JP2002516076A - 緑膿菌のＭｕｒＤタンパク質及び遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は緑膿菌のMurDタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。精製され単離されたMurD組換えタンパク質も提供される。機能的に活性なMurDタンパク質をコードする核酸配列を記載する。MurDの発現のモジュレーター及びMurD活性の阻害剤の同定のためのアッセイも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、細菌における細胞壁合成に関与する遺伝子及び酵素に関するもので
あり、特にそのような酵素の阻害に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】

ホスホマイシン、シクロセリン及びβ-ラクタム等の多くの天然の抗生物質は
、細菌の細胞壁の合成を分子標的とする。これら抗生物質が進化に関与する頻度
からして、細胞壁の生合成の経路は細菌に対する攻撃に特に有効である。遺伝子
の研究によれば、細胞内経路遺伝子の温度感受性アレルは溶菌性で、従って致死
性のものであり、この方法が有力な標的手段とされる。細胞壁を構成するブロッ
クは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれでも高度に保存された構造である
が、真性細菌については特有なものであるので、広スペクトルを有しかつ安全な
抗生物質となる、新規な細胞壁形成阻害剤が期待されている。

【０００３】 細胞の境界及び形状を画定する細菌の細胞壁は、ポリマー、即ちペプチドグリ
カンから構成される単一分子である。完成した構造は、グリカン鎖を短いペプチ
ドで架橋することにより組み立てられており(Rogers, H. J., H. R. Perkins及
び J. B. Ward, 1980, Biosynthesis of peptidoglycan. p. 239-297. Microbia
l cell walls and membranes. Chapman & Hall Ltd. London)、4気圧を超える浸
透圧差にも細胞の一体性を維持するほど強いのみならず、その細胞が移動し、増
殖し、***することを可能にする十分な柔軟性を有する。

【０００４】 ペプチドグリカンの構築は、細胞質内における活性化糖質分子、UDP-N-アセチ
ルグルコサミンによって始まる。グルコサミン部分の3-OH上のラクチル基を生ず
る(MurA及びMurBによって触媒される)2つの反応の後、一連のATP依存性アミノ酸
リガーゼ(Mur-C、-D、-E及び-F)が、第1の受容体部位として新たに合成されたラ
クチルカルボキシレートを用いてペンタペプチド側鎖の段階的合成を触媒する。
糖ペンタペプチドが細胞質膜の脂質担体に付加した後、別のグルコサミン単位が
ムラミン酸部分の4-OHに付加される。完成した単量体構築物ブロックは膜を通過
して周辺細胞質に移動し、そこでペニシリン結合性タンパク質が成長中の細胞壁
に酵素的に付加される(Lugtenberg, E. J. J., 1972, Studies on Escherichia
coli enzymes involved in the synthesis of Uridine Diphosphate-N-Acetyl-M
uramyl-pentapeptide., J. Bacteriol. 110: 26-34; Mengin-Lecreulx, D., B.
Flouret 及びJ. van Heijenoort, 1982, Cytoplasmic steps of peptidoglycan
synthesis in Escherichia coli., J. Bacteriol. 151: 1109-1117)。

【０００５】 このペンタペプチド側鎖はリボソームによる合成ではないため、構造的にも立
体化学構造的にも一般的なペプチドより幅広い化学的機能を有する。2つの酵素(
MurD及びMurF)はDアミノ酸の付加を触媒し、MurEはD-グルタメートのg-カルボキ
シレートとLリジンのアミノ基との間にペプチド結合形成を媒介する。これらの
構造は露出されたペプチドグリカンにおそらくプロテアーゼに対する耐性を与え
ているが、ある意味で通常でない基質を取り扱うために酵素の活性部位が普通で
ない構造を有せざるを得ないということも意味している。

【０００６】 これらの酵素の標的であり得るもののなかに、MurDがある。D-グルタメート付
加酵素の最初の部分的精製及び特性化は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aure
us)からなされ(Ito, E. 及びJ. L. Strominger, 1962. Enzymatic synthesis of
the peptide in bacterial uridine nucleotides: Enzymatic addition of L-a
lanine, D-glutamic acid, and L-lysine. J. Biol. Chem. 237: 2689-2695; Na
thenson, S. G., J. L. Strominger 及びE. Ito, 1964. Enzymatic synthesis o
f the peptide in bacterial uridine nucleotides: purification and propert
ies of D-Glutamic acid-adding enzyme, J. Biol. Chem. 239: 1773-1776)、そ
の後単離された大腸菌酵素についてより詳細な研究がなされた(Blanot, D., A.
Kretsovali, M. Abo-Ghalia, D. Mengin-Lecreulx 及びJ. van Heijenoort, 198
3. Synthesis of analogues of precursors of bacterial peptidoglycan. in P
eptides. Blaha, K. 及びP. Malon編 pp. 311-314, Walter de Gryter and Co.
Berlin, New York.; Jin, H., Emanuele, J. J., Jr., Fairman, R., Robertson
, J. G., Hail, M. E., Ho, H.-T., Falk, P. 及びVillafranca, J. J., 1996.
Structural studies of Escherichia coli UDP-N-acetylmuramate: L-alanine l
igase. Biochemistry 35: 14423-14431; Ito E. 及びJ. L. Strominger, 1973.
Enzymatic synthesis of the peptide in bacterial uridine nucleotides: Co
mparative biochemistry. J. Biol. Chem. 248: 3131-3136; Michaud, C., D. B
lanot, B. Flouret 及びJ. van Heijenoort, 1987. Partial purification and
specificity studies of the D-glutamate-adding and D-alanyl-D-alanine-add
ing enzymes from Escherichia coli K12. Eur. J. Biochem. 166: 631-637)。
精製された組換え大腸菌MurDが報告され(Pratviel-Sosa F, D. Mengin-Lecreulx
及びJ. van Heijenoort, 1991. Over-production, purification and properti
es of the uridine diphosphate N-acetylmuramoyl-L-alanine:D-glutamate lig
ase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 202 (3): 1169-1176)、かつMur
Dをコードする遺伝子が、大腸菌(Ikeda, M., M. Wachi, F. Ishino 及びM. Mats
uhashi, 1990a. Nucleotide sequence involving murD and an open reading fr
ame ORF-Y spacing murF and ftsW in Escherichia coli. Nucleic Acids Res.
18: 1058; Mengin-Lecreulx, D., C Parquet, L. Desviat, J. Pla, B. Flouret
, J. Ayala 及びJ. van Heijenoort, 1989. Organization of the murE-murG re
gion of Escherichia coli: Identification of the murD gene encoding the D
-glutamic-acid-adding enzyme. J. Bacteriol. 171: 6126-6134)及び枯草菌(Da
niel, R. A. 及びJ. Errington, 1993. DNA sequence of the murE-murD region
of Bacillus subtilis 168. J. Gen. Microbiol. 139: 361-370; Henriques, A
. O. de Lencaster, H. 及びP. J. Piggot, 1992, A Bacillus subtilis morpho
gene cluster that includes spoVE is homologous to the mra region of Esch
erichia coli. Biochimie. 74: 735-748)等の幾つかの細菌の種からクローン化
された。さらに最近になって、精製組換えMurD酵素が、グラム陽性球菌から精製
された(E1-Sherbeini, M., Geissler, W., Pittman, J., Yuan, X., Wong, K. K
. 及びPompliano, D. L. 1998, Cloning and expression of Staphylococcus au
reus and Streptococcus pyogenes murD genes encoding uridine diphosphate
N-acetylmuramoyl-L-alanine:D-glutamate ligases. Gene, 210: 117-125)。 大腸菌酵素に対する抑制活性を有する化合物が設計及び合成されたが(Tanner,
M.E., S. Vaganay, van Heijenoort, J. 及びD. Blanot, 1996. Phosphinate I
nhibitors of the D-Glutamic Acid-Adding Enzyme of Peptidoglycan Biosynth
esis. J. Org. Chem. 61: 1756-1760)、それらは抗菌活性を有していない。

【０００７】

【発明の概要】

細菌の細胞壁生合成に関与する酵素である、緑膿菌MurDのポリヌクレオチド及
びポリペプチドをここに提供する。この組換えMurD酵素は、ATP依存性D-グルタ
メート付加反応において触媒活性を有する。前記酵素は、細胞壁生合成を標的と
する抗菌性化合物のスクリーニングのためのin vitroアッセイにおいて用いる。
本発明は、精製された前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによってコ
ードされる精製されたタンパク質、及び前記組換え酵素を発現する宿主細胞、プ
ローブ及びプライマー、及びアッセイにおけるこれらの分子の使用を包含する。

【０００８】 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurDタンパク質をコードする配列、またはそれ
に相補的な配列を有するポリヌクレオチドである。特定の態様では、コードされ
たタンパク質が配列番号2に対応する配列を有する。他の態様では、コードされ
たタンパク質が、そのタンパク質の天然の変異体または多形体であり得る。好ま
しい態様では、前記ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、または両方の混合物であり
得、かつ一本鎖または二本鎖であり得る。特定の態様では、前記ポリヌクレオチ
ドが、天然のヌクレオチド、非天然のヌクレオチド、または修飾されたヌクレオ
チドからなる。ある態様では、ヌクレオチド間の結合が天然の結合である。別の
態様では、ヌクレオチド間の結合が非天然の結合であるか、または天然の結合と
非天然の結合の混合である。最も好ましい態様では、前記ポリヌクレオチドが配
列番号1に示す配列を有する。

【０００９】 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurDタンパク質をコードする天然のポリヌクレ
オチドに特異的な少なくとも25個の連続するヌクレオチドの配列を有するポリヌ
クレオチドである。特定の好ましい態様では、この形態のポリヌクレオチドは、
緑膿菌MurDタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を特異的に検出する
ためのプローブとして有用である。他の特定の態様では、この形態のポリヌクレ
オチドは、緑膿菌MurDタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を特異的
に検出するための核酸増幅に基づくアッセイで使用するためのプライマーとして
有用である。好ましい態様では、この形態のポリヌクレオチドは、限定するもの
ではないが、プローブまたはプライマーの検出のための化合物、同位体、タンパ
ク質または配列等の追加的な構成成分を有し得る。

【００１０】 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurDタンパク質をコードするポリヌクレオチド
又はその相補的配列及び調節領域を含む発現ベクターである。特定の態様では、
コードされたタンパク質が、配列番号2に対応する配列を有する。特定の態様で
は、前記ベクターは、そのベクターが用いられる宿主細胞に適するとして当分野
で慣用される既知の様々な調節領域を有し得る。最も好ましい態様では、前記ベ
クターは、グラム陰性の原核宿主細胞におけるコードされたタンパク質の発現に
適した調節領域を有する。他の態様では、前記ベクターが、グラム陽性の宿主細
胞、酵母、青緑色細菌または放線菌類におけるコードされたタンパク質の発現に
適した調節領域を有する。ある好ましい態様では前記調節領域が誘導的発現をも
たらし、別の好ましい態様では前記調節領域が構成的発現をもたらす。最後に、
この形態においては、前記発現ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスま
たはこれらの組み合わせに由来するものであり得る。

【００１１】 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurDタンパク質をコードするポリヌクレオチド
または相補的配列及び調節領域を有する発現ベクターを含む宿主細胞である。特
定の態様では、コードされたタンパク質が配列番号2に対応する配列を有する。
好ましい態様では、前記宿主細胞が酵母、グラム陽性菌、青緑色細菌または放線
菌類である。最も好ましい態様では、前記宿主細胞がグラム陰性菌である。

【００１２】 本発明の１つの形態は、宿主細胞において緑膿菌のMurDタンパク質を発現させ
る方法である。この形態においては、宿主細胞を、緑膿菌MurDタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドまたは相補的配列を含む発現ベクターで形質転換又はト
ランスフェクトする。この態様では、前記宿主細胞を、コードされたMurDタンパ
ク質の発現を誘導する条件の下で培養する。特定の態様では、その発現が誘導的
または構成的である。特定の態様では、コードされたタンパク質が、配列番号2
に対応する配列を有する。 本発明の１つの形態は、配列番号2のアミノ酸配列または前記タンパク質の天
然の変異体もしくは多形体の配列を有する精製されたポリペプチドである。

【００１３】 本発明の１つの形態は、候補の化合物が緑膿菌MurDポリペプチドの活性を阻害
することができるかを判定する方法である。この形態によれば、前記ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを用いて特定の宿主細胞に適した発現ベクター
を構築する。前記宿主細胞を前記発現ベクターで形質転換またはトランスフェク
トし、MurDポリペプチドの発現を起こす条件下で培養する。その細胞を前記候補
とを接触させる。最後に前記候補の存在下での前記MurDポリペプチドの活性を測
定する。その活性が、前記候補が存在しない場合のタンパク質の活性より相対的
に低い場合は、その候補はMurDポリペプチドの阻害剤である。好ましい態様では
、前記ポリヌクレオチドが配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質または
その天然の変異体もしくは多形体をコードする。他の好ましい態様においては、
前記ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を有する。特定の態様においては、宿
主細胞におけるMurDの活性を比較することによってMurDの相対活性を決定する。
ある態様では、前記宿主細胞を破壊し、前記候補を放出されたサイトゾルと接触
させる。他の態様では、候補と接触した細胞を、MurDタンパク質の活性を判定す
る前に破壊し得る。さらにこの形態においては、その条件下で宿主細胞において
MurD活性について以前に測定したかまたは予想される活性値と比較することによ
って相対活性を決定することができる。しかし、好ましい態様では、候補の化合
物と接触しなかった対照細胞におけるMurDの活性を測定することによって相対活
性を決定する。特定の態様においては、宿主細胞がシュードモナス属菌であり、
阻害されるタンパク質がシュードモナスにより産生されたMurDである。

【００１４】 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurDタンパク質の阻害剤である化合物及び本明
細書に記載するアッセイである。好ましい態様においては、前記化合物が、本発
明の発現ベクターを含む宿主細胞によって産生される緑膿菌MurDタンパク質の阻
害剤である。最も好ましい態様においては、前記化合物が、緑膿菌の病原性株に
よって産生されたMurDタンパク質の阻害剤でもあり、かつ前記シュードモナスの
増殖も阻害する。

【００１５】 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurD及び医薬上許容される担体とを含む医薬製
剤である。 本発明の１つの形態は、緑膿菌MurD阻害剤を患者に投与することを含む処置方
法である。この処置は、予防的または治療的なものであり得る。好ましい態様に
おいては、特定の患者についての妥当な投薬量は医師により決定される。 「約」は、特定したものの概ね10〜20%大きいかまたは小さい範囲を意味する
。 本明細書において、「阻害剤」は、MurDのポリペプチドと相互作用し、それが
UDP-N-アセチルムラミル-L-アラニン前駆体のアラニル残基へのD-グルタメート
のATP依存性付加を触媒するのを阻害または防止する化合物である。

【００１６】 本明細書において、「モジュレーター」は、細胞生化学的な形態で相互作用し
て、細胞の表面、周辺細胞質、または周囲の血清もしくは媒体に存在するMurDポ
リペプチドの量を増減させる化合物である。MurDポリペプチドの量の変化は、モ
ジュレーターの前記タンパク質の発現、例えば前記タンパク質の転写、翻訳、翻
訳後プロセッシング、転位または折り畳みに対する作用によって、または前記タ
ンパク質の発現に直接的もしくは間接的に関与する細胞生化学の構成成分と相互
作用することによって媒介され得る。あるいは、モジュレーターは、前記タンパ
ク質との直接の相互作用かあるいはその変化に直接的もしくは間接的に影響を与
える細胞生化学の他の構成成分との相互作用の何れかにより、前記タンパク質の
代謝回転を早めたり遅くしたりすることによって作用することができる。 本明細書における全ての引用文献は、引用によりその内容全体を背景の資料と
して本明細書の一部とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段】

本発明は、本明細書においてMurDと称する、緑膿菌由来の細胞壁生合成遺伝子
のポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。前記ポリヌクレオチド及びポ
リペプチドを用いて、発現ベクター、該ベクターを含む宿主細胞、プローブ及び
プライマー、MurDタンパク質及びそのポリペプチドに対する抗体、MurDの存在ま
たは発現のアッセイ、及びMurDのモジュレーター及び阻害剤の同定のためのアッ
セイをさらに提供する。

【００１８】 細菌のMurD、細胞質ペプチドグリカン生合成酵素であるUDP-N-アセチルムラミ
ル-L-アラニン:D-グルタメートリガーゼは、D-グルタメートのUDP-N-アセチルム
ラミル-L-アラニン前駆体のアラニル残基へのATP依存性付加を触媒し、ジペプチ
ドを生成する。

【００１９】 前記MurD遺伝子は緑膿菌からクローン化された。緑膿菌のMurD遺伝子の配列分
析によって、448個のアミノ酸からなるオープンリーディングフレームが明らか
になった。緑膿菌MurDの推定アミノ酸配列は、大腸菌、インフルエンザ菌、枯草
菌及び黄色ブドウ球菌を起源とするMurDに相同性を有する。緑膿菌由来の組換え
MurDタンパク質を、大腸菌宿主細胞においてHisタグ付きの融合タンパク質とし
て過剰産生させ、緑膿菌MurD酵素を見かけ上均一になるまで精製した。その組換
え体酵素は、前記前駆体糖質ペプチドへのD-グルタメートのATP依存性付加を触
媒した。

【００２０】 緑膿菌からのMurDをコードする核酸は、緑膿菌MurDタンパク質の発現及び産生
に有用である。その核酸は、緑膿菌の存在を検出するためのプローブを提供する
ことにおいても有用である。

【００２１】 (ポリヌクレオチド) 本発明の好ましい形態は、緑膿菌のMurDタンパク質をコードする、単離された
核酸である。好ましい態様は、図1、配列番号1に開示され、且つ以下に示す配列
を有する核酸である。

【００２２】

【化１】 翻訳開始及び終止コドンには下線を付した。

【００２３】 本発明の単離された核酸分子は、一本鎖(コード鎖または非コード鎖)または二
本鎖であり得る、リボ核酸及びデオキシリボ核酸分子、並びに合成された一本鎖
ポリヌクレオチドのような合成核酸を包含し得る。 本発明は、本明細書全体に開示されている実質的に精製された核酸分子を含む
、組換えベクター及び真核生物及び原核生物両方の組換え宿主にも関する。 本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、2個以上のヌクレオチドからな
る核酸である。ポリヌクレオチドは、その単位数の記載により指定される複数の
ポリヌクレオチド単位からなり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、その境界内
に、コード配列を有するポリヌクレオチド、調節領域及び／または当分野で慣用
される他のポリヌクレオチド単位であるポリヌクレオチドを含み得る。

【００２４】 「発現ベクター」は、宿主細胞中でその調節領域がコード配列の発現を誘導し
得るようにコード領域と機能可能なように結合した調節領域を有する、ポリヌク
レオチドである。発現ベクターの使用は当分野で公知である。発現ベクターは様
々な宿主細胞において用いられ得、従って調節領域は、特定の宿主細胞に適した
ものを選択するのが好ましい。

【００２５】 「調節領域」は、コード配列の転写または翻訳の開始または停止を促進・増強
し得るポリヌクレオチドである。調節領域は、宿主細胞のRNAポリメラーゼ、リ
ボソーム、または関連する転写または翻訳の開始または停止因子によって認識さ
れる配列を含む。転写または翻訳の開始を誘導し得る調節領域は、コード配列の
構成的または誘導的発現を誘導し得る。

【００２６】 本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示するMurD遺伝子配列の完全長配
列または部分長配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖で
あり得る。一本鎖の場合、ポリヌクレオチドはコードする「センス」鎖または相
補的な「アンチセンス」鎖であり得る。アンチセンス鎖は、MurDタンパク質をコ
ードするRNAと相互作用することによって遺伝子のモジュレーターとして有用で
あり得る。アンチセンス鎖は、前記タンパク質をコードするRNAにユニークまた
は特異的な配列を有し、完全長鎖より短いものが好ましい。

【００２７】 前記ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ま
たは両者の混合物を含み得る。前記ポリヌクレオチドは、細胞内、無細胞生化学
反応、あるいは化学合成によって製造することができる。イノシン、メチルシト
シン、デアザグアノシン等の非天然または修飾ヌクレオチドが存在してもよい。
天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合が適当であり得る。しかし前記ポリ
ヌクレオチドはヌクレオチド間に非天然の結合を有していてもよい。非天然の結
合は当分野でよく知られており、限定するものではないが、メチルホスホネート
結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオネート結合、ホスホルアミダイ
ト結合及びリン酸エステル結合等が挙げられる。デホスホ結合もヌクレオチド間
の架橋として知られている。これらの例としては、シロキサン架橋、カーボネー
ト架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミド架橋、カルバメート架橋
及びチオエーテル架橋等が挙げられる。例えば、N-ビニル、メタクリルオキシエ
チル、メタクリルアミド、またはエチレンイミンヌクレオチド間結合等を有する
「可塑性DNA」を用いることができる。「ペプチド核酸」(PNA)も有用であり、ヌ
クレアーゼによる分解に耐性がある。これらの結合は、ポリヌクレオチドにおい
て複数混在していてもよい。

【００２８】 本明細書において、「精製された」及び「単離された」は、交換可能に用いら
れ、対象のポリヌクレオチド、タンパク質及びポリペプチド、またはそれらの各
断片がin vivoの環境から取り出され、天然においては見出されない形態または
純度で存在する状態を意味する。精製または単離された核酸分子については、当
業者が、限定するものではないが、例えばシークエンシング、制限酵素による消
化、部位特異的突然変異誘発、核酸断片についての発現ベクターへのサブクロー
ニング等の操作を行うことができると共に、全体にまたは部分的に精製されたタ
ンパク質またはタンパク質断片を得て、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体の生成や、アミノ酸のシークエンシングまたはペプチドの消化に利用すること
ができる。従って、特許請求の範囲に記載の核酸は、完全な細胞中、あるいは細
胞溶解物中に存在し得、または部分的または実質的に精製された形態で存在し得
る。前記分子は、天然に見出される濃度より少なくとも約5倍〜10倍の濃度で存
在するのが好ましい。ポリヌクレオチドは、標準的な方法によって天然に見出さ
れる場合より少なくとも約100倍高い濃度で細胞成分から精製された場合に実質
的に純粋であるとする。またポリヌクレオチドは、天然に見出される場合より少
なくとも約1000倍高い濃度で得られた場合、実質的に純粋であるとする。均一、
即ち少なくとも10,000〜100,000倍に精製されたポリヌクレオチドが最も好まし
い。化学的に合成された核酸配列は、上述の標準によってその化学的前駆体から
精製されたとき実質的に精製されたと考えられる。

【００２９】 ポリペプチド 本発明の好ましい形態は、緑膿菌を起源とする実質的に精製された形態のMurD
タンパク質である。好ましい態様は、図1、配列番号2に開示され、且つ以下に示
すアミノ酸配列を有するタンパク質である。

【００３０】

【化２】 本発明は、配列番号2に記載のMurDペプチド配列の生物学的に活性な断片及び
変異体または多形体にも関する。これらの生物学的に活性な断片及び変異体また
は多形体は、限定するものではないが、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末
端の切断及びカルボキシ末端の切断等を含み、これらの変異が診断、治療または
予防に用いるためのタンパク質またはタンパク質の断片を提供し、MurDの機能の
モジュレーター及び／または阻害剤のスクリーニングに有用であり得るものであ
る。

【００３１】 本明細書に示すポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の開示内容を用いて、
天然の形態のMurDをコードするポリヌクレオチドを単離するため、当業者は配列
の比較によりそのような天然の形態がMurDの変異体または多形体であるか否かを
知ることができる。さらに、MurDタンパク質の生物学的活性についてのin vitro
またはin vivoアッセイにおける断片のタンパク質の通常の試験により、MurDタ
ンパク質のコードされたタンパク質または任意の断片が生物学的に活性であるか
否かを判定することができる。例えば、宿主細胞においてN末端またはC末端の切
断、または内部の付加または欠失を発現させ、UDP-N-アセチルムラミル-L-アラ
ニン前駆体のアラニル残基へのD-グルタメートのATP依存性付加を触媒する能力
を試験すればよい。

【００３２】 特定のアミノ酸をコードする様々なコドンにおいてかなりの量の重複性が存在
することが知られている。従って、本発明は、以下に示すような、最終的に同一
のアミノ酸に翻訳される代替的なコドンを含むRNAをコードするDNA配列にも関連
する。

【００３３】 A=Ala=アラニン: コドン GCA, GCC, GCG, GCU C=Cys=システイン: コドン UGC, UGU D=Asp=アスパラギン酸: コドン GAC, GAU E= Glu=グルタミン酸: コドン GAA, GAG F=Phe=フェニルアラニン: コドン UUC, UUU G=Gly=グリシン: コドン GGA, GGC, GGG, GGU H=His=ヒスチジン: コドン CAC, CAU I=Ile=イソロイシン: コドン AUA, AUC, AUU K=Lys=リジン: コドン AAA, AAG L=Leu=ロイシン: コドン UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M=Met=メチオニン: コドン AUG N=Asp=アスパラギン: コドン AAC, AAU P=Pro=プロリン: コドン CCA, CCC, CCG, CCU Q=Gln=グルタミン: コドン CAA, CAG R=Arg=アルギニン: コドン AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S=Ser=セリン: コドン AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T=Thr=スレオニン: コドン ACA, ACC, ACG, ACU V=Val=バリン: コドン GUA, GUC, GUG, GUU W=Trp=トリプトファン: コドン UGG Y=Tyr=チロシン: コドン UAC, UAU

【００３４】 従って、本発明は、同一のタンパク質をコードする異なるDNA分子となり得る
コドンの重複を開示する。本明細書の目的のため、1個または複数の置換された
コドンを有する配列を縮重変異と定義する。また本発明の範囲に包含されるもの
として、発現されるタンパク質の最終的な物理的特性が実質的に変化しない、DN
A配列または翻訳されたタンパク質における変異がある。例えば、ロイシンから
バリン、リジンからアルギニン、またはグルタミンからアスパラギンへの置換は
、そのポリペプチドの機能性に変化を生じないことがある。但し、与えられた変
異の生物学的機能に対する影響について調べるには、変異していないMurDタンパ
ク質と比較したUDP-N-アセチルムラミル-L-アラニン前駆体のアラニル残基へのD
-グルタメートのATP依存性付加を触媒する能力のアッセイを要する。

【００３５】 あるペプチドをコードするDNA配列を、天然のペプチドの特性とは異なる特性
を有するペプチドをコードするように変化させることができることが知られてい
る。DNA配列の変更方法としては、限定するものではないが、部位特異的突然変
異誘発等が挙げられる。変更された特性の例としては、限定するものではないが
、酵素の基質への親和性の変化等が挙げられる。

【００３６】 本明細書において、野生型MurDの「生物学的に活性な等価物」または「機能的
誘導体」は、野生型MurDの生物学的活性と実質的に同様な生物学的活性を有する
。用語「機能的誘導体」は、UDP-N-アセチルムラミル-L-アラニン前駆体のアラ
ニル残基へのD-グルタメートのATP依存性付加を触媒し得る野生型MurDタンパク
質の「断片」、「突然変異体」、「変異体(mutant, variant)」、「縮重変異体
」、「類似体」、「オーソログ」及び「ホモログ」及び「化学的誘導体」を包含
することを意図する。用語「断片」は、野生型MurDのポリペプチドの任意の一部
を意味する。用語「変異体(mutant)」は、野生型に実質的に類似したものであり
得るが、区別できる生物学的特徴を有している分子を意味する。そのような変化
した特性としては、限定するものではないが、基質への結合性の変化、基質への
親和性の変化、MurDまたはMurDの機能的誘導体の生物学的活性に影響を及ぼす化
学物質に対する感受性の変化等が挙げられる。用語「変異体(variant)」は、全
野生型タンパク質またはその断片の何れかに構造上及び機能上実質的に類似する
分子をいう。ある分子と野生型MurD様タンパク質とが実質的に類似する構造を有
している場合、または両分子が類似する生物学的活性を有している場合、その分
子は野生型MurD様タンパク質に「実質的に類似」しているものとする。従って、
2つの分子が実質的に類似した活性を有している場合、たとえその分子の一方の
構造そのものが他方の分子に見出されなくても、あるいはたとえ2つのアミノ酸
配列が同一でなくても、両分子は変異体(variant)とみなされる。用語「類似体
」は、完全長MurDタンパク質または生物学的に活性なその断片のいずれかに対し
て、機能上実質的に類似な分子をいう。

【００３７】 本明細書において、MurD遺伝子またはコードされたタンパク質に関して使用す
る「多形」MurDは、一般的にシュードモナス属の集団において天然に見出される
MurDである。MurDの多形体は、本明細書において配列番号1として開示されてい
る特定のMurD遺伝子とは異なるヌクレオチド配列によってコードされ得る。但し
、サイレント変異のために、多形MurD遺伝子は、本明細書に開示したものと同一
かまたは異なるアミノ酸配列をコードし得る。さらに、MurDの多形体のなかには
、野生型MurDの活性からそれを区別できる生物学的特性を示すものもあり、この
場合その多形体は変異体(mutant)でもある。

【００３８】 タンパク質またはその断片は、天然には見出されない組成または純度で、その
天然における環境を少なくとも部分的に含まないで得られた場合、精製または単
離されたものとする。その分子が天然で見出される濃度の少なくとも5倍〜10倍
高い濃度で存在するのが好ましい。タンパク質またはその断片は、天然で見出さ
れる濃度の少なくとも約100倍高い濃度で得られた場合、実質的に純粋であるも
のとする。タンパク質またはその断片が、天然で見出される濃度の少なくとも約
1000倍高い濃度で得られた場合、ほぼ純粋であるものとする。均一、即ち少なく
とも約10,000〜100,000倍に精製されたタンパク質が最も好ましい。

【００３９】 プローブ及びプライマー 配列番号1の完全長または部分的配列を含むポリヌクレオチドプローブを用い
て、細胞またはサンプルが緑膿菌MurDのDNAまたはRNAを含むか否かを判定するこ
とができる。MurD遺伝子の転写に影響を与えるモジュレーターの効果は、これら
のプローブを用いることによって研究することができる。好ましいプローブは、
少なくとも完全長のMurDのコード配列を有する一本鎖のアンチセンスプローブで
ある。完全長配列より短く、緑膿菌MurDのDNAまたはRNAに特異的な配列を有する
プローブを用いることも好ましい。特異的プローブとして用いるための配列の同
定は当分野でよく知られており、標的配列にユニークな配列かそれに特異的な配
列を選択して行う。プローブであるポリヌクレオチドは、少なくとも約25個のヌ
クレオチド、最も好ましくは約30〜35個のヌクレオチドを有するのが好ましい。
より長いプローブは、緑膿菌MurD遺伝子及びRNAにより特異性が高いと考えられ
、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で用いることができる
。より長いプローブを使用することは可能であるが、合成によって作製すること
が困難であるか、あるいは合成収率が小さくなる可能性がある。緑膿菌MurD遺伝
子のプローブまたはプライマーとして有用な配列の例としては、プライマーA(セ
ンス) 5’-TTCTCGAGATGAGCCTGATCGCCTC-3’ (配列番号3)、及びプライマーB(ア
ンチセンス) 5’-TTGGATCCTCACGCTAGCTCCTCTAC-3’ (配列番号4)を挙げることが
できる。これらのプライマーはそれぞれ、配列番号1の51番目〜67番目のヌクレ
オチド(A)及び1378番目〜1395番目のヌクレオチドの相補物(B)である。下線を付
したXhoI及びBamHIの制限部位をプライマーの5’末端に付加し、発現ベクターpE
T-15bのXhoI及びBamHIの制限部位の間にクローン化できるようにする。しかし当
業者であれば、これらが配列番号1から得られる有用なプローブまたはプライマ
ーの配列の例にすぎないことを理解するであろう。

【００４０】 緑膿菌MurD遺伝子にユニークまたは特異的な配列を有するポリヌクレオチドを
、増幅反応アッセイにおいてプライマーとして用いることができる。これらのア
ッセイは本明細書に記載する組織タイプ決定に使用することができる。さらに、
緑膿菌MurDの配列から得られたプライマーを用いる増幅反応を使用して、最初の
テンプレートとして細胞のMurDのDNAを用いて増幅された緑膿菌MurDのDNAを得る
ことができる。そのように得られたMurDのDNAは、MurDのオープンリーディング
フレームまたはORFに隣接する配列における1個または複数のヌクレオチドが配列
番号1と異なっている、緑膿菌MurDの変異体(mutant)または多形体であり得る。
その相違は、MurDの欠陥のない天然の形態または不完全な形態と関連を有し得る
。従って、本発明のポリヌクレオチドは、様々なポリヌクレオチド緑膿菌MurD遺
伝子緑膿菌の同定や、MurD遺伝子を有する生物の検出に用いることができる。様
々な種類の増幅反応が当分野で知られており、限定するものではないが、ポリメ
ラーゼ連鎖反応、逆転写酵素連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続型配列反応等が挙
げられる。これらの反応または類似の反応の何れかを、配列番号1から得られた
プライマーと共に用いることができる。

【００４１】 MurDの発現 宿主細胞において組換えMurDを発現させるために、様々な発現ベクターを用い
ることができる。本明細書において発現ベクターは、適当な宿主におけるクロー
ン化DNAの転写及びそれらのmRNA翻訳のための調節配列を有する核酸配列として
定義される。そのようなベクターを用い、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、
動物細胞等の様々な宿主において細菌遺伝子を発現させることができる。特別に
設計されたベクターにより、例えば細菌−酵母菌間または細菌−動物細胞間で遺
伝子をやりとりさせることができる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細
胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、限定された数の有用な制
限酵素部位、多くのコピー数を与える能力、及び調節配列を含んでいる。プロモ
ーターは、RNAポリメラーゼのDNAへの結合を誘導し、RNAの合成を開始させる調
節配列として定義される。強力なプロモーターは、高い頻度でmRNAの合成を開始
させるものである。発現ベクターとしては、限定するものではないが、クローニ
ングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたは
ウイルス等が挙げられる。

【００４２】 特に、様々な細菌発現ベクターにより、細菌宿主において組換えMurDを発現さ
せることができる。組換えMurDの発現に適した市販の細菌発現ベクターとしては
、限定するものではないが、pQE(Qiagen)、pET11a又は pET15b(Novagen)、lambd
a gt11(Invitrogen)及びpKK223-3(Pharmacia)等が挙げられる。

【００４３】 あるいは、無細胞転写−翻訳系においてMurDのDNAを発現させ、あるいは無細
胞翻訳系においてMurDのRNAを発現させることができる。MurDの無細胞合成は、
公知のバッチ式または連続式のものとし得る。 MurDを化学的に合成することもできるが、この方法は好ましくはない。

【００４４】 様々な宿主細胞を発現ベクターと共に利用して、MurDタンパク質を合成するこ
とができる。これらの宿主細胞としては、大腸菌、バチルス属細菌、サルモネラ
属細菌等を挙げることができる。昆虫及び酵母細胞も適切であり得る。

【００４５】 宿主細胞においてMurDを発現させた後、MurDポリペプチドを回収することがで
きる。いくつかのタンパク質精製方法が利用可能で、使用に適している。限外濾
過、酸抽出、アルコール沈殿、塩分画化、イオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、レシチンクロマトグラフィー、アフィニティ
ー(例えば抗体またはHis-Ni)クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び親水性または疎水性相
互作用に基づいたクロマトグラフィー等の方法を組み合わせるか個別に適用して
、MurDタンパク質及びポリペプチドを細胞溶解物及び抽出物、あるいは培養培地
から精製することができる。ある場合においては、タンパク質の変性及び再折り
畳み過程を用いることができる。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及び逆相HP
LCも有用であり得る。最終的なバッファーの組成を調節するために透析を用いる
ことができる。

【００４６】 MurDタンパク質自体が、該タンパク質の活性を阻害する等の、タンパク質の活
性調整化合物を特定するためのアッセイにおいて有用である。MurDタンパク質は
、該タンパク質に対する抗体の生成、該タンパク質の構造研究及び該タンパク質
の構造／機能相関の研究にも有用である。

【００４７】 MurDのモジュレーター及び阻害剤 本発明は、MurDタンパク質を調整または阻害する化合物のスクリーニング方法
にも関連する。MurDを調整または阻害する化合物は、DNA、RNA、ペプチド、タン
パク質、または非タンパク性有機もしくは無機化合物、あるいはその他の種類の
分子であり得る。MurDをコードするDNAまたはRNAの発現を調整する化合物または
MurDの生物学的機能の阻害剤である化合物は、様々なアッセイによって検出する
ことができる。そのアッセイは、発現または機能上の変化があるかを決める単純
な「イエス／ノー」アッセイとすることができる。前記アッセイは、試験サンプ
ルの発現または機能を、標準サンプル即ち対照における発現機能レベルとを比較
することによって定量化することができる。モジュレーターである化合物は、そ
の化合物の存在時に産生されるMurDの量を測定することによって検出できる。阻
害剤である化合物は、その化合物の存在時及び不存在時におけるMurDの特異的活
性を測定することによって検出できる。

【００４８】 タンパク質、DNA分子、RNA分子及び抗体は、MurDの検出及び分析に適したキッ
トの成分となる。そのようなキットは、少なくとも1個の容器に密閉された形で
保持するのに適した区画に区切られたキャリアを備えている。前記キャリアはさ
らに、MurDの検出に適した抗MurD抗体または組換えMurDのような試薬を含む。前
記キャリアは、標識された抗原または酵素の基質等のような検出のための手段も
含むことができる。

【００４９】 医薬組成物 MurDのモジュレーターまたは阻害剤を含む医薬として有用な組成物は、医薬上
許容される担体の混合等の常法に従って製造することができる。そのような担体
及び製剤方法の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている
。有効な投与に適した医薬上許容される組成物を形成するには、そのような組成
物は有効な量の阻害剤を含む。

【００５０】 本発明の治療用、予防用または診断用の組成物は、疾患の治療、予防または診
断を行うのに十分な量個体に投与する。有効な量は、個体の状態、体重、性別、
及び年齢等の種々の因子に応じて変化し得る。その他の因子としては、投与方法
等が挙げられる。適当な量は、熟練した医師が決定することができる。 前記医薬組成物は、皮下投与、局所投与、経口投与、筋内投与等の種々の投与
経路で個体に与えることができる。

【００５１】 用語「化学的誘導体」は、通常は基本分子にない追加の化学的部分を含む分子
を示す。そのような部分は、基本分子の安定性、半減期、吸収性等を向上させ得
る。あるいは、その部分が基本分子の望ましくない副作用を弱めたり、毒性を低
下させたりし得る。そのような部分の例は、例えばRemington’s Pharmaceutica
l Sciencesのような種々の文献に記載されている。

【００５２】 本明細書に開示する方法に従って同定された化合物は、適当な投与量で単独で
用いることができる。あるいは、他の薬物を同時投与または連続投与するのが望
ましい場合もある。

【００５３】 本発明は、本発明の処置方法において用いるための適当な局所投与用、経口投
与用、全身及び非経口的投与用の製剤を得るための手段を提供する。本発明によ
って同定された化合物を活性成分として含む組成物は、投与に慣用されるビヒク
ル中で、種々の治療投与形態で投与することができる。例えば、前記化合物は、
錠剤、カプセル剤(それぞれ持効性及び持続放出性製剤を含む)、丸剤、散剤、顆
粒剤、エリキシル、チンキ、液剤、懸濁剤、シロップ、エマルジョン等のような
経口投与形態で、あるいは注射によって投与し得る。同様に前記化合物は、静脈
内(巨丸剤及び輸液の両方で)、腹腔内、皮下、閉鎖を伴うか伴わない局所、また
は筋肉内投与形態で投与することもでき、かかる使用形態は全て医薬分野の当業
者に周知である。

【００５４】 有利には、本発明の化合物は、毎日単回投与することができ、あるいは毎日の
全投与量を、一日に2回、3回、または4回に分割して投与することもできる。さ
らに本発明の化合物は、適当な鼻腔内投与用ビヒクルの局所的使用により、また
は当業者に公知の経皮投与用スキンパッチの形態を用いて経皮投与により投与す
ることができる。経皮デリバリーシステムの形態で投与する場合、投与は投与期
間全体にわたって間欠的なものではなく連続的なものとなることはいうまでもな
い。

【００５５】 2種以上の活性成分の併用治療を行い、それらの活性成分が別々の製剤である
場合には、それらの活性成分は同時に投与することができ、あるいはそれぞれを
別々に時間をずらして投与することができる。

【００５６】 本発明の化合物を用いる投薬計画は、患者の病態、種、年齢、体重、性別、及
び医学的状態; 処置する病状の重篤度; 投与経路; 患者の腎機能、肝機能及び循
環器機能; 及び用いられる特定の化合物等の種々の因子に基づいて選択される。
通常の知識を有する医師または獣医であれば、病状の進行を予防し、それに対抗
し、または停止させるために必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方すること
ができる。毒性なしに効能を与える薬物の濃度範囲を精度よく決めるには、標的
部位に対する薬物の利用可能性の動態に基づいた計画が必要である。このために
は、薬物の分配、平衡及び排除を考慮する。

【００５７】

【実施例】

以下の実施例は、例示として提示するものであり、他にも種々の態様が当業者
には明らかであるので、以下の実施例を本発明の範囲を限定するものと解釈して
はならない。例えば、本発明の特定の好ましい態様を本明細書に示すが、本明細
書に示す態様と同一または等価な特性や結果を達成し得るようなベクター、宿主
細胞、組成物等の変更や置換、プロトコルまたはアッセイの変更や設計は当業者
が適宜行い得ることである。

【００５８】 実施例1一般的な材料及び方法 特にことわらない限り、試薬は全てSigma Chemical Co, St. Louis, MOから購
入した。UDP-N-アセチルムラミル-L-アラニンは、常法 (Jin, H., Emanuele, J.
J., Jr., Fairman, R., Robertson, J. G., Hail, M. E., Ho, H.-T., Falk, P
.及びVillafranca, J. J., 1996. Structural studies of Escherichia coli UD
P-N-acetylmuramate: L-alanine ligase, Biochemistry 35: 14423-14431) によ
って合成し精製した。

【００５９】DNA操作の試薬及び技術 制限エンドヌクレアーゼ及びT4リガーゼは、Gibco-BRLから得た。アガロース
ゲル電気泳動法及びプラスミドDNAの作製は、文献記載の方法に従った(Sambrook
, J., E. F. Fritsch及び T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a Laborato
ry Manual, 第２版 Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)
。緑膿菌MurDを含む組換えプラスミドを大腸菌DH5a (Gibco-BRL, Rockville, MD
)中で増殖させ、その後大腸菌BL21(DE3)/plysS (Novagen, Madison, WI)におい
てタンパク質を発現させた。プレキャストゲル(Novagen)を用いてSDS-PAGEを行
った。自動ABI PRISM^TM DNAシークエンサー (Perkin-Elmer ABI, Foster City,
CA)を用いてDNA配列を決定した。

【００６０】 実施例2緑膿菌MurDのクローン化 緑膿菌(株MB4439)のゲノムDNAを、脳心臓浸出物液体培地(Difco, Detroit, MI
)において100 mlの静止期後期の培養物から調製した。細胞を0.2 M酢酸ナトリウ
ムで洗浄し、10 mlのTEG (10 mM EDTA及び25%グルコースを含む100 mMのTris, p
H 7)に懸濁し、200μgのN-アセチルムラミダーゼ(Sigma)とともに37℃で1時間イ
ンキュベートすることにより溶解した。染色体DNAは、Qiagen (Santa Clarita,
CA)ゲノムDNA調製キットを用い、製造者マニュアルに従って細胞の溶解物から精
製した。簡単に説明すると、細胞溶解物をプロテアーゼKで50℃で45分間処理し
、平衡化したQiagen ゲノムチップに負荷し、3000 rpmで2分間遠心分離すること
によって樹脂に導入した。ゲノムチップを洗浄した後、ゲノムDNAを蒸留水に溶
出させ、4℃に維持した。約50ngのゲノムDNAをPCRにおいて鋳型として用いてMur
Dをクローン化した。

【００６１】 緑膿菌MurDの5’及び3’末端の配列に相補的な2つのオリゴヌクレオチドプラ
イマー(Gibco/BRL, Bethesda, MD)を用い、KLENTAQ ADVANTAGE^TMポリメラーゼ(C
lontech, Palo Alto, CA)を用いてこの遺伝子をクローン化した。このプライマ
ーヌクレオチド配列は、5’-TCTCGAGATGAGCCTGATCGCCTC-3’ (配列番号3) (XhoI
リンカーに配列番号1の51番目〜67番目のヌクレオチドを付加したもの) 及び5’
-TTGGATCCTCACGCTAGCTCCTCTAC-3’ (配列番号4) (BamHlリンカーに配列番号1の1
378番目〜1395番目のヌクレオチドに相補的な配列を付加したもの)であった。緑
膿菌MurDを表わすPCR産物はヌクレオチド配列で確認し、XhoI及びBamHIで消化し
、pET-15bのXhoI部位とBamHI部位の間にクローン化してプラスミドpPaeMurDを調
製した。このプラスミドを大腸菌でのMurD遺伝子の発現に用いた。

【００６２】 前記プラスミドpPaeMurDは、微生物の寄託に関するブタペスト条約に基づいて
、1998年4月17日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、ATCC 98745
と命名されている。寄託は便宜上のものであり、寄託された材料が本発明の説明
または実施に必須であるわけではない。寄託したポリヌクレオチドの配列及びコ
ードされたアミノ酸配列は、引用により本明細書の一部とし、本明細書または関
連する図面に示された配列の記載と矛盾がある場合の対照標準となる。寄託され
たポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸
配列のタンパク質の製造、使用、販売、または販売の申出には許諾が必要であり
得る。ここではそのような実施許諾を付与するものではない。

【００６３】 実施例3緑膿菌MurDの配列分析 両方向から決定されたMurDのヌクレオチド配列及びMurDタンパク質の推定アミ
ノ酸配列を図1に示す。BLAST (1)アルゴリズムを用いてGenBankデータベースに
対して配列の比較を行った結果、前記クローン化領域が、大腸菌のMurD遺伝子(M
engin-Lecreulx, D.及びJ. van Heijenoort, 1990, Nucleotide sequence of th
e murD gene encoding the UDP-MurNAc-L-AIa-D-Glu synthetase of Escherichi
a coli, Nucleic Acids Research 18:183)に対して、様々な程度で相同性(68%類
似、53%同一)を有することが判明した。

【００６４】 複数属の細菌のMurC (Ikeda, M., M. Wachi, H. K. Jung, F. Ishino及びM. M
atsuhashi, 1990b. Nucleotide sequence involving murG and murC in the mra
gene cluster of Escherichia coli, Nucleic Acids Res. 18: 4014)、MurD、M
urE (Tao, J.S, 及びE. E., Ishiguro, 1989. Nucleotide sequence of the mur
E gene of Escherichia coli. Can. J. Microbiol. 35:1051-1054)及びMurF (Pa
rquet, C., D. Mengin-Lecreulx, B. Flouret及びJ. van Heijenoort, 1989. Nu
cleotide sequence of the murF gene encoding the UDP-MurNAc-pentapeptide
synthetase of Escherichia coli., Nucleic Acids Res. 17: 5379) タンパク質
の複数配列アラインメントから、グラム陽性及びグラム陰性菌の両方のMurリガ
ーゼの間で保存された一定の残基を有する相同な4つの領域が判明した (Eveland
, S.S., D.L. Pompliano及びM.S. Anderson, 1997. Conditionally lethal Esch
erichia coli murein mutants contain point defects that map to regions co
nserved among murein and folyl poly-g-glutamate ligases: Identification
of a ligase superfamily. Biochemistry, 36: 6223-6229, Ikeda, M., M. Wach
i, H. K. Jung, F. Ishino及びM. Matsuhashi, 1990c. Homology among MurC, M
urD, MurE and MurF proteins in Escherichia coli and that between E. coli
murG and a possible murG protein in Bacillus subtilis. J. Gen. Appl. Mi
crobiol. 36: 179-187)。前記相同領域は、これらの酵素の触媒機能と相互関係
を有し得る(Evelandら, 1997)。最も注目すべきものは、MurFにおいて見出され
(Parquet, C.,D.ら, 1989)、緑膿菌MurDタンパク質GlySerAspGlyLysThrThrでも
保存されている (配列番号2の116番目〜122番目のコドン)、推定ATP結合領域Iで
ある。領域IはATP結合ドメインであるが(Ikedaら, 1990)、他の相同領域の機能
はわかっていない。4つの相同領域はすべて緑膿菌MurDにおいて保存されている
。

【００６５】 実施例4緑膿菌MurDの過剰発現、精製及び酵素活性 上述のように、MurDを発現ベクターpET-15b (Novagen) にクローン化し、プラ
スミドpPaeMurDを作製した。前記pET-15bベクターは、タンパク質構築物に6xヒ
スチジンタグを導入し、アフィニティクロマトグラフィーによるMurDの速やかな
精製を可能にする。前記pET (T7 RNAポリメラーゼによる発現のためのプラスミ
ド)は、pBR322に由来し、大腸菌におけるタンパク質の過剰産生用に設計された
ものである。前記ベクターpET-15bは、T7ファージプロモーター及びターミネー
ターに加えて、アンピシリン耐性遺伝子、ColE1複製起点を含む。T7プロモータ
ーは、ファージT7 RNAポリメラーゼによって認識されるが、大腸菌RNAポリメラ
ーゼによっては認識されない。BL21(DE3)pLysSのような宿主大腸菌株は、IPTGに
よって誘導され得るlacUV5の制御下にあるT7 RNAポリメラーゼの一体化されたコ
ピーを含むように製造されている。T7 RNAポリメラーゼの発現が誘導された後、
大腸菌株BL21 (DE3)pLysSにおいて組換えタンパク質の産生が起こる。

【００６６】 pPaeMurDプラスミドを、Hisタグ付きMurDの発現のために宿主株BL21 DE3/pLys
S (Novagen)に導入した。100 mg/mlのアンピシリン及び32 μg/mlのクロラムフ
ェニコールの両者を含む100 mlのLB培地において、37℃でコロニーを成長させた
。培養がA₆₀₀=0.5の細胞密度に達したときに細胞をペレット化し、1 mMのIPTGを
含むM9ZB培地 (Novagen) に再懸濁した。細胞は30℃で3時間誘導し、3000gでペ
レット化し、-80℃で凍結した。

【００６７】 組換えプラスミドpPaeMurDまたは対照プラスミドベクターpET-15bの何れかを
含む培養物を30℃で増殖させ、IPTGで誘導した。pPaeMurDで形質転換した細胞は
、SDS- PAGEによると、緑膿菌MurDタンパク質の予想されるサイズに相当する約5
1 kDaの誘導可能なタンパク質を含んでいた。対照プラスミドベクターpET-15bで
形質転換した細胞を誘導した後には対応する検出可能なタンパク質のバンドは見
られなかった。

【００６８】組換えMurD酵素の精製 上述のように調製した100 mlの誘導培養物からの細胞ペレットを10mlのBTバッ
ファー (100 mM塩化カリウム及び1%グリセロールを含む50 mMビス-トリス-プロ
パン, pH 8.0) に4℃で再懸濁した。細胞を凍結−解凍またはフレンチプレスの
何れかによって溶解した。遠心分離の後、新たに調製した15 mlのTALON^TM (Clon
tech) 樹脂と上清を混合し、室温で30分間インキュベートした。この樹脂を室温
で25 mlのBTバッファーと遠心分離して2回洗浄した。最後に樹脂をカラムに負荷
し、5 mMのイミダゾールを含む20 mlのBTバッファー、pH 7.0で洗浄した。100 m
Mのイミダゾールを含む20 mlのBTバッファー、pH 8.0でタンパク質を溶出させた
。分画 (0.5 ml) を回収し、SDS-ゲル電気泳動法で分析した。この結果、活性の
アッセイで用いることが可能な緑膿菌MurDタンパク質の部分的に精製された調製
物を得た。必要であればこのタンパク質を公知の方法を用いてさらに精製しても
よい。

【００６９】MurD酵素活性のアッセイ ATP依存性MurDの活性を、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ結合
酵素アッセイを用いて産物ADPの形成に注目して測定した。反応は分光光度法に
よりモニターした。

【００７０】 通常、前記アッセイでは、100 mMのビス-トリス-プロパン, pH 8.0、200 μM
NADH、1 mM ATP、20 mM PEP、5 mM MgCl₂、1 mM DTT、350 μM UDP- N-アセチル
-ムラミル-L-アラニン、1 mM D-グルタメート、33単位/mlのピルビン酸キナーゼ
及び1660単位/mlの乳酸デヒドロゲナーゼを、最終容積200μlまたは400μlで用
いた。混合物を25℃で5分間インキュベートし、1〜10μgのMurDを加えることに
よって反応を開始させた。これらの条件は、MurDの活性を評価するのに有効なア
ッセイの一例である。他のアッセイを用いることも可能であり、あるいはバッフ
ァー、基質及び酵素の量を必要に応じて変更し、ADPの産生速度を変えることが
できる。

【００７１】 Molecular Devices SPECTRAMAXPLUS^TM マイクロタイタープレート分光光度計(
200μlのアッセイ用)または循環式水浴を備えたHewlett-Packard HP8452A分光光
度計(400μlのアッセイ用)を用いて、時間の関数としての340nmでの吸光度の低
下に基づいてADPの形成を追跡した。速度は、NADHの吸光係数ｅ=6220cm^-1 M^-1を
用いて連続曲線の直線部分から計算した。MurDの活性の1単位は、25℃において1
分当たり1μモルのADPが形成されることに等しい。MurD活性部分は、〜51 kDaの
タンパク質とともに溶出された。

【００７２】

【表１】 表1 大腸菌及び緑膿菌を起源とする組換えMurDの比活性 1 UDP- N-アセチルムラミル-L-アラニン、D-グルタメート、ATPの濃度は、そ
れぞれ350 μM、1mM及び1mMであった。反応物の容積は25℃で200μlであった。 2 大腸菌MurDはPratviel-Sosaら(1991)に記載のように調製した。 3 緑膿菌MurDは上記のように部分的に精製した。

【００７３】 120及び350μMのUDP- N-アセチル-ムラミル-L-アラニンを用いてアッセイを行
った。しかし、より高い濃度の350μMのUDP- N-アセチル-ムラミル-L-アラニン
では、大腸菌MurDの基質阻害が生じることが観察された。低濃度では、大腸菌酵
素の比活性は8単位/mg付近であり得る。緑膿菌酵素が同様に阻害されるか否かは
不明である。

【００７４】 実施例5MurDの阻害剤のスクリーニング MurDの活性を測定するためのアッセイの1つを実施例4で示した。そのアッセイ
及び他のMurD活性のアッセイは、MurDの阻害剤を検出するためのスクリーニング
アッセイに使用できる。例えば、阻害アッセイについては、DMSO中の阻害剤を所
望の濃度でアッセイ混合物に加える。これとは別の対照反応では、アッセイ混合
物にDMSOのみを加える。酵素(MurD)を加えることによって反応を開始させる。速
度は上述のように計算する。相対活性は、以下の式(1)から計算する。

【００７５】

【数１】 相対活性＝阻害剤がある場合の速度／阻害剤のない場合の速度 (1) 阻害定数 (IC₅₀) の値は、阻害剤濃度の範囲から決定され、式(2)で計算され
る。

【００７６】

【数２】 相対活性＝1 ／ (1 + [I] ／ IC₅₀) (2) 分析上の便宜から、例えばSIGMA PLOT^TM (Jandel Scientific)のようなコンピ
ュータソフトウェアを用いることができる。

【００７７】 MurDの阻害剤は、MurD酵素の相対活性を少なくとも75%未満、より好ましくは2
5〜50%または10〜25%とするものが好ましい。相対活性が阻害剤のない場合のMur
Dの活性の20％未満、特に10%未満となる阻害剤が最も好ましい。 また、阻害剤が非常に低濃度しか存在しないときでもMurDの相対活性を有効に
低下させ得る阻害剤が好ましい。

【００７８】 実施例６MurDの阻害剤を用いた治療 例えば緑膿菌を含むグラム陽性及び陰性菌のようなMurDの阻害剤の影響を受け
やすい微生物の感染症の症状を示す患者を、MurDの阻害剤を投与することによっ
て処置することができる。熟練した医師であれば、微生物酵素の阻害剤またはモ
ジュレーターを治療上有効な量投与することについて熟知している。そのような
技術者であれば所望の治療効果を達成するための適当な投薬計画の決定を容易に
行うことができるであろう。

【００７９】 治療は予防的なものであり得る。例えば、緑膿菌の感染を含む細菌感染が発症
するおそれのある患者を、MurDの阻害剤を投与することによって処置することが
できる。熟練した医師であれば、微生物酵素の阻害剤またはモジュレーターを治
療上有効な量投与することについて熟知している。そのような技術者であれば所
望の治療効果を達成するための適当な投薬計画の決定を容易に行うことができる
であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１A及び１B。緑膿菌MurDのヌクレオチド配列(配列番号1)及び推定
アミノ酸配列(配列番号2)。アミノ酸配列(配列番号2)は、ヌクレオチド配列(配
列番号1の51番目から1395番目のヌクレオチド)の下に3文字コードで表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 アゾリナ，バーバラ アメリカ合衆国 07065 ニュージャージ ー州，ローウェイ，イースト リンカーン アヴェニュー 126 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA07 EA04 GA11 4B064 CA19 CC24 DA15 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 CA53 DC32 ZB352 ZC202

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
   るポリヌクレオチド、 (b) (a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、 (c) (a)の天然の変異体または多形体を表わすポリヌクレオチド、及び (d) (a)、(b)又は(c)のポリヌクレオチドの少なくとも25個のヌクレオチドで
   あって、緑膿菌のMurD遺伝子に特異的なものを含むポリヌクレオチド からなる群から選択される、精製され単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、天然のヌクレオチド、非天然のヌクレ
   オチド及び修飾されたヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチドを含
   む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド間の結合が、天然の結合及び非天然の結合からなる
   群から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のポリヌ
   クレオチド。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、
   ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
7. 【請求項７】 組換え宿主細胞において緑膿菌のMurDタンパク質を発現させる方
   法であって、 (a) 適する宿主細胞を請求項５に記載の発現ベクターで形質転換し、そして (b) 前記発現ベクターからの前記MurDタンパク質の発現を可能とする条件の下
   で段階(a)の宿主細胞を培養する ことを含む、前記方法。
8. 【請求項８】 (a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び (b) (a)の天然の変異体または多形体であるポリペプチド からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、精製され単離されたポリペプ
   チド。
9. 【請求項９】 候補化合物が緑膿菌のMurDポリペプチドの阻害剤であるか否かを
   判定する方法であって、 (a) (i)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
   レオチド、 (ii) (i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、及び (iii) (i)の天然の変異体または多形体を表わすポリヌクレオチド からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する少なく
   とも1つの宿主細胞を得、 (b) 前記細胞の少なくとも1つと前記候補とを接触させて前記候補とMurDポリ
   ペプチドとの相互作用を可能とし、 (c) 前記候補の存在下での前記ポリペプチドの相対活性を確認することによっ
   て前記候補がMurDポリペプチドの阻害剤であるか否かを判定する ことを含む、前記方法。
10. 【請求項１０】 前記ポリヌクレオチドが配列番号1のヌクレオチド配列を有す
    る、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 工程(c)において、工程(b)の前の少なくとも1つの細胞のMurD
    ポリペプチド活性の測定値と、工程(b)の後の少なくとも1つの細胞のMurDポリペ
    プチド活性の測定値とを比較することによって前記相対活性を決定する、請求項
    ９に記載の方法。
12. 【請求項１２】 (a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び (b) (a)の天然の変異体または多形体であるポリペプチド からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの阻害剤である、
    化合物。
13. 【請求項１３】 (a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び (b) (a)の天然の変異体または多形体であるポリペプチド からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの阻害剤と、医薬
    上許容される担体とを含む、医薬組成物。
14. 【請求項１４】 (a) 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び (b) (a)の天然の変異体または多形体であるポリペプチド からなる群から選択されるアミノ酸配列のポリペプチドの阻害剤の有効量を患者
    に投与することを含む、細菌の感染症の予防または治療のための処置が必要な患
    者の処置方法。