【発明の詳細な説明】
バチルス・プルラナーゼ及びデキストラナーゼを含んで成るオーラルケア組成物
発明の分野
本発明はバチルス（Bacillus）プルラナーゼとデキストラナーゼとの組合せを
含んで成る組成物に関する。
本発明は更にオーラルケア組成物及び製品におけるバチルス起源のプルラナー
ゼとデキストラナーゼとの組合せの利用、並びに歯垢の除去及び／又は歯垢の形
成の予防のためのその利用に関する。
発明の背景
歯垢の形成はう食、歯肉炎症、歯周病及び究極的な抜歯に結びつく。歯垢は細
菌、上皮細胞、白血球、マクロファージ及びその他の口内滲出物の混合物である
。かかる細菌は高度に枝分れした多糖類を生み出し、それは口腔由来の微生物と
一緒になって歯垢の持続増殖のための接着床を形成する。
歯垢が沈着し続けると、岩のように硬い白色又は黄味を帯びた沈着物が現れる
。これらの沈着物は石灰化歯垢、結石又は歯石と称され、そして歯垢及び鉱物、
特にカルシウムから唾液の中で形成される。口内多糖類
口内多糖類は口の中に例えば食品又は飲料品成分として導入されたスクロース
から、う食性微生物、例えば口腔の中で増殖するストレプトコッカス・ミュータ
ンス（Streptococcus mutans）又はストレプトコッカス・サングイス（S．Sangu
is）により生成される。
かかる口内多糖類は多量のα−１，６−グルコシド結合を有する水溶性デキス
トランと、α−１，３−グリコシド結合を有する主鎖及びα−１，６−グリコシ
ド結合を有する枝を含んで成る「ムタン（mutan）」と称される水不溶性細胞外
多糖類たる主成分とを含んで成る。
ムタンはヒドロキシアバタイト（歯の硬多孔質外層を構成）に、及び歯の表面
に付着した前記う食性細菌の細胞表層上のアクセプタータンパク質を結合する。プルラナーゼ
プルラナーゼはα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ／又は
プルラン６−グルカノ−ヒドロラーゼ）であり、これはプルラン、アミロペクチ
ン及びグリコーゲン中の１，６−α−Ｄ−グルコシド結合を加水分解する。プル
ラナーゼを産生できるいくつかの微生物、例えばエアロバクター（Aerobacter）
属(Benderら(1959)，Biochim Biophys．Acta 36，p.309)、バチルス属（Novo No
rdisk A/SのEP 063,909及びSolvay SAのEP 605,040）、フェルビドバクテリア属
(Fervidobacterium)(Novo Nordisk A/SのWO92／16617)、ピロコッカス属(Pyroco
ccus)(Novo Nordisk A/SのWO92／02614)が知られている。
市販のプルラナーゼ製品にはNovo NordiskのPromozyme(登録商標)が知られ、
これはバチルス・アシドプルリチカス（B．acidopullulyticus）の株から得られ
、デキストロース及びマルトース生産における糖化段階のために利用される熱安
定性枝切り酵素である。その他の市販のプルラナーゼはバチルス・デラミフィカ
ンス(B．deramificans)から得られるOptimax(登録商標)(Solvay SA)である。デキストラナーゼ
デキストラナーゼはデキストラン中のα−１，６−グリコシド結
合を分解するα−１，６−グルカーゼ（１，６−α−Ｄ−グルカン６グルカノヒ
ドロラーゼとしても知られる）である。いくつかの微生物がデキストラナーゼを
産生でき、とりわけペニシリウム(Penicillium)、パエシロマイセス(Paecilomyc
es)、アスペルギルス(Aspergillus)、フサリウム(Fusarium)、スピカリア(Spica
ria)、バーチシリウム（Verticililum）、ヘルミソスポリウム（Helminthospori
um)、及びケトミウム（Chaetomium）属の真菌；ラクトバチルス(Lactobacillus)
、ストレプトコッカス、セルビブリオ（Cellvibrio）、サイトファガ(Cytophaga
)、ブレビバクテリア（Brevibacterium）、シュードモナス(Pseudomonas)、コリ
ネバクテリア（Corynebacterium）、アルスロバクター（Arthrobacter）及びフ
ラボバクテリア（Flavobacterium）菌、並びに酵母、例えばリポマイセス・スタ
ーケイイ（Lipomyces starkeyi）である。
市販の製品にはペニシリウム・リラシウム(P．lilacium)株の発酵により製造
されたNovo Nordisk A/Sのデキストラナーゼ50Ｌが挙げられる。デキストラナー
ゼ50Ｌは糖産業において、デキストランを原料糖汁又はシロップにおいて分解す
るために使用されている。
う食、歯垢及び歯石の形成を予防するため、オーラルケア組成物及び製品にプ
ルラナーゼ及び／又はデキストラナーゼ及び／又はその他の酵素を加えることが
提案されていた。
DE1,965,043号(Aspro-Nicholas Ltd.)にはデキストラナーゼ及びプルラナーゼ
を含んで成るオーラルケア組成物が記載されている。
発明の概要
本発明の目的は歯垢の形成を安全（即ち、口腔の組織及び構造を損傷すること
なく）且つ効率的に歯垢の形成を予防する及び／又は
既に沈着している歯垢を除去する改良オーラルケア製品を提供することにある。
本発明者はバチルス属の細菌株に由来するプルラナーゼをデキストラナーゼと
の組合せにおいて含んで成る組成物及び製品がムタン加水分解と、歯垢除去及び
歯垢形成予防との相乗的な作用を奏することを見い出した。
第一の観点において、本発明はバチルス・プルラナーゼ及びデキストラナーゼ
を含んで成る組成物に関する。
第二の観点において、本発明は本発明のオーラルケア組成物を含んで成るオー
ラルケア製品に関する。
本発明の更なる目的はムタン含有物質を加水分解並びに／又は歯垢除去及び／
もしくは予防するためのバチルス・プルラナーゼの利用を提供する。
最後の観点において、本発明は歯垢除去及び／又は歯垢予防のための本発明の
組成物及び製品の利用に関する。
図面の簡単な説明
図１は２種類のバチルス・プルラナーゼ及びエンテロバクター・エアロジース
（Enterobacter aerogenes）プルラナーゼの単独のもの、パエシロマイセス・リ
ラシウムデキストラナーゼをそれに組合せたもののムタン加水分解効果を比較す
る。
発明の詳細な説明
本発明の目的は改良オーラルケア組成物の提供にある。
「改良」オーラルケア組成物とは、安全であり（即ち、口腔の組織及び構造を
損傷しない）且つより効率的に歯垢の形成を予防する及び／又は沈着した歯垢を
除去する製品を意味する。
前述の通り、プルラナーゼ及びデキストラナーゼを含んで成るオーラルケア組
成物は公知である。
本発明者は驚くべきことに、デキストラナーゼとの組合せにおけるバチルス属
の細菌に由来するプルラナーゼが改良オーラルケア製品を提供するために利用で
きうることを見い出した。かかるオーラルケア製品はデキストラナーゼとの組合
せにおけるその他の細菌のプルラナーゼを含んで成る他の対応の製品よりも効率
的に歯垢を除去する。
バチルス・プルラナーゼとデキストラナーゼとの相乗効果は歯垢除去との関係
で得られる。標準の細菌プルラナーゼ、例えばエンテロバクター・エアロジーン
スプルラナーゼ及びデキストラナーゼ及び／又はムタナーゼを組合せると、当該
プルラナーゼは歯垢除去効果に寄与しない。
従って、バチルスプルラナーゼとデキストラナーゼとの組合せを含んで成る組
成物及び製品は対応の組成物と比べて多数の利点を有する。
所望の効果を得るために必要な酵素の量を下げることができ、及び／又は所望
の効果を得るために時間を短縮できる。
必要な酵素量の削減はオーラルケア製品製造者の商業的関心であり、なぜなら
本発明に従えばかかる製品の製造費を削減できるからである。
更に、もし従来の酵素量を製品に加えると、改良製品が得られ、なぜなら所望
効果が往々にして短期間で得られるであろうからである。
また、本発明のオーラルケア組成物から調製した本発明のオーラルケア製品（
利用者（後述する）は本発明の利益を受けることができ、なぜなら直接且つ間接
的な欠点（例えば歯の黄色沈着物並びに
歯穴及び歯肉炎の予防、それぞれ）がプルラナーゼ及びデキストラナーゼを含ん
で成る対応の従来製品よりも安全且つより効率的に予防できるからである。
前記オーラルケア製品は同時にその他のオーラルケア機能、例えは歯穴又は歯
肉炎の予防も直接的又は間接的に有しうる。組成物
第一の観点において、本発明はバチルス・プルラナーゼ（即ち、バチルス属の
細菌に由来するプルラナーゼ）及びデキストラナーゼを含んで成る組成物に関す
る。本発明のオーラルケア組成物は更にオーラルケア組成物に利用されている成
分を含んで成る。かかる成分は当業者に周知である。
詳しく考えると、バチルス・プルラナーゼにはバチルス・アシドプルリチカス
株又はバチルス・デラミフィカンス株由来のプルラナーゼが挙げられる。しかし
ながら、その他のバチルス・プルラナーゼも利用できうる。
バチルス・プルラナーゼは好都合にはパエシロマイセス種、特にパエシロマイ
セス・リラシヌス（P．lilacinus）、又はペニシリウム種、例えばペニシリウム
・リラシヌス（P．lilacinus）もしくはペニシリウム・ミニオルテウム（P．min
ioluteum）に由来するデキストラナーゼ、又は「発明の背景」の中で挙げた他の
デキストラナーゼと組合せて利用されうる。
本発明の好適な態様において、当該酵素（即ち、特にプルラナーゼ及びデキス
トラナーゼ）は組換酵素である。
本発明の酵素はヒト又は動物の口の中の温度及びpH、特に37℃前後及び５〜９
の範囲のpH、特にpH６〜8.5において実質的に活性であるべきであり、又は課題
の特殊なオーラルケア製品を利用するとき口内温度及びpHにおいて実質的に活性
であるべきである。
本発明との関連における「実質的に活性」とは酵素の比活性が、至適pHでの比
活性と比較して、当該オーラルケア組成物を利用するときの口内pHにおいて50％
超、特に60％超、特に70％超、例えば90％であることを意味する。
本発明のオーラルケア組成物は更に、ムタナーゼ、オキシダーゼ、例えばグル
コースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばWO
95／10602(Novo Nordisk)に記載のコプリヌス（Coprinus）種ペルオキシダーゼ
、又はラクトペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、プロテア
ーゼ、例えばパパイン、酸性プロテアーゼ（例えばWO95／02044(Novo Nordisk)
に記載の酸性プロテアーゼ）、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、
例えばアミログルコシダーゼ、例えばAMG（Novo NordiskA/S由来）、抗微生物酵
素、及びそれらの混合物の群から選ばれる１又は複数種の酵素を含んで成ってよ
い。
本発明のオーラルケア組成物は適切には、最終オーラルケア製品中の酵素活性
単位として計算して、酵素活性に相当する量において、0.001PUN〜1000PUN／ml
、好ましくは0.01PUN／ml〜500PUN／ml、特に0.1PUN／ml〜100PUN／mlの範囲の
量のバチルス・プルラナーゼが組込まれている。
本発明に従うと、デキストラナーゼは任意的に、最終オーラルケア製品中の酵
素活性単位として計算して、酵素活性に相当する量において、0.001KDU〜1000KD
U／ml、好ましくは0.01KDU／ml〜500KDU／ml、特に0.1KDU／ml〜100KDU／mlの範
囲の量で当該オーラルケア組成物の中に組込まれている。
本発明のオーラルケア組成物は更に適切には最終オーラルケア製品中の酵素活
性単位として計算して、酵素活性に相当する量において、0.001MU〜1000MU／ml
、好ましくは0.01MU／ml〜500MU／ml、
例えば0.1MU／ml〜100MU／ml、特に0.05MU／ml〜100MU／mlの範囲の量でムタナ
ーゼ、例えばトリコデルマ・ハージアヌム（Tricoderma harzianum）ムタナーゼ
を含んで成りうる。オーラルケア製品
本発明は更に本発明のオーラルケア組成物を含んで成るオーラルケア製品に関
する。当該オーラルケア製品は任意の適当な物理形態を有しうる（即ち、粉末、
ペースト、ゲル、液体、オイントメント、錠剤、等）。
「オーラルケア製品」はヒト及び動物の口の中の口内衛生を、歯垢の形成の防
止、歯垢の除去、歯の病気の予防及び／又は処置等により、維持又は改善するた
めに利用できる製品として定義されうる。
少なくとも本発明との関連においては、このオーラルケア製品は義歯、人工歯
等の洗浄のための製品も包括する。
かかるオーラルケア製品の例には歯みがきペースト、歯みがきクリーム、ゲル
又は歯みがき粉、オドンチック、マウスウォッシュ、歯みがき前又は後用のリン
ス製剤、チューインガム、ロゼンジ及びキャンディーが挙げられる。
歯みがきペースト及びゲルは典型的には研磨材、発泡剤、風味剤、保湿剤、結
合剤、増粘剤、甘味剤、白化／漂化／しみ除去剤、水及び任意的に酵素を含む。
歯垢除去液を含むマウスウォッシュは典型的には水／アルコール溶液、風味剤
、保湿剤、甘味剤、発泡剤、着色料及び任意的に酵素を含んで成る。研磨材
研磨材も本発明の歯みがき製品の中に導入してよい。本発明に従うと、かかる
研磨材にはアルミナ及びその水和物、例えばアルファ
ーアルミナ三水和物、三ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、ア
ルミノシリケート、例えば焼成ケイ酸アルミニウム及びケイン酸アルミニウム、
炭酸カルシウム、ケイ酸ジルコニア、そして更には粉末プラスチック、例えばポ
リビニルクロリド、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フ
ェノールホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホル
ムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉末ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒド
ロゲル及びエアロゲン等が挙げられる。ピロリン酸カルシウム、水不溶性メタリ
ン酸アルカリ、リン酸二カルシウム及び／又はその二水和物、オルトリン酸二カ
ルシウム、リン酸三カルシウム、粒状ヒドロキシアパタイト等も研磨材として適
切である。このような物質の混合物を使用することも可能である。
オーラルケア製品に依存して、この研磨製品は０〜70重量％、好ましくは１〜
70重量％で存在していてよい。歯みがき剤に関しては研磨材は典型的には最終歯
みがき製品の10〜70重量％の範囲に属する。
保湿剤を例えば歯みがき剤からの水の損失を防ぐために利用する。本発明に係
るオーラルケア製品に利用するための適切な保湿剤には下記の化合物及びその混
合物が挙げられる：グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレング
リコール(PEG)、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−
ブタンジオール、水素化部分加水分解多糖類、等。保湿剤は一般に歯みがき剤の
０〜80重量％、好ましくは５〜70重量％で存在する。
シリカ、デンプン、トラガカンスゴム、キサンタンゴム、アイルランドコケの
エキス、アルギネート、ペクチン、セルロース誘導体、例えばヒドロキシセルロ
ース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロー
ス、ポリアクリル酸及びそ
の塩、ポリビニルピロリドが適当な増粘剤及び結合剤の例として挙げられ、これ
は歯みがき製品の安定化に役立つ。増粘剤は歯みがきクリーム及びゲルの中に最
終製品の0.1〜20重量％の量で存在していてよく、そして結合剤は0.01〜10重量
％の範囲にありうる。発泡剤
発泡剤石けん、陰イオン、陽性、非イオン、両性及び／又は双イオン性界面活
性剤を利用してよい。これらは最終製品の０〜15重量％、好ましくは0.1〜13重
量％、より好ましくは0.25〜10重量％のレベルで存在していてよい。界面活性剤
界面活性剤は本プロテアーゼに対して不活性化作用を及ぼさない程度のみが適
切である。界面活性剤には脂肪アルコールスルフェート、10〜20個の炭素原子を
有するスルホン化モノグリセリド又は脂肪酸の塩、脂肪酸−アルブメン縮合製品
、脂肪酸アミドの塩及び／又はイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩が挙げられる
。甘味剤
適当な甘味剤にはサッカリンが挙げられる。風味剤
風味剤、例えばスペアミントは通常少量、例えば0.01〜約５重量％、特に0.1
〜５重量％で存在する。白化／漂白剤
白化／漂白剤にはH2O2が挙げられ、そして最終製品の重量を基準に計算して５
重量％未満、好ましくは0.25〜4重量％で加えてよい。
白化／漂白剤は酵素、例えばオキシドリダクターゼであってよい。適当な歯漂
白酵素の例はWO97／06775(Novo Nordisk)に記載されている。水
水は通常、例えば歯みがき剤に流動性を供与する量で加える。追加の剤
更なる水溶性抗菌剤、例えばクロルヘキシジンジグルコネート、ヘキセチジン
、アレキシジン、第四アンモニウム抗菌化合物及び所定の金属イオン、例えば亜
鉛、銅、銀及び錫の水溶性起源（例えば塩化亜鉛、銅及び錫、並びに硝酸銀）も
含ませてよい。
本発明に関して更に考慮されるのはフッ化物起源として利用される化合物、色
素／着色料、保存剤、ビタミン、pH調節剤、抗う食剤、脱感作剤の添加である。酵素
本発明のオーラルケア組成物及びオーラルケア製品において利用されるその他
の必須成分は酵素である。酵素は生体系の化学反応の生物学的触媒である。酵素
はそれが作用する基質と組合さって中間酵素−基質複合体を形成する。この複合
体は次いで反応生成物と、その特異的な酵素機能を維持する遊離酵素とに変換さ
れる。
酵素は口腔の洗浄のために用いる場合にはいくつかの利点を供する。プロテア
ーゼは歯の表面に吸着して歯膜を形成し、その結果第一歯垢層を形成してしまう
唾液タンパク質を分解する。プロテアーゼはリバーゼと一緒になって、細菌の細
胞壁及び膜の構造成分を構成するタンパク質及び脂質を溶解することにより細菌
を破壊する。デキストラナーゼは細菌付着のための床を構成する細菌により生成
された有機骨格構造を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼは歯垢形成を防ぐ
だけでなく、カルシウムと結合する炭水化物−タンパク質複合体を分解すること
により結石の発生をも防ぎ、それ故鉱化を予防する。歯みがき剤
本発明のオーラルケア組成物から製造した歯みがき剤は（最終歯みがき組成物
の％重量において）典型的には下記の成分を含んで成ってよい：
研磨材 10〜70％
保湿剤 ０〜80％
増粘剤 0.1〜20％
結合剤 0.01〜10％
甘味剤 0.1〜５％
発泡剤 ０〜15％
白化剤 ０〜５％
酵素 0.0001〜20％
本発明の特異的な態様において、当該オーラルケア製品は以下を含んで成る歯
みがき剤である：
ａ）10〜70％の研磨材
ｂ）０〜80％の保湿剤
ｃ）0.1〜20％の増粘剤
ｄ）0.01〜10％の結合剤
ｅ）0.1〜５％の甘味剤
ｆ）０〜15％の発泡剤
ｇ）０〜５％の白化剤
ｉ）0.0001〜20％の酵素
ｉ）の酵素は歯みがき剤等を使用されるもので知られる上記のプルラナーゼ、
デキストラナーゼ及びその他の酵素を意味する。マウスウォッシュ
本発明のオーラルケア組成物から製造したマウスウォッシュは（最終マウスウ
ォッシュ組成物の％重量において）典型的には下記の成分を含んで成ってよい：
０〜20％の保湿剤
０〜２％の界面活性剤
０〜５％の酵素
０〜20％のエタノール
０〜２％のその他の成分（例えば、風味剤、甘味剤、活性成分、例えばフッ化
物）
０〜70％の水
このマウスウォッシュ組成物は適当なバッファー、例えばクエン酸又はリン酸
ナトリウムでpH域６〜7.5に緩衝化されていてよい。
このマウスウォッシュは未希釈形態（即ち、使用前に希釈しなくてはならない
もの）であってよい。製造方法
本発明のオーラルケア組成物及び製品はオーラルケア分野に一般の方法を利用
して製造できる。用途
本発明に従うと、バチルス・プルラナーゼはムタンの加水分解及び更には歯垢
の予防及び／又は除去のために利用される。バチルス・プルラナーゼは好ましく
はデキストラナーゼ、時折りムラナーゼと組合せ利用する。
本発明の組成物及び製品は歯垢の除去及び／又は形成予防のために利用されう
る。
バチルス・プルラナーゼを食品、飼料及び／又はペット食品に、好ましくはデ
キストラナーゼ、そして時折り更にはムカナーゼと組合せ利用することは本発明
の範囲に属する。
材料と方法
材料プルラナーゼ
Promozyme(登録商標)：バチルス・アシドプルリチカス由来のプルラナーゼ(No
vo Nordiskより入手可能)(EP 63,909に記載)。
Optimax(登録商標)：バチルス・デラミフィカンス由来のプルラナーゼ（EP 60
5,040(Solvay SA)由来）。
Amano JPより購入したエンテロバクター・エアロジーンスのプルラナーゼ。その他の酵素：
パエシロマイセス・リラシヌム由来のデキストラナーゼ（Novo Nordiskより入
手可能）。
トリコデルマ・ハージアヌム 243.71由来のムタナーゼ(Novo Nordiskより入
手可能）。微生物：
ストレプトコッカス・ムタンス株CBS 350,71（又はOMZ176）アクチノマイセス
・ビスコサス（Actinomyces viscosus）DSM 43329
フソバクテリア・ヌクレアトウム(Fusobacterium nucleatum)亜種の多形態DMS
20482溶液
Britton-Robinsonバッファー
エリトロシンＢ(Sigma)装置
シェーカー（Eppendorf Thermomixer,Type 5436）
クロマメーター CR−200（Minolta）ヒドロキシアパタイトディスクの調製
ヒドロキシアパタイトディスクを、250mgのヒドロキシアパタイトをディスク
ダイの中に約5,900kg（13,0001bs）の圧力で５分圧縮
することにより調製する。このディスクを600℃で４時間焼成し、そして最後に
滅菌脱イオン水で水和させる。ヒドロキシアパタイトディスクの滅菌
HAディスクを180℃で２時間滅菌し、滅菌脱イオン水で水和し、そしてNuncチ
ューブの蓋（10ml容量）の中に入れる。ムタンの調製
ムタンは下記の成分を含んで成る培地の中でpH6.5、37℃（一定に保持）にお
いて75rpmの通気率で増殖中のストレプトコッカス・ムタンスCBS 350.71により
調製する：
NZ-Case 6.5ｇ／リットル
酵母エキス ６ｇ／リットル
(NH4)2SO4 20ｇ／リットル
K2PO4 ３ｇ／リットル
グルコース 50ｇ／リットル
Pluronic PE6100 0.1％
35時間後、スクロースを60ｇ／リットルの最終濃度となるまで加え、グリコシル
トランスフェラーゼを誘導する。総発酵時間は75時間とする。発酵由来の上清液
を遠心分離し、そして濾過する（滅菌）。次いでスクロースを上清液に５％の最
終濃度となるまで加え（pHは酢酸でpH7.0に調整する）、そしてこの溶液を37℃
で一夜撹拌する。この溶液を濾過し、そして不溶性ムタンをプロバックス上で回
収し、そして１％の安息香酸ナトリウムを含むpH５（酢酸で調整）の脱イオン水
でよく洗う。最後に、不溶性ムタンを凍結乾燥し、そして粉砕する。方法
活性測定値である１プルラナーゼ単位Novo(PUN)は下記の標準条件下でプルラ
ンを加水分解し、１マイクロモル／分に相当する還元
力をもつ還元炭水化物を遊離させる酵素の量として定義する：
基質： 0.2％のプルラン
温度： 40℃
pH： 5.0
反応時間： 30分
この分析方法の詳細な説明(AF190)は注文に応じて入手できる。デキストラナーゼ活性(KDU)の決定
１キロのNovoデキストラナーゼ単位(１KDU)は下記の標準条件を基準とするデ
キストラナーゼの測定のためのNovo Nordisk法において、１時間当り１ｇのマル
トースに相当する還元糖を生成するようデキストランを分解する酵素の量である
：
基質： デキストラン500（Pharmacia）
反応時間： 20分
温度： 40℃
pH： 5.4
Novo Nordisk分析方法の詳細な説明(AF120)は注文に応じて入手できる。歯垢除去効果の評価
歯垢除去効果を評価するのに用いる方法は花王社のJP2250816号記載の方法を
基準とする。この方法に従えば、ヒドロキシアパタイトディスクに３種類の口内
微生物（ストレプトコッカス・ムタンス、アクチノマイセス・ビスコサス及びフ
ソバクテリア・ヌクレアトウム）株を含んで成る生物膜をコーティングする。
歯垢除去効果を試験するため、PBS中の0.1％のエリトロシンＢをヒドロキシア
パタイトディスク上の歯垢を赤く染めるのに用いる。赤色の強さ（即ち、a★）
はクロマメーターCR−200で測定する。最大a★値は60である。それより低い値は
弱い強度の赤色を示す（即
ち、少ない歯垢）。a★値がゼロとなったら、赤色はないこととなる（即ち、歯
垢なし）。
実施例
実施例１ムタン加水分解
２種類のバチルス・プルラナーゼ及びエンテロバクター・エアロジーンス由来
の一の標準細菌プルラナーゼによるムタンの加水分解を単独で、及びパエシロマ
イセス・リラシヌム・デキストラナーゼとの組合せにおいて試験した。
「材料と方法」の章で記載の通りに調製したムタン懸濁物を脱イオン水の中に
ウルトラソニケーターで分散させ、2.5％（ｗ／ｖ）の基質懸濁物を形成した。
10mMのBRバッファーに溶解した下記の酵素溶液を調製した。
Optimax(登録商標)(バチルス・プルラナーゼ)：0.5及び10PUN／ml
Promozyme(登録商標)(バチルス・プルラナーゼ)：0.5及び10PUN／ml
エンテロバクター・エアロジーンス・プルラナーゼ：0.5及び10PUN／ml
上記酵素溶液を8.5DU／mlのパエシロマイセス・リラシヌムデキストラナーゼ
とも組合せた。
更に、10mMのBritton-Robinsonバッファー溶液(pH5.5)を調製した。
250μｌづつの上記酵素溶液と250μｌのバッファー溶液(pH5.5)をマイクロ遠
沈管の中で混合した。しかる後、直ちに750μｌのムタン懸濁物を加え、シェー
カーの中で最大速度で37℃でインキュベーションした。
ちょうど15分後、250μｌの0.5ＮのHClを加えて酵素反応を停止させた。コン
トロールは基質懸濁物の添加前に0.5NのHClを加えることにより調製した。各反
応混合物を遠心にかけた。
得られる上清液中の溶解炭水化物をアンスロン反応法（J．H．Roe，(1955)，J
．Biol．Chem．212，p.335）に従ってグルコースとして決定した。
この結果を図１に示す。図１から、２種類のバチルス・プルラナーゼ、Promoz
yme及びOptimaxのそれぞれが、パエシロマイセス・デキストラナーゼと組合さっ
て、ムタンを加水分解するときに相乗効果を奏することがわかり、一方標準のエ
ンテロバクター・プルラナーゼは同デキストラナーゼと一緒でもそれを奏しない
ことがわかる。
本明細書において引用する様々な文献はその全内容を本明細書に組入れる。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to compositions comprising a combination of Bacillus pullulanase and dextranase. The present invention further relates to the use of a combination of pullulanase of bacillus origin and dextranase in oral care compositions and products, and its use for removing plaque and / or preventing plaque formation. BACKGROUND OF THE INVENTION Plaque formation is linked to caries, gingival inflammation, periodontal disease and ultimate tooth extraction. Plaque is a mixture of bacteria, epithelial cells, leukocytes, macrophages and other oral exudates. Such bacteria produce highly branched polysaccharides, which together with microorganisms from the oral cavity form an adhesive bed for the sustained growth of plaque. As plaque continues to deposit, a rocky white or yellowish deposit appears. These deposits are called calcified plaque, calculus or tartar, and are formed in saliva from plaque and minerals, especially calcium. Oral polysaccharides Oral polysaccharides can be derived from sucrose introduced into the mouth, for example, as a food or beverage ingredient, from cariogenic microorganisms, such as Streptococcus mutans or Streptococcus sanguis, which grow in the oral cavity. Sangu is). Such an oral polysaccharide comprises a large amount of a water-soluble dextran having an α-1,6-glycosidic bond, a main chain having an α-1,3-glycosidic bond, and a branch having an α-1,6-glycosidic bond. A water-insoluble extracellular polysaccharide, referred to as "mutan". Mutanes bind the hydroxyapatite (which constitutes the hard, porous outer layer of the tooth) and acceptor proteins on the cell surface of the cariogenic bacteria attached to the tooth surface. Pullulanase is an α-dextrin endo-1,6-α-glucosidase / or pullulan 6-glucano-hydrolase, which hydrolyzes 1,6-α-D-glucosidic bonds in pullulan, amylopectin and glycogen. . Some microorganisms capable of producing pullulanase, such as the genus Aerobacter (Bender et al. (1959), Biochim Biophys. Acta 36, p. 309), the genus Bacillus (Novo Nordisk A / S EP 063,909 and Solvay SA) EP 605,040), the genus Fervidobacterium (WO92 / 16617 of Novo Nordisk A / S) and the genus Pyrococcus (WO92 / 02614 of Novo Nordisk A / S) are known. A commercially available pullulanase product is known as Novo Nordisk's Promozyme®, which is obtained from a strain of B. acidopullulyticus and is used for the saccharification step in dextrose and maltose production. It is a thermostable debranching enzyme. Another commercially available pullulanase is Optimax® (Solvay SA) obtained from B. deramificans. Dextranase Dextranase is an α-1,6-glucase (also known as 1,6-α-D-glucan 6-glucanohydrolase) that degrades α-1,6-glycosidic bonds in dextran. Several microorganisms can produce dextranase, especially Penicillium, Paecilomyces, Aspergillus, Fusarium, Spicaria, Verticililum, Hermisoporium ( Helminthospori um) and fungi of the genus Chaetomium; Lactobacillus, Streptococcus, Cellvibrio, Cytophaga, Brevibacterium, Pseudomonas, Corynebacterium, Corynebacterium, Corynebacterium Shrobacter (Arthrobacter) and Flavobacterium (Flavobacterium) bacteria, and yeasts such as Lipomyces starkeyi. Commercially available products include 50 L of Novo Nordisk A / S dextranase produced by fermentation of a Penicillium lilacium strain. Dextranase 50L is used in the sugar industry to degrade dextran in raw juice or syrup. It has been proposed to add pullulanase and / or dextranase and / or other enzymes to oral care compositions and products to prevent the formation of caries, plaque and tartar. DE 1,965,043 (Aspro-Nicholas Ltd.) describes an oral care composition comprising dextranase and pullulanase. SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to prevent plaque formation safely (i.e., without damaging the tissues and structures of the oral cavity) and efficiently prevent plaque formation and / or remove plaque already deposited. It is to provide an improved oral care product for removal. The present inventors have found that compositions and products comprising pullulanases from bacterial strains of the genus Bacillus in combination with dextranase have a synergistic effect on mutan hydrolysis, plaque removal and prevention of plaque formation. I found something. In a first aspect, the present invention relates to a composition comprising Bacillus pullulanase and dextranase. In a second aspect, the present invention relates to an oral care product comprising the oral care composition of the present invention. A further object of the present invention provides the use of Bacillus pullulanase for hydrolyzing and / or removing and / or preventing plaque of a mutan-containing substance. In a last aspect, the invention relates to the use of the compositions and products of the invention for plaque removal and / or plaque prevention. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 compares the mutan hydrolysis effects of two Bacillus pullulanases and Enterobacter aerogenes pullulanase alone, and a combination thereof with Paecilomyces reelacium dextranase. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide an improved oral care composition. By "improved" oral care composition is meant a product that is safe (i.e., does not damage oral tissues and structures) and that more effectively prevents plaque formation and / or removes deposited plaque. I do. As mentioned above, oral care compositions comprising pullulanase and dextranase are known. The present inventors have surprisingly found that pullulanases from bacteria of the genus Bacillus in combination with dextranase can be used to provide improved oral care products. Such oral care products remove plaque more efficiently than other corresponding products comprising other bacterial pullulanases in combination with dextranase. The synergistic effect of Bacillus pullulanase and dextranase is obtained in relation to plaque removal. When combined with standard bacterial pullulanases, such as Enterobacter aerogenus pullulanases and dextranases and / or mutanases, the pullulanases do not contribute to the plaque removal effect. Thus, compositions and products comprising a combination of Bacillus pullulanase and dextranase have a number of advantages over the corresponding compositions. The amount of enzyme required to achieve the desired effect can be reduced, and / or the time to achieve the desired effect can be reduced. Reducing the amount of enzyme required is of commercial interest to oral care product manufacturers, since the invention can reduce the cost of manufacturing such products. Furthermore, if conventional amounts of enzymes are added to the product, an improved product is obtained, since the desired effect will often be obtained in a short time. Also, oral care products of the present invention (users (described below) prepared from the oral care compositions of the present invention can benefit from the present invention because of direct and indirect disadvantages (eg, yellow deposits on teeth). And prevention of dental cavities and gingivitis, respectively, can be prevented more safely and more efficiently than the corresponding conventional products comprising pullulanase and dextranase. In a first aspect of the composition, the invention relates to Bacillus pullulanases (ie, pullulanases from bacteria of the genus Bacillus) and dextra. The present invention relates to a composition comprising an enzyme.The oral care composition of the present invention further comprises a component utilized in the oral care composition. Such components are well known to those of skill in the art.When considered in detail, Bacillus pullulanase includes pullulanase from a Bacillus acidophilus strain or a Bacillus deramificans strain, however, other Bacillus pullulanases may be utilized. Bacillus pullulanase is advantageously dextranase from Paecilomyces spp., Especially Paecilomyces lilacinus (P. lilacinus), or penicillium spp., Such as Penicillium lilacinus or Penicillium miniorteum (P. Alternatively, it may be used in combination with other dextranases listed in “Background of the Invention.” In a preferred embodiment of the present invention, the enzymes (ie, especially pullulanases and dextranases) are recombinant enzymes. The enzyme of the present invention is human or Should be substantially active at the temperature and pH in the mouth of the animal, especially around 37 ° C. and in the pH range of 5 to 9, especially pH 6 to 8.5, or when utilizing the special oral care product in question It should be substantially active at oral temperature and pH In the context of the present invention, "substantially active" means that the specific activity of the enzyme is greater than the specific activity at the optimal pH. By oral pH when utilizing the composition is meant more than 50%, especially more than 60%, especially more than 70%, for example 90% The oral care composition of the present invention further comprises a mutanase, an oxidase such as glucose. Oxidases, L-amino acid oxidases, peroxidases, such as Coprinus sp. Peroxidase described in WO 95/10602 (Novo Nordisk), or lactoperoxidase, haloperoxidase, Protease, such as papain, acid protease (eg, acid protease described in WO95 / 02044 (Novo Nordisk)), endoglucosidase, lipase, amylase, such as amyloglucosidase, such as AMG (from Novo Nordisk A / S), antimicrobial enzyme , And one or more enzymes selected from the group of mixtures thereof. The oral care composition of the present invention is suitably 0.001 PUN-1000 PUN / ml, preferably 0.01 PUN / ml-500 PUN / ml, in an amount corresponding to enzyme activity, calculated as units of enzyme activity in the final oral care product. Bacillus pullulanase in an amount ranging from 0.1 PUN / ml to 100 PUN / ml is incorporated. In accordance with the present invention, dextranase optionally comprises 0.001 KDU to 1000 KD U / ml, preferably 0.01 KDU / ml to an amount corresponding to enzyme activity, calculated as units of enzyme activity in the final oral care product. It is incorporated into the oral care composition in an amount ranging from 500 KDU / ml, especially from 0.1 KDU / ml to 100 KDU / ml. The oral care compositions of the present invention are more suitably 0.001 MU to 1000 MU / ml, preferably 0.01 MU / ml to 500 MU / ml, in amounts corresponding to enzyme activity, calculated as units of enzyme activity in the final oral care product. ml, such as 0.1 MU / ml to 100 MU / ml, especially 0.05 MU / ml to 100 MU / ml, comprising mutanase, such as Tricoderma harzianum mutanase. Oral care product The present invention further relates to an oral care product comprising the oral care composition of the present invention. The oral care product may have any suitable physical form (ie, powder, paste, gel, liquid, ointment, tablet, etc.). "Oral care products" can be used to maintain or improve oral hygiene in the mouth of humans and animals by preventing plaque formation, removing plaque, preventing and / or treating dental diseases, etc. Can be defined as a product. At least in the context of the present invention, this oral care product also includes products for cleaning dentures, artificial teeth and the like. Examples of such oral care products include toothpaste pastes, toothpaste creams, gels or toothpastes, odontics, mouthwashes, pre or post-rinse rinse formulations, chewing gums, lozenges and candies. Toothpastes and gels typically include abrasives, foaming agents, flavoring agents, humectants, binders, thickeners, sweeteners, whitening / bleaching / stain removers, water and optionally enzymes. Mouthwash containing plaque remover typically comprises a water / alcohol solution, flavoring agent, humectant, sweetener, foaming agent, colorant and optionally enzymes. Abrasives Abrasives may also be introduced into the toothpaste products of the present invention. According to the present invention, such abrasives include alumina and its hydrates, such as alpha-alumina trihydrate, magnesium trisilicate, magnesium carbonate, kaolin, aluminosilicates, such as calcined aluminum silicate and aluminum silicate, calcium carbonate Zirconia silicate, and even powdered plastics such as polyvinyl chloride, polyamide, polymethyl methacrylate, polystyrene, phenol formaldehyde resin, melamine-formaldehyde resin, urea-formaldehyde resin, epoxy resin, powdered polyethylene, silica xerogel, hydrogel, aerogen, etc. Is mentioned. Calcium pyrophosphate, water-insoluble alkali metaphosphate, dicalcium phosphate and / or dihydrate thereof, dicalcium orthophosphate, tricalcium phosphate, granular hydroxyapatite, and the like are also suitable as abrasives. It is also possible to use mixtures of such substances. Depending on the oral care product, the abrasive product may be present at 0-70% by weight, preferably 1-70% by weight. For dentifrices, the abrasives typically range from 10 to 70% by weight of the final dentifrice product. Moisturizers are used, for example, to prevent water loss from dentifrices. Suitable humectants for use in the oral care products according to the present invention include the following compounds and mixtures thereof: glycerol, polyol, sorbitol, polyethylene glycol (PEG), propylene glycol, 1,3-propanediol, 1,4-butanediol, hydrogenated partially hydrolyzed polysaccharides, and the like. Humectants are generally present at 0-80%, preferably 5-70% by weight of the dentifrice. Suitable thickeners are silica, starch, tragacanth gum, xanthan gum, Irish moss extract, alginate, pectin, cellulose derivatives such as hydroxycellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylcellulose, polyacrylic acid and its salts, polyvinylpyrrolid and Examples are binders, which help stabilize the dentifrice product. Thickeners may be present in toothpastes and gels in amounts of 0.1-20% by weight of the final product, and binders may range from 0.01-10% by weight. Blowing agents Blowing agents Soaps, anionic, positive, nonionic, amphoteric and / or zwitterionic surfactants may be utilized. They may be present at a level of 0 to 15%, preferably 0.1 to 13%, more preferably 0.25 to 10% by weight of the final product. Detergents Detergents are only appropriate to the extent that they do not have an inactivating effect on the protease. Surfactants include fatty alcohol sulfates, salts of sulfonated monoglycerides or fatty acids having 10 to 20 carbon atoms, fatty acid-albumen condensation products, salts of fatty acid amides and / or salts of fatty acid esters of isethionic acid. . Sweetening agents Suitable sweetening agents include saccharin. Flavoring agents flavoring agents, for example, spearmint usually small amounts, for example 0.01 to about 5 wt%, present in particular from 0.1 to 5 wt%. The whitening / bleaching agents whitening / bleaching agents include H 2 O 2, and the weight of the final product was calculated based on less than 5 wt%, preferably be added at 0.25 to 4% by weight. The whitening / bleaching agent may be an enzyme, such as an oxidoreductase. Examples of suitable tooth bleaching enzymes are described in WO 97/06775 (Novo Nordisk). Water Water is usually added, for example, in an amount that provides fluidity to the dentifrice. Additional agents Additional water-soluble antimicrobial agents such as chlorhexidine digluconate, hexetidine, alexidine, quaternary ammonium antimicrobial compounds and water soluble sources of certain metal ions such as zinc, copper, silver and tin (e.g., zinc chloride, copper and Tin, as well as silver nitrate). Further considerations in connection with the present invention are the addition of compounds, dyes / colorants, preservatives, vitamins, pH regulators, cariogenics, desensitizers utilized as fluoride sources. Enzymes Another essential ingredient utilized in the oral care compositions and products of the present invention are enzymes. Enzymes are biological catalysts for chemical reactions in biological systems. The enzyme combines with the substrate on which it acts to form an intermediate enzyme-substrate complex. This complex is then converted into a reaction product and a free enzyme that maintains its specific enzymatic function. Enzymes offer several advantages when used for cleaning the oral cavity. The protease degrades salivary proteins that form on the tooth surface by adsorbing on the tooth surface, thereby forming the first plaque layer. Proteases, along with rivases, destroy bacteria by dissolving proteins and lipids that make up the structural components of bacterial cell walls and membranes. Dextranase degrades the organic framework produced by the bacteria that make up the bed for bacterial attachment. Proteases and amylases not only prevent plaque formation but also prevent the development of stones by breaking down the carbohydrate-protein complex that binds calcium, and thus prevent mineralization. Toothpaste A dentifrice made from the oral care composition of the present invention may typically comprise (in% weight of the final dentifrice composition) the following ingredients: abrasive 10-70% humectant 0-80 % Thickener 0.1-20% Binder 0.01-10% Sweetener 0.1-5% Foaming agent 0-15% Whitening agent 0-5% Enzyme 0.0001-20% In a specific embodiment of the invention, the oral care product Is a dentifrice comprising: a) 10-70% abrasive b) 0-80% humectant c) 0.1-20% thickener d) 0.01-10% binder e) 0.1 to 5% sweetener f) 0 to 15% foaming agent g) 0 to 5% whitening agent i) 0.0001 to 20% enzyme The enzyme of i) is known to use a toothpaste or the like Pullulanase, dextranase and other enzymes. Mouthwash Mouthwash made from the oral care composition of the present invention may typically comprise (in% by weight of the final mouthwash composition) the following ingredients: 0-20% humectant 0-2 % Surfactant 0-5% enzyme 0-20% ethanol 0-2% other ingredients (eg, flavors, sweeteners, active ingredients, eg, fluoride) 0-70% water This mouthwash The composition may be buffered with a suitable buffer, for example, citric acid or sodium phosphate, in the pH range 6-7.5. The mouthwash may be in undiluted form (ie, must be diluted prior to use). Manufacturing Method The oral care compositions and products of the present invention can be manufactured using methods common to the oral care field. Use According to the invention, Bacillus pullulanase is used for the hydrolysis of mutans and also for the prevention and / or removal of plaque. Bacillus pullulanase is preferably utilized in combination with dextranase, sometimes muranase. The compositions and products of the present invention can be used to remove plaque and / or prevent formation. It is within the scope of the present invention to utilize Bacillus pullulanase in food, feed and / or pet food, preferably in combination with dextranase, and sometimes also with mucanase. Materials and Methods Material Pullulanase Promozyme®: Pullulanase from Bacillus acido pluriticus (available from Novo Nordisk) (described in EP 63,909). Optimax®: pullulanase from Bacillus deramificans (from EP 605,040 (Solvay SA)). Enterulacter aerugins pullulanase purchased from Amano JP. Other enzymes: dextranase from Paecilomyces reerasinum (available from Novo Nordisk). Mutanase from Trichoderma harzianum 243.71 (available from Novo Nordisk). Microorganisms: Streptococcus mutans strain CBS 350,71 (or OMZ176) Actinomyces viscosus DSM 43329 Fusobacterium nucleatum subspecies polymorphic DMS 20482 solution Britton-Robinson buffer Eritrosin B (Sigma) Equipment Shaker (Eppendorf Thermomixer, Type 5436) Preparation of Chromameter CR-200 (Minolta) Hydroxyapatite Disk Hydroxyapatite disk is placed in a disk die at a pressure of about 5,900 kg (13,0001 bs) for 5 minutes in a disk die. Prepared by pressing. The disc is baked at 600 ° C. for 4 hours and finally hydrated with sterile deionized water. Sterilize the hydroxyapatite disk in a sterile HA disk at 180 ° C. for 2 hours, hydrate with sterile deionized water, and place in a Nunc tube lid (10 ml volume). Preparation of Mutans Mutans are prepared with Streptococcus mutans CBS 350.71 growing at pH 6.5, 37 ° C. (constantly maintained) at aeration of 75 rpm in a medium comprising the following components: NZ-Case 6.5 g Per liter Yeast extract 6 g / liter (NH 4 ) 2 SO 4 20 g / liter K 2 PO 4 3 g / liter Glucose 50 g / liter Pluronic PE6100 0.1% After 35 hours, add sucrose to a final concentration of 60 g / liter and add glycosyl. Induce transferase. Total fermentation time is 75 hours. The supernatant from the fermentation is centrifuged and filtered (sterilized). Sucrose is then added to the supernatant to a final concentration of 5% (pH adjusted to pH 7.0 with acetic acid) and the solution is stirred at 37 ° C. overnight. The solution is filtered and the insoluble mutan is collected on Provacs and washed thoroughly with deionized water at pH 5 (adjusted with acetic acid) containing 1% sodium benzoate. Finally, the insoluble mutan is lyophilized and ground. The activity measurement, one pullulanase unit Novo (PUN), is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes pullulan under the following standard conditions and liberates reduced carbohydrate with a reducing power equal to 1 micromol / min: Substrate: 0.2% pullulan Temperature: 40 ° C pH: 5.0 Reaction time: 30 minutes Detailed description of this analytical method (AF190) is available on order. Determination of dextranase activity (KDU) One kilogram of Novo dextranase unit (1 KDU) is equivalent to 1 g maltose per hour in the Novo Nordisk method for the determination of dextranase based on the following standard conditions: The amount of enzyme that degrades dextran to produce reducing sugars: Substrate: Dextran 500 (Pharmacia) Reaction time: 20 minutes Temperature: 40 ° C pH: 5.4 Novo Nordisk Detailed description of analytical method (AF120) is available on order Available as needed. Evaluation of Plaque Removal Effect The method used to evaluate the plaque removal effect is based on the method described in JP2250816 by Kao Corporation. According to this method, a hydroxyapatite disc is coated with a biofilm comprising three strains of oral microorganisms (Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus and Fusobacterium nucleatum). To test the plaque removal effect, 0.1% erythrosin B in PBS is used to stain plaque on hydroxyapatite discs red. The intensity of the red color (ie, a * ) is measured with a chromameter CR-200. The maximum a ★ value is 60. Lower values indicate a less intense red color (ie, less plaque). a ★ If the value is zero, there is no red color (ie, no plaque). Example 1 Mutane Hydrolysis The hydrolysis of mutans by two Bacillus pullulanases and one standard bacterial pullulanase from Enterobacter aerogenes was tested alone and in combination with Paecilomyces relasinum dextranase. . The mutan suspension, prepared as described in the "Materials and Methods" section, was dispersed with ultrasonicator in deionized water to form a 2.5% (w / v) substrate suspension. The following enzyme solution dissolved in 10 mM BR buffer was prepared. Optimax® (Bacillus pullulanase): 0.5 and 10 PUN / ml Promozyme® (Bacillus pullulanase): 0.5 and 10 PUN / ml Enterobacter aerogenes pullulanase: 0.5 and 10 PUN / ml Also combined with DU / ml Paecilomyces relasinum dextranase. Further, a 10 mM Britton-Robinson buffer solution (pH 5.5) was prepared. 250 μl of the above enzyme solution and 250 μl of a buffer solution (pH 5.5) were mixed in a microcentrifuge tube. Immediately afterwards, 750 μl of the mutan suspension was added and incubated at 37 ° C. at maximum speed in a shaker. Exactly 15 minutes later, the enzyme reaction was stopped by adding 250 μl of 0.5N HCl. Controls were prepared by adding 0.5N HCl before adding the substrate suspension. Each reaction mixture was centrifuged. The dissolved carbohydrate in the resulting supernatant was determined as glucose according to the Anthrone reaction method (JH Roe, (1955), J. Biol. Chem. 212, p.335). The result is shown in FIG. FIG. 1 shows that each of the two Bacillus pullulanases, Promozyme and Optimax, combined with Paecilomyces dextranase, exerted a synergistic effect when hydrolyzing mutans, while the standard Enterobacter. It can be seen that pullulanase does not play even with the same dextranase. The various documents cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
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(72)発明者 アースリング，ドリット
デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ
エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク
アクティーゼルスカブ────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY,
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(72) Inventor Earth ring, dolit
Daco, Denmark, 2880 Bagsva
Elto, Novo Are, Novo Nordisk
Actiesel Skab