つかの鉄−硫黄中心を介してユビキノンに伝達して、呼吸鎖の第１の段
階が始まる。NADPH依存性キノン酸化還元酵素が、ミトコンドリの電子のフラボ
タンパク質からチトクロムへの伝達を調節する。電子の伝達反応中に、NADPHの
存在の下で、ユビキノン１０がユビキノール１０に還元される。ユビキノン１０
は、チトクロムｃ1−ｂ還元酵素によるユビキノール１０からチトクロムｃへ電
子伝達によって再生される。これらの反応によって、脂質から水相への電子伝達
、並びにミトコンドリア膜内側への水素イオンの同時ポンピングが可能となる。[0003] The mitochondrial electron transport or respiratory chain is composed of a series of enzyme complexes of the mitochondrial membrane. This chain is a series of redox centers in these complexes (
It is involved in the transfer of electrons from NADH to oxygen by the redox center (electron carrier) and in the coupling of this oxidation with ATP synthesis (oxidative phosphorylation). ATP is the primary source of energy that triggers a number of cellular reactions that require energy. Important enzyme complex of the respiratory chain is NADH dependent ubiquinone oxidoreductase, ubiquinone oxidoreductase succinate salt, cytochrome c 1 -b oxidoreductase, cytochrome c oxidase, the ATP synthase. These complexes are distributed on the substrate side inside the mitochondrial membrane, except for ubiquinone oxidoreductase, which is a succinate distributed on the cytosol side. NA
The first stage of the respiratory chain begins, with DH-dependent ubiquinone oxidoreductases accepting electrons from NADH and transferring them to ubiquinone via flavin molecules and several iron-sulfur centers. NADPH-dependent quinone oxidoreductase regulates the transfer of mitochondrial electrons from flavoproteins to cytochromes. During the electron transfer reaction, ubiquinone 10 is reduced to ubiquinol 10 in the presence of NADPH. Ubiquinone 10
Is regenerated by electron transfer from ubiquinol 10 to cytochrome c by cytochrome c 1 -b reductase. These reactions allow electron transfer from the lipid to the aqueous phase, as well as simultaneous pumping of hydrogen ions inside the mitochondrial membrane.
【０００４】 NADH依存性ユビキノン酸化還元酵素の発現の異常及び変化は、神経変性疾患及
び筋障害、癌を含む様々なヒトの疾患に関連する(Singer, T.P.他 (1995)Biochi
m. Biophys. Acta 1271:211-219; 及び Selvanayagam, P. 及び Rajaraman, S.
(1996) Lab. Invest. 74:592-599.)。更に、NADH依存性ユビキノン酸化還元酵素
によるドキソルビシンなどの化学療法薬剤のキノン部分の還元は、こられの薬剤
の抗腫瘍活性及び／または変異原性に関与すると思われる(Akman, S.A. 他 (199
2) Biochemistry 31:3500-3506.)。[0004] Aberrant and altered NADH-dependent ubiquinone oxidoreductase expression is associated with a variety of human diseases, including neurodegenerative and muscular disorders, and cancer (Singer, TP et al. (1995) Biochi.
m. Biophys. Acta 1271: 211-219; and Selvanayagam, P. and Rajaraman, S.
(1996) Lab. Invest. 74: 592-599.). Furthermore, the reduction of the quinone moiety of chemotherapeutic drugs such as doxorubicin by NADH-dependent ubiquinone oxidoreductase appears to be involved in the antitumor activity and / or mutagenicity of these drugs (Akman, SA et al. (199)
2) Biochemistry 31: 3500-3506.).
【０００５】 神経伝達物質及びその他の情報伝達分子の生合成及び生分解に関与する多くの
酵素が、単離され、短鎖NAD+／NADH依存性アルコール脱水素酵素ファミリーのメ
ンバーであると同定された。実験的な向神経活性剤の使用で示されているように
、神経伝達物質の不活化は神経系が正しく機能するために必須である(Avery, L.
及び Horvitz, H.R. (1990) J. Ex. Zool. 253:263-270.)。神経伝達物質の代
謝経路における後成的または遺伝的な異常は、パーキンソン病及び遺伝性ミオク
ロヌスを含む様々な組織の様々な疾患を引き起こし得る(McCance, K.L. 及び Hu
ether, S.E. (1994) Pathophysiology, Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO
pp.402-404; 及び Gundlach, A.L. (1990) FASEB J. 4:2761-2766.)。[0005] Many enzymes involved in the biosynthesis and biodegradation of neurotransmitters and other signaling molecules have been isolated and identified as members of the short chain NAD + / NADH-dependent alcohol dehydrogenase family. Was. Inactivation of neurotransmitters is essential for the proper functioning of the nervous system, as demonstrated by the use of experimental neuroactive agents (Avery, L.
And Horvitz, HR (1990) J. Ex. Zool. 253: 263-270.). Epigenetic or genetic abnormalities in the metabolic pathways of neurotransmitters can cause a variety of diseases in various tissues, including Parkinson's disease and hereditary myoclonus (McCance, KL and Hu
ether, SE (1994) Pathophysiology , Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO
pp. 402-404; and Gundlach, AL (1990) FASEB J. 4: 2761-2766.).
【０００６】 細胞内酸化還元酵素活性をもつ酵素のその他の例には、アスパラギンアミドヒ
ドロラーゼ及びビオチン−アミドアミドヒドロラーゼ、キノン酸化還元酵素が含
まれる。Ｎ末端アスパラギンアミドヒドロラーゼは、タンパク質のＮ末端のアス
パラギン残基のアスパラギン酸への脱アミドを触媒する。これは、in vivoでの
タンパク質の半減期がＮ末端残基が何であるかによって左右されるというＮ末端
規則（N-end rule）に従った、タンパク分解のタンパク質不安定化経路の第１の
段階である。Ｎ末端規則は、異なった不安定化残基をもつ一連のＮ末端を指定す
る(Grigoryev, S., 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:28521-28532.)。アスパラギ
ン酸は、二次Ｎ末端不安定化残基と考えられている。Ｎ末端アスパラギン酸は、
一次不安定化残基であるアルギニン酸に酵素によって転換される。[0006] Other examples of enzymes having intracellular oxidoreductase activity include asparagine amidohydrolase, biotin-amido amide hydrolase, and quinone oxidoreductase. N-terminal asparagine amidohydrolase catalyzes the deamidation of the N-terminal asparagine residue of a protein to aspartic acid. This is the first of the protein destabilization pathways of proteolysis, following the N-end rule, where the half-life of the protein in vivo depends on what the N-terminal residue is. It is a stage. The N-terminal rule specifies a series of N-termini with different destabilizing residues (Grigoryev, S., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 28521-28532.). Aspartic acid is considered a secondary N-terminal destabilizing residue. The N-terminal aspartic acid is
Enzymatically converted to the primary destabilizing residue, arginic acid.
【０００７】 ビオチンは、代謝に必要な４つのカルボキシラーゼ酵素反応の補酵素である。
ビオチンは、二酸化炭素の１分子が基質へ転移するのを仲介する。ビオチン依存
性酵素には、脂質生合成の第１段階であるアセチルCoAカルボキシラーゼ、及び
ピルビン酸に炭素を取込んでオキサロアセターゼを形成するピルビン酸カルボキ
シラーゼが含まれる。ビオサイチン（ビオチン−ξ−リシン）は、カルボキシラ
ーゼ活性の産物である。ビオチン−アミドアミドヒドロラーゼ（ビオチニダーゼ
とも呼ばれる、EC 3.5.1.12）は、ビオサイチンのビオチンとリシンへの転換を
触媒する。ビオチニダーゼの欠乏は、発作及び低血圧、視神経萎縮、脱毛、ケト
アシドーシス（ketolactic acidosis）、有機酸性尿（organic acidurea）を含
む遅発型の多発性カルボキシラーゼ欠乏症に結びつく。[0007] Biotin is a coenzyme of the four carboxylase enzymatic reactions required for metabolism.
Biotin mediates the transfer of one molecule of carbon dioxide to a substrate. Biotin-dependent enzymes include acetyl-CoA carboxylase, the first step in lipid biosynthesis, and pyruvate carboxylase, which incorporates carbon into pyruvate to form oxaloacetase. Biocytin (biotin-ξ-lysine) is the product of carboxylase activity. Biotin-amidoamide hydrolase (also called biotinidase, EC 3.5.1.12) catalyzes the conversion of biocytin to biotin and lysine. Biotinidase deficiency is associated with seizures and hypotension, optic atrophy, hair loss, late-onset multiple carboxylase deficiency, including ketolactic acidosis, organic acidurea.
【０００８】 チトクロムは、強固に結合した鉄原子を含むポルフィリン環であるヘム補欠分
子族を有する電子伝達タンパク質である。チトクロムは呼吸の他に、光合成及び
脂肪酸の代謝、電子伝達物質の生合成などの多様な細胞プロセスにおいて酸化還
元酵素として働く。ヘム鉄原子は、電子を受取って第二鉄から第一鉄に変わる実
際の電子伝達体である。チトクロムは、NADHやアスコルビン酸などの１つの基質
から電子を受取り、受取った電子を他のチトクロム及びユビキノン、セミデヒド
ロアスコルビン酸などの他の電子伝達体に供与する(Lodish, H. 他 (1995) Mole
cular Cell Biology,, Scientific American Books, New York, NY, pp. 759-77
0, 786-797; Sperling, P. 他 (1995) Eur. J. Biochem. 232:798-805; 及び On
line Mendelian Inheritance in Man (OMIM) *600019 Cytochrome b561, CYB56l
.)。[0008] Cytochrome is an electron transfer protein having a heme prosthetic group, a porphyrin ring containing a tightly bound iron atom. In addition to respiration, cytochromes act as oxidoreductases in a variety of cellular processes, such as photosynthesis and metabolism of fatty acids, and biosynthesis of electron mediators. Heme iron atoms are the actual electron carriers that accept electrons and change from ferric to ferrous. Cytochrome accepts electrons from one substrate, such as NADH or ascorbic acid, and donates the received electrons to other cytochromes and other electron carriers, such as ubiquinone, semidehydroascorbic acid (Lodish, H. et al. (1995) Mole
cular Cell Biology ,, Scientific American Books, New York, NY, pp. 759-77
0, 786-797; Sperling, P. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 798-805; and On
line Mendelian Inheritance in Man (OMIM) * 600019 Cytochrome b561, CYB56l
.).
【０００９】 チトクロムb5は、脂質及び薬物代謝に関与する膜結合酸化還元酵素系における
電子供与体である。チトクロムb5は、ゴルジ体及び血漿、外ミトコンドリア、小
胞体（ＥＲ）、微小体膜にみられる。チトクロムb5に保存されたアミノ酸には、
W34及びH51、P52、G53、G54、G63、F70、H74における８つの不変のアミノ酸と、
L24及びI35、S36、V41、Y42、N43、T45、W47、A48、L58、D65、T67、L85、T87、
G88における１５個の保存されたアミノ酸とがある（数字はヒマワリチトクロムb
5/delta-6に従った；GI 1040729, Sperling, 前出）。不変の残基H51PGGはヘム
結合に関与する。チトクロムb5様ドメインは、他の酵素に結合することがわかっ
た。例えば、チトクロムb5様ドメインは、酵母及びHitoplasma capsulatumのδ
−９脂肪酸不飽和化酵素、硝酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、フラボシトクロムb2
、Arabidopsis thalianaアシル脂質不飽和化酵素、Borago officinalis(borage)
及びHelianthus annuus(sunfolwer)δ−６不飽和化酵素の一部である(Sperling,
前出 Sayanova, O. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4211-4216; M
itchell, AG. 及び Martin, C.E. (1997) J. Biol. Chem. 272:28281-28288.)。[0009] Cytochrome b5 is an electron donor in the membrane-bound oxidoreductase system involved in lipid and drug metabolism. Cytochrome b5 is found in Golgi apparatus and plasma, outer mitochondria, endoplasmic reticulum (ER), and micromembrane membrane. Amino acids stored in cytochrome b5 include:
8 constant amino acids in W34 and H51, P52, G53, G54, G63, F70, H74;
L24 and I35, S36, V41, Y42, N43, T45, W47, A48, L58, D65, T67, L85, T87,
There are 15 conserved amino acids in G88 (numbers are sunflower cytochrome b
5 / delta-6; GI 1040729, Sperling, supra). The constant residue H51PGG is involved in heme binding. The cytochrome b5-like domain was found to bind to other enzymes. For example, the cytochrome b5-like domain is the delta of yeast and Hitoplasma capsulatum .
-9 fatty acid desaturase, nitrate reductase, sulfite reductase, flavocytochrome b2
, Arabidopsis thaliana acyl lipid desaturase, Borago officinalis (borage)
And a part of Helianthus annuus (sunfolwer) δ-6 desaturase (Sperling,
Sayanova, O. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4211-4216; M
Itchell, AG. and Martin, CE (1997) J. Biol. Chem. 272: 28281-28288.).
【００１０】 δ−６不飽和化酵素は、脂肪酸の延長及び不飽和化を触媒する酵素であり、例
えば必須脂肪酸であるリノール酸のγ−リノール酸への転換を触媒する。δ−６
不飽和化酵素脂肪酸は、膜構造及びその機能の維持、コレステロールの合成及び
その輸送の調節、皮膚の保湿に関与し、プロスタグランジン及びロイコトリエン
を含むエイコサノイドの前駆体である（Sayanova、前出）。不飽和化反応は、Ｅ
Ｒ膜のサイトゾル表面において、不飽和化酵素及びチトクロムb5、チトクロムb5
還元酵素からなる複合体によって生じる場合が多い(Leikin, A. 及び Shinitzky
, M. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1211:150-155.)。Marzoら(1996; Biochim
. Biophys. Acta 1301:263-272)は、２つのδ−６不飽和化酵素活性がヒトに存
在してそれぞれが異なった脂肪酸基質に特異的であるだろうと提唱した。borage
及びヒマワリチトクロムb5／不飽和化酵素融合タンパク質には、一般的な配列HX 2(3) [XH]H（Xは任意のアミノ酸）の３つの保存されたヒスチジンボックスを含む
δ−６不飽和化酵素ドメインが続く他の保存されたアミノ酸及び推定上のヘム結
合部位を有するＮ末端チトクロムb5ドメインが含まれる。ヒスチジンボックスの
ヒスチジンは金属キレート化リガンドとして作用し、反応中心における酸素の結
合に関与し得る。borageチトクロムb5／不飽和化酵素融合タンパク質は、ＥＲに
局在化していると思われる。チトクロムb5ドメインと不飽和化酵素との融合によ
って、より効率的な電子伝達を促進しされ得る（Sayanova、前出；Sperling、前
出）。[0010] δ-6 desaturase is an enzyme that catalyzes elongation and desaturation of fatty acids.
For example, it catalyzes the conversion of linoleic acid, which is an essential fatty acid, to γ-linoleic acid. δ-6
Unsaturated fatty acids maintain membrane structure and function, synthesize cholesterol,
Involved in regulating its transport, moisturizing the skin, prostaglandins and leukotrienes
It is a precursor of eicosanoids containing (Sayanova, supra). The desaturation reaction is E
On the cytosol surface of the R membrane, desaturase and cytochrome b5, cytochrome b5
It is often caused by a complex consisting of reductase (Leikin, A. and Shinitzky
, M. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1211: 150-155.). Marzo et al. (1996; Biochim
Biophys. Acta 1301: 263-272) states that two δ-6 desaturase activities are present in humans.
It has been proposed that each would be specific for different fatty acid substrates. borage
And the sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein have the general sequence HX 2 (3) Contains three conserved histidine boxes of [XH] H (X is any amino acid)
Other conserved amino acids followed by a δ-6 desaturase domain and putative heme formation
An N-terminal cytochrome b5 domain with a joining site is included. Histidine box
Histidine acts as a metal chelating ligand and binds oxygen at the reaction center.
May be involved. borage cytochrome b5 / desaturase fusion protein
It seems to be localized. By fusion of cytochrome b5 domain with desaturase
Can promote more efficient electron transfer (Sayanova, supra; Sperling, supra).
Out).
【００１１】 δ−６不飽和化酵素及びそれらのタンパク質は、幾つかの障害と関連する。Na
kadaら（1990; Neuroreport 1:153-155）は、アルツハイマー病の脳組織の膜脂
肪酸組成を分析して、δ−６不飽和化の異常の証拠を発見した。δ−６不飽和化
活性の低下が、老化、ストレス、糖尿病、湿疹、及びある種の感染において観察
された。γ−リノール酸（δ−６不飽和化酵素の産物）の異化の増大は、例えば
癌及び炎症による急激な細胞***から起こる。δ−６不飽和化酵素活性の低下及
びγ−リノール酸の異化の増大の両方が、γ−リノール酸の欠乏につながり得る
。γ−リノール酸は、湿疹及び***痛、糖尿病ニューロパシー、ウイルス感染、
ある種の癌の治療に効果的であろう（Sayanova、前出）。[0011] δ-6 desaturases and their proteins are associated with several disorders. Na
(1990; Neuroreport 1: 153-155) analyzed the fatty acid composition of membranes in Alzheimer's disease brain tissue and found evidence of abnormal δ-6 desaturation. Decreased δ-6 desaturation activity was observed in aging, stress, diabetes, eczema, and certain infections. Increased catabolism of γ-linoleic acid (the product of δ-6 desaturase) results from rapid cell division due to, for example, cancer and inflammation. Both reduced δ-6 desaturase activity and increased catabolism of γ-linoleic acid can lead to γ-linoleic acid deficiency. γ-linoleic acid is eczema and breast pain, diabetic neuropathy, viral infection,
It may be effective in treating certain types of cancer (Sayanova, supra).
【００１２】 チトクロムb561は、幾つかのカテコールアミン及びペプチド神経伝達物質の生
合成における電子チャンネル（electron channel）として働き、副腎髄質組織、
下垂体組織、及びその他の神経内分泌組織の神経ペプチド分泌小胞及びカテコー
ルアミンにみられる。チトクロムb561 mRNAが、脳、胎盤、肺、膵臓及び腎臓で
検出された。チトクロムb561によって、クロム親和性顆粒のドーパミンベータ水
酸化酵素と神経分泌小胞のペプチジル−グリシンアルファアミド化モノオキシゲ
ナーゼの２つのモノオキシゲナーゼに相当するものが減少する。チトクロムb561
は、細胞質供与体であるアスコルビン酸からリン脂質二重層を通って管腔受容体
セミデヒドロアスコルビン酸への電子伝達を触媒する（OMIM、前出；Srivastava
, M 他(1994) Biochem. J. 303:915-921）。ヒトチトクロムb561は、５つの膜貫
通スパン（transmembrane span）を有し、ウシは６つの膜貫通スパンを有する。
ヒト型とウシ型との間に保存されたチトクロムb561の６つの残基は、ヘム結合に
関与すると推測されている。これらの残基は、H87及びW136、G139、F140、H160
、F163である（数字はヒトチトクロムb561に従った）（GI 1345640; Srivastava
, (1994)、前出）。チトクロムb561酵素は、ヒト及びウシ、Xenpus laevis、マ
ウスを含む多くの生物で見つかっている。Xenpus laevis型及びマウス型は、発
生的に調節されると報告されている（Srivastava, M. (1995) J. Biol. Chem. 2
70:22714-22720）。[0012] Cytochrome b561 acts as an electron channel in the biosynthesis of some catecholamines and peptide neurotransmitters, and
It is found in pituitary and other neuroendocrine tissue neuropeptide secreting vesicles and catecholamines. Cytochrome b561 mRNA was detected in brain, placenta, lung, pancreas and kidney. Cytochrome b561 reduces the equivalent of two monooxygenases, dopamine beta hydroxylase in chromaffin granules and peptidyl-glycine alpha amidated monooxygenase in neurosecretory vesicles. Cytochrome b561
Catalyzes the transfer of electrons from the cytoplasmic donor ascorbic acid through the phospholipid bilayer to the luminal acceptor semidehydroascorbic acid (OMIM, supra; Srivastava
, M et al. (1994) Biochem. J. 303: 915-921). Human cytochrome b561 has five transmembrane spans, and bovine has six transmembrane spans.
Six residues of cytochrome b561 conserved between the human and bovine forms have been implicated in heme binding. These residues are H87 and W136, G139, F140, H160
, F163 (numbers according to human cytochrome b561) (GI 1345640; Srivastava
, (1994), supra). The cytochrome b561 enzyme has been found in many organisms, including humans and cows, Xenpus laevis , and mice. Xenpus laevis and mouse types have been reported to be developmentally regulated (Srivastava, M. (1995) J. Biol. Chem. 2
70: 22714-22720).
【００１３】 Srivastavaら（1994、前出）は、チトクロムb561の発現が神経内分泌組織に制
限されているという事実から、チトクロムb561が神経内分泌障害に関与している
と推測した。Srivastava（1995、前出）は、チトクロムb561の発達及び細胞分化
、発癌への関与の可能性を示唆した。バーキット及びDaudiのＢ細胞リンパ腫に
おいて、チトクロムb561 mRNAの発現は観察されていない。チトクロムb561の発
現は、末梢血白血球における発現と較べ、大腸癌細胞株及びＴ細胞リンパ腫、未
分化細胞株で増加している（Srivastava(1995)、前出）。[0013] Srivastava et al. (1994, supra) speculated that cytochrome b561 is involved in neuroendocrine disorders from the fact that cytochrome b561 expression is restricted to neuroendocrine tissues. Srivastava (1995, supra) suggested that cytochrome b561 may be involved in development and cell differentiation and carcinogenesis. No expression of cytochrome b561 mRNA has been observed in Burkitt and Daudi B-cell lymphomas. The expression of cytochrome b561 is increased in colorectal cancer cell lines, T cell lymphomas, and undifferentiated cell lines as compared to expression in peripheral blood leukocytes (Srivastava (1995), supra).
【００１４】 新規のヒト酸化還元酵素タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチド
の発見により、神経疾患及び自己免疫／炎症性疾患、生殖障害、細胞増殖異常、
内分泌障害、小胞輸送障害、平滑筋異常の診断及び治療、予防に有用な新規の組
成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。[0014] The discovery of novel human oxidoreductase proteins and polynucleotides encoding them has led to the discovery of neurological and autoimmune / inflammatory diseases, reproductive disorders, abnormal cell proliferation,
The need in the art can be met by providing a novel composition useful for diagnosing, treating, and preventing endocrine disorders, vesicle transport disorders, and smooth muscle abnormalities.
【００１５】 発明の要約 本発明は、個別にはそれぞれ「HORP−1」、「HORP−2」、「HORP−3」、「HOR
P−4」、「HORP−5」、「HORP−6」であり、総称して「HORP」と呼ぶヒト酸還元
酵素タンパク質である実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明の一
実施態様では、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択されたア
ミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention separately comprises "HORP-1,""HORP-2,""HORP-3," and "HOR
P-4 "," HORP-5 "," HORP-6 ", which provide a substantially purified polypeptide which is a human acid reductase protein collectively referred to as" HORP ". In one embodiment of the present invention, there is provided a substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof.
【００１６】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的に
精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片
からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単離さ
れ実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:
1−6及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上のポリヌクレオチド
配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。The present invention further provides a substantially purified variant having at least 90% amino acid identity with at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof. provide. The present invention also provides an isolated and substantially purified polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-6 and fragments thereof. The present invention also provides SEQ ID NO:
Provided is an isolated and purified polynucleotide variant sequence having at least 90% or more polynucleotide sequence identity with a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 1-6 and fragments thereof. I do.
【００１７】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件
の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。ま
た、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を含む単離さ
れ精製されたポリヌクレオチドとを提供する。Further, the present invention provides an isolation that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof. To provide a purified and purified polynucleotide. Also provided is a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof, and an isolated and purified polynucleotide comprising a sequence complementary to the polypeptide. .
【００１８】 本発明はまた、SEQ ID NO:7−12及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。また、本発明は、SEQ ID NO:7−12及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列と９０％以上のポリヌク
レオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提
供する。また、SEQ ID NO:7−12及びそれらの断片からなる一群から選択された
ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され
精製されたポリヌクレオチドを提供する。[0018] The present invention also provides an isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-12 and fragments thereof. The present invention also relates to an isolated and purified polynucleotide sequence having a polynucleotide sequence identity of 90% or more with a polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-12 and fragments thereof. A polynucleotide variant sequence is provided. Also provided is an isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-12 and fragments thereof.
【００１９】 本発明は更に、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１
つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発現ベクターは宿
主細胞内に含まれる 本発明はまた、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチド
の発現に好適な条件の下、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少
なくとも１つの断片を有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（
ｂ）その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法
を提供する。The present invention further provides at least one polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof.
An expression vector comprising the two fragments. In another embodiment, the expression vector is contained within a host cell. The invention also provides a method of producing a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof. (A) culturing a host cell containing an expression vector having at least one fragment of a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expression of the polypeptide;
b) recovering the polypeptide from the culture medium of the host cell.
【００２０】 本発明はまた、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好
適な医薬用担体と共に提供する。The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof together with a suitable pharmaceutical carrier. provide.
【００２１】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、
そのポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストとも提供する。[0021] The invention further provides a purified antibody that binds to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof. Also,
Also provided are purified agonists and antagonists of the polypeptide.
【００２２】 本発明はまた、HORPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者にSEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択されたア
ミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適
な医薬用担体と共に効果的な量投与することを含む、HORPの発現または活性の低
下に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。The present invention also has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof in a patient in need of treatment or prevention of a disease associated with reduced HORP expression or activity. Provided is a method for treating or preventing a disease associated with decreased HORP expression or activity, comprising administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide together with a suitable pharmaceutical carrier.
【００２３】 本発明はまた、HORPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者にSEQ ID NO:1−6及びそれらの断片からなる一群から選択されたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与することを含
む、HORPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法を提供す
る。The present invention also includes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof in a patient in need of treatment or prevention of a disease associated with increased HORP expression or activity. A method for treating or preventing a disease associated with increased HORP expression or activity, comprising administering an effective amount of a polypeptide antagonist.
【００２４】 本発明はまた、核酸を含む生物学的サンプルにおいて、SEQ ID NO:1−6及びそ
れらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）SEQ ID NO:1−6及びそ
れらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列の相補配列を、少なくとも１つの前記生物学的サン
プルの核酸とハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過
程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、その
ハイブリダイゼーション複合体の存在と前記生物学的サンプルにおけるそのポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在とが相関性を有する、検出方法を
提供する。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレ
オチドを増幅する過程を含む。The present invention also provides a method for detecting a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-6 and fragments thereof in a biological sample containing nucleic acids. (A) complementing a polynucleotide sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof with at least one of said biological samples Hybridizing with the nucleic acid to form a hybridization complex; and (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex and the poly- A detection method is provided which has a correlation with the presence of a polynucleotide encoding a peptide. One embodiment of the invention involves amplifying the polynucleotide prior to hybridization.
【００２５】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。Before describing the protein and nucleic acid sequences and methods of the present invention in describing the present invention, it is to be understood that this invention is not limited to the particular devices, materials, and methods disclosed herein, which embodiments may be modified. I want to be understood. Further, the terms used herein are used only for the purpose of describing a specific embodiment, and are limited only by the claims described below.
It should also be understood that they are not intended to limit the scope of the present invention.
【００２６】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。As used herein and in the claims, the singular forms “a”, “the”, etc.
Note that the plural includes the plural unless explicitly stated in the context. Thus, for example, "a host cell" includes a plurality of host cells, and the "antibody" includes a plurality of antibodies, including equivalents well known to those skilled in the art.
【００２７】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。All technical and scientific terms used herein are, unless otherwise defined,
This has the same meaning as commonly interpreted by a general engineer in the technical field to which the present invention belongs.
Although all devices and materials and methods similar or equivalent to those described herein can be used in the practice and testing of the present invention, the preferred devices, materials and methods are described here.
All references mentioned herein are cited to describe and disclose the cell lines, protocols, reagents, and vectors described in the literature that may be used in connection with the present invention. Citing a conventional invention does not, however, be construed as impairing the novelty of the present invention.
【００２８】 定義 本明細書において「HORP」とは、天然、合成、半合成或いは組換え体など全て
の種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳動
物）から得られる実質的に精製されたHORPのアミノ酸配列のことである。 Definitions As used herein, the term "HORP" refers to any species, including natural, synthetic, semi-synthetic, or recombinant forms, especially mammals, including cows, sheep, pigs, mice, horses, and preferably humans. The substantially purified HORP amino acid sequence.
【００２９】 本明細書において「アゴニスト」とは、HORPと結合したとき、HORPの効果を増
大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。このアゴニストには
、HORPに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の分子
を含み得る。As used herein, “agonist” refers to a molecule that, when bound to HORP, increases the effect of HORP or prolongs its duration. The agonist may include proteins, nucleic acids, carbohydrates, and any other molecules that bind to HORP and modulate its effects.
【００３０】 本明細書において、「アレル変異配列」とは、HORPをコードする遺伝子の別の
形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって
生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変
わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝子
には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般に
アレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換
による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内
で一回或いはそれ以上生じる。As used herein, “allelic variant” is another form of the gene encoding HORP. Allelic variant sequences result from at least one mutation in the nucleic acid sequence, resulting in a variant mRNA or variant polypeptide, whose structure or function may or may not change. All natural or recombinant genes may have no allele, one or many alleles. In general, mutations that result in allelic variants are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these mutations may occur alone or concurrently with other mutations, and may occur one or more times within a given sequence.
【００３１】 本明細書において、HORPをコードする「変異」核酸配列とは、様々なヌクレオ
チドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、HORPと同じポヌクレオチド或いは
HORPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドのことである。この定義
には、HORPをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座ではな
い位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及び
HORPをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質
も変異され得り、サイレント変化を生じHORPと機能的に等価となるアミノ酸残基
の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或い
は免疫学的にHORPの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水
性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。た
とえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得
り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得り、そして近い
親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、
バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン
、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。As used herein, “mutant” nucleic acid sequence encoding HORP refers to the same polynucleotide or HORP as the HORP, even when various nucleotide deletions, insertions, or substitutions occur.
A polypeptide having at least one of the functional properties of HORP. This definition includes improper or unexpected hybridization of the polynucleotide sequence encoding HORP to an allelic variant at a position other than the normal chromosomal locus, and
Includes polymorphisms that are readily detectable or difficult to detect using specific oligonucleotide probes of a polynucleotide encoding HORP. The encoded protein can also be mutated and contain deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that produce a silent change and are functionally equivalent to HORP. Intentional amino acid substitutions are similar in terms of residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity, as long as HORP activity is retained biologically or immunologically. Can be performed based on For example, a negatively charged amino acid can include aspartic acid and glutamic acid, a positively charged amino acid can include lysine and arginine, and an amino acid with a near hydrophilic value and an uncharged polar head group. Is leucine, isoleucine,
It may include valine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, threonine, phenylalanine and tyrosine.
【００３２】 本明細書において「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド
、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の分
子または合成された分子である。HORPの断片である「断片」及び「免疫原性断片
」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も
好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、HORPのある生物学的活性または免疫学
的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミ
ノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。As used herein, “amino acid” or “amino acid sequence” refers to an oligopeptide, peptide, polypeptide, or protein sequence and fragments thereof, and is a natural molecule or a synthesized molecule. "Fragments" and "immunogenic fragments", which are fragments of HORP, are preferably about 5 to about 15 amino acids in length, most preferably about 14 amino acids in length, Retains some biological or immunological activity of HORP. As used herein, "an amino acid sequence is that of a naturally occurring protein molecule, but the amino acid sequence and similar terms are not limited to the complete, intact amino acid sequence associated with the listed protein molecule.
【００３３】 本明細書において用語「増幅」とは、核酸配列の付加的な複製を生成すること
に関連する。一般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
技術を用いて行われる(例えば、Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) P
CR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY,
pp. 1-5.を参照)。As used herein, the term “amplification” refers to generating additional copies of a nucleic acid sequence. Polymerase chain reaction (PCR) generally well known in the art.
Performed using techniques (eg, Dieffenbach, CW and GS Dveksler (1995) P
CR Primer, a Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,
pp. 1-5.).
【００３４】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、HORPと結合したとき、HORPの生
物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮す
る分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはHORPの
効果を減少させるの他の分子である。As used herein, an “antagonist” is a molecule that, when bound to HORP, reduces the extent of the biological or immunological activity of HORP or reduces its duration. Antagonists are proteins, nucleic acids, carbohydrates, antibodies or other molecules that reduce the effect of HORP.
【００３５】 本明細書において「抗体」とは、Ｆab及びＦ(ab')2、及びそれらの断片、Ｆｖ
断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。HORPポリペプチド
と結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小ペプチドを含む無傷の分子またはそ
の断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサ
ギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡ
の翻訳から引き出されたり化学的に合成され得り、必要に応じて担体プロテイン
と結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担
体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペットヘモニア
ン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する
。As used herein, “antibody” refers to Fab and F (ab ′) 2 , and fragments thereof, Fv
An intact molecule, such as a fragment, that can bind to an antigenic determinant. Antibodies that bind HORP polypeptides can be prepared using intact molecules or fragments thereof containing the small peptide of interest to immunize the antibody. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, a mouse, rat, or rabbit) may be RNA
And can be chemically synthesized and, if necessary, conjugated to a carrier protein. Commonly used carriers that are chemically coupled to the peptide include bovine serum albumin, thyroglobin, and keyhole limpet haemonian (KLH). The animal is then immunized with the conjugated peptide.
【００３６】 本明細書において「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグメ
ント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動
物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定
基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の
産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免
疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。As used herein, an “antigenic determinant” is a fragment of a molecule (ie, an epitope) that makes contact with a particular antibody. When a protein or a fragment of a protein is used to immunize a host animal, various regions of the protein may contain antibodies that specifically bind to antigenic determinants (defined regions or three-dimensional structures on the protein). Can be induced. Antigenic determinants can compete with the intact antigen (ie, the immunogen used to elicit the immune response) to bind the antibody.
【００３７】 本明細書において「アンチセンス」とは、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的
な核酸配列を含む全ての組成物である。アンチセンス分子は、合成や転写を含む
任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻
訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プラ
ス（＋）」という表現はセンス鎖と言える。As used herein, “antisense” is any composition that includes a nucleic acid sequence that is complementary to the sense strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense molecules can be created by any method, including synthesis and transcription. Once introduced into a cell, the complementary nucleotide combines with the native sequence created by the cell to form a duplex and inhibits transcription and translation. The expression "minus (-)" can be said to be an antisense strand, and the expression "plus (+)" can be said to be a sense strand.
【００３８】 本明細書において「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、或
いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活性
」とは、天然或いは組換え体のHORP、合成のHORPまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力のことである。As used herein, “biological activity” refers to a protein having a structural, regulatory, or biochemical function of a naturally occurring molecule. Similarly, "immunologically active" refers to natural or recombinant HORP, synthetic HORP, or any of their oligopeptides, which elicits a specific immune response in a suitable animal or cell to a specific antibody. The ability to combine with
【００３９】 本明細書において「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の温
度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することで
ある。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。
２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、
或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。
核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並
びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。As used herein, “complementary” or “complementary” refers to the spontaneous binding of polynucleotides by base pair formation under acceptable salt and acceptable temperature conditions. For example, it binds to the sequence "TCA" which is complementary to the sequence "AGT".
The complementarity between two single-stranded molecules is only partially bound by some nucleic acids,
Alternatively, there may be cases where perfect complementarity exists between the single strands, resulting in perfect complementarity.
The degree of complementarity between nucleic acid strands greatly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands. This is particularly important in amplification reactions that depend on binding between nucleic acid strands, as well as in the design or use of peptide nucleic acid (PNA) molecules.
【００４０】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定
のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いは
アミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤或
いは水溶液、無菌組成物を含み得る。HORP若しくはHORPの断片をコードするポリ
ヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用
され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化
剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例え
ば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例えば、デ
ンハート液、乾燥ミルク、サケ***ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開され得る。As used herein, the term “composition containing a predetermined polynucleotide sequence” or “composition containing a predetermined amino acid sequence” refers to any composition containing a predetermined nucleotide sequence or amino acid sequence in a broad sense. It is. The composition may include a dry formulation or an aqueous solution, a sterile composition. A composition comprising a polynucleotide sequence encoding HORP or a fragment of HORP can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, the probe can be developed into an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl) and a surfactant (eg, SDS), and other substances (eg, Denhardt's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.).
【００４１】 本明細書において「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために再
配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲTM（Perkinn Elmer, Norwalk, CT）
を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或いは
GELVIEW Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメントの
構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン社
の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によって
コンセンサス配列に構築されるものもある。As used herein, the term “consensus sequence” refers to a nucleic acid sequence rearranged to separate unnecessary bases, and is a XL-PCR ™ (Perkinn Elmer, Norwalk, CT)
A nucleic acid sequence that has been extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction and rearranged using
This refers to a nucleic acid sequence constructed from two or more overlapping sequences of Insight Clones using a computer program for constructing fragments such as the GELVIEW Fragment Assembly System (GCG, Madison, WI). Some are built into consensus sequences by both extension and construction.
【００４２】 本明細書において「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン分析によるHORPをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、サ
ンプル内のHORPをコードする核酸の存在を示すことから、HORPをコードするポリ
ヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを意味する。As used herein, “correlated with the expression of a polynucleotide” means that detection of a nucleic acid that is the same as or related to a nucleic acid sequence encoding HORP by Northern analysis indicates the presence of the nucleic acid encoding HORP in the sample. Indicates that there is a correlation with the expression of a transcript from a polynucleotide encoding HORP.
【００４３】 本明細書において「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が
欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。As used herein, a “deletion” is a change in an amino acid or nucleic acid sequence that lacks one or more amino acid residues or nucleic acid residues.
【００４４】 本明細書において「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、
アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌ
クレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少な
くとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もと
のポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する
、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによ
って修飾されたものである。As used herein, “derivative” refers to a chemical modification of a polypeptide or polynucleotide sequence. Chemical modifications of a polynucleotide sequence include, for example,
There is replacement of hydrogen by an alkyl group, an acyl group, or an amino group. A derivative polynucleotide encodes a polypeptide that retains at least one biological or immunological function of a natural molecule (unmodified molecule). A derivative polypeptide is one that has been modified by glycosylation, polyethyleneglycolation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function of the original polypeptide.
【００４５】 本明細書において「類似性」とは、相補性の程度を表すものである。これには
、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも
言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも
部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全
に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低
下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或い
はノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査さ
れる。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を
低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合し
て抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合
が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条
件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性と
もいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用い
て、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在し
ない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイ
ブリダイゼーションしない。As used herein, “similarity” indicates the degree of complementarity. This can be partial similarity and complete similarity. This “identity” can be said to be “similarity”. Partially complementary sequences that at least partially prevent the same sequence from hybridizing to the target nucleic acid are referred to as "substantially similar." The suppression of hybridization between the completely complementary sequence and the target sequence is examined using a hybridization assay (Southern or Northern blotting, solution hybridization, etc.) under reduced stringency conditions. Substantially similar sequences or hybridization probes compete under reduced stringency conditions for binding of the completely complementary sequence to the target sequence. This means that under reduced stringency conditions, the binding of the two sequences to each other must interact specifically (ie, selectively), and under reduced stringency conditions, This does not mean that specific binding is tolerated. Using a second target sequence that is not even partially complementary (eg, less than 30% similarity or identity), it can be tested for the absence of non-specific binding. In the absence of non-specific binding, substantially similar sequences or probes will not hybridize to the second non-complementary target sequence.
【００４６】 本明細書において「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ
酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。こ
の百分率同一性は、例えば、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Inc., Madison Wl)
など電子装置を用いて決定可能である。このMEGALIGNプログラムは、様々な方法
、例えば、クラスター方法 (例えば、Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gen
e73:237-244.を参照)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すこ
とが可能である。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配
列を各クラスターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次
ぎにグループに分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配
列Ａと配列Ｂの百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配
列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引い
たもので除し、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配
列間の低い類似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれ
ない。核酸配列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法など
の当分野で周知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(
例えば、Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同
一性はまた、例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で周
知の別の方法によって決定することも可能である。As used herein, “percent identity” or “% identity” refers to the percentage of sequence similarity found in a comparison of two or more amino acid sequences or nucleic acid sequences. This percentage identity is determined, for example, by the MEGALIGN program (DNASTAR, Inc., Madison Wl).
It can be determined using an electronic device. The MEGALIGN program can be implemented in a variety of methods, such as the cluster method (eg, Higgins, DG and PM Sharp (1988) Gen.
e73: 237-244.), it is possible to create an alignment between two or more sequences. A cluster algorithm measures the distance between all sets and classifies the sequence into each cluster. These clusters are aligned by sets and then divided into groups. The percentage similarity between the sequences of two amino acids, for example, the percentage similarity between sequence A and sequence B, is calculated by calculating the total number of matching residues in sequence A and sequence B from the length of sequence A to gap residues in sequence A. It is obtained by dividing the number by subtracting the number of gap residues in sequence B and multiplying by 100. Low similarity or dissimilarity gaps between two amino acid sequences are not included in the determination of percentage similarity. Percent identity between nucleic acid sequences can also be counted or calculated by another method known in the art, such as the cluster method or the Jotun Hein method (
See, for example, Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645. The identity between sequences can also be determined by other methods well-known in the art, for example, by changing the conditions for hybridization.
【００４７】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み
得り、安定した***染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微
小染色体である（例えば、Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355
を参照）。[0047] Human artificial chromosomes (HACs) are linear microchromosomes that can contain DNA sequences between 6 Kb and 10 Mb in size and contain all the elements necessary for the separation and maintenance of stable dividing chromosomes (eg, Harrington, JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355
See).
【００４８】 本明細書において「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒト
の抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子で
ある。As used herein, a “humanized antibody” is an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been mutated in order to resemble a human antibody while retaining the original binding ability.
【００４９】 本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な
一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。As used herein, “hybridization” is any process in which one strand of a nucleic acid forms a base pair with a complementary single strand and binds.
【００５０】 本明細書において「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間
の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである
。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ0ｔまたはＲ0ｔ分析）で
形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜
、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸
を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成さ
れ得る。As used herein, the term “hybridization complex” refers to a complex formed between two nucleic acid sequences by forming hydrogen bonds between complementary base pairs. Hybridization complexes may be formed in solution (eg, C 0 t or R 0 t analysis) or may comprise one nucleic acid sequence in solution and a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin). Or another nucleic acid sequence immobilized on a glass slide, or any suitable substrate that immobilizes the cells and their nucleic acids.
【００５１】 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対し
て、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸
配列或いは核酸配列の変化のことである。As used herein, the term “insertion” or “addition” refers to a change in an amino acid sequence or a nucleic acid sequence in which one or more amino acid residues or nucleotides are respectively added to a naturally occurring molecule sequence. It is.
【００５２】 本明細書において「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症
、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に
影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子
の発現によって特徴づけられ得る。As used herein, the term “immune response” refers to a symptom associated with inflammatory diseases and trauma, immune disorders, infectious diseases, genetic diseases, and the like. These conditions can be characterized by the expression of various factors that affect the cell line and the systemic defense system, such as cytokines and chemokines, and other signaling molecules.
【００５３】 本明細書において「マイクロアレイ」とは、例えば、紙やナイロンなどの任意
の形態の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、または任意の好適な固体支
持物などの基板上に配列された様々なポリヌクレオチドのアレイのことである。As used herein, the term “microarray” refers to various forms arranged on a substrate such as a membrane, a filter, a chip, a glass slide, or any suitable solid support, for example, any form of paper or nylon. An array of unique polynucleotides.
【００５４】 本明細書のマイクロアレイの記述における「要素」或いは「アレイ要素」とは
、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのこ
とである。The “element” or “array element” in the description of the microarray herein refers to a hybridizable polynucleotide arranged on the surface of a substrate.
【００５５】 本明細書において「変調」とは、HORPの活性の変化のことである。変調の例と
して、HORPのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物学的
特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。As used herein, “modulation” refers to a change in the activity of HORP. Examples of modulation include changes in the protein activity or binding properties of HORP, or other biological, functional or immunological properties.
【００５６】 本明細書において「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若し
くは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤ
ＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ
様物質も指す。本明細書において「断片（またはフラグメント）」とは、（例え
ば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）SEQ ID NO:7−12を特別に同定
する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列のことである。例えば、
SEQ ID NO:7−12は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、更に
、関連ポリヌクレオチド配列からSEQ ID NO:7−12を区別する類似性の検査にも
有用である。SEQ ID NO:7−12の断片は、少なくともヌクレオチド１５〜２０個
の長さである。この断片に対応するSEQ ID NO:7−12の正確な長さ及びSEQ ID NO
:7−12の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一般的な技術の１つを用い
て日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場合、完全長のポリペプチ
ドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的ドメ
イン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。As used herein, “nucleic acid” or “nucleic acid sequence” refers to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, or fragments thereof. In addition, a single-stranded or double-stranded sense or antisense strand of genomic or synthetic origin
NA or RNA, peptide nucleic acid (PNA), any DNA-like substance, RNA
Also refers to similar substances. As used herein, “fragment (or fragment)” refers to a region of a unique polynucleotide sequence that specifically identifies SEQ ID NOs: 7-12 (eg, different from any other sequence in the same genome). Nucleic acid sequence. For example,
SEQ ID NOs: 7-12 are useful for hybridization and amplification techniques, and are also useful for testing for similarities that distinguish SEQ ID NOs: 7-12 from related polynucleotide sequences. The fragment of SEQ ID NO: 7-12 is at least 15-20 nucleotides in length. The exact length of SEQ ID NOs: 7-12 corresponding to this fragment
: 7-12 can be determined routinely using one of the techniques common in the art based on the intended use of the fragments. Also, the fragment, when translated, may form a polypeptide that retains some functional characteristics, such as antigenicity, of a full-length polypeptide or structural domain characteristics, such as an ATP binding site.
【００５７】 本明細書において「機能的に関係した」或いは「機能的に結合した」とは、機
能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロ
モータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する
或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は
近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝
子要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリ
ペプチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。As used herein, “functionally related” or “operably linked” refers to a functionally related nucleic acid sequence. When the promoter controls the transcription of the encoded polypeptide, the promoter is operably associated with or operably linked to the coding sequence. Although functionally related or operably linked nucleic acid sequences can be in close proximity and in the same reading frame, certain genetic elements, such as repressor genes, are in close proximity to the polypeptide-encoding sequence. Unbound, but remains bound to an operator sequence that regulates expression of the polypeptide.
【００５８】 本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼ
ーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さ
は少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５か
ら３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチド
である。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義
される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じで
ある。As used herein, “oligonucleotide” refers to a nucleic acid sequence that can be used for PCR amplification, hybridization, or microarray, and has a length of at least 6 to 60 nucleotides. Preferably it is about 15 to 30 nucleotides, more preferably about 20 to 25 nucleotides. As used herein, an oligonucleotide is substantially the same as "amplimer" and "primer", "oligomer", which are defined to be the same in the art.
【００５９】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるア
ミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さの
オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この
末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖
ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコー
ル化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993) An
ticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。As used herein, “peptide nucleic acid” (PNA) refers to an antisense molecule or an antigene comprising an oligonucleotide of about 5 or more nucleotides in length bound to a peptide backbone of amino acid residues terminating in lysine. It is an agent. This terminal lysine makes the composition soluble. PNAs can preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA, stop transcript elongation, and become polyethylene glycolated to extend their lifespan in cells. (For example, Nielsen, PE et al. (1993) An
ticancer Drug Des. 8: 53-63).
【００６０】 本明細書において「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。HO
RPをコードする核酸若しくはその断片、HORP自体を含むと推測される生物学的サ
ンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小
器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。As used herein, “sample” is used in its broadest sense. HO
Biological samples presumed to contain RP-encoding nucleic acids or fragments thereof, and HORP itself, include body fluids, extracts from cells and chromosomes and organelles isolated from cells, membranes, Genomic DNA, RN fixed in a solution or on a solid support
A, cDNA, tissue or tissue print, etc. may also be included.
【００６１】 本明細書において「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク
質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用の
ことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原
決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右され
る。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していな
い標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペ
プチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と
結合する標識Ａの量が減少する。As used herein, “specific binding” or “specifically binds” refers to an interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, or antagonist. This interaction is dependent on the presence of a particular structure of the protein, such as an antigenic determinant or epitope, recognized by the binding molecule. For example, if the antibody is specific for epitope "A", then in a reaction involving unbound labeled "A" and the antibody, the presence of the polypeptide comprising epitope A or the absence of unbound polypeptide The presence of the label "A" reduces the amount of label A that binds to the antibody.
【００６２】 本明細書において「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載され
たポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条
件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野
で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルム
アミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳
密性を高めることができる。As used herein, “strict conditions” are conditions under which hybridization between a polynucleotide and the polynucleotide described in the claims is possible. The exact conditions are determined by the salt concentration and the concentration of the organic solvent (eg, formamide), the temperature, and other conditions well known in the art. Specifically, stringency can be increased by lowering the salt concentration, increasing the formamide concentration, or increasing the hybridization temperature.
【００６３】 本明細書において「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれて
から、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合
している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは
約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。As used herein, “substantially purified” refers to a nucleic acid or amino acid sequence that has been isolated or separated after it has been removed from its natural environment, and that is a naturally-associated component. Is at least about 60% or more removed, preferably about 75% or more removed, and most preferably about 90% or more removed.
【００６４】 本明細書において「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそ
れぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。As used herein, “substitution” refers to replacing one or more amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
【００６５】 本明細書において「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化
させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、
自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の
中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この
形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この
方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェク
ション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換さ
れた」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは
宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる
。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細
胞も含まれる。As used herein, “transformation” refers to the process by which foreign DNA enters and changes a recipient cell. Transformation can be accomplished by various methods well known in the art.
It can occur under natural or artificial conditions and can be performed by any known method of inserting foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. The method of transformation is selected according to the type of host cell to be transformed. The methods include, but are not limited to, viral infection, electroporation, lipofection, and microparticle irradiation. A "transformed" cell includes a stably transformed cell that is capable of replicating autonomously replicating the introduced DNA as a plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that express the introduced DNA or RNA temporarily for a limited time are also included.
【００６６】 本明細書において「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置
換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が
含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「
非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿
入、或いはその両方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥTMソ
フトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミ
ノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。As used herein, “variant” is an amino acid sequence in which one or more amino acids have been mutated. The variants include "conservative" mutations, wherein the substituted amino acid has a similar structure or similar chemical properties, such as, for example, a substitution of leucine for isoleucine. Although rare, some mutants replace glycine with tryptophan.
Also included are "non-conservative" mutations. Similar small mutations also include amino acid deletions, insertions, or both. For example, LASERGENE ™ software well known in the art could be used to determine which amino acid residues to substitute, insert or delete without impairing biological or immunological activity.
【００６７】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、HORPに関連
したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、「ス
プライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ変異
配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング
中のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなっ
たり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わった
り、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオ
チド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。
多形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列に
おける変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基
が異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は
、例えば、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。A “variant sequence” as used in the context of a polynucleotide sequence may include a polynucleotide sequence related to HORP. This definition also applies, for example, to "allelic", "splice", "species", "polymorphic" variant sequences. A splice variant may be very identical to the reference molecule, but will have more or less polynucleotides due to alternate splicing of exons during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional or fewer functional domains. Species variant sequences are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides have high amino acid identity with each other.
Polymorphic variant sequences are variations in the polynucleotide sequence of a particular gene between a given species. Polymorphic variant sequences can also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) that differ by one base in the polynucleotide sequence. The presence of a SNP may, for example, represent a population, condition, or characteristic of a condition.
【００６８】 発明 本発明は、新規のヒト酸化還元酵素タンパク質(HORP)、及びHORPをコードする
ポリヌクレオチドの発見に基づき、神経疾患及び自己免疫／炎症性疾患、生殖障
害、細胞増殖異常、内分泌障害、小胞輸送障害、平滑筋異常の診断及び治療、予
防におけるこれらの組成物の使用法に関する。表１は、配列識別番号、クローン
識別番号、HORPのライブラリを示す。[0068] This invention relates to novel human oxidoreductase protein (HORP), and based on the discovery of polynucleotides encoding HORP, neurological diseases and autoimmune / inflammatory diseases, reproductive disorders, cell proliferative disorders, endocrine disorders Use of these compositions in the diagnosis, treatment and prevention of vesicular transport disorders, smooth muscle abnormalities. Table 1 shows the sequence identification numbers, clone identification numbers, and HORP libraries.
【００６９】 表２に示されているように、それぞれのHORPと酸化還元酵素との化学的及び構
造的類似性の特徴がそれぞれ示されている。表３には、ノーザン分析によって、
様々なライブラリにおけるHORPをコードする核酸配列の発現は、発現の少なくと
も４２％が不死化即ち癌であり、少なくとも１６％が免疫応答に関連することが
分かった。注目すべきは、生殖組織及び胃腸組織、心血管組織、神経組織におけ
るHORP−1、HORP−2、HORP−3、HORP−4の発現である。As shown in Table 2, the characteristics of the chemical and structural similarities between each HORP and oxidoreductase are shown, respectively. Table 3 shows that by Northern analysis,
Expression of nucleic acid sequences encoding HORP in various libraries was found to be at least 42% of expression immortal or cancer and at least 16% involved in the immune response. Of note is the expression of HORP-1, HORP-2, HORP-3, HORP-4 in reproductive and gastrointestinal, cardiovascular, and nervous tissues.
【００７０】 図１Ａ及び図１Ｂ、図１Ｃに示されているように、HORP−5は、ヒマワリチト
クロムｂ５／不飽和化酵素融合タンパク質（GI 1040729; SEQ ID NO:13）との化
学的及び構造的類似性を有する。特に、HORP−5とヒマワリチトクロムｂ５／不
飽和化酵素融合タンパク質との同一性は２３％である。HORP−5とヒマワリチト
クロムｂ５／不飽和化酵素融合タンパク質は、HORP−5のH53PGGに位置する潜在
ヘム結合部位と、HORP−5のH53及びP54、G55、G56、G65、F72、H76に位置する７
つのチトクロムb5スーパーファミリー不変残基と、HORP−5のV43及びY44、N45、
T47、W49、D67、T69、L89、G92に位置する９つのチトクロムb5スーパーファミリ
ー保存残基とを共に有する。HORP−5とヒマワリチトクロムｂ５／不飽和化酵素
融合タンパク質は、HORP−5のI26及びL37、S50、I60に位置する４つのチトクロ
ムb5スーパーファミリー保存部位に類似のアミノ酸残基を有する。HORP−5とヒ
マワリチトクロムｂ５／不飽和化酵素融合タンパク質は、HORP−5のH180DYGH及
びH217FQHH、Q382IEHHに位置する３つの潜在不飽和化酵素ヒスチジンボックスを
共に有する。ノーザン分析により、様々なライブラリにおけるSEQ ID NO:11の発
現は、発現の少なくとも５９％が不死化即ち癌であり、少なくとも２６％が免疫
応答に関与し、少なくとも２３％が胎児細胞または胎児組織、あるいは増殖細胞
または増殖組織であることが分かった。注目すべきは、SEQ ID NO:11が男女の生
殖組織及び神経組織、心血管組織、内分泌組織で発現していることである。SEQ
ID NO:11の概ねヌクレオチド２１６から２３３までの断片が、例えばハイブリダ
イゼーションプローブとして有用である。As shown in FIGS. 1A and 1B, FIG. 1C, HORP-5 is chemically and structurally linked to the sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein (GI 1040729; SEQ ID NO: 13). Have similarity. In particular, the identity between HORP-5 and the sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein is 23%. HORP-5 and sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein are located at the cryptic heme binding site located at H53PGG of HORP-5 and at H53 and P54, G55, G56, G65, F72, H76 of HORP-5. 7
Two cytochrome b5 superfamily invariant residues and HORP-5 V43 and Y44, N45,
It has 9 conserved residues of the cytochrome b5 superfamily located at T47, W49, D67, T69, L89, G92. The HORP-5 and sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein has amino acid residues similar to the four cytochrome b5 superfamily conserved sites located at I26 and L37, S50, and I60 of HORP-5. The HORP-5 and sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein has both the three latent desaturase histidine boxes located at H180DYGH and H217FQHH, Q382IEHH of HORP-5. By Northern analysis, expression of SEQ ID NO: 11 in various libraries indicates that at least 59% of the expression is immortal or cancer, at least 26% is involved in the immune response, and at least 23% is fetal cells or tissue, Alternatively, it was found to be a proliferating cell or a proliferating tissue. Notably, SEQ ID NO: 11 is expressed in reproductive and nervous tissues, cardiovascular and endocrine tissues of males and females. SEQ
Fragments of approximately nucleotides 216 to 233 of ID NO: 11 are useful, for example, as hybridization probes.
【００７１】 図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、HORP−6は、ヒトチトクロムb561（G
I 1345640; SEQ ID NO:14）との化学的及び構造的類似性を有する。特に、HORP
−6とヒトチトクロムb561は３４％の同一性を有する。HORP−6とヒトチトクロム
b561の双方は、５つの潜在膜貫通領域を有する。HORP−6とヒトチトクロムb561
は、HORP−6のH86及びG138、F139、H159に位置する４つの潜在チトクロムb561ヘ
ム結合残基を共に有する。ノーザン分析によって、様々なライブラリにおけるSE
Q ID NO:12の発現は、発現の少なくとも４８％が不死化即ち癌であり、少なくと
も２３％が免疫応答に関与し、少なくとも１２％が胎児組織または増殖細胞であ
ることが分かった。注目すべきは、SEQ ID NO:12が男女の生殖組織及び胃腸組織
、心血管組織、神経組織、内分泌組織で発現していることである。SEQ ID NO:12
の概ねヌクレオチド３３２から３４９ままでの断片が、例えばハイブリダイゼー
ションプローブとして有用である。As shown in FIG. 2A and FIG. 2B, HORP-6 is derived from human cytochrome b561 (G
I 1345640; SEQ ID NO: 14) with chemical and structural similarities. In particular, HORP
-6 and human cytochrome b561 have 34% identity. HORP-6 and human cytochrome
Both of b561 have five potential transmembrane regions. HORP-6 and human cytochrome b561
Has both cryptic cytochrome b561 heme binding residues located at H86 and G138, F139, H159 of HORP-6. SE in various libraries by Northern analysis
Expression of QID NO: 12 was found to be at least 48% of the expression immortal or cancer, at least 23% involved in the immune response, and at least 12% to fetal tissue or proliferating cells. Notably, SEQ ID NO: 12 is expressed in reproductive and gastrointestinal, cardiovascular, nervous, and endocrine tissues of males and females. SEQ ID NO: 12
Fragments of about 332 to 349 are useful, for example, as hybridization probes.
【００７２】 本発明はまた、HORPの変異体を含む。HORPの変異体は、HORPのアミノ酸配列と
好ましくは約８０％以上の配列同一性、更に好ましくは約９０％以上の配列同一
性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有し、HORPの機能的特性或いは
構造的特性のうちの少なくとも１つを含む。The present invention also includes variants of HORP. A variant of HORP preferably has at least about 80% sequence identity, more preferably at least about 90% sequence identity, most preferably at least about 95% sequence identity with the HORP amino acid sequence, At least one of the functional characteristics or the structural characteristics.
【００７３】 本発明はまた、HORPをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例にお
いて、本発明は、HORPをコードするSEQ ID NO:7−12からなる一群から選択され
た配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。The present invention also includes polynucleotides that encode HORP. In certain embodiments, the invention includes a polynucleotide sequence having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-12 encoding HORP.
【００７４】 本発明はまた、HORPをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはHORPをコー
ドするポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性、更に
好ましくは８５％以上のポリヌクレオチド配列同一性、最も好ましくは９５％以
上のポリヌクレオチド配列同一性を有する。上記した各ポリヌクレオチド変異配
列のすべてが、HORPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ
酸配列をコードする。The present invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding HORP. In particular, such a variant of the polynucleotide sequence preferably has a polynucleotide sequence identity of at least 70%, more preferably at least 85% polynucleotide identity with the polynucleotide sequence encoding HORP, most preferably Have 95% or more polynucleotide sequence identity. Each of the above-described polynucleotide variants encodes an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of HORP.
【００７５】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るHORPをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のHORPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。The various polynucleotide sequences encoding HORP that can be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known, naturally occurring genes. One skilled in the art will understand. Thus, the present invention may include all possible polynucleotide sequence variations that may be made by selection of combinations based on possible codon choices. These combinations are made based on the standard triplet genetic code as applied to the polynucleotide sequence of naturally occurring HORP, and all variations are considered to be expressly disclosed.
【００７６】 HORPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された厳
密な条件の下で、自然発生のHORPのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが
望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用
を有するHORP又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有
益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを
選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高め
ることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、HORP及びその誘
導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ
転写物を作ることにある。It is desirable that the nucleotide sequence encoding HORP and its mutant sequences be capable of hybridizing to the nucleotides of naturally occurring HORP under suitably selected stringent conditions, but include non-naturally occurring codons. It may be beneficial to create nucleotide sequences encoding HORP or derivatives thereof having substantially different codon usage, such as. Codons can be selected based on the frequency with which particular codons are utilized by the host to increase the rate at which expression of the peptide occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding HORP and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that RNA with favorable properties, such as a longer half-life, than transcripts made from naturally occurring sequences.
To make a transcript.
【００７７】 本発明はまた、HORP及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片
を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分
野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何
れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、HORPまたはその任意の断
片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。The present invention also includes generating DNA sequences encoding HORP and its derivatives, or fragments thereof, entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence can be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to introduce mutations into the sequence encoding HORP or any fragment thereof.
【００７８】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:7−12またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチ
ド配列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzy
mol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.
を参照)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム
と約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満
の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好まし
くは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウ
ムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低い
ハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは
５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーション
になる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７
℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメ
ーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には周
知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えること
ができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７
５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで
行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと
５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１０
０μｇ／ｍｌの変性サケ***ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例で
は、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナト
リウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ
で行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。The invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing to the claimed polynucleotide sequences under various stringency conditions. For more information,
Polynucleotide sequences capable of hybridizing to the described SEQ ID NOs: 7-12 or fragments thereof are included. (E.g., Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzy
mol. 152: 399-407; and Kimmel.AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511.
See). For example, the exact salt concentration is usually less than about 750 mM sodium chloride and less than about 75 mM trisodium citrate, preferably less than about 500 mM sodium chloride and less than about 50 mM trisodium citrate, most preferably. Is less than about 250 mM sodium chloride and less than about 25 mM trisodium citrate. For example, the absence of an organic solvent such as formamide results in less stringent hybridization, while the use of about 35% or more formamide, more preferably 50% or more formamide, results in more stringent hybridization. Strict temperature conditions are usually about 30 ° C. or higher, and more preferably about 37 ° C.
° C or higher, most preferably about 42 ° C or higher. Other parameters that can be changed include hybridization time, sodium dodecyl sulfate (SDS)
And the presence or absence of carrier DNA, and are well known to those skilled in the art. By combining various necessary conditions, the degree of strictness can be changed. In a preferred embodiment, the hybridization is performed at a temperature of
Perform with 50 mM sodium chloride and 75 mM trisodium citrate, 1% SDS. In a more preferred embodiment, at a temperature of 37 ° C., 500 mM sodium chloride and 50 mM trisodium citrate, 1% SDS, 35% formamide, 10%
Performed with 0 μg / ml denatured salmon sperm DNA (ssDNA). In the most preferred embodiment, at a temperature of 42 ° C., 250 mM sodium chloride and 25 mM trisodium citrate, 1% SDS, 50% formamide, 200 μg / ml ssDNA
Do with. Useful alterations of these conditions will be apparent to those skilled in the art.
【００７９】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗
浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度
を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例
えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。
洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２
℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過
程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が
４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０
．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で
、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％Ｓ
ＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであ
る。The washing process after hybridization also has varying degrees of stringency. The exact conditions for washing are determined by salt concentration and temperature. As described above, the stringency of washing can be increased by lowering the salt concentration or raising the temperature. For example, the stringent conditions for the salt concentration during the washing step are preferably less than about 30 mM sodium chloride and less than about 3 mM trisodium citrate, more preferably about 15 mM.
Less than mM mM sodium chloride and less than about 1.5 mM trisodium citrate.
Strict conditions for the temperature of the washing process are usually about 25 ° C. or higher, preferably about 42 ° C.
° C or higher, more preferably about 68 ° C or higher. In a preferred embodiment, the washing step is performed at a temperature of 25 ° C. with 30 mM sodium chloride and 3 mM trisodium citrate, 0.1% SDS. In a more preferred embodiment, the washing process is carried out at a temperature of 42 ° C. with 15 mM sodium chloride and 1.5 mM trisodium citrate, 0 mM
. Performed with 1% SDS. In the most preferred embodiment, the washing process is performed at a temperature of 68 ° C. with 15 mM sodium chloride and 1.5 mM trisodium citrate, 0.1% S
Performed in DS. Further modifications of these conditions will be apparent to those skilled in the art.
【００８０】 当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施
例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断
片であるSequenase（US Biochemical社, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Pe
rkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはELON
GASE増幅システム(GIBCO/BRL,Gaithersburg, MD)にみられるような校正エキソヌ
クレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。このプロセ
スは、HYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)、Ham
ilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC20
0；MJ Reserch, Watertown MA）並びにABI Catalyst８００（Perkin Elmer）な
どの装置を用いて自動化するのが好ましい。次に、ABI 373または377 DNAシーク
エンシングシステム(Perkin-Elmer)またはキャピラリー電気泳動法(Molecular D
ynamics)のどちらか１つを用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分
野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubei, 前出ch 7.7
; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, Ne
w York NY, pp. 856-853.を参照)。Any of the embodiments of the invention can be performed using DNA sequencing methods well known in the art. This method includes, for example, Sequenase (Klenow fragment of DNA polymerase I (US Biochemical, Cleveland OH)), Taq polymerase (Pe
rkin Elmer), thermostable T7 polymerase (Amersham, Chicago IL), or ELON
Enzymes such as the combination of a calibrated exonuclease and a polymerase, as found in the GASE amplification system (GIBCO / BRL, Gaithersburg, MD), are used. This process is based on the HYDRA microdispenser (Robbins Scientific, Sunnyvale CA)
ilton Micro Lab2200 (Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler (PTC20
0; MJ Research, Watertown MA) and ABI Catalyst 800 (Perkin Elmer). Next, use the ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Perkin-Elmer) or capillary electrophoresis (Molecular D
sequencing). The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (eg, Ausubei, supra, ch 7.7).
; Meyers, RA (1995) Molecular Biology and Biotechnology , Wiley VCH, Ne
w York NY, pp. 856-853.).
【００８１】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした
種々の方法を用いてHORPをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要
素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの
方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベ
クター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Sarkar, G. (19
93) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広
範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用い
る。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由
来する。（Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。キャプチャＰ
ＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に
隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Lagerstrom, M.他（1991）
PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限酵素による
消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組
換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を
用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)N
ucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー
、PromoterFinderTMライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である
（Clontech, Palo Alto CA）。この方法ではライブラリをスクリーニングする必
要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法
をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis s
oftware（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラム
などを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６
８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される。Using the partial nucleotide sequence, the nucleic acid sequence encoding HORP can be extended using a variety of PCR-based methods well known in the art to reduce the sequence upstream of promoters and regulatory elements. To detect. For example, one method utilizing restriction site PCR involves amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using common primers and nested primers. (For example, Sarkar, G. (19
93) PCR Methods Applic 2: 318-322). Another method using the inverse PCR method uses primers that amplify an unknown sequence from a circularized template that has been extended in a wide range of directions. This template is derived from a restriction fragment containing the known genomic locus and surrounding sequences. (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). Capture P
A third method using the CR method involves PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosomal DNA. (Eg, Lagerstrom, M. et al. (1991)
PCR Methods Applic 1: 111-119). In this method, it is possible to insert the recombinant double-stranded sequence into a region of unknown sequence before performing PCR using digestion and ligation with multiple restriction enzymes. It is also possible to obtain unknown sequences using other methods well known in the art. (E.g. Parker, JD et al. (1991) N
ucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Furthermore, the use of PCR, nested primers, and PromoterFinder ™ library enables walking in genomic DNA (Clontech, Palo Alto CA). This method eliminates the need to screen libraries and is useful for finding intron / exon junctions. For all PCR-based methods, the primers are commercially available OLIGO 4.06 Primer Analysis s
Using oftware (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program, the length is 22-30 nucleotides, the GC content is 50% or more, and about 6%.
It is designed to anneal to the mold at a temperature between 8C and 72C.
【００８２】 完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、大きなｃＤＮＡを含むように
サイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ラ
イブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有
する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用で
ある。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう
。When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries whose size has been selected to include large cDNAs. Furthermore, if the oligo d (T) library cannot produce full-length cDNA, a randomly primed library, often containing a sequence having the 5 'region of the gene, is useful. Genomic libraries may be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
【００８３】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光
色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能であ
る。出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer社のGenotyperT M 及びSequence NavigatorTM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローデ
ィングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ
制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在し
ない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。Sequencing or PC using a commercially available capillary electrophoresis system
Analysis or confirmation of the size of the nucleotide sequence of the R product is possible. Specifically, for capillary sequencing, a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye specific for four different nucleotides, and a CCD camera for detecting the emitted wavelength It is possible to use Output / light intensity is converted to electrical signal using appropriate software (e.g. Perkin Elmer Co. Genotyper T M and Sequence Navigator TM) of the process and electronic data display from loading of samples to computer analysis computer-controllable It is. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA that may be present in small amounts in a particular sample.
【００８４】 本発明の別の実施例では、HORPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にHORP、その断片または機
能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的
に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ
得り、これらの配列をHORPのクローン化及び発現に利用可能である。In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding HORP, or a fragment thereof, is used in a recombinant DNA molecule to express HORP, a fragment, or a functional equivalent, in a suitable host cell. Is possible. Due to the inherent duplication of the genetic code, additional DNA sequences encoding substantially the same or functionally equivalent amino acid sequences can be made, and these sequences can be used for HORP cloning and expression.
【００８５】 種々の目的でHORPをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの
混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌク
レオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による
定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グ
リコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等
が可能である。The nucleotide sequences of the present invention can be recombined using methods generally known in the art to change the sequence encoding HORP for various purposes. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Recombination of nucleotide sequences is possible using mixing of DNA with random fragments or PCR reassembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, oligonucleotide-mediated directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splice variants, and the like.
【００８６】 別の実施例によれば、HORPをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Re
s Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてHORP自体また
はその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技
術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:202-
204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ（Per
kin Elmer）を用いて達成し得る。更にHORPのアミノ酸配列または任意のその一
部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク
質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプチド
を作ることが可能である。According to another embodiment, the sequence encoding HORP can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH et al. (1980).
) Nuc Acids Res Symp Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Re.
s See Symp. Ser. 225-232). Alternatively, HORP itself or a fragment thereof can be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using various solid-phase techniques (eg, Roberge, JY et al. (1995) Science 269: 202-).
204). In addition, automation of synthesis can be performed, for example, using an ABI 431A peptide synthesizer (PerPerformance).
kin Elmer). Further, the amino acid sequence of HORP, or any portion thereof, may be altered by alterations during direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins or any portion thereof using chemical methods. It is possible to make a polypeptide.
【００８７】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei
n.s, Structures and Molecular Properties, WH Freeman and Co., New York,
NYを参照)。The peptide can be purified by high performance liquid chromatography (eg, Chiez, RM).
And FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (for example, Creighton. T. (1983) Protei
ns, Structures and Molecular Properties , WH Freeman and Co., New York,
NY).
【００８８】 生物学的に活性のHORPを発現させるために、HORPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含
む。これらの要素には、ベクター及びHORPをコードするポリヌクレオチド配列に
おけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻
訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様
々である。特定の開始シグナルによって、HORPをコードする配列のより効果的な
翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン
及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。HORPをコードする配列及びその
開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる
転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、
コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければ
ならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから
得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含
めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (19
94) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.を参照)。To express a biologically active HORP, the nucleotide sequence encoding HORP or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the necessary elements for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding HORP. Such elements vary in their length and specificities. With certain initiation signals, it is possible to achieve more efficient translation of the sequence encoding HORP. Such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding HORP, its initiation codon and upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be necessary. However,
If only the coding sequence or its fragment is inserted, the in-frame AT
Exogenous translational control signals, including the G initiation codon, must be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be obtained from a variety of sources, both natural and synthetic. Increasing the efficiency of expression can be achieved by including enhancers suitable for the particular host cell line used. (For example, Scharf, D. et al. (19
94) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162.).
【００８９】 当業者に周知の方法を用いて、HORPをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in
vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる
。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratom Manua
l, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及
び Ausubel, F.M. 他. (1995, 及び周期的な追加) Current Protocols irt Mole
cular Biology, John Wiley & Sons, New York,NY. ch. 9章及び13章、16章を参
照)。Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to create an expression vector containing a sequence encoding HORP and suitable transcription and translation control elements. These methods include in
It includes in vitro recombinant DNA technology, synthetic technology, and in vivo genetic recombination technology. (For example, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratom Manua
l , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; and Ausubel, FM et al. (1995, and periodic additions) Current Protocols irt Mole
cular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY. See ch. 9 and 13, 16).
【００９０】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、HORPをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌な
どの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベ
クター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベ
クター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プ
ラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明
は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。A variety of expression vector / host systems can be used to retain and express HORP encoding sequences. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with a recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vector, yeast transformed with a yeast expression vector, and viral expression vectors. (E.g., baculovirus) -infected insect cell lines and plants transformed with a viral expression vector (e.g., cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a bacterial expression vector (e.g., Ti or pBR322 plasmid). Cell lines and animal cell lines are included. The present invention is not limited by the host cell used.
【００９１】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、HORPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、HORPを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、Bluescript? (Stratagene)またはpSportlTM plasmid (GIBCO BRL)な
どの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニ
ング部位にＨＬＯＲをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破
壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニン
グ法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列
のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一
本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば、Van Hee
ke. G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を参照)。例
えば、抗体の産生のためなどに多量のHORPが必要な場合は、HORPの発現をハイレ
ベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５また
はＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。[0091] In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors are available depending on the use for which the polynucleotide sequence encoding HORP will be used. For example, routine cloning, subcloning,
For growth, a multifunctional E. coli vector such as Bluescript ™ (Stratagene) or pSportl ™ plasmid (GIBCO BRL) can be used. Ligation of the sequence encoding HLOR into multiple cloning sites of the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. Furthermore, using these vectors, it is possible to transcribe cloned sequences in vitro , dideoxin screening, rescue single stranded by helper phage, and create nested deletions. (For example, Van Hee
ke. G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.). For example, when a large amount of HORP is required, such as for the production of an antibody, a vector that induces HORP expression at a high level can be used. For example, vectors containing a T5 or T7 bacteriophage promoter that strongly induces expression can be used.
【００９２】 HORPの発現に酵母の発現系の使用が可能である。酵母菌サッカロミセス−セレ
ビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨなどの構成型或いは誘導
型のプロモーターを含む多種のベクターが使用可能である。更に、このようなベ
クターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安
定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、上記のAus
ubel.; 及び Grant 他 (1987) Methods Enzymol.153:51−794: Scorer. C. A.
他 (1994) Bio/Technology 12:181-184.を参照) 植物系もHORPの発現に使用可能である。HORPをコードする配列の転写は、例え
ば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーター
が単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来の
オメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮ
Ａ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中
に導入可能である。（例えば、Hobbs, S.又はMurry, L.E. in McGraw Hill Year
book of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）
。[0092] A yeast expression system can be used for the expression of HORP. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, various types of vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase, and PGH can be used. In addition, such vectors induce either the secretion or retention of the expressed protein in cells, incorporating foreign sequences into the host genome for stable growth. (For example, Aus above
ubel .; and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 51-794: Scorer. CA
Et al. (1994) Bio / Technology 12: 181-184.) Plant systems can also be used to express HORP. Transcription of the HORP-encoding sequence can be performed, for example, by using a virus promoter such as the 35S and 19S promoters derived from CaMV alone or an omega leader sequence derived from TMV (Takamatsu, N. et al. (1987) EMBO J 6: 307-311). Is promoted in combination with. These products are directly DN
It can be introduced into plant cells by A-transformation or transfection via a pathogen. (Eg, Hobbs, S. or Murry, LE in McGraw Hill Year
book of Science and Technology (1992) McGraw Hill NY, pp.191-196)
.
【００９３】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にHORPをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にHORPを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用い
ることが可能である。[0093] In mammalian cells, a variety of virus-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding HORP may be ligated to an adenovirus transcript / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion of the viral genome into a non-essential E1 or E3 region makes it possible to obtain a live virus expressing HORP in infected host cells (Logan, J.
And Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. To express proteins at high levels, vectors based on SV40 or EBV can be used.
【００９４】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０Ｍｂ
のＨＡＣｓを作製し、従来の方法（リボソーム、ポリカチオンアミノポリマー、
またはベシクル）で供給する。Human artificial chromosomes (HACs) can be used to supply fragments of DNA that are expressed on a plasmid and larger than those contained therein. About 6kb-10Mb for treatment
HACs were prepared using conventional methods (ribosomes, polycation amino polymers,
Or vesicles).
【００９５】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるHORPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、HORPをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。For long-term production of mammalian-based recombinant proteins, stable expression of HORP in cell lines is desirable. For example, an expression vector can be used to transform a HORP encoding sequence into a cell line. Such expression vectors contain replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells are allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker confers resistance to the selective mediator, and its presence allows the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
【００９６】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk-又はaprt-細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (19
77) Cell 11:223-232; and Lowy. I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14; 及び前出のMurryを参照)。さらに選択に
利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhi
sDが文献に記載されている（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Na
tl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）(Clontech. Palo Alto. CA)、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ
，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これ
らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参
照）。[0096] Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines. The selection systems include, but are not limited to, include herpes simplex virus thymidine kinase gene and adenine phosphoribosyltransferase genes, respectively tk - or aprt - used in the cell. (For example, Wigler, M. et al. (19
77) Cell 11: 223-232; and Lowy. I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as a basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, als or pat confers resistance to chlorsulfuron, phosphinotricin acetyltransferase (eg, , Wigl
er, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-3570; Colbere-Garapin,
F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14; and Murry, supra). In addition, genes available for selection, such as trpB and hi, which alter what the cell needs for metabolism
sD is described in the literature (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Na
tl. Acad. Sci. 85: 8047-51). Anitocyanin, green fluorescent protein (
GFP) (Clontech. Palo Alto. CA), β-glucuronidase and its substrate GUS
Luciferase and its substrate luciferin and the like.
Green fluorescent protein (GFP) (Clontech, Palo Alto, CA) can also be used. These markers can be used to not only identify transformants, but also quantify transient or stable protein expression resulting from a particular vector system (eg, Rhodes, CA et al. (1995) Methods). Mol. Biol. 55: 121-791).
【００９７】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、HORPをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、HORPをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がHORPをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。Even if the presence / absence of the expression of a marker gene indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding HORP is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding HORP can be identified by a lack of marker gene function.
Alternatively, the marker gene can be aligned with the sequence encoding HORP under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
【００９８】 一般に、HORPをコードする核酸配列を含み、HORPを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核
酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或い
はチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイ
が含まれるが、これらに限定されるものではない。In general, host cells that contain a nucleic acid sequence encoding HORP and that express HORP can be identified using various methods well known to those skilled in the art. These methods include:
Protein biology or immunological, including DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR, membrane-based, solution-based, or chip-based techniques for the detection and / or quantification of nucleic acids or proteins. Assays, including but not limited to.
【００９９】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるHO
RPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。HORP上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratony Manual. APS Press. St Paul
. MN, Section IV; Coligan. J. E. 他 (1997 and periodic supplements) Curr
ent Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscien
ce, New York. NY: 及び Maddox. D.E. 他 (1983) J. Exp. Med. 158:1211-1216
)。HO using either specific polyclonal or monoclonal antibodies
Immunological methods for detecting and measuring RP expression are well known in the art. Such techniques include immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIAs), and fluorescence activated cell sorters (FACS) linked to enzymes. Two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on HORP
Is preferred, but competitive binding assays can also be used. These and other assays are well known in the art. (For example, Hampton. R
. (1990) Serological Methods, a Laboratony Manual. APS Press. St Paul.
. MN, Section IV; Coligan. JE et al. (1997 and periodic supplements) Curr.
ent Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscien
ce, New York. NY: and Maddox. DE et al. (1983) J. Exp. Med. 158: 1211-1216.
).
【０１００】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。HORPをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーショ
ン、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる
。別法として、HORPをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプロー
ブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では
周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６な
どの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in
vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例え
ば、Pharmacia＆Upjohn（Kalamazoo, MI）及びPromega（Madison WI）、U.S. Bi
ochemical Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて行うことがで
きる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質
、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化
学発光剤、色素産生剤などが含まれる。Various labeling and conjugation methods are well known to those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to a polynucleotide encoding HORP include oligo-labeling, nick translation, end-labeling, or labeled nucleotides. The PCR amplification used is included. Alternatively, the sequence encoding HORP, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for generating an mRNA probe. Such vectors, which are well known in the art and are commercially available, can be prepared by adding a suitable RNA polymerase such as T7, T3, or SP6 and labeled nucleotides in
It can be used for the synthesis of RNA probes in vitro . These methods are described, for example, in Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI) and Promega (Madison WI), US Bi
It can be performed using various kits commercially available from ochemical Corp (Cleveland OH). Suitable reporter molecules or labels that can be used for easy detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
【０１０１】 HORPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の出現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞で作製されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される
その配列及び／またはそのベクターによる。HORPをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を通ってHORPの分泌を誘導す
るシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。別の
作製物を用いて、HORPをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促すポリ
ペプチド領域をコードするヌクレオチド配列と結合させることも可能である。こ
のような精製を促す領域には、固定された金属上での精製を可能とするヒスチジ
ントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロ
ブリンでの精製を可能とするタンパク質Ａ領域、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ
ー精製システム（Immunex Corp., Seattle WA）に用いられる領域が含まれるが
、これらに限定されるものではない。精製領域と配列をコードするHORPとの間の
XA因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego, CA)に特異的なものな
どの切断可能なリンカー配列を含むものを用いて、精製が促進され得る。このよ
うな発現ベクターの１つは、HORPと、チオレドキシン或いはエンテロキナーゼ切
断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含む融合タンパク質を
発現させる。ヒスチジン残基は、固定された金属イオンアフィニティクロマトグ
ラフィー上で精製を促進する(IMAC)（例えば、Porath, J他（1992）; Protein E
xp. Purif. 3:263-281を参照）。エンテロキナーゼ切断部位が、融合タンパク質
からHORPを精製する手段を提供する(例えば、Kroll, D.J.他(1993); DNA Cell B
iol. 12:441-453を参照)。[0101] Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding HORP are cultured under conditions suitable for the appearance and recovery of the protein from cell culture. Whether a protein produced in a transformed cell is secreted or remains in the cell depends on the sequence used and / or the vector. One of skill in the art will appreciate that expression vectors containing a polynucleotide encoding HORP can be designed to include a signal sequence that directs secretion of HORP through prokaryotic and eukaryotic cell membranes. Other constructs can be used to join a sequence encoding HORP to a nucleotide sequence encoding a polypeptide region that facilitates purification of a soluble protein. Areas that facilitate such purification include metal chelating peptides such as the histidine tryptophan module that allow for purification on immobilized metals, protein A regions that allow for purification with immobilized immunoglobulins, and FLAGS extensions / Includes, but is not limited to, regions used in affinity purification systems (Immunex Corp., Seattle WA). Between the purified region and the HORP encoding sequence
Purification can be facilitated with those containing a cleavable linker sequence, such as those specific for factor XA or enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA). One such expression vector expresses a fusion protein containing HORP and a nucleic acid encoding the six histidine residues preceding the thioredoxin or enterokinase cleavage site. Histidine residues facilitate purification on immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) (eg, Porath, J et al. (1992); Protein E
xp. Purif. 3: 263-281). Enterokinase cleavage sites provide a means to purify HORP from fusion proteins (e.g., Kroll, DJ et al. (1993); DNA Cell B
iol. 12: 441-453).
【０１０２】 更に、挿入した配列の発現調節能力またはタンパク質の発現を所望の形にプロ
セシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの
修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（li
pidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タ
ンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タン
パク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活
性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ異なった宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ
ロセシングを確実にするために選択される。In addition, a host cell strain may be selected for its ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expression of the protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation (li
pidation), and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" form of the protein can be used to identify the target protein, folding and / or activity. Different host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38) with specific cellular devices and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATC).
C; Bethesda, MD) and selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
【０１０３】 本発明の別の実施例では、HORPをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラHO
RPタンパク質が、HORPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク
質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢ
Ｐ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、
これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈ
ｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物
（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族
の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素
（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクロ
ナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製
ができる。また、HORPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタン
パク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、HORPが精
製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Au
subel. F. M. 他による (1995 and periodic supplements) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Ne,,v York. NY. ch 10.に記載さ
れている。様々な市販されているキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精
製を促進することができる。In another embodiment of the present invention, a natural or altered or recombinant nucleic acid sequence encoding HORP is linked to a heterologous sequence which results in the translation of a fusion protein in any of the host systems described above. For example, a chimeric HO containing a heterologous moiety that can be recognized by a commercially available antibody
RP proteins can facilitate screening of peptide libraries for inhibitors of HORP activity. Further, the heterologous protein portion and the heterologous peptide portion are
Commercially available affinity substrates can be used to facilitate purification of the fusion protein. Such moieties include glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CB
P), 6-His, FLAG, c-mc, hemagglutinin (HA),
It is not limited to these. GST and MBP, Trx, CBP, 6-H
Is allows purification of homologous fusion proteins with immobilized glutathione, maltose, phenylarsine oxide, calmodulin, and metal chelating resins, respectively. FLAG, c-mc, and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of the fusion protein using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, if the fusion protein is engineered so that the fusion protein contains a proteolytic cleavage site between the sequence encoding HORP and the heterologous protein sequence, HORP may be cleaved from the heterologous portion after purification. The method of expression and purification of the fusion protein is Au
subel. FM et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols
Ne Molecular Biology , John Wiley & Sons. Ne, v York. NY. ch 10. Various commercially available kits can be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
【０１０４】 本発明の別の実施例では、ＴＮＴTMウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系(Promega. Madison. WI)を用いてin vitroで放射能標識したHORPの合成
が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に
結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。転写は、好まし
くは３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こ
る。In another embodiment of the invention, the synthesis of radiolabeled HORP in vitro using the TNT ™ rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extract system (Promega. Madison. WI) is possible. These systems link transcription and translation of sequences encoding proteins operably linked to the T7 or T3, SP6 promoter. Transcription occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor, preferably 35S methionine.
【０１０５】 HORPの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えばApplied Bi
osystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能で
ある。HORPの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成
する。Fragments of HORP can be made by direct peptide synthesis using solid phase technology as well as recombinant products (see, eg, Creighton, pp. 55-60, supra). Protein synthesis can be performed manually or automatically. Automatic synthesis, for example, Applied Bi
It can be performed using osystem 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). The various fragments of HORP are synthesized separately and then ligated to produce the full length molecule.
【０１０６】 治療 HORPと酸還元酵素の配列及びモチーフの特徴との間に化学的及び構造的類似性
が存在する。更に、HORPが、癌び炎症、免疫、胎児または増殖、生殖、胃腸、心
血管、内分泌、神経のそれぞれの組織に発現する。従って、HORPが、神経疾患及
び自己免疫／炎症性疾患、生殖障害、細胞増殖異常、内分泌障害、小胞輸送障害
、平滑筋異常において一定の役割を果たしていると考えられる。There are chemical and structural similarities between therapeutic HORP and the characteristics of the acid reductase sequences and motifs. In addition, HORP is expressed in cancer, inflammation, immunity, fetus or proliferation, reproduction, gastrointestinal, cardiovascular, endocrine, and nerve tissues. Therefore, HORP appears to play a role in neurological and autoimmune / inflammatory diseases, reproductive disorders, abnormal cell proliferation, endocrine disorders, vesicle transport disorders, and smooth muscle abnormalities.
【０１０７】 従って、一実施例において、HORPの発現または活性の低下に関連した疾患の治
療または予防のために、そのような患者にHORPのアンタゴニストを投与すること
が可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、神経障害が含
まれ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー
病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及び他の錐体外路障害、
筋萎縮性側索硬化症及び他の運動ニューロン疾患、進行性神経性筋萎縮症、色素
性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイル
ス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、
脊髄炎及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェ
ルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群
を含むプリオン病（prion disease）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病
及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal
hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び
他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（neuroskeletal disorder）、自律神
経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、皮膚筋
炎及び多発性筋炎と、遺伝性の代謝性及び内分泌性、中毒性ミオパシーと、重症
筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、***病性精神障害と
、静座不能、健忘症、双極性障害、緊張病、鬱病、糖尿病性ニューロパシー、ダ
ウン症候群、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、妄想性精神病、帯状疱疹
後神経痛、トゥーレット病が含まれ、更に、自己免疫／炎症性疾患が含まれ、そ
の中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症
候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動
脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分
泌障害−カンジダ−外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎
、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶
発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏
性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨
粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強
皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス
、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、
血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感
染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、更に、生殖障害が含まれ、そ
の中には、プロラクチンの産生異常と、卵管病及び***異常、子宮内膜症、発情
期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜癌及
び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形発生を含む不妊症と、乳
癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症と、***形成異常、生理学上の***異常、精巣癌
、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男
性***及び女性化***癌とが含まれ、更に、細胞増殖異常が含まれ、その中には
、日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、
混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真
性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫
、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、
頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ
、更に内分泌疾患も含まれ、その中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂
体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症
などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下及びシーハン症
候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レトラ‐シヴ
ェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む下垂体低下に関
連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）
分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した
障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウィルス感染性亜急
性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下
症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘
液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含む甲状腺機能亢
進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及
びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、
アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病
、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、副腎機能不全な
どの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不妊症、子宮内膜
症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激
ホルモン不全（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、乳汁漏出症、半
陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過
形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢
進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症
候群、女性***症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とが含まれ、
更に小胞輸送障害が含まれ、その中には嚢胞性線維症、グルコース‐ガラクトー
ス吸収不全症候群、高コレステロール血症、糖尿病、尿崩症、高／低血糖症、グ
レーブス病、甲状腺腫、クッシング病、副腎機能不全と、潰瘍性大腸炎や胃潰瘍
、十二指腸潰瘍を含む胃腸疾患と、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む小
胞輸送障害に関連した別の症状と、枯草熱や喘息、じんま疹を含むアレルギーと
、自己免疫性溶血性貧血、増殖性糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重
症筋無力症、リウマチ様変形性関節症、硬皮、チェディアック‐東症候群、シェ
ーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、トキシックショック症候群、外傷性
組織損傷、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、蠕虫感染、原虫感染が含まれ、
更に平滑筋異常も含まれ、その中には口峡炎、アナフィラキシー、不整脈、喘息
、心血管ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、
褐色細胞腫と、心筋症及び脳症、癲癇、カーンズ‐セイヤ症候群、乳酸アシドー
シス、筋クローヌス性障害、眼筋麻痺を含む筋障害とが含まれるが、平滑筋には
血管、胃腸管、心臓、子宮などが含まれるがこれらに限定するものではない。Thus, in one embodiment, it is possible to administer an antagonist of HORP to such patients for the treatment or prevention of a disease associated with reduced HORP expression or activity. Examples of such diseases include, but are not limited to, neuropathy, including epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, brain tumors, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's Disease and other extrapyramidal disorders,
Amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron diseases, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meninges Inflammation, brain abscess, subdural pyometra, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis,
Myelitis and radiculitis, viral central nervous system disease, prion disease including Kuru and Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann syndrome, Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, fatal familial insomnia, neurology Systemic nutritional and metabolic diseases, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastoma (cerebelloretinal)
hemangioblastomatosis), trigeminal neurovascular syndrome, central nervous system mental retardation and other developmental disorders, cerebral palsy, neuroskeletal disorder, autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, spinal cord diseases, muscular dystrophy and other nerves Myopathy, dermatomyositis and polymyositis, hereditary metabolic and endocrine, toxic myopathy, myasthenia gravis, periodic limb paralysis, mood and anxiety mental disorders, schizophrenic mental disorders , Restlessness, amnesia, bipolar disorder, catatonia, depression, diabetic neuropathy, Down syndrome, extrapyramidal terminal defect syndrome, dystonia, paranoid psychosis, postherpetic neuralgia, Tourette's disease, and more And autoimmune / inflammatory diseases, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome, allergies, ankylosing spondylitis, Myloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine disorders-Candida-ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, Contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, accidental lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves Disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, lighter Syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werna Syndrome, cancer complications,
Hemodialysis, extracorporeal circulation and viral and bacterial infections, fungal infections, parasite infections, protozoal infections, helminth infections, trauma, and also reproductive disorders, including , Abnormal production of prolactin, fallopian tube disease and ovulation abnormality, endometriosis, abnormal estrus, menstrual cycle abnormality, polycystic ovary syndrome, ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial and ovarian cancer, uterine fibroids, autoimmunity Infertility, including abnormalities, ectopic pregnancy, teratogenesis, and breast cancer, fibrocystic mastopathy, breast milk and spermatogenesis, physiological sperm abnormalities, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, It includes prostatitis, Peyronie's disease, impotence, male breast and gynecomastia, and also includes abnormal cell proliferation, including actinic keratosis and atherosclerosis, atherosclerosis, synovial fluid. Folliculitis, cirrhosis, hepatitis,
Mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and Teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast,
Includes cervical, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterine cancer, and more Also includes endocrine disorders, including thalamus arising from primary brain tumors and adenomas, gestational infarction, pituitary resection, aneurysms, vascular malformations, thrombosis, infections, immune abnormalities, and complications from head trauma. Lower and pituitary disorders associated with hypogonadism and hypopituitarism, including Sheehan's syndrome, diabetes insipidus, Karman's disease, Hand-Schuller-Christian disease, Letra-Sybe disease, sarcoidosis, empty cella syndrome, and dwarfism Antidiuretic hormone (ADH), which is prone to be caused by benign actinic disease
Disorders associated with secretory syndrome (SIADH) and hyperpituitary gland including acromegaly, giantosis and goiter and myxedema, bacterial infectious acute thyroiditis, viral infectious subacute thyroiditis, autoimmune thyroiditis ( Disorders associated with hypothyroidism, including Hashimoto's disease) and cretin disease, as well as thyrotoxicosis and its various forms, Graves' disease, anterior tibial myxedema, toxic multinodular goiter, thyroid cancer, and Plummer's disease. Hyperthyroidism including, hyperparathyroidism including Conn's disease (chronic hypercalemia), pancreatic diseases such as type I and type II diabetes and complications, carcinomas and adenomas of hyperplasia and adrenal cortex,
Adrenal disorders such as hypertension, amyloidosis, hypokalemia, Cushing's disease, Riddle syndrome, Arnold-Healy-Gordon syndrome, pheochromocytoma, adrenal insufficiency associated with alkalosis, and abnormal prolactin production and infertility in women , Endometriosis, menstrual cycle perturbation, polycystic ovarian disease, hyperprolactinemia, selective gonadotropin deficiency, amenorrhea, milk leakage, semi-yin yang, hirsutism and virilization, Breast cancer, postmenopausal osteoporosis, male Leydig cell hyperplasia, male climacteric, germ cell aplasia, hypersexual function associated with Leydig cell tumor, androgen resistance, 5α-reductase syndrome associated with lack of androgen receptor , And diseases associated with gonadal steroid hormones, such as female breast disease,
Also included are vesicular transport disorders, including cystic fibrosis, glucose-galactose malabsorption syndrome, hypercholesterolemia, diabetes, diabetes insipidus, hyper / hypoglycemia, Graves' disease, goiter, Cushing's disease. , Adrenal insufficiency, gastrointestinal disorders including ulcerative colitis, gastric ulcer, and duodenal ulcer, and other symptoms associated with vesicle transport disorders including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), hay fever, asthma, and hives Allergies including rash, autoimmune hemolytic anemia, proliferative glomerulonephritis, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, rheumatoid osteoarthritis, scleroderma, Chediak-Higashi syndrome, Includes Sjogren's syndrome, systemic lupus erythematosus, toxic shock syndrome, traumatic tissue injury, viral infection, bacterial infection, fungal infection, helminth infection, protozoan infection,
It also includes smooth muscle abnormalities, including stomatitis, anaphylaxis, arrhythmias, asthma, cardiovascular shock, Cushing's syndrome, hypertension, hypoglycemia, myocardial infarction, migraine,
Pheochromocytomas and myopathy, including cardiomyopathy and encephalopathy, epilepsy, Kearns-Sayre syndrome, lactic acidosis, myoclonic disorders, ophthalmoplegia, but smooth muscle includes blood vessels, gastrointestinal tract, heart, uterus And the like, but are not limited to these.
【０１０８】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHORPの発現
または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HORPまたはその断
片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。In another embodiment, HORP or a fragment or derivative thereof is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with reduced HORP expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. The resulting vector can be administered to a patient.
【０１０９】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHORPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製
されたHORPを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも
可能である。In yet another embodiment, substantially purified HORP is used to treat or prevent a disease associated with reduced HORP expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible to administer the containing pharmaceutical composition to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
【０１１０】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHORPの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、HORPの活性を
調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of HORP is used for the treatment or prevention of a disease associated with reduced HORP expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. It can also be administered to patients.
【０１１１】 更に別の実施例では、HORPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療や予
防のために、アンタゴニストを投与することが可能である。このような疾患は、
限定するものではないが上に列記した神経疾患及び自己免疫／炎症性疾患、生殖
障害、細胞増殖異常、内分泌障害、小胞輸送障害、平滑筋異常を含む。一実施態
様では、HORPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはHORP
を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として間接的に用い
られ得る。In yet another embodiment, an antagonist can be administered to treat or prevent a disease associated with increased HORP expression or activity. Such diseases are:
Includes, but is not limited to, the neurological and autoimmune / inflammatory diseases listed above, reproductive disorders, abnormal cell proliferation, endocrine disorders, vesicle transport disorders, and smooth muscle abnormalities listed above. In one embodiment, the antibody that specifically binds HORP is directly
Can be used indirectly as a target or delivery mechanism for delivering an agent to a cell or tissue that expresses.
【０１１２】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むHORPの発現
または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、HORPをコードする
ポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能で
ある。In another example, the complement of a polynucleotide encoding HORP for the treatment or prevention of a disease associated with increased HORP expression or activity, including but not limited to the diseases listed above. Can be administered to a patient.
【０１１３】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. One skilled in the art can select a suitable therapeutic agent to use in combination therapy according to conventional pharmaceutical principles. Combinations with therapeutic agents can have synergistic effects in the treatment or prevention of the various diseases listed above. Using this method, it is possible to achieve a medicinal effect with a small amount of each drug, and to reduce the possibility of a wide range of side effects.
【０１１４】 HORPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたHORPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてHORPと特異的に結合するものを同定が可能である。HORP
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメント
が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（
即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。An antagonist of HORP can be produced using methods common in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified HORP, or a therapeutic drug library can be screened to identify those that specifically bind to HORP. HORP
Can also be produced using methods common in the art. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain,
Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries are included. However, it is not limited to these. For treatment, neutralizing antibodies (
That is, those which inhibit the formation of a dimer) are particularly preferred.
【０１１５】 抗体の作製のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、HORPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium par
vumが特に好ましい。For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, were injected with HORP or any fragment, or oligopeptide thereof with immunogenic properties. Can be immunized with. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, surfactants such as keyhole limpet hemocyanin, and dinitrophenol. However, the present invention is not limited to these. Among adjuvants used for humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium par
vum is particularly preferred.
【０１１６】 HORPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望まし
いのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或い
はペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と
同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む。
HORPアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨ(キーホールリンペットヘモシニアン)など
の別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。The oligopeptide, peptide or fragment used to elicit antibodies against HORP preferably has an amino acid sequence of about 5 or more amino acids, more preferably about 10 or more amino acids. Desirably, these oligopeptides or peptides, or fragments thereof, are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein, and also include the entire amino acid sequence of small, naturally occurring molecules.
Short stretches of HORP amino acids can be fused to sequences of another protein, such as KLH (keyhole limpet hemocyanin), to produce antibodies against the chimeric molecule.
【０１１７】 HORPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler
, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. M
ethods 81.:31-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2
030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。[0117] Monoclonal antibodies to HORP can be made by continuous cell lines in culture using any technique that produces antibody molecules. These techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler
(1975) Nature 256: 495-497; Kozbor, D. et al. (1985) .J. Immunol. M
ethods 81.:31-42; Cote, RJ et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2.
030; Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).
【０１１８】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
HORP特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。In addition, techniques such as splicing a mouse antibody gene with a human antibody gene developed for the production of a “chimeric antibody” are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity. (For example, Morrison, SL et al. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger, MS et al. (1984) Nature 312: 604.
-608; Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452,454). Alternatively, applying the described techniques for the production of single chain antibodies using methods well known in the art,
Generate HORP-specific single-chain antibodies. Antibodies with related specificities but different idiotypic compositions can also be generated by chain mixing from random combinations of immunoglobulin libraries (eg, Burton DR (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88: 11120-3).
【０１１９】 抗体は、in vivoでのリンパ球集団の中の生成を誘発することによって、また
は免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、
高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、作製する
こともできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
3833-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。Antibodies can be raised in vivo by inducing production in lymphocyte populations, or by screening immunoglobulin libraries or as indicated in the literature.
It can also be made by screening a panel of highly specific binding reagents (eg, Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
【０１２０】 HORPに対する特異的な結合部位を含む抗体も作製することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）
２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成さ
れるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆ
ａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦ
ａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989)
Science 254:1275-1281を参照）。Antibodies containing specific binding sites for HORP can also be generated. For example,
Such fragments include the F (ab ') generated by pepsin digestion of the antibody molecule.
2 fragments and Fab fragments generated by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragment, including but not limited to. Alternatively, F
By creating an ab expression library, the desired specificity and monoclonal F
It enables rapid and easy identification of ab fragments (eg, Huse, WD et al. (1989)
Science 254: 1275-1281).
【０１２１】 種々のイムノアッセイでスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定
する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコ
ルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、HORPとその
特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性HORPエピトー
プに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベース
のイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することができる(M
addox、前出）。Screening with various immunoassays identifies antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding, using either polyclonal or monoclonal antibodies with sequestered specificity, or immunoradioactivity, are well known in the art. Typically, such immunoassays involve the measurement of complex modulation between HORP and its specific antibody. A two-site monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering HORP epitopes is preferred, but a competitive binding assay can also be used (M
addox, supra).
【０１２２】 本発明の別の実施例では、HORPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、HORPをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止する
のに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、HORPをコード
するポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって
、相補的分子または断片は、HORPの活性の調節、または遺伝子機能の調節のため
に使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまた
はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、HORPをコードする配列
の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である
。In another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding HORP, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In certain embodiments, if the complementary sequence of the polynucleotide encoding HORP is suitable for blocking transcription of mRNA, it can be used. In particular, cells can be transformed with sequences complementary to the polynucleotide encoding HORP. Thus, complementary molecules or fragments can be used to modulate the activity of HORP, or to regulate gene function. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the sequence encoding HORP, or from various locations along the coding region.
【０１２３】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてHORPをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。[0123] Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpes or vaccinia, or various bacterial plasmids can also be used to carry the nucleotide sequence to the target organ, tissue or cell population. Vectors expressing HORP and a nucleic acid sequence complementary to the encoding polynucleotide can be made using methods well known to those of skill in the art (see, for example, Sambrook et al., Supra, and Ausubel et al., Supra). .
【０１２４】 HORPをコードする遺伝子は、HORPをコードするポリヌクレオチド又はその断片
を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによ
って止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はア
ンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れられ
ない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損な
われるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一
ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに
長く持続し得る。The gene encoding HORP can be turned off by transforming a cell or tissue with an expression vector that expresses high levels of a polynucleotide encoding HORP or a fragment thereof. Such constructs can be used to introduce sense or antisense sequences that cannot be translated into cells. Such vectors, even when not incorporated into DNA, continue to transcribe mRNA molecules until their function is impaired by endogenous nucleases. Non-replicating vectors also maintain transient expression for over a month, and may last longer if suitable replication elements are part of the vector system.
【０１２５】 上記した通り、遺伝子の発現は、HORPをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、Ｐ
ＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開始
部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適であ
る場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。
三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結
合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用いる最
近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: H
uber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分
子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの
翻訳を阻止するように設計できる。As described above, gene expression is determined by the sequence complementary to the regulatory 5 ′ or regulatory region of the gene encoding HORP or an antisense molecule (DNA or RNA, P
NA) can be adjusted by designing. As is the case when oligonucleotides derived from the transcription initiation site, i.e. between -10 and +10 from the start site, are preferred, they can be blocked using "triple helix" and base-pairing techniques.
Triple helix structures are beneficial because they prevent the double helix from spreading sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules. Recent advances in therapy using triplex DNA have been described in the literature (eg, Gee, JE et al. (1994) In: H
uber, BE and BI Carr, Molecular and Immunologic Approaches , Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to prevent translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome.
【０１２６】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、HORPをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効
果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。[0126] Ribozymes, which are enzymatic RNA molecules, can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by nucleotide strand breaks. For example, a recombinant hammerhead ribozyme molecule that specifically and effectively catalyzes the cleavage of the nucleotide chain of the sequence encoding HORP is included.
【０１２７】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。A specific ribozyme cleavage site in any potential RNA target has the sequence G
It is initially identified by scanning target molecules for ribozyme cleavage sites, including UA, GUU, and GUC. Once identified, a short RN of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site
The A sequence can be evaluated for secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional. The suitability of a candidate target can also be assessed by using a ribonuclease protection assay to test the ease of hybridization with a complementary oligonucleotide.
【０１２８】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでHORPをコードするＤＮＡ
配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等
の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入
れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成
するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入すること
ができる。[0128] Complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made for synthesis of nucleic acid molecules using methods well known in the art. These methods include chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, the RNA molecule may be a DNA encoding HORP in vitro and in vivo.
Such DNA sequences, which can be generated by transcription of the sequence, can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter, such as T7 or SP6. Alternatively, those cDNA constructs that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into a cell line, cell, or tissue.
【０１２９】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めるこによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。Modification of an RNA molecule can increase intracellular stability and increase half-life. Possible modifications include the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' end of the molecule, or the use of phosphorothioate or 2'O methyl rather than a phosphodiesterase linkage in the backbone of the molecule. Are not limited to these. This concept inherent in the production of PNAs includes acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine that are not readily recognized by endogenous endonucleases, as well as Inosine, queosine, and wybutosine
Inclusion of non-conventional bases such as, for example, can be extended throughout these molecules.
【０１３０】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr
o、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。A number of methods for introducing vectors into cells or tissues are available, including in vivo , in vitr,
o and equally suitable for ex vivo use. In the case of ex vivo treatment, the vector is introduced into hepatocytes collected from a patient and cloned and propagated to return the same patient by autologous transplantation. Transfection, ribosome injection or delivery by polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (eg, Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462).
-66 :).
【０１３１】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。Any of the methods of treatment described above are applicable to all subjects in need of treatment, including, for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and most preferably humans.
【０１３２】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、HORP、HORPに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はHORPの
インヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類
以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。
このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが
含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又
はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。Another embodiment of the present invention relates to the administration of a medicament or sterile composition with a pharmaceutically acceptable carrier for all of the above-mentioned therapeutic effects. Such pharmaceutical compositions comprise HORP, antibodies to HORP, mimetics, agonists, antagonists, or inhibitors of HORP, and the like. The composition can be administered alone or in combination with one or more other agents, such as stabilizers, to a sterile, biocompatible pharmaceutical carrier.
Such pharmaceutical carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, glucose, water, and the like. The composition can be administered alone or with another drug, such as a drug or hormone.
【０１３３】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、もく膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。[0133] The pharmaceutical compositions used in the present invention can also be administered using any number of routes. This route includes oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, ectopic, sublingual Or rectum, but is not limited thereto.
【０１３４】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., E
aston, PA)に記載されている。In addition to the active ingredient, these pharmaceutical compositions also include suitable pharmaceutically acceptable excipients and excipients, which include excipients and adjuvants, that facilitate the conversion of the active compound into pharmaceutically acceptable agents. Carrier can be included. For detailed formulation and administration techniques, see the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., E
aston, PA).
【０１３５】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。Pharmaceutical compositions for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art at dosages suitable for oral administration. Such carriers enable the pharmaceutical composition to be consumed by the patient in tablets, pills, dragees, capsules,
It is formulated as a liquid, gel, syrup, mud, suspension.
【０１３６】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。Pharmaceutical preparations for oral use are prepared by mixing the active compound with a solid drug additive, treating the resulting granule mixture and (after grinding if desired) tablets or dragee cores. cores). Suitable excipients include sugars including lactose, sucrose, mannitol, or sorbitol, starch from corn, wheat, rice, potato, or other plants, cellulose such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, or sodium carboxymethylcellulose; Carbohydrate or protein excipients such as gums, including gum arabic and tragacanth, and proteins such as gelatin and collagen.
If desired, disintegrating or solubilizing agents may be added, such as, for example, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, tangerine, alginic acid, or a salt thereof, sodium alginate.
【０１３７】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。[0137] Dragee cores are used with suitable coatings, such as concentrated sugar solvents. Such concentrated sugar solvents can include gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopol gel, polyethylene glycol, and / or titanium dioxide, lacquer solvents, and suitable organic or mixed solvents. Dyestuffs or pigments are added to the tablets or dragees for product identification or to indicate the amount of active compound, ie, dosage.
【０１３８】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。Pharmaceutical preparations for oral use include push-fit capsules made of gelatin, as well as encapsulated capsules made of gelatin with a coating, such as glycerol or sorbitol. Push-fit capsules contain the active ingredient in admixture with excipients and binders such as lactose or starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, and stabilizers if desired. In soft capsules, the active compound is treated with or without a stabilizer.
It can be dissolved or suspended in a suitable solution such as a fatty oil, a solution, or a polyethylene glycol solution.
【０１３９】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。Pharmaceutical agents suitable for parenteral administration are formulated in aqueous solutions, with physiologically compatible buffers such as Hanks's solution, Ringer's solution, physiological saline buffer being preferred. Aqueous injection suspensions can contain substances that increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. Additionally, suspensions of the active compounds may be formulated as suitable oily injection suspensions. Suitable hydrophilic solutions or vehicles include fatty oils such as sesame oil, and synthetic fatty acids such as ethyl oleate, triglycerides or ribosomes. Non-lipid polycationic amino polymers are used for delivery purposes. Optionally, the suspension may contain suitable stabilizers or agents that increase the solubility of the compounds to allow for concentrated solutions.
【０１４０】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。For topical or nasal administration, penetrants appropriate to the particular barrier to be used are used in the formulation. Such penetrants are well-known to those skilled in the art.
【０１４１】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared using methods known in the art, for example, conventional mixing, dissolving, granulating, dragee-making, levigating, emulsifying, encapsulating, encapsulating, or lyophilizing processes. Can be manufactured.
【０１４２】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。Pharmaceutical compositions are formulated as salts and can be formed with many acids, including but not limited to hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, and the like. Salts are more soluble in aqueous or other protic solvents than the corresponding free base systems. Another preferred form of the drug comprises some or all of 1-50 mM histidine, 0.1% -2% sucrose, and 2-7% mannitol, with a pH range of 4-4.
. A lyophilized powder which is 5 to 5.5 and binds to a buffer before use can be used.
【０１４３】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。HORPの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。After the pharmaceutical compositions have been formulated, they can be packaged in a suitable box and labeled as medication for the indicated condition. For the administration of HORP, such labels will include the amount, frequency, and mode of administration.
【０１４４】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。Suitable pharmaceutical compositions for use in the present invention include compositions that contain an effective amount of the active ingredient to achieve its intended purpose. One skilled in the art can determine a dose that is sufficiently effective for his or her ability.
【０１４５】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。For any composition, a therapeutically effective dose can be estimated initially either in tumor cell assays, for example on tumor cells, or in animal models. Usually, a mouse, rabbit, dog, pig, or the like is used as an animal model. Animal models can also be used to determine suitable enrichment ranges and routes of administration. Based on such treatment, beneficial dosages and routes for administration in humans can be determined.
【０１４６】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばHORP又はその
断片、HORPの抗体、HORPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど
の活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ50（服
用に対して集団の５０％に医薬的効果がある。）またはＬＤ50（服用に対して集
団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験にお
ける標準的な薬剤手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果との
薬用量比は治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50の比率で示すことができる。高い治
療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得ら
れたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる
。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ50 を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及
び患者の感受性、投与の経路にによって、この範囲内で様々である。A medically effective dose is related to the amount of active ingredient that ameliorates a symptom or condition, eg, HORP or a fragment thereof, an antibody to HORP, an agonist or antagonist of HORP, an inhibitor, and the like. Medication efficacy and toxicity are calculated, for example, by calculating the ED 50 (50% of the population has a medicinal effect on taking) or the LD 50 (lethal is 50% of the population on taking) statistics. And the like can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal experiments. Dosage ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD 50 / ED 50. Pharmaceutical compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. The data obtained from the cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for human application. Such compositions dosage included are toxic not including little or no, it is desirable that a range of circulating concentrations that include the ED 50. Dosage will vary within this range depending upon the dosage form employed, sensitivity of the patient, and the route of administration.
【０１４７】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the patient that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors that may be considered as dose components include disease severity, general health of the patient, age, weight, and gender of the patient, time and frequency of administration, concomitant medications, response sensitivities, and Response is included. Long-acting pharmaceutical compositions can be administered once every three or four days, once a week, once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
【０１４８】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。Normal dosage amounts will vary depending on the route of administration, but will range from about 0.1 to 100,000 μg.
Up to about 1 gram. Guidance on specific dosages and modes of delivery is provided in the literature and is generally available to practitioners in the art. One of skill in the art will utilize formulations of nucleotides that are different from the protein or inhibitor. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide
It will be specific for a particular cell, state, location, etc.
【０１４９】 診断 別の実施例では、HORPに特異的に結合する抗体が、HORPの発現による特徴をも
つ疾患の診断、またはHORPやHORPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビ
ターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断
に有益な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。HORPの
診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取
されたものからHORPを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或
いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着
によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが
、その内の幾つかは上記した。 Diagnostics In another embodiment, antibodies that specifically bind to HORP are used to diagnose diseases characterized by HORP expression, or to monitor patients being treated with HORP or HORP agonists or antagonists or inhibitors. Used in assays to perform Antibodies useful for diagnosis are formulated in the same manner as described for therapy. HORP diagnostic assays include methods of using antibodies and labels to detect HORP from human body fluids or from cells or tissues. These antibodies can be used with or without modification and can be labeled by covalent or non-covalent attachment of a reporter molecule. Various reporter molecules known in the art may be used, some of which are described above.
【０１５０】 HORPを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロト
コルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのHORPの発現を診
断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なHORPの発現の値は、複合体
の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者から採
取した体液または細胞とHORPに対する抗体とを結合させることによって決定する
。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（photometri
c）が好ましい。被験者のHORPの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサン
プルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパ
ラメーターとなる。Various protocols for measuring HORP, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide a basis for diagnosing the expression of unusual or abnormal levels of HORP. Normal or standard HORP expression values can be determined by combining an antibody against HORP with a body fluid or cells collected from a normal mammal, preferably a human subject, under conditions suitable for complex formation. decide. The amount of standard complex formation can be quantified in a variety of ways, but can be determined by photometry.
c) is preferred. A sample from the subject's amount of HORP expression, control and disease, biopsy tissue is compared to a standard value. The deviation between the standard value and the subject is a parameter for diagnosing the disease.
【０１５１】 別の実施例によれば、HORPをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用
いて、疾患と相関し得るHORPを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出及
び定量する。この診断アッセイを用いて、HORPの不在、存在、及び過度の発現を
調べ、治療中のHORPレベルの制御を監視する。According to another embodiment, a polynucleotide encoding HORP can be used for diagnosis. Polynucleotides used include oligonucleotide sequences,
Includes complementary RNA and DNA molecules, and PNA. The polynucleotide is used to detect and quantify the expression of a gene in a biopsy tissue that expresses HORP that can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to determine the absence, presence, and overexpression of HORP and to monitor the regulation of HORP levels during treatment.
【０１５２】 ある実施形態では、HORPまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーション
によって、HORPをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'
調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特
異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブがHORP
をコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コ
ードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。In one embodiment, the nucleic acid sequence encoding HORP can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising the gene sequence encoding HORP or a closely related molecule. is there. For example, 5 '
The specificity of the probe, whether it is created from a highly specific region that is a regulatory region or, for example, a conserved motif and a less specific region, and the stringency of hybridization or amplification (maximum, high, intermediate The probe is HORP
Or only the natural sequence encoding the allele or related sequence will be identified.
【０１５３】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、HORPをコードする任意の配
列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブリ
ダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、SEQ ID NO:7
−12の配列、或いはHORP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含
むゲノム配列に由来し得る。[0153] Probes may also be used to detect related sequences, and preferably contain at least 50% nucleotides from any sequence encoding HORP. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be obtained from SEQ ID NO: 7.
-12 or a genomic sequence containing the HORP gene promoter, enhancer, and intron.
【０１５４】 HORPをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの
作製方法には、HORP及びHORP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮ
Ａプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このような
ベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ
及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例え
ば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）
結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等
の種々のレポーターの集団によって標識され得る。[0154] Methods for preparing hybridization probes specific for HORP-encoding DNA include using polynucleotide sequences encoding HORP and HORP derivatives with mRN
There is a method of cloning into a vector for producing the A probe. Such vectors are commercially available and well known to those skilled in the art, and are used to synthesize RNA probes in vitro by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide. The hybridization probe may be a radionuclide such as 32P or 35S, or avidin / biotin.
It can be labeled with a population of various reporters, such as an enzyme label such as alkaline phosphatase, linked to the probe by a binding system.
【０１５５】 HORPをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、HORPの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には
、神経障害が含まれ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、
アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及び他の
錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化症及び他の運動ニューロン疾患、進行性神経性
筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細
菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内
血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウィルス性中枢神経系疾患と、クールー及
びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Gerstmann-Straussler-S
cheinker症候群を含むプリオン病（prion disease）と、致死性家族性不眠症、
神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ce
rebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系
性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（neuroskeletal diso
rder）、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経
筋障害、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性の代謝性及び内分泌性、中毒性ミオ
パシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、***
病性精神障害と、静座不能、健忘症、双極性障害、緊張病、鬱病、糖尿病性ニュ
ーロパシー、ダウン症候群、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、妄想性精
神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、更に、自己免疫／炎症性疾
患が含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、
成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、
アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免
疫性多腺性内分泌障害−カンジダ−外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気
管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿
病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球
体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸
球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症
、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマ
チ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エ
リテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候
群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感
染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、更に、生殖障
害が含まれ、その中には、プロラクチンの産生異常と、卵管病及び***異常、子
宮内膜症、発情期異常、月経周期異常、多嚢胞卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群
、子宮内膜癌及び卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫異常、異所性妊娠、奇形発生を含
む不妊症と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症、乳漏症と、***形成異常、生理学上の精
子異常、精巣癌、前立腺癌、良性の前立腺過形成、前立腺炎、ペーロニー病、イ
ンポテンス、男性***及び女性化***癌とが含まれ、更に、細胞増殖異常が含ま
れ、その中には、日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎
、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグ
ロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リ
ンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨
髄、脳、***、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵
巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の
癌などが含まれ、更に内分泌疾患も含まれ、その中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊
娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外
傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、性機能低下
及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病
、レトラ‐シヴェ病、サルコイドーシス、エンプティセラ症候群、小人症を含む
下垂体低下に関連した障害と、良性線種によって発生しやすい不適当抗利尿ホル
モン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体
亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウィ
ルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む
甲状腺機能低下症に関連した障害と、甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブ
ス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プランマー病を含
む甲状腺機能亢進症と、Conn病（chronic hypercalemia）を含む副甲状腺機能亢
進症と、Ｉ型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質
の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧、アミロイド症、低カリウム血
、クッシング病、リドル症候群、Arnold-Healy-Gordon症候群、褐色細胞腫瘍、
副腎機能不全などの副腎に関連した障害と、女性の異常プロラクチン産生及び不
妊症、子宮内膜症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、高プロラクチン血症、
選択的性腺刺激ホルモン不全（isolated gonadotropin deficiency）、無月経、
乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経期後の骨粗鬆症、男性のラ
イジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関
連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５
α−還元酵素症候群、女性***症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾
患とが含まれ、更に小胞輸送障害が含まれ、その中には嚢胞性線維症、グルコー
ス‐ガラクトース吸収不全症候群、高コレステロール血症、糖尿病、尿崩症、高
／低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病、副腎機能不全と、潰瘍性
大腸炎や胃潰瘍、十二指腸潰瘍を含む胃腸疾患と、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）を含む小胞輸送障害に関連した別の症状と、枯草熱や喘息、じんま疹を含
むアレルギーと、自己免疫性溶血性貧血、増殖性糸球体腎炎、炎症性腸疾患、多
発性硬化症、重症筋無力症、リウマチ様変形性関節症、硬皮、チェディアック‐
東症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、トキシックショック
症候群、外傷性組織損傷、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、蠕虫感染、原虫
感染が含まれ、更に平滑筋異常も含まれ、その中には口峡炎、アナフィラキシー
、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋
梗塞、片頭痛、褐色細胞腫と、心筋症及び脳症、癲癇、カーンズ‐セイヤ症候群
、乳酸アシドーシス、筋クローヌス性障害、眼筋麻痺を含む筋障害とが含まれる
が、平滑筋には血管、胃腸管、心臓、子宮などが含まれるがこれらに限定するも
のではない。HORPをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーンブロット法や
ノーザンブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティッ
ク（dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び患者から採取した体
液或いは組織を利用して変異HORPの発現の検出に用いられるマイクロアレイに使
用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知で
ある。The polynucleotide sequence encoding HORP can be used to diagnose a disease associated with HORP expression. Examples of such diseases include, but are not limited to, neuropathy, including epilepsy, ischemic cerebrovascular disease, stroke, brain tumors,
Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, dementia, Parkinson's disease and other extrapyramidal disorders, amyotrophic lateral sclerosis and other motor neuron diseases, progressive neuromuscular atrophy, retinitis pigmentosa, hereditary Ataxia, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, bacterial and viral meningitis, brain abscess, subdural pyometra, epidural abscess, purulent intracranial thrombophlebitis, myelitis and nerve roots Inflammation, viral central nervous system disease, Kuru and Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann syndrome, Gerstmann-Straussler-S
prion disease including cheinker syndrome, fatal familial insomnia,
Nervous nutritional and metabolic diseases, neurofibromatosis, tuberous sclerosis, cerebellar retinal hemangioblastoma (ce
rebelloretinal hemangioblastomatosis, trigeminal neurovascular syndrome, central nervous system mental retardation and other developmental disorders, cerebral palsy, neuroskeletal diso
rder), autonomic nervous system disorders, cranial nerve disorders, myelopathy, muscular dystrophy and other neuromuscular disorders, dermatomyositis and polymyositis, hereditary metabolic and endocrine, toxic myopathy, myasthenia gravis, cycle Sexual limb paralysis, mood and anxiety psychiatric disorders, schizophrenic psychiatric disorders, restlessness, amnesia, bipolar disorder, catatonia, depression, diabetic neuropathy, Down syndrome, extrapyramidal terminal defect syndrome, It includes dystonia, delusional psychosis, postherpetic neuralgia, Tourette's disease, and also includes autoimmune / inflammatory diseases, including acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency,
Adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma,
Atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine disorders-Candida-ectodermal dystrophy (APECED), bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, Atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, incident lymphopenia, erythroblastosis, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, over Eosinophilia, irritable bowel syndrome, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, strong Scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, blood Analysis, extracorporeal circulation, viral and bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminth infections, trauma, and further includes reproductive disorders, among which are: Abnormal prolactin production and fallopian tube disease and ovulation, endometriosis, abnormal estrus, abnormal menstrual cycle, polycystic ovary syndrome, ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial and ovarian cancer, uterine fibroids, autoimmune abnormalities Infertility, including ectopic pregnancy, teratogenesis, and breast cancer, fibrocystic mastopathy, breast milk and spermatogenesis, physiological sperm abnormalities, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, prostate Inflammation, Peyronie's disease, impotence, male breast and gynecomastia, as well as abnormal cell proliferation, including actinic keratosis and atherosclerosis, atherosclerosis, bursa. Inflammation, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MC D), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically , Adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen Cancer of the testis, thymus, and uterus, as well as endocrine disorders, including primary brain tumors and adenomas, gestational infarction, pituitary resection, aneurysms, vascular malformations, thrombosis, infectious diseases, immunity Disorders of the hypothalamus and pituitary gland resulting from abnormalities, lesions such as complications due to head trauma, hypogonadism and Sheehan syndrome, diabetes insipidus, Kalman disease, Hand-Schuller-Christian disease, Letra-Syve disease, sarcoidosis, Emptycella syndrome Disorders associated with hypopituitarism, including dwarfism, associated with inappropriate antidiuretic hormone (ADH) secretion syndrome (SIADH) and acromegaly, including acromegaly, and gigantism Disorders associated with goiter and myxedema, bacterially transmitted acute thyroiditis, virally transmitted subacute thyroiditis, autoimmune thyroiditis (Hashimoto's disease), hypothyroidism including cretinism, Hyperthyroidism including toxicosis and its various forms, Graves' disease, anterior tibial myxedema, toxic polynodular goiter, thyroid cancer, Plummer's disease, and parathyroidism including Conn's disease (chronic hypercalemia) And pancreatic diseases such as type I and type II diabetes and complications, and hyperplasia and adenoma carcinomas and adenomas, hypertension, amyloidosis, hypokalemia, cussin associated with alkalosis Disease, Liddle's syndrome, Arnold-Healy-Gordon Syndrome, pheochromocytoma tumor,
Disorders related to the adrenal gland, such as adrenal insufficiency, and abnormal prolactin production and infertility in women, endometriosis, menstrual cycle perturbation, polycystic ovarian disease, hyperprolactinemia,
Selective gonadotropin deficiency, amenorrhea,
Milk leakage, semi-yin-yang, hirsutism and virilization, breast cancer, postmenopausal osteoporosis, male Leydig cell hyperplasia, male climacteric, germ cell aplasia, hypersexual function associated with Leydig cell tumor, androgen receptor Androgen resistance associated with lack of
Includes diseases associated with gonad steroid hormones such as α-reductase syndrome, female mastosis, and further includes vesicular transport disorders, including cystic fibrosis, glucose-galactose malabsorption syndrome, and high cholesterol. Blood, diabetes, diabetes insipidus, hyper / hypoglycemia, Graves' disease, goiter, Cushing's disease, adrenal insufficiency, gastrointestinal diseases including ulcerative colitis, gastric ulcer, duodenal ulcer, and acquired immunodeficiency syndrome ( AI
DS) and other symptoms associated with vesicular transport disorders, and allergies including hay fever, asthma, urticaria, autoimmune hemolytic anemia, proliferative glomerulonephritis, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis Syndrome, myasthenia gravis, rheumatoid osteoarthritis, scleroderma, Chediak-
Higashi syndrome, Sjogren's syndrome, systemic lupus erythematosus, toxic shock syndrome, traumatic tissue injury, viral infection, bacterial infection, fungal infection, helminth infection, protozoan infection, and also smooth muscle abnormalities, including oral muscle Ischitis, anaphylaxis, arrhythmia, asthma, cardiovascular shock, Cushing's syndrome, hypertension, hypoglycemia, myocardial infarction, migraine, pheochromocytoma, cardiomyopathy and encephalopathy, epilepsy, Kearns-Sayre syndrome, lactic acidosis, muscle clonus Smooth muscles include, but are not limited to, blood vessels, gastrointestinal tract, heart, uterus, and the like. Polynucleotide sequences encoding HORP can be obtained from Southern blots, Northern blots, or other membrane-based techniques, PCR, dipsticks, pins, ELISA assays, and body fluids or tissues from patients. It can be used for microarrays used for detecting the expression of mutant HORP by utilizing the method. Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.
【０１５６】 特定の形態において、HORPをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、
特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。HORPをコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと
較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のHORPをコードするヌクレオチド
配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッ
セイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、
特定の治療効果を推定することが可能である。In certain aspects, the nucleotide sequence encoding HORP is associated with a disease,
It will be particularly useful in assays to detect the above-mentioned diseases. The nucleotide sequence encoding HORP could be labeled by standard methods and added to a sample of body fluid or tissue taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the patient's sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding HORP in the sample will reveal the presence of the associated disease. Such assays can be used to monitor animal studies, clinical trials, or treatment of individual patients.
It is possible to estimate the effect of a particular treatment.
【０１５７】 HORPの発現に関連する疾患の診断の元となるものを提供するために、正常ある
いは標準的な発現の概要が確立される。この確立は、ハイブリダイゼーション或
いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出さ
れた体液或いは細胞と、HORPをコードする配列或いはその断片とを結合させるこ
とにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から
得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
の値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的
な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者
の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。A normal or standard expression profile is established to provide a basis for the diagnosis of diseases associated with HORP expression. This establishment is achieved by combining a HORP-encoding sequence or a fragment thereof with a body fluid or cell extracted from a normal subject, either animal or human, under conditions suitable for hybridization or amplification. obtain. Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from normal subjects to values from experiments in which known amounts of substantially purified polynucleotides are used. Standard values obtained from normal samples can be compared to values obtained from subjects exhibiting symptoms of the disease. The presence of the disease is determined using the deviation between the standard value and the subject's value.
【０１５８】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。[0158] Once the presence of the disease is determined and the treatment protocol is initiated, the hybridization assay may be repeated on a regular basis to estimate whether the level of expression in the subject has begun to approach the value shown in a normal patient. It is possible. The results of the repeated assays can be used to see the effect of the treatment over a period of days to months.
【０１５９】 癌において、個体からの生体組織における比較的多量の転写物の存在は、疾患
の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提
供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防
方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐこと
が可能となる。In cancer, the presence of relatively high amounts of transcripts in living tissue from an individual indicates a predisposition to the development of the disease, and may provide a way to detect the disease before actual clinical symptoms occur. It is possible. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatments early to prevent the development or progression of cancer.
【０１６０】 HORPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成
、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましく
はHORPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはHORPをコードするポリヌク
レオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺
伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩い厳密性
条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いる
ことが可能である。Additional diagnostic uses for oligonucleotides designed from HORP-encoding sequences may include the use of PCR. Such oligomers can be produced chemically, enzymatically, or in vitro . Oligomers, including fragments of a polynucleotide that preferably encodes HORP, or fragments of a polynucleotide that is complementary to a polynucleotide that encodes HORP, are used to identify a particular gene or condition under optimal conditions. You. Oligomers can also be used for detection and / or quantification of closely related DNA or RNA sequences under somewhat less stringent conditions.
【０１６１】 HORPの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量の速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含ま
れ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを
用いることによって加速された。Methods that can be used to quantify HORP expression include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, coamplification of regulatory nucleic acids, and standard curves with results added. (For example, Melby, PC, etc. (1993) J. Imm
unol. Methods, 159: 235-44; see Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). The rate of quantification of large numbers of samples was accelerated by using an ELISA-type assay in which the oligomer of interest was included in various diluents and quickly quantified by spectrophotometry or non-color response.
【０１６２】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。In another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein are used as targets in a microarray. Microarrays are used to simultaneously monitor the expression levels of a very large number of genes and identify gene mutations, mutations and polymorphisms. This information is useful for determining gene function, interpreting the genetic basis of disease, diagnosing disease, and monitoring and developing the activity of therapeutic agents.
【０１６３】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、HORPをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌
Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Price, C.M
. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:14
9-154を参照） In sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, R.A.(ed.) Molecular Biology and Biotechnology,VCH Pu
blishers New York, NY, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は、
種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイト
で見付けることができる。物理的な染色体マップ上のHORPをコードする遺伝子の
位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾
患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を
用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検出
することもある。[0163] Microarrays are prepared, used and analyzed by methods well known in the art. (E.g., Brennan, TM et al. (1995) U.S. Patent No. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995) PCT Application No.W
O95 / 251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No.WO95 / 35505; Heller, RA et al. (1
Natl.Acad.Sci. 94: 2150-2155; and Heller, MJ et al. (1997) U.S. Pat.No. 5,605,662) Another embodiment of the invention also employs a nucleic acid sequence encoding HORP. Thus, it is possible to generate hybridization probes useful for mapping naturally occurring genomic sequences. This array maps to:
Specific chromosomes, specific regions of chromosomes or artificially generated chromosomes, such as human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC), bacterial P1 products or single chromosomal cDNA libraries. (Eg Price, CM
(1993) Blood Rev. 7: 127-134, and Trask, BJ (1991) Trends Genet. 7:14.
In situ fluorescence hybridization (FISH) will correlate with other physical chromosome mapping techniques and genetic map data (eg, Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, RA ( ed.) Molecular Biology and Biotechnology , VCH Pu
blishers New York, NY, pp. 965-968). An example of gene map data is
It can be found in various scientific journals or on the Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) site. The correlation between the location of the gene encoding HORP on the physical chromosomal map and a particular disease, or a predisposition to a particular disease, can help determine the region of DNA associated with such a disease. The nucleotide sequences of the present invention may also be used to detect differences in gene sequences between normal, carrier, and infected individuals.
【０１６４】 染色体標本のIn sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色***置の違いを検出することも
ある。The genetic map can also be extended using physical mapping techniques, such as in situ hybridization of chromosomal preparations and binding analysis using defined chromosomal markers. By placing the gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse,
Even if the number or arm of a particular human chromosome is not known, relevant markers are often revealed. New arrays are created by physical mapping
It can also be assigned to chromosome arms. This is valuable information for researchers studying genetic diseases using positional cloning or other gene discovery techniques. The location of the disease or syndrome is, for example, 11q22-
Once roughly determined by gene binding to a particular gene region, such as 23, any sequence mapping for that region represents a relevant or regulatory gene for further investigation (eg, by Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580
See). In addition, using the nucleotide sequence of the present invention of interest, normal, holder,
That is, a difference in chromosome position due to translocation or inversion between infected persons may be detected.
【０１６５】 本発明の別の実施例では、HORP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。HORPとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成
は計測されることもある。In another embodiment of the invention, HORP, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof can be used to screen libraries of compounds in any of a variety of drug screening techniques. Fragments used for such screening are free in solution, fixed to a solid support, retained on the surface of cells, or present intracellularly. The formation of binding of the complex between HORP and the agent to be tested may be measured.
【０１６６】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、多数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の表面な
どの固体基板上に合成される。試験用化合物は、HORP、或いはその断片と反応し
てから洗浄される。次ぎに、結合されたHORPが、当分野で周知の方法で検出され
る。精製されたHORPはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられ
るプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペ
プチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。Another method used for drug screening is used to enhance the throughput of screening compounds with suitable binding affinity for the protein of interest (eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. See WO84 / 03564). In this method, a number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate, such as a plastic pin or other surface. The test compound is washed after reacting with HORP or a fragment thereof. Next, the bound HORP is detected by methods well known in the art. Purified HORP can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
【０１６７】 別の実施例では、HORPと結合可能な中和抗体がHORPと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、HORPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding HORP specifically compete with the test compound for binding to HORP.
In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with HORP.
【０１６８】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にHORPをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。In another embodiment, developing molecular biology techniques employ HORP-encoding nucleotide sequences, including, but not limited to, nucleotides such as, but not limited to, the currently known triplet code and specific base-pairing interactions. New techniques that depend on the properties of the sequence can be provided.
【０１６９】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで十分に本発
明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目
的であって本発明を限定するものではない。Those skilled in the art will be able to utilize the present invention with the preceding description alone without further explanation. Accordingly, the specific examples described below are for illustration purposes and do not limit the invention.
【０１７０】 前出及び以下に記載した全ての特許出願及び特許、刊行物、特に０６／３０／
９８に出願した米国出願第６０／０９１、１７７号、及び０７／１６／９８に出
願した米国出願（Atty Docket #PF-0557P）を引用することをもって本明細書の
一部とする。All the patent applications and patents, publications mentioned above and below, in particular 06/30 /
Nos. 60 / 091,177 filed on Mar. 98 and U.S. Application (Atty Docket # PF-0557P) filed on 07/16/98 are incorporated herein by reference.
【０１７１】[0171]
１ ｃＤＮＡライブラリの作製 ＨＭＣ１ＮＯＴ０１ ヒト肥満細胞HMCINOT01 cDNAライブラリは、Stratagene社(Stratagene, La Jo
lla, CA)が培養したHMC-1細胞から精製したｍＲＮＡを用いて作製した。このヒ
ト肥満細胞（HMC-1）cDNAライブラリは、ヒト肥満細胞からのポリ(A+)RNA (mRNA
)を精製し、そのmRNAの二本鎖相補cDNA複製を酵素的に合成して作製した。合成
アダプターオリゴヌクレオチドをcDNAの端部に結合させて、λベクターに導入で
きるようにした。HMC-1ライブラリは、UNIZAPベクター系（Stratagene）を用い
て作製した。 1. Preparation of cDNA Library HMC1NOT01 human mast cell HMCINOT01 cDNA library was obtained from Stratagene (Stratagene, La Jo
Ila, CA) was prepared using mRNA purified from HMC-1 cells cultured. This human mast cell (HMC-1) cDNA library contains poly (A +) RNA (mRNA) from human mast cells.
) Was purified and double-stranded complementary cDNA replication of the mRNA was enzymatically synthesized. A synthetic adapter oligonucleotide was ligated to the end of the cDNA so that it could be introduced into the λ vector. The HMC-1 library was prepared using the UNIZAP vector system (Stratagene).
【０１７２】 HMC-1 cDNAライブラリは、DNAプローブ或いは抗体プローブのどちらかでスク
リーニングして、PBLUESCRIPTファージミド（Stratagene）をin vivoで切断した
。特別に作製したライブラリファージ粒子を大腸菌宿主系XL1-BLUE細胞（Strata
gene）に感染させた。The HMC-1 cDNA library was screened with either a DNA probe or an antibody probe to cleave PBLUESCRIPT phagemid (Stratagene) in vivo . Specially prepared library phage particles were transformed into E. coli host line XL1-BLUE cells (Strata
gene).
【０１７３】 ＰＲＯＳＮＯＮ０１ PROSNON01規準化cDNAライブラリは、射創で死亡した２８歳の白人男性から採
取した顕微鏡でみて正常な前立腺組織から作製した。The PROSONON01 PROSNON01 normalized cDNA library was generated from microscopically normal prostate tissue taken from a 28-year-old white male who had died of a wound.
【０１７４】 Brinkman Homogenizer Polytron PT-3000(Brinkman Instruments, Westbury,
NY)を用いて凍結組織をホモジナイズして、グアニジニウムイソチオシアネート
溶液に溶解した。この溶解物を、Beckman L8-70M Ultracentrifuge(Beckman Ins
truments)のBeckman SW28ローターを用いて５．７Ｍの塩化セシウムクッション
において外界温度、毎分回転数２５，０００で１８時間遠心分離した。ＲＮＡを
ｐＨ４．７の酸性フェノールで抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍
量のエタノールを用いて沈殿させ、RNA分解酵素を含まない水で再懸濁し、DNA分
解酵素を用いて３７℃で処理した。RNAの抽出及び沈殿を同様の方法で繰り返し
た。次に、OLIGOTEXキット（QIAGEN, Valencia, CA）を用いてmRNAを単離し、cD
NAライブラリの作製に用いた。Brinkman Homogenizer Polytron PT-3000 (Brinkman Instruments, Westbury,
NY), and the frozen tissue was homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution. This lysate is transferred to a Beckman L8-70M Ultracentrifuge (Beckman Ins
using a Beckman SW28 rotor (C. truments) on a 5.7M cesium chloride cushion at ambient temperature, 25,000 rpm for 18 hours. RNA is extracted with acidic phenol at pH 4.7, precipitated using 0.3 M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, resuspended in RNase free water, and treated with DNase. Processing was performed at 37 ° C. RNA extraction and precipitation were repeated in a similar manner. Next, mRNA was isolated using the OLIGOTEX kit (QIAGEN, Valencia, CA) and cD
It was used for construction of NA library.
【０１７５】 SURERSCRIPTプラスミド系（Life Technologies）の推奨プロトコルに従ってRN
Aを処理した。cDNAをSepharose CL4Bカラム（Amersham Pharmacia Biotech）上
に分画し、４００bpを超えるcDNA はPSPORT 1（Life Technologies）に結合させた。続いて、プラスミドPSPORT 1
をDH5αTMコンピテント細胞（Life Technologies）に形質転換した。RN according to the recommended protocol of the SURERSCRIPT plasmid system (Life Technologies)
A processed. The cDNA was fractionated on a Sepharose CL4B column (Amersham Pharmacia Biotech), and the cDNA over 400 bp was bound to PSPORT 1 (Life Technologies). Subsequently, plasmid PSPORT 1
Was transformed into DH5α ™ competent cells (Life Technologies).
【０１７６】 SEQ ID NO:7−10を単離したcDNAライブラリの作製は以下のように行った。RNA
は、Clontech社(Palo Alto, CA)から購入、或いはインサイト社で表４に示した
組織から単離した。組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート
溶液に溶解し、この溶解物を塩化セシウムクッションにおいて遠心分離した。別
法では、組織をホモジナイズして、TRIZOL試薬、フェノールの単相性溶液及びグ
アニジンイソチオシアネートなどの好適な変性剤の混合物またはフェノールに溶
解し、溶解物をクロロホルム（1:5 v/v）で抽出した。RNAをイソプロパノールま
たは酢酸ナトリウムを含むエタノールのどちらかで溶解物から沈殿させた。別法
では、RNAを調製用のアガロースゲル電気泳動法によって溶解物から精製して、W
hatman P81 ペーパー（Whatman, lexing, MA）から回収した。RNAの純度を高め
るために、RNAのフェノール抽出及び沈殿を必要なだけ繰り返し、RNAをRNA分解
酵素が含まれていない溶液に保存した。RNAをDNA分解酵素で処理する場合もある
。多くのライブラリでは、ポリ(A+)RNAの単離に、オリゴd(T)結合常磁性粒子(Pr
omega, Madison, WI)またはOligotex 樹脂、Oligotex キット(QIAGEN Inc, Chat
sworth, CA)を用いた。別法では、RNA I単離キット(Stratagene)またはAmbion P
oly A Quick キット(Ambion, Austin, TX)を用いて組織溶解物から直接RNAを単
離した。[0176] Preparation of the cDNA library from which SEQ ID NOs: 7-10 were isolated was performed as follows. RNA
Was purchased from Clontech (Palo Alto, CA) or isolated from the tissues listed in Table 4 by Insight. The tissue was homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, and the lysate was centrifuged on a cesium chloride cushion. Alternatively, the tissue is homogenized, dissolved in a mixture of TRIZOL reagent, a monophasic solution of phenol and a suitable denaturant such as guanidine isothiocyanate or phenol, and the lysate is extracted with chloroform (1: 5 v / v). did. RNA was precipitated from the lysate with either isopropanol or ethanol with sodium acetate. Alternatively, RNA is purified from the lysate by preparative agarose gel electrophoresis and
hatman P81 paper (Whatman, lexing, MA). To increase the purity of the RNA, phenol extraction and precipitation of the RNA were repeated as necessary, and the RNA was stored in a solution containing no RNase. In some cases, RNA is treated with a DNase. In many libraries, poly (A +) RNA isolation involves the use of oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Pr
omega, Madison, WI) or Oligotex resin, Oligotex kit (QIAGEN Inc, Chat
sworth, CA). Alternatively, RNA I isolation kit (Stratagene) or Ambion P
RNA was isolated directly from tissue lysates using the oly A Quick kit (Ambion, Austin, TX).
【０１７７】 当分野で周知の方法(Ausubel, 1997, units 5.1-6.6)に基づいたUNIZAPTMベク
ター(Stratagene, La Jolla, CA)またはSuperScriptプラスミド系(Life Technol
ogies, Inc)の推奨方法に従って、RNAを用いてcDNAを合成してcDNAライブラリを
作製した。別法では、Sratagene社がインサイト社の提供したRNAを用いてcDNAラ
イブラリを作製した。オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて逆転写を開
始させた。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに結合させ、cDNAを
好適な制限酵素で消化した。大抵のライブラリのcDNAの大きさの選択(300-1000b
p)には、Sephacryl S1000、Sepharose CL2BまたはCL4Bカラムクロマトグラフィ
ー(Amersham Pharmacia Biotech)、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用
いた。例えばPBLUESCRIPT (Stratagene)やPSPORT 1(Life Technologies)、pINCY
(Incyte Pharmaceuticals Inc, Palo Alto, CA)などの好適なプラスミドのポリ
リンカーの適合制限酵素部位にcDNAを結合させた。pINCYをJM109で増幅し、QiaQ
uickカラム(QIAGEN Inc)を用いて精製した。XL1-BlueまたはXL1-BlueMRF、SOLR(
Stratagene)またはDH5α、DH10B、ElectroMAX DH10B(Life Technologies)などの
コンピテント大腸菌細胞に組換えプラスミドを形質転換した。The UNIZAP ™ vector (Stratagene, La Jolla, Calif.) Or SuperScript plasmid system (Life Technol) based on methods well known in the art (Ausubel, 1997, units 5.1-6.6)
ogies, Inc), cDNA was synthesized using RNA to prepare a cDNA library. Alternatively, Sratagene produced a cDNA library using RNA provided by Insight. Reverse transcription was initiated using oligo d (T) or random primers. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA and the cDNA was digested with appropriate restriction enzymes. Choice of cDNA size for most libraries (300-1000b
For p), Sephacryl S1000, Sepharose CL2B or CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech), or preparative agarose gel electrophoresis was used. For example, PBLUESCRIPT (Stratagene), PSPORT 1 (Life Technologies), pINCY
The cDNA was ligated to the compatible restriction enzyme site of a polylinker of a suitable plasmid such as (Incyte Pharmaceuticals Inc, Palo Alto, CA). Amplify pINCY with JM109 and use QiaQ
Purification was performed using a uick column (QIAGEN Inc). XL1-Blue or XL1-BlueMRF, SOLR (
Competent E. coli cells such as Stratagene) or DH5α, DH10B, ElectroMAX DH10B (Life Technologies) were transformed with the recombinant plasmid.
【０１７８】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 ＨＭＣ１ＮＯＴ０１ ファージミド型の各cDNAクローンは、in vivoでの切断プロセスから得た。こ
の時、宿主菌種を、λライブラリファージ及びf1ヘルパーファージ（UNIZAP ベ
クター系、Stratagene）の両方で同時感染した。ファージ含むライブラリとヘル
パーファージを含むライブラリの両方に由来するタンパク質がλDNAに切れ目を
入れ、λ標的DNAの指定配列から新規のDNA合成を開始し、BLUESCRIPT(Stratagen
e)プラスミド及びcDNA挿入断片の全てのDNA配列を含む小さな一本鎖の環状ファ
ージミドDNA分子を作製した。細胞から分泌されたファージミドDNAを精製し、新
鮮な宿細胞に再感染させ、そこで二本鎖ファージミドDNAを産生させた。ファー
ジミドがβラクタマーゼの遺伝子を運んだため、新規に形質転換した細菌が、ア
ンピシリンを含む培地に選択された。 2 Isolation of cDNA Clones Each cDNA clone of the HMC1NOT01 phagemid type was obtained from an in vivo cleavage process. At this time, the host strain was co-infected with both the λ library phage and the f1 helper phage (UNIZAP vector system, Stratagene). Proteins from both the phage-containing library and the helper phage-containing library cleave λ DNA, start new DNA synthesis from the specified sequence of λ target DNA, and use BLUESCRIPT (Stratagen
e) A small single-stranded circular phagemid DNA molecule containing the entire DNA sequence of the plasmid and cDNA insert was prepared. The phagemid DNA secreted from the cells was purified and reinfected into fresh host cells, where double-stranded phagemid DNA was produced. Because the phagemid carried the gene for β-lactamase, newly transformed bacteria were selected on media containing ampicillin.
【０１７９】 ファージミドDNAを、MAGIC MINIPRESP DNA精製システム(Promega, Madison, W
I)を用いて精製した。DNA配列決定及びその他の分析操作のために精製樹脂からD
NAを溶出した。QIAWELL-8 PlasmidまたはDNA Purification システム(QIAGEN)を
用いても、ファージミドDNAを精製できる。DNAを精製樹脂から溶出し、DNA配列
決定及びその他の分析操作に備えた。The phagemid DNA was purified using the MAGIC MINIPRESP DNA purification system (Promega, Madison, W.).
Purified using I). D from purified resin for DNA sequencing and other analytical procedures
NA was eluted. Phagemid DNA can also be purified using QIAWELL-8 Plasmid or DNA Purification System (QIAGEN). DNA was eluted from the purified resin and prepared for DNA sequencing and other analytical procedures.
【０１８０】 別法では、ファージミドDNAの精製に、Advanced Genetic Technologies Corp(
Gaitherburg, MD)が販売するMiniprep Kitを利用する。このキットは９６個のウ
ェルが付いたタイプであり、９６０回の精製に十分な試薬が含まれている。それ
ぞれのキットには、推奨プロトコルが含まれ、以下の変更点以外はそれを使用し
た。その変更点とは、第１に、９６個のウェルのそれぞれを、０．４％のグリセ
リンに２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む僅か１ｍｌの無菌Terrific Broth(L
ife Technologies)で満たす。ウェルを接種後、細菌を２４時間培養し、６０μ
ｌの溶解緩衝液で溶解する。ブロックの内容物を一次フィルタープレートに添加
する前に、遠心分離(毎分回転数2900で５分間)を行う。任意選択のTRIS緩衝液へ
のイソプロパノールの添加は行わない。プロトコルの最終段階を終えた後、サン
プルをBeckman９６ウェルブロックに移して保管した。Alternatively, purification of phagemid DNA can be performed using the Advanced Genetic Technologies Corp (
Use the Miniprep Kit sold by Gaitherburg, MD). The kit is of the type with 96 wells and contains enough reagents for 960 purifications. Each kit contained a recommended protocol that was used with the following changes. First, each of the 96 wells was filled with only 1 ml of sterile Terrific Broth (L) containing 25 mg / L carbenicillin in 0.4% glycerin.
ife Technologies). After inoculating the wells, the bacteria were cultured for 24 hours,
Dissolve in 1 lysis buffer. Centrifuge (5 min at 2900 rpm) before adding the contents of the block to the primary filter plate. There is no addition of isopropanol to the optional TRIS buffer. After finishing the final step of the protocol, the samples were transferred to a Beckman 96-well block and stored.
【０１８１】 ＰＲＯＳＮＯＮ０１ 電気穿孔法による形質転換の後、大腸菌系DH12S(Life Technologies)の正常な
前立腺プラスミドライブラリの４．４×１０6の独立したクローンを、カルベニ
シリン(25mg/L)とメチシリン(1mg/ml)選択の下、培養液で増殖させた。この培養
液を分光光度的に測定して(Model DU-7 Spectrophotometer, Beckman Instrumen
ts)、光学濃度６００の０．２まで増殖させ、Viera他の方法(1987, Methods Enz
ymol. 153:3-11) (引用することで本明細書の一部とする)に従って、５倍を超え
るヘルパーファージM13K07に重感染させた。After transformation by PROSONON01 electroporation, 4.4 × 10 6 independent clones of the normal prostate plasmid library of the E. coli strain DH12S (Life Technologies) were selected for carbenicillin (25 mg / L) and methicillin (1 mg / l). (ml) Propagated in culture under selection. The culture was measured spectrophotometrically (Model DU-7 Spectrophotometer, Beckman Instrument).
ts), grown to an optical density of 600 to 0.2, using the method of Viera et al. (1987, Methods Enz
ymol. 153: 3-11) (incorporated herein by reference) was overinfected with more than 5-fold helper phage M13K07.
【０１８２】 ライブラリの存在量の程度によって超過cDNAコピーの数を減らすために、Soar
esらの方法(1994 Proc. Natl. Acad. Sci 91:9928-9932) (引用することで本明
細書の一部とする)に以下に示す点を変更して、cDNAを１回で規準化した。１）
プライマー延長反応における鋳型に対するプライマーの割合を、２：１から１０
：１にした。２）この反応のddNTP濃度を１５０μＭまで下げて、各ddNTPが長い
プライマー延長物（400−1000nt）を生成できるようにした。３）再アニーリン
グハイブリダイゼーションを１３時間から１９時間に延長した。４）規準化ライ
ブラリの一本鎖DNA環をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって精製
し、ランダムプライミングによって部分的二本鎖に転換し、DH10Bコンピテント
細菌（Life Technologies）に電気穿孔して導入した。To reduce the number of excess cDNA copies depending on the degree of library abundance, Soar
Nats. Acad. Sci 91: 9928-9932 (1994 Proc. Natl. Acad. Sci 91: 9928-9932) did. 1)
The ratio of the primer to the template in the primer extension reaction was 2: 1 to 10: 1.
: 1. 2) The ddNTP concentration in this reaction was reduced to 150 μM so that each ddNTP could generate a longer primer extension (400-1000 nt). 3) Reannealing hybridization was extended from 13 hours to 19 hours. 4) Single stranded DNA circles of the normalized library were purified by hydroxyapatite chromatography, converted to partially double stranded by random priming, and electroporated into DH10B competent bacteria (Life Technologies).
【０１８３】 R.E.A.L.PREP96プラスミドキット(QIAGEN, Valencia, CA)を用いて、プラスミ
ドDNAを細胞から解離させて精製した。このキットで、マルチチャンネル試薬デ
ィスペンサを使って、９６個のウェルブロックの中の９６のサンプルを同時に精
製できる。以下の点を除いて、推奨プロトコルにしたがった。１）細菌を、０．
４％のグリセリンに２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む僅か１ｍｌの無菌Terr
ific Broth(Life Technologies)で培養した。２）接種後、培養物を１９時間培
養し、インキュベーションの最後に細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解した。
３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドDNAペレットを０．１ｍｌの蒸留水
に再懸濁した。プロトコルの最終段階を終えた後、サンプルを９６ウェルブロッ
クに移して４℃で保管した。Plasmid DNA was dissociated from cells and purified using the REALPREP96 plasmid kit (QIAGEN, Valencia, CA). With this kit, 96 samples in 96 well blocks can be purified simultaneously using a multichannel reagent dispenser. The recommended protocol was followed, with the following exceptions: 1) Bacteria are used for 0.
Only 1 ml of sterile Terr containing 25 mg / L carbenicillin in 4% glycerin
Cultured in ific Broth (Life Technologies). 2) After inoculation, the culture was cultured for 19 hours and at the end of the incubation the cells were lysed with 0.3 ml of lysis buffer.
3) After isopropanol precipitation, the plasmid DNA pellet was resuspended in 0.1 ml of distilled water. After finishing the final step of the protocol, the samples were transferred to a 96-well block and stored at 4 ° C.
【０１８４】 SEQ ID NO:7−10を含むcDNAクローンの単離は以下の通りである。プラスミド
を、in vivo切断(UniZAP ベクター系, Stratagene)または細胞溶解によって宿主
細胞から回収した。プラスミドを、MAGIC MINIPREPS DNA精製システム(Promega,
Madison, WI)またはMiniprepキット(Advanced Genetic Technologies Corporat
ion, Gaithersburg, MD)、QIAwell-8 Plasmid或いはQiAwell PLUS DNA、QiAwell
ULTRA DNA 精製システム、またはR.E.A.L. PREP 96 プラスミドキット(QIAGEN
Ine)を用いて推奨プロトコルに従って精製した。沈殿後、プラスミドを０．１ｍ
ｌの蒸留水に再懸濁し、乾燥凍結して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。The isolation of a cDNA clone containing SEQ ID NOs: 7-10 is as follows. Plasmids were recovered from host cells by in vivo cleavage (UniZAP vector system, Stratagene) or cell lysis. Plasmids were transferred to the MAGIC MINIPREPS DNA purification system (Promega,
Madison, WI) or Miniprep kit (Advanced Genetic Technologies Corporat
ion, Gaithersburg, MD), QIAwell-8 Plasmid or QiAwell PLUS DNA, QiAwell
ULTRA DNA Purification System or REAL PREP 96 Plasmid Kit (QIAGEN
Purified using Ine) according to the recommended protocol. After precipitation, the plasmid was
Resuspended in 1 liter of distilled water and stored at 4 ° C with or without freeze-drying.
【０１８５】 別法では、高スループット型の直接結合PCR(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem
. 2 16:1-14)によって、プラスミドDNAを宿主細胞溶解物から増幅した。宿主細
胞の溶解及び熱サイクルス段階は、単一反応混合液で行った。サンプルを３８４
個のウェルを備えたプレート(Genetix Ltd, Christchurch UK)で処理して保存し
、増幅したプラスミドDNAの濃度を、Pico Green Dye (Molecular Probes, Eugen
e OR)とFluoroscan II 蛍光スキャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を
用いて蛍光定量的に定量化した。Alternatively, a high-throughput direct binding PCR (Rao, VB (1994) Anal. Biochem.
2 16: 1-14), plasmid DNA was amplified from host cell lysates. The lysis and thermal cycling steps of the host cells were performed in a single reaction mixture. 384 samples
The plate was processed and stored in a plate with two wells (Genetix Ltd, Christchurch UK), and the concentration of the amplified plasmid DNA was measured using a Pico Green Dye (Molecular Probes, Eugen
e OR) and fluorimetric quantification using a Fluoroscan II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland).
【０１８６】 ３ シークエンシング及び分析 シークエンシング用のｃＤＮＡの準備には、ABI PRISMTM CATALYSTTM 800 (Pe
rkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)或いはMICROLAB 2200 シス
テム(Hamilton Co., Reno, NV) シークエンシング準備システムのどちらかとPel
tier PTC-200 thermal cyclers (MJ Research, Inc., Watertown, MA)との組合
せを用いた。ｃＤＮＡのシークエンシングには、ABI PRISM 373または377シーク
エンシングシステム及びABIプロトコル、塩基対読み出しソフトウェア、キット(
Perkin-Elmer Applied Biosystems)を用いた。別法では、ABIキットの代わりにA
mersham Pharmacia Biotech社の溶液と色素を用いた。読み枠は標準的な方法(Au
subel、前出)で決定する場合もある。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施
例の５に記載した方法で延長した。 3. Preparation of cDNA for Sequencing and Analytical Sequencing ABI PRISM ™ CATALYST ™ 800 (Pe
Pel with either rkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) or MICROLAB 2200 System (Hamilton Co., Reno, NV) sequencing preparation system
A combination with tier PTC-200 thermal cyclers (MJ Research, Inc., Watertown, MA) was used. For sequencing cDNA, ABI PRISM 373 or 377 sequencing system and ABI protocol, base pairing software, kit (
Perkin-Elmer Applied Biosystems) was used. Alternatively, use A instead of ABI kit
Solutions and dyes from mersham Pharmacia Biotech were used. Reading frames are written in the standard way (Au
subel, supra). Some of the cDNA sequences were selected and extended as described in 5 of this example.
【０１８７】 ｃＤＮＡ及び延長、ショットガンシークエンシングから得たポリヌクレオチド
配列の構築及び分析は、当分野の技術者に既知のアルゴリズムを利用したソフト
ウェアを組合せて行った。表５は、使用したソフトウェアプログラム、対応する
アルゴリズム、引用文献、該当する部分のカットオフスコアを示す。表５の３列
目に引用した文献は、本明細書の一部とする。配列アライメントは、MACDNASIS
PROソフトウェア(Hitachi 15 Software Engineering Co., Ltd. San Bruno, CA)
及びLASERGENEソフトウェア(DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアラ
イメントプログラムで分析して作成した。The construction and analysis of cDNA and polynucleotide sequences from extension and shotgun sequencing were performed in combination with software utilizing algorithms known to those skilled in the art. Table 5 shows the software programs used, the corresponding algorithms, the cited references, and the cut-off scores for the relevant parts. The documents cited in the third column of Table 5 are part of the present specification. Sequence alignment is MACDNASIS
PRO Software (Hitachi 15 Software Engineering Co., Ltd. San Bruno, CA)
And LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI).
【０１８８】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ尾部配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次
に、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベー
スであるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータ
ベースやBLOCKSデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合
わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基づいたプログラムを用いて完全
長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、GeneMark及びBLAST
、FASTAに基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリ
ーニングした。この後、完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全
長のアミノ酸配列を引き出した。上記したGenBankデータベース及びSwissProt、
BLOCKS、PRINTS、PFAM、Prositeなどのデータベースに対して問い合わせ、これ
らの完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を連続して分析した。Confirmation of polynucleotide sequences is performed using BLAST and dynamic programming, programs and algorithms based on dinucleotide nearest neighbor analysis, removing vector and linker, poly A tail sequences and masking ambiguous base pairs. I went by that. Next, using a program based on BLAST and FASTA, BLIMPS, to the sequence selected from the public database GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotes databases and BLOCKS database, etc. These sequences were queried to obtain annotations. These sequences were assembled into full-length polynucleotide sequences using programs based on Phred and Phrap, Consed, and then generated using GeneMark and BLAST.
, Screened for open reading frames with a program based on FASTA. Thereafter, the full-length polynucleotide sequence was translated to derive the corresponding full-length amino acid sequence. GenBank database and SwissProt described above,
Databases such as BLOCKS, PRINTS, PFAM, and Prosite were queried and their full-length polynucleotide and amino acid sequences were continuously analyzed.
【０１８９】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,上記
, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、上記, 4章及び16章を参照)。 4 Northern Analysis Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of gene transcripts, in which labeled nucleotides on a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. With sequence hybridization (see, eg, Sambrook, supra).
, Chapter 7; and Ausubel. FM et al., Supra, Chapters 4 and 16).
【０１９０】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ
データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或い
は関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより
非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一
致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定すること
ができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。Using a similar computer technique used for BLAST, GenBank or LIFESEQ
Search for identical or related molecules in a nucleotide database such as a database (Insight). This analysis is much faster than many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be changed to determine whether any particular match is classified as an exact match or a homologous match. The criteria for the search is the product score defined as (% sequence identity x% maximum BLAST score) / 100. The product score takes into account both the similarity between the two sequences and the length of the sequence match. For example, for a product score of 40, the match is 1-2
It is accurate within% error, and at 70 the match will be accurate. Similar molecules are typically identified by selecting a molecule that exhibits a product score in the range of 15 to 40, although lower scores may identify related molecules.
【０１９１】 ノーザン分析の結果は、HORPをコードする転写物が発生するライブラリのリス
トとして報告されている。存在量及び存在率も示した。cDNAライブラリで示され
た特定の転写物の回数が存在量を直接反映している。存在率は、存在量をcDNAラ
イブラリで測定した配列の合計数で割ったものである。The results of the Northern analysis are reported as a list of libraries in which transcripts encoding HORP are generated. Abundance and abundance are also shown. The number of specific transcripts shown in the cDNA library directly reflects the abundance. The abundance is the abundance divided by the total number of sequences measured in the cDNA library.
【０１９２】 ５ HORPをコードするポリヌクレオチドの延長 インサイト社クローン番号321510及び634343、1942326、2395269、008879、22
74011の核酸配列を用いて、不完全なヌクレオチド配列を完全長にするためのオ
リゴヌクレオチドプライマーを設計した。各核酸配列において、一方のプライマ
ーはアンチセンスポリヌクレオチドの延長を開始するために合成し、他方のプラ
イマーはセンスヌクレオチドの延長を開始するために合成する。これらのプライ
マーを用いて既知の配列の「外側への」延長を促進し、目的の領域の新しい未知
のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを作り出す。開始プライマーは、ＯＬＩ
ＧＯ ４．０６（National Biosciences, Plymouth, MN）或いは他の適切なプロ
グラムを用いて、約２２〜約３０個のヌクレオチドからなる長さで、約５０％以
上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニールするよ
うにｃＤＮＡから設計する。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化
を生ずるようなヌクレオチドのストレッチは避ける。 5 Extension of HORP-encoding Polynucleotide Clone Nos. 321510 and 634343, 1942326, 2395269, 008879, 22
Using the nucleic acid sequence of 74011, oligonucleotide primers were designed to make incomplete nucleotide sequences full length. In each nucleic acid sequence, one primer is synthesized to initiate extension of the antisense polynucleotide and the other primer is synthesized to initiate extension of the sense nucleotide. These primers are used to facilitate "outward" extension of a known sequence, creating an amplicon containing a new, unknown nucleotide sequence of the region of interest. The starting primer is OLI
Using GO 4.06 (National Biosciences, Plymouth, MN) or other suitable program, it is about 22 to about 30 nucleotides in length, has a GC content of about 50% or more, and has a GC content of about 68%. Design from the cDNA to anneal to the target sequence at a temperature of 約 72 ° C. Avoid stretches of nucleotides that result in hairpin structure and primer-primer dimerization.
【０１９３】 この配列の延長のために選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）
を用いる。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、既知領域
をさらに延長するための別のプライマーの組を設計する。Human cDNA library selected for extension of this sequence (Gibco / BRL)
Is used. If more than one step extension is necessary or desired, another set of primers is designed to further extend the known region.
【０１９４】 ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って処理を行い、ま
た酵素と反応混合物とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅を行う
。それぞれ４０ｐｍｏｌの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全て
の成分とから増幅を開始する場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Res
erch, Watertown MA）を用いて、以下のパラメータ、即ち、 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行う。Processing is performed according to the instructions of the XL-PCR kit (Perkin Elmer) and high fidelity amplification is performed by thoroughly mixing the enzyme and the reaction mixture. When starting amplification with 40 pmol of each primer and all other components of the kit at the recommended concentration, Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Res.
erch, Watertown MA) using the following parameters: Step 1 1 minute at 94 ° C (initial denaturation) Step 2 1 minute at 65 ° C Step 3 6 minutes at 68 ° C Step 4 15 seconds at 94 ° C Step 565 Step 6 Repeat the steps 4 to 6 for another 15 cycles Step 8 94 ° C for 15 seconds Step 9 65 ° C for 1 minute Step 10 68 ° C for 7 minutes 15 seconds Step 11 Step 8 to Step 12 is repeated for 12 cycles.
【０１９５】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度の（約０．６〜０．８％）
アガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、何れの反応物が配列を延長する
ことに成功したかを決定する。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドを選
択して、ゲルから切り出し、QIAQUICKTM（QIAGEN Inc.）を用いて精製し、クレ
ノウ酵素を用いて末端の延び出しを切り取って、再連結及びクローニングが容易
になる平滑末端を作る。Aliquots of 5-10 μl of the reaction mixture to low concentrations (about 0.6-0.8%)
Analysis by electrophoresis on an agarose minigel determines which reactions have successfully extended the sequence. The band believed to contain the largest product was selected, excised from the gel, purified using QIAQUICK ™ (QIAGEN Inc.), cut off the terminal extension using Klenow enzyme, and religated and cloned. Create blunt ends that will be easier.
【０１９６】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トする。（４０μｌの適切な培養液の中の）コンピテントな大腸菌細胞を、３μ
ｌの連結混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培養液で（例えば、Semb
roo、前出、Appendix A, p. 2を参照）で培養する。３７℃で１時間インキュベ
ートした後、全ての形質転換した混合物を、カルベニシリン（２ｘ ｃａｒｂ）
を含むLuria Bertani（ＬＢ）アガー（例えば、Sembrook、前出、Appendix A, p
. 1を参照）上にプレートする。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無
作為に選択し、適切な市販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの各ウェル内
に入れられた１５０μｌの液状のＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後
日、それぞれ５μｌの終夜培養した各培養物を非滅菌９６穴プレート内に移し、
水で１：１０に希釈した後、各サンプルの内の５μｌをＰＣＲアレイに移す。After ethanol precipitation, the product was redissolved in 13 μl ligation buffer and 1 μl
Of T4-DNA ligase (15 units) and 1 μl of T4 polynucleotide kinase are added and the mixture is incubated for 2-3 hours at room temperature or overnight at 16 ° C. Competent E. coli cells (in 40 μl of appropriate culture)
l ligation mixture and transform with 80 μl SOC culture (eg Semb
roo, supra, see Appendix A, p. 2). After incubation at 37 ° C. for 1 hour, all transformed mixtures were washed with carbenicillin (2 × carb).
Luria Bertani (LB) agar (eg, Sembrook, supra, Appendix A, p.
Plate on top). At a later date, several colonies are randomly selected from each plate and cultured in 150 μl of liquid LB / 2xCarb medium in each well of an appropriate commercially available sterile 96-well microtiter plate. Further at a later date, each 5 μl of the overnight culture was transferred into a non-sterile 96-well plate,
After dilution 1:10 with water, transfer 5 μl of each sample to the PCR array.
【０１９７】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行う。For PCR amplification, 18 μl of the enriched PCR reaction mixture (3.3 ×) containing 4 units of rTth DNA polymerase, vector primers, and / or gene-specific primers used in the extension reaction are added to each well. The amplification was performed under the following conditions: Step 1 at 94 ° C. for 60 seconds Step 2 at 94 ° C. for 20 seconds Step 3 at 55 ° C. for 30 seconds Step 4 at 72 ° C. for 90 seconds Step 5 Steps 2 to 4 were repeated 29 more cycles Step 6 For 180 seconds at step 74 ° C. (hold as it is).
【０１９８】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ産物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロー
ンを選択し、プラスミドに連結して配列決定をした。An aliquot of the PCR reaction is run on an agarose gel with a molecular weight marker. The size of the PCR product was compared to the original partial cDNA, the appropriate clone was selected, ligated into the plasmid and sequenced.
【０１９９】 同様に、SEQ ID NO:7−12のヌクレオチド配列を利用して上述の手順で、この
５′延長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用い
て５′調節配列を得た。Similarly, using the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 7-12, the above procedure was used to obtain 5 'regulatory sequences using the oligonucleotide designed for this 5' extension and a suitable gene library. Was.
【０２００】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:7−12から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基
対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡ
フラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OL
IGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを
用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐32Ｐ]
アデノシン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。
標識されたオリゴヌクレオチドを、SephadexTM G-25超精細排除デキストランビ
ードカラム（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製する
。毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌ
クレアーゼ、AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN）の
１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼー
ション解析において用いる。 6 Labeling and Use of Individual Hybridization Probes cDNA, mRNA, or genomic DNA is screened using hybridization probes derived from SEQ ID NOs: 7-12. Particular mention is made of the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs, but the larger cDNA
The same procedure is basically used for fragments. Oligonucleotide, OL
Designed using state-of-the-art software such as IGO 4.06 software (National Bioscience), 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ- 32 P]
Labeling is performed by using adenosine triphosphate (Amersham, Chicago, IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA) in combination.
The labeled oligonucleotide is substantially purified using a Sephadex ™ G-25 ultra-fine exclusion dextran bead column (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI). An aliquot containing per minute 10 7 counts of labeled probe, following endonuclease, AseI, Bgl II, EcoRI, typically of Pst I, Xba1 or PvuII (DuPont NEN) human genomic DNA digested with one of the Used in simple membrane-based hybridization analyses.
【０２０１】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT ARTMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、フィルムに写すためにブロッ
トに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。DNA from each cut is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, the blots are washed sequentially at room temperature up to 0.1x sodium citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate under increasingly stringent conditions.
After exposing the XOMAT AR ™ film (Kodak, Rochester, NY) to the blot for transfer to film for several hours, the hybridization patterns are visually compared.
【０２０２】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。 7 It is possible to synthesize array elements on the surface of a substrate using microarray chemical bonding methods and inkjet devices (see, eg, Baldeschweiler, supra). Using an array similar to dot or slot blots, the elements are exposed to heat, UV,
It is arranged and bonded to the surface of the substrate using a mechanical or chemical bonding method. Typical arrays can be made manually or using available methods and machines, and can include any suitable number of elements. After hybridization, unhybridized probe is removed and the level and pattern of fluorescence is determined using a scanner. The scanned images can be analyzed to determine the degree of complementarity and the relative amount / expression level of each probe that hybridizes to the element on the microarray.
【０２０３】 完全長のｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ：Expressed Sequence Tags）、或
いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を含み得る。ハイブリダイゼーショ
ンに好適な断片を、LASERGENETMなどの当分野で公知のソフトウェアを用いて選
択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ
、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリか
ら任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基板に整列する。
ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固
定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena,
M. 他. (1995) Science 270:467-470; 及び Shalon,D. 他. (1996) Genome Res.
6:639-645を参照)。蛍光プローブを基板上の要素にハイブリダイゼーションす
るために準備する。上記した方法によってこの基板を分析する。[0203] Full-length cDNAs, Expressed Sequence Tags (ESTs), or fragments thereof, can comprise elements of a microarray. Fragments suitable for hybridization can be selected using software known in the art, such as LASERGENE ™ . Full-length cDNA corresponding to one of the nucleic acid sequences of the invention
EST, or fragments thereof, or cDNA arbitrarily selected from a cDNA library related to the present invention, are arranged on a suitable substrate such as a glass slide.
The cDNA is fixed to a slide using, for example, UV cross-linking, subjected to heat treatment and chemical treatment, and finally dried (for example, Schena,
(1995) Science 270: 467-470; and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res.
6: 639-645). A fluorescent probe is prepared for hybridization to an element on a substrate. The substrate is analyzed by the method described above.
【０２０４】 ８ 相補的ポリヌクレオチド HORPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発
生のHORPの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア及びHORPをコードする配列を用いて、好適なオリゴヌクレオチドを設
計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌク
レオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するの
を阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して
、リボソームがHORPをコードする転写物に結合するのを阻害する。 8 Complementary Polynucleotides The sequence encoding HORP, or a sequence complementary to any portion thereof, is used to reduce or inhibit the expression of naturally occurring HORP. Although the use of oligonucleotides containing about 15 to about 30 base pairs is described, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. Suitable oligonucleotides are designed using Oligo 4.06 software and sequences encoding HORP. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent the ribosome from binding to transcripts encoding HORP.
【０２０５】 ９ HORPの発現 HORPの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うこ
とができる。細菌でHORPが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクロ
ーニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメント
に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハ
イブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換
えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性
をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発される
とＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのHORPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物
細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californi
ca核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介に
よる遺伝子転移のどちらかによって、HORPをコードするｃＤＮＡと置換する。ウ
イルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルの
ｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodopte
ra frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用
いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変
更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を
参照)。 9 HORP Expression HORP can be expressed and purified using bacterial or viral-based expression systems. For expression of HORP in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that increases antibiotic resistance and the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express HLOR when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of HORP in eukaryotic cells has been demonstrated in insect or mammalian cell lines by Autographica californi , commonly known as baculovirus.
It is performed by infecting with ca nuclear pleiotropic virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is replaced with the cDNA encoding HORP by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid-mediated. The virus's infectivity is maintained and the strong polyhedrin promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are often Spodopte
ra frugiperda (Sf9) Used to infect insect cells, but may also be used to infect human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (For example, Engelhard. EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91: 3224-3227; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.).
【０２０６】 殆どの発現系では、HORPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持し
た状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる。(Pharm
acia, Piscataway, N J)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯＲか
らタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市
販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak, Rochester,
NY)を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して
伸展した6-Hisによって、金属キレート樹脂(QIAGEN Inc, Chatsworth, CA)で精
製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausubel (1995,及び定期
的な追加)に記載されている(Current Protocols in Molecular Biology, John W
iley & Sons, New York, NY, ch 10, 16.)。これらの方法で精製したＨＬＯＲを
直接用いて以下の活性のアッセイを行うことができる。In most expression systems, HORP is, for example, glutathione S-transferase (GST)
Or a fusion protein synthesized with a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, so that affinity-based purification of the recombinant fusion protein from unpurified cell lysate can be performed quickly and in one go. GST, a 26 kilodalton enzyme from Schistosoma japonicum, allows purification of the fusion protein with immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity. (Pharm
acia, Piscataway, NJ). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from the HLOR at a specific manipulation site. FLAG, an eight amino acid peptide, is a commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibody (Eastman Kodak, Rochester,
NY) can be used for immunoaffinity purification. 6-His with six consecutively extending histidine residues allows for purification on metal chelating resins (QIAGEN Inc, Chatsworth, CA). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995, and periodic additions) ( Current Protocols in Molecular Biology , John W.
iley & Sons, New York, NY, ch 10, 16.). The following activities can be assayed directly using HLOR purified by these methods.
【０２０７】 １０ HORP活性の実証 ヒト酸化還元酵素タンパク質のアッセイは、酸化活性の測定における３４０ｎ
ｍでのNAD(P)H補酵素の消衰係数の増加、或いは還元活性の測定における３４０
ｎｍでのNAD(P)H補酵素の消衰係数の低下に基づいている(Dalziel, K. (1963) J
. Biol. Chem. 238:2850-2858)。Asn-I3Galまたはbiocytidine、ユビキノン−１
０の内の１つの基質を用いることができる。例えば、cytochtome c1-b酸化還元
酵素とチトクロムcとの酵素反応のそれぞれのサブユニットを再構成した。反応
混合液は、１−２ｍｇ／ｍｌのHORP及び１５ｍＭの基質と、２．４ｍＭのNAD(P) + または２．０ｍＭのNAD(P)Hを含むｐＨ７．１(NAD(P)+、酸化反応)の０．１Ｍ
のリン酸塩緩衝液またはｐＨ７．４(NAD(P)、還元反応)の０．１ＭのNa2HPO4緩
衝液であり、全容量が０．１ｍｌである。３４０ｎｍ(A340)での吸光度の変化を
、記録分光光度計(Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Pleasanton, CA)
を用いて測定する。NAD(P)Hの量は、初めにあった基質の量に化学量論的に等し
く、A340での変化が生成されたNAD(P)Hの量（ΔA340 = 6620[NADH]）の直接的な
測定となる。HORPの活性は、アッセイでのNAD(P)Hの量に比例する。[0207]10 Demonstration of HORP activity The assay for human oxidoreductase protein is 340n in measuring oxidative activity.
increase of the extinction coefficient of NAD (P) H coenzyme at 400 m.
(Dalziel, K. (1963) J
Biol. Chem. 238: 2850-2858). Asn-I3Gal or biocytidine, ubiquinone-1
One of the substrates can be used. For example, cytochtome c1-b redox
Each subunit of the enzyme reaction between the enzyme and cytochrome c was reconstituted. reaction
The mixture contains 1-2 mg / ml HORP and 15 mM substrate and 2.4 mM NAD (P). + Or pH 7.1 containing 2.0 mM NAD (P) H (NAD (P) H+, Oxidation reaction) 0.1 M
Phosphate buffer or 0.1 M Na at pH 7.4 (NAD (P), reduction reaction)TwoHPOFourLoose
Impulse solution, the total volume is 0.1 ml. 340 nm (A340Change in absorbance at
, Recording Spectrophotometer (Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Pleasanton, CA)
Measure using The amount of NAD (P) H is stoichiometrically equal to the amount of substrate initially present.
A340Change in the amount of NAD (P) H produced (ΔA340 = 6620 [NADH])
Measurement. The activity of HORP is proportional to the amount of NAD (P) H in the assay.
【０２０８】 別法では、HORP−5の活性を、精製されたミクロソームにおけるリノール酸のc
isリノレン酸への転換能力によって実証する(Ivanetich, K.M. 他 (1996) Bioch
im. Biophys. Acta 1292:120-132.)。内在性ミクロソームacyl-Coenzyme A(CoA)
合成酵素によって、リノール酸がHORP−5の直接基質であるlinoleoyl-CoAに転換
される。HORP−5によって、linoleoyl-CoAがlinolenoyl-CoAに転換され、続いて
内在性ミクロソームリゾリン脂質アシル基転移酵素によって2-γ- linolenoyl-
リン脂質に転換される。けん化によって、2-γ- linolenoyl-リン脂質がcisリノ
レン酸に転換され、これをこのアッセイにおける生成物として測定する。HORP−
5 cDNAに形質転換された哺乳類細胞及び調節細胞から精製したミクロソームを、
Buffer A（０．２５Ｍのスクロース及び０．１５ＭのKCL、１．５ｍＭのグルタ
チオン、５ｍＭの塩化マグネシウム、４ｍＭのEDTAを含むｐＨ７．４の０．０５
Ｍのリン酸カリウム）に懸濁する。このミクロソーム（０．５ｍｇ／ｍｌのタン
パク質）をBuffer A（７．５ｍＭのATP及び１ｍＭのCoenzyme A、２．６ｍＭのN
ADH、４０ｍＭのKF、０．３３ｍＭのニコチンアミド、ウシ血清アルブミン（１
１．５μｇ／μｇの脂肪酸を添加）、[１−14Ｃ]リノール酸（０．４５−１０．
９ｎｍｏｌ、２６−６３２ｎＣｉ）を含み、総量が１ｍｌ）でインキュベートす
る。３５℃で１分間に６０回振盪して、０〜１０分間インキュベートした。０．
００５％のブチル化ヒドロキシトルエンを含むメタノールに１０％の水酸化カリ
ウムを１ｍｌ添加して反応を終了させる。[0208] Alternatively, the activity of HORP-5 is measured by determining the linoleic acid c in purified microsomes.
is demonstrated by its ability to convert to linolenic acid (Ivanetich, KM et al. (1996) Bioch
im. Biophys. Acta 1292: 120-132.). Endogenous microsomal acyl-Coenzyme A (CoA)
Linoleic acid is converted by the synthase to linoleoyl-CoA, a direct substrate for HORP-5. HORP-5 converts linoleoyl-CoA to linolenoyl-CoA, followed by 2-γ-linolenoyl-CoA by endogenous microsomal lysophospholipid acyltransferase.
Converted to phospholipids. Saponification converts 2-γ-linolenoyl-phospholipid to cis-linolenic acid, which is measured as a product in this assay. HORP−
5 Microsomes purified from mammalian cells and regulatory cells transformed into cDNA
Buffer A (0.05 at pH 7.4 containing 0.25 M sucrose and 0.15 M KCL, 1.5 mM glutathione, 5 mM magnesium chloride, 4 mM EDTA)
M potassium phosphate). This microsome (0.5 mg / ml protein) was transferred to Buffer A (7.5 mM ATP and 1 mM Coenzyme A, 2.6 mM N
ADH, 40 mM KF, 0.33 mM nicotinamide, bovine serum albumin (1
Addition of fatty acids 1.5μg / μg), [1- 14 C] linoleic acid (0.45-10.
Incubate with 9 nmol, 26-632 nCi) for a total volume of 1 ml). Shake at 35 ° C. 60 times for 1 minute and incubate for 0 to 10 minutes. 0.
The reaction is terminated by adding 1 ml of 10% potassium hydroxide to methanol containing 005% butylated hydroxytoluene.
【０２０９】 １ｍｇの脂肪酸担体を含む反応混合液を６０℃で３０分間アルゴン下でけん化
し、酸性化し、２ｍｌのヘキサンで３回抽出した。ヘキサン抽出物を窒素下で約
４５℃で乾燥させ、脂肪酸を０．５ｍｌのエタノールに溶解してその溶液を０．
４５μｍのフィルターを透過させた。脂肪酸基質と生成物を高性能液体クロマト
グラフィーカラム（Zorbax ODS, DuPont, Wilmington, DE, 25 cm × 0.45 cm;
または Spherisorb ODS, Phase Separations, UK, 25 cm ×0.45 cm, 細孔サイ
ズ10 μm ）上に分離した。カラムを、流速２ｍｌ／分でアセトニトリル：３０
ｍＭのリン酸(65:3 5, v/v)に通す。２ｍｌの画分を収集して、液体シンチレー
ションカウンターで各画分の放射能を測定する。Zorbax ODS (35℃で流す) 及び
Spherisorh（25℃で流す）での保持時間は、リノール酸（基質）の場合はそれぞ
れ、２４±２分及び１５±１分であり、cis-リノレン酸（生成物）の場合はそれ
ぞれ１６±１分及び１１±１分である。δ−６不飽和化酵素活性は、ｄｐｍ（壊
変毎分）生成物／（ｄｐｍ生成物＋ｄｐｍ基質）の比率から計算できる。HORP−
5を形質移入した細胞のミクロソームの活性が、調節細胞の活性を上回っている
のはHORP−5のためである。The reaction mixture containing 1 mg of the fatty acid carrier was saponified at 60 ° C. for 30 minutes under argon, acidified and extracted three times with 2 ml of hexane. The hexane extract is dried at about 45 ° C. under nitrogen, the fatty acid is dissolved in 0.5 ml of ethanol and the solution is dissolved in 0.5 ml of ethanol.
The light was passed through a 45 μm filter. The fatty acid substrate and the product are subjected to a high performance liquid chromatography column (Zorbax ODS, DuPont, Wilmington, DE, 25 cm × 0.45 cm;
Or Spherisorb ODS, Phase Separations, UK, 25 cm × 0.45 cm, pore size 10 μm). The column was washed with acetonitrile: 30 at a flow rate of 2 ml / min.
Pass through mM phosphoric acid (65:35, v / v). Collect 2 ml fractions and measure the radioactivity of each fraction in a liquid scintillation counter. Zorbax ODS (flow at 35 ° C) and
The retention times in Spherisorh (flowing at 25 ° C.) are 24 ± 2 min and 15 ± 1 min for linoleic acid (substrate) and 16 ± 1 min for cis-linolenic acid (product), respectively. Min and 11 ± 1 min. δ-6 desaturase activity can be calculated from the ratio of dpm (decay per minute) product / (dpm product + dpm substrate). HORP−
It is because of HORP-5 that the microsomal activity of cells transfected with 5 exceeds that of regulatory cells.
【０２１０】 更なる別法では、HORP−6の活性は、再構成されたリン脂質小胞膜における膜
貫通電子伝達を触媒する能力によって実証する(Srivastava, M. 他 (1984) J. B
iol. Chem. 259:8072-8075.)。このアッセイでは、小胞内のアスコルビン酸から
外部媒質のフェリチトクロムへの電子の伝達を測定する。小胞を準備するために
、ヘキサンの卵ホスファチジルコリン（４ｍｇ、Sigma）を窒素下で乾燥させる
。乾燥脂質に１０％のコール酸塩１００μｌを加え、溶液が透明になるまで超音
波処理機で超音波処理する。１％のオクチルグルコシド（Sigma）のHORP−6を超
音波処理した混合物と速やかに混合する。HUCY-2／脂質／界面活性剤混合液を、
２００ｍｌの５０ｍＭの4-(2-ヒドロキシエチル)-1- piperazineethanesulfonic
酸（Herpes）pH7.4、０．０５ＭのNaCl、０．１Ｍのアスコルビン酸に対して、
窒素下４℃で２４時間透析して、アスコルビン酸が負荷された小胞を用意する。
コール酸塩及びオクチルグルコシドの除去を促進するために、４ｇのSM-2 Bio-B
eads(Bio-Rad)を別の透析バッグに詰め、Hepes／塩緩衝液に加える。通常は、１
〜２ｎｍｏｌのHORP−6を用い、オクチルグルコシドとコール酸塩とホスファチ
ジルコリンとのモル比率を約７：６：１とする。HORP−6とリン脂質との比率は
約１：５０００である。水和Sephadex G-25-80(5 ml bed volume)でサンプル（
通常は０．６ｍｌ）を遠心分離し、Sephadexカラムを通して精製した小胞を収集
して、小胞から外部アスコルビン酸を分離する(Fry, D.W. 他 (1978) Anal. Bio
chem. 90:809-8 15.)。In yet another alternative, the activity of HORP-6 is demonstrated by its ability to catalyze transmembrane electron transfer in reconstituted phospholipid vesicle membranes (Srivastava, M. et al. (1984) J. B.
iol. Chem. 259: 8072-8075.). This assay measures the transfer of electrons from ascorbic acid in vesicles to ferricytochrome in the external medium. To prepare the vesicles, dry hexane egg phosphatidylcholine (4 mg, Sigma) under nitrogen. Add 100 μl of 10% cholate to the dried lipid and sonicate with a sonicator until the solution is clear. Immediately mix HORP-6 of 1% octyl glucoside (Sigma) with the sonicated mixture. HUCY-2 / lipid / surfactant mixture
200 ml of 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic
Acid (Herpes) pH 7.4, 0.05M NaCl, 0.1M ascorbic acid
Dialysis at 4 ° C. for 24 hours under nitrogen provides vesicles loaded with ascorbic acid.
To facilitate the removal of cholate and octylglucoside, 4 g of SM-2 Bio-B
Pack the eads (Bio-Rad) into another dialysis bag and add to Hepes / salt buffer. Usually 1
Using ２2 nmol of HORP-6, the molar ratio of octylglucoside, cholate and phosphatidylcholine is about 7: 6: 1. The ratio of HORP-6 to phospholipid is about 1: 5000. Sample with hydrated Sephadex G-25-80 (5 ml bed volume)
(Usually 0.6 ml), centrifuged, collect the purified vesicles through a Sephadex column, and separate external ascorbic acid from the vesicles (Fry, DW et al. (1978) Anal. Bio.
chem. 90: 809-8 15.).
【０２１１】 フェリチトクロムｃは、２ｍＭのウマチトクロムｃ（Sigma）にフェリシアン
化カリウム（４ｍＭ）を添加して用意する。溶液を２００倍量の０．３Ｍのスク
ロース、１０ｍＭのHepes/KOH、ｐＨ７．０に対して４℃で２４時間透析し、５
０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４、０．１５ＭのNaClで平衡のSephadex G-25カラムを
通過させて、フェリシアン化物を除去する。フェリチトクロムｃを小胞に加える
。小胞内に閉じ込められたアスコルビン酸から電子を伝達することで、フェリチ
トクロムｃが減少し、小胞溶液の５５０ｎｍでの吸光度が高まる。従って、分光
光度計で測定する５５０ｎｍでの吸光度の上昇は、小胞内のHORP−6の量に比例
する。[0211] Ferric cytochrome c is prepared by adding potassium ferricyanide (4 mM) to 2 mM horse cytochrome c (Sigma). The solution was dialyzed against 200 volumes of 0.3 M sucrose, 10 mM Hepes / KOH, pH 7.0 for 24 hours at 4 ° C.
Pass through a Sephadex G-25 column equilibrated with 0 mM Hepes, pH 7.4, 0.15 M NaCl to remove ferricyanide. Ferritichrome c is added to the vesicles. Transferring electrons from ascorbic acid confined within the vesicles reduces ferricytochrome c and increases the absorbance of the vesicle solution at 550 nm. Thus, the increase in absorbance at 550 nm as measured by a spectrophotometer is proportional to the amount of HORP-6 in the vesicle.
【０２１２】 １１ 機能的アッセイ HORPの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
HORPをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレ
ベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニン
グする。このようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies. Gaither
sburg. MD)及びpCRTM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイ
トメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを
、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔
法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含
む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により
、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識
タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想
できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP) (Clontech,
Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。レーザ
ー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、GFPまたは
CD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシスの状態などの特
性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する
蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ
化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオ
キシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、
特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質
の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって
計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ormerod, M.
G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に記載されている
。 11 Functional Assay HORP functions at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems.
It is assessed by expression of the sequence encoding HORP. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Such vectors include pCMV SPORT ™ (Life Technologies. Gaither
sburg. MD) and pCR ™ 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), both containing the cytomegalovirus promoter. 5-10 μg of the recombinant vector is preferably transiently transfected into human cell lines, preferably of endothelial or hematopoietic origin, by liposome preparation or electroporation. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein allows one to distinguish between transfected and non-transfected cells. Further, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. Such labeled proteins include green fluorescent protein (GFP) (Clontech,
Palo Alto, CA), and CD64 or CD64-GFP fusion proteins. Using automatic flow cytometry (FCM), which utilizes laser optics-based technology,
Transfected cells expressing CD64-GFP are identified and characterized such as apoptotic status. In addition, the FCM detects and measures the incorporation of a fluorescent molecule that diagnoses the phenomenon of preceding or simultaneous cell death. These phenomena include changes in nuclear DNA content as measured by staining DNA with propidium iodide, down-regulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine,
Includes changes in cell surface and intracellular protein expression as measured by reactivity with specific antibodies, and changes in plasma membrane composition as measured by binding of fluorescent complex annexin V protein to the cell surface It is. Flow cytometry is described in Ormerod, M.
G. (1994) Flow Cytometry (Oxford, New York, NY.).
【０２１３】 遺伝子発現におけるHORPの影響は、HORPをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グ
ロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参照)。ｍＲＮ
Ａは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。HORP及び目的の他
の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で
分析することができる。The effect of HORP on gene expression was determined by the sequence encoding HORP and CD64 or CD64-G
Highly purified cell populations transfected with either of the FPs can be evaluated. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64. (See DYNAL. Lake Success. NY). mRN
A can be purified from cells by methods known in the art. Expression of mRNA encoding HORP and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
【０２１４】 １２ HORPに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE) (例えば、Harrington,M.G. (1990)
Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術を用いて実質的に精
製されたHORPを、標準的なプロトコルによりウサギを免疫化し、抗体を作り出す
ために用いる。 12 Production of Antibodies Specific for HORP Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) (eg, Harrington, MG (1990)
HORP, substantially purified using Methods Enzymol. 182: 488-495) or other purification techniques, is used to immunize rabbits and generate antibodies according to standard protocols.
【０２１５】 別法では、HORPアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（DNASTAR In
c.）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを
合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、
或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択につい
ては、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel他による11章を参照)。[0215] Alternatively, the HORP amino acid sequence is sequenced using LASERGENE software (DNASTAR In
The region having high immunogenicity is determined by analysis using c.), and the corresponding oligopeptide is synthesized and used to produce an antibody by a method well known to those skilled in the art. Near the C-terminal,
Alternatively, the selection of appropriate epitopes, such as epitopes in adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel et al., Supra, Chapter 11).
【０２１６】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用い
た反応によりＫＬＨ（Sigma, St. Louis, MO）に結合させて、免疫原生を高める
(例えば、前出のAusubel 他による文献を参照)。フロイントの完全アジュバント
においてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた
抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合
し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに
放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。Usually, oligopeptides of about 15 residues in length are synthesized by fmoc chemistry using Applied Biosystems peptide synthesizer Model 431A, using N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). KLH (Sigma, St. Louis, MO) by the reaction that has been used to enhance immunogenicity
(See, for example, Ausubel et al., Supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in Freund's complete adjuvant. To test the anti-peptide activity of the obtained antiserum, for example, the peptide is bound to plastic, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and further treated with radioactive iodine-labeled goat antiserum. React with rabbit IgG.
【０２１７】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生HORPの精製 自然発生HORP或いは組換えHORPを、HORPに特異的な抗体を用いるイムノアフィ
ニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Pharmacia & Upjohn）のような活性化クロマトグ
ラフィー用レジンとHORP抗体とを共有結合させることにより構築する。結合の後
、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。13. Purification of naturally occurring HORP using specific antibodies Naturally occurring HORP or recombinant HORP is substantially purified by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for HORP. An immunoaffinity column is constructed by covalently linking a HORP antibody to an activation chromatography resin such as CNBr-activated SEPHAROSE (Pharmacia & Upjohn). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
【０２１８】 HORPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをHORPを
優先的に吸着できる条件下で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強
度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とHORPとの結合を切るような
条件下で（例えば、ｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシ
アン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、HORPを回収する。The culture containing HORP is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of HORP (eg, with a buffer of high ionic strength in the presence of a detergent). The column is eluted under conditions that disrupt the binding of the antibody to HORP (eg, with a buffer of pH 2-3 or a high concentration of chaotropic ions such as urea or thiocyanate ions) to recover HORP. .
【０２１９】 １４ HORPと相互作用する分子の同定 HORP又は生物学的に活性なその断片を、125Ｉボルトンハンター試薬（例えば
、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウェルプ
レートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したHORPと共にインキュベート
し、洗浄して、標識したHORP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々
なHORP濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とHORPとの結合、親和性、数
について数値を計算する。 14 Identification of Molecules That Interact with HORP HORP or a biologically active fragment thereof is labeled with 125 I Bolton Hunter reagent (see, eg, Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133: 529). . Candidate molecules pre-arranged in a multiwell plate are incubated with labeled HORP, washed and all wells with labeled HORP complexes are assayed. Using data obtained at various HORP concentrations, numerical values are calculated for the binding, affinity, and number of candidate molecules to HORP.
【０２２０】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。Those skilled in the art will be able to make various modifications of the described method and system without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described with reference to certain preferred embodiments, it is to be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be covered by the following claims. .
【０２２１】 表の簡単な説明 表１の第１の列は、ポリペプチドの配列番号(SEQ ID NO:1−6)を示す。第２の
列は、HORPをコードするコンセンサス配列のヌクレオチド配列番号(SEQ ID NO:7
−12)を示す。第３の列は、それぞれのHORPをコードする核酸が初めに同定され
たインサイト社クローン番号を示す。第４の列は、クローンが単離された組織ラ
イブラリを示す。第５の列は、コンセンサス配列SEQ ID NO:7−12を作り出すた
めに用いた重複及び／または延長された核酸配列を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE TABLES The first column of Table 1 shows the polypeptide SEQ ID NOs (SEQ ID NOs: 1-6). The second column is the nucleotide sequence number of the consensus sequence encoding HORP (SEQ ID NO: 7).
−12). The third column indicates the Incyte clone number at which the nucleic acid encoding each HORP was originally identified. The fourth column shows the tissue library from which the clone was isolated. The fifth column shows the duplicated and / or extended nucleic acid sequences used to generate the consensus sequence SEQ ID NOs: 7-12.
【０２２２】 表２の第１の列は、ポリペプチドの配列番号を示す。第２の列は、SEQ ID NO:
1−6のアミノ酸残基の数を示す。第３の列は、SEQ ID NO:1−6の潜在リン酸化部
位を示し、第４の列は潜在Ｎグリコシル化部位を示す。第５の列は、SEQ ID NO:
1−6に存在する重要なタンパク質ファミリーサイン（protein family signature
）またはリガンド／基質結合モチーフを示す。第６の列は、タンパク質の識別を
示す。第７の列は、ポリペプチドの同定に用いた分析またはアルゴリズムの方法
を示す。[0222] The first column of Table 2 shows the SEQ ID NO of the polypeptide. The second column contains SEQ ID NO:
Shows the number of 1-6 amino acid residues. The third column shows the potential phosphorylation sites of SEQ ID NO: 1-6, and the fourth column shows the potential N-glycosylation sites. The fifth column contains SEQ ID NO:
Important protein family signatures present in 1-6
) Or a ligand / substrate binding motif. The sixth column shows the identity of the protein. The seventh column indicates the analytical or algorithmic method used to identify the polypeptide.
【０２２３】 表３の第１の列は、ポリヌクレオチドの配列番号(SEQ ID NO:7−12)を示す。
第２の列は、HORPの発現組織及びSEQ ID NO:7−12を発現する全組織の割合を示
す。第３の列は、SEQ ID NO:7−12を発現する分類した疾患名とその発現割合を
示す。第４の列は、ｃＤＮＡライブラリをサブクローニングするのに用いたベク
ターを示す。The first column of Table 3 shows the polynucleotide SEQ ID NO (SEQ ID NOs: 7-12).
The second column shows the tissues expressing HORP and the percentage of total tissues expressing SEQ ID NOs: 7-12. The third column shows the names of the classified diseases expressing SEQ ID NOs: 7-12 and their expression ratios. The fourth column shows the vector used to subclone the cDNA library.
【０２２４】 表４の第１の列は、HORP−1及びHORP−2、HORP−3、HORP−4のヌクレオチド配
列番号(SEQ ID NO:7−12)を示す。第２の列は、対応するインサイト社クローン
番号を示す。第３の列は、クローンが作り出された組織のライブラリの説明を示
す。[0224] The first column of Table 4 shows the nucleotide sequence numbers of HORP-1 and HORP-2, HORP-3, HORP-4 (SEQ ID NOs: 7-12). The second column shows the corresponding Insights clone number. The third column gives a description of the library of tissues from which the clone was created.
【０２２５】 表５は、HORPの分析に用いたプログラム及びアルゴリズム、データベース、有
効スコアを示す。表５の第１の列はツール及びプログラム、アルゴリズム、第２
の列はデータベース、第３の列は短い説明、第４の列（該当欄）は、２つの配列
間の一致の程度（値が大きいほどその相同性が高い）を決定するスコアを示す。[0225] Table 5 shows the programs and algorithms, databases, and effective scores used for HORP analysis. The first column of Table 5 shows tools and programs, algorithms, second
The third column shows the database, the third column shows the short description, and the fourth column (corresponding column) shows the score that determines the degree of matching between the two sequences (the higher the value, the higher the homology).
【表１】 [Table 1]
【表２】 [Table 2]
【表３】 [Table 3]
【表４】 [Table 4]
【表５】 [Table 5]
【表６】 [Table 6]
【表７】 [Table 7]
【配列表】 [Sequence list]
【図１Ａ】 HORP−5（008879; SEQ ID NO:5）とヒマワリチトクロムb5／不飽和化酵素融合タ
ンパク質（GI 1040729; SEQ ID NO:13）との間のアミノ酸配列アライメントの一
部を示す。FIG. 1A shows a portion of an amino acid sequence alignment between HORP-5 (008879; SEQ ID NO: 5) and a sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein (GI 1040729; SEQ ID NO: 13).
【図１Ｂ】 HORP−5（008879; SEQ ID NO:5）とヒマワリチトクロムb5／不飽和化酵素融合タ
ンパク質（GI 1040729; SEQ ID NO:13）との間のアミノ酸配列アライメントの一
部を示す。FIG. 1B shows a portion of the amino acid sequence alignment between HORP-5 (008879; SEQ ID NO: 5) and sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein (GI 1040729; SEQ ID NO: 13).
【図１Ｃ】 HORP−5（008879; SEQ ID NO:5）とヒマワリチトクロムb5／不飽和化酵素融合タ
ンパク質（GI 1040729; SEQ ID NO:13）との間のアミノ酸配列アライメントの一
部を示す。FIG. 1C shows a portion of an amino acid sequence alignment between HORP-5 (008879; SEQ ID NO: 5) and a sunflower cytochrome b5 / desaturase fusion protein (GI 1040729; SEQ ID NO: 13).
【図２Ａ】 HORP−6（2274011; SEQ ID NO:6）とヒトチトクロムb561（GI 1345640; SEQ ID
NO:14）との間のアミノ酸配列アライメントの一部を示す。この配列アライメン
トは、LASERGENETMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）のマルチシーケン
スアライメントプログラムを用いて作成された。FIG. 2A shows HORP-6 (2274011; SEQ ID NO: 6) and human cytochrome b561 (GI 1345640; SEQ ID NO: 6).
NO: 14) shows a part of the amino acid sequence alignment between the two. This sequence alignment was generated using the multi-sequence alignment program of LASERGENE ™ software (DNASTAR Inc, Madison WI).
【図２Ｂ】 HORP−6（2274011; SEQ ID NO:6）とヒトチトクロムb561（GI 1345640; SEQ ID
NO:14）との間のアミノ酸配列アライメントの一部を示す。この配列アライメン
トは、LASERGENETMソフトウエア（DNASTAR Inc, Madison WI）のマルチシーケン
スアライメントプログラムを用いて作成された。FIG. 2B: HORP-6 (2274011; SEQ ID NO: 6) and human cytochrome b561 (GI 1345640; SEQ ID NO: 6)
NO: 14) shows a part of the amino acid sequence alignment between the two. This sequence alignment was generated using the multi-sequence alignment program of LASERGENE ™ software (DNASTAR Inc, Madison WI).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ 1/19 9/02 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/50 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ゴルゴン、ジーナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95006・ ボールダークリーク・パインクレストドラ イブ 1253 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 CA04 DA02 DA06 GA14 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ22 QQ42 QQ52 QR56 QR84 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 CE12 CE13 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA28 CA44 CA46 4C084 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 CA04 CA53 CA56 DC23 NA14 ZA812 ZA942 ZB112 ZB212 ZC032 4H045 AA11 AA20 BA10 CA40 DA89 EA20 FA74 GA26 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/15 C12N 1/21 4C084 1/19 9/02 4H045 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/68 A 9/02 C12N 15/00 ZNAA C12P 21/02 A61K 37/50 C12Q 1/68 C12N 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES , FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE) , SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, R , TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK , MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Hillman, Jennifer El. Mountain View # 12, Monroe Drive 230, California, United States of America 230 (72) Inventor Tang, Wye Tom 95118, California, United States of America San Jose Runwick Co 4230 (72) Inventor Lal, Pleity 95054, Santa Clara Las Drive, California, USA 2382 (72) Inventor Korey, Neil Sea, 94040, Mountain View # 30, Dale Avenue, California, USA 1240 (72) Inventor Gegler Carl Jay, California United States 94025 Menlo Park Oakland Ave 1048 (72) Inventor Gorgon, Gina A, United States 95006 California Ball Dark Creek Pine Crest Drive 1253 (72) Inventor Bogun, Mariah Earl California, United States 94577 ・ San Leandro Santiago Road 14244 F-term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA08 CA04 DA02 DA06 GA14 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ22 QQ42 QQ52 QR56 QR84 QS25 QS34 4B064 AG01 CA27 CA02 C24 CE12 CE13 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA28 CA44 CA46 4C084 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 CA04 CA53 CA56 DC23 NA14 ZA812 ZA942 ZB112 ZB212 ZC032 4H045 AA11 AA20 EA20 GA40
Claims (20)
なる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。1. A substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-6 (SEQ ID NOs: 1-6) and fragments thereof.
性を有する実質的に精製された変異体。2. A substantially purified variant having an amino acid sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence of claim 1.
ポリヌクレオチド。3. An isolated and purified polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1.
チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。4. An isolated and purified polynucleotide variant having 90% or more polynucleotide sequence identity to the polynucleotide of claim 3.
ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。5. An isolated and purified polynucleotide which hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide of claim 3.
され精製されたポリヌクレオチド。6. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 3.
されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。7. An isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7-12 and fragments thereof.
チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。8. An isolated and purified polynucleotide variant having 90% or more polynucleotide sequence identity to the polynucleotide of claim 7.
され精製されたポリヌクレオチド。9. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 7.
含む発現ベクター。10. An expression vector comprising a fragment of at least one polynucleotide of claim 3.
されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
を特徴とする製造方法。12. A method for producing a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof, comprising: (a) under conditions suitable for expression of said polypeptide. And (b) recovering the polypeptide from the culture medium of the host cell.
医薬品組成物。13. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 1 together with a suitable pharmaceutical carrier.
抗体。14. A purified antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1.
は予防が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を
含む、当該疾患の治療または予防方法。17. A method for treating or preventing a disease associated with decreased expression or activity of HORP, comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 13 to a patient in need of treatment or prevention. Method.
は予防が必要な患者に、請求項１６のアンタゴニストを効果的な量投与する過程
を含む、当該疾患の治療または予防方法。18. A method for treating or preventing a disease associated with an increase in the expression or activity of HORP, comprising administering an effective amount of the antagonist of claim 16 to a patient in need of treatment or prevention.
の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの少なくとも１つ
の核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルに前記ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドが存在することと相関性を有する、該過程とを含
むことを特徴とする検出方法。19. A method for detecting a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-6 and fragments thereof in a biological sample, comprising: (a) 7.) a step of hybridizing the polynucleotide of claim 6 with at least one nucleic acid of the biological sample to form a hybridization complex; and (b) detecting the hybridization complex. A process wherein the presence of said hybridization complex is correlated with the presence of a polynucleotide encoding said polypeptide in said biological sample.
ドを増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。20. The method according to claim 19, further comprising amplifying the polynucleotide before the hybridization.
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