JP2002517177A - オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー - Google Patents

オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、経胎盤デリバリーに有用である合成オリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双方であり、好ましくは１２−３５ヌクレオチド長であり、安定化されかつ帯電した骨格および少なくとも１個の化学修飾された塩基または糖部分を有し、ここに該修飾された塩基または糖部分は経胎盤デリバリーを促進する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリーを介した、胚における遺伝
子発現の変調に関する。本発明は、非−ヒト哺乳動物の胚に対するオリゴヌクレ
オチドの経胎盤デリバリーを介して作製した非−ヒト哺乳動物遺伝子のノックア
ウト・モデルを用いる遺伝子機能の決定方法にも関する。
【０００２】 発明の背景 遺伝子配列情報の急速に成長しつつあるデータベースに伴い、イン・ビボ（in
vivo）で迅速かつ効率的に機能に帰着することができる技術に対する要望が存
在する。現在まで、哺乳動物モデルにおいては、唯一の解決策はトランスジェニ
ック・ノックアウト動物の作製であった。マウスおよびラットのごときノックア
ウト動物モデルは、発生の間に演じられる遺伝子の役割を研究する強力なツール
である。これらのモデルにおいては、標的化遺伝子は非−機能的にされ、変化し
た表現型となる。この表現型は該遺伝子の機能およびそれが発生の間に演ずる役
割の指標となり得る。しかしながら、トランスジェニック・ノックアウト法は、
技術的な困難性、要する時間、単一遺伝子標的への制限、および時間依存的な二
次的表現型を取出すことができないことを含む幾つかの重大な不利な点を被る。
【０００３】 最近のかかるノックアウト体を作製する最も広く用いられているアプローチは
、外因性ＤＮＡを用いた遺伝子組換えによる遺伝子の破壊である（Mansour（199
0）Genet.Anal.Tech.App.7：219−227；Robertson（1991）Biol.Reprod.44：238
−245；Zimmer（1992）Ann.Rev.Neurosci.15：115−137）。この方法においては
、刺激して過剰***させた動物から採取した卵母細胞を外因性ＤＮＡでトランス
フェクトする。組換えが起こると、非−機能遺伝子を有する卵母細胞が生じる。
ついで、この卵母細胞を受精させ、動物に着床させる。この形質転換動物のすべ
てのつづく子孫は破壊された標的遺伝子を含んでいるであろう。しかしながら、
この方法は幾つかの重大な不利な点を被る。このトランスジェニック・ノックア
ウト法は高価で、複雑で、時間がかかる。加えて、組換え事象は発生の初期の時
点に限定される。最後に、この技術は、２つの別々の組換えノックアウト動物の
生まれた子孫間の交配を除いては、一度に１を超える遺伝子を標的化することが
できない。
【０００４】 動物ノックアウト体を作製するために用いられているもう１つの方法は、アン
チセンスＲＮＡ（Briceら（1993）Dev.Genet.14：174−184）またはＤＮＡ（Bri
ceら（1993）Dev.Genet.14：174−184；Ochiyaら（1995）J.Cell.Biol.130：997
−1003；Chenら（1995）Biol.Reprod.53：1229−1238；Augustineら（1995）Ter
atol.51：300−310；Stutzら（1997）Mol.Cell.Biol.17：1759−1767）を用いた
胚のイン・ビトロ（in vitro)処理である。アンチセンス・アプローチはｍＲＮ
Ａのレベルで遺伝子発現を破壊し、ホモ接合性ノックアウト表現型の等価体を生
じるという利点を有する。しかしながら、最近用いられている該方法も、人工的
なイン・ビトロ環境で胚を操作し成長させることが必要である点において、高価
で、複雑で、時間がかかる。イン・ビトロで胚を処理するよりも、表現型ノック
アウト体を直接的に作製するために妊娠マウスにオリゴヌクレオチドを投与でき
ることは異なる利点があるであろう。このことに対する明らかな障害は胎盤であ
る。
【０００５】 したがって、ノックアウトモデルを作製し、遺伝子機能を明らかにして研究す
る改善された方法がなお求められている。
【０００６】 アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、細胞性遺伝子の発現から生じる疾病お
よび障害に対する治療適用用の候補として裏付けが示されている（例えば、ＷＯ
９５／０９２３６号、ＷＯ ９４／２６８８７号、およびＰＣＴ／ＵＳ／１３
６８５号を参照されたし）。合成アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、広範な
種々のウイルスを阻害するのに有用なツールであることが実証もされている（例
えば、Agrawal（1992）Trends Biotech.10：152−158を参照されたし）。治療剤
および診断剤としての種々のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの開発はAgrawa
lおよびIyerによって最近概説されている（Current Opinion Biotech.（1995）6
：12−19）。より最近では、アンチセンス・アプローチはイン・ビボの治療処理
に有用であることが見出されている（例えば、Agrawal（1996）TIBTECH 14：376
−387；Moniaら（1996）Nature Medicine 2：668−675；Crookeら（1996）Ann.
Rev. Pharmacol.Med.36：107−129を参照されたし）。
【０００７】 しかしながら、ウイルス感染症または異常型遺伝子発現に対する胚の処理も、
胚の遺伝子または胚によって運搬される外来遺伝子の変調も、アンチセンス・ア
プローチを介して子宮内（in utero）でこれまで首尾よく行われていない。ヒト
疾病に対する非侵入的な治療方法および情報を与えるイン・ビボモデルを案出す
る場合、かかる証明は重要となる。妊娠雌性マウスに注射したホスホロチオエー
ト修飾オリゴヌクレオチドが胚に対して毒性でも奇形性でもないことが、非−特
異的な方法で示されている（Gaudetteら（1993）Antisense Res.Dev.3：391−39
7）。 したがって、哺乳動物の胚における治療に好適で効果的な遺伝子−特異的アン
チセンス・オリゴヌクレオチド療法に対する要望が存在し続けている。
【０００８】 発明の概要 妊娠哺乳動物に全身投与した場合、修飾合成オリゴヌクレオチドは、子宮内で
その胎盤を通過して胚に到達し得、そこで標的遺伝子の発現の変調を実現し得る
ことを発見した。この発見の派生効果は、胚における異常な遺伝子−特異的な発
現によって引起される感染症、疾病および障害を治療するために最近用いられて
いるストラタジーを変えると期待される。この発見を活用して本発明が開発され
、本発明は、遺伝子発現の変調方法および子宮内で合成オリゴヌクレオチドを胚
に、および同時にその母体に無傷でデリバリーする方法；遺伝子機能を決定する
ための方法およびノックアウト・モデル；ならびにかかるモデルを作製する方法
を包含する。
【０００９】 経胎盤デリバリーに有用である合成オリゴヌクレオチドは、好ましくは１２−
３５のヌクレオチド長であり、安定化され帯電した骨格および少なくとも１つの
化学修飾された塩基または糖部分を有するＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双
方であるオリゴヌクレオチドであり、ここに該修飾された塩基または糖部分が経
胎盤デリバリーを促進する。
【００１０】 例示として、ホスホジエステル・ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオ
チドは非−安定化骨格を有するオリゴヌクレオチドである。かかる構築物は安定
ではなく、イン・ビボで分解される。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結
合を有するオリゴヌクレオチドは安定であって、母体組織においても存続してい
る。もう１つの例示において、ホスホン酸メチル・ヌクレオチド間結合を有する
オリゴヌクレオチドは、この系において不活性である非−帯電オリゴヌクレオチ
ド変異型のよい例である。首尾よく修飾された塩基または糖部分の例示は、２’
−Ｏ−メチル リボヌクレオチドであろう。
【００１１】 さらなる例示により、本発明をさらに明らかにする。ホスホロチオエート単独
で修飾されたオリゴヌクレオチドは安定であるが、胎盤を通過しない（Gaudette
ら（1993）Antisense Res.Dev.3：391−397）。５’および３’末端のホスホジ
エステルの領域によって挟まれたホスホロチオエートのコア領域よりなる逆方向
キメラ・オリゴヌクレオチドは、そのホスホジエステル結合が十分に安定化され
ておらず、しかもイン・ビボで分解されるため有効でない。ホスホロチオエート
骨格は帯電しているが、経胎盤デリバリーを促進するためのさらなる修飾が塩基
または塩基群に必要である。経胎盤デリバリーを首尾よく促進するいずれの２’
−置換基も予想されるが、少なくとも１個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド
はかかる修飾である。好ましい具体例は、少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル修
飾リボヌクレオチドを含むホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドである。こ
の好ましい組成は、経胎盤取込み用に安定化も修飾もされているので、有効であ
る。
【００１２】 本発明の前記および他の目的、その種々の特徴、ならびに本発明自体は、添付
する図面と一緒に読めば、以下の説明からより十分に理解し得る。
【００１３】 好ましい具体例の詳細な説明 本明細書中に言及する特許および科学刊行物は、当業者に入手可能である知識
を確立する。本明細書中に引用する発行米国特許、特許査定された出願、および
参考文献は出典明示して本明細書の一部とみなす。本発明は、標的化遺伝子に対
して特異的なオリゴヌクレオチドの妊娠哺乳動物から胚への経胎盤デリバリーを
介する、哺乳動物の胚における遺伝子発現を変調させる方法を提供する。
【００１４】 ゲノム配列決定プロジェクトによって多数の特徴付けされていない配列が同定
されている。本発明は、オリゴヌクレオチドベースであって、遺伝子機能を決定
および／または同定するためのトランスジェニック・ノックアウトモデル系に代
わる迅速で安価な別法を提供する、技術的に単純な遺伝子ノックアウト系を記載
する。本発明の大規模な使用は新規な遺伝子配列の高処理スクリーニングを許容
し、したがって、いずれかのつづく臨床開発におけるリード化合物としての活性
アンチセンス・オリゴヌクレオチドに対して価値ある情報を供すると共に効力の
ある新たな治療標的を同定することができる。本発明は妊娠期間のいずれの時点
においても行うことができ、遥かに広い範囲の確実な標的を供する。また、さら
なるタイプの分析も行うことができる。遺伝子の配列の本来の状況の外側でそれ
を観察することによってはすべての遺伝情報が得られるとは限らない。機能経路
で遺伝子を順番付けすること（エピスタシス）によって、この系を分析すること
ができる。多重ノックアウトは、単に１を超える活性オリゴヌクレオチドで投薬
することによって達成することができる。
【００１５】 本発明は、子宮内における胚の治療用に、例えばＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＢＶ、ル
ビウイルス、インフルエンザまたはＣＭＶのごとき感染症用に；限定されるもの
ではないが連鎖球菌（Streptococci）、大腸菌（E．coli）、リステリア菌（Lis
teria）、エンテロコッカス（Enterococci）、結核菌、ネオセリア（Neosseria
）、グラム陰性腸内生物を包含する病原菌からのもののごとき外来遺伝子の発現
から；または例えば正常な遺伝子の過剰発現のごとき異常型の発現から生じる遺
伝障害用に供される。本発明の方法は、危険性の高い胚の物理学的操作またはい
ずれの侵入手法も必要としないので、胎児治療の現存する方法よりも好ましい。
加えて、妊娠哺乳動物へのオリゴヌクレオチドの全身投与を含む特許請求する発
明の性質のため、妊娠哺乳動物を胚と同時に処理することができる。投与したオ
リゴヌクレオチドは胎盤を通過し、胚の組織に無傷で入り、そこでそれが指向さ
れた遺伝子（群）の発現をダウン−レギュレーションするか変調させる。
【００１６】 遺伝子のダウン−レギュレーションは、経胎盤投与したオリゴヌクレオチドが
胚に入り、塩基対合のワトソン−クリックまたはフーグスティーン法則に従って
その中の相補的一本鎖核酸配列に結合した場合に起こると考えられる。そのよう
になる場合には、オリゴヌクレオチドは、幾つかの機能のうちの１つによって；
正常な翻訳、スプライシングまたは転写に必要な因子の結合を妨害することによ
って；ｍＲＮＡ標的の場合には、ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの酵素的破壊の引
き金を引くことによって；あるいは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドに直接
結合した反応基を介して標的を破壊することによって、標的の機能を破壊し、そ
れによってＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を阻害する。アンチセンス・オリ
ゴヌクレオチドは、ゲノミックＤＮＡに結合し、三重らせんを形成し、転写を阻
害することも示されている（一般的に、Agrawal（1992）Trends in Biotech.10
：152−158；Wagner（1994）Nature 372：333−335；およびSteinら（1993）Sci
ence 261：1004−1012を参照されたし）。
【００１７】 本発明の方法により胚にデリバリーされたオリゴヌクレオチドは、１つのヌク
レオチドの５’末端ともう１つのヌクレオチドの３’末端が共有結合されている
、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または双方の組合せからなる
。これらのオリゴヌクレオチドは少なくとも約１２ヌクレオチド長であるが、好
ましくは１５ないし３５ヌクレオチド長であって、２０ないし２５ｍｅｒが最も
一般的である。
【００１８】 これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートまたはＨ−ホスホネート
法のごとき当該技術分野で認識された方法によって調製することができ、それは
手動的に行うか、またはAgrawal（Trends Biotechnol.(1992)10：152−158）お
よびUhlmannら（Chem.Rev．（1990）90：534−583）に記載されているごとく自
動シンセサイザーによって行うことができる。
【００１９】 第一の態様において、本発明は、子宮内で哺乳動物の胚中の遺伝子の発現を変
調させる方法を提供する。本明細書中で用いる“発現を変調させる”なる語句は
、（ａ）標的化遺伝子または核酸の発現の阻害またはダウン−レギュレーション
、または（ｂ）その発現が標的化された負のレギュレーターまたはレプレッサー
によって調節されている遺伝子または核酸の活性化またはアップ−レギュレーシ
ョンをいう。我々は、（ａ）標的化遺伝子または核酸の発現の阻害またはダウン
−レギュレーションによる変調を優先する。変調させるべき遺伝子は、その発生
の間およびその誕生後に胚中で発現されるいずれの内因性または外因性遺伝子と
することもできる。“内因性遺伝子”とは、胚中に通常見出される遺伝子をいい
、一方“外因性遺伝子”とは、胚および／または誕生後の哺乳動物の組織中で関
連するようになり、後に発現するようになったウイルスまたは他の病原菌、例え
ば細菌の遺伝子をいう。標的化遺伝子は、目的の遺伝子のレギュレーターとする
こともできる。
【００２０】 本発明の方法においては、核酸に特異的な合成オリゴヌクレオチドを哺乳動物
の胚に経胎盤的に子宮内でデリバリーされ、該オリゴヌクレオチドは医薬上許容
される担体と共に妊娠哺乳動物に全身投与される。かく投与されたオリゴヌクレ
オチドは胎盤を通過し、ついで胚中および／または誕生後の哺乳動物中の遺伝子
の発現を阻害する。
【００２１】 “全身投与する”なる語句は、経口摂取、腸もしくは結腸直腸投与によってか
、または筋肉内、静脈内、皮下もしくは腹膜内注射によって、全生物に薬物をデ
リバリーするものとして本明細書中では用いる。“核酸”なる語句は、ゲノミッ
ク領域またはそれから転写されたＲＮＡ分子を包含することを意味する。ある種
の具体例において、核酸はｍＲＮＡである。
【００２２】 いずれの理論または機構にも限定されることなく、本発明の方法で用いるオリ
ゴヌクレオチドの活性は、標的核酸（例えば、ゲノミック領域、遺伝子またはそ
のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分）へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションに依存し、したがって該標的の機能を破壊すると一般的に考えられる
。生理学的条件下におけるかかるハイブリダイゼーションは、核酸配列の機能の
妨害を観察することによって実際問題として測定される。したがって、本発明で
用いる好ましいオリゴヌクレオチドは、胎盤を通過しての取込みを促進すること
ができ、標的核酸と安定な二重らせん（またはフーグスティーン対合機構におけ
る三重らせん）を形成することができ；ＲＮアーゼＨを活性化し、それによって
標的ＲＮＡ分子の効果的な破壊を引起すことができ；加えて、イン・ビボにおけ
る核酸加水分解（例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性）
に抵抗することができる。以下に記載するオリゴヌクレオチドに対する多数の修
飾および当該技術分野で知られている他の修飾は、これらの各々の好ましい特性
に特異的かつ首尾よく対応している。
【００２３】 本明細書中で用いる“哺乳動物”なる語句は、限定されるものではないが、げ
っ歯類、霊長類および特にはヒトを含むその若い生命を有している脊椎動物に限
定される。“非−ヒト哺乳動物”なる語句には、その群からヒトが除かれる。
【００２４】 本明細書中で用いる“合成オリゴヌクレオチド”なる語句は、少なくとも１つ
の５’から３’へのヌクレオチド間結合を介して共有結合したヌクレオチドの化
学合成ポリマーをいう。ある種の具体例において、このオリゴヌクレオチドは少
なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはデオキシ
リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの双方を含む。これらのオリゴヌクレ
オチドは典型的には１２ないし３５ヌクレオチド長である。
【００２５】 ある種の具体例において、オリゴヌクレオチドは、標的化ｍＲＮＡ内に含まれ
るヌクレオチド配列にハイブリダイズするその能力を落とすことなく、多種の方
法で修飾することもできる。本明細書中で用いる”修飾合成オリゴヌクレオチド
”なる語句は、少なくとも２個のそのヌクレオチドが合成結合、すなわち１個の
ヌクレオチドの５’末端ともう１個のヌクレオチドの３’末端との間のホスホジ
エステル結合以外の結合であって、そこにおいては５’ヌクレオチドリン酸が多
種の化学基のうちのいずれかで置換されている結合、を介して共有結合したオリ
ゴヌクレオチドを説明している。ある種の具体例において、オリゴヌクレオチド
の少なくとも１個のヌクレオチド間結合はアルキルホスホネート、ホスホロチオ
エート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデ
ート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、および／またはアセ
トアミデートである。ある種の好ましい具体例において、合成ヌクレオチドのヌ
クレオチドは、１個または少なくとも１個のホスホロチオエート・ヌクレオチド
間結合によって結合されている。ホスホロチオエート結合は混合ＲpおよびＳpエ
ナンチオマーとすることができ、あるいはＲpまたはＳp形態のいずれかで立体規
則性または実質的に立体規則性とすることができる（Iyerら(1995)Tetrahedron
Asymmetry 6：1051−1054を参照されたし）。１つの特別な具体例において、本
発明の方法で用いるオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合は、各々、ホス
ホロチオエート・ヌクレオチド間結合を介して結合されている。
【００２６】 修飾オリゴヌクレオチドは、それが１を超えるタイプのヌクレオチド間結合を
有しているという点において“キメラ”となり得る。例えば、米国特許第５,１
４９,７９７号は、メチルホスホネートまたはホスホルアミデート・フランキン
グ領域の間に挟まれたホスホロチオエート・コア領域を有する伝統的なキメラ・
オリゴヌクレオチドを記載している。１９９６年８月１６日に出願されたＰＣＴ
出願番号ＰＣＴ／ＵＳ５９６／１３３７１号は、オリゴヌクレオチド・ホスホロ
チオエートの１またはそれを超える領域によって挟まれた１またはそれを超える
非イオン性オリゴヌクレオチド領域（例えば、アルキルホスホネートおよび／ま
たはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステル・ヌクレオシド間結
合）を含む“逆方向”キメラオリゴヌクレオチドを開示している。
【００２７】 さらに、“修飾オリゴヌクレオチド”なる語句には、修飾された塩基および／
または糖を有するオリゴヌクレオチドが包含される。加えて、非酸化オリゴヌク
レオチド、または分子中のヌクレオチド当たりに１個の非架橋酸素で置換を有す
る部分酸化オリゴヌクレオチドも、修飾オリゴヌクレオチドと考えられる。また
、修飾オリゴヌクレオチドと考えられるものは、その３’および／または５’末
端（群）にヌクレアーゼ抵抗性を付与するバルキーな置換基、ならびに／あるい
はヒトの介在なしではイン・ビボで見出されない種々の他の構造修飾を有するオ
リゴヌクレオチドである。他の修飾には、オリゴヌクレオチド分子の内部または
末端（群）に存在するものが含まれ、ヌクレオシド間リン酸結合の分子への付加
物、ならびに反対側の鎖に、またはゲノムもしくはＲＮＡに結合する関連酵素も
しくは他のタンパク質に付着または架橋する末端リボース、デオキシリボースお
よびリン酸修飾が含まれる。
【００２８】 “修飾オリゴヌクレオチド”なる語句には、２'−Ｏ−置換リボヌクレオチド
のごとき修飾された塩基および／または糖を有する少なくとも１個のヌクレオチ
ドを有するオリゴヌクレオチドも包含される。本発明の目的につき、“２’−Ｏ
−置換”なる語句は、１−６個の飽和または不飽和の炭素原子を含有する−Ｏ−
低級アルキル基を有するか、または２−６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリール
もしくは−アリル基を有するペントース基の２’位の置換を意味し、かかるアル
キル、アリールまたはアリル基は非置換であっても、あるいは例えばハロ、ヒド
ロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコ
キシ、カルボキシル、カルボバルコキシ、またはアミノ基で；または２’−Ｈ基
以外でヒドロキシ、アミノまたはハロ基で置換されていてもよい。ある種の具体
例において、本発明のオリゴヌクレオチドは、５’末端で２’−Ｏ−アルキル化
された２または４個のリボヌクレオチド（すなわち、５’ ２−Ｏ−アルキル化
リボヌクレオチド）、および／または３’末端で２’−Ｏ−アルキル化された２
または４個のリボヌクレオチド（すなわち、３’ ２−Ｏ−アルキル化リボヌク
レオチド）を含む。ある種の好ましい具体例において、該オリゴヌクレオチドは
２’−Ｏ−メチル化ハイブリッド・オリゴヌクレオチドである。
【００２９】 本発明は、胎盤を通過しての取込みを促進するような合成オリゴヌクレオチド
の修飾も提供する。修飾には、限定されるものではないが、安定化骨格の存在が
含まれる。修飾には、帯電骨格の存在がさらに含まれる。修飾には、化学修飾さ
れた塩基または糖部分も含まれ、ここに該基は経胎盤的な取込みおよびデリバリ
ーを首尾よく促進する。例示として、ホスホジエステル・ヌクレオチド間結合を
有するオリゴヌクレオチドは、非−安定化骨格を有するオリゴヌクレオチドであ
る。かかる構築物は、安定ではなく、イン・ビボ（in vivo)で分解される。ホス
ホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは安定であ
って、母体組織中で存続する。もう１つの例示において、ホスホン酸メチル・ヌ
クレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、この系において不活性である
非−帯電オリゴヌクレオチド変異型のより例である。首尾よく修飾された塩基ま
たは糖部分の例示は、２’−Ｏ−メチル リボヌクレオチドであろう。
【００３０】 さらなる例により本発明をさらに明らかにする。ホスホロチオエート単独で修
飾されたオリゴヌクレオチドは安定であるが、胎盤を通過しない（Gaudetteら（
1993）Antisense Res．Dev．3：391−397）。５’および３’末端のホスホジエ
ステルの領域によって挟まれたホスホロチオエート・コア領域からなる逆方向キ
メラ・オリゴヌクレオチドは有効ではない。なぜならば、そのホスホジエステル
結合は十分に安定化されておらず、イン・ビボで分解されるからである。ホスホ
ロチオエート骨格は帯電しているが、経胎盤デリバリーを促進するさらなる修飾
が塩基または塩基群に必要である。経胎盤デリバリーを首尾よく促進するいずれ
かの２’置換も考えられるが、少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル リボヌクレ
オチドはかかる修飾である。好ましい具体例は、少なくとも１個の２’−Ｏ−メ
チル修飾リボヌクレオチドを含有するホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
である。この好ましい組成は、それが安定化され、かつ経胎盤取込み用に修飾さ
れているため有効である。
【００３１】 もう１つの態様において、本発明は哺乳動物で発現される遺伝子の機能を決定
する方法を提供する。この方法においては、遺伝子に対して特異的な化学修飾合
成オリゴヌクレオチドを、妊娠非−ヒト哺乳動物に医薬上許容される担体中の当
該オリゴヌクレオチドを全身投与することによって、非−ヒト哺乳動物の胚に経
胎盤デリバリーする。該オリゴヌクレオチドは遺伝子の発現を阻害し、それによ
って胚の、そしておそらくは誕生後の哺乳動物の表現型を変化させる。胚および
／または哺乳動物の変化した表現型は、遺伝子の機能の指標となるであろう。
【００３２】 本発明は、胚または誕生後の哺乳動物において発現する遺伝子に対して特異的
な合成オリゴヌクレオチドを子宮内でそれに経胎盤投与し、該オリゴヌクレオチ
ドが遺伝子の発現を変調させ、それによって変化した表現型が生じる、妊娠して
いる非−ヒト哺乳動物中の胚を含む表現型ノックアウト・モデルも提供する。も
う１つの態様において、本発明は、哺乳動物の胚に合成オリゴヌクレオチドを経
胎盤デリバリーする方法を提供する。この方法においては、合成オリゴヌクレオ
チドおよび医薬上許容される担体を妊娠哺乳動物に全身投与する。該オリゴヌク
レオチドは胎盤を通過して胚に至る。
【００３３】 ある種の具体例において、オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチド間結合を有
する。特定の具体例において、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート・ヌク
レオチド間結合を有する。好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドは、少
なくとも１個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドをさらに含む。特別な具体例に
おいて、２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル リボヌクレオチ
ドのごとき２’−Ｏ−アルキル リボヌクレオチドである。好ましい具体例にお
いて、オリゴヌクレオチドは、さらにその３’末端に少なくとも１個の２’−Ｏ
−置換リボヌクレオチドを含み、その５’末端に少なくとも１個の２’−Ｏ−置
換リボヌクレオチドを含む。他の好ましい具体例において、オリゴヌクレオチド
はその３’末端に少なくとも２個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含み、そ
の５’末端に少なくとも２個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含む。特別な
具体例において、オリゴヌクレオチドは、さらにその３’末端に４個の２’−Ｏ
−置換リボヌクレオチドを含み、その５’末端に４個の２’−Ｏ−置換リボヌク
レオチドを含む（すなわち、“４×４のハイブリッド”）。
【００３４】 本発明は、妊娠哺乳動物にオリゴヌクレオチドおよび医薬上許容される担体を
全身投与することを含み、ここに該オリゴヌクレオチドは無傷形態で胎盤を通過
して胎児に至る、合成オリゴヌクレオチドを哺乳動物の胚にデリバリーする方法
も提供する。本明細書中で用いる“無傷形態”とは、ヌクレアーゼによって消化
されていないこと、あるいは部分消化されているが、遺伝子発現を変調させるそ
の能力でアンチセンス・オリゴヌクレオチドとしてなお機能的であることを意味
する。例えば、プロ−ドラッグはイン・ビボで部分消化されてその無傷な活性形
態が得られるように設計されている。
【００３５】 本発明の方法で用いるオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによるその分解の
機会が減少するように修飾されている。哺乳動物に対して非−特異的に毒性でな
い限り、いずれの修飾をも許容し得る。しかしながら、遺伝子発現を変調させる
方法において用いるオリゴヌクレオチドについては、この修飾は標的核酸にハイ
ブリダイズするその能力を落としてはならない。１つのタイプの修飾は１つのヌ
クレオチドの５’末端ともう１つのヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエ
ステル・ヌクレオチド間結合以外の存在であり、そこにおいては５’ヌクレオチ
ド ホスホジエステル結合はいずれかの多種の化学基で置換されている。かかる
化学基の例には、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオ
エート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、ア
セトアミデート、カーボネート、およびリン酸トリエステルが含まれる。
【００３６】 好ましいヌクレオチド間結合はホスホロチオエートである。ホスホロチオエー
ト・ヌクレオチド間結合は、混合ＲpおよびＳpエナンチオマー、あるいはＲpお
よびＳpのいずれかの形態で立体規則性または実質的に立体規則性とし得る（Iye
rら（1995）Tetrahedron Asymmetry 6：1051−1054を参照されたし）。ホスホロ
チオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法（例えば
、Agrawalら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：7079−7083を参照されたし
）またはＨ−ホスホネート法（例えば、Froehler（1986）Tetrahedron Lett.27
：5575−5578を参照されたし）のごとき当該技術分野でよく知られている方法を
用いて調製することができる。Bergotら（J.Chromatog.（1992）559：35−42）
に記載されている合成方法を用いることもできる。
【００３７】 修飾オリゴヌクレオチドは、１を超えるタイプのヌクレオチド間結合を有する
という点で“キメラ”とすることもできる。例えば、米国特許第５,１４９,７９
７号は、ホスホン酸メチルまたはホスホルアミデート・フランキング領域の間に
挟まれたホスホロチオエート・コア領域を有する伝統的なキメラ・オリゴヌクレ
オチドを記載している。１９９６年８月１６日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣ
Ｔ／ＵＳ５９６／１３３７１号は、オリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートの
１またはそれを超える領域（群）によって挟まれた１またはそれを超える非イオ
ン性オリゴヌクレオチド領域（群）（例えば、アルキルホスホネートおよび／ま
たはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステル・ヌクレオチド間結
合）を含む“逆方向”キメラ・オリゴヌクレオチドを開示している。
【００３８】 自己−安定化（self−stabilized）であるオリゴヌクレオチドも、本発明の方
法において有用な修飾オリゴヌクレオチドと考えられる（Tangら（1993）Nuclei
c Acids Res.20：2729−2735）。このオリゴヌクレオチドは２つの領域：標的ハ
イブリダイズ領域；および自己−安定化オリゴヌクレオチド内に存在する核酸配
列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する自己−相補性領域、を含む。
【００３９】 他の修飾には、オリゴヌクレオチド分子の内部またはその末端（群）に存在す
るものが含まれ、コレステリル化合物またはアミノ基と末端リボースとの間に変
化する数の炭素残基を有するジアミン化合物、反対側の鎖またはゲノムに結合す
る関連酵素または他のタンパク質に付着または架橋するデオキシリボースおよび
リン酸修飾のごとき、ヌクレオチド間リン酸結合の分子への付加物が含まれる。
かかる修飾オリゴヌクレオチドの例には、リボースの代わりにアラビノースのご
とき修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチド、あるいはその３’
および５’位の双方で、（その３’位では）ヒドロキシル基以外の化学基に、（
その５’位では）リン酸基以外の化学基に結合する糖を有する３’，５’−置換
オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４０】 他の修飾オリゴヌクレオチドは、その３’および／または５’末端（群）でヌ
クレアーゼ抵抗性を付与するバルキーな置換基でキャッピングされているか、ヌ
クレオチド当たりに１個の非架橋酸素中の置換を有する。かかる修飾は、ヌクレ
オシド間結合のうちの幾つかまたは全部において、ならびにオリゴヌクレオチド
のいずれかまたは双方の末端および／または分子の内部に存在させることができ
る。
【００４１】 本発明の方法で用いる好ましい修飾オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌク
レオチドと少なくとも１個のリボヌクレオチドとの双方を含有するハイブリッド
・オリゴヌクレオチドである。好ましくは、該修飾オリゴヌクレオチドは、その
末端（群）に少なくとも２個の置換リボヌクレオチドを含有する。本発明の目的
につき、“２’置換”なる語句は、例えば、１−６個の炭素原子を含有する−Ｏ
−低級アルキル、アリールもしくは置換アリールまたは２−６個の炭素原子を有
するアリル、例えば２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アリール、２’−Ｏ−アルキ
ル、２’−ハロまたは２’−Ｏ−アミノを有するリボースの２’位における置換
を意味するが、２’−Ｈを有することはなく、ここにアリル、アリールまたはア
ルキル基は非置換であっても、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメ
チル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カ
ルバルコキシまたはアミノ基で置換されていてもよい。有用な置換リボヌクレオ
チドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピルのごとき２
’−Ｏ−アルキルであるが、２’−Ｏ−メチルが最も好ましい。
【００４２】 本発明の方法において有用なハイブリッド・オリゴヌクレオチドは、核酸加水
分解に対して抵抗性であり、ＲＮＡまたはＤＮＡと安定な二重らせんを形成し、
好ましくはＲＮＡとハイブリダイズした場合にＲＮエースＨを活性化する。それ
は、さらに、少なくとも１個の非置換リボヌクレオチドを含んでいてもよい。例
えば、本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオ
チドの３’末端、または当該オリゴヌクレオチドの５’末端の２個の２’置換リ
ボヌクレオチドを除いてすべてデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。
そのほか、該オリゴヌクレオチドはその３’および５’末端の双方に、少なくと
も２個、好ましくは４個の置換リボヌクレオチドを有していてもよい。
【００４３】 修飾オリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野でよく知られている（Agrawal
（1992）Trends Biotechnol.10：152−158；Agrawalら（1995）Curr.Opin. Biot
echnol.6：12−19に概説されており；また、Goodchild（1990）Bioconjugate Ch
em.2：165−187；Agrawalら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）85：7079−708
3；およびUhlmannら（1990）Chem.Rev.90：534−583も参照されたし）。例えば
、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート法、またはメチルホスホルアミデート
法のごとき当該技術分野で認識されている技術を用いてヌクレオチドを共有結合
させることができる（例えば、Uhlmannら（1990）Chem.Rev.90：543−584；Agra
walら（1987）Tetrahedron Lett.28：（31）：3539−3542；Caruthersら（1987
）Meth.Enzymol.154：287−313；米国特許第５,１４９,７９８号を参照されたし
）。オリゴマーホスホロチオエート・アナログは、メトキシホスホルアミダイト
法（例えば、Agrawalら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）85：7079−7083を
参照されたし）またはＨ−ホスホネート法（例えば、Froehler（1986）Tetrahed
ron Lett.27：5575−5578を参照されたし）のごとき当該技術分野でよく知られ
ている方法を用いて調製することができる。Bergotら（J.Chromatog.（1992）55
9：35−42）に記載されている合成方法を用いることもできる。
【００４４】 無傷で胚に経胎盤デリバリーされるオリゴヌクレオチドは、いずれの望ましい
ヌクレオチド配列を有することもできる。胚中の遺伝子発現を変調させる方法に
おいて、投与するオリゴヌクレオチドは、胚中で妊娠時点で発現される外因性ま
たは内因性遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列を有する。有用なヌクレオチ
ド配列には、胚および／または妊娠母体に感染するウイルスまたは他の病原菌か
らの核酸に対して、ならびに正常または異常型の遺伝子または胚中で正常または
異常に発現されるｍＲＮＡに対して相補的なものが含まれる。
【００４５】 本発明の目的につき、“核酸配列に相補的であるオリゴヌクレオチド配列”な
る語句は、例えばワトソン−クリック型塩基対合（オリゴヌクレオチドと一本鎖
核酸との間の相互作用）またはフーグスティーン塩基対合（オリゴヌクレオチド
と二本鎖核酸との間の相互作用）あるいはＲＮＡにオリゴヌクレオチドが結合す
る場合におけるシュードノット形成を含む他のいずれかの方法によって、生理学
的条件下において標的核酸配列に結合するオリゴヌクレオチド配列を意味するこ
とを意図する。生理学的条件下における（ワトソン・クリック型塩基対合による
）かかる結合は、核酸配列の機能の妨害を観察することによって実際問題として
測定される。
【００４６】 本発明の方法に準じて用いられるオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列は、
変調またはダウン−レギュレートされるべき遺伝子に依存して変化する。ある種
の場合、該オリゴヌクレオチドによって標的化される遺伝子または核酸配列はウ
ウイルス核酸配列であろう。種々のウイルスを阻害するアンチセンス・ヌクレオ
チドの使用は良く知られている（［Agrawal (1992) Trends in Biotech. 10: 15
2-158］に論評される）。有効なアンチセンス・オリゴヌクレオチドに相補的な
ウイルス核酸配列がヒト免疫不全ウイルス・タイプ１（ＨＩＶ−１）［米国特許
第４,８０６,４６３号］、単純ヘルペスウイルス［米国特許第４,６８９,３２０
号］、インフルエンザウイルス［米国特許第５,１９４,４２８号］、およびヒト
パピローマウイルス［Storeyら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4109-4114］
を含む多くのウイルスについて記載されている。これらの核酸配列のいずれかに
相補的な配列は、子宮内の胚に影響し得るいずれの他のウイルス由来の核酸配列
に相補的なオリゴヌクレオチドであり得るので、本発明のオリゴヌクレオチドに
つき用い得る。
【００４７】 本発明の方法に用いられる他のオリゴヌクレオチドは細胞性遺伝子または遺伝
子転写物に相補的なヌクレオチド配列を有し、その異常発現または産物が疾病状
態をもたらす。いくつかのそのような細胞性遺伝子の核酸配列が記載されており
、プリオンタンパク質［Stahlら(1991) FASEB J. 5: 2799-2807］、アルツハイ
マー病に関連するアミロイド様タンパク質［米国特許第５,０１５,５７０号］、
ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌおよびＮ−ｒａｓのごとき種々の良く知ら
れたガン遺伝子およびガン原遺伝子を含む。さらに、卵形成、***形成、***運
動性または***生存度に大きくまたは広く関係する構造タンパク質または酵素の
合成を阻害するオリゴヌクレオチドは有用であろう。レニン−アンギオテンシン
系において酵素または関連する酵素を変換するアンギオテンシンの合成をダウン
−レギュレートするオリゴヌクレオチドによって、高血圧を制御することができ
る。心筋および大脳循環疾患、梗塞、動脈硬化、塞栓症および血栓症に用いられ
るトロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制することによって、血小
板凝集を制御することができる。コリンホスホトランスフェラーゼの合成を阻害
することは低脂質血症に有用であろう。ハイブリダイゼーション拘束も数多くの
神経障害の有害効果を低減または除去するために用いることができる。プロスタ
グランジンおよびロイコトリエンを誘導するアラキドン酸カスケードにおいて選
択酵素の抑制は血小板凝縮、アレルギー、炎症、痛みおよび喘息の制御に有用で
あろう。腫瘍耐性を種々の抗ガン剤に展開する原因であり得、化学療法において
主用な障害である多剤耐性（ｍｄｒ−１）遺伝子は、ガン治療に有益であると証
明されるであろう。これらのいずれかのガン由来の核酸配列に相補的なオリゴヌ
クレオチド配列は本発明の方法によるオリゴヌクレオチドに対して用いられ、い
ずれの他の細胞性遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチド配列であり得るの
で、その異常発現または産物が障害または疾患状態をもたらす。
【００４８】 以下に記載するごとく、本発明の方法は、例えば開発中で、特性評価していな
い遺伝子の機能を決定することについて有用であるので、標的される遺伝子また
は核酸の特性または機能が良く特性評価されていることも、あるいは知られてい
ることさえも必要ではない。
【００４９】 本発明において、子宮内の胚への該オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリーが
、該胚を宿している妊娠哺乳動物への該オリゴヌクレオチドの全身投与により達
成される。「全身投与」なる語句は、経口摂取、経腸または経結腸直腸投与ある
いは筋肉内、静脈内、皮下または腹腔内注射による全生物への該薬物のデリバリ
ーを包含することを意味する。該妊娠哺乳動物への全身投与は、当業者が決定す
るごとき状態および反応に依存して、ボーラス的（bolus）、間欠的または連続
的でもよい。
【００５０】 本発明の方法に準じて投与される少なくとも一つの標的化遺伝子の少なくとも
一部分に特異的な少なくとも一つの合成オリゴヌクレオチドを、生理上および／
または医薬上許容される担体と組みあわせた場合、医薬組成物の一部として用い
ることができる。該担体の特性は投与の経路に依存する。そのような組成物は、
該合成オリゴヌクレオチドおよび担体に加えて、希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤
、安定化剤、可溶化剤、および当該分野で知られた他の物質を含有してもよい。
本発明の医薬組成物は、胎盤を通過できる他の活性因子および／または剤も含有
し、遺伝子発現の調節を促進し、かくして、該胚中の遺伝子機能を変化させるこ
とができる。当該さらなる活性因子および／または剤を該医薬組成物中の該オリ
ゴヌクレオチドと共に投与して相乗効果を奏し、あるいは、該合成オリゴヌクレ
オチドにより引き起こされる副作用を最小限にすることができる。本発明の方法
に準じて投与される医薬組成物において、各々が同一または異なる遺伝子または
ｍＲＮＡの異なる部位に向けられる合成オリゴヌクレオチドの組合せを用いるこ
とができる。
【００５１】 医薬組成物の１の型はリポソームの形態を取ることができ、その中では、他の
医薬上許容される担体に加えて、水溶液中のミセル、不溶性単分子膜、液晶また
はラメラ層として凝集形態で存在する脂質のごとき両親媒性剤と共に合成オリゴ
ヌクレオチドが組合される。リポソーム製剤に適する脂質は限定されないが、モ
ノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニ
ン、胆汁酸等を含む。特に有用な脂質担体の一つはリポフェクチンである。その
ようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４,２３５,８７１号；米国
特許第４,５０１,７２８号；米国特許第４,８３７,０２８号；および米国特許第
４,７３７,３２３号に開示されているごとく、当該分野の技術水準にある。本発
明の医薬組成物は、Zhaoら［Biochem. Pharmacol. (1996) 52: 1537-1544］によ
って記載されたごとく細胞へのオリゴヌクレオチドのデリバリーを促進し、また
はポリマーの放出を遅らせるシクロデキストリン等のごとき化合物をさらに含む
ことができる。
【００５２】 合成オリゴヌクレオチドを経口投与する場合、該合成オリゴヌクレオチドは錠
剤、カプセル剤、散剤、液剤またはエリキシル剤の形態であろう。錠剤の形態で
投与する場合、本発明の医薬組成物は、さらに、ゼラチンまたはアジュバントの
ごとき固体担体を含有することができる。該錠剤、カプセル剤および散剤は、約
５ないし９５％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約２５ないし９０％の合
成オリゴヌクレオチドを含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、落花生
油、鉱油、ダイズ油、ゴマ油のごとき動物または植物由来の油、または合成油の
ごとき、液体担体を添加することができる。該医薬組成物の液状形態は、生理食
塩水、デキストロースまたは他の糖類の溶液、またはエチレングリコール、プロ
ピレングリコールまたはポリエチレングリコールのごときグリコール類をさらに
含有することができる。液体形態で投与する場合、該医薬組成物は約０.５重量
％ないし９０重量％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約１ないし５０重量
％の合成オリゴヌクレオチドを含有する。
【００５３】 本発明の合成オリゴヌクレオチドを静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内注射に
より投与する場合、該合成オリゴヌクレオチドは、発熱性物質無しの非経口的に
許容される水溶液の形態であろう。そのような非経口的に許容される溶液は、ｐ
Ｈ、等張性、安定性等のしかるべき配慮を有し、当該技術分野の範疇である。静
脈内、皮下、筋肉内または腹腔内注射用の好ましい医薬組成物には、該合成オリ
ゴヌクレオチドに加えて、塩化ナトリウム注射液（Sodium Chloride Injection
）、 リンゲル注射液（Ringer's Injection）、デキストロース注射液（Dextros
e Injection）、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液（Dextrose and So
dium Chloride Injection）、乳酸リンゲル注射液（Lactated Ringer's Injecti
on）のごとき等張性賦形剤または当該分野で知られている他の賦形剤を含有させ
るべきである。本発明の医薬組成物は安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤また
は当業者に知られた他の添加剤を含むこともできる。
【００５４】 経結腸直腸で投与する場合、上記のオリゴヌクレオチドを不活性な希釈剤また
は吸収可能な担体のごとき生理学上許容される担体でデリバリーする。注射経路
以外により血流に化合物を導入するための医薬上許容される補形剤を含む適当な
製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.)［Genarro編 (1990)
Mack Publishing Co., Easton, PA］に見出される。該医薬製剤は固体、半固体
、懸濁液または乳液形態で導入し、および、いかなる数の良く知られた医薬上許
容される添加剤と調合することができる。該オリゴヌクレオチドおよび他の成分
を硬質または軟質ゼラチンカプセルに内包させるか、ゲルまたはクリームに含有
させるか、あるいは坐剤に圧縮すること等ができる。米国特許第４,７０４,２９
５号、第４,５５６,５５２号、第４,３０９,４０４号、および第４,３０９,４０
６号に記載されているもののごとき徐放性デリバリーシステムおよび／または経
結腸直腸投与形態用のコーティングも考慮されている。
【００５５】 本明細書中で使用されるとき、「治療有効量」なる語句は、誕生前および／ま
たは後の胚に対してまたは胚および母体の双方に対して意義ある利益を示すのに
十分な投与した有効オリゴヌクレオチドの各々の総量を意味する。例えば、治療
有効量のオリゴヌクレオチドとは、ＡＩＤＳまたは母体から胎児へ感染すること
が知られている他のウイルスに感染した母体から産まれた新生児およびその母体
におけるウイルス負荷を低減もしくは根絶するであろう量である。もちろん、該
胎児に対する治療有効量は母体に対する有効量と異なるものであろう。
【００５６】 本発明の医薬組成物における合成オリゴヌクレオチドの量は、該胚においてま
たは該母体および該胚の双方における治療されるべき状態の性質および重篤度お
よび、おそらく該母体が受けた先の治療の性質に依存する。最終的に、診療する
医者が、該胚または胚および母体を治療する合成オリゴヌクレオチドの量を決定
する。最初は、診療する医者は低用量の合成オリゴヌクレオチドを投与し、該患
者の反応を観察する。（例えば、静脈内、皮下、経口または経結腸直腸的に）全
身投与するために、本発明の方法で投与される医薬組成物の用量は約０.１ない
し１０.０ｍｇ/ｋｇ、好ましくは約０.１ないし５.０ｍｇ/ｋｇ体重、および好
ましくは０.５ないし２.０ｍｇ/ｋｇ体重の全用量を供するべきである。全身投
与する場合、好ましくはオリゴヌクレオチドの血中レベルが約０.０１μＭない
し約１０μＭに達するのに十分な用量にて、該治療組成物を投与する。好ましく
は、異常遺伝子発現のサイトでのオリゴヌクレオチドの濃度は約０.０１μＭな
いし約１０μＭ、および最も好ましくは約０.０５μＭないし約５μＭである。
【００５７】 全身投与の持続時間は、治療すべき疾患および各個別の患者の状態および可能
性のある特異性反応に依存して変化する。最終的に、診療する医者が本発明の医
薬組成物を用いた静脈内治療の適当な持続時間を決定する。
【００５８】 本発明は無傷の合成オリゴヌクレオチドを妊娠哺乳動物から該オリゴヌクレオ
チドの経胎盤デリバリーにより哺乳動物胚に導入する方法も提供する。本発明は
限定されないが、安定化骨格、帯電骨格および化学的修飾塩基および／または糖
類部位を含む修飾を含有する合成オリゴヌクレオチドの使用を含み、ここに、当
該部位は該修飾オリゴヌクレオチドの経胎盤取込みおよびデリバリーを首尾よく
促進する。該オリゴヌクレオチドが無傷であることは、胚組織をサンプリングし
、ＨＰＬＣまたはいずれの知られた方法（例えば、［米国特許第５,６２７,２７
７号、ＰＣＴ/ＵＳ９５/０１０４８号およびＰＣＴ/ＵＳ９６/２０２６６号］を
参照。）により該オリゴヌクレオチドのサイズおよび配列を決定することによっ
て決定し得る。
【００５９】 妊娠中の哺乳動物に全身投与された合成オリゴヌクレオチドが、本発明の方法
により胎盤を経て胚にデリバリーできるか、もしそうならば、かかるオリゴヌク
レオチドが子宮内の胚において遺伝子発現を変調できるかを決定するために、以
下の試験を行った。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に特異的なオリゴヌクレオチ
ドを妊娠中のマウスに全身投与した。４８時間後、種々の体組織の試料をアニオ
ン交換ＨＰＬＣおよびＵＶ吸収によってオリゴヌクレオチド含有量につき分析し
た。
【００６０】 図１は、処理した妊娠中のマウスの肝臓、腎臓、脾臓および胎児中のＶＥＧＦ
特異的ハイブリッド・オリゴヌクレオチドの濃度を示す。低レベルのオリゴヌク
レオチドが、分析した全妊娠マウスからの胚において見られる。これらの結果は
、合成オリゴヌクレオチドが胎盤を通して母親から胎児へ経胎盤デリバリーでき
ることを示す。
【００６１】 ＶＥＧＦは、内皮細胞−特異的マイトジェンである。３形態のＶＥＧＦをコー
ドする核酸配列が、ヒトにおいて報告され（Tischerら（1991） J. Biol. Chem. 266: 11947−11954）、ヒト型およびマウス型ＶＥＧＦ間の比較は８５％を超え
る種間保存を明らかとした（Claffeyら（1992） J. Biol. Chem. 267:16317-163
22）ことが報告されている。
【００６２】 ＶＥＧＦ発現は、最近、低酸素によって刺激され、腫瘍血管形成（Sengerら(1
986) Cancer 46:5629-5632;Kimら(1993) Nature 362;841-844;Schweikiら(1992)
Nature 359:843-845;Plateら(1992) Nature 359;845-848;Tischerら(1994) J.
Biol. Chem. 266:11947-11954）およびレチナール新血管新生（Aielloら(1994)
New. Eng. J. Med. 331: 1480-1487）に必要であることが示された。さらに、上
昇したレベルのＶＥＦＧが、最近、糖尿病の患者からの眼硝子内にて見出された
（Aielloら 同上 ）。かくして、上記の種々の条件によって影響された組織にお
けるＶＥＧＦ発現の調節は、したがって低酸素に関連した治療または予防的治療
において鍵となり得るであろう。
【００６３】 胚中のＶＥＧＦの機能の一次損失はよく特徴付けされている（FerraraおよびD
avis-Smith(1997) Eradocrine Reviews 18:4-25;Carrnelietら(1996) Nature 38
0:435-439）。ヘテロ接合性およびホモ接合性の双方の組換えノックアウト表現
型は、第一血管形成できないことからＥ１０.５により致死的である。これらの
胚は、血管発育の著明な欠如および結果として生じた発育停止を示す。血管の増
殖は発生せず、卵黄嚢が明確でなく、胚発育および成長は減少する。生体内の用
量応答実験は、ＶＥＧＦがハプロ−不十分であるためにこれらの株では不可能で
ある。
【００６４】 経胎盤デリバリーされた合成オリゴヌクレオチドが子宮内の胚において遺伝子
発現を調節できるかを決定するために、処置後の胚の物理的特性、すなわち、表
現型を評価した。化学コントロールオリゴヌクレオチドで処置した動物からの全
ての胚は出産まで行き得る動物を含めて正常に見えた。ＶＥＧＦオリゴヌクレオ
チド（配列番号：２）で処置した動物において、ネズミＶＥＧＦノックアウト動
物につき以前に報告されたいくつかの表現型：コントロールからのものより均一
に小さい発育停止した胚；先の頭蓋顔奇形；および限定***した血管形成の胚が
観察された。また、これらの動物の大動脈上皮は、高度に崩壊した。さらに、活
性なオリゴヌクレオチド（配列番号：２）で処置した動物は、コントロールオリ
ゴヌクレオチドで処置したものより高度に妊娠不全であった（７５％妊娠に比較
して２５％妊娠）。これは、胚が発育停止したために、それらが死滅し、これら
の動物において吸収されたのかもしれない。
【００６５】 第二遺伝子についてのオリゴヌクレオチドに基づく阻害の遺伝子特異性を評価
するために、Ｅ−カドヘリン（E-cadherin）を試験した。Ｅ−カドヘリンの機能
の損失は特徴付けされている（Takeichi,1988、Andersont 1990）。合成アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを生成し、培養中のＥ１０の胚に羊膜の微量注入によっ
て導入した結果、Ｅ１２の胚において神経管欠損を生じることが以前に示された
（Chen、B.およびHales、B. F.(l995) of Reproduction、53: 1229-1238）。妊娠成
体マウスは、本発明の方法によりＥ１０にてＥ−カドヘリン・アンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（図２）で処置され、胚はＥ１２.５にて収穫した。前記の各表
現型が確認された。本質効果は、菱形脳浮腫（脹れた後脳）、神経管閉塞欠損お
よび発育停止であった。５ｂｐのミスマッチコントロールオリゴヌクレオチドは
、胚において影響はなかった（図２）。この同一神経管欠損は子宮内のＥ−カド
ヘリンに対するオリゴヌクレオチドに基づく阻害を用いて観察された。重要なこ
とには、オリゴヌクレオチドに基づくＥ−カドヘリン阻害によって規定される発
育欠全は、オリゴヌクレオチドに基づくＶＥＧＦ阻害によって規定されるものと
は別であり、区別される。
【００６６】 その結果は、オリゴヌクレオチドに基づく遺伝子発現の阻害が哺乳動物モデル
において定期的な遺伝子機能を規定する強力な新しいツールであることをさらに
示す。ＶＥＧＦおよびＥ−カドヘリンの機能的表現型の第一損失は、ノックアウ
ト表現型と同一であり、さらに、ＶＥＧＦの第二表現型が明らかにされた。Ｅ−
カドヘリンの第二表現型（神経管欠損）は、胚培養においてアンチセンスを用い
て記載されてきて、生体内にて現在確認されている。これは、狭い時間範囲で阻
害を試験することを可能とし、発育時間に基づいて表現型の分離を可能として、
第二表現型の生成を迅速にかつ容易にする。生育している胚における組換え体ト
ランスジェニック・ノックアウト表現型をそのコストの何分の一かでおよび年に
代えて日で反復した。
【００６７】 これらの結果は、哺乳動物の胚において遺伝子発現の下降調節がオリゴヌクレ
オチドの経胎盤投与によって達成できることを確認する。 さらに、表現型ノックアウトモデルが開発され、それは発育している胚をａｎ
ｉｎするために経胎盤デリバリーしたオリゴヌクレオチドの濃度が遺伝子発現を
中断させることによって発育を阻害するのに十分であるということを示す（図３
）。
【００６８】 また、子宮内の胚において発現した内因性または外来性遺伝子の機能を評価す
るために、本発明は非−ヒト哺乳動物のノックアウトモデルを提供する。この表
現型モデルにおいて、妊娠中の、非−ヒト哺乳動物における胚は、胚において発
現した遺伝子に特異的な合成オリゴヌクレオチドを子宮内経胎盤投与する。本発
明のモデルにおける投与用量は、約０.１ないし１００.０ｍｇ/ｋｇ、好ましく
は約１ないし５０ｍｇ/ｋｇ体重、最も好ましくは１８ｍｇ/ｋｇ体重の総用量を
供すべきと考えられる。そのオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を調節し、そ
れによって胚または誕生後の哺乳動物に変化した表現型を生じる。このように、
種々の遺伝子の機能を決定できる。
【００６９】 本発明のこのノックアウトモデルは、組換えノックアウトモデルの多くの問題
に解法を供する。実験は妊娠成体への全身投与を含めて技術的に単純である。回
収時間は、年よりむしろ日のオーダーであり、遥かに少ない費用となる潜在性を
有する。オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリーは、妊娠中何時でも行うことが
でき、組換えノックアウトモデルよりも、より広範囲の有効な標的を提供し、よ
り多くのタイプの分析を行うことができる。さらに、複数のノックアウトは、一
つを超える活性オリゴヌクレオチドを単に投与することによって達成できる。か
かる組合せアプローチを用いて、多数のオリゴヌクレオチド配列および遺伝子標
的を機能につき試験できる。この機能的データを用い、細胞培養および動物モデ
ルを特異的に開発して、種々の科学的および医学的要求に適応できる。このタイ
プのスクリーニングは、潜在的な新しい治療標的についての機能的情報を生むだ
けではなく、いずれかのひき続いての臨床的開発に対して活性なアンチセンスオ
リゴヌクレオチドをリード化合物として供する利点を提供する。
【００７０】 このモデルについてのさらなる適用は、後世的および上位性の試験を含む。全
ての遺伝情報がその天然の意味外にある遺伝子配列の観察によって得ることがで
きるのではない。（上位性の）機能的経路における指令遺伝子は、治療標的を識
別するのに重要な成分である。さらに、多数の情報は構造形態に保存され、直鎖
状ＤＮＡ配列に依存しない。この情報は、遺伝的ノックアウトの他の方法を用い
ては非常に得がたいが、本発明のオリゴヌクレオチドに基づくノックアウトモデ
ルにおいては分析できる。また、アフリカツメガエル発育における無翼の情報伝
達経路の一員であるβ−カテニンは、このモデルを用いて治療的適用について潜
在的な新しい標的として研究できる。腫瘍遺伝子としてのその役割はよく知られ
ている。また、ｐ３００、ヒストン脱アセチラーゼの研究は、インプリンティン
グの疾患に洞察を提供できる。そのｐ３００転写因子は、細胞内の全ての活性化
された転写につき必要であり、動的な後世的制御機構の一員である。
【００７１】 また、本発明のモデルは、オリゴヌクレオチド最適化において用い得る。活性
オリゴヌクレオチドの最適化の主領域の一つは、変異体化学である。分子の各部
分に対する修飾が試験されたが、機能についてのアッセイは、依然として組織培
養にあった。機能についてのこの生体内モデルは、いずれの最適化手法の関連性
もかなり増強する。さらに、正常な生体内状況においてオリゴヌクレオチドと標
的との相互作用を試験できる本モデルシステムを確立することは、ある種の標的
配列の接近性について非常に貴重なデータを提供するであろう。これらのデータ
は、配列モチーフと機能を関係付けて、将来オリゴヌクレオチド薬物を設計する
能力を劇的に増強させるであろうデータベースに編集できる。
【００７２】 遺伝子が、生物の寿命にわたって、異なる時間にかつ異なる細胞タイプ中で発
現するので、何時、しばしばどのように遺伝子が発現するのかを知ることは重要
である。組換えノックアウトモデルは最初の必要な発現事象についての情報を提
供するにすぎない。対照的に、特許請求したモデルにおいては、オリゴヌクレオ
チド投与を開発中のいずれかの時点にて行うことができるために、発現の各バー
ストの同定は可能である。
【００７３】 胚にデリバリーされるオリゴヌクレオチド量を変更することは、細胞の要求に
ついての有用な情報を提供できる（図３）。ハプロ−不十分性または活性である
ための遺伝子の２つのコピーの必要性は、遺伝的分析における情報の重要な部分
である。さらに、多くのヒト疾患は、遺伝子発現の不完全な失敗の結果である。
組換えノックアウトは、疾患における発現レベルに対応しないかもしれない、す
べてのまたは半分の状況を提供し、または全く提供しない。本モデルにおいて、
オリゴヌクレオチドの用量を変更することによって、０％ないし１００％のいず
れのレベルの発現も繰り返すことができる。
【００７４】 創傷修復における発育遺伝子の役割における最近の注目は、成体における再活
性化した胚性遺伝子の外挿に導いた。オリゴヌクレオチドに基づくノックアウト
は、これらの再生特異的遺伝子の活性化発現を研究するためのユニークなモデル
系を提供する。
【００７５】 血液脳関門は、病原体および薬物が突破するのに最も難しい防御を示す。その
バリアーは、発育している胚においては十分には形成されず、脳内の薬物効力に
ついて強力なモデルを提供する。現実的には、胚は機能している免疫系を有しな
いが、その制御系は多くの複雑な経路を活性化し、その結果、正常な免疫系を生
じさせている。これらの制御系のうちの多くの崩壊は、多数の免疫系欠損および
疾患についてのモデルの生成に導くであろう。
【００７６】 ノックアウトの概念は、通常、遺伝子発現の阻害またはスイッチを切ることに
関連する。しかしながら、多くの場合に、発現を上昇調節できる。負の調節因子
またはリプレッサーを不活化することによって、リプレッサーの下流標的は増強
されるであろう。多くの疾患は、かかる相互作用の直接的結果であり、本発明の
ノックアウトモデルは、かかる遺伝的問題を研究するために構築することができ
る。
【００７７】 種々の疾患は、限定されるものではないが、早期に開始のアルツハイマー病、
ＢおよびＴ細胞成熟に関係した疾患およびガンを含めてこのモデルを用いて研究
できる（また、そのための治療剤を試験できる）。例えば、プロトオンコジーン
および腫瘍抑制遺伝子の機能は、このモデルにおいて決定できた。機能について
は：
【００７８】 多くの発育遺伝子はガンの発生にも関与する。生体内でのその発現の調節は、
ガン治療のための活性治療分子を開発するための強力な道具を示す。ネズミＶＥ
ＧＦは、機能的データが生体内系において獲得でき、このデータを新薬の開発に
適用できる明確な例を示す。また、本モデルを用いて、ガン治療における薬物と
してのオリゴヌクレオチドを最適化できる。種々の配列および化学的性質を試験
することにおいて、発育モデルは豊富な柔軟性を提供するであろう。
【００７９】 また、本発明のモデルおよび方法は、自己免疫疾患における治療剤としてのオ
リゴヌクレオチドを設計するのに有用である。多くの成体の自己免疫疾患は、遺
伝子の特異的な対立遺伝子の存在と関連付け得る。この対立遺伝子の存在は、疾
患に対する感受性を構成し、環境因子は、疾患の発現を生じ得る。狼瘡、慢性関
節リウマチ、強直性脊椎炎、ブドウ膜炎およびクローン病のような疾患は、すべ
て本質的な免疫系蛋白質の特異的対立遺伝子と関連している。対立遺伝子を発現
する患者を治療すると、危険な分子を下降調節して、疾患のリスクを低下させる
であろうフィードバック機構を活性化できるであろう。
【００８０】 また、このモデルを用いて、発育している胚において合成遺伝子の発現を調節
するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発し、評価できる。このタ
イプの効果に対して多くの農業的および獣医的適用がある。ウイスル遺伝子を標
的とするオリゴヌクレオチドでの治療は、未成熟な免疫系における保護を確立す
る手段を示す。 以下の例は、本発明を作成し行うのに好ましいモデルを示すが、別法が同様の
結果を得るのに利用できるために、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８１】実施例１ オリゴヌクレオチドホスホロチオエートおよび ハイリッドオリゴヌクレオチドの合成 ホスホロチオエートデオキシヌクレオシドは、米国特許第５,１４９,７９８号
に記載されたＨ−ホスホネートアプローチを用いて、自動シンセサイザー（Mode
l8700、Millipore，Bedford，MA）で５−６マイクロモルスケールでＣＰＧ上で
合成した。デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートはMillipore社(Bedford，MA
）から入手した。２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドＨ−ホスホネートまたはホ
スホロチオエートは、標準的手法によって合成し（例えば、Meth. Mol. Biol.(1
993) vol.20中の「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」参照）、また
は商業的に（例えば、Glenn Research社，Sterling，VAおよびClontech社，Palo
Alto，CAから）入手した。２'−Ｏ−メチルヌクレオシドを含むオリゴヌクレオ
チドのセグメントは、望ましいサイクルにつき２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシ
ドＨ−ホスホネートまたはホスホロチオエートを用いて組み立てた。同様に、デ
オキシリボヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドのセグメントは、望ましいサ
イクルにつきデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートを用いて組み立てた。組立
の後、ＣＰＧ結合オリゴヌクレオチドＨ−ホスホネートをイオウで酸化して、ホ
スホロチオエート結合を生成した。次いで、オリゴヌクレオチドは、４０℃にて
濃ＮＨ4ＯＨ中で４８時間脱保護した。
【００８２】 粗製のオリゴヌクレオチド（約５００Ａ260単位）は、Ｃ13逆相溶媒の逆低圧
クロマトグラフィーで分析する。ＤＭＴ基は、８０％酢酸水溶液で処理すること
によって除き、次いでオリゴヌクレオチドを蒸留水に対して透析し、凍結乾燥さ
せた。
【００８３】実施例２ 胚へのオリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー 妊娠１４日目の妊娠中の非近交系ＩＣＲマウスをHarlan Sprague Dawley社（I
ndianapolis，IN）から入手した。動物は、２１ｍｅｒのホスホロチオエート（
ＰＳ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列 ５' ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ Ｃ
ＣＧ ＣＣＴ ＴＧＧ（配列番号：１）、２１ｍｅｒの４×４ハイブリッドＰＳオ
リゴヌクレオチド（ｍＶＥＧＦを標的とした配列 ５' ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＣ Ｔ
ＣＡ ＣＣＧ ＣＣＵ ＵＧＧ（配列番号：２）（下線配列は２'-Ｏ−メチルＲＮ
Ａである））；またはミスマッチの化学的コントロールオリゴヌクレオチドのい
ずれかで、１８ｍｇ/ｋｇの用量にて静脈内注射した。動物を２４または４８時
間後に犠牲にして、腎臓、肝臓、脾臓および胚を採取した。その組織を重量測定
し、５ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ トリス、ｐＨ ８.０；６.４ｍＭ ＥＤＴＡ；２
ｍＭ ＮａＯＨ；１６ｍＭ ＳＤＳ中でホモジナイズして１０％懸濁液を得た。５
０μｌのホモジネートにプロテイナーゼＫ（Sigma Chemical Company社，St. Lo
uis）の２０ｍｇ/ｍｌの溶液の１０μｌを添加し、６０℃にて２時間、次いで９
５℃にて１５分間インキュベートした。１０μｌの消化物を１６０μｌの１０％
ｖ/ｖ血清；０.５％ｖ/ｖ ＮＰ４０；０.９％ｖ/ｖ ＮａＣｌと混合した。これ
は、Hewlett Packard Company社製Model HP−1090機器を用いてアニオン交換Ｈ
ＰＬＣによって分析した。物質は、ｐＨ １０.５の２５ｍＭトリス-ＨＣｌ；２
ｍＭ ＥＤＴＡ中の０.５-２.０Ｍ ＬｉＢｒの塩勾配中で溶出させ、２７０ｎｍ
にてＵＶ吸光度によって検出した。組織中のオリゴヌクレオチド濃度は、既知濃
度のオリジナルのオリゴヌクレオチドから導かれた較正曲線から外挿した。結果
を図１に示す。
【００８４】 確認試験は、同一用量にて、ハイブリッドＰＳオリゴヌクレオチド（配列番号
：２）および（ＶＥＧＦ遺伝子の異なる領域に指向されたミスマッチオリゴヌク
レオチドである）ハイブリッド化学コントロールオリゴヌクレオチドを用いて、
妊娠６または７日目のマウスで行った。胚は、分析のために５日後または誕生に
て取り出した。
【００８５】実施例３ マウス型Ｅ−カドヘリン遺伝子を標的とする オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー マウス上皮カドヘリン（Ｅ−カドヘリン）遺伝子を論文（Chen，B.およびHale
s，B. F.(1995) Biology of Reproduction，53: 1229-1238）に以前に記載され
たアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い標的とした。妊娠１０日目の妊娠中の
非近交系ＩＣＲマウスをHarlan Sprague Dawley社(Indianapolis，IN）から入手
した。動物は、２１ｍｅｒの４×４ハイブリッドＰＳオリゴヌクレオチド（マウ
スＥ−カドヘリンを標的とした配列 ５' ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ３'（配列番号：３）（下線配列は２'-Ｏ−メチルＲＮＡである））；ま
たはミスマッチの化学コントロールオリゴヌクレオチド（Ｅ−ｃａｄ−ｍｍ；配
列番号.１０）のいずれかで１８ｍｇ/ｋｇの用量にて静脈内注射した。動物を妊
娠１２日目に犠牲にして、胚を取り出し評価した（図２）。
【００８６】 観察した表現型は、ラットの全胚培養系において以前に報告されたものと同一
であり、次の通りまとめられる：すべてのコントロ−ル胚は正常である（ｎ=１
２）。Ｅ−カドヘリンアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した胚において、
すべてが発育停止し（ｎ＝１９）、１７個は伸びた後脳を有し、１個は後脳がな
く、１４個が菱形脳浮腫を有し、１５個が伸びた心膜を有して、７個が神経管閉
塞欠損を有した。
【００８７】実施例４ マウス型ＶＥＧＦ遺伝子を標的とする胚への オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー 定期の妊娠中のSwiss−Websterマウスに発育中の異なる時間にて単一用量のオ
リゴヌクレオチドを注射した。２９個のオリゴヌクレオチド配列および化学的修
飾を試験した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、成体または胚中のい
ずれにおいてもいかなる観察可能な効果を生じなかった。２'−Ｏ−メチルホス
ホロチオエート修飾したオリゴヌクレオチド、Ｖｍ、Ｍ３，Ｍ１３およびＨ３の
単回注射を１８ｍｇ/ｋｇ体重でＶＥＧＦの機能表現型の損失を各々繰り返した
Ｅ７.５−Ｅ８.５にて、成体に対する観察可能な毒性効果を持たなかった（Robi
nson、個人的知見）（図３）。
【００８８】 Ｅ６−７.０でのオリゴヌクレオチドの注射は効果を有しなかった。Ｅ９ない
しＥ１２の第一血管形成の残留物では、オリゴヌクレオチド処置は効果を持たず
；胚は正常に発育した。
【００８９】 血管形成表現型（Ｅ７.５−８.５）の損失は、組換えノックアウトの公表報告
（FerraraおよびDavis-Smith(1997) Endocrine Reviews 18:425;Cannelietら(19
96) Nature 380:435-439）とは区別が付かなかった。卵黄嚢血管は、活性オリゴ
ヌクレオチド処置した動物において明確でなく、胚のサイズは野生型の平均６０
％で、頭蓋顔奇形はノックアウトと一致した。Ｅ１０−１２.５の形態学の分析
は、Ｅ１０.５での発育中止、その結果、組織発育の遅れおよび血管のゆるい組
織化を示した。ノックアウト表現型からのわずかに示された差は、組織学的切片
において観察されたＥ１０.５致死率と関係したアポトーシス増加の欠如であっ
た。
【００９０】 Ｖｍ（配列番号.４）、Ｍ３（配列番号.５）およびＭ１３（配列番号.６）は
、マウス特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、一方、Ｈ３（配列番
号.７）はヒト型ＶＥＧＦ配列に基づき、マウス配列に単一の塩基ミスマッチを
含む。活性オリゴヌクレオチドのうち４つは、同一表現型を生成し、同一キネテ
ィックで薄めた。ＶｍまたはＶｍ（Ｖｍ−ｍｍ；配列番号.８）、Ｍ３（Ｍ３−
ｍｍ；配列番号.１１）、Ｍ１３（Ｍ１３−ｍｍ；配列番号.１２）もしくはＨ３
（Ｈ３−ｍｍ；配列番号.９）に対する５塩基ミスマッチのいずれのセンスコン
トロールもいかなる観察可能な効果を生じなかった。４個の２'−Ｏ−メチルオ
リゴヌクレオチド、１６個のホスホロチオネートオリゴヌクレオチド、２個のメ
チルホスホネート修飾オリゴヌクレオチドおよび２つの逆方向キメラオリゴヌク
レオチドを含めた評価された２４個のさらなるオリゴヌクレオチドは、いかなる
野生型からの観察可能な表現型変化も生じなかった（データを示さず）。
【００９１】 Ｅ１２−Ｅ１９からのＶｍまたはＨ３の単回注射は、第二のＶＥＧＦ表現型を
発見せず、その結果、脱水および広がった嚢を生じさせた。注射の時期は非常に
重要であり；Ｅ１６.５ないしＥ１９まで以外の効果が観察されなかったＥ１６
に先立って、活性阻害剤の用量は、著しい広がった嚢を伴う周産期の致死（Ｐ２
.５）を生じさせた。コントロールオリゴヌクレオチドは、いずれの腎臓欠損も
誘導せず、野生型から区別できなかった。ヘマトキシリンおよびエオシン染色し
た腎臓切片は、糸球体、ネフロンまたは関連した血管の組織学的構築において変
化がないことを明らかとした。この表現型は、ＶＥＧＦ抗体処置に比べて顕著で
あり、その結果、血管形成を崩壊させ、ネフロンおよび糸球体の数を減少させた
（Ｋｉｔａｍｏｔｏ、１９９７）。注目すべきことには、Ｅ１６.５および誕生
の間のＶＥＧＦ阻害は、腎臓内の内皮細胞の増殖および血管の形成に効果はなか
った。オリゴヌクレオチドに基づく阻害によって誘導された腎臓欠損は、血管透
過性因子としてＶＥＧＦの役割を示唆する。
【００９２】実施例５ マウス型Ｅ−カドヘリン遺伝子を標的とする オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー 経胎盤デリバリーを判定するために、胚中のオリゴヌクレオチドレベルをＨＰ
ＬＣによって測定し（図１）、成体の脾臓中のレベルに匹敵することを見出し、
胎盤が化合物に対してバリアーでないことを示した。ノックアウト表現型の胎盤
取込みおよび生成の双方は、オリゴヌクレオチド配列および化学薬品に依存し、
遺伝子特異的であった。そのオリゴヌクレオチドの特異的アンチセンスｍＲＮＡ
阻害活性につきアッセイのために、Ｅ７.５またはＥ８.５の胚を持つ成体動物に
２０ｍｇのオリゴヌクレオチド/ｋｇ体重にて単一用量でＩＰ注射した。胚は注
射後６時間集めた。全ＲＮＡを胚から抽出し、ＤＮａｓｅで処理し、即時型定量
ＰＣＲ（PE-ABI Prism 7700 SDS）を用いて、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにつきアッセイ
した。非処置の、コントロール処置のおよびＶｍ処置の同腹子からのＶＥＧＦ
ｍＲＮＡレベルは、参照標準物質であるシクロフィリンに比較して測定した。Ｖ
ｍ処置したＥ７.５＋６時間の胚において、非特異的オリゴヌクレオチド処置し
たコントロールに比較して、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡが５４％低下した（データを示
さず）。このデータは、ＶＥＧＦのオリゴヌクレオチドに基づく阻害がＶＥＧＦ
ｍＲＮＡのレベルを特異的に低下させているというモデルを示唆する。
【００９３】実施例６ マウス型Ｅ−カドヘリン遺伝子を標的とする アンチセンスオリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー 第二遺伝子につきオリゴヌクレオチドに基づく阻害の遺伝子特異性をアッセイ
するために、Ｅ−カドヘリンを試験した。Ｅ−カドヘリンの機能損失は特徴付け
されている（Takeichiら(1988) Development 102:639-655， Andersonら(1990)
Experimentia 46:2-13）。Ｅ−カドヘリンノックアウトは、コンパクション欠乏
を受ける。母親のＥ−カドヘリンはコンパクションを誘導するには十分であるが
、Ｅ−カドヘリン（-/-）バックグラウンドは、固く結び付いた状態を維持でき
ず、胞胚腔を形成しない。合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成して、培
養中のＥ１０胚に羊膜微量注入によって導入し、その結果、Ｅ１２胚の神経管欠
損を生じさせた（Chen、B.およびHales、B. F.(1995) Biolofiy or Reproduction、
53;1229-1238）。同一神経管欠損を子宮内のＥ−カドヘリンに対するオリゴヌク
レオチドに基づく阻害を用いて観察した。
【００９４】 活性なＥ−カドヘリンオリゴヌクレオチドを、活性ＶＥＧＦオリゴヌクレオチ
ドに構造上類似する部分的２'−Ｏ−メチル修飾塩基と共にホスホロチオネート
骨格を含めて合成した（図２）。コントロールとして、４塩基ミスマッチをオリ
ゴヌクレオチドのプリン/ピリミジン比を保存して生成した（Ｅ−ｃａｄ−ｍｍ
；配列番号.１０）。妊娠中の成体はＥ１０にて処置し、その胚をＥ１２.５にて
集めた。以前に記載した各表現型を確認した。本質効果は、菱形脳浮腫（脹れた
後脳）、神経管閉塞欠損および発育停止であった。重要なことには、Ｅ−カドヘ
リンのオリゴヌクレオチドに基づく阻害によって規定された発育欠損はＶＥＧＦ
のオリゴヌクレオチドに基づく阻害によって定義されたものと別であり、区別さ
れた。卵黄嚢および胚の血管は正常であり、頭蓋顔奇形はＥ−カドヘリン表現型
の特徴であって、すべての発育停止は、野生型のおおよそ８０％と著しく異なっ
た。
【００９５】 配列表の概要 配列番号.１ Ｖｍ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＴＧ
Ｇ 配列番号.２ Ｖｍ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＣＵ ＵＧ
Ｇ 配列番号.３ E-cad ＧＧＡ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＣＧ 配列番号.４ Ｖｍ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＴＧ
Ｇ 配列番号.５ Ｍ３ ＴＣＧ ＣＧＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＣ 配列番号.６ Ｍ１３ ＣＧＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＧ 配列番号.７ Ｈ３ ＣＡＣ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＡ Ｇ 配列番号.８ Vm-mm ＣＡＡ ＣＴＴ ＡＧＣ ＴＴＡ ＣＣＧ ＣＣＴ ＴＡ
Ｇ 配列番号.９ Ｈ３-mm ＣＡＴ ＣＣＧ ＡＧＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ Ｇ 配列番号.１０ E-cad-mm ＧＧＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＣＧ 配列番号.１１ Ｍ３-mm ＴＣＡ ＣＧＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＣＣＡ ＧＣ 配列番号.１２ Ｍ１３-mm ＣＧＴ ＴＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＣＣ ＣＧ
【００９６】等価物 当業者ならば、わずかな日常の実験法を用いて、本明細書に記載された具体的
な物質および手順に対する多数の等価物を認識し、または確かめ得るであろう。
かかる等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、次の特許請求の範囲に含ま
れる。
【００９７】 配列表 （１）一般情報： （i）出願人： QIK Technology, Inc. Roberts, Peter D. Driver, Samuel E. （ii）発明の名称：オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリー （iii）配列の数：１２ （iv）通信住所： （A）名宛人：Mintz Levin Cohn Ferris GlovskyおよびPopeo P.C. （B）通り：ワン・ファイナンシャル・センター （C）都市：ボストン （D）州：マサチューセッツ州 （E)国籍：アメリカ合衆国 （F)郵便番号：０２１１１ （v）コンピュータ・リーダブルフォーム： （A）媒質の型：フロッピーディスク （B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ （C）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （D）ソフトウェア：PatentIn Release #１.0，Version #1.30 （vi）最新出願データ： （A）出願番号：まだ割当てられていない （B）出願日：同時（9／10／98） （C）分類： （vii）先の出願データ： （A）出願番号：60／058,585 （B）出願日：9／12／97 （viii）アトニー／代理人情報： （A）氏名：Elrifi，Ivor R. （B）登録番号：39,529 （C）参照／ファイル番号：QIK−1 （ix）電信電話通信情報： （A）電話番号：617−542−6000 （B）ファックス番号：617−542−2241 （２）配列番号：１に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２１塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：１ CAGCCTGGCT CACCGCCTTG G 21 （２）配列番号：２に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２１塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：２ CAGCCTGGCT CACCGCCUUG G 21 （２）配列番号：３に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：１８塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：３ GGAAAAGCTG CGGCACCG 18 （２）配列番号：４に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２１塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：４ CAGCCTGGCT CACCGCCTTG G 21 （２）配列番号：５に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：５ TCGCGCTCCC TCTCTCCGGC 20 （２）配列番号：６に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：６ CGCTCCCTCT CTCCGGCTCG 20 （２）配列番号：７に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：１９塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：７ CACCCAAGAC AGCAGAAAG 19 （２）配列番号：８に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２１塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：８ CAACTTAGCT TACCGCCTTA G 21 （２）配列番号：９に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：１９塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：９ CATCCGAGGC AACAAAAAG 19 （２）配列番号：１０に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：１８塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：１０ GGACAAGATC CGGCAGCG 18 （２）配列番号：１１に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：１１ TCACGTTCCT TCTCCCCAGC 20 （２）配列番号：１２に関する情報 （i）配列の特徴： （A）配列の長さ：２０塩基対 （B）配列の型：核酸 （C）鎖の数：一本鎖 （D）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ／ＲＮＡ （iii）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＹＥＳ （xi）配列：配列番号：１２ CGTTCTCTCC CTCCAGCCCG 20
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、妊娠マウスにオリゴヌクレオチドを全身投与した４８時間後の該妊娠
マウスの組織中および胚中で検出された合成オリゴヌクレオチドを示すグラフで
ある。
【図２（Ａ）−（Ｃ）】 図２（Ａ）は実施例で用いた合成修飾アンチセンス・オリゴヌクレオチドの局
在を示すマウスＶＥＧＦ遺伝子座の図であり、図２（Ｂ）はマウス抗−ＶＥＧＦ
特異的アンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列、およびその対応する誤対合（
−ｍｍ）ネガティブ・コントロールを記載し、図２（Ｃ）はマウス抗−Ｅ−カド
ヘリン特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびその対応する誤対合（
−ｍｍ）ネガティブ・コントロールを記載している。
【図３】 図３は、Ｖｍ ２’−Ｏ−メチル ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
で処理した場合に、用量依存的な様式で血管新生の欠損が誘導されることを示す
表である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA05 CA11 CA12 CA20 DA02 4B065 AA91X AA99Y AB01 AC20 BA01 BA16 BA30 BD50 CA44 CA46 4C057 AA18 BB04 CC05 DD02 MM09 4C084 AA13 MA01 NA14 ZB332 ZB352 ZC612 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 ZB35 ZC61

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 医薬上許容される担体中の遺伝子に特異的な合成オリゴヌク
    レオチドを妊娠哺乳動物に全身投与することによって該合成オリゴヌクレオチド
    を哺乳動物の胚に経胎盤デリバリーすることを含み、ここに該合成オリゴヌクレ
    オチドが： ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双方を含み、 安定化されかつ帯電した骨格を有し、かつ 少なくとも１個の化学修飾された塩基または糖部分を含み、ここに該修飾され
    た塩基または糖部分が経胎盤デリバリーを促進し、かつ ここに、該オリゴヌクレオチドが胚中または誕生後の妊娠哺乳動物中の標的化
    遺伝子または関連遺伝子の発現を変調させることを特徴とする、哺乳動物の胚中
    の遺伝子の発現を変調させる方法。
  2. 【請求項２】 医薬上許容される担体中の遺伝子に特異的な合成オリゴヌク
    レオチドを妊娠非−ヒト哺乳動物に全身投与することによって該合成オリゴヌク
    レオチドを非−ヒト哺乳動物の胚に経胎盤デリバリーすることを含み、ここに該
    合成オリゴヌクレオチドが： ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双方を含み、 安定化されかつ帯電した骨格を有し、かつ 少なくとも１個の化学修飾された塩基または糖部分を含み、ここに該修飾され
    た塩基または糖部分が経胎盤デリバリーを促進し、かつ ここに、該オリゴヌクレオチドが遺伝子の発現を変調させ、それによって胚の
    表現型を変化し、胚の変化した表現型が遺伝子の機能の指標となることを特徴と
    する、哺乳動物中で発現される遺伝子の機能を決定する方法。
  3. 【請求項３】 胚中または胚から発生しつつある哺乳動物中で発現される遺
    伝子に対して特異的な合成オリゴヌクレオチドを子宮内（in utero）で全身投与
    した妊娠非−ヒト哺乳動物中の胚を含み、ここに該合成オリゴヌクレオチドが、 ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双方を含み、 安定化されかつ帯電した骨格を有し、かつ 少なくとも１個の化学修飾された塩基または糖部分を含み、ここに該修飾され
    た塩基または糖部分が経胎盤デリバリーを促進し、かつ ここに、該オリゴヌクレオチドが遺伝子の発現を変調させ、それによって変化
    した表現型が生じることを特徴とする、表現型ノックアウトモデル。
  4. 【請求項４】 合成オリゴヌクレオチドおよび医薬上許容される担体を妊娠
    哺乳動物に全身投与するを含み、ここに該合成オリゴヌクレオチドが： ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双方を含み、 安定化されかつ帯電した骨格を有し、かつ 少なくとも１個の化学修飾された塩基または糖部分を含み、ここに該修飾され
    た塩基または糖部分が経胎盤デリバリーを促進し、かつ ここに、該オリゴヌクレオチドが胎盤を通過して胚に至ることを特徴とする、
    合成オリゴヌクレオチドを哺乳動物の胚にデリバリーする方法。
  5. 【請求項５】 該オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチド間結合を有するこ
    とを特徴とする請求項１−４いずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 該オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート・ヌクレオチド
    間結合を有することを特徴とする請求項１−４いずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 さらに、該オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の２’−Ｏ
    −置換リボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１−４いずれか１項に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 該２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル
    リボヌクレオチドであることを特徴とする請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 該２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル リ
    ボヌクレオチドであることを特徴とする請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 さらに、該オリゴヌクレオチドが、その３’末端に少なく
    とも１個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含み、かつ、その５’末端に少な
    くとも１個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項７
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 さらに、該オリゴヌクレオチドが、その３’末端に少なく
    とも２個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含み、かつ、その５’末端に少な
    くとも２個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項７
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 さらに、該オリゴヌクレオチドが、その３’末端に少なく
    とも４個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含み、かつ、その５’末端に少な
    くとも４個の２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項７
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該遺伝子がＶＥＧＦ遺伝子であることを特徴とする請求項
    １−４いずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該遺伝子がＥ−カドヘリン遺伝子であることを特徴とする
    請求項１−４いずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該胚が非−ヒト哺乳動物の胚であって、該遺伝子の機能が
    知られていないことを特徴とする請求項１−４いずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 合成オリゴヌクレオチドおよび医薬上許容される担体を妊
    娠哺乳動物に全身投与することを含み、ここに該合成オリゴヌクレオチドが： ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの双方を含み、 安定化されかつ帯電した骨格を有し、かつ 少なくとも１個の化学修飾された塩基または糖部分を含み、ここに該修飾され
    た塩基または糖部分が経胎盤デリバリーを促進し、 ここに、該オリゴヌクレオチドが無傷形態で胎盤を通過して胚に至ることを特
    徴とする、合成オリゴヌクレオチドを哺乳動物の胚にデリバリーする方法。
  17. 【請求項１７】 オリゴヌクレオチドの部分毎に対する変異型化学を用いる
    ことによって該オリゴヌクレオチドを最適化するために通常のイン・ビボ設定（
    in vivo setting）でオリゴヌクレオチドと標的との相互作用を試験して、効力
    のある新しいリード治療化合物として最も活性の高い組成を決定することを含む
    ことを特徴とする請求項１−４または１６いずれか１項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該オリゴヌクレオチドの経胎盤デリバリーが、妊娠期間の
    いずれの時点においても行うことができることを特徴とする請求項３記載の方法
    。
  19. 【請求項１９】 多重ノックアウトが、１を超える活性オリゴヌクレオチド
    を同時に投薬することによって達成されることを特徴とする請求項３記載の方法
    。
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