JP2002511734A - 下垂体―腫瘍―形質転換遺伝子及び関連生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 かつて下垂体−腫瘍−特異的−遺伝子(PTSG)として知られた下垂体−腫瘍−形質転換−遺伝子(PTTG)、及びそれらをエンコードする核酸により、ポリペプチドが発現される。例は、ヒト及びラットのPTTG蛋白である。核酸は、組換え蛋白の産生、及び異なる撞のPTTG遺伝子の検出に適用される。核酸はまた、ベクターに操作可能にリンクされ、任意に、制御及び発現配列と共に提供され及び／又はホスト細胞により運ばれる。核酸はまた、内因性蛋白の不在又は欠乏した発現を補償するために哺乳類に送達することもできる。核酸、蛋白及び抗体はまた、診断アッセイ、並びに例えば抗PTTG抗体(蛋白)の産生、治療学的組成物及び蛋白及び抗体の他の適用にも用いられる。核酸、ポリペプチド及び／又は抗体を利用する様々なキット。PTTGを発現する非ヒトトランスジェニック哺乳類。

Description

【発明の詳細な説明】 下垂体−腫瘍−形質転換遺伝子及び関連生成物発明の背景 本発明は、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスよりグラント・ナ ンバーＤＫ４２７４２として授与されたアメリカ合衆国政府の援助金を少なくと も一部得てなされた発明である。政府は本発明に対し、ある種の権利を有するこ とがある。 本願は、1996年11月21日Shlomo Melmed及びLin Peiが出願した米国仮特許出願 第６０／０３１，３３８号「下垂体−腫瘍‐特異性遺伝子ファミリーをエンコー ドする核酸、及びこれに関する生成物(NUCLEIC ACID ENCODING AFAMILY OF PITU ITARY-TUMOR-SPECIFIC-GENES,AND PRODUCTS RELATED THERETO)」の出願日の優先 権を主張する。発明の分野 本発明は、核酸及び該核酸によってエンコードされた蛋白に関する。本発明の 核酸は、下垂体‐腫瘍−特異性遺伝子蛋白の新規なファミリーをエンコードする ものである。本発明はまた、このような核酸及び蛋白の製造及び使用方法に関す る。背景の説明 癌及び腫瘍は、米国における死因の第二位を占めており、毎年４５０，０００ 人が死亡している。アメリカ人の三人に 一人が癌にかかり、五人に一人が癌が原因で死亡していることになる(サイエン ティフィック・アメリカン・メディシン(Scientific American Medicine)、パー ト１２、Ｉ、１、セクション1987年)。癌の環境的、遺伝的原因と考えられるい くつかの要因を明らかとする実質的な進歩が見られるものの、癌による死亡率の 統計を見ると、癌及び関連する疾病及び疾患の治療に対する実質的な改善が必要 であることがわかる。 多くの癌遺伝子、つまり癌の原因論において言及されてきた遺伝子は、癌の遺 伝形態に関して、及び研究により良く知られた多くの腫瘍細胞において特定され ている。癌遺伝子の研究は、腫瘍形成過程を理解するある種の助けとなっている 。癌遺伝子についてはまだまだ解明しなければならないことが多く残されている が、現在知られている癌遺伝子は、腫瘍形成を理解するための有用なモデルとな っている。 癌細胞を大きく分けると、活性化すると腫瘍形成を促進する「オンコジーン( 腫瘍遺伝子)」と、損傷を受けると腫瘍形成の抑制ができなくなる「腫瘍抑制遺 伝子」とに分類される。このように分類することは腫瘍形成を概念化するのには 有用な方法であるが、ある遺伝子が、その特定の対立遺伝子形態、調節因子、遺 伝的背景、及び操作する組織環境によって異なる役割を果たすということも考え られる。 腫瘍抑制遺伝子は、野生形の対立遺伝子では、異常細胞増殖を抑制する蛋白を 発現する遺伝子である。腫瘍抑制蛋白をコードする遺伝子が突然変異したり欠失 したりすると、特に既に細胞調節機構が損傷を受けている場合、その突然変異蛋 白又は腫瘍抑制蛋白が完全に欠失した発現によって、細胞増殖を正しく調節する ことができなくなり、代わりに細胞が異常増殖することとなる。よく研究されて いる多くのヒトの腫瘍及び腫瘍細胞系では、腫瘍抑制遺伝子が欠失したり機能し ていないということが示されている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、レチノブラ ストマ・サセプティビリティー遺伝子つまりＲＢ遺伝子、ｐ５３遺伝子、欠損直 腸癌（ＤＤＣ）遺伝子、及び神経線維腫タイプ１（ＮＦ−１）腫瘍抑制遺伝子が 挙げれられるが、これらに限定されるものではない。腫瘍抑制遺伝子の機能喪失 又は不活性化は、多くのヒトの癌の発生及び／又は進行において中心的な役割を 果たしているのかもしれない。 下垂体前葉腫瘍は、遺伝子的に突然変異した細胞のモノクローナル増殖から生 じる、大半は良性のホルモン分泌性又は非機能性腺腫である。下垂体前葉におけ る腫瘍形成の病原については鋭意研究されている。下垂体腫瘍形成の機構は、近 年になって特徴が解明されてきた細胞内での多段階のカスケードを含む。下垂体 腫瘍において最も特定が進んでいるオンコジーン（腫瘍遺伝子）は、この遺伝子 における点突然変異を活性化させることにより生じる構造的に活性なＧａｓαで あるｇｓｐである。 Ｇａｓα突然変異は、成長ホルモン分泌腫瘍の約４０％に生じ、この腫瘍のサ ブセットには、構造的に活性化されたＣＲＥＢも観察される。成長ホルモン分泌 下垂体腫瘍の成長におけるＧＳα突然変異蛋白の重要性は充分に確立されている が、これらの腫瘍の約三分の一程度しかこの突然変異を有していない。このこと は、下垂体腫瘍形成には追加の形質転換事象が存在することを示している。Ｒａ ｓオンコジーンの点突然変異、染色体１３のＲｂ位置付近におけるヘテロ接合の 欠損(ＬＯＨ)、及び染色体１１におけるＬＯＨが関連している下垂体腫瘍もある が、下垂体細胞形質転換の原因となる機構の大半はまだ解明されていない。従っ て当業界では、下垂体細胞形質転換と関連している下垂体起源の追加の蛋白が必 要とされている。発明の要旨 本発明は、以前は哺乳類下垂体腫瘍特異性遺伝子（ＰＴＳＧ）蛋白と呼ばれて いた、単離され、精製された哺乳類下垂体形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）蛋白に関 する。本発明のＰＴＴＧ蛋白及びそのフラグメントは、抗ＰＴＴＧ抗体を産生す るための免疫原として、バイオアッセイで使用することができ、またこのような 蛋白及び／又は抗体を含有する治療用組成物にも使用することができる。 本発明はまた、ＰＴＴＧ蛋白を発現する非ヒトのトランスジェニック哺乳類に 関する。 本発明はさらに、ヒト、ラット等の哺乳類起源であるＰＴＴＧ（ＰＴＳＧ）蛋 白をエンコードする単離された核酸に関する。ＰＴＴＧをエンコードする核酸は 、それを担持するベクターの形式、ハイブリダイズ用プローブ／プライマー、そ れを担持するホスト細胞、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ 形式、及び関連する組成物の形式でも提供 することができる。本明細書に記載する核酸分子は、当業者に公知の発現系に組 込むことができる。ＰＴＴＧ核酸は、所定試料中におけるＰＴＴＧ遺伝子又はｍ ＲＮＡ転写産物の有無及び／又はその量を分析するためのプローブとして使用す ることができる。本明細書に記載する核酸分子、及びそのオリゴヌクレオチドフ ラグメントもまた、ＰＴＴＧ蛋白をエンコードする遺伝子を増幅するためのＰＣ Ｒ反応において、プライマー及び／又はテンプレートとして使用することができ る。 本発明のＰＴＴＧ蛋白と免疫反応性のある抗体もまた提供される。これらの抗 体は、例えば組織試料、生物学的流体、ウエスタンブロット等の所定の試料中に 存在するＰＴＴＧ蛋白のレベルを測定するための診断的アッセイに使用すること ができる。これらの抗体は粗細胞抽出物等からＰＴＴＧ蛋白を精製するためにも 使用することができる。さらに、これらの抗体はin vivoでＰＴＴＧの生物学的 効果を中和又は補足する治療に使用することができると考えられる。 種々の組織試料中のＰＴＴＧ蛋白のレベルを測定するための方法及び診断シス テムもまた提供される。これらの診断方法は、治療のために投与したＰＴＴＧ蛋 白又はそのフラグメントのレベルをモニターするために使用することができ、治 療のために効果的な量を維持するのに役立つ。これらの診断方法は、ＰＴＴＧ蛋 白が異常レベルとなることによって生じる病理的及び生理的障害を診断するため にも使用することができる。図面の簡単な説明 図１は、細胞増殖に対するＰＴＴＧ発現の効果を示す。細胞増殖率は、５９５ ｎＭにおける吸光度で示す。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝６）を示す。三つの独 立した実験を行った。発明の好ましい実施態様の説明 本発明は、発明者が、ＰＴＴＧ発現の過剰生成や異常に伴う疾患や状態を検出 するための従来の方法を改善しようとしたところから始まった。発明者は、一つ の種からＰＴＴＧ遺伝子を単離することから始め、このようにして見つけた遺伝 子の配列に基づいたプローブを用いて、他の種、特にヒトのゲノムＤＮＡを突き 止め、ＰＴＴＧ遺伝子を突然変異させる方法並びに欠陥のあるＰＴＴＧ遺伝子を 置換する方法を見出した。発明者はさらに、ヒトのこのような疾患及び状態の研 究のためのモデルとして使用するトランスジェニック動物を発明した。従って本 発明は、単離され、精製された哺乳類下垂体腫瘍特異性遺伝子（ＰＴＴＧ）蛋白 、及び本発明の核酸によってエンコードされるポリペプチド及びそのフラグメン トを提供する。本明細書において、「ＰＴＴＧ」という術語は、例えばＮＩＨ ３Ｔ３細胞等の、組織培養液中で細胞を形質転換させることができる、哺乳類フ ァミリー、好ましくはヒトの、単離された及び／又は実質的に純粋な蛋白を意味 する。本発明のＰＴＴＧ蛋白は、ヌードマウスにおいて、例えばＮＩＨ ３Ｔ３ 細胞等にトランスフェクションすると、腫瘍形成を誘発することができる。本発 明のＰＴＴＧ蛋白は、一次転写産物を交互にスプライシングすることによって生 成するｍ ＲＮＡによってエンコードされる自然発生的対立遺伝子変異体、及び免疫抗原性 等の少なくともひとつの生来の生物学的活性を維持しているフラグメントをさら に含む。 下垂体腫瘍細胞で特異的に発現した遺伝子を特定するために、発明者は、成長 ホルモン分泌性且つプロラクチン分泌性ラット下垂体腫瘍細胞系を使用した。こ のようにして、発明者はこれらを外科的に切除したヒト下垂体腫瘍及び実験用ラ ット固体腫瘍に存在する正常組織のきよう雑物を排除するために使用した。発現 したＭＲＮＡの約３０％をスクリーニングによって得ることにより、下垂体腫瘍 形質転換遺伝子（ＰＴＴＧ）を同定し、特徴付けた。ＰＴＴＧの配列から、GenB ankにあるどの公知の配列とも相同性がないことがわかった。ＰＴＴＧ遺伝子は 、特徴がわかっている機能的モチーフを全く含まない１９９個のアミノ酸からな る蛋白をエンコードする。これはＰＴＴＧが新規な蛋白であることを明らかに示 している。 発明者は、ノーザンブロット分析によってＰＴＴＧの下垂体腫瘍特異的発現を 示した。下垂体腫瘍細胞の他では、精巣組織が、ＰＴＴＧ発現を示す唯一の正常 な非腫瘍組織である。興味深いことに、精巣のＰＴＴＧメッセンジャーＲＮＡは 、下垂体腫瘍のＰＴＴＧメッセンジャーＲＮＡよりも約３００ｂｐ短いようであ る。これは精巣メッセンジャーが下垂体メッセンジャーのＰＴＴＧスプライス変 異体であることを示している。 ＰＴＴＧが腫瘍形成において重要であることは、ＰＴＴＧ トランスフェクション産物（transfectants）の形態の変化及び軟寒天中での足 場独立性成長によって示されるように、３Ｔ３繊維芽細胞中で過剰発現すると、 この細胞を形質転換することができるということによって説明される。この発見 は、多数の腫瘍細胞系が大量のＰＴＴＧを発現することを発見したことによって さらに強調される。また、ＰＴＴＧ発現３Ｔ３細胞を注射したヌードマウスは、 ３週間以内に全ての注射部位に大きな腫瘍を生じた。これらのデータは、ＰＴＴ Ｇのみで、相補的なオンコジーンを必要とせずに細胞形質転換を行うことができ ること、及びＰＴＴＧがin vivoで強力な腫瘍形成能を有することを示している 。一般に、完全な細胞形質転換には二つの相補的なオンコジーンが必要である。 Landら,Nature,304:696(1983)、Schwabら,Nature,316:160(1985)、Ruleyら,Natu re 304:602(1983)を参照のこと。しかしながら、Ras遺伝子のみの過剰発現によ るRat-１細胞形質転換の場合のように、一つのオンコジーンの過剰発現で、充分 に細胞形質転換が誘発されることもある。Reynolds,V.L.Oncogene,1:323(1987) 参照。本発明の場合には、発明者は、ＰＴＴＧは、培養されたトランスフェクシ ョンされた細胞中では、７２時間のアッセイ時間中では細胞増殖を刺激しないこ とを見出した。実際には、発明者は、ＰＴＴＧが意外にも培養されたトランスフ ェクションされた細胞中で全ての増殖を阻害することを見出した。この抗増殖効 果は、MassagueらがＴＧＦβで観察した細胞増殖の強力な阻害に似ている。Mass aqueら,Ann.Rev.Cell Biol. 6:597(1990)参照。しかしながら、一且細胞が形質転換されると、細胞増殖が加 速し、ヌードマウスで腫瘍の急速な増殖が見られる。 本発明のＰＴＳＧ蛋白は、抗ＰＴＴＧ（抗ＰＴＳＧ）抗体が選択的に結合する ポリペプチドであり、この抗体は好ましくはアミノ酸配列番号Ｎｏ．２、配列番 号Ｎｏ．４を含むヒト蛋白に結合する。また本発明のＰＴＳＧ蛋白は、抗ＰＴＴ Ｇ抗体に結合する５〜５０アミノ酸長であるフラグメントである。本発明の単離 されたＰＴＳＧ蛋白は、生来のin vivo環境に通常見られる他の細胞成分及び／ きょう雑物を一般的には含まないが、蛋白、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び多糖類等の生 成物をある程度含んでいることがある。 ＰＴＴＧ蛋白は、精巣において検出される発現と共に、主に下垂体腫瘍細胞に よって発現するが、これに限られるものではない。ラット下垂体腫瘍細胞の転写 産物は大きさが約１．３ｋｂであり、精巣の転写産物は約１ｋｂであることが、 ノーザンブロットアッセイによって観察された。ＰＴＴＧファミリーの蛋白をエ ンコードするスプライス変異体ｃＤＮＡ転写産物もまた、明らかに本発明が意図 するものである。 本明細書及び請求の範囲で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は蛋白を修飾 する語句として用いる「単離された」及び／又は「精製された」という術語は、 この修飾語によって修飾されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、又は蛋白が、人 の手によって単離及び／又は精製された形態に製造されたものであることを意味 し、つまりその生来のin vivo細胞環境 から分離されていることを意味する。このように人が関与することによって、本 発明の組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、及び蛋白は、自然発生するＤＮＡ 、ＲＮＡ、ポリペプチド、及び蛋白とは異なる、本明細書に記載するような利用 をすることができる。 本明細書において使用する「哺乳類」という術語は、例えば、ヒト、ラット、 マウス、ウサギ、サル、ヒヒ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等、本発明のＰ ＴＴＧ蛋白の起源となる様々な種を意味する。本発明において好ましいＰＴＴＧ 蛋白は、ヒトＰＴＴＧである。 また、ＰＴＴＧ遺伝子も本発明の一部をなす。この遺伝子の欠失・存在が、下 垂体腫瘍形成を左右する。GenBankの検索及び蛋白プロファイル分析（national center for Biotechnology InformationのデータベースのＢＬＡＳＴプログラム 検索）により、ＰＴＴＧは既知の配列と相同性がなく、ＰＴＴＧのエンコードさ れた蛋白は非常に親水性であり、よく認識されている機能的モチーフを含んでい ないことがわかっている。 現在好ましい本発明のＰＴＴＧ蛋白は、アミノ酸配列番号Ｎｏ．２、Ｎｏ．４ と実質的に同一であるアミノ酸配列、及びその約５〜５０アミノ酸長のフラグメ ント、並びにその生物学的に活性な、修飾された形態を含む。当業者は、上記の 配列の多数の残基を、結果として生じるレセプター種の生物学的活性を実質的に 変えることなく、他の化学的、立体的、及び／又は電子的に類似する残基と置換 できることがわかる であろう。さらに配列番号Ｎｏ．２と実質的に同一の配列を包含するより長いポ リペプチド配列（例えばスプライス変異体）も意図するものである。 本明細書で用いる「実質的に同一なアミノ酸配列」という語句は、言及するア ミノ酸配列と少なくとも約７０％同一で、言及するアミノ酸配列によって規定さ れる蛋白の特徴である機能的、生物学的活性を匹敵する程度有するアミノ酸配列 を意味する。「実質的に同一なアミノ酸配列」を有する蛋白は、言及するアミノ 酸配列と、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは９０％のアミノ酸同 一性を有し、約９５％を超えるアミノ酸配列同一性が特に好ましい。しかしなが ら、スプライス変異体として生じる、上記水準未満の配列同一性を持つポリペプ チド(又は上述の核酸)、又は保存的アミノ酸置換又は縮重コドンによる置換によ って修飾されたポリペプチドもまた本発明の範囲内であることは言うまでもない 。 本明細書において、本発明のＰＴＴＧ蛋白又はそのポリペプチドフラグメント を修飾する語句として使用する「生物学的に活性な」又は「機能的な」という術 語は、ＰＴＴＧに由来する少なくともひとつの機能的特徴を示すポリペプチドを 示す。例えば、ＰＴＴＧの一つの生物学的活性は、in vitroにおける細胞の形質 転換能である(例えばNIH 3T3細胞等)。またＰＴＴＧの別の生物学的活性として は、ヌードマウスにおける腫瘍形成誘発能がある(例えばNIH 3T3細胞にトランス フェクションされた場合等)。 ＰＴＴＧはまた、ＰＴＴＧに選択的に結合するポリクロー ナル及びモノクローナル抗体産生のための免疫原としての活性もある。よって、 ＰＴＴＧをエンコードする本発明の核酸は、アミノ酸配列Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、 及び抗ＰＴＴＧ抗体に結合する約５〜５０アミノ酸長のそのフラグメントを含む ＰＴＴＧ蛋白、好ましくはヒトＰＴＴＧ蛋白を特異的に認識する抗体に特異的に 認識されるポリペプチドをエンコードするものである。このような活性は、当業 者に知られているいかなる方法でも分析することができる。例えば、ＰＴＴＧ ｃＤＮＡによってエンコードされるテスト・ポリペプチドは、抗体産生に使用す ることができ、この抗体を、配列番号Ｎｏ．２の配列を含む蛋白に結合する能力 について分析する。もし抗体が、テストポリペプチドと配列番号Ｎｏ．２の配列 を含む蛋白とに実質的に同じ親和性で結合したなら、ポリペプチドは、必要とさ れる生物学的活性を有していることになる。 本発明のＰＴＴＧ蛋白は、例えば、本明細書に記載する組換え発現システム、 沈降法(precipitation)、ゲルろ過、イオン交換、逆相クロマトグラフィー、及 びアフィニティークロマトグラフィー等の当業者に公知の方法で単離することが できる。他の公知の方法は、Deutscherら,Guide to Protein Purification:Meth odsin Enzymology Vol.182,(Academic Press,(1990))に記載されている。この文 献は参照により本明細書に組込まれる。また、本発明の単離されたポリペプチド は、例えばSambrookら、同上、（1989）に記載される公知の組換え方法によって 得ることができる。 本発明のポリペプチドを調製する手段の例としては、バク テリア細胞、酵母細胞、両生類細胞(例えば卵母細胞)、哺乳類細胞等の適切な宿 主細胞中で、当業者に公知の方法で、ＰＴＴＧをエンコードする核酸を発現させ 、発現したＰＴＴＧポリペプチドを、これも公知の方法で回収する方法が挙げら れる。本発明のＰＴＴＧポリペプチドは、本発明に記載する発現ベクターで形質 転換された細胞から直接単離することもできる。本発明のポリペプチド、生物学 的に活性なフラグメント、及びその機能的同等物は、化学合成によっても調製す ることができる。例えば、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッ ド（Applied Biosystems,Inc.）製のモデル４３０Ａ又は４３１Ａ自動ペプチド 合成装置（カリフォルニア州、フォスター・シティー(Foster City)）を使用し 、製造者が提供する化学的作用によって、合成ポリペプチドを調製することがで きる。 ＰＴＴＧという術語はまた、ポリペプチドフラグメント又はそのポリペプチド 類似体をも含む。「ポリペプチド類似体」という術語は、本明細書に特定する配 列と実質的に同一なアミノ酸残基配列を有し、一つ以上の残基が保存的に、機能 的に類似する残基と置換されており、本明細書に示すＰＴＴＧ模倣能を示す全て のポリペプチドを含む。保存的置換の例としては、例えばイソロイシン、バリン 、ロイシン、又はメチオニン等の一つの非極性（疎水性）基を別の非極性基と置 換すること、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリ ンのように一つの極性（親水性）基を別の極性基と置換すること、リジン、アル ギニン、又はヒスチジン 等の一つの塩基性基を別の塩基性基と置換すること、又はアスパラギン酸又はグ ルタミン酸等の一つの酸性基を別の酸性基と置換することが挙げられる。「保存 的置換」という術語はまた、化学的に誘導した残基を、誘導していない基の代わ りに用いることを含むが、この場合には、得られるポリペプチドが必須の結合活 性を有することが条件となる。 「化学的誘導体」とは、機能的側基の反応によって化学的に誘導された一つ以 上の残基を有する上記のポリペプチドを意味する。このような誘導された分子は 、例えば遊離アミノ基が誘導されて、アミンヒドロクロリド、ｐ−トルエンスル フォニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロキシカルボニル基、クロロアセチ ル基、又はホルミル基を形成している分子を含む。遊離カルボシキル基は、誘導 されて、塩、メチル及びエチルエステル、又は他のエステルまたはヒドラジドを 形成していてもよい。遊離ヒドロキシル基は、誘導されて、Ｏ−アシル又はＯ− アルキル誘導体を形成していてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導 されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成していてもよい。さらに20個の標 準的なアミノ酸の一つ以上の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドも化学的誘導体 に含まれる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンと置換してもよく、リ ジンを５−ヒドロキシリジンと置換してもよく、ヒスチジンを３−メチルヒスチ ジンと置換してもよく、またセリンをホモセリンで置換してもよく、リジンをオ ルニチンで置換してもよい。本発明のポリペプチドは、必須の結合活性を有する ものであれば、本 明細書に配列を示すポリペプチドの配列と比して、残基が一つ以上追加及び／又 は欠失した全てのポリペプチドをも含む。 また本発明によれば、許容される担体と、単離され、精製されたＰＴＴＧポリ ペプチド、その活性フラグメント又はポリペプチド類似体、又は精製され、成熟 した蛋白及びその活性フラグメントのいずれか一種又はこれらの混合物とを含有 する組成物が提供される。これらのポリペプチドや蛋白は、組換えによって誘導 したもの、化学的に合成したもの、又は天然の源から精製したもののいずれであ ってもよい。本明細書で用いる「許容される担体」とは、リン酸緩衝食塩水、水 、及び水中油型又は油中水型エマルジョン等のエマルジョン、及び種々の湿潤剤 等、いかなる標準的な薬学的担体をも含むものである。 本発明の別の実施態様によれば、本発明のＰＴＴＧ（下垂体腫瘍形質転換遺伝 子）蛋白をコードする単離された核酸、及びそのフラグメントが提供される。本 明細書に記載する核酸分子は、当業者に公知の種々の蛋白発現系に組込めば、本 発明の蛋白を調製するのに使用することができる。さらに、このような核酸分子 又はそのフラグメントは、容易に外すことのできる置換基で標識し、与えられた 試料中のＰＴＴＧ遺伝子又はｍＲＮＡ転写産物の有無及び／又は量を検査するた めのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。本明細書に 記載する核酸分子及びそのフラグメントはまた、本明細書に記載する本発明の蛋 白をエンコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応におけるプライマー及び ／又はテンプレートとしても使用することができる。 「核酸」（ポリヌクレオチドとも言う）という術語は、リボ核酸（ＲＮＡ）又 はデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマ ーを含む。ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であっても、ゲノムＤＮＡ、例え ばＰＴＴＧ蛋白をエンコードする遺伝子であってもよい。ＰＴＴＧポリペプチド をエンコードする核酸を単離する一つの手段として、公知の方法によって、天然 又は人工的に設計したＤＮＡプローブで哺乳類のゲノムライブラリーをプローブ する方法が挙げられる。ＰＴＴＧ遺伝子から誘導されたＤＮＡプローブは、この 目的に使用するには特に有用である。ＰＴＴＧポリペプチドをエンコードするＤ ＮＡ及びｃＤＮＡ分子を使用して、哺乳類(例えばヒト、マウス、ラット、ウサ ギ、ブタ等)又は他の動物の源から相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ を得たり、若しくは後により詳細に説明する方法によりｃＤＮＡ又はゲノムライ ブラリーをスクリーニングすることによって、関連するｃＤＮＡ又はゲノムクロ ーンを単離することができる。核酸の例としては、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＴＴＧ ポリペプチドをエンコードする単離されたゲノムＤＮＡが挙げられる。このよう な核酸は、配列番号Ｎｏ．１を含む核酸、その対立遺伝子、好ましくは配列番号 Ｎｏ．１のうち少なくとも核酸２９３−８８９、またはそのスプライス変異体ｃ ＤＮＡ配列を含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。 本明細書において使用する「スプライス変異体」又は「交 互にスプライシングされた」という語句は、本発明のレセプターをエンコードす る特定のヌクレオチド配列を説明するのに使用する場合には、公知の真核細胞Ｒ ＮＡスプライシング工程によって生じるｃＤＮＡ配列を意味する。ＲＮＡスプラ イシング工程は、イントロンを切り出し、真核細胞のＲＮＡ一次転写産物のエク ソンをつなぎ合わせて、細胞質の成熟ＲＮＡ分子を生成する工程を含む。スプラ イス変異体ヌクレオチド配列の単離方法は、当業者には公知である。例えば、当 業者であれば、本明細書に記載するように、ＰＴＴＧをエンコードする配列番号 Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、その対立遺伝子、そのスプライス変異体、又は約１０〜１ ５０ヌクレオチド長のそのフラグメント、及びそのアンチセンス核酸から誘導さ れるヌクレオチドプローブを使用して、同種又は異種のｃＤＮＡ又はゲノムライ ブラリーをスクリーニングすることができる。 本発明のある実施態様では、本発明のＰＴＴＧ蛋白をエンコードするＤＮＡは 、配列番号Ｎｏ．１、配列番号Ｎｏ．３、その対立遺伝子、そのスプライス変異 体、及び約１５〜１５０ヌクレオチド長のそのフラグメント、及びそのアンチセ ンス核酸を含む。本発明の別の実施態様では、本発明の蛋白をエンコードするＤ ＮＡ分子は、配列番号Ｎｏ．１のうちのヌクレオチド２９３−８８９、その対立 遺伝子、そのスプライス変異体、及び約１０〜１５０ヌクレオチド長のそのフラ グメントを含む。本発明のさらに別の実施態様では、ＤＮＡは、配列番号Ｎｏ． ３のうちのヌクレオチド２９２−８９９、そ の対立遺伝子、そのスプライス変異体、及び約１０〜１５０ヌクレオチド長のそ のフラグメントを含む。 本明細書で使用する「実質的に同一なヌクレオチド配列」という術語は、言及 するポリヌクレオチドと充分に同一であって、中程度にストリンジェントなハイ ブリダイゼーション条件下で、言及するヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮ Ａを意味する。ある実施態様では、言及するヌクレオチド配列と実質的に同一な ヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号Ｎｏ．２に記載するアミノ酸配列 又は配列番号Ｎｏ．２を含むより長いアミノ酸配列と、実質的に同一なアミノ酸 配列をエンコードする。別の実施態様では、言及するヌクレオチド配列と「実質 的に同一なヌクレオチド配列」を有するＤＮＡとは、言及するヌクレオチド配列 と少なくとも６０％の同一性を有する。言及するヌクレオチド配列と少なくとも ７０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％ の同一性を有するＤＮＡが好ましい。 本発明は、配列番号Ｎｏ．１に示す核酸とは異なるが、表現型が同一である核 酸をさらに含む。表現型が類似する核酸は、「機能的に同等な核酸」とも呼ばれ る。本明細書で使用する「機能的に同等な核酸」という語句は、実質的に同一な 態様で機能して、本明細書に開示する核酸と同一な蛋白生成物を産生する、僅か で重要でない配列の変化を特徴とする核酸を含む。特に、機能的に同等な核酸は 、本明細書に記載するものと同一のポリペプチドを、又はアミノ酸が保存的な変 更を有するポリペプチドをエンコードするか、又は配列番号Ｎ ｏ．２を含むより長いポリペプチドをエンコードする。例えば、保存的な変更と は、非極性残基を他の非極性残基で置換すること、チャージされた残基を同様に チャージされた残基で置換することを含む。これらの変更は、当業者が蛋白の三 次構造を実質的に変更しないと認めるものを含む。 さらに、遺伝暗号の縮重によって、特定のハイブリダイゼーション条件下にお いて本発明の核酸と必ずしもハイブリダイズしないＰＴＴＧポリペプチドをエン コードする核酸が提供される。本発明のＰＴＴＧポリペプチドをエンコードする 好ましい核酸は、配列番号Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、及び約５〜５０アミノ酸長のそ のフラグメントをエンコードするヌクレオチドを含む。本発明のＰＴＴＧ蛋白を エンコードする核酸の例としては、以下のものが挙げられる。 （ａ）配列番号Ｎｏ．２に記載するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ， （ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズす るＤＮＡであって、生物学的に活性なＰＴＴＧをエンコードするＤＮＡ、又は （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）より縮重しているＤＮＡであって、生物学的に活性 なＰＴＴＧをエンコードするＤＮＡ． ハイブリダイゼーションとは、核酸の相補的ストランド(つまりセンス：アン チセンス鎖又はプローブ：ターゲットＤＮＡ)が水素結合によって互いに結合す ることであり、染色体ＤＮＡにおいて自然に生じる結合に類似するものである。 所定のプローブをターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせるた めに採用するストリンジェンシーのレベルは、当業者であれば容易に変更するこ とができる。 本明細書で用いる「ストリンジェントハイブリダイゼーション」という語句は 、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を意味する。当業者にはわかるように 、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般的に 、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度及び温度の関数である。代表的 には、ハイブリダイゼーション反応を、低めのストリンジェンシーの条件で行い 、次いで種々であるがより高いストリンジェンシーでの洗浄を行う。ハイブリダ イゼーションのストリンジェンシーとは、このような洗浄条件を意味している。 本明細書で使用する「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」 という語句は、ターゲットＤＮＡが、ターゲットＤＮＡに対して約６０％の同一 性、好ましくは約７５％の同一性、より好ましくは約８５％の同一性を有する相 補的核酸に結合することができる条件を意味し、ターゲットＤＮＡに対して約９ ０％より高い同一性を有することが特に好ましい。好ましくは、中程度にストリ ンジェントな条件とは、４２℃で５０％ホルムアミド、５×Denhart溶液、５× ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでハイブリダイゼーションし、次いで６５℃で０．２ ×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで洗浄する条件に等しい条件を意味する。 「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、６５℃ で０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイ ブリッドを形成する核酸配列のみがハイブリダイゼーションできる条件（つまり 本明細書で意図しているものは、ハイブリッドが６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣ ｌ中で安定でなければ、高度にストリンジェントな条件下でも安定ではないとい うことである）を意味する。高度にストリンジェントな条件は、例えば、４２℃ で５０％ホルムアミド、５×Denhart溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでハ イブリダイゼーションし、次いで６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、及び０．１％ＳＤ Ｓで洗浄することによって与えられる。 「低いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション」という語句は、４２ ℃で１０％ホルムアミド、５×Denhart溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで ハイブリダイゼーションし、次いで５０℃で１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、で 洗浄することと同等の条件を意味する。Denhart溶液及びＳＳＰＥ(例えばサムブ ルックらの「分子クローニング−実験室マニュアル」スプリング・ハーバー・ラボ ラトリー・プレス（1989年）(Sambrook et al.，Molecular Cloning,A Laborato ry Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)を参照)は、他の適当な ハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者に良く知られているものである 。 本明細書で使用する「縮重」とは、言及する核酸、例えば配列番号Ｎｏ．１又 はＮｏ．３とは少なくとも一つのヌクレオチドが異なるが、言及する核酸と同じ アミノ酸をエンコードするコドンを意味する。例えば、三塩基「ＵＣＵ」「ＵＣＣ」 「ＵＣＡ」及び「ＵＣＧ」によって特定されるコドンは、４ つともアミノ酸セリンをエンコードするので、互いに縮重している。 本発明のポリペプチドをエンコードする好ましい核酸は、中程度にストリンジ ェントな、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号Ｎｏ．１、 配列番号Ｎｏ．３の実質的に全ての配列、若しくは実質的な部分、つまり代表的 には少なくとも１５−３０ヌクレオチドにハイブリダイズするが、より長いフラ グメントも含まれる。 本明細書では、突然変異体ＰＴＴＧ cDNAの生成のための、ＰＴＴＧ cDNAのい ずれかの領域における指定部位突然変異誘発が意図される。例えば、トランスフ ォーマー突然変異誘発キット（クロンテック（Clontech）より入手可能）を使用 して、ＰＴＴＧ ｃＤＮＡの種々のミスセンス及び／又はナンセンス突然変異を 行うことができる。 本発明の核酸は、当業者に公知の種々の方法、例えば、本明細書に記載するよ うに、配列番号Ｎｏ．１の様々な領域からオリゴヌクレオチドプライマーを用い てＰＣＲ増幅を行う等の方法によって産生することができる。 本発明の別の実施態様によれば、任意にラベル付けされたＰＴＴＧをエンコー ドするｃＤＮＡ又はそのフラグメントを利用して、関連する新規な捕乳類ＰＴＴ Ｇ蛋白をエンコードする追加の核酸配列をライブラリー(ｃＤＮＡライブラリー 、染色体ライブラリー等)からプローブすることができる。哺乳類ｃＤＮＡ及び ゲノムライブラリー、好ましくはヒトのライブラリーの構造は、当業者には周知 である。このようなｃ ＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、まず低いストリンジェンシ ー条件下で行う。この条件は、温度約４２℃未満、ホルムアミド濃度約５０％未 満で、中程度から低濃度の塩濃度の条件を含む。 現在好ましいプローブを使用するスクリーニングの条件は、温度約３７℃、ホ ルムアミド濃度約２０％、塩濃度約５×標準食塩水クエン酸塩（ＳＳＣ；２０× ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ７ ．０である）の条件を含む。このような条件により、完全に相同性がなくても、 プローブの配列と実質的に類似する配列を特定することができる。「実質的に類 似する」という語句は、少なくとも５０％の相同性を有する配列を意味する。好 ましくは、プローブと少なくとも７０％の相同性を有する配列を特定し、且つプ ローブとの相同性がより低い配列を区別することができるハイブリダイゼーショ ン条件を選択する。その結果、本発明の核酸のコード領域、好ましくは配列番号 Ｎｏ．１のヌクレオチド２９３−８８９と実質的に同一なつまり類似する配列を 有する核酸が得られる。 本明細書で使用する核酸「プローブ」とは、配列番号Ｎｏ．１又は配列番号Ｎｏ ．３のいずれかに記載するいずれかの１４以上の連続する塩基と同一の(又は相 補的な)、少なくとも１４、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少な くとも５０の連続する塩基を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡ又はＲ ＮＡ、若しくはその類似体である。プローブを構成し始める好ましい領域は、配 列番号Ｎｏ．１の５’ 及び／又は３’コード領域を含む。さらに、本発明のＰＴＴＧ蛋白のｃＤＮＡコ ード領域全体、又は配列番号Ｎｏ．１に対応する配列全体をプローブとして使用 することもできる。プローブは、以下に説明するように、当業者に周知の方法で ラベル付けして、種々の診断キットに使用することができる。 本明細書で様々な品詞として使用する「ラベル」及び「標識手段」という語は 、検出可能なシグナルの発生に直接的又は間接的に関わる単一の原子又は分子を 意味する。いずれのラベル又は標識手段も本発明の核酸プローブ、発現した蛋白 、ポリペプチドフラグメント、又は抗体分子にリンクさせることができる。これ らの原子又は分子は、単独で使用しても、別の試薬と組合せて使用してもよい。 このようなラベル自体は、臨床診断化学では周知である。 ラベル付け手段としては、変性していない抗体又は抗原に化学結合して、便利 な免疫蛍光染色トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤を使用 することができる。免疫蛍光染色分析法についての説明は、ジョン・ワイリー・ アンド・サンズ・リミテッド編、デルカ「道具としての抗体における免疫蛍光染 色分析」、マーキャロニスら、１８９−２３１頁（１９８２年）(DeLuca,"Immuno -fluorescence Analysis"in Antibody As a Tool,Marchalonis et al.,eds.,Joh n Wiley & Sons,Ltd.,pp.189-231(1982))に記載されている。この文献は参照に より本明細書に組込まれる。 ある実施態様では、標識基は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ) 、グルコースオキシダーゼ等の酵素であ る。別の実施態様では、放射性元素を標識剤として使用する。ラベルを基材にリ ンクさせること、つまり核酸プローブ、抗体、ポリペプチド、及び蛋白の標識は 、当業者には周知である。例えば、本発明の抗体は、培地に添加した放射線標識 アミノ酸を代謝によって取りこむことによって標識することができる。例えば、 ガルフレら(Galfre et al.),Meth.Enzymol.,73:3-46(1981)を参照せよ。特に、 活性化された官能基によって蛋白の共役又は結合を行う慣用の手段が応用可能で ある。例えば、オーラミーズら(Aurameas et al.),Scand.J.Immunol.,Vol.8,Sup pl.7:7-23(1978)、ロッドウェルら(Roddwell et al.),Biotech.,3:889-894(1984 )、及び米国特許第４，４９３，７９５号を参照せよ。 さらに、ＰＴＴＧポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡのいずれかの部分に 特異的に結合して、ｍＲＮＡの翻訳を防止することができる配列を有するアンチ センスオリゴヌクレオチドが提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 ＰＴＴＧポリペプチドをエンコードするｃＤＮＡの配列のいずれかの部分に特異 的に結合可能な配列を有していてもよい。本明細書において使用する「特異的に 結合する」という語句は、核酸配列が、相補的核酸配列を認識し、相補的塩基対 間に水素結合を形成することによって二重らせんセグメントを形成することがで きることを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ヌクレオチド の化学的類似体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。 細胞膜を通過し、ＰＴＴＧポリペプチドをエンコードする ｍＲＮＡと特異的に結合して翻訳を防止することによって、ＰＴＴＧポリペプチ ドの発現を抑えるのに有効な量の上記アンチセンスオリゴヌクレオチドと、細胞 膜を通過することができる許容できる疎水性担体とを含有する組成物もまた、本 発明によって提供される。適切な疎水性担体は、例えば米国特許第５，３３４， ７６１号、同第４，８８９，９５３号、同第４，８９７，３５５号等に記載され ている。細胞膜を通過することができる許容できる疎水性担体は、選択された細 胞型に特異的なレセプターに結合し、それによって選択された細胞型の細胞によ って取り上げられる構造を有していてもよい。この構造は、細胞型特異性レセプ ターに結合することが知られている蛋白の一部であってもよい。 アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、本発明のポリペプチドをエンコー ドするｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに役立つ。合成オリゴヌクレオチド又は他の アンチセンスの化学的構造体は、ＰＴＴＧポリペプチドをエンコードするｍＲＮ Ａに結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計され、組織試料又は被験者 の体内でＰＴＴＧ関連遺伝子の発現を阻害する組成物として有用である。 本発明の別の実施態様によれば、少なくとも一つの本発明のＰＴＴＧプローブ 又はアンチセンスヌクレオチドを含むＰＴＴＧ遺伝子における突然変異、複製、 欠失、再配列、又は異数性を検出するためのキットが提供される。 本発明は、ＰＴＴＧポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する 合成アンチセンスオリゴヌクレオチド組 成物(以下ＳＡＯＣと称する)を用いて、ＰＴＴＧポリペプチドの発現レベルを調 節する手段を提供する。ｍＲＮＡを認識し、選択的に結合するように設計された 合成オリゴヌクレオチド又は他のアンチセンスの化学的構造体は、ＰＴＴＧコー ドストランド又は配列番号Ｎｏ．１又は配列番号Ｎｏ．３に示すヌクレオチド配 列の一部と相補的に構成されている。ＳＡＯＣは、注射によって又は直接腫瘍部 位に組込むことによって被験者に投与できるように、血流中で安定であるように 、若しくは実験室の細胞培養状態で安定であるように、設計されている。ＳＡＯ Ｃは、例えば小型の疎水性ＳＡＯＣ化学的構造を設計することによって細胞膜を 通過できるようにするＳＡＯＣの物理的及び化学的性質によって、若しくはＳＡ ＯＣを認識し、細胞内へ搬送する細胞内の特定の搬送システムによって、細胞の 細胞質に入るように、細胞膜を通過できるように設計されている。さらに、選択 された細胞集団内においてのみSAOCが結合し取りこまれる特定の細胞摂取機構に よって認識されるよう、SAOCをターゲッティングすることによって、特定の選択 された細胞集団にのみ投与できるように、ＳＡＯＣを設計することもできる。 例えばＳＡＯＣは、上述のように特定の細胞型にのみ存在するレセプターに結 合するように設計することもできる。ＳＡＯＣはまた、ターゲットｍＲＮＡ配列 を認識し、選択的に結合するように設計することもできる。このターゲットｍＲ ＮＡ配列は、配列番号Ｎｏ．１に記載する配列に含まれる配列に対応したものと することができる。ＳＡＯＣは、ターゲ ットｍＲＮＡに結合し、例えばＲＮａｓｅＩ切断によるｍＲＮＡの分解を誘発す るか、若しくは翻訳制御因子つまりリボソームの結合を妨げることによってｍＲ ＮＡターゲット配列の翻訳を阻害するか、さらにはリボザイム配列等の他の化学 的構造体や、ターゲットｍＲＮＡを分解又は化学的に修飾する化学的反応基を混 在させるか、いずれかによって、ターゲットｍＲＮＡを不活性化するように設計 されている。ＳＡＯＣは、ｍＲＮＡターゲットに向けるとこのような性質を示す ことが示されている(Cohen et al.,TIPS,10:435(1989)及びWeintraub,Sci.Ameri ca，January(1990),p.40を参照せよ。これらの文献は参照により本明細書に組込 まれる)。 本発明のさらに別の実施態様によれば、上記の核酸配列を適切なホスト細胞中 で発現させることによって、本発明のＰＴＴＧ蛋白を組換えによって産生する方 法が提供される。本明細書に記載するＰＴＴＧ蛋白を製造するのに適した組換え ＤＮＡ発現型系は、当業者には周知である。例えば、さらに操作を行うために、 上記のヌクレオチド配列をベクターに組込むこともできる。本明細書で使用する ベクター（つまりプラスミド）とは、異種ＤＮＡを発現又は複製のために細胞に 導入するのに使用する別個のエレメントを意味する。 適切な発現ベクターは当業者には周知であり、ＤＮＡの発現を制御することが できるプロモーター領域等の制御配列に、操作可能にリンクされたＤＮＡを発現 することができるベクターを含む。従って、発現ベクターとは、プラスミド、フ ァージ、組換えウイルス、又は適切な他のベクター等のホスト 細胞に導入すると挿入されたＤＮＡを発現する組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構造を意 味する。適切な発現ベクターは、当業者には周知であり、真核細胞及び／又は原 核細胞において複製可能なもの、及びエピソーム的な性質を維持しているもの、 宿主細胞ゲノム内に組込むことができるものを含む。さらにベクターは、例えば レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス等の多くのウイルス性ビリ オンによって、ベクターがパッケージされ、「ウイルス性ベクター」を形成する ようにする、適切なパッケージングシグナルを含んでいてもよい。 本明細書において、プロモーター領域とは、それに操作可能にリンクしたDNA の転写を制御するDNAのセグメントを示す。プロモーター領域は、RNAポリメラー ゼ認識、結合及び転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター領 域は、RNAポリメラーゼのこの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列を含 む。これらの配列は、シス作用性とすることができ、又はトランス作用因子応答 性とすることができる。調節の性質に応じて、プロモーターは、構成的又は調節 されたものとすることができる。本発明の実施での使用が意図されるプロモータ ーの例は、SV40アーリープロモーター、サイトメガロウィルス(CMV)プロモータ ー、マウス乳腫瘍ウイルス(MMTV)、ステロイド誘発性プロモーター、Moloneyマ ウス白血病ウイルス(MMLV)プロモーター等を含む。 本明細書において、“操作可能にリンク”の語は、DNAと 調節及びエフェクターヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサー、 転写及び転写ストップサイト、並びに他のシグナル配列との機能的な関係を示す 。例えば、DNAのプロモーターへの操作可能なリンクとは、そのDNAを特異的に認 識し、結合し且つ転写するRNAポリメラーゼにより、そのようなDNAの転写がプロ モーターから開始されるような、DNA及びプロモーターの物理的及び機能的関係 を示す。 本明細書において、発現とは、ポリ核酸がmRNAに転写されペプチド、ポリペプ チド又は蛋白に翻訳される過程を示す。ポリ核酸がゲノムDNA由来の場合、発現 は、もし適切な真核のホスト細胞又は生体が選択された場合、mRNAのスプライシ ングを含む。 原核的な形質転換ベクターは、当該分野でよく知られており、pBluescriptお よびファージラムダZAPベクター(Stratagene,La Jolla,CA)等を含む。他の適切 なベクター及びプロモーターは、1989年１月17日に発行された米国特許明細書第 4,798,885号に詳細に記載されており、この開示は参照によりその全体が本願に 組み込まれる。 E.coliの形質転換のための他の適切なベクターは、pET発現ベクター(Novagen 、米国特許明細書第4,952,496号参照)、例えばT7プロモーター、T7ターミネータ ー、誘発性E.colilacオペレーター及びlacリプレッサー遺伝子を含むpET11a；並 びにT7プロモーター、T7ターミネーター及びE.coli ompT分泌シグナルを含むpET 12a-cを含む。もう一つの適切なベクターは、lppプロモーター、lacUV5プロモー ターオペレーター、ompA分泌シグナル、及びlacリプレッサー遺伝子を含むpIN-I IIompA2（Duffaud et al.,Meth.in Enzymology,153:492-507,1987参照）である 。 例えば、ウシ乳頭腫ウィルスゲノム、マウスレトロウイルスのクローンされた ゲノム、真核カセット(eukaryotic cassettes)、例えばpSV-2 gpt系(Mulligan a nd Berg,1979,Nature Vol.277:108-114に記載される)、Okayama-Bergクローニン グ系(Mol.Cell Biol.Vol.2:161-170,1982)及びGenetics Instituteにより記載さ れる発現クローニングベクター(Science Vol.228:810-815,1985)を含む真核形質 転換ベクターが、利用可能である。これらは、形質転換された真核細胞系におい て、少なくとも関心のある蛋白のいくらかの発現の、実質的な保証を提供する。 哺乳類細胞のトランスフェクションのために本発明のPTTGエンコードDNAにリ ンクすることができる調節因子を含む特に好ましいベースベクターは、サイトメ ガロウイルス(CMV)プロモーターをベースにしたベクター、例えばpcDNA1(Invitr ogen,San Diego,CA)、MMTVプロモーターをベースにしたベクター例えばpMAMNeo( Clontech,PaloAlto,CA)及びpMSG(Pharmacia,Piscataway,NJ)、及びSV40をベース にしたベクター例えばpSVβ(Clontech,PaloAlto,CA)である。 本発明のさらに他の実施態様では、本発明の核酸分子（即ちDNA又はmRNA）を 含む“組換え細胞”が提供される。適切なホスト細胞、好ましくはバクテリア細 胞、より好まし くはE.coli細胞を形質転換する方法、並びに異種蛋白をエンコードする遺伝子を 含む前記細胞を培養する適用可能な方法は、当該分野で一般的に知られている。 例えば、Sambrook et al.,Molecular Clonlng:A Laboratory Manual(2ed),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,USA(1989)を参 照。 本発明の核酸を含む発現ベクターをホスト細胞に導入（形質導入）して形質導 入された組換え細胞（即ち組換え異種核酸を含む細胞）を産生する方法の例は、 当該分野でよく知られている(概説として、例えばFriedmann,1989,Science,244: 1275-1281;Mulligan,1993,Science,260:926-932を参照。それぞれは、参照によ りその全体が本願に組み込まれる)。形質導入の方法の例は、ウイルスベクター を用いた感染(例えば米国特許明細書第4,405,712号及び第4,650,764号参照)、リ ン酸カルシウム形質導入(米国特許明細書第4,339,216号及び第4,634,665号)、硫 酸デキストラン形質導入、エレクトロポレーション、リポフェクション(lipofec tion;例えば米国特許明細書第4,394,448号及び4,619,794号参照)、サイトフェク ション(cytofection)、粒子ビーズ衝撃(particle beads bombardment)等を含む 。異種核酸は、任意に、その染色体外（即ちエピソーマルな）維持をさせる配列 を含むことができ、又は（ホスト中の安定な維持を保証する他の手段として）異 種DNAはホストのゲノムに統合させることができる。 本発明の実施における使用が意図されるホスト生物は、異種蛋白の組換え産生 が実行された生物を含む。そのようなホ スト生物の例は、バクテリア(例えばE.coli)、酵母(例えばSaccharomyces cerev isiae,Candida tropicalis,Hansenulapolymorpha及びP.pastoris;米国特許明細 書第4,882,279号、第4,837,148号及び第4,855,231号参照)、哺乳類細胞(例えばH EK293、CHO及びLtk^-細胞)、昆虫細胞等を含む。現時点で好ましいホスト生物は バクテリアである。最も好ましいバクテリアはE.coliである。 一つの実施態様において、本発明のPTTG蛋白をエンコードする核酸は、in viv o又はin vitroのいずれかで、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ ー等当該分野でよく知られた適切なウイルスベクターを用いて哺乳類細胞に送達 することができる。さらに、本発明のPTTGのin vivo発現を制限又は減少させる ことが望ましい場合、本発明の核酸のアンチセンスストランドの導入が意図され る。 ウイルスをベースにした系は、様々な細胞に比較的高レベルの異種核酸を導入 することができるという利点を提供する。哺乳類細胞（例えば血管組織セグメン ト）にPTTG蛋白をエンコードしたPTTG核酸を導入するのに適切なウイルスベクタ ーは、当該分野でよく知られている。これらのウイルスベクターは、例えば、単 純ヘルペスウイルスベクター（例えば、Geller et al.,1988,Science,241:1667- 1669)、痘瘡ウイルスベクター(例えばPiccini et al.,1987,Meth.in Enzymology ,153:545-563;サイトメガロウイルスベクター(Mocarski et al.,in Viral Vecto rs,Y.Gluzman and S.H.Hughes,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri ng Harbor,N.Y., 1988,pp.78-84)、Moloneyマウス白血病ウイルスベクター(Danos et al.,1980,PN AS,USA,85:6469)、アデノウイルスベクター(e.g.,Logan et al.,1984,PNAS,USA, 81:3655-3659;Jones et al.,1979,Cell,17:683-689;Berkner,1988,Biotechnique s,6:616-626;Cotten et al.,1992,PNAS,USA,89:6094-6098;Graham et al.,1991, Meth.Mol Biol.,7:109-127)、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベ クター、等を含む。例えば、米国特許明細書第4,405,712号及び第4,650,764号参 照。特に好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス及びレトロウイルスベク ターである。 例えば、本発明の一つの実施態様において、アデノウイルスートランスフェリ ン／ポリリシン−DNA(TfAdpl-DNA)ベクター複合体(Wagner et al.,1992,PNAS,US A,89:6099-6103;Curiel et al.,1992,Hum.Gene Therapy,3:147-154;Gao et al., 1993,Hum.Gene Ther.,4:14-24)は、哺乳類細胞に異種性PTTG核酸を形質導入する のに用いられる。本明細書に記載されるいずれのプラスミド発現ベクターも、Tf Adpl-DNA複合体中で用いることができる。 本明細書において、“レトロウイルスベクター”とは、２つのレトロウイルス LTR間に位置する異種遺伝子をエンコードする発現カセットを有する、よく知ら れた遺伝子移送プラスミドを示す。レトロウイルスベクターは、典型的には、レ トロウイルスベクター又はレトロウイルスベクターをテンプレートとして用いて 転写されたRNAを、適切なパッケージング細胞系中のウイルスビリオン中にパッ ケージできるよう にする適切なパッケージングシグナルを含む(米国特許明細書第4,650,764号参照 )。 本発明において使用するための適切なレトロウイルスベクターは、例えば、米 国特許明細書第5,252,479、並びにWIPO刊行物WO92/07573、WO90/06997、WO89053 45、WO92/05266及びWO92/14829に記載され、これらは参照により本願に組み込ま れる。これらは、このようなレトロウイルスベクターを用いて、核酸をヒト細胞 に効率的に導入する方法の記載を提供する。他のレトロウイルスベクターは、例 えば、マウス乳腫瘍ウイルスベクター（例えば、Shackleford et al.,1988,PNAS ,USA,85:9655-9659)等を含む。 本発明のさらに他の実施態様では、本発明のPTTGポリペプチドに対し特異的反 応性を有する抗PTTG抗体が提供される。抗体の活性フラグメントは、“抗体”の 定義に含まれる。本発明の抗体は、本発明のPTTGポリペプチド、蛋白又はその一 部を抗原として用いて、当該分野で知られた方法で製造することができる。例え ば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor La boratory(1988))等に記載される通り、当該分野で良く知られた方法によりポリ クローナル及びモノクローナル抗体を製造することができる。これは参照により 本願に組み込まれる。本発明のPTSGポリペプチドは、このような抗体の生成にお いて抗原として利用することができる。又は、合成ペプチドを調製し（商業的に 入手可能な合成器を用いて)、抗原として用いることができる。アミノ酸配列は 、当該分野でよく知られた方法 により分析することができ、それらが対応するポリペプチドの疎水性又は親水性 ドメインをエンコードしているかどうかを決定することができる。当該分野で良 く知られた方法により、変更した抗体、例えばキメラ、ヒト化(humanized)、CDR -グラフト化又は二官能の抗体を製造することもできる。このような抗体は、例 えば上記Sambrook、及び上記Harlow and Lane等に記載される、ハイブリドーマ 、化学合成又は組み換え法により製造することもできる。抗ペプチド及び抗融合 蛋白抗体の両方を用いることができる(例えば、Bahouth et al.,Trends Parmaco l.Sci.12:338(1991);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Son,NY(1989)参照。これらは参照により本願に組み込まれる) 。 そのように製造された抗体は、とりわけ、哺乳類好ましくはヒトの身体の試料 、例えば組織又は血管流体中に存在するPTTG蛋白のレベルを検出するための診断 の方法及び装置に用いることができる。このような抗体はまた、本発明のPTTG蛋 白の免疫親和性又は親和性クロマトグラフィー精製のために用いることもできる 。さらに、細胞の表面又は細胞内（例えば核内）のいずれかのPTTGポリペプチド の存在を検出する方法が本発明で意図される。これらの方法は、細胞を、細胞の 抗体への結合を許容する条件下で、PTTGポリペプチドと特異的に結合する抗体と 接触させ、PTTGと結合した抗体の存在を検出し、それにより細胞の表面又は細胞 内の、本発明のポリペプチドを検出する工程を含む。そのようなポリペ プチドの検出に関して、抗体はin vitro診断又はin vivo画像法のために用いる ことができる。 試料中の標的PTTGポリペプチドのin vitro検出に有用な免疫学的手法は、検出 可能な抗体を用いるイムノアッセイを含む。このようなイムノアッセイは、例え ば、ELISA、Pandex微量蛍光計量(microfluorimetric)アッセイ、凝集アッセイ、 フローサイトメトリー、血清診断アッセイ及び免疫組織化学的染色手法を含み、 これらは当該分野で良く知られている。抗体は、当該分野においてよく知られた 様々な手段により検出可能とすることができる。例えば、検出可能なマーカーは 、抗体に直接的に又は間接的に取り付けることができる。有用なマーカーは、例 えば、放射核種、酵素、蛍光源、色源体及び化学発光ラベルを含む。 本発明の抗PTTG抗体は、生きた動物において、ヒトにおいて、又はそれらから 単離された生物学的組織若しくは流体においてPTTGポリペプチドの活性を調節す る。従って、担体、及び天然に発生するリガンド又は他のPTTG結合蛋白が本発明 のPTTGポリペプチドに結合するのを遮断するのに効果的な量の、PTTGポリペプチ ドに対する特異性を有する抗体を含む組成物も意図される。例えば、細胞の表面 に存在し、配列番号No.2、配列番号No.4に示されるアミノ酸配列及びそれらのフ ラグメントを含むPTTGポリペプチドの細胞表面エピトーフのアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を有するPTTGポリペプチド分子のエピトーフに対するモ ノクローナル抗体を、この目的に用いることができる。 本発明は、PTTGポリペプチドをエンコードする外因性核酸を発現することがで きるトランスジェニック非ヒト哺乳類を、さらに提供する。本明細書において、 “外因性核酸”の句は、ホストに生来あるものではない、又は生来の環境以外で ホストに存在する（例えば、遺伝子工学的なDNA構成の部分として）核酸配列を 示す。PTTGの天然生成レベルに加え、本発明のPTTG蛋白は、トランスジェニック 哺乳類において、過剰発現され(overexpressed)、過小発現され(underexpressed )又は周知のノックアウトトランスジェニック(knoch-out transgenics)のように 不活性な変異形態に発現されることができる。 正常活性を発現できないよう、即ち天然PTTGを発現しないよう変性されたPTTG ポリペプチドをエンコードする核酸を発現しうるトランスジェニック非ヒト哺乳 類もまた提供される。本発明はまた、PTTGポリペプチドをエンコードする核酸と 相補的なアンチセンス核酸を含み、PTTGポリペプチドをエンコードするmRNAと相 補的なアンチセンスmRNAに転写され、mRNAとハイブリダイズしそれによりその翻 訳を減少させるよう配置されたゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳類 を提供する。この核酸は、さらに、誘発可能なプロモーター及び／又は組織特異 的調節要素を含むことができ、発現を誘発したり、又は特定の細胞タイプに制限 することができる。核酸の例は、配列番号No.1に示されるコード配列と実質的に 同一のコード配列を有するDNA又はcDNAである。非ヒトトランスジェニック哺乳 類の例は、ト ランスジェニックマウスである。 PTTGポリペプチドの生理的及び行動的役割を説明する動物モデル系もまた提供 され、トランスジェニック動物を創生することにより製造される。当該トランス ジェニック動物中では、PTTGポリペプチドの発現は、様々な技術を用いて変更さ れる。そのような技術の例は、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染 又は当業者によく知られた他の手段により、PTTGポリペプチドをエンコードする 正常又は変異バージョンの核酸を、適切な受精胚へ挿入し、トランスジェニック 動物を製造することを含む。(例えば、Hogan et al.,Manipulating the Mouse E mbryo:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,(1986)を参照)。 トランスジェニック動物において、生来の遺伝子座を伴う、変異又は正常バー ジョンのPTTG遺伝子の相同的な組み換え体を使用し、発現の調節又はPTTGポリペ プチドの構造を変更させることも本発明で意図される（Capecchi et al.,Scienc e 244:1288(1989);Zimmer et al.,Nature 338:150(1989)参照；これらは参照に より本願に組み込まれる）相同的な組換え技術は当該分野でよく知られている。 相同的な組換え体は、生来の（内因性の）遺伝子を組換え体又は変異遺伝子と置 き換え、生来の（内因性の）蛋白を発現できないが、例えば変異蛋白を発現でき 変更されたPTTGポリペプチドの発現をもたらす動物を産生する。 相同的組換えとは対照的に、マイクロインジェクションは、ホスト遺伝子を除 くことなく、ホストゲノムに遺伝子を添加 する。マイクロインジェクションは、内因性及び外因性のPTTG蛋白の両方を発現 することができるトランスジェニック動物を産生しうる。誘発性プロモーターは 、核酸のコード領域とリンクすることができ、トランス遺伝子の発現を調節する 手段を提供する。組織特異的調節要素をコード領域とリンクさせ、トランス遺伝 子の組織特異的発現をさせることができる。トランスジェニック動物モデル系は 、特異的リガンド、例えば蛋白応答を活性化又は阻害するアゴニスト及びアンタ ゴニストを識別するための、化合物のin vivoスクリーニングに有用である。 本発明の核酸、オリゴヌクレオチド(アンチセンスを含む)、それを含むベクタ ー、形質転換されたホスト細胞、ポリペプチド及びそれらの組み合わせ、並びに 本発明の抗体は、in vitroでの化合物のスクリーニングに用いることができ、化 合物が本発明のPTTGポリペプチドの有効なアゴニスト又はアンタゴニストとして の機能するかどうかを決定することができる。これらのin vitroスクリーニング アッセイは、本発明のPTTGポリペプチドの機能及び活性に関する情報を提供し、 ポリペプチド、ペプチド又は蛋白の１つ以上のタイプとの特異的相互作用をする ことができる化合物の識別及び設計を導く。 本発明のさらに他の実施態様では、PTTGポリペプチドに結合する化合物の識別 方法が提供される。本発明の蛋白は、競合結合アッセイに用いることができる。 このようなアッセイは、多数の化合物を迅速にスクリーニングし、もしあれば どの化合物がPTTG蛋白と結合できるかを決定することを許容する。続いて、結合 することが分かった化合物についてさらに詳細なアッセイを実行し、そのような 化合物が本発明の蛋白に対する調節剤、アゴニスト又はアンタゴニストとして作 用するかどうかをさらに決定することができる。 本発明のさらに他の実施態様では、本発明のPTTGポリペプチドの活性を調節す る化合物を識別するためのバイオアッセイが提供される。この方法によれば、本 発明のPTTGポリペプチドは、“未知の”即ちテスト物質と接触され(アンタゴニ スト活性がテストされる場合はリポーター遺伝子構造の存在下で)、“未知の” 即ちテスト物質との接触に続いてポリペプチドの活性がモニターされ、リポータ ー遺伝子構造の発現をもたらした物質がPTTGポリペプチドの機能的リガンドと識 別される。 本発明のさらに他の実施態様では、本発明のPTSGポリペプチドを組換え的に発 現する、形質転換されたホスト細胞を、テスト化合物と接触させ、テスト化合物 の存在下及び非存在下におけるPTTG媒介応答（例えばリポーター遺伝子発現を介 して）を比較することにより、又は化合物の存在下でテスト細胞又はコントロー ル細胞（即ちPTTGポリペプチドを発現しない細胞）の応答を比較することにより 、その調節効果を評価することができる。 本明細書において、本発明のPTTGポリペプチドの“活性を調節する”化合物又 はシグナルとは、PTTGポリペプチドの活性を変化させ、それにより本発明のPTTG ポリペプチド の活性が化合物又はシグナルの非存在下に比べて化合物又はシグナルの存在下で 異なってくるようになる化合物又はシグナルを示す。特に、そのような化合物又 はシグナルは、アゴニスト及びアンタゴニストを含む。アゴニストは、PTTG蛋白 機能を活性化させる化合物又はシグナルを包含する。また、アンタゴニストは、 PTTG蛋白機能と干渉する化合物又はシグナルを含む。典型的には、アンタゴニス トの効果はアゴニスト誘発蛋白活性化の遮断として観察される。アンタゴニスト は、競合的及び非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト（即ち競 合的ブロッカー）はアゴニスト結合に特異的な部位と又はその近くに相互作用す る。非競合的アンタゴニスト又はブロッカーは、アゴニスト相互作用部位以外の 部位と相互作用することにより、ポリペプチドの機能を不活化する。 当業者により理解される通り、PTTG活性を調節する化合物を識別するためのア ッセイ方法は、一般的に、対照に対する比較を必要とする。“対照”のタイプの 一つは、化合物に曝されたテスト細胞又はテスト培養物と実質的に同一に処理さ れた細胞又は培養物であるが、“対照”細胞又は培養物は化合物に曝されていな い点で区別されるものである。例えば、電圧固定電気生理学的手法を用いた方法 では、細胞を浴させる外部溶液を単に変化させることにより、化合物の存在下及 び非存在下で、同一の細胞がテストされる。他のタイプの“対照”細胞又は培養 物としては、トランスフェクションさせた細胞と同一であるが、“対照”細胞又 は培養物では生来の蛋白 を発現しない細胞又は培養物が挙げられる。従って、トランスフェクションされ た細胞の化合物に対する応答は、同一の化合物に対する“対照”細胞又は培養物 の応答（又はその欠如）と、同一の反応条件下で比較される。 本発明のさらに他の実施態様では、PTTGポリペプチドの活性化を、ポリペプチ ドを、有効量の少なくとも一つの上記バイオアッセイで識別された化合物と接触 させることにより調節することができる。 本発明のさらに他の実施態様では、治療学的な塊(例えば、内分泌性又は非内 分泌性腫瘍、じゅく状硬化斑等)を診断又は検出する方法であって、被験者の細 胞中において、転写された又は変異した、配列番号No.1を含む配列を検出するこ とを含む方法が提供される。 特定の態様において、ここに記載される本発明の診断方法は、生検標本におけ る悪性−良性腫瘍の差異的診断等に有用である。他の態様において、ここに記載 される本発明の診断方法は、腫瘍の挙動や治療に対する応答を予測するのにも有 用である。 本発明のさらに他の実施態様では、下垂体腫瘍を診断する方法であって、被験 者の下垂体由来細胞において、配列番号No.1を含む転写mRNA配列を検出すること を含む方法が提供される。 本発明のさらに他の実施態様では、適切なパッケージ材料中の少なくとも一つ の本発明の核酸を含み、好ましくはキットの形態である、診断システムが提供さ れる。診断核酸は、 本明細書に記載されるPTTGエンコード核酸に由来する。例えば、一つの実施態様 において、診断核酸は配列番号No.1に由来する。本発明の診断系は、腫瘍（例え ば下垂体等）又は疾患組織においてPTTGをエンコードする、ゲノムDNA又は転写 核酸（mRNA又はcDNA等）のいずれかにおいてPTTGをエンコードする核酸の存在又 は非存在をアッセイするのに有用である。意図される本発明の診断系は、よく知 られたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はRTPCR(逆転写PCR)の手法を利用すること ができる。 適切な診断系は、少なくとも一つの本発明の核酸、好ましくは２以上の本発明 の核酸を、少なくとも１のアッセイに十分な量の別々にパッケージされた化学試 薬として含む。パッケージされた試薬の使用の指示も、典型的には含まれる。当 業者は、ここに記載される本発明の方法の実施のために、本発明の核酸プローブ 及び／又はプライマーを適切な緩衝剤又は溶液と共にキットの形態に容易に組み 込むことができる。 本明細書で用いられるとおり、“パッケージ材料”という句は、本発明の核酸 プローブ又はプライマー等のキットの中身を収容するのに用いられる一つ以上の 物理的構造を示す。パッケージ材料は、よく知られた方法で構成され、好ましく は無菌で混入物のない環境を提供する。パッケージ材料は、本発明の核酸が、配 列番号No.1記載の核酸配列又はその変異物を含むPTTGをエンコードする特定の配 列を検出するのに用いることができ、それにより特定の病変（例えば下垂体腫瘍 新生等）の存在又は素因を診断することができることを示 すラベルを有する。さらに、パッケージ材料は、どのようにキット中の材料が特 定の配列の検出及び特定の病変の存在又は素因の診断の両方に用いられるかを示 す指示を含む。 診断系と関連して、本発明で用いられるパッケージ材料は、核酸−塩基診断系 で慣用的に用いられるものである。ここで用いられるとおり、“パッケージ”の 語は、ガラス、プラスチック、紙、ホイル等の固体のマトリクス又は材料であっ て、単離された本発明の核酸、オリゴヌクレオチド又はプライマーを固定された 境界内に保持することができるものを示す。従って、例えば、パッケージは、ミ リグラム量の意図される核酸、オリゴヌクレオチド又はプライマーを収容するの に用いられるガラスバイアル、又は意図されるマイクログラム量の意図される核 酸プローブが操作可能に固定されたマイクロタイタープレートウェルとすること ができる。 “使用のための指示”は、典型的には、試薬濃度又は少なくとも１つのアッセ イ方法パラメーター、例えば混合される試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物 の保持時間、温度、緩衝条件等を記載する明確な表現を含む。 ここに言及される全ての米国特許及び全ての文献は、それらの全体が、参照に より本願に組み込まれる。本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さら に詳細に説明される。 特に他に述べない限り、本発明は、例えばManiatis et al.,Molecular Clonin g:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Ha rbor,New York,USA(1982);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ed),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring H arbor,New York,USA(1989);Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology ,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986);又はMethod in Enzym ology:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152,S.L.Berger and A.R.K immerl Eds.,Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987)に記載されるとおり、 標準的な手順で行われた。 実施例 実施例１：PTTG cDNAの単離 下垂体の腫瘍新生に関与する分子的な機構を明らかにするため、下垂体腫瘍細 胞中で差異的に発現するmRNAを識別するために、差異ディスプレイ(differentia l display)PCRを用いた(例えば、Risinger et al.,1994,Molec.Carcinogenesis, 11:13-18;及びQu et al.,1996,Nature,380:243-247を参照)。GC及びGH₄下垂体腫 瘍細胞系(それぞれATCC #CCL-82及び#CCL-82.1)及び骨原性肉腫細胞系UM108(ATC C #CRL-1663)を、１０％胎仔ウシ血清で補ったDMEM中で育成した。正常なSpragu e-Dawleyラット下垂体を新たに切り出した。組織培養細胞及び下垂体組織から、 RNeasy（商標）キット(Qiagen)を用い、製造者の指示に従い、総RNAを抽出した 。RNA調製物中の微量のDNAの混入物を、DNase1(GenHunter Corporation)切断に より除いた。200ngの総RNAから、MMLV逆転写酵素(GenHunter Corporation)、及 び３種の固定化された(anchored)プライマー(GenHunter Corporation)のうちの いずれか１つを用いて、cDNAを合成した。生成したcDNAを、PCRディスプレイに 用いた。 PCRディスプレイに、３つの下流の固定化されたプライマーAAGCT_IIX(ＸはＡ、 Ｇ又はＣ)を、４０の上流の任意のプライマーと組み合わせて用いた。１２０の プライマーの対が、下垂体腫瘍対正常下垂体におけるmRNA発現をスクリーニング するのに用いられた。逆転写酵素反応から生じたcDNAの１０分の１が、AmpliTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)を用いて、１０ｍＭトリスｐＨ８．４、５０ｎ Ｍ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．００１％ゼラチン、２μＭ ｄＮＴ Ｐｓ、０．２μＭの各プライマー、及び１μｌ[35S]dATPを含む総体積２０μｌ 中で増幅された。PCRサイクルは、９４℃で３０秒間、４０℃で２分間及び７２ ℃で３０秒間の４０サイクルからなった。生成物を６％シーケンシングゲルで分 離し、乾燥したゲルをKodakフィルムで２４〜４８時間露出した。 現像後、下垂体腫瘍及び正常下垂体から増幅されたDNAフラグメントを比較し た。下垂体腫瘍に特徴的なバンドをゲルから切り取り、１００μｌの水中で煮沸 しグリコーゲン(GenHunter Corporation)の存在下エタノールで沈殿させること によりDNAを抽出した。DNAを、もとのプライマーの組及び同じ熱サイクル条件を 用い、但しdNTP濃度を２０μＭに増加させ、再増幅した。反応生成物を、１％ア ガロースゲル上で泳動させ、エチジウムブロマイドで染色した。バン ドをゲルから切りだし、溶出させ(Qiagen)、TAベクター(Invitrogen)にクローン 挿入し、sequenase(USB)でシーケンスした。上記PCRアッセイにおける１２０の プライマー対を用い、下垂体腫瘍細胞において差異的に発現したと見られる１１ のDNAバンドを識別した。これらのバンドは、PCR生成物をプローブとして用い、 ノーザンブロット分析によりさらに評価された。 ノーザンブロット分析のために、２０μｇの総RNAを１％アガロースゲル上で 分画し、ナイロン膜上にブロットし、Quickhyb溶液(Stratagene)を用い、ランダ ムにプライムされたプローブでハイブリダイズした。洗浄後、膜をKodakフィル ムに６〜７２時間露出した。ノーザンブロットアッセイの結果、下垂体腫瘍に特 異的なシグナルが、２つのバンドで検出された。DNA配列分析は、１つの配列が 、インスリン誘発成長応答蛋白と相同的であり、他の３９６の塩基対フラグメン ト（固定化されたプライマーとしての5'AAGCTTTTTTTTTTTG3'及び任意プライマー としての5'AAGCTTGCTGCTC3゛を用いて増幅された）がGenBank中の知られた配列 と何の相同性をも示さなかったことを明らかにした。この３９６ｂｐのフラグメ ントは、下垂体腫瘍細胞中で高度に発現された約１.３ｋｂのmRNAを検出したが 、正常下垂体及び骨原性肉腫細胞では検出しなかった。 実施例２：PTTG cDNAの特徴づけ この下垂体腫瘍特異的mRNAをさらに特徴付けるために、ラット下垂体腫瘍細胞 から単離されたmRNAを用いて、c DNAライブラリーを構成した。メッセンジャーRNA単離キット(Stratagene)を用い 製造者の指示に従って、ポリＡ＋RNAを、下垂体腫瘍GH₄細胞から単離し、ZAP Ex pressベクター(Stratagene)においてcDNAライブラリーを構成するのに用いた。c DNAライブラリを、ZAP Express(商標)cDNA合成及びGigapack III gold cloning kit(Stratagene)を用い、製造者の指示に従い構成した。ライブラリーを、３９ ６ｂｐ差異ディスプレイPCR産物(TAベクターにクローンされた)をプローブとし て用いてスクリーニングした。第三のスクリーニングの後、陽性クローンを、ヘ ルパーファージを用いたin vivo切りだしにより切り出した。得られた、挿入物 を含むpBK-CMVファージミド(phargemid)を、サザンブロッティング分析により識 別した。DNA挿入物中に、EXOIII/Mung bean nuclease deletion kit(Stratagen) を用い、製造者の指示に従い、一方向ネスト欠失(unidirectional nested delet ions)をつくった。挿入DNAの両方のストランドを、Sequenase(USB)でシーケンス した。 実施例１記載の３９６bpPCRフラグメントをプローブとして用い、９７４bpのc DNAクローンを単離し特徴付けた。このcDNAは、下垂体−腫瘍−形質転換遺伝子( PTTG)と命名された。PTTGの配列は、１９９アミノ酸(配列番号No.2)の読み取り 枠(openreading frame)を含む。予想される開始コドンの上流のイン−フレーム の停止コドンの存在は、PTTGが完全ORFを含むことを示す。核酸及び蛋白の配列 が、以下の表１において提供される。 表１：PTTG核酸及び蛋白配列 これは、実施例３に記載されるとおり、遺伝子産物のin vitro転写及びin vit ro翻訳の両方を示すことにより証明された。 実施例３：PTTGのin vitro転写及び翻訳 センス及びアンチセンスのPTTG mRNAを、T3及びT7RNAポリメラーゼ(Stratage ne)をそれぞれ用い、in vitro転写した。過剰のテンプレートを、DNaseＩ切断で 除いた。in vitro転写ｍRNAを、ウサギ網様体溶解物(rabbit reticular lysate; Stratagene)において翻訳した。反応は、３μl in vitro転写RNA、２μｌ³⁵Ｓ− メチオニン(Dupond)及び２０μｌ溶解物を含む総体積２５μｌ中で、３０℃で６ ０分間行った。翻訳産物を、SDS-PAGE（１５％分離ゲル及び５％スタッキングゲ ル）で分析し、Kodakフィルムで１６時間露出した。 結果は、in vitro転写PTTGセンスmRNAの翻訳はSDS−PAGE上で約２５KDの蛋白 となり、一方添加mRNAなし又はPTTGアンチセンスmRNAが使用された場合では何の 蛋白も生成されなかったことを示す。 実施例４：PTTG mRNAの発現 GenBank及び蛋白プロフィール分析（national center for Biotechnology Inf ormationのデータベースのBLASTプログラムサーチを用いた）のサーチは、PTTG が、知られた配列と何の相同性をも共有しないこと、及びそのエンコードされた 蛋白は高度に親水性であること、及びよく認識された機能的モチーフを何も含ま ないことを示した。PTTG mRNAの組織発現パターンを、ノーザンブロット分析に より研究した。 ラット複数組織ノーザンブロット(a rat multiple tissue Northern blot)を、C lontechより購入した。８つの異なるラット組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、 骨格筋、腎臓及び精巣）からの、レーン当たり約２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、変 性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜上に転写し 、ＵＶ架橋した(UV-cross linked)。膜は、まず全長PTTG cDNAプローブとハイ ブリダイズし、剥離し、ヒトβ-アクチンcDNAコントロールプローブと再ハイブ リダイズした。ハイブリダイゼーションは、ExpressHybハイブリダイゼーション 溶液(Clontech)中で、６０℃で１時間行った。２XSSC、０．０５％SDS中室温で １５分間２回、及び０．１％SSC、０．１％SDS中５０℃で１５分間２回洗浄した 。PTTGプローブの露出時間は２４時間で、アクチンプローブは２時間であった。 ノーザンアッセイの結果は、精巣が、下垂体腫瘍細胞以外では、PTTGmRNAを発 現する唯一の組織であること、及び精巣の発現レベルは下垂体腫瘍細胞（２０μ ｇ総RNA,6時間露出）よりずっと低い（２μｇポリA＋mRNA、２４時間露出）こと を示した。興味深いことに、精巣の転写体（約１Ｋｂ）は下垂体腫瘍の転写体（ 約１．３Ｋｂ）より短かった。このことは、ｍＲＮＡは精巣において差異的にス プライスされていること、及び１．３Ｋｂ転写体は下垂体腫瘍細胞に特異的であ ることを示している。 実施例５：NIH 3T3繊維芽細胞によるPTTGの過剰発現 PTTGmRNAが下垂体腫瘍細胞中で過剰発現(over- expressed)されるため、この蛋白が、細胞の増殖及び形質転換に影響を与えるか どうかを決定した。PTTGの全コード領域を含む真核性発現ベクターを、NIH ３T3 繊維芽細胞に安定にトランスフェクションした。 PTTGの全コード領域を、pBK-CMV真核発現ベクター(Stratagene)に、フレーム でクローンし(cloned in frame)、NIH 3T3細胞に、カルシウム沈殿によりトラ ンスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、1mg/ml G418を含む選択培地中に、１：１０で希釈し育成した。育成は、個々のクローン が単離される２週間行った。それぞれのコロニーからの細胞抽出物を調製し、１ ５％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、ナイロン膜にブロットした。エピ トーフとしてPTTGの最初の17のアミノ酸を用い(Research Genetics)、ポリクロ ーナル抗体を生成した。抗体を１：５０００に希釈し、上記の膜と室温で１時間 インキュベートした。洗浄後、膜をワサビダイコンペルオキシダーゼでラベルし た２次抗体と１時間室温でインキュベートした。ハイブリダイゼーションシグナ ルを、増強化学発光(ECL detection system,Amersham)で検出した。 PTTGの発現レベルを、上記の、前記蛋白の最初の１７アミノ酸に対しての、特 異的ポリクローナル抗体を用いてイムノブロット分析でモニターした。それぞれ のクローンの発現レベルは異なっており、より高いプロテインレベルを発現した クローンを、更なる分析に用いた。 実施例６：細胞増殖におけるPTTG発現の効果 非放射活性細胞増殖アッセイを、細胞増殖におけるPTTG蛋白の過剰発現の効果 を決定するのに用いた(例えば、Mosmann,T.,1983,J.Immunol.Meth.,65:55-63;及 びCarmichael et al.,1987,Cancer Res.,47:943-946を参照)。細胞増殖を、Cell Titer 96TM非放射活性細胞増殖アッセイキット(Promega)を用いて、製造者の指 示に従いアッセイした。５０００の細胞を、９６ウェルプレート(それぞれのア ッセイでそれぞれのクローンにつき６ウェル)に植え、３７℃で２４から７２時 間インキュベートした。各時点で、１５μｌの染色(Dye)溶液をそれぞれのウェ ルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。１００μｌの可溶化／ストッ プ溶液をそれぞれのウェルに添加した。１時間のインキュベートの後、ウェルの 中身を混ぜ、５９５nmの吸収をELISAリーダーを用いて記録した。５９５nmの吸 収は、それぞれのウェル中の細胞の数と直接的に相関する。 ３つの独立の実験が行われた。結果を図１に示す。図１において、細胞の成長 速度は５９５nMの吸収で表現される。エラーバーはSEMを示す(n=6)。結果（図１ ）は、PTTG蛋白を発現する3T3細胞の成長速度（テトラゾリウムからホルマザン への細胞変換によりアッセイされた）は、pCMVベクター単独を発現する3T3細胞 と比較して、２５〜５０％抑制されたことを示す。このことは、PTTG蛋白が、細 胞増殖を阻害することを示す。 実施例７：NIH 3T3細胞の形態学的な形質転換及び軟寒天成長のPTTG誘発 PTTG蛋白の形質転換特性を、単層培養において巣(foci)を形成する能力及び軟 寒天培地における足場独立成長性を示すことにより、下記表２の通り示した。 表２：PTTG cDNA構成体によりトランスフェクションされたNIH 3T3細胞による コロニー形成 始原性の(primary)下垂体細胞は複数の細胞タイプの混合物でありin vitroで は複製しないため、NIH 3T3細胞を用いた。軟寒天アッセイのために、６０ｍｍ 組織培養プレートを５ｍｌの軟寒天(２０％２XDMEM、５０％DMEM)１０％胎仔ウ シ血清、２０％２．５％寒天、４５℃で溶融し合わせた)でコートした。Schwab et al.,1985,Nature,316:160-162を参照。培地に懸濁した２ｍｌ細胞を、続いて ４ｍｌの寒天混合物と合わせ、この混合物１．５ｍｌをそれぞれのプレートに添 加した。細胞を、１０⁴細胞／皿の密度でプレートし、１４日間インキュベート してからコロニーの数を計数 し撮影した。 結果は、NIH 3T3親細胞及びpCMVベクターでトランスフェクションした3T3細 胞は軟寒天上でコロニーを形成しない一方、PTTGでトランスフェクションされた 3T3細胞は多量のコロニーを形成することを示す。さらに、PTTG蛋白過剰発現細 胞においては巣の形質転換が観察されるが、PTTG挿入物のないpCMV発現細胞は親 3T3細胞と同様の形態特性を示した。 実施例８：in vivoPTTG腫瘍新生性の決定 PTTGがin vivoで腫瘍新生性であるかどうかを決定するため、PTTGでトランス フェクションされた3T3細胞を、無胸腺ヌードマウスに皮下的に注射した。PTTG 又はpCMVベクター単独トランスフェクション細胞の３Ｘ１０⁵細胞を、PBSに再懸 濁し、ヌードマウスに皮下的に注射した(各群５匹)。第３週の終わりに腫瘍を動 物から切りだし計量した。すべての注射された動物は、３週間以内に大きな腫瘍 （１−３グラム）を形成した。結果を下記表３に示す。ベクターのみでトランス フェクションされた細胞を注射したマウスは、どれも腫瘍を形成しなかった。 表３：PTTG cDNA発現ベクターでトランスフェクションされたNIH 3T3細胞によ るin vivo腫瘍新生性 これらの結果は、PTTGがin vivo形質転換能力がある遺伝子であることを明ら かに示す。 実施例９：ヒト癌細胞系はPTTGを発現する 複数ヒト癌細胞系ノーザンブロット(Clontech)を用い、様々なヒト細胞系にお けるPTTGの発現を研究した。テストした特定の細胞系を下記表４に示す。 表４：テストされたヒト癌細胞系 上記表１に示された８つの各細胞系からの約２μｇのポリＡ RNAを、変性ホ ルムアルデヒド１．２％アガロースゲルの各レーンに置き、変性ゲル電気泳動に より分離して無傷(intact)であることを確認し、ノーザンブロッティングにより 荷電修飾(charge-modified)ナイロン膜に転写し、UV照射により固定した。レー ン１〜８はそれぞれ、前骨髄球白血病HL-60、HeLa細胞S3、ヒト慢性ミエローマ 性白血病K-562、リンパ芽球性白血病MOLT−４、バーキットリンパ腫Raji、結腸 直腸性アデノカルシノーマＳＷ４８０、肺癌Ａ５４９及びメラノーマＧ３６１か らのRNAを含んでいた。９．５、 ７．５、４．４、２．４、及び１．３５ｋｂのRNAサイズマーカーの線を、ブロ ットの左マージン上にインクで示し、サイズ決めの標準として用い、方向を提供 するために膜の左下手隅からノッチを切り取った。放射標識されたヒトβアクチ ンcDNAを、ポリＡ RNAの異なるバッチをあわせるためのコントロールプローブ として用いた。スポットされた全てのレーンの２．０ｋｂの単一のコントロール バンドは確証的なものである。 ブロットは、全長ラットPTTG cDNAプローブ（配列番号No.1、９７４ｂｐ）で 、６０℃で１時間、Sambrook et al．に記載されたExpressHybハイブリダイゼー ション溶液(Clontech)中でプローブされた。この文献の関連するセクションは、 参照により本願に組み込まれる。Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Labora tory Manual,2nd Ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbo r,N.Y.(1989)参照。ブロットを、続いて２回１５分間室温で２XSSC、０．０５％ SDS中で、そして２回１５分間５０℃で０．１％SSC、０．１％SDS中で洗浄した 。実験手順の他のより詳細な記載は、Pei & Melmedに見ることができる。これの 関連するセクションは参照により本願に組み込まれる。Pei & Melmed,Endocrino logy 4:433-441(1997)参照。 上記の通りノーザンブロット分析によりテストされた、とりわけリンパ腫、白 血病、メラノーマ及び肺癌を含む全ての細胞は、ヒトPTTGを発現することが証明 された。 実施例１０：ヒトPTTG cDNAのクローニング ヒト胎児肝臓cDNAライブラリー(Clontech,Palo Alto,CA)を、放射活性ラベル された全ラットPTTGコード領域のcDNAフラグメントをプローブとして用いてMani atis et al．により記載される通りスクリーニングした。Maniatis et al,Molec ular cloning,Cold Spring Harbor Press,1989参照。陽性クローンからのcDNA挿 入物は、プラスミドpBluescript-SK(Stratagene,La Jolla,CA)にサブクローンさ れ、Sequenaseキット(U.S.Biochemical Corp.,Cleaveland,OH)を用いた配列分析 に供された。核酸配列を、下記表５に提供する。 表５：PTTG核酸配列 ６０６ｂｐの読み取り枠に下線が施されている。 ６０６ｂｐを含む完全な読み取り枠が陽性クローン中に見出された。読み取り 枠の核酸配列とラットPTTG又はPTTG（古い命名）のコード領域との相同性は８５ ％である。導かれるアミノ酸配列を、下記表６に示す。 表６：PTTGアミノ酸配列 この読み取り枠のヒトPTTG翻訳産物のアミノ酸配列と、ラットPTTG蛋白のそれと の比較は、７７％の同一性と８９％の相同性を明らかにした。これらのクローン から得られたcDNAは、ラットPTTGのヒト相同性を表わす。より高い相同性を有す るcDNAフラグメントは、ライブラリからは検出されなかった。 実施例１１：ヒトPTTG mRNAの組織分布 総RNAを、Trizol試薬（Gibco-BRL,Gaithersburg,MD）を用いて、正常ヒト下垂 体腺(Zoion Research Inc.Worcester,MA)及び外科手術で回収され液体窒素で凍 結された新たなヒト下垂体腫瘍から調製した。２０ｍｇの総RNAを、１％アガロ ースゲル電気泳動に用いた。正常成人及び胎児組織からの、ならびに悪性腫瘍細 胞系からのRNAブロット(Clontech,Palo Alto,CA)を、放射活性ラベルされた、完 全コード領域 を含むヒトcDNAフラグメントとハイブリダイズさせた。各細胞系から単離された RNAをナイロン膜(Amersham,Arlington Heights,IL)に転写し、放射活性ラベルさ れたプローブと、５５℃で一晩、６ｘSSC、２ｘDenhardt溶液、０．２５％SDS中 でハイブリダイズした。膜を２回室温で１５分間ずつ、および続いて２０分間６ ０℃で０．５ｘSSC、０．１％SDSで洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。 オートらジオグラフィーは、Kodak BIOMEX-MRフィルム(Eastman Kodak,Rocheste r,NY)を用いて、増感スクリーンで行った。ブロットを、２０分間蒸留水中９５ ℃で洗浄することにより剥がし、さらなるプロービングに用いた。 ノーザンブロット分析の結果は、PTTGはヒト胎児組織の肝臓で発現されるが、 脳、肺及び腎臓では発現されないことを示した。さらに、PTTGは正常ヒト成人組 織では、精巣で強力に発現され、胸腺で中程度に発現され、結腸及び小腸で弱く 発現される。脳、心臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、胎盤、腎臓及びすい臓において は、ノーザン分析によっては何の発現も検出されなかった。 いくつかのヒト癌細胞系中のPTTG発現も、ノーザンブロットにより分析された 。試験された全ての癌細胞において、PTTGは高度に発現することが見出された。 テストされたヒト腫瘍細胞系は、下記表７に示される。 表７：テストされたヒト腫瘍細胞系 前骨髄球白血病HL-60 上皮様細胞癌HeLa細胞S3 ヒト慢性ミエローマ性白血病K-562 リンパ芽球性白血病MOLT−４ バーキットリンパ腫Raji 結腸直腸性アデノカルシノーマSW４８０ 肺癌A５４９ メラノーマG３６１ 肝細胞癌Hep３Ｂ 甲状腺癌TC-1 乳腺癌MCF−７ 骨原性肉腫U2OS 胎盤絨毛癌JAR 絨毛癌JEG−３ 実施例１２：正常下垂体及び下垂体腫瘍におけるヒトPTTG発現 RT-PCRを以下の通り行った。５μｇの総RNAを、RNaseを含まない１００ＵのDN ase Ｉで、室温で１５分間処理した。DnaseIを、６５℃で15分間インキュベー トすることにより不活化した。続いて、試料を、oligo-dTプライマー及びSuperS cript II逆転写酵素（Gibco-BRL,Gaithersburg,MD）を用いて、逆転写に用いた 。逆転写の後、試料を、PCR SuperMIX(Gibco-BRL,Galthersburg,MD)で、hPTTG特 異プライマー及びヒトサイクロフィリンＡ特異的プライマーを内部標準として用 いたPCR増幅に供した。 ノーザンブロット分析は、PTTGの発現のレベルが正常下 垂体及び下垂体腫瘍で非常に低いことを示した。従って、比較RT-PCRを、正常下 垂体及び下垂体腫瘍におけるPTTGの発現を定量的に研究するのに用いた。この研 究の結果は、非機能性腫瘍、GH分泌腫瘍及びプロラクチノーマを含む試験された 多くの下垂体腫瘍において、PTTGの発現レベルは正常下垂体のそれより高いこと を示した。 実施例１３：ヒトPTTGの、NIH 3T3細胞への、安定なトランスフェクション hPTTG cDNAの完全なコード領域を、哺乳類発現ベクターpBK-CMV(Stratagene, La Jolla,CA)の読み取り枠にサブクローンし、NIH 3T3繊維芽細胞に、Lipofect amine(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)で、製造者のプロトコルに従ってトランスフ ェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を連続希釈し、１ｍ ｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む選択培地中で２週間生育した。それぞれのクローンを 単離し、選択培地中で維持した。総RNAをhPTTGトランスフェクションした細胞系 から、並びにブランクのpBK-CMVがトランスフェクションされたコントロール細 胞から単離した。トランスフェクションされた細胞系におけるhPTTGの過剰発現 を確認するために、ノーザンブロットを行った。これらの細胞系を、続く細胞増 殖アッセイならびにin vitro及びin vivo形質転換アッセイに用いた。 実施例１４：細胞増殖アッセイ CellTiter９６非放射活性細胞増殖アッセイキット (Promega Medicine,WI)を用いて、製造者のプロトコルに従 って、細胞増殖アッセイを行った。5000の細胞を、９６ウェルプレートに植え、 ３７℃で２４−７２時間インキュベートした。各アッセイにおいて各クローンに ついて８つのウェルを用いた。それぞれの時点で、１５μｌの染色溶液をそれぞ れのウェルに添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベー ション後、１００μｌの可溶化／ストップ溶液を各ウェルに添加し、プレートを 一晩室温でインキュベートした。吸収を５９５ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリー ダーで決定した。 対照及びｈＰＴＴＧ過剰発現ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、このアッセイを行うのに 用いた。結果は、PTTG発現ベクターでトランスフェクションされた細胞の成長は 、ブランクベクターでトランスフェクションされた細胞と比較して30〜45％抑制 されたことを示した。これらの結果は、PTTG蛋白は、細胞増殖を阻害することを 明らかに示す。 実施例１５：in vitro及びin vivo形質転換アッセイ in vitro形質転換アッセイ 対照及びhPTTG形質転換細胞を、軟寒天中の足場独立成長性について試験した 。３ｍｌの軟寒天(２０％の２ＸDMEM、５０％のDMEM、１０％の胎仔ウシ血清、 及び２０％の２．５％寒天、４５℃で融解及び混合)を、３５ｍｍの組織皿に添 加した。10,000細胞を１ｍｌ軟寒天と混合しそれぞれの皿に添加し、コロニーが 計測できるようになるまで２週間インキュベートし、撮影した。 (b)in vivo形質転換アッセイ ブランクのベクター又はhPTTG発現細胞を含む５ｘ１０⁵細胞をヌードマウスに 注射した。注射２週間後にマウスを屠殺し、注射部位近くに形成された腫瘍を調 べた。 PTTG発現ベクターで安定にトランスフェクションされたNIH 3T3細胞を足場独 立性成長アッセイでテストした場合は、これらの細胞は、軟寒天上で、多量のコ ロニー形成を起こした。このことは、PTTG蛋白の形質転換能を示唆している。 NIH 3T3細胞をヌードマウスに注射した場合、それらは注射後２週間以内でin vivo腫瘍形成を起こした。これらのデータは、ヒトPTTGは、そのラット相同体と 同様、形質転換遺伝子としての効力を有することを示している。 配列の要約 配列番号No.1は、本発明のラットPTTG蛋白をエンコードするcDNAの核酸配列（ 及び導かれるアミノ酸配列）である。 配列番号No.2は、導かれた本発明のラットPTTG蛋白のアミノ酸配列である。 配列番号No.3は、本発明のヒトPTTG蛋白をエンコードするcDNAの核酸配列であ る。 配列番号No.4は、導かれた本発明のヒトPTTG蛋白のアミノ酸配列である。 本発明は、そのいくつかの好ましい実施態様を参照して詳細に説明されたが、 提供された実施態様及び例示的開示に対する修飾及び変更が、この特許において 記載及び請求される 通り本発明の精神及び範囲に入ることが理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年３月９日（１９９９．３．９） 【補正内容】 請求の範囲 １．下垂体腫瘍形成を促進し、下垂体細胞増殖を抑制するアミノ酸配列を含む単 離された純粋なポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、配列番号Ｎｏ．１及 び配列番号Ｎｏ．３からなる群より選択されるポリヌクレオチドのコード領域に よってエンコードされる、ポリペプチド。 ２．配列番号Ｎｏ．２、配列番号Ｎｏ．４からなる群より選択される配列を含む 、請求項１に記載のポリペプチド。 ３．配列番号No.1のコード領域によりエンコードされたアミノ酸配列を含む請求 項１記載のポリペプチド。 ４．配列番号No.3のコード配列によりエンコードされたアミノ酸配列を含む請求 項２記載のポリペプチド。 ５．配列番号No.2を含む請求項２記載のポリペプチド。 ６．配列番号No.4を含む請求項２記載のポリペプチド。 ７．哺乳類起源である、請求項１記載のポリペプチド。 ８．ヒト、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヒト及びウシ起源のポリペプ チドからなる群より選択される請求項７記載のポリペプチド。 ９．請求項１記載のポリペプチド及び担体を含む組成物。 10．（ａ）請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをエンコードする核酸からな る群より選択される核酸、 （ｂ）その対立遺伝子配列、及び （ｃ）４２℃で５０％ホルムアミド、５×Denhart溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２ ％ＳＤＳでハイブリダイズし、次いで６５℃で０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤ Ｓで洗浄するのに等しい、中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）の核酸 にハイブリダイズするアンチセンス核酸、 からなる群より選択される核酸を含む単離された純粋なポリヌクレオチド。 11．配列番号Ｎｏ．２又は配列番号Ｎｏ．４をエンコードする核酸を含む、請求 項１０に記載のポリヌクレオチド。 12．配列番号Ｎｏ．２をエンコードする核酸を含む、請求項１０に記載のポリヌ クレオチド。 13．配列番号Ｎｏ．４をエンコードする核酸を含む、請求項１０に記載のポリヌ クレオチド。 14．配列番号Ｎｏ．１及びＮｏ．３のコード領域にハイブリダイズする核酸から なる群より選択される核酸を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。 15．高度にストリンジェントな条件下で配列番号Ｎｏ．１のコード領域にハイブ リダイズし、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成す る核酸を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。 16．高度にストリンジェントな条件下で配列番号Ｎｏ．３のコード領域にハイブ リダイズし、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成す る核酸を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。 17．RNAである、請求項１０記載のポリヌクレオチド。 18．DNAである、請求項１０記載のポリヌクレオチド。 19．請求項１０記載のポリヌクレオチド及び担体を含む組成物。 20．請求項１０記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 21．請求項２０記載のベクター及び担体を含む組成物。 22．請求項２０記載のベクターを担持するホスト細胞。 23．請求項２２記載のホスト細胞及び担体を含む組成物。 24．検出可能なラベル又はマーカーをさらに含む、請求項１０記載 のアンチセンスポリヌクレオチド。 25．６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成するストリ ンジェントな条件下でｍＲＮＡにハイブリダイズする、請求項１０記載のアンチ センスポリヌクレオチド。 26．請求項２５記載のアンチセンスポリヌクレオチド及び担体を含む組成物。 27．請求項２５記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つ、及びPTTGエンコード ＤＮＡの検出におけるそのラベリング及びその使用のための指示を含むPTTG診断 キット。 28．PTTGポリペプチドの製造方法であって、 発現培地内で、有効な発現条件下で、請求項２２記載のホスト細胞を培養し、 PTTG蛋白を発現させ、培地内で蓄積させ、 PTTG蛋白を含む培地を細胞から分離する 工程を含む方法。 29．PTTG蛋白を、培地及び他の残りの成分から分離する工程をさらに含む請求項 ３８記載の方法。 30．請求項１記載のポリペプチドと選択的に結合する、単離された抗PTTG抗体。 31．モノクローナル抗体である、請求項３０記載の抗体。 32．ポリクローナル抗体である、請求項３０記載の抗体。 33．請求項３０記載の抗体及び担体を含む組成物。 34．ヒトPTTG遺伝子の発現を阻害するのに有効な量のアンチセンスポリヌクレオ チド、及び細胞膜を通過する、薬剤学的に許容し得る疎水性の担体を含む請求項 ２６記載の組成物。 35．配列番号No.2及び配列番号No.4からなる群より選択されるアミノ酸配列を発 現するポリヌクレオチドの少なくとも１つを担持する、非ヒトのトランスジェニ ック哺乳類。 36．請求項１０記載のポリヌクレオチドを担持する、非ヒトのトランスジェニッ ク哺乳類。 37．突然変異した配列番号Ｎｏ．２及び配列番号Ｎｏ．４からなる群より選択さ れる突然変異したアミノ酸配列を発現する突然変異ポリヌクレオチドを担持する 、請求項３５記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。 38．トランスジェニックマウスである、請求項３６記載の非ヒトのトランスジェ ニック哺乳類。 39．哺乳類PTTG核酸を識別する方法であって、 哺乳類試料の核酸を、０．０１８M NaCl中６５℃で安定なハイブリッドが形成 されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされた形態 の請求項２５記載のアンチセンスポリヌクレオチドと接触させ； 前記試料のハイブリダイズ核酸中のラベルの存在を検出し； 前記哺乳類試料の核酸中のラベルの存在において哺乳類の核酸の存在を識別す る 工程を含む方法。 40．哺乳類PTTG核酸を単離する方法であって、 請求項３９記載の方法；及び ラベルされたハイブリダイズ核酸を前記哺乳類試料からのラベルされていない 核酸から分離する工程 を含む方法。 41．試料中のヒトPTTGペプチドの存在を決定する方法であって、 ヒトの試料を請求項３０の抗体と接触させ、前記抗体と前記試料中に存在する PTTGペプチドとの複合体を形成させ； 抗体−PTTG複合体の存在を検出し； 前記試料中にPTTGペプチド−抗体複合体が存在していた場合、ヒトPTTGペプチ ドと決定する 工程を含む方法。 42．前記抗体が検出可能なラベルを担持し、前記検出する工程が、ラベルされて いない及びラベルされている抗体からのラベルされた複合体の分離の後に前記抗 体のラベルを検出することにより行われ る請求項４１記載の方法。 43．０．０１８M NaCl中６５℃で安定なハイブリッドが形成される高度にストリ ンジェントな条件下で、配列番号No.1及び配列番号No.3からなる群より選択され る核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単一ストランドのPTTG増 幅プライマー／プローブ。 44．PTTGの発現に関連する病理学的な塊を検出する方法であって、被験者の細胞 において、請求項１０記載のポリヌクレオチドに対応する配列の、転写された又 は変異の核酸を検出することを含む方法。 45．請求項３０記載の抗体；およびその使用のための指示を含むPTTG検出キット 。 46．前記抗体により選択的に結合される下垂体−腫瘍−形質転換遺伝子ポリペプ チドをさらに含む請求項４５記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 5/00 Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．精製され、単離された(isolated)下垂体−腫瘍−形質転換遺伝子(PTTG)ポリ ペプチドであって、下垂体腫瘍細胞により発現され、抗PTTG抗体に結合するポリ ペプチド。 ２．配列番号No.1の、配列番号No.3の、及び抗PTTG抗体に結合する５〜５０アミ ノ酸長であるそれらのフラグメントのコード領域によりエンコードされたアミノ 酸配列を含む請求項１記載のポリペプチド。 ３．配列番号No.1のコード領域によりエンコードされたアミノ酸配列を含む請求 項２記載のポリペプチド。 ４．配列番号No.1のヌクレオチド２９２〜８９９を含む請求項３記載のポリペプ チド。 ５．配列番号No.1のコード領域によりエンコードされたアミノ酸配列の、５〜５ ０アミノ酸長であるフラグメントを含む請求項２記載のポリペプチド。 ６．配列番号No.3のコード配列によりエンコードされたアミノ酸配列を含む請求 項２記載のポリペプチド。 ７．配列番号No.3のヌクレオチド２９２〜８９９によりエンコードされたアミノ 酸配列を含む請求項６記載のポリペプチド。 ８．配列番号No.3のコード領域によりエンコードされたアミノ酸配列の５〜５０ アミノ酸長フラグメントを含む請求項６記載のポリペプチド。 ９．配列番号No.2、配列番号No.4及び抗PTTG抗体に結合 する５〜５０アミノ酸長であるそれらのフラグメントからなる群より選択される アミノ酸配列を含む請求項２記載のポリペプチド。 １０．配列番号No.2を含む請求項９記載のポリペプチド。 １１．配列番号No.4を含む請求項９記載のポリペプチド。 １２．抗PTTG抗体に結合する５〜５０アミノ酸長である、配列番号No.2のフラグ メントを含む請求項９記載のポリペプチド。 １３．抗PTTG抗体に結合する５〜５０アミノ酸長である、配列番号No.4のフラグ メントを含む請求項９記載のポリペプチド。 １４．哺乳類起源である、請求項１記載のポリペプチド。 １５．請求項１４記載のポリペプチドであって、その起源がヒト、ラット、マウ ス、ブタ、ヒツジ、イヌ、ヒト及びウシ起源からなる群より選択される請求項１ ４記載のポリペプチド。 １６．請求項１記載のポリペプチド及び担体を含む組成物。 １７．請求項１記載のポリペプチドをエンコードする核酸を含む、単離され、精 製されたポリヌクレオチド。 １８．配列番号No.1、配列番号No.3及び１０〜１５０ヌクレオチド長のそれらの フラグメントからなる群より選択される核酸を含む請求項１７記載のポリヌクレ オチド。 １９．(a)配列番号No.2、配列番号No.4及び抗PTTG抗体に結合する５〜５０アミ ノ酸長のそれらのフラグメントをエンコードするものからなる群より選択される 核酸； (b)それらのスプライス変異体(splice variant)； (c)それらのプローブ／プライマーフラグメント；及び (c)中程度に(moderate)ストリンジェントな(stringent)条件下で(a)の 核酸にハイブリダイズ(hybridize)する核酸 からなる群より選択される核酸を含む請求項１７記載のポリヌクレオチド 。 ２０．高度にストリンジェントな条件下で配列番号No.1のPTTGコード領域にハイ ブリダイズするものからなる群より選択される核酸を含む請求項１７記載のポリ ヌクレオチド。 ２１．配列番号No.1のPTTGコード領域の一部にハイブリダイズする１０〜１５０ ヌクレオチド長のフラグメントを含む請求項２０記載のポリヌクレオチド。 ２２．配列番号No.1のPTTGコード領域を含む請求項１９記載のポリヌクレオチド 。 ２３．配列番号No.3のPTTGコード領域を含む請求項１９記載のポリヌクレオチド 。 ２４．配列番号No.3の、１０〜１５０ヌクレオチド長のフラグメントを含む請求 項２３記載のポリヌクレオチド。 ２５．RNAである、請求項１７記載のポリヌクレオチド。 ２６．DNAである、請求項１７記載のポリヌクレオチド。 ２７．請求項１７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 ２８．請求項２７記載のベクター及び担体を含む組成物。 ２９．請求項１７記載のポリヌクレオチドを担持(carrying)するホスト細胞。 ３０．請求項２５記載のベクターを担持するホスト細胞。 ３１．請求項２９記載のホスト細胞および担体を含む組成物。 ３２．ストリンジェントな条件下で請求項１７に含まれる核酸とハイブリダイズ する、少なくとも１５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。 ３３．ストリンジェントな条件下で配列番号No.1とハイブリダイズする請求項３ ２記載のオリゴヌクレオチド。 ３４．ストリンジェントな条件下で配列番号No.3とハイブリダイズする請求項３ ２記載のオリゴヌクレオチド。 ３５．検出可能なラベル又はマーカーをさらに含む請求項３２記載のオリゴヌク レオチド。 ３６．RNAである、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。 ３７．DNAである、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。 ３８．ストリンジェントな条件下で、請求項１７に含まれる核酸に対応するmRNA にハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 ３９．請求項３８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び担体を含む組成物 。 ４０．請求項３２記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、及びPTTGエンコ ードDNAの検出におけるその使用のための指示を含むPTTG診断キット。 ４１．PTTGポリペプチドの製造方法であって、 発現培地内で、有効な発現条件下で、請求項３０記載 のホスト細胞を培養し、 PTTG蛋白を発現させ、培地内で蓄積(accumulate)させ、 PTTG蛋白を含む培地を細胞から分離する 工程を含む方法。 ４２．PTTG蛋白を、培地及び他の残りの成分から分離する工程をさらに含む請求 項４１記載の方法。 ４３．請求項１記載のポリペプチドと選択的に結合する、単離された抗PTTG抗体 。 ４４．モノクローナル抗体である、請求項４３記載の抗体。 ４５．ポリクローナル抗体である、請求項４３記載の抗体。 ４６．請求項４３記載の抗体及び担体を含む組成物。 ４７．ヒトPTTG遺伝子の発現を阻害するのに有効な量の請求項３２記載のアンチ センスオリゴヌクレオチド、及び細胞膜を通過する、薬剤学的に許容し得る疎水 性の担体を含む組成物。 ４８．PTTG蛋白を発現する非生来の(non-native)ポリヌクレオチドの少なくとも １つを担持する、非ヒトのトランスジェニック哺乳類。 ４９．請求項１７記載のポリヌクレオチドを担持する、請求項４８記載の非ヒト のトランスジェニック哺乳類。 ５０．非生来のPTTG蛋白を発現する、変異PTTGエンコード核酸を担持する、請求 項４８記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。 ５１．マウスである、請求項４８記載の非ヒトのトランスジ ェニック哺乳類。 ５２．哺乳類PTTG核酸を識別する方法であって、 哺乳類試料の核酸を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下 で、ラベルされた形態の請求項３２記載のオリゴヌクレオチドと接触させ； 前記試料のハイブリダイズ核酸中のラベルの存在を検出し； 前記哺乳類試料の核酸中のラベルの存在において哺乳類の核酸の存在を識 別する 工程を含む方法。 ５３．哺乳類PTTG核酸を単離する方法であって、 請求項５２記載の方法；及び ラベルされたハイブリダイズ核酸を前記哺乳類試料からのラベルされてい ない核酸から分離する工程 を含む方法。 ５４．試料中のヒトPTTGペプチドの存在を決定する方法であって、 ヒトの試料を請求項４３の抗体と接触させ、前記抗体と前記試料中に存在 するPTTGペプチドとの複合体を形成させ； 抗体−PTTG複合体の存在を検出し； 前記試料中にPTTGペプチド−抗体複合体が存在していた場合、ヒトPTTGペ プチドと決定する 工程を含む方法。 ５５．前記抗体が検出可能なラベルを担持し、前記検出する 工程が、ラベルされていない及びラベルされている抗体からのラベルされた複合 体の分離の後に前記抗体のラベルを検出することにより行われる請求項５４記載 の方法。 ５６．配列番号No.1、配列番号No.3及び１０〜１５０ヌクレオチド長であるそれ らのフラグメントからなる群より選択される核酸に対応する核酸配列を含む、単 一ストランドのPTTG増幅プライマー／プローブ。 ５７．PTTGの発現に関連する病理学的な塊(mass)を検出する方法であって、被験 者の細胞において、請求項１７記載のポリヌクレオチドに対応する配列の、転写 された又は変異の核酸を検出することを含む方法。 ５８．請求項４３記載の抗体；およびその使用のための指示を含むPTTG検出キッ ト。 ５９．前記抗体により選択的に結合される下垂体−腫瘍−形質転換遺伝子ポリペ プチドをさらに含む請求項５８記載のキット。