JP2002513575A - 弱毒インフルエンザウイルス - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
インフルエンザウイルスタンパク質またはその機能性改変体のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3'非コード領域を含む、ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイルスを提供する。前記二本鎖領域は少なくとも１つの塩基対置換を有し、その結果、該ウイルスに感染した細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱毒化された表現型を与える。弱毒インフルエンザウイルスはワクチンとして使用できる。
Description
【０００１】 本発明は、改変型ウイルス、特にインフルエンザウイルスワクチンとして使用
できる弱毒インフルエンザウイルスに関するものである。本発明の改変型ウイル
スには、標的細胞内で異種配列を発現させるためのウイルスベクターとして使用
するのに適した組換え体弱毒インフルエンザウイルスも含まれる。
できる弱毒インフルエンザウイルスに関するものである。本発明の改変型ウイル
スには、標的細胞内で異種配列を発現させるためのウイルスベクターとして使用
するのに適した組換え体弱毒インフルエンザウイルスも含まれる。
【０００２】 インフルエンザは依然として世界的にヒトの健康を脅かす存在である。不活化
インフルエンザウイルスワクチンが多年にわたって利用されてきたが、この種の
ワクチンは限られた防御を提供するにすぎない。インフルエンザの安全な弱毒生
ワクチンを提供しようとするこれまでの努力は、主として低温に順応したインフ
ルエンザウイルスに集中している。こうして、弱毒インフルエンザウイルスは、
以前には、低温でインフルエンザウイルスを徹底的に継代することによって得ら
れていた。低温での増殖に順応した結果、高温（約39℃）での複製能を失ったイ
ンフルエンザウイルスが得られる。このような低温順応型(cold-adapted: CA)ウ
イルスの複製は、比較的低温の上部気道では少ししか制限されないが、疾病に関
連した病理学の主要な部位である温かな下部気道では大いに制限される。野生型
と低温順応型のインフルエンザウイルスの配列比較により、いくつかの遺伝子セ
グメントのコード領域にアミノ酸変化をもたらす非サイレン突然変異とサイレン
突然変異の両方が明らかになった。ほとんどのアミノ酸変化は点突然変異の結果
であることが判明した。CAインフルエンザウイルスを世界中で一般的に利用され
るワクチンとして使用するには、点突然変異の遺伝的不安定性およびCAインフル
エンザウイルスの免疫原性のレベルについての潜在的問題が依然として残されて
いる。
インフルエンザウイルスワクチンが多年にわたって利用されてきたが、この種の
ワクチンは限られた防御を提供するにすぎない。インフルエンザの安全な弱毒生
ワクチンを提供しようとするこれまでの努力は、主として低温に順応したインフ
ルエンザウイルスに集中している。こうして、弱毒インフルエンザウイルスは、
以前には、低温でインフルエンザウイルスを徹底的に継代することによって得ら
れていた。低温での増殖に順応した結果、高温（約39℃）での複製能を失ったイ
ンフルエンザウイルスが得られる。このような低温順応型(cold-adapted: CA)ウ
イルスの複製は、比較的低温の上部気道では少ししか制限されないが、疾病に関
連した病理学の主要な部位である温かな下部気道では大いに制限される。野生型
と低温順応型のインフルエンザウイルスの配列比較により、いくつかの遺伝子セ
グメントのコード領域にアミノ酸変化をもたらす非サイレン突然変異とサイレン
突然変異の両方が明らかになった。ほとんどのアミノ酸変化は点突然変異の結果
であることが判明した。CAインフルエンザウイルスを世界中で一般的に利用され
るワクチンとして使用するには、点突然変異の遺伝的不安定性およびCAインフル
エンザウイルスの免疫原性のレベルについての潜在的問題が依然として残されて
いる。
【０００３】 弱毒インフルエンザウイルスを得るために研究されてきた別の方法は、インフ
ルエンザウイルスゲノムセグメントの非コード領域が、異なる型のインフルエン
ザウイルスのゲノムセグメント由来の非コード領域で置換されているキメラ・イ
ンフルエンザウイルスの構築である。このような弱毒キメラＡ／Ｂインフルエン
ザウイルスは、例えば、Musterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:517
7-5181; Luoら, J. Virology (1992) 66:4679-4685;およびBergmann & Muster,
J. General Virology (1995) 76:3211-3215において述べられている。
ルエンザウイルスゲノムセグメントの非コード領域が、異なる型のインフルエン
ザウイルスのゲノムセグメント由来の非コード領域で置換されているキメラ・イ
ンフルエンザウイルスの構築である。このような弱毒キメラＡ／Ｂインフルエン
ザウイルスは、例えば、Musterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:517
7-5181; Luoら, J. Virology (1992) 66:4679-4685;およびBergmann & Muster,
J. General Virology (1995) 76:3211-3215において述べられている。
【０００４】 インフルエンザウイルスは３種類が知られており、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型と呼ばれ
ている。これらの型はそれぞれが多くの株を含んでいる。インフルエンザウイル
スのゲノムはいくつかの(-)センスRNAから成るセグメント化ゲノムであり（Ａお
よびＢ型では８セグメント、Ｃ型では７セグメント）、Ａ型の場合には10種のポ
リペプチドをコードしている。すなわち、ヌクレオキャプシドを形成しているRN
A指令RNAポリメラーゼタンパク質(PB1、PB2、PA)および核タンパク質(NP)、基質
タンパク質(M1、M2)、リポタンパク質エンベロープから突き出ている２種の表面
糖タンパク質（赤血球凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA)）、ならびに非構造タ
ンパク質NS1およびNS2である。大多数のゲノムRNAセグメントはモノシストロン
性である。こうして、Ａ型のインフルエンザウイルスの場合には、８つのゲノム
RNAセグメントのうち６セグメントがモノシストロン性で、HA、NA、NPおよびウ
イルスポリメラーゼタンパク質PB1、PB2、PAをコードしている。
ている。これらの型はそれぞれが多くの株を含んでいる。インフルエンザウイル
スのゲノムはいくつかの(-)センスRNAから成るセグメント化ゲノムであり（Ａお
よびＢ型では８セグメント、Ｃ型では７セグメント）、Ａ型の場合には10種のポ
リペプチドをコードしている。すなわち、ヌクレオキャプシドを形成しているRN
A指令RNAポリメラーゼタンパク質(PB1、PB2、PA)および核タンパク質(NP)、基質
タンパク質(M1、M2)、リポタンパク質エンベロープから突き出ている２種の表面
糖タンパク質（赤血球凝集素(HA)とノイラミニダーゼ(NA)）、ならびに非構造タ
ンパク質NS1およびNS2である。大多数のゲノムRNAセグメントはモノシストロン
性である。こうして、Ａ型のインフルエンザウイルスの場合には、８つのゲノム
RNAセグメントのうち６セグメントがモノシストロン性で、HA、NA、NPおよびウ
イルスポリメラーゼタンパク質PB1、PB2、PAをコードしている。
【０００５】 インフルエンザウイルスの複製においては、ウイルスゲノム(vRNA)がmRNAに転
写されて相補的RNA(cRNA)分子へと複製され、次いでこれがvRNA合成のための鋳
型として用いられる。これらのプロセスは、PB1、PB2およびPAポリペプチドによ
り形成された３サブユニットから成るウイルスポリメラーゼ複合体によって触媒
されることが知られている。mRNA合成はキャップされたRNAプライマーにより開
始されるが、該プライマーはウイルスポリメラーゼ複合体と関連したエンドヌク
レアーゼによって宿主細胞のmRNAから切断される。mRNAの合成は、インフルエン
ザＡの場合にはvRNA鋳型の5'末端から16または17ヌクレオチド離れて、一連のウ
リジンで早期に終結し、続いてポリ(A)テイルが付加される。一方、cRNAの合成
は、プライマーの不在下で開始されてvRNAセグメントの正確な全長コピーをもた
らすと考えられている。核タンパク質はスイッチング因子として関与しており、
該因子はcRNA合成において抗ターミネーターとして働く。
写されて相補的RNA(cRNA)分子へと複製され、次いでこれがvRNA合成のための鋳
型として用いられる。これらのプロセスは、PB1、PB2およびPAポリペプチドによ
り形成された３サブユニットから成るウイルスポリメラーゼ複合体によって触媒
されることが知られている。mRNA合成はキャップされたRNAプライマーにより開
始されるが、該プライマーはウイルスポリメラーゼ複合体と関連したエンドヌク
レアーゼによって宿主細胞のmRNAから切断される。mRNAの合成は、インフルエン
ザＡの場合にはvRNA鋳型の5'末端から16または17ヌクレオチド離れて、一連のウ
リジンで早期に終結し、続いてポリ(A)テイルが付加される。一方、cRNAの合成
は、プライマーの不在下で開始されてvRNAセグメントの正確な全長コピーをもた
らすと考えられている。核タンパク質はスイッチング因子として関与しており、
該因子はcRNA合成において抗ターミネーターとして働く。
【０００６】 インフルエンザvRNAセグメントを、プラスミドDNAからの転写によりin vitro
で調製し、ウイルスポリメラーゼタンパク質および核タンパク質と混合して、転
写と複製に必要な全成分を有するリボ核タンパク質複合体(RNP)を形成させるこ
とができる。このようなRNPは、細胞パッケージング系で、例えばヘルパーウイ
ルスを用いて、生存能のあるインフルエンザウイルス粒子中に組み入れることが
できる。
で調製し、ウイルスポリメラーゼタンパク質および核タンパク質と混合して、転
写と複製に必要な全成分を有するリボ核タンパク質複合体(RNP)を形成させるこ
とができる。このようなRNPは、細胞パッケージング系で、例えばヘルパーウイ
ルスを用いて、生存能のあるインフルエンザウイルス粒子中に組み入れることが
できる。
【０００７】 RNP再構成およびトランスフェクション系の開発により、転写開始、終結およ
びポリアデニル化の調節に係わるインフルエンザＡ vRNAのRNAシグナルの詳細な
特徴づけが可能となった(4, 20-22, 25, 32, 34)。これらのシグナルはすべて、
vRNAセグメントの末端配列にあることが知られている(19)。5'および3'末端はそ
れぞれ13および12個の保存されたヌクレオチドを含み、部分的に二本鎖のパンハ
ンドル(panhandle)／RNA-フォークまたはコルクスクリュー(corkscrew)構造を形
成することができる(6, 7, 13)。モデルRNA鋳型を用いた初期のin vitro転写研
究では、vRNAおよびcRNAプロモーターがもっぱら3'末端配列に位置すること(25,
32)、およびパンハンドルはin vitroで転写の開始に明らかな役割を担っていな
いことが示唆された。しかしながら、その後、末端配列の詳細な突然変異誘発実
験から、5'末端がプロモーターの必須部分を形成していることが示された。こう
した知見は、RNAポリメラーゼの推定上のプロモーターRNAへの結合実験(7, 33)
に基づいており、さらに重要なことには、変異体モデルRNA鋳型を用いたin vitr
o転写研究(7, 8, 28)にも基づいていた。加えて、ウイルスポリメラーゼ関連エ
ンドヌクレアーゼの活性化には、ポリメラーゼ複合体と、vRNAセグメントの3'末
端配列のみならず5'末端配列との相互作用が必要である(11)。
びポリアデニル化の調節に係わるインフルエンザＡ vRNAのRNAシグナルの詳細な
特徴づけが可能となった(4, 20-22, 25, 32, 34)。これらのシグナルはすべて、
vRNAセグメントの末端配列にあることが知られている(19)。5'および3'末端はそ
れぞれ13および12個の保存されたヌクレオチドを含み、部分的に二本鎖のパンハ
ンドル(panhandle)／RNA-フォークまたはコルクスクリュー(corkscrew)構造を形
成することができる(6, 7, 13)。モデルRNA鋳型を用いた初期のin vitro転写研
究では、vRNAおよびcRNAプロモーターがもっぱら3'末端配列に位置すること(25,
32)、およびパンハンドルはin vitroで転写の開始に明らかな役割を担っていな
いことが示唆された。しかしながら、その後、末端配列の詳細な突然変異誘発実
験から、5'末端がプロモーターの必須部分を形成していることが示された。こう
した知見は、RNAポリメラーゼの推定上のプロモーターRNAへの結合実験(7, 33)
に基づいており、さらに重要なことには、変異体モデルRNA鋳型を用いたin vitr
o転写研究(7, 8, 28)にも基づいていた。加えて、ウイルスポリメラーゼ関連エ
ンドヌクレアーゼの活性化には、ポリメラーゼ複合体と、vRNAセグメントの3'末
端配列のみならず5'末端配列との相互作用が必要である(11)。
【０００８】 インフルエンザＡ vRNAセグメントのプロモーターの推定上の二本鎖領域は、
今では５〜８塩基対から成ることが認められている。最初の３塩基対は、5'末端
のヌクレオチド11'から13'および3'末端のヌクレオチド10から12により形成され
るもので、すべてのインフルエンザＡウイルスの異なるvRNAセグメント間で厳格
に保存されている。塩基配列決定実験からは、インフルエンザＢおよびＣ vRNA
セグメントの3'および5'非コード末端配列も高度に保存されており、部分的な逆
方向相補性を示すことがわかった(36, 37)。その結果として、パンハンドル構造
を形成するために非コード領域のヌクレオチドが塩基対合できることは、すべて
のインフルエンザvRNAが適切に機能するのに重要である。以下で用いるインフル
エンザvRNAセグメントの二本鎖領域という用語は、このような塩基対合によって
形成される領域をさすものと理解されるだろう。
今では５〜８塩基対から成ることが認められている。最初の３塩基対は、5'末端
のヌクレオチド11'から13'および3'末端のヌクレオチド10から12により形成され
るもので、すべてのインフルエンザＡウイルスの異なるvRNAセグメント間で厳格
に保存されている。塩基配列決定実験からは、インフルエンザＢおよびＣ vRNA
セグメントの3'および5'非コード末端配列も高度に保存されており、部分的な逆
方向相補性を示すことがわかった(36, 37)。その結果として、パンハンドル構造
を形成するために非コード領域のヌクレオチドが塩基対合できることは、すべて
のインフルエンザvRNAが適切に機能するのに重要である。以下で用いるインフル
エンザvRNAセグメントの二本鎖領域という用語は、このような塩基対合によって
形成される領域をさすものと理解されるだろう。
【０００９】 Kimら(14)は、以前に、推定上の二本鎖プロモーター領域の突然変異がクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の発現に及ぼす効果をMadin-D
arbyウシ腎(MDBK)細胞で調べるために、インフルエンザＡウイルスNS遺伝子の非
コード配列によって(-)センスCAT RNAが挟まれているCATレポーター遺伝子構築
物を使用した。(-)センスCAT RNA構築物をRNP複合体に組み込み、その後ヘルパ
ーインフルエンザウイルスを感染させたMDBK細胞の単層にトランスフェクトし、
CAT活性についてアッセイした。このモデル系を使用すると、CAT遺伝子構築物の
3'末端の11位と12位および5'末端の12'位と13'位の保存残基の単一突然変異がCA
T活性を消失させるか、または実質的に消失させることがわかった。しかし、ワ
トソン-クリック塩基対合の可能性を回復させるように該構築物に第２の相補的
突然変異を導入すると、CAT活性が部分的に回復することが見いだされた。こう
して、塩基対C12-G13'をU12-A13'で、またはC11-G12'をA11-U12'で置換した構築
物は、野生型インフルエンザＡ遺伝子の非コード領域をもつ対照構築物と比較し
て、それぞれ31％と22％の比率でCATを発現することが判明した。
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の発現に及ぼす効果をMadin-D
arbyウシ腎(MDBK)細胞で調べるために、インフルエンザＡウイルスNS遺伝子の非
コード配列によって(-)センスCAT RNAが挟まれているCATレポーター遺伝子構築
物を使用した。(-)センスCAT RNA構築物をRNP複合体に組み込み、その後ヘルパ
ーインフルエンザウイルスを感染させたMDBK細胞の単層にトランスフェクトし、
CAT活性についてアッセイした。このモデル系を使用すると、CAT遺伝子構築物の
3'末端の11位と12位および5'末端の12'位と13'位の保存残基の単一突然変異がCA
T活性を消失させるか、または実質的に消失させることがわかった。しかし、ワ
トソン-クリック塩基対合の可能性を回復させるように該構築物に第２の相補的
突然変異を導入すると、CAT活性が部分的に回復することが見いだされた。こう
して、塩基対C12-G13'をU12-A13'で、またはC11-G12'をA11-U12'で置換した構築
物は、野生型インフルエンザＡ遺伝子の非コード領域をもつ対照構築物と比較し
て、それぞれ31％と22％の比率でCATを発現することが判明した。
【００１０】 同じCATレポーター遺伝子系がU10-A11'塩基対の突然変異の影響を調べるため
にも使用された。U10からG10およびA11'からC11'への単一の突然変異はCAT活性
を顕著に減少させたが、両方の突然変異体とも検出可能な活性を示した。G10-C1
1'塩基対を導入する２個の突然変異の組合せは、CAT活性の向上を示さなかった
。したがって、10-11'位の塩基対の性質は11-12'位および12-13'位のものと相違
する可能性のあることが示唆された。
にも使用された。U10からG10およびA11'からC11'への単一の突然変異はCAT活性
を顕著に減少させたが、両方の突然変異体とも検出可能な活性を示した。G10-C1
1'塩基対を導入する２個の突然変異の組合せは、CAT活性の向上を示さなかった
。したがって、10-11'位の塩基対の性質は11-12'位および12-13'位のものと相違
する可能性のあることが示唆された。
【００１１】 かかる実験は、ヒト培養細胞においてインフルエンザvRNA二本鎖領域の突然変
異が異種CATレポーター遺伝子の発現に及ぼす影響を単に調べたにすぎない。こ
うした研究から、いくらかのCAT活性を可能にする突然変異が、インフルエンザv
RNAゲノム断片に組み込まれたとき、該断片の生存可能なウイルスへのレスキュ
ーを可能にするのか否かを予想することは不可能である。同様に、たとえこの種
の突然変異が生存可能なウイルスを生じさせるとしても、かかるウイルスが弱毒
化されるのか否かを予測することも不可能である。実際、このことは、インフル
エンザＡウイルスのNA遺伝子vRNAセグメントにおけるC12-G13'のU12-A13'による
塩基対置換が、生存能のあるインフルエンザＡウイルス（MDBK細胞上で顕著な弱
毒化を示さない）へとレスキューされ得る、という本発明者らの知見により支持
される（実施例参照）。
異が異種CATレポーター遺伝子の発現に及ぼす影響を単に調べたにすぎない。こ
うした研究から、いくらかのCAT活性を可能にする突然変異が、インフルエンザv
RNAゲノム断片に組み込まれたとき、該断片の生存可能なウイルスへのレスキュ
ーを可能にするのか否かを予想することは不可能である。同様に、たとえこの種
の突然変異が生存可能なウイルスを生じさせるとしても、かかるウイルスが弱毒
化されるのか否かを予測することも不可能である。実際、このことは、インフル
エンザＡウイルスのNA遺伝子vRNAセグメントにおけるC12-G13'のU12-A13'による
塩基対置換が、生存能のあるインフルエンザＡウイルス（MDBK細胞上で顕著な弱
毒化を示さない）へとレスキューされ得る、という本発明者らの知見により支持
される（実施例参照）。
【００１２】 対照的に、インフルエンザＡウイルスのNA特異的vRNAの二本鎖領域における11
-12'位でのＣのＡによるおよびＧのＵによる置換が、MDBK細胞上で、また培養下
の他の細胞型上でも、弱毒化へと至らせることが、今回見いだされた。さらに、
同じ塩基対置換を有するインフルエンザＡウイルスは生体内で弱毒化され、かつ
野生型インフルエンザＡウイルスに対する防御免疫を引き出しうることが示され
た。かかる弱毒化はNA特異的mRNAのポリアデニル化の減少から生じることが証拠
により示唆される。かくして、vRNAセグメントの二本鎖領域における塩基対置換
は、インフルエンザウイルスの弱毒化を達成するための新しい一般的戦略として
提案される。そのような塩基対置換は、以下でさらに述べるように、遺伝子操作
したインフルエンザvRNAセグメントを生存可能なインフルエンザウイルスに組み
込むための公知のレスキュー系を適用することで選択することができる。
-12'位でのＣのＡによるおよびＧのＵによる置換が、MDBK細胞上で、また培養下
の他の細胞型上でも、弱毒化へと至らせることが、今回見いだされた。さらに、
同じ塩基対置換を有するインフルエンザＡウイルスは生体内で弱毒化され、かつ
野生型インフルエンザＡウイルスに対する防御免疫を引き出しうることが示され
た。かかる弱毒化はNA特異的mRNAのポリアデニル化の減少から生じることが証拠
により示唆される。かくして、vRNAセグメントの二本鎖領域における塩基対置換
は、インフルエンザウイルスの弱毒化を達成するための新しい一般的戦略として
提案される。そのような塩基対置換は、以下でさらに述べるように、遺伝子操作
したインフルエンザvRNAセグメントを生存可能なインフルエンザウイルスに組み
込むための公知のレスキュー系を適用することで選択することができる。
【００１３】 したがって、一態様において、本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質
またはその機能性改変体のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフ
ルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3
'非コード領域を含む、ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイル
スであって、該二本鎖領域が少なくとも１つの塩基対置換を有し、その結果、該
ウイルスに感染した細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱
毒化された表現型を与えることを特徴とする、弱毒インフルエンザウイルスを提
供する。
またはその機能性改変体のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフ
ルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3
'非コード領域を含む、ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイル
スであって、該二本鎖領域が少なくとも１つの塩基対置換を有し、その結果、該
ウイルスに感染した細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱
毒化された表現型を与えることを特徴とする、弱毒インフルエンザウイルスを提
供する。
【００１４】 インフルエンザウイルスRNAゲノムセグメントの変異型二本鎖領域とは、さま
ざまな型の野生型インフルエンザウイルスのvRNAに由来するあらゆる天然のイン
フルエンザウイルスvRNA二本鎖領域を除外するものとして理解されるだろう。
ざまな型の野生型インフルエンザウイルスのvRNAに由来するあらゆる天然のイン
フルエンザウイルスvRNA二本鎖領域を除外するものとして理解されるだろう。
【００１５】 本明細書中で「細胞」とは、通常インフルエンザウイルスにin vivoで感染す
るヒトおよび／または動物細胞をさす。本発明の弱毒ウイルスの選択のためには
、この用語は１種以上の細胞、例えば、１種以上の培養したヒトまたは非ヒト動
物細胞をさすものと理解される。それらはin vivo細胞、例えば動物モデルの細
胞であってもよい。in vitroで本発明の弱毒ウイルスを選択するのに有用であり
うる培養細胞としては、MDBK細胞、Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞およびVero（
アフリカミドリザル腎）細胞がある。
るヒトおよび／または動物細胞をさす。本発明の弱毒ウイルスの選択のためには
、この用語は１種以上の細胞、例えば、１種以上の培養したヒトまたは非ヒト動
物細胞をさすものと理解される。それらはin vivo細胞、例えば動物モデルの細
胞であってもよい。in vitroで本発明の弱毒ウイルスを選択するのに有用であり
うる培養細胞としては、MDBK細胞、Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細胞およびVero（
アフリカミドリザル腎）細胞がある。
【００１６】 本発明の弱毒ウイルスはゲノムセグメントの二本鎖非コード領域に単一の塩基
対置換をもつことができるが、このようなウイルスは同一のゲノムセグメントま
たは異なるゲノムセグメント上に１つより多い塩基対置換（例えば同一のゲノム
セグメントの二本鎖領域に２つの塩基対置換）を有していてもよい。１つ以上の
二本鎖塩基対置換は、親野生型ウイルスと比べたとき、MDBK細胞上でプラーク力
価の若干の低下、例えば少なくとも約１logの低下をもたらすことが望ましい。
１つ以上の二本鎖塩基対置換は、親野生型ウイルスと比べたとき、MDCK細胞およ
びVero細胞上でプラーク力価の若干の低下、例えば少なくとも約１log、より好
ましくは少なくとも３〜４logの低下を示す弱毒ウイルスを提供することが好ま
しい。例えば、本発明の弱毒ウイルスは、vRNA非コード領域の塩基置換に起因し
て、親野生型ウイルスと比べたときVero細胞上でプラーク力価の約５logもの低
下を示しうる。かかる弱毒ウイルスは、二本鎖領域の11-12'位のC-Gに代わる塩
基対置換A11-U12'を含み、さらにU10-A11'に代わる塩基対置換G10-C11'を含むNA
特異的vRNAセグメントを有するインフルエンザA/WSN/33により例示される（実施
例で言及される変異体D1/2）。NA特異的vRNAセグメントまたは別のインフルエン
ザウイルスタンパク質をコードするvRNAセグメント中に同一の塩基対置換を含む
他のインフルエンザＡウイルスも本発明の例となる。
対置換をもつことができるが、このようなウイルスは同一のゲノムセグメントま
たは異なるゲノムセグメント上に１つより多い塩基対置換（例えば同一のゲノム
セグメントの二本鎖領域に２つの塩基対置換）を有していてもよい。１つ以上の
二本鎖塩基対置換は、親野生型ウイルスと比べたとき、MDBK細胞上でプラーク力
価の若干の低下、例えば少なくとも約１logの低下をもたらすことが望ましい。
１つ以上の二本鎖塩基対置換は、親野生型ウイルスと比べたとき、MDCK細胞およ
びVero細胞上でプラーク力価の若干の低下、例えば少なくとも約１log、より好
ましくは少なくとも３〜４logの低下を示す弱毒ウイルスを提供することが好ま
しい。例えば、本発明の弱毒ウイルスは、vRNA非コード領域の塩基置換に起因し
て、親野生型ウイルスと比べたときVero細胞上でプラーク力価の約５logもの低
下を示しうる。かかる弱毒ウイルスは、二本鎖領域の11-12'位のC-Gに代わる塩
基対置換A11-U12'を含み、さらにU10-A11'に代わる塩基対置換G10-C11'を含むNA
特異的vRNAセグメントを有するインフルエンザA/WSN/33により例示される（実施
例で言及される変異体D1/2）。NA特異的vRNAセグメントまたは別のインフルエン
ザウイルスタンパク質をコードするvRNAセグメント中に同一の塩基対置換を含む
他のインフルエンザＡウイルスも本発明の例となる。
【００１７】 先に示したように、本発明の弱毒ウイルスには、NA特異的vRNAセグメント中に
単一の塩基対置換A11-U12'を有するインフルエンザA/WSN/33（実施例で言及され
る変異体D2）およびNA特異的vRNAセグメントまたは別のウイルスタンパク質コー
ド化vRNAセグメント中に同じ塩基対置換を有する他のインフルエンザＡウイルス
も含まれる。したがって、一実施形態において、本発明は、非コード二本鎖領域
中に弱毒化性の塩基対置換をもたらすように、天然親セグメントの3'末端から11
位にＣからＡへの突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から12'位にＧ
からＵへの突然変異を有するか、または同じ位置に機能的に等価の置換（例えば
修飾塩基による置換）を有する変異型のインフルエンザＡウイルスゲノムRNAセ
グメントを担う、Ａ型の弱毒インフルエンザウイルスを提供する。さらに、別の
実施形態において、本発明は、非コード二本鎖領域中に追加の塩基対置換をもた
らすように、同じvRNAセグメント中に天然親セグメントの3'末端から10位にＵか
らＧへの突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から11'位にＡからＣへ
の突然変異を有するか、または同じ位置に機能的に等価の置換を有するＡ型の弱
毒ウイルスを提供する。そのようなウイルスは非コード二本鎖領域中に上記のよ
うな１つ以上の塩基対置換を導入することによって弱毒化された野生型ウイルス
、または以下でさらに述べるような異種コード配列を担う組換え体弱毒ウイルス
でありうる。好ましくは、例えば、弱毒化性の塩基対置換はNAまたはその表面糖
タンパク質の機能性改変体をコードするゲノム核酸セグメントに導入されるだろ
う。
単一の塩基対置換A11-U12'を有するインフルエンザA/WSN/33（実施例で言及され
る変異体D2）およびNA特異的vRNAセグメントまたは別のウイルスタンパク質コー
ド化vRNAセグメント中に同じ塩基対置換を有する他のインフルエンザＡウイルス
も含まれる。したがって、一実施形態において、本発明は、非コード二本鎖領域
中に弱毒化性の塩基対置換をもたらすように、天然親セグメントの3'末端から11
位にＣからＡへの突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から12'位にＧ
からＵへの突然変異を有するか、または同じ位置に機能的に等価の置換（例えば
修飾塩基による置換）を有する変異型のインフルエンザＡウイルスゲノムRNAセ
グメントを担う、Ａ型の弱毒インフルエンザウイルスを提供する。さらに、別の
実施形態において、本発明は、非コード二本鎖領域中に追加の塩基対置換をもた
らすように、同じvRNAセグメント中に天然親セグメントの3'末端から10位にＵか
らＧへの突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から11'位にＡからＣへ
の突然変異を有するか、または同じ位置に機能的に等価の置換を有するＡ型の弱
毒ウイルスを提供する。そのようなウイルスは非コード二本鎖領域中に上記のよ
うな１つ以上の塩基対置換を導入することによって弱毒化された野生型ウイルス
、または以下でさらに述べるような異種コード配列を担う組換え体弱毒ウイルス
でありうる。好ましくは、例えば、弱毒化性の塩基対置換はNAまたはその表面糖
タンパク質の機能性改変体をコードするゲノム核酸セグメントに導入されるだろ
う。
【００１８】 本発明は、特にインフルエンザA/WSN/33を例に引いて、以下でさらに説明され
るが、本発明はＡ型のインフルエンザウイルスに制限されない。ＢおよびＣ型の
ウイルスにおける、D2またはD1/2突然変異と機能的に等価の突然変異、すなわち
弱毒化性の塩基対置換の同定は、利用可能な配列情報を参照し、かつ完全なイン
フルエンザウイルスに弱毒化の特徴を賦与するのに適した、どの遺伝子操作型イ
ンフルエンザvRNAセグメントにも応用可能な公知のレスキュー系を適用すること
で、同様に行なうことができる。
るが、本発明はＡ型のインフルエンザウイルスに制限されない。ＢおよびＣ型の
ウイルスにおける、D2またはD1/2突然変異と機能的に等価の突然変異、すなわち
弱毒化性の塩基対置換の同定は、利用可能な配列情報を参照し、かつ完全なイン
フルエンザウイルスに弱毒化の特徴を賦与するのに適した、どの遺伝子操作型イ
ンフルエンザvRNAセグメントにも応用可能な公知のレスキュー系を適用すること
で、同様に行なうことができる。
【００１９】 かくして、本発明の更なる実施形態は、上でD2と命名したインフルエンザA/WS
N/33の塩基対置換と機能的に相応する位置で、非コード二本鎖領域中に弱毒化性
の塩基対置換を有する変異型インフルエンザＢウイルスゲノムRNAセグメント（
例えばNAコード化セグメント）を担うＢ型のインフルエンザウイルスである。本
発明はまた、変異型インフルエンザＣウイルスゲノムRNAセグメント（例えば変
異型NAコード化セグメント）中にそのような塩基対置換を有するＣ型のインフル
エンザウイルスにも及ぶものである。
N/33の塩基対置換と機能的に相応する位置で、非コード二本鎖領域中に弱毒化性
の塩基対置換を有する変異型インフルエンザＢウイルスゲノムRNAセグメント（
例えばNAコード化セグメント）を担うＢ型のインフルエンザウイルスである。本
発明はまた、変異型インフルエンザＣウイルスゲノムRNAセグメント（例えば変
異型NAコード化セグメント）中にそのような塩基対置換を有するＣ型のインフル
エンザウイルスにも及ぶものである。
【００２０】 上述のように弱毒化性の塩基対置換を組み込んだ本発明のウイルスの核酸セグ
メント、およびこうした核酸を提供するための転写能力があるDNAもまた、本発
明の別の態様を構成する。本発明の核酸は好ましくは非コード二本鎖領域中に適
切な弱毒化性の塩基対置換を有する、突然変異した天然のインフルエンザウイル
スRNAゲノムセグメントである。こうしたRNAは、例えば、3'および／または5'末
端、あるいは内部に、機能を破壊しない１以上の別のヌクレオチドが添加される
などの、別の改変を有していてもよい。それはキメラRNAでもよい。
メント、およびこうした核酸を提供するための転写能力があるDNAもまた、本発
明の別の態様を構成する。本発明の核酸は好ましくは非コード二本鎖領域中に適
切な弱毒化性の塩基対置換を有する、突然変異した天然のインフルエンザウイル
スRNAゲノムセグメントである。こうしたRNAは、例えば、3'および／または5'末
端、あるいは内部に、機能を破壊しない１以上の別のヌクレオチドが添加される
などの、別の改変を有していてもよい。それはキメラRNAでもよい。
【００２１】 in vitroで転写されて本発明のRNA核酸セグメントを提供することができるDNA
を、最初に通常の技術によって１つのプラスミド中に構築し、そして制限エンド
ヌクレアーゼ消化によってそのプラスミドから単離することができる。上述のプ
ラスミドpT3NAm1によって説明したように、この目的のため、天然インフルエン
ザウイルスvRNAセグメントのcDNAを、適切なプロモーターおよび制限エンドヌク
レアーゼ部位に隣接させてプラスミド中に挿入することができる。次にこのcDNA
を、例えば適切な突然変異性プライマーを使用するPCR指令突然変異によって、
部位特異的突然変異を起こさせ、転写のための所望の突然変異vRNAセグメントを
コードする配列を提供させることができる。あるいは、本発明のゲノム核酸セグ
メントを合成してもよい。
を、最初に通常の技術によって１つのプラスミド中に構築し、そして制限エンド
ヌクレアーゼ消化によってそのプラスミドから単離することができる。上述のプ
ラスミドpT3NAm1によって説明したように、この目的のため、天然インフルエン
ザウイルスvRNAセグメントのcDNAを、適切なプロモーターおよび制限エンドヌク
レアーゼ部位に隣接させてプラスミド中に挿入することができる。次にこのcDNA
を、例えば適切な突然変異性プライマーを使用するPCR指令突然変異によって、
部位特異的突然変異を起こさせ、転写のための所望の突然変異vRNAセグメントを
コードする配列を提供させることができる。あるいは、本発明のゲノム核酸セグ
メントを合成してもよい。
【００２２】 本発明の弱毒ウイルスを調製するため、上に定義した弱毒化性の塩基対置換を
１以上有するゲノム核酸セグメントをin vitroでインフルエンザウイルスポリメ
ラーゼタンパク質および核タンパク質と複合体化させてRNP複合体を形成させる
ことができる。こうしたRNP複合体は本発明のさらに別の態様を構成するが、こ
れらは細胞中のウイルスレスキューのためにRNA複合体中に遺伝子操作したイン
フルエンザウイルスRNAゲノムセグメントを組み込むために従来から使用されて
いるような通常の手法で調製することができる（4、5、38）。本発明のRNP複合
体をやはり通常の技法を使用して、培養細胞、例えばMDBK細胞、MDCK細胞または
Vero細胞中にトランスフェクトすることができる。この目的のために通常使用さ
れる方法としてDEAEデキストラントランスフェクションおよびエレクトロポレー
ションが含まれる（19、39）。
１以上有するゲノム核酸セグメントをin vitroでインフルエンザウイルスポリメ
ラーゼタンパク質および核タンパク質と複合体化させてRNP複合体を形成させる
ことができる。こうしたRNP複合体は本発明のさらに別の態様を構成するが、こ
れらは細胞中のウイルスレスキューのためにRNA複合体中に遺伝子操作したイン
フルエンザウイルスRNAゲノムセグメントを組み込むために従来から使用されて
いるような通常の手法で調製することができる（4、5、38）。本発明のRNP複合
体をやはり通常の技法を使用して、培養細胞、例えばMDBK細胞、MDCK細胞または
Vero細胞中にトランスフェクトすることができる。この目的のために通常使用さ
れる方法としてDEAEデキストラントランスフェクションおよびエレクトロポレー
ションが含まれる（19、39）。
【００２３】 さらに別の態様において、本発明は、本発明の弱毒インフルエンザウイルスを
調製する方法であって、このウイルスのためのゲノム核酸セグメントをそのセグ
メントがウイルス粒子中にパッケージされる条件下で宿主細胞中に提供すること
を含む方法を提供する。この目的のため、ゲノム核酸セグメントをプラスミドに
よってその宿主中に提供することができる。あるいは、本明細書に前記したよう
な本発明のRNP複合体を、RNP複合体を補足し所望の弱毒ウイルス粒子の選別を可
能とするインフルエンザヘルパーウイルスで予め感染させた宿主細胞中にトラン
スフェクトすることができる。特定のインフルエンザウイルス遺伝子に関する、
ヘルパーウイルスに基づく多数の細胞レスキュー系が以前に記載されており、Mu
sterおよびGarcia-Sastreによる総説がある（56）。こうした遺伝子特異的レス
キュー系を以下に簡単に要約する。
調製する方法であって、このウイルスのためのゲノム核酸セグメントをそのセグ
メントがウイルス粒子中にパッケージされる条件下で宿主細胞中に提供すること
を含む方法を提供する。この目的のため、ゲノム核酸セグメントをプラスミドに
よってその宿主中に提供することができる。あるいは、本明細書に前記したよう
な本発明のRNP複合体を、RNP複合体を補足し所望の弱毒ウイルス粒子の選別を可
能とするインフルエンザヘルパーウイルスで予め感染させた宿主細胞中にトラン
スフェクトすることができる。特定のインフルエンザウイルス遺伝子に関する、
ヘルパーウイルスに基づく多数の細胞レスキュー系が以前に記載されており、Mu
sterおよびGarcia-Sastreによる総説がある（56）。こうした遺伝子特異的レス
キュー系を以下に簡単に要約する。
【００２４】 ヘルパーウイルスに基づくインフルエンザ遺伝子レスキュー系 NAおよびHA表面抗原、非構造タンパク質、NP、PB2ポリメラーゼタンパク質な
らびにMタンパク質について、インフルエンザA vRNAの遺伝子操作を可能にする
、ヘルパーに基づくレスキュー系が報告されている。
らびにMタンパク質について、インフルエンザA vRNAの遺伝子操作を可能にする
、ヘルパーに基づくレスキュー系が報告されている。
【００２５】 NA遺伝子特異的レスキュー系 最も一般的に使用されるヘルパーウイルスに基づくインフルエンザ遺伝子レス
キュー系はインフルエンザA/WSN/33ウイルスのNAに限定される（4、5）。この方
法は、インフルエンザA/WSN/33由来のNA遺伝子を有するインフルエンザウイルス
のみがトリプシン不在下でMDBK細胞上で成長することができるという観察に基づ
いている。このレスキュー系では、ヘルパーウイルスはインフルエンザA/WSN/33
由来の7個の遺伝子セグメントとインフルエンザA/WSN/33以外のウイルス由来のN
A遺伝子１個を含有する再構築物である。一般的にヘルパーウイルスとして、イ
ンフルエンザA/HK/8/68由来のNA遺伝子１個を有するA/WSN-HKが使用される。こ
の系においては、インフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子を、このヘルパーウイルス
を感染させた細胞中にトランスフェクトする。次に外因性プロテアーゼの不在下
でMDBK細胞上で増殖させることによって、このウイルスを選択する。
キュー系はインフルエンザA/WSN/33ウイルスのNAに限定される（4、5）。この方
法は、インフルエンザA/WSN/33由来のNA遺伝子を有するインフルエンザウイルス
のみがトリプシン不在下でMDBK細胞上で成長することができるという観察に基づ
いている。このレスキュー系では、ヘルパーウイルスはインフルエンザA/WSN/33
由来の7個の遺伝子セグメントとインフルエンザA/WSN/33以外のウイルス由来のN
A遺伝子１個を含有する再構築物である。一般的にヘルパーウイルスとして、イ
ンフルエンザA/HK/8/68由来のNA遺伝子１個を有するA/WSN-HKが使用される。こ
の系においては、インフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子を、このヘルパーウイルス
を感染させた細胞中にトランスフェクトする。次に外因性プロテアーゼの不在下
でMDBK細胞上で増殖させることによって、このウイルスを選択する。
【００２６】 ヘルパーウイルスとしてNA欠失突然変異ウイルスを使用することによって、NA
遺伝子をレスキューすることもできる。こうしたヘルパーウイルスは組織培養で
増殖するためには外因性ノイラミニダーゼを必要とする。このヘルパーウイルス
を感染させた細胞中にNA遺伝子をトランスフェクトする。次にノイラミニダーゼ
の不在下で細胞上で増殖させることによって、ウイルスを選択する（43）。
遺伝子をレスキューすることもできる。こうしたヘルパーウイルスは組織培養で
増殖するためには外因性ノイラミニダーゼを必要とする。このヘルパーウイルス
を感染させた細胞中にNA遺伝子をトランスフェクトする。次にノイラミニダーゼ
の不在下で細胞上で増殖させることによって、ウイルスを選択する（43）。
【００２７】 NS遺伝子特異的レスキュー系 NS遺伝子特異的レスキュー系のヘルパーウイルスとして、NS1タンパク質に欠
陥がある温度感受性インフルエンザウイルスを使用する。NS遺伝子セグメントは
NS1およびNS2タンパク質をコードする2つのオーバーラップ遺伝子を保有する。
このレスキュー系によって、許容されない温度で活性を有するNS1タンパク質を
コードするNS遺伝子セグメントのレスキューが可能になる。この系においては、
レスキューされるべきNS遺伝子セグメントを、温度感受性ウイルスを感染させた
細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクトされたNS遺伝子セグメントを
有するウイルスを、Enamiら（40）によって記載された通りに、許容されない温
度でこのウイルスを増殖させることによって選択する。
陥がある温度感受性インフルエンザウイルスを使用する。NS遺伝子セグメントは
NS1およびNS2タンパク質をコードする2つのオーバーラップ遺伝子を保有する。
このレスキュー系によって、許容されない温度で活性を有するNS1タンパク質を
コードするNS遺伝子セグメントのレスキューが可能になる。この系においては、
レスキューされるべきNS遺伝子セグメントを、温度感受性ウイルスを感染させた
細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクトされたNS遺伝子セグメントを
有するウイルスを、Enamiら（40）によって記載された通りに、許容されない温
度でこのウイルスを増殖させることによって選択する。
【００２８】 PB2遺伝子特異的レスキュー系 PB2遺伝子特異的レスキュー系のヘルパーウイルスとして、トリインフルエン
ザAウイルスPB2遺伝子を有するウイルスを使用することができる。このトリイン
フルエンザAウイルスPB2遺伝子は、哺乳動物細胞中でのヘルパーウイルスの複製
を制限する。したがって、このレスキュー系によって哺乳動物細胞中でインフル
エンザウイルスの複製を可能にするPB2遺伝子をレスキューすることができる。
レスキューされるべきPB2遺伝子を、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にト
ランスフェクトする。トランスフェクトしたPB2遺伝子を有するウイルスを、哺
乳動物細胞中でこのウイルスを増殖させることによって選択する。Subbaraoら（
41）はこのようなトリインフルエンザAウイルスPB2遺伝子に基づく系を使用して
、野生型インフルエンザA/Ann Arbor/6/60ウイルスのPB2遺伝子をレスキューし
た。
ザAウイルスPB2遺伝子を有するウイルスを使用することができる。このトリイン
フルエンザAウイルスPB2遺伝子は、哺乳動物細胞中でのヘルパーウイルスの複製
を制限する。したがって、このレスキュー系によって哺乳動物細胞中でインフル
エンザウイルスの複製を可能にするPB2遺伝子をレスキューすることができる。
レスキューされるべきPB2遺伝子を、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にト
ランスフェクトする。トランスフェクトしたPB2遺伝子を有するウイルスを、哺
乳動物細胞中でこのウイルスを増殖させることによって選択する。Subbaraoら（
41）はこのようなトリインフルエンザAウイルスPB2遺伝子に基づく系を使用して
、野生型インフルエンザA/Ann Arbor/6/60ウイルスのPB2遺伝子をレスキューし
た。
【００２９】 M遺伝子特異的レスキュー系 M遺伝子特異的レスキュー系のヘルパーウイルスとして、インフルエンザA/ウ
マ/Miami/1/63ウイルスのM遺伝子を保有するアマンチジン感受性インフルエンザ
ウイルスを使用することができる。このレスキュー系でウイルスにアマンチジン
耐性を与えるM遺伝子のレスキューが可能になる。この系では、レスキューされ
るべきM遺伝子を、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトす
る。アマンチジン存在下でこのウイルスを増殖させることによって、トランスフ
ェクトしたM遺伝子を有するウイルスを選択する。CastrucciおよびKawaoka（42
）はこうしたアマンチジン感受性M遺伝子に基づく系を使用して、インフルエン
ザA/PR/8/34ウイルスのM遺伝子をレスキューした。
マ/Miami/1/63ウイルスのM遺伝子を保有するアマンチジン感受性インフルエンザ
ウイルスを使用することができる。このレスキュー系でウイルスにアマンチジン
耐性を与えるM遺伝子のレスキューが可能になる。この系では、レスキューされ
るべきM遺伝子を、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトす
る。アマンチジン存在下でこのウイルスを増殖させることによって、トランスフ
ェクトしたM遺伝子を有するウイルスを選択する。CastrucciおよびKawaoka（42
）はこうしたアマンチジン感受性M遺伝子に基づく系を使用して、インフルエン
ザA/PR/8/34ウイルスのM遺伝子をレスキューした。
【００３０】 抗体に基づくレスキュー系 これらの系は、特定の抗体に対するトランスフェクタントウイルスの結合また
は非結合に依存する（5、52）。こうした抗体とは、インフルエンザウイルスに
結合し組織培養中でその増殖を減退させる中和抗体である。ヘルパーウイルスは
、例えば、抗体エピトープを表示するインフルエンザ表面タンパク質をコードす
る遺伝子を保有する。したがってこの系は、こうした遺伝子を保有しないが、確
実に生存し得るトランスフェクタントウイルスを選択するために使用することが
できる。このようにこのタイプのレスキュー系でインフルエンザ表面タンパク質
をコードする遺伝子のレスキューが可能になる。レスキューされるべき遺伝子を
、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトする。抗体の存在下
でこのウイルスを増殖させることによって、トランスフェクトした遺伝子を有す
るウイルスを選択する。こうした系はEnamiおよびPaleseによって使用されて（5
）、トランスフェクトされた合成HAセグメントがレスキューされた。
は非結合に依存する（5、52）。こうした抗体とは、インフルエンザウイルスに
結合し組織培養中でその増殖を減退させる中和抗体である。ヘルパーウイルスは
、例えば、抗体エピトープを表示するインフルエンザ表面タンパク質をコードす
る遺伝子を保有する。したがってこの系は、こうした遺伝子を保有しないが、確
実に生存し得るトランスフェクタントウイルスを選択するために使用することが
できる。このようにこのタイプのレスキュー系でインフルエンザ表面タンパク質
をコードする遺伝子のレスキューが可能になる。レスキューされるべき遺伝子を
、ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトする。抗体の存在下
でこのウイルスを増殖させることによって、トランスフェクトした遺伝子を有す
るウイルスを選択する。こうした系はEnamiおよびPaleseによって使用されて（5
）、トランスフェクトされた合成HAセグメントがレスキューされた。
【００３１】 NP遺伝子特異的レスキュー系 Liと共同研究者（39）は、インフルエンザAウイルス核タンパク質遺伝子のレ
スキューのための逆遺伝学系を報告した。この系において、ヘルパーウイルスと
して温度感受性（ts）突然変異体ts56を使用する。前記（5）のようにin vivoで
RNA複合体を再構築し、その後ts56ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にエレ
クトロポレーションによって導入する。非許容温度でMDBK細胞上にプラーク形成
させることによって、レスキューされたNPをコードするvRNAセグメントを有する
トランスフェクタントウイルスを選択する。
スキューのための逆遺伝学系を報告した。この系において、ヘルパーウイルスと
して温度感受性（ts）突然変異体ts56を使用する。前記（5）のようにin vivoで
RNA複合体を再構築し、その後ts56ヘルパーウイルスを感染させた細胞中にエレ
クトロポレーションによって導入する。非許容温度でMDBK細胞上にプラーク形成
させることによって、レスキューされたNPをコードするvRNAセグメントを有する
トランスフェクタントウイルスを選択する。
【００３２】 インフルエンザBウイルスレスキュー系 BarclayおよびPalese（44）は、インフルエンザBウイルスにおけるHA遺伝子の
レスキューについてもさらに記載している。
レスキューについてもさらに記載している。
【００３３】 別法として、Pleschkaら（45）が開発した発現ベクターに基づくインフルエン
ザ遺伝子レスキュー戦略を使用して、本発明の弱毒ウイルスの調製を達成するこ
とができる。上述のRNPトランスフェクション系とは対照的に、これはRNP複合体
のin vitro再構築のためには必要な、ウイルスNPおよびポリメラーゼタンパク質
の精製を必要としない。NPおよびPタンパク質、ならびに弱毒化塩基対突然変異
を組み込んでいる本発明のゲノムセグメントを提供する発現ベクターを、宿主細
胞中に共にトランスフェクトする。この場合、本発明のRNP複合体が細胞内に形
成される。次に細胞に前記のようにインフルエンザヘルパーウイルスを感染させ
て、必要な弱毒インフルエンザウイルスを選択することができる。
ザ遺伝子レスキュー戦略を使用して、本発明の弱毒ウイルスの調製を達成するこ
とができる。上述のRNPトランスフェクション系とは対照的に、これはRNP複合体
のin vitro再構築のためには必要な、ウイルスNPおよびポリメラーゼタンパク質
の精製を必要としない。NPおよびPタンパク質、ならびに弱毒化塩基対突然変異
を組み込んでいる本発明のゲノムセグメントを提供する発現ベクターを、宿主細
胞中に共にトランスフェクトする。この場合、本発明のRNP複合体が細胞内に形
成される。次に細胞に前記のようにインフルエンザヘルパーウイルスを感染させ
て、必要な弱毒インフルエンザウイルスを選択することができる。
【００３４】 宿主細胞中にさらに別の補足性RNA複合体をトランスフェクトすることによっ
て、本発明のRNA複合体を宿主細胞中で生存可能な弱毒ウイルス中にレスキュー
し、それによってヘルパーウイルスの必要性を排除することもできる。これは、
さらに最近になってEnami（46）によって記載されたインフルエンザウイルス遺
伝子のための一般的なレスキュー戦略にしたがって達成することができる。この
戦略には適切なインフルエンザウイルスからRNPを精製し、レスキューすべきイ
ンフルエンザウイルス遺伝子とハイブリダイズするcDNAの存在下でこのRNPをRNA
アーゼHでin vitro処理することを含む。この方法において、RNAアーゼHによる
その遺伝子の特異的消化が達成される。次に、この遺伝子枯渇RNPをその核酸セ
グメントを含有するRNP複合体とともに細胞中に同時トランスフェクトして、弱
毒化性の塩基対置換を提供する。次に細胞を寒天で被覆して、直接プラーク形成
によって、トランスフェクタント弱毒ウイルスを取得する。この戦略は、上記の
ヘルパーウイルスに基づく遺伝子レスキュー戦略とは異なって、任意のインフル
エンザウイルスからの任意のインフルエンザ遺伝子に適用することができる。し
たがって、これを任意のインフルエンザタイプの本発明の弱毒ウイルスまたは遺
伝子を取得するために適用することができる。
て、本発明のRNA複合体を宿主細胞中で生存可能な弱毒ウイルス中にレスキュー
し、それによってヘルパーウイルスの必要性を排除することもできる。これは、
さらに最近になってEnami（46）によって記載されたインフルエンザウイルス遺
伝子のための一般的なレスキュー戦略にしたがって達成することができる。この
戦略には適切なインフルエンザウイルスからRNPを精製し、レスキューすべきイ
ンフルエンザウイルス遺伝子とハイブリダイズするcDNAの存在下でこのRNPをRNA
アーゼHでin vitro処理することを含む。この方法において、RNAアーゼHによる
その遺伝子の特異的消化が達成される。次に、この遺伝子枯渇RNPをその核酸セ
グメントを含有するRNP複合体とともに細胞中に同時トランスフェクトして、弱
毒化性の塩基対置換を提供する。次に細胞を寒天で被覆して、直接プラーク形成
によって、トランスフェクタント弱毒ウイルスを取得する。この戦略は、上記の
ヘルパーウイルスに基づく遺伝子レスキュー戦略とは異なって、任意のインフル
エンザウイルスからの任意のインフルエンザ遺伝子に適用することができる。し
たがって、これを任意のインフルエンザタイプの本発明の弱毒ウイルスまたは遺
伝子を取得するために適用することができる。
【００３５】 塩基対の突然変異の復帰には２つの特異的突然変異を必要とするので、本発明
の弱毒インフルエンザウイルスは高度に安定であることが期待される（実施例12
を参照されたい）。したがって、こうしたウイルスはインフルエンザウイルスワ
クチンとしての使用にとって特に好都合であるといえる。
の弱毒インフルエンザウイルスは高度に安定であることが期待される（実施例12
を参照されたい）。したがって、こうしたウイルスはインフルエンザウイルスワ
クチンとしての使用にとって特に好都合であるといえる。
【００３６】 上に示したように、本発明のウイルスにさらに、標的細胞中で発現され得る異
種コード配列を付加的に含ませることができる。こうした異種コード配列は、病
原体に対する免疫応答（抗体応答または細胞仲介応答のいずれか）を刺激するこ
とができる抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードするものがよい。こうし
た病原体の代表的な例はウイルス、例えばその他のインフルエンザウイルスまた
はHIVなどの非インフルエンザウイルス、細菌、真菌類、寄生体（マラリア寄生
体等）、および癌細胞などの病原細胞である。
種コード配列を付加的に含ませることができる。こうした異種コード配列は、病
原体に対する免疫応答（抗体応答または細胞仲介応答のいずれか）を刺激するこ
とができる抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードするものがよい。こうし
た病原体の代表的な例はウイルス、例えばその他のインフルエンザウイルスまた
はHIVなどの非インフルエンザウイルス、細菌、真菌類、寄生体（マラリア寄生
体等）、および癌細胞などの病原細胞である。
【００３７】 したがって、さらに別の態様において、本発明は本発明のウイルスを含むワク
チンを提供する。特に好ましいのは弱毒インフルエンザウイルスが２種以上の病
原体、例えばインフルエンザウイルス１種およびインフルエンザウイルス以外の
第２の病原体に対して複合ワクチン剤として作用するようなワクチンである。こ
うしたワクチンをこの目的のために知られている方法にしたがって製剤化して投
与することができる。
チンを提供する。特に好ましいのは弱毒インフルエンザウイルスが２種以上の病
原体、例えばインフルエンザウイルス１種およびインフルエンザウイルス以外の
第２の病原体に対して複合ワクチン剤として作用するようなワクチンである。こ
うしたワクチンをこの目的のために知られている方法にしたがって製剤化して投
与することができる。
【００３８】 このように、また別の態様において、本発明はインフルエンザウイルス（例え
ばA型のインフルエンザウイルス）に対する免疫応答を、単独でまたは１以上の
別の病原体に対する免疫応答の刺激と同時に刺激する方法であって、免疫応答を
誘導する能力がある本発明の弱毒インフルエンザウイルスを免疫化モードで投与
することを含む方法を提供する。例えば、本発明の弱毒インフルエンザウイルス
での鼻腔内免疫化が好ましい。こうした免疫化は、Musterら（49）およびFerko
ら（53）によって報告されたHIVエピトープの１つを発現する組換えインフルエ
ンザウイルスによる免疫化研究によって説明されたようにして実施することがで
きる（実施例15も参照されたい）。好適な免疫化用量は、例えば103〜109 pfuの
範囲となり得る。初回免疫化に続いて、同一の機能的特性を有するが別のサブタ
イプまたはタイプのウイルスでの追加免疫を与えてもよい。
ばA型のインフルエンザウイルス）に対する免疫応答を、単独でまたは１以上の
別の病原体に対する免疫応答の刺激と同時に刺激する方法であって、免疫応答を
誘導する能力がある本発明の弱毒インフルエンザウイルスを免疫化モードで投与
することを含む方法を提供する。例えば、本発明の弱毒インフルエンザウイルス
での鼻腔内免疫化が好ましい。こうした免疫化は、Musterら（49）およびFerko
ら（53）によって報告されたHIVエピトープの１つを発現する組換えインフルエ
ンザウイルスによる免疫化研究によって説明されたようにして実施することがで
きる（実施例15も参照されたい）。好適な免疫化用量は、例えば103〜109 pfuの
範囲となり得る。初回免疫化に続いて、同一の機能的特性を有するが別のサブタ
イプまたはタイプのウイルスでの追加免疫を与えてもよい。
【００３９】 インフルエンザウイルス中に異種コード配列を組み込むための方法は、例えば
国際公開公報WO91/03552（Paleseら）に以前に記載されており、またMusterおよ
びGarcia-Sastreによる「Textbook of Influenza 1998」（56）中に総説もある
。異種コード配列は、弱毒化性の塩基対置換を組み込んだゲノムセグメント上ま
たは別のゲノムセグメント上にあってもよい。選択圧力(selection pressure)を
提供することは、１つのインフルエンザウイルスタンパク質のための遺伝子を同
様に組み込んだ別の核酸セグメントによって実施できる。例えば少なくとも９種
のvRNAセグメントを保有するインフルエンザウイルスを構築することができるこ
とが以前に報告されている（40）。
国際公開公報WO91/03552（Paleseら）に以前に記載されており、またMusterおよ
びGarcia-Sastreによる「Textbook of Influenza 1998」（56）中に総説もある
。異種コード配列は、弱毒化性の塩基対置換を組み込んだゲノムセグメント上ま
たは別のゲノムセグメント上にあってもよい。選択圧力(selection pressure)を
提供することは、１つのインフルエンザウイルスタンパク質のための遺伝子を同
様に組み込んだ別の核酸セグメントによって実施できる。例えば少なくとも９種
のvRNAセグメントを保有するインフルエンザウイルスを構築することができるこ
とが以前に報告されている（40）。
【００４０】 ワクチン接種目的での外来抗原を発現するためのベクターとしての本発明の弱
毒化組換えインフルエンザウイルスの使用は魅力的な治療戦略である。その理由
は以下の通りである。
毒化組換えインフルエンザウイルスの使用は魅力的な治療戦略である。その理由
は以下の通りである。
【００４１】 (i) 異なるサブタイプに対する抗体はほとんど交差反応性を示さない。ワク
チンとしてウイルスを使用する際の欠点の１つは、そのウイルスに対する免疫応
答がもたらされることである。初回免疫化後、同一の抗原を含む１回以上の追加
免疫を与えることが好ましい場合が多い。しかし、そのウイルスに対する免疫応
答が同一のウイルスでの逐次的免疫化の効力を低下させる。異なるインフルエン
ザサブタイプに対する抗体はほとんど交差反応性を示さないので、異なるサブタ
イプであるが同一の抗原を発現するインフルエンザウイルスでのその後の免疫化
はこの影響を克服するはずである。
チンとしてウイルスを使用する際の欠点の１つは、そのウイルスに対する免疫応
答がもたらされることである。初回免疫化後、同一の抗原を含む１回以上の追加
免疫を与えることが好ましい場合が多い。しかし、そのウイルスに対する免疫応
答が同一のウイルスでの逐次的免疫化の効力を低下させる。異なるインフルエン
ザサブタイプに対する抗体はほとんど交差反応性を示さないので、異なるサブタ
イプであるが同一の抗原を発現するインフルエンザウイルスでのその後の免疫化
はこの影響を克服するはずである。
【００４２】 (ii) インフルエンザウイルスは強い細胞性および体液性応答を誘導すること
が示されている。
が示されている。
【００４３】 (iii) インフルエンザウイルスは強い粘膜性応答を誘導することが示されて
いる。インフルエンザウイルスによる鼻腔内免疫化は生殖器および腸管粘膜にお
ける長期継続応答を誘導することが示されている。
いる。インフルエンザウイルスによる鼻腔内免疫化は生殖器および腸管粘膜にお
ける長期継続応答を誘導することが示されている。
【００４４】 (iv) インフルエンザウイルスは非組込性かつ非腫瘍形成性である。
【００４５】 (v) 上述したように、本発明の弱毒インフルエンザウイルスは弱毒性が安定
しているものと期待される。
しているものと期待される。
【００４６】 ワクチン接種の目的で、本発明の弱毒ウイルス中に、病原体の抗原または免疫
応答を刺激する能力があるそれらの改変体をコードする異種コード配列を配置す
ることができる。異種コード配列をウイルス遺伝子中にインサートして、親ウイ
ルスタンパク質の機能を保持している融合タンパク質を提供することができる。
外来抗原のインサート（エピトープの移植）に耐えることがすでに判明している
部位の１つはHAの抗原B部位である。その表面タンパク質の抗原部位Bはタンパク
質の先頭部に位置する露出ループ構造で構成されており、高度に免疫原性である
ことが知られている。HAタンパク質B部位にウイルスエピトープの１つをインサ
ートするための、インフルエンザウイルスHA遺伝子の操作が報告されている（49
中に報告されたMusterらの研究および48に報告されたLiらの報告を再度参照され
たい）。マラリア寄生体由来のB細胞エピトープを発現させるために、同一の戦
略がRodriguesらによって以前用いられている（50）。例えば抗原性ポリペプチ
ドに関する異種コード配列をインフルエンザウイルスNA遺伝子中にインサートす
るのも好ましい。インフルエンザウイルスタンパク質中へのエピトープ移植のた
めの戦略も以前、例えばWO91/03552に記載されている。
応答を刺激する能力があるそれらの改変体をコードする異種コード配列を配置す
ることができる。異種コード配列をウイルス遺伝子中にインサートして、親ウイ
ルスタンパク質の機能を保持している融合タンパク質を提供することができる。
外来抗原のインサート（エピトープの移植）に耐えることがすでに判明している
部位の１つはHAの抗原B部位である。その表面タンパク質の抗原部位Bはタンパク
質の先頭部に位置する露出ループ構造で構成されており、高度に免疫原性である
ことが知られている。HAタンパク質B部位にウイルスエピトープの１つをインサ
ートするための、インフルエンザウイルスHA遺伝子の操作が報告されている（49
中に報告されたMusterらの研究および48に報告されたLiらの報告を再度参照され
たい）。マラリア寄生体由来のB細胞エピトープを発現させるために、同一の戦
略がRodriguesらによって以前用いられている（50）。例えば抗原性ポリペプチ
ドに関する異種コード配列をインフルエンザウイルスNA遺伝子中にインサートす
るのも好ましい。インフルエンザウイルスタンパク質中へのエピトープ移植のた
めの戦略も以前、例えばWO91/03552に記載されている。
【００４７】 インフルエンザウイルスタンパク質中への外来配列のエピトープ移植の結果と
して非機能性キメラウイルスタンパク質となって、生育可能なトランスフェクタ
ントウイルスのレスキューが不可能になることがある。本発明の弱毒ウイルスに
応用し得る、組換えインフルエンザウイルスによる外来配列を発現させるための
別の戦略は、別のオープンリーディングフレームを含有する遺伝子セグメントの
遺伝子工学的操作に関与する。異種コード配列のための内部リボソームエントリ
ー部位を提供する組換えゲノムセグメントを構築し得る。この手法は、例えばGa
rcia-Sastreらによって、NAおよびHIVのgp41の両方の末端切断型をコードするイ
ンフルエンザウイルスvRNAセグメントを取得するために以前使用されている（9
）。あるいは、ウイルスタンパク質コード配列の１つに異種コード配列をフレー
ム内融合させて、自己タンパク質分解性プロテアーゼで切断することができるキ
メラポリタンパク質をコードするようにし、そのウイルスタンパク質および所望
の第２のポリペプチド（例えばウイルス抗原）を生成させることができる。この
戦略はPercyらによって、長さが200アミノ酸までの非インフルエンザタンパク質
を発現させるのに好適であることが示された（51）。
して非機能性キメラウイルスタンパク質となって、生育可能なトランスフェクタ
ントウイルスのレスキューが不可能になることがある。本発明の弱毒ウイルスに
応用し得る、組換えインフルエンザウイルスによる外来配列を発現させるための
別の戦略は、別のオープンリーディングフレームを含有する遺伝子セグメントの
遺伝子工学的操作に関与する。異種コード配列のための内部リボソームエントリ
ー部位を提供する組換えゲノムセグメントを構築し得る。この手法は、例えばGa
rcia-Sastreらによって、NAおよびHIVのgp41の両方の末端切断型をコードするイ
ンフルエンザウイルスvRNAセグメントを取得するために以前使用されている（9
）。あるいは、ウイルスタンパク質コード配列の１つに異種コード配列をフレー
ム内融合させて、自己タンパク質分解性プロテアーゼで切断することができるキ
メラポリタンパク質をコードするようにし、そのウイルスタンパク質および所望
の第２のポリペプチド（例えばウイルス抗原）を生成させることができる。この
戦略はPercyらによって、長さが200アミノ酸までの非インフルエンザタンパク質
を発現させるのに好適であることが示された（51）。
【００４８】 ワクチン接種の他に各種の治療目的のために、標的細胞中での異種コード配列
の発現のための運搬体として、本発明の組換え弱毒ウイルスを使用することがで
きることが理解されるであろう。こうした組換えウイルスは、例えば以下のいず
れかをコードするゲノムセグメントを有するものがよい。
の発現のための運搬体として、本発明の組換え弱毒ウイルスを使用することがで
きることが理解されるであろう。こうした組換えウイルスは、例えば以下のいず
れかをコードするゲノムセグメントを有するものがよい。
【００４９】 −インターフェロンまたはインターロイキンなどのサイトカイン、 −トキシン、 −病原体の機能を直接または間接的に阻害する能力がある緩和剤、例えばウ
イルスプロテアーゼインヒビター、 −細胞傷害性がほとんどまたは全くない化合物を細胞傷害性化合物に転換す
る能力がある酵素、例えばプリンおよびピリミジン類似体をリン酸化して活性毒
性形態にする能力がある、単純ヘルペスチミジンキナーゼなどのウイルス酵素、 −アンチセンス配列、 −リボザイム。
イルスプロテアーゼインヒビター、 −細胞傷害性がほとんどまたは全くない化合物を細胞傷害性化合物に転換す
る能力がある酵素、例えばプリンおよびピリミジン類似体をリン酸化して活性毒
性形態にする能力がある、単純ヘルペスチミジンキナーゼなどのウイルス酵素、 −アンチセンス配列、 −リボザイム。
【００５０】 外来エピトープを発現する本発明の弱毒ウイルスの提供に関連して、上述した
技法のいずれかによって、本発明の弱毒インフルエンザウイルス中に、こうした
物質をコードする配列を組み入れることができる。
技法のいずれかによって、本発明の弱毒インフルエンザウイルス中に、こうした
物質をコードする配列を組み入れることができる。
【００５１】 本発明の弱毒化組換えウイルス中の異種コード配列は組織特異的および／また
は作用特異的プロモーターの制御下に置くのがよい。本発明の組換えウイルスを
遺伝子治療法のために使用することができる。
は作用特異的プロモーターの制御下に置くのがよい。本発明の組換えウイルスを
遺伝子治療法のために使用することができる。
【００５２】 本発明の組換えウイルスを直接投与するか、または、後で患者に投与する細胞
にex vivoで感染させるのに使用できる。
にex vivoで感染させるのに使用できる。
【００５３】 このように、さらに別の態様において、本発明は、標的細胞への異種コード配
列の送達用の、本発明の組換えウイルスを製薬上許容される担体または希釈剤と
組み合わせて含む医薬組成物を提供する。また、本発明のウイルスの１つを感染
させたex vivo細胞（本発明の組換えインフルエンザウイルスを内蔵する細胞）
であって、製薬上許容される担体または希釈剤とともに投与用に製剤化したもの
も提供する。さらに別の態様において、本発明は異種コード配列を細胞に送達す
るための方法であって、この配列を保有する本発明の弱毒化組換えインフルエン
ザウイルスをこの細胞に感染させることを含む方法を提供する。
列の送達用の、本発明の組換えウイルスを製薬上許容される担体または希釈剤と
組み合わせて含む医薬組成物を提供する。また、本発明のウイルスの１つを感染
させたex vivo細胞（本発明の組換えインフルエンザウイルスを内蔵する細胞）
であって、製薬上許容される担体または希釈剤とともに投与用に製剤化したもの
も提供する。さらに別の態様において、本発明は異種コード配列を細胞に送達す
るための方法であって、この配列を保有する本発明の弱毒化組換えインフルエン
ザウイルスをこの細胞に感染させることを含む方法を提供する。
【００５４】 本発明のウイルスは、弱毒化突然変異によって影響を受けた遺伝子を置換し、
選択した細胞タイプ上での増殖が増加したウイルスを提供することができる、遺
伝子をレスキューするためのヘルパーウイルスとしての用途も見出だされ得る。
この目的のため、弱毒ウイルスは、１以上の細胞タイプ上で、対応する野生型ウ
イルスと比較して少なくとも約3-4 log、好ましくは少なくとも約5 logの増殖低
下を示すものを選択するのが好ましい。こうして、さらに別の実施形態において
、本発明は細胞中のインフルエンザウイルスゲノムの核酸セグメントをレスキュ
ーするためのヘルパーウイルスとしての本発明のウイルスの使用を提供するもの
であって、ここではこのセグメントを含有する製造されたウイルスは、選択され
たタイプの細胞上でヘルパーウイルスと比べて増大した増殖に基づいて選択され
る。例えば、そのNAコードvRNAの非コード二本鎖領域中に弱毒化性の塩基対置換
を有する本発明のインフルエンザAウイルスを有効に利用して、第２のインフル
エンザAウイルスに由来するNAをコードするvRNAまたはその機能性改変体をレス
キューすることができる。この目的のための典型的なプロトコルは以下のステッ
プを含む。
選択した細胞タイプ上での増殖が増加したウイルスを提供することができる、遺
伝子をレスキューするためのヘルパーウイルスとしての用途も見出だされ得る。
この目的のため、弱毒ウイルスは、１以上の細胞タイプ上で、対応する野生型ウ
イルスと比較して少なくとも約3-4 log、好ましくは少なくとも約5 logの増殖低
下を示すものを選択するのが好ましい。こうして、さらに別の実施形態において
、本発明は細胞中のインフルエンザウイルスゲノムの核酸セグメントをレスキュ
ーするためのヘルパーウイルスとしての本発明のウイルスの使用を提供するもの
であって、ここではこのセグメントを含有する製造されたウイルスは、選択され
たタイプの細胞上でヘルパーウイルスと比べて増大した増殖に基づいて選択され
る。例えば、そのNAコードvRNAの非コード二本鎖領域中に弱毒化性の塩基対置換
を有する本発明のインフルエンザAウイルスを有効に利用して、第２のインフル
エンザAウイルスに由来するNAをコードするvRNAまたはその機能性改変体をレス
キューすることができる。この目的のための典型的なプロトコルは以下のステッ
プを含む。
【００５５】 １．ヘルパーウイルスによる細胞の感染、 ２．ヘルパーウイルスに感染した細胞中への、レスキューすべき遺伝子を含有
するRNP複合体のトランスフェクション、および ３．ヘルパーウイルスが増大した弱毒化を示す同一の細胞型または別の細胞型
のいずれかでの、レスキューされたウイルスの選択。
するRNP複合体のトランスフェクション、および ３．ヘルパーウイルスが増大した弱毒化を示す同一の細胞型または別の細胞型
のいずれかでの、レスキューされたウイルスの選択。
【００５６】 ステップ３における細胞型は、トランスフェクトされた遺伝子を獲得したウイ
ルスのみが高力価まで増殖することが期待されるように選択される。
ルスのみが高力価まで増殖することが期待されるように選択される。
【００５７】 例えば、上記のインフルエンザA/WSN/33のD1/2突然変異体は別のA型インフル
エンザウイルス起源のNA遺伝子をレスキューするために使用するヘルパーウイル
スとして特に好適である。この場合、例えば、MDBK細胞に最初にこのD1/2ヘルパ
ーウイルスを感染させるのがよく、そして弱毒化突然変異がないvRNAを含有する
NA遺伝子を保有するウイルスの選択のためには、Vero細胞を使用するのが好まし
い。インフルエンザA/WSN/33に由来するD2突然変異体も同様に使用することがで
きる。
エンザウイルス起源のNA遺伝子をレスキューするために使用するヘルパーウイル
スとして特に好適である。この場合、例えば、MDBK細胞に最初にこのD1/2ヘルパ
ーウイルスを感染させるのがよく、そして弱毒化突然変異がないvRNAを含有する
NA遺伝子を保有するウイルスの選択のためには、Vero細胞を使用するのが好まし
い。インフルエンザA/WSN/33に由来するD2突然変異体も同様に使用することがで
きる。
【００５８】 インフルエンザA/WSN/33はその表面抗原NAに関連した神経毒性をマウスにおい
て示すことが知られている（54）。この理由によって、上記のようなこのウイル
スの弱毒化改変体は直接のワクチンとしての使用には好適ではないと考えられる
。しかし、例えば、上記のようにヘルパーウイルスとしてD1/2突然変異体を使用
することによって、部位特異的突然変異誘発のためのNA vRNAを取得して、例え
ばワクチンなどの治療用途のためにより好適な、本発明に従う別の弱毒インフル
エンザAウイルスを構築することができる。
て示すことが知られている（54）。この理由によって、上記のようなこのウイル
スの弱毒化改変体は直接のワクチンとしての使用には好適ではないと考えられる
。しかし、例えば、上記のようにヘルパーウイルスとしてD1/2突然変異体を使用
することによって、部位特異的突然変異誘発のためのNA vRNAを取得して、例え
ばワクチンなどの治療用途のためにより好適な、本発明に従う別の弱毒インフル
エンザAウイルスを構築することができる。
【００５９】 以下の実施例は本発明を説明するものである。
【００６０】実施例1 A型インフルエンザウイルスのNAコード化ウイルスＲＮＡの二本鎖領域中への突
然変異の導入 NAコード化ウイルスゲノムＲＮＡで5'および3'の非コード領域中に突然変異を
有するものを産生させるために、所望の突然変異を有している対応するｃＤＮＡ
を含むプラスミドを構築した。
然変異の導入 NAコード化ウイルスゲノムＲＮＡで5'および3'の非コード領域中に突然変異を
有するものを産生させるために、所望の突然変異を有している対応するｃＤＮＡ
を含むプラスミドを構築した。
【００６１】 位置特異的突然変異誘発のための出発プラスミドはpT3NAm1(図3参照)であり、
該プラスミドは前述のとおり、制限酵素切断部位EcoRI(2398の位置)とHind III(
3837の位置)の間に入れたpUC19クローニングベクターの骨格中に、一方の末端に
唯一のBbsI制限酵素切断部位(2404の位置)が隣接し、もう一方の末端にはバクテ
リオファージT3 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター(3821〜3836の位置)が隣接し
ている、インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA遺伝子の完全長ｃＤＮＡ(2412〜3
820の位置)を含有する(9)。プラスミドpT3NAm1中にNAコード化ｃＤＮＡインサー
トを調製するためのインフルエンザA/WSN/33のサンプルは、例えば、W.H.O. Col
laborating Centre, Division of Virology, National Institute for Medical
Research, 英国ロンドン、から入手しうる。
該プラスミドは前述のとおり、制限酵素切断部位EcoRI(2398の位置)とHind III(
3837の位置)の間に入れたpUC19クローニングベクターの骨格中に、一方の末端に
唯一のBbsI制限酵素切断部位(2404の位置)が隣接し、もう一方の末端にはバクテ
リオファージT3 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター(3821〜3836の位置)が隣接し
ている、インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA遺伝子の完全長ｃＤＮＡ(2412〜3
820の位置)を含有する(9)。プラスミドpT3NAm1中にNAコード化ｃＤＮＡインサー
トを調製するためのインフルエンザA/WSN/33のサンプルは、例えば、W.H.O. Col
laborating Centre, Division of Virology, National Institute for Medical
Research, 英国ロンドン、から入手しうる。
【００６２】 インフルエンザA/WSN/33の突然変異型のNAコード化ｖＲＮＡセグメントの転写
のためのＤＮＡ鋳型を構築するために用いることのできる別のプラスミドとして
は、pUC19由来のプラスミドpT3NAvがあり、その構築についてはWO91/03552(Pale
se, P.ら)に述べられている。プラスミドpT3NAvも、バクテリオファージT3ＲＮ
Ａポリメラーゼによって特異的に認識されるプロモーターおよび制限エンドヌク
レアーゼ開裂部位が隣接している、インフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の完全長
ｃＤＮＡを含んでいる。
のためのＤＮＡ鋳型を構築するために用いることのできる別のプラスミドとして
は、pUC19由来のプラスミドpT3NAvがあり、その構築についてはWO91/03552(Pale
se, P.ら)に述べられている。プラスミドpT3NAvも、バクテリオファージT3ＲＮ
Ａポリメラーゼによって特異的に認識されるプロモーターおよび制限エンドヌク
レアーゼ開裂部位が隣接している、インフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の完全長
ｃＤＮＡを含んでいる。
【００６３】 PCR産物は、鋳型としてのpT3NAm1および図1に示した突然変異をもたらすよう
に改変された下記のプライマーを用いて作製した： 5'-CGGAATTCGAAGACGCAGCAAAAGCAGGAGTTTAAATGAATCC-3'(プライマー1)および、
5'-CCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC-3'(プライマー2)(突
然変異を導入した残基には下線を付しており、例えば、D1突然変異ｃＤＮＡの構
築のためにはプライマー1および2の双方において下線を付した最初のAヌクレオ
チドをCヌクレオチドで置換した)。そのPCR産物をEcoRIおよびHindIII制限酵素
で消化し、同じ酵素で切断したpT3NAm1中にクローン化した。改変したプラスミ
ド中のNA遺伝子および隣接配列について自動配列決定機(Applied Biosystems)で
配列決定した。
に改変された下記のプライマーを用いて作製した： 5'-CGGAATTCGAAGACGCAGCAAAAGCAGGAGTTTAAATGAATCC-3'(プライマー1)および、
5'-CCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC-3'(プライマー2)(突
然変異を導入した残基には下線を付しており、例えば、D1突然変異ｃＤＮＡの構
築のためにはプライマー1および2の双方において下線を付した最初のAヌクレオ
チドをCヌクレオチドで置換した)。そのPCR産物をEcoRIおよびHindIII制限酵素
で消化し、同じ酵素で切断したpT3NAm1中にクローン化した。改変したプラスミ
ド中のNA遺伝子および隣接配列について自動配列決定機(Applied Biosystems)で
配列決定した。
【００６４】 インフルエンザA/WSN/33ウイルスのNA遺伝子中に下記の二重突然変異を導入し
た：U-A→G-C(10-11')(突然変異体D1)、C-G→A-U(11-12')(突然変異体D2)、およ
びC-G→U-A(12-13')(突然変異体D3)(図1)。さらに、対応する1個所の突然変異を
有する6個のNA遺伝子を構築した(U→G10、A→C11’、C→A11、G→U12'、C→U12
、およびG→A13’)。
た：U-A→G-C(10-11')(突然変異体D1)、C-G→A-U(11-12')(突然変異体D2)、およ
びC-G→U-A(12-13')(突然変異体D3)(図1)。さらに、対応する1個所の突然変異を
有する6個のNA遺伝子を構築した(U→G10、A→C11’、C→A11、G→U12'、C→U12
、およびG→A13’)。
【００６５】実施例2 リボ核タンパク質(RNP)複合体の産生およびトランスフェクション トランスフェクタントウイルスはEnamiとPalese(5)が述べている方法に従って
調製した。NA特異的RNP複合体をin vitroで再構成し、A/WSN-HK ヘルパーウイル
スを感染させてMDBK細胞中にトランスフェクトした(5)。
調製した。NA特異的RNP複合体をin vitroで再構成し、A/WSN-HK ヘルパーウイル
スを感染させてMDBK細胞中にトランスフェクトした(5)。
【００６６】 合成ＲＮＡはBbsI制限酵素で直鎖化した改変pT3NAm1プラスミドのT3ＲＮＡポ
リメラーゼによる転写によって得られた。ＲＮＡを、インフルエンザX-31ウイル
スから単離されたＲＮＡポリメラーゼおよびNPタンパク質を用いてRNP複合体に
再構成した。インフルエンザX-31ウイルスはインフルエンザA/HK/8/68およびA/P
R/8/34ウイルスを再分類したもの(reassortant)であり、Evans Biological, Ltd
., Liverpool, 英国から供給されたものである。RNP複合体は、10日令の胚形成
（embryonated)ニワトリ卵中で増殖させたWSN-HKヘルパーインフルエンザウイル
スを感染させたMDBK細胞中に、DEAE-デキストラントランスフェクション法でト
ランスフェクトした。そのMDBK細胞を補強最小必須培地中において増殖させた。
その後の実験では、インフルエンザA/WSN/33の野生型ウイルスも補強最小必須培
地中でMDBK細胞中で増殖させた。レスキューされたトランスフェクタントウイル
スはMDBK細胞中で3回プラーク精製した。その後の分析のためのストックウイル
スの調製には単一のプラークを用いた。
リメラーゼによる転写によって得られた。ＲＮＡを、インフルエンザX-31ウイル
スから単離されたＲＮＡポリメラーゼおよびNPタンパク質を用いてRNP複合体に
再構成した。インフルエンザX-31ウイルスはインフルエンザA/HK/8/68およびA/P
R/8/34ウイルスを再分類したもの(reassortant)であり、Evans Biological, Ltd
., Liverpool, 英国から供給されたものである。RNP複合体は、10日令の胚形成
（embryonated)ニワトリ卵中で増殖させたWSN-HKヘルパーインフルエンザウイル
スを感染させたMDBK細胞中に、DEAE-デキストラントランスフェクション法でト
ランスフェクトした。そのMDBK細胞を補強最小必須培地中において増殖させた。
その後の実験では、インフルエンザA/WSN/33の野生型ウイルスも補強最小必須培
地中でMDBK細胞中で増殖させた。レスキューされたトランスフェクタントウイル
スはMDBK細胞中で3回プラーク精製した。その後の分析のためのストックウイル
スの調製には単一のプラークを用いた。
【００６７】実施例3 トランスフェクタントウイルスのNA遺伝子の配列決定 トランスフェクタント中の突然変異の存在をNA遺伝子の3'および5'末端配列の
配列決定で確認した。配列決定用のウイルスＲＮＡは、30%のスクロースクッシ
ョンを通過させた遠心によって精製したトランスフェクタントウイルスから、フ
ェノール-クロロホルム抽出により単離した。いくつかの場合では感染した細胞
からRNAzol B(Tel-Test, Inc., Friendswood, 米国テキサス州)を用いて単離し
た総ＲＮＡを用いた。5'末端の配列は直接的ＲＮＡ配列決定または5' RACEのい
ずれかによって得た。5'末端の直接的配列決定は、インフルエンザA/WSN/33のNA
遺伝子のヌクレオチド1280〜1299の位置のもの(5'-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3')と
相補的なプライマーおよびＲＮＡ配列決定キット(United States Biochemical C
orporation, Cleveland, 米国オハイオ州)を製造者の使用説明書に従って用いて
行った。5' RACEには、ウイルスＲＮＡはインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の
ヌクレオチド879〜898の位置のもの(5'-GGGTGTCCTTCGACCAAAAC-3')と相補的なプ
ライマーを用いて逆転写させた。その逆転写産物を末端デオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ(TdT)(Gibco BRL, Gaithersburg, 米国メリーランド州)で伸
長し、直接的ＲＮＡ配列決定用として用いたプライマー(上記参照)および5' RAC
E 短縮アンカープライマー(Gibco BRL)を用いてPCRで増幅した。SpeI制限酵素で
切断されたPCR産物をpUC18のXbaI部位中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定キット
(United Stats Biochemical)で配列決定した。トランスフェクタントウイルスの
NA遺伝子の3'末端の配列を調べるために、ウイルスＲＮＡをポリ(A)ポリメラー
ゼ(Gibco BRL)を用いて、3'-ポリアデニル酸を付加した。ポリアデニル酸付加さ
れたＲＮＡをプライマー5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTTTTTTTTTT-3'を用いて逆転写
し、ｃＤＮＡをインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の115〜98の位置に対応する
ヌクレオチド(5'-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3')を含むプライマーおよび逆
転写に用いられたプライマーを用いてPCRで増幅した。HindIIIで消化したPCR産
物をpUC18中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定キットで配列決定した。
配列決定で確認した。配列決定用のウイルスＲＮＡは、30%のスクロースクッシ
ョンを通過させた遠心によって精製したトランスフェクタントウイルスから、フ
ェノール-クロロホルム抽出により単離した。いくつかの場合では感染した細胞
からRNAzol B(Tel-Test, Inc., Friendswood, 米国テキサス州)を用いて単離し
た総ＲＮＡを用いた。5'末端の配列は直接的ＲＮＡ配列決定または5' RACEのい
ずれかによって得た。5'末端の直接的配列決定は、インフルエンザA/WSN/33のNA
遺伝子のヌクレオチド1280〜1299の位置のもの(5'-TGGACTAGTGGGAGCATCAT-3')と
相補的なプライマーおよびＲＮＡ配列決定キット(United States Biochemical C
orporation, Cleveland, 米国オハイオ州)を製造者の使用説明書に従って用いて
行った。5' RACEには、ウイルスＲＮＡはインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の
ヌクレオチド879〜898の位置のもの(5'-GGGTGTCCTTCGACCAAAAC-3')と相補的なプ
ライマーを用いて逆転写させた。その逆転写産物を末端デオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ(TdT)(Gibco BRL, Gaithersburg, 米国メリーランド州)で伸
長し、直接的ＲＮＡ配列決定用として用いたプライマー(上記参照)および5' RAC
E 短縮アンカープライマー(Gibco BRL)を用いてPCRで増幅した。SpeI制限酵素で
切断されたPCR産物をpUC18のXbaI部位中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定キット
(United Stats Biochemical)で配列決定した。トランスフェクタントウイルスの
NA遺伝子の3'末端の配列を調べるために、ウイルスＲＮＡをポリ(A)ポリメラー
ゼ(Gibco BRL)を用いて、3'-ポリアデニル酸を付加した。ポリアデニル酸付加さ
れたＲＮＡをプライマー5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTTTTTTTTTT-3'を用いて逆転写
し、ｃＤＮＡをインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子の115〜98の位置に対応する
ヌクレオチド(5'-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3')を含むプライマーおよび逆
転写に用いられたプライマーを用いてPCRで増幅した。HindIIIで消化したPCR産
物をpUC18中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定キットで配列決定した。
【００６８】 二重突然変異を有する3種のNA遺伝子全てのトランスフェクションによって、
トランスフェクタントウイルス(D1、D2、およびD3)がレスキューされた。他方、
単一突然変異構築物では6つのうちの3つがレスキューされたのみであり、それら
は10、11'、および13'の位置に突然変異のあるものであった(図1)。3回の試行に
おいて、他の3つの構築物(11、12、および12'の位置に突然変異がある)はいずれ
もレスキューされなかった。
トランスフェクタントウイルス(D1、D2、およびD3)がレスキューされた。他方、
単一突然変異構築物では6つのうちの3つがレスキューされたのみであり、それら
は10、11'、および13'の位置に突然変異のあるものであった(図1)。3回の試行に
おいて、他の3つの構築物(11、12、および12'の位置に突然変異がある)はいずれ
もレスキューされなかった。
【００６９】 10および11'の位置に突然変異のある2つの単一突然変異トランスフェクタント
の突然変異の確認は、それらが不安定なためより困難であった。具体的には、U
→G10突然変異体のNA ウイルスＲＮＡの3'末端のクローニングによって、突然変
異のある1種のクローンと野生型配列の2種のクローンが得られた。精製A→C11'
トランスフェクタント由来のNA特異的ｖＲＮＡを、プラークからプラークへの継
代を3回行った後、その5'末端について直接的ＲＮＡ配列決定を行ったところ野
生型配列であった。しかし、このトランスフェクタントのもとのプラークを用い
て感染させたMDBK細胞から得たNA特異的ｖＲＮＡを配列決定すると、突然変異の
存在が確認された。従って、このトランスフェクタントはプラーク精製ステップ
の間に野生型に復帰した可能性が高いと考えられる。この解釈は、そのトランス
フェクタントが最初は小さなプラークを作るが継代を経るにつれて大きなプラー
クを示したという観察結果によって支持される。これらを総合すると、単一突然
変異体の配列データは、単一の突然変異を有するトランスフェクタントウイルス
、少なくとも10および11'の位置に突然変異のある突然変異体は、不安定である
ことを示している。
の突然変異の確認は、それらが不安定なためより困難であった。具体的には、U
→G10突然変異体のNA ウイルスＲＮＡの3'末端のクローニングによって、突然変
異のある1種のクローンと野生型配列の2種のクローンが得られた。精製A→C11'
トランスフェクタント由来のNA特異的ｖＲＮＡを、プラークからプラークへの継
代を3回行った後、その5'末端について直接的ＲＮＡ配列決定を行ったところ野
生型配列であった。しかし、このトランスフェクタントのもとのプラークを用い
て感染させたMDBK細胞から得たNA特異的ｖＲＮＡを配列決定すると、突然変異の
存在が確認された。従って、このトランスフェクタントはプラーク精製ステップ
の間に野生型に復帰した可能性が高いと考えられる。この解釈は、そのトランス
フェクタントが最初は小さなプラークを作るが継代を経るにつれて大きなプラー
クを示したという観察結果によって支持される。これらを総合すると、単一突然
変異体の配列データは、単一の突然変異を有するトランスフェクタントウイルス
、少なくとも10および11'の位置に突然変異のある突然変異体は、不安定である
ことを示している。
【００７０】実施例4 D1、D2、D1/2、およびD3突然変異体の増殖特性 D1、D2、およびD3をMDBK細胞で増殖させた。MDBK細胞のコンフルエントな単層
を低m.o.i.(0.01)で感染させ、培地中に放出された感染性ウイルスの量をMDBK細
胞上でのプラークアッセイを用いて、異なる時点においてアッセイした(図2)。D
2トランスフェクタントウイルスは野生型に比べるとプラーク力価で約1 logの低
減が示された。しかしD1およびD3トランスフェクタントウイルスは突然変異によ
っては顕著な影響を受けなかった。このことと一致して、D2のプラークサイズは
縮小したが、D1およびD3ウイルスの双方とも野生型と同様のプラークサイズを示
した。
を低m.o.i.(0.01)で感染させ、培地中に放出された感染性ウイルスの量をMDBK細
胞上でのプラークアッセイを用いて、異なる時点においてアッセイした(図2)。D
2トランスフェクタントウイルスは野生型に比べるとプラーク力価で約1 logの低
減が示された。しかしD1およびD3トランスフェクタントウイルスは突然変異によ
っては顕著な影響を受けなかった。このことと一致して、D2のプラークサイズは
縮小したが、D1およびD3ウイルスの双方とも野生型と同様のプラークサイズを示
した。
【００７１】 NA特異的ｖＲＮＡ中に複数の二重突然変異を有する突然変異インフルエンザA/
WSN/33の増殖特性も調べた。D1およびD2トランスフェクタント双方からの二重突
然変異を組み入れている構築物を首尾よくレスキューし(D1/2)(図1)、感染性の
ウイルスとした。D1/2トランスフェクタントをプラーク精製法で3回精製し、突
然変異の存在は配列決定することによって確認した。このウイルスはMDBK細胞上
でのプラーク力価(図2)およびプラークサイズにおいてD2トランスフェクタント
と類似の低減を示した。ウイルス増殖に対してのD1/2突然変異の影響はMDCK及び
Vero細胞ではより劇的であり、プラーク力価において少なくとも3〜4 logの低減
が認められた(下記の実施例10および12を参照)。
WSN/33の増殖特性も調べた。D1およびD2トランスフェクタント双方からの二重突
然変異を組み入れている構築物を首尾よくレスキューし(D1/2)(図1)、感染性の
ウイルスとした。D1/2トランスフェクタントをプラーク精製法で3回精製し、突
然変異の存在は配列決定することによって確認した。このウイルスはMDBK細胞上
でのプラーク力価(図2)およびプラークサイズにおいてD2トランスフェクタント
と類似の低減を示した。ウイルス増殖に対してのD1/2突然変異の影響はMDCK及び
Vero細胞ではより劇的であり、プラーク力価において少なくとも3〜4 logの低減
が認められた(下記の実施例10および12を参照)。
【００７２】実施例5 トランスフェクタントウイルス中でのNAレベルの測定 これらのウイルスによって発現されるNAのレベルを、それが増殖レベルと対応
するか否かを調べるために測定した。インフルエンザA/WSN/33およびトランスフ
ェクタントウイルスをMDBK細胞中で増殖させ、30%〜60%のスクロース濃度勾配の
超遠心で精製した。約10μgのウイルスタンパク質を0.5%SDSおよび1% β-メルカ
プトエタノールで100℃で10分間変性させ、50mM リン酸ナトリウム pH7.5、1% N
P40、および5mMのPefabloc(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis,
米国インディアナ州)を含有する反応バッファー中400uのPNGase F(New England
Biolabs, Inc., Beverly, 米国マサチューセッツ州)で37℃で20時間消化した。P
NGase Fによる処理でNAおよびHAから窒素に結合している炭水化物鎖が除去され
る。これによって、ゲル上でNPおよびHAの近傍に移動するNAバンドの分離が良く
なる。タンパク質は12% SDS-PAGEで分析し、クーマシーブリリアントブルーで染
色した。
するか否かを調べるために測定した。インフルエンザA/WSN/33およびトランスフ
ェクタントウイルスをMDBK細胞中で増殖させ、30%〜60%のスクロース濃度勾配の
超遠心で精製した。約10μgのウイルスタンパク質を0.5%SDSおよび1% β-メルカ
プトエタノールで100℃で10分間変性させ、50mM リン酸ナトリウム pH7.5、1% N
P40、および5mMのPefabloc(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis,
米国インディアナ州)を含有する反応バッファー中400uのPNGase F(New England
Biolabs, Inc., Beverly, 米国マサチューセッツ州)で37℃で20時間消化した。P
NGase Fによる処理でNAおよびHAから窒素に結合している炭水化物鎖が除去され
る。これによって、ゲル上でNPおよびHAの近傍に移動するNAバンドの分離が良く
なる。タンパク質は12% SDS-PAGEで分析し、クーマシーブリリアントブルーで染
色した。
【００７３】 D2およびD1/2のどちらのウイルス粒子も野生型、またはD1およびD3トランスフ
ェクタントと比べNA含量の劇的な低減が認められた。
ェクタントと比べNA含量の劇的な低減が認められた。
【００７４】 D2およびD1/2ウイルスのNAレベルを定量するためにノイラミニダーゼ活性を測
定した。精製ウイルスから得たタンパク質の約2μg、0.5μg、0.125μg、および
0.031μg(4倍希釈)を、総量100μL中に150mMリン酸バッファー pH6.0、1mM CaCl ２ 、および基質として50ナノモルの2'-(4-メチルウンベリフェリル)-α-D-N-ア
セチルノイラミン酸(MU-NANA)含有の液中で、37℃で10分間インキュベートした(
27)。次いで停止バッファー(0.5Mグリシン/NaOH、pH10.4)を2ml添加し、放出さ
れた4-メチルウンベリフェロンを分光蛍光法で測定した。0.1mMの4-メチルウン
ベリフェロン溶液を標準対照として用いた。NA活性は1μgのウイルスタンパク質
あたり1分間に放出される4-メチルウンベリフェロンのナノモル数として表現し
た。
定した。精製ウイルスから得たタンパク質の約2μg、0.5μg、0.125μg、および
0.031μg(4倍希釈)を、総量100μL中に150mMリン酸バッファー pH6.0、1mM CaCl ２ 、および基質として50ナノモルの2'-(4-メチルウンベリフェリル)-α-D-N-ア
セチルノイラミン酸(MU-NANA)含有の液中で、37℃で10分間インキュベートした(
27)。次いで停止バッファー(0.5Mグリシン/NaOH、pH10.4)を2ml添加し、放出さ
れた4-メチルウンベリフェロンを分光蛍光法で測定した。0.1mMの4-メチルウン
ベリフェロン溶液を標準対照として用いた。NA活性は1μgのウイルスタンパク質
あたり1分間に放出される4-メチルウンベリフェロンのナノモル数として表現し
た。
【００７５】 野生型ウイルスでのNA活性は2.18 ナノモル/min/μgであった。しかし、トラ
ンスフェクタントウイルスD2およびD1/2はそれぞれ0.24および0.25 ナノモル/mi
n/μgの活性を示すにすぎなかった。このように、トランスフェクタントウイル
スは野生型に比べると約1/10に低減したNA活性を示し、このことはSDS-PAGEで観
察されたNAレベルの低減と一致している。
ンスフェクタントウイルスD2およびD1/2はそれぞれ0.24および0.25 ナノモル/mi
n/μgの活性を示すにすぎなかった。このように、トランスフェクタントウイル
スは野生型に比べると約1/10に低減したNA活性を示し、このことはSDS-PAGEで観
察されたNAレベルの低減と一致している。
【００７６】実施例6 精製トランスフェクタントウイルス中のNA特異的ｖＲＮＡレベル 30%のスクロースクッションを通して精製した野生型ウイルスおよびトランス
フェクタントウイルス由来のウイルスＲＮＡをフェノール/クロロホルムで抽出
した。野生型ウイルスおよびトランスフェクタントウイルスから精製したウイル
スＲＮＡをPAGEで分析し、ＲＮＡセグメントを銀染色で可視化した。NAセグメン
トは全てのトランスフェクタントウイルスにおいて野生型ウイルスと同等のレベ
ルで存在した。NA特異的ｖＲＮＡレベルを定量するために、精製ウイルスから抽
出したｖＲＮＡを用いてプライマー伸長分析を行った。
フェクタントウイルス由来のウイルスＲＮＡをフェノール/クロロホルムで抽出
した。野生型ウイルスおよびトランスフェクタントウイルスから精製したウイル
スＲＮＡをPAGEで分析し、ＲＮＡセグメントを銀染色で可視化した。NAセグメン
トは全てのトランスフェクタントウイルスにおいて野生型ウイルスと同等のレベ
ルで存在した。NA特異的ｖＲＮＡレベルを定量するために、精製ウイルスから抽
出したｖＲＮＡを用いてプライマー伸長分析を行った。
【００７７】 NAおよびNS ｖＲＮＡレベルのプライマー伸長分析は既に報告されているとお
り行った(2)。簡潔に記せば、100ngのウイルスＲＮＡを3 x 10５cpmの３２P-標
識NA特異的およびNS特異的プライマーの存在下で、200uのSuperScript(Gibco BR
L)を用いて42℃で１時間かけて転写した。NA特異的プライマー 5'-GTGGCAATAACT
AATCGGTCA-3' はNA ｖＲＮＡのヌクレオチド1151〜1171と相補的なものである
。NS特異的プライマー 5'-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3'はNS ｖＲＮＡのヌクレオ
チド695〜715の位置に相補的なものである。プライマー伸長反応は、当量の90%
ホルムアミドおよび10mM EDTAを添加し、95℃で3分間加熱することによって停止
させた。伸長産物を7M尿素の存在下で5%ポリアクリルアミドゲルで分析し、乾燥
させたゲルのphosphorimager分析で定量した(Molecular Dynamics)。
り行った(2)。簡潔に記せば、100ngのウイルスＲＮＡを3 x 10５cpmの３２P-標
識NA特異的およびNS特異的プライマーの存在下で、200uのSuperScript(Gibco BR
L)を用いて42℃で１時間かけて転写した。NA特異的プライマー 5'-GTGGCAATAACT
AATCGGTCA-3' はNA ｖＲＮＡのヌクレオチド1151〜1171と相補的なものである
。NS特異的プライマー 5'-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3'はNS ｖＲＮＡのヌクレオ
チド695〜715の位置に相補的なものである。プライマー伸長反応は、当量の90%
ホルムアミドおよび10mM EDTAを添加し、95℃で3分間加熱することによって停止
させた。伸長産物を7M尿素の存在下で5%ポリアクリルアミドゲルで分析し、乾燥
させたゲルのphosphorimager分析で定量した(Molecular Dynamics)。
【００７８】 NS遺伝子を内部対照として用いた。2回の実験で、トランスフェクタントウイ
ルス中のNA特異的ｖＲＮＡセグメントの量は、野生型ウイルスと同様(±20%)で
あった。
ルス中のNA特異的ｖＲＮＡセグメントの量は、野生型ウイルスと同様(±20%)で
あった。
【００７９】実施例7 D2またはD1/2トランスフェクタントウイルスを感染させた細胞中のNA特異的ｖＲ ＮＡレベル MDBK細胞に野生型またはトランスフェクタントウイルスをm.o.i.を2として感
染させ、感染後3.0、5.5、8.0、および10.5時間後にRNAzolB(Tel-Test)を用いて
細胞からＲＮＡを単離した。総ＲＮＡ中のNA特異的ｖＲＮＡのレベルを上述の実
施例6に記載のプライマー伸長アッセイ法において総ＲＮＡを5μg用いて測定し
た。D2トランスフェクタントウイルスに感染させた細胞は野生型ウイルスで感染
させた細胞と同様の(±10%)NA特異的ｖＲＮＡレベルを示した。D1/2を感染させ
た細胞ではNA特異的ｖＲＮＡレベルの28%〜53%の低減(この結果は感染の5.5、8.
0、および10.5時間後にphosphorimager分析の2回の実験で得られたもの)が認め
られたとはいえ、この低減はNAタンパク質レベルの1/10への減少を説明できない
。
染させ、感染後3.0、5.5、8.0、および10.5時間後にRNAzolB(Tel-Test)を用いて
細胞からＲＮＡを単離した。総ＲＮＡ中のNA特異的ｖＲＮＡのレベルを上述の実
施例6に記載のプライマー伸長アッセイ法において総ＲＮＡを5μg用いて測定し
た。D2トランスフェクタントウイルスに感染させた細胞は野生型ウイルスで感染
させた細胞と同様の(±10%)NA特異的ｖＲＮＡレベルを示した。D1/2を感染させ
た細胞ではNA特異的ｖＲＮＡレベルの28%〜53%の低減(この結果は感染の5.5、8.
0、および10.5時間後にphosphorimager分析の2回の実験で得られたもの)が認め
られたとはいえ、この低減はNAタンパク質レベルの1/10への減少を説明できない
。
【００８０】実施例8 D2またはD1/2トランスフェクタントウイルスで感染させた細胞中のNA特異的ｍＲ ＮＡおよびｃＲＮＡのレベル D2およびD1/2トランスフェクタントウイルスにおける突然変異によっては、NA
特異的ｖＲＮＡレベルは劇的な影響は受けなかったので、NAレベルの1/10への低
減(上記参照)はｍＲＮＡレベルにおける低減および/または翻訳の欠陥によりも
たらされたという可能性がある。これらの可能性を見分けるために、D2またはD1
/2トランスフェクタントウイルスを感染させた細胞中のNA特異的ｍＲＮＡの量を
プライマー伸長アッセイを用いて調べた。MDBK細胞に野生型ウイルスまたはトラ
ンスフェクタントウイルスをm.o.i. 2で感染させ、感染後3.0、4.5、6.0、およ
び7.5時間後に総ＲＮＡを単離した。
特異的ｖＲＮＡレベルは劇的な影響は受けなかったので、NAレベルの1/10への低
減(上記参照)はｍＲＮＡレベルにおける低減および/または翻訳の欠陥によりも
たらされたという可能性がある。これらの可能性を見分けるために、D2またはD1
/2トランスフェクタントウイルスを感染させた細胞中のNA特異的ｍＲＮＡの量を
プライマー伸長アッセイを用いて調べた。MDBK細胞に野生型ウイルスまたはトラ
ンスフェクタントウイルスをm.o.i. 2で感染させ、感染後3.0、4.5、6.0、およ
び7.5時間後に総ＲＮＡを単離した。
【００８１】 感染細胞から得た総ＲＮＡ中のNAおよびHAのｍＲＮＡおよびｃＲＮＡレベルの
プライマー伸長分析を、実施例6に記載の条件と同じ条件で行った。NA特異的ｍ
ＲＮＡおよびｃＲＮＡのためのプライマー、5-GCGCAAGCTT TATTGAGATTATATTTCC-
3'はNA遺伝子の115〜98の位置に対応する18個のヌクレオチド(下線部)を含んで
いる。HA特異的ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡの伸長のためのプライマー、5'-CATATTG
TGTCTGCATCTGTAGCT-3'は、HA遺伝子の94〜71の位置に対応している。
プライマー伸長分析を、実施例6に記載の条件と同じ条件で行った。NA特異的ｍ
ＲＮＡおよびｃＲＮＡのためのプライマー、5-GCGCAAGCTT TATTGAGATTATATTTCC-
3'はNA遺伝子の115〜98の位置に対応する18個のヌクレオチド(下線部)を含んで
いる。HA特異的ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡの伸長のためのプライマー、5'-CATATTG
TGTCTGCATCTGTAGCT-3'は、HA遺伝子の94〜71の位置に対応している。
【００８２】 感染細胞から得た総ＲＮＡ中にはｍＲＮＡおよびｃＲＮＡの双方ともが含まれ
ており、その2つは末端が異なっているにすぎないので、この2種類のＲＮＡのシ
グナルは同じプライマー伸長アッセイにおいて現れることが予想された。ｍＲＮ
Ａ分子の5'末端に10〜15個のヌクレオチド長さのキャップを有する異種プライマ
ーが存在することによって、ゲル上のｍＲＮＡのシグナルは異なるサイズのＤＮ
Ａ種を含んでいる1本の多重バンドとして現われる。他方、ｃＲＮＡのシグナル
は単一のバンドとして現われ、それはｍＲＮＡのシグナルよりも約10〜15ヌクレ
オチドほど短い。
ており、その2つは末端が異なっているにすぎないので、この2種類のＲＮＡのシ
グナルは同じプライマー伸長アッセイにおいて現れることが予想された。ｍＲＮ
Ａ分子の5'末端に10〜15個のヌクレオチド長さのキャップを有する異種プライマ
ーが存在することによって、ゲル上のｍＲＮＡのシグナルは異なるサイズのＤＮ
Ａ種を含んでいる1本の多重バンドとして現われる。他方、ｃＲＮＡのシグナル
は単一のバンドとして現われ、それはｍＲＮＡのシグナルよりも約10〜15ヌクレ
オチドほど短い。
【００８３】 D2またはD1/2トランスフェクタントウイルスのいずれかで感染させた細胞中の
NA特異的ｍＲＮＡレベルは、検出限界以下であった。NA特異的ｃＲＮＡレベルは
これらのトランスフェクタントウイルスにおいては明らかに影響を受けていなか
った。NA特異的ｃＲＮＡバンドよりわずかに速く泳動する別のバンドが全サンプ
ルで検出されたが、これは非感染細胞から抽出したＲＮＡでも検出されているの
で、非特異的シグナルを示す。
NA特異的ｍＲＮＡレベルは、検出限界以下であった。NA特異的ｃＲＮＡレベルは
これらのトランスフェクタントウイルスにおいては明らかに影響を受けていなか
った。NA特異的ｃＲＮＡバンドよりわずかに速く泳動する別のバンドが全サンプ
ルで検出されたが、これは非感染細胞から抽出したＲＮＡでも検出されているの
で、非特異的シグナルを示す。
【００８４】 ここで観察された、D2トランスフェクタントを感染させた細胞におけるNA特異
的ｍＲＮＡレベルの減弱は、以前にKimら(14)によって報告された所見、すなわ
ちｖＲＮＡ様CATレポーター遺伝子におけるA-U(11-12')塩基対突然変異は、野生
型の対照と比較するとわずか22%のレポーター活性しかもたらさないとの所見と
一致している。しかし、G-C(10-11')およびU-A(12-13')塩基対の突然変異は、D1
およびD3トランスフェクタントのノイラミニダーゼの発現レベルには影響を及ぼ
さないが、CATレポーター遺伝子系ではそれぞれわずか20%および31%の活性しか
示さない(14)。従って、CATレポーター遺伝子系での塩基対突然変異とｖＲＮＡ
セグメントを含有する天然のNA遺伝子のレスキューとが異なる効果を持つことは
明らかである。
的ｍＲＮＡレベルの減弱は、以前にKimら(14)によって報告された所見、すなわ
ちｖＲＮＡ様CATレポーター遺伝子におけるA-U(11-12')塩基対突然変異は、野生
型の対照と比較するとわずか22%のレポーター活性しかもたらさないとの所見と
一致している。しかし、G-C(10-11')およびU-A(12-13')塩基対の突然変異は、D1
およびD3トランスフェクタントのノイラミニダーゼの発現レベルには影響を及ぼ
さないが、CATレポーター遺伝子系ではそれぞれわずか20%および31%の活性しか
示さない(14)。従って、CATレポーター遺伝子系での塩基対突然変異とｖＲＮＡ
セグメントを含有する天然のNA遺伝子のレスキューとが異なる効果を持つことは
明らかである。
【００８５】実施例9 NA特異的リボ核タンパク質複合体のin vitroでの転写 理論的には、上記で観察されたｍＲＮＡレベルの低減はｍＲＮＡの安定性の低
下またはｍＲＮＡ合成の低下に起因するはずであった。ｍＲＮＡの合成の妨害が
開始の時点で起こりうる。例えば、キャップを付されたＲＮＡプライマーの結合
、またはエンドヌクレアーゼ活性が阻害されうる。あるいはまた、ウイルスｍＲ
ＮＡの終止反応またはポリアデニル酸付加が影響されうる。これら全ての可能性
を見分けるためにin vitro転写アッセイを行った。
下またはｍＲＮＡ合成の低下に起因するはずであった。ｍＲＮＡの合成の妨害が
開始の時点で起こりうる。例えば、キャップを付されたＲＮＡプライマーの結合
、またはエンドヌクレアーゼ活性が阻害されうる。あるいはまた、ウイルスｍＲ
ＮＡの終止反応またはポリアデニル酸付加が影響されうる。これら全ての可能性
を見分けるためにin vitro転写アッセイを行った。
【００８６】 野生型インフルエンザA/WSN/33ウイルス、D2、およびD1/2トランスフェクタン
トをMDBK細胞中で増殖させ、30%スクロースクッション上で精製した。各ウイル
スについて15cmの皿を12個用いた。精製したウイルスは200μLのPBS中に再懸濁
し、50μLの5x 破壊バッファー(500mM Tris-HCl [pH7.4]、 500mM NaCl、 25mM
MgCl２、5mM DTT、25% グリセロール、2.5% NP-40、2.5% Triton X-100、50mg/m
L リゾレシチン)を添加して37℃で30分間インキュベーションすることによって
破壊させた。破壊させたウイルスを、100mM Tris-HCl[pH7.4]、100mM NaCl、5mM
MgCl２、および1mM DTT中の不連続なグリセロール濃度勾配(70%、50%、および3
0%、各150μL)で遠心することによって分画化した。その濃度勾配液を0.8mL遠心
管中で、Beckman SW55ローターにアダプターをつけて15℃で4時間、45,000rpmで
遠心した。遠心管の底部から集めた画分を12% SDS-PAGEで分析し、RNPに富んだ
画分を転写アッセイに用いた。
トをMDBK細胞中で増殖させ、30%スクロースクッション上で精製した。各ウイル
スについて15cmの皿を12個用いた。精製したウイルスは200μLのPBS中に再懸濁
し、50μLの5x 破壊バッファー(500mM Tris-HCl [pH7.4]、 500mM NaCl、 25mM
MgCl２、5mM DTT、25% グリセロール、2.5% NP-40、2.5% Triton X-100、50mg/m
L リゾレシチン)を添加して37℃で30分間インキュベーションすることによって
破壊させた。破壊させたウイルスを、100mM Tris-HCl[pH7.4]、100mM NaCl、5mM
MgCl２、および1mM DTT中の不連続なグリセロール濃度勾配(70%、50%、および3
0%、各150μL)で遠心することによって分画化した。その濃度勾配液を0.8mL遠心
管中で、Beckman SW55ローターにアダプターをつけて15℃で4時間、45,000rpmで
遠心した。遠心管の底部から集めた画分を12% SDS-PAGEで分析し、RNPに富んだ
画分を転写アッセイに用いた。
【００８７】 in vitro転写活性は、グロビンｍＲＮＡをプライマーとして用いて測定した。
転写反応は、50mM Tris-HCl(pH7.8)、50μM KCl、10mM NaCl、5mM MgCl２、5mM
DTT、1mM ATP、GTPおよびCTPを各0.5mM、50μM UTP、0.1μM [α-３２P]UTP(3
,000 Ci/mmol)、20uのRNase阻害剤(Boehringer Mannheim Corporation, Indiana
polis, 米国インディアナ州)、0.6μgのウサギグロビンｍＲＮＡ(Gibco BRL)を
含有する反応液の総量20μL中に6μLのRNPを含有する液を用いて行った。31℃で
1.5時間インキュベーションした後、転写産物をフェノール/クロロホルムで抽出
し、5μgのキャリア酵母ＲＮＡの存在下で沈殿させた。
転写反応は、50mM Tris-HCl(pH7.8)、50μM KCl、10mM NaCl、5mM MgCl２、5mM
DTT、1mM ATP、GTPおよびCTPを各0.5mM、50μM UTP、0.1μM [α-３２P]UTP(3
,000 Ci/mmol)、20uのRNase阻害剤(Boehringer Mannheim Corporation, Indiana
polis, 米国インディアナ州)、0.6μgのウサギグロビンｍＲＮＡ(Gibco BRL)を
含有する反応液の総量20μL中に6μLのRNPを含有する液を用いて行った。31℃で
1.5時間インキュベーションした後、転写産物をフェノール/クロロホルムで抽出
し、5μgのキャリア酵母ＲＮＡの存在下で沈殿させた。
【００８８】 NA特異的転写産物は野生型およびトランスフェクタントRNPの双方から合成し
た。しかし、バンドのパターンには顕著な相異があった。野生型NA特異的転写産
物はサイズの異なるポリ(A)テイルを有するＲＮＡ種に対応する広いバンドとし
て現れた。他方、D2およびD1/2トランスフェクタントの双方のNA特異的転写産物
によるバンドは拡散のより少ないものであり、このことはこれらの産物がポリア
デニル酸付加されていない可能性を意味している。転写産物の特徴を調べるため
に、これらをオリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーで分析した。
た。しかし、バンドのパターンには顕著な相異があった。野生型NA特異的転写産
物はサイズの異なるポリ(A)テイルを有するＲＮＡ種に対応する広いバンドとし
て現れた。他方、D2およびD1/2トランスフェクタントの双方のNA特異的転写産物
によるバンドは拡散のより少ないものであり、このことはこれらの産物がポリア
デニル酸付加されていない可能性を意味している。転写産物の特徴を調べるため
に、これらをオリゴ(dT)セルロースクロマトグラフィーで分析した。
【００８９】 ポリ(A)含有分子を枯渇させた画分は、D2およびD1/2トランスフェクタントで
はより高レベルのNA特異的転写産物を示したが、野生型の対照ではより低いレベ
ルであった。他方、ポリ(A)含有分子に富んだ画分では、D2およびD1/2トランス
フェクタントではNA特異的転写産物はより低いレベルを示したが、野生型ウイル
スではより高いレベルであった。このことはポリ(A)テイルを欠くD2およびD1/2
トランスフェクタントのNA特異的転写産物が大きな比率を占めることを確証する
ものと考えられる。
はより高レベルのNA特異的転写産物を示したが、野生型の対照ではより低いレベ
ルであった。他方、ポリ(A)含有分子に富んだ画分では、D2およびD1/2トランス
フェクタントではNA特異的転写産物はより低いレベルを示したが、野生型ウイル
スではより高いレベルであった。このことはポリ(A)テイルを欠くD2およびD1/2
トランスフェクタントのNA特異的転写産物が大きな比率を占めることを確証する
ものと考えられる。
【００９０】 このような結果から、D2およびD1/2のNA特異的ｖＲＮＡ中の突然変異がｍＲＮ
Ａ転写物のポリアデニル酸付加を妨害するものと考えられる。ポリアデニル酸付
加されていないキャップされた転写物は細胞中で最も急速に分解され易いので(3
0)、これらのウイルスによる感染をうけた細胞中でｍＲＮＡの低レベルが観察さ
れたことはこの結論と全く一致するものである。
Ａ転写物のポリアデニル酸付加を妨害するものと考えられる。ポリアデニル酸付
加されていないキャップされた転写物は細胞中で最も急速に分解され易いので(3
0)、これらのウイルスによる感染をうけた細胞中でｍＲＮＡの低レベルが観察さ
れたことはこの結論と全く一致するものである。
【００９１】実施例10 MDCK細胞でのトランスフェクタントウイルスの増殖 96ウエルのプレート中のMDCK細胞を、野生型インフルエンザA/WSN/33ウイルス
、もしくはトランスフェクタントD1、D2、D3、およびD1/2ウイルスの5x10４ pfu
および10倍希釈で感染させた。各ウイルスに4つのウエルを用いた。感染させた
細胞は、10% ウシ血清アルブミン、および1μg/mLのトリプシンを補給した100μ
Lのダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で維持した。72時間後に、50μLの培地を取
り50μLの1.5%赤血球液を用いて赤血球凝集反応を調べ、各ウイルスについてID
５０値を算出した。ID５０値は感染細胞の培地の50%が陽性の赤血球凝集シグナ
ルを示す投与量として定義される。野生型ウイルスとD1トランスフェクタントの
ID５０は5 pfuであった。他方、D3トランスフェクタントのID５０は20倍高かっ
た。D2およびD1/2トランスフェクタントのID５０は野生型またはD1トランスフェ
クタントより約3000倍高かった。
、もしくはトランスフェクタントD1、D2、D3、およびD1/2ウイルスの5x10４ pfu
および10倍希釈で感染させた。各ウイルスに4つのウエルを用いた。感染させた
細胞は、10% ウシ血清アルブミン、および1μg/mLのトリプシンを補給した100μ
Lのダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で維持した。72時間後に、50μLの培地を取
り50μLの1.5%赤血球液を用いて赤血球凝集反応を調べ、各ウイルスについてID
５０値を算出した。ID５０値は感染細胞の培地の50%が陽性の赤血球凝集シグナ
ルを示す投与量として定義される。野生型ウイルスとD1トランスフェクタントの
ID５０は5 pfuであった。他方、D3トランスフェクタントのID５０は20倍高かっ
た。D2およびD1/2トランスフェクタントのID５０は野生型またはD1トランスフェ
クタントより約3000倍高かった。
【００９２】実施例11 Vero細胞でのD1/2トランスフェクタントの増殖 35mmの皿に入れたコンフルエントなVero細胞に、野生型A/WSN/33ウイルスまた
はD1/2トランスフェクタントをm.o.i.を0.01として2度感染させた。細胞は2% FB
Sを補給したDMEM中で72時間保持し、培地中に存在するウイルスをMDBK細胞上で
のプラークアッセイによって滴定した。感染性ウイルスは、野生型ウイルスでは
5x10７ pfu/mLに達したが、D1/2トランスフェクタントを感染させた細胞の培地
中では5x10２ pfu/mL未満であった。
はD1/2トランスフェクタントをm.o.i.を0.01として2度感染させた。細胞は2% FB
Sを補給したDMEM中で72時間保持し、培地中に存在するウイルスをMDBK細胞上で
のプラークアッセイによって滴定した。感染性ウイルスは、野生型ウイルスでは
5x10７ pfu/mLに達したが、D1/2トランスフェクタントを感染させた細胞の培地
中では5x10２ pfu/mL未満であった。
【００９３】 これらを総合して考慮すると、実施例4、10および11のデータは塩基対突然変
異がインフルエンザAウイルスのｖＲＮＡのプロモーターの二本鎖領域にあると
、組織培養におけるインフルエンザウイルスの増殖の低下につながりうることを
示している。上述のとおり、D2およびD1/2トランスフェクタントウイルスはMDBK
細胞中で約1 log低い増殖を示したのに対して、D1およびD3ウイルスは野生型と
同様に増殖した。D2およびD1/2ウイルスのMDCKおよびVero細胞での増殖ではより
劇的な増殖の低下が観察された。興味深いことに、D3トランスフェクタントは野
生型に比べMDCK細胞において増殖の低下を示した。D2およびD1/2トランスフェク
タントは双方ともMDCK細胞で約4 logの増殖の低下を示し、D1/2トランスフェク
タントはVero細胞で5 logの増殖低下を示した。このような結果はD2およびD1/2
突然変異を有するインフルエンザAウイルスがin vivoで効果的な弱毒化を示すで
あろうことを示唆している。
異がインフルエンザAウイルスのｖＲＮＡのプロモーターの二本鎖領域にあると
、組織培養におけるインフルエンザウイルスの増殖の低下につながりうることを
示している。上述のとおり、D2およびD1/2トランスフェクタントウイルスはMDBK
細胞中で約1 log低い増殖を示したのに対して、D1およびD3ウイルスは野生型と
同様に増殖した。D2およびD1/2ウイルスのMDCKおよびVero細胞での増殖ではより
劇的な増殖の低下が観察された。興味深いことに、D3トランスフェクタントは野
生型に比べMDCK細胞において増殖の低下を示した。D2およびD1/2トランスフェク
タントは双方ともMDCK細胞で約4 logの増殖の低下を示し、D1/2トランスフェク
タントはVero細胞で5 logの増殖低下を示した。このような結果はD2およびD1/2
突然変異を有するインフルエンザAウイルスがin vivoで効果的な弱毒化を示すで
あろうことを示唆している。
【００９４】実施例12 トランスフェクタントウイルスの継代とD1、D2、およびD3突然変異の安定性の測 定のための配列決定 二重突然変異のあることが確認されたD1、D2、およびD3トランスフェクタント
ウイルスのストックをMDBK細胞上でプラークを作らせ、個々のプラークを低m.o.
i.でMDBK細胞で10回の継代を行った。10回の継代の後、ウイルスのプラークを作
らせ、単一のプラークを配列決定のためのウイルスストックを調製するために用
いた。継代を経たウイルスのストックを30%スクロースクッションを通して精製
し、ウイルスＲＮＡをフェノール-クロロホルム抽出で単離した。NA遺伝子の3'
末端の配列決定するために、ポリ(A)ポリメラーゼ(Gibco BRL, Gaithersburg,
米国メリーランド州)を用いてウイルスＲＮＡの3'末端にポリアデニル酸を付加
した。ポリアデニル酸付加したＲＮＡを、プライマー5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTT
TTTTTTTT-3'を用いて逆転写し、ｃＤＮＡをインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子
の115〜98(5'-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3')の位置に対応するヌクレオチ
ドを含有するプライマーおよび逆転写に用いたプライマーを用いてPCRで増幅し
た。HindIIIで消化したPCR産物をpUC18中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定キッ
ト(United States Biochemical, Corporation, Cleveland, 米国オハイオ州)で
配列決定した。
ウイルスのストックをMDBK細胞上でプラークを作らせ、個々のプラークを低m.o.
i.でMDBK細胞で10回の継代を行った。10回の継代の後、ウイルスのプラークを作
らせ、単一のプラークを配列決定のためのウイルスストックを調製するために用
いた。継代を経たウイルスのストックを30%スクロースクッションを通して精製
し、ウイルスＲＮＡをフェノール-クロロホルム抽出で単離した。NA遺伝子の3'
末端の配列決定するために、ポリ(A)ポリメラーゼ(Gibco BRL, Gaithersburg,
米国メリーランド州)を用いてウイルスＲＮＡの3'末端にポリアデニル酸を付加
した。ポリアデニル酸付加したＲＮＡを、プライマー5'-GCGCAAGCTTCTAGATTTTTT
TTTTTTTT-3'を用いて逆転写し、ｃＤＮＡをインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子
の115〜98(5'-GCGCAAGCTTTATTGAGATTATATTTCC-3')の位置に対応するヌクレオチ
ドを含有するプライマーおよび逆転写に用いたプライマーを用いてPCRで増幅し
た。HindIIIで消化したPCR産物をpUC18中にクローン化し、ＤＮＡ配列決定キッ
ト(United States Biochemical, Corporation, Cleveland, 米国オハイオ州)で
配列決定した。
【００９５】 D1トランスフェクタントの3個の個々に継代したプラークに由来する3つのクロ
ーンはU→G10突然変異の存在を示した。D2トランスフェクタントの5個の個々に
継代したプラークから得たクローンは全て予期していたC→A11突然変異を有して
いた。さらに、それらのクローンのうちの2つは4の位置にU→C変化が認められた
が、これは別のインフルエンザAウイルス単離体にも観察される天然の変異であ
る。また、それらのクローンのうちの2つのクローンには、NAの2番目のアミノ酸
をアスパラギンからアスパラギン酸に変える、ノイラミニダーゼの開始コドンに
近接した23の位置におけるU→C突然変異が認められた。D3トランスフェクタント
から得られたクローンのうちC→U12突然変異を示したものは2つのクローンのみ
であった。第3のクローンは野生型配列を有しておりこれはこの塩基対突然変異
が安定ではない可能性を示している。A→G13'の逆行はU-G(12-13')塩基対を有す
る生存可能なウイルスをもたらし、それは次いでU→C12の変化によって野生型の
C-G(12-13')塩基対に復帰しうる。異なる残基の存在により、このような逆突然
変異は調査した他の２つの塩基対においては起こりえない。
ーンはU→G10突然変異の存在を示した。D2トランスフェクタントの5個の個々に
継代したプラークから得たクローンは全て予期していたC→A11突然変異を有して
いた。さらに、それらのクローンのうちの2つは4の位置にU→C変化が認められた
が、これは別のインフルエンザAウイルス単離体にも観察される天然の変異であ
る。また、それらのクローンのうちの2つのクローンには、NAの2番目のアミノ酸
をアスパラギンからアスパラギン酸に変える、ノイラミニダーゼの開始コドンに
近接した23の位置におけるU→C突然変異が認められた。D3トランスフェクタント
から得られたクローンのうちC→U12突然変異を示したものは2つのクローンのみ
であった。第3のクローンは野生型配列を有しておりこれはこの塩基対突然変異
が安定ではない可能性を示している。A→G13'の逆行はU-G(12-13')塩基対を有す
る生存可能なウイルスをもたらし、それは次いでU→C12の変化によって野生型の
C-G(12-13')塩基対に復帰しうる。異なる残基の存在により、このような逆突然
変異は調査した他の２つの塩基対においては起こりえない。
【００９６】 要約すれば、D1およびD2トランスフェクタントの3'末端における突然変異は10
回の継代の間保存された。予備的データでは継代を経たトランスフェクタントウ
イルスのNAセグメントの5'末端にも突然変異の存在が確認された。野生型配列へ
復帰するためには2つの特異的突然変異が同時に起こらねばならないので、二重
突然変異を有するトランスフェクタントウイルスは安定なはずであると仮定する
ことができる。C→A11またはG→U12'の単一突然変異を有するトランスフェクタ
ントウイルスはいかなるものもレスキューできるということは証明されず、この
ことはこのようなウイルスが高度に傷つけられているかもしくは全く生存できな
い可能性を示唆している。
回の継代の間保存された。予備的データでは継代を経たトランスフェクタントウ
イルスのNAセグメントの5'末端にも突然変異の存在が確認された。野生型配列へ
復帰するためには2つの特異的突然変異が同時に起こらねばならないので、二重
突然変異を有するトランスフェクタントウイルスは安定なはずであると仮定する
ことができる。C→A11またはG→U12'の単一突然変異を有するトランスフェクタ
ントウイルスはいかなるものもレスキューできるということは証明されず、この
ことはこのようなウイルスが高度に傷つけられているかもしくは全く生存できな
い可能性を示唆している。
【００９７】実施例13 マウスにおけるD2およびD1/2ウイルスの弱毒化 インフルエンザA/WSN/33野生型ウイルスおよびトランスフェクタントウイルス
D1、D2、D3およびD1/2を補強最小必須培地中でMadin-Darbyウシ腎(MDBK)細胞中
で37℃で増殖させた。プラークアッセイはMDBK細胞上で行った。
D1、D2、D3およびD1/2を補強最小必須培地中でMadin-Darbyウシ腎(MDBK)細胞中
で37℃で増殖させた。プラークアッセイはMDBK細胞上で行った。
【００９８】 6〜12週令の雌のBALB/cマウス5匹を1群としてインフルエンザウイルス感染に
用いた。マウスへの鼻腔内(i.n.)接種をエーテル麻酔下で10６、3x10４、または
10３プラーク形成ユニット(pfu)のD1、D2、D3、またはD1/2ウイルスを含有する5
0μLのPBSを用いて行った。対照として、野生型インフルエンザA/WSN/33ウイル
スを同じpfuでマウスに感染させた。このウイルスをEnamiとPalese(4)によって
既に報告されているとおり、野生型NA遺伝子のリボ核タンパク質トランスフェク
ションによってレスキューした。マウスは連日モニターし、臨終状態が観察され
た場合には屠殺した。全ての操作はNIHの実験動物のケアと使用に関するガイド
ラインに従って行った。結果は図4〜9に示す。
用いた。マウスへの鼻腔内(i.n.)接種をエーテル麻酔下で10６、3x10４、または
10３プラーク形成ユニット(pfu)のD1、D2、D3、またはD1/2ウイルスを含有する5
0μLのPBSを用いて行った。対照として、野生型インフルエンザA/WSN/33ウイル
スを同じpfuでマウスに感染させた。このウイルスをEnamiとPalese(4)によって
既に報告されているとおり、野生型NA遺伝子のリボ核タンパク質トランスフェク
ションによってレスキューした。マウスは連日モニターし、臨終状態が観察され
た場合には屠殺した。全ての操作はNIHの実験動物のケアと使用に関するガイド
ラインに従って行った。結果は図4〜9に示す。
【００９９】 野生型ウイルスを感染させたマウスは全て疾病の徴候が出現し、感染の15日後
までに死亡した。しかし、D2またはD1/2ウイルスを感染させたマウスはずべて生
存した。D2またはD1/2ウイルスの感染をうけた動物のうち、高投与量のウイルス
(10６pfu)で感染させたもののみで体重の減少がみられた：それらでは感染の3日
後までに体重の10〜20%の減少が見られたが、その後急速に回復した。これらの
実験ではD1ウイルスの病原性は野生型ウイルスの病原性と区別し得ない。D3ウイ
ルスはマウスでわずかに弱毒化された表現型を示した。
までに死亡した。しかし、D2またはD1/2ウイルスを感染させたマウスはずべて生
存した。D2またはD1/2ウイルスの感染をうけた動物のうち、高投与量のウイルス
(10６pfu)で感染させたもののみで体重の減少がみられた：それらでは感染の3日
後までに体重の10〜20%の減少が見られたが、その後急速に回復した。これらの
実験ではD1ウイルスの病原性は野生型ウイルスの病原性と区別し得ない。D3ウイ
ルスはマウスでわずかに弱毒化された表現型を示した。
【０１００】実施例14 マウス肺におけるD2およびD1/2ウイルスの複製の損傷 1群6匹のBALB/cマウスを10３pfuの野生型、D1、D2、D3、またはD1/2ウイルス
を用いて上述のとおり鼻腔内に感染させた。感染の3日後に1群あたり3匹を屠殺
し、肺を摘出し2mLのPBS中でホモゲナイズし、ウイルス力価をMDBK細胞中でのプ
ラークアッセイによって測定した。感染の6日後、残りのマウスも屠殺し、同じ
プロトコールでそれらの肺でのウイルス力価を測定した。結果は図10に示す。
を用いて上述のとおり鼻腔内に感染させた。感染の3日後に1群あたり3匹を屠殺
し、肺を摘出し2mLのPBS中でホモゲナイズし、ウイルス力価をMDBK細胞中でのプ
ラークアッセイによって測定した。感染の6日後、残りのマウスも屠殺し、同じ
プロトコールでそれらの肺でのウイルス力価を測定した。結果は図10に示す。
【０１０１】 野生型およびD1ウイルスは、感染マウスの肺で高い力価を示す程度まで増殖し
た(それぞれ感染後3および6日目に約10６および10７pfu/mL)。D3ウイルスを感染
させたマウスの肺での力価は約1.5 log低かった。これに対して、D2またはD1/2
を感染させたマウスの肺でウイルス力価は検出できなかったかあるいは非常に低
かった(10３pfu/mL未満)。この結果はD2およびD1/2ウイルスの複製がマウスの肺
では高度に損なわれていることを示している。
た(それぞれ感染後3および6日目に約10６および10７pfu/mL)。D3ウイルスを感染
させたマウスの肺での力価は約1.5 log低かった。これに対して、D2またはD1/2
を感染させたマウスの肺でウイルス力価は検出できなかったかあるいは非常に低
かった(10３pfu/mL未満)。この結果はD2およびD1/2ウイルスの複製がマウスの肺
では高度に損なわれていることを示している。
【０１０２】実施例15 D2およびD1/2ウイルスによる感染防御免疫の誘導 上述のとおりD2またはD1/2で鼻腔内感染させ生存したマウスの群から感染3週
間後に血清を採取しプールした。BurnetとStone(55)が既に報告しているとおり
に、血清を受容体破壊酵素(Sigma)で処理してインフルエンザウイルス媒介赤血
球凝集反応の非特異的阻害剤を除去した。赤血球凝集阻害(HI)力価はHA力価が8
のインフルエンザA/WSN/33ウイルス調製品の赤血球凝集活性を中和することので
きる最も高い血清希釈度で測定した。これらのアッセイでは0.5%のニワトリ赤血
球を用いた。
間後に血清を採取しプールした。BurnetとStone(55)が既に報告しているとおり
に、血清を受容体破壊酵素(Sigma)で処理してインフルエンザウイルス媒介赤血
球凝集反応の非特異的阻害剤を除去した。赤血球凝集阻害(HI)力価はHA力価が8
のインフルエンザA/WSN/33ウイルス調製品の赤血球凝集活性を中和することので
きる最も高い血清希釈度で測定した。これらのアッセイでは0.5%のニワトリ赤血
球を用いた。
【０１０３】 試験に供した血清のプール全てがHI活性を有するインフルエンザA/WSN/33ウイ
ルスに対する抗体を含むことが認められた。HI力価は高いウイルス投与量で免疫
された動物ではより高かった(下記の表1参照)。
ルスに対する抗体を含むことが認められた。HI力価は高いウイルス投与量で免疫
された動物ではより高かった(下記の表1参照)。
【０１０４】 さらに、D2またはD1/2ウイルスを鼻腔内で感染させたマウスは全て、野生型の
A/WSN/33ウイルスを致死的感染投与量(1000 LD５０を超える量)でチャレンジし
た場合に、死亡および疾病に対して防御されている(体重の減少の程度で見た場
合)ことが観察された(表1ならびに図11および12を参照せよ)。
A/WSN/33ウイルスを致死的感染投与量(1000 LD５０を超える量)でチャレンジし
た場合に、死亡および疾病に対して防御されている(体重の減少の程度で見た場
合)ことが観察された(表1ならびに図11および12を参照せよ)。
【０１０５】 表1 D2およびD1/2ウイルスで免疫したマウスにおける 野生型インフルエンザウイルス感染に対する防御 実施例16 NA遺伝子をレスキューするためのヘルパーウイルスとしてのD1/2トランスフェク タントウイルスの使用 上述のとおり、D1/2トランスフェクタントウイルスのVero細胞での増殖は野生
型インフルエンザA/WSN/33に比べ約5 logの低減を示した。従ってインフルエン
ザAウイルスのNAコード化ｖＲＮＡセグメントのレスキューのための別のレスキ
ューシステムを提供するためにこのウイルスを用いることができる。このための
適切なプロトコールは次のステップからなる。
型インフルエンザA/WSN/33に比べ約5 logの低減を示した。従ってインフルエン
ザAウイルスのNAコード化ｖＲＮＡセグメントのレスキューのための別のレスキ
ューシステムを提供するためにこのウイルスを用いることができる。このための
適切なプロトコールは次のステップからなる。
【０１０６】 1. D1/2ヘルパーウイルスのMDBK細胞への感染 2. DEAE-デキストラン/DMSOトランスフェクション試薬での感染MDBK細胞の 処理 3. D1/2ヘルパーウイルスを感染させDEAE-デキストラン/DMSOで処理したMDBK
細胞への合成NAリボ核タンパク質複合体のトランスフェクション、 ならびに 4. Vero細胞上でのレスキューされたウイルスの選択。
細胞への合成NAリボ核タンパク質複合体のトランスフェクション、 ならびに 4. Vero細胞上でのレスキューされたウイルスの選択。
【０１０７】 トランスフェクションされたNA遺伝子を獲得したウイルスのみがVero細胞上で高
力価となるまで増殖する。
力価となるまで増殖する。
【０１０８】参照文献 1. Muster, T. Subbarao, E.K., Enami, M., Murphy, B.R.およびPalese, P. 19
91.「インフルエンザBウイルスの5’および3’非コード領域をノイラミニダーゼ
遺伝子上に含むインフルエンザAウイルスはマウス中で弱毒化されている(An inf
luenza A virus containing influenza B virus 5' and 3’ non-coding region
s on the neuraminidase gene is attenuated in mice.)」Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 88, 5177-5181. 2. Luo, G., Bergmann, M., Garcia-Sastre, A.およびPalese, P. 1992.「キメ
ラインフルエンザA/Bトランスフェクタントウイルスの弱毒化機構(Mechanism of
attenuation of a chimeric influenza A/B transfectant virus.)」 J. Virol
. 66, 4679-4685. 3. Bergmann, M.およびMuster, T. 1995.「ウイルス粒子中に存在するインフル
エンザAウイルスセグメントの相対的な量は、そのセグメントの複製低下によっ
ては影響を受けない(The relative amount of an influenza A virus segment p
resent in the viral particle is not affected by a reduction in replicati
on of that segment.)」 J. Gen. Virol. 76, 3211-3215. 4. Enami, M., W. Luytjes, M. KrystalおよびP. Palese. 1990.「インフルエン
ザウイルスのゲノムへの、部位特異的突然変異の導入(Introduction of site sp
ecific mutations into the genome of influenza virus.)」Proc. Nati. Acad.
Sci. USA 87:3802-3805. 5. Enami, M.およびP. Palese. 1991.「インフルエンザウイルストランスフェク
タントの高効率での形成(High-efficiency formation of influenza virus tran
sfectants.)」J. Virol. 65: 2711-2713. 6. Flick, R., G. Neumann, E. Hoffmann, E. Neumeierおよび G. Hobom. 1996.
「インフルエンザvRNA末端構造中のプロモーターエレメント(Promoter element
s in the influenza vRNA terminal structure.)」 RNA 2: 1046-1057. 7. Fodor, E., D. C. PritloveおよびG. G. Brownlee. 1994.「インフルエンザ
ウイルスのパンハンドルは転写の開始に関与する(The influenza virus panhand
le is involved in the initiation of transcription.)」 J. Virol. 68: 4092
-4096. 8. Fodor, E., D. C. PritloveおよびG. G. Brownlee. 1995.「インフルエンザA
ウイルスの転写開始におけるビリオンRNAのRNAフォークモデルの特性決定(Chara
cterization of the RNA-fork model of virion RNA in the initiation of tra
nscription in influenza A virus.)」 J. Virol. 69: 4012-4019. 9. Garcia-Sastre, A., T. Muster, W. S. Barclay, N. PercyおよびP. Palese.
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internal ribosomal entry site element for expression of a foreign protei
n by a transfectant influenza virus.)」 J. Virol. 68: 6254-6261. 10. Gubareva, L. V., R. Bethell, G. J. Hart, K. G. Murti, C. R. Pennおよ
びR. G. Webster. 1996.「ノイラミニダーゼ阻害剤である4-グアニジノ-Neu5Ac2
enにより選択されたインフルエンザAウイルス突然変異体の特性決定(Characteri
zation of mutants of influenza A virus selected with the neuraminidase i
nhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en.)」J. Virol. 70: 1818-1827. 11. Hagen, M., T. D. Y. Chung, J. A. ButcherおよびM. Krystal. 1994. 「組
換体インフルエンザウイルスポリメラーゼ：5’および3’ウイルス末端双方の、
エンドヌクレアーゼ活性のための必要性(Recombinant influenza virus polymer
ase: requirement of both 5’ and 3’ viral ends for endonuclease activit
y.)」 J. Virol. 68: 1509-1515. 12. Honda, A.およびA. Ishihama. 1997.「インフルエンザウイルスRNAポリメラ
ーゼの分子解剖学(The molecular anatomy of influenza virus RNA polymerase
.)」 Biol. Chem. 378: 483-488. 13. Hsu, M., J. D. Parvin, S. Gupta, M. KrystalおよびP. Palese. 1987.「
インフルエンザウイルスのゲノムRNAは、末端パンハンドルによってウイルス粒
子中および感染細胞中で環状コンホメーションを保持する(Genomic RNAs of inf
luenza vinises are held in a circular conformation in virions and in inf
ected cells by a terminal panhandle.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8
140-8144. 14. Kim, H-J., E. Fodor, G. G. BrownleeおよびB. L. Seong. 1997. 「インフ
ルエンザAウイルスのvRNAプロモーターのRNAフォークモデルのin vivo突然変異
分析(Mutational analysis of the RNA-fork model of the influenza A virus
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に必要とされるプロモーターの突然変異解析(Mutational analysis of the prom
oter required for influenza virus virion RNA synthesis.)」 J. Virol. 66:
4331-4338. 17. Li, X.およびP. Palese. 1994.「インフルエンザウイルスRNAのポリアデニ
ル化シグナルの特性決定(Characterization of the polyadenylation signal of
influenza virus RNA.)」J. Virol. 68: 1245-1249. 18. Luo, G., W. Luytjes, M. EnamiおよびP. Palese. 1991.「インフルエンザ
ウイルスRNAのポリアデニル化シグナルは、パンハンドル構造のRNA二本鎖が後に
続いているウリジンのストレッチを必要とする(The polyadenylation signal of
influenza virus RNA involves a stretch of uridines followed by the RNA
duplex of the panhandle structure.)」 J. Virol. 65: 2861-2867. 19. Luytjes, W., M. Krystal, M. Enami, J. D. ParvinおよびP. Palese. 1989
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感染細胞から精製されたウイルスタンパク質を使用する活性インフルエンザウイ
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に活性なインフルエンザコアタンパク質の合成(Synthesis of biologically act
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エレメントのin vivo突然変異分析(Mutational analysis of influenza virus p
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フルエンザAウイルス相補性RNAの末端のin vitro転写およびポリメラーゼ結合に
関する研究：cRNAパンハンドルに関する証拠(In vitro transcription and poly
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リメラーゼおよびRNAを再構成するための新規方法：in vitroでのcRNAおよびvRN
A合成のためのプロモーターエレメント、およびin vivoでのウイルスレスキュー
の研究(A new method for reconstituting influenza polymerase and RNA in v
itro: A study of the promoter elements for cRNA and vRNA synthesis in vi
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attenuation of a chimeric influenza A/B transfectant virus.)」 J. Virol
. 66, 4679-4685. 3. Bergmann, M.およびMuster, T. 1995.「ウイルス粒子中に存在するインフル
エンザAウイルスセグメントの相対的な量は、そのセグメントの複製低下によっ
ては影響を受けない(The relative amount of an influenza A virus segment p
resent in the viral particle is not affected by a reduction in replicati
on of that segment.)」 J. Gen. Virol. 76, 3211-3215. 4. Enami, M., W. Luytjes, M. KrystalおよびP. Palese. 1990.「インフルエン
ザウイルスのゲノムへの、部位特異的突然変異の導入(Introduction of site sp
ecific mutations into the genome of influenza virus.)」Proc. Nati. Acad.
Sci. USA 87:3802-3805. 5. Enami, M.およびP. Palese. 1991.「インフルエンザウイルストランスフェク
タントの高効率での形成(High-efficiency formation of influenza virus tran
sfectants.)」J. Virol. 65: 2711-2713. 6. Flick, R., G. Neumann, E. Hoffmann, E. Neumeierおよび G. Hobom. 1996.
「インフルエンザvRNA末端構造中のプロモーターエレメント(Promoter element
s in the influenza vRNA terminal structure.)」 RNA 2: 1046-1057. 7. Fodor, E., D. C. PritloveおよびG. G. Brownlee. 1994.「インフルエンザ
ウイルスのパンハンドルは転写の開始に関与する(The influenza virus panhand
le is involved in the initiation of transcription.)」 J. Virol. 68: 4092
-4096. 8. Fodor, E., D. C. PritloveおよびG. G. Brownlee. 1995.「インフルエンザA
ウイルスの転写開始におけるビリオンRNAのRNAフォークモデルの特性決定(Chara
cterization of the RNA-fork model of virion RNA in the initiation of tra
nscription in influenza A virus.)」 J. Virol. 69: 4012-4019. 9. Garcia-Sastre, A., T. Muster, W. S. Barclay, N. PercyおよびP. Palese.
1994.「トランスフェクタントインフルエンザウイルスによる外来遺伝子発現の
ための哺乳動物内部リボソーム進入部位エレメントの使用(Use of a mammalian
internal ribosomal entry site element for expression of a foreign protei
n by a transfectant influenza virus.)」 J. Virol. 68: 6254-6261. 10. Gubareva, L. V., R. Bethell, G. J. Hart, K. G. Murti, C. R. Pennおよ
びR. G. Webster. 1996.「ノイラミニダーゼ阻害剤である4-グアニジノ-Neu5Ac2
enにより選択されたインフルエンザAウイルス突然変異体の特性決定(Characteri
zation of mutants of influenza A virus selected with the neuraminidase i
nhibitor 4-guanidino-Neu5Ac2en.)」J. Virol. 70: 1818-1827. 11. Hagen, M., T. D. Y. Chung, J. A. ButcherおよびM. Krystal. 1994. 「組
換体インフルエンザウイルスポリメラーゼ：5’および3’ウイルス末端双方の、
エンドヌクレアーゼ活性のための必要性(Recombinant influenza virus polymer
ase: requirement of both 5’ and 3’ viral ends for endonuclease activit
y.)」 J. Virol. 68: 1509-1515. 12. Honda, A.およびA. Ishihama. 1997.「インフルエンザウイルスRNAポリメラ
ーゼの分子解剖学(The molecular anatomy of influenza virus RNA polymerase
.)」 Biol. Chem. 378: 483-488. 13. Hsu, M., J. D. Parvin, S. Gupta, M. KrystalおよびP. Palese. 1987.「
インフルエンザウイルスのゲノムRNAは、末端パンハンドルによってウイルス粒
子中および感染細胞中で環状コンホメーションを保持する(Genomic RNAs of inf
luenza vinises are held in a circular conformation in virions and in inf
ected cells by a terminal panhandle.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8
140-8144. 14. Kim, H-J., E. Fodor, G. G. BrownleeおよびB. L. Seong. 1997. 「インフ
ルエンザAウイルスのvRNAプロモーターのRNAフォークモデルのin vivo突然変異
分析(Mutational analysis of the RNA-fork model of the influenza A virus
vRNA promoter in vivo.)」J. Gen. Virol. 78: 353-357. 15. Krug, R. M., F. V. Alonso-Caplen, I. JulkunenおよびM. G. Katze. 1989
.「インフルエンザウイルスゲノムの発現および複製(Expression and replicati
on of the influenza virus genome)」 p.98-152. In R. M. Krug(ed), The Inf
luenza Viruses. Plenum, New York. 16. Li, X.およびP. Palese. 1992.「インフルエンザウイルスビリオンRNA合成
に必要とされるプロモーターの突然変異解析(Mutational analysis of the prom
oter required for influenza virus virion RNA synthesis.)」 J. Virol. 66:
4331-4338. 17. Li, X.およびP. Palese. 1994.「インフルエンザウイルスRNAのポリアデニ
ル化シグナルの特性決定(Characterization of the polyadenylation signal of
influenza virus RNA.)」J. Virol. 68: 1245-1249. 18. Luo, G., W. Luytjes, M. EnamiおよびP. Palese. 1991.「インフルエンザ
ウイルスRNAのポリアデニル化シグナルは、パンハンドル構造のRNA二本鎖が後に
続いているウリジンのストレッチを必要とする(The polyadenylation signal of
influenza virus RNA involves a stretch of uridines followed by the RNA
duplex of the panhandle structure.)」 J. Virol. 65: 2861-2867. 19. Luytjes, W., M. Krystal, M. Enami, J. D. ParvinおよびP. Palese. 1989
. 「インフルエンザウイルスによる外来遺伝子の増幅、発現およびパッケージン
グ(Amplification, expression, and packaging of a foreign gene by influen
za virus.)」 Cell. 59: 1107-1113. 20. Martin, J., C. Albo, J. Ortin, J. A. MeleroおよびA. Portela. 1992.「
感染細胞から精製されたウイルスタンパク質を使用する活性インフルエンザウイ
ルスヌクレオタンパク質複合体のin vitro再構成(In vitro reconstitution of
active influenza virus nucleoprotein complexes using viral proteins puri
fied from infected cells.)」 J. Gen. Virol. 73: 1855-1859, 21. Mena, I., S. de Ia Luna, C. Albo, J. Martin, A. Nieto, J. Ortinおよ
びA. Portela. 1994.「ワクシニア-T7 RNAポリメラーゼ発現系を用いた生物学的
に活性なインフルエンザコアタンパク質の合成(Synthesis of biologically act
ive influenza core proteins using a vaccinia-T7 RNA polymerase expressio
n system.)」 J. Gen. Virol. 75: 2109-2114. 22. Neumann, G.およびG. Hobom. 1995.「インフルエンザウイルスプロモーター
エレメントのin vivo突然変異分析(Mutational analysis of influenza virus p
romoter elements in vivo.)」J. Gen. Virol. 76: 1709-1717. 23. O’Neill, R. E, J. TalonおよびP. Palese. 1998.「インフルエンザウイル
スNEP(NS2タンパク質)はウイルスリボヌクレオタンパク質の核からの輸送を媒介
する(The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export o
f viral ribonucleoproteins.)」 EMBO J. 17: 288-296. 24. Palese. P. 1977. 「インフルエンザウイルスの遺伝子(The genes of influ
enza virus.)」 Cell 10: 1-10. 25. Parvin, J.D., P. Palese, A. Honda, A. IshihamaおよびM. Krystal. 1989
.「インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼのプロモーターの分析(Promoter an
alysis of the influenza virus RNA polymerase.)」J. Virol. 63: 5142-5152. 26. Piccone, M. E., A. Fernandez-SesmaおよびP. Palese. 1993.「インフルエ
ンザウイルスvRNAプロモーターの突然変異分析(Mutational analysis of the in
fluenza virus vRNA promoter.)」 Virus Res. 28: 99-112. 27. Potier, M., L. Mameli, M. Belisle, L. DallaireおよびS. B. Melancon.
1979.「(4-メチルウンベリフェリル-α-D-N-アセチルノイラミン酸)ナトリウム
基質を用いるノイラミニダーゼの蛍光光度的アッセイ(Fluorometric assay of n
euraminidase with a sodium(4-methylumbellifery1-α-D-N-acetylneuraminate
) substrate.)」 Anal. Biochem. 94: 287-296. 28. Pritlove, D.C., E. Fodor, B.L. SeongおよびG.G. Brownlee. 1995.「イン
フルエンザAウイルス相補性RNAの末端のin vitro転写およびポリメラーゼ結合に
関する研究：cRNAパンハンドルに関する証拠(In vitro transcription and poly
merase binding studies of the termini of influenza A virus complementary
RNA: evidence for a cRNA panhandle.)」J. Gen. Virol. 76: 2205-2213. 29. Pritlove, D. C., L. L. M. Poon, E. Fodor, J. SharpsおよびG. G. Brown
lee. 1998.「モデルビリオンRNAテンプレートからin vitroで転写されたインフ
ルエンザウイルスmRNAのポリアデニル化：5’保存配列の必要性(Polyadenylatio
n of influenza virus mRNA transcribed in vitro from model virion RNA tem
plates: requirement for 5’ conserved sequences.)」 J. Virol.72:1280-128
7. 30. Proudfoot, N. J.およびE. Whitelow. 1988.「真核生物RNAの終結および3’
末端のプロセシング (Termination and 3’ end processing of eukaryotic RNA
)」 p. 97-129. D. M. GloverおよびB. D. Hames (編), Frontiers in molecula
r biology-transcription and splicing. IRL Press, Oxford. 31. Robertson, J. S., M. SchubertおよびR. A. Lazzarini. 1981.「インフル
エンザウイルスmRNAのポリアデニル化部位(Polyadenylation sites for influen
za virus mRNA.)」 J. Virol. 38: 157-163. 32. Seong, B. L.およびG. G. Brownlee. 1992.「in vitroでインフルエンザポ
リメラーゼおよびRNAを再構成するための新規方法：in vitroでのcRNAおよびvRN
A合成のためのプロモーターエレメント、およびin vivoでのウイルスレスキュー
の研究(A new method for reconstituting influenza polymerase and RNA in v
itro: A study of the promoter elements for cRNA and vRNA synthesis in vi
tro and viral rescue in vivo.)」 Virology 186: 247-260. 33. Tiley, L. S., M. Hagen, J. T. MatthewsおよびM. Krystal. 1994.「イン
フルエンザウイルスRNAポリメラーゼの、ウイルスRNAの5’末端に位置する配列
に対する配列特異的結合(Sequence-specific binding of the influenza virus
RNA polymerase to sequences located at the 5'ends of the viral RNAs.)」
J. Virol. 68: 5108-5116. 34. Yamanaka, K., N. Ogasawara, H. Voshikawa, A. IsbihamaおよびK. Nagata
. 1991.「遺伝子操作されたRNAを有するトランスフェクション系を使用する、イ
ンフルエンザゲノムのプロモーター構造のin vivo分析(In vivo analysis of th
e promoter structure of the influenza genome using a transfection system
with an engineered RNA.)」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5369-5373. 35. Zheng, H., P. PaleseおよびA. Garcia-Sastre. 1996.「インフルエンザAウ
イルスRNAの3’末端および5’末端の非保存ヌクレオチドは、ウイルスRNA複製に
重要な役割を果たす(Nonconserved nucleotides at the 3' and 5' ends of an
influenza A virus RNA play an important role in viral RNA replication.)
」 Virology 217: 242-251. 36. Desselberger, U., Racariello, V.R., Zazra, J.J.およびPalese, P. 1980
.「インフルエンザA、BおよびCウイルスRNAセグメントの3’末端および5’末端
配列は高度に保存され、部分的逆方向相補性を示す(The 3’ and 5’-terminal
sequences of influenza A, B and C virus RNA segments are highly conserve
d and show partial inverted complementarity.)」 Gene 8, 315-328. 37. Lee, Y-S および Seong, B.L. 1996. 「インフルエンザBウイルスRNA転写の
in vitro突然変異分析(Mutational Analysis of Influenza B virus RNA transc
ription in vitro.)」 J. Virol. 70, 1232-1236. 38. Garcia-Sastre, A.およびPalese, P. 1993.「(-)鎖RNAウイルスゲノムの遺
伝学的操作(Genetic manipulation of negative-strand RNA virus genomes.)」
Ann. Rev. Microbiol. 47, 765-90. 39. Li,S., Xu,M.およびCoelingh,K. 1995.「ヌクレオタンパク質遺伝子および
マトリックス遺伝子のレスキューのための、リボヌクレオプロテイン複合体のエ
レクトロポレーション(Electroporation of ribonucleoprotein complexes for
rescue of the nucleoprotein and matrix genes.)」Virus Res. 37, 153-161. 40. Enami, M., Sharma, G., Benham, G.およびPalese, P. 1991.「9種類の異な
るRNAセグメントを含有するインフルエンザウイルス(An influenza virus conta
ining nine different RNA segments.)」 Virology 185, 291-8. 41. Subbarao, E. K., Park, E.J., Lawson, C.M., Chen, A.Y.およびMurphy, B
.R. 1995.「インフルエンザAトランスフェクタントウイルスのPB2遺伝子中への
、温度感受性ミスセンス突然変異の逐次的付加は、温度感受性と弱毒化を増加さ
せ得、遺伝子操作された生インフルエンザAウイルスワクチンの合理的な設計を
可能とする(Sequential addition of temperature-sensitive missense mutatio
ns into the PB2 gene of influenza A transfectant virus can effect an inc
rease in temperature sensitivity and attenuation and permits the rationa
l design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine.)」
J. Virol. 69, 5969-77. 42. Castrucci M. R.およびKawaoka, Y. 1995.「M2タンパク質のカルボキシ末端
残基が欠失しているインフルエンザAウイルス突然変異体の作製のための逆行性
遺伝学系 (Reverse genetics system for generation of an influenza A virus
mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 pro
tein.)」 J. Virol. 69, 2725-8. 43. Liu, C.およびAir, G. M. 1993.「インフルエンザウイルスのノイラミニダ
ーゼマイナス突然変異体の選択および特性決定、ならびにクローン化されたノイ
ラミニダーゼ遺伝子によるそのレスキュー(Selection and characterization of
a neuraminidase-minus mutant of influenza virus and its rescue by clone
d neuratninidase genes.)」 Virology 194, 403-7. 44. Barclay, W.S.およびPalese, P. 1995. 「NA遺伝子中に導入された部位特異
的突然変異を有するインフルエンザBウイルス(Influenza B viruses with site-
specific mutations introduced into the NA gene.)」 J. Virol. 76, 3211-5. 45. Pleschka, S., Jaskunas, R., Engelhardt, O.G., Zurcher, T., Palese P.
およびGarcia-Sastre, A. 1996.「インフルエンザAウイルスのためのプラスミド
に基づく逆行性遺伝学系(A plasmid-based reverse genetics system for influ
enza A virus.)」 J. Virol. 70,4188-92. 46. Enami, M. 1997.「インフルエンザウイルスの遺伝学的操作のための改善さ
れた技術(Improved technique to genetically manipulate influenza virus.)
」 In Frontiers of RNA Virus Research p.19, The Oji International Semina
r in Natural Science, Kyoto, Japan 1997. 47. 国際公開公報第WO 91/03552号(Published International Application WO 9
1/03552)(Palese, P.ら、) 48. Li, S., Polords, V., Isobe, H.ら、 1993.「キメラインフルエンザウイル
スは、ヒト免疫不全ウイルス1型に対する中和抗体および細胞傷害性T細胞を誘導
する(Chimeric influenza virus induces neutralising antibodies and cytoto
xic T cells against human immunodeficiency virus type 1.)」J. Virol. 67,
6659-66. 49. Muster T., Ferko B., Klima, A. ら、 1995.「ヒト免疫不全ウイルス1型に
対する、キメラインフルエンザウイルスを用いる免疫化の粘膜モデル(Mucosal m
odel of immunization against human immunodeficiency virus type 1 with a
chimeric influenza virus.)」 J. Virol. 69, 6678-86. 50. Rodrigues, M., Li, S., Murata, K., Rodrignes D. 1994.「マラリアCD8+
TおよびB細胞エピトープを発現するインフルエンザウイルスおよびワクシニアウ
イルス(Influenza and vaccinia viruses expressing malaria CD8+ T and B ce
ll epitopes.)」 J. Immunol. 153,4636-48. 51. Percy, N., Barclay, W. S., Garcia-Sastre, A.およびPalese, P. 1994.「
インフルエンザAウイルスによる外来タンパク質の発現」(Expression of a fore
ign protein by influenza A virus.) J. Virol 68, 4486-92. 52. Horimoto, T.およびKawacka, Y. 1994. 「逆行性遺伝学は、血球凝集素の分
解性とトリインフルエンザAウイルスの毒性との相関についての直接的な証拠を
提供する (Reverse genetics provides direct evidence for a correlation of
haemagglutinin cleavability and virulence of an avian influenza A virus
.)」 J. Virol. 68, 3120-3128. 53. Ferko, B., Egorav, A.ら、 1997.「粘膜免疫化のためのベクターとしての
インフルエンザウイルス(Influenza virus as a vector for mucosal immunizat
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inar in Natural Science, Kyoto, Japan. 54. Li ら、1993.「ノイラミニダーゼのグリコシル化が、インフルエンザA/WSN1
33の神経毒性を決定する(Glycolysation of neuraminidase determines the neu
rovirulence of influenza A/WSN133.)」 J. Virol. 67, 6667-73. 55. Burnet, F.M.およびJ.D. Stone.1947.「V. choleraeの受容体破壊酵素(The
receptor-destroying enzyme of V cholerae.)」J.Exper.Med.Sci.25:227-233. 56. Muster, T.およびGarcia-Sastre, M. June 1998. Textbook of Influenza,
Blackwell Science Ch.9, p.93-106 「インフルエンザウイルスの遺伝子操作(Ge
netic Manipulation of Influenza Viruses.)」
【図１】 パンハンドル型／RNAフォーク型コンホメーションのインフルエンザAウイルス
vRNAの保存された配列を示す図である（7、13）。このRNAセグメントの5'および
3'末端の両方を有するRNAフォークの二本鎖領域内の、保存された塩基対を四角
で囲んでいる。残基の番号は3'末端および5'末端から始まる。5'末端からの番号
をダッシュ（'）で区別している。実施例中の、D1、D2、D3およびD1/2と命名さ
れたトランスフェクタントウイルスの、改変体NAをコードするvRNAの保存された
二本鎖領域の塩基対を示す。変化した塩基対に影をつけて強調している。
vRNAの保存された配列を示す図である（7、13）。このRNAセグメントの5'および
3'末端の両方を有するRNAフォークの二本鎖領域内の、保存された塩基対を四角
で囲んでいる。残基の番号は3'末端および5'末端から始まる。5'末端からの番号
をダッシュ（'）で区別している。実施例中の、D1、D2、D3およびD1/2と命名さ
れたトランスフェクタントウイルスの、改変体NAをコードするvRNAの保存された
二本鎖領域の塩基対を示す。変化した塩基対に影をつけて強調している。
【図２】 MDBK細胞上のトランスフェクタントウイルスの増殖曲線を示す図である。35 m
mディッシュ中の集密的細胞に、野生型インフルエンザA/WSN/33（野生型；WT）
ウイルス、およびトランスフェクタントD1、D2、D3またはD1/2ウイルスを感染多
重度（m.o.i.）0.01で感染させた。指示した時点で、MDBK細胞中のプラークアッ
セイによって、培地中に存在する感染性粒子の力価を測定した。示した数値は二
重試験の平均である。
mディッシュ中の集密的細胞に、野生型インフルエンザA/WSN/33（野生型；WT）
ウイルス、およびトランスフェクタントD1、D2、D3またはD1/2ウイルスを感染多
重度（m.o.i.）0.01で感染させた。指示した時点で、MDBK細胞中のプラークアッ
セイによって、培地中に存在する感染性粒子の力価を測定した。示した数値は二
重試験の平均である。
【図３】 一方の末端（部位2404）で唯一のBbsI制限部位に隣接し、そして他方の末端（
部位3821-3836）でバクテリオファージT3RNAポリメラーゼプロモーターに隣接し
たインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子（位置2412-3820）の全長cDNAを、pUC19ク
ローニングベクターを背景としてEcoRI制限部位（位置2398）とHindIII（位置38
37）制限部位との間に含有するプラスミドpT3NAm1のヌクレオチド配列を示す図
である（9）。このプラスミドを使用して、D1、D2、D3およびD1/2ウイルス中に
存在するインフルエンザA/WSN/33のNAをコードするvRNAの突然変異体を取得した
（実施例１参照）。
部位3821-3836）でバクテリオファージT3RNAポリメラーゼプロモーターに隣接し
たインフルエンザA/WSN/33のNA遺伝子（位置2412-3820）の全長cDNAを、pUC19ク
ローニングベクターを背景としてEcoRI制限部位（位置2398）とHindIII（位置38
37）制限部位との間に含有するプラスミドpT3NAm1のヌクレオチド配列を示す図
である（9）。このプラスミドを使用して、D1、D2、D3およびD1/2ウイルス中に
存在するインフルエンザA/WSN/33のNAをコードするvRNAの突然変異体を取得した
（実施例１参照）。
【図４】 103プラーク形成単位（pfu）を鼻腔内感染させたマウスにおける、野生型、D1
、D2、D3およびD1/2ウイルスの病原性の時間経過を示す図である（実施例13参照
）。
、D2、D3およびD1/2ウイルスの病原性の時間経過を示す図である（実施例13参照
）。
【図５】 103 pfuで野生型、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスをマウスに鼻腔内感染させ
た後の体重を示す図である。
た後の体重を示す図である。
【図６】 3×104 pfuを鼻腔内感染させたマウスにおける、野生型、D1、D2、D3およびD1
/2ウイルスの病原性の時間経過を示す図である。
/2ウイルスの病原性の時間経過を示す図である。
【図７】 3×104 pfuで野生型、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスをマウスに鼻腔内感染さ
せた後の体重を示す図である。
せた後の体重を示す図である。
【図８】 106 pfuを鼻腔内感染させたマウスにおける、野生型、D1、D2、D3およびD1/2
ウイルスの病原性の時間経過を示す図である。
ウイルスの病原性の時間経過を示す図である。
【図９】 106 pfuで野生型、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスをマウスに鼻腔内感染させ
た後の体重を示す図である。
た後の体重を示す図である。
【図１０】 103 pfuで野生型（WT）、D1、D2、D3およびD1/2ウイルスを鼻腔内感染させた
後、感染後3日目（左）および6日目（右）のマウスの肺のウイルス力価（1mlあ
たりのlog pfu）を示す図である（実施例14参照）。
後、感染後3日目（左）および6日目（右）のマウスの肺のウイルス力価（1mlあ
たりのlog pfu）を示す図である（実施例14参照）。
【図１１】 D2（3用量レベル：106、3×104および103 pfu）で免疫したマウスの、106 pfu
野生型ウイルスでチャレンジした後の体重を示す図である（実施例15参照）。
野生型ウイルスでチャレンジした後の体重を示す図である（実施例15参照）。
【図１２】 D1/2（3用量レベル：106、3×104および103 pfu）で免疫したマウスの、106 p
fu野生型ウイルスでチャレンジした後の体重を示す図である。
fu野生型ウイルスでチャレンジした後の体重を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 フォドー，アーヴィン イギリス国 オーエックス１ ３アールイ ー オックスフォード，ユニバーシティー オブ オックスフォード，サー ウィリ アム ダン スクール オブ パソロジー (72)発明者 パレッセ，ピーター アメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州， ニューヨーク，ガステイヴ エル．レヴィ ー プレイス １，マウント シナイ ス クール オブ メディシン，デパートメン ト オブ マイクロバイオロジー (72)発明者 ガルシア−サストレ，アドルフォ アメリカ合衆国 10029 ニューヨーク州， ニューヨーク，ガステイヴ エル．レヴィ ー プレイス １，マウント シナイ ス クール オブ メディシン，デパートメン ト オブ マイクロバイオロジー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 CA05 CA12 DA02 EA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA97X AA97Y AC20 BA02 BA14 CA24 CA44 CA45 4C085 AA03 BA55 CC08
Claims (27)
- 【請求項１】 インフルエンザウイルスタンパク質またはその機能性改変体
のタンパク質コード配列と機能的に連結された、インフルエンザウイルスRNAゲ
ノムセグメントの変異型二本鎖領域を提供する5'および3'非コード領域を含む、
ゲノム核酸セグメントを担う弱毒インフルエンザウイルスであって、該二本鎖領
域が少なくとも１つの塩基対置換を有し、その結果として、該ウイルスに感染し
た細胞における該タンパク質コード配列の発現が低下して、弱毒化された表現型
を与えることを特徴とする弱毒インフルエンザウイルス。 - 【請求項２】 Madin-Darbyウシ腎(MDBK)細胞、Madin-Darbyイヌ腎(MDCK)細
胞およびVero細胞から選択される１種以上の細胞上でのプラーク力価が、親野生
型ウイルスと比べたとき、低下している、請求項１記載のウイルス。 - 【請求項３】 MDBK細胞上でのプラーク力価が、親野生型ウイルスと比べた
とき、少なくとも約１log低下している、請求項２記載のウイルス。 - 【請求項４】 MDCK細胞およびVero細胞上でのプラーク力価が、親野生型ウ
イルスと比べたとき、少なくとも約３〜４log低下している、請求項２記載のウ
イルス。 - 【請求項５】 前記ゲノム核酸セグメントが変異型の天然インフルエンザウ
イルスゲノムRNAセグメントである、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイル
ス。 - 【請求項６】 Ａ型の弱毒インフルエンザウイルスであり、ここで、前記核
酸セグメントは、非コード二本鎖領域中に弱毒化性の塩基対置換をもたらすよう
に、天然親セグメントの3'末端から11位にＣからＡへの突然変異を有しかつ天然
親セグメントの5'末端から12'位にＧからＵへの突然変異を有するか、または同
一位置に機能的に等価の置換を有する、変異型のインフルエンザＡウイルスゲノ
ムRNAセグメントである、請求項１〜５のいずれか１項記載のウイルス。 - 【請求項７】 前記核酸セグメントがさらに、非コード二本鎖領域中に追加
の塩基対置換をもたらすように、天然親セグメントの3'末端から10位にＵからＧ
への突然変異を有しかつ天然親セグメントの5'末端から11'位にＡからＣへの突
然変異を有するか、または同一位置に機能的に等価の置換を有する、請求項６記
載のウイルス。 - 【請求項８】 前記核酸セグメントがノイラミニダーゼ(NA)またはその機能
性改変体をコードする、請求項６または７記載のウイルス。 - 【請求項９】 １つ以上の前記塩基対置換によって弱毒化されている野生型
ウイルスである、請求項１〜８のいずれか１項記載のウイルス。 - 【請求項１０】 標的細胞内での発現が可能な異種コード配列をさらに含む
、請求項１〜８のいずれか１項記載のウイルス。 - 【請求項１１】 前記異種コード配列が病原体に対する免疫応答を刺激しう
る抗原性のペプチドまたはポリペプチドをコードする、請求項10記載のウイルス
。 - 【請求項１２】 請求項８で定義したNAコード化核酸セグメントを有する弱
毒インフルエンザA/WSN/33である、請求項９記載のウイルス。 - 【請求項１３】 請求項１または請求項５〜８のいずれか１項で定義した核
酸。 - 【請求項１４】 請求項13記載の核酸を提供する転写可能なDNA。
- 【請求項１５】 請求項14記載のDNAを含有するプラスミド。
- 【請求項１６】 請求項13記載の核酸がインフルエンザウイルスの核タンパ
ク質およびポリメラーゼタンパク質と複合体を形成している、請求項１〜12のい
ずれか１項記載の弱毒ウイルスの作製に使用するためのリボ核タンパク質(RNP)
複合体。 - 【請求項１７】 請求項１〜12のいずれか１項記載のウイルスを感染させた
ex vivo細胞。 - 【請求項１８】 請求項１〜11のいずれか１項記載のウイルスを含むワクチ
ン。 - 【請求項１９】 請求項11記載のウイルスを含み、インフルエンザウイルス
とインフルエンザウイルス以外の第２の病原体に対する免疫応答を刺激しうる、
請求項18記載のワクチン。 - 【請求項２０】 請求項10記載のウイルスを、標的細胞へ前記異種コード配
列を送達するための製薬上許容される担体または希釈剤と共に含有する医薬組成
物。 - 【請求項２１】 請求項10または11記載のウイルスを感染させた細胞を、製
薬上許容される担体または希釈剤と共に含有する医薬組成物。 - 【請求項２２】 宿主細胞中に、請求項１〜12のいずれか１項記載のウイル
スのゲノム核酸セグメントを、該セグメントがウイルス粒子へとパッケージング
される条件下で供給することを含む、請求項１〜12のいずれか１項記載のウイル
スの作製方法。 - 【請求項２３】 細胞内のインフルエンザウイルスゲノム核酸セグメントを
レスキューするヘルパーウイルスとしての請求項１〜12のいずれか１項記載のウ
イルスの使用であって、該核酸セグメントを含む産生されたウイルスが、所定の
型の細胞上で、該ヘルパーウイルスと比べて増大した増殖を示すことに基づいて
選択されることを特徴とする、上記使用。 - 【請求項２４】 NAをコードするインフルエンザＡウイルスゲノム核酸セグ
メントまたはその機能性改変体をレスキューする請求項23記載のヘルパーウイル
スとしての請求項８記載のインフルエンザＡウイルスの使用。 - 【請求項２５】 レスキューされるべき前記核酸セグメントを担うウイルス
の選択がVero細胞上で実施される、NAコード化ゲノムRNAセグメント中に請求項
７で定義した突然変異を有する弱毒インフルエンザA/WSN/33の請求項24記載の使
用。 - 【請求項２６】 請求項１〜11のいずれか１項記載の弱毒インフルエンザウ
イルスを免疫化の方法で投与することを含む、インフルエンザウイルスに対する
免疫応答を、場合により１以上の他の病原体に対する免疫応答と共に、刺激する
方法。 - 【請求項２７】 異種コード配列を担う請求項10記載のウイルスを細胞に感
染させることを含む、細胞への異種コード配列の送達方法。
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