JP2002514076A - 散在性腫瘍細胞の検出のための新規プライマー及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡに相補的な核酸分子もしくはその一部またはＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原をコードするその相補鎖に特異的にハイブリダイズするプライマー並びに該抗原を含有してなる診断用組成物に関する。さらに、本発明は、本発明のプライマーを用いる散在性腫瘍細胞を検出する方法ならびに腫瘍アジュバントワクチンの製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 散在性腫瘍細胞の検出のための新規プライマー及び方法 本発明は、ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子から転写されるメッセ ンジャーＲＮＡに相補的な核酸分子又はその一部或いはその相補鎖に特異的にハ イブリダイズするプライマー、並びに前記抗原を含有してなる診断用組成物に関 する。本発明はさらに本発明のプライマーを使用する散在性腫瘍細胞を検出する ための方法並びに腫瘍アジュバントワクチンの製造法に関する。 免疫治療法的なアプローチは最小残留疾患の患者に以前適用され、遠位転移（ ｄｉｓｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）と関連した死亡率及び再発を減少させ 得た。初期の隠れた腫瘍細胞の散在が既に約半分の癌患者に存在しているので、 充分な治療法が残留の腫瘍細胞を排除するために開発されなければならない。組 織発生分化マーカーを使用する多くの免疫細胞学的アッセイ及びＰＣＲに基づく アッセイは専ら、局所腫瘍摘出後に予後を悪化させる微小転移性細胞の検出を、 アジュバント免疫治療用抗原を同定することなく可能にする。腫瘍学的な障害に おけるＲＴ−ＰＣＲ分析の限界によりマーカー遺伝子の腫瘍特異的発現というよ りむしろ組織特異的な発現となる。従って、散在性腫瘍細胞の検出は類似の組織 学的起源に由来する少ない特定の腫瘍タイプに限定される。さらに、腫瘍細胞は 固有の組織バックグラウンドの前で検出され得るのみであり、そのため、多くの 公表された方法は間葉コンパートメントから取得された試料に依存する。偏在す る転写因子の存在及びバックグラウンド細胞におけるプロモーター配列の最小活 性化により、異常な転写が生ずるかもしれず、またバックグラウンドシグナルと の競合により特異性及び感度が減少するかもしれない。さらに、大部分のアッセ イでは個々の腫瘍細胞間及び細胞内の不均一性を考慮することなく単一のマーカ ー遺伝子のみを測定する。 最近、いくつかの腫瘍拒絶抗原は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１分 子上で自己由来の細胞融解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提供されるということが特 徴づけられた。ＭＡＧＥ遺伝子は全体の相同性が６４〜８５％である１２個の密 に関連した遺伝子のファミリーに属し、「癌精巣抗原」として分類される。 ＭＡＧＥ遺伝子は、様々な腫瘍の検出のためのＭＡＧＥ１〜４、６及び１２に 特異的なプライマーを使用するために先行技術において用いられている（国際公 開第９５／２３８７４号パンフレット）。しかしながら、特異的なプライマー並 びにＭＡＧＥ遺伝子においてそれらがプライムする（ｐｒｉｍｅ）領域は、ヒト 試料における散在性腫瘍細胞の診断には不適である。国際公開第９６／２９４３ ０号パンフレットでは、隠れた癌細胞又はそれに由来する転移性細胞を含むメラ ノーマ及び乳癌細胞の検出のための遺伝マーカーが開示されている。前記出願に おいて、ＭＡＧＥ−３を含む多くのマーカーがそのような腫瘍の検出に用いられ てよいことがさらに記載されている。しかしながら、この出願に開示されている 方法は、多くの異なる組織学的起源のヒト悪性腫瘍に由来する散在性腫瘍細胞の 検出に適するものであると期待されるものではない。 特に患者における散在性腫瘍細胞の初期における信頼性のある検出は、癌の増 殖の再発を防止するための初期における処置及び／又はワクチン接種を可能にす るので、本発明の基礎をなす技術的課題は、多くの異なる組織学的起源の悪性腫 瘍を持つ患者において散在性腫瘍細胞を検出するための先行技術の方法の感度を 改善することであった。前記課題に対する解決は、請求の範囲に特徴付けられる 具体的態様により達成される。 従って、本発明は、ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子から転写され るメッセンジャーＲＮＡに相補的な核酸分子又はその一部或いはその相補鎖に特 異的にハイブリダイズするプライマーに関するものであり、前記プライマーは、 （ｉ）下記群のプライマーの１つと同じ３’部分を有するプライマー：；及び （ｉｉ）（ａ）又は（ｂ）に示されるプライマー配列とオーバーラップするプラ イマー の群から選択されるものである。 本明細書中における「オーバーラップ」の語は、少なくとも１つのヌクレオチ ドの重なりを意味する。 従って、前記プライマーはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、或いはＤＮＡ、好ま しくはｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる。 本発明により、前記３’末端を有するプライマーは特に先行技術からは知られ ていない感度レベルで多くの異なる組織学的起源の散在性腫瘍細胞を検出するの に有効であることが見出された。さらに、前記核酸配列とオーバーラップし、Ｍ ＡＧＥ遺伝子にハイブリダイズするプライマーはヒト試料における散在性腫瘍細 胞の検出に有効であることが見出された。好ましくは、前記プライマーは前記（ ａ）の下に示された核酸配列とオーバーラップする。本発明のプライマーは１５ 〜２５ヌクレオチドの長さを有することがさらに好ましい。ＭＡＧＥ−３及びＭ ＡＧＥ−６を認識するプライマーを除いて、前記プライマーの各々は特異的に１ つのＭＡＧＥ遺伝子のみの発現を検出する。 従って、本発明は疾患の非常に初期の段階において癌の状態を検出する手段を 提供するものであり、従って散在性腫瘍細胞が検出される患者の時機を得た処置 が可能となる。先行技術の報告とは対照的に、たとえ分析される患者に疾患の臨 床上の証拠がなくとも、多くの異なる組織学的起源の散在性腫瘍細胞を前記プラ イマーを使用して検出することができるということが、驚くべきことに本発明に より見出された。先行技術の方法及びプライマー並びに先行技術に記載される該 プライマーがハイブリダイズするＭＡＧＥ遺伝子の領域は多くの異なる組織学的 起源の悪性腫瘍を持つ患者の試料における散在性腫瘍細胞を検出するのに適して はいないということを強調せねばならない。というのは、本発明により、前記プ ライマーの感度はそのような分析をするのに充分高くないということが明らかと なったからである。本発明により用いられる「特異的にハイブリダイズする」の 語は、これらのプライマーが高感度のＲＴ−ＰＣＲにおいて他のＭＡＧＥ腫瘍特 異的抗原の遺伝子由来の核酸を交差増幅しないことを意味するように意図されて いる。そのようなＲＴ−ＰＣＲは従来のプロトコルに従い当業者により作出され 得る。特異的なハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で生ずる。 そのような条件は過度の負担なく通常のプロトコルに従って当業者により作出さ れ得る；例えば「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」；ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ編、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ １９８５年参照。 本発明のプライマーは、所望のＭＡＧＥ遺伝子又はそのフラグメントに由来す る核酸配列のＰＣＲ増幅において有利に使用される。本発明のプライマーはゲノ ムＤＮＡの増幅を回避するが、メッセンジャーＲＮＡの逆転写に由来するＤＮＡ 配列を増幅するように作出される。このように、ＰＣＲ産物は発現したＭＡＧＥ 遺伝子と明白に相互に関係し得る。ＰＣＲは慣用の方法に従って行われてよい。 また、ＰＣＲ産物は当該分野で確立されるプロトコルに従って検出してよい。 好ましくは、本発明のプライマーは前記の（ａ）群又は（ｂ）群に示されるプ ライマーである。この具体的態様のプライマーは、多くの異なる組織学的起源の 悪性腫瘍を有する患者の試料における散在性腫瘍細胞を同定するのに特に有効か つ有利である。また、（ａ）群のプライマーはＰＣＲ増幅の第１回目の工程のた めのプライマーとして使用し、一方、（ｂ）群のプライマーはネスティドプライ マーＰＣＲ増幅に使用することが特に好ましい。 本発明はさらに、少なくとも４つのプライマーが少なくとも２つの異なる核酸 分子の逆方向の鎖と一対の様式でハイブリダイズする、本発明の少なくとも４つ のプライマーを含有してなる診断用組成物であって、１つの方向の鎖が少なくと も２つの異なるＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるメッセンジャー ＲＮＡに相補的である、診断用組成物に関する。本発明の診断用組成物は特に様 々なＰＣＲを行うのに有効であり、従って、多くの異なる組織学的起源の悪性腫 瘍を有する患者における散在性腫瘍細胞の存在を明白に同定するのに特に有効で ある。本発明に従って見出されたようにして、調査の診断価値をさらに保証する ためにＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６及び−１２の群由来の少なくとも ２つの異なるＭＡＧＥ遺伝子を発現について調べるべきである。好ましくは、前 記診断用キットは、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６及び−１２遺伝子の 各々に特異的な少なくとも１対のプライマーを含有してなる。試料の分析は、少 なくとも２つの異なるＭＡＧＥ遺伝子の発現が保証されるまで、本発明のキット により行われることがさらに好ましい。 前記キットにおけるプライマーの封入（ｂｏｔｔｌｉｎｇ）は従来の手順に従 って行う。好ましくは、各プライマーは個々に封入する。一方、各ＭＡＧＥ遺伝 子に特異的なプライマーは第１回目のプライマー反応及びネスティドプライマー 反応用のプライマーが個々に封入されるという理解の下で共に封入する。 さらに本発明は、患者における癌の状態を示す散在性腫瘍細胞を検出する方法 であって、 （ａ）本発明の少なくとも２つのプライマーを使用して１つ以上の患者試料由来 のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行う工程、該プライマーは少 なくともトゥー ワン（ｔｗｏ ｏｎｅ）のｃＤＮＡ分子の逆方向の鎖と一対の 様式でハイブリダイズし、その際、１つの方向の鎖は少なくとも１つのＭＡＧＥ 腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡと相補的である； 及び （ｂ）１つ以上のＰＣＲ産物を検出する工程、 を含む方法に関する。 「癌の状態」の語は、個細胞における悪性形質転換の開始から遠位の頑強な（ ｓｏｌｉｄ）転移を含む進行した癌疾患までの全範囲を意味することを意図する ものである。好ましくは、少なくとも２つのＭＡＧＥ転写物及びその相補鎖に特 異的な少なくとも４つのプライマーが本発明の方法において用いられる。 さらに、本発明は、下記工程： （ａ）本発明の少なくとも４つのプライマーを使用して１つ以上の患者試料由来 のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行う工程、該プライマーは少 なくとも２つの異なる核酸分子の逆方向の鎖と一対の様式でハイブリダイズし、 その際、１つの方向の鎖は少なくとも２つの異なるＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺 伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡと相補的である； （ｂ）得られるＰＣＲ産物を検出する工程；及び （ｃ）ＭＨＣ拘束Ｔ細胞エピトープに類似するＭＡＧＥ抗原由来のペプチド、全 ＭＡＧＥ抗原又はそのフラグメント、ＭＡＧＥでトランスフェクトした宿主細胞 に基づくアジュバント腫瘍ワクチンの製造のために、少なくとも１つのＭＡＧＥ 遺伝子産物を使用する工程、前記ＭＡＧＥ遺伝子の発現は工程（ｂ）の結果とし て検出され、ＤＮＡワクチン接種法はＭＡＧＥをコードするヌクレオチド配列、 或いはＭＡＧＥ遺伝子産物又はそれらをコードするヌクレオチド配列に基づく他 のいずれかの免疫方法を使用する、 を含む、腫瘍アジュバントワクチンの製造法に関する。 本発明のこの具体的態様は、ヒト試料における散在性腫瘍細胞の存在の積極的 な分析の直接の適用に関する。一旦、前記腫瘍細胞が検出されると、最終的に腫 瘍の増殖に至る前記腫瘍細胞のさらなる増殖についての好適な解毒剤が作出され るべきである。本発明の方法はそのような解毒剤を提供する。腫瘍アジュバント ワクチンは従来のプロトコルに従って調製し得る。特に、本発明の診断用組成物 を使用してこの特定の患者の散在性腫瘍細胞により発現され検出されるそれらＭ ＡＧＥ遺伝子のコード配列に由来するペプチドを、患者から単離された樹状突起 細胞に適用することが考えられる。これらペプチドは、この患者のＭＨＣ分子へ の結合に適しており、従ってＭＨＣ拘束Ｔ細胞エピトープに類似する。次いで、 該ペプチドを適用した樹状突起細胞は患者に再注され、二次リンパ器官のＴ細胞 帯に移動し、そこで、それらはＭＡＧＥ特異的Ｔリンパ球にプライムし、その結 果、ＭＡＧＥ陽性の腫瘍細胞に対し免疫応答を示すであろう。 本発明の方法の好ましい具体的態様において、前記ｃＤＮＡは、 （ａ）前記患者から分離された１つ以上の試料由来のｍＲＮＡを調製する工程； 及び （ｂ）前記ｍＲＮＡを逆転写する工程、 により得られる。前記ｍＲＮＡの調製及びその逆転写は簡便に慣用の手順により 行われる。 対応するｃＤＮＡを生ずるｍＲＮＡの逆転写は、オリゴｄＴプライミング又は １つ以上のＭＡＧＥ−ｍＲＮＡ種に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドを使 用する特異的プライミングにより実施例３に記載されるようなランダムヘキサヌ クレオチドプライミングにより行われてよい。Ｍａｇｅ遺伝子ファミリーの異な るメンバー間の配列相同性の程度が高いため、１つを超えるＭａｇｅ遺伝子のｍ ＲＮＡに、また、最も好ましくは、本発明により使用される全てのＭａｇｅ遺伝 子（Ｍａｇｅ−１、−２、−３／６、−４及び−１２）に効率的にハイブリダイ ズするｃＤＮＡ合成のための特異的プライマーが同定されてよい。そのような「 全Ｍａｇｅプライマー」を、コンピューターに基づく配列分析及びラボラトリー マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ（１９８９））又はＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（Ｎｕ ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ ＤＣ（１９８５））によって特に示される現状の技術に従って同定し、また 試験することが出来る。 本発明の方法のさらなる好ましい具体的態様においては、前記ＰＣＲはネステ ィドＰＣＲである。本発明に従って見出されたように、ネスティドＰＣＲは患者 の疾患状態に関する明白な結果を得るためのさらなる保護手段である。 本発明の方法のさらなる好ましい具体的態様においては、前記プライマーはＭ ＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡ及びその相 補鎖に相補的な２〜６個の異なる核酸分子にハイブリダイズする。本発明の方法 のさらなる好ましい具体的態様においては、前記ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原はＭＡ ＧＥ−１、−２、−３、−４、−６又は−１２腫瘍特異的抗原である。本発明に 従って見出されるように、全てのＭＡＧＥ抗原の中で、前記抗原が最も頻繁に腫 瘍細胞上に現れ、それゆえ転移腫瘍を発達させる癌の危険性を特に示すものであ る。 本発明に従い、２つの異なる吸引部位から試料を分離することがさらに好まし い。本発明に従い見出されるように、両面（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｉｄｅｄ）吸引の 分析は感度を非常に改善する。それゆえ、腫瘍細胞の散在性の日常的な診断では 両面吸引を使用することが望ましい。 本発明の方法のさらなる好ましい具体的態様においては、分析される前記試料 は骨髄吸引液である。本発明に従って驚くべきことに見出されるように、患者の 転移可能性を分析するための原料としての骨髄吸引液の使用は、先行技術により 示唆されるような末梢血液を使用することよりもより高感度である。 さらに好ましくは、前記ｍＲＮＡの調製が下記工程： （ａ）ＲＮＡの分解を実質的に完全に避けながら、緩衝液中で試料を直ちに溶解 する工程；及び （ｂ）ＲＮアーゼ阻害剤、好ましくはセシウムトリフルオロアセテートをクッシ ョンに用い、溶解物中に得られたｍＲＮＡを任意に遠心分離する工程 を含む方法である。本発明のこの具体的態様は有利である。というのは、当該分 野でよく知られているように、エキソヌクレアーゼによる分解に感受性が高いｍ ＲＮＡの損失を防止し、それゆえ、アッセイ方法の感度の損失を防止するためで ある。 さらに、前記方法はＴａｑ−ポリメラーゼを阻害する量以下にＲＮＡ調製物中 のヘム濃度を減少させる。これはヘモグロビンが除去されるためであり、高いヘ ム濃度はアッセイ方法の感度を減少させる。「直ちに」の語は、試料を（ａ）の 下で示される試薬中で患者から分離後数秒以内に溶解することを意味する。前記 試薬は好ましくはグアニジンイソチオシアネート等のグアニジン塩である。試料 の溶解後、前記試料を（ｂ）の下で示されるＲＮＡｓｅ阻害剤のクッションに重 層する。前記試薬は好ましくはセシウムトリフルオロアセテート等のセシウム塩 である。ｍＲＮＡは前記クッションを添加し超遠心分離することにより有利に得 られる。 好ましくは、癌の状態は前立腺癌、非小細胞又は小細胞肺癌又は肉腫又は悪性 メラノーマ又は乳癌又は大腸癌に関する。腫瘍タイプの前記列挙は好ましい実施 例として引用される腫瘍の選抜として理解され得る。他の腫瘍もまた、本発明に 従って、それらの初期の段階で検出されてよい。 図は以下を示す： 図１： ＭＡＧＥ遺伝子配列における特異的オリゴヌクレオチドプライマーの位置。灰 色の囲みは異なるエキソンを示す。矢印はＲＴ−ＰＣＲ分析のために使用される オリゴヌクレオチドの位置を示す。エクスターナル並びにインターナル増幅にお けるＰＣＲ産物の期待される大きさを示す。 図２： 少なくとも１つのＭＡＧＥについてのＰＣＲアッセイ及びＣＫ免疫細胞学にお いて陽性の結果を示した肺癌患者由来のＢＭ吸引液の数。 図３： 少なくとも１つのＭＡＧＥ及びＰＳＡについてのＰＣＲアッセイ、及びＢＭの 少なくとも１つの吸引部位におけるＣＫ免疫細胞学において陽性の結果を示した 前立腺癌患者の数。 図４： 少なくとも１つのＭＡＧＥ及びＰＳＡについてのＰＣＲアッセイ、及びＢＭの 少なくとも１つの吸引部位におけるＣＫ免疫細胞学において陽性の結果を示した 前立腺癌患者の数。 ａ）原発性腫瘍に関する分析 ｂ）進行性疾患に関する分析 図５： 肺癌患者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−１ ＰＣＲアッセイ。レーン４〜１１は 患者試料１〜８（ＺＩ．ＪＯ．、ＢＡ．ＭＡ．、ＤＥ．ＩＶ．、ＮＥ．ＷＩ．、 ＨＯ．ＦＲ．、ＭＡ．ＪＯ．、ＲＥ．ＬＵ．、ＨＥ．ＪＯ）。コントロール：レ ーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、 レーン３は血液１ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン１２は血液１ ｍｌ中の１０００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮＡラダー。 図６： 肺癌患者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−２ ＰＣＲアッセイ。レーン４〜１１は 患者試料１〜８（ＦＩ．ＲＩ．、ＲＥ．ＬＵ．、ＫＵ．ＬＵ．、ＫＬ．ＪＵ．、 ＨＥ．ＪＯ．、ＨＡ．ＡＮ．、ＲＯ．ＡＤ．、ＢＥ．ＦＲ）。コントロール：レ ーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、 レーン３は血液１ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン１２は血液１ ｍｌ中の１０００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮＡラダー。 図７： 肺癌患者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−３ ＰＣＲアッセイ。レーン４〜１１は 患者試料１〜８（ＨＡ．ＨＩ．、ＤＥ．ＩＶ．、ＨＯ．ＦＲ．、ＭＡ．ＲＯ．、 ＬＡ．ＡＬ．、ＡＲ．ＪＯ．、ＶＯ．ＫＬ．、ＷＥ．ＡＬ）。コントロール：レ ーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、 レーン３は血液１ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン１２は血液１ ｍｌ中の１０００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮＡラダー。 図８： 肺癌患者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−４ ＰＣＲアッセイ。レーン３〜８は患 者試料１〜６（ＨＡ．ＡＮ．、ＶＯ．ＫＬ．、ＤＥ．ＩＶ．、ＢＥ．ＦＲ．、Ｌ Ａ．ＢＲ．、ＩＮ．ＦＲ．．）。コントロール：レーン１は模擬調製物、レーン ２は血液１ｍｌ中の１０ ＬＢ２３−ＳＡＲ腫瘍細胞、レーン９は血液１ｍｌ中 の１００ ＬＢ２３−ＳＡＲ腫瘍細胞、レーンＭはＤＮＡラダー。 図９： 肺癌患者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−１２ ＰＣＲアッセイ。レーン４〜１１ は患者試料１〜８（ＳＯ．ＪＯ．、ＨＡ．ＨＩ．、ＨＯ．ＦＲ．、ＭＡ．ＪＯ． 、ＬＡ．ＢＲ．、ＩＮ．ＦＲ．、ＮＩ．ＯＳ．、ＦＩ．ＲＩ）。コントロール： レーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞 、レーン３は血液１ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン１２は血液 １ｍｌ中の１０００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮＡラダー。 図１０： 前立腺癌患者及び健常者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−１ ＰＣＲアッセイ。レ ーン４〜１１は患者試料１〜８（ＦＥ．ＫＵ．ｒｅ．、ＲＩ．ＥＲ．ｌｅ．、Ｚ Ｏ．ＪＯ．ｒｅ．、ＳＣ．ＨＯ．ｌｅ．、ＫＮ．ＤＩ．ｒｅ．、ＭＡ．ＧＵ．ｌ ｅ．、ＭＥ．ＪＯ．ｌｅ．、ＢＥ．ＷＡ．ｌｅ．）。レーン１２〜１５は健常者 。コントロール：レーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ− ２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン３は血液１ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、 レーン１６は血液１ｍｌ中の１０００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮ Ａラダー。 図１１： 前立腺癌患者及び健常者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−２ ＰＣＲアッセイ。レ ーン４〜１１は患者試料１〜８（ＳＣ．ＧＵ．ｌｅ．、ＷＯ．ＪＡ．ｒｅ．、Ｐ Ｆ．ＬＯ．ｌｅ．、ＳＣ．ＡＵ．ｌｅ．、ＦＥ．ＫＵ．ｌｅ．、ＺＯ．ＪＯ．ｌ ｅ．、ＳＴ．ＥＢ．ｌｅ．、ＳＣ．ＨＯ．ｌｅ．）。レーン１２〜１５は健常者 。コントロール：レーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ− ２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン３は血液１ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、 レーン１６は血液１ｍｌ中の１０００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮ Ａラダー。 図１２： 前立腺癌患者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−３ ＰＣＲアッセイ。レーン４〜１ １は患者試料１〜８（ＲＩ．ＥＲ．ｌｅ．、ＳＣ．ＧＵ．ｌｅ．、ＢＡ．ＧＩ． ｒｅ．、ＢＥ．ＷＡ．ｌｅ．、ＷＯ．ＪＡ．ｌｅ．、ＦＥ．ＫＵ．ｒｅ．、ＫＮ ．ＤＩ．ｒｅ．、ＲＩ．ＦＥ．ｒｅ．）。コントロール：レーン１は模擬調製物 、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン３は血液１ｍ ｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン１２は血液１ｍｌ中の１０００Ｍ ｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮＡラダー。 図１３： 前立腺癌患者及び健常者由来の骨髄試料のＭａｇｅ−４ ＰＣＲアッセイ。レ ーン４〜１１は患者試料１〜８（ＰＦ．ＬＯ．ｌｅ．、ＨＩ．ＥＲ．ｌｅ．、Ｓ Ｃ．ＨＯ．ｒｅ．、ＨＥ．ＲＵ．ｒｅ．、ＬＵ．ＶＯ．ｌｅ．、ＭＡ．ＧＵ．ｌ ｅ．、ＷＩ．ＪＡ．ｌｅ．、ＬＥ．ＤＩ．ｒｅ．）。レーン１２〜１５は健常者 。コントロール：レーン１は模擬調製物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０ ＬＢ ２３−ＳＡＲ腫瘍細胞、レーン３は血液１ｍｌ中の１００ ＬＢ２３−ＳＡＲ腫 瘍細胞、レーン１６は血液１ｍｌ中の１０００ ＬＢ２３−ＳＡＲ腫瘍細胞。レ ーンＭはＤＮＡラダー。 図１４： 前立腺癌患者由来の骨髄試料のＭＡＧＥ−１２ ＰＣＲアッセイ。レーン４〜 １１は患者試料１〜８（ＷＯ．ＪＡ．ｌｅ．、ＲＩ．ＥＲ．ｌｅ．、ＬＵ．ＶＯ ．ｒｅ．、ＧＥ．ＣＨ．ｌｅ．、ＢＡ．ＧＩ．ｒｅ．、ＷＥ．ＨＪ．ｌｅ．、Ｈ Ｉ．ＥＲ．ｌｅ．、ＢＩ．ＧＵ．ｒｅ．）。コントロール：レーン１は模擬調製 物、レーン２は血液１ｍｌ中の１０Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン３は血液１ ｍｌ中の１００Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞、レーン１２は血液１ｍｌ中の１０００ Ｍｚ−２Ｍｅｌ腫瘍細胞。レーンＭはＤＮＡラダー。 図１５： 肉腫患者Ｈ．Ｍ．の一次腫瘍のＭＡＧＥ ＰＣＲアッセイ；（表４ｃも参照） ＰＣＲアッセイは同じものについて４回行った。（ａ）ＭＡＧＥ−１の発現。レ ーン３〜６は腫瘍試料。コントロール：レーン８は模擬調製物、レーン１、６、 ７は腫瘍細胞株Ｍｚ−２Ｍｅｌ。レーンＭはＤＮＡラダー。（ｂ）ＭＡＧＥ−２ 及びＭＡＧＥ−３の発現。Ｍａｇｅ−２に対応しており、レーン４〜７は腫瘍試 料、レーン２、３及び８は腫瘍細胞株Ｍｚ−２Ｍｅｌ、レーン１は模擬調製物。 Ｍａｇｅ−３に対応しており、レーン１２〜１５は腫瘍試料、レーン１０、１１ 、及び１６は腫瘍細胞株Ｍｚ−２Ｍｅｌ、レーン９は模擬調製物。レーンＭはＤ ＮＡラダー。（ｃ）ＭＡＧＥ−４及びＭＡＧＥ−１２の発現。ＭＡＧＥ−４に対 応しており、レーン４〜７は腫瘍試料、レーン２、３及び８は腫瘍細胞株ＬＢ２ ３−ＳＡＲ、レーン１は模擬調製物。ＭＡＧＥ−１２に対応しており、レーン１ ２〜１５は腫瘍試料、レーン１０、１１、及び１６は腫瘍細胞株Ｍｚ−２Ｍｅｌ 、レーン９は模擬調製物。レーンＭはＤＮＡラダー。 実施例により本発明を説明する。 実施例１：細胞株および患者 ＭＡＧＥ発現について、全２８種の腫瘍細胞株を試験した。それらのうち１７ 種は、上皮（ＭＣＦ−７、ＢＴ２０、ＳｋＢｒ３、ＭＤＡ−ＭＢ：胸部；ＬＮＣ ａＰ：前立腺、ＳｋＣｏ、ＨＴ２９、ＬＳ１８０、ＳＷ４８０：大腸；Ａ４９８ 、Ｃａｋｉ １：腎臓；ＨｅｐＢ３、ＨｅｐＧ２：肝臓；Ｐａｎｃ−Ｔｕ：膵臓 ；Ｋａｔｏ：胃、Ａ４２７：肺およびＡ４３１：皮膚）であり、２種は間葉起源 （ＨＴ１０８０、ＬＢ２３−ＳＡＲ）である。３種の造血細胞株（Ｕ９３７、Ｒ ａｊｉ、Ｋ５６２）および神経外胚葉組織由来の６種の腫瘍細胞株（Ａ１７２、 Ｕ１３８：グリア芽細胞腫；Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏ、Ｍｅｌ−Ｍｅｉ、Ａ３７５、Ｍ ｚ−２Ｍｅｌ：メラノーマ）を分析した。メラノーマ細胞株Ｍｚ−２Ｍｅｌおよ び肉腫細胞株ＬＢ２３−ＳＡＲは、Ｆｒａｎｃｉｓ Ｂｒａｓｓｅｕｒ〔Ｌｕｄ ｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ〕の供与であった。調査母集団 は、前立腺癌の３０患者の両面（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｉｄｅｄ）ＢＭ吸引液（ｎ＝ ６０吸引液）からなった；単面（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ）ＢＭ吸引液は、非 小（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）および小（ｓｍａｌｌ）肺癌の３４患者（ｎ＝３４吸 引液）ならびに肉腫の６患者（ｎ＝６吸引液）から得られた。さらに、我々は前 立腺癌の１２患者（ｎ＝１２試料）、肉腫の６患者（ｎ＝６試料）および悪性メ ラノーマの１２患者（ｎ＝１２試料）由来の末梢血液試料を分析した。前立腺癌 および肺癌の全患者は、遠位の明白な転移が無いもの（Ｍ０）として病期分類さ れた。対照的に、肉腫および悪性メラノーマの患者は、進行した疾患または他の 器官における転移を患っていた。患者は、組織病理学的試験により悪性度分類さ れ、ＴＮＭ分類（第４版、１９８７）に従って病期分類された。ＭＡＧＥ ＰＣ Ｒアッセイの特異性を試験するため、６７人の非悪性患者：トラウマ、良性腫瘍 、炎症疾患または健常者ドナーの過去のある２０ＢＭ吸引液および２０末梢血試 料からなる「陰性」対照群を、調査に採用した；さらに２７の健常な同種異型の 骨髄ドナーの骨髄をＭａｇｅ遺伝子産物の発現に関して分析した。ヘパリンを抗 凝固剤として用い、化学療法中の前立腺癌および肉腫の患者における局所麻酔の 下または腫瘍除去前の肺癌患者における全身麻酔の下、上部腸骨稜の片側もしく は両側からＢＭを吸引した。 実施例２：組織のサンプリングおよび調製 ＲＮＡの分解を避けるため、１ｍｌの未変性試料を、数秒以内に直ちに５ｍｌ の核酸抽出緩衝液（４Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．５％サルコシル（ Ｎ−ラウリルサルコシン ナトリウム塩）、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ＝７．０）および０．７％ ２−メルカプトエタノールと混合した。強くボルテ ックスしたのち、該試料を容易にかつＲＮＡ分解の危険性なしに必要時まで−２ ０℃で保存することができた。全ＲＮＡを精製するため、岡山らの方法を下記の ように改変した：溶解物をジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理されオー トクレーブされたＳＷ４０遠心管中ＣｓＴＦＡ溶液〔セシウムトリフルオロアセ テート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および０． ２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．０〕の５ｍｌのクッションに穏やかに重層し、３ ５，０００ｒｐｍで１８時間１５℃で遠心分離した。遠心分離後、核酸抽出緩衝 液／ＢＭまたは血液混合物の上層とＣｓＴＦＡ溶液の下層とを吸引により分離し 、捨てた。該遠心管を素早くひっくり返し、ペーパータオルに置いて２分間排液 し、該遠心管の底部１ｃｍをメスで切り離した。該底部を再度ひっくり返し、氷 床に置き、ＲＮＡペレットを全部で３００μｌのＤＥＰＣ処理ＨＰＬＣ水に溶解 した。ついで、試料を３００μｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアル コール混合物（２５：２４：１、体積：体積：体積）の入った新しい試験管に移 した。再度ボルテックスおよび遠心分離（１分、１４，０００ｒｐｍ）した後、 上層を３００μｌのクロロホルムで再抽出した。ついで、ＲＮＡを３００μｌの イソプロパノール、４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ＝５．０および２０μ ｇのグリコーゲンにより−２０℃で一晩沈澱させた。遠心分離後、ＲＮＡペレッ トを７０％エタノールで洗浄し、４分間乾燥し、５μｌのＤＥＰＣ処理ＨＰＬＣ 水に溶解した。ＰＣＲアッセイの感度を決定するために、Ｍｚ−２ＭｅｌとＬＢ ２３−ＳＡＲとを組織培養フラスコから回収し、これらの細胞株の個細胞を顕微 鏡の下ピペットで取り出し、健常者ドナーの１ｍｌの末梢血液に混合した。ＲＮ Ａ調製は前記のように行なった。ＰＣＲへの持込みの可能性を最小限にするため 、全試料をＰＣＲ産物の増幅および電気泳動から離れた位置で扱った。 実施例３：逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 全ＲＮＡの半分を５分間７０℃で変性し、直ちに氷上で凍結させ、ランダムヘ キサマープライマーズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて逆転写した。合成は、スーパースクリプトＩ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．３）、７５ｍＭ Ｋｃｌ、 ３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ全ｄＮＴＰ、１．６μｇの ランダムプライマーおよび１００ユニットのスーパースクリプトＩＩを含む最終 容量１０μｌ中に含むファースト−ストランドｃＤＮＡシンセシスキット（Ｇｉ ｂｃｏ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行なった。ＲＮＡの 添加後、試料を４０℃で１時間インキュベートし、ついで１０μｌのＨＰＬＣ水 で希釈した。 ＰＣＲ反応混合液（１０μｌ）は、１μｌのｃＤＮＡ、１μｌの１０×ＰＣＲ 緩衝液（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂）、４０μＭ ｄＮＴＰ、各０．４μＭの２つのプライマー、５μｇのＢ ＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍ ａｎｙ）、０．６ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から構成され、１ ２．５μｌのミネラルオイルが重層された。ＭＡＧＥ遺伝子のプライマーは、以 前発表されていた配列（表１、図１）からデザインされ、交差増幅を避けるため 、異なるＭＡＧＥ配列間のミスマッチ、特に３’領域におけるミスマッチを最大 にするように選択された。ＭＡＧＥ遺伝子１、２、４および１２の同一性のパー センテージが６４〜８５％の間で変化するため、特異的ＰＣＲアッセイは、これ らの遺伝子について可能であった。対照的に、Ｍａｇｅ−６の配列は、Ｍａｇｅ −３の配列と９９％同一であろことが見出された。したがって、Ｍａｇｅ−３／ ６用の我々のプライマーは、両方の遺伝子にハイブリダイズし、ＰＣＲにより、 Ｍａｇｅ−３および／またはＭａｇｅ−６発現を検出することができる。１９〜 ２２塩基の範囲の短いプライマーおよび約６０℃のアニーリング温度は、最も効 果的である。さらに、２つのエキソンにまたがるジャンクションプライマーは、 驚くべき効率の結果を示した。近年発表されたように、我々は１．６キロ塩基の イントロンをまたぎ、３つの異なるＰＳＡ ｃＤＮＡを増幅する、エキソン２お よび３上のＰＳＡ（表１）のプライマーを適用した。各試料におけるｃＤＮＡテ ンプレートの存在を確認するため、ｐ５３に特異的なプライマー（Ｔｈｏｍａｓ Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ、Ｍｕｎｃｈｅｎにより快く提供された、表１）を 用いての唯一発現された「ハウスキーピング」遺伝子を共増幅した。オリゴヌク レオチドプライマーをＧｅｎｓｅｔ、Ｐａｒｉｓで合成し、精製した。ＭＡＧＥ のエクスターナル（ｅｘｔｅｒｎａｌ）フラグメント増幅のために、下記サイク ルプロフィールのＰＣＲアッセイを用いた：１回目のサイクルとして、９４℃６ 分間の変性、６０℃３０秒間のアニーリングおよび７２℃２分間の伸長；９３℃ ４０秒間の変性、６０℃３０秒間のアニーリングおよび７２℃２０秒間の伸長を １４サイクル；９３℃４０秒間の変性、６０℃３０秒間のアニーリングおよび７ ２℃３０秒間の伸長を５０サイクル；７２℃２分間の終わりの伸長と３０℃１分 間の冷却。ついで、１μｌの反応物を前記ＰＣＲ混合物を含む別のチューブへ移 した。隣接フラグメントの増幅のために、７２℃２分間の最後の伸長および３０ ℃１分間の冷却を伴い、９３℃（４０秒）、５８℃（３０秒）および７２℃（３ ０秒）で３０サイクル以上行なった。ＰＳＡのためのサイクル条件は、常法のワ ンーステージＰＣＲを用いること、および１４サイクルを６４℃のアニーリング 温度の７サイクルと５７℃の７サイクルとに分け、５７℃の５０サイクルを続け ることにより変化させた。増幅は、ハイバイドサーマルリアクター（Ｂｉｏｍｅ ｔｒａ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でプレートコントロールを用 いて行なった。重要なことに、全てのピペッティングは、層状エアフローベンチ の下、フィルター付きピペットチップを用いて氷上で行ない、エクスターナルお よび隣接フラグメントの増幅は潜在的なＤＮＡ交差汚染を避けるため別室で行な った。ＲＮＡ調製のための陰性対照反応（模擬反応）とＲＴ−ＰＣＲとを一連の 操作で行なった。ＰＣＲ産物を１．８％アガロース上でゲル電気泳動し、エチジ ウムブロマイド染色の後、ＵＶ光の下で直接可視化して分析した。１ｋｂ ＤＮ Ａラダー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を全 てのアッセイの参照マーカーとして用いた。得られた増幅産物の特異性をＤＮＡ 配列決定によってモニターした。このアプローチを用いて、異なるＭＡＧＥ遺伝 子に関するＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、１ｍｌの正常な全血と混合された悪性 腫瘍細胞株の１０細胞を検出することができた。ネスティドＰＣＲアッセイの再 現性は１００％であった。 実施例４：免疫細胞学 ＰＣＲ分析用の１ｍｌの全ＢＭおよび血液の分離後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ ｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介する、 ４００ｇ３０分間の密度勾配遠心分離により、残存吸引液由来の単核細胞（ＭＮ Ｃ）を単離し、界面の細胞をガラススライド上に１５０ｇ５分間細胞遠心分離し た（スライドあたり５×１０⁵細胞）。サイトケラチン構成物における共通のエ ピトープを検出する、モノクローナル抗体ＣＫ２〔Ｍ．Ｏｓｂｏｒｎ博士、Ｍａ ｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎにより快く提供され 、後にＨ．Ｂｏｄｅｎｍｕｌｌｅｒ博士、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ、Ｔｕｔｚｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た；これらならびに本出願の実施 例部分に用いられた他の全ての抗体は常法の手法に従って調製された。本明細書 で用いた特異的抗体は本発明を実施するのに必須ではない〕およびＡ−４５−Ｂ ／Ｂ３（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎ ｙより快く提供された）で、ＢＭ生検を染色した。抗体反応は、抗体結合を可視 化するＮｅｕｆｕｃｈｓｉｎ法と組み合わせたアルカリホスファターゼ抗アルカ リホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）技術により顕現させた。簡単にいえば、１次抗 体とのインキュベーション後、多価ラビット抗マウスＩｇ抗血清（Ｚ２５９、Ｄ ａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および実施したアルカリホスフアタ ーゼとモノクローナル抗アルカリホスファターゼ抗体（Ｄ６５１、Ｄａｋｏ、Ｈ ａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）との複合体を用いて製造者（Ｄａｋｏｐｏｔｔ ｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により推奨された希釈律で用いた。各Ｂ Ｍ吸引液に関して、全１０６ＭＮＣを含む２つのスライドを評価した。 実施例５：他のマーカーに対する正常な骨髄および血液におけるＭＡＧＥ遺伝子 の発現 ＲＮＡを対照患者のＢＭから抽出し、数種の組織発生分化マーカーと腫瘍関連 抗原とから由来のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅に供した（表２）。５０ サイクルの増幅の後、ＰＳＡとＭＡＧＥ遺伝子とを除いて、悪性腫瘍で発現する ことが知られているこれらの全ての候補遺伝子の産物が見られた。それにもかか わらず、ＰＳＡ発現は前立腺における悪性腫瘍に限定され、散在性の腫瘍細胞の フラクションにダウンレギュレートされるように思われる。対照的に、ＭＡＧＥ 遺伝子は、悪性腫瘍で唯一発現され、高感度なネスティドＰＣＲの後の増幅産物 、分析された２０のＢＭ吸引液および２０の末梢血試料のいずれにおいても見ら れなかった。この結果は、２７人の健常者の骨髄吸引液を分析した際に確認され た。同種異系の骨髄ドナー由来の該吸引液のいずれも、ＭＡＧＥ遺伝子を発現し ていなかった、表５を参照のこと。 腫瘍関連分子とは対照的に腫瘍抗原の高度に限定された発現パターンは、ＭＡ ＧＥ遺伝子が、最小の残留疾患のＰＣＲに基づく検出のための興味深い候補であ ろうことを強く支持する。 実施例６：異なるタイプの腫瘍を患った患者の骨髄試料におけるＭＡＧＥ遺伝子 の発現 本研究の目的は異なる組織学的起源の散在性腫瘍細胞の検出のためのＰＣＲア ッセイを確立することにあった。原発性腫瘍は、表６における前立腺癌に関して 示されるように、種々のＭＡＧＥ遺伝子（１，２，３，４，６，１２）の異種発 現パターンを示したので、我々は、最初に我々のイン・ビトロでのマルチマーカ ーＲＴ−ＰＣＲアッセイを評価し、上皮、間葉、造血および神経外胚葉起源の２ ８細胞株をスクリーニングした（表３）。３５サイクルのワンーステージＰＣＲ を行なったところ、２８中２７細胞株が少なくとも１つのＭＡＧＥの発現を呈し 、したがって該ＰＣＲにおいて陽性をスコアした。腎臓細胞肉腫（Ａ４９８）の １つのみが完全に陰性であった。６５サイクルを行なうことによる感度の増加に より、ＭＡＧＥ−２および−４発現を示した。正常造血組織における発現の完全 な欠如を伴うＭＡＧＥ遺伝子のこの異質発現パターンは、我々が異なる組織学的 起源の悪性腫瘍を患った患者由来のＢＭ吸引液および末梢血試料を評価すること を促した。結果および患者の特徴を表４ａ〜ｃと表７とに記載。Ｍａｇｅ ＰＣ Ｒ産物のゲル電気泳動は、図５〜１４の実施例に示した。前立腺癌 まず、ＢＭ吸引液を前立腺癌の患者の腸骨稜の両方の部位から得た（表４ａ、 表７）。３０患者のうち、ＭＡＧＥ−１の転写物は１２患者（４０％）に観察さ れ、ＭＡＧＥ−２は３患者（１７％）に、ＭＡＧＥ３／６は５患者（１７％）に 、ＭＡＧＥ−４は６患者（２０％）に、ＭＡＧＥ−１２は５患者（１７％）に観 察された。１患者における少なくとも１つのＭＡＧＥ遺伝子の発現の全体の確率 は１８（６０％）であった。１６患者が異質発現を顕現していたが、興味深いこ とに、２患者のみが両方の吸引部位におけるＭＡＧＥ遺伝子の一致した発現パタ ーンを示した。原発性腫瘍期、組織病理学的悪性度分類または血清における平均 ＰＳＡ濃度とＰＣＲアッセイにおけるＭＡＧＥの確実性との間に相関関係はなか った。肺癌 我々が興味を持った二番目の上皮腫瘍の存在は非小および小肺癌であった（表 ４ｂ）。我々は、ＭＡＧＥ−１が５吸引液（１５％）、ＭＡＧＥ−２が４吸引液 （１２％）、ＭＡＧＥ３／６が３吸引液（９％）、ＭＡＧＥ−４が３吸引液（９ ％）およびＭＡＧＥ−１２が４吸引液（１２％）であるという陽性結果の３４人 の癌患者の単面（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ）ＢＭ吸引液を分析した。少なくと も１つのＭＡＧＥ発現が１２吸引液（３５％）に見出された。ＭＡＧＥ−ＰＣＲ は、鱗状細胞癌の患者の１９ＢＭ吸引液中７つと腺癌の患者の１０の分析したＢ Ｍ吸引液中３つとにおいて陽性シグナルを顕現した。肉腫 間葉腫瘍細胞株が、種々のＭＡＧＥ遺伝子を発現するので、我々は、高感度な ＭＡＧＥ ＰＣＲアッセイを用いてＭ１に病期分類された６人の肉腫患者の単面 （ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ）ＢＭ吸引液を分析した（表４ｃ）。ＭＡＧＥ１、 ２、４、１２が２つの腫瘍試料でそれぞれ陽性であり、かつＭＡＧＥ３／６が１ つの試料で陽性であったが、５つの試料は少なくとも１つのＭＡＧＥ遺伝子の発 現を示した。全てのＭＡＧＥ遺伝子の転写物は、浸潤性骨髄転移を伴う横紋筋肉 腫を患った患者Ｔ．Ｃ．，のＢＭ吸引液に見出された。 実施例７：ＭＡＧＥ発現と他の腫瘍細胞散在マーカーとの相関関係 肺および前立腺の悪性腫瘍を患った患者の全てのＢＭ吸引液を、ＭＡＧＥ Ｒ Ｔ−ＰＣＲとサイトケラチン類に対するｍＡｂを用いた十分に確立された免疫組 織学的アッセイとの両方により評価した。少なくとも１つのＭＡＧＥ遺伝子の発 現および３４の分析した肺癌試料のＣＫ状態を図２に示す。８吸引液は、ＣＫ陽 性細胞を顕現したが、１２の吸引液はＭＡＧＥ ＰＣＲアッセイで陽性の結果を 示した。６吸引液は、一致して陽性であることが見出され、それら全ての鱗状細 胞癌の患者から取得された。ＭＡＧＥ ＰＣＲは、腺癌の１０患者のうち３患者 に陽性結果を示したが、一方、免疫組織学はこの組織学的なサブタイプにおいて ＣＫ陽性細胞を顕現しなかった。 さらに前立腺癌の患者を、ＭＡＧＥ ＲＴ−ＰＣＲと、ＣＫ免疫組織学と三番 目のアッセイ：ＰＳＡの高感度ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。図３は、ＭＡＧ ＥとＰＳＡとのＰＣＲアッセイの結果およびＣＫ免疫組織学の結果を示す。前記 したように、前立腺癌の３０患者のうち、１８患者は、少なくとも１つのＭＡＧ Ａ遺伝子の発現を示した。ＰＳＡ発現は、８患者で観察されたが、一方、ＣＫ免 疫染色細胞は９患者に見出された。興味深いことに、全てのＰＳＡ陽性患者およ び９人中７人のＣＫ陽性患者は、ＭＡＧＥ ＰＣＲアッセイの陽性結果により確 認された。比べて、ＣＫ免疫染色細胞は、４人のＰＳＡ陽性患者にのみ見出され た。さらに７人のＰＳＡ−およびＣＫ−陰性患者は、散在性腫瘍細胞の指標とし てＭＡＧＥ発現を顕現した。 実施例８：骨髄試料に比較した血液試料における発現 近年発表されたＰＣＲアッセイのほとんどが、循環性腫瘍細胞を検出すること を要求し、高い感受性を予想する；それでもなお、ＣＫ免疫組織学で得られたＰ Ｂ試料の分析の結果は約束されていない。我々は、ＢＭ吸引液と並行して採取さ れた、前立腺癌（ｎ＝１２）および肉腫（ｎ＝６）の患者の１８血液試料を分析 した。表４ａに記載したように、ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３／６転写物が １人の患者に見出されたが、一方ＭＡＧＥ−４発現は、前立腺癌の２患者に観察 することができた。興味深いことに、血液におけるＭＡＧＥ発現を有する２患者 は、骨髄における異なるパターンを呈した。ＰＳＡ−ＰＣＲアッセイは、全ての 分析されたＰＢ試料に関して完全に陰性であった。末梢血液を用いたアッセイの 明らかな低い感度は、肉腫の患者を分析することにより確認された（表４ｃ）。 ２患者のみがＭＡＧＥ−２および３／６発現を顕現するが、一方ＢＭ吸引液にお ける種々のＭＡＧＥ遺伝子の発現を再現することができなかった。さらに、我々 は、高感度ＭＡＧＥ ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて進行した転移悪性メラノー マの１２患者を分析した。少なくとも１つのＭＡＧＥ遺伝子の発現は、２つの試 料においてＭＡＧＥ−１、２、３／６および１２の陽性結果および１つの試料に おいてＭＡＧＥ−４の陽性結果の５患者のみに観察された。局在または進行疾患 の患者において、循環細胞を検出できないことは、散在性腫瘍細胞を検出するた めの好ましい指標コンパートメントとして骨髄を指示すると思われる。 実施例９：前立腺癌患者の原発性腫瘍におけるＭＡＧＥ遺伝子の異なる発現 全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ １６２（１９８７）１５６−１５９に従って原発性腫瘍から調製し た。つづいて、ｃＤＮＡを実施例６に記載のように合成した。表６に示すように 、２０中７腫瘍は、ＭＡＧＥ−１陽性であり、２０中６腫瘍はＭＡＧＥ２および −１２それぞれに陽性であり、２０中１０腫瘍はＭＡＧＥ３／６に陽性であり、 ２０中４がＭＡＧＥ−４に陽性であった：全体として、２０中１４腫瘍（７０％ ）は少なくとも１つのＭＡＧＥ遺伝子産物に関して陽性であった。 実施例１０：本発明の方法により決定された同一患者の原発性腫瘍および骨髄に おけるＭＡＧＥ遺伝子の異なる発現 全ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ １６２（１９８７）１５６−１５９に従って、肉腫患者Ｈ．Ｍ（表 ４ｃもまた参照のこと）の原発性腫瘍から調製した。つづいて、ｃＤＮＡを実施 例３に記載されたように合成し、ついでＭＡＧＥ １、２、３／６、４および１ ２のための３５サイクルのワン−ステップＰＣＲを実施例６に記載のように行な った。 患者Ｈ．Ｍの骨髄試料のＭＡＧＥ分析を本発明の方法に従って行なった。原発 性腫瘍の分析（結果を図１５に示す）は、ＭＡＧＥ−１の優勢な発現およびＭＡ ＧＥ−４と１２とを含む他のＭＡＧＥ遺伝子の極弱くかつ一致しない発現を顕現 した。しかしながら、骨髄の分析はＭａｇｅ−４および−１２の発現を顕現する のみであり、ＭＡＧＥ−１の発現は全く顕現されなかった（表４ｃ）。したがっ て、全身性の散在性腫瘍細胞のＭＡＧＥ発現パターンは、対応する原発性腫瘍の ものと必ずしも適合しない。したがって、全身散在性腫瘍細胞を除去し、したが って将来の遠位転移を妨げる請求項５記載の治療的アプローチは、好ましくは、 原発性腫瘍のＭＡＧＥ発現パターンの分析よりもむしろ適切な指標である骨髄の ような組織における該細胞のＭＡＧＥ発現パターンの分析に基づくべきである。 実施例１１：前立腺癌患者のリスク分析 ３０人中１８人の前立腺癌患者において、散在性腫瘍細胞を本発明の方法にし たがって骨髄分析により検出することができた。少なくとも１つのＭＡＧＥ−１ 、−２、−３／６、−４または−１２に特異的なＰＣＲ産物が、右及び左の腸骨 稜のそれぞれから採取された２つの骨髄吸引液の少なくとも１つにおいて検出で きた場合、患者は、ＭＡＧＥ陽性であるとみなされた。患者の臨床データを表７ 及び４ａに記載した（表７において、同じ３０人の前立腺癌患者が表４ａに記載 される。しかしながら、表４ａは、より予備的な臨床データを含むので、腫瘍病 期分類および段階分類に関して表７にいくつかの不一致がある。さらに、表４ａ に示されたＰＳＡ値は骨髄吸引時のものであり、したがって、表７に示された前 立腺癌の初診時の開始ＰＳＡ値と同一ではない。最後に、ＣＫ免疫組織学データ の再評価は、ＳＳＣ．ＦＲ．およびＬＥ．ＤＩ．のそれぞれの患者の左骨髄の吸 引試料の陽性結果および右骨髄の吸引試料の陰性結果を顕現する；さらに患者Ｊ Ｕ．ＨＡ．は両方の吸引部位に関してＣＫ陽性であることが分かった。前立腺癌 患者のリスク分析のために、表７からデータを排除的に得た）。前立腺癌の初診 時または治療用に意図した前立腺切除または照射前のそれらの原発性腫瘍のネオ アジュバント療法の間に、３０人の患者中２２人においてＭＡＧＥ発現を分析し た（結果を図４ａに示す）。分析した残りの８患者は、増加したＰＳＡの血液濃 度または局所再発により規定されたように分析時に進行性疾患を有していた；し かしながら、これらの患者は、誰もＭＡＧＥ分析の時に遠位転移の臨床サインを 有していなかった。それは、当該分野でよく確立されているように、これらの患 者は将来の遠位転移の非常に高いリスクを有している（Ｚｉｅｔｍａｎ，Ｃａｎ ｃｅｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ７１（１９９３），９５９〜９６９；Ｆｕｋｓ ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ． ２１（１９９１），５３７−５４７；Ｐｏｕｎｄ，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒ ｔｈ Ａｍ ２４（１９９７），３９５−４０６）；したがって、臨床顕性の遠 位転移がまだ進行していないが、おそらく将来、これら散在性の腫瘍の個細胞の なかから成長するであろう場合、それらのほとんどは、ＭＡＧＥ分析の時、すで に癌細胞の全身散在がなされていたことが予想されるであろう。事実、遠位転移 の高いリスクのこれらの８患者中７人（８７．５％）はＭＡＧＥ陽性であること を証明した。対照的に、原発性腫瘍と一時期関連し、したがって将来の遠位転移 による高リスクおよび低リスク患者の両方を示す分析された２２患者中１１人（ ５０．０％）のみでＭＡＧＥ陽性であることが見出された。興味深いことに、後 者の群（５／２２）の患者の２２．７％のみが、両方の吸引部位に関してＭＡＧ Ｅ陽性であることは見出され、比べて５０％が高リスク群（４／８）に見出され た。これらのデータは、少なくとも１つの骨髄試料における検出可能なＭＡＧＥ 発現は、多くが全身散在性腫瘍細胞の存在によるであろう将来の遠位転移の高リ スクに関連する。したがって、癌、特に将来の遠位転移のリスクが高い前立腺癌 を患った患者のサブグループは、本発明の方法により同定されるであろう。この サブグループは、全身散在性の癌の個細胞由来の遠位転移の生成を妨げるため請 求項５記載のアジュバント癌療法またはいかなる他のアジュバント手法に優先的 に供されるであろう。 表７−説明： 前立腺癌の３０人の患者の臨床学的データおよび左右腸骨稜由来の骨髄試料の分 析により得られたMAGE RT-PCR、PSA RT-PCRおよびCK免疫細胞学それぞれの対応 する結果。 表の記載：患者、臨床ステージＡ〜Ｄ、初診の時期、組織学（腺癌＝ＡＤＥＮＯ 、神経内分泌細胞癌＝ＮＥＵＲＯ）および対応する段階（１＝よく分化した、２ ＝適度に分化した、３＝ほとんど分化していない）、生検材料とリンパ節切除と に関連した（＝ｂ）または前立腺切除とリンパ節切除とに関連した（＝ｐ）ＴＮ Ｍステージ、治療前のＰＳＡレベル（＝初期ＰＳＡ）、免疫細胞学およびＲＴ− ＰＣＲの結果、吸引の時期（０＝進行性疾患であるが臨床顕性の遠位転移はない 時期の骨髄吸引、ｘ＝前立腺癌の初診時または治療用に意図した前立腺切除また は照射前の原発性腫瘍のネオアジュバント療法の間の骨髄吸引）、治療モダリテ ィー（Ａ＝ネオアジュバント抗男性ホルモン療法およびつづく前立腺切除、Ｂ＝ ネオアジュバント抗男性ホルモン療法およびつづく照射、Ｃ＝経尿道切除、Ｄ＝ １次抗男性ホルモン療法、Ｅ＝前立腺切除およびアジュバント抗男性ホルモン療 法、Ｆ＝ネオアジュバント抗男性ホルモン療法＋化学療法、およびつづく前立腺 切除、Ｇ＝前立腺切除）ならびに最後の臨床追跡調査の時期と結果（ＮＲ＝再発 なし、ＢＣＲ＝時期の延長された期間にわたる連続的なＰＳＡレベルにより決め られた生化学的再発、ｉＢＣＲ＝追跡調査の終了前の時期の短期間にわたる最初 に増加したＰＳＡレベル、ＬＲ＝局所再発、ＤＭ＝臨床顕性の遠位転移）。ｎ． ａ＝調査できず。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年４月２７日（１９９９．４．２７） 【補正内容】 請求の範囲 １． ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子から転写されるメッセンジャ ーＲＮＡに相補的な核酸分子又はその一部或いはその相補鎖に特異的にハイブリ ダイズするプライマーであって、 （ｉ）下記群のプライマーの１つと同じ３’部分を有するプライマー： ；及び （ｉｉ）配列番号：２、３、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、 １６、１７、１８、１９又は２０により特徴付けられるプライマー配列とオーバ ーラップするプライマー の群から選択されるプライマー。 ２． （ａ）群又は（ｂ）群のいずれかに示されるプライマーである請求項１記 載のプライマー。 ３． 少なくとも４つのプライマーを含有してなる診断用組成物であって、 （ｉ）下記群のプライマーの１つと同じ３’部分を有するプライマー： ；及び （ｉｉ）（ａ）又は（ｂ）に示されるプライマー配列とオーバーラップするプラ イマー；或いは（ａ）群又は（ｂ）群のいずれかに示されるプライマー、前記少 なくとも４つのプライマーは少なくとも２つの異なる核酸分子の逆方向の鎖と一 対の様式でハイブリダイズし、その際、１つの方向の鎖が少なくとも２つの異な るＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるｍＲＮＡに相補的である、の 群から選択される少なくとも４つのプライマーを含有してなる診断用組成物。 ４． 患者における癌の状態を示す散在性腫瘍細胞を検出する方法であって、 （ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の逆方向の鎖と一対の様式でハイブリダイ ズする請求項１又は２記載の少なくとも２つのプライマーを使用して１つ以上の 患者試料由来のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行う工程、その 際、１つの方向の鎖は少なくとも１つのＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転 写されるｍＲＮＡに相補的である；及び （ｂ）１つ以上のＰＣＲ産物を検出する工程 を含む方法。 ５． 下記工程： （ａ）少なくとも２つの異なる核酸分子の逆方向の鎖と一対の様式でハイブリダ イズする請求項１又は２記載の少なくとも４つのプライマーを使用して１つ以上 の患者試料由来のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行う工程、そ の際、１つの方向の鎖は少なくとも２つの異なるＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝 子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに相補的である； （ｂ）得られるＰＣＲ産物を検出する工程；及び （ｃ）ＭＨＣ拘束Ｔ細胞エピトープに類似するＭＡＧＥ抗原由来のペプチド、全 ＭＡＧＥ抗原又はそのフラグメント、ＭＡＧＥでトランスフェクトした宿主細胞 に基づくアジュバント腫瘍ワクチンの製造のために、少なくとも１つのＭＡＧＥ 遺伝子産物を使用する工程、前記ＭＡＧＥ遺伝子の発現は工程（ｂ）の結果とし て検出され、ＤＮＡワクチン接種法はＭＡＧＥをコードするヌクレオチド配列、 或いはＭＡＧＥ遺伝子産物又はそれらをコードするヌクレオチド配列に基づく他 のいずれかの免疫方法を使用する、 を含む腫瘍アジュバントワクチンの製造法。 ６． 前記ｃＤＮＡが、 （ａ）前記患者から分離された１つ以上の試料由来のｍＲＮＡを調製する工程； 及び （ｂ）前記ｍＲＮＡを逆転写する工程 により得られる、請求項４又は５記載の方法。 ７． 前記ＰＣＲがネスティドＰＣＲである請求項４〜６のいずれか１つに記載 の方法。 ８． 前記プライマーがＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるｍＲＮ Ａ及びその相補鎖に相補的な２〜６個の異なる核酸分子にハイブリダイズする、 請求項４〜７のいずれか１つに記載の方法。 ９． 前記ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原がＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６又 は−１２腫瘍特異的抗原である、請求項４〜８のいずれか１つに記載の方法。 １０． 前記試料が２つの異なる吸引部位から分離されるものである、請求項４ 〜９のいずれか１つに記載の方法。 １１． 前記試料が骨髄吸引液である請求項４〜１０のいずれか１つに記載の方 法。 １２． 前記ｍＲＮＡの調製が、下記工程： （ａ）ＲＮＡの分解を実質的に完全に避けながら、緩衝液中で試料を直ちに溶解 する工程；及び （ｂ）ＲＮアーゼ阻害剤、好ましくはセシウムトリフルオロアセテートをクッシ ョンに用いて、溶解物中に得られたｍＲＮＡを任意に遠心分離する工程 を含む請求項４〜１１のいずれか１つに記載の方法。 １３． 前記癌の状態が前立腺癌、非小（ｎｏｎ−ｓｍａｌ１）肺癌又は小（ｓ ｍａｌｌ）肺癌、肉腫、悪性メラノーマ、乳癌又は大腸癌に関する、請求項４〜 １２のいずれか１つに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原をコードする遺伝子から転写されるメッセンジャ ーＲＮＡに相補的な核酸分子又はその一部或いはその相補鎖に特異的にハイブリ ダイズするプライマーであって、 （ｉ）下記群のプライマーの１つと同じ３’部分を有するプライマー： ；及び （ｉｉ）（ａ）又は（ｂ）に示されるプライマー配列とオーバーラップするプラ イマー の群から選択されるプライマー。 ２． （ａ）群又は（ｂ）群のいずれかに示されるプライマーである請求項１記 載のプライマー。 ３． 少なくとも４つのプライマーが少なくとも２つの異なる核酸分子の逆方向 の鎖と一対の様式でハイブリダイズする、請求項１又は２記載の少なくとも４つ のプライマーを含有してなる診断用組成物であって、１つの方向の鎖が少なくと も２つの異なるＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるｍＲＮＡに相補 的である、診断用組成物。 ４． 患者における癌の状態を示す散在性腫瘍細胞を検出する方法であって、 （ａ）少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の逆方向の鎖と一対の様式でハイブリダイ ズする請求項１又は２記載の少なくとも２つのプライマーを使用して１つ以上の 患者試料由来のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行う工程、その 際、１つの方向の鎖は少なくとも１つのＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転 写されるｍＲＮＡに相補的である；及び （ｂ）１つ以上のＰＣＲ産物を検出する工程 を含む方法。 ５． 下記工程： （ａ）少なくとも２つの異なる核酸分子の逆方向の鎖と一対の様式でハイブリダ イズする請求項１又は２記載の少なくとも４つのプライマーを使用して１つ以上 の患者試料由来のｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行う工程、そ の際、１つの方向の鎖は少なくとも２つの異なるＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝 子から転写されるメッセンジャーＲＮＡに相補的である； （ｂ）得られるＰＣＲ産物を検出する工程；及び （ｃ）ＭＨＣ拘束Ｔ細胞エピトープに類似するＭＡＧＥ抗原由来のペプチド、全 ＭＡＧＥ抗原又はそのフラグメント、ＭＡＧＥでトランスフェクトした宿主細胞 に基づくアジュバント腫瘍ワクチンの製造のために、少なくとも１つのＭＡＧＥ 遺伝子産物を使用する工程、前記ＭＡＧＥ遺伝子の発現は工程（ｂ）の結果とし て検出され、ＤＮＡワクチン接種法はＭＡＧＥをコードするヌクレオチド配列、 或いはＭＡＧＥ遺伝子産物又はそれらをコードするヌクレオチド配列に基づく他 のいずれかの免疫方法を使用する、 を含む腫瘍アジュバントワクチンの製造法。 ６． 前記ｃＤＮＡが、 （ａ）前記患者から分離された１つ以上の試料由来のｍＲＮＡを調製する工程； 及び （ｂ）前記ｍＲＮＡを逆転写する工程 により得られる、請求項４又は５記載の方法。 ７． 前記ＰＣＲがネスティドＰＣＲである請求項４〜６のいずれか１つに記載 の方法。 ８． 前記プライマーがＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原の遺伝子から転写されるｍＲＮ Ａ及びその相補鎖に相補的な２〜６個の異なる核酸分子にハイブリダイズする、 請求項４〜７のいずれか１つに記載の方法。 ９． 前記ＭＡＧＥ腫瘍特異的抗原がＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４、−６又 は−１２腫瘍特異的抗原である、請求項４〜８のいずれか１つに記載の方法。 １０． 前記試料が２つの異なる吸引部位から分離されるものである、請求項４ 〜９のいずれか１つに記載の方法。 １１． 前記試料が骨髄吸引液である請求項４〜１０のいずれか１つに記載の方 法。 １２． 前記ｍＲＮＡの調製が、下記工程： （ａ）ＲＮＡの分解を実質的に完全に避けながら、緩衝液中で試料を直ちに溶解 する工程；及び （ｂ）ＲＮアーゼ阻害剤、好ましくはセシウムトリフルオロアセテートをクッシ ョンに用いて、溶解物中に得られたｍＲＮＡを任意に遠心分離する工程 を含む請求項４〜１１のいずれか１つに記載の方法。 １３． 前記癌の状態が前立腺癌、非小（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）肺癌又は小（ｓ ｍａｌｌ）肺癌、肉腫、悪性メラノーマ、乳癌又は大腸癌に関する、請求項４〜 １２のいずれか１つに記載の方法。