JP2002514403A - GPRW receptor - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 GPRW受容体ポリペプチドおよびGPRW受容体ポリヌクレオチド、ならびにかかるポリペプチドを組換え技術により生産する方法が開示されている。さらに、GPRW受容体ポリペプチドおよびGPRW受容体ポリヌクレオチドを治療に用いる方法、およびそのための診断アッセイも開示されている。   (57) [Summary] GPRW receptor polypeptides and GPRW receptor polynucleotides and methods for producing such polypeptides by recombinant techniques are disclosed. Also disclosed are methods of using GPRW receptor polypeptides and GPRW receptor polynucleotides for therapy, and diagnostic assays therefor.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】発明の分野 本発明は、新たに同定されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの治療の際のまたは治療
に有効でありうるアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターであ
る化合物を同定する際の使用、ならびに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
の生産方法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to newly identified polypeptides, polynucleotides encoding said polypeptides, agonists, antagonists and / or agonists which may be effective in or for the treatment of said polypeptides and polynucleotides. Or for use in identifying compounds that are inhibitors, and methods for producing the polypeptides and polynucleotides.

【０００２】発明の背景 薬物探索プロセスには目下根本的な大変化が生じている。というのは、それが
「機能性ゲノミクス」(functional genomics)、すなわちハイスループット（高
効率）のゲノムまたは遺伝子に基づく生物学に及んでいるからである。このアプ
ローチは「ポジショナルクローニング」に基づいた比較的初期のアプローチに急
速に取って代わりつつある。表現型、つまり生物学的機能または遺伝病、が同定
され、続いてその遺伝子地図の位置を手がかりとして病因遺伝子が突き止められ
るだろう。[0002] currently in the background drug discovery process of the invention fundamentally very reduction has occurred. Because it extends to "functional genomics", high-throughput (high-efficiency) genome or gene-based biology. This approach is rapidly replacing a relatively early approach based on “positional cloning”. The phenotype, ie, biological function or genetic disease, will be identified and the etiological gene will then be located based on its genetic map location.

【０００３】 機能性ゲノミクスは、現在入手できる多くの分子生物学データベースから目的
となりそうな遺伝子配列を同定するためのバイオインフォマティクスの様々なツ
ールに大きく依存している。依然として、まだ未解明の遺伝子およびその関連ポ
リペプチド／タンパク質を薬物探索の標的として同定し特性づける必要性がある
。[0003] Functional genomics relies heavily on various bioinformatics tools to identify likely gene sequences from many currently available molecular biology databases. There is still a need to identify and characterize as yet unknown genes and their related polypeptides / proteins as targets for drug discovery.

【０００４】 多くの医学的に重要な生物学的プロセスが、Gタンパク質を含むシグナル伝達
経路に関与するタンパク質および／または例えばcAMPなどの第二メッセンジャー
によって媒介されるということは十分に証明されている（Lefkowitz、Nature、1
991、351:353-354）。本明細書では、これらのタンパク質はGタンパク質を含む
経路に関与するタンパク質つまりPPGタンパク質と称される。これらのタンパク
質のいくつかの例として、アドレナリン作動性物質およびドーパミン（Kobilka,
B.K.ら,Proc.Natl Acad.Sci.,USA,1987,84:46-50；Kobilka,B.K.ら,Science,198
7,238:650-656；Bunzow,J.R.ら,Nature,1988,336:783-787）、Gタンパク質自身
、エフェクタータンパク質（ホスホリパーゼC、アデニルシクラーゼおよびホス
ホジエステラーゼなど）あるいはアクチュエータータンパク質（プロテインキナ
ーゼAおよびプロテインキナーゼCなど）（Simon,M.I.ら,Science,1991,252:802-
8）の受容体などのGPC受容体が挙げられる。[0004] It is well documented that many medically important biological processes are mediated by proteins involved in signal transduction pathways, including G proteins, and / or second messengers such as, for example, cAMP. (Lefkowitz, Nature, 1
991, 351: 353-354). These proteins are referred to herein as proteins involved in pathways involving G proteins, or PPG proteins. Some examples of these proteins include adrenergic substances and dopamine (Kobilka,
BK et al., Proc. Natl Acad. Sci., USA, 1987, 84: 46-50; Kobilka, BK et al., Science, 198.
7,238: 650-656; Bunzow, JR et al., Nature, 1988, 336: 783-787), G protein itself, effector proteins (such as phospholipase C, adenyl cyclase and phosphodiesterase) or actuator proteins (such as protein kinase A and protein kinase C) ) (Simon, MI et al., Science, 1991, 252: 802-
GPC receptors such as the receptor of 8).

【０００５】 例えばシグナル伝達の1形態として、ホルモンの結合は、酵素アデニル酸シク
ラーゼの細胞内での活性化に作用する。ホルモンによる酵素の活性化はヌクレオ
チドGTPの存在に依存する。GTPはまたホルモンの結合にも影響を与える。Gタン
パク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼに連結させる。Gタンパク質は
、ホルモン受容体によって活性化されると、結合したGDPをGTPと交換することが
示された。続いてこのGTP担持形態は活性化アデニル酸シクラーゼに結合する。G
TPからGDPへの加水分解はGタンパク質自身によって触媒され、Gタンパク質はそ
の不活性な基底形態に戻る。従って、Gタンパク質は、受容体からエフェクター
へのシグナルを中継する中間体として、およびシグナルの継続期間を制御する時
計として機能し、2つの役割を果たしている。[0005] For example, as one form of signal transduction, hormone binding affects the activation of the enzyme adenylate cyclase in cells. Activation of enzymes by hormones depends on the presence of nucleotide GTP. GTP also affects hormone binding. The G protein links the hormone receptor to adenylate cyclase. G proteins have been shown to exchange bound GDP for GTP when activated by hormone receptors. This GTP-carrying form then binds to activated adenylate cyclase. G
The hydrolysis of TP to GDP is catalyzed by the G protein itself, which returns to its inactive basal form. Thus, the G protein plays a dual role, acting as an intermediate that relays the signal from the receptor to the effector and as a clock that controls the duration of the signal.

【０００６】 Gタンパク質共役型受容体の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、推定
上7回膜貫通ドメインを有すると特性付けられてきた。該ドメインは、細胞外ま
たは細胞質ループにより連結された膜貫通αヘリックスに相当すると考えられて
いる。Gタンパク質共役型受容体には、ホルモン、ウイルス性、増殖因子および
神経性受容体などの多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。[0006] The membrane protein gene superfamily of G protein-coupled receptors has been characterized as having a putative seven transmembrane domain. The domain is thought to represent a transmembrane α-helix connected by an extracellular or cytoplasmic loop. G protein-coupled receptors include many biologically active receptors such as hormones, viral, growth factors and neuronal receptors.

【０００７】 Gタンパク質共役型受容体（他に7TM受容体として知られている）は、少なくと
も8つの異なる親水性ループを連結している7つの保存された疎水性ストレッチ（
約20〜30アミノ酸からなる）を含むと特性付けられてきた。Gタンパク質共役型
受容体のファミリーには、精神病および神経系疾患の治療に用いられる神経弛緩
薬と結合するドーパミン受容体が含まれる。このファミリーの他のメンバーの例
として、限定するものではないが、カルシトニン、アドレナリン作動性、エンド
セリン、cAMP、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン、ヒス
タミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝
子−1、ロドプシン、臭気物質、およびサイトメガロウイルス受容体が含まれる
。[0007] G protein-coupled receptors (otherwise known as 7TM receptors) comprise seven conserved hydrophobic stretches (at least eight different hydrophilic loops).
(Comprising about 20-30 amino acids). The family of G protein-coupled receptors includes dopamine receptors that bind neuroleptics used in the treatment of psychiatric and nervous system disorders. Examples of other members of this family include, but are not limited to, calcitonin, adrenergic, endothelin, cAMP, adenosine, muscarinic, acetylcholine, serotonin, histamine, thrombin, kinin, follicle stimulating hormone, opsin, endothelial cells Includes differentiation gene-1, rhodopsin, odorants, and cytomegalovirus receptor.

【０００８】 大部分のGタンパク質共役型受容体は、機能性タンパク質の構造を安定化させ
ていると考えられるジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基を最
初の二つの細胞外ループそれぞれに1つ有する。7つの膜貫通領域は、TM1、TM2、
TM3、TM4、TM5、TM6およびTM7と呼ばれている。TM3はシグナル伝達に関係してい
る。[0008] Most G protein-coupled receptors contain a conserved cysteine residue forming a disulfide bond, thought to stabilize the structure of the functional protein, in each of the first two extracellular loops. Have one. The seven transmembrane regions are TM1, TM2,
They are called TM3, TM4, TM5, TM6 and TM7. TM3 is involved in signal transduction.

【０００９】 システイン残基のリン酸化およびリピド化（パルミチル化またはファルネシル
化）は、いくつかのGタンパク質共役型受容体のシグナル伝達に影響を与える。
大部分のGタンパク質共役型受容体は、第3の細胞質ループおよび／またはカルボ
キシ末端に潜在的なリン酸化部位を含んでいる。βアドレナリン受容体などの数
種のGタンパク質共役型受容体では、プロテインキナーゼAおよび／または特異的
な受容体キナーゼによるリン酸化が受容体の脱感受性を媒介する。[0009] Phosphorylation and lipidation (palmitylation or farnesylation) of cysteine residues affects signaling of some G protein-coupled receptors.
Most G protein-coupled receptors contain a potential phosphorylation site at the third cytoplasmic loop and / or carboxy terminus. In some G protein-coupled receptors, such as the β-adrenergic receptor, phosphorylation by protein kinase A and / or specific receptor kinases mediates receptor desensitization.

【００１０】 いくつかの受容体では、Gタンパク質共役型受容体のリガンド結合部位は、複
数のGタンパク質共役型受容体膜貫通ドメインによって形成される親水性ソケッ
ト(socket)を含み、該ソケットはGタンパク質共役型受容体の疎水性残基に囲ま
れていると考えられている。各Gタンパク質共役型受容体膜貫通ヘリックスの親
水性側は内側に面し、極性を持つリガンド結合部位を形成すると仮定されている
。TM3は、TM3アスパラギン酸残基などのリガンド結合部位を有し、いくつかのG
タンパク質共役型受容体におけるリガンドの結合に関与している。TM5のセリン
、TM6のアスパラギンおよびTM6またはTM7のフェニルアラニンまたはチロシンも
またリガンド結合に関与している。[0010] In some receptors, the ligand binding site of a G protein-coupled receptor comprises a hydrophilic socket formed by a plurality of G protein-coupled receptor transmembrane domains, wherein the socket comprises a G socket. It is thought to be surrounded by hydrophobic residues of protein-coupled receptors. It is postulated that the hydrophilic side of each G protein-coupled receptor transmembrane helix faces inward, forming a polar ligand binding site. TM3 has a ligand binding site such as a TM3 aspartic acid residue and has several G
It is involved in ligand binding in protein-coupled receptors. TM5 serine, TM6 asparagine and TM6 or TM7 phenylalanine or tyrosine are also involved in ligand binding.

【００１１】 Gタンパク質共役型受容体は、細胞内でヘテロ三量体のGタンパク質によって種
々の細胞内酵素、イオンチャネルおよびトランスポーターに結合しうる（Johnso
nら、Endoc.Rev.,1989,10:317-331を参照のこと）。種々のGタンパク質αサブユ
ニットは、選択的に特定のエフェクターを刺激し、細胞内の多様な生物学的機能
をモジュレートする。Gタンパク質共役型受容体の細胞質側の残基のリン酸化は
、いくつかのGタンパク質共役型受容体のGタンパク質の結合を調節するために重
要な機構であると同定されている。Gタンパク質共役型受容体は哺乳動物宿主内
の数多くの部位で見られる。G protein-coupled receptors can bind to various intracellular enzymes, ion channels and transporters by heterotrimeric G proteins in cells (Johnso
n et al., Endoc. Rev., 1989, 10: 317-331). Various G protein α subunits selectively stimulate specific effectors and modulate a variety of biological functions within cells. Phosphorylation of cytoplasmic residues of G protein-coupled receptors has been identified as an important mechanism for regulating G protein binding of some G protein-coupled receptors. G protein-coupled receptors are found at numerous sites in mammalian hosts.

【００１２】 過去15年にわたって、350種近くの7回膜貫通（7TM）受容体を標的とする治療
薬が市場に送り出され成功してきた。Over the past 15 years, nearly 350 therapeutic agents targeting the seven transmembrane (7TM) receptor have been successfully launched on the market.

【００１３】発明の概要 本発明は、GPRW受容体、特にGPRW受容体ポリペプチドおよびGPRW受容体ポリヌ
クレオチド、組換え物質、ならびにその生産方法に関する。もう一つの態様にお
いて、本発明は、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染症、特にHIV-1また
はHIV-2により引き起こされる感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過
食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿停留；骨粗鬆症
；狭心症；心筋梗塞；卒中；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛
；嘔吐；不安、精神***病、躁うつ、うつ病、せん妄、痴呆および重度の精神遅
滞を含む精神病性および神経系疾患；あるいはハンチントン病またはジル・ド・
ラ・ツレット症候群などの運動障害（以後まとめて「前記疾患」という）の治療
をはじめとする、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する
。他の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を用いてアゴニストお
よびアンタゴニスト／インヒビターを同定する方法、ならびに同定された化合物
を用いてGPRW受容体平衡異常と関連した症状を治療することに関する。さらに他
の態様において、本発明は不適当なGPRW受容体活性またはGPRW受容体レベルと関
連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。SUMMARY OF THE INVENTION [0013] The present invention relates to GPRW receptors, particularly GPRW receptor polypeptides and polynucleotides, recombinant materials, and methods for producing the same. In another embodiment, the present invention relates to bacterial, fungal, protozoan and viral infections, particularly infections caused by HIV-1 or HIV-2; pain; cancer; diabetes, obesity; anorexia; binge eating; asthma Parkinson's disease; acute heart failure; hypotension; hypertension; urinary retention; osteoporosis; angina; myocardial infarction; stroke; ulcer; asthma; allergy; benign prostatic hypertrophy; migraine; Psychotic and nervous system disorders, including depression, delirium, dementia and severe mental retardation; or Huntington's disease or Jill de
The present invention relates to a method for using the polypeptide and the polynucleotide, including the treatment of a movement disorder such as La Tourette syndrome (hereinafter collectively referred to as “the disease”). In another aspect, the present invention provides a method of identifying agonists and antagonists / inhibitors using a substance provided by the present invention, and treating a condition associated with GPRW receptor imbalance using the identified compound. About. In yet another embodiment, the present invention relates to diagnostic assays for detecting diseases associated with inappropriate GPRW receptor activity or GPRW receptor levels.

【００１４】発明の説明 第一の態様において、本発明はGPRW受容体ポリペプチドに関する。この種のペ
プチドには、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくと
も70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくと
も90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少
なくとも97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド
が含まれる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２のアミノ酸配列を含むも
のがある。DESCRIPTION OF THE INVENTION In a first aspect, the present invention relates to a GPRW receptor polypeptide. Such peptides have at least 70% identity, preferably at least 80% identity, more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 90% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 over the entire length of SEQ ID NO: 2. An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence having 95% identity, most preferably at least 97-99% identity, is included. Such polypeptides include those comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

【００１５】 本発明の他のペプチドには、そのアミノ酸配列が配列番号２の全長にわたって
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80
％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なく
とも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有する単離さ
れたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドとしては配列番号２のアミ
ノ酸配列からなるポリペプチドがある。 本発明の更なるペプチドには、配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが含まれる。Another peptide of the invention has an amino acid sequence of at least 70% identity, preferably at least 80%, with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 over the entire length of SEQ ID NO: 2
% Polypeptide, more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity, most preferably at least 97-99% identity. Such polypeptides include polypeptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Further peptides of the invention include an isolated polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1.

【００１６】 本発明のポリペプチドはプリン作動性受容体ファミリーのメンバーであると考
えられる。従って、本発明のポリペプチドは重要である。なぜなら、本発明によ
り、いくつかの生物学的発現および疾病の発現に関与する遺伝子のプリン作動性
7TM受容体ファミリーに更に1つのメンバーが追加されるからである。これらの特
性を以後「GPRW受容体活性」または「GPRW受容体ポリペプチド活性」あるいは「
GPRW受容体の生物学的活性」という。これらの活性の中には、前記GPRW受容体ポ
リペプチドの抗原性および免疫原性活性、特に配列番号２のポリペプチドの抗原
性および免疫原性活性も含まれる。本発明のポリペプチドはGPRW受容体の少なく
とも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。[0016] The polypeptides of the present invention are believed to be members of the purinergic receptor family. Therefore, the polypeptide of the present invention is important. Because of the invention, purinergic properties of genes involved in the expression of some biological and disease
This is because one additional member is added to the 7TM receptor family. These properties are hereinafter referred to as "GPRW receptor activity" or "GPRW receptor polypeptide activity" or "
The biological activity of the GPRW receptor ". Among these activities are also the antigenic and immunogenic activities of the GPRW receptor polypeptide, especially the antigenic and immunogenic activities of the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Preferably, the polypeptide of the invention exhibits at least one biological activity of the GPRW receptor.

【００１７】 本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質
のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミ
ノ酸配列を含むことが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌すな
わちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え体生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。The polypeptides of the invention may be in the form of the “mature” protein or may be part of a larger protein, such as a fusion protein. Often, it will be advantageous to include additional amino acid sequences, such as secretory or leader sequences, prosequences, sequences useful for purification such as multiple histidine residues,
Or additional sequences to ensure stability during recombinant production.

【００１８】 また、前記ポリペプチドの変異体、すなわち保存的アミノ酸置換（ある残基が
性質の似ている他の残基により置換される）により基準ポリペプチドと相違して
いるポリペプチドも本発明に含まれる。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Le
u および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間
；塩基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に
、数個、5〜10個、1〜5個、1〜3個、1〜2個または1個のアミノ酸が任意の組合せ
で置換、欠失または付加されている変異体が好適である。[0018] Also, the present invention relates to a mutant of the above-mentioned polypeptide, that is, a polypeptide which differs from a reference polypeptide by conservative amino acid substitution (a certain residue is substituted by another residue having similar properties). include. Typical such substitutions are Ala, Val, Le
between u and Ile; between Ser and Thr; between the acidic residues Asp and Glu; between Asn and Gln; between the basic residues Lys and Arg; or between the aromatic residues Phe and Tyr. In particular, a mutant in which several, 5 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2 or 1 amino acids are substituted, deleted or added in any combination is suitable.

【００１９】 本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このよう
なポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換えにより生産された
ポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せ
により製造されたポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを製造するた
めの手段は当業界でよく理解されている。The polypeptide of the present invention can be produced by any appropriate method. Such polypeptides include isolated natural polypeptides, recombinantly produced polypeptides, synthetically produced polypeptides, or polypeptides produced by a combination of these methods. . The means for producing such polypeptides are well understood in the art.

【００２０】 本発明の更なる態様において、本発明は、GPRW受容体ポリヌクレオチドに関す
る。このようなポリヌクレオチドには、配列番号２の全長にわたって配列番号２
のアミノ酸配列と少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性
、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも95％の
同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポ
リヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性を有するポ
リペプチドが一層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより
一層好ましく、少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドが最も好ましいも
のである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号２のポリペプチドをコード
する配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられ
る。[0020] In a further aspect, the present invention relates to a GPRW receptor polynucleotide. Such polynucleotides include SEQ ID NO: 2 over the entire length of SEQ ID NO: 2.
Comprises a nucleotide sequence encoding a polypeptide having at least 70% identity, preferably at least 80% identity, more preferably at least 90% identity, even more preferably at least 95% identity with the amino acid sequence of Includes an isolated polynucleotide. In this regard, polypeptides having at least 97% identity are more preferred, those with at least 98-99% identity are even more preferred, and those with at least 99% identity are most preferred. . Such polynucleotides include polynucleotides comprising the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2.

【００２１】 本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列と、その全コード領域にわたって、少なくとも70％の同一性
、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性
、さらに好ましくは少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単
離されたポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性
を有するポリヌクレオチドが一層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有
するものがより一層好ましく、少なくとも99％の同一性を有するポリヌクレオチ
ドが最も好ましいものである。A further polynucleotide of the invention includes at least 70% identity, preferably at least 80% identity, more preferably at least 80% identity over the entire coding region thereof with the nucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. Comprises an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 90% identity, more preferably at least 95% identity. In this regard, polynucleotides having at least 97% identity are more preferred, while those with at least 98-99% identity are even more preferred, and polynucleotides with at least 99% identity are most preferred. .

【００２２】 本発明の更なるポリヌクレオチドには、配列番号１の全長にわたって配列番号
１のポリヌクレオチドと少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の
同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらに好ましくは少なくとも
95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含
まれる。これに関して、少なくとも97％の同一性を有するポリヌクレオチドが一
層好ましいが、少なくとも98〜99％の同一性を有するものがより一層好ましく、
少なくとも99％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ましいものである。
かかるポリヌクレオチドとして、配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌク
レオチドおよび配列番号１のポリヌクレオチドが挙げられる。 本発明はまた、上記の全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
提供する。A further polynucleotide of the invention includes at least 70% identity, preferably at least 80% identity, more preferably at least 90% identity to the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 over the entire length of SEQ ID NO: 1. Sex, more preferably at least
An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 95% identity is included. In this regard, polynucleotides having at least 97% identity are more preferred, while those with at least 98-99% identity are even more preferred,
Polynucleotides having at least 99% identity are most preferred.
Such polynucleotides include a polynucleotide comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 and a polynucleotide of SEQ ID NO: 1. The present invention also provides polynucleotides that are complementary to all of the above polynucleotides.

【００２３】 配列番号１のヌクレオチド配列は、GPCRW受容体（Gantz,I.,Muraoka,A.,Yang,
Y.K.,Samuelson,L.C.,Zimmerman,E.M,Cook,H.およびYamada,T. Genomics 42(3),
462-466(1997)）との相同性を示す。配列番号１のヌクレオチド配列はcDNA配列
であり、配列番号２のポリペプチドである331個のアミノ酸のポリペプチドをコ
ードするポリペプチドコード化配列(ヌクレオチド1〜993)を含む。配列番号２の
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペプ
チドコード化配列と同一であっても、遺伝暗号の重複性（縮重）のため、やはり
配列番号２のポリペプチドをコードする、配列番号１に含まれる配列以外の配列
であってもよい。配列番号２のポリペプチドはプリン作動性受容体ファミリーの
他のタンパク質と構造的に関連しており、GPCRW受容体（Gantz,I.,Muraoka,A.,Y
ang,Y.K.,Samuelson,L.C.,Zimmerman,E.M,Cook,H.およびYamada,T. Genomics 42
(3), 462-466(1997)）との相同性および／または構造類似性を有する。The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a GPCRW receptor (Gantz, I., Muraoka, A., Yang,
YK, Samuelson, LC, Zimmerman, EM, Cook, H. and Yamada, T. Genomics 42 (3),
462-466 (1997)). The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a cDNA sequence and includes a polypeptide-encoding sequence (nucleotides 1-993) encoding a polypeptide of 331 amino acids, which is a polypeptide of SEQ ID NO: 2. Even though the nucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is identical to the polypeptide encoding sequence contained in SEQ ID NO: 1, the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is still redundant due to the redundancy (degeneracy) of the genetic code. And a sequence other than the sequence contained in SEQ ID NO: 1. The polypeptide of SEQ ID NO: 2 is structurally related to other proteins in the purinergic receptor family and is associated with the GPCRW receptor (Gantz, I., Muraoka, A., Y
ang, YK, Samuelson, LC, Zimmerman, EM, Cook, H. and Yamada, T. Genomics 42
(3), 462-466 (1997)) and / or structural similarity.

【００２４】 本発明の好適なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それと相
同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／性質をもつこ
とが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは少なくとも１つのGPRW受容体活性を有する。Preferred polypeptides and polynucleotides of the present invention are expected to have, inter alia, similar biological functions / properties as the polypeptides and polynucleotides homologous thereto. Further, preferred polypeptides and polynucleotides of the present invention have at least one GPRW receptor activity.

【００２５】 本発明のポリヌクレオチドは、エクスプレスド・シーケンス・タグ（EST）解
析法（Adams,M.D.ら、Science(1991) 252:1651-1656；Adams,M.D.ら、Nature(19
92) 355:632-634；Adams,M.D.ら、Nature(1995) 377 Supp:3-174）を用いて、ヒ
トの胎盤の細胞中のmRNAから誘導されたcDNAライブラリーから、標準的なクロー
ニングおよびスクリーニング技術により得ることができる。また、本発明のポリ
ヌクレオチドはゲノムDNAライブラリーのような天然源から得ることができ、商
業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。The polynucleotide of the present invention can be obtained by an Expressed Sequence Tag (EST) analysis method (Adams, MD et al., Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, MD et al., Nature (19)
92) 355: 632-634; Adams, MD, et al., Nature (1995) 377 Supp: 3-174) using standard cloning and cDNA cloning from mRNA libraries derived from mRNA in cells of human placenta. It can be obtained by screening techniques. In addition, the polynucleotide of the present invention can be obtained from a natural source such as a genomic DNA library, and can also be synthesized using a commercially available known technique.

【００２６】 本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生産のために用
いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列単独、ま
たは他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もし
くはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの
）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列が含まれ
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得
る。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例においては、マーカー配列は、pQ
Eベクター(Qiagen, Inc.)により提供されかつ Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA (1989) 86:821-824に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、
またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列
、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル
化シグナル、リボソーム結合部位、およびmRNA安定化配列を含んでいてもよい。When a polynucleotide of the present invention is used for recombinant production of a polypeptide of the present invention, the polynucleotide may include the coding sequence for the mature polypeptide alone, or another coding sequence (eg, a leader or secretory sequence). Sequences, those encoding the pre-, pro- or prepro-protein sequences, or other fusion peptide moieties) in the same reading frame. For example, a marker sequence that facilitates purification of the fusion polypeptide can be encoded. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker sequence is pQ
Provided by the E vector (Qiagen, Inc.) and Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1989) 86: 821-824, a hexa-histidine peptide,
Or it is an HA tag. The polynucleotide may also include 5 'and 3' non-coding sequences, such as transcribed but not translated sequences, splicing and polyadenylation signals, ribosome binding sites, and mRNA stabilizing sequences.

【００２７】 本発明の更なる実施形態としては、数個、例えば5〜10個、1〜5個、1〜3個、1
〜2個、または1個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド変異体をコードする
ポリヌクレオチドがある。Further embodiments of the present invention include several, for example, 5-10, 1-5, 1-3, 1
There is a polynucleotide that encodes a polypeptide variant comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein -2 or 1 amino acid residues have been substituted, deleted or added in any combination.

【００２８】 配列番号１に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一であるポリ
ヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする完全長cDNAおよびゲノムク
ローンを単離するために、また、配列番号１に対して高い配列類似性を有する他
の遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体(homolog)およびオーソログ(ortholog
)をコードする遺伝子を含む）のcDNAおよびゲノムクローンを単離するために、c
DNAおよびゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増
幅（PCR）反応用のプライマーとして用いることができる。一般的に、これらの
ヌクレオチド配列は基準のヌクレオチド配列と70％、好ましくは80％、より好ま
しくは90％、最も好ましくは95％同一である。プローブまたはプライマーはたい
てい15個以上のヌクレオチドを含み、好ましくは30個以上を含み、50個以上のヌ
クレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは30〜50個の範囲のヌク
レオチドを有するものである。A polynucleotide that is identical or sufficiently identical to the nucleotide sequence contained in SEQ ID NO: 1 can be used to isolate full-length cDNA and genomic clones encoding a polypeptide of the present invention, as well as SEQ ID NO: Other genes with high sequence similarity to H.1 (homolog and ortholog from non-human species)
To isolate cDNA and genomic clones (including the gene encoding
It can be used as a hybridization probe for DNA and genomic DNA, or as a primer for a nucleic acid amplification (PCR) reaction. Generally, these nucleotide sequences are 70%, preferably 80%, more preferably 90%, and most preferably 95% identical to the reference nucleotide sequence. Probes or primers usually contain 15 or more nucleotides, preferably 30 or more, and may have 50 or more nucleotides. Particularly preferred probes are those having a range of 30 to 50 nucleotides.

【００２９】 本発明のポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログを含
む）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列またはそ
の断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配列
を含む完全長cDNAおよびゲノムクローンを単離する各工程を含む方法により得ら
れる。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。好ましい
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50% ホルムアミド、5×SSC
(150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)
、5×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサ
ケ***DNAを含有する溶液中42℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを
0.1×SSC 中約65℃で洗浄することを含む。かくして、本発明は、配列番号１の
ヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングす
ることにより得られるポリヌクレオチドをも包含する。Polynucleotides encoding polypeptides of the present invention (including homologs and orthologs from non-human species) can be stringent using labeled probes having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or fragments thereof. It is obtained by a method comprising the steps of screening an appropriate library under hybridization conditions and isolating a full-length cDNA and a genomic clone containing the polynucleotide sequence. Such hybridization techniques are known to those skilled in the art. Preferred stringent hybridization conditions are 50% formamide, 5 × SSC
(150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6)
Incubate overnight at 42 ° C. in a solution containing 5 × Denhardt solution, 10% dextran sulfate and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then filter
This involves washing at about 65 ° C in 0.1 x SSC. Thus, the present invention also includes a polynucleotide obtained by screening an appropriate library under stringent hybridization conditions using a labeled probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof.

【００３０】 当業者には理解されるように、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域が
そのcDNAの5'末端で短く切断されることから、単離されたcDNA配列は不完全であ
るだろう。それは逆転写酵素のためであり、この酵素はもともと「プロセシビテ
ィ」（processivity：重合反応中に鋳型に結合した状態でいる該酵素の能力の尺
度）が低く、第一鎖cDNA合成の間にmRNA鋳型のDNAコピーを完成させることがで
きない。As will be appreciated by those skilled in the art, the isolated cDNA sequence will often be incomplete due to the truncation of the region encoding the polypeptide at the 5 ′ end of the cDNA in many cases. Would. It is because of reverse transcriptase, which originally has low "processivity" (a measure of the enzyme's ability to remain bound to the template during the polymerization reaction), and the mRNA template during first-strand cDNA synthesis. DNA copy cannot be completed.

【００３１】 完全長cDNAを得るための、または短鎖cDNAを伸長させるための、当業者に公知
で利用可能な方法がいくつかあり、例えば、cDNA末端高速増幅法（RACE）に基づ
いた方法がある（例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988を参照の
こと）。例えばMarathon^TM技術(Clontech Laboratories Inc.)により示されるよ
うな、上記技法の最近の改良により、より長いcDNAの検索が大いに簡便化された
。Marathon^TM技術では、所定の組織より抽出されたmRNAからcDNAを作製し、各末
端に「アダプター」配列を連結する。続いて、遺伝子特異的およびアダプター特
異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて核酸増幅（PCR）を行い
、cDNAの「欠失」5'末端を増幅する。次に、「ネステッド（nested）」プライマ
ー、すなわち増幅産物の内部にアニーリングするように設計されたプライマー（
典型的には、アダプター配列のさらに3'側にアニーリングするアダプター特異的
プライマーおよび既知遺伝子配列のさらに5'側にアニーリングする遺伝子特異的
プライマー）を用いてPCR反応を繰り返す。その後、この反応の産物をDNA塩基配
列決定により解析し、この産物を既存のcDNAに直接結合するか、または5'プライ
マー設計用の新たな配列情報を用いて別の完全長PCRを行うことにより、完全長c
DNAを構築することができる。There are several methods known and available to those skilled in the art for obtaining full-length cDNAs or elongating short cDNAs, such as those based on the rapid cDNA end amplification method (RACE). (See, eg, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Recent improvements in the above techniques, as demonstrated by, for example, Marathon ^™ technology (Clontech Laboratories Inc.), have greatly simplified the search for longer cDNAs. In the Marathon ^™ technology, cDNA is made from mRNA extracted from a given tissue, and an “adapter” sequence is ligated to each end. Subsequently, nucleic acid amplification (PCR) is performed using a combination of gene-specific and adapter-specific oligonucleotide primers to amplify the "deleted" 5 'end of the cDNA. Next, a “nested” primer, ie, a primer designed to anneal inside the amplification product (
Typically, the PCR reaction is repeated using an adapter-specific primer that anneals further 3 'to the adapter sequence and a gene-specific primer that anneals further 5' to the known gene sequence. The products of this reaction are then analyzed by DNA sequencing and either directly linked to the existing cDNA or another full-length PCR using new sequence information for 5 ′ primer design. , Full length c
DNA can be constructed.

【００３２】 本発明の組換え体ポリペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、発現系を含
有する遺伝子操作宿主細胞から生産することができる。したがって、更なる態様
において、本発明は、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含有する発現系、該
発現系により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明ポリペプ
チドの生産に関する。本発明のDNA構築物から誘導されたRNAを用いてこの種のタ
ンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。[0032] The recombinant polypeptides of the present invention can be produced from genetically engineered host cells containing the expression system using methods known in the art. Thus, in a further aspect, the present invention relates to an expression system containing one or more polynucleotides of the present invention, a host cell engineered with said expression system, and the production of a polypeptide of the present invention by recombinant methods. Cell-free translation systems can also be used to produce such proteins using RNA derived from the DNA constructs of the present invention.

【００３３】 組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み込むために宿主細胞を遺伝子操作することができる。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986)
および Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))などの多
くの標準的な実験室マニュアルに記載された方法により行うことができる。好適
なこうした方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)
、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレ
クトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾
丸導入(ballistic introduction)または感染などがある。For recombinant production, host cells can be genetically engineered to incorporate a polynucleotide expression system of the invention or a portion thereof. Introduction of a polynucleotide into a host cell is described in Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986).
And Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) and many other standard laboratory manuals. Suitable such methods include, for example, calcium phosphate transfection, DEAE
-Dextran-mediated transfection, transvection
, Microinjection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction or infection.

【００３４】 適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス(Strepto
cocci)、スタフィロコッカス(Staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミ
セス(Streptomyces)、枯草菌(Bacillus subtilis)）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス(Aspergillus)）、昆虫細胞（例：ドロソフィラ(Drosophila)S2、
スポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3
T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。[0034] Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, Streptococcus).
cocci), Staphylococci, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila) (Drosophila) S2,
Spodoptera Sf9 cells), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3
T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.

【００３５】 多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入因子由来
、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、SV40のような
パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂
犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せに由来
するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリ
オファージの遺伝的要素に由来するものがある。これらの発現系は発現を起こさ
せるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、宿主内
でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現する
ことができる系またはベクターはどれも使用しうる。Sambrookら, Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual (前掲) に記載されるような、日常的に用いられる
公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入すること
ができる。翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞
外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み
込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ
っても、異種シグナルであってもよい。[0035] A wide variety of expression systems can be used. Such expression systems include, in particular, systems derived from chromosomes, episomes and viruses, such as those derived from bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, yeast episomes, insertion factors, yeast chromosomal elements, viruses (eg, baculovirus, SV40 Such as papovavirus, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, and retrovirus), and vectors derived from combinations thereof, for example, plasmids such as cosmids and phagemids and bacteriophage genetics. Some come from elements. These expression systems may contain control sequences that regulate as well as cause expression. Generally, any system or vector that can maintain, augment, and express a polynucleotide for the production of a polypeptide in a host can be used. Sambrook et al., Molecular Cl
oning: The appropriate nucleotide sequence can be inserted into the expression system by any of the commonly used and known techniques, such as those described in the A Laboratory Manual (supra). Appropriate secretion signals can be incorporated into the polypeptide of interest to secrete the translated protein into the endoplasmic reticulum lumen, into the periplasmic space, or into the extracellular environment. These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or heterologous signals.

【００３６】 スクリーニングアッセイで使用するために本発明のポリペプチドを発現させよ
うとする場合、一般にそのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適で
ある。その場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する
。該ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製す
るために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、
その後にポリペプチドを回収する必要がある。When it is desired to express a polypeptide of the invention for use in a screening assay, it is generally preferred that the polypeptide be produced on the surface of cells. If so, the cells are harvested prior to use in the screening assay. If the polypeptide is secreted into the medium, the medium is recovered to recover and purify the polypeptide. If produced intracellularly, lyse the cells first,
Thereafter, the polypeptide must be recovered.

【００３７】 組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を
再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元す
ることが可能である。To recover and purify the polypeptide of the present invention from recombinant cell culture, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity Known methods including chromatography, hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography can be used. Most preferably, high performance liquid chromatography is used for purification. When the polypeptide is denatured during isolation and / or purification, it is possible to restore the active conformation using known techniques for regenerating proteins.

【００３８】 本発明はまた、診断薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連した、配列番号１のポリヌクレオチドにより特徴づけられる遺伝子
の変異型の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または変化した発現により生
ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に追加しうる、またはその診断を
下しうる診断用ツールを提供するだろう。該遺伝子に突然変異がある個体を、さ
まざまな技法によりDNAレベルで見つけ出すことができる。The present invention also relates to the use of the polynucleotide of the present invention as a diagnostic. Detection of a variant of a gene characterized by a polynucleotide of SEQ ID NO: 1 associated with a dysfunction is useful for diagnosing a disease caused by under-expression, over-expression or altered expression of the gene or susceptibility to the disease. It will provide a diagnostic tool that can be added or diagnosed. Individuals with mutations in the gene can be found at the DNA level by various techniques.

【００３９】 診断用の核酸は、被験体の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料由来の細胞から得ることができる。検出のためにゲノムDNAを直接使用し
てもよいし、分析前にPCRまたは他の増幅法を使ってゲノムDNAを酵素的に増幅し
てもよい。同様の方法でRNAまたはcDNAを使用することもできる。欠失および挿
入突然変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により
検出できる。点突然変異は増幅DNAを標識化GPRW受容体ヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重
鎖とはRNase消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、DNA配
列の差異は、変性剤を含むもしくは含まないゲルでのDNA断片の電気泳動の移動
度の変化により、または直接DNA塩基配列決定によっても検出できる（例えば、M
yersら, Science (1985) 230:1242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌ
クレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、RNaseおよびS1プロテクション）
または化学的開裂法によっても確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、例えば、遺伝子
変異の効率のよいスクリーニングを行うため、GPRW受容体ヌクレオチド配列また
はその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる
。アレイ技術は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖お
よび遺伝的変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用い
られている（例えば、M. Cheeら, Science, Vol.274, pp.610-613 (1996) を参
照のこと）。[0039] Diagnostic nucleic acids can be obtained from cells of a subject, such as cells from blood, urine, saliva, tissue biopsy or autopsy material. Genomic DNA may be used directly for detection, or may be enzymatically amplified using PCR or other amplification methods prior to analysis. RNA or cDNA can be used in a similar manner. Deletion and insertion mutations can be detected by a change in the size of the amplified product when compared to the normal genotype. Point mutations can be identified by hybridizing the amplified DNA to a labeled GPRW receptor nucleotide sequence. Perfectly matched sequences and mismatched duplexes can be distinguished by RNase digestion or by differences in melting temperatures. DNA sequence differences can also be detected by changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments on gels with or without denaturing agents, or by direct DNA sequencing (eg, M
yers et al., Science (1985) 230: 1242). Sequence changes at specific positions can be detected by nuclease protection assays (eg, RNase and S1 protection)
Alternatively, it can be confirmed by a chemical cleavage method (Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1985) 85: 4397-4401). In another embodiment, an array of oligonucleotide probes containing the GPRW receptor nucleotide sequence or a fragment thereof can be constructed, for example, to perform efficient screening for gene mutations. Array technology is known and has general applicability and is used to solve various molecular genetics problems, including gene expression, genetic linkage and genetic variability (eg, M Chee et al., Science, Vol. 274, pp. 610-613 (1996)).

【００４０】 診断アッセイは、前記の方法によりGPRW受容体遺伝子の変異を検出することで
、前記疾患への罹りやすさを診断または判定する方法を提供する。さらに、被験
体から得られたサンプルからポリペプチドまたはmRNAのレベルの異常な低下また
は上昇を測定する方法により、前記疾患の診断を下すことができる。発現の低下
または増加は、当業界で公知のポリヌクレオチドの定量法、例えば核酸増幅（例
：PCR、RT−PCR）、RNaseプロテクション、ノーザンブロッティング、その他の
ハイブリダイゼーション法のいずれかによりRNAレベルで測定することができる
。宿主から得られたサンプル中の本発明ポリペプチドのようなタンパク質のレベ
ルを測定するアッセイ法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法とし
て、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELIS
Aアッセイなどがある。The diagnostic assay provides a method for diagnosing or determining susceptibility to the disease by detecting a mutation in the GPRW receptor gene by the method described above. Furthermore, the disease can be diagnosed by a method of measuring an abnormal decrease or increase in the level of a polypeptide or mRNA from a sample obtained from a subject. Decrease or increase in expression is measured at the RNA level by any of the polynucleotide quantification methods known in the art, such as nucleic acid amplification (eg, PCR, RT-PCR), RNase protection, Northern blotting, or other hybridization methods. can do. Assays for measuring the level of a protein, such as a polypeptide of the present invention, in a sample obtained from a host are well-known to those of skill in the art. These assays include radioimmunoassays, competitive binding assays, western blot analysis, ELIS
There is A assay.

【００４１】 かくして、もう一つの態様において、本発明は、 (a) 本発明のポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列
）もしくはその断片、 (b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、 (c) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしく
はその断片、または (d) 本発明のポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対す
る抗体、 を含む診断用キットに関する。Thus, in another embodiment, the present invention provides: (a) a polynucleotide of the present invention (preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) or a fragment thereof, (b) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a). (C) an antibody against the polypeptide of the present invention (preferably, the polypeptide of SEQ ID NO: 2) or a fragment thereof, or (d) an antibody against the polypeptide of the present invention (preferably, the polypeptide of SEQ ID NO: 2), And a diagnostic kit comprising:

【００４２】 このようなキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)が実質的な構成成分であ
ることが理解されよう。かかるキットは疾患または疾患への罹りやすさ、特に細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染症、特にHIV-1またはHIV-2により引き起
こされる感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥満；食欲不振；過食症；喘息；パーキン
ソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿停留；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；
卒中；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；不安、精神分
裂病、躁うつ、うつ病、せん妄、痴呆および重度の精神遅滞を含む精神病性およ
び神経系疾患；あるいはハンチントン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群な
どの運動障害などを診断するうえで有用である。It will be appreciated that in such a kit, (a), (b), (c) or (d) is a substantial component. Such a kit may be a disease or susceptibility to a disease, especially bacterial, fungal, protozoan and viral infections, especially infections caused by HIV-1 or HIV-2; pain; cancer; diabetes, obesity; anorexia; Disease; asthma; Parkinson's disease; acute heart failure; hypotension; hypertension; urinary retention; osteoporosis; angina;
Stroke; ulcer; asthma; allergy; benign prostatic hyperplasia; migraine; vomiting; psychotic and nervous system disorders including anxiety, schizophrenia, manic depression, depression, delirium, dementia and severe mental retardation; It is useful for diagnosing movement disorders such as Jill de la Tourette syndrome.

【００４３】 また、本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも有用である。この配列は
個々のヒト染色体上の特定の位置をターゲッティングし、その特定位置とハイブ
リダイズすることができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成するこ
とは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させるうえで重要な第一段階であ
る。ひとたび配列が正確な染色***置にマッピングされたら、その染色体上のそ
の配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデー
タは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins U
niversity Welch Medical Library からオンラインで入手可能) 中に見いだせる
。その後、同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を連鎖解
析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。The nucleotide sequence of the present invention is also useful for chromosome identification. This sequence can target a specific location on an individual human chromosome and hybridize to that specific location. Creating a chromosomal map of related sequences according to the present invention is an important first step in correlating these sequences with gene-related diseases. Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of that sequence on that chromosome can be correlated with genetic map data. This type of data is described, for example, in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins U.
niversity (available online from the Welch Medical Library). Thereafter, the relationship between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease is confirmed by linkage analysis (co-inheritance of physically adjacent genes).

【００４４】 罹患個体と非罹患個体とのcDNAまたはゲノム配列の差異も調べることができる
。罹患個体の一部または全部に突然変異が観察されるが、どの正常個体にも観察
されない場合は、その突然変異が疾患の原因である可能性がある。 本発明の遺伝子は、ヒト染色体13q32にマッピングされる。[0044] Differences in cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals can also be determined. If a mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in any normal individuals, then the mutation may be responsible for the disease. The gene of the present invention maps to human chromosome 13q32.

【００４５】 本発明のポリペプチド、その断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細
胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を生産するための免疫原として
も使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における他
の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実
質的に高い親和性を示すことを意味する。The polypeptide of the present invention, a fragment or an analog thereof, or a cell expressing the same can also be used as an immunogen for producing an antibody immunospecific for the polypeptide of the present invention. By "immunospecific" is meant that the antibody exhibits a substantially higher affinity for the polypeptides of the present invention than its affinity for other related polypeptides in the prior art.

【００４６】 本発明のポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコルを用いて、動物（好
ましくはヒト以外の動物）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似
体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には
、連続細胞系の培養物から抗体を産生させる任意の技法を用いることができる。
例を挙げると、ハイブリドーマ法 (Kohler, G.およびMilstein, C., Nature (19
75) 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 (Kozborら, Im
munology Today (1983) 4:72) およびEBV−ハイブリドーマ法 (Coleら, Monoclo
nal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)
などがある。Antibodies to a polypeptide of the present invention can be obtained by administering fragments, analogs or cells containing the polypeptide or epitope to an animal, preferably a non-human animal, using conventional protocols. For preparation of monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures can be used.
For example, the hybridoma method (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (19
75) 256: 495-497), trioma method, human B cell hybridoma method (Kozbor et al., Im
munology Today (1983) 4:72) and the EBV-hybridoma method (Cole et al., Monoclo
nal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)
and so on.

【００４７】 本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、米国特許第4,946,
778号に記載されるような一本鎖抗体の調製法を適応させることができる。また
、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物を含む他の生物を利用することができる。 前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。To generate single chain antibodies to the polypeptides of the present invention, US Pat. No. 4,946,
Methods for preparing single chain antibodies as described in US Pat. No. 778 can be adapted. Also, transgenic mice or other organisms, including other mammals, can be used to express humanized antibodies. Using the antibody described above, a clone expressing the polypeptide can be isolated and identified, or the polypeptide can be purified by affinity chromatography.

【００４８】 本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、前記疾患の治療に使用でき
る可能性がある。 本発明の更なる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断
片と、各種サブクラス（IgG、IgM、IgA、IgE）の免疫グロブリンのH鎖またはL鎖
の定常領域の様々な部分と、を含んでなる遺伝子工学的に作製された可溶性融合
タンパク質に関する。免疫グロブリンとしてはヒトIgG、特にIgG1のH鎖の定常部
が好ましく、その場合は融合がヒンジ領域で起こる。特定例では、血液凝固Xa因
子で開裂され得る開裂配列を組み込むことで、Fc部分を簡単に除去できる。さら
に、本発明は、これら融合タンパク質の遺伝子工学的作製方法、ならびに薬物ス
クリーニング、診断および治療におけるそれらの使用に関する。また、本発明の
更なる態様はこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する
。融合タンパク質技術の例は国際特許出願 WO94/29458 およびWO94/22914に見い
だせる。[0048] Antibodies to the polypeptides of the present invention may be used, inter alia, for the treatment of the aforementioned diseases. In a further aspect of the present invention, the present invention provides a polypeptide of the invention or a fragment thereof and various parts of the constant regions of the heavy or light chains of the immunoglobulins of the various subclasses (IgG, IgM, IgA, IgE). And a genetically engineered soluble fusion protein comprising: The immunoglobulin is preferably the constant region of the heavy chain of human IgG, especially IgG1, in which case the fusion takes place in the hinge region. In certain instances, the Fc portion can be easily removed by incorporating a cleavage sequence that can be cleaved by blood coagulation factor Xa. Furthermore, the invention relates to methods for the genetic engineering of these fusion proteins and their use in drug screening, diagnosis and therapy. A further aspect of the present invention relates to a polynucleotide encoding such a fusion protein. Examples of fusion protein technology can be found in International Patent Applications WO94 / 29458 and WO94 / 22914.

【００４９】 本発明の更なる態様は哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に前記疾患から該動物を防御するための抗体および／またはＴ細
胞免疫応答を生ずるのに十分な本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を前記疾患から防御する抗
体を産生させるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo で本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して該ポ
リペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を引き
出す方法に関する。A further aspect of the invention relates to a method of eliciting an immunological response in a mammal,
The method comprises inoculating a mammal with an antibody and / or a polypeptide of the invention sufficient to generate a T cell immune response, particularly to protect the animal from the disease. Yet another aspect of the invention directs the expression of a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention in vivo to elicit an immunological response that produces antibodies that protect the mammal from the disease. A method of eliciting an immunological response in a mammal, comprising providing the polypeptide via a vector.

【００５０】 本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
本発明のポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物は本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。ポリペプチ
ドは胃の中で分解される可能性があるので、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内
、静脈内または皮内注射により）投与することが好ましい。非経口投与に適した
製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等
張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、ならびに懸濁剤または
増大剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量
容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供すること
ができ、また、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのア
ジュバント系、例えば水中油型のアジュバント系や当業界で公知の他のアジュバ
ント系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性により変化するが、ルー
チンな実験操作により簡単に決定できる。A further aspect of the present invention relates to immunological / vaccine formulations (compositions) that, when introduced into a mammalian host, elicit an immunological response in the mammal to the polypeptide of the present invention. Contains a polypeptide or polynucleotide of the invention. The vaccine formulation may further comprise a suitable carrier. Since the polypeptide may be broken down in the stomach, it is preferably administered parenterally (eg, by subcutaneous, intramuscular, intravenous or intradermal injection). Formulations suitable for parenteral administration include sterile aqueous and non-aqueous injections, which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats and solutes which render the formulation isotonic with the blood of the recipient, and suspensions. Alternatively, there are aqueous and non-aqueous sterile suspensions that may include augmenting agents. Such formulations may be presented in single or multi-dose containers (eg, sealed ampules and vials) and may also be stored in a lyophilized condition which requires only the addition of a sterile liquid carrier immediately before use. it can. The vaccine formulation may include an adjuvant system to enhance the immunogenicity of the formulation, such as an oil-in-water adjuvant system or other adjuvant systems known in the art. The dose varies with the specific activity of the vaccine, but can be easily determined by routine experimentation.

【００５１】 本発明のポリペプチドは、多くの病状、特に前記疾患を含めて、さまざまな生
物学的機能に関与している。それゆえ、このポリペプチドの機能を刺激または抑
制する化合物を同定するスクリーニング法を開発することが望ましい。したがっ
て、更なる態様において、本発明は、このポリペプチドの機能を刺激または抑制
する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。一般的には
、前記疾患の治療および予防目的のためにアゴニストまたはアンタゴニストが使
用される。種々の供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー
および天然産物の混合物から化合物を同定することができる。このように同定さ
れたアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、場合により、該ポリペ
プチドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、酵素などであってよ
く、また、その構造的または機能的なミメティックであってもよい（Coliganら,
Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参照のこと）。[0051] The polypeptides of the present invention are involved in a variety of biological functions, including a number of medical conditions, particularly those diseases. Therefore, it is desirable to develop screening methods that identify compounds that stimulate or suppress the function of this polypeptide. Accordingly, in a further aspect, the present invention provides a method of screening a compound to identify a compound that stimulates or suppresses the function of the polypeptide. Generally, agonists or antagonists are used for the purpose of treating and preventing the above-mentioned diseases. Compounds can be identified from a variety of sources, such as mixtures of cells, cell-free preparations, chemical libraries and natural products. The agonist, antagonist or inhibitor so identified may optionally be a natural or modified substrate, ligand, receptor, enzyme, etc., of the polypeptide, and its structural or functional mimetic (Coligan et al.,
Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991)).

【００５２】 スクリーニング法では、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドを担持
する細胞もしくは膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補
化合物に直接または間接的に結合された標識を用いて簡単に測定できる。あるい
はまた、スクリーニング法では標識した競合物質との競合を用いることもある。
さらに、こうしたスクリーニング法では、候補化合物がポリペプチドの活性化ま
たは抑制により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを、該ポリペプチドを
担持する細胞に適した検出系を用いて試験することができる。一般的には、既知
のアゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイして、アゴニストによ
る活性化に候補化合物の存在が与える影響を調べる。アゴニストまたはインヒビ
ターの非存在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化を抑制するか否かを調べ
ることによる逆アゴニストまたはインヒビターのスクリーニング法では、構成的
に活性のあるポリペプチドが用いられる。さらに、これらのスクリーニング法は
、候補化合物と本発明のポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつく
り、この混合物中のGPRW受容体活性を測定し、そしてこの混合物のGPRW受容体活
性をスタンダードと比較する各ステップを単に含むだけでよい。本発明のポリペ
プチドのアンタゴニストを同定する高効率スクリーニングアッセイでは、上記の
ようなFc部分とGPRW受容体ポリペプチドから作製されるような融合タンパク質も
使用することができる(D. Bennettら, J. Mol. Recognition, 852-58 (1995) お
よびK. Johansonら, J. Biol. Chem., 270(16):94599471 (1995)を参照のこと）
。In the screening method, the binding of the candidate compound to the polypeptide of the present invention, or a cell or membrane carrying the polypeptide, or a fusion protein thereof is performed using a label directly or indirectly bound to the candidate compound. And easy to measure. Alternatively, the screening method may use competition with a labeled competitor.
Furthermore, such screening methods can test whether a candidate compound results in a signal resulting from activation or suppression of the polypeptide, using a detection system suitable for cells carrying the polypeptide. . Generally, inhibitors of activation are assayed in the presence of a known agonist to determine the effect of the presence of the candidate compound on activation by the agonist. Constitutively active polypeptides are used in screening methods for inverse agonists or inhibitors by examining whether a candidate compound inhibits polypeptide activation in the absence of an agonist or inhibitor. Furthermore, in these screening methods, a mixture is prepared by mixing a candidate compound and a solution containing the polypeptide of the present invention, the GPRW receptor activity in the mixture is measured, and the GPRW receptor activity of the mixture is determined as a standard. Simply include each step of comparing with. In high efficiency screening assays to identify antagonists of the polypeptides of the invention, fusion proteins such as those made from the Fc portion and GPRW receptor polypeptide as described above can also be used (D. Bennett et al., J. See Mol. Recognition, 852-58 (1995) and K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270 (16): 94599471 (1995).
.

【００５３】 あるスクリーニング技術は、受容体の活性化により引き起こされる細胞外のpH
変化または細胞内のカルシウム変化を測定する系における、本発明の受容体を発
現する細胞（例えば、トランスフェクトしたCHO細胞）の使用を含む。この技術
では、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞と接触させ得る。次
に第2メッセンジャーの応答、例えばシグナル伝達、pH変化またはカルシウムレ
ベルの変化を測定し、その候補化合物が受容体を活性化するか阻害するかを判定
する。One screening technique involves measuring extracellular pH caused by receptor activation.
And the use of cells expressing the receptor of the invention (eg, transfected CHO cells) in a system that measures changes or intracellular calcium changes. In this technique, a compound may be contacted with a cell that expresses a receptor polypeptide of the invention. The response of the second messenger, eg, signal transduction, changes in pH or changes in calcium levels are then measured to determine if the candidate compound activates or inhibits the receptor.

【００５４】 他の方法では、受容体介在型cAMPおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の
抑制または刺激を測定することにより受容体インヒビターについてスクリーニン
グする。このような方法には、真核細胞を本発明の受容体でトランスフェクトし
、細胞表面上で該受容体を発現させることが含まれる。続いて該細胞を本発明の
受容体の存在下で潜在的なアンタゴニストに曝露する。次にcAMP蓄積量を測定す
る。潜在的なアンタゴニストが該受容体に結合し、それゆえ受容体結合を抑制し
ている場合、受容体介在型cAMP活性レベルまたはアデニル酸シクラーゼ活性レベ
ルは減少するかまたは上昇する。Another method screens for receptor inhibitors by measuring inhibition or stimulation of receptor-mediated cAMP and / or adenylate cyclase accumulation. Such methods include transfecting a eukaryotic cell with a receptor of the present invention and expressing the receptor on the cell surface. Subsequently, the cells are exposed to a potential antagonist in the presence of the receptor of the invention. Next, the amount of cAMP accumulation is measured. When a potential antagonist binds to the receptor and thus inhibits receptor binding, the level of receptor-mediated cAMP activity or adenylate cyclase activity is reduced or increased.

【００５５】 本発明の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを検出する別の方法は、米
国特許第5,482,835号に記載のような酵母に基づく技法である。 また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは該ポリペプチドに対す
る抗体を用いて、細胞内でのmRNAまたはポリペプチドの産生に及ぼす添加化合物
の作用を検出するためのスクリーニング法を組み立てることができる。例えば、
当業界で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用い
て、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのELISAア
ッセイを構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織からのポ
リペプチドの産生を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまたはア
ゴニストともいう）の探索に用いることができる。Another method for detecting agonists or antagonists of the receptor of the present invention is a yeast-based technique as described in US Pat. No. 5,482,835. In addition, a screening method for detecting the effect of an additional compound on the production of mRNA or polypeptide in cells can be assembled using the polynucleotide, polypeptide or antibody against the polypeptide of the present invention. For example,
Using monoclonal or polyclonal antibodies by standard methods known in the art, an ELISA assay can be constructed to measure the level of secretion or cell binding of the polypeptide, from appropriately engineered cells or tissues. Can be used to search for a substance that suppresses or enhances the production of a polypeptide (also referred to as an antagonist or an agonist, respectively).

【００５６】 膜に結合した受容体または可溶性の受容体が存在するのであれば、当業界で公
知の標準的な受容体結合法によりこの種の受容体を同定するために本発明のポリ
ペプチドを用いることができる。こうした受容体結合法には、限定するものでは
ないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり、これらのアッセイで
は、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例：¹²⁵I）で標識するか、化学的に修
飾（例：ビオチニル化）するか、または検出や精製に適したペプチド配列に融合
させ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液な
ど）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズモン共鳴および
分光学のような生物物理的方法がある。これらのスクリーニング法は、該ポリペ
プチドの（存在するのであれば）その受容体への結合と競合する該ポリペプチド
のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。スク
リーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界でよく理解されている。If a membrane-bound or soluble receptor is present, the polypeptide of the invention may be used to identify such receptor by standard receptor binding methods known in the art. Can be used. Such receptor binding methods include, but are not limited to, ligand binding assays and cross-linking assays, in which the polypeptide is labeled with a radioactive isotope (eg, ¹²⁵ I) or chemically modified (eg, ¹²⁵ I). (Eg, biotinylation) or fused to a peptide sequence suitable for detection or purification and incubated with a putative receptor source (cells, cell membranes, cell supernatants, tissue extracts, body fluids, etc.). Other methods include biophysical methods such as surface plasmon resonance and spectroscopy. These screening methods can also be used to identify agonists or antagonists of the polypeptide that compete with the binding of the polypeptide (if any) to its receptor. Standard methods for performing screening assays are well understood in the art.

【００５７】 本発明のポリペプチドの潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、ある場
合には、該ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接な関係があ
るオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、
酵素などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を誘導しない
（それゆえ該ポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。Examples of potential antagonists of the polypeptides of the present invention include antibodies, and in some cases, oligonucleotides or proteins (eg, oligonucleotides or proteins) that are closely related to the ligands, substrates, receptors, enzymes, etc., of the polypeptide. , Ligands, substrates, receptors,
Fragments, such as enzymes) or small molecules that bind to a polypeptide of the invention but do not elicit a response (and thus prevent the activity of the polypeptide).

【００５８】 かくして、他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニスト
、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはこの種のポリペ
プチドの産生を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキ
ットに関し、このキットは、 (a) 本発明のポリペプチド、 (b) 本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞、 (c) 本発明のポリペプチドを発現している細胞膜、または (d) 本発明のポリペプチドに対する抗体、 を含み、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号２のポリペプチドである。 このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成成分で
あることが理解されよう。Thus, in other aspects, the present invention identifies agonists, antagonists, ligands, receptors, substrates, enzymes, etc., of the polypeptides of the invention, or compounds that decrease or increase the production of such polypeptides. This kit comprises: (a) a polypeptide of the present invention, (b) a recombinant cell expressing the polypeptide of the present invention, and (c) expressing the polypeptide of the present invention. Or (d) an antibody against the polypeptide of the present invention, wherein said polypeptide is preferably the polypeptide of SEQ ID NO: 2. It will be appreciated that in such a kit, (a), (b), (c) or (d) is a substantial component.

【００５９】 当業者であれば、本発明のポリペプチドは、その構造に基づいて該ポリペプチ
ドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを設計する方法にも使用で
きることが容易に理解されよう。この方法は、 (a) 最初に該ポリペプチドの三次元構造を解析し、 (b) アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの有望と思われる反応部
位または結合部位の三次元構造を想定し、 (c) 想定された結合部位または反応部位と結合または反応すると予想される候
補化合物を合成し、そして (d) その候補化合物が実際にアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター
であるか否かを調べる、 ことを含んでなる。これは通常反復プロセスであることがさらに理解されよう。Those skilled in the art will readily appreciate that the polypeptides of the present invention can also be used in methods for designing agonists, antagonists or inhibitors of the polypeptides based on their structure. This method comprises: (a) first analyzing the three-dimensional structure of the polypeptide; (b) assuming the three-dimensional structure of a likely reactive or binding site for an agonist, antagonist or inhibitor; Synthesizing a candidate compound that is expected to bind or react with the assigned binding or reactive site, and (d) determining whether the candidate compound is in fact an agonist, antagonist or inhibitor. It will be further appreciated that this is a generally iterative process.

【００６０】 更なる態様において、本発明は、GPRW受容体ポリペプチド活性の過剰発現と過
少発現のいずれかに関係した、例えば細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染
症、特にHIV-1またはHIV-2により引き起こされる感染症；疼痛；癌；糖尿病、肥
満；食欲不振；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；
尿停留；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；卒中；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前
立腺肥大；片頭痛；嘔吐；不安、精神***病、躁うつ、うつ病、せん妄、痴呆お
よび重度の精神遅滞を含む精神病性および神経系疾患；あるいはハンチントン病
またはジル・ド・ラ・ツレット症候群などの運動障害などの異常な状態の治療法
を提供する。In a further embodiment, the present invention relates to bacterial, fungal, protozoan and viral infections, especially HIV-1 or HIV-related to either overexpression or underexpression of GPRW receptor polypeptide activity. Pain; cancer; diabetes, obesity; anorexia; bulimia; asthma; Parkinson's disease; acute heart failure;
Urinary retention; osteoporosis; angina; myocardial infarction; stroke; ulcer; asthma; allergy; benign prostatic hyperplasia; migraine; vomiting; Methods for treating abnormal conditions such as psychotic and nervous system disorders; or movement disorders such as Huntington's disease or Jill de la Tourette syndrome.

【００６１】 該ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可能
である。一つのアプローチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結
合をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状
態を軽減することにより、該ポリペプチドの機能を抑制するのに有効な量で、上
記のインヒビター化合物（アンタゴニスト）を場合により製剤学上許容される担
体とともに被験体に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内
因性のポリペプチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結合す
る能力がまだある可溶性形態のポリペプチドを投与することができる。このよう
な競合物質の典型的な例はGPRW受容体ポリペプチドの断片である。If the activity of the polypeptide is in excess, several approaches are available. One approach is to suppress the function of the polypeptide, for example, by blocking the binding of ligands, substrates, receptors, enzymes, etc., or by reducing an abnormal condition by suppressing a second signal. Administering to the subject an inhibitor compound (antagonist) as described above, optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier. In another approach, soluble forms of the polypeptide that are still capable of binding ligands, substrates, enzymes, receptors, etc., in competition with the endogenous polypeptide can be administered. A typical example of such a competitor is a fragment of a GPRW receptor polypeptide.

【００６２】 さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性GPRW受容体ポリペプチ
ドをコードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体
内で産生されるかまたは別に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする（
例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression
(遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド
), CRC Press, Boca Raton, FL (1988) 中のO'Connor, J. Neurochem (1991) 56
:560を参照のこと）。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオ
リゴヌクレオチドを供給することもできる（例えば、Leeら, Nucleic Acids Res
(1979) 6:3073; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervanら, Science (199
1) 251:1360 を参照のこと）。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することも
できるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させることもできる。[0062] In yet another approach, expression of the gene encoding endogenous GPRW receptor polypeptide can be suppressed using expression blocking techniques. These known techniques require the use of antisense sequences produced in the body or administered separately (
For example, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression
(Oligodeoxynucleotides as antisense inhibitors of gene expression
O'Connor, J. Neurochem (1991) 56 in CRC Press, Boca Raton, FL (1988).
: 560). Alternatively, oligonucleotides that form a triple helix with this gene can be provided (eg, Lee et al., Nucleic Acids Res.
(1979) 6: 3073; Cooney et al., Science (1988) 241: 456; Dervan et al., Science (199
1) See 251: 1360). These oligomers can be administered as such, or the relevant oligomer can be expressed in vivo.

【００６３】 GPRW受容体およびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も
、いくつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療に有効
な量の本発明ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記アゴニスト）を
製剤学上許容される担体とともに被験体に投与して、異常な状態を緩和すること
を含んでなる。別法として、被験体の関連細胞においてGPRW受容体を内因的に産
生させるために遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複
製欠損レトロウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを
遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチ
ドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入さ
れたパッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺
伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in vivo 細胞操作
およびin vivo ポリペプチド発現のために、これらのプロデューサー細胞を被験
体に投与する。遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Genetics, T St
rachanおよび A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中のChapter
20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approache
s(およびその中の引用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量の本
発明のポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに投与することである。For treating abnormal conditions related to an under-expression of the GPRW receptor and its activity, several approaches are also available. One approach involves administering to a subject a therapeutically effective amount of a compound that activates a polypeptide of the invention (ie, the agonist) together with a pharmaceutically acceptable carrier to alleviate the abnormal condition. Comprising. Alternatively, gene therapy can be used to produce the GPRW receptor endogenously in the relevant cells of the subject. For example, a polynucleotide of the invention may be engineered for expression by a replication defective retroviral vector as described above. The retroviral expression construct is then isolated and introduced into packaging cells transduced with a retroviral plasmid vector containing RNA encoding a polypeptide of the present invention. As a result, the packaging cells will produce infectious viral particles containing the gene of interest. These producer cells are administered to a subject for in vivo cell manipulation and in vivo polypeptide expression. For an overview of gene therapy, see Human Molecular Genetics, T St.
Chapter in rachan and AP Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)
20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approache
See s (and references therein). Another approach is to administer a therapeutic amount of a polypeptide of the invention together with a suitable pharmaceutical carrier.

【００６４】 更なる態様において、本発明は、治療に有効な量のポリペプチド（例えば、可
溶性形態の本発明ポリペプチド）、アゴニストもしくはアンタゴニストペプチド
、または小分子化合物を製剤学上許容される担体または賦形剤と共に含有する医
薬組成物を提供する。この種の担体としては、食塩水、生理食塩水、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これら
に限らない。本発明はさらに、上記の本発明の組成物の１以上の成分を充填した
１以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。本発明のポリペプ
チドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例えば治療用化合物と
一緒に使用してもよい。In a further aspect, the invention provides a therapeutically effective amount of a polypeptide (eg, a soluble form of the polypeptide of the invention), an agonist or antagonist peptide, or a small molecule compound in a pharmaceutically acceptable carrier or Pharmaceutical compositions are provided that contain together with excipients. Such carriers include, but are not limited to, saline, saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. The invention further relates to pharmaceutical packs and kits comprising one or more containers filled with one or more components of the composition of the invention as described above. The polypeptides and other compounds of the present invention may be used alone or in conjunction with other compounds, eg, therapeutic compounds.

【００６５】 医薬組成物は投与経路、例えば全身または経口による投与経路に適合させるこ
とができる。全身投与に適した形態は、注入、典型的には静脈内注射である。皮
下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身投与の別の手
段には、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘
膜および経皮投与がある。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を腸
溶剤またはカプセル剤として製剤化し得るのであれば、経口投与も可能である。
これらの化合物を軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／
または局在化させてもよい。The pharmaceutical composition can be adapted to the route of administration, for example by a systemic or an oral route. A form suitable for systemic administration is infusion, typically intravenous injection. Other injection routes, such as subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal, can also be used. Alternative means of systemic administration include transmucosal and transdermal administration using penetrants such as bile salts, fusidic acid, and other surfactants. In addition, oral administration is possible provided the polypeptide or other compound of the present invention can be formulated as an enteric coating or capsule.
Topical administration of these compounds in the form of ointments, pastes, gels, and / or
Alternatively, it may be localized.

【００６６】 必要な投与量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、
製剤の性質、被験体の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投
与量は被験体の体重１kgあたり0.1〜100μgの範囲である。入手可能な化合物が
多様であること、投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与
量は広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は静注による投与より
も高い投与量を必要とすると予想されよう。こうした投与量レベルの変動は、当
業界でよく理解されているような、標準の経験的な最適化手順を用いて調整する
ことができる。The required dosage range depends on the choice of peptide or other compound of the invention, the route of administration,
It depends on the nature of the formulation, the condition of the subject, and the judgment of the physician. However, suitable dosages are in the range of 0.1-100 μg / kg body weight of the subject. Given the variety of compounds available and the differing efficiencies of the routes of administration, it is expected that the required dosage will vary widely. For example, oral administration would be expected to require higher dosages than intravenous administration. Such variations in dosage level can be adjusted using standard empirical optimization procedures, as is well understood in the art.

【００６７】 治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、被験体の体内で産生させることもできる。例えば、被験体由来の細胞
を、ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAのようなポリヌクレオチドにより、
例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、ex vivo で遺伝子工学的に
操作する。その後、これらの細胞を被験体に導入する。The polypeptide used for the treatment can also be produced in the subject in a therapeutic method called “gene therapy” as described above. For example, cells from a subject can be treated with a polynucleotide such as DNA or RNA encoding the polypeptide.
It is genetically engineered ex vivo, for example, using a retroviral plasmid vector. Thereafter, these cells are introduced into the subject.

【００６８】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、類似の相同性を有する別の配
列を同定する際の価値ある情報源を提供する。これは、こうした配列をコンピュ
ータ読み取り可能媒体中に保存し、次に保存したデータを用いてGCGなどの公知
の検索ツールにより配列データベースを検索することで最大限促進される。した
がって、更なる態様において、本発明は、配列番号１の配列を含むポリヌクレオ
チドおよび／またはそれによりコードされるポリペプチドを保存したコンピュー
タ読み取り可能媒体を提供する。[0068] Polynucleotide and polypeptide sequences provide a valuable source of information in identifying alternative sequences having similar homology. This is facilitated by storing such sequences in a computer readable medium and then using the stored data to search a sequence database using known search tools such as GCG. Accordingly, in a further aspect, the present invention provides a computer readable medium having stored thereon a polynucleotide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 and / or a polypeptide encoded thereby.

【００６９】 以下の定義は上記の説明中でしばしば用いられた用語を理解しやすくするため
のものである。 本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン
発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。The following definitions are provided to facilitate understanding of terms used frequently in the above description. As used herein, “antibody” includes polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, humanized antibodies, as well as Fab fragments, including Fab or other products of an immunoglobulin expression library.

【００７０】 「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか分離されており、またはその両方である。
例えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離
されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように
、「単離された」ものである。“Isolated” means altered “by the hand of man” from the natural state. If an "isolated" composition or substance occurs in nature, it has been changed or separated from its original environment, or both.
For example, a polynucleotide or polypeptide naturally occurring in the body of a living animal is not "isolated", but a polynucleotide or polypeptide separated from its naturally occurring co-localized material is described herein. As used herein, "isolated".

【００７１】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないRNAもしくはDNA、また
は修飾されたRNAもしくはDNAであり得る。「ポリヌクレオチド」には、制限する
ものではないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合
ったDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったRNA
、DNAとRNAを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、またはより典型的には二本鎖
でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。
加えて、「ポリヌクレオチド」はRNAまたはDNAまたはRNAとDNAの両方からなる三
重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾
塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために修飾された
骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化
された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。DNAおよびRNAに対してさ
まざまな修飾を行うことができる。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾され
た形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包
含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称され
る比較的短いポリヌクレオチドも包含する。“Polynucleotide” generally refers to any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which can be unmodified RNA or DNA, or modified RNA or DNA. "Polynucleotide" includes, but is not limited to, single-stranded and double-stranded DNA, DNA in which single-stranded and double-stranded regions are mixed, single-stranded and double-stranded RNA, single-stranded RNA with mixed region and double-stranded region
And hybrid molecules containing DNA and RNA (which may be single-stranded, or more typically double-stranded, or a mixture of single- and double-stranded regions).
In addition, "polynucleotide" means a triple-stranded region consisting of RNA or DNA or both RNA and DNA. The term "polynucleotide" also includes DNAs or RNAs containing one or more modified bases, and DNAs or RNAs with backbones modified for stability or for other reasons. "Modified" bases include, for example, tritylated bases and special bases such as inosine. Various modifications can be made to DNA and RNA. Thus, "polynucleotide" encompasses chemically, enzymatically or metabolically modified forms of polynucleotides commonly occurring in nature, as well as chemical forms of DNA and RNA characteristic of viruses and cells. . "Polynucleotide" also embraces relatively short polynucleotides, often referred to as oligonucleotides.

【００７２】 「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により互いに連結された２個以上のアミノ酸を含む
ペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチ
ド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質と
いう）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外の
アミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天
然のプロセスで、または当業界で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたア
ミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文およ
び研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまた
はカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタ
イプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに
異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾
を含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分
枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状
のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法に
よって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リ
ボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱
メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホ
ルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシン
グ、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化の
ようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などがある（
例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Cre
ighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Posttranslational Cova
lent Modification of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York,
1983中のWold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspective
s and Prospects, pgs. 1-12; Seifterら, “Analysis for protein modificati
ons and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646; および R
attanら, “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging
", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）。By “polypeptide” is meant a peptide or protein comprising two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds (ie, peptide isosteres). "Polypeptide" refers to both short chains (commonly referred to as peptides, oligopeptides or oligomers) and long chains (commonly referred to as proteins). Polypeptides may contain amino acids other than the 20 gene-encoded amino acids. "Polypeptides" include amino acid sequences that have been modified by natural processes, such as post-translational processing, or by any of the chemical modification methods known in the art. Such modifications are elaborated in basic textbooks, more detailed scholarly articles and research literature. Modifications can be made anywhere in the polypeptide, including the peptide backbone, amino acid side chains, amino or carboxyl termini. The same type of modification may be present in the same or varying degrees at several sites in a given polypeptide. Also, a given polypeptide may contain many types of modifications. Polypeptides can be branched for ubiquitination or cyclic, with or without branching. Cyclic, branched or branched cyclic polypeptides can result from post-translation natural processes and can also be produced by synthetic methods. Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, phosphatidylinositol covalent bond. , Cross-linking, cyclization, formation of disulfide bonds, demethylation, formation of covalent cross-links, formation of cystine, formation of pyroglutamate, formylation, γ-carboxylation, glycosylation, formation of GPI anchor, hydroxylation, iodination Transfer RNA-mediated addition of amino acids to proteins, such as, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulphation, arginylation, and ubiquitination (
For example, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., TE Cre
ighton, WH Freeman and Company, New York, 1993; Posttranslational Cova
lent Modification of Proteins, edited by BC Johnson, Academic Press, New York,
Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspective in 1983
s and Prospects, pgs. 1-12; Seifter et al., “Analysis for protein modificati
ons and nonprotein cofactors ", Meth Enzymol (1990) 182: 626-646; and R
attan et al., “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging
", Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62).

【００７３】 「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことである。
典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列
の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくても
よい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配列によりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および末端切断（トランケ
ーション）をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変異体は基準ポリペプチド
とアミノ酸配列の点で相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体
の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるような相違に限ら
れる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み合わせた１以上の置換、欠失、付
加によりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残基
は遺伝子コードによりコードされるものであっても、なくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変異体はアレル変異体のように天然に存在するもの
でも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により作製することができる。“Variant” refers to a polynucleotide or polypeptide that differs from a reference polynucleotide or polypeptide, but retains essential properties.
A typical variant of a polynucleotide differs in nucleotide sequence from a reference polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of this variant may or may not alter the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Nucleotide changes can result in amino acid substitutions, deletions, additions, fusions and truncations of the polypeptide encoded by the reference sequence, as described below. A typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from a reference polypeptide. In general, the sequences of the reference polypeptide and the variant are generally closely similar and limited to differences so that they will be identical in many regions. A variant and reference polypeptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, deletions, or additions in any combination. The amino acid residue to be substituted or inserted may or may not be one encoded by the genetic code. The variant of the polynucleotide or polypeptide may be a naturally occurring variant, such as an allelic variant, or a variant that is not known to occur naturally. Non-naturally occurring variants of polynucleotides and polypeptides can be made by mutagenesis methods or by direct synthesis.

【００７４】 当技術分野で知られた「同一性」とは、場合によりポリペプチド配列またはポ
リヌクレオチド配列の比較により決定される、２以上のかかる配列間の関連性の
ことである。当技術分野ではまた、「同一性」は、場合によりポリペプチド配列
またはポリヌクレオチド配列の鎖間のマッチ(match)により決定される、このよ
うな配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は公知の方法により難な
く算出することができ、こうした方法として、例えば Computational Molecular
Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomp
uting: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 編, Academic Press,
New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M
. and Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysi
s in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence A
nalysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press, New
York, 1991; および Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48
: 1073 (1988) に記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定す
るための方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計される
。さらに、同一性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュータプログラムに
編集されている。２配列間の同一性を決定するコンピュータプログラム法として
は、GCGプログラムパッケージ (Devereux, J.ら, Nucleic Acids Research 12(1
):387 (1984))、BLASTP、BLASTINおよびFASTA (Atschul, S.F.ら, J. Molec. Bi
ol. 215:403-410 (1990)) があるが、これらに限らない。BLAST XプログラムはN
CBIおよび他のソースから一般に入手可能である (BLAST Manual, Altschul, S.
ら, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol. 215:
403-410 (1990))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用す
ることができる。“Identity,” as known in the art, is a relatedness between two or more such sequences, optionally determined by comparing polypeptide or polynucleotide sequences. In the art, “identity” also means the degree of sequence relatedness between such sequences, optionally as determined by the match between the strands of the polypeptide or polynucleotide sequence. "Identity" can be calculated without difficulty by a known method. Examples of such a method include, for example, Computational Molecular
Biology, Lesk, AM, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomp
uting: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, Academic Press,
New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM
and Griffin, HG, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysi
s in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence A
nalysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. Ed., M Stockton Press, New
York, 1991; and Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48
: 1073 (1988), but not limited thereto. Methods for determining identity are designed to give the largest match between the sequences considered. In addition, methods for determining identity have been compiled into publicly available computer programs. As a computer program method for determining the identity between two sequences, a GCG program package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12 (1)
): 387 (1984)), BLASTP, BLASTIN and FASTA (Atschul, SF et al., J. Molec. Bi
215: 403-410 (1990)). BLAST X program is N
Publicly available from the CBI and other sources (BLAST Manual, Altschul, S.
Et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215:
403-410 (1990)). The known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.

【００７５】 ポリペプチド配列を比較するための好適なパラメータは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)； 比較マトリックス：BLOSSUM62 、Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) ギャップペナルティ：12 ギャップ長ペナルティ：４ これらのパラメータと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group(M
adison WI)から「ギャップ」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパ
ラメータはペプチド比較のためのデフォルトパラメータである（末端ギャップの
ペナルティは無し）。Suitable parameters for comparing polypeptide sequences include: 1) Algorithm: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSSUM62, Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) Gap penalty: 12 Gap length penalty: 4 A useful program with these parameters is the Genetics Computer Group (M
adison WI) is generally available as a "gap" program. The above parameters are default parameters for peptide comparison (no end gap penalty).

【００７６】 ポリヌクレオチド配列を比較するためのパラメータは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)； 比較マトリックス：マッチ＝＋10、ミスマッチ＝0 ギャップペナルティ：50 ギャップ長ペナルティ：３ これらのパラメータと共に役に立つプログラムは Genetics Computer Group(M
adison WI)から「ギャップ」プログラムとして入手可能である。これらのパラメ
ータは核酸比較のためのデフォルトパラメータである。The parameters for comparing polynucleotide sequences include: 1) Algorithm: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Comparison matrix: match = + 10, mismatch = 0 Gap penalty: 50 Gap length penalty: 3 A useful program with these parameters is the Genetics Computer Group (M
adison WI) as a “gap” program. These parameters are default parameters for nucleic acid comparison.

【００７７】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの「同一性」の場合によっては好ましい
意味を以下の(1)および(2)に示す。In some cases, preferred meanings of “identity” of polynucleotides and polypeptides are shown in (1) and (2) below.

【００７８】 (1) 更なるポリヌクレオチドの実施形態には、配列番号１の基準配列と少な
くとも50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同一性を有するポリヌク
レオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。該ポリヌクレオチ
ドは、配列番号１の基準配列と同一であるか、該基準配列と比較してある整数個
までのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。該変異は少なくとも１個のヌクレ
オチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または
挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしく
は3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列
中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループ
として介在することができる。ヌクレオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオ
チドの総数に、100で割った同一性％を意味する整数値を掛け、その積を配列番
号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎ_n ≦ｘ_n −（ｘ_n・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_nはヌクレオチド変異の数であり、ｘ_nは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは50％については0.50、60％について
は0.60、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％
については0.90、95％については0.95、97％については0.97、100％については1
00などであり、・は乗法演算子の記号である。ｘ_nとｙの非整数の積は、その積
をｘ_nから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、そのコード配列にナンセンス、
ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生じさせ、それにより、こうした変
異後に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変させることが
できる。(1) Additional polynucleotide embodiments include polynucleotide sequences having at least 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 or 100% identity to the reference sequence of SEQ ID NO: 1. And isolated polynucleotides comprising: The polynucleotide may be identical to the reference sequence of SEQ ID NO: 1 or may include up to an integer number of nucleotide variations compared to the reference sequence. The mutation is selected from the group consisting of deletions, substitutions (including transitions and transversions) or insertions of at least one nucleotide, such mutations being at the 5 ′ or 3 ′ terminal position of the reference nucleotide sequence, or at these terminal positions. Between the nucleotides in the reference sequence, individually or as one or more contiguous groups within the reference sequence. The number of nucleotide variations is determined by multiplying the total number of nucleotides of SEQ ID NO: 1 by an integer value that means% identity divided by 100, and subtracting the product from the total number of nucleotides of SEQ ID NO: 1, ie, _n n ≦ x n - it can be obtained by (x _n · y). Wherein, n _n is the number of nucleotide alterations, x _n is the total number of nucleotides in SEQ ID NO: 1, y is about 0.70,80% for 0.60,70% for 0.60 for 60% for 50% 0.85, 90% for 0.80, 85%
0.90 for 95%, 0.95 for 97%, 0.97 for 97%, 1 for 100%
00 is a symbol of the multiplication operator. The non-integer product of _xn and y is rounded down to the nearest integer before subtracting the product from _xn . Modifications in the polynucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2 include nonsense,
Missense or frameshift mutations can be made, thereby altering the polypeptide encoded by the polynucleotide after such mutations.

【００７９】 例として、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号２の基準配列と同一、す
なわち100％同一であっても、該基準配列と比較して同一性が100％未満となるよ
うな、ある整数個までのアミノ酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくと
も１個の核酸の欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）
または挿入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリヌクレオチド配列
の5'もしくは3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく
、基準配列中の核酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグルー
プとして介在することができる。所定の同一性％についての核酸変異の数は、配
列番号２のアミノ酸の総数に、100で割った同一性％を意味する整数値を掛け、
その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわち、次式
： ｎ_n ≦ｘ_n −（ｘ_n・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_nはアミノ酸変異の数であり、ｘ_nは配列番
号２のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％については
0.80、85％については0.85などであり、・は乗法演算子の記号である。ｘ_nとｙ
の非整数の積は、その積をｘ_nから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。By way of example, a polynucleotide sequence of the present invention is identical to the reference sequence of SEQ ID NO: 2, ie, is 100% identical, but has less than 100% identity compared to the reference sequence. It may contain up to an integer number of amino acid mutations. The mutation is a deletion or substitution (including transition and transversion) of at least one nucleic acid.
Or insertions, wherein such mutations may be located at the 5 'or 3' terminal positions of the reference polynucleotide sequence, or anywhere between these terminal positions, and may vary individually between nucleic acids in the reference sequence. Or one or more contiguous groups within the reference sequence. The number of nucleic acid mutations for a given percent identity is calculated by multiplying the total number of amino acids in SEQ ID NO: 2 by an integer value that means percent identity divided by 100;
And then subtracting that product from said total number of amino acids in SEQ ID NO: 2, i.e., the following formula: _n n ≦ x n - can be obtained by (x _n · y). Wherein, n _n is the number of amino acid alterations, x _n is the total number of amino acids in SEQ ID NO: 2, y is about 0.70,80% for 70% for example,
For example, 0.85 for 0.80 and 85%, and the symbol for the multiplication operator. _xn and y
Is rounded down to the nearest integer before subtracting the product from x _n .

【００８０】 (2) ポリペプチドの実施形態には更に、配列番号２のポリペプチド基準配列
と少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97、または100％の同一性を有する
ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドが含まれる。該ポリペプチド配列は
、配列番号２の基準配列と同一であるか、該基準配列と比較してある整数個まで
のアミノ酸変異を含んでいてもよい。該変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失
、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿入よりなる群から
選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末
端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよく、基準配列中の
アミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして介
在することができる。アミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、10
0で割った同一性％を意味する整数値を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の
総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎ_a ≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは50％については0.50、60％については0.60
、70％については0.70、80％については0.80、85％については0.85、90％につい
ては0.90、95％については0.95、97％については0.97、100％については100など
であり、・は乗法演算子の記号である。ｘ_aとｙの非整数の積は、その積をｘ_aか
ら引く前に、最も近似する整数に切り下げる。(2) The polypeptide embodiments further include a polypeptide having at least 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, or 100% identity to the polypeptide reference sequence of SEQ ID NO: 2. Included are isolated polypeptides, including peptides. The polypeptide sequence may be identical to the reference sequence of SEQ ID NO: 2, or may contain up to an integer number of amino acid variations compared to the reference sequence. The mutation is selected from the group consisting of a deletion, substitution (including conservative and non-conservative amino acid substitutions) or insertion of at least one amino acid, wherein the mutation is at the amino or carboxy terminal position of the reference polypeptide sequence, or And may intervene individually between amino acids in the reference sequence, or as one or more contiguous groups within the reference sequence. The number of amino acid mutations is 10 to the total number of amino acids in SEQ ID NO: 2.
Multiplied by an integer value, which means the percent identity divided by 0, and then subtracting that product from said total number of amino acids in SEQ ID NO: 2, i.e., the following equation: n _a ≦ x _a - be determined by (x _a · y) Can be. Where n _a is the number of amino acid mutations, x _a is the total number of amino acids in SEQ ID NO: 2, y is 0.50 for 50%, 0.60 for 60%
, 0.70 for 70%, 0.80 for 80%, 0.85 for 85%, 0.90 for 90%, 0.95 for 95%, 0.97 for 97%, 100 for 100%, etc. Child symbol. non-integer product of x _a and y is, prior to subtracting it from x _a, rounded down to the nearest integer.

【００８１】 例として、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の基準配列と同一、すなわ
ち100％の同一性であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミノ酸
変異を含んで同一性％が100％未満であってもよい。前記変異は少なくとも１個
のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保存的アミノ酸置換を含む）または挿
入よりなる群から選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもし
くはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよ
く、基準配列中のアミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続する
グループとして介在することができる。所定の同一性％についてのアミノ酸変異
の数は、配列番号２のアミノ酸の総数に、100で割った同一性％を意味する整数
値を掛け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すな
わち、次式： ｎ_a ≦ｘ_a −（ｘ_a・ｙ） により求めることができる。式中、ｎ_aはアミノ酸変異の数であり、ｘ_aは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85などであり、・は乗法演算子の記号である。ｘ_aと
ｙの非整数の積は、その積をｘ_aから引く前に、最も近似する整数に切り下げる
。By way of example, the polypeptide sequence of the present invention is identical to the reference sequence of SEQ ID NO: 2, ie, even though it is 100% identical, it contains up to an integer number of amino acid variations with respect to the reference sequence. The percent identity may be less than 100%. The mutation is selected from the group consisting of a deletion, substitution (including conservative and non-conservative amino acid substitution) or insertion of at least one amino acid, wherein such mutation is at the amino or carboxy terminal position of the reference polypeptide sequence, or And may be intervening individually between amino acids in the reference sequence, or as one or more contiguous groups within the reference sequence. The number of amino acid mutations for a given% identity is calculated by multiplying the total number of amino acids of SEQ ID NO: 2 by an integer value representing% identity divided by 100, and subtracting the product from the total number of amino acids of SEQ ID NO: 2. by, i.e., the following equation: n _a ≦ x _a - can be obtained by (x _a · y). Wherein, n _a is the number of amino acid alterations, x _a is the total number of amino acids in SEQ ID NO: 2, y is about 70% for example and the like 0.85 for 0.80,85% for 0.70,80% ,. Are symbols of the multiplication operator. non-integer product of x _a and y is, prior to subtracting it from x _a, rounded down to the nearest integer.

【００８２】 「融合タンパク質」とは、２つの、しばしば無関係の、融合された遺伝子また
はその断片によりコードされるタンパク質のことである。一例として、EP-A-0 4
64には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と他のヒトタンパク質また
はその一部とを含んでなる融合タンパク質が記載されている。多くの場合、治療
および診断における使用には、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ
領域を使用することが有利であり、これにより例えば薬物速度論的性質が向上す
る（例えば、EP-A- 0232 262を参照のこと）。一方、いくつかの使用にとっては
、その融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後でＦｃ部分を除去するこ
とが望ましいだろう。“Fusion protein” refers to a protein encoded by two, often unrelated, fused genes or fragments thereof. As an example, EP-A-0 4
64 describes a fusion protein comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule and other human proteins or portions thereof. Often, for use in therapy and diagnosis, immunoglobulin Fc as part of a fusion protein
The use of regions is advantageous, for example, to improve pharmacokinetic properties (see, for example, EP-A-0232262). On the other hand, for some uses, it may be desirable to remove the Fc portion after expressing, detecting and purifying the fusion protein.

【００８３】 本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
考としてここに組み入れるものとする。All publications, including patents and patent application specifications, cited herein are incorporated by reference in their entirety, as if each publication was clearly and individually indicated. It shall be incorporated here.

【００８４】実施例 クローニング方法 公開されているGPCRWを、公のデータベースから潜在的な7TMファミリーとして
同定した。オリゴヌクレオチド（5'）を該クローンの5'および3'末端で設計した
。5'プライマーは、GAGCTATTTTAACAGAAGCAACTC（配列番号３）であり、3'プライ
マーは、AGGGACTTGATAGTATTATACAG（配列番号４）であった。これらのオリゴヌ
クレオチドを、ヒト胎盤のcDNAを鋳型として用いて1kbの断片のPCRに使用した。
該PCR断片を、pCR2.1ベクター中にサブクローニングし、配列決定した。GPRW（
配列番号１）と公開されているGPCRWとのヌクレオチド配列比較により、4個のア
ミノ酸の相違が明らかになった。このクローニング方法を2回実施して、アミノ
酸配列の変化を確認した。[0084] The GPCRW being examples cloning methods published, were identified as potential 7TM family from public databases. Oligonucleotides (5 ') were designed at the 5' and 3 'ends of the clone. The 5 'primer was GAGCTATTTTAACAGAAGCAACTC (SEQ ID NO: 3) and the 3' primer was AGGGACTTGATAGTATTATACAG (SEQ ID NO: 4). These oligonucleotides were used for PCR of 1 kb fragments using human placenta cDNA as a template.
The PCR fragment was subcloned into the pCR2.1 vector and sequenced. GPRW (
A nucleotide sequence comparison between SEQ ID NO: 1) and the published GPCRW revealed four amino acid differences. This cloning method was performed twice to confirm changes in the amino acid sequence.

【００８５】実施例1：哺乳動物細胞における発現 本発明の受容体を、ヒト胚腎293（HEK293）細胞または付着性dhfr CHO細胞の
いずれかにおいて発現させる。受容体の発現を最大にするために、pCDNまたはpC
DNA3ベクターへ挿入する前に、一般的には全ての5'および3'非翻訳領域（UTR）
を受容体cDNAから取り除く。これらの細胞をリポフェクションにより個々の受容
体cDNAでトランスフェクトし、400mg/mlのG418の存在下で選択する。選択の3週
間後に、個々のクローンを回収し、さらなる分析のために増殖させる。ベクター
のみでトランスフェクトしたHEK293細胞またはCHO細胞を陰性対照として使用す
る。個々の受容体を安定して発現している細胞系を単離するために、一般的に約
24個のクローンを選択し、ノーザンブロット分析により分析する。受容体mRNAは
、通常、分析したＧ418耐性クローンの約50％において検出可能である。 Example 1 Expression in Mammalian Cells The receptor of the present invention is expressed in either human embryonic kidney 293 (HEK293) cells or adherent dhfr CHO cells. PCDN or pC to maximize receptor expression
Prior to insertion into the DNA3 vector, generally all 5 'and 3' untranslated regions (UTRs)
Is removed from the receptor cDNA. These cells are transfected with the individual receptor cDNA by lipofection and selected in the presence of 400 mg / ml G418. Three weeks after selection, individual clones are harvested and expanded for further analysis. HEK293 or CHO cells transfected with the vector alone are used as negative controls. In order to isolate cell lines stably expressing individual receptors, generally about
24 clones are selected and analyzed by Northern blot analysis. Receptor mRNA is usually detectable in about 50% of the G418 resistant clones analyzed.

【００８６】実施例2：結合アッセイおよび機能アッセイ用のリガンドバンク(bank) 200種を越える推定上の受容体リガンドのバンクがスクリーニングのために構
築された。このバンクには以下のものが含まれる。すなわち、ヒトの７回膜貫通
(7TM)受容体を介して作用することが知られている伝達物質、ホルモンおよびケ
モカイン；ヒト7TM受容体の推定上のアゴニストでありうる、天然に存在する化
合物；非哺乳動物の生物学的に活性なペプチド(哺乳動物の対応物は未だ同定さ
れていない)；ならびに天然には見出せないが未知の天然リガンドと共に7TM受容
体を活性化する化合物である。このバンクは結合アッセイと機能(すなわち、カ
ルシウム、cAMP、ミクロフィジオメーター(microphysiometer)、卵母細胞電気生
理学など、以下を参照)アッセイの両方を用いて、既知のリガンドに対する該受
容体を最初にスクリーニングするために使用される。 Example 2: Ligand banks for binding and functional assays A bank of over 200 putative receptor ligands was constructed for screening. This bank includes: That is, human transmembrane seven times
(7TM) Transmitters, hormones and chemokines known to act through the receptor; naturally occurring compounds that may be putative agonists of the human 7TM receptor; Active peptides (mammalian counterparts have not yet been identified); as well as compounds that activate the 7TM receptor with a natural ligand that is not found in nature but is unknown. This bank first screens the receptor for a known ligand using both binding and functional (i.e., calcium, cAMP, microphysiometer, oocyte electrophysiology, etc., see below) assays. Used to

【００８７】実施例3：リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは受容体薬理学をつきとめるための直接的な方法を提供
し、またハイスループット方式にも適用が可能である。受容体の精製リガンドを
結合実験のために高い比活性( 50−2000 Ci／mmol )で放射性標識する。次に、
放射性標識化のプロセスがその受容体に対するリガンドの活性を低下させないこ
とを確かめる。緩衝液、イオン、pHおよびヌクレオチドのような他のモジュレー
ターについてのアッセイ条件を最適化し、膜および全細胞の両受容体源について
の実施可能な生じうるシグナル対ノイズ比を確立する。これらのアッセイのため
に、特異的受容体結合を、全結合放射能から、過剰の未標識競合リガンドの存在
下で測定した放射能を差し引いた値として定義する。可能であれば、２以上の競
合リガンドを用いて残留する非特異的な結合を確定する。 Example 3 Ligand Binding Assay The ligand binding assay provides a straightforward method for determining receptor pharmacology and is also applicable to a high-throughput format. The purified ligand of the receptor is radiolabeled with high specific activity (50-2000 Ci / mmol) for binding experiments. next,
Ensure that the process of radiolabeling does not reduce the activity of the ligand for its receptor. Optimize assay conditions for other modulators such as buffers, ions, pH and nucleotides to establish viable possible signal-to-noise ratios for both membrane and whole cell receptor sources. For these assays, specific receptor binding is defined as total bound radioactivity minus the radioactivity measured in the presence of excess unlabeled competing ligand. If possible, two or more competing ligands are used to determine residual non-specific binding.

【００８８】実施例4：アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ 本発明の受容体cDNAをコードする線状化プラスミドの鋳型からのキャッピング
されたRNA転写物を、標準的な手法に従い、in vitroでRNAポリメラーゼを使用し
て合成する。in vitroでの転写物を最終濃度0.2 mg／mlで水中に懸濁する。卵巣
葉(ovarian lobes)を成熟雌カエルから取り出し、ステージVの脱濾胞化卵母細胞
を得て、RNA転写物(10ng／卵母細胞)を微量注入装置を用いて50nlで単回注入す
る。２つの電極電位クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応答した個々のア
フリカツメガエルの卵母細胞からの電流を測定する。室温でCa²⁺を含まないバー
ス(Barth's)培地中で記録を行う。このアフリカツメガエル系を使用して、活性
化するリガンドについての既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物をスクリーニ
ングすることができる。 Example 4: Functional Assay in Xenopus Oocytes Xenopus capped RNA transcripts from the linearized plasmid template encoding the receptor cDNA of the present invention were ligated in vitro with RNA according to standard procedures. Synthesize using a polymerase. The in vitro transcript is suspended in water at a final concentration of 0.2 mg / ml. The ovarian lobes are removed from the mature female frog and stage V defolliculated oocytes are obtained and a single injection of RNA transcript (10 ng / oocyte) at 50 nl using a microinjector. Two electrode potential clamps are used to measure the current from individual Xenopus oocytes in response to exposure to the agonist. Recordings are made at room temperature in Ca ²⁺ -free Barth's medium. This Xenopus system can be used to screen for known ligands and tissue / cell extracts for activating ligands.

【００８９】実施例5：ミクロフィジオメトリックアッセイ 多様な第二メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が放出される
。この酸は主として細胞内のシグナル伝達プロセスを活気づけるために必要な代
謝活性が増強した結果として産出される。この細胞を取り巻く培地におけるpHの
変化は非常に小さいが、サイトセンサー(CYTOSENSOR)ミクロフィジオメーター（
Mole cular Devices Ltd., Menlo Park,CA）により検出できる。したがって、こ
のサイトセンサーは本発明のＧタンパク質共役受容体のような、細胞内シグナル
伝達経路を利用するエネルギーに共役する受容体の活性化を検出することができ
る。 Example 5: Microphysiological Assay Activation of various second messenger systems releases small amounts of acid from cells. This acid is produced primarily as a result of the increased metabolic activity required to activate intracellular signaling processes. The change in pH in the medium surrounding the cells is very small, but the cytosensor (CYTOSENSOR) microphysiometer (
Molecular Devices Ltd., Menlo Park, CA). Thus, this site sensor can detect the activation of a receptor that is coupled to energy utilizing an intracellular signaling pathway, such as the G protein-coupled receptor of the present invention.

【００９０】実施例6：抽出物／細胞上清スクリーニング 多くの哺乳動物受容体が存在するが、今のところ同一動物種(cognate)の活性
化リガンド(アゴニスト)は見つかっていない。したがって、これらの受容体に活
性なリガンドは、今日までに同定されたリガンドバンクには含まれていない可能
性がある。よって、本発明の7TM受容体もまた、天然のリガンドを同定するため
に組織抽出物に対して機能的に(カルシウム、cAMP、ミクロフィジオメーター、
卵母細胞電気生理学などの機能スクリーンを使用して)スクリーニングされる。
陽性の機能的な応答を示す抽出物を、活性化用リガンドが単離され同定されるま
で順次副分画化することができる。 Example 6: Extract / Cell Supernatant Screening Many mammalian receptors exist, but to date no activating ligand (agonist) of the same animal species (cognate) has been found. Thus, ligands active at these receptors may not be among the ligand banks identified to date. Thus, the 7TM receptor of the present invention can also be functionalized on tissue extracts (calcium, cAMP, microphysiometer,
(Using a functional screen such as oocyte electrophysiology).
Extracts showing a positive functional response can be sequentially subfractionated until the activating ligand is isolated and identified.

【００９１】実施例8：カルシウムおよびcAMP機能アッセイ HEK293細胞で発現された7TM受容体は、PLCおよびカルシウムの動員活性化およ
び／またはcAMPの刺激または阻害と機能的に共役することが示された。受容体ト
ランスフェクト細胞またはベクター対照細胞におけるHEK293細胞中のベースのカ
ルシウムレベルは、正常な100nM〜200nMの範囲で観察された。組換え受容体を発
現しているHEK293細胞を、フラ２を添加し、一日で150個より多く選択したリガ
ンドまたは組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員について評価する
。同様に、組換え受容体を発現しているHEK293細胞を標準的なcAMP定量アッセイ
を用いて、cAMP産生の刺激または阻害について評価する。一時的にカルシウムを
動員する、またはcAMPの変動を示すアゴニストをベクター対照細胞で試験し、こ
のときの応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特有なものである
かどうかを決定する。 Example 8 Calcium and cAMP Function Assay The 7TM receptor expressed in HEK293 cells has been shown to be functionally coupled to PLC and calcium mobilization activation and / or cAMP stimulation or inhibition. Basal calcium levels in HEK293 cells in receptor transfected cells or vector control cells were observed in the normal range of 100 nM to 200 nM. HEK293 cells expressing the recombinant receptor are added to Hula 2 and more than 150 selected ligands or tissue / cell extracts per day are evaluated for agonist-induced calcium mobilization. Similarly, HEK293 cells expressing the recombinant receptor are evaluated for stimulation or inhibition of cAMP production using a standard cAMP assay. Agonists that transiently recruit calcium or exhibit altered cAMP are tested in vector control cells to determine if the response is unique to transfected cells expressing the receptor.

【００９２】配列情報 配列番号１ Sequence information SEQ ID NO: 1

【００９３】 配列番号２ SEQ ID NO: 2

【配列表】[Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA12 DA02 GA13 GA19 HA03 HA17 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 FA72 FA73 FA74 HA05 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA12 DA02 GA13 GA19 HA03 HA17 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 FA72 FA73 FA74 HA05

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下のポリペプチド： (i) 配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも以
下の同一性： (a) 70％同一性、 (b) 80％同一性、 (c) 90％同一性、または (d) 95％同一性、 を有する群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、 (ii) 配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、あるいは (iii) 配列番号２のアミノ酸配列である単離されたポリペプチド、 からなる群より選択される単離されたポリペプチド。1. The following polypeptides: (i) at least the following identities to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 over the entire length of SEQ ID NO: 2: (a) 70% identity, (b) 80% identity, (c ) An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: 90% identity, or (d) 95% identity; Or (iii) an isolated polypeptide which is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an isolated polypeptide selected from the group consisting of: 【請求項２】 以下のポリヌクレオチド： (i) 配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも以
下の同一性： (a) 70％同一性、 (b) 80％同一性、 (c) 90％同一性、または (d) 95％同一性、 を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌク
レオチド、 (ii) 配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全長にわた
って少なくとも以下の同一性： (a) 70％同一性、 (b) 80％同一性、 (c) 90％同一性、または (d) 95％同一性、 を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (iii) 配列番号１の全長にわたって配列番号１のヌクレオチド配列と少なく
とも以下の同一性： (a) 70％同一性、 (b) 80％同一性、 (c) 90％同一性、または (d) 95％同一性、 を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 (iv) 配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離さ
れたポリヌクレオチド、 (v) 配列番号１のポリヌクレオチドである単離されたポリヌクレオチド、 (vi) ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の配
列またはその断片を有する標識化プローブを用いて、適切なライブラリーをスク
リーニングすることにより得ることのできる単離されたポリヌクレオチド、 あるいは前記単離されたポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド。2. The following polynucleotides: (i) at least the following identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 over the entire length of SEQ ID NO: 2: (a) 70% identity, (b) 80% identity, (c (D) an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having 90% identity, or (d) 95% identity; (ii) over the entire length of the nucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2. An isolated polyprotein comprising a nucleotide sequence having at least the following identities: (a) 70% identity, (b) 80% identity, (c) 90% identity, or (d) 95% identity. (Iii) at least the following identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 over the entire length of SEQ ID NO: 1: (a) 70% identity, (b) 80% identity, (c) 90% identity, or ( d) 95% identity, including nucleotide sequences having (Iv) an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2, (v) an isolated polynucleotide that is the polynucleotide of SEQ ID NO: 1, (vi) a string An isolated polynucleotide obtainable by screening an appropriate library using a labeled probe having the sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof under gentle hybridization conditions; An isolated polynucleotide selected from the group consisting of: a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide obtained. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。3. An antibody immunospecific for the polypeptide of claim 1. 【請求項４】 被験体を治療する方法であって、 (i) 請求項１記載のポリペプチドの増強された活性または発現を必要とした
場合に、 (a) 治療上有効な量の、前記ポリペプチドに対するアゴニストを該被験体
に投与すること、および／または (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポ
リヌクレオチドを、in vivoで該ポリペプチド活性を生じさせるような形態で被
験体に投与すること、あるいは (ii) 請求項１記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある場
合に、 (a) 治療上有効な量の、前記ポリペプチドに対するアンタゴニストを被験
体に投与すること、および／または (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を抑制する核
酸分子を被験体に投与すること、および／または (c) 前記ポリペプチドと、そのリガンド、基質もしくは受容体について競
合する治療上有効な量のポリペプチドを被験体に投与すること、 を含む、前記治療方法。4. A method of treating a subject, comprising: (i) requiring enhanced activity or expression of the polypeptide of claim 1; and (a) providing a therapeutically effective amount of said polypeptide. Administering to the subject an agonist for the polypeptide, and / or (b) isolating the isolated polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the polypeptide in a form that produces the polypeptide activity in vivo. Or (ii) when it is necessary to suppress the activity or expression of the polypeptide of claim 1, wherein (a) a therapeutically effective amount of an antagonist to the polypeptide is administered to the subject. And / or (b) administering to the subject a nucleic acid molecule that suppresses the expression of a nucleotide sequence encoding the polypeptide; and / or (c) administering the nucleic acid molecule to a subject. Peptide, administering the ligand, the polypeptide therapeutically effective amount to compete for substrate or receptor in a subject, including, the treatment method. 【請求項５】 被験体において請求項１に記載のポリペプチドの発現または
活性に関連した該被験体の疾病または該疾病への罹りやすさを診断する方法であ
って、 (a) 該被験体のゲノム中の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に突
然変異があるか否かを調べること、および／または (b) 該被験体から得られたサンプルにおいて該ポリペプチド発現の存在または
その量を分析すること、 を含む、前記診断方法。5. A method for diagnosing, in a subject, a disease or a susceptibility to the disease associated with the expression or activity of the polypeptide of claim 1, comprising: Determining whether there is a mutation in the nucleotide sequence encoding the polypeptide in the genome of the subject and / or (b) analyzing the presence or amount of expression of the polypeptide in a sample obtained from the subject The diagnostic method, comprising: 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドの機能を刺激または抑制する
化合物を同定するためのスクリーニング法であって、 (a) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細
胞もしくはその膜）あるいはその融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直
接または間接的に結合させた標識により測定すること、 (b) 候補化合物と、該ポリペプチド（または該ポリペプチドを担持している細
胞もしくはその膜）あるいはその融合タンパク質との結合を、標識した競合物質
の存在下で測定すること、 (c) 候補化合物が該ポリペプチドの活性化または抑制により産生されるシグナ
ルをもたらすか否かを、該ポリペプチドを担持している細胞または細胞膜に適し
た検出系を用いて調べること、 (d) 候補化合物と、請求項１に記載のポリペプチドを含有する溶液とを一緒に
して混合物を調製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、該混合物の
活性をスタンダードと比較すること、および (e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドをコードするmRNAおよび該ポリ
ペプチドの産生に及ぼす効果を、ELISAアッセイなどを用いて検出すること、 からなる群より選択される方法を含む、前記スクリーニング法。6. A screening method for identifying a compound that stimulates or suppresses the function of the polypeptide according to claim 1, comprising: (a) a candidate compound; Measuring the binding to the candidate compound with a label directly or indirectly bound to the candidate compound, and (b) measuring the binding between the candidate compound and the polypeptide (or the polypeptide). (C) carrying a cell or its membrane) or its fusion protein in the presence of a labeled competitor, and (c) detecting the signal produced by the activation or inhibition of the polypeptide by the candidate compound. Examining whether or not to bring about using a detection system suitable for a cell or a cell membrane carrying the polypeptide; (d) a candidate compound; Preparing a mixture together with a solution containing the described polypeptide, measuring the activity of the polypeptide in the mixture, comparing the activity of the mixture with a standard, and (e) determining whether the candidate compound is a cell. Detecting the effect of the polypeptide on the mRNA encoding the polypeptide and the production of the polypeptide by using an ELISA assay or the like, wherein the method comprises a method selected from the group consisting of: 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
スト。7. An agonist or antagonist of the polypeptide according to claim 1. 【請求項８】 発現系が適合性の宿主細胞内に存在する場合、請求項１に記
載のポリペプチドを産生する能力のあるポリヌクレオチドを含有する発現系。8. An expression system comprising a polynucleotide capable of producing the polypeptide of claim 1 when the expression system is in a compatible host cell. 【請求項９】 組換え宿主細胞の生産方法であって、請求項８記載の発現系
を用いて細胞を形質転換またはトランスフェクトし、該宿主細胞が適切な培養条
件下で、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも70
％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生するようにさせるこ
とを含む、前記生産方法。9. A method for producing a recombinant host cell, wherein the cell is transformed or transfected using the expression system according to claim 8, and the host cell is cloned under the appropriate culture conditions. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and at least 70
The method of any of the preceding claims, comprising producing a polypeptide comprising an amino acid sequence having a 100% identity. 【請求項１０】 請求項９記載の方法で生産された組換え宿主細胞。10. A recombinant host cell produced by the method according to claim 9. 【請求項１１】 配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配列と
少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する、
請求項１０記載の組換え宿主細胞の膜。11. Expressing a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 70% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 over the entire length of SEQ ID NO: 2,
A recombinant host cell membrane according to claim 10. 【請求項１２】 ポリペプチドを産生させるのに十分な条件下で、請求項１
０に記載の宿主細胞を培養し、この培地から該ポリペプチドを回収することを含
む、ポリペプチドの生産方法。12. The method of claim 1 under conditions sufficient to produce a polypeptide.
A method for producing a polypeptide, comprising culturing the host cell according to Item 0 and recovering the polypeptide from the medium.