JP2002512791A - Enzymatic nucleic acid therapy for diseases or conditions associated with hepatitis C virus infection - Google Patents

Enzymatic nucleic acid therapy for diseases or conditions associated with hepatitis C virus infection

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ブラット，ローレンス
マクスウィゲン，ジェームズ・エイ
ロバーツ，エリザベス
パヴコ，パメラ・エイ
マセジャック，デニス
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リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 Ｃ型肝炎の発現および／または複製を調節する酵素的核酸分子。   (57) [Summary] An enzymatic nucleic acid molecule that regulates the expression and / or replication of hepatitis C.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 本出願は，Ｂｌａｔｔら，米国出願（番号未定），（１９９９年２月２４日出
願），Ｂｌａｔｔら，米国出願６０／１００，８４２（１９９８年９月１８日出
願）およびＭｃＳｗｉｇｇｅｎら，米国出願６０／０８３，２１７（１９９８年
４月２７日出願）に基づく優先権を主張する。これらの先の出願の表題はすべて
，"ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ Ｏ
Ｆ ＤＥＳＥＡＳＥＳ ＯＲ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ ＲＥＬＡＴＥＤ ＴＯ
ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ"である。これらの
出願のそれぞれは，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する
。The present application is directed to Blatt et al., US application (unnumbered), (filed February 24, 1999), Blatt et al., US application 60 / 100,842 (filed September 18, 1998) and McSwigen et al. Claim priority under U.S. Application 60 / 083,217, filed April 27, 1998. The titles of these earlier applications are all "ENZYMATIC NUCLEIC ACID TREAMENTMENT O"
F DESEASES OR CONDITIONS RELATED TO
HEPATISIS C VIRUS INFECTION ". Each of these applications, including the drawings, is hereby incorporated by reference in its entirety.

【０００２】発明の背景 本発明は，Ｃ型肝炎ウイルス感染に関連する疾患または状態を治療するための
方法および薬剤に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] The present invention relates to methods and medicaments for treating diseases or conditions associated with hepatitis C virus infection.

【０００３】 以下は関連する技術の議論であり，これらのいずれも本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。The following is a discussion of the related art, none of which is admitted to be prior art to the present invention.

【０００４】 １９８９年，ＨＣＶは，ＲＮＡウイルスであると決定され，ほとんどの非Ａ非
Ｂ肝炎の原因となるウイルスであることが同定された（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９；２４４：３５９−３６２）。ＨＩＶ等のレトロウ
イルスとは異なり，ＨＣＶはＤＮＡ複製相を通らず，ウイルスゲノムが宿主染色
体内にインテグレーションした形は検出されていない（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９１；１４：３８１−３８８）。その代
わり，コーディング（プラス）鎖の複製は，複製（マイナス）鎖の生成により媒
介され，数コピーのプラス鎖ＨＣＶ ＲＮＡが生成される。ゲノムは，ポリ蛋白
質に翻訳される単一の大きなオープンリーディングフレームから構成される（Ｋ
ａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．１９９１；２８０：３２５
−３２８）。このポリ蛋白質は，続いて翻訳後切断を受け，いくつかのウイルス
蛋白質が生ずる（Ｌｅｉｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９
４：２０４：１６３−１６９）。In 1989, HCV was determined to be an RNA virus and was identified as the causative virus of most non-A non-B hepatitis (Choo et al.
, Science. 1989; 244: 359-362). Unlike retroviruses such as HIV, HCV does not pass through the DNA replication phase, and no integrated form of the viral genome in the host chromosome has been detected (Houghton et al.).
al. , Hepatology 1991; 14: 381-388). Instead, replication of the coding (plus) strand is mediated by the generation of the replication (minus) strand, producing several copies of the plus-strand HCV RNA. The genome is composed of a single large open reading frame that is translated into a polyprotein (K
ato et al. , FEBS Letters. 1991; 280: 325.
-328). This polyprotein is subsequently subjected to post-translational cleavage, resulting in several viral proteins (Leinbach et al., Virology. 199).
4: 204: 163-169).

【０００５】 ＨＣＶの９．５キロベースのゲノムの研究は，ウイルス核酸が高い率で変異し
うることを示した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９９７
４５：２３８−２４６）。この変異率により，約７０％の配列同一性を共有する
，いくつかの区別しうる遺伝子型のＨＣＶが進化した（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４；７５：１０５３−１０６１）。
これらの配列は，進化的には非常に区別されるものであることに注目することが
重要である。例えば，ヒトと霊長類，例えばチンパンジーとの間の遺伝的同一性
は約９８％である。さらに，一人の患者におけるＨＣＶ感染は，ＲＮＡレベルで
９８％の同一性を有するいくつかの異なりかつ進化した亜種（ｑｕａｓｉｓｐｅ
ｃｉｅｓ）から構成されることが示されている。すなわち，ＨＣＶゲノムは超可
変性であり，絶えず変化している。ＨＣＶゲノムは超可変性であるが，高度に保
存されているゲノムの３つの領域が存在する。これらの保存配列は，５'および
３'非コーディング領域，ならびにコア蛋白質コーディング領域の５'−末端に存
在し，ＨＣＶ ＲＮＡの複製ならびにＨＣＶポリ蛋白質の翻訳に必須であると考
えられる。すなわち，これらの保存ＨＣＶゲノム領域を標的とする治療薬剤は，
広範な種類のＨＣＶ遺伝子型に対して有意な影響を有するであろう。さらに，Ｈ
ＣＶゲノムの保存領域に特異的なリボザイムによっては，薬剤耐性は生じないで
あろう。これに対し，ウイルスプロテアーゼまたはヘリカーゼ等の酵素の阻害を
標的とする療法は，ウイルスにコードされるこれらの酵素のＲＮＡがＨＣＶゲノ
ムの超可変性部分に位置するため，薬剤耐性株の選択が生ずるであろう。[0005] Studies of the 9.5 kilobase genome of HCV have shown that viral nucleic acids can be mutated at high rates (Smith et al., Mol. Evol. 1997).
45: 238-246). This mutation rate has evolved several distinct genotypes of HCV that share about 70% sequence identity (Simonds et al.).
al. , J. et al. Gen. Virol. 1994; 75: 1053-1061).
It is important to note that these sequences are very distinct in evolution. For example, the genetic identity between humans and primates, such as chimpanzees, is about 98%. In addition, HCV infection in one patient has several distinct and evolved quasispecies with 98% identity at the RNA level.
ces). That is, the HCV genome is hypervariable and constantly changing. Although the HCV genome is hypervariable, there are three regions of the genome that are highly conserved. These conserved sequences are present at the 5 'and 3' non-coding regions and at the 5'-end of the core protein coding region and are thought to be essential for the replication of HCV RNA and translation of HCV polyprotein. In other words, therapeutic agents targeting these conserved HCV genomic regions
It will have significant effects on a wide variety of HCV genotypes. Furthermore, H
Ribozymes specific to conserved regions of the CV genome will not result in drug resistance. In contrast, therapies that target the inhibition of enzymes such as viral proteases or helicases result in the selection of drug-resistant strains because the RNAs of these enzymes encoded by the virus are located in the hypervariable portion of the HCV genome. Will.

【０００６】 ＨＣＶへの最初の暴露の後，患者において肝酵素の過渡的上昇が生ずるであろ
う。これは，炎症性の過程が生じていることを示す（Ａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．
，ＩＮ：Ｓｅｅｆｆ ＬＢ，Ｌｅｗｉｓ ＪＨ ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌ
ｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ；１９８９：８３−８９）。この肝
酵素の上昇は，最初の暴露の少なくとも４週間後に起こり，２ヶ月まで持続する
であろう（Ｆａｒｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９１：３２５：９８−１０４）。肝酵素の上
昇の前に，ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて患者血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出するこ
とが可能である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９３：８８：２：
２４０−２４３）。疾患のこの段階は急性段階と称され，ＨＣＶ感染からの急性
肝炎ウイルスを有する患者の７５％が無症候性であるため，通常は検出されない
ままである。これらの患者の残りの２５％は黄疸または肝炎の他の症状を発症す
る。[0006] After initial exposure to HCV, a transient elevation of liver enzymes will occur in the patient. This indicates that an inflammatory process is taking place (Alter et al.
, IN: Seeff LB, Lewis JH eds. Current Pe
rspectives in Hepatology. New York: Pl
enum Medical Book Co; 1989: 83-89). This elevation of liver enzymes occurs at least 4 weeks after the first exposure and will persist for up to 2 months (Farci et al., New England Journal.
l of Medicine. 1991: 325: 98-104). Prior to elevation of liver enzymes, it is possible to detect HCV RNA in patient sera using RT-PCR analysis (Takahashi et al., American Jo
urnal of Gastroenterology. 1993: 88: 2:
240-243). This stage of the disease is referred to as the acute stage, and usually remains undetected because 75% of patients with acute hepatitis virus from HCV infection are asymptomatic. The remaining 25% of these patients develop jaundice or other symptoms of hepatitis.

【０００７】 急性ＨＣＶ感染は良性疾患であるが，急性ＨＣＶ患者の８０％程度が，血清ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの持続的上昇および循環ＨＣ
Ｖ ＲＮＡの継続的な存在により示される慢性肝疾患に進行する（Ｓｈｅｒｌｏ
ｃｋ，Ｌａｎｃｅｔ １９９２；３３９：８０２）。慢性ＨＣＶ感染は１０−２
０年間に自然に進行して，２０−５０％の患者で肝硬変となり（Ｄａｖｉｓ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ
１９９３；２：１５０：１５４），ＨＣＶ感染の肝細胞癌への進行は，詳細に報
告されている（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９３；
１８：１３２６−１３３３；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９４；Ｖｏｌ．１６０，Ｎｏ．２：１
３３−１３８）。肝硬変および／または肝細胞癌に進行する可能性の高い亜集団
を判定した研究はない。したがって，すべての患者は進行の等しいリスクを有す
る。[0007] Acute HCV infection is a benign disease, but as much as 80% of acute HCV patients have a sustained rise in serum alanine aminotransferase (ALT) levels and circulating HC
Progress to chronic liver disease as indicated by the continued presence of V RNA (Sherlo
ck, Lancet 1992; 339: 802). 10-2 chronic HCV infection
It progresses spontaneously in 0 years, resulting in cirrhosis in 20-50% of patients (Davis e)
t al. , Infectious Agents and Disease
1993; 2: 150: 154), the progression of HCV infection to hepatocellular carcinoma has been reported in detail (Liang et al., Hepatology. 1993;
18: 1326-1333; Tong et al. , Western Jou
rnal of Medicine, 1994; Vol. 160, no. 2: 1
33-138). No studies have determined a subpopulation likely to progress to cirrhosis and / or hepatocellular carcinoma. Therefore, all patients have an equal risk of progression.

【０００８】 肝細胞癌を有すると診断された患者の生存は，最初の診断からわずか０．９−
１２．８月であることに注目することが重要である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ
ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒ
ｏｌｏｇｙ．１９９３：８８：２：２４０−２４３）。肝細胞癌の化学療法剤に
よる治療は，有効ではないことが証明されており，肝臓の広い範囲に腫瘍が侵入
するため，患者のわずか１０％しか外科手術の恩恵を受けないであろう（Ｔｒｉ
ｎｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９４：２３
：８３１−８３３）。原発性肝細胞癌の侵略的な性質のため，外科手術に代わる
唯一の実行可能な治療は肝移植である（Ｐｉｃｈｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈ
ｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１９９４：２０：３３Ｓ−４０Ｓ）。The survival of patients diagnosed with hepatocellular carcinoma is only 0.9-
It is important to note that this is August (Takahashi et al.
al. , American Journal of Gastroenter
logic. 1993: 88: 2: 240-243). Treatment of hepatocellular carcinoma with chemotherapeutic agents has proven ineffective and only 10% of patients will benefit from surgery due to tumor invasion of a large area of the liver (Tri
nchet et al. , Presse Medicine. 1994: 23
: 831-833). Because of the aggressive nature of primary hepatocellular carcinoma, the only viable alternative to surgery is liver transplantation (Pichlmayr et al., H.
epatology. 1994: 20: 33S-40S).

【０００９】 慢性ＨＣＶ感染を有する患者は，肝硬変に進行すると，臨床的肝硬変に共通す
る臨床的特徴が現れる（Ｄ'Ａｍｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１９８６；３１：５：４６８-
４７５）。これらの臨床的特徴には，出血性食道静脈瘤，腹水症，黄疸，および
脳障害が含まれる（Ｚａｋｉｍ Ｄ，Ｂｏｙｅｒ ＴＤ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
ａ ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ １．１９９０ Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。肝硬変の初期段階においては，患
者は，代償性（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）として分類される。これは，肝臓組織
傷害が生じているにもかかわらず，患者の肝臓は依然として血流中の代謝物を解
毒することができることを意味する。さらに，代償性肝疾患を有するほとんどの
患者は，無症候性であり，症状を有する少数の者は，味覚不全および虚弱などの
小さな症状しか報告していない。肝硬変のより後期においては，患者は，脱代償
性（ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）と分類される。これは，その患者が血中代謝
物を解毒する能力が低下していることを意味し，上述した臨床的特徴が現れるの
はこの段階である。As patients with chronic HCV infection progress to cirrhosis, clinical features common to clinical cirrhosis appear (D'Amico et al., Digestive).
Diseases and Sciences. 1986; 31: 5: 468-
475). These clinical features include hemorrhagic esophageal varices, ascites, jaundice, and encephalopathy (Zakim D, Boyer TD. Hepatology).
a textbook of river disease. Second
Edition Volume 1.1990 W.C. B. Saunders C
ompany. Philadelphia). In the early stages of cirrhosis, patients are classified as compensated. This means that despite liver tissue injury, the patient's liver can still detoxify metabolites in the bloodstream. Furthermore, most patients with compensatory liver disease are asymptomatic, and a small number of symptomatic patients report only small symptoms such as taste dysfunction and weakness. In later stages of cirrhosis, patients are classified as decompensated. This means that the patient has a reduced ability to detoxify blood metabolites, and it is at this stage that the above-mentioned clinical features appear.

【００１０】 １９８６年，Ｄ'Ａｍｉｃｏらは，アルコール関連およびウイルス関連の肝硬
変を有する１１５５人の患者の臨床的発現および生存率を記載した（Ｄ'Ａｍｉ
ｃｏ（上掲））。１１５５人の患者のうち，４３５人（３７％）が代償性疾患を
有しているが，研究の開始時には７０％は無症候性であった。残りの７２０人の
患者（６３％）は脱代償性肝疾患を有しており，このうち，７８％は腹水の病歴
を，３１％は黄疸を，１７％は出血を有し，１６％は脳障害を有していた。肝細
胞癌は，代償性疾患を有する患者の６人（０．５％）および脱代償性疾患を有す
る患者の３０人（２．６％）において認められた。[0010] In 1986, D'Amico et al. Described the clinical expression and survival of 1155 patients with alcohol-related and virus-related cirrhosis.
co (supra)). Of the 1155 patients, 435 (37%) had compensatory disease, but 70% were asymptomatic at the start of the study. The remaining 720 patients (63%) had decompensated liver disease, of which 78% had a history of ascites, 31% had jaundice, 17% had bleeding, and 16% had He had brain damage. Hepatocellular carcinoma was found in 6 (0.5%) of patients with compensatory disease and in 30 (2.6%) of patients with decompensated disease.

【００１１】 ６年間の経過の間に，代償性肝硬変を有する患者は，１年に１０％の割合で，
脱代償性疾患の臨床的特徴を発症した。ほとんどのケースにおいては，腹水症が
脱代償性の最初の現れであった。さらに，６年間の研究の終わりには，最初は代
償性疾患が現れていた５９人の患者で肝細胞癌が発症した。During the course of six years, patients with compensated cirrhosis have a rate of 10% per year,
The clinical features of decompensated disease developed. In most cases, ascites was the first manifestation of decompensation. In addition, at the end of the six-year study, hepatocellular carcinoma developed in 59 patients who initially had compensatory disease.

【００１２】 生存に関しては，Ｄ'Ａｍｉｃｏの研究は，研究したすべての患者についての
５年生存率はわずか４０％であることを示した。最初に代償性肝硬変を有してい
た患者についての６年生存率は５４％であり，最初に脱代償性疾患を有していた
患者についての６年生存率はわずか２１％であった。アルコール性肝硬変を有す
る患者とウイルス関連肝硬変を有する患者との間には，生存率の有意な差はなか
った。Ｄ'Ａｍｉｃｏの研究における患者の主要な死亡原因は，肝不全が４９％
；肝細胞癌が２２％；出血が１３％であった（Ｄ'Ａｍｉｃｏ（上掲））。Regarding survival, D'Amico's study showed that the 5-year survival rate for all patients studied was only 40%. The 6-year survival rate for patients who initially had compensated cirrhosis was 54%, and the 6-year survival rate for patients who initially had decompensated disease was only 21%. There was no significant difference in survival between patients with alcoholic cirrhosis and those with virus-related cirrhosis. Liver failure was the leading cause of death in patients in the D'Amico study at 49%
Hepatocellular carcinoma 22%; bleeding 13% (D'Amico, supra).

【００１３】 慢性Ｃ型肝炎は，ゆっくり進行する肝臓の炎症性疾患であり，ウイルス（ＨＣ
Ｖ）により媒介され，１０−２０年間の間に，肝硬変，肝不全および／または肝
細胞癌を引き起こしうる。米国においては，ＨＣＶによる感染は，毎年新たに５
０，０００人の急性肝炎が発生していると見積もられている（ＮＩＨ Ｃｏｎｓ
ｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｔｅｍｅ
ｎｔ ｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ，Ｍａｒｃ
ｈ １９９７）。米国におけるＨＣＶの罹患率は，１．８％であると見積もられ
ており，ＣＤＣは，慢性的に感染した米国人の人数が約４５０万人であると認め
ている。ＣＤＣはまた，慢性ＨＣＶ感染により引き起こされる死亡は１年間に１
０，０００人に達すると推定している。[0013] Chronic hepatitis C is a slowly progressing inflammatory disease of the liver, characterized by the virus (HC
V) and can cause cirrhosis, liver failure and / or hepatocellular carcinoma during 10-20 years. In the United States, infection with HCV is increasing
It has been estimated that 000 acute hepatitis cases occur (NIH Cons
ensus Development Conference Stateme
nt on Management of Hepatitis C, Marc
h 1997). The prevalence of HCV in the United States is estimated to be 1.8%, and the CDC recognizes that approximately 4.5 million chronically infected Americans. CDC also shows that deaths caused by chronic HCV infection are one in one year.
It is estimated that it will reach 0000.

【００１４】 慢性ＨＣＶ感染の治療にインターフェロン（ＩＦＮ−アルファ）を用いる多数
のよく制御された臨床試験は，週３回の治療により，６ヶ月の治療の終了時まで
に，約５０％（４０％−７０％の範囲）の患者において血清ＡＬＴ値が低下する
ことを示した（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９８９；３２１：１５０１−１５０６；Ｍ
ａｒｃｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９１；１３：３
９３−３９７；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７：２
６：７４７−７５４；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９
７ ２６（６）：１６４０−１６４５）。しかし，インターフェロン治療の終了
後，応答した患者の約５０％が再発し，"持続可能な"応答の比率は，血清ＡＬＴ
濃度により標準化して約２０−２５％であった。[0014] A number of well-controlled clinical trials using interferon (IFN-alpha) in the treatment of chronic HCV infection show that three times a week of treatment leads to approximately 50% (40%) by the end of 6 months of treatment. (Range -70%) showed reduced serum ALT levels (Davis et al., New England Jour).
nal of Medicine 1989; 321: 1501-1506; M
arcellin et al. , Hepatology 1991; 13: 3.
93-397; Tong et al. , Hepatology 1997: 2.
6: 747-754; Tong et al. , Hepatology 199
726 (6): 1640-1645). However, after the end of interferon therapy, approximately 50% of responding patients relapse and the rate of "sustainable"
Normalized by concentration, it was about 20-25%.

【００１５】 近年，分岐ＤＮＡまたはリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析のいずれかを用いて，ＨＣＶ ＲＮＡを直接測定するこ
とが可能となった。一般に，ＲＴ−ＰＣＲ法は，より感度が高く，臨床経過のよ
り正確な評価をもたらす（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。臨床的エンド
ポイントとしてＨＣＶ ＲＮＡ値の変化を用いる６ヶ月のタイプ１インターフェ
ロン療法を試験した研究は，治療の終わりまでには，３５％の患者がＨＣＶ Ｒ
ＮＡを失うことを示した（Ｍａｒｃｅｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。し
かし，ＡＬＴエンドポイントと同様に，約５０％の患者は，治療の終了から６ヶ
月後に再発し，持続可能なウイルス応答はわずか１２％であった（Ｍａｒｃｅｌ
ｌｉｎ ｅｔ ａｌ（上掲））。４８週間の治療を試験した研究は，持続するウ
イルス応答が２５％以下であることを示した（ＮＩＨ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓ
ｔａｔｅｍｅｎｔ：１９９７）。すなわち，現在，タイプ１インターフェロンに
よる慢性ＨＣＶ感染の治療の標準は，有効性の主な評価としてＨＣＶ ＲＮＡ濃
度の変化を用いる４８週間の治療である（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９７
；３３６（５）３４７−３５６）。In recent years, it has become possible to directly measure HCV RNA using either branched DNA or reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. In general, the RT-PCR method is more sensitive and provides a more accurate assessment of the clinical course (Tong et al., Supra). A study testing 6 months of type 1 interferon therapy using changes in HCV RNA levels as clinical endpoints showed that by the end of treatment, 35% of patients had HCV R
Loss of NA has been shown (Marcefin et al., Supra). However, similar to the ALT endpoint, approximately 50% of patients relapsed 6 months after the end of treatment, with only 12% of the sustainable viral response (Marcel)
lin et al (supra). Studies testing treatment for 48 weeks have shown that sustained viral responses are less than 25% (NIH Consensus S.
statement: 1997). Thus, at present, the standard for the treatment of chronic HCV infection with type 1 interferons is a 48-week treatment using changes in HCV RNA levels as the primary assessment of efficacy (Hoofnagle et al.,
New England Journal of Medicine 1997
336 (5) 347-356).

【００１６】 タイプ１インターフェロンによる治療に起因する副作用は，４つの一般的カテ
ゴリーに分類することができる。すなわち，１．インフルエンザ様症状；２．神
経精神医学；３．実験室的異常；および４．その他（Ｄｕｓｈｅｉｋｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．１９９４：
１：３−５）。インフルエンザ様症状の例としては，疲労，発熱；筋肉痛；倦怠
；食欲喪失；頻脈；悪寒；頭痛および関節痛がある。インフルエンザ様症状は，
通常は短期間であり，投与の最初の４週間の後には軽減する傾向にある（Ｄｕｓ
ｈｉｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。神経精神医学的副作用としては，被刺
激性，無関心；気分変化；不眠；認識変化および鬱病がある。これらの神経精神
病学的副作用の最も重要なものは鬱病であり，鬱病の病歴を有する患者にはタイ
プ１インターフェロンを投与してはならない。実験室的異常としては，顆粒球等
の骨髄細胞，血小板，および頻度は低いが赤血球の減少がある。これらの血液細
胞の変化が有意な臨床的結末につながることはほとんどない（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ
ｅｔ ａｌ．，（上掲））。さらに，トリグリセリドの濃度の増加および血清
アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの濃度の上昇が認めら
れている。最後に，甲状腺異常が報告されている。これらの甲状腺異常は，通常
はインターフェロン治療の終了後は可逆的であり，治療の間には適当な薬物で調
節することができる。その他の副作用には，吐き気；下痢；腹部および背中の痛
み；そう痒；脱毛；および鼻漏がある。一般に，ほとんどの副作用は，治療の４
−８週間後には軽減するであろう（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，（上掲）
）。[0016] Side effects resulting from treatment with type 1 interferon can be divided into four general categories. That is, 1. Flu-like symptoms; 2. neuropsychiatry; 3. laboratory abnormalities; and Other (Dusheiko et
al. , Journal of Viral Hepatitis. 1994:
1: 3-5). Examples of flu-like symptoms include fatigue, fever; muscle pain; malaise; loss of appetite; tachycardia; chills; headache and joint pain. Flu-like symptoms
It is usually short-lived and tends to decrease after the first 4 weeks of administration (Dus
hieko et al. , (Supra)). Neuropsychiatric side effects include irritability, apathy; mood changes; insomnia; cognitive changes and depression. The most important of these neuropsychiatric side effects is depression, and patients with a history of depression should not receive type 1 interferon. Laboratory abnormalities include a decrease in bone marrow cells such as granulocytes, platelets, and, less frequently, red blood cells. These changes in blood cells rarely lead to significant clinical consequences (Dushieko).
et al. , (Supra)). In addition, increased levels of triglycerides and increased levels of serum alanine and aspartate aminotransferase have been observed. Finally, thyroid abnormalities have been reported. These thyroid abnormalities are usually reversible after termination of interferon treatment and can be adjusted with appropriate drugs during treatment. Other side effects include nausea; diarrhea; abdominal and back pain; pruritus; alopecia; and rhinorrhea. In general, most side effects are due to treatment 4
After 8 weeks it will alleviate (Dushieko et al., Supra).
).

【００１７】 Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９６ ３（１１
）：９９４−１００１は，Ｃ型肝炎ウイルスを標的とするヘアピンリボザイムを
発現する２つのベクターを用いるインビトロおよびインビボ研究を記載する。Welch et al. , Gene Therapy 1996 3 (11
): 994-1001 describes in vitro and in vivo studies using two vectors expressing a hairpin ribozyme targeting hepatitis C virus.

【００１８】 Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ
ａｔｉｏｎ １９９６ ９８（１２）：２７２０−２７２８は，ハンマーヘッド
リボザイムを発現するある種のベクターによる，Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの細胞
内切断およびウイルス蛋白質翻訳の阻害を記載する。[0018] Sakamoto et al. , J. et al. Clinical Investig
ation 1996 98 (12): 2720-2728 describes the inhibition of intracellular cleavage of hepatitis C virus RNA and viral protein translation by certain vectors expressing hammerhead ribozymes.

【００１９】 Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６ ７０（１２
）：８７８２−８７９１は，ある種のハンマーヘッドリボザイムのアデノウイル
ス媒介性発現による，感染ヒト肝細胞におけるＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの排除を
記載する。[0019] Lieber et al. , J. et al. Virology 1996 70 (12
): 8782-8791 describes the elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocytes by adenovirus-mediated expression of certain hammerhead ribozymes.

【００２０】 Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７；
７８−８４は，ある種のインビトロ転写ハンマーヘッドリボザイムを用いる，Ｈ
ＣＶ ＲＮＡのインビトロ切断およびウイルス蛋白質翻訳の阻害を記載する。Ohkawa et al. , 1997, J.A. Hepatology, 27;
78-84 use a class of in vitro transcription hammerhead ribozymes.
In vitro cleavage of CV RNA and inhibition of viral protein translation are described.

【００２１】 Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／３２０１８は，ある種の抗
Ｃ型肝炎ウイルスヘアピンリボザイムを発現するアデノウイルスベクターの使用
を記載する。Barber et al. WO 97/32018 describes the use of adenovirus vectors expressing certain anti-hepatitis C virus hairpin ribozymes.

【００２２】 Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８４１９は，抗ＨＣＶハンマー
ヘッドリボザイムの発現のための，ある種の組換えアデノウイルスベクターを記
載する。Kay et al. WO 96/18419 describes certain recombinant adenoviral vectors for the expression of anti-HCV hammerhead ribozymes.

【００２３】 Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，日本特許出願ＪＰ ０７２３１７８４は，特定
のポリ−（Ｌ）−リシンとコンジュゲートさせた，ＨＣＶを標的とするハンマー
ヘッドリボザイムを記載する。[0023] Yamada et al. , Japanese Patent Application JP 0721784 describes a hammerhead ribozyme targeting HCV conjugated with a specific poly- (L) -lysine.

【００２４】 Ｄｒａｐｅｒ，米国特許５，６１０，０５４は，ＨＣＶの複製を阻害しうる酵
素的核酸分子を記載する。Draper, US Pat. No. 5,610,054, describes an enzymatic nucleic acid molecule that can inhibit the replication of HCV.

【００２５】 Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５ ２２（３）：７０
７−７１７は，ある種のアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレ
オチドによるＣ型肝炎ウイルス遺伝子発現の特異的阻害を記載する。Alt et al. , Hepatology 1995 22 (3): 70
7-717 describes the specific inhibition of hepatitis C virus gene expression by certain antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides.

【００２６】発明の概要 本発明は，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡ種および／またはＨＣＶによ
りコードされるＲＮＡ種の切断に向けられたリボザイムもしくは酵素的核酸分子
に関する。特に，本出願人は，ＨＣＶ ＲＮＡを特異的に切断しうるリボザイム
の選択および機能を記載する。そのようなリボザイムは，ＨＣＶ感染に関連する
疾患を治療するために用いることができる。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to ribozymes or enzymatic nucleic acid molecules directed to the cleavage of the hepatitis C virus (HCV) RNA species and / or the RNA species encoded by HCV. In particular, Applicants describe the selection and function of ribozymes capable of specifically cleaving HCV RNA. Such ribozymes can be used to treat diseases associated with HCV infection.

【００２７】 ＨＣＶゲノムの高い配列可変性のため，広い治療適用症のためのリボザイムの
選択には，ＨＣＶゲノムの保存領域が関与するであろう。詳細には，本発明は，
ＨＣＶゲノムの保存領域中で切断するであろうハンマーヘッドリボザイムを記載
する。保存領域（ＨＣＶゲノムの５'−非コーディング領域（ＮＣＲ），コア蛋
白質コーディング領域の５'−末端，および３'−ＮＣＲ）に由来する３０個のハ
ンマーヘッドリボザイムの一覧が表ＩＶに示される。一般に，本出願人は，ＨＣ
Ｖゲノムの５'末端に位置する部位を切断する酵素的核酸分子が翻訳を妨害する
のに対し，ゲノムの３'末端に位置する部位を切断するリボザイムはＲＮＡ複製
を妨害するであろうことを見いだした。約５０個のＨＣＶ単離物を同定し，遺伝
子型１ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，２ｃ，３ａ，３ｂ，４ａ，５ａ，および６からの
これらの単離物の配列アライメントを実施した。本出願人は，これらのアライメ
ントを用いて，各遺伝子型の間で高度に保存されている領域中に，３０個のハン
マーヘッドリボザイム部位を同定した。保存領域中の最も相同性の高い領域中で
２３個のリボザイム部位が同定された。したがって，ＨＣＶのすべての異なる単
離物を切断する１つのリボザイムを設計することができる。本出願人によれば，
種々のＨＣＶ単離物の保存領域に対して設計されたリボザイムは，多様な患者集
団においてＨＣＶ複製の効果的な阻害を可能とするであろうし，ＨＣＶゲノムの
非保存領域中の変異のために進化するＨＣＶ亜種に対するリボザイムの有効性を
確実なものにすることができる。Due to the high sequence variability of the HCV genome, the selection of ribozymes for broad therapeutic applications will involve conserved regions of the HCV genome. Specifically, the present invention
A hammerhead ribozyme that will cleave in a conserved region of the HCV genome is described. A list of 30 hammerhead ribozymes from conserved regions (5'-non-coding region (NCR) of the HCV genome, 5'-end of the core protein coding region, and 3'-NCR) is shown in Table IV. In general, the Applicant
It has been shown that enzymatic nucleic acid molecules that cleave at the 5 'end of the V genome interfere with translation, whereas ribozymes that cleave a site located at the 3' end of the genome will interfere with RNA replication. I found it. Approximately 50 HCV isolates were identified and sequence alignments of these isolates from genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a, and 6 were performed. Applicants have used these alignments to identify 30 hammerhead ribozyme sites in regions that are highly conserved between each genotype. Twenty-three ribozyme sites were identified in the most homologous region of the conserved region. Thus, one ribozyme can be designed that cleaves all different isolates of HCV. According to the applicant,
Ribozymes designed against conserved regions of various HCV isolates will allow effective inhibition of HCV replication in diverse patient populations, and due to mutations in non-conserved regions of the HCV genome The efficacy of ribozymes against evolving HCV subspecies can be ensured.

【００２８】 "阻害する"とは，ＨＣＶの活性またはＨＣＶゲノムによりコードされるＲＮＡ
のレベルが，核酸の非存在下で観察されるよりも低下していることを意味する。
特に，リボザイムによる阻害は，好ましくは，ｍＲＮＡの同じ部位に結合しうる
が，そのＲＮＡを切断することができない不活性なＲＮＡ分子の存在下で観察さ
れるレベルより低い。“Inhibit” refers to the activity of HCV or RNA encoded by the HCV genome.
Is lower than that observed in the absence of nucleic acid.
In particular, inhibition by the ribozyme is preferably below the level observed in the presence of an inactive RNA molecule that can bind to the same site on the mRNA but is unable to cleave the RNA.

【００２９】 "酵素的核酸"とは，他の核酸分子の部位特異的切断および／またはライゲーシ
ョン，ペプチドおよびアミド結合の切断，およびトランススプライシングを含む
がこれらに限定されない反応を触媒しうる核酸分子を意味する。そのようなエン
ドヌクレアーゼ活性を有する分子は，基質結合領域において特定の遺伝子標的に
相補性を有し，かつその標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素的
活性を有する。すなわち，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，分子内
でまたは分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断し，このことにより，標的ＲＮＡま
たはＤＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は，酵素的ＲＮＡ分子
と標的ＲＮＡまたはＤＮＡとの間に十分なハイブリダイゼーションが生ずるよう
に機能し，切断が生ずることを可能とする。１００％の相補性が好ましいが，５
０−７５％程度の低い相補性も本発明において有用である。核酸は，塩基，糖，
および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボ
ザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，触媒的オリゴヌクレオチ
ド，ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エ
ンドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素
等の用語と互換可能なように用いられる。これらの用語のすべては，酵素的活性
を有する核酸分子を記述する。本明細書に記載される特定の酵素的核酸分子は，
本発明を限定することを意味するものではなく，当業者は，本発明の酵素的核酸
分子において重要なすべては，それが１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的
な特異的な基質結合部位を有し，かつその基質結合部位の中または周辺に分子に
核酸切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることを認識するで
あろう。“Enzymatic nucleic acid” refers to a nucleic acid molecule that can catalyze reactions including, but not limited to, site-specific cleavage and / or ligation of other nucleic acid molecules, cleavage of peptide and amide bonds, and trans-splicing. means. Such molecules with endonuclease activity have complementarity to a particular gene target in the substrate binding region and have enzymatic activity to specifically cleave RNA or DNA in that target. That is, a nucleic acid molecule having endonuclease activity can cleave RNA or DNA within or between molecules, thereby inactivating a target RNA or DNA molecule. This complementation functions to allow sufficient hybridization between the enzymatic RNA molecule and the target RNA or DNA to allow cleavage to occur. 100% complementarity is preferred, but 5%
Complementarities as low as 0-75% are also useful in the present invention. Nucleic acids are bases, sugars,
And / or may be modified with a phosphate group. The term enzymatic nucleic acid is defined as ribozyme, catalytic RNA, enzymatic RNA, catalytic DNA, catalytic oligonucleotide, nucleozyme, DNAzyme, RNA enzyme, endoribonuclease, endonuclease, minizyme, leadzyme, oligozyme or DNA. It is used interchangeably with terms such as enzyme. All of these terms describe nucleic acid molecules that have enzymatic activity. Certain enzymatic nucleic acid molecules described herein are:
Without intending to limit the invention, those skilled in the art will recognize that all that matters in an enzymatic nucleic acid molecule of the invention is that it is a specific substrate binding site complementary to one or more target nucleic acid regions. And having a nucleotide sequence conferring nucleic acid cleavage activity on the molecule in or around its substrate binding site.

【００３０】 "酵素的部分"または"触媒ドメイン"とは，核酸基質の切断に必須のリボザイム
の部分／領域を意味する（例えば図１を参照）。By “enzymatic moiety” or “catalytic domain” is meant a ribozyme moiety / region essential for cleavage of a nucleic acid substrate (see, eg, FIG. 1).

【００３１】 "基質結合アーム"または"基質結合ドメイン"とは，その基質の一部に相補的な
（すなわち，それと塩基対形成しうる）リボザイムの部分／領域を意味する。一
般に，そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはより低くてもよい
。例えば，１４塩基中の１０塩基程度でも塩基対形成しうる。そのようなアーム
は，図１および図３に一般的に示される。すなわち，これらのアームは，リボザ
イムと標的ＲＮＡを相補的塩基対形成相互作用により一緒にすることが意図され
る配列をリボザイム中に含む。本発明のリボザイムは，連続的または非連続的な
，種々の長さの結合アームを有することができる。結合アームの長さは，好まし
くは４ヌクレオチド以上；特に１２−１００ヌクレオチド；より好ましくは１４
−２４ヌクレオチドの長さである。２つの結合アームが選択される場合，その設
計は，結合アームの長さが対称的（すなわち，それぞれの結合アームが同じ長さ
，例えば５ヌクレオチドと５ヌクレオチド，６ヌクレオチドと６ヌクレオチドま
たは７ヌクレオチドと７ヌクレオチドの長さのものである）または非対称的（す
なわち，結合アームが異なる長さ，例えば６ヌクレオチドと３ヌクレオチド；３
ヌクレオチドと６ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと５ヌクレオチド長；４ヌク
レオチドと６ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと７ヌクレオチド長等）である。By “substrate binding arm” or “substrate binding domain” is meant a portion / region of a ribozyme that is complementary to (ie, capable of base pairing with) a portion of its substrate. Generally, such complementarity is 100%, but may be lower if desired. For example, base pairs can be formed even with about 10 bases out of 14 bases. Such an arm is shown generally in FIGS. That is, these arms contain sequences in the ribozyme that are intended to bring the ribozyme and target RNA together by complementary base pairing interactions. The ribozymes of the present invention can have continuous or discontinuous binding arms of various lengths. The length of the binding arm is preferably at least 4 nucleotides; especially 12-100 nucleotides; more preferably 14 nucleotides.
-24 nucleotides in length. When two binding arms are selected, the design is such that the length of the binding arms is symmetric (ie, each binding arm is of the same length, eg, 5 and 5 nucleotides, 6 and 6 nucleotides or 7 nucleotides). 7 nucleotides in length or asymmetric (ie, the binding arms are of different lengths, eg, 6 nucleotides and 3 nucleotides; 3
Nucleotides and 6 nucleotides in length; 4 nucleotides and 5 nucleotides in length; 4 nucleotides and 6 nucleotides in length; 4 nucleotides and 7 nucleotides in length, etc.).

【００３２】 好ましい態様の１つにおいては，酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘア
ピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイントロン，
グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴う
），またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡのモチーフで形成してもよい。
そのようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｄｒｅｙｆｕｓ，（上掲），Ｒｏｓ
ｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍ
ａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３により；ヘアピンモチーフの例は
，Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ
Ｔｒｉｔｚ，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２９，Ｆｅｌｄ
ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２，５３，Ｈａｓｅｌｏｆ
ｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，４３，Ｈａｍｐｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，２９
９により；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は，Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂ
ｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１６により；ＲＮａｓｅ
Ｐモチーフの例は，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８３
Ｃｅｌｌ ３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９０
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３；Ｌｉ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ，１９９６，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，８３５により；Ｎｅｕｒｏｓｐ
ｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は，Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌ
ｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６１，６８５−６９６；
Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎ
ｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，２７９５−２７
９９；Ｇｕｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６
３）により；グループＩＩイントロンの例は，Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，
１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；Ｍｉｃｈｅｌｓ ａｎｄ Ｐｙｌ
ｅ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，２９６５；Ｐｙｌｅ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／２２６８９により；グループＩイントロンの例は，
Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１により；ＤＮＡザイムモ
チーフの例は，Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，４０９２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９７，ＰＮＡＳ ９４，４２６２により，それぞれ記載されている。
これらの特定のモチーフは本発明において限定的なものではなく，当業者は，本
発明の酵素的核酸分子において重要なすべては，それが標的遺伝子のＲＮＡ領域
の１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつその基質結合部
位の中または周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有す
ることであることを認識するであろう。[0032] In one preferred embodiment, the enzymatic nucleic acid molecule is formed with a hammerhead or hairpin motif, but the hepatitis delta virus, group I intron,
It may be formed with a Group II intron or RNase P RNA (with an RNA guide sequence), or a Neurospora VS RNA motif.
An example of such a hammerhead motif is found in Dreyfus, (supra), Ross.
si et al. , 1992, AIDS Research and Hum.
an Retroviruses 8,183; examples of hairpin motifs are described in Hampel et al. , EP 0360257, Hampel and
Tritz, 1989 Biochemistry 28, 4929, Feld
Stein et al. , 1989, Gene 82, 53, Haselof.
f and Gerlach, 1989, Gene, 82, 43, Hampel
et al. , 1990 Nucleic Acids Res. 18,29
9; examples of the hepatitis delta virus motif are described in Perrotta and B
een, 1992 Biochemistry 31, 16; RNase
Examples of P motifs are described in Guerrier-Takada et al. , 1983
Cell 35, 849; Forster and Altman, 1990.
, Science 249, 783; Li and Altman, 1996,
Nucleic Acids Res. 24,835; Neurosp.
An example of an ora VS RNA ribozyme motif is Collins (Savil).
le and Collins, 1990 Cell 61, 685-696;
Savile and Collins, 1991 Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 88, 8826-8830; Collins an.
d Olive, 1993 Biochemistry 32, 2795-27.
99; Guo and Collins, 1995, EMBO. J. 14,36
By 3); examples of Group II introns are described in Griffin et al. ,
1995, Chem. Biol. 2,761; Michels and Pyl
e, 1995, Biochemistry 34, 2965; Pyle et
al. According to WO 96/22689; examples of Group I introns are:
Cech et al. According to U.S. Patent No. 4,987,071; examples of DNAzyme motifs are described in Chartland et al. , 1995, Nucleic
Acids Research 23, 4092; Santro et a
l. , 1997, PNAS 94, 4262, respectively.
These particular motifs are not limiting in the present invention, and those skilled in the art will recognize that all that is important in an enzymatic nucleic acid molecule of the present invention is that it is complementary to one or more of the RNA regions of the target gene. It will be appreciated that it has a specific substrate binding site and, within or around the substrate binding site, a nucleotide sequence that confers RNA cleavage activity on the molecule.

【００３３】 ＨＣＶと"同等な"ＲＮＡとは，ヒト，齧歯類，霊長類，ウサギおよびブタを含
む種々の動物においてＨＣＶ感染と関連する天然に生ずるＲＮＡ分子を含むこと
を意味する。同等なＲＮＡ配列はまた，コーディング領域に加えて，５'−非翻
訳領域，３'−非翻訳領域，イントロン，イントロン−エクソンジャンクション
等の領域を含む。By “equivalent” RNA to HCV is meant to include naturally occurring RNA molecules associated with HCV infection in various animals, including humans, rodents, primates, rabbits and pigs. Equivalent RNA sequences also include, in addition to coding regions, 5'-untranslated regions, 3'-untranslated regions, introns, intron-exon junctions, and the like.

【００３４】 "相補性"とは，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的な型（例えば
，フーグスティーン型）の塩基対形成相互作用により，別のＲＮＡ配列と水素結
合を形成しうる核酸を意味する。“Complementarity” refers to the formation of hydrogen bonds with another RNA sequence by traditional Watson-Crick or other non-traditional (eg, Hoogsteen) base-pairing interactions. Mean nucleic acid.

【００３５】 好ましい態様においては，本発明は，所望の標的のＲＮＡに対して高度な特異
性を示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は，好
ましくは，１つまたはいくつかの酵素的核酸のいずれかにより疾患または状態の
特異的治療が与えられるように，ＨＣＶ蛋白質をコードする標的ｍＲＮＡの高度
に保存された配列領域を標的とする。そのような酵素的核酸分子は，必要に応じ
て，特定の細胞に外的に輸送することができる。あるいは，リボザイムは，特定
の細胞に輸送されたＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができる。In a preferred embodiment, the present invention provides a method for producing a group of enzymatic cleavage agents that exhibit a high degree of specificity for a desired target RNA. The enzymatic nucleic acid molecule is preferably a highly conserved sequence region of a target mRNA encoding an HCV protein, such that either one or several enzymatic nucleic acids provide for specific treatment of a disease or condition. Target. Such enzymatic nucleic acid molecules can be transported externally to specific cells as needed. Alternatively, ribozymes can be expressed from a DNA / RNA vector that has been transported to a particular cell.

【００３６】 そのようなリボザイムは，上述した疾患および状態，および細胞または組織に
おけるＨＣＶの活性のレベルに関連した他の疾患および状態の予防に有用である
。[0036] Such ribozymes are useful for the prevention of the above-mentioned diseases and conditions, and other diseases and conditions associated with the level of activity of HCV in cells or tissues.

【００３７】 "関連する"とは，ＨＣＶ ＲＮＡの阻害が，したがって，それぞれのウイルス
の活性のレベルの低下が，疾患または状態の症状をある程度軽減するであろうこ
とを意味する。“Related” means that inhibition of HCV RNA, and thus a reduced level of activity of the respective virus, will alleviate the symptoms of the disease or condition to some extent.

【００３８】 好ましい態様においては，リボザイムは表ＩＶ−ＩＸの標的配列に相補的な結
合アームを有する。そのようなリボザイムの例もまた，表ＩＶ−ＩＸに示される
。そのようなリボザイムの例は，本質的に，これらの表に規定される配列からな
る。そのような切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。In a preferred embodiment, the ribozyme has a binding arm complementary to the target sequence in Table IV-IX. Examples of such ribozymes are also shown in Table IV-IX. Examples of such ribozymes consist essentially of the sequences defined in these tables. Other sequences that do not interfere with such cleavage may be present.

【００３９】 "本質的に・・・からなる"とは，活性なリボザイムが，実施例におけるものと
同等の酵素的中心またはコア，および標的部位における切断が生ずるようにｍＲ
ＮＡに結合しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しな
い他の配列が存在していてもよい。“Consisting essentially of” means that the active ribozyme has the same enzymatic center or core as in the Examples, and the mR such that cleavage at the target site occurs.
It is meant to include a binding arm that can bind to NA. Other sequences that do not interfere with such cleavage may be present.

【００４０】 すなわち，第１の観点においては，本発明は遺伝子発現および／またはウイル
ス複製を阻害するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成
されたＲＮＡ分子は，その標的ｍＲＮＡのアクセス可能領域に結合する基質結合
ドメインを含む。ＲＮＡ分子はまた，ＲＮＡの切断を触媒するドメインを含む。
ＲＮＡ分子は，好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイム
である。リボザイムは，結合した後，標的ｍＲＮＡを切断して，翻訳および蛋白
質蓄積を防止する。標的遺伝子が発現しないため，ＨＣＶ遺伝子発現および／ま
たは複製が阻害される。That is, in a first aspect, the present invention features a ribozyme that inhibits gene expression and / or virus replication. These chemically or enzymatically synthesized RNA molecules contain a substrate binding domain that binds to the accessible region of its target mRNA. RNA molecules also contain domains that catalyze the cleavage of RNA.
The RNA molecule is preferably a ribozyme with a hammerhead or hairpin motif. After binding, the ribozyme cleaves the target mRNA, preventing translation and protein accumulation. Since the target gene is not expressed, HCV gene expression and / or replication is inhibited.

【００４１】 好ましい態様においては，リボザイムは直接加えるか，またはカチオン性脂質
とともに複合体化するか，リポソーム中に封入するか，または他の方法により標
的細胞に輸送される。核酸または核酸複合体は，エクスビボで，またはインビボ
で，注射，注入ポンプまたはステントにより，バイオポリマー中に取り込むか取
り込まずに，関連する組織に局所的に投与することができる。別の好ましい態様
においては，リボザイムは，適当なリポソームベヒクル中で，ＨＣＶ活性の部位
（例えば肝細胞）に投与される。In a preferred embodiment, the ribozyme is added directly, or complexed with a cationic lipid, encapsulated in liposomes, or otherwise transported to the target cells. The nucleic acid or nucleic acid complex can be administered locally, ex vivo or in vivo, by injection, infusion pump or stent, with or without incorporation into the biopolymer. In another preferred embodiment, the ribozyme is administered to a site of HCV activity (eg, hepatocytes) in a suitable liposome vehicle.

【００４２】 本発明の別の観点においては，標的分子を切断し，ＨＣＶ活性を阻害するリボ
ザイムは，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現さ
れる。組換えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター
である。リボザイム発現ウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイ
ルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができ
るが，これらに限定されない。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベク
ターは，上述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイム
の過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのようなベク
ターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されたら，
リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイム発現ベクターの輸送は，例え
ば静脈内または筋肉内投与により全身的に，または患者から外植された標的細胞
に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入
を可能とする他の任意の手段により，行うことができる（総説については，Ｃｏ
ｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１
０を参照）。本発明の別の観点においては，標的分子を切断しウイルス複製を阻
害するリボザイムは，ＤＮＡ，ＲＮＡ，またはウイルスベクター中に挿入された
転写ユニットから発現される。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベク
ターを上述のように局所的に輸送し，平滑筋細胞中に過渡的に残留させる。しか
し，この目的のために，ＲＮＡの発現を指示する他の哺乳動物細胞ベクターを用
いてもよい。In another aspect of the invention, a ribozyme that cleaves a target molecule and inhibits HCV activity is expressed from a transcription unit inserted into a DNA or RNA vector. The recombinant vector is preferably a DNA plasmid or a viral vector. Ribozyme-expressing viral vectors can be constructed based on, but not limited to, adeno-associated virus, retrovirus, adenovirus, or alphavirus. Preferably, the recombinant vector capable of expressing the ribozyme is transported as described above and remains in the target cells. Alternatively, viral vectors that provide for transient expression of the ribozyme can be used. Such vectors can be administered repeatedly as needed. Once expressed,
Ribozymes cleave target mRNA. Delivery of the ribozyme expression vector may be systemic, for example, by intravenous or intramuscular administration, or by administration to target cells explanted from the patient and then re-introduced into the patient, or introduction into the desired target cells. Can be carried out by any other means that allows
ture and Stinchcomb, 1996, TIG. , 12,51
0). In another aspect of the invention, the ribozyme that cleaves the target molecule and inhibits viral replication is expressed from a transcription unit inserted into DNA, RNA, or a viral vector. Preferably, a recombinant vector capable of expressing a ribozyme is locally delivered as described above and transiently remains in smooth muscle cells. However, other mammalian cell vectors that direct the expression of RNA may be used for this purpose.

【００４３】 "患者"とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細
胞それ自体を意味する。"患者"とはまた，酵素的核酸分子を投与することができ
る生物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好
ましくは，患者はヒトまたはヒト細胞である。“Patient” means an organism that is a donor or recipient of explanted cells, or the cells themselves. "Patient" also refers to an organism to which an enzymatic nucleic acid molecule can be administered. Preferably, the patient is a mammal or a mammalian cell. More preferably, the patient is a human or a human cell.

【００４４】 "ベクター"とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
／またはウイルス系技術を意味する。“Vector” means any nucleic acid-based and / or viral-based technique used to deliver a desired nucleic acid.

【００４５】 これらのリボザイムは，個々に，または組み合わせて，または他の薬剤と一緒
に，上述の疾患または状態を治療するために用いることができる。例えば，当業
者には明らかなように，ＨＣＶのレベルに関連する疾患または状態を治療するた
めに，患者を処置することができ，または他の適当な細胞を処理することができ
る。These ribozymes can be used individually or in combination, or together with other agents, to treat the above-mentioned diseases or conditions. For example, as will be apparent to one of skill in the art, a patient can be treated or other suitable cells can be treated to treat a disease or condition associated with a level of HCV.

【００４６】 本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の説明および特許請求の
範囲から明らかであろう。[0046] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following description of the preferred embodiments, and from the claims.

【００４７】好ましい態様の説明 まず図面を簡単に説明する。図面 図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は
切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は，
三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループＩイントロン：
Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を表す（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１，２７３）。ＲＮａｓｅ
Ｐ（Ｍ１ＲＮＡ）ＥＧＳは外部ガイド配列を表す（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ
．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９
９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８７）。グループＩＩイントロ
ン：５'ＳＳは５'スプライシング部位を意味する；３’ＳＳは３’−スプライシ
ング部位を意味する；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味する；ＥＢＳはエクソ
ン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，３３，２７１６）。ＶＳ ＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは，６つのステム−ルー
プ構造を示す；陰領域は三次相互作用を示す（Ｃｏｌｌｉｎｓ，国際公開ＷＯ９
６／１９５７７）。ＨＤＶリボザイム：Ｉ−ＩＶは４つのステム−ループ構造を
示す（Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッ
ドリボザイム：Ｉ−ＩＩＩは，３つのステム−ループ構造を示す；ステムＩ−Ｉ
ＩＩは，任意の長さであってもよく，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７
）。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１，４および５は任意の長さでありうる；
ヘリックス２は３−８塩基対の長さである；Ｙはピリミジンである；ヘリックス
２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対で与えられ（すなわち，ｎは１，２，３または
４），ヘリックス５は任意に２塩基またはそれ以上の長さでありうる（好ましく
は３−２０塩基，すなわち，ｍは１−２０またはそれ以上）。ヘリックス２およ
びヘリックス５は，１またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（す
なわち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５はまた，リボザイム構造
を安定化するために，２塩基対またはそれ以上長くてもよく（すなわち４−２０
塩基対），好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において，各Ｎおよ
びＮ'は，独立して，任意の正常または修飾塩基であり，各ダッシュは潜在的塩
基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸で修飾さ
れていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが，好まし
い。ヘリックス１および４は，ある程度の塩基対形成が保持される限り，任意の
サイズでありうる（すなわち，ｏおよびｐは，それぞれ独立して，０から任意の
数，例えば２０である）。必須塩基は，構造中に特定の塩基として示されるが，
当業者は，１またはそれ以上が化学的に修飾（脱塩基，塩基，糖および／または
リン酸修飾）されていてもよく，または著しい影響なしで他の塩基で置き換えら
れていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は，２つの別々の分子か
ら，すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは，存在する場合，
その塩基，糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドで
ある。ｑは２塩基以上である。接続ループはまた，非ヌクレオチドリンカー分子
で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを表す。Ｙはピリミジ
ン塩基を表す。"＿＿"は，共有結合を表す（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９
６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈｏ
ｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６３１，３５９）。 Description of the Preferred Embodiment First, the drawings will be briefly described. Drawings FIG. 1 shows the secondary structure models of seven different types of enzymatic nucleic acid molecules. Arrows indicate sites of cleavage. −−−−−−−−− indicates the target sequence. The lines with scattered points are
Shows tertiary interactions. -Indicates base pairing interaction. Group I intron:
P1-P9.0 represents various stem-loop structures (Cech et al.,
1994, Nature Struc. Bio. , 1,273). RNase
P (M1RNA) EGS represents an external guide sequence (Forster et al.
. 1990, Science, 249, 783; Pace et al. , 19
90, J. M .; Biol. Chem. , 265, 3587). Group II introns: 5 'SS means 5' splice site; 3 'SS means 3'-splice site; IBS means intron binding site; EBS means exon binding site (Pyle et al. , 1994, Biochemi.
try, 33, 2716). VS RNA: I-VI shows a six stem-loop structure; the negative region shows tertiary interactions (Collins, International Publication WO 9).
6/19577). HDV ribozymes: I-IV exhibit a four stem-loop structure (Been et al., US Pat. No. 5,625,047). Hammerhead ribozyme: I-III shows three stem-loop structures; Stem II
II may be of any length and may be symmetric or asymmetric (Usman e
t al. , 1996, Curr. Op. Struct. Bio. , 1,527
). Hairpin ribozyme: helices 1, 4 and 5 can be of any length;
Helix 2 is 3-8 base pairs in length; Y is a pyrimidine; helix 2 (H2) is given at least 4 base pairs (ie, n is 1, 2, 3, or 4) and helix 5 is Optionally it can be 2 bases or more in length (preferably 3-20 bases, ie, m is 1-20 or more). Helix 2 and helix 5 may be covalently linked by one or more bases (ie, r is one or more bases). Helix 1, 4 or 5 may also be 2 base pairs or longer (ie, 4-20) to stabilize the ribozyme structure.
Base pair), preferably a protein binding site. In each example, each N and N ′ is independently any normal or modified base, and each dash represents a potential base pair interaction. These nucleotides may be modified with sugars, bases or phosphates. Complete base pairing in the helix is not required, but is preferred. Helixes 1 and 4 can be of any size, as long as some degree of base pairing is retained (ie, o and p are each independently 0 to any number, eg, 20). Essential bases are designated as specific bases in the structure,
One skilled in the art will recognize that one or more may be chemically modified (abasic, base, sugar and / or phosphate modified), or may be replaced by another base without significant effect. Will recognize. Helix 4 may be formed from two separate molecules, ie, without connecting loops. If a connection loop exists,
A ribonucleotide with or without modification of its base, sugar or phosphate. q is 2 bases or more. The connecting loop may also be replaced by a non-nucleotide linker molecule. H represents a base A, U, or C. Y represents a pyrimidine base. "__" represents a covalent bond (Burke et al., 199).
6, Nucleic Acids & Mol. Biol. , 10, 129; Cho
wrira et al. U.S. Pat. No. 5,631,359).

【００４８】 図２は，保存５'ＨＣＶ ＵＴＲ領域中の種々の部位を標的とするリボザイム
がいくつかの遺伝子型から生じた転写産物を切断する能力を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the ability of ribozymes targeting various sites in the conserved 5 ′ HCV UTR region to cleave transcripts generated from several genotypes.

【００４９】 図３は，培養細胞におけるルシフェラーゼ活性のリボザイム媒介性低下を示す
ために用いられたデュアルレポーターシステムの概略図である。FIG. 3 is a schematic of the dual reporter system used to demonstrate ribozyme-mediated reduction of luciferase activity in cultured cells.

【００５０】 図４は，リボザイムがＯＳＴ−７細胞においてルシフェラーゼ活性を低下させ
る能力を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the ability of ribozymes to reduce luciferase activity in OST-7 cells.

【００５１】 図５は，ＯＳＴ−７細胞において，部位ＨＣＶ．５−３１３およびＨＣＶ．５
−３１８を標的とするリボザイムが，その不活性対照と比較して，ルシフェラー
ゼ活性を低下させる能力を示すグラフである。FIG. 5 shows that in OST-7 cells, the site HCV. 5-313 and HCV. 5
Figure 4 is a graph showing the ability of ribozymes targeting -318 to reduce luciferase activity as compared to an inactive control.

【００５２】 図６Ａは，ＨＣＶ−ポリオウイルス（ＰＶ）複製に及ぼすリボザイム処理の影
響を示す棒グラフである。９６ウエルプレート中のＨｅＬａ細胞にＨＣＶ−ＰＶ
を感染多重度（ＭＯＩ）０．１で感染させた。次に，ウイルス接種物を，５％血
清，および示されるようにカチオン性脂質と複合体化させたリボザイムまたは対
照（２００ｎＭ）を含有する培地で置き換えた。２４時間後，細胞を３回凍結／
融解することにより溶解させ，ウイルスをプラークアッセイにより定量した。ス
クランブル対照（ＳＡＣ），結合対照（ＢＡＣ），３Ｐ＝Ｓリボザイム，および
４Ｐ＝Ｓリボザイムが示されている。プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌは，３
重の試料の平均＋標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示されている。FIG. 6A is a bar graph showing the effect of ribozyme treatment on HCV-poliovirus (PV) replication. HCV-PV was added to HeLa cells in a 96-well plate.
Were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1. Next, the virus inoculum was replaced with medium containing 5% serum and ribozymes or controls (200 nM) complexed with cationic lipids as indicated. After 24 hours, freeze the cells three times /
Lysed by thawing and virus was quantified by plaque assay. Scramble control (SAC), binding control (BAC), 3P = S ribozyme, and 4P = S ribozyme are shown. Plaque forming units (pfu) / ml is 3
Shown as the mean + standard deviation (SD) of the duplicate samples.

【００５３】 図６Ｂは，野生型ＰＶの複製に及ぼすリボザイム処理の影響を示す棒グラフで
ある。９６ウエルプレート中のＨｅＬａ細胞に野生型ＰＶをＭＯＩ＝０．０５で
３０分間感染させた。すべてのリボザイムは，４Ｐ＝Ｓを含んでいた（Ｂ）。プ
ラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌは，３重の試料の平均＋標準偏差（Ｓ．Ｄ．）
として示されている。FIG. 6B is a bar graph showing the effect of ribozyme treatment on wild-type PV replication. HeLa cells in a 96-well plate were infected with wild-type PV at MOI = 0.05 for 30 minutes. All ribozymes contained 4P = S (B). Plaque forming units (pfu) / ml is the mean of triplicate samples + standard deviation (SD)
It is shown as

【００５４】 図７は，ＨＣＶ ＲＮＡを標的とする．種々のハンマーヘッドリボザイム構築
物の概略図である。FIG. 7 targets HCV RNA. FIG. 1 is a schematic of various hammerhead ribozyme constructs.

【００５５】 図８は，１回のＨＣＶ−ＰＶ感染に及ぼす部位１８３リボザイム処理の影響を
示すグラフである。ＨｅＬａ細胞にＨＣＶ−ＰＶをＭＯＩ＝５で３０分間感染さ
せ，次にリボザイムまたは対照で処理した。６，７または８時間後に細胞を溶解
し，プラークアッセイによりウイルスを定量した。リボザイム結合アーム／ステ
ムＩＩフォーマット（７／４，７／３，６／４，６／３）およびスクランブル対
照（ＳＡＣ，７／４フォーマット）が示されている。すべて４Ｐ＝Ｓ安定化を含
んでいた。結果は，ｐｆｕ／ｍｌで，二重の試料の中央値＋範囲で示されている
。FIG. 8 is a graph showing the effect of site 183 ribozyme treatment on one HCV-PV infection. HeLa cells were infected with HCV-PV at MOI = 5 for 30 minutes and then treated with ribozymes or controls. Cells were lysed after 6, 7 or 8 hours and virus was quantified by plaque assay. The ribozyme binding arm / stem II format (7/4, 7/3, 6/4, 6/3) and the scramble control (SAC, 7/4 format) are shown. All included 4P = S stabilization. Results are shown in pfu / ml, median of duplicate samples + range.

【００５６】 図９は，本明細書に記載される３つのリボザイムモチーフの二次構造モデルを
示す。FIG. 9 shows a secondary structure model of the three ribozyme motifs described herein.

【００５７】 図１０は，インターフェロンと組み合わせた抗ＨＣＶリボザイムの活性を示す
。結果は，ｐｆｕ／ｍｌで，二重の試料の中央値＋範囲で示される。ＢＡＣ，結
合弱化対照分子；ＩＦ，インターフェロン；Ｒｚ，ＨＣＶ部位１８３を標的とす
るハンマーヘッドリボザイム；ｐｆｕ，プラーク形成単位。FIG. 10 shows the activity of anti-HCV ribozyme in combination with interferon. Results are given in pfu / ml, median of duplicate samples + range. BAC, binding weakened control molecule; IF, interferon; Rz, hammerhead ribozyme targeting HCV site 183; pfu, plaque forming unit.

【００５８】リボザイム 現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られている。さらに
，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．
Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエステル結
合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してきた（Ｊ
ｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９
９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅ
ａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８
；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９
９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６
２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙ
ｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，
１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，（上掲）；
Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，６４
９５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。それぞれは
，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを含
む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しう
る）。表Ｉは，これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたものである。一
般に，酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのよ
うな結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持
された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，ま
ず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正
しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標
的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊
するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡ
から離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができ
る。 Ribozymes Currently, seven basic variants of naturally occurring enzymatic RNA are known. In addition, several in vitro selection (evolution) strategies (Orgel, 1979, Proc.
R. Soc. (London, B205, 435), a new nucleic acid catalyst has been developed which can catalyze the cleavage and ligation of phosphodiester bonds (J.
oyce, 1989, Gene, 82, 83-87; BEAUDRY et a.
l. , 1992, Science 257, 635-641; Joyce, 19
92, Scientific American 267, 90-97; Bre
aker et al. , 1994, TIBTECH 12, 268;
el et al. , 1993, Science 261: 1411-1418.
Szostak, 1993, TIBS 17, 89-93; Kumar et.
al. , 1995, FASEB J .; , 9, 1183; Breaker, 19
96, Curr. Op. Biotech. , 7, 442; Santro et.
al. , 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. , 94,426
2; Tang et al. , 1997, RNA 3,914; Nakamay
e & Eckstein, 1994, supra; Long & Uhlenbeck,
1994, supra; Ishizaka et al. , 1995, supra.
See Vaish et al. , 1997, Biochemistry 36, 64.
95; (all of which are incorporated herein by reference). Each can catalyze a series of reactions under physiological conditions, including hydrolyzing phosphodiester bonds in trans (and thus can cleave other RNA molecules). Table I summarizes some properties of these ribozymes. Generally, enzymatic nucleic acids work by first binding to a target RNA. Such binding results from the target binding portion of the enzymatic nucleic acid being held in close proximity to the enzymatic portion of the molecule that acts to cleave the target RNA. That is, the enzymatic nucleic acid first recognizes the target RNA, then binds to it by complementary base pairing, and once bound to the correct site, acts enzymatically to cleave the target RNA. Such strategic cleavage of the target RNA will destroy its ability to direct the synthesis of the encoded protein. After the enzymatic nucleic acid binds and cleaves the RNA target, the RNA
Can search for another target, and repeatedly bind and cleave a new target.

【００５９】 リボザイムの酵素的性質は，治療を行うのに必要なリボザイムの濃度が低いた
め，他の技術より有利である。この利点は，リボザイムが酵素的に作用する能力
を反映している。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切
断することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な阻害剤であり，そ
の阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標
的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミス
マッチまたは塩基置換を選択して，リボザイムの触媒活性を完全に排除すること
ができる。[0059] The enzymatic properties of ribozymes are advantageous over other techniques because of the lower levels of ribozymes required to effect therapy. This advantage reflects the ability of the ribozyme to act enzymatically. That is, one ribozyme molecule can cleave many target RNA molecules. In addition, ribozymes are highly specific inhibitors whose specificity of inhibition depends not only on the base-pairing mechanism of binding to the target RNA, but also on the mechanism of target RNA cleavage. A single mismatch or base substitution near the site of cleavage can be selected to completely eliminate the catalytic activity of the ribozyme.

【００６０】 エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特
異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような
酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，イ
ンビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２
４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８
，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅ
ｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８
；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１
，１９８９；Ｃｈａｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，４０９２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ
．，１９９７（上掲））ＰＮＡＳ ９４，４２６２）。A nucleic acid molecule having endonuclease enzyme activity can repeatedly cleave another RNA molecule in a nucleotide sequence-specific manner. Such enzymatic nucleic acid molecules can target virtually all RNA transcripts and achieve efficient cleavage in vitro (Zaug et al., 32).
4, Nature 429 1986; Uhlenbeck, 1987 Nat.
ure 328, 596; Kim et al. , 84 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 8788, 1987; Dreyfus, 1988.
, Einstein Quart. J. Bio. Med. , 6,92; Hase
Loff and Gerlach, 334 Nature 585, 1988
Cech, 260 JAMA 3030, 1988; Jefferies e
t al. , 17 Nucleic Acids Research 1371
, 1989; Chartland et al. , 1995, Nucleic
Acids Research 23, 4092; Santro et al.
. , 1997 (supra)) PNAS 94, 4262).

【００６１】 その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾患の治療剤とし
て有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａ
ｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７
）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切
断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性に
し，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連
する蛋白質の合成が選択的に阻害される。Because of their sequence specificity, trans-cleaved ribozymes hold promise as therapeutics for human diseases (Usman & McSwigen, 1995 Ann. Rep.
Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen a
nd Marr, 1995J. Med. Chem. 38, 2023-2037
). Ribozymes can be designed to cleave specific RNA targets in the background of cellular RNA. Such a cleavage event renders the RNA non-functional and eliminates protein expression from the RNA. In this way, the synthesis of proteins associated with the disease state is selectively inhibited.

【００６２】 ＨＣＶ ＲＮＡの特定の部位を切断するリボザイムは，Ｃ型肝炎ウイルスによ
る感染の新規な治療方法である。本出願人は，リボザイムがＨＣＶの活性を阻害
しうること，およびリボザイムの触媒活性がその阻害効果に必要であることを示
す。当業者は，記載される実施例から，ＨＣＶ ＲＮＡを切断する他のリボザイ
ムを容易に設計することができ，これらも本発明の範囲内であることが明らかで
あることを理解するであろう。[0062] Ribozymes that cleave specific sites in HCV RNA are a novel therapeutic method for infection by hepatitis C virus. Applicants show that ribozymes can inhibit the activity of HCV and that the catalytic activity of ribozymes is required for its inhibitory effect. Those of skill in the art will understand from the examples described that other ribozymes that cleave HCV RNA can be readily designed and are also within the scope of the present invention.

【００６３】標的部位 有用なリボザイムの標的は，以下の開示にしたがって決定することができる（
Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ
ａｌ．，ＷＯ９３／２３０５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９４
／０：２５９５；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／０４８１８；ＭｃＳ
ｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５２５，４６８（これらのすべてを
本明細書の一部としてここに引用する））。ここでは，これらの文献に与えられ
るガイダンスを繰り返さず，以下にそのような方法の特定の例を提供するが，こ
れらは当業者を限定するものではない。そのような標的に対するリボザイムを，
これらの出願に記載されるように設計し，これもまた記載されるようにインビト
ロおよびインビボで試験すべく合成した。そのようなリボザイムはまた，本明細
書に記載されるように最適化し，輸送することができる。 Target Sites Useful ribozyme targets can be determined according to the disclosure below (
Draper et al. Sullivan et al., WO 93/23569;
al. Thompson et al., WO 93/23057; , WO94
/ 0: 2595; Draper et al. , WO 95/04818; McS
Wigen et al. U.S. Pat. No. 5,525,468, all of which are incorporated herein by reference. Here, without repeating the guidance given in these documents, the following provides specific examples of such methods, which are not limiting to those skilled in the art. Ribozymes against such targets,
They were designed as described in these applications and were also synthesized for testing in vitro and in vivo as described. Such ribozymes can also be optimized and transported as described herein.

【００６４】 コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ＨＣＶ ＲＮＡの配列を，最適
リボザイム標的部位についてスクリーニングした。ハンマーヘッドまたはヘアピ
ンリボザイム切断部位を同定した。これらの部位は表ＩＶ−ＶＩＩＩに示される
（表中，すべての配列は５’から３'方向である）。表中，ヌクレオチド塩基の
位置は，指示されたタイプのリボザイムにより切断されるべき位置として示され
る。Using a computer folding algorithm, the sequences of HCV RNA were screened for optimal ribozyme target sites. Hammerhead or hairpin ribozyme cleavage sites were identified. These sites are shown in Tables IV-VIII, where all sequences are in the 5 'to 3' direction. In the tables, the position of the nucleotide base is indicated as the position to be cleaved by the indicated type of ribozyme.

【００６５】 ＨＣＶ ＲＮＡは，ある領域中では高度に相同性であるため，いくつかのリボ
ザイム標的部位もまた相同性である（表ＩＶおよびＶＩＩＩを参照）。この場合
，１つのリボザイムが異なる種類のＨＣＶ ＲＮＡを標的とするであろう。いく
つかの種類のＨＣＶ ＲＮＡを標的とする１つのリボザイムの利点は，特に，こ
れらのＲＮＡの１またはそれ以上が疾患状態に寄与しているかもしれない場合に
明らかである。[0065] Because HCV RNA is highly homologous in certain regions, some ribozyme target sites are also homologous (see Tables IV and VIII). In this case, one ribozyme will target different types of HCV RNA. The advantages of one ribozyme targeting several types of HCV RNA are particularly apparent where one or more of these RNAs may contribute to a disease state.

【００６６】 ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイムは，結合しうるように設計し，コン
ピュータ折り畳みにより別々に分析して（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８６，７７０６），
リボザイム配列が適当な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アーム
と触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは，考慮か
ら除外した。活性を最適化するために，種々の結合アーム長を選択することがで
きる。一般に，各アーム上の少なくとも５塩基が，標的ＲＮＡに結合することが
できるか，さもなくばそれと相互作用することができる。ハンマーヘッドまたは
ヘアピンモチーフのリボザイムをｍＲＮＡメッセージの種々の部位にアニーリン
グするように設計した。標的部位配列に相補的な結合アームは上述のとおりであ
る。The hammerhead or hairpin ribozyme was designed to be capable of binding and analyzed separately by computer folding (Jaeger et al., 198).
9 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7706),
It was evaluated whether the ribozyme sequence was folded into an appropriate secondary structure. Ribozymes with undesired intramolecular interactions between the binding arm and the catalytic core were excluded from consideration. Various binding arm lengths can be selected to optimize activity. Generally, at least 5 bases on each arm are able to bind to or otherwise interact with the target RNA. Hammerhead or hairpin motif ribozymes were designed to anneal to various sites in the mRNA message. The binding arm complementary to the target site sequence is as described above.

【００６７】リボザイム合成 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難
であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，
小さい核酸モチーフ（例えば，ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム）が外
的輸送に用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸がｍＲＮＡ構
造の標的領域に進入する能力が高い。しかし，これらの核酸分子はまた，細胞中
で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａ
ｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；Ｍｃ
Ｇａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ Ｓｃａｎｌｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１
９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌ
ｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅ
ｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３
１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１２２２−１２２５
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２３，２２５９）。当業者は，真核生物細胞中で適当なＤＮＡ／ＲＮＡ
ベクターから任意の核酸を発現させることができることを理解するであろう。そ
のような核酸の活性は，リボザイムによってそれらを一次転写産物から放出させ
ることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ
ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／
０２５９５（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）；Ｏｈ
ｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．
Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ
ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９
−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６９，２５８５６）。 Ribozyme Synthesis The synthesis of nucleic acids longer than 100 nucleotides is difficult using automated methods, and the therapeutic cost of such molecules is very high. In the present invention,
Small nucleic acid motifs (eg, hammerheads or hairpin ribozymes) are used for external transport. Because of the simple structure of these molecules, the ability of the nucleic acid to enter the target region of the mRNA structure is high. However, these nucleic acid molecules can also be expressed in cells from eukaryotic promoters (eg, Izanta).
nd Weintraub, 1985 Science 229, 345; Mc
Garry and Lindquist, 1986 Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 83,399; Sullenger Scanlo
net et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al. , 1
992 Antisense Res. Dev. , 2, 3-15; Dropul
ic et al. , 1992 J.C. Virol, 66, 1432-41; We
erasinghe et al. , 1991 J .; Virol, 65, 553
1-4; Ojwang et al. , 1992 Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 89, 10802-6; Chen et al. , 19
92 Nucleic Acids Res. , 20, 4581-9; Sarv
er et al. , 1990 Science 247, 1222-1225.
Thompson et al .; , 1995 Nucleic Acids
Res. 23, 2259). One of skill in the art will appreciate that appropriate eukaryotic DNA / RNA
It will be appreciated that any nucleic acid can be expressed from the vector. The activity of such nucleic acids can be increased by releasing them from primary transcripts by ribozymes (Draper et al., PCT
WO 93/23569, Sullivan et al. , PCT WO94 /
02595 (both are hereby incorporated by reference in their entirety); Oh
Kawa et al. , 1992 Nucleic Acids Symp.
Ser. , 27, 15-6; Taira et al. , 1991, Nucl
eic Acids Res. , 19, 5125-30; Ventura et.
al. , 1993 Nucleic Acids Res. , 21,3249
-55; Chowrira et al. , 1994 J .; Biol. Chem
. 269, 25856).

【００６８】 実施例のリボザイムは化学的に合成した。用いた合成の方法は，通常のＲＮＡ
合成の方法（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６
８４）にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５'末端
にジメトキシトリチル，および３'−末端にホスホルアミダイトを用いた。３９
４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した２．
５μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドに
ついては５分間のカップリング工程を，２'−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについ
ては２．５分間のカップリング工程を行い，小スケールの合成を行った。表ＩＩ
は，合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時間の概要を示す。各カッ
プリングサイクルにおいて，ポリマー結合５'−ヒドロキシルに対して６．５倍
過剰（１６３μＬの０．１Ｍ＝１６．３μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび
２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（２３８μＬの０．２５Ｍ＝５９．５μｍ
ｏｌ）を用いた。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合
成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して
，９７．５−９９％であった。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
，Ｉｎｃ．合成器用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：
脱トリチル化溶液は塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピング
は，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無
水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍ
Ｍ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった
。Ｂ＆Ｊ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラ
ゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した
。The ribozymes of the examples were chemically synthesized. The method of synthesis used was a standard RNA
Methods of synthesis (Usman et al., 1987 J. Am. Chem. So
c. Scaringe et al., 109, 7845; , 1990 Nuc
leic Acids Res. , 18, 5433; Wincott et a
l. , 1995 Nucleic Acids Res. 23,2677-26
84), conventional nucleic acid protecting and coupling groups, for example dimethoxytrityl at the 5 'end and phosphoramidites at the 3' end. 39
4 Applied Biosystems, Inc. Modified by a synthesizer
Using a 5 μmol scale protocol, a small scale synthesis was performed with a 5 minute coupling step for alkylsilyl protected nucleotides and a 2.5 minute coupling step for 2′-O-methylated nucleotides. . Table II
Outlines the amounts of reagents and contact times used in the synthesis cycle. In each coupling cycle, a 6.5-fold excess (163 μL of 0.1 M = 16.3 μmol) of phosphoramidite and a 24-fold excess of S-ethyltetrazole (238 μL of 0.25 M relative to polymer-bound 5′-hydroxyl) = 59.5 μm
ol). 394 Applied Biosystems, Inc. The average coupling yield in the synthesizer was 97.5-99% as determined by colorimetric determination of the trityl fraction. 394 Applied Biosystems
, Inc. Other oligonucleotide synthesis reagents for the synthesizer are as follows:
The detritylation solution is 2% TCA in methylene chloride (ABI); capping is in 16% N-methylimidazole in THF (ABI) and 10% acetic anhydride / 10% 2,6-lutidine in THF (ABI). The oxidation solution is 16.9 m
M I 2, 49 mM pyridine, 9% water in THF (Millipore). B & J synthetic grade acetonitrile was used directly from the reagent bottle. The S-ethyltetrazole solution (0.25M in acetonitrile) was obtained from American Inter
national Chemical, Inc. Made from solid obtained from.

【００６９】 ＲＮＡの脱保護は以下のように実施した。ポリマー結合オリゴリボヌクレオチ
ド（トリチルオフ）を合成カラムから４ｍＬガラスねじ蓋バイアルに移し，メチ
ルアミン（ＭＡ）の溶液中に６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した後
，上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣ
Ｎ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清
に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を
得た。The deprotection of RNA was performed as follows. The polymer-bound oligoribonucleotide (trityl-off) was transferred from the synthesis column to a 4 mL glass screw cap vial and suspended in a solution of methylamine (MA) at 65 ° C. for 10 minutes. After cooling to −20 ° C., the supernatant was removed from the polymer support. The support was washed with 1.0 mL of EtOH: MeC
Washed three times with N: H 2 O / 3: 1: 1, vortexed, and then added the supernatant to the first supernatant. The combined supernatant containing the oligoribonucleotides was dried to give a white powder.

【００７０】 塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（２５０
μL溶液，１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μL ＴＥＡおよび１．
０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦから１．４Ｍ ＨＦ濃度を得る）に再懸濁し，６５℃に
１．５時間加熱した。得られた完全に脱保護したオリゴマーを，５０ｍＭ ＴＥ
ＡＢ（９ｍＬ）で急冷し，次にアニオン交換脱塩に供した。The base deprotected oligoribonucleotide was added to an anhydrous TEA · HF / NMP solution (250
μL solution, 1.5 mL N-methylpyrrolidinone, 750 μL TEA and
0 mL TEA.3HF to obtain a 1.4M HF concentration) and heated to 65 ° C. for 1.5 hours. The completely deprotected oligomer obtained was purified with 50 mM TE.
Quenched with AB (9 mL) and then subjected to anion exchange desalting.

【００７１】 脱保護オリゴマーのアニオン交換脱塩のためには，５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０
ｍＬ）であらかじめ洗浄したＱｉａｇｅｎ５００（登録商標）アニオン交換カー
トリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）にＴＥＡＢ溶液を負荷した。負荷したカー
トリッジを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後，２Ｍ ＴＥＡＢ（１
０ｍＬ）でＲＮＡを溶出し，乾燥して白色粉末とした。For anion exchange desalting of the deprotected oligomer, 50 mM TEAB (10
mL) was loaded with a TEAB solution onto a Qiagen 500® anion exchange cartridge (Qiagen Inc.). After washing the loaded cartridge with 50 mM TEAB (10 mL), 2 M TEAB (1
(0 mL) and dried to a white powder.

【００７２】 Ｇ５とＡ６の順番を変更し，Ａ１４をＵで置換することにより，不活性なハン
マーヘッドリボザイムを合成した（番号付けは，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．， ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２
５２による）。不活性リボザイムはまた，Ｇ５をＵで，Ａ１４をＵで置換するこ
とにより合成した。場合によっては，全体の塩基組成を維持したまま基質結合ア
ームの配列をランダム化した。An inactive hammerhead ribozyme was synthesized by changing the order of G5 and A6 and replacing A14 with U (numbering is from Hertel, KJ, e).
t al. , 1992, Nucleic Acids Res. , 20,32
52). Inactive ribozymes were also synthesized by replacing G5 with U and A14 with U. In some cases, the sequence of the substrate binding arm was randomized while maintaining the overall base composition.

【００７３】 平均段階カップリング収率は，＞９８％（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１
９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）で
あった。The average step coupling yield was> 98% (Wincott et al., 1
995 Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684).

【００７４】 ヘアピンリボザイムは，２つの部分で合成し，アニーリングして活性なリボザ
イムを再構築する（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムは
また，バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレート
から合成することができる（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，
１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。A hairpin ribozyme is synthesized in two parts and annealed to reconstitute an active ribozyme (Chowrira and Burke, 1992 Nuc).
leic Acids Res. , 20, 2835-2840). Ribozymes can also be synthesized from DNA templates using bacteriophage T7 RNA polymerase (Milligan and Uhlenbeck,
1989, Methods Enzymol. 180, 51).

【００７５】 リボザイムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば２’−アミノ，２'−Ｃ−アリル
，２'フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾する
ことにより，安定性を増強および／または触媒活性を増強するように修飾するこ
とができる（総説として，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２
ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ，Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ
．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６，１４０９０を参照）。Ribozymes can be made stable by modification with nuclease resistant groups such as 2′-amino, 2′-C-allyl, 2′fluoro, 2′-O-methyl, 2′-H, nucleotide base modifications. Can be modified to enhance and / or enhance catalytic activity (for review, see Usman and Cedergren, 1992).
TIBS 17, 34; Usman et al. , 1994 Nuclei
c Acids Symp, Ser. 31,163; Burgin et al
. , 1996 Biochemistry 6,14090).

【００７６】 リボザイムは，一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，
国際公開ＷＯ９５／２３２２５（そのすべてを本明細書の一部としてここに引用
する）を参照）により精製し，水に再懸濁した。Ribozymes can be purified by gel electrophoresis using general methods, or by high performance liquid chromatography (HPLC; Stinchcomb et al.,
Purified by WO 95/23225 (see all of which are incorporated herein by reference) and resuspended in water.

【００７７】 本研究において有用な，化学的に合成したリボザイムの配列は，表ＩＶ−ＩＸ
に示される。当業者は，これらの配列が，リボザイムの酵素的部分（結合アーム
以外のすべて）が活性に影響するように変更されているはるかに多くのそのよう
な配列の代表にすぎないことを認識するであろう。例えば，ハンマーヘッドリボ
ザイムのステム−ループＩＩ配列は，最低２塩基対のステム構造が形成しうる限
り，任意の配列を含むように変更（置換，欠失，および／または挿入）すること
ができる。同様に，ヘアピンリボザイムのステム−ループＩＶ配列は，最低２塩
基対のステム構造が形成しうる限り，任意の配列を含むように変更（置換，欠失
，および／または挿入）することができる。好ましくは，これらの位置には２０
０塩基以上は挿入しない。表ＩＶ−ＩＸに挙げられる配列は，リボヌクレオチド
または他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドとして形成することができる。そ
のようなリボザイム（酵素的活性を有する）は，表に示される特定のリボザイム
と同等である。The sequences of chemically synthesized ribozymes useful in this study are listed in Table IV-IX
Is shown in One of skill in the art will recognize that these sequences are only representative of many more such sequences in which the enzymatic portion of the ribozyme (all but the binding arm) has been modified to affect activity. There will be. For example, the stem-loop II sequence of a hammerhead ribozyme can be altered (substituted, deleted, and / or inserted) to include any sequence as long as a stem structure of at least two base pairs can be formed. Similarly, the stem-loop IV sequence of the hairpin ribozyme can be altered (substituted, deleted, and / or inserted) to include any sequence as long as a stem structure of at least two base pairs can be formed. Preferably, these positions have 20
Do not insert more than 0 bases. The sequences listed in Table IV-IX can be formed as ribonucleotides or other nucleotides or non-nucleotides. Such ribozymes (with enzymatic activity) are equivalent to the specific ribozymes shown in the table.

【００７８】リボザイム活性の最適化 本発明に記載されるリボザイムの触媒活性は，Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，
（上掲）に記載のように最適化することができる。詳細はここでは繰り返さない
が，例えば，リボザイム結合アームの長さの変更，または血清リボヌクレアーゼ
による分解を防ぎ，および／またはその酵素的活性を増強する修飾（塩基，糖お
よび／またはリン酸）を有するリボザイムの化学的合成が挙げられる（例えば，
Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａ
ｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅ
ｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ
ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５
１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏ
ａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上
掲）を参照；これらはすべて酵素的ＲＮＡ分子の塩基，リン酸および／または糖
成分になしうる種々の化学修飾を記載する）。細胞中におけるその抗力を増強す
る修飾，およびＲＮＡ合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するためにステ
ムループ構造から塩基を除去することが望ましい（これらの刊行物のすべてを本
明細書の一部としてここに引用する）。 Optimization of Ribozyme Activity The catalytic activity of the ribozymes described in the present invention was determined by Draper et al. ,
It can be optimized as described in (supra). Details will not be repeated here, but have, for example, alterations in the length of the ribozyme binding arm or modifications (bases, sugars and / or phosphates) that prevent degradation by serum ribonucleases and / or enhance their enzymatic activity Chemical synthesis of ribozymes (for example,
Eckstein et al. , International Publication WO92 / 07065; Perra
ult et al. , 1990 Nature 344, 565; Pieke
net et al. Usman, 1991 Science 253, 314;
and Cedergren, 1992 Trends in Biochem
. Sci. 17, 334; Usman et al. , International Publication WO93 / 15
187; Rossi et al. , International Publication WO91 / 03162; Spro
at, U.S. Patent 5,334,711; and Burgin et al. , Supra; all of which describe various chemical modifications that can be made to the base, phosphate and / or sugar components of an enzymatic RNA molecule). It is desirable to modify bases to enhance their drag in cells, and to remove bases from stem-loop structures to shorten RNA synthesis time and reduce the need for chemicals (all of these publications are incorporated herein by reference). Quoted here as part).

【００７９】 当該技術分野には，触媒活性に有意に影響することなくそのヌクレアーゼ安定
性および効力を有意に増強することができる，酵素的核酸分子に導入することが
できる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。リボザイムは
，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フル
オロ，２’−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することによ
り，安定性を高め，および／または触媒活性を増強するために修飾する（総説に
ついては，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ
１７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４０９０を参照）。酵素的核酸分子の糖
修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａ
ｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅ
ｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１
７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７
；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２を参照，こ
れらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
このような文献は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／またはリン
酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載
しており，本明細書の一部としてここに引用する。これらの教示に基づいて，同
様の修飾を本明細書に記載されるように用いて，本発明の核酸触媒を修飾するこ
とができる。The art knows that sugar, base and phosphate modifications that can be introduced into enzymatic nucleic acid molecules can significantly enhance their nuclease stability and potency without significantly affecting catalytic activity. There are some examples that describe Ribozymes have improved stability by modification with nuclease resistant groups such as 2'-amino, 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2'-O-methyl, 2'-H, nucleotide base modifications. To enhance and / or enhance catalytic activity (for a review, see Usman and Cedergren, 1992 TITBS
17, 34; Usman et al. , 1994 Nucleic Acid
s Symp. Ser. 31, 163; Burgin et al. , 1996
Biochemistry 35, 14090). Sugar modifications of enzymatic nucleic acid molecules have been widely described in the art (Eckstein et al.
al. , International Publication WO 92/07065; Perrault et al. Na
cure, 1990, 344, 565-568; Pieken et al. S
science 1991, 253, 314-317; Usman and Ce
derren, Trends in Biochem. Sci. 1992, 1
7, 334-339; Usman et al. International Publication WO93 / 15187
Sproat, US Pat. No. 5,334,711 and Beigelman et.
al. , 1995J. Biol. Chem. 270, 25702, all of which are incorporated herein by reference in their entirety).
Such documents describe general methods and strategies for determining the location of incorporation of sugar, base and / or phosphate modifications, etc. into ribozymes without inhibiting catalytic activity, and are described in part herein. As quoted here. Based on these teachings, similar modifications can be used to modify the nucleic acid catalysts of the present invention as described herein.

【００８０】 酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有する核酸触媒が提供される。
そのような核酸はまた，一般に，非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高
い。すなわち，細胞においておよび／またはインビボで，活性は有意に低下しな
いであろう。本明細書に例示されるように，そのようなリボザイムは，たとえ全
体的活性が１０倍低下しても，細胞においておよび／またはインビボで有用であ
る（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５
，１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書において，全ＲＮＡリボザ
イムの酵素的活性を"維持する"と称される。[0080] Nucleic acid catalysts having chemical modifications that maintain or enhance enzymatic activity are provided.
Such nucleic acids are also generally more resistant to nucleases than unmodified nucleic acids. That is, the activity will not be significantly reduced in cells and / or in vivo. As exemplified herein, such ribozymes are useful in cells and / or in vivo, even if the overall activity is reduced by a factor of 10 (Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35).
, 14090). Such ribozymes are referred to herein as "maintaining" the enzymatic activity of the total RNA ribozyme.

【００８１】 外的に輸送された治療用リボザイムは，最適には，望ましくない蛋白質のレベ
ルが低下するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定
でなければならない。この期間は，疾患の状態により，数時間から数日まで様々
であろう。明らかに，リボザイムは，有効な細胞内治療剤として機能するために
は，ヌクレアーゼに耐性でなければならない。ＲＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎ
ｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
３，２６７７；本明細書の一部としてここに引用する）は，ヌクレオチド修飾を
導入して，上述のように，そのヌクレアーゼ安定性を増強することにより，リボ
ザイムを修飾する能力を拡大した。The exogenously delivered therapeutic ribozyme should optimally be stable in the cell until the translation of the target RNA is inhibited long enough to reduce the level of the undesired protein. This period may vary from hours to days, depending on the condition of the disease. Clearly, ribozymes must be resistant to nucleases in order to function as effective intracellular therapeutics. Improvement of chemical synthesis of RNA (Win
cot et al. , 1995 Nucleic Acids Res. 2
3,2677; incorporated herein as part of the present specification), introduced nucleotide modifications to enhance the ribozyme's ability to modify ribozymes by enhancing its nuclease stability, as described above.

【００８２】 本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"とは，当該技術分野において認
識されているように，天然の塩基（標準），および当該技術分野においてよく知
られる修飾塩基を含む。そのような塩基は，一般に糖成分の１’位に位置する。
ヌクレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，
リン酸および／または塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい
（また，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準
ヌクレオチド等として，互換的に称される，例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｃ
Ｓｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９
２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；
（すべて本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。当該技術分野におい
て知られるいくつかの修飾核酸塩基の例があり，最近概要がまとめられている（
Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２２，２１８３）。その触媒活性に有意に影響を与えることなく酵素的核酸
中に導入しうる塩基修飾の非限定的例としては，イノシン，プリン，ピリジン−
４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−ト
リメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミ
ノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アル
キルウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロ
モウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば
６−メチルウリジン）およびその他のもの（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）が挙げられる。この観点
において，"修飾塩基"とは，１’位に存在するアデニン，グアニン，シトシンお
よびウラシル以外のヌクレオチド塩基，またはその同等物を意味する。そのよう
な塩基は，酵素の触媒コア中でおよび／または基質結合領域中で用いることがで
きる。[0082] As used herein, "nucleotide" includes natural bases (standard), as recognized in the art, and modified bases well known in the art. Such a base is generally located at the 1 'position of the sugar component.
Nucleotides generally contain base, sugar and phosphate groups. Nucleotides are sugars,
It may or may not be modified at the phosphate and / or base components (also interchangeably referred to as nucleotide analogs, modified nucleotides, unnatural nucleotides, non-standard nucleotides, etc., eg, Usman and Mc
Swigen, (supra); Eckstein et al. , International Publication WO9
2/07065; Usman et al. , International Publication WO 93/15187;
(See all references herein as part of this specification). There are several examples of modified nucleobases known in the art and have recently been summarized (
Limbach et al 1994, Nucleic Acids Re.
s. 22, 2183). Non-limiting examples of base modifications that can be introduced into enzymatic nucleic acids without significantly affecting their catalytic activity include inosine, purine, pyridine-
4-one, pyridin-2-one, phenyl, pseudouracil, 2,4,6-trimethoxybenzene, 3-methyluracil, dihydrouridine, naphthyl, aminophenyl, 5-alkylcytidine (for example, 5-methylcytidine) , 5-alkyluridines (eg, ribothymidine), 5-halouridines (eg, 5-bromouridine) or 6-azapyrimidines or 6-alkylpyrimidines (eg, 6-methyluridine) and others (Burgin et al., 19).
96, Biochemistry, 35, 14090). In this regard, "modified base" means a nucleotide base other than adenine, guanine, cytosine and uracil present at the 1 'position, or an equivalent thereof. Such bases can be used in the catalytic core of the enzyme and / or in the substrate binding region.

【００８３】 "脱塩基"とは，塩基を欠失した，または１’位に塩基の代わりに他の化学基を
有する糖成分を意味する。“Abasic” refers to a sugar moiety that lacks a base or has another chemical group at the 1 ′ position in place of a base.

【００８４】 "非修飾ヌクレオシド"とは，ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１'炭素に結合
した，アデニン，シトシン，グアニン，ウラシルのいずれかの塩基を意味する。“Unmodified nucleoside” means any base of adenine, cytosine, guanine, or uracil attached to the 1 ′ carbon of beta-D-ribo-furanose.

【００８５】 "修飾ヌクレオシド"とは，非修飾ヌクレオチド塩基，糖および／またはリン酸
の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。“Modified nucleoside” means any nucleotide base that contains a modification in the unmodified nucleotide base, sugar and / or phosphate chemical structure.

【００８６】 リボザイム構造に対する種々の修飾を作成して，リボザイムの有用性を高める
ことができる。そのような修飾は，貯蔵寿命，インビトロでの半減期，安定性，
およびそのようなリボザイムの標的部位への導入の容易性を増強して，例えば，
細胞膜への浸透を高め，および標的細胞の認識およびそれへの結合の能力を付与
するであろう。Various modifications to the ribozyme structure can be made to enhance the utility of the ribozyme. Such modifications include shelf life, in vitro half-life, stability,
And enhancing the ease of introduction of such ribozymes into target sites, for example,
It will enhance cell membrane penetration and confer the ability to recognize and bind to target cells.

【００８７】リボザイムの投与 Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５は，酵素的
ＲＮＡ分子を輸送するための一般的な方法を記載する。リボザイムは当業者に知
られる種々の方法によって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの
封入，イオントホレシス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデ
キストリン，生分解性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含
まれるが，これらに限定されない。ある適応症に対しては，リボザイムをエクス
ビボで，上述のベヒクルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送す
ることができる。あるいは，ＲＮＡ／ベヒクルの組み合わせを，直接注入により
，またはカテーテル，注入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に
輸送する。他の輸送経路には，静脈内，筋肉内，皮下または関節注射，エアロゾ
ル吸入，経口（錠剤またはピル形態），局所，全身，眼，腹腔内および／または
くも膜下腔内輸送が含まれるが，これらに限定されない。リボザイムの輸送およ
び投与のより詳細な説明はＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）およびＤ
ｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９に提供されており，
これらを本明細書の一部としてここに引用する。 Administration of Ribozymes Sullivan et al. PCT WO 94/02595 describes a general method for delivering enzymatic RNA molecules. Ribozymes can be administered to cells by various methods known to those skilled in the art, including encapsulation in liposomes, iontophoresis, or other vehicles such as hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules, and Includes, but is not limited to, incorporation into bioadhesive microspheres. For certain indications, ribozymes can be delivered ex vivo, directly to cells or tissues, with or without the vehicles described above. Alternatively, the RNA / vehicle combination is delivered locally by direct infusion or by using a catheter, infusion pump or stent. Other routes of delivery include intravenous, intramuscular, subcutaneous or joint injection, aerosol inhalation, oral (tablet or pill form), topical, systemic, ocular, intraperitoneal and / or intrathecal delivery, It is not limited to these. A more detailed description of ribozyme transport and administration can be found in Sullivan et al. , (Supra) and D
raper et al. , PCT WO 93/23569,
These are incorporated herein by reference.

【００８８】 本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾患状態を予防
し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全ての
症状を緩和する）。The molecules of the present invention can be used as a medicine. The medicament prevents, inhibits the onset of, or treats the patient's disease state (alleviates some, preferably all) symptoms.

【００８９】 本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白
質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用い
ることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
脂質またはリポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，処方のため
の標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用の
錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用の
懸濁液等として，処方して用いることもできる。The negatively charged polynucleotide (eg, RNA, DNA or protein) of the present invention can be used with any standard, with or without stabilizers, buffers, etc., to form pharmaceutical compositions. Can be administered and introduced to the patient by any suitable means.
If it is desired to use a lipid or liposome delivery mechanism, standard protocols for formulation can be followed. The compositions of the present invention can also be formulated and used as tablets, capsules or elixirs for oral administration; suppositories for rectal administration; sterile solutions;

【００９０】 本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。The present invention also includes pharmaceutically acceptable formulations of the described compounds. These formulations include salts of the above compounds, eg, acid addition salts (eg, salts of hydrochloric, oxalic, acetic and benzenesulfonic acids).

【００９１】 医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ま
しくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部
分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そ
のような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマ
ーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例
えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は
当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方が
その効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。A pharmaceutical composition or formulation refers to a composition or formulation in a form suitable for administration to cells or patients (eg, systemic administration), preferably to humans. Proper form is dependent in part on the route of administration used (eg, oral, transdermal, or injection). Such morphology must not prevent the composition or formulation from reaching the target cells (ie, the cells for which the negatively charged polymer is desired to be transported). For example, a pharmaceutical composition that is injected into the bloodstream must be soluble. Other factors are known in the art and include, for example, considering toxicity and the forms that prevent the composition or formulation from exerting its effect.

【００９２】 "全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静
脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限
定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例
えば核酸）をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，
分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリ
ポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイ
プの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることができる。
薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にする
ことができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージお
よび白血球による異常な細胞（例えばＨＣＶ感染肝細胞）の免疫認識の特異性を
利用することにより，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。By “systemic administration” is meant distributed throughout the body following systemic absorption in vivo, or accumulation of the drug in the bloodstream. Routes of administration that result in systemic absorption include, but are not limited to, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation, oral, pulmonary, and intramuscular. Each of these routes of administration exposes the desired negatively charged polymer (eg, nucleic acid) to accessible diseased tissue. The rate at which the drug enters the circulation is
It has been shown to be a function of molecular weight or size. By using liposomes or other drug carriers containing the compounds of the present invention, the drug can be localized, for example, to certain types of tissues, such as those of the reticuloendothelial system (RES).
Also useful are liposome formulations that can facilitate the association of the agent with the surface of cells (eg, leukocytes and macrophages). This method will enhance the transport of drugs to target cells by exploiting the specificity of immune recognition of abnormal cells (eg, HCV infected hepatocytes) by macrophages and leukocytes.

【００９３】 本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰ
ＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって
，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉ
ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉ
ｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，
４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標
的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示され
ている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２
７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，
ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べ
て，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；
Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国
際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用
する）。これらの参考文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する。[0093] The invention also features the use of compositions comprising surface-modified liposomes, including poly (ethylene glycol) lipids (PEG-modified or long-circulating liposomes or stealth liposomes). These formulations provide a way to increase drug accumulation in target tissues. This type of drug carrier is supported by the mononuclear phagocyte system (MP
S or RES), which is resistant to opsonization and elimination, thus prolonging the circulation time of the encapsulated drug and enhancing tissue exposure (Lasi
c et al. Chem. Rev .. 1995, 95, 2601-2627; I
Shiwata et al. Chem. Pharm. Bull. 1995,
43, 1005-1011). Such liposomes have been shown to selectively accumulate in tumors, presumably due to extravasation and capture in angiogenic target tissues (Lasic et al., Science 1995, 267,12).
75-1276; Oku et al. , 1995, Biochim. Biop
hys. Acta, 1238, 86-90). Long-circulating liposomes, in particular,
Enhances DNA and RNA pharmacokinetics and pharmacodynamics compared to conventional cationic liposomes known to accumulate in tissues of MPS (Liu et al.
al. , J. et al. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870;
Choi et al. , International Publication WO 96/10391; Ansell et.
al. , International Publication WO 96/10390; Holland et al. , International Publication No. WO 96/10392; all of which are incorporated herein by reference.) All of these references are incorporated herein by reference.

【００９４】 さらに，他のカチオン性分子を用いて本発明の分子を輸送することもできる。
例えば，リボザイムを，アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝臓への局在化を促
進することが知られているグリコシル化ポリ（Ｌ−リシン）にコンジュゲートさ
せることができる（Ｎａｋａｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｈｅｐａｔｏ
ｌｏｇｙ ２３，１２９７−１３０３；Ｎａｈａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７
，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ．５３，８８７−８９５）。グリコシル化ポリ（
Ｌ−リシン）は，酵素的核酸に共有結合させてもよく，または静電的相互作用に
より酵素的核酸に結合させてもよい。Further, the molecules of the present invention can be transported using other cationic molecules.
For example, ribozymes can be conjugated to glycosylated poly (L-lysine), which is known to promote the localization of antisense oligonucleotides to the liver (Nakazono et al., 1996, Hepato).
logic 23,1297-1303; Nahato et al. , 1997
, Biochem Pharm. 53, 887-895). Glycosylated poly (
L-lysine) may be covalently linked to the enzymatic nucleic acid or may be linked to the enzymatic nucleic acid by electrostatic interaction.

【００９５】 本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られ
ており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａ
ｒｏｅｄｉｔ．１９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載され
ている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる（
同上，１４４９）。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−
ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用
いてもよい（同上）。The invention also includes compositions prepared for storage or administration that include a pharmaceutically effective amount of the desired compounds in a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Acceptable carriers or diluents for use in therapeutic applications are well known in the pharmaceutical art, and include, for example, Remington's Pharmaceutical Sc.
ices, Mack Publishing Co. (A. R. Genna
roedit. 1985), which is incorporated herein by reference. For example, preservatives, stabilizers, dyes, and flavoring agents can be used (
Id., 1449). These include sodium benzoate, sorbic acid, and p-
Includes esters of hydroxybenzoic acid. In addition, antioxidants and suspending agents may be used (Id.).

【００９６】 薬学的に有効な用量とは，疾患状態の予防，発症の阻害または治療（症状をあ
る程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は，疾患の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物
の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に
荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重
／日の活性成分を投与する。A pharmaceutically effective dose is that dose required to prevent, prevent the onset of, or treat (alleviate some of the symptoms, and preferably all of the symptoms) of the disease state. A pharmaceutically effective dose will depend on the type of disease, the composition used, the route of administration, the type of mammal being treated, the physical characteristics of the particular mammal under consideration, the co-administered drug, and the field of medicine. Depends on other factors that those skilled in the art will recognize. Generally, 0.1 mg / kg-100 mg / kg body weight / day of active ingredient is administered, depending on the potency of the negatively charged polymer.

【００９７】 あるいは，本発明の酵素的核酸分子は，細胞中で真核生物プロモーターから発
現させることができる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１
９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄ
ｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａ
ｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２
，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６
６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０
，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，
１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５；すべての参考文献は，その全
体を本明細書の一部としてここに引用する））。当業者は，真核生物細胞中で任
意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認
識するであろう。そのような核酸の活性は，それらをリボザイムにより一次転写
産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１
２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，
１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６；すべての参考文献は
その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。Alternatively, the enzymatic nucleic acid molecules of the invention can be expressed in cells from eukaryotic promoters (eg, Izant and Weintraub, 1).
985 Science 229, 345; McGarry and Lind
quist, 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
3, 399; Scanlon et al. , 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sa
bet et al. , 1992 Antisense Res. Dev. , 2
, 3-15; Dropulic et al. , 1992 J.C. Virol 6
6,1432-41; Weerasinghe et al. , 1991 J .;
Virol, 65, 5531-4; Ojwang et al. , 1992 P
rc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10802-6; Ch
en et al. , 1992 Nucleic Acids Res. , 20
Sarver et al., 4581-9; , 1990 Science 2
47, 1222-1225; Thompson et al. , 1995 Nu
cleic Acids Res. 23, 2259; Good et al. ,
1997, Gene Therapy, 4, 45; all references are hereby incorporated by reference in their entirety)). One skilled in the art will recognize that any nucleic acid can be expressed in a eukaryotic cell from a suitable DNA / RNA vector. The activity of such nucleic acids can be increased by releasing them from the primary transcript by ribozymes (Draper et al.
al. , PCT WO 93/23569, Sullivan et al. , P
CT WO 94/02595; Ohkawa et al. , 1992 Nuc
leic Acids Symp. Ser. , 27, 15-6; Taira e
t al. , 1991, Nucleic Acids Res. , 19,51
25-30; Ventura et al. , 1993 Nucleic Ac
ids Res. Chowira et al., 21, 3249-55. ,
1994 J.C. Biol. Chem. 269, 25856; all references are hereby incorporated by reference in their entirety).

【００９８】 本発明の別の観点においては，標的分子を切断する酵素的核酸分子は，ＤＮＡ
またはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏ
ｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換
えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リ
ボザイムを発現するウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス
，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができるが
，これらに限定されない。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクター
は，上述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過
渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクター
は，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，リボ
ザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。活性なリボザイムは，実施例に記載されるも
のと同等の酵素的中心またはコア，および標的部位における切断が生ずるように
標的核酸分子に結合しうる結合アームを含む。そのような切断を妨害しない他の
配列が存在していてもよい。リボザイムを発現するベクターの輸送は，全身的（
例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与
した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能
とする他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔ
ｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。In another aspect of the invention, an enzymatic nucleic acid molecule that cleaves a target molecule is a DNA molecule.
Alternatively, it is expressed from a transcription unit inserted into an RNA vector (for example, Co
ture et al. , 1996, TIG. , 12, 510). The recombinant vector is preferably a DNA plasmid or a viral vector. Viral vectors expressing ribozymes can be constructed based on, but not limited to, adeno-associated virus, retrovirus, adenovirus, or alphavirus. Preferably, the recombinant vector capable of expressing the ribozyme is transported as described above and remains in the target cells. Alternatively, a viral vector that provides for transient expression of the ribozyme can be used. Such vectors can be administered repeatedly as needed. Once expressed, the ribozyme cleaves the target mRNA. Active ribozymes include an enzymatic center or core equivalent to that described in the Examples, and a binding arm that can bind to a target nucleic acid molecule such that cleavage at the target site occurs. Other sequences that do not interfere with such cleavage may be present. Delivery of ribozyme-expressing vectors is systemic (
After administration to target cells explanted from the patient (eg, by intravenous or intramuscular administration), and then re-introduced into the patient, or any other method that allows for introduction into the desired target cells. (For a review, see Cout
ure et al. , 1996, TIG. , 12, 510).

【００９９】 本発明の１つの観点においては，本発明の核酸触媒の少なくとも１つをコード
する核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸触媒をコードする
核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結され
ている。[0099] In one aspect of the present invention, there is disclosed an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding at least one of the nucleic acid catalysts of the present invention. The nucleic acid sequence encoding the nucleic acid catalyst of the present invention is operably linked in a manner that allows expression of the nucleic acid molecule.

【０１００】 本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生
物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核
生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少な
くとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現およ
び／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可
能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸触媒をコードす
る遺伝子の５'側または３’側に動作可能なように連結された蛋白質のオープン
リーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含
んでいてもよい。In another aspect of the invention, the expression vector comprises a transcription initiation region (eg, the initiation region of eukaryotic pol I, II or III); b) a transcription termination region (eg, eukaryotic pol I, II or C) a gene encoding at least one of the nucleic acid catalysts of the invention, said gene comprising said starting region and said termination in a manner allowing expression and / or transport of said nucleic acid molecule. Operably linked to the area. The vector optionally comprises a protein open reading frame (ORF) operably linked to the 5 'or 3' side of the gene encoding the nucleic acid catalyst of the present invention; and / or an intron (intervening sequence). May be included.

【０１０１】 リボザイム配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），Ｒ
ＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐ
ｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより推進される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ
ＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現
されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーター
のレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）
の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で
発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（
Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａ
ｎｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７
２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．
，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモ
ーターから発現したリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを示している
（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１
９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８９，１０８０
２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚ
ｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎ
ｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細
には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）
およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞
中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生成するのに有用
である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ
．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏ
ｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６；（これらのすべての刊行物を本明
細書の一部としてここに引用する）。上述のリボザイム転写ユニットは，哺乳動
物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクター
としては，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノ
ウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター
（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが，こ
れらに限定されない（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。The transcription of the ribozyme sequence is determined by the eukaryotic RNA polymerase I (pol I), R
NA polymerase II (pol II) or RNA polymerase III (p
ol III). pol II or pol
Transcripts from the III promoter will be expressed at high levels in all cells. The level of a given pol II promoter in a given cell type depends on the presence of nearby gene regulatory sequences (enhancers, silencers, etc.).
Will depend on the nature of A prokaryotic RNA polymerase promoter is also used, as long as the prokaryotic RNA polymerase enzyme is expressed in appropriate cells (
Eloy-Stein and Moss, 1990 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87, 6743-7; Gao and Hua.
ng 1993 Nucleic Acids Res. , 21,2867-7
2; Lieberet. al. , 1993 Methods Enzymol.
, 217, 47-66; Zhou et al. , 1990 Mol. Cell
. Biol. , 10, 4529-37). Some investigators have shown that ribozymes expressed from such promoters can function in mammalian cells (eg, Kashani-Sabet et al., 1992 Antis).
ense Res. Dev. Ojwang et al., 2, 3-15; , 1
992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1080
2-6; Chen et al. , 1992 Nucleic Acids R
es. Yu et al., 20, 4581-9; 1993 Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Hilli
er et al. , 1992 EMBO J .; 11,4411-8; Lisz
iewicz et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sc
i. U. S. A. Thompson et al., 90, 8000-4; , 1
995 Nucleic Acids Res. 23,2259; Sullen
ger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). More specifically, transcription units such as U6 micronucleus (snRNA), transfer RNA (tRNA)
And those derived from genes encoding adenovirus VA RNA are useful for producing high concentrations of a desired RNA molecule (eg, a ribozyme) in cells (Thompson et al., Supra); Couture and
Stinchcomb, 1996, supra; Noonberg et al.
. , 1994, Nucleic Acid Res. , 22, 2830; Noo
nberg et al. Good et al., US Pat. No. 5,1624,803;
al. , 1997, Gene Ther. 4,45; Beicrelman e
t al. , International Publication WO 96/18736; (all of these publications are incorporated herein by reference). The ribozyme transcription units described above can be incorporated into various vectors for introduction into mammalian cells. Vectors include, but are not limited to, plasmid DNA vectors, viral DNA vectors (eg, adenovirus or adeno-associated virus vectors), or viral RNA vectors (eg, retrovirus or alphavirus vectors) (for a review, see Couture). and Stinch
comb, 1996, supra).

【０１０２】 本発明のさらに別の観点は，本発明の触媒的核酸分子の少なくとも１つをコー
ドする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを
特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）
転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好まし
い態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ
）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコード
する遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−
末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現お
よび／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディン
グフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の
態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）
イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前
記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記
開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されてい
る。別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領
域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子の
少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーデ
ィングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は
，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，
前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作
可能なように連結されている。[0102] Yet another aspect of the invention features an expression vector that includes a nucleic acid sequence encoding at least one of the catalytic nucleic acid molecules of the invention in a manner that allows expression of the nucleic acid molecule. In one embodiment, the expression vector comprises: a) a transcription initiation region; b)
A transcription termination region; c) including a gene encoding at least one of the nucleic acid molecules;
The gene is operably linked to the start region and the stop region in a manner that allows for expression and / or transport of the nucleic acid molecule. In another preferred embodiment, the expression vector comprises: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region;
D) comprising a gene encoding at least one of the nucleic acid molecules, wherein the gene comprises a 3'- of the open reading frame.
Operably linked to the terminus, the gene is operably linked to the start region, the open reading frame and the stop region in a manner that allows for expression and / or transport of the nucleic acid molecule. Are linked. In yet another embodiment, the expression vector comprises: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region;
An intron; d) comprising a gene encoding at least one of said nucleic acid molecules; said gene operating in said start region, said intron and said stop region in a manner allowing expression and / or transport of said nucleic acid molecule. They are connected as much as possible. In another embodiment, the expression vector comprises: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region; c) an intron; d) an open reading frame; e) a gene encoding at least one of said nucleic acid molecules, wherein said gene Is operably linked to the 3'-end of the open reading frame, wherein the gene is capable of expressing and / or transporting the nucleic acid molecule in a manner that allows the initiation region,
The intron, the open reading frame and the termination region are operably linked.

【０１０３】インターフェロン タイプＩインターフェロン（ＩＦＮ）は，２５種類以上のＩＦＮ−αのファミ
リー（Ｐｅｓｔａ，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１９，３−
１４），ならびにＩＦＮ−β，およびＩＦＮ−ωを含む，一群の天然のサイトカ
インである。進化的には同じ遺伝子に由来するものであるが（Ｄｉａｚ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２２，５４０−５５２），これらの分子
の一次配列には多くの差異があり，生物学的活性が進化的に分岐してきたことが
暗示される。すべてのタイプＩのＩＦＮは，ＩＦＮが細胞表面レセプターに結合
することから始まる生物学的効果の共通のパターンを共有する（Ｐｆｅｆｆｅｒ
＆Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ，１９９２，Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｃｏｎ
ｄａｒｙ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ ｆｏｒ ＩＦＮ−α／β．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ．，Ｓ．Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ．Ｄｉａ
ｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．，Ｔ．Ｋ．Ｈｕｇｈｅｓ
Ｊｒ．，Ｇ．Ｒ．Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｊ．Ｓｔａｎｔ
ｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ．１５１−１６０）。結合した後
，ヤヌス（Ｊａｎｕｓ）チロシンキナーゼおよびＳＴＡＴ蛋白質等のチロシンキ
ナーゼが活性化され，いくつかのＩＦＮ−刺激性遺伝子産物が産生される（Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉ．Ａｍ．２７０，６８−７５）。
ＩＦＮ−刺激性遺伝子産物は，抗ウイルス，抗増殖および免疫調節効果，サイト
カイン誘導，およびＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ制御を含む，タイプＩ Ｉ
ＦＮの多面的な生物学的効果の原因である（Ｐｅｓｔｋａ ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５６，７２７）。ＩＦＮ−刺激性遺
伝子産物の例としては，２−５−オリゴアデニレートシンターゼ（２−５ ＯＡ
Ｓ），β２−ミクログロブリン，ネオプテリン，ｐ６８キナーゼ，およびＭｘ蛋
白質（Ｃｈｅｂａｔｈ＆Ｒｅｖｅｌ，１９９２，Ｔｈｅ ２−５ Ａ ｓｙｓｔ
ｅｍ：２−５ Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｉｓｏｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎ
ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓ．Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｃ
ｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ．Ｄｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ．Ｊｒ．Ｆｌｅｉｓｃｈ
ｍａｎｎ，Ｔ．Ｋ．Ｊｒ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｇ．Ｒ．Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｎｉ
ｅｓｅｌ，Ｇ．Ｊ．Ｓｔａｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ．
，ｐｐ．２２５−２３６；Ｓａｍｕｅｌ，１９９２，Ｔｈｅ ＲＮＡ−ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ Ｐ１／ｅＩＦ−２α ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｉｎ：Ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓ．Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ．Ｄ
ｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．Ｒ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．，Ｔ．Ｋ．Ｈｕｇｈ
ｅｓ Ｊｒ．，Ｇ．Ｒ．Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｈ．Ｓｔａ
ｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｋ．Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ．２３７−２５０；Ｈｏｒｉ
ｓｂｅｒｇｅｒ，１９９２，ＭＸ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓ
．Ｂａｒｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ，Ｆ．Ｄｉａｎｚａｎｉ，Ｗ．
Ｒ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｊｒ．，Ｔ．Ｋ．Ｈｕｇｈｅｓ Ｊｒ．，Ｇ．Ｒ
．Ｋｉｍｐｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｎｉｅｓｅｌ，Ｇ．Ｈ．Ｓｔａｎｔｏｎ，ａｎｄ Ｓ
．Ｋ．Ｔｙｒｉｎｇ，ｅｄｓ．２１５−２２４）。すべてのタイプＩ ＩＦＮは
類似する生物学的効果を有するが，すべての活性が各タイプＩのＩＦＮに共通な
わけではなく，多くの場合，活性の程度は，各ＩＦＮサブタイプにより非常に異
なる（Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．
９，９７−１１４；Ｏｚｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒ
ｏｎ Ｒｅｓ．１２，５５−５９）。より詳細には，異なるサブタイプのＩＦＮ
−αおよびＩＦＮ−αの分子ハイブリッドの特性の研究は，薬理学的特性の相違
を示した（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，１９８７，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ
ｓ．７，５４５−５５１）。これらの薬理学的相違は，３アミノ酸残基程度の変
化によっても生じうる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．４２，１３１２−１３１６）。 Interferon type I interferon (IFN) is a family of 25 or more IFN-αs (Pesta, 1986, Methods Enzymol. 119, 3-
14), and a group of natural cytokines, including IFN-β and IFN-ω. Although they are evolutionarily derived from the same gene (Diaz et al.
al. , 1994, Genomics 22, 540-552), with many differences in the primary sequences of these molecules, implying that biological activity has evolved divergently. All Type I IFNs share a common pattern of biological effects that begins with the binding of IFNs to cell surface receptors (Pffefer
& Strulovici, 1992, Transmembrane second
day messengers for IFN-α / β. In: Inter
feron. Principles and Medical Applica
tions. , S .; Baron, D .; H. Coopenhaver, F .; Dia
nzani, W.C. R. Fleischmann Jr. , T .; K. Hughes
Jr. , G .; R. Kimpel, D.M. W. Niesel, G .; J. Stant
on, and S. K. Tyring, eds. 151-160). After binding, tyrosine kinases such as Janus tyrosine kinase and STAT protein are activated, producing several IFN-stimulated gene products (Jo).
hnson et al. , 1994, Sci. Am. 270, 68-75).
IFN-stimulated gene products include type II, including antiviral, antiproliferative and immunomodulatory effects, cytokine induction, and HLA class I and class II regulation.
It is responsible for the pleiotropic biological effects of FN (Pestka et al., 19).
87, Annu. Rev .. Biochem 56,727). Examples of IFN-stimulatory gene products include 2-5-oligoadenylate synthase (2-5 OA
S), β2-microglobulin, neopterin, p68 kinase, and Mx protein (Chebath & Revel, 1992, The 2-5 A system
em: 2-5 A synthase, isospecies and f
functions. In: Interferon. Principles an
d Medical Applications. S. Baron, D .; H. C
openhaver, F.C. Dianzani, W.M. R. Jr. Fleisch
mann, T .; K. Jr Hughes, G .; R. Kimpel, D.M. W. Ni
esel, G .; J. Stanton, and S.M. K. Tyring, eds.
Pp. 225-236; Samuel, 1992, The RNA-depe
dent P1 / eIF-2α protein kinase. In: In
terferon. Principles and Medical Appl
ications. S. Baron, D .; H. Coopenhaver, F .; D
ianzani, W.C. R. Fleischmann Jr. , T .; K. Hugh
es Jr. , G .; R. Kimpel, D.M. W. Niesel, G .; H. Sta
nton, and S.N. K. Tyring, eds. 237-250; Hori
sberger, 1992, MX protein: function and
Mechanism of Action. In: Interferon. P
rinciples and Medical Applications. S
. Baron, D .; H. Coopenhaver, F .; Dianzani, W.M.
R. Fleischmann Jr. , T .; K. Hughes Jr. , G .; R
. Kimpel, D.M. W. Niesel, G .; H. Stanton, and S
. K. Tyring, eds. 215-224). Although all Type I IFNs have similar biological effects, not all activities are common to each Type I IFN, and in many cases the degree of activity is very different for each IFN subtype ( Fish et al, 1989, J. Interferon Res.
9, 97-114; Ozes et al. , 1992, J. Mol. Interfer
on Res. 12, 55-59). More specifically, different subtypes of IFN
Studies of the properties of molecular hybrids of IFN-α and IFN-α have shown differences in pharmacological properties (Rubinstein, 1987, J. Interferon Re.
s. 7, 545-551). These pharmacological differences can be caused by as little as three amino acid residues (Lee et al., 1982, Cancer Re.
s. 42, 1312-1316).

【０１０４】 既知のＩＦＮ−αサブタイプにおいて８５−１６６アミノ酸が保存されている
。ＩＦＮ−α偽遺伝子をのぞき，約２５種類の異なるＩＦＮ−αのサブタイプが
知られている。これらの非対立遺伝子サブタイプの対の比較により，一次配列の
差異が２％−２３％であることが示された。天然に生ずるＩＦＮに加え，コンセ
ンサスインターフェロン（ＣＩＦＮ）として知られる非天然型組換えタイプＩイ
ンターフェロンが治療用化合物として合成された（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１
９９７，，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２６，７４７−７５４）。[0104] 85-166 amino acids are conserved in known IFN-α subtypes. Except for the IFN-α pseudogene, about 25 different IFN-α subtypes are known. Comparison of these non-allelic subtype pairs indicated that the primary sequence differences were 2% -23%. In addition to naturally occurring IFN, a non-natural recombinant type I interferon known as consensus interferon (CIFN) has been synthesized as a therapeutic compound (Tong et al., 1).
997, Hepatology 26, 747-754).

【０１０５】 インターフェロンは，現在，感染性疾患および自己免疫疾患および癌を含む，
少なくとも１２の異なる適応症において用いられている（Ｂｏｒｄｅｎ，１９９
２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１４９１−１４９２）。自己免疫疾患
については，ＩＦＮは，慢性関節リウマチ，多発性硬化症およびクローン病の治
療に用いられてきた。癌の治療については，ＩＦＮは，単独でまたは多くの異な
る化合物との組み合わせで用いられてきた。ＩＦＮが用いられている特定のタイ
プの癌には，扁平上皮癌，黒色腫，副腎腫，血管腫，毛様細胞性白血病およびカ
ポジ肉腫が含まれる。感染性疾患の治療においては，ＩＦＮは，マクロファージ
の食作用活性および白血球の細胞毒性を増加させ，細胞性病原体の増殖を阻害す
る。ＩＦＮが治療に用いられている特定の適応症には，Ｂ型肝炎，ヒトパピロー
マウイルスタイプ６および１１（すなわち，性器ゆうぜい）（Ｌｅｖｅｎｔｈａ
ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５，６１３−６
１７），慢性肉芽腫疾患およびＣ型肝炎ウイルスが含まれる。Interferons currently include infectious and autoimmune diseases and cancer,
It has been used in at least 12 different indications (Borden, 199
2, N. Engl. J. Med. 326,1491-1492). For autoimmune diseases, IFN has been used to treat rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and Crohn's disease. For the treatment of cancer, IFN has been used alone or in combination with many different compounds. Certain types of cancer for which IFN has been used include squamous cell carcinoma, melanoma, adrenal tumor, hemangiomas, pilocytic leukemia, and Kaposi's sarcoma. In the treatment of infectious diseases, IFN increases macrophage phagocytic activity and leukocyte cytotoxicity and inhibits the growth of cellular pathogens. Specific indications for which IFN has been used for treatment include hepatitis B, human papillomavirus types 6 and 11 (ie, genital flu) (Leventha).
l et al. 1991, N.M. Engl. J. Med. 325,613-6
17), chronic granulomatous disease and hepatitis C virus.

【０１０６】 慢性ＨＣＶ感染の治療におけるＩＦＮ−アルファの，多くのよく統制された臨
床試験は，週３回の治療により，６ヶ月の治療の終わりには患者の約５０％（４
０％−７０％の範囲）で血清ＡＬＴ値が低下することを示している（Ｄａｖｉｓ
ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２１，１５０１−１５０６；Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １３，３９３−３９７；Ｔ
ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６，７４７−７５
４；Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６，１６４０−１６４
５）。しかし，インターフェロン治療を中止した後，応答した患者の約５０％が
再発し，"永続的"応答率は，血清ＡＬＴ濃度の正常化により評価して約２０−２
５％であった。さらに，ＨＣＶ ＲＮＡの値の変化を臨床的最終結果として用い
た６ヶ月間のタイプＩインターフェロン治療を試験した研究は，３５％までの患
者が治療の終わりまでにＨＣＶ ＲＮＡを失うことを示した（Ｔｏｎｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，（上掲））。しかし，ＡＬＴの最終結果に関しては，約５０
％の患者が治療の中止から６ヶ月後に再発し，永続的なウイルス性応答はわずか
１２％（２３）であった。４８週間の治療を試験した研究は，持続するウイルス
性応答は２５％までであることを示した。Many well-controlled clinical trials of IFN-alpha in the treatment of chronic HCV infection show that three times a week of treatment may result in approximately 50% (4%) of patients at the end of 6 months of treatment.
0% -70%) (Davis)
et al. , 1989, The New England Journal.
of Medicine 321, 1501-1506; Marcellin
et al. , 1991, Hepatology 13, 393-397; T
ong et al. , 1997, Hepatology 26, 747-75.
4; Tong et al. , Hepatology 26, 1640-164
5). However, after discontinuing interferon therapy, approximately 50% of responding patients relapse, and a "durable" response rate of about 20-2 as assessed by normalization of serum ALT levels.
5%. In addition, studies testing 6 months of type I interferon treatment using changes in HCV RNA levels as the clinical end result have shown that up to 35% of patients lose HCV RNA by the end of treatment ( Tong et
al. , 1997, supra). However, the final result of ALT is about 50
% Of patients relapsed 6 months after discontinuation of treatment, with a permanent viral response of only 12% (23). Studies testing 48 weeks of treatment showed that the sustained viral response was up to 25%.

【０１０７】 ＩＦＮと組み合わせたリボザイムは，ＨＣＶまたは上述した他のいずれかの適
応症の治療の有効性を改良する可能性を有する。疾患，例えば感染性疾患，自己
免疫疾患，および癌に関連するＲＮＡを標的とするリボザイムを，個々にまたは
ＩＦＮ等の他の療法と組み合わせて用いて，増強された有効性を達成することが
できる。Ribozymes in combination with IFN have the potential to improve the efficacy of treatment of HCV or any of the other indications mentioned above. Ribozymes targeting RNAs associated with diseases such as infectious diseases, autoimmune diseases, and cancer can be used individually or in combination with other therapies such as IFN to achieve enhanced efficacy .

【０１０８】実施例 以下は，本発明の酵素的核酸の選択，単離，合成および活性を示す非限定的例
である。[0108] Example Hereinafter, the selection of the enzymatic nucleic acid of the present invention, the isolated, non-limiting examples showing the synthesis and activity.

【０１０９】 以下の実施例は，ＨＣＶ ＲＮＡを切断するリボザイムの選択を示す。本明細
書に記載される方法は，ＨＣＶ複製に必要な他のＲＮＡ標的を切断するリボザイ
ムを誘導することができるスキームである。The following example illustrates the selection of a ribozyme that cleaves HCV RNA. The methods described herein are schemes that can induce ribozymes that cleave other RNA targets required for HCV replication.

【０１１０】実施例１：ＨＣＶ ＲＮＡ中の潜在的リボザイム切断部位の同定 コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いて，ＨＣＶ ＲＮＡの配列をアクセ
ス可能部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成せず，潜在的
ハンマーヘッドおよび／またはヘアピンリボザイム切断部位を含むｍＲＮＡの領
域を同定した。これらの切断部位の配列は，表ＩＶ−ＶＩＩＩに示される。 Example 1 Identification of Potential Ribozyme Cleavage Sites in HCV RNA Using a computer folding algorithm, the sequences of HCV RNA were screened for accessible sites. Regions of the mRNA that did not form a secondary fold and contained potential hammerhead and / or hairpin ribozyme cleavage sites were identified. The sequences of these cleavage sites are shown in Tables IV-VIII.

【０１１１】実施例２：ＨＣＶ ＲＮＡ中のリボザイム切断部位の選択 コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより予測された部位がＨ
ＣＶ ＲＮＡ中のアクセス可能部位に対応するか否かを試験するため，２０個の
ハンマーヘッド部位を選択して分析した。リボザイム標的部位は，ＨＣＶのゲノ
ム配列を分析することにより選択し（インプット配列＝ＨＰＣＪＴＡ（Ａｃｃ＃
Ｄ１１１６８＆Ｄ０１１７１）），折り畳みに基づいて部位に優先順位をつけた
。各標的に結合しうるようにハンマーヘッドリボザイムを設計し（図１を参照）
，コンピュータ折り畳みにより別々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１
１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適当な二次構造
に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない
分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に記載されるよう
に，種々の結合アームの長さを選択して活性を最適化することができる。一般に
，各アーム上に少なくとも５塩基あれば，標的ＲＮＡに結合するか，さもなくば
それと相互作用することができる。 Example 2 Selection of Ribozyme Cleavage Site in HCV RNA The site predicted by the computer-based RNA folding algorithm was H
Twenty hammerhead sites were selected and analyzed to test whether they corresponded to accessible sites in CV RNA. The ribozyme target site was selected by analyzing the genomic sequence of HCV (input sequence = HPCJTA (Acc #
D11168 & D01171)), the sites were prioritized based on the fold. Design a hammerhead ribozyme to bind to each target (see Figure 1)
Analyzed separately by computer folding (Christoffesen)
et al. , 1994 J .; Mol. Struc. Theochem, 31
1, 273; Jaeger et al. , 1989, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 86, 7706), to evaluate whether the ribozyme sequence is folded into an appropriate secondary structure. Ribozymes with undesired intramolecular interactions between the binding arm and the catalytic core were excluded from consideration. As described below, various binding arm lengths can be selected to optimize activity. Generally, at least 5 bases on each arm can bind to or otherwise interact with the target RNA.

【０１１２】 リボザイム候補の選択は，ＨＣＶ遺伝子型ｌｂに感染した患者に由来するＨＣ
Ｖ ＲＮＡ配列中のすべてのハンマーヘッド切断部位をスキャンすることにより
開始した。この配列分析の結果は表ＩＩＩに示される。表ＩＩＩに示されるよう
に，この分析により１３００個のハンマーヘッドリボザイム部位を同定した。次
に，ＨＣＶゲノムの保存領域中で切断するハンマーヘッドリボザイム候補を同定
するために，遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，２ｃ，３ａ，３ｂ，４ａ，５ａ
，および６からの約５０個のＨＣＶ単離物の配列アライメントを完成させた。遺
伝子型の中で，試験したすべての単離物の間で最も高い配列同一性を有する領域
中の部位を同定した。この分析により，ハンマーヘッドリボザイム候補は約２３
に減少した（表ＩＩＩ）。The selection of ribozyme candidates is based on HCV from patients infected with HCV genotype lb.
Started by scanning all hammerhead cleavage sites in the V RNA sequence. The results of this sequence analysis are shown in Table III. As shown in Table III, this analysis identified 1300 hammerhead ribozyme sites. Next, to identify candidate hammerhead ribozymes that cleave in the conserved regions of the HCV genome, genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a
, And 6 completed a sequence alignment of approximately 50 HCV isolates. Among the genotypes, sites in the region with the highest sequence identity among all isolates tested were identified. According to this analysis, about 23 hammerhead ribozyme candidates were found.
(Table III).

【０１１３】 ＨＣＶゲノムの高い配列可変性のため，広い治療用途のためのリボザイムの選
択は，おそらくＨＣＶゲノムの保存領域を含まなければならないであろう。ＨＣ
Ｖゲノムの保存領域（５'−非コーディング領域（ＮＣＲ），コア蛋白質コーデ
ィング領域の５'−末端，および３'−ＮＣＲ）に由来する３０個のハンマーヘッ
ドリボザイムの一覧が表ＩＶに示される。一般に，ＨＣＶゲノムの５'末端領域
に位置する部位を標的とするリボザイムは翻訳を妨害し，一方，ゲノムの３'末
端領域中に位置するリボザイム切断部位はＲＮＡ複製を妨害するはずである。Due to the high sequence variability of the HCV genome, selection of a ribozyme for broad therapeutic use will probably have to include conserved regions of the HCV genome. HC
A list of 30 hammerhead ribozymes from the conserved regions of the V genome (5'-non-coding region (NCR), 5'-end of the core protein coding region, and 3'-NCR) is shown in Table IV. In general, ribozymes targeting sites located in the 5 'end region of the HCV genome will interfere with translation, whereas ribozyme cleavage sites located in the 3' end region of the genome should interfere with RNA replication.

【０１１４】実施例３．リボザイムの化学合成および精製 ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムを，ＲＮＡメッセージの
種々の部位にアニーリングするよう設計した。結合アームは，上述した標的部位
配列に相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成方法は，通常
のＲＮＡ合成の方法に従い（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７ Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５），Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．
，（１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３）；Ｗ
ｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）），慣用的な核酸保護基およびカップリ
ング基，例えば５’末端にジメトキシトリチル，および３’−末端にホスホルア
ミダイトを用いた。平均段階カップリング収率は＞９８％であった。 Embodiment 3 FIG . Chemical Synthesis and Purification of Ribozymes Ribozymes in the hammerhead or hairpin motif were designed to anneal to various sites in the RNA message. The binding arm is complementary to the target site sequence described above. Ribozymes were chemically synthesized. The synthesis method used was according to the usual method of RNA synthesis (Usman et al., (1987 J. Am.
. Chem. Soc. , 109, 7845), Scaninge et al.
, (1990 Nucleic Acids Res., 18, 5433); W
incott et al. , (Supra)), conventional nucleic acid protecting and coupling groups such as dimethoxytrityl at the 5 'end and phosphoramidites at the 3' end. The average stage coupling yield was> 98%.

【０１１５】 Ｇ5Ａ6の順番を変更し，Ａ１４をＵで置換することにより不活性リボザイムを
合成した（番号付けはＨｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２に従う）。ヘアピンリボザイムは，２
つの部分で合成し，アニーリングして活性なリボザイムを再構築した（Ｃｈｏｗ
ｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムはまた，バクテリオファージＴ
７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから合成した（Ｍｉｌｌｉｇ
ａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９３９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１８０，５１）。リボザイムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミ
ノ，２'−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈで修飾するこ
とにより，安定性を増強するよう修飾した（総説については，Ｕｓｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＢＳ １７，３４を参照）。リボザイ
ムは，一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロ
マトグラフィーにより精製し（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上
掲）を参照；その全体を本明細書の一部としてここに引用する），水に再懸濁し
た。この研究で用いた化学的に合成したリボザイムの配列は以下の表ＩＶ−ＩＸ
に示される。An inactive ribozyme was synthesized by changing the order of G 5 A 6 and replacing A14 with U (numbering is Hertel et al., 1992 Nucleic).
Acids Res. , 20, 3252). Hairpin ribozyme is 2
The active ribozyme was reconstituted by synthesis and annealing in two parts (Chow
rira and Burke, 1992 Nucleic Acids Re
s. , 20, 2835-2840). Ribozymes also provide bacteriophage T
Synthesized from DNA template using 7RNA polymerase (Millig
and and Uhlenbeck, 1939, Methods Enzymo
l. 180, 51). Ribozymes are modified to enhance stability by modification with nuclease resistant groups such as 2'-amino, 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2'-O-methyl, 2'-H. (For a review, see Usman an
d Cedergren, 1992 TIBS 17, 34). Ribozymes may be purified by gel electrophoresis using general methods, or by high performance liquid chromatography (HPLC; see Wincott et al., Supra); incorporated herein in its entirety. Re-suspended in water. The sequences of the chemically synthesized ribozymes used in this study are shown in Table IV-IX below.
Is shown in

【０１１６】実施例４：インビトロでのＨＣＶ ＲＮＡ標的のリボザイム切断 ＨＣＶを標的とするリボザイムを設計し，上述のように合成する。これらのリ
ボザイムは，例えば以下の方法を用いてインビトロで切断活性を試験することが
できる。ＨＣＶ中の標的配列およびヌクレオチドの位置は表ＩＶに示される。 Example 4 Ribozyme Cleavage of HCV RNA Target In Vitro A ribozyme targeting HCV is designed and synthesized as described above. These ribozymes can be tested for cleavage activity in vitro using, for example, the following method. The target sequences and nucleotide positions in HCV are shown in Table IV.

【０１１７】 切断反応：リボザイム切断アッセイのための，完全長または部分的完全長の，
内部標識された標的ＲＮＡを，［α−32Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写に
より調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
を通し，さらに精製することなく基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５’−32Ｐ−末端標識してもよい。ア
ッセイは，リボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，
３７℃，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）中で２Ｘ濃度の精製リボザイムを予熱すること
により実施し，切断反応は，２Ｘリボザイムミックスを，やはり切断緩衝液中で
予熱した等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより開始した。最
初のスクリーニングとして，アッセイは，最終濃度４０ｎＭまたは１ｍＭのリボ
ザイム，すなわちリボザイム過剰を用いて３７℃で１時間行う。等量の９５％ホ
ルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０
．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を停止し，次に試料を９５
℃に２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮ
Ａおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオー
トラジオグラフィーで可視化した。切断のパーセントは，ホスファーイメージャ
ー（登録商標）を用いて，無傷の基質と切断生成物を表すバンドを定量すること
により決定した。Cleavage Reaction: Full-length or partially full-length, for ribozyme cleavage assays
Internally labeled target RNA is prepared by in vitro transcription in the presence of [α- 32 P] CTP, passed through a G50 Sephadex column by spin chromatography, and used as substrate RNA without further purification. Alternatively, it may be 5'32 P- end labeled substrates using T4 polynucleotide kinase enzyme. The assay was performed using a ribozyme cleavage buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5,
37 ° C., was performed by preheating the purification ribozymes 2X concentration in 10 mM MgCl 2) in the cutting reaction, the 2X ribozyme mix an equal volume of substrate RNA was also preheated in cutting buffer (maximum 1-5 nM) Started by adding to As an initial screen, the assay is performed for 1 hour at 37 ° C. with a final concentration of 40 nM or 1 mM ribozyme, ie ribozyme excess. Equal volumes of 95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue and 0%
. The reaction was stopped by adding 05% xylene cyanol, and then
Heat to 2 ° C. for 2 minutes, quench, and load onto denaturing polyacrylamide gel. Substrate RN
A and specific RNA cleavage products generated by ribozyme cleavage were visualized by gel autoradiography. Percentage of cleavage was determined by quantifying bands representing intact substrate and cleavage products using PhosphorImager®.

【０１１８】実施例５：ＨＣＶリボザイムが患者血清中のＨＣＶ ＲＮＡを切断する能力 ヌクレアーゼ耐性を付与する修飾を用いて，ＨＣＶ ＲＮＡ中の部位を標的と
するリボザイムを合成した（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，１９９５，ＪＢｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７０，２５７０２）。慢性Ｃ型肝炎患者からの血清は，平均して３ｘ１
０6コピー／ｍｌのＨＣＶ ＲＮＡを含むことがよく証明されている。さらにリ
ボザイム製品の候補を選択するために，３０個のＨＣＶ特異的リボザイムを，遺
伝子型ｌｂのＨＣＶ患者の血清から単離されたＨＣＶ ＲＮＡを用いて，ＨＣＶ
ＲＮＡ切断活性について特性決定した。ＨＣＶ遺伝子型１ｂのスクリーニング
からの最適な候補を，１ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，２ｃ，３ａ，３ｂ，４ａ，５ａ
，および６を含む広範な種類のＨＣＶ遺伝子型からの単離物に対してスクリーニ
ングすることができる。したがって，多様な範囲のＨＣＶ遺伝子型および亜種か
らのＨＣＶ ＲＮＡを広く切断する能力に基づいて，さらなる開発のためのリボ
ザイム候補を選択することが可能である。 Example 5: The ability of HCV ribozyme to cleave HCV RNA in patient serum A ribozyme targeting a site in HCV RNA was synthesized using a modification that imparts nuclease resistance (Beigeman, 1995, JBiol. Ch
em. 270, 25702). Serum from chronic hepatitis C patients averaged 3x1
It is well proven to contain 0 6 copies / ml of HCV RNA. To further select ribozyme product candidates, 30 HCV-specific ribozymes were identified using HCV RNA isolated from the serum of HCV patients with genotype lb using HCV RNA.
It was characterized for RNA cleavage activity. The best candidates from the HCV genotype 1b screen were identified as 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a.
, And 6, isolates from a wide variety of HCV genotypes. Thus, it is possible to select ribozyme candidates for further development based on their ability to widely cleave HCV RNA from a wide range of HCV genotypes and subspecies.

【０１１９】実施例６：インビトロでの保存ＨＣＶ ＲＮＡ標的部位のリボザイム切断 遺伝子型中でおよび異なる遺伝子型の間で高度に保存された３つのゲノムの領
域が存在する。これらの保存配列は，５'および３'非コーディング領域（ＮＣＲ
）ならびにコア蛋白質コーディング領域の５'−末端に存在する。これらの領域
は，ＨＣＶ ＲＮＡの複製および翻訳に重要であると考えられている。すなわち
，これらの保存ＨＣＶゲノム領域を標的とする治療剤は，広範な種類のＨＣＶ遺
伝子型に対して有意な影響を有しているであろう。亜種の存在，および，２以上
の遺伝子型による感染の可能性のため，これは有効な治療のための重要な特徴で
ある。さらに，薬剤耐性を導くと示唆されている変異は，典型的にはこれらの高
度に保存された領域中には生じないため，薬剤耐性は生じそうにもない。多数の
遺伝子型を標的として，薬剤耐性の発生の機会を低下させるために，本出願人は
，上述した保存領域中の同一の領域中で切断するリボザイムを設計した。 Example 6: In Vitro Conservation There are three genomic regions that are highly conserved in ribozyme cleavage genotypes of HCV RNA target sites and among different genotypes. These conserved sequences contain 5 'and 3' non-coding regions (NCR
) As well as at the 5'-end of the core protein coding region. These regions are believed to be important for the replication and translation of HCV RNA. Thus, therapeutics targeting these conserved HCV genomic regions will have significant effects on a wide variety of HCV genotypes. Because of the presence of the subspecies and the possibility of infection by more than one genotype, this is an important feature for effective treatment. Furthermore, mutations suggested to lead to drug resistance are not likely to occur in these highly conserved regions, as drug resistance typically does not occur. In order to target multiple genotypes and reduce the chance of developing drug resistance, Applicants have designed ribozymes that cleave in the same conserved region described above.

【０１２０】 ５'ＮＣＲ，コア蛋白質コーディング領域の５'末端，および３'ＮＣＲについ
て，配列アライメントを実施した。５'ＮＣＲについては，遺伝子型１ａ，１ｂ
，２ａ，２ｂ，２ｃ，３ａ，３ｂ，４ａ，４ｆ，および５ａを表す３４個の異な
る単離物をアライメントさせた。アライメントは，報告されている配列"ＨＰＣ
Ｋ１Ｓ１”を番号付けの参照として，１番目のヌクレオチドから３５０番目のヌ
クレオチド（開始ＡＴＧコドンの１８ヌクレオチド下流）の配列を含有していた
。コア蛋白質コーディング領域については，遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ，２ｂ，
２ｃ，３ａ，３ｂ，４ａ，４ｃ，４ｆ，５ａ，および６ａを表す４４個の異なる
単離物をアライメントした。これらのアライメントは，開始ＡＴＧコドンから８
ヌクレオチド上流から始まる６００ヌクレオチドを含有していた。番号付けの参
照として，報告されている配列"ＨＰＣＣＯＰＲ”を用い，開始コドンＡＴＧの
８ヌクレオチド上流の"Ｃ"を"１"と表した。３'ＮＣＲ領域については，遺伝子
型１ｂ，２ａ，２ｂ，３ａ，および３ｂを表す２０個の異なる単離物をアライメ
ントした。これらのアライメントは，ゲノムの３'末端の２３５ヌクレオチドの
配列を含有していた。番号付けの参照として，報告されている配列"Ｄ８５５１
６"を用い，３'末端から２３５番目のヌクレオチドを"１"と表した。Sequence alignment was performed on the 5 ′ NCR, the 5 ′ end of the core protein coding region, and the 3 ′ NCR. For 5 'NCR, genotypes 1a, 1b
, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 4f, and 5a were aligned. The alignment is based on the reported sequence "HPC
K1S1 "contained the sequence from nucleotide 1 to nucleotide 350 (18 nucleotides downstream of the start ATG codon) with reference to the numbering. For the core protein coding region, genotypes 1a, 1b, 2a, 2b,
Forty-four different isolates representing 2c, 3a, 3b, 4a, 4c, 4f, 5a, and 6a were aligned. These alignments are 8 starting from the start ATG codon.
It contained 600 nucleotides starting from the nucleotide upstream. As a reference for numbering, the reported sequence "HPCCOPR" was used and "C" 8 nucleotides upstream of the start codon ATG was designated "1". For the 3 'NCR region, 20 different isolates representing genotypes 1b, 2a, 2b, 3a, and 3b were aligned. These alignments contained a sequence of 235 nucleotides at the 3 'end of the genome. As a numbering reference, the reported sequence "D8551
Using 6 ", the 235th nucleotide from the 3 'end was represented as" 1 ".

【０１２１】 各領域のアライメントの分析の間，各配列をそれぞれの参照配列（上で同定さ
れているもの）と比較し，すべての単離物にわたって同一である領域を決定した
。参照配列中のすべての潜在的リボザイム部位を同定した。リボザイム部位を選
択する最も高い優先順位は，その部位が，すべての位置において切断部位および
結合アームの両方でアライメントしたすべての単離物にわたって１００％の同一
性を有することであった。これらの基準を満たすリボザイム部位を選択した。さ
らに，以下のように２つの特定の酌量を加えた：１）潜在的リボザイム部位が１
または２個のヌクレオチド位置を除くすべての位置で１００％の配列同一性を有
する場合，その位置の実際のヌクレオチドをこれとは異なる単離物で試験した。
そのヌクレオチドが，"Ｇ：Ｕ動揺"塩基対形成を可能とするよう設計されたリボ
ザイムが単離物のすべてにおいて機能することができたようなものである場合，
その部位を選択した。２）潜在的リボザイム部位が１または２個のヌクレオチド
位置を除くすべての位置で１００％の配列同一性を有する場合，異なるヌクレオ
チドを含む単離物の遺伝子型を試験した。異なる単離物の遺伝子型が非常にまれ
な罹患率のものである場合，その部位もまた選択した。During the analysis of the alignment of each region, each sequence was compared to its respective reference sequence (identified above) to determine the regions that were identical across all isolates. All potential ribozyme sites in the reference sequence were identified. The highest priority for selecting a ribozyme site was that it had 100% identity at all positions across all isolates aligned with both the cleavage site and the binding arm. Ribozyme sites meeting these criteria were selected. In addition, two specific considerations were added as follows: 1) The potential ribozyme site was 1
Alternatively, if all positions except two nucleotide positions have 100% sequence identity, the actual nucleotide at that position was tested on a different isolate.
If the nucleotide is such that a ribozyme designed to allow "G: U perturbation" base pairing could function in all of the isolates,
The site was selected. 2) If the potential ribozyme site had 100% sequence identity at all but one or two nucleotide positions, the isolates containing different nucleotides were genotyped. If the genotypes of the different isolates were of a very rare prevalence, the sites were also selected.

【０１２２】 同定されかつ以下に参照されるリボザイム部位は，以下の命名法を用いる："
その部位が存在するゲノムの領域"，続いて"切断部位の５’側のヌクレオチド位
置"（上述した参照配列および番号付けに従う）。例えば，５'ＮＣＲ中のヌクレ
オチド位置６７のリボザイム切断部位は"５−６７"と表され，コアコーディング
領域中の位置４８のリボザイム切断部位は"ｃ４８"と表される。The ribozyme sites identified and referenced below use the following nomenclature: "
The region of the genome in which the site resides ", followed by the" nucleotide position 5 'to the cleavage site "(according to the reference sequence and numbering described above). 5-67 "and the ribozyme cleavage site at position 48 in the core coding region is designated" c48 ".

【０１２３】 これらの多数のリボザイムをインビトロＨＣＶ切断アッセイにおいてスクリー
ニングして，培養細胞研究に適当なリボザイム候補を選択した。スクリーニング
用に選択されたリボザイムは，ＨＣＶの翻訳に必要な５'ＵＴＲ領域を標的とす
るものであった。これらの部位はすべて８個の主要なＨＣＶ遺伝子型および１８
個のサブタイプにおいて保存されており，上述した分析に用いた各ＨＣＶ単離物
において，高い相同性を有している。４つの異なる遺伝子型（１ｂ，２ａ，４，
および５）のＨＣＶ ＲＮＡをヒト患者から単離し，５'ＨＣＶ ＵＴＲおよび
５'コア領域をＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ転
写キットおよび製造元のプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて，Ｔ７
プロモーターを含むＲＴ−ＰＣＲ産物から，５'ＨＣＶ ＵＴＲ領域のランオフ
転写産物（約７５０ヌクレオチドの転写産物）を調製した。取り込まれなかった
ヌクレオチドは，Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６０樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でスピンカ
ラム濾過により除去した。濾過した転写産物は，ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１５０μＣｉ／μｌのガンマ−
３２Ｐ−ＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて，酵素製造元のプロトコルにしたがって，32 Ｐで５'末端標識した。キナーゼ処理した転写産物は，再びスピン精製して，取
り込まれなかったガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去し，５％ポリアクリルアミドゲ
ルでゲル精製した。A number of these ribozymes were screened in an in vitro HCV cleavage assay to select suitable ribozyme candidates for cell culture studies. The ribozymes selected for screening targeted the 5 'UTR region required for HCV translation. All of these sites contain eight major HCV genotypes and 18
And a high degree of homology in each of the HCV isolates used in the above analysis. Four different genotypes (1b, 2a, 4,
And 5) HCV RNA was isolated from a human patient, and the 5 ′ HCV UTR and 5 ′ core region were amplified using RT-PCR. Using the T7 Megascript transcription kit and the manufacturer's protocol (Ambion, Inc.), the T7
From the RT-PCR product containing the promoter, a run-off transcript (transcript of about 750 nucleotides) of the 5 ′ HCV UTR region was prepared. Unincorporated nucleotides were removed by spin column filtration on Bio-Gel P-60 resin (Bio-Rad). The filtered transcript is a polynucleotide kinase (B
oehringer / Mannheim) and 150 μCi / μl gamma-
5P end-labeled with 32 P using 32 P-ATP (NEN) according to the protocol of the enzyme manufacturer. The kinase-treated transcript was spin-purified again to remove unincorporated gamma-32P-ATP and gel purified on a 5% polyacrylamide gel.

【０１２４】 表ＩＶからの種々の部位を標的とするリボザイムを選択し，５'ＨＣＶ ＵＴ
Ｒ転写産物の配列について試験して，ＲＮＡ切断の効率を試験した。１５個のリ
ボザイムを先に記載されたように合成した（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（
上掲））。Ribozymes targeting various sites from Table IV were selected and 5 ′ HCV UT
The sequence of the R transcript was tested to test the efficiency of RNA cleavage. Fifteen ribozymes were synthesized as previously described (Wincott et al., (
Above)).

【０１２５】 アッセイは，リボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ，ｐＨ７．５，１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2，１０ユニットＲＮａｓｅ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ），１０ｍＭ ＤＴＴ，０．５μｇ ｔＲＮＡ）中の２Ｘ（２μ
Ｍ）濃度の精製リボザイムを予熱することにより行い，２Ｘリボザイムミックス
を，切断緩衝液中で予熱した等量の基質ＲＮＡ（最終濃度１７．４６ｐｍｏｌｅ
）に加えることにより切断反応を開始した。アッセイは，最終濃度１μＭのリボ
ザイム，すなわちリボザイム過剰で，３７℃で２４時間行った。等量の９５％ホ
ルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０
．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を停止し，次に試料を９５
℃に２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮ
Ａおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオー
トラジオグラフィーで可視化した。切断のパーセントは，ホスファーイメージャ
ー（登録商標）を用いて，無傷の基質と切断生成物を表すバンドを定量すること
により決定した。The assay was performed using ribozyme cleavage buffer (50 mM TRIS, pH 7.5, 10
mM MgCl 2 , 10 units RNase inhibitor (Boehringer / M
annheim), 10 mM DTT, 0.5 μg tRNA).
M) by preheating purified ribozyme at a concentration and mixing 2X ribozyme mix with an equal volume of substrate RNA (final concentration 17.46 pmole) preheated in cleavage buffer.
) To initiate the cleavage reaction. The assay was performed at 37 ° C. for 24 hours with a final concentration of 1 μM ribozyme, ie ribozyme excess. Equal volumes of 95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue and 0%
. The reaction was stopped by adding 05% xylene cyanol, and then
Heat to 2 ° C. for 2 minutes, quench, and load onto denaturing polyacrylamide gel. Substrate RN
A and specific RNA cleavage products generated by ribozyme cleavage were visualized by gel autoradiography. Percentage of cleavage was determined by quantifying bands representing intact substrate and cleavage products using PhosphorImager®.

【０１２６】 ゲルから観察された切断フラグメントのサイズを，ＲＮＡマーカーとの比較に
より予測されたフラグメントサイズと関連づけた。予測切断フラグメントの光学
密度を，スファーイメージャープレートから決定し，最も切断された産物を表す
最高密度から，試験したＨＣＶ転写産物の各遺伝子型の最低密度まで並べた。上
位３個の切断リボザイム（試験した１５個のリボザイム中）にランキング値５を
与え，次に高い密度の３個にランキング値４を与え，試験した各遺伝子型につい
て同様に行った。各リボザイムについてのランキング値を，試験した遺伝子型の
間で平均した。個々のおよび平均のリボザイムランキング値をグラフに表し，比
較した。結果（図２）は，これらの試験したリボザイムの多くが，遺伝子型に関
わらず高いレベルの切断を与えることができることを示す。特に，部位ＨＣＶ．
５−２５８，ＨＣＶ．５−２９４，ＨＣＶ．５−３１３（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １９９６，
９８（１２）：２７２０−２７２８），およびＨＣＶ．５−３１８（表ＩＶ）を
標的とするリボザイムは，ＲＮＡ切断の一貫したパターンを示すようである。The size of the cleaved fragment observed from the gel was related to the fragment size predicted by comparison with the RNA marker. The optical densities of the predicted truncated fragments were determined from spher imager plates and ranged from the highest density representing the most cleaved product to the lowest density of each genotype of the HCV transcript tested. The top three truncated ribozymes (out of the fifteen ribozymes tested) were given a ranking value of 5, and the next three with the highest density were given a ranking value of 4, and so on for each genotype tested. Ranking values for each ribozyme were averaged between the genotypes tested. Individual and average ribozyme ranking values were graphed and compared. The results (FIG. 2) show that many of these tested ribozymes can give high levels of cleavage regardless of genotype. In particular, site HCV.
5-258, HCV. 5-294, HCV. 5-313 (Sakamoto e
t al. , J. et al. Clinical Investigation 1996,
98 (12): 2720-2728), and HCV. Ribozymes targeting 5-318 (Table IV) appear to show a consistent pattern of RNA cleavage.

【０１２７】実施例７：ＨＣＶを標的とするリボザイムを用いる，ＯＳＴ７細胞における ルシフェラーゼ活性の阻害 リボザイムが細胞内でＨＣＶ ＲＮＡを阻害する能力を，蛍ルシフェラーゼと
ウミシイタケルシフェラーゼの両方を用いるデュアルレポーターシステムを用い
て試験した（図３）。５'ＨＣＶ ＵＴＲ領域を標的とするリボザイムは，この
領域を切断したときに，転写産物のルシフェラーゼへの翻訳を阻害するであろう
。ＯＳＴ−７細胞を，１０％ウシ胎児血清，１％ペニシリン／ストレプトマイシ
ンおよび１％Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ培地で，黒壁９６ウエルプレート（
Ｐａｃｋａｒｄ）にウエルあたり１２，５００細胞で播種し，３７℃で一夜イン
キュベートした。Ｔ７プロモーターを含み５'ＨＣＶ ＵＴＲおよび蛍ルシフェ
ラーゼを発現するプラスミド（Ｔ７Ｃ１−３４１（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１
９９３，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．６７，３３３８−３３４４））をｐＲＬＳＶ４
０ウミシイタケ対照プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と
混合し，次にリボザイムおよびカチオン性脂質と混合して，５Ｘ濃度の試薬を作
成した（Ｔ７Ｃ１−３４１（４μｇ／ｍｌ），ｐＲＬＳＶ４０ウミシイタケルシ
フェラーゼ対照（６μｇ／ｍｌ），リボザイム（２５０ｎＭ），トランスフェク
ション試薬（２８．５μｇ／ｍｌ））。 Example 7: Inhibition of luciferase activity in OST7 cells using ribozymes targeting HCV The ability of ribozymes to inhibit HCV RNA in cells was determined using a dual reporter system using both firefly luciferase and Renilla luciferase. (Figure 3). Ribozymes targeting the 5'HCV UTR region will inhibit translation of the transcript into luciferase when this region is cleaved. OST-7 cells were plated in black-walled 96-well plates with DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin and 1% L-glutamine (
Packard) at 12,500 cells per well and incubated overnight at 37 ° C. Plasmids containing the T7 promoter and expressing the 5 ′ HCV UTR and firefly luciferase (T7C1-341 (Wang et al., 1)
993, J.C. of Virol. 67, 3338-3344)) with pRLSV4
0 Renilla control plasmid (Promega Corporation), then mixed with ribozyme and cationic lipid to make a 5X concentration of reagent (T7C1-341 (4 μg / ml), pRLSV40 Renilla luciferase control (6 μg / ml) ), Ribozyme (250 nM), transfection reagent (28.5 μg / ml)).

【０１２８】 複合体混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。細胞から培地を除去し
，１２０μｌのＯｐｔｉ−ｍｅｍ培地をウエルに加え，次に３０μｌの５Ｘ複合
体混合物を加えた。未処理細胞の入ったウエルには１５０μｌのＯｐｔｉ−ｍｅ
ｍを加えた。複合体混合物をＯＳＴ−７細胞上で４時間インキュベートし，受動
性溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で溶解し，発光シグ
ナルを，デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて，製造元のプロトコル
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にしたがって定量した。用いたリ
ボザイム配列は表ＩＶに示される。用いたリボザイムは，ハンマーヘッドモチー
フのものであった。ハンマーヘッドリボザイムを，リボザイムが，５つの位置で
リボース残基からなり（例えば図７を参照）；位置４が２'−Ｃ−アリルまたは
２'−アミノ修飾を有し；位置７が２'−アミノ修飾または２−Ｏ−メチル修飾を
有し；残りのヌクレオチド位置が２'−Ｏ−メチル置換を有し；４つのヌクレオ
チドが５'末端にホスホロチオエート置換を有するように，化学的に修飾した。
さらに，リボザイムの３'末端は３'−３'結合反転脱塩基成分（脱塩基デオキシ
リボース；ｉＨ）を含有していた。データ（図４）は，蛍ルシフェラーゼの蛍光
とウミシイタケルシフェラーゼの蛍光との比率を示す。５'ＨＣＶ ＵＴＲを標
的とするすべてのリボザイムは，ウミシイタケルシフェラーゼと比較して蛍ルシ
フェラーゼのシグナルを減少させることができた。The complex mixture was incubated at 37 ° C. for 20 minutes. The medium was removed from the cells and 120 μl of Opti-mem medium was added to the wells, followed by 30 μl of 5X complex mixture. 150 μl of Opti-me was added to the wells containing untreated cells.
m was added. The complex mixture was incubated on OST-7 cells for 4 hours, lysed with passive lysis buffer (Promega Corporation) and the luminescence signal was quantified using a dual luciferase assay kit according to the manufacturer's protocol (Promega Corporation). did. The ribozyme sequences used are shown in Table IV. The ribozyme used was of the hammerhead motif. The hammerhead ribozyme is characterized in that the ribozyme consists of ribose residues at five positions (see, eg, FIG. 7); position 4 has a 2'-C-allyl or 2'-amino modification; position 7 has a 2'- The remaining nucleotide positions had a 2'-O-methyl substitution; the four nucleotides were chemically modified to have a phosphorothioate substitution at the 5 'end, with amino or 2-O-methyl modifications.
Furthermore, the 3 'end of the ribozyme contained a 3'-3' linked inverted abasic component (abasic deoxyribose; iH). The data (FIG. 4) shows the ratio of fluorescence of firefly luciferase to Renilla luciferase. All ribozymes targeting the 5'HCV UTR were able to reduce the firefly luciferase signal compared to Renilla luciferase.

【０１２９】実施例９：ＯＳＴ−７細胞における，不活性対照と比較したときのルシフェラー ゼ活性のリボザイム媒介性阻害 上述したデュアルレポーターシステムを利用して，リボザイムにより媒介され
るルシフェラーゼ活性の低下のレベルをその不活性対照と比較して決定した。先
の例において記載した化学組成を有する，ＨＣＶ３１３および３１８部位（表Ｉ
Ｖ）に対するリボザイムおよびその不活性対照を上述のように合成した。不活性
対照は，活性リボザイムと同じヌクレオチド塩基組成を有しているが，ヌクレオ
チド配列はスクランブル化されていた。組織培養およびルシフェラーゼアッセイ
に用いたプロトコルは，５Ｘ複合体混合物中のリボザイム濃度が１ｍＭ（細胞上
の最終濃度２００ｎＭ）であったことをのぞき，実施例８に記載のとおりであっ
た。[0129] Example 9: in OST-7 cells, using a dual reporter system described above ribozyme-mediated inhibition of luciferase activity when compared to inactive control, the level of reduction of the luciferase activity mediated by ribozyme Was determined relative to its inactive control. HCV 313 and 318 sites with the chemical composition described in the previous example (Table I)
The ribozyme against V) and its inactive control were synthesized as described above. The inactive control had the same nucleotide base composition as the active ribozyme, but the nucleotide sequence was scrambled. The protocol used for tissue culture and luciferase assay was as described in Example 8, except that the ribozyme concentration in the 5X complex mixture was 1 mM (final concentration on cells 200 nM).

【０１３０】 結果は図５に示される。ＨＣＶ．５−３１８を標的とするリボザイムは，未処
理および不活性対照と比較して，蛍ルシフェラーゼ活性を非常に低下させること
ができた。ＨＣＶ．５−３１３を標的とするリボザイムは，不活性対照と比較し
て，蛍ルシフェラーゼ活性をわずかに低下させることができた。The results are shown in FIG. HCV. Ribozymes targeting 5-318 were able to greatly reduce firefly luciferase activity compared to untreated and inactive controls. HCV. Ribozymes targeting 5-313 were able to slightly reduce firefly luciferase activity compared to the inactive control.

【０１３１】実施例１０：ウイルス複製のリボザイム阻害 ＨＣＶ感染の間，ウイルスＲＮＡは，いくつかのプロセス，すなわち，脱外被
，翻訳，ＲＮＡ複製およびパーケージングにおいて，リボザイム切断の潜在的標
的として存在する。標的ＲＮＡは，これらの段階のいずれか１つにおいて，リボ
ザイム切断に対していくぶんアクセス可能であろう。ＨＣＶ ５'ＵＴＲ／ルシ
フェラーゼレポーターシステムにおいては，ＨＣＶ開始リボソーム侵入部位（Ｉ
ＲＥＳ）と翻訳装置の間の関係を模倣するが（実施例９），これらの他のウイル
ス過程は，ＯＳＴ７システムでは表されない。この結果得られる，標的ウイルス
ＲＮＡと関連するＲＮＡ／蛋白質複合体も存在しない。さらに，これらの過程は
，ＨＣＶ感染細胞中で組み合わされて，さらに標的ＲＮＡのアクセス可能性に影
響を与えるかもしれない。したがって，我々は，ＨＣＶ ５'ＵＴＲを切断する
よう設計されたリボザイムがウイルス系の複製に影響を及ぼすか否かを試験した
。 Example 10 Ribozyme Inhibition of Viral Replication During HCV infection, viral RNA is present as a potential target of ribozyme cleavage in several processes, namely uncoating, translation, RNA replication and packaging. . The target RNA will be somewhat accessible for ribozyme cleavage at any one of these stages. In the HCV 5'UTR / luciferase reporter system, the HCV-initiated ribosome entry site (I
RES) and the translation device (Example 9), but these other viral processes are not represented in the OST7 system. There is no resulting RNA / protein complex associated with the target viral RNA. In addition, these processes may be combined in HCV infected cells to further affect target RNA accessibility. Therefore, we tested whether ribozymes designed to cleave the HCV 5'UTR affect viral replication.

【０１３２】 最近，ＬｕおよびＷｉｍｍｅｒは，ポリオウイルスＩＲＥＳがＨＣＶからのＩ
ＲＥＳで置き換えられているＨＣＶ−ポリオウイルスキメラの特性決定を行った
（Ｌｕ＆Ｗｉｍｍｅｒ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．９３，１４１２−１４１７）。ポリオウイルス（ＰＶ）は，ＨＣＶと同様
の正鎖ＲＮＡウイルスであるが，ＨＣＶとは異なり，外被を有さず，培養細胞中
で効率的に複製する。ＨＣＶ−ＰＶキメラは，野生型ＰＶより安定かつ小さいプ
ラーク表現型を発現する。[0132] Recently, Lu and Wimmer have reported that the poliovirus IRES has been
Characterization of the HCV-poliovirus chimera replaced by RES was performed (Lu & Wimmer, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.
SA. 93, 1412-1417). Poliovirus (PV) is a positive-sense RNA virus similar to HCV, but unlike HCV, it has no coat and replicates efficiently in cultured cells. HCV-PV chimeras express a more stable and smaller plaque phenotype than wild-type PV.

【０１３３】 実験のために，以下のリボザイムを合成した（表ＶＩＩＩ）：部位１８３を標
的とするリボザイム（３個の５'−末端ホスホロチオエート結合），部位１８３
のスクランブル対照，部位３１８を標的とするリボザイム（３個の５'−末端ホ
スホロチオエート結合），部位１８３を標的とするリボザイム（４個の５'−末
端ホスホロチオエート結合），部位１８３を標的とする不活性リボザイム（４個
の５'−末端ホスホロチオエート結合）。ＨｅＬａ細胞にＨＣＶ−ＰＶキメラを
３０分間感染させ，直ちにリボザイムで処理した。ＨｅＬａ細胞を，Ｕ底９６ウ
エルプレートに９０００−１０，０００細胞／ウエルの密度で播種し，３７℃で
５％ＣＯ2下で２４時間インキュベートした。リボザイム（２００ｎＭ）のトラ
ンスフェクションは，５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）中で１０Ｘリボザイム（２０００ｎＭ）と１０Ｘカチオン性脂質（８
０μｇ／ｍｌ）を混合することにより行った。リボザイム／脂質複合体を，３７
℃で５％ＣＯ2下で１５分間インキュベートした。細胞から培地を吸引し，５％
ＦＢＳ血清を含む８０μｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で置き換え，２０
μｌの１０Ｘ複合体を加えた。細胞を複合体とともに，３７℃で５％ＣＯ2下で
２４時間インキュベートした。For the experiments, the following ribozymes were synthesized (Table VIII): ribozymes targeting site 183 (three 5′-terminal phosphorothioate linkages), site 183
Control, ribozyme targeting site 318 (three 5'-terminal phosphorothioate linkages), ribozyme targeting site 183 (four 5'-terminal phosphorothioate linkages), inactive targeting site 183 Ribozymes (four 5'-terminal phosphorothioate linkages). HeLa cells were infected with the HCV-PV chimera for 30 minutes and immediately treated with ribozymes. HeLa cells were seeded at a density of 9000-10,000 cells / well in U-bottom 96 well plates and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Transfection of ribozyme (200 nM) was performed using DMEM (Gibco) containing 5% fetal bovine serum (FBS).
10X ribozyme (2000 nM) and 10X cationic lipid (8
0 μg / ml). The ribozyme / lipid complex was
Incubate for 15 minutes at 5 ° C. under 5% CO 2 . Aspirate medium from cells, 5%
Replace with 80 μl of DMEM (Gibco BRL) containing FBS serum and
μl of 10 × complex was added. The cells were incubated with the conjugate at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours.

【０１３４】 試験した細胞からのＨＣＶ−ＰＶの収率（図６Ａ）は，プラークアッセイによ
り定量した。プラークアッセイは，ウイルス試料を無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）で希釈し，６ウエルプレートで，１００μｌをＨｅＬａ細胞単層（約
８０％コンフルエント）に３０分間適用することにより行った。感染させた単層
の上に３ｍｌの１．２％寒天（Ｓｉｇｍａ）を重層し，３７℃で５％ＣＯ2下で
インキュベートした。２−３日後，重層を除去し，単層を１．２％クリスタルバ
イオレットで染色し，プラーク形成単位を計数した。データは図６Ａに示される
。部位１８３に対するリボザイムは，スクランブル対照と比較して，ＨＣＶ−Ｐ
Ｖ複製を＞８０％（Ｐ＜０．０５）阻害した（図６Ａ，最初の２つの棒）。さら
に，３または４個のホスホロチオエートで安定化したものも，ウイルス複製の阻
害において同等に有効であった（各対照に対してＰ＜０．０５）（図６Ａの最初
の棒と４番目の棒を比較されたい）。部位３１８に対するリボザイムはまた，ウ
イルス複製に対して統計学的に有意な（Ｐ＜０．０５）影響を有していた（図６
Ａの２番目と３番目の棒を比較されたい）。The yield of HCV-PV from the cells tested (FIG. 6A) was quantified by plaque assay. The plaque assay was performed using serum samples in serum-free DMEM (Gibco
BRL) and applied in a 6-well plate by applying 100 μl to a HeLa cell monolayer (about 80% confluent) for 30 minutes. The infected monolayer was overlaid with 3 ml of 1.2% agar (Sigma) and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 . After 2-3 days, the overlay was removed, the monolayer was stained with 1.2% crystal violet, and plaque forming units were counted. The data is shown in FIG. 6A. The ribozyme for site 183 contained HCV-P as compared to the scrambled control.
V replication was inhibited by> 80% (P <0.05) (FIG. 6A, first two bars). In addition, those stabilized with 3 or 4 phosphorothioates were equally effective at inhibiting viral replication (P <0.05 for each control) (first and fourth bars in FIG. 6A). Please compare). Ribozymes against site 318 also had a statistically significant (P <0.05) effect on viral replication (FIG. 6).
Compare the second and third bars of A).

【０１３５】 リボザイム切断メカニズムが，観察されたＨＣＶ−ＰＶ複製の阻害の原因であ
ることを確認するために，ＨＣＶ−ＰＶ感染細胞を，結合アーム配列を維持して
いるが触媒コア中に変異を含み切断活性が弱められた，部位１８３に対するリボ
ザイムで処理した（表Ｉ）。これらの細胞におけるウイルス複製は，スクランブ
ル対照リボザイムで処理した細胞と比較して，阻害されなかった（図６Ａ，４番
目および５番目の棒）。このことは，観察されたＨＣＶ−ＰＶ複製の阻害にはリ
ボザイムの切断活性が必要であったことを示す。さらに，ＨＣＶ ５'ＵＴＲの
部位１８３を標的とするリボザイムは，野生型ＰＶの複製に影響を及ぼさなかっ
た（図６Ｂ）。これらのデータは，ＨＣＶ−ＰＶ複製のリボザイム媒介性阻害が
ＨＣＶ ５'ＵＴＲに依存性であり，ＰＶ複製の一般的阻害ではないことの証拠
を提供する。To confirm that the ribozyme cleavage mechanism is responsible for the observed inhibition of HCV-PV replication, cells infected with HCV-PV were maintained with binding arm sequences but with mutations in the catalytic core. Site 183 was treated with a ribozyme with reduced attenuating cleavage activity (Table I). Virus replication in these cells was not inhibited compared to cells treated with the scrambled control ribozyme (FIG. 6A, 4th and 5th bars). This indicates that the observed inhibition of HCV-PV replication required ribozyme cleavage activity. In addition, ribozymes targeting site 183 of the HCV 5'UTR did not affect wild-type PV replication (FIG. 6B). These data provide evidence that ribozyme-mediated inhibition of HCV-PV replication is dependent on the HCV 5 'UTR and is not a general inhibition of PV replication.

【０１３６】 また，部位１８３に対するリボザイムを，ＨｅＬａ細胞中で１回の感染サイク
ルの間にＨＣＶ−ＰＶ複製を阻害する能力について試験した（図８）。部位１８
３に対するリボザイムで処理した細胞（７／４フォーマット）は，スクランブル
対照で処理した細胞より有意に少ないウイルスを生成した（感染後８時間で＞８
０％阻害，Ｐ＜０．００１）。The ribozyme against site 183 was also tested for its ability to inhibit HCV-PV replication in HeLa cells during one cycle of infection (FIG. 8). Part 18
Cells treated with the ribozyme against 3 (7/4 format) produced significantly less virus than cells treated with the scrambled control (> 8 at 8 hours post-infection).
0% inhibition, P <0.001).

【０１３７】実施例１１：リボザイムの長さの短縮 上述の実施例１０に記載されるすべてのリボザイムは，各結合アーム上に７個
のヌクレオチドを含み，４塩基対のステムＩＩ要素を含んでいた（７／４フォー
マット）。治療用リボザイムの薬剤の製造のためには，可能であれば配列の長さ
を最小にすることが有利である。したがって，部位１８３に対するリボザイムを
，以下のように短縮した：各結合アームから最も外側のヌクレオチドを除去する
ことにより，リボザイムが各結合アーム中に６ヌクレオチドを有し，ステムＩＩ
領域が４塩基対の長さとなるようにする（６／４フォーマット）；ステムＩＩ中
の１塩基対（２ヌクレオチド）を除去することにより，３塩基対のステムＩＩと
する（７／３フォーマット）；または各結合アームから１ヌクレオチドを除去し
てステムＩＩを１塩基対短縮する（６／３フォーマット）。（これらのリボザイ
ムのそれぞれの図解的描写については図７を参照）。試験したすべてのフォーマ
ットのリボザイムは，ウイルス複製の有意な阻害を与え（図８），８時間の時点
において７／４，７／３および６／３フォーマットはほぼ同一であった（すべて
のフォーマットについて各時点においてＰ＜０．００１）。試験した最も短いリ
ボザイム（６／３フォーマット）は，７／４リボザイム（約８０％阻害，Ｐ＜０
．００１）よりわずかに高い有効性を有していた（＞９０％阻害，Ｐ＜０．００
１）。６／３リボザイムは，ＨＣＶ−ＰＶキメラ中の部位１８３にアクセスする
，より高い能力を有しているかもしれない。 Example 11: Reduction of ribozyme length All ribozymes described in Example 10 above contained 7 nucleotides on each binding arm and contained a 4 base pair Stem II element. (7/4 format). For the production of therapeutic ribozymes, it is advantageous to minimize the length of the sequence, if possible. Therefore, the ribozyme for site 183 was shortened as follows: by removing the outermost nucleotide from each binding arm, the ribozyme had 6 nucleotides in each binding arm and stem II
Make the region 4 base pairs long (6/4 format); remove one base pair (2 nucleotides) in stem II to make a 3 base pair stem II (7/3 format) Or shortening stem II by one base pair by removing one nucleotide from each binding arm (6/3 format). (See Figure 7 for a schematic depiction of each of these ribozymes). Ribozymes of all formats tested gave significant inhibition of viral replication (FIG. 8), and at 8 hours the 7/4, 7/3 and 6/3 formats were nearly identical (for all formats). P <0.001 at each time point). The shortest ribozyme tested (6/3 format) was the 7/4 ribozyme (about 80% inhibition, P <0
. 001) had slightly higher efficacy (> 90% inhibition, P <0.00
1). The 6/3 ribozyme may have a higher ability to access site 183 in the HCV-PV chimera.

【０１３８】実施例１２：ＨＣＶリボザイムとインターフェロンとの組み合わせ療法 ＨｅＬａ細胞（ウエルあたり１０，０００細胞）を，完全培地（ＤＭＥＭ＋５
％ＦＢＳ）中の１２．５ユニット／ｍｌのインターフェロンアルファで前処理す
るか，または完全培地のみで４時間前処理し，次にＨＣＶ−ＰＶでＭＯＩ＝０．
１で３０分間感染させた。次に，ウイルス接種物を除去し，ＨＣＶの部位１８３
を標的とする２００ｎＭのリボザイム（Ｒｚ）またはリボザイムの触媒コア中に
リボザイムの活性を非常に減弱させる変異を有する結合弱化対照（ＢＡＣ）を，
カチオン性脂質を用いて完全培地中で２４時間輸送した。２４時間後，３回の凍
結／融解により細胞を溶解させてウイルスを放出させ，プラークアッセイにより
ウイルスを定量した。ウイルス収率は，１ｍｌあたりの平均プラーク形成単位（
ｐｆｕ／ｍｌ）＋ＳＥＭで表される。データは図１０に示される。 Example 12 Combination therapy of HCV ribozyme and interferon HeLa cells (10,000 cells per well) were added to complete medium (DMEM + 5
% FBS) or pretreated with complete medium alone for 4 hours, then HCV-PV with MOI = 0.
1 for 30 minutes. Next, the viral inoculum was removed and site 183 of HCV was removed.
A binding-weakening control (BAC) with 200 nM ribozyme (Rz) or a mutation in the catalytic core of the ribozyme that greatly attenuates the activity of the ribozyme,
Transported for 24 hours in complete medium using cationic lipids. Twenty-four hours later, the cells were lysed by three freeze / thaw cycles to release the virus, and the virus was quantified by plaque assay. Virus yield was calculated as the average plaque forming units per ml (
pfu / ml) + SEM. The data is shown in FIG.

【０１３９】 インターフェロン（ＩＦＮ）による前処理は，対照処理細胞と比較して，ウイ
ルス収率を約１０-1低下させる（ＢＡＣ＋ＩＦＮ対ＢＡＣ）。リボザイム処理細
胞は対照処理細胞と比較して，２ｘ１０-1少ないウイルスを生成する（Ｒｚ対Ｂ
ＡＣ）。ＲｚとＩＦＮの組み合わせ処理により，ウイルス収率が相乗的に４ｘ１
０-2低下した（Ｒｚ＋ＩＦＮ対ＢＡＣ）。相加的効果であれば，３ｘ１０-1の低
下しか認められなかったであろう（１ｘ１０-1＋２ｘ１０-1）。Pre-treatment with interferon (IFN) reduces virus yield by about 10 −1 compared to control-treated cells (BAC + IFN vs. BAC). Ribozyme-treated cells produce 2 × 10 -1 less virus than control-treated cells (Rz vs. B
AC). By the combined treatment of Rz and IFN, the virus yield is synergistically 4 × 1
0 -2 decreased (Rz + IFN versus BAC). With an additive effect, only a reduction of 3 × 10 −1 would have been observed ( 1 × 10 −1 + 2 × 10 −1 ).

【０１４０】実施例１３：他のリボザイムモチーフを用いるＣ型肝炎ウイルスの阻害 多くの種々のリボザイムモチーフ（ＲＰＩモチーフ１−３；図９）を，組織培
養においてＨＣＶの増殖を阻害する能力について試験した。ＲＰＩモチーフＩの
例は，Ｋｏｒｅら（１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２６，４１１６−４１２０）に記載されており，ＲＰＩモチーフＩＩの例は，
Ｌｕｄｗｉｇ＆Ｓｐｒｏａｔ（国際公開ＷＯ９８／５８０５８）に記載されてい
る。ＲＰＩモチーフＩＩＩは，本出願人が最近開発した新規なリボザイムモチー
フであり，本明細書においてはこのモチーフの例を試験した。 Example 13: Inhibition of hepatitis C virus using other ribozyme motifs A number of different ribozyme motifs (RPI motifs 1-3; Figure 9) were tested for their ability to inhibit the growth of HCV in tissue culture. . Examples of RPI motif I are described in Kore et al. (1998, Nucleic Acids Research).
26, 4116-4120) and examples of RPI motif II are:
Ludwig & Sproat (WO 98/58058). RPI motif III is a novel ribozyme motif recently developed by the applicant and examples of this motif were tested herein.

【０１４１】 １０％ウシ胎児血清，Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）およびペニシリン／ストレプ
トマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で
ＯＳＴ７細胞を維持した。トランスフェクションのためには，ＯＳＴ７細胞を黒
壁９６ウエルプレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に１２，５
００細胞／ウエルの密度で播種し，５％ＣＯ2下で３７℃で２４時間インキュベ
ートした。標的レポーターＨＣＶＴ７Ｃ（０．８μｇ／ｍｌ），対照レポーター
ｐＲＬＳＶ４０（１．２μｇ／ｍｌ）およびリボザイム（５０−２００ｎＭ）
のコトランスフェクションは，以下の方法により行った：ＨＣＶＴ７Ｃ（４μｇ
／ｍｌ，ｐＲＬＳＶ４０（６μｇ／ｍｌ），リボザイム（２５０−１０００ｎＭ
）およびカチオン性脂質（２８．５μｇ／ｍｌ）の５Ｘ混合物を，１５０μｌの
血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中に作成した。５％Ｃ
Ｏ2下で３７℃で２０分間，レポーター／リボザイム／脂質複合体を形成させた
。ＯＳＴ７細胞から培地を吸引し，１２０μｌの血清を含まないＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で置き換え，直ちに３０μｌの５Ｘレポーター／リボ
ザイム／脂質複合体を加えた。細胞を，複合体とともに，３７℃で５％ＣＯ2下
で４時間インキュベートした。ルシフェラーゼアッセイは，実施例７に記載のよ
うに行った。データは表ＩＸにまとめ，各モチーフの結果をその対照とともに記
載した。すべてのリボザイムモチーフは，いかなるＨＣＶをも標的としないリボ
ザイム（無関係対照）と比較して，細胞により生成されるＨＣＶの量を減少させ
ることができた。OST7 cells were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO BRL) supplemented with 10% fetal calf serum, L-glutamine (2 mM) and penicillin / streptomycin. For transfection, OST7 cells were transferred to black wall 96-well plates (Packard Instruments) for 12.5
Cells were seeded at a density of 00 cells / well and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours. Target reporter HCVT7C (0.8 μg / ml), control reporter pRLSV40 (1.2 μg / ml) and ribozyme (50-200 nM)
Was cotransfected by the following method: HCVT7C (4 μg)
/ Ml, pRLSV40 (6 μg / ml), ribozyme (250-1000 nM
) And cationic lipids (28.5 μg / ml) were made in 150 μl of serum-free OPTI-MEM (GIBCO BRL). 5% C
The reporter / ribozyme / lipid complex was allowed to form at 37 ° C. for 20 minutes under O 2 . The medium is aspirated from the OST7 cells and 120 μl of OPTI-ME without serum
M (GIBCO BRL) and immediately added 30 μl of 5X reporter / ribozyme / lipid complex. Cells were incubated with the conjugate for 4 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 . Luciferase assays were performed as described in Example 7. The data is summarized in Table IX and the results for each motif are listed along with its controls. All ribozyme motifs were able to reduce the amount of HCV produced by cells compared to ribozymes not targeting any HCV (irrelevant control).

【０１４２】培養細胞アッセイ 培養細胞におけるＨＣＶの複製についての報告はあるが（以下を参照），これ
らの系は，複製が困難であり，信頼性があるとは考えられていない。したがって
，インターフェロンおよびリバビリン等の他の抗ＨＣＶ療法の開発の場合と同様
に，動物実験で安全性が証明された後，臨床的実用性研究に直接進むことができ
る。 Cultured Cell Assays There have been reports of HCV replication in cultured cells (see below), but these systems are difficult to replicate and are not considered reliable. Thus, as with the development of other anti-HCV therapies, such as interferon and ribavirin, after safety has been demonstrated in animal studies, one can proceed directly to clinical utility studies.

【０１４３】 最近のいくつかの報告は，ヒト細胞株におけるＨＣＶのインビトロ成長を示し
ている（Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９６ ２２７（３）：８２２−８２６；Ｔａｇａｗ
ａ， ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５ １０（５）：５２３−５２７
；Ｃｒｉｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１０）：２４８５−２４９１；Ｓｅｉｐｐ ｅｔ ａｌ
．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７ ７
８（１０）２４６７−２４７８；Ｉａｃｏｖａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｅ
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ｃａｖａｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７ ２６（５）
１３２８−１３３７；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ，，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６ ７７（５）：１０４３−１０５４；Ｎａ
ｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９
９６ ７０（５）：３３２５−３３２９；Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６ ７０（１０）：７２１９−
７２２３；Ｖａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ １９９５ １４６
（４）：２８５−２８８；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．１９９５ ２０６（３）：８６３−８６９）。ＨＣ
Ｖの複製は，Ｔ細胞株およびＢ細胞株の両方，ならびにヒト肝細胞に由来する細
胞株において示されている。複製は，ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイまたはｂ−
ＤＮＡアッセイのいずれかを用いて証明された。ＨＣＶ細胞培養に関する最も最
近の刊行物が６ヶ月までの複製を証明していることに注目することが重要である
。Several recent reports have shown the in vitro growth of HCV in human cell lines (Mizutani et al., Biochem Biophys).
Res Commun 1996 227 (3): 822-826; Tagaw
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ral Virology 1996 77 (5): 1043-1054; Na
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hys Res Comm. 1995 206 (3): 863-869). HC
V replication has been demonstrated in both T and B cell lines, as well as cell lines derived from human hepatocytes. Replication is based on RT-PCR based assays or b-
Proven using any of the DNA assays. It is important to note that the most recent publications on HCV cell culture have demonstrated replication by up to 6 months.

【０１４４】 ＨＣＶに感染させることができる細胞株に加えて，いくつかのグループは，細
胞株を全長または部分的ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡクローンでトランスフォーメー
ションすることに成功したことを報告した（Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５ ７６（５）
１２１５−１２２１；Ｈａｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ １９９７ ４Ｓ（１）：６１−６７；Ｄ
ａｓｈ ｅｔ ａｌ，，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏ
ｌｏｇｙ １９９７ １５１（２）：３６３−３７３；Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９５ １０９（６）：１９３
３−４０；Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１９９５ ６９（１）：３２−３８）。In addition to cell lines capable of infecting HCV, several groups have reported successful transformation of cell lines with cDNA clones of the full or partial HCV genome (Harada et al.). , Jo
urnal of General Virology 1995 76 (5)
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3-40; Yoo et al. , Journal Of Virology
1995 69 (1): 32-38).

【０１４５】動物モデル ＨＣＶ感染について最もよく特性決定されている動物系はチンパンジーである
。さらに，チンパンジーおよびヒトにおいてＨＣＶ感染により引き起こされる慢
性肝炎は非常に類似している。臨床的には適切であるが，チンパンジーモデルは
いくつかの実用的な障害を有するため，このモデルの使用は困難である。例えば
，コストが高く，長期間のインキュベーションが必要であり，十分な量の動物が
得られないことである。これらの原因のため，多くのグループが，慢性Ｃ型肝炎
感染の齧歯類モデルの開発を試みてきた。直接感染は可能ではないが，いくつか
のグループは，ＨＣＶゲノムの一部または全部を齧歯類に安定的にトランスフェ
クションしたことを報告している（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａ
ｔｏｌｏｇｙ １９９５，２２（３）：８４７−８５５；Ｇａｌｕｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １９９
５ １７２（１）：２５−３０；Ｋｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５ ７６（１２）３０３１−
３０３８；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １
９９７ ２５（３）：７１９−７２７；Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉ
ｎｃｅｓｓ Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｓｙｍｐ １９９５ ２５：１４３−１４９
；Ｍａｒｉｙａ Ｋ，Ｙｏｔｓｕｙａｎａｇｉ Ｈ，Ｓｈｉｎｔａｎｉ Ｙ，Ｆ
ｕｊｉｅ Ｈ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｋ，Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｙ，Ｍｉｙａｍｕ
ｒａ Ｔ，Ｋｏｉｋｅ Ｋ．）。Ｃ型肝炎ウイルスコア蛋白質は，トランスジェ
ニックマウス中で肝臓脂肪症を誘導する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７ ７８（７）１５２７−１５３１；Ｔａｋｅｈ
ａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５ ２１（３）：７４６
−７５１；Ｋａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９７
２５（４）：１０１４−１０２１）。さらに，ＨＣＶ感染ヒト肝臓を免疫無防
備状態マウスに移植すると，動物の血液中でＨＣＶ ＲＮＡがより長く検出され
る。 Animal Models The best characterized animal system for HCV infection is the chimpanzee. Furthermore, chronic hepatitis caused by HCV infection in chimpanzees and humans is very similar. Although clinically appropriate, the chimpanzee model is difficult to use because it has some practical barriers. For example, it is expensive, requires long-term incubation, and does not provide a sufficient amount of animals. Because of these causes, many groups have attempted to develop rodent models of chronic hepatitis C infection. Although direct infection is not possible, several groups have reported stable transfection of some or all of the HCV genome into rodents (Yamamoto et al., Hepa.
strategy 1995, 22 (3): 847-855; Galun et a
l. , Journal of Infectious Disease 199
5 172 (1): 25-30; Koike et al. , Journal
of General Virology 1995 76 (12) 3031
3038; Pasquinelli et al. , Hepatology 1
997 25 (3): 719-727; Hayashi et al. , Pri
access Takamatsu Symp 1995 25: 143-149
Mariya K, Yotsuyanagi H, Shintani Y, F
ujie H, Ishibashi K, Matsuura Y, Miyamu
ra T, Koike K. ). Hepatitis C virus core protein induces hepatic steatosis in transgenic mice (Journal of Genera)
l Virology 1997 78 (7) 1527-1531; Takeh
ara et al. , Hepatology 1995 21 (3): 746.
-751; Kawamura et al. , Hepatology 1997
25 (4): 1014-1021). Furthermore, transplantation of HCV-infected human liver into immunocompromised mice results in longer detection of HCV RNA in the animal's blood.

【０１４６】診断用途 本発明のリボザイムは，診断道具として用いて，疾患細胞内の遺伝的浮動およ
び突然変異を試験するか，または細胞中におけるＨＣＶ ＲＮＡの存在を検出す
ることができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により
，分子の任意の領域において，標的ＲＮＡの塩基対形成および三次構造を変化さ
せる突然変異の検出が可能となる。本発明に記載される多重リボザイムを用いる
ことにより，ＲＮＡの構造，およびインビトロでのならびに細胞および組織にお
ける機能に重要なヌクレオチド変化を位置づけることができる。リボザイムによ
る標的ＲＮＡの切断を用いて，遺伝子発現を阻害し，疾患の進行における特定の
遺伝子産物の役割（本質的な）を特定することができる。このようにして，疾患
の重要な媒介物として他の遺伝的標的を特定することができる。このような実験
は，組み合わせ治療（例えば，異なる遺伝子を標的とする多重リボザイム，既知
の小分子阻害剤と結合させたリボザイム，またはリボザイムおよび／または他の
化学的もしくは生物学的分子の組合せによる断続的治療）の可能性を与えること
により，疾患進行のよりよい治療をもたらすであろう。本発明のリボザイムの他
のインビトロの用途は当該技術分野においてよく知られており，これにはＨＣＶ
に関連する状態に関連するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡ
は，リボザイムにより処理した後に，切断生成物の存在を標準的方法論を用いて
決定することにより検出することができる。 Diagnostic Use The ribozymes of the present invention can be used as diagnostic tools to test for genetic drift and mutation in diseased cells or to detect the presence of HCV RNA in cells. The close relationship between ribozyme activity and the structure of the target RNA allows for the detection of mutations that alter base pairing and tertiary structure of the target RNA in any region of the molecule. By using the multiple ribozymes described in the present invention, it is possible to map nucleotide changes that are important for RNA structure and function in vitro and in cells and tissues. Cleavage of target RNAs by ribozymes can be used to inhibit gene expression and identify the role (essentially) of particular gene products in disease progression. In this way, other genetic targets can be identified as important mediators of the disease. Such experiments may involve intermittent treatment with combination therapy (eg, multiple ribozymes targeting different genes, ribozymes conjugated to known small molecule inhibitors, or a combination of ribozymes and / or other chemical or biological molecules). And treatment of disease progression. Other in vitro uses of the ribozymes of the invention are well known in the art and include HCV
Detecting the presence of mRNA associated with a condition associated with. Such RNA
Can be detected after treatment with a ribozyme by determining the presence of cleavage products using standard methodology.

【０１４７】 特定の例においては，野生型または突然変異型の標的ＲＮＡのみを切断しうる
リボザイムをアッセイに用いる。第１のリボザイムを用いて試料中に存在する野
生型ＲＮＡを同定し，第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定す
る。反応対照として，野生型および変異型ＲＮＡの両方の合成基質を両方のリボ
ザイムで切断して，反応における相対的なリボザイム効率および”非標的”ＲＮ
Ａ種の切断がないことを示すことができる。合成基質からの切断生成物はまた，
試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを生成す
るためにも役立つ。すなわち，各分析は，２つのリボザイム，２つの基質および
１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応とする。切断生
成物の存在は，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントがポリアクリルアミド
ゲルの１つのレーンで分析することができるように，ＲＮＡｓｅ保護アッセイを
用いて決定される。変異ＲＮＡの発現および標的細胞における所望の発現型の変
化の推定リスクを見抜くためには，結果を定量することは必ずしも必要ではない
。その蛋白質生成物が発現型（すなわちＨＣＶ）の発生に関与していると考えら
れるｍＲＮＡが発現していることは，リスクの確立に適当である。匹敵する特異
的活性を有するプローブを両方の転写産物について用いれば，ＲＮＡレベルの定
性的比較が適当であり，初期診断のコストを下げるであろう。ＲＮＡレベルを定
性的に比較しようと定量的に比較しようと，野生型に対する変異型の比率がより
高いことは，よりリスクが高いことと相関しているであろう。In certain instances, ribozymes capable of cleaving only wild-type or mutated target RNA are used in the assays. The first ribozyme is used to identify wild-type RNA present in the sample, and the second ribozyme is used to identify mutant RNA in the sample. As a reaction control, both wild-type and mutant RNA synthetic substrates were cleaved with both ribozymes to determine the relative ribozyme efficiency in the reaction and the "non-target" RN
It can be shown that there is no type A cleavage. The cleavage product from the synthetic substrate also
It also serves to generate size markers for the analysis of wild-type and mutant RNA in a sample population. That is, each analysis requires two ribozymes, two substrates, and one unknown sample, which are combined into six reactions. The presence of cleavage products is determined using an RNAse protection assay so that the full length and cleavage fragments of each RNA can be analyzed in one lane of a polyacrylamide gel. It is not necessary to quantify the result in order to see the expression of the mutant RNA and the estimated risk of a desired phenotypic change in the target cell. The expression of mRNA whose protein product is thought to be involved in the development of the phenotype (ie, HCV) is suitable for establishing a risk. Using a probe with comparable specific activity for both transcripts, a qualitative comparison of RNA levels would be appropriate and would reduce the cost of initial diagnosis. Whether qualitatively or quantitatively comparing RNA levels, a higher ratio of mutant to wild type will correlate with higher risk.

【０１４８】追加の用途 本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌク
レアーゼがＤＮＡの研究に対して有していたものと同じ用途の多くを，ＲＮＡの
研究に対しても有するであろう（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限酵素フラグメン
トのパターンを用いて，２つの関連するＲＮＡの配列の関係を確立し，大きいＲ
ＮＡをより研究に有用なフラグメントに特異的に切断することができる。リボザ
イムの配列特異性を遺伝子工学的に処理することが可能であることは，未知の配
列のＲＮＡの切断に理想的である。 Additional Uses The potential utility of the sequence-specific enzymatic nucleic acid molecules of the present invention is that many of the same uses that DNA restriction endonucleases have for DNA studies have been made for RNA studies. (Nathans et al., 1975 A
nn. Rev .. Biochem. 44: 273). For example, using the pattern of restriction fragments to establish the relationship between the sequences of two related RNAs,
NA can be specifically cleaved into fragments that are more useful for research. The ability to engineer the sequence specificity of a ribozyme is ideal for cleaving RNA of unknown sequence.

【０１４９】 他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。[0149] Other embodiments are within the following claims.

【０１５０】表１ 天然に存在するリボザイムの特徴グループＩイントロン ・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび
５’グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子
をさらに必要とする。 ・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ
ラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他
において，介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によ
ってほぼ確立されている［１，２］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３
，４，５，６］。 ・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，
９］。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。 ・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮ
Ａ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩ
イントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラク
シダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて
いる［１２］。ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ） ・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。 ・反応メカニズム：恐らくはＭ2+−ＯＨによって攻撃し，３’−ＯＨおよび５’
リン酸を有する切断産物を生成する。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサ
ブユニットは，細菌，酵母，げっ歯類および霊長類から配列決定されている。 ・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，
内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。 ・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。グループＩＩイントロン ・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ，および３’−５
’および２’−５’分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有す
る切断産物を生成する。 ・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，
２１］唯一の天然リボザイムである。 ・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。 ・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。 ・力学的フレームワークは検討中である［２４］。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’，３’
−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ
に見出されている。ハンマーヘッド・リボザイム （本文を参照のこと） ・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。 ・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの
植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。 ・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２
６，２７］ ・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性
が実証された。［２８］ ・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立
されている。［２９］ ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］ヘアピンリボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド。 ・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３’側で可変数のヌ
クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植
物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルス
およびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。 ・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン
ビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３
６］。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。 ・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５
’側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を
含む［４０］。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し，２’
，３’−サイクリックリン酸および５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する
。 ・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。 ・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４１］。 1. Michel, Francois; Westhof, Eric. Slippery substrates. Nat. Struct. Bi
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II introns. Annu. Rev. Biochem. (1995), 64, 435-61. 23. Abramovitz, Dana L.; Friedman, Richard A.; Pyle, Anna Marie. Catalyt
ic role of 2'-hydroxyl groups within a group II intron active site. Scie
nce (Washington, D. C.) (1996), 271(5254), 1410-13. 24. Daniels, Danette L.; Michels, William J., Jr.; Pyle, Anna Marie. Two
competing pathways for self-splicing by group II introns: a quantitativ
e analysis of in vitro reaction rates and products. J. Mol. Biol. (1996)
, 256(1), 31-49. 25. Guo, Hans C. T.; Collins, Richard A.. Efficient trans-cleavage of a
stem-loop RNA substrate by a ribozyme derived from Neurospora VS RNA. EM
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NA hammerhead ribozyme:Aproposed mechanism for RNA catalytic cleavage. C
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es. US Patent No. 5,633,133. 29. Hertel, K.J., Herschlag, D., Uhlenbeck, O. A kinetic and thermodynam
ic framework for the hammerhead ribozyme reaction. Biochemistry, (1994)
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d ribozymes. J. Biol. Chem., (1995) 270, 25702-25708. 30. Beigelman, L., et al., Chemical modifications of hammerhead ribozyme
s. J. Biol. Chem., (1995) 270, 25702-25708. 31. Hampel, Arnold; Tritz, Richard; Hicks, Margaret; Cruz, Phillip. 'Hai
rpin' catalytic RNA model: evidence for helixes and sequence requiremen
t for substrate RNA. Nucleic Acids Res. (1990), 18(2), 299-304. 32. Chowrira, Bharat M.; Berzal-Herranz, Alfredo; Burke, John M.. Novel
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ary structure elements of the hairpin ribozyme. EMBO J. (1993), 12(6), 2
567-73. 34. Joseph, Simpson; Berzal-Herranz, Alfredo; Chowrira, Bharat M.; Butch
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ined by in vitro selection, mutation, and analysis of mismatched substra
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election of active hairpin ribozymes by sequential RNA-catalyzed cleavag
e and ligation reactions. Genes Dev. (1992), 6(1), 129-34. 36. Hegg, Lisa A.; Fedor, Martha J.. Kinetics and Thermodynamics of Inte
rmolecular Catalysis by Hairpin Ribozymes. Biochemistry (1995), 34(48),
15813-28. 37. Grasby, Jane A.; Mersmann, Karin; Singh, Mohinder; Gait, Michael J..
Purine Functional Groups in Essential Residues of the Hairpin Ribozyme
Required for Catalytic Cleavage of RNA. Biochemistry (1995), 34(12), 406
8-76. 38. Schmidt, Sabine; Beigelman, Leonid; Karpeisky, Alexander; Usman, Nas
sim; Sorensen, Ulrik S.; Gait, Michael J.. Base and sugar requirements f
or RNA cleavage of essential nucleoside residues in internal loop B of t
he hairpin ribozyme: implications for secondary structure. Nucleic Acids
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s by a ribozyme derived from the hepatitis .delta. virus RNA sequence. B
iochemistry (1992), 31(1), 16-21. 40. Perrotta, Anne T.; Been, Michael D.. A pseudoknot-like structure req
uired for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA. Nature (
London) (1991), 350(6317), 434-6. 41. Puttaraju, M.; Perrotta, Anne T.; Been, Michael D.. A circular trans
-acting hepatitis delta virus ribozyme. Nucleic Acids Res. (1993), 21(18
), 4253-8. Table 1 Characteristics of naturally occurring ribozymes Group I Intron size: about 150-1000 or more nucleotides. -Requires U adjacent 5 'to cleavage site in target sequence. • Binds 4-6 nucleotides 5 'to the cleavage site. -Reaction mechanism: attack by the 3'-OH of guanosine to generate a cleavage product with 3'-OH and 5 'guanosine. • Optionally requires additional protein cofactors to help fold and maintain the active structure. -More than 300 types are known for this class. It has been found as an intervening sequence in Tetrahymena thermophila rRNA, fungal mitochondria, chloroplasts, phage T4, cyanobacteria, and others. Key structural features have been largely established by phylogenetic comparisons, mutagenicity and biochemical studies [1, 2]. A complete dynamic framework has been established for one ribozyme [3
, 4,5,6].・ Research on ribozyme folding and substrate docking is ongoing [7,8,
9]. • Chemical modification studies of important residues are well established [10, 11].・ Since this ribozyme has a small binding site (4 to 6 nucleotides), target RN
Can be very non-specific for A-cleavage, but group I of Tetrahymena
Introns have been used to repair the "defective" β-galactosidase message by attaching a new β-galactosidase sequence to the message [12]. RNase P RNA (M1 RNA) size: about 290-400 nucleotides. -The ubiquitous ribonucleoprotein enzyme RNA portion. Cleavage the tRNA precursor to form the mature tRNA [13]. Reaction mechanism: attacked by M 2+ -OH, probably 3'-OH and 5 '
Produces a cleavage product with phosphate. • RNaseP is found throughout prokaryotes and eukaryotes. This RNA subunit has been sequenced from bacteria, yeast, rodents and primates.・ By hybridization of external guide sequence (EGS) and target RNA,
Endogenous RNaseP can be exploited for therapeutic applications [14, 15]. -The importance of contact between phosphoric acid and 2'OH has recently been found [16,17]. Group II intron size: 1000 or more nucleotides. -It has recently been demonstrated to be trans-cleavage of the target RNA [18, 19]. -Sequence requirements have not been completely determined. Reaction mechanism: 2'-OH of internal adenosine is 3'-OH and 3'-5
It produces a cleavage product with a "lariat" RNA containing the 'and 2'-5' branch points. Involvement in DNA cleavage in addition to RNA cleavage and binding has been demonstrated [20,
21] The only natural ribozyme. • Major structural features have been almost established by phylogenetic comparisons [22]. -The importance of 2'OH contact has begun to emerge [23]. -A mechanical framework is under consideration [24]. Neurospora VS RNA size: about 144 nucleotides. -It has recently been demonstrated to be trans-cleavage of the hairpin target RNA [25]. -Sequence requirements have not been completely determined.・ Reaction mechanism: 2'-OH attacks the 5 'side of the bond which is easily broken, and 2', 3 '
-Generates cleavage products with cyclic phosphate and 5'-OH termini. -Binding site and structural requirements have not been fully determined. -Only one class is known. Neurospora VS RNA
Is found in Hammerhead ribozyme (see text) Size: about 13-40 nucleotides. -Requires a target sequence UH 5 'adjacent to the cleavage site. -Binds a variable number of nucleotides on both sides of the cleavage site.・ Reaction mechanism: 2'-OH attacks the 5 'side of the bond which is easily broken, and 2'
, 3′-cyclic phosphate and a cleavage product with a 5′-OH end. -There are 14 known species in this class. It has been found in many plant pathogens (Wilsoid) that utilize RNA as an infectious agent. -The essential structural features, including the two crystal structures, have been almost clarified. [2
6,27] • Negligible ligation activity was demonstrated (vs. engineering by in vitro selection). [28] A complete mechanical framework has been established for two or more ribozymes. [29]-Chemical modification studies of important residues are well established. [30] Hairpin ribozyme size: about 50 nucleotides. -Requires a target sequence GUC 3 'adjacent to the cleavage site. • Binds 4-6 nucleotides 5 'to the cleavage site and a variable number of nucleotides 3' to the cleavage site.・ Reaction mechanism: 2'-OH attacks the 5 'side of the bond which is easily broken, and 2'
, 3′-cyclic phosphate and a cleavage product with a 5′-OH end.・ Three types are known in this class. It has been found in three plant pathogens that utilize RNA as infectious agents (tobacco ring spot virus, Arabis mosaic virus and satellite RNA of chicory yellow spot virus). -The essential structural features have been largely clarified [31, 32, 33, 34]. -Due to the ligation activity (in addition to the cleavage activity), this ribozyme can be engineered by in vitro selection [35]. A complete mechanical framework has been established for one ribozyme [3
6]. -Consideration of chemical modification of important residues has been started [37, 38]. Delta hepatitis virus (HDV) ribozyme size: about 60 nucleotides. -It has been demonstrated to be trans-cleavage of the target RNA [39]. The binding site and structural requirements are not completely determined, but the 5
The 'side array is not required. The folded ribozyme contains a pseudoknot structure [40].・ Reaction mechanism: 2'-OH attacks the 5 'side of the bond which is easily broken, and 2'
, 3′-cyclic phosphate and a cleavage product with a 5′-OH end.・ There are only two known classes. Found in human HDV. • Cyclic HDV is active and has increased nuclease stability [41]. 1. Michel, Francois; Westhof, Eric. Slippery substrates. Nat. Struct. Bi
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-acting hepatitis delta virus ribozyme.Nucleic Acids Res. (1993), 21 (18
), 4253-8.

【表１】 [Table 1]

【表２】 [Table 2]

【表３】 [Table 3]

【表４】 [Table 4]

【表５】 [Table 5]

【表６】 [Table 6]

【表７】 [Table 7]

【表８】 [Table 8]

【表９】 [Table 9]

【表１０】 [Table 10]

【表１１】 [Table 11]

【表１２】 [Table 12]

【表１３】 [Table 13]

【表１４】 [Table 14]

【表１５】 [Table 15]

【表１６】 [Table 16]

【表１７】 [Table 17]

【表１８】 [Table 18]

【表１９】 [Table 19]

【表２０】 [Table 20]

【表２１】 [Table 21]

【表２２】 [Table 22]

【表２３】 [Table 23]

【表２４】 [Table 24]

【表２５】 [Table 25]

【表２６】 [Table 26]

【表２７】 [Table 27]

【表２８】 [Table 28]

【表２９】 [Table 29]

【表３０】 [Table 30]

【表３１】 [Table 31]

【表３２】 [Table 32]

【表３３】 [Table 33]

【表３４】 [Table 34]

【表３５】 [Table 35]

【表３６】 [Table 36]

【表３７】 [Table 37]

【表３８】 [Table 38]

【表３９】 [Table 39]

【表４０】 [Table 40]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを
示す。FIG. 1 shows secondary structure models of seven different types of enzymatic nucleic acid molecules.

【図２】 図２は，保存５'ＨＣＶ ＵＴＲ領域中の種々の部位を標的とす
るリボザイムがいくつかの遺伝子型から生じた転写産物を切断する能力を示すグ
ラフである。FIG. 2 is a graph showing the ability of ribozymes targeting various sites in the conserved 5 ′ HCV UTR region to cleave transcripts generated from several genotypes.

【図３】 図３は，培養細胞におけるルシフェラーゼ活性のリボザイム媒介
性低下を示すために用いられたデュアルレポーターシステムの概略図である。FIG. 3 is a schematic of a dual reporter system used to demonstrate ribozyme-mediated reduction of luciferase activity in cultured cells.

【図４】 図４は，リボザイムがＯＳＴ−７細胞においてルシフェラーゼ活
性を低下させる能力を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the ability of ribozymes to reduce luciferase activity in OST-7 cells.

【図５】 図５は，ＯＳＴ−７細胞において，部位ＨＣＶ．５−３１３およ
びＨＣＶ．５−３１８を標的とするリボザイムが，その不活性対照と比較して，
ルシフェラーゼ活性を低下させる能力を示すグラフである。FIG. 5 shows that in OST-7 cells, the site HCV. 5-313 and HCV. The ribozyme targeting 5-318 is compared to its inactive control,
4 is a graph showing the ability to reduce luciferase activity.

【図６】 図６Ａは，ＨＣＶ−ポリオウイルス（ＰＶ）複製に及ぼすリボザ
イム処理の影響を示す棒グラフである。図６Ｂは，野生型ＰＶの複製に及ぼすリ
ボザイム処理の影響を示す棒グラフである。FIG. 6A is a bar graph showing the effect of ribozyme treatment on HCV-poliovirus (PV) replication. FIG. 6B is a bar graph showing the effect of ribozyme treatment on wild-type PV replication.

【図７】 図７は，ＨＣＶ ＲＮＡを標的とする．種々のハンマーヘッドリ
ボザイム構築物の概略図である。FIG. 7 targets HCV RNA. FIG. 1 is a schematic of various hammerhead ribozyme constructs.

【図８】 図８は，１回のＨＣＶ−ＰＶ感染に及ぼす部位１８３リボザイム
処理の影響を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the effect of site 183 ribozyme treatment on one HCV-PV infection.

【図９】 図９は，本明細書に記載される３つのリボザイムモチーフの二次
構造モデルを示す。FIG. 9 shows a secondary structure model of the three ribozyme motifs described herein.

【図１０】 図１０は，インターフェロンと組み合わせた抗ＨＣＶリボザイ
ムの活性を示す。結果は，ｐｆｕ／ｍｌで，二重の試料の中央値＋範囲で示され
る。ＢＡＣ，結合弱化対照分子；ＩＦ，インターフェロン；Ｒｚ，ＨＣＶ部位１
８３を標的とするハンマーヘッドリボザイム；ｐｆｕ，プラーク形成単位。FIG. 10 shows the activity of anti-HCV ribozyme in combination with interferon. Results are given in pfu / ml, median of duplicate samples + range. BAC, binding weakened control molecule; IF, interferon; Rz, HCV site 1
Hammerhead ribozyme targeting 83; pfu, plaque forming unit.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０９／２５７，６０８ (32)優先日 平成11年２月25日(1999．2．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／２７４，５５３ (32)優先日 平成11年３月23日(1999．3．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ロバーツ，エリザベス アメリカ合衆国コロラド州80221，フェデ ラル・ハイツ，エリオット・サークル 10025 (72)発明者 パヴコ，パメラ・エイ アメリカ合衆国コロラド州80026，ラファ イエット，バーバリー・サークル705 (72)発明者 マセジャック，デニス アメリカ合衆国コロラド州80004，アルヴ ァダ，ユニオン・ストリート6595 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 CA11 DA03 HA08 4B050 CC10 DD01 LL01 4C084 AA02 AA13 BA44 CA01 CA18 DA21 NA14 ZA751 ZB022 ZB261 ZB331 ZC752 4C086 AA01 EA16 NA14 ZA75 ZB02 ZB26 ZB33 ZC75 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (31) Priority claim number 09 / 257,608 (32) Priority date February 25, 1999 (Feb. 25, 1999) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 09 / 274,553 (32) Priority date March 23, 1999 ( (33 Mar. 1999) (33) Countries claiming priority US (US) (81) Designated States EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT , LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM) , KE, LS, MW , SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Roberts, Elizabeth 80221, Fed., Colorado, United States of America Lal Heights, Elliott Circle 10025 (72) Inventor Pav , Pamela A, 80026, Lafayette, Colorado, United States, Burberry Circle 705 (72) Inventor Macejac, Dennis, 80004, Colorado, United States, Alvada, Union Street 6595 F-term (reference) 4B024 AA01 BA80 CA01 CA11 DA03 HA08 4B050 CC10 DD01 LL01 4C084 AA02 AA13 BA44 CA01 CA18 DA21 NA14 ZA751 ZB022 ZB261 ZB331 ZC752 4C086 AA01 EA16 NA14 ZA75 ZB02 ZB26 ZB33 ZC75

Claims (50)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来するＲＮＡを特異的に切
断する酵素的核酸分子であって，前記酵素的核酸分子はハンマーヘッドモチーフ
のものであり，前記酵素的核酸分子の結合アームは，表ＩＶ−ＶＩおよびＶＩＩ
Ｉに規定されるいずれかの基質配列に相補的な配列を含むことを特徴とする酵素
的核酸分子。1. An enzymatic nucleic acid molecule that specifically cleaves RNA derived from hepatitis C virus (HCV), wherein the enzymatic nucleic acid molecule has a hammerhead motif, and The binding arms are listed in Tables IV-VI and VII.
An enzymatic nucleic acid molecule comprising a sequence complementary to any of the substrate sequences defined in I. 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来するＲＮＡを特異的に切
断する酵素的核酸分子であって，前記酵素的核酸分子はヘアピンモチーフのもの
であり，前記酵素的核酸分子の結合アームは，表ＶＩＩに規定されるいずれかの
基質配列に相補的な配列を含むことを特徴とする酵素的核酸分子。2. An enzymatic nucleic acid molecule that specifically cleaves RNA derived from hepatitis C virus (HCV), wherein the enzymatic nucleic acid molecule is of a hairpin motif and the binding of the enzymatic nucleic acid molecule is performed. An enzymatic nucleic acid molecule, wherein the arm comprises a sequence complementary to any of the substrate sequences defined in Table VII. 【請求項３】 前記酵素的核酸分子が，２塩基対以上の長さのステムＩＩ領
域を含む，請求項１記載の酵素的核酸分子。3. The enzymatic nucleic acid molecule of claim 1, wherein said enzymatic nucleic acid molecule comprises a stem II region that is at least 2 base pairs in length. 【請求項４】 前記核酸が，前記ＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む
，請求項１または２記載の酵素的核酸分子。4. The enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1, wherein said nucleic acid comprises 12-100 bases complementary to said RNA. 【請求項５】 前記核酸が前記ｍＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む，
請求項１または２記載の酵素的核酸分子。5. The nucleic acid comprises 14 to 24 bases complementary to the mRNA.
An enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1 or 2. 【請求項６】 前記酵素的核酸分子が，３−７塩基対の長さのステムＩＩ領
域を含む，請求項２記載の酵素的核酸。6. The enzymatic nucleic acid of claim 2, wherein said enzymatic nucleic acid molecule comprises a stem II region 3-7 base pairs in length. 【請求項７】 前記酵素的核酸分子が，本質的に表ＶＩＩに規定されるいず
れかのリボザイム配列からなる，請求項２記載の酵素的核酸。7. The enzymatic nucleic acid of claim 2, wherein said enzymatic nucleic acid molecule consists essentially of any of the ribozyme sequences defined in Table VII. 【請求項８】 前記酵素的核酸分子が本質的に表ＩＶ−ＶＩおよびＶＩＩＩ
に規定されるいずれかのリボザイム配列からなる，請求項１記載の酵素的核酸分
子。8. The method according to claim 8, wherein said enzymatic nucleic acid molecule is substantially as defined in Tables IV-VI and VIII.
2. The enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1, consisting of any of the ribozyme sequences defined in (1). 【請求項９】 請求項１または２に記載の酵素的核酸分子を含む医薬組成物
。9. A pharmaceutical composition comprising the enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1 or 2. 【請求項１０】 請求項１または２に記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物
細胞。10. A mammalian cell comprising the enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1 or 2. 【請求項１１】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１０記載の哺
乳動物細胞。11. The mammalian cell according to claim 10, wherein said mammalian cell is a human cell. 【請求項１２】 請求項１または２に記載の少なくとも１つの酵素的核酸分
子をコードする核酸配列を，該酵素的核酸分子の発現を可能とする様式で含む発
現ベクター。12. An expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding at least one enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 in a manner enabling the expression of said enzymatic nucleic acid molecule. 【請求項１３】 請求項１２記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。13. A mammalian cell comprising the expression vector according to claim 12. 【請求項１４】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項１３記載の哺
乳動物細胞。14. The mammalian cell according to claim 13, wherein said mammalian cell is a human cell. 【請求項１５】 肝硬変，肝不全または肝細胞癌を治療する方法であって，
患者に請求項１または２に記載の酵素的核酸分子を前記治療に適当な条件下で投
与する工程を含む方法。15. A method for treating cirrhosis, hepatic failure or hepatocellular carcinoma, comprising:
A method comprising administering to a patient the enzymatic nucleic acid molecule of claim 1 or 2 under conditions suitable for said treatment. 【請求項１６】 肝硬変，肝不全および／または肝細胞癌を治療する方法で
あって，患者に請求項１または２に記載の発現ベクターを前記治療に適当な条件
下で投与する工程を含む方法。16. A method for treating cirrhosis, hepatic failure and / or hepatocellular carcinoma, comprising administering to a patient the expression vector according to claim 1 or 2 under conditions suitable for the treatment. . 【請求項１７】 ＨＣＶ感染に関連する状態を有する患者を治療する方法で
あって，前記患者の細胞を請求項１または２に記載の核酸分子と接触させること
を含み，および１またはそれ以上の薬剤療法を前記治療に適当な条件下で使用す
ることをさらに含む方法。17. A method of treating a patient having a condition associated with an HCV infection, comprising contacting cells of said patient with a nucleic acid molecule of claim 1 or 2, and one or more of the following: A method further comprising using drug therapy under conditions suitable for said treatment. 【請求項１８】 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み，お
よび前記核酸が５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエ
ート結合を含み，および前記核酸が前記核酸の４位に２'−Ｃ−アリル修飾を含
み，および核酸が少なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル修飾を含み，および前記
核酸が３'−末端修飾を含む，請求項１記載の酵素的核酸分子。18. The nucleic acid molecule comprises at least five ribose residues, and the nucleic acid comprises a phosphorothioate linkage at at least three of the 5 'terminal nucleotides, and the nucleic acid comprises a 2'-C at position 4 of the nucleic acid. 2. The enzymatic nucleic acid molecule of claim 1 comprising an allyl modification, and wherein the nucleic acid comprises at least 10 2'-O-methyl modifications, and wherein the nucleic acid comprises a 3'-terminal modification. 【請求項１９】 前記核酸が，前記３’末端において３'−３'結合反転脱塩
基成分を含む，請求項１８記載の酵素的核酸。19. The enzymatic nucleic acid of claim 18, wherein said nucleic acid comprises a 3'-3 'linked inverted abasic component at said 3' end. 【請求項２０】 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み，お
よび前記核酸分子が５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチ
オエート結合を含み，および前記核酸が前記核酸分子の４位および／または７位
において２'−アミノ修飾を含み，前記核酸分子が少なくとも１０個の２'−Ｏ−
メチル修飾を含み，および前記核酸が３'−末端修飾を含む，請求項１記載の酵
素的核酸分子。20. The nucleic acid molecule comprises at least five ribose residues, and the nucleic acid molecule comprises a phosphorothioate linkage at at least three of the 5 'terminal nucleotides, and the nucleic acid is at position 4 and / or A 2'-amino modification at position 7 wherein said nucleic acid molecule comprises at least 10 2'-O-
2. The enzymatic nucleic acid molecule of claim 1, comprising a methyl modification, and wherein said nucleic acid comprises a 3'-terminal modification. 【請求項２１】 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み，お
よび前記核酸分子が５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチ
オエート結合を含み，および前記核酸分子が前記核酸分子の４位および／または
７位において脱塩基置換を含み，および前記核酸が少なくとも１０個の２'−Ｏ
−メチル修飾を含み，および前記核酸分子が３’−末端修飾を含む，請求項１記
載の酵素的核酸分子。21. The nucleic acid molecule comprises at least five ribose residues, and the nucleic acid molecule comprises a phosphorothioate linkage in at least three of the 5 'terminal nucleotides, and the nucleic acid molecule is at position 4 and / or Or comprises an abasic substitution at position 7 and said nucleic acid has at least 10 2'-O
2. The enzymatic nucleic acid molecule of claim 1 comprising a -methyl modification and wherein said nucleic acid molecule comprises a 3'-terminal modification. 【請求項２２】 前記核酸分子が少なくとも５つのリボース残基を含み，お
よび前記核酸が５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエ
ート結合を含み，および前記核酸分子が前記核酸分子の４位および／または７位
において６−メチルウリジン置換を含み，および前記核酸分子が少なくとも１０
個の２'−Ｏ−メチル修飾を含み，および前記核酸分子が３'末端修飾を含む，請
求項１記載の酵素的核酸分子。22. The nucleic acid molecule comprises at least five ribose residues, and the nucleic acid comprises a phosphorothioate linkage at at least three of the 5 ′ terminal nucleotides, and the nucleic acid molecule is at position 4 and / or A 6-methyluridine substitution at position 7 and said nucleic acid molecule is at least 10
2. The enzymatic nucleic acid molecule of claim 1, comprising two 2'-O-methyl modifications, and wherein said nucleic acid molecule comprises a 3 'terminal modification. 【請求項２３】 哺乳動物細胞においてＨＣＶ複製を阻害する方法であって
，前記細胞に請求項１または２に記載の酵素的核酸分子を前記阻害に適当な条件
下で投与する工程を含む方法。23. A method of inhibiting HCV replication in a mammalian cell, comprising the step of administering to said cell the enzymatic nucleic acid molecule of claim 1 or 2 under conditions suitable for said inhibition. 【請求項２４】 別のＲＮＡ分子を切断する方法であって，請求項１または
２に記載の酵素的核酸分子を，前記別のＲＮＡ分子の切断に適当な条件下で，前
記別のＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。24. A method for cleaving another RNA molecule, wherein the enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 is treated under conditions suitable for cleaving said another RNA molecule. Contacting with a method. 【請求項２５】 前記切断が二価カチオンの存在下で実施される，請求項２
４記載の方法。25. The method according to claim 2, wherein the cleavage is performed in the presence of a divalent cation.
4. The method according to 4. 【請求項２６】 前記二価カチオンがＭｇ2+である，請求項２５記載の方法
。26. The method of claim 25, wherein said divalent cation is Mg 2+ . 【請求項２７】 前記核酸が化学的に合成されたものである，請求項１また
は２記載の核酸分子。27. The nucleic acid molecule according to claim 1, wherein the nucleic acid is chemically synthesized. 【請求項２８】 前記ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み， 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている，請求項１２
記載の発現ベクター。28. The vector comprises: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region; c) a gene encoding at least one of the nucleic acid molecules, wherein the gene directs expression and / or transport of the nucleic acid molecule. 13. The operatively connected to the start region and the end region in a manner that allows.
The expression vector according to any one of the preceding claims. 【請求項２９】 前記ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）オープンリーディングフレーム； ｄ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み， 前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可能なよ
うに連結されており；および 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能
なように連結されている，請求項１２記載の発現ベクター。29. The vector, comprising: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region; c) an open reading frame; d) a gene encoding at least one of the nucleic acid molecules; And the gene is operably linked to the start region, the open reading frame and the termination region in a manner that allows expression and / or transport of the nucleic acid molecule. 13. The expression vector according to claim 12, operably linked. 【請求項３０】 前記ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）イントロン； ｄ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子； を含み， 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されて
いる，請求項１２記載の発現ベクター。30. The vector comprises: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region; c) an intron; d) a gene encoding at least one of the nucleic acid molecules; 13. The expression vector of claim 12, operably linked to said start region, said intron and said termination region in a manner that allows for and / or transport. 【請求項３１】 前記ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）イントロン； ｄ）オープンリーディングフレーム； ｅ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み， 前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なよ
うに連結されており；および 前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前
記開始領域，前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終
止領域に動作可能なように連結されている，請求項１２記載の発現ベクター。31. The vector comprises: a) a transcription initiation region; b) a transcription termination region; c) an intron; d) an open reading frame; e) a gene encoding at least one of the nucleic acid molecules; Operably linked to the 3'-end of the open reading frame; and wherein the gene is capable of expressing and / or transporting the nucleic acid molecule, wherein the initiation region, the intron, the open 13. The expression vector of claim 12, operably linked to a reading frame and said termination region. 【請求項３２】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来するＲＮＡを特異的に
切断する酵素的核酸分子であって，前記酵素的核酸分子がＤＮＡ酵素であること
を特徴とする，酵素的核酸分子。32. An enzymatic nucleic acid molecule that specifically cleaves RNA derived from hepatitis C virus (HCV), wherein the enzymatic nucleic acid molecule is a DNA enzyme. . 【請求項３３】 前記酵素的核酸が少なくとも１つの２'−糖修飾を含む，
請求項１，２または３２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。33. The enzymatic nucleic acid comprises at least one 2'-sugar modification.
An enzymatic nucleic acid molecule according to any of claims 1, 2 or 32. 【請求項３４】 前記酵素的核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，
請求項１，２または３２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。34. The enzymatic nucleic acid comprises at least one nucleobase modification.
An enzymatic nucleic acid molecule according to any of claims 1, 2 or 32. 【請求項３５】 前記酵素的核酸が少なくとも１つのホスホロチオエート修
飾を含む，請求項１，２または３２のいずれかに記載の酵素的核酸分子。35. The enzymatic nucleic acid molecule according to claim 1, wherein the enzymatic nucleic acid comprises at least one phosphorothioate modification. 【請求項３６】 前記薬剤療法がタイプＩインターフェロンである，請求項
１７記載の方法。36. The method of claim 17, wherein said drug therapy is a type I interferon. 【請求項３７】 前記タイプＩインターフェロンおよび酵素的核酸分子が同
時に投与される，請求項３６記載の方法。37. The method of claim 36, wherein said type I interferon and said enzymatic nucleic acid molecule are administered simultaneously. 【請求項３８】 前記タイプＩインターフェロンおよび酵素的核酸分子が別
々に投与される，請求項３６記載の方法。38. The method of claim 36, wherein said type I interferon and said enzymatic nucleic acid molecule are administered separately. 【請求項３９】 前記タイプＩインターフェロンがインターフェロンアルフ
ァである，請求項３６記載の方法。39. The method of claim 36, wherein said type I interferon is interferon alpha. 【請求項４０】 前記タイプＩインターフェロンがインターフェロンベータ
である，請求項３６記載の方法。40. The method of claim 36, wherein said type I interferon is interferon beta. 【請求項４１】 前記タイプＩインターフェロンがインターフェロンガンマ
である，請求項３６記載の方法。41. The method of claim 36, wherein said type I interferon is interferon gamma. 【請求項４２】 前記タイプＩインターフェロンがコンセンサスインターフ
ェロンである，請求項３６記載の方法。42. The method of claim 36, wherein said type I interferon is a consensus interferon. 【請求項４３】 ＨＣＶ感染に関連する状態を有する患者を治療する方法で
あって，前記患者の細胞を請求項３２記載の核酸分子と接触させることを含み，
および前記治療に適当な条件下で１またはそれ以上の薬剤療法を使用することを
さらに含む方法。43. A method of treating a patient having a condition associated with HCV infection, comprising contacting cells of said patient with a nucleic acid molecule of claim 32,
And the use of one or more drug therapies under conditions suitable for said treatment. 【請求項４４】 前記薬剤療法がタイプＩインターフェロンである，請求項
４３記載の方法。44. The method of claim 43, wherein said drug therapy is a type I interferon. 【請求項４５】 前記タイプＩインターフェロンおよび酵素的核酸分子が同
時に投与される，請求項４４記載の方法。45. The method of claim 44, wherein said type I interferon and said enzymatic nucleic acid molecule are administered simultaneously. 【請求項４６】 前記タイプＩインターフェロンおよび酵素的核酸分子が別
々に投与される，請求項４４記載の方法。46. The method of claim 44, wherein said type I interferon and said enzymatic nucleic acid molecule are administered separately. 【請求項４７】 前記タイプＩインターフェロンがインターフェロンアルフ
ァである，請求項４４記載の方法。47. The method of claim 44, wherein said type I interferon is interferon alpha. 【請求項４８】 前記タイプＩインターフェロンがインターフェロンベータ
である，請求項４４記載の方法。48. The method of claim 44, wherein said type I interferon is interferon beta. 【請求項４９】 前記タイプＩインターフェロンがインターフェロンガンマ
である，請求項４４記載の方法。49. The method of claim 44, wherein said type I interferon is interferon gamma. 【請求項５０】 前記タイプＩインターフェロンがコンセンサスインターフ
ェロンである，請求項４４記載の方法。50. The method of claim 44, wherein said type I interferon is a consensus interferon.
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