【発明の詳細な説明】
造血性細胞増殖のペプチド阻害剤
発明の背景
テトラペプチドN−Acetyl−Ser−Asp−Lys−Pro(AcS
DKP)は、初めにウシ胎児の骨髄から単離された。レンファント(Lenfa
nt)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:779−78
2(1989)。AcSDKPは、造血幹細胞増殖の負の調節因子であり、S期
への幹細胞の補充を妨げている。フリンデル(Frindel)等、Exp.H
ematol.5:74−76(1977)。AcSDKPは、幹細胞−特異的
増殖刺激因子の作用をブロックしてこの作用を発揮するらしい。ロビンソン等、
細胞増殖(Cell Proliferation)25:623−32(1992)。相−特異的抗
癌剤(例えばAra−Cまたはシスプラチン)または放射線は、細胞が悪性かど
うかにかかわりなく増殖にかかわる細胞に作用する。従って、細胞障害性療法に
おけるAcSDKPの投与は、静止状態にある正常な造血性前駆細胞を保護する
。
発明の要旨
一の概念において、本発明は式の化合物を特徴とする:
ここにおいて、
A1は、SerのD−またはL−異性体の識別基(identifying group)であり、
A2は、AspまたはGluのD−またはL−異性体の識別基であり、
A3は、Lys、ArgまたはOrnのD−またはL−異性体の識別基であり
、
A4は、ProのD−またはL−異性体の識別基であり、
R1は、水素原子、C1-12アルキル、C7-20アリールアルキル、R7COまたは
R7OC(O)であり、R7はC1-12アルキル、C7-20アリールアルキル、もしく
はC1-12アルキル、または、例えば水酸基、CO2HまたはNH2で1から3回置
換したC7-20アリールアルキルであり、
R2は、水素原子、C1-12アルキルまたはC7-20アリールアルキルであり、
各R3およびR4は、それぞれCO−NH、CH2−NH、CH2−S、CH2−
O、CO−CH2、CH2−CO、O−CH2−CH2であり、
R5は、COまたはCH2であり、および
R6は、水酸基、NH2、C1-12アルコキシまたはNH−Y−CH2−Zであり
、Yは分岐を有するまたは直鎖のC1-12炭化水素であり、例えば分岐を有するま
たは直鎖、部分、およびZは水素原子、水酸基、CO2HまたはCONH2であり
、もしR6が水酸基でありR3がCO−NHでありR4がCO−NHであるとき、
R5がCH2であるものが提供され、または製剤学的に許容できるそれらの塩であ
る。
本発明の化合物の具体例には、以下のものがある:
CH3CO−Ser−Ψ(CH2NH)−Asp−Lys−Pro−OH(アナ
ログ1)、
CH3CO−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pro−OH(アナ
ログ2)、
CH3CO−Ser−Asp−Lys−Ψ(CH2N)Pro−OH(アナログ
3)、
CH3CO−Ser−Ψ(CH2NH)−Asp−Lys−Pro−NH2、
CH3CO−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pro−NH2、
CH3CO−Ser−Asp−Lys−Ψ(CH2N)Pro−NH2、
H−Ser−Ψ(CH2NH)−Asp−Lys−Pro−OH、
H−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pro−OH、
H−Ser−Asp−Lys−Ψ(CH2N)−Pro−OH、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Ψ(CH2NH)−Asp−Lys−Pr
o−OH、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pr
o−OH、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Asp−Lys−Ψ(CH2N)Pro−
OH、
H−Ser−Ψ(CH2NH)−Asp−Lys−Pro−NH2、
H−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pro−NH2、
H−Ser−Asp−Lys−Ψ(CH2N)−Pro−NH2、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Ψ(CH2NH)−Asp−Lys−Pr
o−NH2、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pr
o−NH2、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Asp−Lys−Ψ(CH2N)
Pro−NH2、
CH3CO−Ser−Asp−Lys−Pro−NH2、
H−Ser−Asp−Lys−Pro−NH2、
CH3CO−Ser−Asp−Lys−Pro−NHCH3、
H−Ser−Asp−Lys−Pro−NHCH3、
HOOCCH2CH2CO−Ser−Asp−Lys−Pro−NHCH3、お
よび
HOOCCH2CH2CO−Ser−Asp−Lys−Pro−NH2。
N末端基アミノ酸およびProを除いて、この開示におけるアミノ酸の全ての
略記号(例えばAsp)は、−NH−CH(R)−CO−の構造を表し、ここに
おいてRは、アミノ酸の側鎖の「識別基(identifying group)」である(例えば
、SerにおけるCH2OH、AspにおけるCH2COOH、GluにおけるC
H2CH2COOH、ArgにおけるCH2CH2CH2NHC(NH2)NH2、O
rnにおける(CH2)3NH2およびLysにおける(CH2)4NH2)。N末端
基アミノ酸に関し、この略記号は、=N−CH(R)−CO−または−NH−C
H(R)−CO−構造を表示し、ここにおいてRはそのアミノ酸の識別基である
。Proは、プロリルの略記号である。非ペプチド結合または偽ペプチド結合に
よって意味されることは、プロリンのα−アミノ基は含まないが、二つのアミノ
酸残基間のペプチドCO−NH結合は、非ペプチド結合、例えば、CH2−NH
、CH2−S、CH2−O、CO−CH2、CH2−COまたはCH2−CH2(Ψ(
CH2−NH)等により表される)に置換され、または、プロリンのα−アミノ
基を含んで、ペプチド結合のカルボニル基は、CH2(Ψ(CH2−N)で表され
る)に置換されるということである。C1-12アルキルおよびC1-12アルコキシは
、直鎖または分岐を有してもよく、例えばメチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、メトオキシ、エトオキシ、プロポキシまたはイソプロポキ
シである。
C7-20アリールアルキルは、直鎖または分岐を有していてもく、例えばベンジ
ル、ナフチルまたはフェニルエチルである。
本発明の化合物は、造血細胞の増殖を抑制するために使用できる。本発明の化
合物は、細胞障害性薬剤(例えば薬物療法)または放射線(例えば放射線療法)
の治療の間中、造血細胞(例えば幹細胞)を保護するために使うことができる。
本発明の化合物は、細胞障害性薬剤または放射線投与前に投与することができ、
かつ細胞障害性治療または放射線の期間中継続できる。
本発明の化合物は、製剤学的に許容できる塩として提供できる。可能な塩とし
ては、これらに制限されるものではないが、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、
ピロリン酸塩、ハイドロブロマイドまたは硝酸塩等の無機酸の付加塩を含み、ま
たは有機酸、例えばアセテート、マレイン酸エステル、フマル酸塩、酒石酸塩、
スクシナート、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホネート、p−トルエンスルホ
ナート、パルモエート、サリチル酸塩、シュウ酸塩およびステアリン酸塩が含ま
れる。また、本発明の範囲内で、水酸化ナトリウムまたはカリウム等の塩基から
なる塩を使用できる。更なる薬学的に許容できる塩は、ベルグ(Berge)等J.P
harm.Sci.66:1(1977)に例示されている。
本発明の化合物の治療有効量(例えば、造血細胞の増殖を減らす有効量)と製
剤学的許容可能な担体物質(例えば炭酸マグネシウム、乳糖、または、治療薬と
共にミセルを形成できるリン脂質等)は、この化合物を必要とする被検者に投与
(例えば、経口で、静注、経皮、経肺、経膣に、皮下に、経鼻に、イオノフォア
的に、経気管的に)するための治療組成物(例えば丸剤、タブレット、カプセル
または液体)を形成する。
丸剤、タブレットまたはカプセルは、組成物が被検者の小腸で消化されずに通過
できるように、十分な時間、被検者の胃酸や腸の酵素から組成物を保護できる物
質で被覆することができる。この治療組成物は、皮下、筋肉内投与のために生分
解性または徐放薬製剤とすることができる。参照、例えば米国特許3,773,
919および4,767,628および特許協力条約出願番号WO94/001
48。治療組成物を投与するため埋め込み(implantable)ポンプまたは外部ポン
プ(例えばインフサイド(INFUSAIDTM)ポンプ)を使用して継続投与することがで
きる。
本発明の造血細胞を保護するための化合物の用量は、投与方法、被検者の年齢
および体重、状態によって変化し、医師または獣医師によって最終的に決定され
る。ここで医師または獣医師によって、定められた化合物のこの用量を「治療有
効量」という。本発明の化合物は、同様に細胞毒性薬剤または放射線とともに投
与できる。細胞毒性薬剤の例は、これらに制限されるものではないが、ダウノル
ビシン、シクロフォスファミド、タキソール、5−フルオロウラシル、ジオキソ
ルビシン、シスプラチン、メトトレキセート、シトシン、アラビノシド、マイト
マイシンC、プレドニゾン、ビンデシン、カルボプラチナム(carboplatinum)、
ビンクリスチンまたは3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)を含む
。本発明の化合物は、同様にアンギオテンシン変換酵素(ACE)抑制剤ととも
に投与できる。ACE抑制剤の例は、ジャクソン等のレニンおよびアンジオテン
シン(Jackson,et al.,Renin and Angiotensin)、グッドマンとギルマンの治療の
薬理学的基礎、第9版(Gooddman & Gillman's,The Pharmacological Basis of
Therapeutics,9th ed.,ハルディナン(Hardiman)等(MCGraw Hill,1996))に挙げられて
いる。
また本発明に含まれる化合物には、例えば薬物療法、ウイルス治療または放射
線療法等の細胞毒性療法期間中、造血細胞の保護ために用いら
れる上記一般式でカバーされる化合物がある。
本発明の他の特徴および効果は、詳細な説明および請求の範囲から明らかとさ
れる。
発明の詳細な説明
当業者は、この明細書に基づいてその最も広い範囲で本発明を利用できる。従
って、以下の特定の実施例は、単に例示として文言上解釈され、開示内のいかな
る類似方法の他のものを制限するものではない。
定義がない場合には、ここで使われる全ての技術的、科学的用語は、本発明が
属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。また、全て
の刊行物、特許出願、特許およびここで言及される他の引用文は、引用したもの
とする。
合成
短いペプチドの合成はその技術において実施される。本発明のペプチドは、次
の一般的合成手順を用いて合成された。
全ての保護されたアミノ酸を、バーケム(Bachem;Bobendorf、スイス)、カルビオ
ケム(Calbiochem;サンディエゴ、カナダ)またはノババイオケム(NovaBiochem;ラ
ホーヤ、カナダ)から購入した。質量スペクトルは、グリセロール、チオグリセ
ロールまたはニトロベンジルアルコールをマトリックスとするキセノン高速原子
衝撃(FAB)ガンを用いる質量分析計(MS50)を使用して得られた。薄層
クロマトグラフィ(TLC)は、シリカゲルプレコートプレート(60F 25
4、メルク、ダルムシュタット、ドイツ)を用いて行った。
以下の溶媒システムが使われた。:
A) ジクロロメタン/メタノール(95/5)、
B) ジクロロメタン/メタノール9/1、
C) 酢酸エチル/ヘプタン(1/1)、
D) n−ブタノール/酢酸/水(4/1/1)、
および
E) n−ブタノール/酢酸/水/ピリジン(1/1/1/1)。
UV光線、ニンヒドリンおよび/またはパタキ(Pataki)試薬を検出のために使
用した。保護されたペプチドを、メルクシリカゲル60(40−60μm)カラ
ムを用いたクロマトグラフによって精製した。全ての試薬および溶剤は、分析用
グレードのものであり、ナトリウム塩/ベンゾフェノンから蒸留して得たまたは
使用直前に塩基性アルミナカラムでろ過したテトラヒドロフラン(THF)、お
よびニンヒドリンから減圧下に蒸留され、4オングストロームのモレキュラーシ
ーブ下に保存されたジメチルホルムアミド(DMF)を除いて、供給品を使用し
た。保護されたペプチドは、それらの高速原子衝撃(FAB)または二次イオン
質量スペクトル(SIMS)により特定された。高圧液体クロマトグラフィ(H
PLC)による精製は、逆相べックマンウルトラスフェア C−18カラム(粒
子サイズ5μ、10×250mm、ベックマン、フラートン、カナダ)を用い、
アセトニトリルと0.1%トリフルオロ酢酸との混合液の勾配またはイソクラチ
ック溶出で流速3ml/分の溶出より行った。溶出を記録吸光度210ナノメー
トルでモニターした。純粋のペプチドをFABまたはSI質量スペクトルによっ
て特定した。純度制御のためのHPLC解析は、ノバパック(Novapak)カラムC
−18、5μm(3.9×150mm、ウォータース、ミルフォード、MA)で
、水と0.1%のTFAを含有するアセトニトリルとからなる二成分系溶媒シス
テムで流速1ml/分、210nmでモニターして行った。溶剤
プログラムは、次の直線濃度勾配によった。:
1)アセトニトリル0〜50%を50分
2)アセトニトリル0〜80%を40分
k値は、二つの溶媒システムにおいて報告されている。
以下に、N−Ac−Ser−Asp−Ψ(CH2NH)−Lys−Pro−O
H(アナログ2)の合成を説明する。
略記号Ac、Z、Boc、t−ButおよびBzlは、それぞれアセチル、ベ
ンジルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル、tert−ブチルお
よびベンジルを表す。
(1) N−α−(Z)−N−ε−(Boc)−L−リジル−L−プロリン−
tert−ブチルエステル(N-α-(Z)-N-ε-(Boc)-L-lysyl-L-proline-tert-but
ylester)
−15℃に冷やしたZ−Lys(Boc)−OH(2.66g、7mmol)
THF溶液(35ml)に攪拌溶液に、N−メチルモルホリン(0.77ml、
7mmol)を加え、ついで、イソブチルクロロホルメート(0.98ml、7
mmol)を加えた。この溶液を5分間−15℃で攪拌し、−20℃に冷やした
。プロリン第三ブチルエステル(1.32g、7.7mmol)DMF溶液を添
加した。温度を1時間−10℃に保ち、ついで室温に温めた。攪拌5時間後、反
応液を減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル(200ml)および5%クエン酸
(50ml)で溶解した。水層を酢酸エチル(50ml)で抽出した。集めた有
機層を、水、5%炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥
し、ついで減圧下に油状の保護されたジペプチドを得るために濃縮した(3.6
g、収量:96%)。
(2) N−ε−(Boc)−L−リジル−L−プロリン−tert−ブチル
エステル(N-ε-(Boc)-L-lysyl-L-proline-tert-butylester)
ステップ(1)で得た油(1.08g、2mmol)をエタノール(40ml
)に溶かした。10%パラジウム炭素触媒(0.120g)を添加し、ついで、
懸濁液を4時間30分、水素中、大気下に攪拌した。触媒を濾過により取り除き
、濾液を減圧下に濃縮した(0.672g、収量:84%)。
(3) N−α−(Z)−β−(t−But)−L−アスパルチルN,O−ジ
メチルヒドロキサメート(N-α-(Z)-β-(t-But)-L-aspartyl N,O-dimethylhydr
oxamate)
この化合物を製造し、マーティネス(Martines)等が、J.Med chem.
,28:1878(1985)で述べたように、対応するアルデヒドに変換した
。
(4) N−α−(Z)−β−(O−t−But)−L−アスパルチル−Ψ(
CH2NH)−N−ε−(Boc)−L−リジル−L−プロリン−tert−ブ
チルエステル(N-α-(Z)-β-(O-t-But)-L-aspartyl-Ψ(CH2NH)-N-ε-(Boc)-L-ly
syl-L-proline-tert-butylester)
ステップ(3)で得たアルデヒド(2mmol)を、ステップ(2)のジペプ
チド(1mmol)の1%酢酸含有メタノール(MeOH)溶液(7ml)に添
加した。シアノボロハイドライドナトリウム(0.094g)を一部に30分か
けて添加した。2時間以後30分、反応液を攪拌下、氷水中で冷却し、および冷
えた飽和炭酸水素ナトリウム溶液を0℃で添加し、ついで酢酸エチルを添加した
。水層を酢酸エチルで抽出した。プールした有機層を水洗し、Na2SO4で乾燥
し、ついで減圧
下に濃縮した。粗生産物を、所望の生産物(収量:56%)を得るため溶離液と
してCH2Cl2/MeOH(99/1)およびCH2Cl2/MeOH(98/2
)を用いてシリカゲルでクロマトグラフした。
(5) β−(o−t−But)−L−アスパルチル−Ψ(CH2NH)−N
−ε−(t−Boc)−L−リジル−L−プロリン−tert−ブチルエステル
(β-(O-t-But)-L-aspartyl-Ψ(CH2NH)-N-ε-(t-Boc)-L-Iysyl-L-proline-tert-
butylester)
ステップ(4)で得た化合物(0.5mmol)をエタノール(13mL)に
溶解した。10%パラジウム炭素触媒(0.040g)を添加し、懸濁液を24
時間水素中で大気下に攪拌した。追加触媒水溶液(1ml)を添加した。24時
間後、触媒を濾過により除去し、濾液を減圧下に濃縮した(0.277g、収量
100%)。
(6) N−α−(Z)−β−(O−t−But)−L−セリル−β−(O−
t−But)−L−アスパルチル−Ψ(CH2NH)−N−ε−(Boc)−L
−リジル−L−プロリン−tert−ブチルエステル(N-α-(Z)-β-(O-t-But)-
L-seryl-β-(O-t-But)-L-aspartyl-Ψ(CH2NH)-N-ε-(Boc)-L-Iysyl-L-proline-t
ert-butylester)
−15℃に冷却したZ−(O−t−But)−Ser−OH(0.132g、
0.45mmol)TFA溶液(2.5ml)に、N−メチルモルホリン(0.
050ml、0.45mmol)を添加し、ついでイソブチルクロロホルメート
(0.063ml、0.45mmol)を添加した。この溶液を−15℃で5分
間攪拌し、−20℃に冷却した。最少量のジクロロメタンに溶解したステップ(
5)のトリペプチドを添加した。温度を1時間−10℃に維持し、ついで室温に
温めた。5時間の
攪拌の後、反応液を減圧下に濃縮した。残渣を、酢酸エチルおよび5%クエン酸
に溶解した。水層を、酢酸エチル(AcOEt)(50ml)で抽出した。プー
ルした有機層を、水、5%炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、ついでN
a2SO4で乾燥し、白い泡(0.351g)を得るため減圧下に濃縮した。粗生
産物を、AcOEt/ヘキサン(1/1)を溶離液としてシリカゲルでクロマト
グラムした(0.233g、収量:70%)。
(7) β−(O−t−But)−L−セリル−β−(o−t−But)−L
−アスパルチルーΨ(CH2NH)−N−ε−(Boc)−L−リジル−L−プ
ロリン−tert−ブチルエステル(β-(O-t-But)-L-seryl-s-(O-t-But)-L-asp
artyl-Ψ(CH2NH)-N-ε-(Boc)-L-lysyl-L-proline-tert-butylester)
ステップ(6)で得た化合物(0.2mmol)を10%エタノール(4.4
ml)に溶解した。10%パラジウム炭素触媒(0.035g)を添加し、懸濁
液を水素中、大気下に一晩中攪拌した。触媒を濾過によって、除去し、濾液を減
圧下に濃縮した(0.110g)。
(8) N−α−(アセチル)−β−(O−t−BUt)−L−セリル−β−
(O−t−But)−L−アスパルチル−Ψ(CH2NH)−N−ε−(Boc
)−L−リジル−L−プロリン−tert−ブチルエステル(N-α-(acetyl)-β
-(O-t-But)-L-seryl-β-(O-t-But)-L-aspartyl-Ψ(CH2NH)-N-ε-(Boc)-L-lysyl-
L-proline-tert-butylester)
ステップ(7)のアミノ酸(0.110g、0.16mmol)をDMF(0
.4ml)に溶解し、アセチルイミダゾール(0.026g、0.24mmol
)と反応させた。3時間の攪拌後、反応液を酢酸エチ
ルで希釈した。有機層を水と食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下に濃
縮した。粗生産物(0.120g)を、溶離液としてAcOEt/MeOH(9
9/1)を使用しシリカゲルでクロマトグラフした(0.090g、収量:76
%)。
(9) N−α−(アセチル)−L−セリル−L−アスパルチル−Ψ(CH2
NH)−L−リジル−L−プロリンーOH(N-α-(acetyl)-L-seryl-L-aspartyl
-Ψ(CH2NH)-L-lysyl-L-proline-OH)
ステップ(8)で得た化合物(0.086g、0.12mmol)を、TFA
/CH2Cl2(0.4ml)に溶解した。溶液を2時間30分室温で攪拌した。
反応液を減圧下に濃縮した。残渣を乾燥エーテルで粉末し、エーテル除去後、減
圧下に乾燥した。以下の勾配溶媒システムを用いるC18カラムによるHPLC
による精製:アセトニトリル0%から3%を10分かけ、アセトニトリル3%を
15分かけ流速3ml/min(k’(1)=8.17、k’(2)=8)で、
所望のN−アセチル還元テトラペプチドを生産した。
以下は、CH3CO−Ser−Asp−Lys−Pro−NH2(アナログ9)
の合成である。
(1) N−α−ベンジルオキシカルボニル−N−ε−tert−ブトキシカ
ルボニル−L−リジル−L−プロリン−ベンジル−エステル(N-α-Benzyloxyca
rbonyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-proline-benzyl-ester)
−15℃に冷却したZ−Lys(Boc)−OH(1.54g、4mmol)
TFA攪拌溶液を、N−メチルホルモリン0.5ml(4mmol)に添加し、
ついでイソブチルクロロフォルメート0.44mmo
l(4mmol)を添加した。溶液を5分間−15℃で攪拌し、−20℃に冷却
した。ベンジルエステルプロリン塩酸塩(1.06g、4.4mmol)DMF
懸濁液(6mL)を添加し、N−メチルモルホリン(0.48mL、4.4mm
ol)を添加した。温度を−10℃で1時間維持し、ついで室温に温めた。5時
間の攪拌後、反応液を減圧下に濃縮した。残渣を酢酸エチル(120mL)およ
び5%クエン酸(60mL)で溶解した。水層を酢酸エチル(60mL)で抽出
した。併せた有機層を水、5%炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、Na2
SO4で乾燥し、およびシロップを生産物とするよう減圧下に濃縮した。粗生産
物は、1を与えるため、CH2Cl2/MeOH(99/1)を溶出剤としてシリ
カゲルでクロマトグラフした。収量:1.76g(77%)、Rf(CH2Cl2
/MeOH、98/2)−0.22;Rf(AcOEt/ヘプタン、1/1)=
0.24、MS(FAB)m/z=590(MNa+)、568(MH+)、5
12(MH+−But)、468(MH+−Boc)、434(MH+−Z)、
378(MH+−Boc−Bzl)、334(MH+−Boc−Z).
(2) N−ε−tert−ブトキシカルボニル−L−リジル−L−プロリン(
N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-proline)
ステップ(1)(1g、1.75mmol)からの生産物を、10%水性メタ
ノール(33mL)に溶解した。10%パラジウム炭素触媒(0.200g)を
添加し、水素中、大気下に一晩中攪拌した。触媒を濾過によって、除去し、濾液
を減圧下に濃縮した。収量:0.565g(94%)、Rf(n−ブタノール/
酢酸/水、4/1/1)=0.55.MS(FAB)m/z=366(MNa+
)、344(MH+)、288(MH+−BUt)、244(MH+−Boc)
.
(3) N−α−ベンジルオキシカルポニル−β−O−tert−ブチル−L
−アスパルチル−N−ε−tert−ブトキシカルボニル−L−リジル−L−プ
ロリン(N-α-Benzyloxycarbonyl-β-O-tert-butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-Butox
ycarbonyl-L-lysyl-L-proline)
−15℃に冷却したZ−L−Asp(O−t−But)−OH(0.323g
、1mmol)の攪拌溶液にN−メチルモルホリンの0.11mL(1mmol
)を添加し、その後イソブチルクロロホルメートを0.14ml(1mmol)
を添加した。この溶液を5分間−15℃で攪拌し、ついで−20℃に冷却した。
ステップ(2)の生産物を、DMF(2.5mL)溶液に添加した。5時間攪拌
後、反応液を減圧下に濃縮した。残渣を、酢酸エチル(50mL)および5%ク
エン酸(25mL)に溶解した。水層を酢酸エチル(25mL)で抽出した。併
せた有機層を水および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、および白い泡を得
るために減圧下に濃縮した。粗生産物を、CH2Cl2/MeOH/AcOH(9
7/3/0.5)を溶出剤とするシリカゲルでクロマトグラムした。収量:0.
450g(60%)、Rf(CH2Cl2/MeOH/AcOH、97/3/0.
5)=0.11 MS(FAB)m/z=693(M2Na+−H)、671
(MNa+)、615(MNa+−But)、549(MH+−Boc)、53
7(MNa+−Z)、515(MNa+−But−Boc)、493(MH:+
−But−Boc)、437(MNa+−Boc−Z).
(4) N−α−ベンジルオキシカルボニル−β−O−tert−ブチル−L
−アスパルチル−N−ε−tert−ブトキシカルボニル−L−リジル−L−プ
ロリンアミド(N-α-Benzyloxycarbonyl-β-O-tert-
butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
−15℃に冷却したステップ(3)生産物(0.129g、0.2mmol)
のTFA溶液(5ml)をN−メチルモルフォリン0.022mL(0.2mm
ol)に添加し、ついでイソブチルクロロフォルメート0.028mL(0.2
mmol)を添加した。溶液を5分間−15℃で攪拌し、ついで−20℃に冷却
した。0.2mlの冷34%mLアンモニア溶液を添加した。
−10℃以下で1時間攪拌後、さらに0℃以下で反応溶液を減圧下に濃縮した
。残渣を酢酸エチルおよび5%クエン酸で溶解した。水層を酢酸エチルで抽出し
た。併せた有機層を水および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、および減圧
下に白い泡を得るため濃縮した。粗生産物をCH2Cl2/MeOH(95/5)
を溶出剤とするシリカゲルでクロマトグラムした。収量:0.105g(81%
).Rf(CH2Cl2/MeOH、95/5)=0.24、Rf(AcOEt/M
eOH、99/1)=0.45.MS(FAB)m/z=670(MNa+)、
648(MH+)、614(MNa+−But)、548(MH+−Boc)、
534(MH+−proNH2)、514(MH+−Z)、492(MH+−B
ut−Boc).
(5) β−O−tert−ブチル−L−アスパルチル−N−ε−tert−
ブトキシカルボニル−L−リジル−L−プロリンアミド(β-O-tert-butyl-L-as
partyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
ステップ(4)の生産物(0.152g、0.23mmol)をメタノール(
6mL)に溶解し、10%パラジウム炭素触媒(0.030g)を添加しおよび
、懸濁液を2時間、水素中、大気下に攪拌した。触媒をセライトパッドで濾過に
より除去し、および濾液を減圧下に濃縮し
た。収量:0.111g(94%)、Rf(CH2Cl2/MeOH、95/5)
=0.08、Rf(CH2Cl2/MeOH、9/1)=0.35.MS(FAB
)m/z=536(MNa+)、514(MH+)、480(MNa+−But
)、458(NH+−But)、414(MH+−Boc)、400(MH+−
proNH2).
(6) N−α−ベンジルオキシカルボニル−L−セリル−β−O−tert−
ブチル−L−アスパルチル−N−ε−tert−ブトキシカルボニル−L−リジ
ル−L−プロリンアミド(N-α-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-β-O-tcrt-butyl-L
-aspartyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
−15℃に冷却したZ−L−Ser−OH(0.045g、0.19mmol
)THF攪拌溶液(1ml)にN−メチルモルホリン0.021mL(0.19
mmol)を添加し、ついでイソブチルクロロホルメート0.026mL(0.
19mmol)を添加した。溶液を5分間−15℃で攪拌し、ついで−20℃に
冷却した。ステップ(5)の生産物(0.105g、0.2mmol)をDMF
(1mL)に添加した。
5時間攪拌後、反応液を減圧下に濃縮した。反応液を酢酸エチル(50mL)
および5%クエン酸(25mL)に溶解した。水層を酢酸エチル(25mL)で
抽出した。併せた有機層は、水および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、お
よび減圧下に濃縮した。粗生産物を、CH2Cl2/MeOH(94/6)を溶出
剤としてシリカゲルで精製した。収量:0.140g(80%).Rf(CH2C
l2/MeOH、95/5)=0.18、Rf(CH2Cl2/MeOH、9/1)
=0.43.MS(FAB)m/z=757(MNa+)、735(MH+)、
701(MNa+−But)、635(MH+−Boc)、601(MH+
−Z)、579(MH+−But−Boc)、501(MH+−Boc−Z)、
465(MH+−Boc−But−ProNH2).
(7) N−α−アセチル−L−セリル−s−O−tert−ブチル−L−ア
スパルチル−N−ε−tert−ブトキシカルボニル−L−リジル−L−プロリ
ンアミド(N-α-acetyl-L-seryl-s-O-tert-butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-Butoxy
carbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
ステップ(6)の生産物(0.080g、0.011mmol)を酢酸エチル
AcOEt(2mL)に溶解した。10%パラジウム炭素触媒(0.016g)
とアセチルイミダゾール(0.014g、0.013mmol)を添加し、懸濁
液を水素中、大気下に一晩攪拌した。触媒をセライトパッドの濾過によって、除
去し、濾液を減圧下に濃縮した。粗生産物をCH2Cl2/MeOH(9/1)を
溶出剤とするゲルカラムで精製した。収量:0.050g(71%)、Rf(C
H2Cl2/MeOH、9/1)=0.29.MS(FAB)m/z=665(M
Na+)、643(MH+)、609(MNa+−But)、543(MH+−
Boc)、487(MH+−But−Boc)、373(MH+−Boc−Bu
t−ProNH2).
(8) N−α−アセチル−L−セリル−L−アスパルチル−L−リジル−L
−プロリンアミド(N-α-acetyl-L-seryl-L-aspartyl-L-lysyl-L-prolincamide
)
ステップ(7)の生産物(0.039g、0.06mmol)の20μlの水
を含有するトリフルオロ酢酸溶液200μlを、95分間室温で攪拌した。反応
液を減圧下に濃縮し、および残渣を二回乾燥エーテルで粉末にした。エーテルを
除去した後、固形の白残渣を1.5ml水に
とり凍結乾燥した。粗ペプチドを3ml.min-1の流速の二つの溶媒(A:H2
0/0.1%TFA、B:アセトニトリル0.1%TFA;100%20分、
tR=13分)からなる溶離液システムを用いるC−18カラム、ベックマン
ウルトラスフェアーODS(10x250mm)のHPLCによって精製した。
集めた分画を凍結乾燥し、ウォータースノバパックC−18カラム(ウォーター
ス、ミルフォード、MA)4μ、80λ(3.9のx150mm)、上記と同じ
溶媒システムを使用する二つの異なる溶出プログラムで、1ml.min-1流速
によって、HPLC分析した。k=8.4、100〜50%のAを50分;k=
7.1、100〜20%のAを40分;MS(FAB)m/z=509(MNa
+)、487(MH+).
他の置換基は、公知技術の類似方法によるペプチドN末端基に同様に添加され
る。例えば、N−α−(HOOCCH2CH2CO)−β−(O−t−But)−
L−Ser−β−(O−t−But)−L−アスパルチル−Ψ(CH2NH)−
N−ε−(Boc)−L−リジル−L−プロリン−OHは、最少量のCH2Cl2
に溶解した前記ステップ(7)のアミンと無水コハク酸のTFA溶液とを混合す
ることにより合成される。反応液を室温で攪拌し、ついで混合物を減圧下に蒸留
する。残渣をAcOEtに溶解し、5%クエン酸、水、食塩水で洗浄し、ついで
Na2SO4で乾燥する。結果化合物を、所望の生産物を得るために脱保護する。
本発明の他のペプチドは、類似の方法で当業者により提供される。
AcSDKPアナログの生物的活性 本発明の化合物の活性を、ネズミ原始造血
細胞のS期に入ることをインビトロで抑制する能力により評価した。サイタルの
静止幹細胞を誘発
するために、正常ネズミ骨髄細胞(ダルベッコ培地、5x106 cells/
ml)を刺激培地(全身に4.5グレイX線照射量を照射された亜致死照射マウ
スから得た骨髄細胞の調整培地)、またはコントロールとしてダルベッコ培地の
同量でインキュベートした。試験化合物をインキュベーションの初めに2x10-9
Mの最終濃度で添加した。インキュベーションを、一組の試験管に3時間、3
7℃で行った。インキュベーション終了1時間前に、S期の細胞を最初にセット
した試験管の最終濃度25/1g/mlのシトシンアラビノシド(Ara−C)
を添加して殺した。ダルベッコ培地をコントロールとして、他の試験管に添加し
た。Ara−Cによるインキュベーションは、S期に誘発された細胞を死に導く
。従ってアナログの作用でサイクルを妨害された細胞は、Ara−Cの相−特異
的毒性に感受性がない。細胞を次のHPP−CFC分析の前に2回洗浄した。
HPP−CFCは、ロビンソン等、Cell Prolif.25:623−
632、1992に記載されるように、二層半固体寒天分析を用いて行った。2
0%ウマ血清を含有する2ミリリットルのダルベッコ培地、WEHI3B骨髄単
球性白血病細胞株(IL−3/マルチCSFのソースとして)の10%調整培地
、L929線維芽細胞細胞株(M−CSF/CSF1のソースとして)の10%
調整培地、0.5%溶解寒天、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシ
リンおよび100μg/mlストレプトマイシンを、直径55mmの非組織培養
グレードプラスチックシャーレに下層として等分した。20%ウマ血清を補った
ダルベッコ培地2ミリリットル、0.3%溶解寒天、2mM L−グルタミン、
100U/mlペニシリンおよび4x104の骨髄細胞を含有する100μg/
mlストレプトマイシンを、下層の上に等分した。4つの培地を5%CO2の大
気圧下、充分に加湿し37℃で14日間培養
した。培養終了前12時間前に、無色1mg/ml 2−(4−ヨードフェニル
)−3−(4−ニトロフェニル)−5−フェニルテトラゾリウム塩化物(INT
)生理食塩水溶液の1mlを添加し、INT処理により生細胞を細胞内に沈殿す
る赤色物で染色する。HPP−CFC誘導された巨視的コロニーを、直径2mm
上のものと定義し記録した。表Iは、試験化合物によって、S期に誘導されたH
PP−CFC誘導巨視的コロニーのパーセント減少を示す。
他の実施例
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は例示であり本
発明を限定するものではなく、添付の請求の範囲により特定されるものである。
他の概念、効果および修正が、請求の範囲内に含まれる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Peptide inhibitors of hematopoietic cell proliferation
Background of the Invention
Tetrapeptide N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (AcS
DKP) was originally isolated from fetal bovine bone marrow. Lenfant
nt) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 779-78
2 (1989). AcSDKP is a negative regulator of hematopoietic stem cell proliferation,
Preventing the recruitment of stem cells to the See Frindel et al., Exp. H
ematol. 5: 74-76 (1977). AcSDKP is a stem cell-specific
It seems to exert this effect by blocking the action of growth stimulating factors. Robinson et al.
Cell Proliferation 25: 623-32 (1992). Phase-specific anti
Cancer agents (eg, Ara-C or cisplatin) or radiation can detect whether a cell is malignant.
Acts on cells involved in proliferation regardless of how it is. Therefore, for cytotoxic therapy
Administration of AcSDKP in Protects Normal Hematopoietic Progenitor Cells at Rest
.
Summary of the Invention
In one concept, the invention features, a compound of the formula:
put it here,
A1Is an identifying group for the D- or L-isomer of Ser;
ATwoIs a distinguishing group for the D- or L-isomer of Asp or Glu,
AThreeIs a discriminating group for the D- or L-isomer of Lys, Arg or Orn.
,
AFourIs a distinguishing group for the D- or L-isomer of Pro;
R1Is a hydrogen atom, C1-12Alkyl, C7-20Arylalkyl, R7CO or
R7OC (O) and R7Is C1-12Alkyl, C7-20Arylalkyl or
Is C1-12Alkyl or, for example, hydroxyl, COTwoH or NHTwoPlace one to three times
Replaced C7-20Arylalkyl,
RTwoIs a hydrogen atom, C1-12Alkyl or C7-20Arylalkyl,
Each RThreeAnd RFourIs CO-NH, CHTwo-NH, CHTwo-S, CHTwo−
O, CO-CHTwo, CHTwo-CO, O-CHTwo-CHTwoAnd
RFiveIs CO or CHTwoAnd
R6Is a hydroxyl group, NHTwo, C1-12Alkoxy or NH-Y-CHTwo-Z
, Y is a branched or straight chain C1-12Hydrocarbons, for example,
Or Z is a hydrogen atom, a hydroxyl group, CO 2TwoH or CONHTwoIs
, If R6Is a hydroxyl group and RThreeIs CO-NH and RFourIs CO-NH,
RFiveIs CHTwoOr a pharmaceutically acceptable salt thereof.
You.
Specific examples of compounds of the present invention include:
CHThreeCO-Ser-Ψ (CHTwoNH) -Asp-Lys-Pro-OH (ana
Log 1),
CHThreeCO-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pro-OH
Log 2),
CHThreeCO-Ser-Asp-Lys-Ψ (CHTwoN) Pro-OH (analog
3),
CHThreeCO-Ser-Ψ (CHTwoNH) -Asp-Lys-Pro-NHTwo,
CHThreeCO-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pro-NHTwo,
CHThreeCO-Ser-Asp-Lys-Ψ (CHTwoN) Pro-NHTwo,
H-Ser-Ψ (CHTwoNH) -Asp-Lys-Pro-OH,
H-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pro-OH,
H-Ser-Asp-Lys-Ψ (CHTwoN) -Pro-OH,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Ψ (CHTwoNH) -Asp-Lys-Pr
o-OH,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pr
o-OH,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Asp-Lys-Ψ (CHTwoN) Pro-
OH,
H-Ser-Ψ (CHTwoNH) -Asp-Lys-Pro-NHTwo,
H-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pro-NHTwo,
H-Ser-Asp-Lys-Ψ (CHTwoN) -Pro-NHTwo,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Ψ (CHTwoNH) -Asp-Lys-Pr
o-NHTwo,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pr
o-NHTwo,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Asp-Lys-Ψ (CHTwoN)
Pro-NHTwo,
CHThreeCO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHTwo,
H-Ser-Asp-Lys-Pro-NHTwo,
CHThreeCO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCHThree,
H-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCHThree,
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHCHThree,
And
HOOCCHTwoCHTwoCO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHTwo.
All of the amino acids in this disclosure, except for the N-terminal amino acid and Pro
The abbreviation (e.g., Asp) represents the structure -NH-CH (R) -CO-, where
R is the "identifying group" of the side chain of the amino acid (eg,
, CH in SerTwoOH, CH in AspTwoCOOH, C in Glu
HTwoCHTwoCOOH, CH in ArgTwoCHTwoCHTwoNHC (NHTwo) NHTwo, O
(CH at rnTwo)ThreeNHTwoAnd Lys (CHTwo)FourNHTwo). N-terminal
With respect to the base amino acid, this abbreviation is = N—CH (R) —CO— or —NH—C
Denotes the H (R) -CO- structure, where R is the discriminating group of the amino acid
. Pro is the abbreviation for prolyl. For non-peptide or pseudo-peptide bonds
It is thus meant that the α-amino group of proline is not included, but two amino acids
Peptide CO-NH bonds between acid residues are non-peptide bonds, such as CHTwo-NH
, CHTwo-S, CHTwo-O, CO-CHTwo, CHTwo-CO or CHTwo-CHTwo(Ψ (
CHTwo-NH) or the like, or α-amino of proline
Group, including the carbonyl group of the peptide bondTwo(Ψ (CHTwo−N)
). C1-12Alkyl and C1-12Alkoxy is
, Which may be linear or branched, such as methyl, ethyl,
Pill, isopropyl, methoxy, ethoxy, propoxy or isopropoxy
It is Shi.
C7-20Arylalkyl can be straight-chain or branched, for example, benzyl
, Naphthyl or phenylethyl.
The compounds of the present invention can be used to inhibit the growth of hematopoietic cells. Embodiment of the present invention
The compound may be a cytotoxic agent (eg, a drug therapy) or radiation (eg, a radiation therapy)
Can be used to protect hematopoietic cells (eg, stem cells) throughout the treatment of.
The compound of the present invention can be administered prior to administration of the cytotoxic agent or radiation,
And can be continued during cytotoxic treatment or radiation.
The compounds of the present invention can be provided as pharmaceutically acceptable salts. Possible salt
Although not limited to these, for example, hydrochloride, sulfate, phosphate,
Includes addition salts of inorganic acids such as pyrophosphate, hydrobromide or nitrate.
Or organic acids such as acetate, maleate, fumarate, tartrate,
Succinate, citrate, lactate, methanesulfonate, p-toluenesulfo
Contains naat, palmoate, salicylate, oxalate and stearate
It is. Also, within the scope of the present invention, from a base such as sodium or potassium hydroxide
Can be used. Further pharmaceutically acceptable salts are described in Berge et al. P
harm. Sci. 66: 1 (1977).
A therapeutically effective amount of a compound of the invention (eg, an effective amount to reduce hematopoietic cell proliferation) and
Pharmaceutically acceptable carrier materials (eg, magnesium carbonate, lactose, or therapeutic agents)
Phospholipids that can form micelles) are administered to subjects in need of this compound.
(Eg, oral, intravenous, transdermal, pulmonary, vaginal, subcutaneous, nasal, ionophore
(Eg, pills, tablets, capsules)
Or liquid).
Pills, tablets or capsules pass through the composition without digestion in the subject's small intestine
A substance that can protect the composition from gastric acid and intestinal enzymes in the subject for a sufficient amount of time to
Quality. This therapeutic composition is used for subcutaneous and intramuscular administration.
It can be a degradable or sustained release drug formulation. See, for example, US Pat.
919 and 4,767,628 and Patent Cooperation Treaty Application No. WO 94/001
48. Implantable pump or external pump to administer the therapeutic composition
(For example, INFUSAIDTM) Pump) can be administered continuously
Wear.
The dose of the compound for protecting hematopoietic cells of the present invention depends on the method of administration, the age of the subject.
And may vary by weight, condition and ultimately determined by a physician or veterinarian
You. The doctor or veterinarian may now enter this dose of the compound as
"Efficacy". The compounds of the present invention may also be administered with cytotoxic drugs or radiation.
Can be given. Examples of cytotoxic drugs include, but are not limited to,
Bicine, cyclophosphamide, taxol, 5-fluorouracil, dioxo
Rubicin, cisplatin, methotrexate, cytosine, arabinoside, mites
Mycin C, prednisone, vindesine, carboplatinum,
Contains vincristine or 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT)
. The compounds of the present invention may also be used with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors.
Can be administered. Examples of ACE inhibitors include renin and angiotensin such as Jackson.
Singh (Jackson, et al., Renin and Angiotensin), for the treatment of Goodman and Gilman
Pharmacological Basics, 9th Edition (Gooddman & Gillman's, The Pharmacological Basis of
Therapeutics, 9th ed., Hardinan (Hardiman) et al. (MCGraw Hill, 1996)
I have.
Also included in the compounds included in the present invention are, for example, drug therapy, viral therapy or radiation.
Used to protect hematopoietic cells during cytotoxic therapy such as radiotherapy
There are compounds covered by the above general formula.
Other features and advantages of the invention will be apparent from the detailed description and from the claims.
It is.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Those skilled in the art can, based on this description, utilize the present invention in its broadest scope. Obedience
Thus, the following specific examples are to be interpreted literally by way of example only, and
It is not intended to limit other similar methods.
Unless defined, all technical and scientific terms used herein are not intended to
It has the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which it belongs. Also all
Publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference.
And
Synthesis
The synthesis of short peptides is performed in the art. The peptide of the present invention comprises:
Was synthesized using the general synthetic procedure of
All protected amino acids were purchased from Bachem (Bobendorf, Switzerland), Calbio
Chem (Calbiochem; San Diego, Canada) or NovaBiochem (La
Hoya, Canada). Mass spectra are glycerol, thioglycer
Xenon fast atom with roll or nitrobenzyl alcohol as matrix
Obtained using a mass spectrometer (MS50) with a shock (FAB) gun. Thin layer
Chromatography (TLC) was performed on silica gel pre-coated plates (60F 25
4, Merck, Darmstadt, Germany).
The following solvent system was used. :
A) dichloromethane / methanol (95/5),
B) dichloromethane / methanol 9/1,
C) ethyl acetate / heptane (1/1),
D) n-butanol / acetic acid / water (4/1/1),
and
E) n-butanol / acetic acid / water / pyridine (1/1/1/1).
UV light, ninhydrin and / or Pataki reagents are used for detection.
Used. The protected peptide was purified using Merck silica gel 60 (40-60 μm)
The product was purified by chromatography using a chromatography. All reagents and solvents are analytical
Grade, obtained by distillation from sodium salt / benzophenone or
Tetrahydrofuran (THF) filtered through a basic alumina column immediately before use, and
And distilled under reduced pressure from ninhydrin and 4 Å molecular weight
Use the supplies except for dimethylformamide (DMF) stored under
Was. Protected peptides may have their fast atom bombardment (FAB) or secondary ion
Specified by mass spectrum (SIMS). High pressure liquid chromatography (H
Purification by PLC) is performed on a reversed-phase Beckman Ultrasphere C-18 column (particles).
Child size 5μ, 10 × 250 mm, Beckman, Fullerton, Canada)
Gradient or isocratic mixture of acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid
The elution was performed at a flow rate of 3 ml / min. Record elution at 210 nm
Monitored in torr. Pure peptides are analyzed by FAB or SI mass spectra.
Identified. HPLC analysis for purity control was performed using Novapak column C
-18, 5 μm (3.9 × 150 mm, Waters, Milford, Mass.)
, A binary solvent system consisting of water and acetonitrile containing 0.1% TFA
Monitoring was performed at 210 nm with a flow rate of 1 ml / min. solvent
The program relied on the following linear concentration gradient. :
1) Acetonitrile 0-50% for 50 minutes
2) Acetonitrile 0-80% for 40 minutes
The k value is reported in a two solvent system.
Hereinafter, N-Ac-Ser-Asp-Ψ (CHTwoNH) -Lys-Pro-O
The synthesis of H (analog 2) will be described.
Abbreviations Ac, Z, Boc, t-But and Bzl are acetyl,
Benzyloxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, tert-butyl and
And benzyl.
(1) N-α- (Z) -N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-
tert-butyl ester (N-α- (Z) -N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-tert-but
ylester)
Z-Lys (Boc) -OH cooled to -15 ° C (2.66 g, 7 mmol)
To a stirred solution of a THF solution (35 ml) was added N-methylmorpholine (0.77 ml,
7 mmol), followed by isobutyl chloroformate (0.98 ml, 7 mmol).
mmol). The solution was stirred at -15 ° C for 5 minutes and cooled to -20 ° C
. Proline tert-butyl ester (1.32 g, 7.7 mmol) in DMF was added.
Added. The temperature was kept at -10 ° C for 1 hour and then warmed to room temperature. After 5 hours of stirring,
The reaction solution was concentrated under reduced pressure. The residue was washed with ethyl acetate (200 ml) and 5% citric acid
(50 ml). The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (50ml). Yu collected
The organic layer was washed with water, 5% sodium bicarbonate and brine,TwoSOFourDry with
And then concentrated under reduced pressure to give an oily protected dipeptide (3.6
g, yield: 96%).
(2) N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-tert-butyl
Ester (N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-tert-butylester)
The oil (1.08 g, 2 mmol) obtained in step (1) was added to ethanol (40 ml).
). 10% palladium on carbon catalyst (0.120 g) was added, followed by
The suspension was stirred for 4 hours 30 minutes in hydrogen under air. Remove catalyst by filtration
The filtrate was concentrated under reduced pressure (0.672 g, yield: 84%).
(3) N-α- (Z) -β- (t-But) -L-aspartyl N, O-di
Methyl hydroxamate (N-α- (Z) -β- (t-But) -L-aspartyl N, O-dimethylhydr
oxamate)
This compound was prepared and described by Martinez et al. Med chem.
, 28: 1878 (1985).
.
(4) N-α- (Z) -β- (Ot-But) -L-aspartyl-Ψ (
CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-tert-butyl
Cyl ester (N-α- (Z) -β- (O-t-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L-ly
syl-L-proline-tert-butylester)
The aldehyde (2 mmol) obtained in the step (3) is added to the dipep
To a solution (7 ml) of 1% acetic acid in methanol (MeOH) containing 1% acetic acid
Added. 30 minutes of sodium cyanoborohydride (0.094g)
And added. After 2 hours and 30 minutes, the reaction solution was cooled in ice water with stirring, and cooled.
The obtained saturated sodium hydrogen carbonate solution was added at 0 ° C., and then ethyl acetate was added.
. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate. Wash the pooled organic layer with waterTwoSOFourDry with
Then decompress
Concentrated down. The crude product is combined with the eluent to obtain the desired product (yield: 56%).
And CHTwoClTwo/ MeOH (99/1) and CHTwoClTwo/ MeOH (98/2
) Was chromatographed on silica gel.
(5) β- (ot-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N
-Ε- (t-Boc) -L-lysyl-L-proline-tert-butyl ester
(Β- (O-t-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (t-Boc) -L-Iysyl-L-proline-tert-
butylester)
The compound (0.5 mmol) obtained in step (4) is added to ethanol (13 mL).
Dissolved. 10% palladium on carbon catalyst (0.040 g) was added and the suspension was
Stirred under hydrogen in air for hours. Additional aqueous catalyst solution (1 ml) was added. 24:00
After a while, the catalyst was removed by filtration and the filtrate was concentrated under reduced pressure (0.277 g, yield).
100%).
(6) N-α- (Z) -β- (Ot-But) -L-seryl-β- (O-
t-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L
-Lysyl-L-proline-tert-butyl ester (N-α- (Z) -β- (O-t-But)-
L-seryl-β- (O-t-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L-Iysyl-L-proline-t
ert-butylester)
Z- (Ot-But) -Ser-OH (0.132 g,
0.45 mmol) TFA solution (2.5 ml) in N-methylmorpholine (0.
050 ml, 0.45 mmol), followed by isobutyl chloroformate
(0.063 ml, 0.45 mmol) was added. This solution is kept at -15 ° C for 5 minutes.
While stirring and cooled to -20 ° C. Step dissolved in a minimum amount of dichloromethane (
5) Tripeptide was added. Maintain the temperature at -10 ° C for 1 hour and then to room temperature
Warmed up. 5 hours
After stirring, the reaction solution was concentrated under reduced pressure. The residue is treated with ethyl acetate and 5% citric acid
Was dissolved. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (AcOEt) (50 ml). Pooh
Washed organic layer with water, 5% sodium bicarbonate and brine,
aTwoSOFourAnd concentrated under reduced pressure to give a white foam (0.351 g). Crude
The product was chromatographed on silica gel using AcOEt / hexane (1/1) as eluent.
(0.233 g, 70% yield).
(7) β- (Ot-But) -L-seryl-β- (ot-But) -L
-Aspartyl II (CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-p
Loline-tert-butyl ester (β- (O-t-But) -L-seryl-s- (O-t-But) -L-asp
artyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-tert-butylester)
The compound (0.2 mmol) obtained in step (6) was added to 10% ethanol (4.4
ml). Add 10% palladium on carbon catalyst (0.035 g) and suspend
The solution was stirred in hydrogen under air overnight. The catalyst was removed by filtration and the filtrate was reduced.
Concentrated under pressure (0.110 g).
(8) N-α- (acetyl) -β- (Ot-BUt) -L-seryl-β-
(Ot-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (Boc
) -L-Lysyl-L-proline-tert-butyl ester (N-α- (acetyl) -β
-(O-t-But) -L-seryl-β- (O-t-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH) -N-ε- (Boc) -L-lysyl-
L-proline-tert-butylester)
The amino acid of step (7) (0.110 g, 0.16 mmol) was added to DMF (0
. Acetylimidazole (0.026 g, 0.24 mmol)
). After stirring for 3 hours, the reaction solution was washed with ethyl acetate.
Diluted with water. The organic layer was washed with water and brine,TwoSOFourAnd concentrated under reduced pressure.
Shrank. The crude product (0.120 g) was eluted with AcOEt / MeOH (9
9/0) and chromatographed on silica gel (0.090 g, yield: 76).
%).
(9) N-α- (acetyl) -L-seryl-L-aspartyl-{(CHTwo
NH) -L-lysyl-L-proline-OH (N-α- (acetyl) -L-seryl-L-aspartyl
-Ψ (CHTwoNH) -L-lysyl-L-proline-OH)
Compound (0.086 g, 0.12 mmol) obtained in step (8) was added to TFA
/ CHTwoClTwo(0.4 ml). The solution was stirred for 2 hours 30 minutes at room temperature.
The reaction was concentrated under reduced pressure. The residue is triturated with dry ether,
Dry under pressure. HPLC on a C18 column using the following gradient solvent system
Purification by: acetonitrile 0% to 3% over 10 minutes, acetonitrile 3%
At a flow rate of 3 ml / min (k '(1) = 8.17, k' (2) = 8) over 15 minutes,
The desired N-acetyl reduced tetrapeptide was produced.
The following is CHThreeCO-Ser-Asp-Lys-Pro-NHTwo(Analog 9)
Is a synthesis of
(1) N-α-benzyloxycarbonyl-N-ε-tert-butoxyca
Rubonyl-L-lysyl-L-proline-benzyl-ester (N-α-Benzyloxyca
rbonyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-proline-benzyl-ester)
Z-Lys (Boc) -OH (1.54 g, 4 mmol) cooled to -15 ° C
The stirring solution of TFA is added to 0.5 ml (4 mmol) of N-methylformoline,
Then 0.44 mmol of isobutyl chloroformate
1 (4 mmol) was added. Stir solution at −15 ° C. for 5 minutes and cool to −20 ° C.
did. Benzyl ester proline hydrochloride (1.06 g, 4.4 mmol) DMF
Suspension (6 mL) was added and N-methylmorpholine (0.48 mL, 4.4 mm
ol) was added. The temperature was maintained at -10 <0> C for 1 hour, then warmed to room temperature. 5 o'clock
After stirring during this time, the reaction solution was concentrated under reduced pressure. The residue was washed with ethyl acetate (120 mL) and
And 5% citric acid (60 mL). Extract the aqueous layer with ethyl acetate (60 mL)
did. The combined organic layers were washed with water, 5% sodium bicarbonate and brine,Two
SOFourAnd the syrup was concentrated under reduced pressure to produce the product. Crude production
Thing gives CH to give 1.TwoClTwo/ MeOH (99/1)
Chromatographed on Kagel. Yield: 1.76 g (77%), Rf(CHTwoClTwo
/ MeOH, 98/2) -0.22; Rf(AcOEt / heptane, 1/1) =
0.24, MS (FAB) m / z = 590 (MNa +), 568 (MH +), 5
12 (MH + -But), 468 (MH + -Boc), 434 (MH + -Z),
378 (MH + -Boc-Bzl), 334 (MH + -Boc-Z).
(2) N-ε-tert-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-proline (
N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-proline)
The product from step (1) (1 g, 1.75 mmol) is added to 10% aqueous meta
Dissolved in knol (33 mL). 10% palladium on carbon catalyst (0.200 g)
Was added and stirred in hydrogen under air overnight. The catalyst is removed by filtration and the filtrate
Was concentrated under reduced pressure. Yield: 0.565 g (94%), Rf(N-butanol /
(Acetic acid / water, 4/1/1) = 0.55. MS (FAB) m / z = 366 (MNa +
), 344 (MH +), 288 (MH + -BUt), 244 (MH + -Boc)
.
(3) N-α-benzyloxycarbonyl-β-O-tert-butyl-L
-Aspartyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-p
Lorin (N-α-Benzyloxycarbonyl-β-O-tert-butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-Butox
ycarbonyl-L-lysyl-L-proline)
ZL-Asp (Ot-But) -OH (0.323 g) cooled to −15 ° C.
0.11 mL (1 mmol) of N-methylmorpholine
) And then add 0.14 ml (1 mmol) of isobutyl chloroformate
Was added. The solution was stirred at -15 ° C for 5 minutes and then cooled to -20 ° C.
The product of step (2) was added to a DMF (2.5 mL) solution. Stir for 5 hours
Thereafter, the reaction solution was concentrated under reduced pressure. The residue was taken up in ethyl acetate (50 mL) and 5%
Dissolved in enic acid (25 mL). The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (25mL). Both
The combined organic layers were washed with water and brine,TwoSOFourDry and get white foam
For concentration under reduced pressure. The crude product isTwoClTwo/ MeOH / AcOH (9
7/3 / 0.5) as the eluent. Yield: 0.
450 g (60%), Rf(CHTwoClTwo/ MeOH / AcOH, 97/3/0.
5) = 0.11 MS (FAB) m / z = 693 (M2Na + -H), 671
(MNa +), 615 (MNa + -But), 549 (MH + -Boc), 53
7 (MNa + -Z), 515 (MNa + -But-Boc), 493 (MH: +
-But-Boc), 437 (MNa + -Boc-Z).
(4) N-α-benzyloxycarbonyl-β-O-tert-butyl-L
-Aspartyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-p
Lorinamide (N-α-Benzyloxycarbonyl-β-O-tert-
butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
Step (3) product cooled to −15 ° C. (0.129 g, 0.2 mmol)
Of TFA solution (5 ml) in 0.022 ml (0.2 mm) of N-methylmorpholine
ol) and then 0.028 mL (0.2%) of isobutyl chloroformate.
mmol) was added. Stir the solution for 5 minutes at -15 ° C, then cool to -20 ° C
did. 0.2 ml of cold 34% mL ammonia solution was added.
After stirring at -10 ° C or lower for 1 hour, the reaction solution was further concentrated at 0 ° C or lower under reduced pressure.
. The residue was dissolved with ethyl acetate and 5% citric acid. Extract the aqueous layer with ethyl acetate
Was. The combined organic layers were washed with water and brine,TwoSOFourDry and vacuum
Concentrated to give a white foam below. CH to crude productTwoClTwo/ MeOH (95/5)
Was chromatographed on silica gel using as eluent. Yield: 0.105 g (81%
). Rf(CHTwoClTwo/ MeOH, 95/5) = 0.24, Rf(AcOEt / M
MeOH, 99/1) = 0.45. MS (FAB) m / z = 670 (MNa +),
648 (MH +), 614 (MNa + -But), 548 (MH + -Boc),
534 (MH + -proNHTwo), 514 (MH + -Z), 492 (MH + -B)
ut-Boc).
(5) β-O-tert-butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-
Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolinamide (β-O-tert-butyl-L-as
partyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
The product of step (4) (0.152 g, 0.23 mmol) was converted to methanol (
6%), add 10% palladium on carbon catalyst (0.030 g) and
The suspension was stirred under hydrogen in the atmosphere for 2 hours. Filter catalyst through Celite pad
And the filtrate is concentrated under reduced pressure.
Was. Yield: 0.111 g (94%), Rf(CHTwoClTwo/ MeOH, 95/5)
= 0.08, Rf(CHTwoClTwo/ MeOH, 9/1) = 0.35. MS (FAB
) M / z = 536 (MNa +), 514 (MH +), 480 (MNa + -But)
), 458 (NH + -But), 414 (MH + -Boc), 400 (MH +-
proNHTwo).
(6) N-α-benzyloxycarbonyl-L-seryl-β-O-tert-
Butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-L-lysine
Ru-L-prolinamide (N-α-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-β-O-tcrt-butyl-L
-aspartyl-N-ε-tert-Butoxycarbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
ZL-Ser-OH cooled to −15 ° C. (0.045 g, 0.19 mmol
) 0.021 mL (0.19 mL) of N-methylmorpholine was added to a stirred THF solution (1 mL).
mmol) and then 0.026 mL of isobutyl chloroformate (0.
19 mmol) was added. The solution was stirred at -15 ° C for 5 minutes, then brought to -20 ° C.
Cool. The product of step (5) (0.105 g, 0.2 mmol) was added to DMF
(1 mL).
After stirring for 5 hours, the reaction solution was concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (50 mL)
And 5% citric acid (25 mL). Aqueous layer with ethyl acetate (25 mL)
Extracted. The combined organic layers were washed with water and brine,TwoSOFourAnd dry
And concentrated under reduced pressure. The crude product isTwoClTwo/ MeOH (94/6)
Purified on silica gel as an agent. Yield: 0.140 g (80%). Rf(CHTwoC
lTwo/ MeOH, 95/5) = 0.18, Rf(CHTwoClTwo/ MeOH, 9/1)
= 0.43. MS (FAB) m / z = 757 (MNa +), 735 (MH +),
701 (MNa + -But), 635 (MH + -Boc), 601 (MH +
-Z), 579 (MH + -But-Boc), 501 (MH + -Boc-Z),
465 (MH + -Boc-But-ProNH)Two).
(7) N-α-acetyl-L-seryl-s-O-tert-butyl-LA
Spartyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-proli
Namide (N-α-acetyl-L-seryl-s-O-tert-butyl-L-aspartyl-N-ε-tert-Butoxy
carbonyl-L-lysyl-L-prolineamide)
The product of Step (6) (0.080 g, 0.011 mmol) was added to ethyl acetate
Dissolved in AcOEt (2 mL). 10% palladium on carbon catalyst (0.016 g)
And acetylimidazole (0.014 g, 0.013 mmol) were added and suspended.
The solution was stirred in hydrogen under air overnight. The catalyst was removed by filtration through a celite pad.
The filtrate was concentrated under reduced pressure. CH to crude productTwoClTwo/ MeOH (9/1)
Purification was performed using a gel column as an eluent. Yield: 0.050 g (71%), Rf(C
HTwoClTwo/ MeOH, 9/1) = 0.29. MS (FAB) m / z = 665 (M
Na +), 643 (MH +), 609 (MNa + -But), 543 (MH +-
Boc), 487 (MH + -But-Boc), 373 (MH + -Boc-Bu)
t-ProNHTwo).
(8) N-α-acetyl-L-seryl-L-aspartyl-L-lysyl-L
-Prolinamide (N-α-acetyl-L-seryl-L-aspartyl-L-lysyl-L-prolincamide
)
20 μl of water of the product of step (7) (0.039 g, 0.06 mmol)
200 μl of a trifluoroacetic acid solution containing was stirred at room temperature for 95 minutes. reaction
The liquid was concentrated under reduced pressure and the residue was triturated twice with dry ether. Ether
After removal, the solid white residue is taken up in 1.5 ml water.
And lyophilized. 3 ml of crude peptide. min-1Of two solvents (A: HTwo
0 / 0.1% TFA, B: acetonitrile 0.1% TFA; 100% for 20 minutes,
C-18 column using an eluent system consisting of tR = 13 minutes), Beckman
Purified by HPLC on Ultrasphere ODS (10 × 250 mm).
The collected fractions were lyophilized and subjected to a Watersnova Pack C-18 column (water
, Milford, MA) 4μ, 80λ (3.9 x 150mm), same as above
In two different elution programs using a solvent system, 1 ml. min-1Flow velocity
Was analyzed by HPLC. k = 8.4, 100-50% A for 50 minutes; k =
7.1, 100-20% A for 40 min; MS (FAB) m / z = 509 (MNa
+), 487 (MH +).
Other substituents are similarly added to the peptide N-terminal by analogous methods of the prior art.
You. For example, N-α- (HOOCCHTwoCHTwoCO) -β- (Ot-But)-
L-Ser-β- (Ot-But) -L-aspartyl-Ψ (CHTwoNH)-
N-ε- (Boc) -L-lysyl-L-proline-OH has a minimum amount of CHTwoClTwo
The amine of step (7) dissolved in the above and a TFA solution of succinic anhydride are mixed
Are synthesized by The reaction was stirred at room temperature, then the mixture was distilled under reduced pressure
I do. The residue was dissolved in AcOEt, washed with 5% citric acid, water and brine, then
NaTwoSOFourDry with. The resulting compound is deprotected to obtain the desired product.
Other peptides of the invention are provided in a similar manner by those skilled in the art.
Biological activity of AcSDKP analogs The activity of the compounds of the invention is
The entry of cells into S phase was assessed by their ability to suppress in vitro. Cytal
Induces quiescent stem cells
To do this, normal murine bone marrow cells (Dulbecco's medium, 5 × 106 cells /
ml) with a stimulation medium (sublethal irradiated mouse irradiated with 4.5 Gray X-ray irradiation over the whole body).
Medium for the preparation of bone marrow cells obtained from culture) or Dulbecco's medium as a control.
Incubated in equal volume. The test compound is added 2 × 10 at the beginning of the incubation.-9
M was added at a final concentration. Incubate for 3 hours in a set of tubes, 3 hours
Performed at 7 ° C. One hour before the end of incubation, set S-phase cells first
Cytosine arabinoside (Ara-C) at a final concentration of 25/1 g / ml in a test tube
Was added and killed. Add Dulbecco's medium to another test tube as a control.
Was. Incubation with Ara-C leads to death of cells induced in S phase
. Thus, cells disrupted in the cycle by the action of the analogs will exhibit Ara-C phase-specificity.
Insensitive to chemical toxicity. Cells were washed twice before the next HPP-CFC analysis.
HPP-CFC is described in Robinson et al., Cell Prolif. 25: 623-
632, 1992, using a two-layer semi-solid agar assay. 2
2 ml Dulbecco's medium containing 0% horse serum, WEHI3B bone marrow
10% conditioned medium of a leukemia cell line (as a source of IL-3 / multi-CSF)
, 10% of L929 fibroblast cell line (as source of M-CSF / CSF1)
Conditioned medium, 0.5% dissolved agar, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penic
Phosphorus and 100 μg / ml streptomycin were added to 55 mm diameter non-tissue culture
It was equally divided as a lower layer in a grade plastic petri dish. Supplemented with 20% horse serum
Dulbecco's medium 2 ml, 0.3% dissolved agar, 2 mM L-glutamine,
100 U / ml penicillin and 4 × 10Four100 μg /
ml streptomycin was aliquoted over the lower layer. 4 media with 5% COTwoLarge
Cultivate well under atmospheric pressure and cultivate at 37 ° C for 14 days
did. Twelve hours before the end of the culture, colorless 1 mg / ml 2- (4-iodophenyl)
) -3- (4-Nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium chloride (INT
1) Add 1 ml of physiological saline solution and precipitate viable cells into cells by INT treatment.
Stain with a red material. HPP-CFC induced macroscopic colonies were 2 mm in diameter
Defined above and recorded. Table I shows that the test compound induced H in S phase.
Figure 2 shows the percentage reduction of PP-CFC-induced macroscopic colonies.
Other embodiments
Although the invention has been described in conjunction with its detailed description, the above description is illustrative and not restrictive.
It is not intended to limit the invention, but to be defined by the appended claims.
Other concepts, effects, and modifications are within the scope of the claims.
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(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 5/06 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,
CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,H
U,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ
,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,
MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM
,TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN
(72)発明者 ジクザク―バカラ,ジョアンナ
フランス国,エフ―75012 パリ,アベニ
ュー ドゥ セー―メーデ,9
(72)発明者 ボーテェ,ピエール
フランス国,エフ―75007 パリ,アベニ
ュー ドゥ ブレトール,14
(72)発明者 ランファト,マリース
フランス国,エフ―91190 ジフ―シル―
イベック,リュ デ シャテンジェ,18
(72)発明者 グリジョー,カトリーヌ
フランス国,エフ―91300 マシ,リュ
ジャン―メルモズ,4──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/06 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, K , KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Zigzag-Baccarat, Joanna France, F-75012 Paris, Avenue de Saymede, 9 (72) Inventor Beauté, Pierre France, F-75007 Paris, Avenue de Bretol, 14 (72) Inventor Ranphate, Maries France, F-91190 Difcir-Ibec, Rue des Chatensier, 18 (72) Inventor Grigio , Catherine France, F-91300 Mashi, Ryu Jean-Mermoz, 4