JP2002518062A - 生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための方法 - Google Patents
生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための方法であって、ａ）特定量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合体形成を許容する条件下で、インキュベートし；ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と、ステップａ）で反応していない量の認識剤との前期参照抗生物質との複合体形成を許容する条件下で接触させ；そしてｃ）前記支持体に固定された認識剤の量を決定することを含む。本発明は、前記認識剤が、バチルス・リケニホルミス（Ba cillus licheniformis）から得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを含むことを特徴とする。
Description
【０００１】 本発明は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のβ−ラク
タム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを用いて、生物流体中の
β−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための新規、迅速かつセンシティブな
方法に関する。本発明は、これらの方法を行うためのキットにも関する。
タム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセプターを用いて、生物流体中の
β−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための新規、迅速かつセンシティブな
方法に関する。本発明は、これらの方法を行うためのキットにも関する。
【０００２】 現在、抗生物質は、細菌によって引きおこされる感染性の疾患の治療における
治療剤としてばかりでなく、食物を保存するための剤として及び成長を刺激する
ための動物飼料中の添加物としても極めて広範囲に用いられている。従って、複
合生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽出物、発酵液又は緩衝
化水性媒体中で極めて低い濃度でさえ抗生物質の存在を検出することができる必
要性が次第に感じられている。
治療剤としてばかりでなく、食物を保存するための剤として及び成長を刺激する
ための動物飼料中の添加物としても極めて広範囲に用いられている。従って、複
合生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽出物、発酵液又は緩衝
化水性媒体中で極めて低い濃度でさえ抗生物質の存在を検出することができる必
要性が次第に感じられている。
【０００３】 ミルク生産の場合はこの一例である。なぜなら乳牛の特定の感染性疾患を治療
するために抗生物質を用いることは公知であるからである。 しかしながら、明らかな医学的理由のため、ヒトの消費を意図したミルクは原
則として、いずれの微量の抗生物質も含んではならない。更に、０．００５I.V.
／ml又はそれ未満のペニシリン濃度は、チーズ、ヨーグルト等のようなミルクベ
ースの製品の製造の間に有害な効果を有し得る。
するために抗生物質を用いることは公知であるからである。 しかしながら、明らかな医学的理由のため、ヒトの消費を意図したミルクは原
則として、いずれの微量の抗生物質も含んではならない。更に、０．００５I.V.
／ml又はそれ未満のペニシリン濃度は、チーズ、ヨーグルト等のようなミルクベ
ースの製品の製造の間に有害な効果を有し得る。
【０００４】 いくつかの状況を心に描くことができる。第１の場合、例えばワゴンに移す前
に農場で抗生物質の存在を検出するために、極めて迅速（５分未満）かつ簡単な
テストが優先される。例えば処理のために用いられている抗生物質が既知である
場合、及び更にこのテストが法的基準で問題の抗生物質の検出を許容する場合、
このような迅速なテストを用いることを考えることもできる。第２の場合、速度
が強調されない場合、法的基準で全てではないがほとんどの抗生物質を検出する
ことが重要である。
に農場で抗生物質の存在を検出するために、極めて迅速（５分未満）かつ簡単な
テストが優先される。例えば処理のために用いられている抗生物質が既知である
場合、及び更にこのテストが法的基準で問題の抗生物質の検出を許容する場合、
このような迅速なテストを用いることを考えることもできる。第２の場合、速度
が強調されない場合、法的基準で全てではないがほとんどの抗生物質を検出する
ことが重要である。
【０００５】 この理由は、特定の国の法が、極めて特異的な質の基準を強いるからである。
例えば、ＵＳ当局は、以下の６種の抗生物質のミルク中の濃度が極めて特定の値
を超えないことを要求とする：ペニシリン、５ppb ；アンピシリン、１０ppb ；
アモキシシリン、１０ppb ；シクロキサシリン、１０ppb ；セファピリン、２０
ppb ；セフチオフル、５０ppb 。ヨーロッパ共同体は、以下の質的基準を強いる
：ペニシリン、４ppb ；アモキシシリン、４ppb ；アンピシリン、４ppb ；シク
ロキサシリン、３０ppb ；ジシクロキサシリン、３０ppb ；オキサシリン、３０
ppb ；セファピリン、１０ppb ；セフチオフル、１００ppb ；セフキノン、２０
ppb ；ナフシリン、３０ppb ；セファゾリン、５０ppb 。
例えば、ＵＳ当局は、以下の６種の抗生物質のミルク中の濃度が極めて特定の値
を超えないことを要求とする：ペニシリン、５ppb ；アンピシリン、１０ppb ；
アモキシシリン、１０ppb ；シクロキサシリン、１０ppb ；セファピリン、２０
ppb ；セフチオフル、５０ppb 。ヨーロッパ共同体は、以下の質的基準を強いる
：ペニシリン、４ppb ；アモキシシリン、４ppb ；アンピシリン、４ppb ；シク
ロキサシリン、３０ppb ；ジシクロキサシリン、３０ppb ；オキサシリン、３０
ppb ；セファピリン、１０ppb ；セフチオフル、１００ppb ；セフキノン、２０
ppb ；ナフシリン、３０ppb ；セファゾリン、５０ppb 。
【０００６】 従って、抗生物質のほとんどが検出されるのを許容するであろうテストにアク
セスすることが有利であり得る。更に、乳業において、速度、感度及び簡単さの
特徴全てを有するテストの欠如下で、これら３つのパラメータの最も優れた組合
せを許容するテストが、それらが全体としてカバーされないなら、有利であろう
と考えることができる。
セスすることが有利であり得る。更に、乳業において、速度、感度及び簡単さの
特徴全てを有するテストの欠如下で、これら３つのパラメータの最も優れた組合
せを許容するテストが、それらが全体としてカバーされないなら、有利であろう
と考えることができる。
【０００７】 生物流体中にβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出のために種々の型のテスト
が既に提案されている。 これらのテストは一般に、抗生物質又はこの抗生物質のアナログを特異的に認
識する認識剤（レセプター又は抗体）、及びラベリング剤（放射性元素、酵素、
蛍光剤等）を用いる検出方法を利用する。ここでこれらの剤は、以後、検出剤と
呼ぶ。選択した要素により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオレセプタ
ーアッセイ（ＲＲＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）等が用いられる。それら
の一般的な原理において、これらのテストは、その値が存在する被検体の質を示
す結果を得ることを可能にするであろう上述の２つの要素（検出試薬）の最小の
組合せを用いる。
が既に提案されている。 これらのテストは一般に、抗生物質又はこの抗生物質のアナログを特異的に認
識する認識剤（レセプター又は抗体）、及びラベリング剤（放射性元素、酵素、
蛍光剤等）を用いる検出方法を利用する。ここでこれらの剤は、以後、検出剤と
呼ぶ。選択した要素により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオレセプタ
ーアッセイ（ＲＲＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）等が用いられる。それら
の一般的な原理において、これらのテストは、その値が存在する被検体の質を示
す結果を得ることを可能にするであろう上述の２つの要素（検出試薬）の最小の
組合せを用いる。
【０００８】 選択した検出法により、ラベリング剤は、認識剤による認識に関して認識剤に
、抗生物質に、又は抗生物質のアナログ物質にかわりに結合させることができる
ことに注意すべきである。認識剤、抗生物質又は抗生物質のアナログ物質は固有
的にラベリング剤を含む（例えば放射性標識化被検体）方法もある。 乳製品のために、最も広く記述される被検体検出テストは抗生物質の検出に関
する。
、抗生物質に、又は抗生物質のアナログ物質にかわりに結合させることができる
ことに注意すべきである。認識剤、抗生物質又は抗生物質のアナログ物質は固有
的にラベリング剤を含む（例えば放射性標識化被検体）方法もある。 乳製品のために、最も広く記述される被検体検出テストは抗生物質の検出に関
する。
【０００９】 ＵＳ特許４，２３９，８５２号は、β−ラクタム環を有する抗生物質のミルク
中での検出のための微生物学的方法を記載する。この方法によれば、ミルクのサ
ンプルは最初に、抗生物質に対して極めてセンシティブである微生物、特にバチ
ルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）の細胞部分の
存在下で、そして２番目に放射性元素で又は酵素で標識化（“タグ”）された抗
生物質の存在下でインキュベートされる。そのインキュベーションは、サンプル
中に存在するなら、抗生物質及び標識化抗生物質が細胞部分に結合するのを許容
する条件下で行われる。
中での検出のための微生物学的方法を記載する。この方法によれば、ミルクのサ
ンプルは最初に、抗生物質に対して極めてセンシティブである微生物、特にバチ
ルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）の細胞部分の
存在下で、そして２番目に放射性元素で又は酵素で標識化（“タグ”）された抗
生物質の存在下でインキュベートされる。そのインキュベーションは、サンプル
中に存在するなら、抗生物質及び標識化抗生物質が細胞部分に結合するのを許容
する条件下で行われる。
【００１０】 インキュベーションの後、細胞の部分はその混合物から分離され、次に洗浄さ
れる。次に、細胞部分に結合した標識化抗生物質の量が決定され、標準と比較さ
れる。細胞部分に結合した標識化抗生物質の量は分析するミルクサンプル中に存
在する抗生物質の濃度に逆比例する。 この方法は、特に混合物から細胞部分を分離する段階に、かなりきめ細かい取
扱いを要求する。更に、ミルク中に０．０１I.V.／mlまで及び０．００１I.V.／
mlまでさえのペニシリンＧの検出を許容する最もセンシティブな型において、こ
の方法は放射性元素（14Ｃ又は 125Ｉ）で標識された抗生物質を用いる。この場
合において、存在する又はさもなければミルク中に存在する抗生物質の量の測定
は、例えばシンチレーションカウンターのような特別の装置の使用を必要とする
。更に、極めて小量でさえ放射性物質を取り扱うことは、分析を行う人について
の危険性を完全になくさない。
れる。次に、細胞部分に結合した標識化抗生物質の量が決定され、標準と比較さ
れる。細胞部分に結合した標識化抗生物質の量は分析するミルクサンプル中に存
在する抗生物質の濃度に逆比例する。 この方法は、特に混合物から細胞部分を分離する段階に、かなりきめ細かい取
扱いを要求する。更に、ミルク中に０．０１I.V.／mlまで及び０．００１I.V.／
mlまでさえのペニシリンＧの検出を許容する最もセンシティブな型において、こ
の方法は放射性元素（14Ｃ又は 125Ｉ）で標識された抗生物質を用いる。この場
合において、存在する又はさもなければミルク中に存在する抗生物質の量の測定
は、例えばシンチレーションカウンターのような特別の装置の使用を必要とする
。更に、極めて小量でさえ放射性物質を取り扱うことは、分析を行う人について
の危険性を完全になくさない。
【００１１】 欧州特許出願５９３ １１２は、ミルク中の抗生物質の検出を許容する別の方
法を記載する。この方法は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus ）のような抗生物質感受性微生物から単離されたタンパク質を
用いる。このタンパク質は、ペルオキシダーゼのような酵素で更に標識される。 テストは次の通り行われる：ミルクのサンプルを標識化タンパク質の存在下で
チューブ内でインキュベートし；インキュベーションの後、ミルクを、その壁に
参照抗生物質が固定されている第２のチューブに移し；第２のインキュベーショ
ンを行い、そして次にそのチューブの内容物を除去し；この第２のチューブの壁
を洗浄液で３回、洗い、それ自体を除去し、そして次に第２のチューブ中に存在
する残留物を吸収性紙の断片に移し；次にその第２のチューブに有色物質を加え
、それを再び１回、インキュベートし、そして次にその色の発達を遅らせる溶液
を加え；そのチューブの色を抗生物質の標準サンプルで平行に行った同一のテス
トの色と比較する。支持体上に固定された標識化タンパク質の量、及びそれゆえ
色の強度は分析したミルクサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例する。
法を記載する。この方法は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus ste arothermophilus ）のような抗生物質感受性微生物から単離されたタンパク質を
用いる。このタンパク質は、ペルオキシダーゼのような酵素で更に標識される。 テストは次の通り行われる：ミルクのサンプルを標識化タンパク質の存在下で
チューブ内でインキュベートし；インキュベーションの後、ミルクを、その壁に
参照抗生物質が固定されている第２のチューブに移し；第２のインキュベーショ
ンを行い、そして次にそのチューブの内容物を除去し；この第２のチューブの壁
を洗浄液で３回、洗い、それ自体を除去し、そして次に第２のチューブ中に存在
する残留物を吸収性紙の断片に移し；次にその第２のチューブに有色物質を加え
、それを再び１回、インキュベートし、そして次にその色の発達を遅らせる溶液
を加え；そのチューブの色を抗生物質の標準サンプルで平行に行った同一のテス
トの色と比較する。支持体上に固定された標識化タンパク質の量、及びそれゆえ
色の強度は分析したミルクサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例する。
【００１２】 この特許出願の実施例１によれば、このテストはペニシリンＧを５ppb のオー
ダーの濃度まで検出することを可能にし、アモキシシリン（５ppb ）、アンピシ
リン（１０ppb ）、セファピリン（５ppb ）及びセフチオフル（５ppb ）を検出
することを可能にする。このテストは、ヨーロッパの規制により強いられるレベ
ルまでペニシリン、アモキシシリン及びアンピシリンの検出を許容せず、他方、
このテストはむしろ複雑であり；それは本発明の文脈に見い出される感度及び簡
単さの基準を全体的に満足しない。
ダーの濃度まで検出することを可能にし、アモキシシリン（５ppb ）、アンピシ
リン（１０ppb ）、セファピリン（５ppb ）及びセフチオフル（５ppb ）を検出
することを可能にする。このテストは、ヨーロッパの規制により強いられるレベ
ルまでペニシリン、アモキシシリン及びアンピシリンの検出を許容せず、他方、
このテストはむしろ複雑であり；それは本発明の文脈に見い出される感度及び簡
単さの基準を全体的に満足しない。
【００１３】 しかしながら、そのテストは特に熟練していない人が行うには極めて面倒であ
る。実際、このテストは、１つの容器から別の容器に液体及び残留物を移すステ
ップ、及びいくつかのゆすぎステップを含む多数のステップを含む。このテスト
に要求されるステップの数及び型を仮定すれば、信頼できる結果を得ることは、
ひどく、作業者の実験上のノウハウに依存する。
る。実際、このテストは、１つの容器から別の容器に液体及び残留物を移すステ
ップ、及びいくつかのゆすぎステップを含む多数のステップを含む。このテスト
に要求されるステップの数及び型を仮定すれば、信頼できる結果を得ることは、
ひどく、作業者の実験上のノウハウに依存する。
【００１４】 更に、結果を解釈するには平行して行うべき２つのテストを要求し、これによ
りその作業を増加させ更に複雑にする。 他の型の酵素的方法も開示されており、それは、アクチノマデュラＲ３９（Ac tinomadure R39 ）により生産される特定の酵素、即ち可溶性細胞外Ｄ−アラニル
−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ（以後、“酵素Ｒ３９”と呼ぶ）の使用
に基づく、ミルク内の低濃度の抗生物質を測定することを可能にする（J.M.Frer
eら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510(1980) 、並び
に特許ＥＰ ８５ ６６７及びＥＰ ４６８ ９４６）。酵素Ｒ３９は種々のペ
プチドのＤ−アラニル−Ｄ−アラニン基を加水分解する比活性を有し、特定のチ
オエステルを加水分解することもできる。
りその作業を増加させ更に複雑にする。 他の型の酵素的方法も開示されており、それは、アクチノマデュラＲ３９（Ac tinomadure R39 ）により生産される特定の酵素、即ち可溶性細胞外Ｄ−アラニル
−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ（以後、“酵素Ｒ３９”と呼ぶ）の使用
に基づく、ミルク内の低濃度の抗生物質を測定することを可能にする（J.M.Frer
eら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510(1980) 、並び
に特許ＥＰ ８５ ６６７及びＥＰ ４６８ ９４６）。酵素Ｒ３９は種々のペ
プチドのＤ−アラニル−Ｄ−アラニン基を加水分解する比活性を有し、特定のチ
オエステルを加水分解することもできる。
【００１５】 更に、酵素Ｒ３９はβ−ラクタム環を有する抗生物質と反応して、極めて迅速
に、不活性かつ実質的に不可逆性である等モルの酵素−抗生物質複合体を形成す
る。 このテストの最新型（ＥＰ ４６８ ９４６）においては、検査すべき予め決
められた容量のサンプルが、予め決められた量の酵素Ｒ３９と、サンプル中に存
在し得るβ−ラクタム抗生物質が酵素と反応して不活性かつ実質的に不可逆性で
ある等モルの酵素−抗生物質複合体を形成するのを許容する条件下でインキュベ
ートされる。
に、不活性かつ実質的に不可逆性である等モルの酵素−抗生物質複合体を形成す
る。 このテストの最新型（ＥＰ ４６８ ９４６）においては、検査すべき予め決
められた容量のサンプルが、予め決められた量の酵素Ｒ３９と、サンプル中に存
在し得るβ−ラクタム抗生物質が酵素と反応して不活性かつ実質的に不可逆性で
ある等モルの酵素−抗生物質複合体を形成するのを許容する条件下でインキュベ
ートされる。
【００１６】 次に、予め決められた量のチオエステル型基質が第１段階で得られた産物と、
第１のインキュベーションの過程で抗生物質と複合体形成していない残存酵素Ｒ
３９により基質が加水分解される条件下でインキュベートする。これにより形成
されたメルカプトアルカン酸は、次にそのメルカプトアルカン酸の遊離ＳＨ基と
の反応により色を形成することができる試薬の助けで比色アッセイにより測定さ
れる。その色の強度は既知の量の抗生物質を含むサンプルから事前に確認された
標準と比較される。定量的測定は、分光光度計での測定により行うことができ；
ミルクの場合、事前にサンプルを浄化することが必要になり得る。
第１のインキュベーションの過程で抗生物質と複合体形成していない残存酵素Ｒ
３９により基質が加水分解される条件下でインキュベートする。これにより形成
されたメルカプトアルカン酸は、次にそのメルカプトアルカン酸の遊離ＳＨ基と
の反応により色を形成することができる試薬の助けで比色アッセイにより測定さ
れる。その色の強度は既知の量の抗生物質を含むサンプルから事前に確認された
標準と比較される。定量的測定は、分光光度計での測定により行うことができ；
ミルクの場合、事前にサンプルを浄化することが必要になり得る。
【００１７】 特許ＥＰ ４６８，９４６の実施形態によれば、この方法は、ミルク内で、５
分の全インキュベーション時間でペニシリンＧ １０ppb を、１５分の全インキ
ュベーション時間でペニシリンＧ約２．５ppb を測定することを可能にする。 食品中の抗生物質を検出するための方法のために必要とされる速度、簡単さ及
び感度の基準を仮定すれば、その出願人は、生物流体中の抗生物質を検出するた
めの新規なより有効な方法を研究する目的を主張する。特に、出願人は、１回の
テストで、ヨーロッパ及びＵＳ当局によりその含有が規制される抗生物質のほと
んどを検出するための方法を研究する目的を主張する。更に、その研究した方法
は、好ましくは資格のない人が行うことができる限られた数のステップでこの結
果を得ることを可能にするはずである。その出願人は、現在の方法より短いイン
キュベーション時間でこれらの目的を達成するための方法も研究した。
分の全インキュベーション時間でペニシリンＧ １０ppb を、１５分の全インキ
ュベーション時間でペニシリンＧ約２．５ppb を測定することを可能にする。 食品中の抗生物質を検出するための方法のために必要とされる速度、簡単さ及
び感度の基準を仮定すれば、その出願人は、生物流体中の抗生物質を検出するた
めの新規なより有効な方法を研究する目的を主張する。特に、出願人は、１回の
テストで、ヨーロッパ及びＵＳ当局によりその含有が規制される抗生物質のほと
んどを検出するための方法を研究する目的を主張する。更に、その研究した方法
は、好ましくは資格のない人が行うことができる限られた数のステップでこの結
果を得ることを可能にするはずである。その出願人は、現在の方法より短いイン
キュベーション時間でこれらの目的を達成するための方法も研究した。
【００１８】 本出願人は、これらの目的を注目すべき様式で達成することを許容する、生物
流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための新規方法を発見した。 従って、本発明は、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するた
めの新規な方法であって、 ａ）決められた量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得ら
れた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合
体形成を許容する条件下で、インキュベートし； ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少くとも１の参
照抗生物質と、ステップａ）で反応していない量の認識剤との前記参照抗生物質
との複合体形成を許容する条件下で接触させ；そして ｃ）前記支持体に結合した認識剤の量を決定すること を含み、ここで、前記認識剤が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheni formis ）から得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセ
プターを含むことを特徴とする方法に関する。
流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するための新規方法を発見した。 従って、本発明は、生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するた
めの新規な方法であって、 ａ）決められた量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得ら
れた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合
体形成を許容する条件下で、インキュベートし； ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少くとも１の参
照抗生物質と、ステップａ）で反応していない量の認識剤との前記参照抗生物質
との複合体形成を許容する条件下で接触させ；そして ｃ）前記支持体に結合した認識剤の量を決定すること を含み、ここで、前記認識剤が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheni formis ）から得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセ
プターを含むことを特徴とする方法に関する。
【００１９】 本発明による方法の例外的性能は特定の認識剤の使用に基づき、それは、バチ
ルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受
性であるレセプター、即ちその単離及びペプチド配列がY.Zhu ら、J.Bacteriol.
, 1137-1141, (1990) に記載されるＢｌａＲタンパク質、又はその単離及びペプ
チド配列がB.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)に記載さ
れるＢｌａＲのカルボキシ末端領域であるＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチドを含む
。
ルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受
性であるレセプター、即ちその単離及びペプチド配列がY.Zhu ら、J.Bacteriol.
, 1137-1141, (1990) に記載されるＢｌａＲタンパク質、又はその単離及びペプ
チド配列がB.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)に記載さ
れるＢｌａＲのカルボキシ末端領域であるＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチドを含む
。
【００２０】 β−ラクタム環を含む抗生物質の検出のための本発明によるＢｌａＲ又はＢｌ
ａＲ−ＣＴＤレセプターの使用は、以前に用いられる認識剤よりかなりの利点を
有する。この理由は、ＢｌａＲ及びＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは、極めて迅速
に極めて多数の抗生物質と複合体を形成することができ、そして既知の認識剤、
例えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）か
ら得られるレセプターのために要求されるのより短いインキュベーション時間で
それを行うことができるからである。
ａＲ−ＣＴＤレセプターの使用は、以前に用いられる認識剤よりかなりの利点を
有する。この理由は、ＢｌａＲ及びＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは、極めて迅速
に極めて多数の抗生物質と複合体を形成することができ、そして既知の認識剤、
例えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus ）か
ら得られるレセプターのために要求されるのより短いインキュベーション時間で
それを行うことができるからである。
【００２１】 本発明による方法により検出することができる抗生物質の例としては次の抗生
物質がある：ベンジルペニシリン（又はペニシリンＧ）、アンピシリン、アモキ
シシリン、カルベニシリン、メチルシリン、クロキサシリン、６−ＡＰＡ、モノ
ラクタム、アズトレオナム、メシリナム、セファレキシン、セファログリシン、
セファロリジン、ニトロセフィン、セファトキシム、セフオロキシム、セフチオ
フル、セファピリン、７−ＡＣＡ。特に、本発明による方法は、ＵＳ及びヨーロ
ッパ当局により支配される全ての抗生物質を、許容される限界域値上で検出する
ことを可能にする。
物質がある：ベンジルペニシリン（又はペニシリンＧ）、アンピシリン、アモキ
シシリン、カルベニシリン、メチルシリン、クロキサシリン、６−ＡＰＡ、モノ
ラクタム、アズトレオナム、メシリナム、セファレキシン、セファログリシン、
セファロリジン、ニトロセフィン、セファトキシム、セフオロキシム、セフチオ
フル、セファピリン、７−ＡＣＡ。特に、本発明による方法は、ＵＳ及びヨーロ
ッパ当局により支配される全ての抗生物質を、許容される限界域値上で検出する
ことを可能にする。
【００２２】 本発明による方法は、生物流体、例えばミルク、尿、血液、血清、唾液、肉抽
出液、発酵液又は緩衝水性媒体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出を許容
する。 本発明の好ましい実施形態によれば、認識剤はラベリング剤と結合した形態で
用いられる。このラベリング剤は、異なる性質のものであってよい。ラベリング
剤は、特定の型のもの、例えば金属コロイド粒子（プラチナ、金、銀等）、セレ
ン、炭素、硫黄もしくはテルルのコロイド粒子、又は有色合成ラテックスのコロ
イド粒子であり得る。ラベリング剤は、蛍光物質、例えば活性化フルオレセイン
（Boeringher-Mannheim Biochemicaから利用できる）、フルオレセインイソシア
ネート、ロダミンテトラメチルイソシアネート又は当業者に知られたいずれかの
他の蛍光物質でもあり得る。ラベリング剤は、酵素、例えばβ−ラクタマーゼ、
ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等であってもよい。この場合、ＢｌａＲ又は
ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは化学的に又は遺伝学的にこの酵素ラベリング剤と
結合されて融合タンパク質を形成する。
出液、発酵液又は緩衝水性媒体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の検出を許容
する。 本発明の好ましい実施形態によれば、認識剤はラベリング剤と結合した形態で
用いられる。このラベリング剤は、異なる性質のものであってよい。ラベリング
剤は、特定の型のもの、例えば金属コロイド粒子（プラチナ、金、銀等）、セレ
ン、炭素、硫黄もしくはテルルのコロイド粒子、又は有色合成ラテックスのコロ
イド粒子であり得る。ラベリング剤は、蛍光物質、例えば活性化フルオレセイン
（Boeringher-Mannheim Biochemicaから利用できる）、フルオレセインイソシア
ネート、ロダミンテトラメチルイソシアネート又は当業者に知られたいずれかの
他の蛍光物質でもあり得る。ラベリング剤は、酵素、例えばβ−ラクタマーゼ、
ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等であってもよい。この場合、ＢｌａＲ又は
ＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターは化学的に又は遺伝学的にこの酵素ラベリング剤と
結合されて融合タンパク質を形成する。
【００２３】 認識剤は、当業者に知られた慣用的な方法に従ってラベリング剤に結合させる
ことができる。認識剤は、ラベリング剤に直接結合させても、中間複合体の形成
を介して結合させてもよい。認識剤とラベリング剤との間の結合は、本発明の方
法を行う間の異なる時間に行うことができる。第１の実施形態によれば、認識剤
とラベリング剤との間の結合は、認識剤を分析すべき生物流体に接触させる前に
行われる。本発明の方法の他の実施形態によれば、認識剤とラベリング剤との間
の結合は、認識剤を生物流体のサンプルに接触させる時又はその後に行うことが
できる。好ましくは、認識剤のラベリングはその認識剤を分析すべきサンプルに
接触させる前に行われる。
ことができる。認識剤は、ラベリング剤に直接結合させても、中間複合体の形成
を介して結合させてもよい。認識剤とラベリング剤との間の結合は、本発明の方
法を行う間の異なる時間に行うことができる。第１の実施形態によれば、認識剤
とラベリング剤との間の結合は、認識剤を分析すべき生物流体に接触させる前に
行われる。本発明の方法の他の実施形態によれば、認識剤とラベリング剤との間
の結合は、認識剤を生物流体のサンプルに接触させる時又はその後に行うことが
できる。好ましくは、認識剤のラベリングはその認識剤を分析すべきサンプルに
接触させる前に行われる。
【００２４】 本発明による方法の最初のステップａ）は、決められた量の生物流体を所定量
の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、生物流体中に存在し得る。抗生
物質の認識剤との複合化を許容する条件下でインキュベートすることからなる。 生物流体は、ＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターと共に、４〜６０℃の
温度範囲でインキュベートすることができる。好ましくはこの温度は約４７℃で
ある。インキュベーション温度の増加はその継続時間を減少させる効果を有する
であろうし、その逆も同じであろう。従って、その温度を増加させることにより
その方法の時間を減少させることが常に可能である。
の認識剤に接触させ、そして得られた混合物を、生物流体中に存在し得る。抗生
物質の認識剤との複合化を許容する条件下でインキュベートすることからなる。 生物流体は、ＢｌａＲ又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターと共に、４〜６０℃の
温度範囲でインキュベートすることができる。好ましくはこの温度は約４７℃で
ある。インキュベーション温度の増加はその継続時間を減少させる効果を有する
であろうし、その逆も同じであろう。従って、その温度を増加させることにより
その方法の時間を減少させることが常に可能である。
【００２５】 本発明による方法の第２のステップｂ）において、ステップａ）で得られた混
合物は、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と接触させる。 本発明により用いることができる支持体は、極めて多様な型のものであり得る
。それらは、固体支持体、例えば参照抗生物質調製物でコートされたチューブ、
プレート又はロッドであり得る。それは、膜が結合している固体支持体の形態の
テスト装置であって、１又は複数の捕獲物質が決められた検出ゾーンにあるもの
であり得る。それらは、ゲルを形成することができ、参照抗生物質が固定されて
いる磁石又は非磁石ビーズの形態（アガロース、ポリスチレン等）の支持体であ
り得る。
合物は、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と接触させる。 本発明により用いることができる支持体は、極めて多様な型のものであり得る
。それらは、固体支持体、例えば参照抗生物質調製物でコートされたチューブ、
プレート又はロッドであり得る。それは、膜が結合している固体支持体の形態の
テスト装置であって、１又は複数の捕獲物質が決められた検出ゾーンにあるもの
であり得る。それらは、ゲルを形成することができ、参照抗生物質が固定されて
いる磁石又は非磁石ビーズの形態（アガロース、ポリスチレン等）の支持体であ
り得る。
【００２６】 参照抗生物質は、当業者に知られている方法により、例えば任意にスペーサー
を介した支持体への共有結合又は非共有結合吸着により、支持体上に固定するこ
とができる。 本発明の特定の実施形態によれば、ステップａ）及びｂ）は同時に行うことが
できる。
を介した支持体への共有結合又は非共有結合吸着により、支持体上に固定するこ
とができる。 本発明の特定の実施形態によれば、ステップａ）及びｂ）は同時に行うことが
できる。
【００２７】 本発明による方法のステップｃ）は、参照抗生物質が固定された支持体に結合
したレセプターを測定することからなる。この測定のために用いる方法は、用い
るラベリング剤の型に直接、関連する。ラベリング剤が酵素によるなら、測定ス
テップは、例えば所定の色の形成を伴う、関連するこの酵素に特異的な反応に関
するであろう。ラベリング剤が蛍光によるなら、測定は単に支持体の蛍光を測定
することにより行われるだろう。金属粒子又は有色ラテックスの場合、支持体に
結合したレセプターの存在は、その強度が支持体に結合したレセプターの数に直
接、比例する色によって反映される。用いるラベリング剤の型と関係なく、検出
するシグナルの強度は、分析するサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例す
る。
したレセプターを測定することからなる。この測定のために用いる方法は、用い
るラベリング剤の型に直接、関連する。ラベリング剤が酵素によるなら、測定ス
テップは、例えば所定の色の形成を伴う、関連するこの酵素に特異的な反応に関
するであろう。ラベリング剤が蛍光によるなら、測定は単に支持体の蛍光を測定
することにより行われるだろう。金属粒子又は有色ラテックスの場合、支持体に
結合したレセプターの存在は、その強度が支持体に結合したレセプターの数に直
接、比例する色によって反映される。用いるラベリング剤の型と関係なく、検出
するシグナルの強度は、分析するサンプル中に存在する抗生物質の量に逆比例す
る。
【００２８】 本発明は、生物流体中の抗生物質を検出するためのテストキットであって、バ
チルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対してセ
ンシティブであるレセプターを含む少くとも１の認識剤、及び支持体上に固定さ
れた少くとも１の参照抗生物質を含むキットにも関する。 以下の例は本発明を行うための種々の態様及び方法を詳述するが、その範囲を
限定するものではない。
チルス・リケニホルミスから得られるβ−ラクタム環を含む抗生物質に対してセ
ンシティブであるレセプターを含む少くとも１の認識剤、及び支持体上に固定さ
れた少くとも１の参照抗生物質を含むキットにも関する。 以下の例は本発明を行うための種々の態様及び方法を詳述するが、その範囲を
限定するものではない。
【００２９】 実施例１．ミルク中のβ−ラクタム環を含む抗生物質の測定 この例は、ヘルス・オーソリティーにより規制されているβ−ラクタム環を含
む抗生物質のミルク中での測定を示す。この例に記載されるテストは、ラベリン
グ剤として機能する金のビーズに結合したＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、
膜が結合している固体支持体を含むテスト装置の形態の支持体を用いる。
む抗生物質のミルク中での測定を示す。この例に記載されるテストは、ラベリン
グ剤として機能する金のビーズに結合したＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、
膜が結合している固体支持体を含むテスト装置の形態の支持体を用いる。
【００３０】 １．１．金のビーズへのＢｌａＲ−ＣＴＤのカップリング １．１．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤのビオチニル化 ６．６mg／mlの濃度を有する認識剤ＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液３．７９mlをリン
酸ナトリウム緩衝液２０mM pH７にとる。次にこのＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液に、
４１．７１mlの重炭酸緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、pH９）及び２．２３
mg／mlの重炭酸緩衝液を含むＮ−ヒドロキシスクシニミド６−（ビオチンアミド
）カプロン酸エステルの２mlの溶液を加える。この溶液を環境温度で光なしで、
２時間、２回転／分の速度で（VEL, Belgiumから利用できる）回転軸上のチュー
ブについてのＬＡＢＩＮＣＯスターラーで静かに撹拌する。２．５mlのＴｒｉｓ
緩衝液、１Ｍ pH８の溶液を３０分、同じ条件下で反応混合物と共にインキュベ
ートする。得られた溶液をＨＮＭ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ １００mM、pH８、ＮａＣ
ｌ １００mM、ＭｇＣｌ2 ５０mM）に対して２４時間、透析する。この方法に
おいて、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を得てそれをＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液
（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2 ２５０mM、
ＢＳＡ １０mg／ml）で緩衝液１ml当り２５０mgのビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴ
Ｄの濃度に希釈する。
酸ナトリウム緩衝液２０mM pH７にとる。次にこのＢｌａＲ−ＣＴＤの溶液に、
４１．７１mlの重炭酸緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、pH９）及び２．２３
mg／mlの重炭酸緩衝液を含むＮ−ヒドロキシスクシニミド６−（ビオチンアミド
）カプロン酸エステルの２mlの溶液を加える。この溶液を環境温度で光なしで、
２時間、２回転／分の速度で（VEL, Belgiumから利用できる）回転軸上のチュー
ブについてのＬＡＢＩＮＣＯスターラーで静かに撹拌する。２．５mlのＴｒｉｓ
緩衝液、１Ｍ pH８の溶液を３０分、同じ条件下で反応混合物と共にインキュベ
ートする。得られた溶液をＨＮＭ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ １００mM、pH８、ＮａＣ
ｌ １００mM、ＭｇＣｌ2 ５０mM）に対して２４時間、透析する。この方法に
おいて、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を得てそれをＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液
（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2 ２５０mM、
ＢＳＡ １０mg／ml）で緩衝液１ml当り２５０mgのビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴ
Ｄの濃度に希釈する。
【００３１】 １．１．２．ラベリング剤 ラベリング剤として、ヤギ抗ビオチン抗体が、（British Biocell (Ret. GAB
40）から利用できる）０．１％のアジ化ナトリウムにより安定化したpH７．２の
テトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態で析出している４０nmの直径を
有する金の粒子を用いる。これら懸濁液の５２０nmでの光学密度は約１０であり
タンパク質濃度は約２４mg／mlである。
40）から利用できる）０．１％のアジ化ナトリウムにより安定化したpH７．２の
テトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態で析出している４０nmの直径を
有する金の粒子を用いる。これら懸濁液の５２０nmでの光学密度は約１０であり
タンパク質濃度は約２４mg／mlである。
【００３２】 １．１．３．ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤの金粒子へのカップリング 実施例３．１．１で調製したビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液を、ＨＮＭ−
ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2
２５０mM、ＢＳＡ １０mg／ml）で１１４．７倍に希釈する。室温で、この希
釈ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液２２．５容量部、ＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液７
．５容量部、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤを標識するために用いる金の粒子懸
濁液９．２７容量部、及び参照金粒子懸濁液６容量部を混合する。
ＢＳＡ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ ５００mM、pH８、ＮａＣｌ ５００mM、ＭｇＣｌ2
２５０mM、ＢＳＡ １０mg／ml）で１１４．７倍に希釈する。室温で、この希
釈ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤ溶液２２．５容量部、ＨＮＭ−ＢＳＡ緩衝液７
．５容量部、ビオチニル化ＢｌａＲ−ＣＴＤを標識するために用いる金の粒子懸
濁液９．２７容量部、及び参照金粒子懸濁液６容量部を混合する。
【００３３】 １．１．４．独立した参照物質 このテストにおいて、その強度がサンプル中に存在する抗生物質の迅速な定量
を可能にするバンドを供給する参照物質を用いる。 この目的のために、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体が析出している金の４
０nm粒子を用いた。これらの粒子は０．１％アジ化ナトリウムにより安定化した
pH７．２の２mMテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態でBritish Bioc
ell (Ref. GAR40)から利用できる。これらの懸濁液の５２０nmにおける光学密度
は約３であり、タンパク質濃度は約６mg／mlである。
を可能にするバンドを供給する参照物質を用いる。 この目的のために、ヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体が析出している金の４
０nm粒子を用いた。これらの粒子は０．１％アジ化ナトリウムにより安定化した
pH７．２の２mMテトラホウ酸ナトリウム水溶液中の懸濁液の形態でBritish Bioc
ell (Ref. GAR40)から利用できる。これらの懸濁液の５２０nmにおける光学密度
は約３であり、タンパク質濃度は約６mg／mlである。
【００３４】 １．２．テスト装置 用いたテスト装置は、第１の端から始まり連続的に結合している第１及び第２
の端を有する固体支持体（１）、 分析する流体を精製するための膜（２）、 ２種の捕獲物質（参照抗生物質及び独立した参照物質に結合することができる
物質）が固定されている膜（３）、及び 吸収膜（４） を含む。
の端を有する固体支持体（１）、 分析する流体を精製するための膜（２）、 ２種の捕獲物質（参照抗生物質及び独立した参照物質に結合することができる
物質）が固定されている膜（３）、及び 吸収膜（４） を含む。
【００３５】 １．２．１．アッセイ装置のアセンブル ３００×７６．２mmの大きさを有するカードを、まず最初に、以下の方法に従
って（BioDot, Inc.から利用できる）Clamshell laminator 型のラミネーターを
用いてアセンブルする： （Adhesive Research から利用できる）型ＡｒＣａｒｅ８５６５の長方形のプ
ラスチック支持体を３００×７６．２mmを測定して切断する（固体支持体（１）
）。次に、３００×２０mmの大きさの（Pall Gelman Sciencesから利用できる）
長方形のＬｅｕｋｏｓｏｒｂ ＬＫ４膜（膜（２））、３００×２５mmの大きさ
の（Millipore から利用できる）長方形のＨｉ−Ｆｌｏｗ ＳＸ膜（膜（３））
、３００×４０mmの大きさの（Whatman から利用できる）長方形の３mmセルロー
ス膜（膜（４））を切断する。
って（BioDot, Inc.から利用できる）Clamshell laminator 型のラミネーターを
用いてアセンブルする： （Adhesive Research から利用できる）型ＡｒＣａｒｅ８５６５の長方形のプ
ラスチック支持体を３００×７６．２mmを測定して切断する（固体支持体（１）
）。次に、３００×２０mmの大きさの（Pall Gelman Sciencesから利用できる）
長方形のＬｅｕｋｏｓｏｒｂ ＬＫ４膜（膜（２））、３００×２５mmの大きさ
の（Millipore から利用できる）長方形のＨｉ−Ｆｌｏｗ ＳＸ膜（膜（３））
、３００×４０mmの大きさの（Whatman から利用できる）長方形の３mmセルロー
ス膜（膜（４））を切断する。
【００３６】 続けて、膜（２）及び（４）、次に（３）をラミネーターの下方の鋳型の特定
の位置におく。接着剤で包んだ固体支持体（１）を、その部分を、接着剤面が空
気に露出するように装置のカバー内に保持する。下側の鋳型においた膜を、ラミ
ネーターを閉じることにより接着支持体に接触させ；その膜を真空ポンプからの
空気吸引により正確な場所に保持する。真空をなくした時に、膜（２），（３）
及び（４）がその上に固定された固体支持体（１）からなるカードを得る。
の位置におく。接着剤で包んだ固体支持体（１）を、その部分を、接着剤面が空
気に露出するように装置のカバー内に保持する。下側の鋳型においた膜を、ラミ
ネーターを閉じることにより接着支持体に接触させ；その膜を真空ポンプからの
空気吸引により正確な場所に保持する。真空をなくした時に、膜（２），（３）
及び（４）がその上に固定された固体支持体（１）からなるカードを得る。
【００３７】 次に、以下の溶液を膜（３）上に析出させる：近位側：第１の捕獲物質；バン
ドNo. １；遠位側：第２の捕獲物質；バンドNo. ２。これらの捕獲物質をBioDot
IncからのX-Y Platform Biojet Quanti-3000タイプの“Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ”
を用いて析出させる。 その析出した溶液を、カード全体を１分間、６０℃の熱い強制空気下におくこ
とにより直ちにエバポレートする。
ドNo. １；遠位側：第２の捕獲物質；バンドNo. ２。これらの捕獲物質をBioDot
IncからのX-Y Platform Biojet Quanti-3000タイプの“Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ”
を用いて析出させる。 その析出した溶液を、カード全体を１分間、６０℃の熱い強制空気下におくこ
とにより直ちにエバポレートする。
【００３８】 アセンブリー後に得られたカードを、ギロチン型装置で、又はロータリー装置
でストリップに切断する（BioDot, Kinematic 又はAkzoから利用可）。その端の
ストリップを除去し、他のストリップを直ちに用いる。 図１はこのようなアッセイ装置を示す。 それらを保護するために、アッセイ装置はデシカント（Silgelac, France）の
存在下で不透明な密閉した容器に入れる。
でストリップに切断する（BioDot, Kinematic 又はAkzoから利用可）。その端の
ストリップを除去し、他のストリップを直ちに用いる。 図１はこのようなアッセイ装置を示す。 それらを保護するために、アッセイ装置はデシカント（Silgelac, France）の
存在下で不透明な密閉した容器に入れる。
【００３９】 １．２．２．第１の捕獲物質、参照抗生物質 炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトガンマグロブリ
ン（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノ−チオランヒドロクロライ
ド（Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を２５℃で１時間、インキュ
ベートする。
ン（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノ−チオランヒドロクロライ
ド（Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を２５℃で１時間、インキュ
ベートする。
【００４０】 更に、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に１１９．８mgのセファロ
スポリンＣ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）を含
む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。 次に先に調製した２つの溶液を混合する。得られた溶液のpHを３mlのＮａＨ2
ＰＯ4 ５００mMを加えることにより７．１に調節し、その溶液を２５℃で２時
間、インキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を１Ｌのリン
酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する。得られた溶
液を０．２２mmフィルターを介してろ過し、次にアリコートに分けて使用まで−
２０℃で凍結する。
スポリンＣ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）を含
む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。 次に先に調製した２つの溶液を混合する。得られた溶液のpHを３mlのＮａＨ2
ＰＯ4 ５００mMを加えることにより７．１に調節し、その溶液を２５℃で２時
間、インキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を１Ｌのリン
酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する。得られた溶
液を０．２２mmフィルターを介してろ過し、次にアリコートに分けて使用まで−
２０℃で凍結する。
【００４１】 使用の時にアリコートを解凍し、析出物の正確な位置及び微量物の質をいつで
も示すように、それらを膜上に析出させる前に、それらに食品着色剤を加える。 第１の捕獲物質はサンプル中に存在する抗生物質の量に対して過剰に金粒子に
結合したＢｌａＲ−ＣＴＤを固定することを可能にする。 １．２．３．第２の捕獲物質。独立した参照物質を固定することができる物質 第２の捕獲物質のために、１０mMリン酸ナトリウムpH７．５、ヒトガンマグロ
ブリン５mg／ml緩衝液中０．５mg／mlのイムノグロブリン濃度を有するウサギイ
ムノグロブリン溶液（Sigma Ｉ ５００６）を用いる。この第２の捕獲物質は、
液体がアッセイ装置を超えてマイグレートする時に参照物質を停止させる。
も示すように、それらを膜上に析出させる前に、それらに食品着色剤を加える。 第１の捕獲物質はサンプル中に存在する抗生物質の量に対して過剰に金粒子に
結合したＢｌａＲ−ＣＴＤを固定することを可能にする。 １．２．３．第２の捕獲物質。独立した参照物質を固定することができる物質 第２の捕獲物質のために、１０mMリン酸ナトリウムpH７．５、ヒトガンマグロ
ブリン５mg／ml緩衝液中０．５mg／mlのイムノグロブリン濃度を有するウサギイ
ムノグロブリン溶液（Sigma Ｉ ５００６）を用いる。この第２の捕獲物質は、
液体がアッセイ装置を超えてマイグレートする時に参照物質を停止させる。
【００４２】 １．３．ミルク中の抗生物質の測定 １．３．１．３分テスト−迅速テスト 各々０；１；２；３；４；５及び６ppb のペニシリンＧを含む新しいミルクの
７つのサンプルを調製する。次にこれらの溶液各々を以下の方法で分析する： ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１分間、４７
℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混
合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、
ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリ
ーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
７つのサンプルを調製する。次にこれらの溶液各々を以下の方法で分析する： ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１分間、４７
℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混
合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、
ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリ
ーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００４３】 以下の表１は、テストした７つのサンプルについて得られた結果を要約する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するペニシリンＧの量に反比例する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するペニシリンＧの量に反比例する。
【００４４】
【表１】
【００４５】 この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、
テストは陽性であると考えられる。表１に示す結果は、このテストが３分で、ミ
ルクのサンプル中の４ppb 未満のペニシリンＧの検出を許容することを示す。 同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この３
分間、行ったテストは、５ppb までのアモキシシリン、５ppb までのアンピシリ
ン、１０ppb 未満までのシクロキサシリン、２０ppb 未満までのジシクロキサシ
リン、２０ppb 未満までのオキサシリン及び２０ppb までのセファピリンのミル
クのサンプル中での検出を許容する。
テストは陽性であると考えられる。表１に示す結果は、このテストが３分で、ミ
ルクのサンプル中の４ppb 未満のペニシリンＧの検出を許容することを示す。 同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この３
分間、行ったテストは、５ppb までのアモキシシリン、５ppb までのアンピシリ
ン、１０ppb 未満までのシクロキサシリン、２０ppb 未満までのジシクロキサシ
リン、２０ppb 未満までのオキサシリン及び２０ppb までのセファピリンのミル
クのサンプル中での検出を許容する。
【００４６】 １．３．２．５分テスト 各々０；２；４；６；８及び１０ppb のシクロキサシリンを含む新しいミルク
の６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する
： ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を３分間、４７
℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混
合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、
ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリ
ーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
の６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する
： ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を３分間、４７
℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混
合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、
ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリ
ーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００４７】 以下の表２は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するシクロキサシリンの量に反比例する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するシクロキサシリンの量に反比例する。
【００４８】
【表２】
【００４９】 この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、
テストは陽性であると考えられる。表２に示す結果は、このテストが５分で、ミ
ルクのサンプル中の４ppb 未満のシクロキサシリンの検出を許容することを示す
。 同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この５
分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリ
ン、４ppb までのアンピシリン、８ppb までのジシクロキサシリン、８ppb まで
のオキサシリン、１６ppb までのセファピリン、１００ppb までのセフチオフル
、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb までのナフシリン、及び６０ppb ま
でのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
テストは陽性であると考えられる。表２に示す結果は、このテストが５分で、ミ
ルクのサンプル中の４ppb 未満のシクロキサシリンの検出を許容することを示す
。 同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この５
分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリ
ン、４ppb までのアンピシリン、８ppb までのジシクロキサシリン、８ppb まで
のオキサシリン、１６ppb までのセファピリン、１００ppb までのセフチオフル
、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb までのナフシリン、及び６０ppb ま
でのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００５０】 このテストは、ミルクワゴンをサイロに出す前のソーティングテストとして特
に適している。 １．３．３．９分テスト 各々０；４；６；８；１０及び１２ppb のセファピリンを含む新しいミルクの
６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する。
に適している。 １．３．３．９分テスト 各々０；４；６；８；１０及び１２ppb のセファピリンを含む新しいミルクの
６のサンプルを調製する。次に、これらの溶液の各々を以下の方法で分析する。
【００５１】 ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を７分間、４７
℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混
合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、
ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリ
ーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を７分間、４７
℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が混
合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように、
ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブリ
ーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００５２】 以下の表３は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するセファピリンの量に反比例する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するセファピリンの量に反比例する。
【００５３】
【表３】
【００５４】 この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、
テストは陽性であると考えられる。表３に示す結果は、このテストが９分で、ミ
ルクのサンプル中の６ppb 未満のセファピリンの検出を許容することを示す。 同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この９
分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリ
ン、４ppb までのアンピシリン、４ppb までのシクロキサシリン、８ppb 未満ま
でのジシクロキサシリン、８ppb 未満までのオキサシリン、８０ppb までのセフ
チオフル、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb 未満までのナフシリン、及
び４５ppb までのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
テストは陽性であると考えられる。表３に示す結果は、このテストが９分で、ミ
ルクのサンプル中の６ppb 未満のセファピリンの検出を許容することを示す。 同じ条件下でβ−ラクタム環を含む他の抗生物質でもテストを行った。この９
分間、行ったテストは、３ppb までのペニシリンＧ、４ppb までのアモキシシリ
ン、４ppb までのアンピシリン、４ppb までのシクロキサシリン、８ppb 未満ま
でのジシクロキサシリン、８ppb 未満までのオキサシリン、８０ppb までのセフ
チオフル、２０ppb 未満までのセフキノン、２０ppb 未満までのナフシリン、及
び４５ppb までのセファゾリンのミルクのサンプル中での検出を許容する。
【００５５】 これにより、９分間、行ったこのテストは、ヨーロッパ当局により現在、規制
されている全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検
出を許容する。 １．３．４．２０分テスト 各々０；２０；３０；４０；５０及び６０ppb のセフチオフルを含む新しいミ
ルクの６のサンプルを調製する。次にこれら溶液の各々を以下の方法で分析する
。
されている全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検
出を許容する。 １．３．４．２０分テスト 各々０；２０；３０；４０；５０及び６０ppb のセフチオフルを含む新しいミ
ルクの６のサンプルを調製する。次にこれら溶液の各々を以下の方法で分析する
。
【００５６】 ミルクの２００μｌアリコートサンプル及び実施例１．１．３で調製した４５
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１８分間、４
７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が
混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように
、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブ
リーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
．２７μｌの溶液をとり、ガラスフラスコに入れる。この混合物を１８分間、４
７℃でインキュベートする。テスト装置をとって、そのテスト装置の第１の端が
混合物に接触するように、及び第２の端がガラスフラスコの壁に横たわるように
、ガラスフラスコ内に垂直におく。その混合物を、４７℃で２分、そのアセンブ
リーをインキュベートしながらテスト装置上をマイグレートさせる。
【００５７】 以下の表４は、テストした６つのサンプルについて得られた結果を要約する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するセフチオフルの量に反比例する。
０〜１０の範囲の強度値は検出されるバンドに起因し、ここで１０の値は最も大
きい強度のバンドを与え、０の値は最も小さな強度のバンドを与える。このスケ
ールによれば、６の値は参照バンドに割り当てられる。第１のバンドで観察され
たシグナルの強度はサンプル中に存在するセフチオフルの量に反比例する。
【００５８】
【表４】
【００５９】 この例において、第１のバンドが第２のバンドより小さい強度を有する場合、
テストは陽性であると考えられる。表４に示す結果は、このテストが２０分で、
ミルクのサンプル中の３０ppb までのセフチオフルの検出を許容することを示す
。 これにより、２０分でのこのテストは、ヨーロッパ及び米国当局により現在規
制される全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検出
を許容する。
テストは陽性であると考えられる。表４に示す結果は、このテストが２０分で、
ミルクのサンプル中の３０ppb までのセフチオフルの検出を許容することを示す
。 これにより、２０分でのこのテストは、ヨーロッパ及び米国当局により現在規
制される全ての抗生物質の、これらの当局により強制される法的限界までの検出
を許容する。
【００６０】 実施例２．ミルク中の６の抗生物質の測定 この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６の抗生物質のミ
ルク中での検出を示す。この例に記載されるテストはβ−ラクタマーゼとの融合
タンパク質の形態でＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、磁気ビーズの形態で支
持体を用いる。
ルク中での検出を示す。この例に記載されるテストはβ−ラクタマーゼとの融合
タンパク質の形態でＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、磁気ビーズの形態で支
持体を用いる。
【００６１】 ２．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質 ＢｌａＲ−ＣＴＤ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレ
セプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, 1990 ）とバチ
ルス・セレウス（Bacillus cereus ）からのＺｎβ−ラクタマーゼ（M.Hussain
ら、1985, J.Bact., 164: 1, 223〜229, 1985 ）との間の遺伝子カップリングに
より得る。
セプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, 1990 ）とバチ
ルス・セレウス（Bacillus cereus ）からのＺｎβ−ラクタマーゼ（M.Hussain
ら、1985, J.Bact., 164: 1, 223〜229, 1985 ）との間の遺伝子カップリングに
より得る。
【００６２】 そのカップリングは以下の方法で行われる： ２．１．１．プラスミドの作製： ＢｌａＲ−ＣＴＤポリペプチド及びβ−ラクタマーゼの遺伝子間で１／１カッ
プリングを行った。β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を同時にＢｌａＲ−Ｃ
ＴＤ遺伝子の後に導入した。その遺伝子融合を有するプラスミドは、カナマイシ
ンに対する耐性を示す。その融合タンパク質を以後、Ｆｕｓｌと呼ぶ。
プリングを行った。β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を同時にＢｌａＲ−Ｃ
ＴＤ遺伝子の後に導入した。その遺伝子融合を有するプラスミドは、カナマイシ
ンに対する耐性を示す。その融合タンパク質を以後、Ｆｕｓｌと呼ぶ。
【００６３】 ２．１．２．生産： 株：融合遺伝子を有するプラスミドを大腸菌に導入した。その組換えプラスミ
ドを有するクローンをＬＢ＋Ｋｍ（５０μｇ／ml）上で選択する。 選択：放射性抗生物質での細胞抽出物のラベリング、次の変性ポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動は、そのタンパク質のほとんどが、その分子量が約５０，
０００である融合タンパク質の形態で生産されることを示す。しかしながら、翻
訳後タンパク質分解が極めて小さい割合（２％）のこれらの分子を２つの別個の
活性に解離させるようである。
ドを有するクローンをＬＢ＋Ｋｍ（５０μｇ／ml）上で選択する。 選択：放射性抗生物質での細胞抽出物のラベリング、次の変性ポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動は、そのタンパク質のほとんどが、その分子量が約５０，
０００である融合タンパク質の形態で生産されることを示す。しかしながら、翻
訳後タンパク質分解が極めて小さい割合（２％）のこれらの分子を２つの別個の
活性に解離させるようである。
【００６４】 培養：５００mlのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）を−７０℃で保存した組換
え細胞を用いて接種する。そのプレカルチャーを３７℃でインキュベートし、２
２５rpm で一晩、撹拌する。１８リッターのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）に
５００mlのこのプレカルチャーを接種する。その６００nmでの光学密度は４であ
る。その１８リッター培養を、光学密度が６の値に達した時に停止させる。
え細胞を用いて接種する。そのプレカルチャーを３７℃でインキュベートし、２
２５rpm で一晩、撹拌する。１８リッターのＬＢ＋Ｋｍ培地（５０μｇ／ml）に
５００mlのこのプレカルチャーを接種する。その６００nmでの光学密度は４であ
る。その１８リッター培養を、光学密度が６の値に達した時に停止させる。
【００６５】 ２．１．３．抽出： 培養を停止した直後に、細胞をろ過し次に遠心する。粉砕機内で溶解した細胞
ペレットからの上清を維持する。それは融合タンパク質ＦＵＳＩを含む。 ２．１．４．精製： 用いる緩衝液： ・緩衝液Ａ：２０mM pH８．０ Ｔｒｉｓ、１０％エチレングリコール、５０μ
ｍ ＤＴＴ； ・緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮＡＣｌ 融合タンパク質を、イオンクロマトグラフィーにより及び分子ふるいで部分精
製する。その抽出物を析出させ、緩衝液Ａ中でＱＳＦＦカラム（Pharmacia, Ups
ala ）で洗浄した後、ＦＵＳＩを緩衝液Ｂの直線勾配で溶出する。次にその活性
画分（±０．２５Ｍ ＮａＣｌ）を組み合わせＧ−１００分子ふるい（Pharmaci
a, Upsala ）に析出し；それらを緩衝液Ａで溶出する。回収したバッチの平均比
活性は３０％であると評価される。
ペレットからの上清を維持する。それは融合タンパク質ＦＵＳＩを含む。 ２．１．４．精製： 用いる緩衝液： ・緩衝液Ａ：２０mM pH８．０ Ｔｒｉｓ、１０％エチレングリコール、５０μ
ｍ ＤＴＴ； ・緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ ＮＡＣｌ 融合タンパク質を、イオンクロマトグラフィーにより及び分子ふるいで部分精
製する。その抽出物を析出させ、緩衝液Ａ中でＱＳＦＦカラム（Pharmacia, Ups
ala ）で洗浄した後、ＦＵＳＩを緩衝液Ｂの直線勾配で溶出する。次にその活性
画分（±０．２５Ｍ ＮａＣｌ）を組み合わせＧ−１００分子ふるい（Pharmaci
a, Upsala ）に析出し；それらを緩衝液Ａで溶出する。回収したバッチの平均比
活性は３０％であると評価される。
【００６６】 ２．１．５．β−ラクタマーゼの阻害： 融合タンパク質（９／１０容量）を、３７℃で４５分、５０mM ＥＤＴＡ（１
／１０容量）と共にインキュベートする。その阻害を、１０mM pH６．０カコジ
ル酸緩衝液中ニトロセファイン（nitrocefine ）を用いて検査する。Ｚｎの存在
又は欠如下で、シグナルは各々陽性又は陰性であるはずである。阻害の後、β−
ラクタマーゼ活性に基づいて測定した有効な濃度は７．７４pmol／μｌである。
／１０容量）と共にインキュベートする。その阻害を、１０mM pH６．０カコジ
ル酸緩衝液中ニトロセファイン（nitrocefine ）を用いて検査する。Ｚｎの存在
又は欠如下で、シグナルは各々陽性又は陰性であるはずである。阻害の後、β−
ラクタマーゼ活性に基づいて測定した有効な濃度は７．７４pmol／μｌである。
【００６７】 ２．２．固体支持体：磁気ビーズ−セファロスポリンＣ（参照抗生物質） （ＡＭ ４１００ＢとしてDRG Instrument GmbH, Marburg, Germany から利用
できる）ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子を用いる。そのＮＨ2 端は以下の方法でグ
ルタルアルデヒトで活性化されている。 ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子の開始溶液１容量を５容量の０．０１Ｍ pH６．
０ピリジン緩衝液で４回、ゆすぐ。その粒子をピリジン緩衝液中５％で２．５容
量のグルタルアルデヒトにとり、室温で３時間、回転させて撹拌する。次にそれ
らを２容量の０．０１Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液で１０回、ゆすぐ。次にその
粒子をＫｐｉ緩衝液中０．１ＭセファロスポリンＣの１容量に再度懸濁し、＋４
℃で一晩、回転させて撹拌する。最後のゆすぎを、セファロスポリンＣが０．１
Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液から完全に除去されるまで行う。
できる）ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子を用いる。そのＮＨ2 端は以下の方法でグ
ルタルアルデヒトで活性化されている。 ＢｉｏＭａｇ ４１００粒子の開始溶液１容量を５容量の０．０１Ｍ pH６．
０ピリジン緩衝液で４回、ゆすぐ。その粒子をピリジン緩衝液中５％で２．５容
量のグルタルアルデヒトにとり、室温で３時間、回転させて撹拌する。次にそれ
らを２容量の０．０１Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液で１０回、ゆすぐ。次にその
粒子をＫｐｉ緩衝液中０．１ＭセファロスポリンＣの１容量に再度懸濁し、＋４
℃で一晩、回転させて撹拌する。最後のゆすぎを、セファロスポリンＣが０．１
Ｍ pH７．０ Ｋｐｉ緩衝液から完全に除去されるまで行う。
【００６８】 ２．３．ミルク中の６の抗生物質、ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシシ
リン、シクロキサシリン、セファピリン及びセルチオフルの測定 ２．３．１．用いる溶液： 溶液１：１００mM、pH８ Ｔｒｉｓ、１mg／ml ＢＳＡ、５０mM ＥＤＴＡ、
５０μｍ ＤＴＴ中に凍結乾燥した融合タンパク質７００ピコモルを５mlのＭｉ
ｌｌｉ−Ｑ水で再び水和する。この溶液５０μｌが測定を行うために必要とされ
る。
リン、シクロキサシリン、セファピリン及びセルチオフルの測定 ２．３．１．用いる溶液： 溶液１：１００mM、pH８ Ｔｒｉｓ、１mg／ml ＢＳＡ、５０mM ＥＤＴＡ、
５０μｍ ＤＴＴ中に凍結乾燥した融合タンパク質７００ピコモルを５mlのＭｉ
ｌｌｉ−Ｑ水で再び水和する。この溶液５０μｌが測定を行うために必要とされ
る。
【００６９】 溶液２：１００％イソプロパノール中実施例１．２で調製したＢｉｏＭａｇ−
セファロスポリンＣ粒子２ml；測定を行うために２０μlが要求される。 溶液３：凍結乾燥し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５００mlで再び水和した１０mM、pH６
カコジル酸緩衝液。 溶液４：ＤＭＦ中１０mMニトロセファインの４００mlを溶液３で４０mlに希釈
する。検出のために４００μｌが要求される。
セファロスポリンＣ粒子２ml；測定を行うために２０μlが要求される。 溶液３：凍結乾燥し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５００mlで再び水和した１０mM、pH６
カコジル酸緩衝液。 溶液４：ＤＭＦ中１０mMニトロセファインの４００mlを溶液３で４０mlに希釈
する。検出のために４００μｌが要求される。
【００７０】 ２．３．２．検出法： ５０μｌの溶液１を５００ｍｌのドープト（ｄｏｐｅｄ）ミルクサンプルに入
れ、４７℃で２分、インキュベートする。２０μｌの溶液２をそのミルクに懸濁
し、それを４７℃で２分、再びインキュベートする。その粒子を常磁性磁石を用
いて容器の壁に引きつけながら、上清をチューブからとる。その粒子を溶液３で
２回、ゆすぎ、磁石で同じ方法を行う。最後に４００μｌの溶液４を４７℃で３
分、その粒子の存在下でインキュベートする。次に、４８２nmでの残存溶液の吸
光度をニトロセファイン（ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎｅ）溶液に対して測定する。
れ、４７℃で２分、インキュベートする。２０μｌの溶液２をそのミルクに懸濁
し、それを４７℃で２分、再びインキュベートする。その粒子を常磁性磁石を用
いて容器の壁に引きつけながら、上清をチューブからとる。その粒子を溶液３で
２回、ゆすぎ、磁石で同じ方法を行う。最後に４００μｌの溶液４を４７℃で３
分、その粒子の存在下でインキュベートする。次に、４８２nmでの残存溶液の吸
光度をニトロセファイン（ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎｅ）溶液に対して測定する。
【００７１】 この方法は、ＵＳ当局で示される６種の抗生物質の、当業により強制される基
準未満の濃度で、即ちペニシリンを５ppb 、アンピシリンを１０ppb 、アモキシ
シリンを１０ppb 、シクロキサシリンを１０ppb 、セファピリンを２０ppb 及び
セフチオフルを５０ppb での検出を許容する。 実施例３．ミルク中の３種の抗生物質（ペニシリンＧ、シクロキサシリン、セ
フチオフル）の測定 この例はヘルス・オーソリティーにより規制されるμ−ラクタム環を含む３種
の抗生物質のミルク中での検出を示す。この例に記載されるテストは、アルカリ
ホスファターゼ及びペルオキシダーゼ各々との２つの融合タンパク質の形態のＢ
ｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、マイクロプレートの形態の支持体を用いる。
準未満の濃度で、即ちペニシリンを５ppb 、アンピシリンを１０ppb 、アモキシ
シリンを１０ppb 、シクロキサシリンを１０ppb 、セファピリンを２０ppb 及び
セフチオフルを５０ppb での検出を許容する。 実施例３．ミルク中の３種の抗生物質（ペニシリンＧ、シクロキサシリン、セ
フチオフル）の測定 この例はヘルス・オーソリティーにより規制されるμ−ラクタム環を含む３種
の抗生物質のミルク中での検出を示す。この例に記載されるテストは、アルカリ
ホスファターゼ及びペルオキシダーゼ各々との２つの融合タンパク質の形態のＢ
ｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、マイクロプレートの形態の支持体を用いる。
【００７２】 ３．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質 ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−Ｃ
ＴＤレセプター（B Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114 (1990)）
とリフェレンス１４６４７５２としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用
できる活性化アルカリホスファターゼとの間の化学的カップリングにより得る。
ＴＤレセプター（B Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114 (1990)）
とリフェレンス１４６４７５２としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用
できる活性化アルカリホスファターゼとの間の化学的カップリングにより得る。
【００７３】 カップリングは以下の方法で行った： ３．１．１．コンジュゲーション：ＢｌａＲ−ＣＴＤ及びアルカリホスファタ
ーゼをpH９．８で１００mM炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。１５ナ
ノモルのＢｌａＲ−ＣＴＤを２５℃で２時間、１００μｌの活性化アルカリホス
ファターゼ（２０mg／ml）の存在下でインキュベートする。
ーゼをpH９．８で１００mM炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。１５ナ
ノモルのＢｌａＲ−ＣＴＤを２５℃で２時間、１００μｌの活性化アルカリホス
ファターゼ（２０mg／ml）の存在下でインキュベートする。
【００７４】 ３．１．２．反応の停止：４０μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液、
次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０
分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールア
ミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートす
る。
次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０
分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールア
ミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートす
る。
【００７５】 ３．１．３．カップリングの安定化：１０μｌの１Ｍ、pH７．０グリシン溶液
を加える。 ３．１．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約３００μｌ）を３回、８
時間、０．５Ｌの５０mM、pH７．６トリエタノールアミン緩衝液、１５０mM Ｎ
ａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ2 、０．５mM ＺｎＣｌ2 、１０mMグリシンに対して＋
４℃で透析する。
を加える。 ３．１．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約３００μｌ）を３回、８
時間、０．５Ｌの５０mM、pH７．６トリエタノールアミン緩衝液、１５０mM Ｎ
ａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ2 、０．５mM ＺｎＣｌ2 、１０mMグリシンに対して＋
４℃で透析する。
【００７６】 ３．１．５．最終タイター：カップリングの最終タイターは、溶液１μｌ当り
約５０pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。 ３．２．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質 ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレ
セプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, (1990) ）とリ
ファレンス１４２８８６１としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用でき
る活性化ペルオキシダーゼとの間の化学的カップリングにより得る。
約５０pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。 ３．２．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質 ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ融合タンパク質を、ＢｌａＲ−ＣＴＤレ
セプター（B.Joris ら、FEMS Microbiology Letters, 107〜114, (1990) ）とリ
ファレンス１４２８８６１としてBoehringer-Mannheim Biochemicaから利用でき
る活性化ペルオキシダーゼとの間の化学的カップリングにより得る。
【００７７】 カップリングは以下の通り行う： ３．２．１．コンジュゲーション：ＢｌａＲ−ＣＴＤ及びペルオキシダーゼを
１００mM、ｐＨ９．８炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。４０ナノモ
ルのＢｌａＲ−ＣＴＤを１００μｌの活性化ペルオキシダーゼ（１６mg／ml）の
存在下で２時間、25℃でインキュベートする。
１００mM、ｐＨ９．８炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液中で透析する。４０ナノモ
ルのＢｌａＲ−ＣＴＤを１００μｌの活性化ペルオキシダーゼ（１６mg／ml）の
存在下で２時間、25℃でインキュベートする。
【００７８】 ３．２．２．反応の停止：４０μｌの２mM、pH８トリエタノールアミン溶液、
次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０
分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールア
ミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートす
る。
次に５０μｌの２００mMホウ化水素ナトリウム溶液を加える。その混合物を３０
分、＋４℃でインキュベートする。次に２５μｌの２mM、pH８トリエタノールア
ミン溶液を加え、その後、その混合物を＋４℃で２時間、再びインキュベートす
る。
【００７９】 ３．２．３．カップリングの安定化：１０μｌの１Ｍ、pH７．０グリシン溶液
を加える。 ３．２．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約４６０μｌ）を３回、８
時間、０．５Ｌの１０mM、pH７．５ リン酸カリウム緩衝液、２００mM ＮａＣ
ｌ、１０mMグリシンに対して＋４℃で透析する。
を加える。 ３．２．４．保存緩衝液に移す：その反応混合物（約４６０μｌ）を３回、８
時間、０．５Ｌの１０mM、pH７．５ リン酸カリウム緩衝液、２００mM ＮａＣ
ｌ、１０mMグリシンに対して＋４℃で透析する。
【００８０】 ３．２．５．最終タイター：カップリングの最終タイターは、溶液１μｌ当り
約１００pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。 ３．３．固体支持体：マイクロプレート−セファロスポリンＣ ３．３．１．参照抗生物質溶液の調製 炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトγ−グロブリン
（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノチオランヒドロクロライド（
Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を１時間、２５℃でインキュベー
トする。
約１００pmolの活性ＢｌａＲ−ＣＴＤである。 ３．３．固体支持体：マイクロプレート−セファロスポリンＣ ３．３．１．参照抗生物質溶液の調製 炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に２１３mgのヒトγ−グロブリン
（Ｇ４３８６、Sigma ）及び８．６mgの２−イミノチオランヒドロクロライド（
Aldrich 、３３０５６−６）を含む８mlの溶液を１時間、２５℃でインキュベー
トする。
【００８１】 別個に、炭酸ナトリウム緩衝液（１００mM、pH９）中に１１９．８mgのセファ
ロスポリン−Ｃ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）
を含む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。 次に、先に調製した２つの溶液を一緒に混合する。得られた溶液のpHを、３ml
の５００mM ＮａＨ2ＰＯ4を加えることにより７．１に調節し、その混合物を２
時間、２５℃でインキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を
、１Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する
。得られた溶液を０．２２μｍフィルターを介してろ過する。
ロスポリン−Ｃ及び５４mgのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル
）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、２２３２２ Pierce）
を含む２０mlの溶液を２５℃で１時間、インキュベートする。 次に、先に調製した２つの溶液を一緒に混合する。得られた溶液のpHを、３ml
の５００mM ＮａＨ2ＰＯ4を加えることにより７．１に調節し、その混合物を２
時間、２５℃でインキュベートする。インキュベーション後に得られた混合物を
、１Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１０mM、pH７．５）に対して３回、透析する
。得られた溶液を０．２２μｍフィルターを介してろ過する。
【００８２】 ３．３．２．参照抗生物質でのマイクロプレートのコーティング ブランド名ＮＵＮＫ（Immuno Plate: Maxisorp Type ）又はブランド名ＧＲＥ
ＩＮＥＲ（microlon 600, reterence 705071）の、高タンパク質吸着のポリスチ
レンマイクロプレートを用いる。マイクロプレートキュベットを１５０mM、pH７
．２ ＰＢＳ緩衝液で洗う。次に、実施例３．３．１．で調製した溶液のアリコ
ートを２４時間、４℃でそのキュベット中でインキュベートする。インキュベー
ションの後、そのキュベットを３回、１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ緩衝液、０．
１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗う。次にチューブを２時間、２０℃で１５０mM、pH
７．２ ＰＢＳ飽和緩衝液、５％ ＢＳＡで満たす。洗浄液で３回、洗った後、
そのチューブを乾燥させ、水分を遠ざけて４℃で保存する。
ＩＮＥＲ（microlon 600, reterence 705071）の、高タンパク質吸着のポリスチ
レンマイクロプレートを用いる。マイクロプレートキュベットを１５０mM、pH７
．２ ＰＢＳ緩衝液で洗う。次に、実施例３．３．１．で調製した溶液のアリコ
ートを２４時間、４℃でそのキュベット中でインキュベートする。インキュベー
ションの後、そのキュベットを３回、１５０mM、pH７．２ ＰＢＳ緩衝液、０．
１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗う。次にチューブを２時間、２０℃で１５０mM、pH
７．２ ＰＢＳ飽和緩衝液、５％ ＢＳＡで満たす。洗浄液で３回、洗った後、
そのチューブを乾燥させ、水分を遠ざけて４℃で保存する。
【００８３】 ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤を意図したキュベットのた
めに、用いる洗浄液は１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ 2 であり；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤を意図したキュベットの
ために、用いる洗浄緩衝液は５０mM、pH５リン酸カリウムである。 ３．４．ミルク中の３種の抗生物質の測定 １．４ピコモルの標識化認識剤を４７℃で５分、１００μｌのドープトミルク
の存在下でインキュベートする。そのミルクをピペットを用いて、実施例２．３
．に示すようにプレ処理したキュベットに移す。次にそのミルクを２分、４７℃
でインキュベートする。ミルクを除去した後、洗浄液で２回、洗い（実施例２．
３．２を参照）、その後、顕在化基質を含む３００μｌの緩衝液を２分、キュベ
ット中でインキュベートする（ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤のた
めの顕在化基質：５０mM、pH５リン酸カリウム、９．１mM ＡＢＴＳ、０．００
２％ Ｈ2Ｏ2；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤のための顕在
化基質：１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
４−ＮＰＰ）。次にそのプレートをＥＬＩＳＡプレートのための自動分光光度計
に入れる。ここでその波長は４０５nmにセットする。
めに、用いる洗浄液は１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ 2 であり；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤を意図したキュベットの
ために、用いる洗浄緩衝液は５０mM、pH５リン酸カリウムである。 ３．４．ミルク中の３種の抗生物質の測定 １．４ピコモルの標識化認識剤を４７℃で５分、１００μｌのドープトミルク
の存在下でインキュベートする。そのミルクをピペットを用いて、実施例２．３
．に示すようにプレ処理したキュベットに移す。次にそのミルクを２分、４７℃
でインキュベートする。ミルクを除去した後、洗浄液で２回、洗い（実施例２．
３．２を参照）、その後、顕在化基質を含む３００μｌの緩衝液を２分、キュベ
ット中でインキュベートする（ＢｌａＲ−ＣＴＤ−ペルオキシダーゼ認識剤のた
めの顕在化基質：５０mM、pH５リン酸カリウム、９．１mM ＡＢＴＳ、０．００
２％ Ｈ2Ｏ2；ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ認識剤のための顕在
化基質：１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
４−ＮＰＰ）。次にそのプレートをＥＬＩＳＡプレートのための自動分光光度計
に入れる。ここでその波長は４０５nmにセットする。
【００８４】 このテストは、ＵＳ当局により要求される規制域値での３種の抗生物質ペニシ
リンＧ、シクロキサシリン及びセフチオフルの検出を許容する（５ppb のペニシ
リンＧ、１０ppb のシクロキサシリン及び５０ppb のセフチオフル）。 実施例４．ミルク中の６種の抗生物質ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシ
シリン、シクロキサシリン、セファピリン及びセフチオフルの測定 この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６種の抗生物質の
、これらの当局により現在要求される基準以下までのミルク中での検出を示す。
この例に記載するテストは、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼとの
融合タンパク質の形態のＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、コートしたチュー
ブの形態の支持体を用いる。
リンＧ、シクロキサシリン及びセフチオフルの検出を許容する（５ppb のペニシ
リンＧ、１０ppb のシクロキサシリン及び５０ppb のセフチオフル）。 実施例４．ミルク中の６種の抗生物質ペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシ
シリン、シクロキサシリン、セファピリン及びセフチオフルの測定 この例は、ＵＳ当局により規制されるβ−ラクタム環を含む６種の抗生物質の
、これらの当局により現在要求される基準以下までのミルク中での検出を示す。
この例に記載するテストは、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼとの
融合タンパク質の形態のＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターを用い、コートしたチュー
ブの形態の支持体を用いる。
【００８５】 ４．１．ＢｌａＲ−ＣＴＤ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質 実施例３．１．を参照のこと。 ４．２．固体支持体：参照抗生物質でコートしたチューブ この例において、ブランド名ＮＶＮＫ（Maxisorp type ）の高タンパク質吸着
のポリスチレンチューブを用い、それを実施例３．３．２に示すような参照抗生
物質溶液で処理する。
のポリスチレンチューブを用い、それを実施例３．３．２に示すような参照抗生
物質溶液で処理する。
【００８６】 ４．３．ミルク中の６種の抗生物質の測定 ７ピコモルの認識剤を、エッペンドルフチューブ内で４７℃で５分、５００μ
ｌのミルクの存在下でインキュベートする。次に、そのミルクをピペットを用い
て、実施例３．２に記載されるように処理したチューブに移す。次にそのミルク
を４７℃で２分、インキュベートする。ミルクを除去した後、チューブを２回、
１mLの１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン緩衝液、０．５mM ＭｇＣｌ2 で洗う
。次に、１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
４−ＮＰＰ顕在化基質を含む５００μｌの緩衝液を加え、その基質を２分、４７
℃でインキュベートする。次にその上清の吸光度を、４０５nmに波長を設定した
分光光度計を用いて測定する。
ｌのミルクの存在下でインキュベートする。次に、そのミルクをピペットを用い
て、実施例３．２に記載されるように処理したチューブに移す。次にそのミルク
を４７℃で２分、インキュベートする。ミルクを除去した後、チューブを２回、
１mLの１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン緩衝液、０．５mM ＭｇＣｌ2 で洗う
。次に、１Ｍ、pH９．８ジエタノールアミン、０．５mM ＭｇＣｌ2 、１０mM
４−ＮＰＰ顕在化基質を含む５００μｌの緩衝液を加え、その基質を２分、４７
℃でインキュベートする。次にその上清の吸光度を、４０５nmに波長を設定した
分光光度計を用いて測定する。
【００８７】 この方法は、ＵＳ当局により要求される基準以下の６種の抗生物質の測定を許
容する：５ppb 未満のペニシリンＧ；１０ppb 未満のアンピシリン；１０ppb 未
満のアモキシシリン；１０ppb 未満のシクロキサシリン；２０ppb 未満のセファ
ピリン；５０ppb 未満のセフチオフル。
容する：５ppb 未満のペニシリンＧ；１０ppb 未満のアンピシリン；１０ppb 未
満のアモキシシリン；１０ppb 未満のシクロキサシリン；２０ppb 未満のセファ
ピリン；５０ppb 未満のセフチオフル。
【図１】 膜（２），（３）及び（４）が結合した固体支持体（１）を含むテスト装置の
型である。本発明により用いることができる支持体の型を示す。図１ａはテスト
装置の正面図であり、図１ｂはテスト装置の縦断面図である。
型である。本発明により用いることができる支持体の型を示す。図１ａはテスト
装置の正面図であり、図１ｂはテスト装置の縦断面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ジョリ，ベルナール ベルギー国，ベ−4900 スパ，シュマン デ ムートン 66 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB30 DA80 FA36 FB01 FB03 FB04 FB07 FB12 GC10 GC15 4B063 QA01 QA06 QQ03 QQ15 QQ16 QQ61 QQ98 QR33 QR54 QR83 QS15 QX01
Claims (13)
- 【請求項１】 生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を検出するため
の方法であって、 ａ）決められた量の前記生物流体を、所定量の認識剤に接触させ、そして得ら
れた混合物を、前記生物流体中に存在し得る前記抗生物質の前記認識剤との複合
体形成を許容する条件下で、インキュベートするステップと、 ｂ）ステップａ）で得られた混合物を、支持体上に固定された少くとも１の参
照抗生物質と、ステップａ）で反応していない量の認識剤との前記参照抗生物質
との複合体形成を許容する条件下で接触させるステップと、 ｃ）前記支持体に結合した認識剤の量を決定するステップと、 を含み、ここで、前記認識剤が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheni formis ）から得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレセ
プターを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレ
セプターがＢｌａＲレセプター又はＢｌａＲ−ＣＴＤレセプターであることを特
徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレ
セプターが、金属コロイド粒子、セレニウム、炭素、硫黄又はテルルのコロイド
粒子、及び有色合成ラテックスのコロイド粒子から選択されるラベリング剤に結
合していることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレ
セプターが、蛍光物質から選択されるラベリング剤に結合していることを特徴と
する請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレ
セプターが、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びβ−
ラクタマーゼから選択されるラベリング剤に結合していることを特徴とする請求
項１又は２に記載の方法。 - 【請求項６】 前記抗生物質に対して感受性であるレセプターが、化学的又
は遺伝学的に酵素ラベリング剤に結合していることを特徴とする請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレ
セプターが、ステップａ）の前にラベリング剤に結合されることを特徴とする請
求項３〜６のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項８】 前記β−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性であるレ
セプターが、ステップａ）の間又は後にラベリング剤に結合されることを特徴と
する請求項３〜６のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項９】 ステップａ）又はｂ）を同時に行うことを特徴とする請求項
１〜８のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項１０】 ステッブｂ）に用いる支持体が、参照抗生物質でコートさ
れたチューブ、プレート又はロッドから選択されることを特徴とする請求項１〜
９のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項１１】 ステップｂ）に用いる支持体が、連続的につなげられた第
１の端から開始する第１及び第２の端を有する固体支持体（１）と、 分析する流体を精製するための膜（２）と、 １又は複数の捕獲物質が固定されている膜（３）と、 吸収膜（４）と、 を含むテスト装置であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一に記載の方
法。 - 【請求項１２】 ステップｂ）に用いる支持体が、一セットの磁気又は非磁
気ビーズからなることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一に記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか一に記載の方法により生物流体
中の抗生物質を検出するためのテストキットであって、バチルス・リケニホルミ
スから得られたβ−ラクタム環を含む抗生物質に対して感受性である少くとも１
の認識剤と、支持体上に固定された少くとも１の参照抗生物質と、を含むキット
。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| BE9800485 | 1998-06-25 | ||
| BE9800485A BE1012049A6 (fr) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique. |
| PCT/EP1999/002166 WO1999067416A2 (fr) | 1998-06-25 | 1999-03-30 | Procede pour la determination d'antibiotiques a noyau beta-lactame |
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|---|---|
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| JP2000556056A Expired - Fee Related JP4426103B2 (ja) | 1998-06-25 | 1999-03-30 | 生物流体中のβ−ラクタム環を含む抗生物質を測定するための方法 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008536130A (ja) * | 2005-04-14 | 2008-09-04 | ユニセンサー エッス．アー． | 種々の系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なうインビトロ方法およびこの方法による分析キット |
| JP2018537972A (ja) * | 2015-11-20 | 2018-12-27 | ディーエスエム シノケム ファーマシューティカルズ ネザーランズ ビー．ヴイ． | 廃棄物中の抗生物質の決定アッセイ |
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| EP2529217B1 (en) * | 2010-01-29 | 2013-10-23 | Tartu Ülikool (University Of Tartu) | On-line system, method of its calibration and simultaneous detection of antibiotic residues and their concentration in milk |
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| WO2013037888A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
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| DE69830416T2 (de) * | 1997-10-07 | 2005-11-10 | Ucb S.A. | Testvorrichtung und verfahren zur bestimmung von analyten in einem flüssigen milchprodukt |
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2002
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008536130A (ja) * | 2005-04-14 | 2008-09-04 | ユニセンサー エッス．アー． | 種々の系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なうインビトロ方法およびこの方法による分析キット |
| JP2018537972A (ja) * | 2015-11-20 | 2018-12-27 | ディーエスエム シノケム ファーマシューティカルズ ネザーランズ ビー．ヴイ． | 廃棄物中の抗生物質の決定アッセイ |
| JP2019071822A (ja) * | 2017-10-16 | 2019-05-16 | 日本製粉株式会社 | 変異体受容体タンパク質 |
| JP2019211439A (ja) * | 2018-06-08 | 2019-12-12 | 株式会社島津製作所 | 流体デバイスの製造方法および流体デバイス |
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