JP2002515063A

JP2002515063A - 予め決定されたｄｎａ配列にナノモル以下の濃度で結合するポリアミド

Info

Publication number: JP2002515063A
Application number: JP54701098A
Authority: JP
Inventors: ダーヴァン，ピーター・ビー
Original assignee: カリフォルニア・インスティチュート・オブ・テクノロジー
Priority date: 1997-04-06
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 2002-05-21
Also published as: CA2286232A1; EP0986539A1; WO1998049142A1

Abstract

(57)【要約】ヒトゲノム中の任意の予め決定された配列にナノモル以下の親和性で特異的に結合し、分子生物学およびヒト医薬において潜在的用途を有する式（Ｉ）の新規小分子ポリアミドが記載される。さらに、設計された化合物は、Ｂ−形二本らせんＤＮＡのマイナーグルーブを標的とし、遺伝子発現の制御の一般的アプローチを提供する。簡単な規則が開示され、これはＮ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールアミノ酸を含む合成ポリアミドのＤＮＡ−結合配列特異性の合理的制御を提供する。ポリアミド設計のための一連の分子テンプレートが開示され、これは予め決定されたＤＮＡ配列を、配列特異的ＤＮＡ−結合蛋白質、例えば転写因子と匹敵する親和性および特異性で認識する小分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】予め決定されたＤＮＡ配列にナノモル以下の濃度で結合するポリアミド発明の分野本発明は、分子生物学、生化学、および薬剤設計の分野に関する。より詳細には、本発明は、転写因子等のＤＮＡ結合蛋白質に匹敵する親和性および特異性をもって二重らせんＤＮＡの特定の塩基対配列に結合するピロールおよびイミダゾールアミノ酸を含む合成ポリアミドを提供する。治療における可能性を有する任意の予め決定されたＤＮＡ配列の合理的標的化を可能とする一連の分子テンプレートが記載される。ＤＮＡ認識へのこの非生物学的アプローチは遺伝子発現の制御のための合成細胞透過性リガンドの設計の基盤を提供する。発明の背景各ヒト細胞においては、遺伝情報はひも状のＤＮＡポリマー上に保存されており、これは、約１メートルの長さであり、３×１０⁹ユニットの情報を塩基対の形で含む。この中では、約８０，０００−１００，０００個の遺伝子または指令の組がコードされている(Watson，J.D．Gene，135，309-315(1993))。転写因子等の蛋白質のＤＮＡとの特異的相互作用は、遺伝子の、したがって細胞プロセスの制御を調節する(Roeder，R.G．TIBS，9，327-335(1996))。癌からウイルス感染にわたる広範な種類のヒトの状態は、遺伝子発現を制御する生化学的機構の機能不全に起因する(R.Tjian，Sci.Am.，2，54-61(1995))。特定のＤＮＡ配列を標的とする設計された二官能性小分子は、プラスミド、遺伝子、ｃＤＮＡ、コスミド、または染色体の、遺伝子特異的、配列特異的、または生物特異的な、修飾、検出または捕獲のための一般的アプローチを提供する可能性がある。より詳細には、生命を脅かす疾患は、二重らせん中に保存された３ ×１０⁹単位の情報中の１つの誤りから生ずるかもしれない。配列特異的ポリアミドは、そのような小さい誤りを判別することができ、したがって、二官能性ポリアミドは、生命を脅かす疾患の分子的基礎の決定から、生きている生物中での疾患遺伝子の配列特異的可視化までにわたる広い診断用途を有することができる。Ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎによる、マイナーグルーブ中のＡ，Ｔリッチ配列の認識の概略的描写を以下に示す。発明の概要本発明は、分子に選択的に結合する改良されたポリアミドを提供する。本発明の化合物は次式: ［式中、Ｒ¹，Ｒ^a，Ｒ^b，Ｒ^e，Ｒ^f，Ｒⁱ，Ｒ^j，Ｒⁿ，およびＲ^oは、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ −アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，およびC_1-6アルキニルから独立して選択され；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，およびＮ−ホルミルからなる群より選択され；Ｒ³，Ｒ^d，Ｒ¹およびＲ^qは、独立して、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，Ｏｍｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，ＣＨ₂ＮＨ₂からなる群より選択され；Ｒ⁴は、−ＨＮ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0- ₆ ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨＲ⁵またはＮＨ（ＣＨ₂）₂ＣＯＮＨＲ⁵であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，Ｃ_1-6Ｌから選択され、Ｌ基は、独立して、ビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋）−α−トコフェラール，およびＣ_1-6アルキニルから選択され、ｒは０−６の整数であり；Ｘ，Ｘ^a，Ｘ^b，Ｘ^e，Ｘ^f，Ｘⁱ，Ｘ^j，Ｘⁿ，Ｘ^oは、独立して、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，ＣＦからなる群より選択され；そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｉ，ｊ，ｋ，およびｍは、独立して０−５の整数である］のポリアミドまたはその薬学的に許容しうる塩を含む。本発明はまた、次式：［式中、Ｒ¹，Ｒ^a(i,m)およびＲ^b(j,m)は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ₁ _-6 アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，およびＣ_1-6アルキニルから選択され；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，およびＮ−ホルミルからなる群より選択され；Ｒ^f(m)およびＲ^c(k,m)は、独立して、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，Ｏｍｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，ＣＨ₂ＮＨ₂からなる群より選択され；Ｒ⁴は、-ＮＨ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0-6 ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨＲ⁵またはＮＨ（ＣＨ₂）₂ＣＯＮＨＲ⁵であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，Ｃ_1-6Ｌから選択され、Ｌ基は、独立して、ビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋）−α−トコフェラール，およびＣ_1-6アルキニルから選択され、ｒは、０−６の整数であり；Ｘ，Ｘ^a(i,m)およびＸ^b(j,m)は、独立して、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，ＣＦからなる群より選択され；そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏおよびｐは、独立して０−５の整数である］のポリアミドまたはその薬学的に許容しうる塩を含む。本発明において、「アルキル」または「低級アルキル」とは、Ｃ_1-6アルキル、すなわち、１−６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシルおよび３−メチルペンチルが挙げられる。好ましいＣ_1-6アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、シクロプロピルまたはシクロプロピルメチルである。特に好ましいものは、メチル、エチル、およびプロピル等のＣ₁−Ｃアルキル基である。図面の簡単な説明図２．ヘアピンポリアミド。図５．拡張されたヘアピンポリアミド。図６．拡張されたヘアピンポリアミドの結合プロファイル。図８．８環ヘアピンポリアミドの結合モデルの概要。図９．８残基ヘアピンポリアミド。図１０．４−β−４ポリアミドの構造。図１１．４−β−４ポリアミドによるＤＮＡの認識。図１２．β／β対の配置。図１３．β−結合完全オーバーラップポリアミド複合体。図１４．１０環ヘアピンポリアミド．図１５．ポリアミドによる７塩基対配列の判別。図１６．７塩基対配列を認識するヘアピンポリアミド。図１７．ＤｎａｓｅＩフットプリント滴定。図１８．Ｎｉ（ＩＩ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ修飾ポリアミド。図１９．ブロモアセチル化ヘアピンポリアミド。図２３．ＣＢＩ−ポリアミドコンジュゲートの合成。図２４．二官能性メチジウム−ポリアミドコンジュゲートの合成。図２５．ポリアミド−ローダミンコンジュゲートの合成。図２６．ポリアミド−ＤＹＥコンジュゲートの構造。図２７．ビオチン−ポリアミドコンジュゲートの合成。図２８．二官能性ビオチン−ポリアミドコンジュゲート。図２９．二官能性ビオチン−ポリアミドコンジュゲートを用いるアフィニティー捕獲。図３０．ソラーレン−ポリアミドコンジュゲート。図３１．ポリアミドの協調的二量体化。図３２．ポリアミドのミスマッチ部位への結合。図３３．ポリアミドのフットプリント滴定。図３４．一般化しうるポリアミドモチーフ。図３５．ポリアミドの例。図３６．ポリアミド親和性の判定。図３７．Ｎ−末端拡張ポリアミド。図３８．ポリアミド結合１６塩基対配列。図３９．１６塩基対配列の決定。図４０．ポリアミドのミスマッチ部位への結合。図４１．ポリアミド中のβ−置換。図４２．β−置換ポリアミドの親和性判定。図４３．ポリアミドのＴＡＴＡボックスへの結合。好ましい態様の詳細な説明本出願において、別途記載しない限り本出願の用語および説明は幾つかの周知の文献のいずれか、たとえば下記のものにみられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，アカデミック・プレス，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９１）；ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＤｅｕｔｓｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．編，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミック・プレス，カリフォルニア州サンディエゴ（１９８９）；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，アカデミック・プレス，カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｐｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版，アラン・リス社，ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７）；Ｍｕｒｒａｙ，Ｅ．Ｊ．編，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ザ・ヒューマナ・プレス社，ニュージャージー州クリフトン；およびＬｅｗｉｎ，Ｂ．，ＧｅｎｅｓＶＩ，オックスフォード大学出版社，ニューヨーク（１９９７）。本出願の目的に関し、プロモーターは、遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する、ＤＮＡの調節配列である。遺伝子は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の産生に関与するＤＮＡセグメントであり、コード領域、このコード領域の前（リーダー）または後（トレイラー）の非コード領域、および各コードセグメント（エキソン）間に介在する非コード配列（イントロン）を含む。コードするとは、３塩基“トリプレット”コードのアミノ酸開始および終止シグナルの提示を意味する。プロモーターは対応する遺伝子の転写開始部位の上流（５’側）にあることが多い。プロモーターのほか他のＤＮＡ調節配列が知られている。これには、誘導性因子が結合するＤＮＡ配列である応答エレメントを含む、転写因子結合に関与する配列が含まれる。エンハンサーはさらに他の群のＤＮＡ調節配列を構成し、これらはプロモーターの利用を高め、プロモーターに対しいずれの方向にも（５’−３’または３’−５’）、またいかなる位置でも（上流または下流）機能できる。好ましくは、調節配列は正の活性をもつ。すなわち内因性リガンド（たとえば転写因子）が調節配列に結合すると、転写が高まり、これにより対応するターゲット遺伝子の発現が高まる。このような場合、調節配列にポリアミドが結合することにより転写が妨害されると、遺伝子発現が低下または停止するであろう。プロモーターは、当技術分野でサイレンサーとして知られる調節配列を含むか、またはそれに隣接することもある。サイレンサー配列は、一般に遺伝子発現に対し負の調節作用をもつ。このような場合、因子がサイレンサー調節配列に結合するのを阻止するポリアミドを用いて直接に、または因子がサイレンサー調節配列に転写されるのを遮断するポリアミドを用いて間接的に、遺伝子発現を高めることができる。本発明のポリアミドは二本鎖ＤＮＡに配列特異的に結合することを理解すべきである。ある配列のＤＮＡセグメント、たとえば５’−ＴＡＴＡＡＡ−３’の機能は、ＤＮＡ配列中における他の機能性領域に対するそれの位置に依存する。この場合、配列５’−ＴＡＴＡＡＡ−３’がＤＮＡコード鎖上で転写開始部位の約３０塩基対上流に位置すると、その配列はプロモーター領域の一部を形成する( Ｌｅｗｉｎ，ＧｅｎｅｓＶＩ，ｐｐ．８３１−８３５)。これに対し、配列５ ’−ＴＡＴＡＡＡ−３’がコード領域中の転写開始部位の下流にあり、かつリーディングフレームに対し適正な位置にあると、その配列はチロシルおよびリシルアミノ酸残基をコードする（Ｌｅｗｉｎ，ＧｅｎｅｓＶＩ，ｐｐ．２１３−２１５）。１仮説に固執するわけではないが、本発明のポリアミドが結合すると、ＤＮＡ結合性タンパク質、たとえばＲＮＡポリメラーゼ、転写因子、ＴＢＦ、ＴＦＩＩＩＢその他のタンパク質の結合を変化させることにより、遺伝子発現が調節されると考えられる。二本鎖ＤＮＡセグメントへのポリアミド結合が遺伝子発現に与える影響は、そのＤＮＡセグメントの機能、たとえばプロモーターに関係があると考えられる。本発明の改良ポリアミドが前記ＤＮＡセグメントのいずれにも、または遺伝子発現に際し目的とする効果をもつ他のいずれの配列にも結合しうることは、当業者に理解されるであろう。さらに米国特許第５，５７８，４４４号には、本発明の改良ポリアミドをターゲティングするための塩基対配列をそれから同定できる、多数のプロモーターターゲティング配列が記載されている。生細胞中におけるＤＮＡの基本構造には主溝と副溝が含まれることは、当業者に一般に理解されている。本発明を記載する目的に関し、副溝は、一般的な分子生物学の参考文献、たとえばLｅｗｉｎ，Ｂ．，ＧｅｎｅｓＶＩ，オックスフォード大学出版社，ニューヨーク（１９９７）に示される狭いＤＮＡ溝である。細胞の遺伝子発現に影響を与えるには（遺伝子発現の増強または低下のいずれを引き起こすことも含む）、有効量の1種類またはそれ以上のポリアミドを細胞と接触させ、細胞にインターナリゼーションさせる。細胞をインビボまたはインビトロのいずれでも接触させることができる。遺伝子発現を調節しうるポリアミドの細胞外有効濃度は、約１０ナノモル濃度から約１マイクロモル濃度に及ぶ。Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３８７，２０２−２０５（１９９７）。インビトロでのポリアミドの有効量および濃度を判定するには、適切な数の細胞を組織培養プレートに接種し、１種類またはそれ以上の種々の量のポリアミドを別個のウェルに添加する。ポリアミド暴露後の遺伝子発現は、細胞中または培地中において、特異的抗体を用いる種々の方法（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを含む）で測定した遺伝子生成物であるタンパク質の存在量を検出することにより監視できる。あるいは、ポリアミド暴露後の遺伝子発現は、種々の方法（ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲを含む）で測定したメッセンジャーＲＮＡの存在量を検出することにより監視できる。同様にインビボ投与のためのポリアミドの有効量および濃度を判定するには、身体組織または体液の試料、たとえば血漿、血液、尿、脳脊髄液、唾液、または皮膚、筋肉、肝臓、脳その他の適切な組織源の生検材料を分析する。ポリアミド暴露後の遺伝子発現は、細胞中または培地中において、特異的抗体を用いる種々の方法（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを含む）で測定した遺伝子生成物であるタンパク質の存在量を検出することにより監視できる。あるいは、ポリアミド暴露後の遺伝子発現は、種々の方法（ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲを含む）で測定したメッセンジャーＲＮＡの存在量を検出することにより監視できる。本発明のポリアミドは、インビボまたはインビトロで用いる診断用および療法用組成物中に配合できる。代表的な配合方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ,第１９版，マック・パブリシング社，ペンシルベニア州イーストン（１９９５）中にみられる。インビボ用として、処置を必要とする患者に投与するか、または医療もしくは研究の目的で動物に投与する生理学的に許容しうる薬剤組成物中に、ポリアミドを含有させることができる。ポリアミド組成物は薬剤学的に許容しうるキャリヤー、賦形剤、佐剤、安定剤およびビヒクルを含む。組成物は固体、液体、ゲルまたはエーロゾルの形であってよい。本発明のポリアミド組成物は種々の剤形で、経口、非経口、吸入スプレーにより、直腸または局所に投与できる。本明細書中で用いる非経口という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内への注入法、または腹腔内投与が含まれる。厳密な濃度、組成および送達方式の選択は、選択したその化合物の個々の薬理学的特性、意図する用途、処置または診断する状態の性質および程度、意図するレシピエントの年齢、体重、性別、身体状態および精神明瞭度、ならびに投与経路により、特に影響される。そのような考慮は当業者が容易になしうる。たとえば投与方式は広範に及びうるが、標準法によりルーティンに決定できる。本発明のポリアミドは、診断または調製の目的で特定配列の二本鎖ＤＮＡの存在を検出するのにも有用である。二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、固体支持体に結合したポリアミドを接触させ、これにより目的配列を含むＤＮＡを単離することができる。あるいは、適切な検出可能なマーカー、たとえばビオチン、ハプテン、放射性同位体または色素分子に結合したポリアミドに、二本鎖ＤＮＡを含有する試料を接触させることができる。２官能性の配列特異的ＤＮＡ結合性分子を設計するには、認識活性と機能活性という２つの別個のものを統合する必要がある。予め定めた二本鎖ＤＮＡ配列の副溝にナノモル濃度未満の親和性で特異的に結合するポリアミドを官能性分子に結合させて、分子生物学、ゲノム配列決定およびヒト用医薬に有用な対応する２官能性結合体を得る。本発明のポリアミドは、下記のものから独立して選ばれる多様な官能性分子（これらに限定されない）に結合させることができる：アリールボロン酸、ビオチン、約２〜８個のアミノ酸からなるポリヒスチジン、抗体が結合するハプテン、固相支持体、オリゴデオキシヌクレオチド、Ｎ−エチルニトロソ尿素、フルオレセイン、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ＤＬ− α−リポ酸、アクリジン、カプトテシン、ピレン、マイトマイシン、テキサスレッド、アントラセン、アントリニル酸、アビジン、ＤＡＰＩ、イソスルファンブルー、マラカイトグリーン、プソラレン、エチルレッド、４−（プソラエン−８ −イルオキシ）−ブチラート、酒石酸、（＋）−α−トコフェラール、プソラレン、ＥＤＴＡ、メチジウム、アクリジン、Ｎｉ（ＩＩ）Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、ＴＯ、ダンシル（Ｄａｎｓｙｌ）、ピレン、Ｎ−ブロモアセトアミド、および金粒子。このような２官能性ポリアミドは、ＤＮＡアフィニティー捕獲、ＤＮA 共有結合修飾、酸化的ＤＮＡ開裂、ＤＮＡ光開裂に有用である。このような２官能性ポリアミドは、ＤＮＡ検出にも有用である。すなわち、検出可能な標識に結合したポリアミドを調製し、次いで標識ポリアミドに複合体形成したＤＮＡを当業者に周知の適切な検出系により判定できる。たとえばビオチンに結合したポリアミドと会合したＤＮＡは、ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ系により検出できる。本発明はまた、身体試料（たとえば脳組織、細胞懸濁液または組織切片）または体液試料（たとえばＣＦＳ、血液、血漿または血清）中において、その存在を検出するのが望まれる二本鎖ＤＮＡに本発明のポリアミドが結合したものの存在、好ましくは試料中の二本鎖ＤＮＡに本発明のポリアミドが結合したものの量を、本明細書に記載する診断法に従ってアッセイするための診断系、好ましくはキットの形のものを記載する。診断系には、少なくとも１回のアッセイを行うのに十分な量の特異的ポリアミドが、別個にパッケージされた試薬として含まれる。パッケージされた試薬（１またはそれ以上）の使用指示書も一般に含まれる。本明細書において用いる“パッケージ”という用語は、固体マトリックス、たとえばガラス、プラスチック（たとえばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネート）、紙、箔など、本発明のポリアミドを一定の区画内に保持できるものを意味する。たとえばパッケージは、ミリグラム量の意図するポリアミドを収容するのに用いるガラスバイアルであってよい。またはパッケージは、マイクログラム量の意図するポリアミドが作動可能な状態で固定された、すなわちターゲットＤＮＡ配列が結合しうるように結合したマイクロタイタープレートウェルであってよい。“使用指示書 ”には、一般に試薬濃度、または少なくとも１つのアッセイ法パラメーター、たとえば混合すべき試薬と試料の相対量、試薬または試料混合物の保持期間、温度、緩衝液条件などを記載した明確な表現が含まれる。本発明の診断系には、好ましくは検出可能な標識、および本発明の意図するポリアミドがターゲットＤＮＡ配列に結合したことを示しうる検出または指示手段も含まれる。前記のように、多数の検出可能な標識、たとえばビオチン、および検出または指示手段、たとえば酵素結合（直接または間接）ストレプトアビジンが当技術分野で周知である。Ｔｒａｕｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，３８２：５５９−５６１）およびＳｗａｌｌｅｙら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：６９５３−６９６１）は、ナノモル濃度未満の濃度の特定のポリアミドによるＤＮＡ認識につき記載している。特異的カルボキシアミド基の対合により、特定のＤＮＡ配列を認識できる（Ｓｗａｌｌｅｙら、前掲）。Ｈｐ、ＩｍおよびＰｙを含むポリアミドは、予め定めたＤＮＡ配列を高い親和性および選択性でコード化ターゲティングする。ＩｍおよびＰｙポリアミドは、結合してＩｍ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍ，Ｐｙ／Ｐｙ結合対を形成でき、これらが４つのワトソン−クリック対Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに相補対合する。表１にそのような対合を示す。先行技術の基本的ポリアミド対合法則は、ナノモル未満の結合親和性をもつターゲット部位を認識するリガンドの設計には不十分である。ポリアミド設計のための追加の第２世代法則を本明細書に示す。それぞれの追加法則単独では、ナノモル未満の親和性をもつポリアミドの設計には不十分であろう。しかし本明細書に示す第２世代設計法則を同時適用すると、ポリアミド設計のための多数の多能分子鋳型を構築できる。Ｂｏｃ−β−アラニン−Ｐａｍ−樹脂から合成したヘアピンポリアミド、ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは、Ｃ−末端β−アラニンを欠如する親化合物ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−Ｄｐと比較して高い親和性および特異性で結合することが見いだされた（ＤＮＡの副溝を認識するヘアピンポリアミドの最適設計．Ｍ．Ｅ．Ｐａｒｋｓ，Ｅ．Ｅ．ＢａｉｒｄおよびＰ．Ｂ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：６１４７（１９９６））。より詳細には、ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは、見掛けの一次会合定数Ｋ_a＝３×１０⁸Ｍ^-1で結合する。これは親ポリアミドＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−ＤＰのＫ_a＝８×１０⁷Ｍ^-1より４倍大きい。さらに、ＩｍＰｙＰｙ− γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは、１塩基対５’−ＴＧＡＣＡ−３’不適正対合部位と比較して６０倍の特異性でターゲット５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正対合部位を結合する。これを、これらの同じ２つのＤＮＡ部位に対し２４倍の特異性をもつ親ポリアミドＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−Ｄｐと対比できる。適度に増大したＣ−末端β−アラニンポリアミドの結合親和性は、β−アラニンカルボキシアミドと結合部位の“第６”塩基対との間の追加の水素結合により生じると思われる。本発明の３環または４環の改良されたポリアミドは、共有結合して、それぞれ６環または８環構造を形成し、これらはそれぞれ４または６塩基対の標的にナノモル以下の濃度で特異的に結合する。このようにして、本発明の改良されたポリアミドは、Ａ，Ｃ，Ｇ，またはＴから構成される任意のＤＮＡ配列に向けることができる。１つの態様においては、本発明は、それぞれ共有結合して一般構造Ｉ−ＸＸＶＩＩＩの６環または８環ヘアピン構造を形成する３環または４環ポリアミド構造を有する改良されたポリアミドを含む。［式中、Ｘ_1-12はイミダゾール、例えばＮ−メチルイミダゾールカルボキサミド（Ｉｍ）、またはピロール、例えばＮ−メチルピロールカルボキサミド（Ｐｙ）である。本発明の改良されたポリアミドはまた、ジメチルアミノプロピルアミド（Ｄｐ）等のアミド基に結合したＣ−末端脂肪族アミノ酸、例えばβ−アラニン残基（β）を含んでいてもよい。さらに、本発明の改良されたポリアミドは、さらにγ−アミノ酪酸（Ｙ）残基に結合した脂肪族アミノ酸、例えばβ−アラニン残基（β）またはグリシン（Ｇ）、ジメチルアミノプロピルアミド（Ｄｐ）等のアミド、ＥｔＯＨ等のアルコール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の酸、またはこれらの任意の誘導体を含んでいてもよい。合成法においてβ−アラニンを用いることにより、芳香族／脂肪族対形成（Ｉｍ／β,β／Ｉｍ，Ｐｙ／β,およびβ／Ｐｙ）および脂肪族／脂肪族対形成（β ／β）置換が得られる。γ−アミノ酪酸または置換γ−アミノ酪酸、例えば（Ｒ）−２，４ジアミノ酪酸を用いることにより、好ましいヘアピンターンが得られる。本発明の実施の目的に適当な他の多くの基が、当業者によく知られており、広く入手可能である。上述のポリアミドサブユニット構造Ｉ−ＸＸＶＩＩＩは、γ残基を介して共有結合させることができ、これは、γ−アミノ酪酸に由来する−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸に由来するキラルヘアピン連結を表す。本発明は、あるポリアミドのα−残基を（Ｒ）− ２，４，−ジアミノ酪酸（（Ｒ）^H2Nγ等の部分で置換する試薬および方法論を提供する。５'−ＴＧＴＴＡ−３'標的部位と複合体化した配列組成ImPyPy-γ-Py PyPyのヘアピンポリアミドのＮＭＲ構造は、ヘアピン−ＤＮA複合体中のγ−アミノ酪酸残基のα−位を置換することが可能であることを示した(de C1aire，et al．J．Am．Chem．Soc．1997，119，7909)。モデリングは、γのα−Ｈをアミノ基で置き換えるとα−炭素においてＲ−コンフィギュレーションを与え、マイナーグルーブの床および壁の中に適応しうることを示す。式Ｉ−ＸＸＶＩＩＩのポリアミドはまた、二官能性基にコンジュゲートさせることができる。二官能性基としては、アリールボロン酸，ビオチン，２−８アミノ酸のポリヒスチジン，抗体が結合するハプテン，固相支持体，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，カプトテシン，ピレン，マイトマイシン，テキサスレッド，アントラセン，アントリニル酸，アビジン，ＤＡＰＩ，イソスルファンブルー，マラカイトグリーン，ソラーレン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，または（＋）−α−トコフェラールが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の実施の目的に適当な多くの他の基が、当業者にはよく知られており、広く入手可能である。本明細書において用いる場合、「ポリアミド」は、以下に掲げるサブユニットを含むポリマーを表す。［式中、Ｒ¹は、Ｃ_1-100アルキル（好ましくはＣ_1-10アルキル、例えばメチル，エチル，イソプロピル），Ｃ_1-100アルキルアミン（好ましくはＣ_1-10アルキルアミン、例えばエチルアミン），Ｃ_1-100アルキルジアミン（好ましくはＣ_1-10アルキルジアミン、例えばＮ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン），Ｃ_1-100アルキルカルボキシレート（好ましくはＣ_1-10アルキルカルボキシレート、例えば−ＣＨ₂ＣＯＯＨ），Ｃ_1-100アルケニル（好ましくはＣ_1-10アルケニル、例えばＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂），Ｃ_1-100アルキニル（好ましくはＣ_1-10アルキニル、例えばＣＨ₂Ｃ≡ ＣＨ₃），またはＣ_1-100Ｌであり；Ｌは、アリールボロン酸，ビオチン，２−８アミノ酸を含むポリヒスチジン，抗体が結合するハプテン，固相支持体，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，カプトテシン，ピレン，マイトマイシン，テキサスレッド，アントラセン，アンスリニル酸，アビジン，ＤＡＰＩ，イソスルファンブルー，マラカイトグリーン，ソラーレン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，および（＋）−α−トコフェラールであるがこれに限定されず；ｍは、０−１２の整数であり；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，またはＮ−ホルミルであり；Ｒ³は、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，ＯＭｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，またはＣＨ₂ＮＨ₂であり；そしてＸは、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，またはＣＦである］。好ましい態様においては、Ｒ⁵およびＲ⁶はＨである。本発明の化合物は、式ＸＸＩＸまたはＸＸＸ：ＸＸＩＸ［式中、Ｒ¹，Ｒ^a，Ｒ^b，Ｒ^e，Ｒ^f，Ｒⁱ，Ｒ^j，Ｒⁿ，およびＲ^oは、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1- ₆ アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，およびＣ_1-6アルキニルから選択され；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，およびＮ−ホルミルからなる群より選択され；Ｒ³，Ｒ^d，Ｒ¹およびＲ^qは、独立して、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，Ｏｍｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，ＣＨ₂ＮＨ₂からなる群より選択され；Ｒ⁴は、-ＮＨ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0-6 ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨＲ⁵またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨＲ⁵であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，Ｃ_1-6Ｌから選択され、Ｌ基は、独立してビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋） −α−トコフェラール，およびＣ_1-6アルキニル、から選択され、ｒは０−６の整数であり；Ｘ，Ｘ^a，Ｘ^b，Ｘ^e，Ｘ^f，Ｘⁱ，Ｘ^j，Ｘⁿ，Ｘ^oは、独立して、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，ＣＦからなる群より選択され；そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｉ，ｊ，ｋ，およびｍは、独立して、０−５の整数である］の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を含んでいてもよい本発明はさらに、式：ＸＸＸ［式中、Ｒ¹，Ｒ^a(i,m)およびＲ^b(j,m)は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ₁ _-6 アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，およびＣ_1-6アルキニルから選択され；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，およびＮ−ホルミルからなる群より選択され；Ｒ^f(m)およびＲ^c(k,m)は、独立して、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，Ｏｍｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，ＣＨ₂ＮＨ₂からなる群より選択され；Ｒ⁴は、-ＮＨ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0-6 ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨＲ⁵またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨＲ⁵であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，Ｃ_1-6Ｌから選択され、Ｌ基は、独立して、ビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋）−α−トコフェラール，およびＣ_1-6アルキニルから選択され、ｒは０−６の整数であり；Ｘ，Ｘ^a(i,m)およびＸ^b(j,m)は、独立して、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，ＣＦからなる群より選択され；そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏおよびｐは独立して選択される０−５の整数である］を有するポリアミドまたはその薬学的に許容しうる塩を含む。Ｂａｉｒｄら(J．Am．Chem．Soc．118:6141-6146)およびＰＣＴ／ＵＳ９７／００３３３２は、本発明のポリアミドの製造に適当なポリアミドの合成の方法を記載する。本発明のポリアミドは、Ｂｏｃ−保護３−メトキシピロール，イミダゾール，およびピロール芳香族アミノ酸等の化合物を用いて固相法により合成することができ、これをアミノ分解により支持体から切断し、ナトリウムチオフェノキシドで脱保護し、そして逆相ＨＰＬＣにより精製することができる。ポリアミドの同一性および純度は、当業者に利用可能な種々の分析技術の任意のもの、例えば１Ｈ−ＮＭＲ，分析ＨＰＬＣ，および／または飛行質量分析器のマトリックス補助レーザー吸収イオン化時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ−モノイソトロピック）を用いて確認することができる。ポリアミドポリマーは、ＰｙおよびＩｍサブユニットのホモポリマーであってもよく、または戦略的に配置した脂肪族アミノ酸モノマー、例えばα−アミノ酸（天然に生ずるアミノ酸を含むがこれに限定されず、好ましくはグリシンである）；式−ＮＨ−（ＣＨ）_n−ＣＯ−のアミノ酸（ｎは１−１２の整数であり、好ましくはｎはβ−アラニンにおけるように１であるか、またはγ−アミノ酪酸におけるように２である）とのコポリマーであってもよい。ポリアミドのＣ末端は、−ＮＨ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ¹Ｒ²またはＮＨ（ＣＨ₂）_bＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ¹Ｒ²，ＮＨＲ¹またはＮＨ（ＣＨ₂）_bＣＯＮＨＲ¹［式中、ｂは１−１２の整数であり、好ましくは１であり、Ｒ¹およびＲ²は、独立して、Ｃ_1-6アルキル（好ましくはＣ_1-10アルキル、例えばメチル，エチル，イソプロピル），Ｃ_1-100アルキルアミン（好ましくはＣ_1-3アルキルアミン、例えばエチルアミン），Ｃ_1-6アルキルジアミン（好ましくはＣ_1-3アルキルジアミン、例えばＮ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン），Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート（好ましくはＣ_1-3アルキルカルボキシレート、例えばＣＨ₂ＣＯＯＨ），Ｃ_1-6アルケニル（好ましくはＣ_1-3アルケニル、例えばＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂），Ｃ_1-6アルキニル（好ましくはＣ_1-3アルキニル、例えば−ＣＨ₂Ｃ≡ＣＨ₃），またはＣ_1-6Ｌ（Ｌはビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋）−αートコフェラールを含むがこれに限定されない）から選択される］である。本発明の最も好ましい化合物は、ポリアミドコア配列組成：原則として、個々のポリアミドサブユニットは、２つの可能な結合方向でＤＮＡを認識することができる。コア配列組成ImPyPy-γ-PyPyPyのポリアミドによる5'-TGTTA-3'の認識は、各ポリアミドサブユニットのＮ末端を認識される各D ＮＡ鎖の５'−側に置く。ポリアミドＮ−末端を認識される各鎖の３'側に置くと、5'-TCTTA-3'配列が標的化される。各結合方向は、ユニークかつ判別可能なヘアピン折り畳みである。サブユニット方向の優先性は、先行技術では規定されていないが、対形成規則をポリアミド設計に成功するように適用するためには、単一の予測可能なサブユニット結合方向が好ましい。ヘアピンポリアミドＤＮＡ結合方向の２つの可能なモデルを以下に示す。それぞれの標的ＤＮＡ鎖の５'−側に向けて位置する各サブユニットのＮ−末端との６環ヘアピンポリアミド結合について、３０倍（２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の結合方向優先性が存在することが観察されている。ピロール−イミダゾールポリアミドのＤＮＡ結合方向の優先性は、ポリアミド設計のための、対形成規則の成功する適用のために考慮されなければならない第二次の設計規則を規定する。Ｇ・ＣおよびＣ・Ｇの認識についてのＩｍ／ＰｙおよびＰｙ／Ｉｍ対の可能な縮重は、先行技術においては十分に注意されてこなかった。グアニンの環外アミン基は、マイナーグルーブの床に対称に配置され、したがって、Ｃ・ＧおよびＧ・Ｃ塩基対に対して同じ場所で提示されるであろう。先行技術において記載された１つのミスマッチの結合部位は、もっぱらＧ・ＣからＡ・Ｔへの置換であった。当業者には、１つのＧ・ＣからＣ・Ｇへの置換により異なる配列がピロール− イミダゾールポリアミド−ＤＮＡモチーフにより判別されるかどうかは明らかではなかった。完全な対形成規則を解明するための新規ポリアミドの迅速な設計は、ヘアピン−ポリアミドモチーフが固相合成法に適合しうるという発見により促進された。一連の４つのポリアミドを製造した：ImPyPy-γ-PyPyPy-β-Dp，ImImPy-γ-Py PyPy-β-Dp，ImPyPy-γ-PyImPy-β-Dp，およびImImPy-γ-PyImPy-β-Dp。各ポリアミドは、８つの可能な環対形成-塩基対の組み合わせにおいて、Ｔ／ＡまたはＧ／Ｃ塩基対のいずれかの向かい側に、Ｐｙ／Ｐｙ，Ｉｍ／Ｐｙ，Ｐｙ／Ｉｍ，またはＩｍ／Ｉｍ対を配置する。中心環対形成において異なる４つのヘアピンポリアミドの構造が図３に示される。Ｉｍ／ＰｙおよびＰｙ／Ｉｍ対が効率的にＧ・ＣをＣ・Ｇ塩基対からそれぞれ判別すること、およびＩｍ／Ｉｍ対形成はエネルギー的に好ましくない対形成であることが決定された。定量的ＤＮａｓｅＩフットプリンティング実験は、４つの可能なピロール−イミダゾールポリアミド環対形成のエネルギー論を明らかにする。Ｐｙ／ＰｙはＡ・Ｔ／Ｔ・Ａ＞＞Ｇ・Ｃ／Ｃ・Ｇに、Ｉｍ／Ｐｙは、Ｇ・Ｃ＞＞Ｔ・Ａ／Ａ・Ｔ＞Ｃ・Ｇに優先的に結合し、そしてＩｍ／ＩｍはＧ・Ｃ／Ｃ・ＧまたはＡ・Ｔ／Ｔ・Ａに結合しないことがわかった。８つの可能な環対− 塩基対相互作用の概略の描写を以下に示す。これらの結果は、Ｇ・ＣおよびＣ・Ｇ塩基対がマイナーグルーブ中で判別されることができることを示しているが、以下に明らかになるように、Ｉｍ／Ｉｍ対形成のエネルギー的不利は、特定の非連結オーバーラップポリアミド複合体の設計の基礎を提供する。６環ヘアピンポリアミドモチーフがＤＮＡマイナーグルーブ中の広範な種類の配列の認識のための多用途テンプレートを提供することが明らかにされている(P arks，et al．J．Am．Chem．Soc.，118，6153(1996);Szewczyk，et al.Angew．C hemie，35，1487-1489(1996);Swalley，et al．J．Am．Chem．Soc．118，8198-8 206(1996))。６環ヘアピンポリアミドは、１ｘ１０⁷Ｍ^-1から１ｘ１０⁸Ｍ^-1の範囲の親和性および１塩基対ミスマッチ部位に対して２倍から６０倍の範囲の特異性をもってその同起源の部位を認識する。同起源の５塩基対部位を認識する９つの６環ヘアピンポリアミドの概略図が以下に示される。６環ヘアピンモチーフにより認識される広い配列レパートリーは、リガンド設計における著しい進歩である。しかし、ナノモル以下の親和性で標的部位を認識する６環ヘアピンポリアミドは同定されていない。これらの結果、特に８環ポリアミドが１０塩基対標的部位を認識できなかったという結果は、２：１ポリアミド−ＤＮＡモチーフを９塩基対より長い配列に延長するためには新規なクラスのポリアミドが必要であることを示唆する。本発明により、中心ピロールまたはイミダゾールアミノ酸をよりフレキシブルなアミノ酸サブユニットで置き換え、したがって、アンチパラレル二量体が親和性および特異性を獲得し続けるためのレジスターをリセットすることを可能とする。フレキシブルリンカーアミノ酸を同定するために、式ImPyPy-X-PyPyPy-Dp［式中、ＸはそれぞれＰｙ，Ｇ（グリシン），β，またはγ］の４つのポリアミドを合成し、これらの平衡結合定数を5'-TGTTAAACA-3'（９塩基対）部位について決定した(Trauger，et al．J．Am．Chem．Soc.，118，6160(1996))。ピロールまたはフレキシブルグリシンまたはβ−アラニンリンカーにより連結されたImPyPyおよびPyPyPy-Dpサブユニットに基づくポリアミドの構造を以下に示す。延長されたコンフォメーションでポリアミドサブユニットを連結するのにβ− アラニンが最適なリンカーであることが決定され、７塩基対より長い配列を標的とする新規ポリアミドの設計のための有用な構造的モチーフが提供される。β− アラニン連結化合物ImPyPy-β-PyPyPy-Dpは、４つのポリアミドのうち最も高い結合親和性を有し、形式上Ｎ−メチルピロール連結ポリアミドImPyPy-Py-PyPyPy -Dpより約１０倍高い親和性をもって９ｂｐ部位5'−TGTTAAACA-3'（Ｋ_a＝８×１０⁸Ｍ^-1）に結合する。 β−スプリングを含むポリアミドによる９塩基対標的部位の認識の概略図を以下に示す。「ヘアピン」コンフォメーションでＤＮＡに結合することが先に示されたImPy Py-γ-PyPyPy-Dpの結合データは、γ-アミノ酪酸は、延長されたコンフォメーションにおいてはポリアミドサブユニットを効率的に連結しないことを示す。延長されたコンフォメーションにおける、ポリアミドサブユニットの連結に効率的なリンカーとしてのβ−アラニンの発見は、７ｂｐより長い部位を標的とする５環より小さいサブユニットに基づく新規ポリアミドの設計に有用な構造的モチーフを提供する。延長されたコンフォメーションで結合する上述のImPyPy-X-PyPyPy-Dpポリアミドについて、少なくとも２つの異なる結合モードが形成されることが予測される。これらの結合モードは、「スリップ」および「オーバーラップ」と称される。オーバーラップ（９塩基対）結合モードにおいては、２つのImPyPy-X-PyPyPy-Dp ポリアミドが互いに直接向かい側に結合する。「スリップ」（１３塩基対）結合モードは、２：１および１：１ポリアミド−ＤＮＡ結合モチーフを１つの部位で統合する。この結合モードにおいては、２つのImPyPy-X-PyPyPy-Dp ポリアミドのImPyPy部分はImPyPyホモ二量体におけるように２：１様式で中心5' -AGACA-3'配列に結合し、ポリアミドのPyPyPy部分は、ジスタマイシンの１：１複合体におけるようにＡ，Ｔフランキング配列に結合する。「スリップ」および「オーバーラップ」結合モードの概略モデルを以下に示す。本発明は、「スリップ」延長コンフォメーション中においてポリアミドサブユニットを連結する最適のリンカーとしてβ−アラニンを提供し、構造モチーフを提供し、このことにより分子量約９００のポリアミドは１３塩基対ＤＮＡ配列を認識する。β−アラニン−連結化合物ImPyPy-β-PyPyPy-Dpは、13bp 5'-AAAAAGA CAAAAA-3'部位に結合定数Ｋ_a＝５×１０⁹Ｍ^-1で結合し、これは形式上Ｎ−メチルピロール−連結ポリアミドImPyPy-Py-PyPyPy-Dpより約８５倍高い。上述したように、γ−アミノ酪酸、および好ましくはβ−アラニンは、ヘアピン中において効率的にポリアミドに結合し、それぞれコンフォメーションを延長する。また、延長コンフォメーションにおいてはγ−アミノ酪酸はポリアミドサブユニットを最適には連結せず、ヘアピンコンフォメーションにおいてはβ−アラニンはポリアミドサブユニットを最適には連結しないことが示されている。これらの結果は、γ−アミノ酪酸およびβ−アラニンを予測可能な結果をもって１つのポリアミド中で組み合わせうことを示唆する(Trauger．et al．Chem．& Bio l.，3，369(1996))。９環「延長ヘアピン」ポリアミドImPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy-G-Dpが９塩基対標的部位5'-AAAAAGACA-3'に０．０５ｎＭの濃度で結合することが明らかにされており、これは、６環ヘアピンポリアミドImPyPy-γ-ImPyPy-β-Dpに対して約４００倍の親和性の増加である。これらの結果は、ＤＮＡヘアピンポリアミドの結合親和性をナノモル以下の範囲に増加させる戦略を提供する。さらに、以下に明らかにされるように、多くの重要なＤＮＡ結合転写因子、例えばＴＢＰおよびホメオドメイン蛋白質は、Ａ，Ｔリッチなコンセンサス配列を有する。延長ヘアピンポリアミドは、ポリアミドがある蛋白質結合部位に隣接するユニーク配列を認識することにより蛋白質−ＤＮＡ相互作用を妨害しうる一般的方法を提供する。９塩基対配列の延長ヘアピンポリアミド認識の結合モデルの概略図を以下に示す。 DNAの浅い方の溝にある多様な配列を認識するための、用途の広い鋳型を提供する伸長したヘアピンポリアミドモチーフを、本明細書中で提供する。伸長したポリアミドは、１x10⁸M^-1から>5x10¹⁰M^-4の範囲にある親和性および５倍から60倍までの範囲にある１塩基対ミスマッチ部位に対する特異性によって、９から13塩基対部位の標的部位を認識する。９から12個の環を含み９から13塩基対の標的部位を認識する、９個伸長したヘアピンポリアミドの概略図を図５に示す。ポリアミド-DNA複合体形成の速度を測定するためのエンドヌクレアーゼプロテクションアッセイを、本明細書中で提供する。そのようなアッセイには、制限エンドヌクレアーゼ切断部位とオーバーラップするようなポリアミド結合部位を含む、標識された制限酵素切断断片が含まれ得る。同種のものによる切断は、オーバーラップするポリアミド結合部位がそのポリアミドによってふさがれた場合に妨げられる。対照として、第二の標識されたDNA断片は、制限酵素切断部位を含むがオーバーラップするポリアミド結合部位を欠いたものであり得る。ポリアミドがその標的結合部位と結合する速度は、ポリアミドの溶液を標識された標的および参照断片と十分な時間インキュベートすることによって評価し得る。本明細書中に提供する実験条件を用いると、参照部位はほぼ完全に消化されるが、標的部位におけるプロテクションは観察され、ポリアミド濃度および平衡時間と相関し得る。同様に、過剰量の標識されていない競合体DNAを標識されたDNA断片とポリアミドの平衡溶液に加えることにより、解離速度を解析する。競合体の添加により遊離のポリアミドの濃度がゼロまで減少する。標識された断片上の標的部位からポリアミド解離が起こる速度は、再平衡時間を増加させていく時に制限酵素消化からのプロテクションが失われる速度によって追跡し得る。第一世代の６環ヘアピンポリアミドは、およそ１x10⁸M^-1の結合定数でDNAに結合する。連結されていない４環ポリアミドは３環ポリアミドと比較して70倍高い親和性で2:1の複合体を形成するという観察は、ナノモル以下の濃度のDNAの認識のための８環ヘアピンポリアミドモチーフを示唆していた。本発明者は、配列に関して１アミノ酸だけ異なる２つの８環ピロール-イミダゾールポリアミドが、配列に関して１塩基対だけ異なるようなそれぞれの６塩基対標的部位に特異的に結合するということを示した（Trauger,et al.Nature,382,559-561(1996)）。結合はナノモル以下のリガンド濃度において観察される。１アミノ酸だけ異なるような２つの８環ヘアピンポリアミド、ImPyPyPy-γ- ImPyPyPy-β-DpおよびImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpに関して、１塩基対だけ異なるような２つの６塩基対(bp)標的部位、5'-AGTACA-3'および5'-AGTATT-3'へのDN A結合親和性を決定した。ポリアミド-DNA複合体に関する対合規則に基づくと、部位5'-AGTACA-3'および5'-AGTATT-3'は、ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dpについてはそれぞれ“マッチ”および゛“1塩基対ミスマッチ”部位であり、ポリアミドI mPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpについてはそれぞれ“1塩基対ミスマッチ”および“ マッチ”部位である。ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-DpおよびImPyPyPy-γ-PyPyPyPy -β-Dpとの複合体における5'-AGTACT-3'および5'-AGTATT-3'の結合モデルを、図７に示す。 ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-DpおよびImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpを、固相法により合成し、逆相HPLCにより精製した。3-'³²P-標識された229bp制限酵素切断断片上のマッチおよびミスマッチの６塩基対結合部位に関する平衡結合定数を、定量的DNaseＩフットプリント滴定実験によって決定した。ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy- β-Dpは、そのマッチ部位5'-AGTACT-3'と0.03nM濃度で、その１塩基対ミスマッチ部位5'-AGTATT-3'とはほぼ100倍低い親和性で結合する。ImPyPyPy-γ-PyPyPyP y-β-Dpは、その指定されたマッチ部位5'-AGTATT-3'と0.3nM濃度で、その１塩基対ミスマッチ部位5'-AGTACT-3'とはほぼ10倍低い親和性で結合する。ImPyPyPy- γ-ImPyPyPy-β-DpおよびImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpのそれぞれのマッチ部位に対する特異性は、極めて小さな構造変化の結果である。ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy -β-Dp中のただ１つの窒素原子をC-H残基と置き換えることにより、ポリアミド・ 5'-AGTACT-3'複合体の親和性が、〜2.5kcal/モルの自由エネルギー差に相当する同様に、ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp中のC-HをＮ残基と置き換えることにより、ポリアミド・5'-AGTATT-3'複合体の親和性が〜10倍低下、結合エネルギーにして〜1.3kcal/モルが失われる。これらの結果は、単純な分子形および２文字の芳香族アミノ酸コードであるピロール-イミダゾールポリアミドを用いることによりDNA結合タンパク質に匹敵する親和性および特異性を達成し得るということを示している。さらに別のモチーフがポリアミドにナノモル以下の結合親和性を提供し得るかどうかは、まだ決定されずにいる。ピロール-イミダゾールポリアミドはG/Cに富んだ配列と、環外のグアニン塩基の環外のアミンとの立体障害のために低い結合親和性で結合するだろうということが示唆されてきた。A、Tに富んだ浅い方の溝と比較してG/Cに富んだ浅い方の溝の静電ポテンシャルがより低いために、高親和性結合が妨げられ得るということも注目されてきた（Pullman,et al．Quarterly Reviews of Biophysics.（198 1）14,289-380;Pullman,B．Advances in Drug Research．（1989）18,1-113.Man ning,G.S．Q.Rev.of Biophysics.(1978)11,179-246;Honig and Nicholls．Scien ce(1995)268,1144.）。８環ヘアピンポリアミドがナノモル以下の親和性でG/Cに富んだ標的配列を認識し得るということが見出されていた。８環ヘアピンポリアミドの概略結合モデルは、5'-(A/T)(G/C)₄(A/T)-3'配列の認識を目的とした。純粋にG、Cである塩基対のコア配列が高い親和性および特異性で認識され得るかどうか調べるために、ピロールおよびイミダゾールアミノ酸の配置だけが異なるような３つの８環ヘアピンポリアミド、ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dp、ImPyIm Py-γ-ImPyImPy-β-Dp、およびImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dp3つの８環ヘアピンポリアミドを、G、C塩基対だけを含む３つのコア配列を認識するために設計した。DNaseＩフットプリント滴定により、各ポリアミドに関する平衡結合定数(K_a) の決定ができる。ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dpは、マッチ部位5'-TGGCCA-3'と平衡結合定数K_a=１x10¹⁰M^-1(10mM Tris・HCl,10mM KCl,10mM MgCl₂and ５mM CaCl₂, pH7.0および22℃)で結合する。２つの設計された２塩基対ミスマッチ配列、5'-T GCGCA-3'および5'-TGGGGA-3'を、少なくとも200倍減少した親和性で結合する。I mPyImPy-γ-ImPyImPy-β-Dpは、部位5'-TGCGCA-3'と□４倍の特異性のあるKa=４ x10⁷M^-1で結合し、ImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dpは、部位5'-TGGGGA-3'と□６倍の特異性のあるK_a=３x10⁷M^-1で結合する。これらの結果は、Imアミノ酸の配置にはピロール-イミダゾールポリアミドのの結合親和性に対する絶大な効果があるということを示している。特に、これらの結果は、ピロール環がβ-アラニンのようなより柔軟なスペーサーアミノ酸で置換されたようなヘアピンポリアミドを設計することにより、結合親和性を回復し得るということを示している。 ImPyImPy-γ-ImPyImPy-β-Dpの各サブユニット内でピロール残基をβ-アラニンスペーサー残基と置換することにより、ナノモル以下の親和性で5'-TGCGCA-3' 配列を認識するような８残基ヘアミンポリアミド、Im-β-ImPy-γ-Im-β-ImPy- β-Dpが提供される。８環ヘアピンポリアミドImPyImPy-γ-ImPyImPy-β-Dpおよび８残基ヘアピンポリアミドIm-β-ImPy-γ-Im-β-ImPy-β-Dpの構造および概略結合モデルを、図８に示す。４環ヘアピンポリアミドモチーフは、DNAの浅い方の溝にある多様な配列を認識するための用途の広い鋳型を提供するということが、見出されてきた。８つの環および残基のヘアピンポリアミドは、１x10⁷M^-1から>1x10¹⁰M^-1の範囲の親和性および一塩基対ミスマッチ部位に対する２倍から>100倍の範囲の特異性で、６塩基対標的部位を認識する。６塩基対標的部位を認識する15個の８残基ヘアピンポリアミドの概略図を、図９に示す。３環のサブユニットに基づいた、第一世代の完全にオーバーラップするβ-連結したポリアミドは、およそ８x10⁸M^-1の結合定数でDNAと結合する。連結していない４環ポリアミドは、３環ポリアミドと比較して70倍高い親和性で2:1の複合体を形成するという観察は、ナノモル以下の濃度でDNAの11塩基対を認識するための完全にオーバーラップする８環4-β-4ポリアミドモチーフを示唆していた。３つの4-β-4ポリアミドの化学構造を図10に示す。３っの８環4-β-4ピロール-イミダゾールポリアミド、ImImImPy-β-PyPyPyPy- β-Dp、ImImPyPy-β-PyPyPyPy-β-DpおよびImPyPyPy-β-PyPyPyPy-β-Dpは、それぞれ標的とする5'-AGGGATTCCCT-3'、5'-AGGTATTATCCT-3'および5'-AGTAATTTAC T-3'を特異的に認識するということが見出されていた。DNaseＩフットプリント滴定は、各ポリアミドがそれぞれの標的部位とナノモル以下の濃度で、K_a=７x10⁹ M^-1からK_a５x10¹⁰M^-1の範囲の平衡結合定数、および２塩基対ミスマッチ部位に対して７から30倍の特異性で結合することを示している。 3-β-3および4-β-4ポリアミドが、２つの別々の種類の標的部位の認識に関して、“スリップした”および“オーバーラップした”両方の複合体を認識する能力は、β-長したポリアミドモチーフの配列特異性に対する限界を意味している。Im,/Imポリアミド対形成が不都合であるという発見は、4-β-4ポリアミドImIm ImPy-β-PyPyPyPy-β-Dpが完全にオーバーラップしたポリアミドモチーフ内で選択的に結合するはずであるということを示唆している。３つの4-β-4ポリアミドによる３つの標的DNAの認識の概略を表したものを、図11に示す。 4-γ-4ポリアミドImImImPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpは、5'-AGGGAA-3'標的部位 ImImImPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpは、１メチレン単位(MW=14）をリンカー領域から削ることにより4-β-4ポリアミドImImImPy-β-PyPyPyPy-β-Dpと関連している。γ およびβは、特異性ターンと伸長した結合をそれぞれ連結しており、標的とする結合部位の大きさを６から11塩基対に大きくし、その結果、結合エネルギーを2. 1kcal/モル増強する。これらの結果、すなわちG、Cに富んだ11塩基対配列の特異的な認識は、ヒトゲノム内のただ１つの部位を認識するような一般的なDNA結合の開発における、意義深い進歩を意味している。 G・CまたはC・G塩基対と比較して、A・TまたはT・A塩基対に対するβ/β対の配置に少なくとも20倍の選択性が存在することが測定された。定量的DNaseＩフットプリント滴定実験により、ImImImPy-β-PyPyPyPy-β-Dpが設計されたマッチ部位に平衡結合定数K_a 1.4x10¹⁰M^-1で、１塩基対β/βミスマッチ配列5'-AGGGAGTCCC T-3'には少なくとも20倍低い親和性(K_a=6.9x10⁸M^-1)で結合することが示されている。これらの結果は、β/β連結を柔軟なスペーサー単位および配列特異的DNA 結合要素として意味している。β/βの特異性は、より長い結合部位の認識のためのポリアミドの設計に中枢的な、さらにべつの対合規則を明らかにしている。 G、CまたはA、T塩基対に対するβ/β対の配置の概略モデルを図12に示す。伸長した、完全にオーバーラップするポリアミド-DNAモチーフは、浅い方の溝にある９から13塩基対を含む対称的な配列を認識するために、用途の広い鋳型を提供するということを見出した。協同的な複合体形成の平衡結合定数は、K_a= １x10⁷M^-1からK_a>１x10¹¹M^-1の範囲にある。特異性は、１塩基対ミスマッチ部位の識別に関して２倍から＞20倍の葉ににあることがわかった。いくつかのβ-結合した完全にオーバーラップするポリアミド複合体を概略的に表したものを図13 に示す。標的となり得る結合部位の大きさおよびヘアピンポリアミドモチーフに取り入れ得る配列のレパートリーをさらに拡大するために、それぞれ２または３個のIm アミノ酸残基を含む２つのポリアミド、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpおよび ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpを固相合成法により調製し、そのDNA結合特性を解析した。２つの10環ヘアピンポリアミドの構造を図14に示す。 ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpは正規の７bpマッチ配列5-TGTAACA-3'と、K_a 1.2×10¹⁰M^-1の平衡結合定数(K_a)で、１塩基対ミスマッチ配列5'-TGGACA-3'とはK_a=6.8×10⁸M^-1.(10mM Tris・HCl,10mM KCl,10mM MgCl₂,５mM CaCl₂,pH7.0,22 ℃)で結合することが示された。ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpとはただ１つのアミノ酸置換が異なるようなImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpは、その正規のマッチ配列5'-TGGAACA-3'と平衡結合定数K_a=3.6×10⁹M^-1で、対応する１塩基対ミスマッチ配列5'-TGTAACA-3'とはK_a<１×10⁷M^-1で結合する。ただ１個の孤立電子対を〜1500MWポリアミド内の水素原子と置き換えると、１オーダー以上の規模で親和性および特異性を調節することがわかっている。ナノモル以下の濃度での 10環ヘアピンポリアミドによる７bp標的部位の配列特異的な認識は、ピロール- イミダゾールポリアミド-DNAモチーフの、効果的な標的となり得る配列のレパートリーを広げる。マッチおよびミスマッチ７塩基対配列を認識する２つの10環ヘアピンポリアミドの概略モデルを以下に示す。 ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-DpおよびImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpのそれぞれのマッチ部位に対する特異性は、極めて小さな構造変化の結果である。Im ImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp内のようにImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp内のただ１つのC-Hを窒素原子で置き換えると、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp・5' -TGTAACA-3'複合体と比較してImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp・5'-TGTAACA-3' 複合体の親和性が>300倍、少なくとも４kcal/モルの自由エネルギー差分減少する。同様に、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp内のようにImImPyPyPy-γ-ImPyPy PyPy-β-Dp内のＮ原子をC-Hで置き換えると、ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp・ 5'-TGGAACA-3'複合体と比較してImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp・5'-TGGAACA-3 '複合体の親和性が５倍の力価分低下、結合エネルギーにして〜1kcal/モルが失われる。ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpと比較してImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy -β-Dpの低下した総合的な特異性および結合親和性は、おそらく設計された標的部位中の5'-GA-3'段階の存在の結果である。 β-アラニンに結合した２環サブユニットに基づいたポリアミドImPy-β-ImPy- γ-ImPy-β-ImPy-β-Dpを、保存されたHIV遺伝子プロモーター配列内の転写因子 TBPの結合部位に近接した７塩基対領域を標的とするために調製した。このポリアミドは、本明細書中に記載の対合規則に基づいて設計されており、その意図する5'-TGCTGCA-3'標的配列をK_a=3.6×10⁹M^-1の結合親和性で認識することがわかった。2-β-2-γ-2-β-2分子鋳型内のPyおよびImアミノ酸の位置だけが異なるような異性体のミスマッチポリアミドImPy-β-ImPy-γ-ImPy-β- ImPy-β-Dpは、標的とする5-TGCTGCA-3'配列と100倍減少した親和性で結合する。分子異性体であり、100倍の特異性でHIV遺伝子プロモーターの７塩基対配列をなお識別するようなポリアミドおよび対照ポリアミドを概略的に表したものを、図15に示す。これらの結果は、５環サブユニットに基づいたヘアピンポリアミドはナノモル以下の濃度で７bp結合部位を認識するための有用な構造モチーフを提供するということを示している。5'-WGWWWCW-3'配列を標的とすることに関して、2γ-アミノ酪酸に結合した５環サブユニットに基づいた5-γ-5ポリアミド、ImPyPyPyPy- γ-ImPyPyPyPy-β-Dpは、対応するβ-置換された、2-β-2-γ-2-β-2ポリアミド ImPy-β-PyPy-γ-ImPy-β-PyPy-β-Dpよりも好ましい。5'-WGCWGCW-3'および5'- WGGWGGW-3'配列を標的とすることに関して、それぞれのβ置換された、2-β-2- γ-2-β-2ポリアミドImPy-β-ImPy-γ-ImPy-β-ImPy-β-DpおよびImIm-β-ImIm- γ-PyPy-β-PyPy-β-Dpは、γ-ブチル酪酸に結合した５環サブユニットに基づいたそれぞれの5-γ-5ポリアミド、ImPyPyImPy-γ-ImPyPyImPy-β-DpおよびImImPy ImIm-γ-PyPyPyPyPy-β-Dpよりも好ましい。７塩基対標的部位を認識するような一連のヘアピンポリアミドを、図16に示す。本発明者は、β/β対はヘアピンポリアミドの標的となり得る結合部位の大きさを拡大することに関してPy/β対よりも好ましいということを発見した。３つの“12環ヘアピン”ポリアミド、ImPyPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPyPy-β-Dp、ImPyPy -β-PyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy-β-DpおよびImPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy- β-Dpを、固相合成法によって合成した。 DNaseＩフットプリント滴定により、６環サブユニットに基づいたヘアピンポリアミド、ImPyPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPyPy-β-Dpは、正規の８bpマッチ配列5'-T GTTAACA-3'とK_a=４×10⁹M^-1の平衡結合定数(K_a)で、１塩基対ミスマッチ配列5'- TGTGAACA-3'とはK_a=２×10⁸M^-1で結合することが示されている。ImPyPyPyPyPy- γ-ImPyPyPyPyPy-β-Dpとは２つの柔軟な脂肪族アミノ酸残基が２つのピロール環に置換されている点で異なるようなImPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy-β-Dp は、5'-TGTTAACA-3'マッチ部位とK_a=２×10¹⁰M^-1で、5'-TGTGAACA-3'ミスマッチとはK_a=１×10⁹M^-1で結合する。ImPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy-β-Dpは、5 '-TGTTAACA-3'マッチ部位とK_a□1×10¹¹の平衡結合定数で、１塩基対ミスマッチ配列5'-TGTGAACA-3'とはK_a<１×10⁹で結合する（表II）。これらの結果は、８塩基対までのヘアピンポリアミドモチーフにアクセスし得る、標的となり得る結合部位の大きさを拡大する。以下に示すようなヘアピンポリアミドモチーフ内のβ/β対は、DNA結合を完全に破壊する。本発明者は、対になったβ/β置換されたヘアピンモチーフにより、形5'-WGWG WWCW-3'の配列の特異的なターゲッティングが可能になることを見出した。β/β 対を12環ヘアピンポリアミドの第二のピロール対と置換することにより、混合された配列組成の多様な８塩基対配列を標的とするようなポリアミドが提供される。配列は、表４に示すような１塩基対ミスマッチ部位に対してナノモル以下の親和性および50-100倍の特異性で結合されている。以下の実施例は、本発明の特異的な態様を例証したものであって、明細書および請求項をいかなるようにも限定しない。実施例実施例１ポリアミドの合成１． ImPyPy-G-PyPyPy-G-Dp-NH₂ ポリアミドは、手動固相法により、２４０ｍｇの樹脂をＮ−メチル−ビス（アミノプロピル）アミン（２ｍ１，５５℃）で切断して、白色粉末として製造した（ＨＰＬＣ精製後，１９．０ｍｇ，４４％回収率）。２． ImPyPy-G-PyPyPy-β-Dp-NH₂ ポリアミドは、手動固相法により、２４０ｍｇの樹脂をＮ−メチル−ビス（アミノプロピル）アミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して、白色粉末として製造した（２５ｍｇ，５５％回収率）。３． ImPyPy-β-PyPyPy-G-Dp-NH₂ ポリアミドは、自動化固相法により、２４０ｍｇの樹脂をＮ−メチル−ビス（アミノプロピル）アミンで切断して（２ｍｌ，５５℃）白色粉末として製造した（２３．０ｍｇ，５３％回収率）。４． ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp-NH₂ 機械補助固相合成により製造したImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-樹脂のサンプル（２４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、３，３−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（２ｍＬ）で５５℃で１８時間処理した。樹脂を濾過により除去し、濾液を０．１％（ｗｔ／ｖ）水性ＴＦＡで総容量８ｍＬに希釈した。得られた粗ポリアミド／アミン溶液を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-NH₂ のトリフルオロ酢酸塩（３１ｍｇ，４０％回収率）を白色粉末として得た。５． ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp-NH₂ ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-NH₂について記載したように、ポリアミドを白色粉末として製造した。６． ImPyPy-G-PyPyPy-G-Dpポリアミドは、手動固相法により、２４０ｍｇの樹脂（0.2mmol，Boc-グリシン／グラムの初期置換）をジメチルアミノプロピルアミンで切断して製造し、白色粉末として得た（１１．９ｍｇ，２９％回収率）。７． ImPyPy-G-PyPyPy-β-Dp ポリアミドは、手動固相法により、１８０ｍｇの樹脂（0.2mmol，Boc-β-アラニン／グラムの初期置換）をジメチルアミノプロピルアミンで切断して（２ｍｌ，５５℃）、白色粉末として得た（ＨＰＬＣ精製後，１２．３ｍｇ，３８％回収率）。８． ImPyPy-β-PyPyPy-G-Dp ポリアミドは、自動化固相法により、１８０ｍｇの樹脂（0.2mmol Boc-グリシン /グラムの初期置換）をジメチルアミノプロピルアミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して、白色粉末として得た（ＨＰＬＣ精製後，１７．２ｍｇ，５７％回収率）。９． ImPyPy-β-PyPyPy-β-Dp ポリアミドは、自動化固相法により、２４０ｍｇの樹脂（0.2mmol Boc-β-アラニン／グラムの初期置換）をジメチルアミノプロピルアミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して、白色粉末として得た（ＨＰＬＣ精製後，１９．０ｍｇ，４３％回収率）。 10． ImPyPy-Py-PyPyPy-G-Dp ポリアミドは手動固相法により製造した。回収率は、１８０ｍｇの樹脂(0.2mmol Boc-グリシン/グラムの初期置換)のジメチルアミノプロピルアミン（２ｍｌ，５５℃）による切断に基づく（ＨＰＬＣ精製後，８ｍｇ，２４％回収率）。初期製造物に少量の失敗ヘプタミドAcPyPyPyPyPyPy-Dpが認められ、これを第２の調製ＨＰＬＣ精製により除去して、純粋なImPyPy-Py-PyPyPy-G-Dpを白色粉末（１．２ｍｇ）として得た。 11． ImPyPy-Py-PyPyPy-β-Dp ポリアミドは機械補助固相合成により製造し、８００ｍｇの樹脂（0.2mmol Boc- β-アラニン/グラムの初期置換）をジメチルアミノプロピルアミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して、白色粉末を得た（ＨＰＬＣ精製後，５６ｍｇ，３６％回収率）。 12． ImPyPy-G-PyPyPy-G-Dp ポリアミドは、手動固相法により、２４０ｍｇの樹脂をＮ−メチル−ビス（アミノプロピル）アミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して、白色粉末として得た（ＨＰＬＣ精製後，１９．０ｍｇ，４４％回収率）。 13． ImPyPy-G-PyPyPy-β-Bp ポリアミドは、手動固相法により、２４０ｍｇの樹脂をＮ−メチル−ビス（アミノプロピル）アミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して、白色粉末として得た（２５ｍｇ，５５％回収率）。 14． ImPyPy-β-PyPyPy-G-Dp ポリアミドは、自動化固相法により、２４０ｍｇの樹脂をＮ−メチル−ビス（アミノプロピル）アミン（２ｍｌ，５５℃）で切断して白色粉末として得た（２３．０ｍｇ，５３％回収率）。 15． ImPyPy-G-PyPyPy-G-Dp-EDTA ＥＤＴＡ−ジアンヒドリド（５０ｍｇ）を、５５℃で５分間加熱することにより、１ｍＬのＤＭＳＯ／ＮＭＰ溶液および１ｍＬのＤＩＥＡに溶解した。このジアンヒドリド溶液を、７５０μＬのＤＭＳＯに溶解したImPyPy-G-PyPyPy-G-Bp（１２．０ｍｇ，１１μｍｏｌ）に加えた。混合物を５５℃で２５分間加熱し、３ｍＬの０．１ＭＮａＯＨで処理し、５５℃で１０分間加熱した。０．１％のＴＦＡを加えて総容量を８ｍＬに調節し、溶液を調製ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより直接精製して、ImPyPy-G-PyPyPy-G-Bp-EDTAを白色粉末として得た（ＨＰＬＣ精製後，４．７ｍｇ，３１％回収率）。16． ImPyPy-G-PyPyPy-β-Bp-EDTA ポリアミドは、ImPyPy-G-PyPyPy-β-Bp(20mg)からImPyPy-G-PyPyPy-G-Bp-EDTAについて記載したように製造した（ＨＰＬＣ精製後，１３．０ｍｇ，５５％回収率）。 17． ImPyPy-β-PyPyPy-G-Bp-EDTA ポリアミドは、ImPyPy-β-PyPyPy-G-Bp(12mg)から、ImPyPy-G-PyPyPy-G-Bp-EDTA について記載したように製造した（ＨＰＬＣ精製後，６ｍｇ，４２％回収率）。18． Ac-PyImPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy-β-Dp ポリアミドは、機械補助固相法（２９）により、白色粉末として製造した（５ｍｇ，２０％回収率）。19． DM-γ-PyImPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy-β-Dp ポリアミドは、機械補助固相法により、白色粉末として得た（１３ｍｇ，５２％回収率）。20． DM-γ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy-β-PyPyPy-β-Dp ポリアミドは、機械補助固相法により、白色粉末として得た（３ｍｇ，１０％回収率）。 21． ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp ポリアミドImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dpは、機械補助固相法により、白色粉末として得た（１７ｍｇ，５６％回収率）。 22． ImPvPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp: ポリアミドImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dpは、機械補助固相法により、白色粉末として得た（１２ｍｇ，１９％回収率）。 23． ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dp ポリアミドImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-PAM-樹脂は、機械補助合成により、０．２ｍｍｏｌ／グラムのBoc-β-PAM-樹脂上に組み立てた。γ−Ｉｍ工程は、Ｂｏｃ −γ−Ｉｍ酸（ＨＢＴＵ，ＤＩＥＡ）を用いて組み立て、他のすべての残基は適当な活性化Ｂｏｃ保護モノマーユニットとして加えた。樹脂のサンプル（２５０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム²¹）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、２ｍＬのジメチルアミノプロピルアミンを加え、混合物を５５℃ で１８時間放置した。樹脂をディスポーザブルプロピレンフィルターを通して濾過により除去し、得られた溶液を水で総容量８ｍＬに希釈し、調製逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dp（２６ｍｇ，４５％回収率）を白色粉末として得た。 24． ImPyImPy-γ-ImPyImPy-β-Dp ポリアミドImPyImPy-γ-ImPyImPy-β-PAM-樹脂は、０．２ｍｍｏｌ／グラムのＢｏｃ−β−ＰＡＭ−樹脂上で手動ポリアミド合成により組み立てた。Ｐｙ−Ｉｍおよびγ−Ｉｍ工程はＢｏｃ−γ−Ｉｍ酸およびＢｏｃ−Ｐｙ−Ｉｍ酸（ＨＢＴＵ，ＤＩＥＡ）を用いて加え、他のすべての残基は適当な活性化Ｂｏｃ保護モノマーユニットとして加えた。樹脂のサンプル（２５０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム²¹）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、２ｍＬのジメチルアミノプロピルアミンを加え、混合物を５５℃で１８時間放置した。樹脂をディスポーザブルプロピレンフィルターを通して濾過により除去し、得られた溶液を水で総容量８ｍＬに希釈し、調製逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、Im PyImPy-γ-ImPyImPy-β-Dp（１９ｍｇ，３２％回収率）を白色粉末として得た。 25． ImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dp ポリアミドImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-PAM-樹脂を手動ポリアミド合成により、０．２ｍｍｏｌ／グラムＢｏｃ−ｂ−ＰＡＭ−樹脂上に組み立てた。γ−Ｉｍ工程は、Ｂｏｃ−γ−Ｉｍ酸（ＨＢＴＵ，ＤＩＥＡ）を用いて加え、他のすべての残基は適当な活性化Ｂｏｃ保護モノマーユニットとして加えた。樹脂のサンプル（２５０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム²¹）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、２ｍＬのジメチルアミノプロピルアミンを加え、混合物を５５℃で１８時間放置した。樹脂をディスポーザブルプロピレンフィルターを通して濾過により除去し、得られた溶液を水で総容量８ｍＬに希釈し、調製逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dp（１２ｍｇ，２１％回収率）を白色粉末として得た。 26． ImImImPy-β-PyPyPyPy-β-Dp 機械補助固相合成により製造したImImImPy-β-PyPyPyPy-β-樹脂のサンプル（２４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム）を、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、ジメチルアミノプロピルアミン（２ｍＬ）で５５℃で１８時間処理した。樹脂を濾過により除去し、濾液を０．１％（ｗｔ／ｖ）水性ＴＦＡで総容量８ｍＬに希釈した。得られた粗ポリアミド／アミン溶液を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImImImPy-β-PyPyPyPy-β-Dpのトリフルオロ酢酸塩（３１ｍｇ，４０％回収率）を白色粉末として得た。 27． ImImPyPy-β-PyPyPyPy-β-Dp 機械補助固相合成により製造したImImPyPy-β-PyPyPyPy-β-樹脂のサンプル（２４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム¹⁵）を、２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、ジメチルアミノプロピルアミン（２ｍＬ）で５５℃で１８時間処理した。樹脂を濾過により除去し、濾液を０．１％（ｗｔ／ｖ）水性ＴＦＡで総容量８ｍＬに希釈した。得られた粗ポリアミド／アミン溶液を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImImPyPy-β-PyPyPyPy-β-Dpのトリフルオロ酢酸塩（３１ｍｇ，４０％回収率）を白色粉末として得た。 28． ImPyPyPy-β-PyPyPyPy-β-Dp 機械補助固相合成により製造したImPyPyPy-β-PyPyPyPy-β-樹脂のサンプル（２４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、ジメチルアミノプロピルアミン（２ｍＬ）で５５℃で１８時間処理した。樹脂を濾過により除去し、濾液を０．１％（ｗｔ／ｖ）水性ＴＦＡで総容量８ｍＬに希釈した。得られた粗ポリアミド／アミン溶液を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImPyPyPy-β-PyPyPyPy-β-Dpのトリフルオロ酢酸塩（３１ｍｇ，４０％回収率）を白色粉末として得た。29． ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp 機械補助固相合成により製造したImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-樹脂のサンプル（２４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、ジメチルアミノプロピルアミン（２ｍＬ）で５５℃で１８時間処理した。樹脂を濾過により除去し、濾液を０．１％（ｗｔ／ｖ）水性ＴＦＡで総容量８ｍＬに希釈した。得られた粗ポリアミド／アミン溶液を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-DPのトリフルオロ酢酸塩（１３ｍｇ，１８％回収率）を白色粉末として得た。 30． ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp ポリアミドは、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dpについて記載したようにして、白色粉末として得た（２８ｍｇ，３４％回収率）。 31． ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp-NH₂ 機械補助固相合成により製造したImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-樹脂のサンプル（２４０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ／グラム）を２０ｍＬガラスシンチレーションバイアル中に入れ、３，３−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン（２ｍＬ）で５５℃で１８時間処理した。樹脂を濾過により除去し、濾液を０．１％（ｗｔ／ｖ）水性ＴＦＡで総容量８ｍＬに希釈した。得られた粗ポリアミド／アミン溶液を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-NH₂のトリフルオロ酢酸塩（３１ｍｇ，４０％回収率）を白色粉末として得た。32． ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp-NH₂ ポリアミドは、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-NH₂について記載したようにして、白色粉末として製造した。 33． ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp-EDTA ＥＤＴＡ−ジアンヒドリド（５０ｍｇ）を、５５℃で５分間加熱することにより、ＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１ｍｌ）およびＤＩＥＡ（１ｍＬ）の溶液に溶解した。ジアンヒドリド溶液をＤＭＳＯ（７５０μＬ）に溶解したImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPy Py-β-Dp-NH₂（８．１ｍｇ）に加えた。混合物を５５℃で２５分間加熱し、０．１ＭＮａＯＨ（３ｍＬ）で処理し、５５℃で１０分間加熱した。水性０．１％（ｗｔ／ｖ）ＴＦＡを加えて総容量を８ｍＬに調節し、溶液を調製ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより直接精製して、ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy-β-Dp-EDTAを白色粉末として得た（２．４ｍｇ，２２％回収率）。アフィニティー切断による結合方向の同定３つのヘアピンポリアミド:ImImPyPy-γ-ImXmPyPy-β-Dp-EDTA，ImPyImPy-γ- ImPyImPy-β-Dp-EDTA，およびImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dp-EDTAのＥＤＴＡ類似体の結合方向を同定するために、アフィニティ一切断アッセイ（２５ｍＭＴｒｉｓ−酢酸，１０ｍＭＮａＣｌ，１００μＭ／塩基対ウシ胸腺ＤＮＡ，ｐＨ７．０，２２℃）を実施した。ポリアミドImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dp-EDTA，ImPyImP y-γ-ImPyImPy-β-Dp-EDTAは、それぞれのパリンドロームマッチ配列，５'−ＴＧＧＣＣＡ−３'および５'−ＴＧＣＧＣＡ−３'を２つの等価の方向で認識し、これはヘアピン形成と一致する。これに対し、ポリアミドImImImXm-γ-PyPyPyPy -β-Dp-EDTAは、非パリンドローム配列，5'-TGGGGA-3'を１つの方向で認識し、ヘアピンモデルにより予測されたように、切断は部位の５'−側においてのみ認められた。図１７に示されるものは、プラスミドｐＳＥＳ９ｈｐからの３'−³²Ｐ−標識２８２ｂｐＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ制限フラグメントでの代表的なアフィニティー切断実験である。5'-TGGCCA-3'，5'-TGCGCA-3および5'-TGGGGA-3'部位は、オートラジオグラムの右側に示されている。レーン１，Ａ反応；レーン２，Ｃ反応；レーン３−５，１μＭ，２μＭおよび５μＭ ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dp-ED TA（１−Ｅ）；レーン６−８，１μＭ，２μＭおよび５μＭ ImPyImPy-γ-ImPyI mPy-β-Dp-EDTA（２−Ｅ）；レーン９−１１，１μＭ，２μＭおよび５μＭ ImI mImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dp-EDTA（３−Ｅ）；レーン１２，インタクトＤＮＡ。すべてのレーンは、１５ｋｃｐｍの３'−放射性標識ＤＮＡ，２５ｍＭＴｒｉｓ− 酢酸緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭＮａＣｌ，および１００μＭ／塩基対ウシ胸腺ＤＮＡを含む。（右）ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-Dp-EDTAおよびImPyImPy-γ -ImPyImPy-β-Dp-EDTAの１μＭ濃度でのアフィニティー切断パターン、およびIm ImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Dp-EDTAの５μＭ濃度でのパターン。２８２ｂｐ制限フラグメントは、示される配列の位置とともに表される。棒の高さは、各バンドにおける切断からの相対的保護に比例する。ボックスは、公開されたモデルから決定された等価結合部位を表し、ＤＮａｓｅＩフットプリント滴定により定量された部位のみがボックスで囲まれている。実施例２ポリアミド−Ｎｉ（Ｉｉ）トリペプチドコンジュゲートで修飾したポリアミドによる二重らせんＤｎａの合成および酸化的切断多くの抗癌剤は、ＤＮＡを修飾するその能力を通して作用する。新規ポリアミドコンジュゲートを、二重らせんＤＮＡを配列特異的様式で修飾するように設計した。より詳細には、金属ペプチドＮｉ（ＩＩ）・Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓをピロール−イミダゾールポリアミドに共有結合させた。コンジュゲートは、Ｄｅｒｖａｎのグループが開発した手動固相合成プロトコルを用いて、Ｂｏｃ−ピロール−ＯＢｔエステルおよびＢｏｃ−イミダゾール酸モノマー,γ−アミノ酪酸およびβ−アラニンの活性化エステル，およびＢｏｃ−β−アラニン−Ｐａｍ樹脂を用いて合成した。個々のポリアミドを逆相ＨＰＬＣにより精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により特徴づけた。金属ペプチドＮｉ（ＩＩ）・Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓは、モノペルオキシフタル酸の存在下で、ＤＮＡの効率的な酸化的切断を促進することが示されている（Mack and Dervan，J．Am．Chem．Soc.，11 2，4604(1990);Mack and Dervan，Biochemistry，31，9399(1992))。反応は、非拡散性高価ニッケル結合酸素による、ＤＮＡのデオキシリボース主鎖からの水素原子（一個またはそれ以上）の抽出を含むメカニズムを通して進行すると考えられる。ポリアミドが任意のあらかじめ定められたＤＮＡ配列を認識する能力とＮｉ（ＩＩ）・Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ化学を組み合わせるために、二官能性コンジュゲートを設計した。固相化学プロトコルを用いて、アミノ酸Ｈｉｓの対称無水物とＧｌｙの活性化エステルを、β−アラニン−Ｐａｍ樹脂上に直接延長されたヘアピンポリアミドとカップリングさせた。ｐＨ７．５でＮｉ（ＩＩ）・Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ修飾ポリアミドで処理した３２Ｐ末端標識ＤＮＡの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、コンジュゲートが二重らせんＤＮＡを、３'−末端標識ＤＮＡにおいて（１０ｎＭポリアミド）７７％および７２％の収率で配列選択的様式で切断しうることを示した。Ｎｉ（ＩＩ）・Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｈｉｓ修飾ポリアミドの化学構造は、図１８に示される。実施例３Ｄｎａ反応性薬剤で修飾したピロール−イミダゾールポリアミドによるＤｎａの配列特異的アルキル化配列特異的ＤＮＡ結合−修飾分子の設計には、２つの別々の実体、すなわち認識および機能的反応性の一体化が必要である。本発明者は、ピロール−イミダゾールポリアミドＤＮＡ結合モチーフと、マイナーグルーブ中の塩基の親電子的修飾を行うことができるメカニズムに基づく反応性官能基を組み合わせたリガンドを発見した。二重らせんＤＮＡのアルキル化のための配列特異的分子の設計には、特異的ＤＮＡ結合分子と原子特異的ＤＮＡ切断部分の両方が必要である。ヘアピンポリアミドは、任意の予め決定されたＤＮＡ配列に結合しうる配列特異的分子である。ＣＣ−１０６５のシクロプロピル求電子剤のブロモアセチルおよびプロドラッグ類似体は、原子特異的様式で二重らせんＤＮＡと反応する。ＣＣ−１０６５のシクロプロピル求電子剤のブロモアセチル部分またはプロドラッグ類似体をヘアピンポリアミドにつなぐことにより、本発明者は、ナノモル以下の濃度で任意の予め決定されたＤＮＡ配列を標的としうる配列特異的ＤＮＡアルキル化剤を発見した。成功する二官能性分子設計の２つの基準は、結合した複合体中の指定された単一の原子における配列特異的反応、および生理学的条件下（すなわち、中性ｐＨ，３７℃，１００−２００ｎＭＫＣｌ／ＮａＣｌ）で定量的な切断収率である。ＤＮＡ上で化学量論的反応を最大化するためには、「切断官能基」が、３７℃でＤＮＡと十分に反応性があり、水性媒体中で不活性であり、緩衝液成分と反応せず、ＤＮＡ上の所望の反応と競合して単分子分解を起こさないものでなければならない。そのような二官能性分子を設計するために、ＣＣ−１０６５のシクロプロピル求電子剤のＮ−末端ブロモアセチル基またはプロドラッグ類似体を備えたヘアピンポリアミドを製造した。Ａ．ブロモアセチル化ポリアミドポリアミドNH₂PyPyPyPy-g-ImPyPyPy-b-Dpは、配列5'-AGTTT^*A-3' を標的とするように設計した。Ｔ＊はアルキル化アデニンの向かい側のチミンを表す。ポリアミドは、固相プロトコルにより合成し、ジメチルアミノプロピルアミンにより固体支持体から切断し、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製した。末端ピロール残基を脱保護し、アセチル化されないままにしておき、Ｎ− 末端に遊離の第１アミンを残した。ポリアミドをブロモアセチル化するために、ブロモ酢酸を１ｍｌＤＭＦ中でＨＯＢｔおよびＤＣＣで活性化した。５分後、ＤＣＵを濾別し、溶液をＤＩＥＡとともにポリアミドに加えた。１５分後、反応混合物を逆相ＨＰＬＣにより直接精製して、ブロモアセチル化ポリアミドを単離した。短い反応時間を用いて、未保護イミダゾール環窒素のアルキル化を回避した。精製したＮ−ブロモアセチルヘアピンポリアミドは、質量分析により特性決定した。ブロモアセチル化ヘアピンポリアミドの合成は図１９に記載されている。延長されたヘアピンモチーフに基づいて別の組のポリアミドを合成した。このモチーフは、ヘアピンモチーフのγ−ターンと延長モチーフのβ−アラニンスペーサーとを組み合わせたものであり、２：１結合モードと１：１結合モードとの組み合わせである。以下の化合物を合成した:PyPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dp ，PyPyPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dp，PyPy-β-PyPyPy-γ-PyPyIm-β-Dp，およびPyPyPyPyPyPy-γ-PyPyIm-β-Dp。ブロモアセチル化延長ヘアピンの合成は成功し、ブロモアセチル化ヘアピンポリアミドについて記載したように製造した。対照として、４つすべてのアセチル化化合物を同様に作成した。Ｂ． PyPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dpの典型的手動固相ポリアミド合成Ｂｏｃ−β−アラニン−Ｐａｍ樹脂（１．２５ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌガラス反応容器中に入れ、ＤＭＦ中で５分間撹拌し、排出した。樹脂をＤＣＭ（２倍容量）で洗浄し、８０％ＴＦＡ／ＤＣＭ／０．５ＭＰｈＳＨで脱保護した（１回洗浄，１Ｘ２０分間）。脱保護の後、樹脂をＤＣＭで３回、ＤＭＦで１回洗浄した。Ｂｏｃ−ピロール−ＯＢｔエステル（３５７ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＭＦに加え、続いて１ｍｌのＤＩＥＡを加えた。カップリング反応は、４５分間激しく撹拌した。定期的に樹脂サンプル（５ｍｇ）を採取して、ＨＰＬＣにより合成をモニターした。続いて、残りのモノマー，Boc-Py-OBt(2X)， Boc-γ-Im-COOH，Boc-Py-OBt(4X)のサイクルを行った。Boc-γ-Im-COOHは、２ｍｌのＤＭＦ中のＨＢＴＵ（３７８ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加えることにより活性化した。ＤＩＥＡ（１ｍｌ）を加え、溶液を透明になるまで５分間放置した。合成の完了後、樹脂をＤＭＦ，ＤＣＭ，メタノール、およびエチルエーテルで洗浄した。次に樹脂を凍結乾燥して、溶媒を除去した。ポリアミドを、（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアミノプロピルアミン（２ｍｌ）でガラスシンチレーションバイアル中で５５℃で１２時間、樹脂から切り離した。ポリアミドを濾過し、ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡで０．２５％ＣＨ₃ＣＮ／ｍｉｎ勾配を用いて精製した。Ｃ．ブロモアセチル化ポリアミドの合成ブロモ酢酸（６５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾチアゾール（６５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶解した。ＤＣＣ（１０２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、ＤＣＵを濾別し、溶液をポリアミド（１０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）に加えた。濾液を１ｍｌＤＭＦで洗浄し、３００μｌのＤＩＥＡを反応に加えた。反応を室温で１５分間放置した。０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ中で０．２５％ＣＨ₃ＣＮ／ｍｉｎの勾配での溶出によるＨＰＬＣ精製によりブロモアセチル化ポリアミドを回収した（０．１８４ｍｇ，１３５．６μ ｍｏｌ）。Ｄ． AcPyPyPyPy-γ-ImPyPyPy-Dp 上述のようにして合成した。Ｅ． NH₂PyPy-β-PyPyPy-γ-XmPyPy-β-Dp 上述のようにして合成した。Ｆ． AcPyPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dp ＤＭＳＯ／ＮＭＰ（５００μｌ）およびＤＩＥＡ（５００μｌ）中のNH₂PyPy-β -PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dpの溶液に無水酢酸（４００μｌ）を加えた。反応を５５℃で１５分間加熱し、上述のようにＨＰＬＣ精製した。Ｇ． BrAcPyPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dp 上述のブロモアセチル化ポリアミドと同様に合成した。Ｈ． NH₂PyPyPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dp 上述のようにして合成した。Ｉ． AcPyPyPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-Dp 上述のようにしてアセチル化した。 NH₂PyPy-β-PyPyPy-γ-PyPyIm-β-Dp．上述のようにして合成した。Ｊ． AcPyPy-β-PyPyPy-γ-PyPyIm-β-Dp 上述のようにしてアセチル化した。 NH₂PyPyPyPyPyPy-γ-PyPyIm-β-Dp．上述のようにして合成した。Ｋ． AcPyPyPyPyPyPy-γ-PyPyIm-β-Dp 上述のようにしてアセチル化した。 BrAcPyPyPyPyPyPy-γ-PyPyIm-β-DP．上述のようにしてブロモアセチル化した。Ｌ．アルキル化反応３’末端で放射性標識した（１０，０００ｃｐｍ／反応）ｐＢＲ３２２の２６２ｂｐ制限フラグメント（ＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩ）でアルキル化を調べた。ポリアミドまたはブロモジスタマイシンを適当な濃度で加えた。最終反応濃度は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），１００μＭ超音波処理ウシ胸腺ＤＮＡであった。反応を３７℃で、０，１，５，１０，２０，および４０時間インキュベートした。インキュベートの後、反応をエタノール沈殿させ、１０μｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、９０℃で１５分間加熱した。ピペリジン（４０μｌ，１．４Ｍ）を加え、反応を再び９０℃で１５分間加熱した。ピペリジンを凍結乾燥により除去し、反応を７μｌの１ｘＴＢＥ／８０％ホルムアミド負荷緩衝液に溶解し、８５℃で１０分間加熱することにより変性し、氷上に置いた。反応を８％ポリアクリルアミドゲル（５％架橋，７Ｍ尿素）で１ｘＴＢＥ中で２０００Ｖで電気泳動した。ゲルを乾燥し、記憧ホスファースクリーン (storage phosphor screen;Molecular Dynamics)を感光させた。Ｍ． NH₂PyPyPyPy-γ-ImPyPyPy-NH(CH₂)₂OH ポリアミドは、グリシン結合Ｐａｍ樹脂上で上述のように合成した。切断のために、樹脂（５００ｍｇ）を計り取り、５０ｍｌフラスコの５ｍｌの１００％ＥｔＯＨ中に加えた。等重量のＬｉＢＨ₄（５００ｍｇ，２３ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。樹脂を５５℃で２時間インキュベートし、必要に応じてさらにエタノールを加えた。ポリアミドは、上述のようにＨＰＬＣ精製した。実施例４ポリアミドＣＢＩユニットＢｏｇｅｒらは、（＋）ＣＣ−１０６５のＡ環の多くの修飾体を合成して、これらの薬剤のアルキル化能に及ぼす立体的変化の影響を調べた。このＣＣ−１０６５誘導体を用いる研究においては、薬剤の安定性と細胞毒性の間に直接的直線的相関があることが示された。加溶媒分解に対してより安定な化合物は、最も高い程度の細胞毒性をも示した。これまでに最も成功した修飾は、１，２，９，９ａ−テトラヒドロシクロプロパ［ｃ］ベンズ［ｅ］インドール−４−オン（ＣＢＩ）の合成である。これは、縮合ピロールを縮合ベンゼン環で置き換え、系における環の束縛を解放した(Boger，D.L.，Yun，W.，and Han，N．Bioorganic and Medicinal Chemistry 1995，3，1429-1453.)。ＣＣ−１０６５のＢ環とＣ環にカップリングしたとき、ＣＢＩは（＋）ＣＣ−１０６５それ自体より高い安定性、反応性、および選択性を示した。Ｂｏｇｅｒはまた、Ｂｏｃ保護ＣＢＩユニットがＤＮＡアルキル化に十分であることを示した。この早い速度論および効率的なアルキル化のため、ＣＢＩをヘアピンにつないで強力な配列特異的アルキレーターを生成するための理想的な候補である。ＣＢＩサブユニットは、Ｂｏｇｅｒ(Boger，D．L．a．McKie.，J.A．J．Org． Chem．1995．60．1271-1275)に記載のように合成した。簡単には、アンモニアと１，３−ジヒドロキシナフタレンを縮合し、Ｂｏｃアンヒドリドにより速やかにＢｏｃ保護することにより、Ｎ−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシ−２−ナフチルアミンを合成した。アルコールを臭化ベンジルで保護した後、ＮＩＳで処理して、ヨードナフチルアミンを得た。臭化アリルでアルキル化して、Ｂｕ₃ＳｎＨおよびＴＥＭＰＯラジカルトラップを用いて、望ましい５−エキソ−トリグ（ｔｒｉｇ）アリールラジカル−アルケン環化が生ずるための基質を得た。活性化Ｚｎ粉末とともに加熱すると、ＴＥＭＰＯトラップ中間体の切断が生ずる。ＰＰｈ₃／ＣＣｌ₄で処理し、続いてベンジルエーテルを加水分解して、所望の生成物を得た。ポリアミド−ＣＢＩユニットのカップリング条件の後処理をするために、簡単な三環化合物であるImPyPy-b-NH(CH₂)₂NH₂を作成した。新規な活性化方法は、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、すなわち、ＮＨＳエステルにより活性化した二酸を用いた。Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，Ｅ．Ａ．らの方法(Lukhtanov，et al．Nucleic Acids Research 1996，24，683-687)にしたがって、β−アラニンリンカーをＣＢＩユニットに加えて反応の完了を容易にした。ＨＰＬＣ精製の後、１つの主要なピークを単離した。この画分を質量分析およびＮＭＲにより分析し、ポリアミド−ＣＢＩ（クロロ）コンジュゲートであると同定することができた。ＣＢＩ−ポリアミドコンジュゲートの合成は図２３に示される。Ａ． ImPyPy-β-ED ポリアミドは上述のように合成し、エチレンジアミンで切断した。上述のようにＨＰＬＣ精製した。Ｂ． ImPyPy-β-ED-スクシンイミド-NHS ImPyPy-β-ED（10mg）を２ｍｌのＤＭＦに溶解し、ジスクシンイミジルグルタレート（１００ｍｇ）およびＤＩＥＡ（１０μｌ）の１ｍｌＤＭＦ中の溶液に室温で一度に１００μｌずつ加えた。反応は、分析ＨＰＬＣによりモニターし、ポリアミドを最後に加えた１時間後に完了した。調製ＨＰＬＣにより白色粉末を得た。Ｃ．Ｂｏｃ−β−アラニン−ＣＢＩアルコール（２１７ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）を上述のように脱保護した。酢酸エチルを除去した後、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解した。Ｂｏｃ−β−アラニン（２４５．９８ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（７６７ｍｇ，４ｍｍｏｌ）に加えた。反応をアルゴン下で一夜撹拌した。溶媒を真空中で除去し、２０ｍｌの水中で沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、水で洗浄し、凍結乾燥した。フラッシュクロマトグラフィーにより、黄色粉末を得た。Ｄ．ＣＢＩコンジュゲート化ポリアミドＢｏｃ−β−アラニンＣＢＩは、上述のように脱保護した。１００μｌのＤＭＦ中のＩｍＰｙＰｙ−β−ＥＤ−スクシンイミド−ＮＨＳ（２０ｍｇ）の溶液を１０μｌのＤＩＥＡとともに加えた。反応を室温でアルゴン下で一夜撹拌した。ＨＰＬＣ精製により、白色粉末を得た。実施例５ポリアミド−インターカレーターコンジュゲート蛋白質：ＤＮＡ相互作用の人工的制御は、潜在的に強力な治療道具である。ＤＮＡの蛋白質認識は、特異的なものも非特異的なものも、近傍のＤＮＡ構造に強く依存する(Luisi，B．(1995)，DNA-protein:Structural Interactions，ed．Li lley，D．M．J．(IRL Press，Oxford)，p．23.)。例えば、ＤＮＡのベント配列は、ＨＭＧ−Ｉにおけるように、非特異的蛋白質を補充することができ、あるいは蛋白質が高親和性結合のために適当な接触を形成することを防止することができる。ＤＮＡの予め決定された配列に結合し、局所的ＤＮＡトポロジーを変更させるよう設計された小分子は、ＤＮＡ結合蛋白質の機能の制御のための一般的なアプローチであろう。インターカレーターは、強力な抗菌剤および抗腫瘍剤である一群の分子である（Neidle and Abraham（1984）CRC Crit．Rev．Biochem．17，73-121．Wang，A ．H-J．(1992)Curr．Opin．Struct．Biol．2，361-368.）。Ｌｅｒｍａｎは、二重らせんの隣接する塩基対の間への、平面的芳香族発色団の挿入として、インターカレーションを最初に記載した(Lerman.L．S．(1961)J．Mol．Biol．3，18-30 ．）。Ｂ−形ＤＮＡの上昇は通常３．４Ａ／塩基対である。インターカレーターのスタッキングは、隣接する塩基対をさらに３．４Ａ離し、らせんの長さを延長させて、結合したインターカレーターあたりの量を平衡化させる。インターカレーション部位に隣接する塩基対もまた互いに１０−２６°ほどけている。一般に、その治療活性の基礎となると考えられるものは、インターカレーションにより導入されたこれらの構造的ひずみである。しかし、ほとんどの場合、インターカレーション部位の数塩基対以内では、ＤＮＡらせんはそのＢ−形構造に戻ることに注意することが重要である。塩基対の間でスタッキングする性質のため、インターカレーターは一般に配列特異性をほとんどまたは全く示さない。アクチノマイシンＤおよびインターカレーターのアントラサイクリンおよびプルラマイシンファミリー等の若干の天然産物は、ある種のジヌクレオチド工程に対する優先性を付与する官能基を付加した (Hansen and Hurley（1996）Acc．Chem．Res．29，249-)。アクチノマイシンＤは、グアニンの環外アミンと接触する２つの同一の環状ペンタペプチドにカップリングした芳香族フェノキサゾンのコアからなり、５’−ＧＣ−３’ 工程でインターカレーションのための特異性を与える。同様に、アンスラサイクリンおよびプルラマイシン・インターカレーターの発色団に結合した炭水化物部分は、メジャーグルーブおよびマイナーグルーブの両方においてＤＮＡ塩基と相互作用して、これらの分子に配列優先性を与える。ほぼすべての場合に、これらの天然産物の配列特異性は、インターカレーション部位に隣接する２つの塩基対に限られている。非特異的インターカレーター部分をポリアミドに連結すると、蛋白質：ＤＮＡ相互作用の制御に必要なＤＮＡ構造の配列特異的ゆがみが生ずるであろう。臭化エチジウムは、約１０⁵Ｍ^-1のＫａでＤＮＡに結合し、ＤＮＡらせんを２６°ほどくことが示されている慣用的なインターカレーターである(LePecq and Paolet ti（1967）J．Mol．Biol．27，87-106;Waring，M．(1970)J．Mol．Biol．54，24 7-279;Wang，J．C．(1974)J．Mol．Biol．89，783-801;Bresloff and Crothers （1975)J．Mol．Biol．95，103-123.）。エチジウムの誘導体であるメチジウムは、設計されたインターカレーターの製造において用いられており、メチジウム −プロピル−Ｆｅ・ＥＤＴＡ（ＭＰＥ）フットプリンティングの基礎として働く (Dervan and Becker（1978）J．Am．Chem．Soc．100，1968-1970;Hertzberg and Dervan（1982）J．Am．Chem．Soc．104．313-315.)。本発明者により、一連のメチジウム−ポリアミドコンジュゲートの合成およびＤＮＡ−結合特性が発見された。メチジウム−ポリアミドコンジュゲートは、転写因子，ＧＣＮ−４，ＳＰ１，およびＮＦ−_KＢ等の広範な種類のＤＮＡ結合蛋白質によるＤＮＡ結合を阻害するのに十分であろうように、配列特異的にらせんをほどき、延長することを誘導するよう設計される。Ａ．メチジウム−ポリアミドインターカレーターの設計および合成一般設計DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C_n-Mdm(DMγ=N,N-ジメチル-γ-アミノ酪酸．C_n=炭素原子ｎ個のジアミンリンカー，Mdm=p-カルボキシメチジウム)の一連のメチジウム−ポリアミドコンジュゲートを合成した。ポリアミドは一般にＣ−末端に正に荷電したジメチルアミノプロピルアミドを含む。この場合、Ｃ− 末端がメチジウムにコンジュゲートされるため、正味正電荷を維持するためにＮ −末端にDMγが置かれた。この変更は、ポリアミド結合に有意な影響を及ぼさなかった。Ｂｏｃ−化学固相ポリアミド合成により、溶液中におけるメチジウムコンジュゲーションに適当なミリグラム量の精製ポリアミドの迅速な製造が可能となつた。DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-Pam-樹脂をBoc-Py-OBtエステルおよびBoc-I m酸モノマーから製造した。種々のジアミン（NH₂(CH₂)_nNH₂，n.2.4.6）でのアミノ分解、続いて調製ＨＰＬＣ精製により、メチジウムとカップリングさせるのに適当なＣ−末端１級アミンを有する遊離ポリアミドが得られた。ポリアミドアミンとｐ−カルボキシメチジウムのアシルイミダゾールエステルとの反応、およびＨＰＬＣ精製により、種々のリンカー長さを有する一連のメチジウム−ポリアミドコンジュゲートを製造した。ポリアミド／メチジウムカップリング反応は、分析ＨＰＬＣによれば、定量的であった。DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C_n-NH₂からの精製コンジュゲートは、１４．５％の平均回収率が得られた。各コンジュゲートの¹ＨＮＭＲスペクトルは、ポリアミドおよびメチジウムプロトンと一致する共鳴、ならびに、ポリアミド／メチジウムカップリング反応において形成されたアミド結合に由来する８．７５ｐｐｍに追加のブロードな三重項を有していた。各コンジュゲートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、コンジュゲート化された種の質量と一致する化合物の存在を明らかにし、遊離ポリアミドまたはメチジウムは認められなかった。二官能性メチジウム−ポリアミドコンジュゲートの合成は、図２４に記載される。 DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C_n-Mdmコンジュゲートは、ＧＣＮ４のＡＲＥおよびGＣＲＥ結合部位の5'-TGACT-3'部分を標的とする。ＣＰＫモデリングにより、インターカレーションはＧＣＮ４結合部位の３’末端の２つの塩基対の間、すなわちＡＲＥについてはＡＴ(5'-CTGACTAAT-3')、およびＧＣＲＥについてはＴＴ( 5'-ATGACTCTT-3')で生ずることが予測される（インターカレーション部位は太字で示す）。メチジウム（Ｋ_a１０⁵Ｍ^-1）とポリアミド（Ｋ_a１０⁵Ｍ^-1）部分とのカップリングはまた、結合親和性の顕著な増加を生成することが予測される。メチジウム−ポリアミドコンジュゲートの5'-AGTGTA-3'部位への結合は、以下に描写される。メチジウムは、灰色の四角で表され、塩基対の間に配置されており、ここで、インターカレーションは、分子モデリング研究に基づいて予測されている。 ¹H NMRは、300MHzで動作するGE 300装置で記録した。スペクトルは、DMSO-d₆ で記録し、化学シフトは、残存DMSO-d₅に対するｐｐｍで表した。UVスペクトルは、Hewlett-Packardモデル8452Aダイオードアレイ分光光度計で測定した。飛行質量分析のマトリックス補助レーザー吸収／イオン化時間は、California Insti tute of Technologyのthe Protein and Peptide Microanalytical Facilityにおいて実施された。HPLC分析は、HP 1090M分析HPLCまたはBeckman Goldsystemのいずれかにより、Rainen C18，Microsorb MV，５μm，300x4.6mm逆相カラム、0.1% （wt/v）TFA、溶出剤としてアセトニトリルおよび1.0ml/minの流速、1.25毬アセトニトリル/minの勾配溶出を用いて行った。調製HPLCは、Beckman製機械でWater s DeltaPak 25x100mm 100μm C₁₈カラムを用いて、0.1%（wt/v）TFA中、0.25%/m in．CH₃CNの勾配溶出を用いて実施した。水はミリポア（Millipore）Milli-Q水精製システムから得た。特に記載しない限り、試薬等級の化学物質を用いた。制限エンドヌクレアーゼは、New England BiolabsまたはBoeringher-Mannheimのいずれかから購入し、製造元のプロトコルにしたがって使用した。シークエナーゼ (Sequenase(version 2.0))は、United States Biochemicalから入手し、DNase Ｉ(FPLCpure)はBoeringher-Mannheimから入手した。[α-³²P]-チミジン-5'-トリホスフェート(3000C_i/mmol)，および[α−³²P]-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(6000C_i/mmol),はDu Pont/NENから購入した。Ｂ．ポリアミド−メチジウムコンジュゲートの合成 Boc-Im酸およびBoc-Py-OBtを、それぞれ５および６工程で合成した。DMγ-ImPyP y-γ-ImPyPy-β-Pam-樹脂は、Ｂｏｃ−化学を用いて手動固相合成プロトコルにより製造した。純ジアミン中でのアミノ分解（２ｍＬ，２４−４８時間，６０℃ ）により、ポリアミドを樹脂（４００ｍｇ）から切断し、調製ＨＰＬＣにより精製した。ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のｐ−カルボキシメチジウム酸（５０ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（２００μL）中のカルボニルジイミダゾール（２２ｍｇ）およびＮ− エチルモルホリン（１５μＬ）との反応（２５℃，１時間）により活性化した。この溶液のアリコート（３７５μＬ）およびＤＩＥＡ（１５０μＬ）を、それぞれＤＭＳＯ（１５０μＬ）中のＤＭγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C_n-NH₂(n=2，4，6) ポリアミドに加えた。１２−２４時間後、反応を０．１％（ｗｔ／ｖ）ＴＦＡ（５ｍＬ）で希釈し、ＨＰＬＣにより精製した。Ｃ． DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₂-Mdm ｐ−カルボキシメチジウム酸のDMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₂-NH₂(20mg,19μmol ）へのカップリングにより、DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₂-Mdmを紫色粉末として得た(3.0mg,２μmol，10.5%回収率)。Ｄ． DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₄-Mdm p-カルボキシメチジウム酸のDMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₄-NH₂(35mg，32μmol ）へのカップリングにより、DMγ-ImPyPy-γ-XmPyPy-β-C₄-Mdmを紫色粉末として得た(8.7mg,６μmol，19%回収率)。Ｅ． DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₆-Mdm p-カルボキシメチジウム酸のDMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₆-NH₂(30mg，27μmol) へのカップリングにより、DMγ-ImPyPy-γ-ImPyPy-β-C₆-Mdmを紫色粉末として得た(5.3mg，3.7μmol，14%回収率)。実施例６ポリアミド色素結合体核酸配列特異的検出のための溶液法は試料調製および測定の時間分析に関していくつかの利点を与える。現在、この分野におけるほとんどの努力は一本鎖標的のハイブリダイゼーション法に焦点を当てている。二本鎖らせんＤＮＡの標的化はプラスミド、コスミドまたはゲノムＤＮＡを含む生物学的ＤＮＡ試料の直接検出を可能にする。ＤＮＡ結合ピロール−イミダゾールポリアミドはＤＮＡへ環境感受性蛍光色素を配列特異的に送達するであろう。いくつかの色素はＤＮＡとの結合により著しく蛍光が増加することを示しており、その中にはＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（エチジウムブロミド）があり、および最も注目されるのはチアゾールオレンジである。より一般的には、ダンシルおよびマンシルのような色素が環境へとてつもなく大きな感受性を示す。配列特異的、高親和性ＤＮＡ蛍光色素を開発するために多数のそのような色素で結合体が製造された。各々の色素のポリアミド部分は固相合成法を使用して製造され、アミン反応性蛍光色素と反応させた。多数の色素および”リンカージアミン”が検討された。これらの結合体は、任意の前もって決められたＤＮＡ配列を認識する能力と直接的にシグナルと結合する能力を兼ね備えた点で独特である。実施例７エネルギー移動を通したＤＮＡ検出特定のＤＮＡ配列へ結合することにより増大されたまたは特異的な蛍光を示す系はゲノム分析に有用な試薬となるであろう。色素間のエネルギー移動は配列特異的イミダゾール−ピロールポリアミド近位のＤＮＡ結合部位への同時結合を検出する手段を提供する。（Ｊｕ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２，４３４７−４３５１．，Ｎｉｅ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６，１０１８−１０２１）。二つのＤＮＡ結合ポリアミドは隣接するＤＮＡ結合部位（一つはドナー色素と結合体形成し、他方はアクセプター色素と結合体形成する）を標的にするように製造されるであろう。色素対は、ドナー色素がアクセプターを励起することなしに励起できるように選択されるであろう。このエネルギーでの励起により、ドナーからのエネルギー移動を通してドナー蛍光色素近くのアクセプター蛍光色素の蛍光のみが生じるであろう。二つのポリアミドに必要とされる結合は、ゲノムレベル分析に適当なレベルにまで有効認識配列を伸ばすであろうし、本技術の特異性を改良するであろう。本発明者により開発された色素結合体生成化学を用いると、複数の結合体が製造、精製および特徴付けされるであろう。フルオレセイン−ローダミンまたはチアゾール−オレンジ／ローダミンのようなドナー−アクセプター対のこの系での算定可能性が分析されるであろう。このエネルギー移動系はポリアミドの現在利用できる認識配列を増加させ、均一および不均一検出系の両方に応用可能な独特な結合依存性シグナルを提供する。エクサイマー（励起状態ダイマー）を目的とするピレンおよび類似の系は三次元空間に二つまたはそれ以上の分子が接近して存在することを提供する。ＤＮＡ結合ポリアミドはピレンをＤＮＡ上の近位の位置に送達する。次に結合がエクサイマーの形成によりモニターされる。ピレンポリアミド結合体の構造は以下に示されている。ピレン−ＰｙＰｙＰｙ−β−ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙ−β−Ｄｐ実施例８ポリアミドビオチン結合体配列特異的ＤＮＡ結合ポリアミドおよびビオチン間で製造された結合体は種々の応用において有用である。第一に、そのような化合物はビオチンとタンパク質ストレプトアビジンの強い相互作用を通して種々のマトリックスへ容易に結合させることができる。（Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｏｈｌｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．Ｈ．，Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｌｅｍｍｅ，Ｆ．Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３，８５−８８）。容易に入手可能なストレプトアビジン誘導体化マトリックスには分離のための磁気ビーズならびにクロマトグラフィーのための樹脂が含まれる。（Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｌ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，４９５−４９８；Ｔａｇｌｅ，Ｄ．Ａ．，Ｓｗａｒｏｏｐ，Ｍ．，Ｌｏｖｅｔｔ，Ｍ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ３６１，７５１−７５３）。多数のそのようなポリアミド−ビオチン結合体が固相合成法により合成されている。種々のジアミンによる樹脂の切断に続いて、ポリアミドをビオチンカルボン酸誘導体と反応させて結合体を得た。結合体はＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ −ＴＯＦ質量分析法および¹ＨＮＭＲで確認した。ビオチン−ポリアミド結合体の合成は図２７に示されている。本発明で製造された多数の二機能性ビオチン −ポリアミド結合体の化学構造は図２８Ａ−Ｄに示されている。二機能性ポリアミド−ビオチン結合体による配列特異的親和性捕捉のスキームは図２９に概説されている。実施例９ポリアミド−ソラレン結合体によるＤＮＡの光活性化修飾ポリアミド−ソラレン結合体によるＤＮＡの光活性化修飾。ソラレンおよびソラレン誘導体は癌の処置において光活性薬剤として使用されてきた。（Ｅｄｅｌｓｏｎ，ｅｔａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６．２９７（１９８７））。これらの分子は二重らせんＤＮＡ内へインターカレートし、ＵＶＡの照射によりチミン残基の５、６二重結合と［２＋２］付加環化反応を起こして単付加物および鎖間ＤＮＡ架橋の両方を形成する。（ＰｓｏｒａｌｅｎＤＮＡＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１ａｎｄ２；Ｇｅｓｐａｒｒｏ，Ｆ．Ｐ．，Ｅｄ．ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌ．１９８８）。我々の最近の興味は、配列特異的様式でＤＮＡへの共有結合的結合を形成するように設計された光活性ポリアミド−ソラレン結合体Ｂの合成およびインビトロ分析に焦点を合わせてきた。ＤＮＡ修飾の永久共有結合的修飾の引き金としての光の使用は、副溝結合ポリアミドによる転写の特異的阻害のようなインビボ応用可能性に魅力的な手段であることが証明されている。伸張ヘアピンポリアミド−ソラレン結合体Ｂは５−（８−ソラレニルオキシ）ペンタン酸（Ｌｅｅ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１２０８）のＯＢｔエステルとβ −アラニン−Ｐａｍ樹脂上に直接結合された伸張ヘアピンポリアミドとのカップリングにより合成された。ｐＨ７．５でのソラレン−ポリアミド結合体と２４７ｂｐ制限断片を平衡化させ、続いて３６０ｎｍで照射すると、鎖内架橋形成の程度は１０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のポリアミドで各々の１５−２０％および５４−５７％の範囲にあることが示された。我々の最近の研究は、鎖内共有結合的修飾の部位ならびに二重らせんＤＮＡ上の可能性のある単一付加物形成部位を位置決定するための手段としてポリメラーゼ停止アッセイを使用することである。ソラレン−ポリアミド結合体の構造は図３０に示されている。実施例１０ポリアミド結合のインビトロアッセイ９ｂｐポリアミド結合部位が制限エンドヌクレアーゼＰｖｕIIのための切断部位の二つの塩基対と重複している、遺伝子操作され、放射性標識されたｐＵＣ− １９からの制限断片が調製された。ＰｖｕIIによる切断は、重複ポリアミド結合部位がポリアミドにより占領されている場合には妨げられる。対照として、ＰｖｕII部位を含んでいるが重複ポリアミド結合部位を欠いている第二の放射性標識ＤＮＡ断片が調製された。標的結合部位へのポリアミド会合の速度は、ポリアミド溶液を放射性標識標的および対照断片と混合し、酵素ＰｖｕIIによる処理（１−２分）を開始する前に５分から５時間放置することにより評価された。実験条件下、対照部位はほとんど完全に切断されたが、標的部位での保護が観察され、それはポリアミド濃度および平衡化時間に関連付けできる。同様に、解離速度は標識ＤＮＡ断片およびポリアミドの平衡化溶液に過剰の非標識競合剤ＤＮＡを加えることにより分析された。競合剤の添加は遊離ポリアミドの濃度をゼロに減少させる。標識断片上の標的部位からポリアミド解離が起こる速度は、再平衡化時間が増加するにつれてのＰｖｕIIの保護喪失の速度により追うことができる。９環伸張ヘアピンポリアミドＩｍＰｙＰｙ−γ−ＩｍＰｙＰｙ−β−ＰｙＰｙＰｙ−Ｇ−Ｄｐの同種９塩基対一致部位への結合に対する時間についての会合プロフィールは図６に示されている。伸張ヘアピン解離速度はｋｄ＝３．１±０．２ｘ１０^-5ｓ^-1であることが決定され、これは６．２時間の半減期（１０ｍＭビス−トリス（ｐＨ７．０）、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭメルカプトエタノール、３７℃）に相当している。ここで、半減期は５０％のＤＮＡおよびポリアミドが解離または会合するのに必要とされる時間として定義される。会合速度はｋａ＝１．３± ０．８ｘ１０⁴ｓ^-1であることが決定された；これは５．０ｎＭで３．０時間の半減期に相当する。平衡会合定数として決定された値（ｋｅｑ＝６．３±０．８ｘ１０⁸Ｍ^-1）は速度論的に決定された比（ｋａ／ｋｄ＝４．２±２．６ｘ１０⁸ Ｍ^-1）とよく一致している。これらの結果は、ポリアミドは秒から分以内で指示された標的部位へ結合し、そのような部位からの解離が起こるには時間の単位がかかることを示している。特にこれらの結果は、ポリアミドが会合および解離速度の組み合わせでDＮＡと結合してＤＮＡ結合タンパク質の活性を有効に調節することを示している。実施例１１Ｐｙ−ＩｍポリアミドによるＤＮＡ認識のための協同的ヘアピンダイマー細胞に浸透しおよび前もって決められたＤＮＡ配列へ結合する小さな分子は特定の遺伝子の発現を制御する可能性を持っている。（Ｔｒａｕｇｅｒ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ１９９６，３８２，５５９-５６１；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８７，２０２-２０５）。最近、６塩基対標的部位へ結合する８環ポリアミドが細胞培養において遺伝子転写を阻害することが示された（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８７，２０２-２０５）。より長いＤＮＡ配列を認識するポリアミドはより特異的な生物学的活性を持っているのが当然であり（Ｐ．Ｂ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８６，２３２，４６４）、それはより大きなヘアピンを合成することにより達成できるであろう（Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔａｌ．ＥＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，７６３６-７６４４）。しかしながら、有効な細胞浸透に関するポリアミドサイズの上限は知られていない。さもなくば、より生物模倣的方法はポリアミドのサイズを維持しながらより大きなＤＮＡ配列を結合させることである。天然の転写因子はしばしば隣接する半部位での協同的タンパク質ダイマーの形成により大きなＤＮＡ配列に結合する（Ｐｔａｓｈｎｅ，ｅｔａｌ．ＡＧｅｎｅｔｉｃＳｗｉｔｃｈ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓａｎｄＣｅｌｌｒｅｓｓ：ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，１９８６；Ｐａｂｏ，ｅｔａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，６１，１０５３-１０９５；Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ１９９２，３５６，４０８-４１４；Ｋｌｅｍｍ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ１９９４，７７，２１-３２；Ｂｅｌｌｏｎ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９７，４，５８６-５９１）。伸張Ｐｙ−Ｉｍポリアミドダイマーの協同的結合のためには、二つのリガンドがお互いに関して横に滑ることができると他の配列の認識が可能になる（Ｔｒａｕｇｅｒ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１６０-６１６６；Ｓｗａｌｌｅｙ，ｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１９９７，３，１６００-１６０７）。転回特異的γ−アミノ酪酸リンカーを利用しているヘアピンポリアミドは、完全に重複されているように、および”滑ったモチーフ”選択肢を排除するように構築される（Ｍｒｋｓｉｃｈ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，７９８３-７９８８；Ｐａｒｋｓ，ｅｔａｌ．ｉｂｉｄ．１９９６，１１８，６１５３-６１５９；Ｓｗａｌｌｅｙ，ｅｔａｌ．ｉｂｉｄ．１９９６，１１８，８１９８ -８２０６；Ｓｗａｌｌｅｙ，ｅｔａｌ．ｉｂｉｄ．１９９７，１１９，６９５３-６９６１；Ｔｒａｕｇｅｒ，ｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１９９６，３，３６９-３７７；Ｄｅｃｌａｉｒａｃ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，７９０９-７９１６）。本明細書に提供されているものは前もって決められた１０塩基対配列に特異的に結合するように二量化する協同的６環伸張ヘアピンポリアミドである。ＨＩＶ−１ゲノムの調節領域中に含まれる配列（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．１９９４，６３，７１７-７４３；Ｆｒｅｃｈ，１ｅｔａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９６，２２４，２５６-２６７）が標的部位として選択された。リガンドを設計するため、リガンドのひずみを緩和するためのβ−アラニン（β）の包含およびポリアミド−ＤＮＡ複合体内”ヘアピン転回”コンホメーションのためのγ−アミノ酪酸（γ）の優先のような本明細書に提供されているポリアミド環対形成ルールが考慮された。コア配列ＩｍＰｙ− β−ＩｍＰｙ−γ−ＩｍＰｙを持っている６環ポリアミドは協同的ヘアピンダイマーの形成により標的配列５’-ＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴ-３’に結合しているに違いないことを分析は示唆している（図３１）。複合体内で一つのリガンドのＮ− 末端と第二のリガンドのＣ−末端間の衝突を避けるため、標準ポリアミドで使用されている陽性に荷電したβ−アラニン−ジメチルアミノプロピルアミドＣ−末端はより短い非荷電（ＣＨ₂）₂ＯＨ基（Ｃ₂−ＯＨ）で置換されている。カチオン性”転回”残基（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸（（Ｒ）^H2Nγ）が水への至適溶解性のために全体としての＋１電荷を維持している。ポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨは固相法（Ｅ．Ｅ．Ｂａｉｒｄ，Ｐ．Ｂ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１４１-６１４６）を使用し、グリシン−ＰＡＭ樹脂（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋ γから０．３ｍｍｏｌ／ｇ置換として入手可能）上、ＬｉＢＨ₄を用いる固相からの還元的切断（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７８，４３，２８４５；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔａｌ．ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４）により合成され、ＨＰＬＣ（逆相）により精製された。ポリアミドの同定および純度は¹ＨＮＭＲ、分析ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより確認された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（単一同位体）（Ｍ＋Ｈ）：ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ− ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨ、測定値９５３．３、計算値（Ｃ₄₂Ｈ₅₃Ｎ₁₈Ｏ₉）９５３．４；ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨ、測定値１１９７．５、計算値（Ｃ₅₄Ｈ₆₅Ｎ₂₂Ｏ₁₁）１１９７．５。図３２は（ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨ）₂ ・５’−ＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴ−３’複合体を例示しており、１０塩基対適正および単一塩基対不適正複合体のための結合モデルを示している（不適正塩基対は斜線で陰をつけている）。斜線をつけた丸および白丸は各々イミダゾールおよびピロール環を表しており、ダイア形はβ−アラニンを表しており、半円は（ＣＨ₂ ）₂ＯＨ基を表しており、および曲線は（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸を表している。図３３ａはポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂ −ＯＨの定量的フットプリント滴定実験においてＮＡａｓｅＩ切断により発生した断片を分離するために使用された８％変性ポリアクリルアミドゲルの保存リンオートラジオグラムを示している：レーン１，Ａレーン；レーン２、ポリアミド不在下で得られたＮＡａｓｅＩ切断生成物；レーン３−１２、各々０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０および１００ｎＭポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨ存在下で得られたＮＡａｓｅＩ切断生成物。すべての反応はｐＪＴ−ＬＴＲ３’−³²Ｐ−標識ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片（１５ｋｃｐｍ）、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および５ｍＭＣａＣｌ₂（ｐＨ７．０、２４℃）を含んでいる。プラスミドｐＪＴ−ＬＴＲは配列５’−ＣＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴ−ＧＣＴＴＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＧＡＣＧＣＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＴＧＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧＣＴＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＣＧＡ−３’を持っている挿入物をｐＵ１９のラージＡｖａＩ／ＳａｌＩ断片へ結合することにより調製された。２５４塩基対３’−³²Ｐ−末端標識制限断片の定量的ＤＮａｓｅＩフットプリンティングはＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨがその適正部位５’−ＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴ−３’にナノモル濃度で結合し（見かけのモノマー会合定数Ｋａ＝１．９（±０．３）ｘ１０⁸Ｍ^-1）、単一塩基対不適正部位５’−ＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡ−３’にも９分の１の親和性で結合する（Ｋａ＝２．２（±０．５）Ｘ１０⁷Ｍ^-1）ことを示している（図３３ｂ）。適正および単一塩基対不適正部位に対する結合データは協同的結合等温式によく合致し、協同的２:１ポリアミド−ＤＮＡ複合体の形成と一致している。^[5] 二重塩基対不適正部位（５’−ＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣ−３’）ともまた６５分の１の親和性で結合する。”半部位”を含むこの不適正部位（５’−ＡＧＣＴＧＣＡ−３’）が有効に結合されないという事実は、適正部位の認識は協同的二量化を経て起こっており、１：１ヘアピン複合体の形成によるものではないことを示している。このモチーフの一般性および配列特異性のさらなる研究は進行中であり、順を追って報告されるであろう。例えば、８環ポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨはＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2N γ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨよりも１２塩基対適正部位５’−ＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴ−３’を１０倍高い親和性で結合し、この部位に対する二重塩基対不適正部位５’−ＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴ−３’では約１００倍特異的である。１０塩基対結合部位に対する６環ポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−（Ｒ）^H2N γ−ＩｍＰｙ−Ｃ₂−ＯＨのＤＮＡ結合親和性および特異性は、５塩基対を認識する標準６環ヘアピンに典型的なものである。従って、協同的ヘアピンダイマーモチーフの使用は、親和性または特異性を犠牲にすることなく、およびリガンドの分子量を増加させることなく標準ヘアピンモチーフと比較して結合部位サイズを倍にする。本明細書に示されているように、新規協同的ヘアピンダイマーモチーフ、すなわち比較的低分子量のピロール−イミダゾールポリアミド（ＭＷ約９５０−１，２００）はＤＮＡの１０−１２塩基対を特異的に認識できる。図３４は改良された結合性および特異性を持つポリアミドの設計に使用するための一般ポリアミドモチーフが示されている。図３５は本発明のポリアミドのための５つの一般式が示されている。図３６はＤＮＡフットプリント分析および追加の協同的結合ポリアミドの親和性が示されている。図３７はポリアミドＩｍＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（式中、Ｘはγ、Ｃ５ −８、β−βまたはβ−Ｃ５である）のＮ−末端伸長を示している。表５はＩｍＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐポリアミドによる１５塩基対の認識を例示している。適正部位５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡ−３’に対する会合定数（Ｋａ）および中心（５’−ＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡ−３’）および末端（５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡ−３’）不適正部位に対する適正部位の特異性もまた示されている。溶液条件：１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、および５ｍＭＣａＣｌ₂、２４℃およびｐＨ７．０。親ヘアピンＡｃ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは１５塩基対標的部位内の５塩基対結合部位、５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡ−３’の両方にＫａ＝３ｘ１０⁷ Ｍ^-1で結合する。表６はＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＰｙＰｙ−β−Ｄｐポリアミドによる１５塩基対の認識を例示している。適正部位５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡ−３’に対する会合定数（Ｋａ）および中心（５’−ＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡ−３’）および末端（５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡ−３’）不適正部位に対する適正部位の特異性が示されている。溶液条件：１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、および５ｍＭＣａＣｌ₂、２４℃およびｐＨ７．０。親ヘアピンＡｃ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは１５塩基対標的部位内の５塩基対結合部位、５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡ−３’の両方にＫａ＝１ｘ１０⁸ Ｍ^-1で結合する。表７はＩｍＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−Ｃ３−ＯＨによる１５塩基対の認識を例示している。適正部位５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＡ−３’に対する会合定数（Ｋａ）および中心(５’−ＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡ−３’)および末端(５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡ−３’ )不適正部位に対する適正部位の特異性。表８はＩｍＰｙＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐによる１６塩基対の認識を例示している。適正部位５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡ−３’に対する会合定数（Ｋａ）および中心（５’−ＡＡＣＣＡＡＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡ−３’）および末端（５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＡ−３’）不適正部位に対する適正部位の特異性。表９はＩｍＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＰｙＰｙ−β−Ｄｐによる９−１１塩基対の認識を例示している。溶液条件：１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、および５ｍＭＣａＣｌ₂、２２℃およびｐＨ７．０。表１０は式ＩｍＰｙＰｙＰｙ−Ｘ−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−Ｃ３− ＯＨを持つポリアミドによる１６塩基対の認識を例示している。適正部位５’− ＡＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡ−３’に対する会合定数（Ｋａ）および中心（５’−ＡＡＣＣＡＡＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡ−３’）および末端（５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＡ−３’）不適正部位に対する適正部位の特異性。表１１は式ＩｍＰｙＰｙ−β−Ｘ−β−ＩｍＩｍＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β −Ｄｐ（Ｘ＝βまたはＰｙ）のポリアミドによる１７塩基対の認識を例示している。適正部位５’−ＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＡ−３’に対する会合定数（Ｋａ）および中心（５’−ＡＡＣＣＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＧＴＡ−３’）および末端（５’−ＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡ−３’）不適正部位に対する適正部位の特異性。実施例１２Ｉｍ−ＰｙポリアミドダイマーによるＤＮＡの副溝中の１６塩基対の認識天然のＤＮＡ結合タンパク質に匹敵する親和性および特異性で前もって決められたＤＮＡ配列を結合する細胞透過性小分子は特定の遺伝子の発現を制御できる可能性を持っている。最近、ＤＮＡの６塩基対を結合する８環ヘアピンＰｙ−Ｉｍポリアミドが細胞培養において特定の遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８７，２０２−２０５）。より長いＤＮＡ配列を認識するポリアミドはより特異的な生物学的活性を提供するであろう。３０億塩基対ヒトゲノム内の単一部位を特定するためには１５−１６塩基対を特異的に認識するリガンドが必要とされる。このため、１６塩基対の認識はＤＮＡ認識の化学的方法の開発においての里程標となる（Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８６，２３２，４６４；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．，ＴｈｅＲｏｂｅｒｔＡ．ＷｅｌｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＸＸＸＩ．ＤｅｓｉｇｎｏｆＥｎｚｙｍｅｓａｎｄＥｎｚｙｍｅＭｏｄｅｌｓ；Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，１９８７年１１月２−４日；ｐｐ９３ −１０９；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ:Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９８８；ｐｐ４９−６４;Ｍｏｓｅｒ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８７，２３８，６４５−６５０；ＬｅＤｏａｎ，ｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７，１５，７７４９；Ｓｔｒｏｂｅｌ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１，２５４，１６３９ −１６４２；Ｔｈｕｏｎｇ，ｅｔａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９３，３２，６６６−６９０）。本明細書においてＤＮＡ副溝中の１６の連続した塩基対を標的とするＩｍ−Ｐｙポリアミドダイマーが提供される。一般配列Ｉｍ−Ｐｙ２−６を持っているポリアミドダイマーの長さが５環（７塩基対結合部位に対応する）を越えて増加すると、ポリアミド長でのＤＮA結合親和性の増大は停止する（Ｋｅｌｌｙ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９６，９３，６９８１−６９８５）。この観察に対する構造的基礎は最近決定されたＤＮＡとの複合体中の４環ホモダイマーのＸ線結晶構造により提供され、それはＤＮＡ二重鎖のピッチとポリアミド残基当たりの増大の完全な一致、しかし過度に屈曲したリガンドひずみを明らかにした（Ｋｅｉｌｋｏｐｆ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９８，５，１０４−１０９）。ひずみ不適正は、ポリアミドダイマーと長い結合部位でのＤＮＡらせんの至適適合を融通性のあるβ−アラニン残基が組み直しているという観察結果を説明している（Ｔｒａｕｇｅｒ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１６０−６１６６；Ｓｗａｌｌｅｙ，ｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１９９７，３，１６００−１６０７）。ＨＩＶゲノムの制御領域中に存在する１６塩基対配列５’−ＡＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴ−３’が結合部位として利用された（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，６３，７１７−７４３；Ｆｒｅｃｈ，ｅｔａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９６，２２４，２５６−２６７）。以前に公表されているポリアミド環対形成ルール（Ｗａｄｅ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，８７８３−８７９４；Ｍｒｋｓｉｃｈ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９３，３２，１１３８５−１１３８９；Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，４４７４−４４８２；Ｗｈｉｔｅ，ｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１９９７，４，５６９−５７８；Ｐｅｌｔｏｎ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８９，８６，５７２３−５７２７；Ｐｅｌｔｏｎ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０，１１２，１３９３−１３９９；Ｃｈｅｎ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９４，１，１６９−１７５；Ｗｈｉｔｅ，ｅｔａl．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９６，３５，１２５３２ −１２５３７）、β／β対のＡ、Ｔ特異性および”滑った”ダイマーモチーフ（Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ，ｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９６，３，３２１−３２４；Ｔｒａｕｇｅｒ，ｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１９９６，３，３６９−３７７）を考慮すると、８環ポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１）が協同的逆平行ダイマーとして標的配列に特異的に結合するであろうことが示唆される（図３８）。図３８はＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１、Ｒ＝Ｈ）またはＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β −Ｄｐ−ＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）（１−Ｅ、Ｒ＝Ｒ_E）（Ｉｍ＝Ｎ−メチルイミダゾール、Ｐｙ＝Ｎ−メチルピロール、β＝β−アラニン、Ｄｐ＝ジメチルアミノプロピルアミド）と５’−ＡＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴ−３’の複合体モデルを示している。斜線を入れた丸および白丸は各々イミダゾールおよびピロール環を表しており、およびダイア形はβ−アラニンを表している。点を含んだ丸はプリンのＮ３およびピリミジンＯ２の不対電子を表しており、Ｈを含んでいる丸はグアニンのＮ２水素を表している。推定水素結合は点線により示されている。ポリアミドは固相法（Ｂａｉｒｄ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１４１−６１４６）を用いて合成し、ＨＰＬＣにより精製して¹ＨＮＭＲ、分析ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより同定および純度が確認された。２４５塩基対３’−³²Ｐ−標識制限断片で実施された定量的ＤＮａｓｅＩフットプリント実験は、ポリアミドがその標的部位ヘナノモル以下の濃度で結合することを明らかにした（見かけのモノマー会合定数Ｋａ，３．５ｘ１０¹⁰Ｍ^-1）（図３９）（Ｂａｉｒｄ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１４１−６１４６；Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９８６，１３０，１３２−１８１；Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．；Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＰａｒｔＩＩＩ：ＴｈｅＢｅｈａｖｉｏｒｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０，ｐ８６３）。図３９はポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ− β−Ｄｐ（１）の定量的フットプリント滴定実験においてＮＡａｓｅＩ切断により発生した断片を分離するために使用された８％変性ポリアクリルアミドゲルの保存リンオートラジオグラムを示している：レーン１，Ａレーン；レーン２、ポリアミド不在下で得られたＮＡａｓｅＩ切断生成物；レーン３−１０、各々０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５および１ｎＭポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ存在下で得られたＮＡａｓｅＩ切断生成物。すべての反応はｐＪＴ−ＬＴＲからの３’−³²Ｐ− 標識ＥｃｏＲＩ／ＨｊｎｄＩＩＩ制限断片（１５ｋｃｐｍ）、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および５ｍＭＣａＣｌ₂（ｐＨ７．０、２４℃）を含んでいる。ｂ）ポリアミドＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ− β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）（１−Ｅ）を使用した親和性切断反応により発生した断片を分離するために使用されたゲルのオートラジオグラフ。レーン１および５：シークエンシングレーン；レーン２− ４：各々０．０３、０．１、０．３および１ｎＭＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β −ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）存在下で得られた切断生成物；レーン６：そのままのＤＮＡ。すべての反応は標識制限断片（７ｋｃｐｍ）、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、３００ｍＭＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬグリコーゲン、１μＭＦｅ（ＩＩ）および５ｍＭＤＴＴ（ｐＨ７．３、２４℃ ）を含んでいる。１６塩基対標的部位領域中の制限断片配列はオートラジオグラフの右側に沿って示されている。線の高さは示された塩基で観察された切断強度に比例している。会合定数の決定に使用された方法には［Ｌ］_tot〜［Ｌ］_free（ここで［Ｌ］_f _ree は溶液中の遊離（非結合）のポリアミド濃度である）という仮定が含まれている。非常に高い会合定数に対してはこの仮定は無効であり、会合定数を小さく見積もることになる。ここに記載された実験においては、ＤＮＡ濃度は〜５ｐＭであると見積もられる。従って、１−２ｘ１０¹⁰Ｍ^-1より大きな見かけの会合定数が真の会合定数の下限を示している。結合データは協同的結合等温式によく合致し、協同的２：１複合体の形成と一致している。ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β −ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐが伸長ダイマーとして結合するというさらなる証拠を提供するため、図３９ｂに示されたＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＩｍＰｙ−β−ＰｙＰｙ−β−Ｄｐのポリアミド−ＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）結合体で親和性切断実験が実施された。切断は適正配列の各々の末端で観察され、二量体、逆平行結合様式と一致している。配列特異性に関しては、適正部位より少なくとも３５分の１の親和性で結合される³²Ｐ標識鎖の５’末端に近接して二つの塩基対不適正部位、５’−ｃＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＡＴａ−３’が存在する。しかしながら、制限断片上の他の不適正部位は１０−２０分の１の親和性で結合し、１６塩基対認識でのこの最初の努力の限界を明らかにしている。疑いもなく、配列特異性のさらなる最適化には十分な余地がある。１６塩基対ポリアミド・ＤＮＡ複合体で観察された高結合親和性および親和性切断パターンは、６Ｇ、Ｃ塩基対の認識のための６Ｉｍ／Ｐｙおよび２Ａ、Ｔ塩基対認識のための２β／β対が適切に位置されている完全重複コアをアミド残基の８対が形成していることを示している。β−アラニンにより連結されている２環サブユニットから成るポリアミドはＢ−ＤＮＡと等らせんであるようであり、任意の環位置でのイミダゾールの配置を可能にし、前もって決められたＤＮＡ配列認識のための一般化可能なモチーフを提供する。ここに示されたデータはナノモル以下の濃度でＤＮＡの１６塩基対を結合でき、細胞に浸透するために適したサイズ（即ち、ＭＷ〜１，２００）のポリアミドの設計を可能にする。本明細書に記載されている参照文献は本明細書において援用される。本発明の好適な形が図面で示され、記載されてきたが、好適な形の変形は当業者には明らかであろうし、本発明は示され、記載された特定の形に制限されると解釈されてはならず、代わりに請求の範囲に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０４２，０２２ (32)優先日平成９年４月16日(1997．4．16) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／８３７，５２４ (32)優先日平成９年４月21日(1997．4．21) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／８５３，５２２ (32)優先日平成９年５月８日(1997．5．8) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７２２ (32)優先日平成９年７月21日(1997．7．21) (33)優先権主張国世界知的所有権機関（ＷＯ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．次式：［式中、Ｒ¹，Ｒ^a，Ｒ^b，Ｒ^e，Ｒ^f，Ｒⁱ，Ｒ^j，Ｒⁿ，およびＲ^oは、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ −アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，およびＣ_1-6アルキニルから独立して選択され；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，およびＮ−ホルミルからなる群より選択され；Ｒ³，Ｒ^d，Ｒ¹およびＲ^qは、独立して、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，Ｏｍｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，ＣＨ₂ＮＨ₂からなる群より選択され；Ｒ⁴は、-ＨＮ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0-6 ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨＲ⁵またはＮＨ（ＣＨ₂）₂ＣＯＮＨＲ⁵であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，Ｃ_1-6Ｌから選択され、ここでＬ基は、独立して、ビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋）−α−トコフェラール，およびＣ_1-6アルキニルから選択され、ｒは０−６の整数であり；Ｘ，Ｘ^a，Ｘ^b，Ｘ^e，Ｘ^f，Ｘⁱ，Ｘ^j，Ｘⁿ，Ｘ^oは、独立して、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，ＣＦからなる群より選択され；そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｉ，ｊ，ｋ，およびｍは、独立して０−５の整数である］のポリアミドまたはその薬学的に許容しうる塩。２．ａは３であり、ｂ、ｇ、ｍ、ｎ、ｑは０であり、ｏは４であり、およびｈは２である、請求項１記載のポリアミド。３．Ｒ²およびＲ³はＨであり、Ｒａ、Ｒ¹およびＲＯはＣＨ₃であり、ＸはＮであり、およびＸ'およびＸ'はＣＨである、請求項２記載のポリアミド。４．次式：［式中、Ｒ¹，Ｒ^a(i,m)およびＲ^b(j,m)は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ₁ _-6 アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，およびＣ_1-6アルキニルから選択され；Ｒ²は、Ｈ，ＮＨ₂，ＳＨ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｆ，Ｎ−アセチル，およびＮ−ホルミルからなる群より選択され；Ｒ^f(m)およびＲ^c(k,m)は、独立して、Ｈ，ＮＨ₂，ＯＨ，ＳＨ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｆ，Ｏｍｅ，ＣＨ₂ＯＨ，ＣＨ₂ＳＨ，ＣＨ₂ＮＨ₂からなる群より選択され；Ｒ⁴は、-ＮＨ（ＣＨ₂）_0-6ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨ（ＣＨ₂）_rＣＯＮＨ（ＣＨ₂）_0-6 ＮＲ⁵Ｒ⁶またはＮＨＲ⁵またはＮＨ（ＣＨ₂）₂ＣＯＮＨＲ⁵であり、ここでＲ⁵およびＲ⁶は、独立して、Ｈ，Ｃｌ，ＮＯ，Ｎ−アセチル，ベンジル，Ｃ_1-6アルキル，Ｃ_1-6アルキルアミン，Ｃ_1-6アルキルジアミン，Ｃ_1-6アルキルカルボキシレート，Ｃ_1-6アルケニル，Ｃ_1-6Ｌから選択され、Ｌ基は、独立して、ビオチン，オリゴデオキシヌクレオチド，Ｎ−エチルニトロソウレア，フルオレセイン，ブロモアセトアミド，ヨードアセトアミド，ＤＬ−α−リポ酸，アクリジン，エチルレッド，４−（ソラーレン−８−イルオキシ）−ブチレート，酒石酸，（＋）−α−トコフェラール，およびＣ_1-6アルキニルから選択され、ｒは、０−６の整数であり；Ｘ，Ｘ^a(i,m)およびＸ^b(j,m)は、独立して、Ｎ，ＣＨ，ＣＯＨ，ＣＣＨ₃，ＣＮＨ₂，ＣＣｌ，ＣＦからなる群より選択され；そしてａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏおよびｐは、独立して０−５の整数である］のポリアミドまたはその薬学的に許容しうる塩。５．ａは３であり、ｂは４であり、ｄは１であり、およびｃは０であり、０は４である、請求項４記載のポリアミド。６．Ｒ'およびＲｆ〜'）は、Ｈ、Ｒ'、ＸａｌｉＸｂ（ｊ、ＷＲａ（１およびＲｍ）はＣＨ３であり、ＸはＮであり、およびＣＨである、請求項５記載のポリアミド。７．以下の群：［式中、コア配列は請求項４記載の式において定義されたとおりであるが、ただしＲ４はのぞかれ、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびｙはγ−アミノ酪酸である］より選択されるコア配列を含む、請求項４記載のポリアミド、。８．Ｒ'はＤ−Ｄｐであり、ここで０はアラニンであり、およびＤｐはジメチルアミノプロピルアミドである、請求項４記載のポリアミド。９．少なくとも１０⁹Ｍ^-1の結合定数を有する、請求項４記載のポリアミド。１０．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が１より大きい、請求項４記載のポリアミド。１１．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が５より大きい、請求項４記載のポリアミド。１２．以下の群：［式中、コア配列は請求項４記載の式において定義されるとおりであるが、ただしＲ'は除かれ、ＩｍはＮ７メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、βはβ−アラニンであり、およびｙはγ−アミノ酪酸である」より選択されるコア配列を含むポリアミン。１３．Ｒ'はＰ−Ｄｐであり、ここでβはβ−アラニンであり、およびＤｐはジメチルアミノプロピルアミドである、請求項１２記載のポリアミド。１４．少なくとも１０⁹Ｍ^-1の結合定数を有する、請求項１２記載のポリアミド。１５．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が１より大きい、請求項１２記載のポリアミド。１６．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が５より大きい、請求項１２記載のポリアミド。１７．以下の群：［式中、コア配列は請求項４記載の式において定義されるとおりであるがただしＲ４は除かれ、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、Ａはβ−アラニンであり、およびｙはγ−アミノ酪酸である］より選択されるコア配列を含む、二本鎖DＮＡの６塩基対配列を認識するための、請求項４記載のポリアミド。１８．Ｒ'はＰ−Ｄｐであり、ここで０はβ−アラニンであり、およびＤｐはジメチルアミノプロピルアミドである、請求項１７記載のポリアミド。１９．１０９Ｍ−１−の結合定数を有する、請求項１７記載のポリアミド。２０．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が１より大きい、請求項１７記載のポリアミド。２１．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が５より大きい、請求項１７記載のポリアミド。２２．以下の群：［式中、コア配列は、請求項４記載の式において定義されるとおりであるが、ただしＲ４は除かれ、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドだり、βはβ−アラニンであり、およびｙはγ−アミノ酪酸である］より選択されるコア配列を含む、二本鎖ＤＮＡの７塩基対配列の認識に適当な、請求項４記載のポリアミド。２３．Ｒ'がＰ−Ｄｐであり、ここでβはβ−アラニンであり、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミドである、請求項２２記載のポリアミド。２４．少なくとも１０⁹Ｍ^-1の結合定数を有する、請求項２２記載のポリアミド。２５．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が１より大きい、請求項２２記載のポリアミド。２６．マッチ部位における結合定数とミスマッチ部位における結合定数の比が５より大きい、請求項２２記載のポリアミド。２７．以下のコア配列組成：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびｙはγ−アミノ酪酸であり、および０は０−アラニンである］からなる群より選択される、７塩基対配列を認識するためのヘアピンポリアミドを形成することができる、請求項４記載のポリアミド。２８．８塩基対配列を認識するためのヘアピンポリアミドを形成することができ、および以下の群：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびｙはγ−アミノ酪酸であり、および βはβアラニンである］より選択されるコア配列組成を含む、請求項４記載のポリアミド。２９．ヘアピンポリアミド複合体を形成することができ、および以下の群：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびｙはγ−アミノ酪酸であり、および０は０−アラニンである］より選択される、請求項４記載のポリアミド。３０．８塩基対配列を認識するためのヘアピンポリアミドを形成することができ、および以下のコア配列組成：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびｙ−はγ−アミノ酪酸であり、およびβはアラニンである］からなる群より選択される、請求項４記載のポリアミド。３１．「オーバーラップ」または「スリップ」ポリアミド複合体を形成することができ、および［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、βはβ−アラニンであり、ＣＳは５−アミノペンタン酸であり、Ｃ６は６−アミノヘキサン酸であり、Ｃ７は７−アミノヘプタン酸であり、Ｃ８は８−アミノオクタン酸であり、Ｃ９は９−アミノノナン酸である］からなる群より選択される、請求項４記載のポリアミド。３２．８員環βアラニン拡張ポリアミドであり、および以下のコア配列組成：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびβはβ−アラニンである］．からなる群より選択される、請求項４記載のポリアミド。３３．８員環βアラニン拡張ポリアミドであり、以下のコア配列組成：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびβはβ−アラニンである］からなる群より選択される、請求項４記載のポリアミド。３４．９または１１塩基対配列を認識するための９員環または１２員環拡張ヘアピンポリアミド複合体を形成することができ、以下の群：［式中、ＩｍはＮ−メチル−イミダゾールカルボキサミドであり、ＰｙはＮ−メチルピロールカルボキサミドであり、およびｙはγ−アミノ酪酸であり、および０はＰ− アラニンであり、およびＧはグリシンである］からなるコア配列組成より選択される、請求項４記載のポリアミド。３５．請求項４記載のポリアミドおよび薬学的に許容しうる賦形剤を含む組成物。