JP2002510207A - Hammerhead ribozymes with extended cleavage rules - Google Patents

Hammerhead ribozymes with extended cleavage rules

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Abstract

(57)【要約】 ＲＮＡ切断活性を持っている組成物、ならびにインビトロおよびインビボにおいてＲＮＡ基質を切断するためのそれらの使用が開示されている。組成物は活性中心(そのサブユニットはヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体から選択される)、ならびにＲＮＡ基質との特異的なハイブリダイゼーションの形成に寄与する隣接領域を含んでいる。好適な組成物は、ＲＮＡ基質と組み合わされてハンマーヘッド構造に似ている構造を形成する。開示された組成物の活性中心は、Ｃ16.1を持っているＲＮＡ基質の切断を可能にするＩ15.1の存在により特徴付けられる。 Abstract: Compositions having RNA cleaving activity and their use for cleaving RNA substrates in vitro and in vivo are disclosed. The composition includes an active center, the subunits of which are selected from nucleotides and / or nucleotide analogs, and flanking regions that contribute to the formation of specific hybridization with the RNA substrate. Preferred compositions combine with an RNA substrate to form a structure resembling a hammerhead structure. The active center of the disclosed composition is characterized by the presence of I 15.1 , which allows cleavage of the RNA substrate having C 16.1 .

Description

【発明の詳細な説明】 拡張された開裂ルールを有するハンマーヘッドリボザイム 発明の背景 本発明はＲＮＡ開裂活性を有する組成物の技術分野にある。 ハンマーヘッドリボザイムはある特定のＲＮＡ基質を認識して開裂することが できる触媒性ＲＮＡ分子の例である(Ｈｏｔｃｈｉｎｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３６２７(１９８６)；ＫｅｅｓｅとＳｙｍｏｎｓ，Ｖ ｉｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｉｄ−ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（Ｊ．Ｊ ．Ｓｅｍａｎｃｈｉｋ，ＣＲＣプレス、ボカレイトン、フロリダ、１９８７，１ 〜４７頁)。ハンマーヘッドリボザイムの触媒中心は３つのステムが側面に位置 し、近接したＲＮＡの配列領域又は多くのヌクレオチドによって互いに分離され た領域によって形成され得る。図１はそのような触媒活性のあるハンマーヘッド 構造の概略図を示す。ステムはＩ，ＩＩ及びＩＩＩと表示されている。ヌクレオ チドはハンマーヘッドリボザイムの標準的な命名法に準じて数えられる(Ｈｅｒ ｔｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３２５２(１９９２)) 。この命名法では、塩基は、開裂部位の５’側に関するその位置に関連する数に よって表記される。さらに、ステム又はループ領域に含まれる各塩基は、ステム 又はループ内部のその塩基の位置を定義する追加的な表記（小数点と別の数によ って表記される）を有する。Ｎ11.3という表記は、この塩基が対合領域に含まれ ていて、コア領域から離れたステムの第３番目の塩基であるということを示す。 ハンマーヘッド由来のリボザイムを記載するこの受け入れられた約定によれば、 酵素のコア部分に含まれているヌクレオチドが、他のすべてのヌクレオチドに関 連して、いつでも同一のナンバーを有するようになる。基質結合又はコア形成に 関わるステムのサイズは任意のサイズ及び任意の配列であり得るし、例えばＡ9 という位置は、他のコアヌクレオチドのすべてに関して同一であろう。例えば、 Ｎ＾12又はＮ9＾と表記されたヌクレオチドは、挿入されたヌクレオチドを表し 、数字に関する脱字呼号（＾）の位置はその挿入が指定されたヌクレオチドの前 か後かを示す。従って、Ｎ＾12は、ヌクレオチド１２位の前に挿入されたヌクレ オチ ドを表し、Ｎ9＾はヌクレオチド９位の後に挿入されたヌクレオチドを表す。 この触媒コア構造のコンセンサス配列は、ＲｕｆｆｎｅｒとＵｈｌｅｎｂｅｃ ｋ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６０２５〜６０２９(１９９ ０)）に記載されている。一方Ｐｅｒｒｉｍａｎら（Ｇｅｎｅ １１３：１５７ 〜１６３(１９９２)）は、この構造が変異（例えばＮ9＾及びＮ＾12のような天 然に存在するヌクレオチド挿入）をも含有し得ることを示した。従って、タバコ 輪紋（ｒｉｎｇ-ｓｐｏｔ）ウイルスのサテライトＲＮＡのポジティブ（＋）鎖 がこの２つのヌクレオチド挿入を１つも含有しないのに対し、ル−セールン・ト ランジェント・ストリーク（ｌｕｃｅｒｎｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔｒｅａ ｋ）ウイルスのウイルソイド（ｖＬＴＳＶ）は、活性を失うことなくＣ又はＧへ 突然変異し得るＮ9＾＝Ｕの挿入を含有する(ＳｈｅｌｄｏｎとＳｙｍｏｎｓ，Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５６７９〜５６８５(１９８９))。 さらに、この特殊なケースでは、Ｎ7＝Ａであり、Ｒ15.1＝Ａである。一方、カ ーネーション楼化病に関連するウイルソイド（−ＣａｒＳＶ）のマイナス鎖は、 Ｎ＾12＝Ａ及びＮ9＾＝Ｃという両方のヌクレオチド挿入を含有する点できわめ て珍しい(Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０ ：６３２３〜６３２９(１９９２))。このウイルソイドでは、Ｎ7＝Ａであり、Ｒ15.1 ＝Ａである。さらに、この特別なハンマーヘッド構造は、中心ステムがより 開いているにもかかわらず、大変有効な自己触媒開裂を示す。 ハンマーヘッドリボザイムの可能な使用は、例えば、ＲＮＡ制限酵素の産生及 び、例えば動物、ヒト又は植物の細胞及び原核生物、酵母及びマラリア原虫にお ける遺伝子発現の特異的な不活性化を包含する。格別な生物医学的関心は、多く の形態の腫瘍を包含する多くの疾患が特定遺伝子の過剰発現に関連しているとい う事実に基づいている。関連するｍＲＮＡを開裂してそのような遺伝子を不活性 化することは、そのような疾患を抑制し、最終的には治療するための可能な方法 を具現化する。さらに、抗ウイルス薬、抗菌薬及び抗真菌薬を開発することに対 する高いニーズがある。リボザイムがそのような抗感染症薬として潜在価値を有 するのは、微生物の生存に必須であるＲＮＡ分子を選択的に破壊し得るからであ る。 ハンマーヘッドベースリボザイムの薬剤としての使用における最大の障害の１ つは、通常のゲルラッハ（Ｇｅｒｌａｃｈ）設計では、及び前もって形成された 半ハンマーヘッド構造をターゲットにするときには、受容されるターゲットのア ベイラビリティが限定されていることである(ＷＯ９７／１８３１２を参照のこ と)。ハンマーヘッドリボザイムの基質は、基質結合のために正確なハイブリダ イズ配列を必要とすることに加えて、トリプレットＮ16.2Ｕ16.1Ｈ17（Ｎは任意 のヌクレオチド、Ｕはウリジン、Ｈはアデノシン、シチジン又はウリジンである ）を強く選好することが示されている(Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ．２２８，２２８〜２３０(１９８８)；Ｒｕｆｆｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ２９，１０６９５〜１０７０２(１９９０)；Ｐｅｒｒｉｍａｎら、Ｇｅ ｎｅ １１３：１５７〜１６３(１９９２))。この基質特異性の一般則を変更す ると、非機能的な基質が生じるという事実は、上記の必要条件から逸脱した基質 が提供されるときに形成される「非コア適合性」の構造が存在することを示唆す る。このことに関連した証拠がＵｈｌｅｎｂｅｃｋと共同研究者によって最近報 告された(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１１０８〜１１１４(１９９７))。 １７位のＧを置換すると、Ｇ17とＣ3間に機能的に致命的な塩基対が形成され、 開裂のための切れやすい（ｓｃｉｓｓｉｌｅ）結合の正確な配向性とＣ3の相互 作用に必要な三次構造の形成が妨害されることを実証したのである(Ｍｕｒｒａ ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１：４８７〜４９４(１９９５))。同様の理由 で１６．１位のＵに対する強い選好性が存在し得る。１６．１位のＵ要求性を効 率的に軽減し得るリボザイムを単離することを試みた多くの実験がなされてきた が、１６．１位にＵ以外の塩基を有する基質を開裂し得るハンマーヘッド型リボ ザイムを見出そうとする試みは、不可能であることが証明された(Ｐｅｒｒｉｍ ａｎら、Ｇｅｎｅ １１３：１５７〜１６３(１９９２))。 開裂領域における要求性が減少又は変更した効率的な触媒分子が強く所望され るのは、それらが単離されればこのタイプの分子が開裂し得る利用可能なターゲ ット配列の数を大いに増加させるからである。例えば、Ｎ16.2Ｕ16.1Ｈ17以外の トリプレットを含有する基質を効率的に開裂し得るリボザイム変異体を得ること が所望されるのは、それが潜在的なターゲット開裂部位の数を増加し得るから である。 分子の中央領域にデオキシリボヌクレオチドの塊を含有する化学修飾されたオ リゴヌクレオチドは、遺伝子発現を特異的に不活性化する薬剤としての潜在可能 性を有する(Ｇｉｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：７６ ３〜７７０(１９９２))。これらオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡに結合したＲＮ Ａ鎖がＲＮアーゼＨによって分解されるハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形 成し得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの開裂を促進すると考えら れ、ＲＮＡ開裂活性を有するか又はＲＮＡ分子を開裂するものとして（開裂する のはＲＮアーゼＨである）は特徴づけられない。これらオリゴヌクレオチドのｉ ｎ ｖｉｖｏ応用に対する重要な欠点はその低い特異性であり、ハイブリッド形 成及び開裂がＲＮＡ分子上の所望されない部位でも起こり得ることである。 適切な遺伝子で細胞をトランスフェクトすることによって触媒活性のあるＲＮ Ａ分子を細胞内で組換え技術により発現させようとしたかつての試みは、特定の ＲＮＡ基質を不活性化するのに非常に高い発現量が必要とされるのであまり有効 でないことが証明された。さらに、今日市販されているベクター系は概して応用 し得ない。さらに、非修飾リボザイムは、ＲＮアーゼによる分解に対するＲＮＡ の感受性及びそのタンパク質との相互作用のために直接投与することはできない 。従って、ハンマーヘッドリボザイムを体外から投与するためには、化学的に修 飾した活性物質を使用しなければならない(例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１３１〜２１３８(１９９４)；Ｋｉｅｈ ｎｔｏｐｆら、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４６４５〜４６５２(１９９４)；Ｐａｏｌ ｅｌｌａら、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１９１３〜１９１９(１９９２)；及びＵｓｍ ａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３〜１６ ４（１９９４）によって論じられている)。 米国特許第５，３３４，７１１号は、核酸ターゲット配列を開裂するのに好適 で所望により置換された１〜１０の炭素原子を有するアルキル、アルケニル又は アルキニル基をリボースの２'−Ｏ原子に含有する修飾ヌクレオチドを含有する 、３５〜４０ヌクレオチド長の合成触媒オリゴヌクレオチド構造に基づいた、そ のような化学修飾した活性物質を記載する。これらオリゴヌクレオチドは修飾ヌ ク レオチドの構築ブロックを含有し、ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。 これらオリゴヌクレオチドは特定のＲＮＡ基質を開裂することができる。 ハイブリダイゼーションアーム又は活性中心に数多くのデオキシリボヌクレオ チドを使用すると、所望のターゲット配列に関連した配列も開裂され得るので、 ＲＮアーゼＨの活性化により特異性の欠失につながる場合がある。さらに、触媒 性ＤＮＡオリゴマーは、タンパク質と相互作用し、ヌクレアーゼ分解に対する抵 抗性が無いために、ｉｎ ｖｉｖｏ応用に特に適してはいない。 従って、ＲＮＡを開裂する組成物を提供すること、特に、高い安定性、活性及 び特異性を同時に有するＲＮＡ開裂オリゴマーを提供することが本発明の目的で ある。 Ｎ16.2Ｕ16.1Ｈ17以外の開裂部位トリプレットを有するＲＮＡ基質を開裂する 組成物を提供することも本発明のもう１つの目的である。 発明の概要 開示されるのは、ＲＮＡ開裂活性を有する組成物、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及 びｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ基質を開裂するためのその使用である。この組成物は 、活性中心（このサブユニットはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ から選択される）及びＲＮＡ基質との特異的ハイブリダイゼーションの形成に寄 与するフランキング（flanking）領域を含有する。好ましい組成物は、ＲＮＡ基 質と組合わさって、ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。開示組成物の活 性中心は、Ｃ16.1を有するＲＮＡ基質の開裂を可能にするＩ15.1の存在によって 特徴付けられる。 図表の簡単な説明 図１は、ハンマーヘッド構造及び対応する命名法（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） の概略図である。Ｈ17とＮ1.1の間で開裂が起こり、Ｈ17に２’，３’−サイク リックリン酸を産生する。 図２は、ＲＮＡ基質を開裂するオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の１例 と結合したＲＮＡ基質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の概略図である。このオリゴ マーと基質によって形成される構造はハンマーヘッドリボザイムの構造に似てい る。このケースでは、基質がステムＩ及びＩＩＩの半分を構成し、ループＩ及び ＩＩＩは存在していない。開裂はＨ17の３’で起こる。 図３は、ハンマーヘッドリボザイム（上）におけるＡ15.1−Ｕ16.1塩基対の相 互作用及び、Ａ15.1−Ｕ16.1塩基対を置換したＩ15.1−Ｃ16.1塩基対（下）の予 測されるイソ構造上の相互作用を示す概略図である。 図４Ａは、短い５’−フルオレセインで標識されておりＧＣＡ部位を含有する オリゴリボヌクレオチド基質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を、Ｎ7の位置に様々 なヌクレオ塩基（Ｕ、Ｃ、Ａ及びＧ；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２２ 、２３及び２４である）をそれぞれ含有する４種の２’−Ｏ−アリル化５−リボ 触媒オリゴマーの変異体で、開裂したときの時間（分）に対する開裂生成物分画 のグラフである。 図４Ｂは、短い５’−フルオレセインで標識されておりＧＣＡ部位を含有する ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のオリゴリボヌクレオチド基質を、Ｎ7の位置に様々な ヌクレオ塩基又は塩基アナログ（Ｕ、５−ニトロインドール、Ｉ及びキナゾリン −２，４−ジオン；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２７、２５及び２６で ある）をそれぞれ含有する４種の２’−Ｏ−アリル化５−リボ触媒オリゴマーの 変異体で、開裂したときの時間（分）に対する開裂生成物分画のグラフである。 発明の詳細な説明 開示されるのは、ＲＮＡ開裂活性を有する組成物、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及 びｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ基質を開裂するためのその使用である。この組成物は 、活性中心（このサブユニットはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ から選択される）及びＲＮＡ基質との特異的ハイブリダイゼーション形成に貢献 するフランキング領域を含有する。好ましい組成物は、ＲＮＡ基質と組合わさっ て、ハンマーヘッド構造に似た構造を形成する。開示組成物の活性中心は、Ｃ16 .1 を有するＲＮＡ基質の開裂を可能にするＩ15.1の存在によって特徴付けられる 。 天然に存在するハンマーヘッドリボザイムはすべてＡ15.1−Ｕ16.1塩基対を有 する。さらに、コンセンサスハンマーヘッド配列に基づいたリボザイムの基質 は、Ｎ16.2Ｕ16.1Ｈ17トリプレット（Ｈ17はグアノシンではない）を含有する基 質を強く選好することが知られている(Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ．２２８，２２８〜２３０(１９８８)；Ｒｕｆｆｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ２９，１０６９５〜１０７０２(１９９０)；Ｐｅｒｒｉｍａｎら、Ｇｅ ｎｅ １１３：１５７〜１６３(１９９２))。１６．１位のＵ要求性を効率的に 軽減し得るリボザイムを単離することを試みた多くの実験がなされてきたが、１ ６．１位にＵ以外の塩基を有する基質を開裂し得るリボザイムを見出そうとする 試みは不可能であることが証明された(Ｐｅｒｒｉｍａｎら、Ｇｅｎｅ １１３ ：１５７〜１６３(１９９２)；Ｓｉｎｇｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６５〜１ ６８(１９９６))。 しかしながら、最近公表されたＸ線結晶構造（Ｐｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３ ７２：６８〜７４(１９９４)、ｓｃｏｔｔら、Ｃｅｌｌ ８１：９９１〜１００ ２(１９９５)及びＳｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：２０６５〜２０６９ (１９９６))を検討すると、このＡ15.1−Ｕ16.1相互作用はアデノシンの環外ア ミン（Ｎ６）とウリジンの４−オキソ基とが単一の水素結合をした非標準的な塩 基対であることが理解された。次いで（結晶構造に基づいた）モデリング研究か ら、この野生型Ａ15.1−Ｕ16.1塩基対の相互作用は、イソ構造的な配向性をとり 、Ｃ16.1の２−ケト基とウリジンターンのＡ6との要求される接触を保存するＩ1 5.1 −Ｃ16.1塩基対での置換によって空間的に模倣し得ることが発見された。こ のモデルでは、１５．１位と１６．１位との間の安定化される水素結合の極性が Ｉ15.1−Ｃ16.1相互作用において逆転しているが、この結合付近にある塩基の正 確な配向性は維持される。 １５．１位にイノシンを含有するゲルラッハ型リボザイムアナログがＮ16.2Ｃ16.1 Ｈ17トリプレットを含有するＲＮＡ基質を容易に開裂することが発見されて いる。このことに基づいて、Ｎ16.2Ｃ16.1Ｈ17トリプレットを含有する核酸のタ ーゲット配列を開裂する組成物、好ましくは合成オリゴマーが開示される。Ｈ17 はグアノシンでないことが好ましい。Ｎ16.2Ｃ16.1Ｘ17トリプレットを有する基 質を開裂する能力により、開示されるタイプの組成物により開裂されるタ ーゲットの数は効果的に倍となる。 ＲＮＡ開裂活性を有する組成物 特に開示されるのはＲＮＡ基質を開裂する組成物であり、ここでその組成物は 成分（ａ）及び（ｂ）を包含し、成分（ａ）は５’−Ｚ1−Ｚ2−３’という構造 を包含し、成分（ｂ）は５’−Ｚ3−Ｚ4−３’という構造を包含する。成分（ａ ）及び（ｂ）は別個の分子であり得るか又は共有結合され得る。成分（ａ）及び （ｂ）における要素Ｚ1及びＺ4は、それぞれヌクレオチド、ヌクレオチドアナロ グ又は両者の組み合わせからなるオリゴマー配列であるか、又はオリゴヌクレオ チドアナログである。要素Ｚ1及びＺ4のオリゴマー配列は、ＲＮＡ基質と好まし くはハイブリダイゼーションによって特異的に相互作用する。 これらの好ましい組成物において、要素Ｚ2は以下のいずれかの構造を有し、 ５’−Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9−３’又は ５’−Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ9＾−３’ 要素Ｚ3は以下のいずれかの構造を有する： ５’−Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15.1−３’又は ５’−Ｘ＾12Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15.1−３’ これらの好ましい組成物における要素Ｚ2及びＺ3は、ヌクレオチド、ヌクレオ チドアナログ又は両者の組み合わせからなる。要素Ｚ2及びＺ3におけるヌクレオ チド及びヌクレオチドアナログはそれぞれ以下の構造を有する。 構造式（Ｉ）において、各Ｂは、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、 グアニン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチ ン−９−イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジ アミノプリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、 ７−デアザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロ ピニルウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９− イル、６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリ ミドン−１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９− イル、Ｎ2−ジメチルグアニン−９−イル又はそれらの機能的同等物であり； 各Ｖは、Ｏ、Ｓ，ＮＨ又はＣＨ2基であり得る。 各Ｗは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ1、−ＣＯＮ Ｒ1Ｒ2、−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＮＨＣＯＲ1、−ＳＨ、−ＳＲ1、 −Ｆ、−ＯＮＨ2、−ＯＮＨＲ1、−ＯＮＲ1Ｒ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＯＲ1、− ＮＲ2ＯＨ、−ＮＲ2ＯＲ1、置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10の 直鎖又は分岐アルキル、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルケニル、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルキニル、置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルコキシ、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルケニルオキシ、及び置換されているか又は置換されていないＣ2 〜Ｃ10の直鎖又は分岐アルキニルオキシであり得る。Ｗ基の置換基は、独立して ハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキサミド 、ヒドロキシ又はメルカプトである。Ｒ1及びＲ2は置換されているか又は置換さ れていないアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり得て、ここで置換基は 独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボ キサミド、ヒドロキシ又はメルカプトである。 Ｄ及びＥは、隣接したヌクレオシド又はヌクレオシドアナログとの間にホスホ ジエステル又はホスホロチオエートジエステル結合を一緒に形成するか又はヌク レオシド間結合のアナログを一緒に形成する残基である。 Ｂは、Ｘ15.1においてはヒポキサンチン−９−イル又はその機能的同等物であ り；Ｘ5、Ｘ8及びＸ12においてはグアニン−９−イル、ヒポキサンチン−９−イ ル又は７−デアザグアニン−９−イルでありえ；Ｘ6、Ｘ9、Ｘ13及びＸ14におい てはアデニン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、プリン−９−イ ル又は７−デアザアデニン−９−イルでありえ；Ｘ4においてはウラシル− １−イル、ウラシル−５−イル、チミン−１−イル又は５−プロピニルウラシル −１−イルでありえ；Ｘ3においてはシトシン−１−イル、５−メチルシトシン −１−イル又は５−プロピニルシトシン−１−イルでありえ；Ｘ7、Ｘ9＾及びＸ ＾12においてはアデニン−９−イル、シトシン−１−イル、グアニン−９−イル 、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル、チミ ン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジアミノプリン−９− イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、７−デアザグアニン −９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロピニルウラシル−１ −イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル、６−メチルウ ラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリミドン−１−イル、 キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９−イル、Ｎ2−ジメチ ルグアニン−９−イル又はそれらの機能上の同等物でありえる。Ｘ15.1のＢは、 好ましくはヒポキサンチン−９−イル、又はこの塩基の２位における任意の基と Ｃ16.1の２−オキソ基との間に水素結合を形成し得ない類似体である。好ましく は、ＢはＸ15.1においてグアニン−９−イルではない。 Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ12、Ｘ13及びＸ14におけるＢは、ハ ンマーヘッドリボザイムの触媒中心に存在する機能的に同等なヌクレオ塩基でも あり得る。例えば、ハンマーヘッドリボザイムのＣ3、Ｕ4、Ｇ5及びＡ6は、ｔＲ ＮＡのウリジンターンに酷似した構造を形成する(Ｐｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６８〜７４(１９９４))。他のヌクレオチド基もウリジンターンを形成 し得るので、ヌクレオチドＸ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6は、ウリジンターンに似た構造を 形成する潜在可能性を有するヌクレオチド又はヌクレオチドアナログにより１つ のグループとして置換される可能性がある。同様に、ハンマーヘッドリボザイム の触媒コアにあるせん断された塩基対は、他の非標準的な塩基対の相互作用に似 ていてもよい相互作用を有する。ハンマーヘッドリボザイムの触媒コアに関する 結晶構造の知識は、非標準的な塩基対がイソ構造的な非標準塩基対で置換された ゲルラッハ型のハンマーヘッドリボザイムが活性であるという発見とともに、同 様のイソ構造的な塩基対置換が触媒コアのどこかで可能であることを示している 。 定義 本明細書で使用されるように、オリゴマーとは、同一のクラス（ヌクレオチド のような）又は異なるクラス（ヌクレオチドとエチレングリコールのような）の 混合物であり得るサブユニットからなるオリゴマー分子を呼ぶ。開示されるオリ ゴマーは、オリゴマー配列、非ヌクレオチドリンカー又はオリゴマー配列と非ヌ クレオチドリンカーとの組み合わせであることが好ましい。開示されるオリゴマ ーはオリゴマー配列であることがより好ましい。オリゴマー配列は、サブユニッ トのそれぞれが塩基特異的なやり方で他のオリゴマー配列と相互作用し得るヌク レオ塩基（即ち、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの塩基部分）を包含す るオリゴマー分子である。核酸鎖のハイブリダイゼーションはそのような塩基特 異的な相互作用の好ましい例である。オリゴマー配列は好ましくはヌクレオチド 、ヌクレオチドアナログ又はその両方から構成されるか又はオリゴヌクレオチド アナログである。 非ヌクレオチドリンカーは、オリゴマー配列ではなくて、オリゴマー配列と共 有結合し得る任意の分子であり得る。好ましい非ヌクレオチドリンカーは非ヌク レオチドサブユニットから形成されるオリゴマー分子である。そのような非ヌク レオチドリンカーの例は、ＬｅｔｓｉｎｇｅｒとＷｕ(Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ ｏｃ．１１７：７３２３〜７３２８(１９９５))、Ｂｅｎｓｅｌｅｒら(Ｊ．Ａｍ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８４８３〜８４８４(１９９３))及びＦｕら(Ｊ． Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４５９１〜４５９８(１９９４))によって記 載されている。好ましい非ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーの サブユニットは、置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10の直鎖又は 分岐アルキル、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直鎖又は分 岐アルケニル、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直鎖又は分 岐アルキニル、置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10の直鎖又は分 岐アルコキシ、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直鎖又は分 岐アルケニルオキシ、及び置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の 直鎖又は分岐アルキニルオキシを包含する。これらの好ましい非ヌクレオチドリ ンカー（又はサブユニット）の置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキ シ、エステル、エーテル、カルボキサミド、ヒドロキシ又はメルカプトであり得 る。 本明細書で使用されるように、ヌクレオシドとは、アデノシン、グアノシン、 シチジン、ウリジン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、 ２’−デオキシシチジン又はチミジンを呼ぶ。ヌクレオシドアナログとはヌクレ オシドの塩基又は糖部分のどこかの部位に化学修飾を含有するヌクレオシドの化 学修飾した形態である。本明細書で使用されるように、ヌクレオシドアナログと いう用語は、例えばイノシンやシュードウリジンのような天然に存在する修飾さ れたヌクレオシドに基づいたヌクレオシドアナログと、糖の２’位への修飾のよ うな他の修飾を有するヌクレオシドアナログの両方を網羅する。本明細書で使用 されるように、ヌクレオチドとは上記のようなヌクレオシドのリン酸誘導体をよ び、ヌクレオチドアナログは上記のようなヌクレオシドアナログのリン酸誘導体 である。ペプチド核酸のようなオリゴヌクレオチドアナログのサブユニットもヌ クレオチドアナログであると考えられる。 本明細書で使用されるように、リボヌクレオチドは、２’ヒドロキシル基を有 するヌクレオチドである。同様に、２’−デオキシリボヌクレオチドは、２’水 素のみを有するヌクレオチドである。従って、本明細書で使用されるリボヌクレ オチド及びデオキシリボヌクレオチドとは、化学修飾されていないヌクレオシド 成分のアデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジン、又は２’−デオキシア デノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン及びチミジンを それぞれ有する天然に存在するヌクレオチドをよぶ。リボヌクレオシド、デオキ シリボヌクレオシド、リボヌクレオシドアナログ及びデオキシリボヌクレオシド アナログは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログに見出されるリン酸基又は リン酸基のアナログを欠いたものとして同様に定義される。 本明細書で使用されるように、オリゴヌクレオチドアナログとは、配列依存的 なハイブリダイゼーションのような核酸様の性質を有し、標準的なＲＮＡ又はＤ ＮＡヌクレオチドから離れる修飾を１つ又はそれ以上の部位に含有する、核酸様 物質のポリマーである。オリゴヌクレオチドアナログの好ましい例はペプチド核 酸である。 本明細書で使用されるように、塩基対とは１つ又はそれ以上の水素結合を介し て相互作用するヌクレオチド又とはヌクレオチドアナログの対を呼ぶ。塩基対と いう用語は、ワトソン−クリック型塩基対として一般に特徴付けられる相互作用 に限定されず、非標準的な又はせん断された塩基対の相互作用を包含する(Ｔｏ ｐａｌとＦｒｅｓｃｏ、Ｎａｔｕｒｅ ２６３：２８５(１９７６)；Ｌｏｍａｎ ｔとＦｒｅｓｃｏ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．１５：１８５(１９７５))。従って、ヌクレオチドＡ15.1及びＵ16.1はハンマ ーヘッドリボザイムにおいて塩基対を形成する（図１参照）が、この塩基対は非 標準的である（図３参照）。 ２つのヌクレオシドのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合又はホス ホロチオエート基又は、例えば米国特許第５，３３４，７１１号に記載された他 の結合のような修飾されたホスホ結合によって達成され得る。 フランキング要素Ｚ1及びＺ4 （要素Ｚ2及びＺ3によって形成される）活性中心に隣接する要素Ｚ1及びＺ4の モノマーサブユニットは、好ましくはヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナ ログである。要素Ｚ1及びＺ4は、所定のＲＮＡ基質と好ましくはハイブリダイゼ ーションによって特異的に相互作用し、活性中心のＺ2及びＺ3とともにＲＮＡ基 質を特異的に開裂する構造（好ましくはハンマーヘッドリボザイムに似た構造） を形成するように設計される。 一方、要素Ｚ1及びＺ4のサブユニットは、リボヌクレオチドであり得る。しか しながら、リボヌクレオチドが存在するとオリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏ安定性が 減少するので、リボヌクレオチドの数は可能な限り少ないことが好ましい。要素 Ｚ1及びＺ4（及びまた活性中心のＺ2及びＺ3）は、ピリミジンヌクレオ塩基を含 有する位置に好ましくはリボヌクレオチドを１つも含有しない。そのような位置 は、好ましくはヌクレオチドアナログを含有する。 要素Ｚ1及びＺ4における多数のデオキシリボヌクレオチドの使用もより好まし くないのは、タンパク質との望ましくない相互作用が起こり得るか、又は意図し ないＲＮアーゼＨ感受性のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成し得るためである 。従って、要素Ｚ1及びＺ4は、それぞれ好ましくは（１）リボヌクレオチドを含 有せず、（２）３つより多い連続したデオキシリボヌクレオチドの配列を含有し ない。 要素Ｚ1及びＺ4のサブユニットは、好ましくはヌクレオチド、ヌクレオチドア ナログ又はその組み合わせである。好ましくは、要素Ｚ1及びＺ4におけるヌクレ オチド及びヌクレオチドアナログはそれぞれ以下の構造を有する。 構造式（Ｉ）において、各Ｂは、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、 グアニン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチ ン−９−イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジ アミノプリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、 ７−デアザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロ ピニルウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９− イル、６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリ ミドン−１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９− イル、Ｎ2−ジメチルグアニン−９−イル又はそれらの機能的同等物でありえ； 各Ｖは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＣＨ2基であり得る。 各Ｗは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ1、−ＣＯＮ Ｒ1Ｒ2、−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＮＨＣＯＲ1、−ＳＨ、−ＳＲ1、 −Ｆ、−ＯＮＨ2、−ＯＮＨＲ1、−ＯＮＲ1Ｒ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＯＲ1、− ＮＲ2ＯＨ、−ＮＲ2ＯＲ1、置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10の 直鎖又は分岐アルキル、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルケニル、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルキニル、置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルコキシ、置換されているか又は置換されていないＣ2〜Ｃ10の直 鎖又は分岐アルケニルオキシ、及び置換されているか又は置換されていないＣ2 〜Ｃ10の直鎖又は分岐アルキニルオキシであり得る。Ｗ基の置換基は、独立し てハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カルボキサミ ド、ヒドロキシ又はメルカプトである。Ｒ1及びＲ2は置換されているか又は置換 されていないアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり得て、ここで置換基 は独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ、エステル、エーテル、カル ボキサミド、ヒドロキシ又はメルカプトである。 Ｄ及びＥは、隣接したヌクレオシド又はヌクレオシドアナログとの間に、ホス ホジエステル又はホスホロチオエートジエステル結合を一緒に形成するか、又は ヌクレオシド間結合のアナログを一緒に形成する残基である。 ヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを有する構造式（Ｉ）の要素Ｚ1 及びＺ4にとっては、各Ｗは置換されているか又は置換されていないＣ1〜Ｃ10 の直鎖又は分岐アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ10の直鎖又は分岐アルケニルオキシ又はＣ2 〜Ｃ10の直鎖又は分岐アルキニルオキシであることが好ましい。 さらに、フランキング要素Ｚ，及びＺ1は4ペプチド核酸（ペプチド性核酸とも 言及される；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜 １５００（１９９１）及びＤｕｅｈｏｌｍら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５ ７６７〜５７７３（１９９４）を参照のこと）のようなヌクレオチドアナログも 含有し得る。この場合、各サブユニットのカップリングは、例えば、酸アミド結 合によって達成され得る。要素Ｚ1及びＺ4は、ペプチド核酸に基づいたとき、適 切なリンカー（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ ｔ．５：１１１９〜１１２１（１９９５）を参照のこと）又は直接的なカップリ ング（Ｂｅｒｇｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：６８２ ３〜６８２６(１９９５))のいずれかを使用して、ヌクレオチド又はヌクレオチ ドアナログに基づいた要素Ｚ2及びＺ3とカップルされ得る。要素Ｚ1及びＺ4がヌ クレオチド（及び／又はヌクレオチドアナログ）とペプチド核酸の組み合わせを 含有する場合、異なる部分をカップルさせるために、同様の連結が使用され得る 。 フランキング要素Ｚ1及びＺ4のサブユニットは、ＲＮＡ分子において天然に存 在するヌクレオ塩基とハイブリダイズするか又は相互作用し得るヌクレオ塩基又 はヌクレオ塩基アナログを含有する。ヌクレオ塩基は、天然に存在する塩基（即 ち、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル）並びに２，６−ジア ミノプリン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、シュードウラシル、５−プ ロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンのような、ターゲットＲＮＡとの 特異的な結合を可能にするヌクレオ塩基アナログから好ましくは選択される。 ＲＮＡ基質と要素Ｚ1及びＺ4との間の強くて配列特異的な相互作用（即ち、Ｒ ＮＡ基質とオリゴマーとの間のより安定なハイブリッド）が好ましい。この目的 のために、要素Ｚ1及びＺ4のオリゴマー配列において、標準的なヌクレオ塩基に 代わる以下のヌクレオ塩基アナログが使用されることが好ましい：アデニンの代 わりに２，６−ジアミノプリン；ウラシルの代わりにチミン又は５−プロピニル ウラシル；及びシトシンの代わりに５−メチルシトシン又は５−プロピニルシト シン。２−アミノ−２’−Ｏ−アルキルアデノシンもまた好ましい(Ｌａｍｍら 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３１９３〜３１９８(１９９１) )。さらに、二本鎖の安定性を高め得るフェノキサジンのようなヌクレオ塩基ア ナ口グを産生するために、ウラシルの４位及び５位に芳香族系を連結し得る(Ｌ ｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８７３〜３８７４(１９９５) )。 開示組成物による開裂に好ましいＲＮＡ基質は以下の構造を有する： ５’−Ｚ4’−Ｃ16.1−Ｘ17−Ｚ1’−３’ ここで、Ｚ1’及びＺ4’は、それぞれＺ1及びＺ4と相互作用し、Ｃ16.1はシチジ ンであり、Ｘ17はアデノシン、グアノシン、シチジン又はウリジンである。開裂 はＸ17の３’で起こる。好ましくは、Ｘ17はアデノシン、シチジン又はウリジン であり、より好ましくは、Ｘ17はアデノシン又はシチジンであり、最も好ましく は、Ｘ17はアデノシンである。好ましくは、Ｘ16.2（即ち、Ｚ4’における３’ ヌクレオシド）はアデノシン又はグアノシンである。開示組成物によって開裂さ れ得る基質のターゲット部位は、これまでのハンマーヘッドリボザイムでは基質 の１６．１位にウリジンが要求されるので、従来のハンマーヘッドリボザイムの ターゲット部位とは異なっている。 Ｚ4’に存在する３’位であるＮ16.2位は、グアノシン、アデノシン、シチジ ン又はウリジンのいずれかであり得る。Ｎ16.2はグアノシン、アデノシン又はシ チジンのいずれかであることが好ましい。Ｎ16.2はグアノシン又はアデノシンの いずれかであることがより好ましい。Ｎ16.2はグアノシンであることが最も好ま しい。開示化合物による開裂に好ましい基質は、Ｎ16.2がグアノシン、アデノシ ン又はシチジンであり、Ｘ17がアデノシンであるものである。開示化合物による 開裂により好ましい基質は、Ｎ16.2がグアノシン又はアデノシンであり、Ｘ17が アデノシンであるものである。開示化合物による開裂に最も好ましい基質は、Ｎ16.2 がグアノシンであり、Ｘ17がアデノシンであるものである。 フランキング要素Ｚ1及びＺ4は、それぞれ独立に、好ましくは３〜４０、より 好ましくは５〜１０のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含有する。Ｚ1 及びＺ1’が相互作用して少なくとも３つの塩基対のステムを形成し、Ｚ4及びＺ4 ’が相互作用して少なくとも３つの塩基対のステムを形成することが好ましい 。これらステムがそれぞれＺ2及びＺ3に隣接していることがより好ましい。Ｚ1 及びＺ1’が相互作用して３つより多い塩基対のステムを形成し、Ｚ4及びＺ4’ が相互作用して３つより多い塩基対のステムを形成することが最も好ましい。 好ましいＲＮＡ基質は、ＲＮＡのターゲット領域に関連した阻害性の二次構造 をほとんど有さないものである。ＲＮＡ分子のどの領域が二次構造を含有し、そ れ故より好ましくないか、ＲＮＡ分子のどの領域が二次構造をほとんど有さず、 それ故より好ましいかを決定するための多くの方法がある。単鎖ＲＮＡの領域を 決定するための好ましい方法は、単鎖ＲＮＡの領域と選択的に反応させるか又は それを認識することによってこの領域をマッピングするものである。ヌクレオチ ドのワトソン−クリック面にある窒素と反応する多くの化学物質（硫酸ジメチル (ＤＭＳ)、ジエチルピロカーボネート(ＤＥＰＣ)、カトキサール(ＣＭＣＴ)、カ ルボジイミド）がある。ワトソン−クリック型の塩基対合に関与するヌクレオチ ドは、関与しないヌクレオチドよりもこれらの化学物質に対してより少ない反応 性を示す。化学修飾したＲＮＡとの（逆転写酵素、ＲＮアーゼＴ１、コブラ毒ヌ クレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１、ヌクレアーゼＶ１を使用する）酵素反応から、 その長さが化学反応の起こった塩基に依存する、短縮されたオリゴヌクレオチド が創出される。化学反応はＲＮＡの単鎖領域で選好的に起こるので、これらの技 術はＲＮＡの二次構造がどこにあるかを示す。例えば、硫酸ジメチル及び逆転写 酵素マッピングのような方法は、二本鎖ＲＮＡの領域がどこにあるかを示す。逆 転写酵素は、適切な条件下では、二本鎖ＲＮＡの領域を複製し得ないので、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって分析したときに、複製途中 で停止した（ａｂｏｒｔｉｖｅ）転写産物が存在し、これがどこに強い二次構造 のＲＮＡ領域があるかを示す。この方法の諸例は、Ｋａｍａｒら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ ３３(２)：５８３〜５９２(１９９４)、ＭａｎｄｉｙａｎとＢｏ ｕｂｌｉｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８(２３)：７０５５〜７ ０６２(１９９０)、ＢｅｒｎａｌとＧａｒｃｉａ−Ａｒｅｎａｌ、ＲＮＡ ３( ９)：１０５２〜１０６７(１９９７)及びＥｈｒｅｓｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５(２２)：９１０９〜９１２８（１９８７）に記載 されている。 ＲＮＡのどの領域が単鎖であるかを評価する別の方法はＲＮアーゼＨマッピン グである。この方法では、短いランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成され、 タ一ゲットＲＮＡと混合される。容易にアクセスできる領域がこの短いＤＮＡ分 子とハイブリダイズされる。次いでこのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド領域がＲＮ アーゼＨによって開裂される。次ぎに標識化したＲＮＡ分子がＰＡＧＥによって 分析され得る。開裂された分子を配列決定の梯子（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｌａ ｄｄｅｒ）と比較することにより、単鎖ＤＮＡの領域が推定され得る。この方法 の諸例は、Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５９〜 ６３（１９８８）及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎの米国特許第５，５２５，４６８号に 記載されている。 ＲＮＡのアクセス可能な単鎖領域を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選別実 験（Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ １９：８９〜９３(１９９２)）も実施され得る 。例えばターゲットＲＮＡは、ＰＣＲ増幅のために使用され得るプライマー結合 領域を含有するランダムＤＮＡオリゴヌクレオチドと混合され得る。増幅及び再 選別を繰り返すことで、ＲＮＡと結合し得るＤＮＡ配列を濃縮することが可能に なる。これによってオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのためにアクセ スし得るＲＮＡの領域が同定される。この選択又は濃縮の工程は任意のサイズ選 別技術であるか又は二本鎖核酸の分離技術であり得る。例えば、セファデックス カラムクロマトグラフィーでは、大きい、結合性のＤＮＡ：ＲＮＡ複合体と小さ な 非結合性のＤＮＡ分子が分離され、またニトロセルロース濾過法では結合性のＲ ＮＡが保持される一方、非結合性のＤＮＡ分子は素通りする。 所定の基質に対するオリゴマーを最適化するための方法も数多くある。例えば 、特定の配列要求性を持たないオリゴマーのＮ7位を変更し、所定のターゲット 配列のために設計されたオリゴマーのなかに所望しない二次構造が発生する可能 性を最小化することに役立てることができる。また、７−デアザグアノシン又は ７−デアザアデノシンのような特定の塩基修飾は、所望しないプリン：プリン相 互作用を防ぐために、数多くのグアノシン又はアデノシンを有する領域に利用さ れ得る。同様の置換は、例えば触媒オリゴマーのＺ1又はＺ4領域に存在し得るグ アノシンリッチ領域へイノシンを導入することによって達成され得る。 触媒コア 要素Ｚ2及びＺ3は、開示組成物の触媒コアを形成すると考えられ、好ましくは ヌクレオチドアナログ及び少数のリボヌクレオチドから構成される。要素Ｚ2及 びＺ3においては、（構造式（Ｉ）の）各Ｗは、Ｃ1〜Ｃ5の直鎖又は分岐アルキ ル、Ｃ2〜Ｃ5の直鎖又は分岐アルケニル、Ｃ2〜Ｃ5の直鎖又は分岐アルキニル、 Ｃ1〜Ｃ5の直鎖又は分岐アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ5の直鎖又は分岐アルケニルオキシ 、及びＣ2〜Ｃ5の直鎖又は分岐アルキニルオキシであることが好ましい。また、 各Ｘ3、Ｘ4、Ｘ7及びＸ＾12においては、ＷはＮＨ2、ＯＨ−置換Ｃ1〜Ｃ4のアル キル、ＯＨ−置換Ｃ2〜Ｃ4のアルケニル、ＯＨ−置換Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ又は ＯＨ−置換Ｃ2〜Ｃ4のアルケニルオキシであることが好ましい。各Ｘ3、Ｘ4、Ｘ7 及びＸ＾12においては、ＷはＮＨ2、メトキシ、２−ヒドロキシエトキシ、アリ ルオキシ又はアリルであることがより好ましい。また、Ｘ12においては、Ｗは− Ｈ又は−ＯＨであることが好ましい。また、各Ｘ13及びＸ14においては、ＷはＣ1 〜Ｃ4のアルキル、Ｃ2〜Ｃ4のアルケニル、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ、Ｃ2〜Ｃ4の アルケニルオキシ、ＯＨ−置換Ｃ1〜Ｃ4のアルキル、ＯＨ−置換Ｃ2〜Ｃ4のアル ケニル、ＯＨ−置換Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ又はＯＨ−置換Ｃ2〜Ｃ4のアルケニル オキシであることが好ましい。各Ｘ13及びＸ14においては、Ｗはメトキシ、２− ヒドロキシエトキシ又はアリルオキシであることがより好ましい。 要素Ｚ2及びＺ3におけるサブユニットは、好ましくはリボヌクレオチドと弱く だけハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログである。そのようなサブユニッ トの例は、リボースの２’位に好ましくは１〜５の炭素原子を有する置換されて いるか又は置換されていないアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、 アルケニルオキシ又はアルキニルオキシ基を含有するヌクレオチドアナログであ る。この目的のために要素Ｚ2及びＺ3において使用され得る好ましいヌクレオ塩 基は、アデニン−９−イル、プリン−９−イル、ウラシル−１−イル、シトシン −１−イル、グアニン−９−イル及びヒポキサンチン−９−イルである。 以下のヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが（構造式（Ｉ）の成分に関連 する）要素Ｚ2に対して好ましい： Ｘ3位：Ｂ＝シトシン−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝シトシン −１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリル； Ｘ4位：Ｂ＝ウラシル−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝ウラシル −１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリル；Ｂ＝ウラシル−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ ； Ｘ5位：Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ，Ｗ＝アミノ；Ｂ＝グアニン−９− イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ6位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝Ｈ；Ｂ＝プリン−９−イル、 Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ7位：Ｂ＝ウラシル−１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝シトシン −１−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリル； Ｘ8位：Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アミノ；Ｂ＝ヒポキサンチン −９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ9位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝Ｈ；Ｂ＝プリン−９−イル、 Ｖ＝Ｏ，Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ。 以下のヌクレオチド及びヌクレオチドアナログが（構造式（Ｉ）の成分に関連 する）要素Ｚ3に対して好ましい： Ｘ12位：Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝Ｈ；Ｂ＝７−デアザグアニン −９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ； Ｘ13位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝アデニン −９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝２−ヒドロキシエトキシ；Ｂ＝プリン−９−イル、Ｖ ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ； Ｘ14位：Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ；Ｂ＝プリン− ９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝ＯＨ；Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝２−ヒド ロキシエトキシ；Ｂ＝プリン−９−イル、Ｖ＝Ｏ、Ｗ＝アリルオキシ； Ｘ15.1位：Ｂ＝ヒポキサンチン−９−イル又はその機能的同等物、Ｖ＝Ｏ、Ｗ ＝ＯＨ。 要素Ｚ2及びＺ3は、触媒構造の形成を可能にするようなやり方で相互作用する 。好ましい組成物では、Ｚ2及びＺ3は、ハンマーヘッド触媒構造に似た触媒構造 の形成を可能にするようなやり方で相互作用する。Ｚ2及びＺ3が相互作用して触 媒構造を形成し得る１つの方法は、Ｚ2及びＺ3を構成するヌクレオチド及び／又 はヌクレオチドアナログの相互作用を介してである。開示組成物はＲＮアーゼＨ から独立したＲＮＡ開裂活性を有する。即ち、開示組成物は、ＲＮアーゼＨに関 わらずにＲＮＡ基質の開裂を起こすことができる。開示組成物はＲＮアーゼＨに よるＲＮＡの開裂を促進し得る可能性があるが、そうしないことが好ましい。 Ｚ2とＺ3との所望の相互作用は、好ましくはＺ2の３’末端及び／又はＺ3の５ ’末端へ要素をカップリングすることによって強められる。単一の要素（本明細 書においてＺ5と呼ばれる）は、要素Ｚ2及びＺ3をこのように共有結合させるた めに使用され得る。開示組成物のそのような形態の構造は、５’−Ｚ1−Ｚ2−Ｚ5 −Ｚ3−Ｚ4−３’となろう。別個の要素（本明細書においてＺ6及びＺ7と呼ば れる）は、Ｚ2及びＺ3にカップルされ得て、好ましくは相互作用（非共有的に） して、要素Ｚ2とＺ3の相互作用を安定化又は別のやり方で増強し得る。この形態 の組成物の成分（ａ）は、５’−Ｚ1−Ｚ2−Ｚ6−３’という構造を有し、成分 （ｂ）は、５’−Ｚ7−Ｚ3−Ｚ4−３’という構造を有するだろう。 要素Ｚ5、Ｚ6及びＺ7は、オリゴマー配列、非ヌクレオチドリンカー又はオリ ゴマー配列と非ヌクレオチドリンカーの組み合わせであることが好ましい。要素 Ｚ5、Ｚ6及びＺ7は、オリゴマー配列であることがより好ましい。これらのオリ ゴマー配列は相互作用して分子内ステム（Ｚ5の場合）又は分子間ステム（Ｚ6及 びＺ7の場合）を形成することが最も好ましい。そのようなステムは、好ましく は２〜３０の塩基対を含有し、好ましくは連続している(つまり、非対合性の塩 基がない)。要素Ｚ5、Ｚ6及びＺ7は、好ましくはヌクレオチド、ヌクレオチドア ナログ又はその両方から構成されるか、又はオリゴヌクレオチドアナログである 。Ｚ5は、Ｚ2とＺ3の相互作用を安定化させるようなやり方でそれ自身と相互作 用することが好ましい。同様に、Ｚ6は、Ｚ2とＺ3の相互作用を安定化させるよ うなやり方でＺ7と相互作用することが好ましい。要素は、ヌクレオチド及び／ 又はヌクレオチドアナログから構成されるオリゴマー配列、オリゴヌクレオチド アナログ又はその組み合わせであり、相互にハイブリダイズし得ることが好まし い。 要素Ｚ5は、Ｚ2の３’末端をＺ3の５’末端へカップリングする共有リンカー として役立ち得る。要素Ｚ5は、好ましくはポリエチレングリコールのような非 ヌクレオチド分子、又はヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びオリゴヌクレ オチドアナログを包含するオリゴマー配列、又はヌクレオチド、ヌクレオチドア ナログ及びオリゴマーヌクレオチドアナログの組み合わせのいずれかから構成さ れる。要素Ｚ5の好ましい形態は、分子内で相互反応してステム−ループ構造を 形成し得る、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチドアナロ グ、又はヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの組み合わせから構成される。 要素Ｚ5の好ましいステムール−プ構造は、２〜３０の塩基対を含有するもので ある。 開示組成物の好ましい態様は、ヌクレオチドがすべて２’−Ｏ−アリル−リボ ヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドである５’−Ｚ1−Ｚ2− Ｚ5−Ｚ3−Ｚ4−３’であるが、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15.1位は、２’ 位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ）リボヌクレオチドである。 開示組成物の別の好ましい態様は、ヌクレオチドがすべて２’−Ｏ−アリル− リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドである５’−Ｚ1− Ｚ2−Ｚ5−Ｚ3−Ｚ4−３’であるが、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15.1位は、２’ 位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ）リボヌクレオチドである。 開示組成物の別の好ましい態様は、成分（ａ）が５’−Ｚ1−Ｚ2−Ｚ6−３’ であり、成分（ｂ）が５’−Ｚ7−Ｚ3−Ｚ4−３’である上記の成分（ａ）及び （ｂ）から構成される組成物であり、ここでヌクレオチドはすべて２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドであるが、Ｘ4 、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15.1位は、２’位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ） リボヌクレオチドである。 開示組成物の別の好ましい態様は、成分（ａ）が５’−Ｚ1−Ｚ2−Ｚ6−３’ であり、成分（ｂ）が５’−Ｚ7−Ｚ3−Ｚ4−３’である上記の成分（ａ）及び （ｂ）から構成される組成物であり、ここでヌクレオチドはすべて２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドであるが、Ｘ5 、Ｘ6、Ｘ8、Ｘ12、Ｘ15.1位は、２’位が修飾されていない（Ｗ＝ＯＨ）リボ ヌクレオチドである。 開示組成物の好ましい形態は、Ｚ2の３’末端にＧがついたものである。Ｔａ ｉｒａと共同研究者(ＡｍｏｎｔｏｖとＴａｉｒａ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ ｃ．１１８：１６２４〜１６２８(１９９６))は、ハンマーヘッド様リボザイム のＲ9に並置したグアノシンから得られるスタッキングエネルギーが触媒構造の 形成を安定化させることを示した。従って、Ｚ6の５’ヌクレオチドはＧである ことが好ましい。 開示組成物の３’末端は、例えば、リボース糖の３’位が（例えば、上記に定 義したような置換されているか又は置換されていないアルキル、アルコキシ、ア ルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル又はアルキニルオキシ基を包含するこ とによって）修飾されたヌクレオチドアナログを使用することによって、エクソ ヌクレアーゼによる分解に対して保護され得る。開示組成物はまた、３’−３’ −連結ジヌクレオチド構造（Ｏｒｔｉｇａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２：１２９〜１４６(１９９２)） 及び／又は２つのホスホロチオエート結合のような２つの修飾されたホスホ結合 を包含することによって、エクソヌクレアーゼによる３’末端での分解に対して 安定化され得る。 開示組成物はまた、その細胞への取込みを向上させる及び／又は特定の細胞内 局在化を可能にするために、補欠分子族へ連結され得る。そのような補欠分子族 の例は、ポリアミノ酸(例えば、ポリリシン)、脂質、ホルモン又はペプチドであ る。これら補欠分子族は通常直接的に又は適切なリンカー（例えば、６−アミノ ヘキサノール又は６−メルカプトヘキサノールに基づいたリンカー）によってオ リゴマーの３’又は５’末端を介して連結される。これらリンカーは市販されて いて、補欠分子族をオリゴマーへ連結させるのに好適な技術は当業者に知られて いる。 ハイブリダイゼーション速度を高めることが開示組成物の生物学的な活性にと って重要であり得るのは、こうすれば低濃度の組成物でより高い活性を達成する ことが可能になるからである。このことは短命のＲＮＡ基質又はあまり頻繁には 生じないＲＮＡ基質にとって重要である。ハイブリダイゼーションの実質的な加 速は、例えば、（例えばいくつかのリジン残基を含有する）正電荷のペプチドを オリゴヌクレオチドの末端へカップリングさせることによって達成され得る(Ｃ ｏｒｅｙ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：９３７３〜９３７４(１９９ ５))。開示化合物は上記のリンカーを使用するこのやり方で平易に修飾され得る 。別のやり方では、ハイブリダイゼーション速度は、スペルミニル残基を含有す るサブユニットを取込むことによっても高められ得る(ＳｃｈｍｉｄとＢｅｈｒ 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：１４４７〜１４５０)。開示化合 物のそのような修飾は二次構造を有するＲＮＡ基質に結合する能力も向上させる 。 オリゴマーの合成 開示化合物は任意の適切な方法を使用して合成され得る。多くの合成法が知ら れている。開示化合物の合成には以下の技術が好ましい。プリンリボヌクレオチ ド残基を含有し、転換したチミジン残基のような適切な３’末端（Ｏｒｔｉｇａ ｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ ２：１２９〜１４６(１９９２)）又は３’−エクソヌクレアーゼによる起こ り得る分解を防ぐ３’末端の２つのホスホロチオエート連結を有する、２’−Ｏ −アリル修飾オリゴマーが、任意の市販ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いた固相β− シアノエチルホスホロアミダイト化学によって合成され得る(Ｓｉｎｈａら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４５３９〜４５５７(１９８４))。 好ましい方法は、リボヌクレオチドのための２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチ ルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護戦略（Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．１０９：７８４５〜７８５４(１９８７)）であり、必要とされる３’−Ｏ−ホ スホロアミダイトはすべて市販されている。さらに、アミノメチルポリスチレン の 支持物質としての使用がその有利な性質のために好ましい(ＭｃＣｏｌｌｕｍと Ａｎｄｒｕｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３２：４０６９〜４ ０７２(１９９１))。市販のフルオレセインホスホロアミダイトを使用して、合 成中に基質ＲＮＡの５’末端へフルオレセインを付けることができる。一般に、 標準的なＲＮＡサイクルを使用して所望のオリゴマーが合成され得る。アセンブ リーが完了したら、密封バイアルにて濃縮水性アンモニア水／エタノール（３： １ｖ／ｖ）で５５℃、８時間処置することにより、不安定な塩基保護基をすべて 除去する。エタノールは２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳが早めに除去されるのを抑制する が、そうしないと脱保護の基本条件下で得られるリボヌクレオチドの位置でかな りの鎖開裂が起こってしまう(Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１ ０９：７８４５〜７８５４(１９８７))。凍結乾燥した後に、ＴＢＤＭＳ保護化 オリゴマーは、６０℃で２時間、トリエチルアミントリヒドロフルオリド／トリ エチルアミン／Ｎ−メチルピロリドンの混合物で処置し、中性的な条件下でシリ ル保護基を迅速的かつ効率的に除去する(Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７〜２６８４(１９９５))。次いで、完全に 脱保護化したオリゴマーは、ＣａｔｈａｌａとＢｒｕｎｅｌの方法(Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２０１(１９９０))によりブタノール沈殿さ れ得る。精製は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はイオン交換ＨＰＬ Ｃ(Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓ １４：２５５〜２７３(１９９５))と逆相ＨＰＬＣの組み合わせのいずれか により実施され得る。細胞内で使用するには、合成されたオリゴマーをアセトン 中の過塩素酸ナトリウムで沈殿してそのナトリウム塩へ変換することが好ましい 。次いで残った微量の塩は、好ましくは市販の小さな使い捨てゲル濾過カラムを 使用して除去される。最終工程として、この単離オリゴマーの真性をマトリック ス介助レーザーデソープション質量分析法（Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３１９１〜３１９６(１９９３)）及びヌクレオシド 塩基組成分析によって確認する。さらに、対応する化学合成された短いオリゴリ ボヌクレオチド基質に対するこのオリゴマーを用いた開裂機能テストも好ましい 。 ＲＮＡ基質の開裂 ＲＮＡ切断は細胞の核または細胞質に存在するタンパク質因子により促進され るので、開示された化合物は非常に高いインビボ活性を持っている。ハンマーヘ ッドリボザイムの活性を増大できるそのようなタンパク質因子の例は、例えば、 ＨＩＶ１のヌクレオカプシドタンパク質ＮＣｐ７(Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．２４２：４２２−４２９(１９９４))および異種核リボ 核タンパク質Ａ１（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．２３：２２２３−２２２８(１９９５)）である。従って、 長いＲＮＡ転写体は開示された化合物により細胞内で効率的に切断される。 開示された化合物は、活性物質として一つまたはいくつかのオリゴマーおよび 、随意に医薬として受容可能な補助物質、添加物および担体を含んでいる医薬組 成物に使用できる。そのような医薬組成物は、真核生物、原核生物およびウイル ス、特に細胞中の腫瘍遺伝子またはウイルス遺伝子またはＲＮＡ分子のようなヒ ト遺伝子の発現を特異的に不活性化する薬剤の製造に適している。応用のさらな る範囲は植物遺伝子または昆虫遺伝子発現の不活性化である。従って、開示され た組成物はヒトおよび動物のための薬剤ならびに植物のための殺虫剤に使用でき る。 細胞へ開示された化合物を送達するためには種々の方法が利用可能である。例 えば、一般的に開示された化合物はマイクロパーティクル内または上に取り込む ことができる。本明細書で使用される場合、マイクロパーティクルには合成およ び／または天然ポリマーで形成されたリポソーム、ビロソーム、マイクロスフェ アおよびマイクロカプセルが含まれる。マイクロカプセルおよびマイクロスフェ アを作成する方法は当業者には既知であり、溶剤蒸発、溶剤鋳造、噴霧乾燥およ び溶剤伸長が含まれる。種々のマイクロパーティクル内へ取り込むことができる 有用なポリマーの例としてはポリサッカライド、ポリ無水物、ポリオルトエステ ル、ポリ水酸化物およびタンパク質およびペプチドが挙げられる。 リポソームはＫｉｍ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ ，７２８：３３９−３４８(１９８３)；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃ ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ，１１０４：９５−１０１(１９９２)；およ びＬｅｅ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ.，１１０ ３：１８５−１９７(１９９２)；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｅｍ.，２ ８： ９５０８−９５１４（１９８９）により報告されているような標準法により作成 できる。そのような方法は核酸分子のＭＯＬＴ−３白血病細胞株細胞核および細 胞質への送達に使用されている(Ｔｈｉｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌ ｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.，２０：５６９１−５６９８(１９９２))。 もしくは、開示された化合物はイオン的かまたは共有結合でマイクロパーティク ル内へ取り込ませるか、またはマイクロパーティクルの外側に結合することがで きる。 カチオンリポソームまたはマイクロカプセルは、開示された化合物のような陰 性に荷電した化合物を送達するのに特に有用であるマイクロパーティクルであり 、化合物はリポソームの陽性に荷電した外側表面へイオン的に結合できる。Ｆｅ ｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７(１９８７)；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄ ｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ，５：１６３−１８７(１９９０)； Ｃｌａｒｅｎｃ ｅｔ ａｌ.，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉ ｇｎ ，８：８１−９４（１９９３）により報告されているように、種々のカチオ ンリポソームはインビトロおよびインビボの両方で細胞への核酸または核酸−タ ンパク質複合体の送達に非常に有効であることが示されている。混合物から形成 されたリポソームまたはマイクロカプセルが、陰性に荷電した化合物をイオン的 に結合するであろう正味の陽性電荷を持つように、カチオンリポソームまたはマ イクロカプセルは十分な量の一つまたはそれ以上のカチオン側鎖を含んでいる脂 質からなる混合物を用いて製造できる。カチオンリポソームを製造するために使 用される陽性に荷電した脂質の例には、アミノ脂質ジオレオイルホスファチジル エタノールアミン(ＰＥ、陽性に荷電した一級アミノ頭部を持つ);ホスファチジ ルコリン(ＰＣ、一級アミンではない陽性に荷電した頭部を持つ);およびＮ[１− （２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウ ム（”ＤＯＴＭＡ,”Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ，８４：７４１３−７４１７(１９８７)；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：３８７−３８８(１９８９)；Ｆｅｌｇ ｎｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５ ：１６３ −１８７（１９９０）を参照されたい)が含まれる。 開示された組成物送達のためのマイクロパーティクルの好適な形はヘムを持つ マイクロパーティクルである。これらのマイクロパーティクルにおいて、ヘムは マイクロパーティクルの外側表面内へインターカレートされているかまたは共有 結合で結合されている。ヘムを持つマイクロパーティクルは、肝細胞のようなヘ ムレセプターを発現する細胞により優先的に結合および取り込まれるので、有効 投与量に必要とされる薬剤量が著しく少なくてもよいという利点を持っている。 そのような標的化送達はまた、非標的化送達法において相対的に高薬剤濃度使用 する場合に起こりうる全身的副作用も減少させる。ヘムを持つマイクロパーティ クルの形成に好適な脂質は１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアン モニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノー ルアミン（ＤＯＰＥ）である。ヘムを持つマイクロパーティクルの製造および使 用はＩｎｎｏｖｉｒによるＰＣＴ出願ＷＯ９５／２７４８０に記載されている。 開示された組成物はまたカチオンリポソームによりカプセル化またはカチオン リポソーム上を被覆でき、それは哺乳類に静脈注射できる。この系は内皮および 造血細胞が存在する骨髄を含む成体マウスの多様な組織の細胞内へＤＮＡを導入 するために使用されている(例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ ６１：２０９−２１１（１９９３）を参照されたい)。 開示された組成物を含んでいるリポソームは、標的細胞への開示された化合物 送達のための有効量で、例えば、静脈内または腹腔内投与により全身的に投与で きる。他の可能な経路には、適切なマイクロパーティクルとともに使用された場 合の経皮または経口が含まれる。一般的に、個体に投与されるリポソーム結合オ リゴマーの総量は、同一の所望されるまたは意図される効果のために投与されな ければならない非結合オリゴマー量よりも少ないであろう。 ポリ乳酸およびポリグリコール酸コポリマー、ポリエチレンおよびポリオルト エステルのような種々のポリマーを含んでいる組成物および開示された組成物は 、カテーテルまたは注射器を使用して適切な細胞に局所的に送達できる。そのよ うな組成物を細胞へ局所的に送達する他の手段には、注入ポンプの使用（例えば 、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ ｉ ａからのもの）または移植物に隣接した領域への治療組成物の徐放性放出を達成 できるポリマー性移植物内への組成物の取り込み（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａ ｎｄ Ｌｌｏｙｄ−Ｊｏｎｅｓ，ｅｄｓ.，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙ ｓｔｅｍｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏ ｏｄ Ｌｔｄ.，１９８７を参照されたい）が含まれる。 治療的応用には、活性物質は好適には０．０１から１０，０００μｇ／ｋｇ体 重、より好適には０．１から１０００μｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。投与 は、例えば、注射、スプレーとして吸入(例えばエアロゾルとして)、経口的(例 えば、錠剤、カプセル、被覆錠剤その他として)、局所的または直腸的（例えば 座薬として）により実施できる。 開示された組成物は遺伝子発現の特異的不活性化のための方法に使用でき、組 成物が細胞内に存在する前もって決められたＲＮＡ分子を切断するように(切断 は好適には触媒的に起こる)、活性濃度の組成物が細胞に取り込まれる。米国特 許第５，３３４，７１１号に記載されている類似の組成物はマウスでの遺伝子不 活性化に成功している(Ｌｙｎｇｓｔａｄａａｓ et ａｌ.，ＥＭＢＯ Ｊ．１ ４：５２２４−５２２９(１９９５))。この方法は培養細胞に対してインビトロ で、ならびに生きている生物体（原核生物またはヒト、動物または植物のような 真核生物）に対してインビボで実施できる。 開示された組成物はまた、ＲＮＡ分子を切断するためのＲＮＡ制限酵素として 使用できる(例えば、細胞なしのインビトロ反応)。開示された組成物はまたＲＮ Ａ分子の制限切断のための反応キットにも使用でき、例えばそれには、オリゴマ ーおよび適した緩衝化物質が含まれている。この場合、オリゴマーおよび緩衝化 物質は溶液、懸濁液または散剤または凍結乾燥物のような固形物の形で存在でき る。試薬は一緒に、お互いに分離されてまたは随意に適した担体上にも存在でき る。開示された組成物はまた、診断試薬としてまたは未知遺伝子の機能を同定す るためにも使用できる。 本発明は以下の非制限的な実施例を参考にしてさらに理解されるであろう。実施例 実施例１：１５．１位でのイノシン置換は効果的にＮ16.2Ｃ16.1Ｈ17を切断でき ることを示している切断反応 Ｎ16.2Ｃ16.1Ｈ17モチーフ（式中、Ｈ17はグアノシンではない）の各々の順列 を含む１２の基質の組が合成された。切断アッセイに使用されたオリゴマーおよ び対応する基質は表１に示されている。基質の各々は５’末端がフルオレセイン で標識されており、および３’末端に逆方向チミジンキャップが使用された。四 つの触媒オリゴマーの組が合成され、基質の各々に対して適切に一致した触媒オ リゴマーを提供している。これらの触媒オリゴマーの各々は１５．１位にイノシ ンを持っている。基質の１６．１位にＵおよび触媒オリゴマーの１５．１位にＡ がある対照基質および触媒オリゴマーも合成された。 Ｆｌ＝フルオレセイン標識 ＊Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｕ＝リボヌクレオチド（Ｉはイノシンである） ａ，ｃ，ｇ，ｕ＝２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド 上記の基質および触媒オリゴマーは、切断のために１６．１位のＵを必要とす ることを克服するための１５．１位のイノシンの能力を決定するための切断反応 で使用された。すべての反応は以下のプロトコールを使用して実施された。反応 は典型的には１００μｌで行われ、反応液には蒸留およびオートクレーブ処理さ れたＨ2Ｏ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、５ μＭリボザイムおよび０．２５μＭ基質が含まれている。触媒オリゴマー、基質 および緩衝液は一緒に加えられ、９５℃で５分間加熱された。５分以上かけて室 温まで冷却後、反応液を１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に加え、混合して３７℃に置かれ た。特定の時間間隔（１０、３０、６０および１２０分）で１０μｌを採り、反 応を停止させるために３μｌの充填緩衝液(９５％ホルムアミド、１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．０５％ブロモフェノールブル−）に加えた。試料は ２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。ゲルはＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅｒで分析さ れた。表１に示された基質および触媒オリゴマーを使用したこの型の切断反応の 結果は表２に示されている。 数字は示された時間点（反応を開始して０，１０、３０、６０および１２０分 後）で切断された基質のパーセントを示している。結果は、１６．１位にＣを持 つ基質は１５．１位にＩを含んでいる触媒オリゴマーにより切断されうることを 示している。１２０分の時点で種々の基質間に相違はあるものの、１６．１位に Ｃを持つ基質は１５．１位にＩを持つ触媒オリゴマーに関して、すべての場合で 効率よく切断できることをデータは示しており、１５．１位でのＩの置換はＮ16 .2 Ｃ16.1Ｈ17部位を含んでいる適当な基質の切断を実際に可能にすることを示し ている。 Ｃ16.1を持っている１２の基質およびＵ16.1を持っている対照基質の対応する 触媒オリゴマー（すべて表１に示されている）による切断初速度は単一ターンオ ーバー速度論を用いて決定された。単一ターンオーバー速度論は２．５μｌの１ ００μＭリボザイム溶液、２．５μｌの１０μＭ ５’フルオレセイン標識基質 溶液および１０μｌの１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４溶液を混合するこ とにより算定された。混合物は９０μｌの最終容量に希釈し、９５℃に５分間加 熱した後、３７℃に冷却した。１０μｌの１００ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液を添加す ることにより反応を開始させた。反応成分の最終濃度は、２５０ｎＭ基質、２． ５μＭリボザイムおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ2であった。種々の時間に１０マイ クロリットルの試料を採り、反応を停止させるために１０μｌの１００ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、ブロモフェノールブルー溶液と混合した。切断生成物はＰＡＧＥにより 未反応基質から分離し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｆｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅｒで定量された。 時間に対する切断された基質の分画として測定されたデータはＪａｎｋｏｗｓ ｋｙ ａｎｄ Ｓｃｈｗｅｎｚｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４ ３３（１９９６）により記載されているように式 分画［Ｐ］＝Ｈ0（１−ｅk21）／Ｓ0 に適合させた。種々のリボザイムについて計算されたｋ2の値は表３に示されて いる。 Ｆｌ＝フルオレセイン標識 *Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｉ，Ｕ＝リボヌクレオチド（Ｉはイノシンである） ａ，ｃ，ｇ，ｕ＝２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド この結果はＡ16.2Ｃ16.1Ｈ17およびＧ16.2Ｃ16.1Ｈ17トリプレットを持つ基質 は速い速度で切断されることを示している。１５．１位にＡを持っている対照触 媒オリゴマーとの比較（Ｇ16.2Ｕ16.1Ｃ17トリプレットを持つ基質の切断） は、Ａ16.2Ｃ16.1Ｈ17およびＧ16.2Ｃ16.1Ｈ17トリプレットを持つ基質（１５． １位にＩを持つ触媒オリゴマーにより切断される）が、標準Ａ15.1−Ｕ16.1塩基 対を持つ反応体を含む対応する対照反応よりも速い切断初速度を持っていること を示している。実施例２：リボヌクレオチドのみを含んでいる触媒オリゴマーによるＧＣＨおよ びＡＣＨトリプレットでの切断速度 ＧＣＨおよびＡＣＨトリプレットを切断するために設計された、すべてリボヌ クレオチドからなるオリゴマー（修飾なし）による基質ＲＮＡの切断が評価され た。使用されたオリゴマーは配列ＩＤ番号：１７（ＡＣＨトリプレット後を切断 ）（表１）および配列ＩＤ番号：１８（ＧＣＨトリプレット後を切断）（表１） であった。対応する短い蛍光標識基質、配列ＩＤ番号：４、５および６（ＡＣＨ トリプレットを含んでいる）(表１)および配列ＩＤ番号：７、８および９（ＧＣ Ｈトリプレットを含んでいる）(表１)、を各々配列ＩＤ番号：１７および配列Ｉ Ｄ番号：１８の触媒オリゴマーと共に使用した。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭ Ｍｇ2+存在下のｐＨ６．０で、および１ｍＭ Ｍｇ2+存在下のｐＨ７．４の両方で実施された。他のすべての条件は実施例１ で使用されたものと同一であった。 データは実施例１のように分析された。全リボヌクレオチド触媒オリゴマーお よび対応する基質の６つの組み合わせのｋ2値は表４に示されている。 ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＡＣＡおよびＡＣＣ部位を標的とするすべてのリボヌクレオチ ドオリゴマーは、ＧＣＵまたはＡＣＵ部位を標的とするすべてのリボヌクレオチ ドオリゴマーよりも速い切断速度を持っている。さらに、切断活性は１ｍＭ Ｍ ｇ2+存在下で非常に速いことを表４は示している。このレベルのＭｇ2+はインビ ボにおけるＭｇ2+濃度に類似している。実施例３：６つのみのリボヌクレオチドを含んでいる触媒オリゴマーによるＧＣ ＨおよびＡＣＨトリプレットでの切断速度 ＧＣＨおよびＡＣＨトリプレットを切断するように設計された６−リボヌクレ オチドオリゴマーによる基質ＲＮＡの切断が評価された。これらのオリゴマーに おいて、リボヌクレオチドはＵ4、Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ15.1位に存在し ており、他のすべての位置は２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドであった(番 号付けは図２を参照されたい)。使用されたオリゴマーは配列ＩＤ番号：１７（ ＡＣＨトリプレット後を切断）(表１)および配列ＩＤ番号：１８（ＧＣＨトリプ レット後を切断）(表１)であった。対応する短い蛍光標識基質、配列ＩＤ番号： ４、５および６(ＡＣＨトリプレットを含んでいる)(表１)および配列ＩＤ番号： ７、８および９（ＧＣＨトリプレットを含んでいる）(表１)、が各々配列ＩＤ番 号：１７および配列ＩＤ番号：１８の触媒オリゴマーと共に使用された。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭ Ｍｇ2+存在下のｐＨ６．０で、および１ｍＭ Ｍｇ2+存在下のｐＨ７．４の両方で実施された。他のすべての条件は実施例１ で使用されたものと同一であった。 データは実施例１のように分析された。６−リボ触媒オリゴマーおよび対応す る基質の６つの組み合わせにおいて計算されたｋ2値は表５に示されている。 これらの結果は、Ｕ4、Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ15.1位以外のすべてのリ ボヌクレオチドが修飾されている場合は、配列ＩＤ番号：１７（ＡＣＨトリプレ ット後を切断）(表１)および配列ＩＤ番号：１８（ＧＣＨトリプレット後を切断 ）(表１)のような触媒オリゴマーに活性が残っていることを示している。これら の結果はまた、触媒オリゴマーは生理学的濃度のＭｇ2+で基質を切断できること も示している。実施例４：Ｕ4位の糖修飾が異なっている触媒オリゴマーによるＧＣＡトリプレ ットでの切断速度 Ｕ4位に修飾を持つオリゴマーによる基質ＲＮＡの切断が評価された。これら のアッセイはヌクレアーゼ耐性修飾を含むオリゴマーが活性を保持し、活性を保 ったままで触媒オリゴマーの与えられた位置に異なった修飾ができることを示し ている。触媒オリゴマーは配列ＩＤ番号：１８に基づいたものであった。変異体 Ｉは配列ＩＤ番号：１８から作製され、５つ以外のヌクレオチドが２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチドで修飾されていた(リボヌクレオチドはＧ5、Ａ6、Ｇ8、 Ｇ12およびＩ15.1位に存在し、他の位置はすべて２’−Ｏ−アリル−リボヌクレ オチドであった；番号付けは図２を参照されたい)。変異体IIは配列ＩＤ番号： １８から作製され、６つのヌクレオチド以外はすべて２’−Ｏ−アリル−リボヌ クレオチドで修飾されていた(リボヌクレオチドはＵ4、Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12お よびＩ15.1位に存在し、他の位置はすべて２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチド であった)。変異体IIIはＧ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ15.1位にリボヌクレオチ ドを、およびＵ4位に２’−アミノ−２’−デオキシウリジンを含んでいた。他 の すべての塩基は２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドであった。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１ｍＭ Ｍｇ2+存在下のｐＨ７．４で実施された。他の すべての条件は実施例１で使用されたものと同一であった。 データは実施例１のように分析された。計算されたｋ2値は各々全リボヌクレ オチド体に対して２．３２ｍｉｎ-1、変異体Ｉに対して０．１０ｍｉｎ-1、変異 体IIに対して０．８７ｍｉｎ-1、および変異体・に対して０．５６ｍｉｎ-1であ った。これらの結果は、ＲＮａｓｅ Ａ活性を阻害する異なった修飾が、高度に ＲＮａｓｅ Ａ感受性であるＵ4部位に活性を保持しながら行えることを示して いる。Ｕ4位に２’−アミノ−２’−デオキシウリジンを含んでいるヌクレアー ゼ耐性変異体は、この位置にリボウリジンを含む、ＲＮａｓｅ Ａ感受性である が高度に活性な変異体よりもほんの少しばかり活性が低い。このことは、非修飾 全リボヌクレオチド体に近い活性を持つヌクレアーゼ耐性触媒オリゴマーを発生 させることが可能であること、および活性を保ちながら与えられた部位で異なっ た修飾をすることができることを示している。実施例５：１２の可能なＮＣＨトリプレットすべてでの２’−Ｏ−メチル−およ び２’−Ｏ−アリル修飾触媒オリゴマーの切断活性の比較 Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ15.1を除くすべての位置のヌクレオチドに修飾 を持つオリゴマーによる基質ＲＮＡの切断が、すべてのＮＣＨ部位での切断を示 すために評価された。Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ15.1以外のすべてに位置に ２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドかまたは２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオ チドを含んでいる配列ＩＤ番号：１７(ＡＣＨトリプレット後を切断)、配列ＩＤ 番号：１８(ＧＣＨトリプレット後を切断)、配列ＩＤ番号：１９（ＣＣＨトリプ レット後を切断）および配列ＩＤ番号：２０（ＵＣＨトリプレット後を切断）に 基づく触媒オリゴマーが合成された。配列ＩＤ番号：４、５および６(ＡＣＨト リプレットを含んでいる、配列ＩＤ番号：１７により切断される)、配列ＩＤ番 号：７、８および９(ＧＣＨトリプレットを含んでいる、配列ＩＤ番号：１８に より切断される)、配列ＩＤ番号：１０、１１および１２（ＣＣＨトリプレット を含ん でいる、配列ＩＤ番号：１９により切断される）および配列ＩＤ番号：１３、１ ４および１５（ＵＣＨトリプレットを含んでいる、配列ＩＤ番号：２０により切 断される）もまた合成された。配列ＩＤ番号：４−２０は表１に示されている。 反応は単一ターンオーバー速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭマグネシウムイオン存在下のｐＨ７．４で実施 された。他のすべての条件は実施例１で使用されたものと同一であった。データ は実施例１のように分析された。 これらのアッセイからのデータはＧＣＨ、ＡＣＨ、ＣＣＨおよびＵＣＨ基質に 対する触媒オリゴマーはそれらの各々の標的を切断できることを示した。結果は また多くの触媒オリゴマー：基質の組み台わせに対し、２’−Ｏ−アリル−リボ ヌクレオチド修飾触媒オリゴマーおよび対応する２’−Ｏ−メチル−リボヌクレ オチド触媒オリゴマーとの間には実際的な相違がないことも示している。さらに 、どの組み合わせに対してもこれら二つの型の修飾間には２倍を超える相違はな かった。実施例６：Ｎ7位の核塩基が異なった触媒オリゴマーによるＧＣＡトリプレット での切断速度 切断アッセイは、異なった修飾を持つ異なった塩基がＮ7位に置換でき、およ びそれでも活性を保持していることを示すために実施された。すべての触媒オリ ゴマーはＧ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ15.1（それらはリボヌクレオチドである ）を除くすべての位置に２’−Ｏ−アリル−リボヌクレオチドを含んでいた。す べての触媒オリゴマーはＧＣＨトリプレット後を切断するように設計された。触 媒オリゴマーの配列は以下のようであった(Ｎ7位はボールド体で示されている) ： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー *Ｔ=３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇ，ｕおよびｉは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオ チドである。 ｑは１−（２−Ｏ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）キナゾリン−２，４− ジオンである。 ｎは５−ニトロ−１−（２−Ｏ−アリル−β−Ｄ−リボフラノシル）インドー ルである。 反応は単一ターンオーバ一速度論条件下、２．５μＭ触媒オリゴマーおよび２ ５０ｎＭ基質を使用し、１０ｍＭマグネシウムイオン存在下のｐＨ７．４で実施 された。他のすべての条件は実施例１で使用されたものと同一であった。データ は実施例１のように分析された。 Ｎ7変異体オリゴマーの生成物分画に対する時間曲線を示しているグラフが図 ４Ａおよび４Ｂに示されている。データはＮ7でのすべての変異体は非常によく 切断できることを示している。触媒オリゴマーはウラシル類似体、キナゾリン− ２，４−ジオンのようなかさばった基を全く申し分なく許容している。与えられ た基質に触媒構造を最適化するために変形できる触媒オリゴマー中の部位が存在 していることを示しているので、このような情報は重要である。実施例７：肝炎Ｃウイルスから誘導される長い基質のインビトロ切断 プラスミドから転写された長いＲＮＡ基質が、開示された組成物を用いるその ような基質の切断を示すために使用された。プラスミドｐＮ（１−４７２８）は 肝炎Ｃウイルスゲノム（ＨＣＶ）の第一の１３５８塩基を含んでいる。配列は、 １３５８塩基転写体を生成するＢａｍＨＩ直線化プラスミドのランオフ転写体が 可能なように配向されている。ランオフ転写（３−５μｇ）は４０ｍＭトリス− ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１８ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭスペルミジン、５ｍＭ Ｄ ＴＴ、２０００Ｕ／ｍｌ胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤(Ｐｒｏｍｅｇａ)、各々３ｍＭの ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、５０μＣｉの［α−32Ｐ］ＧＴＰ（Ｄｕ Ｐｏｎｔ ＮＥＮ）および３０００Ｕ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅ ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んでいる１００μｌの反応液で実施 された。反応液は３７℃で２−３時間インキュベートし、１００μｌのＲＮＡゲ ル添加緩衝液（９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％キシレ ンシアノールＦＦおよび０．０２５％ブロモフェノールブル−）を加えることに より反応を停止させる。混合物は次に９０℃で３分間加熱し、氷上で急冷して４ ％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで電気泳動する。１３５８ヌクレオチド長 転写体はＵＶで影をつけることにより可視化し、バンドを切り出し、ＲＮＡは１ 時間の電気泳動により抽出した。ＲＮＡは一夜のエタノール沈殿により回収され た。遠心分離および７０％エタノールによる洗浄後、精製された転写体は２０μ ｌのＤＥＰＣ滅菌水に再懸濁し、濃度はＵＶ測定により決定された。 以下のオリゴマーがＨＣＶのランオフ転写体を標的にするために設計された。 Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー *Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 これらの配列は転写体に存在するＨＣＶゲノムのＧＣＡ−３４５部位を標的に している。 切断反応は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、３ ０ｎＭ放射標識転写体および３００ｎＭ触媒オリゴマー（配列ＩＤ番号：２８− ３１）を含んでいる１０μｌの反応容量で実施された。インキュベーションは３ ７℃で１０分間および各々の試験されたオリゴマーと６０分間実施され、反応は ２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むゲル添加緩衝液１０μｌを加えることにより停止させ 、９０℃で５分間加熱し、氷上で５分間冷却した。非切断転写体および切断生成 物は４％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルでの電気泳動により分離した。電気 泳動後、ゲルをＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭフィルター濾紙上に移し、８０℃で２時 間乾燥させた。バンドはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーンへ暴露するこ とにより定量した。 これらのアッセイの結果は触媒オリゴマーの４つすべてがＨＣＶランオフ転写 体を切断できたことを示している。このことはＵ4、Ｇ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12および Ｉ15.1位を除いて（配列ＩＤ番号：３０）およびＧ5、Ａ6、Ｇ8、Ｇ12およびＩ1 5.1 位を除いて（配列ＩＤ番号：２８、２９および３１）すべてに２’−Ｏ−ア リル−リボヌクレオチドを含んでいる標的触媒オリゴマーは長いＲＮＡを切断で きることを示している。実施例８：ＧＣＡおよびＧＵＡトリプレットを標的としている触媒オリゴマーを 用いる、肝炎Ｃウイルスから誘導された長い基質のインビトロ切断の比較 切断アッセイは、１３５８塩基ＨＣＶ基質を切断するために設計された触媒オ リゴマーが３０ｎＭほどの低い濃度で機能することを示すために実施された。ラ ンオフ転写体は実施例７のように製造された。これらのアッセイで使用されたオ リゴマーは以下のものである： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー*Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ，Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 これらの触媒オリゴマーはＧＣＡ３４５トリプレット（配列ＩＤ番号：２８の オリゴマー）およびＧＵＡ３７８トリプレット（配列ＩＤ番号：３２）を標的に している。ＨＣＶの１３５８ランオフ転写体の切断反応を分析するときに得られ る断片は、ＧＣＡ３４５部位での切断に対しては３４７および１０１１ヌクレオ チド長、およびＧＵＡ３７８部位での切断に対しては３８０および９７８ヌクレ オチド長である。触媒オリゴマーは１時間の反応時間では１および３μＭ、およ び３時間の反応時間では３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭおよび３μ Ｍの濃度で比較された。すべての他の反応および条件は実施例７と同じである。 試験された触媒オリゴマーのすべての濃度で３時間後には、オリゴマーがＨＣ Ｖ転写体を切断していることをデータの分析は示した。このことは３０ｎＭの触 媒オリゴマー濃度はＨＣＶゲノムの１３５８塩基ＲＮＡ断片を切断できることを 示している。実施例９：ジュルカット細胞溶解物中のヒトＩＬ−２ｍＲＮＡの切断 切断アッセイは、ＩＬ−２ｍＲＮＡを標的とする触媒オリゴマーが、細胞溶解 物溶液中の天然のままのｍＲＮＡを切断できることを示すために実施された。こ れらのアッセイは下記の配列を持つ触媒オリゴマーで実施された： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー *Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 この配列はヒトインターロイキン−２ｍＲＮＡ（ＥＭＢＬヌクレオチド配列デー タベース４３版中の配列名ＨＳＩＬ２Ｒ）のＧＣＡ(ここでＡは１４０位である) 後を切断するように設計された。 ジュルカット細胞はＩＬ−２の発現を誘導するためにホルボール １２−ミリ ステート １３−アセテート（ＰＭＡ）／フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で５ 時間刺激された。粗細胞溶解物は以下のような凍結−融解により調製された：２ ｘ１０7細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない５００ μｌの脱イオン水に再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした後、液体窒素 で急速冷凍し、３７℃で融解した。細胞破片は低速遠心分離により除去し、切断 アッセイで使用するための粗溶解物を残した。 各々の切断反応は、６２．５μｌの細胞溶解物、５０ｍＭトリスｐＨ７．５、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１μＭ触媒オリゴマーを含んでいる１００μｌの反 応液中３７℃にて０、１０、３０、６０および１２０分の反応時間で実施された 。以下の対照実験が行われた、オリゴマーを含まない１２０分後の対照、ＩＬ− ２プローブ対照、ＩＬ−２およびβ−アクチンＲＮａｓｅ消化、およびオリゴマ ーを含まない１０分後の対照。ＲＮＡはＢｉｏＧｅｎｅ Ｘ−Ｃｅｌｌ溶液を用 いる反応から精製され、ＡｍｂｉｏｎからのＲＰＡ ＩＩキットを用い、使用説 明書のプロトコールに従ったリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）により分 析された。ＩＬ−２のためのビオチン標識アンチセンスＲＮＡプローブおよびβ −アクチンＲＮＡ（内部標準）はＳＰ６転写キットを使用して調製された。β− アクチンプローブのための鋳型はＡｍｂｉｏｎから購入され、３３４ヌクレオチ ドのＲＮＡプローブおよび２４５ヌクレオチド長の保護断片が生成された。 すべてのＩＬ−２プローブ鋳型がジュルカット細胞ＲＮＡからのＩＬ−２配列 の断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することにより作製された。一つの プライマーには得られるＤＮＡプローブがＰＣＲ反応で直接転写できるようにＳ Ｐ６転写プロモーター部位も含まれている。プローブは４８７ヌクレオチド長で あるように設計され、ＩＬ−２ＲＮＡのＲＰＡ分析後に４８７ヌクレオチドの保 護断片を導く。触媒オリゴマーによる切断後のＲＰＡ分析は完全長ＲＮＡに加え て４２８および５９ヌクレオチドの保護断片を同定しなければならない。 保護ＲＮＡ断片はポリアクリルアミドゲル電気泳動（５％）により分離し、ナ イロン膜上にブロットし、ＡｍｂｉｏｎからのＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｂｉｏｄ ｅｔｅｃｔキットを用いた化学発光検出により可視化した。５００、４００、３ ００および２００ヌクレオチド長のビオチニル化ＲＮＡマーカーが使用された。 細胞溶解物は前記のように調製され、細胞内転写により生成されたＩＬ−２ｍＲ ＮＡを含んでいる。この細胞溶解物は標的基質を含んでいる。基質および触媒オ リゴマー間の反応はＩＬ−２ｍＲＮＡの４２８塩基および５９塩基断片を生成す る。この配列のための標識プローブを使用することにより、切断生成物が検出で きる。ＩＬ−２ｍＲＮＡは細胞溶解物存在下で触媒オリゴマー、配列ＩＤ番号： ３３により切断された。このことは、インビボでｍＲＮＡに関連する細胞物質存 在下、触媒オリゴマーが長い天然のままのｍＲＮＡを切断できることを示してい る。実施例１０：ＣＨＯ細胞溶解物中のラットドーパミンＤ２レセプターＲＮＡの切 断 切断アッセイは、ラットドーパミンＤ２レセプターｍＲＮＡを標的とした触媒 オリゴマーが、ＣＨＯ細胞溶解物溶液中の天然のままのｍＲＮＡを切断できるこ とを示すために実施された。アッセイは下記の配列の触媒オリゴマーで実施され た： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー *Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 この配列はラットドーパミンＤ２レセプターＲＮＡ（ＥＭＢＬヌクレオチド配列 データベース４３版中の配列名ＲＮＤ２ＤＯＰＲ）のＧＣＡ（ここでＡは８１１ 位である）後を切断するように設計された。 粗細胞溶解物は前記実施例９に記載したような凍結−融解法により、ラットド ーパミンＤ２レセプター遺伝子で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から作 製された。各々の切断反応は、６２．５μｌの細胞溶解物、５０ｍＭトリスｐＨ ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および０．５μＭ触媒オリゴマーを含んでいる１ ００μｌの反応液中３７℃にて１０、３０、６０および１２０分の反応時間で実 施された。以下の対照実験が実施された：ＲＮａｓｅで切断したドーパミンＤ２ レセプターＲＮＡおよびβ−アクチン、ドーパミンＤ２レセプターＲＮＡおよび β−アクチン対照、ラットドーパミンＤ２レセプターＲＮＡプローブおよびβ− アクチン対照、オリゴマーを含まない１０分後の対照、オリゴマーを含まない３ ０分後の対照およびオリゴマーを含まない６０分後の対照。 ＲＮＡは反応液から精製され、ＡｍｂｉｏｎからのＲＰＡ ＩＩキットを用い 、使用説明書のプロトコールに従ったリボヌクレアーゼ保護アッセイにより分析 された。ラットドーパミンＤ２レセプターのためのビオチン標識アンチセンスＲ ＮＡプローブおよびマウスβ−アクチンＲＮＡ（内部標準）はＳＰ６転写キット を使用して調製された。β−アクチンプローブのための鋳型はＡｍｂｉｏｎから 購入され、３３４ヌクレオチドのＲＮＡプローブおよび２４５ヌクレオチド長の 保護断片が生成された。 ドーパミンＤ２レセプタープローブ鋳型が、ＣＨＯ細胞ＲＮＡからのドーパミ ンＤ２レセプター配列の断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することによ り作製された。一つのプライマーには、得られるＤＮＡプローブがＰＣＲ反応で 直接転写できるように、ＳＰ６転写プロモーター部位も含まれている。プローブ は、ドーパミンＤ２レセプターＲＮＡの分析後に６６３ヌクレオチドであるよう に設計された。触媒オリゴマーによる切断後のＲＰＡ分析は、完全長ＲＮＡに加 えて３９４および２６９ヌクレオチドの保護断片を同定しなければならない。保 護ＲＮＡ断片は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５％）により分離し、ナイ ロン膜上にブロットし、ＡｍｂｉｏｎからのＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｂｉｏｄｅ ｔｅｃｔキットを用いた化学発光検出により可視化した。 結果はＤ２レセプターＲＮＡは触媒オリゴマー、配列ＩＤ番号：３４により切 断されることを示している。切断生成物は１０分で検出可能で時間とともに増加 し、時間中、触媒オリゴマーは実質上分解されていないことを示している。実施例１１：Ａ５４９細胞溶解物中のヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの切断 切断アッセイは、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡを標的とする触媒オリゴマーが、Ａ５ ４９細胞溶解物溶液中の天然のままのｍＲＮＡを切断できることを示すために実 施された。これらのアッセイは下記の配列を持つ触媒オリゴマーで実施された： Ｌ＝５’−末端ヘキサンジオールリンカー *Ｔ＝３’−３’逆方向チミジン Ａ、Ｇ、Ｕおよび，Ｉはリボヌクレオチドである。 ａ，ｃ，ｇおよびｕは２’−アリルオキシ−２’−デオキシリボヌクレオチド である。 これらの配列はＡＣＡ部位の後ろを切断するように設計されており、ここで第 一のＡはヒト細胞内接着分子−１ｍＲＮＡ（ＩＣＡＭ−１）(ＥＭＢＬヌクレオ チド配列データベース４３版中の配列名ＨＳＩＣＡＭ０１)の塩基１２０５（配 列ＩＤ番号：３５）および１５９２位（配列ＩＤ番号：３６）に位置している。 粗細胞溶解物は前記実施例９に記載したような凍結−融解法により、ＩＣＡＭ −１を誘導するために１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦαで５時間剌激した後のＡ５４ ９細胞から作製された。各々の切断反応は、６２．５μｌの細胞溶解物、５０ｍ ＭトリスｐＨ７．５、７０ｍＭ ＭｇＣｌ2および５００ｎＭオリゴマー、２０ ０ｎＭオリゴマー、１００ｎＭオリゴマー、５０ｎＭオリゴマーの最終濃度の触 媒オリゴマー、触媒オリゴマーを含まない対照、を含む１００μｌの反応液中で ３７℃で２時間実施された。ＲＮＡは反応液から精製され、Ａｍｂｉｏｎからの ＲＰＡ ＩＩキットを用い、使用説明書のプロトコールに従ったリボヌクレアー ゼ保護アッセイにより分析された。ヒトＩＣＡＭ−１およびＧＡＰＤＨ ＲＮＡ （内部標準）のためのビオチン標識アンチセンスＲＮＡプローブはＳＰ６転写キ ットを使用して調製された。ＧＡＰＤＨのための鋳型はＡｍｂｉｏｎから購入さ れ、３１６ヌクレオチド長の保護断片が生成された。 ＩＣＡＭ−１プローブ鋳型は、Ａ５４９細胞ＲＮＡからのＩＣＡＭ−１配列の 断片を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することにより作製された。一つのプ ライマーには、得られるＤＮＡプローブがＰＣＲ反応で直接転写できるように、 ＳＰ６転写プロモーター部位も含まれている。プローブは５９８ヌクレオチド長 であるように設計され、ＩＣＡＭ−１ ＲＮＡのＲＰＡ分析後に５９８ヌクレオ チドの保護断片を導く。触媒オリゴマーによる切断後のＲＰＡ分析は、完全長Ｒ ＮＡに加えて５５２および４６ヌクレオチド（１２０５ＡＣＡ部位）および４３ ３および１６５ヌクレオチド（１５９２ＡＣＡ部位）の保護断片を同定しなけれ ばならない。 保護ＲＮＡ断片は、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ナイ ロン膜上にブロットし、ＡｍｂｉｏｎからのＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｂｉｏｄｅ ｔｅｃｔキットを用いた化学発光検出により可視化した。５００、４００、３０ ０および２００ヌクレオチド長のビオチニル化ＲＮＡマーカーが使用された。切 断生成物は試験されたオリゴマーのすべての濃度で生成された。１５９２ＡＣＡ 部位での切断は、５０ｎＭのみの触媒オリゴマーを使用しても特に有効であった 。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION           Hammerhead ribozymes with extended cleavage rules                                Background of the Invention   The present invention is in the technical field of compositions having RNA cleavage activity.   Hammerhead ribozymes can recognize and cleave certain RNA substrates Examples of possible catalytic RNA molecules (Hotchins et al., Nucleic A cids Res. 14: 3627 (1986); Keese and Symons, V. iroids and viroid-like pathsogens (JJ . Semanchik, CRC Press, Boca Rayton, Florida, 1987, 1 Pp. 47). The center of the hammerhead ribozyme catalyst has three stems on the side And separated from each other by adjacent RNA sequence regions or many nucleotides Can be formed by the region. Figure 1 shows such a catalytically active hammerhead. 1 shows a schematic view of the structure. Stems are labeled I, II and III. Nucleo Pide is counted according to the standard nomenclature for hammerhead ribozymes (Her tel et al., Nucleic Acids Res. 20: 3252 (1992)) . In this nomenclature, bases are numbered relative to their position on the 5 'side of the cleavage site. Therefore, it is described. Further, each base contained in the stem or loop region is Or an additional notation that defines the position of that base within the loop (with a decimal point and another number). ). N11.3Indicates that this base is included in the pairing region. And the third base of the stem away from the core region. According to this accepted agreement describing ribozymes from hammerhead, The nucleotides in the core of the enzyme are related to all other nucleotides. In succession, they always have the same number. For substrate binding or core formation The size of the stems involved can be of any size and any sequence, e.g.9 Will be the same for all other core nucleotides. For example, N ＾12Or N9Nucleotides marked with ＾ represent inserted nucleotides. , The position of the caret (に 関 す る) in the number is before the nucleotide whose insertion is specified. Or after. Therefore, N ＾12Is the nucleotide inserted before nucleotide position 12. ending And N9＾ represents the nucleotide inserted after nucleotide position 9.   The consensus sequence of this catalyst core structure is Ruffner and Uhlenbec k (Nucleic Acids Res. 18: 6025-6029 (199) 0)). Meanwhile, Perriman et al. (Gene 113: 157) 163 (1992)) show that this structure is mutated (eg, N9＾ and N ＾12Heaven like (Naturally occurring nucleotide insertions). Therefore, tobacco Positive (+) strand of satellite RNA of ring-spot virus Does not contain any of these two nucleotide insertions, whereas Lucerne transient streaks k) The viral virus (vLTSV) is transferred to C or G without loss of activity N that can be mutated9挿入 = contains an insertion of U (Sheldon and Symons, N ucleic Acids Res. 17: 5679-5885 (1989)). Furthermore, in this special case, N7= A and R15.1= A. On the other hand, The minus strand of the virusoid (-CarSV) associated with the N ＾12= A and N9Characteristic in that it contains both nucleotide insertions, ＾ = C (Hernandez et al., Nucleic Acids Res. 20 : 6323-6329 (1992)). In this virusoid, N7= A and R15.1 = A. In addition, this special hammerhead construction makes the central stem more Despite being open, it shows very effective autocatalytic cleavage.   Possible uses of hammerhead ribozymes include, for example, production of RNA restriction enzymes and And animal and human or plant cells and prokaryotes, yeast and malaria parasites, for example. Specific inactivation of gene expression in the cell. Of particular interest in biomedical Many diseases, including some forms of tumors, are associated with overexpression of certain genes Based on the facts. Cleavage of related mRNAs to inactivate such genes Is a possible way to control and ultimately treat such diseases To embody. In addition, we are working to develop antiviral, antibacterial and antifungal drugs. You have high needs. Ribozymes have potential value as such anti-infectives Because they can selectively destroy RNA molecules that are essential for microbial survival. You.   One of the biggest obstacles in using hammerhead-based ribozymes as drugs One is the conventional Gerlach design and the pre-formed When targeting a semi-hammer head structure, the acceptable target Limited availability (see WO 97/18312) When). Hammerhead ribozyme substrates are correctly hybridized for substrate binding. In addition to requiring a noise sequence, the triplet N16.2U16.1H17(N is optional U is uridine, H is adenosine, cytidine or uridine ) Have been shown to be strongly preferred (Koizumi et al., FEBS Lett.) . 228, 228-230 (1988); Ruffner et al., Biochemis. try 29,10695-10702 (1990); Perriman et al., Ge. ne 113: 157-163 (1992)). Modify this general rule of substrate specificity The fact that a non-functional substrate results in a substrate that deviates from the above requirements Suggests that there is a "non-core compatible" structure formed when You. Evidence related to this has been recently reported by Uhlenbeck and co-workers. (Biochemistry 36: 1108-1114 (1997)). Substituting G at position 17 gives G17And CThreeA functionally lethal base pair is formed between them, Precise orientation of scissile bonds for cleavage and CThreeMutual It demonstrated that the formation of the tertiary structure required for action was hindered (Murra y et al., Biochem. J. 311: 487-494 (1995)). Similar reasons There may be a strong preference for U at position 16.1. 16.Effective U request of first place Many experiments have been attempted to isolate ribozymes that can be reduced efficiently Is a hammerhead ribosome capable of cleaving a substrate having a base other than U at position 16.1 Attempts to find Zyme proved impossible (Perrim an et al., Gene 113: 157-163 (1992)).   Efficient catalyst molecules with reduced or altered requirements in the cleavage zone are highly desirable. This is because the available targets that this type of molecule can cleave when isolated are This greatly increases the number of bit arrays. For example, N16.2U16.1H17Other than Obtaining ribozyme mutants that can efficiently cleave substrates containing triplets Is desirable because it can increase the number of potential target cleavage sites It is.   A chemically modified o-nucleoside containing a mass of deoxyribonucleotides in the central region of the molecule. Ligonucleotides have potential as agents that specifically inactivate gene expression (Giles et al., Nucleic Acids Res. 20:76). 3-770 (1992)). These oligonucleotides contain RN bound to DNA. A chain forms a hybrid DNA-RNA duplex that is degraded by RNase H Can be achieved. Such oligonucleotides are thought to promote RNA cleavage. Have the activity of cleaving RNA or cleave RNA molecules (cleave Is RNase H). I of these oligonucleotides An important drawback for n vivo applications is their low specificity, It is possible that cleavage and cleavage may occur at undesired sites on the RNA molecule.   Catalytically active RN by transfecting cells with the appropriate gene Previous attempts to express the A molecule intracellularly by recombinant techniques have been Very effective because very high expression levels are required to inactivate RNA substrates Not proved. In addition, vector systems available today are generally applied I can't. In addition, unmodified ribozymes provide RNA against degradation by RNase Cannot be administered directly due to its sensitivity and interaction with its protein . Therefore, in order to administer the hammerhead ribozyme from outside the body, it must be chemically modified. Decorated active substances must be used (for example, Heidenreich et al. J. Biol. Chem. 269: 2131-2138 (1994); Kieh. ntopf et al., EMBO J .; 13: 4645-4652 (1994); Paol. ella et al., EMBO J .; 11: 1913-1919 (1992); and Usm. an et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 31: 163-16 4 (1994)).   U.S. Patent No. 5,334,711 is suitable for cleaving nucleic acid target sequences. Having 1 to 10 carbon atoms, optionally substituted with alkyl, alkenyl or Contains modified nucleotides containing an alkynyl group at the 2'-O atom of ribose Based on a synthetic catalytic oligonucleotide structure of 35 to 40 nucleotides in length. The chemically modified active substance is described. These oligonucleotides are K It contains building blocks of leotide and forms a structure similar to a hammerhead structure. These oligonucleotides can cleave specific RNA substrates.   Many deoxyribonucleotides in the hybridization arm or active center The use of tides can also cleave sequences related to the desired target sequence, Activation of RNase H can lead to loss of specificity. In addition, the catalyst DNA oligomers interact with proteins and resist nuclease degradation. Due to their lack of resistance, they are not particularly suitable for in vivo applications.   Accordingly, providing a composition that cleaves RNA, in particular, has high stability, activity and It is an object of the present invention to provide an RNA cleavage oligomer having both is there.   N16.2U16.1H17Cleaves RNA substrates with other cleavage site triplets It is another object of the present invention to provide a composition.                                Summary of the Invention   Disclosed are compositions having RNA cleavage activity, as well as in vitro and And its use to cleave RNA substrates in vivo. This composition is , Active center (this subunit is a nucleotide and / or nucleotide analog And the formation of specific hybridization with RNA substrates. It contains a flanking region to provide. Preferred compositions include RNA groups Combined with quality, it forms a structure similar to a hammerhead structure. Activity of the disclosed composition The sex center is C16.1I that allows cleavage of RNA substrates with15.1By the existence of Characterized.                             Brief description of the chart   FIG. 1 shows a hammerhead structure and corresponding nomenclature (SEQ ID NO: 1). FIG. H17And N1.1Cleavage occurs between H172 ', 3'-cycle Produces ric phosphoric acid.   FIG. 2 shows an example of an oligomer (SEQ ID NO: 2) that cleaves an RNA substrate. FIG. 2 is a schematic diagram of an RNA substrate bound to (SEQ ID NO: 3). This oligo The structure formed by the hammerhead and the substrate is similar to that of the hammerhead ribozyme. You. In this case, the substrate makes up half of stems I and III, loops I and III III does not exist. Cleavage is H173 '.   FIG. 3 shows A in the hammerhead ribozyme (top).15.1-U16.1Base pair phase Interaction and A15.1-U16.1I with base pairs replaced15.1-C16.1Base pair (bottom) FIG. 3 is a schematic diagram showing the measured isostructural interaction.   FIG. 4A is labeled with short 5'-fluorescein and contains a GCA site The oligoribonucleotide substrate (SEQ ID NO: 8) was7Various in the position Nucleobases (U, C, A and G; SEQ ID NOs: 18, 22 respectively) , 23 and 24), respectively. Variant of catalytic oligomer, cleavage product fraction versus time (minutes) at cleavage It is a graph of.   FIG. 4B is labeled with short 5'-fluorescein and contains a GCA site The oligoribonucleotide substrate of SEQ ID NO: 8 was7Various in position Nucleobases or base analogs (U, 5-nitroindole, I and quinazoline -2,4-dione; SEQ ID NOs: 18, 27, 25 and 26, respectively. ) Of four 2'-O-allylated 5-ribocatalyst oligomers each containing FIG. 4 is a graph of the cleavage product fraction versus time (minutes) at cleavage for the mutant.                             DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION   Disclosed are compositions having RNA cleavage activity, as well as in vitro and And its use to cleave RNA substrates in vivo. This composition is , Active center (this subunit is a nucleotide and / or nucleotide analog Selected from) and specific hybridization with RNA substrates Flanking regions. Preferred compositions are combined with an RNA substrate. Thus, a structure similar to the hammerhead structure is formed. The active center of the disclosed composition is C16 .1 I that allows cleavage of RNA substrates with15.1Characterized by the existence of .   All naturally occurring hammerhead ribozymes are A15.1-U16.1Has base pairs I do. In addition, ribozyme substrates based on consensus hammerhead sequences Is N16.2U16.1H17Triplet (H17Is not guanosine) It is known to have a strong preference for quality (Koizumi et al., FEBS Lett.) . 228, 228-230 (1988); Ruffner et al., Biochemis. try 29,10695-10702 (1990); Perriman et al., Ge. ne 113: 157-163 (1992)). 16. Efficiently rank 1st U requirement Many experiments have been attempted to isolate reducible ribozymes, 6. Attempt to find a ribozyme that can cleave a substrate having a base other than U at position 1. Attempts have proved impossible (Perriman et al., Gene 113). : 157-163 (1992); Singh et al., Antisense and N ucleic Acid Drug Development 6: 165-1 68 (1996)).   However, the recently published X-ray crystal structure (Pley et al., Nature 3 72: 68-74 (1994), Scott et al., Cell 81: 991-100. 2 (1995) and Scott et al., Science 274: 2065-2069. (1996)), this A15.1-U16.1The interaction is adenosine exocyclic Non-standard salt having a single hydrogen bond between min (N6) and 4-oxo group of uridine It was understood to be a base pair. Then modeling studies (based on crystal structure) Et al., This wild type A15.1-U16.1Base pair interactions take on isostructural orientation. , C16.12-keto group and A of uridine turn6I to save the required contact with1 5.1 -C16.1It has been discovered that substitutions with base pairs can be spatially mimicked. This In the model, the polarity of the stabilized hydrogen bond between the 15.1 and 16.1 positions is I15.1-C16.1Although the interaction is reversed, the positive Reliable orientation is maintained.   15. A gellach-type ribozyme analog containing inosine at position 1 is N16.2C16.1 H17Discovered to easily cleave triplet-containing RNA substrates I have. Based on this, N16.2C16.1H17Of nucleic acids containing triplets Disclosed are compositions, preferably synthetic oligomers, that cleave target sequences. H17 Is preferably not guanosine. N16.2C16.1X17Groups with triplets Due to the ability to cleave the substance, the The number of targets is effectively doubled.   Composition having RNA cleavage activity   Particularly disclosed are compositions that cleave RNA substrates, wherein the composition comprises Component (a) and (b), wherein component (a) is 5'-Z1-ZTwo-3 'structure Wherein component (b) is 5'-ZThree-ZFour-3 '. Ingredient (a ) And (b) can be separate molecules or can be covalently linked. Component (a) and Element Z in (b)1And ZFourAre nucleotide and nucleotide analog, respectively. Or an oligomer sequence consisting of a combination of It is a pseudo analog. Element Z1And ZFourOligomer sequences are preferred with RNA substrates Or specifically by hybridization.   In these preferred compositions, the component ZTwoHas one of the following structures,     5'-XThreeXFourXFiveX6X7X8X9-3 'or     5'-XThreeXFourXFiveX6X7X8X9X9＾ -3 ’ Element ZThreeHas one of the following structures:     5'-X12X13X14X15.1-3 'or     5'-X ＾12X12X13X14X15.1-3 '   Element Z in these preferred compositionsTwoAnd ZThreeIs a nucleotide, nucleo It consists of a pseudo analog or a combination of both. Element ZTwoAnd ZThreeNucleos in Tide and nucleotide analogs have the following structures, respectively.   In the structural formula (I), each B is adenine-9-yl, cytosin-1-yl, Guanin-9-yl, uracil-1-yl, uracil-5-yl, hypoxanchi N-9-yl, thymin-1-yl, 5-methylcytosin-1-yl, 2,6-di Aminopurin-9-yl, purin-9-yl, 7-deazaadenin-9-yl, 7-deazaguanin-9-yl, 5-propynylcytosin-1-yl, 5-pro Pinyluracil-1-yl, isoguanin-9-yl, 2-aminopurine-9- Yl, 6-methyluracil-1-yl, 4-thiouracil-1-yl, 2-pyri Midon-1-yl, quinazolin-2,4-dione-1-yl, xanthine-9- Il, NTwo-Dimethylguanin-9-yl or a functional equivalent thereof;   Each V is O, S, NH or CHTwoGroup.   Each W is -H, -OH, -COOH, -CONHTwo, -CONHR1, -CON R1RTwo, -NHTwo, -NHR1, -NR1RTwo, -NHCOR1, -SH, -SR1, -F, -ONHTwo, -ONHR1, -ONR1RTwo, -NHOH, -NHOR1, − NRTwoOH, -NRTwoOR1Substituted or unsubstituted C1~ CTenof Linear or branched alkyl, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenDirectly Chain or branched alkenyl, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenDirectly Chain or branched alkynyl, substituted or unsubstituted C1~ CTenDirectly Chain or branched alkoxy, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenDirectly Chain or branched alkenyloxy and substituted or unsubstituted CTwo ~ CTenLinear or branched alkynyloxy. The substituents of the W group are independently Halogen, cyano, amino, carboxy, ester, ether, carboxamide , Hydroxy or mercapto. R1And RTwoIs substituted or substituted May be an unsubstituted alkyl, alkenyl or alkynyl group, wherein the substituent is Independently halogen, cyano, amino, carboxy, ester, ether, carbo Oxamide, hydroxy or mercapto.   D and E are phosphodiesters between adjacent nucleosides or nucleoside analogs. Forming a diester or phosphorothioate diester bond together or Residues that together form an analog of an interleoside linkage.   B is X15.1Is hypoxanthin-9-yl or a functional equivalent thereof. R; XFive, X8And X12Guanine-9-yl, hypoxanthine-9-i Or 7-deazaguanin-9-yl; X6, X9, X13And X14smell Adenin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, purine-9-i Or 7-deazaadenin-9-yl; XFourIn the uracil- 1-yl, uracil-5-yl, thymin-1-yl or 5-propynyluracil -1 -yl; XThreeIs cytosine-1-yl, 5-methylcytosine X can be -1-yl or 5-propynylcytosin-1-yl; X7, X9＾ and X ＾12Are adenine-9-yl, cytosin-1-yl, guanine-9-yl , Uracil-1-yl, uracil-5-yl, hypoxanthin-9-yl, thimi 1-yl, 5-methylcytosin-1-yl, 2,6-diaminopurine-9- Yl, purin-9-yl, 7-deazaadenine-9-yl, 7-deazaguanine -9-yl, 5-propynylcytosin-1-yl, 5-propynyluracil-1 -Yl, isoguanin-9-yl, 2-aminopurin-9-yl, 6-methyl Racyl-1-yl, 4-thiouracil-1-yl, 2-pyrimidone-1-yl, Quinazolin-2,4-dione-1-yl, xanthin-9-yl, NTwo−Dimethy It can be luguanin-9-yl or their functional equivalents. X15.1B of Preferably with hypoxanthin-9-yl, or any group at position 2 of this base C16.1Is an analog which cannot form a hydrogen bond with the 2-oxo group of the above. Preferably Is B is X15.1Is not guanin-9-yl.   XThree, XFour, XFive, X6, X7, X8, X9, X12, X13And X14B in Even functionally equivalent nucleobases in the catalytic center of the Nmmerhead ribozyme possible. For example, the hammerhead ribozyme CThree, UFour, GFiveAnd A6Is tR Form a structure that closely resembles the uridine turn of NA (Pley et al., Nature 372: 68-74 (1994)). Other nucleotide groups also form uridine turns So that nucleotide XThree, XFour, XFive, X6Has a structure similar to uridine turn One by nucleotide or nucleotide analog with potential to form May be replaced as a group. Similarly, hammerhead ribozyme Sheared base pairs in the catalytic core of this protein mimic the interactions of other non-standard base pairs. May have interactions. Regarding the catalytic core of hammerhead ribozyme Crystal structure knowledge suggests that non-standard base pairs have been replaced by isostructural non-standard base pairs. Along with the discovery that the Gerlach-type hammerhead ribozyme was active, Shows that a similar isostructural base-pair substitution is possible somewhere in the catalyst core .   Definition   As used herein, oligomers are of the same class (nucleotide Or different classes (such as nucleotides and ethylene glycol) An oligomer molecule consisting of subunits that can be a mixture is referred to. Disclosed Ori Gomer is non-numeric with an oligomer sequence, non-nucleotide linker or oligomer sequence. The combination with a nucleotide linker is preferred. Oligomers disclosed Is more preferably an oligomer sequence. The oligomer sequence is Nucleotides, each of which can interact with other oligomer sequences in a base-specific manner Includes a leo base (ie, the base portion of a nucleotide or nucleotide analog) Oligomer molecules. Hybridization of nucleic acid strands is based on such base characteristics. It is a preferred example of a different interaction. The oligomer sequence is preferably a nucleotide Consisting of, nucleotide analogs or both or oligonucleotides It is analog.   Non-nucleotide linkers are not associated with the oligomer sequence, but with the oligomer sequence. It can be any molecule capable of binding. Preferred non-nucleotide linkers are non-nucleic Oligomeric molecules formed from leotide subunits. Such non-nuku Examples of reotide linkers are described in Letsinger and Wu (J. Am. Chem. S. oc. 117: 7323-7328 (1995)), Benseler et al. (J. Am. . Chem. Soc. 115: 8483-8484 (1993)) and Fu et al. Am. Chem. Soc. 116: 4591-4598 (1994)). It is listed. Preferred non-nucleotide linkers or non-nucleotide linkers The subunit may be a substituted or unsubstituted C1~ CTenStraight chain or Branched alkyl, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenStraight or branched Branched alkenyl, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenStraight or branched Branched alkynyl, substituted or unsubstituted C1~ CTenStraight or branched Branched alkoxy, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenStraight or branched Branched alkenyloxy and substituted or unsubstituted CTwo~ CTenof Includes linear or branched alkynyloxy. These preferred non-nucleotide libraries The substituents of the linker (or subunit) may be halogen, cyano, amino, , Ester, ether, carboxamide, hydroxy or mercapto You.   As used herein, nucleoside is adenosine, guanosine, Cytidine, uridine, 2'-deoxyadenosine, 2'-deoxyguanosine, Refers to 2'-deoxycytidine or thymidine. What is a nucleoside analog? Conversion of nucleosides containing a chemical modification at some site on the base or sugar moiety of the oside It is a form that has been chemically modified. As used herein, nucleoside analogs The term refers to naturally occurring modifications such as, for example, inosine and pseudouridine. Nucleoside analogs based on the modified nucleoside and the modification of the sugar at the 2 'position Both nucleoside analogs with other modifications such as As used herein As described above, a nucleotide is a phosphate derivative of a nucleoside as described above. And the nucleotide analog is a phosphate derivative of the nucleoside analog as described above. It is. Subunits of oligonucleotide analogs such as peptide nucleic acids It is considered a nucleotide analog.   As used herein, ribonucleotides have a 2 'hydroxyl group. Is the nucleotide to be used. Similarly, 2'-deoxyribonucleotide is 2 'water This is a nucleotide having only an element. Accordingly, the ribonucleic acid used herein is Otides and deoxyribonucleotides are nucleosides that are not chemically modified Component adenosine, guanosine, cytidine and uridine, or 2'-deoxya Denosine, 2'-deoxyguanosine, 2'-deoxycytidine and thymidine Each refers to a naturally occurring nucleotide that has. Ribonucleoside, deoxy Siribonucleosides, ribonucleoside analogs and deoxyribonucleosides Analogs may include the phosphate groups found in nucleotides and nucleotide analogs or It is similarly defined as lacking a phosphate analog.   As used herein, an oligonucleotide analog is a sequence-dependent Nucleic acid-like properties such as simple hybridization, Nucleic acid-like, containing at one or more sites modifications away from NA nucleotides It is a polymer of matter. Preferred examples of oligonucleotide analogues are peptide nuclei Is an acid.   As used herein, base pairing is through one or more hydrogen bonds. Refers to pairs of interacting nucleotides or nucleotide analogs. Base pairs and The term refers to an interaction commonly characterized as Watson-Crick base pairing. But includes non-standard or sheared base pair interactions (To pal and Fresco, Nature 263: 285 (1976); Roman. t and Fresco, Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol . 15: 185 (1975)). Thus, nucleotide A15.1And U16.1Is a hammer Form a base pair in the head ribozyme (see FIG. 1). Standard (see FIG. 3).   The internucleoside linkage of two nucleosides can be a phosphodiester bond or Holothioate groups or other groups described, for example, in US Pat. No. 5,334,711. Can be achieved by a modified phospho bond, such as the bond of   Flanking element Z1And ZFour   (Element ZTwoAnd ZThreeElement Z adjacent to the active center)1And ZFourof The monomer subunit is preferably a nucleotide and / or nucleotide It is a log. Element Z1And ZFourAre preferably hybridized with a given RNA substrate. Specifically interact with each other,TwoAnd ZThreeWith the RNA group Structure that specifically cleaves proteins (preferably a structure similar to a hammerhead ribozyme) Is designed to form   On the other hand, element Z1And ZFourMay be ribonucleotides. Only However, the presence of ribonucleotides increases the in vivo stability of the oligomer. It is preferred that the number of ribonucleotides is as small as possible because of the reduction. element Z1And ZFour(And also the active center ZTwoAnd ZThree) Contains pyrimidine nucleobases Preferably, the position does not contain any ribonucleotides. Such a position Contains preferably nucleotide analogues.   Element Z1And ZFourUse of multiple deoxyribonucleotides is also preferred Less is that undesired interactions with the protein can occur or are RNase H-sensitive DNA-RNA hybrids can form . Therefore, the element Z1And ZFourPreferably each contain (1) a ribonucleotide. (2) contains more than three consecutive deoxyribonucleotide sequences Absent.   Element Z1And ZFourSubunits are preferably nucleotides, nucleotide Nalog or a combination thereof. Preferably, the element Z1And ZFourNucleus in Otide and nucleotide analogs have the following structures, respectively.   In the structural formula (I), each B is adenine-9-yl, cytosin-1-yl, Guanin-9-yl, uracil-1-yl, uracil-5-yl, hypoxanchi N-9-yl, thymin-1-yl, 5-methylcytosin-1-yl, 2,6-di Aminopurin-9-yl, purin-9-yl, 7-deazaadenin-9-yl, 7-deazaguanin-9-yl, 5-propynylcytosin-1-yl, 5-pro Pinyluracil-1-yl, isoguanin-9-yl, 2-aminopurine-9- Yl, 6-methyluracil-1-yl, 4-thiouracil-1-yl, 2-pyri Midon-1-yl, quinazolin-2,4-dione-1-yl, xanthine-9- Il, NTwo-Dimethylguanin-9-yl or a functional equivalent thereof;   Each V is O, S, NH or CHTwoGroup.   Each W is -H, -OH, -COOH, -CONHTwo, -CONHR1, -CON R1RTwo, -NHTwo, -NHR1, -NR1RTwo, -NHCOR1, -SH, -SR1, -F, -ONHTwo, -ONHR1, -ONR1RTwo, -NHOH, -NHOR1, − NRTwoOH, -NRTwoOR1Substituted or unsubstituted C1~ CTenof Linear or branched alkyl, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenDirectly Chain or branched alkenyl, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenDirectly Chain or branched alkynyl, substituted or unsubstituted C1~ CTenDirectly Chain or branched alkoxy, substituted or unsubstituted CTwo~ CTenDirectly Chain or branched alkenyloxy and substituted or unsubstituted CTwo ~ CTenLinear or branched alkynyloxy. The substituents of the W group are independently Halogen, cyano, amino, carboxy, ester, ether, carboxami , Hydroxy or mercapto. R1And RTwoIs substituted or substituted Unsubstituted alkyl, alkenyl or alkynyl group, wherein the substituent Is independently halogen, cyano, amino, carboxy, ester, ether, cal Boxamide, hydroxy or mercapto.   D and E represent a phosphide between adjacent nucleosides or nucleoside analogs. Form a homodiester or phosphorothioate diester bond together, or Residues that together form an analog of an internucleoside linkage.   Element Z of structural formula (I) having nucleotides and / or nucleotide analogs1 And ZFourFor each W is a substituted or unsubstituted C1~ CTen Linear or branched alkoxy, CTwo~ CTenLinear or branched alkenyloxy or CTwo ~ CTenIs preferably a linear or branched alkynyloxy.   Further, the flanking elements Z and Z1IsFourPeptide nucleic acid (also called peptide nucleic acid) Mentioned; for example, Nielsen et al., Science 254: 1497- 1500 (1991) and Dueholm et al. Org. Chem. 59: 5 767-5773 (1994)). May be included. In this case, the coupling of each subunit is, for example, an acid amide bond. Can be achieved by combination. Element Z1And ZFourIs suitable when based on peptide nucleic acids. Clever linkers (eg, Petersen et al., BioMed. Chem. Let. t. 5: 1119-1121 (1995)) or direct coupling (Bergmann et al., Tetrahedron Lett. 36: 682). 3-6826 (1995)). Element Z based on analogTwoAnd ZThreeAnd get coupled with. Element Z1And ZFourIs nu Combination of nucleotide (and / or nucleotide analog) and peptide nucleic acid When included, similar linkages can be used to couple different parts .   Flanking element Z1And ZFourSubunits occur naturally in RNA molecules. A nucleobase or a nucleobase capable of hybridizing or interacting with an existing nucleobase or Contains a nucleobase analog. Nucleobases are naturally occurring bases (immediately Adenine, guanine, cytosine, thymine and uracil) and 2,6-dia Minopurine, hypoxanthine, 5-methylcytosine, pseudouracil, 5-p With target RNAs, such as ropinyluracil and 5-propynylcytosine It is preferably selected from nucleobase analogs that allow specific binding.   RNA substrate and element Z1And ZFourAnd a strong sequence-specific interaction between (ie, R More stable hybrids between NA substrates and oligomers) are preferred. This purpose For the element Z1And ZFourTo standard nucleobases in the oligomer sequence of It is preferred that the following alternative nucleobase analogs are used: 2,6-diaminopurine instead; thymine or 5-propynyl instead of uracil Uracil; and 5-methylcytosine or 5-propynylcyto instead of cytosine Shin. Also preferred are 2-amino-2'-O-alkyl adenosines (Lamm et al. Nucleic Acids Res. 19: 3193-3198 (1991) ). In addition, nucleobases such as phenoxazine, which can enhance duplex stability An aromatic system can be linked to the 4- and 5-positions of uracil to produce nag (L in et al. Am. Chem. Soc. 117: 3873-3874 (1995) ).   Preferred RNA substrates for cleavage by the disclosed compositions have the following structures:   5'-ZFour'-C16.1-X17-Z1'-3' Where Z1’And ZFour’Is Z1And ZFourInteracts with C16.1Is Sichiji And X17Is adenosine, guanosine, cytidine or uridine. cleavage Is X173 '. Preferably, X17Is adenosine, cytidine or uridine And more preferably X17Is adenosine or cytidine, most preferably Is X17Is adenosine. Preferably, X16.2(Ie, ZFour3 'in' Nucleoside) is adenosine or guanosine. Cleaved by the disclosed composition The target site of the substrate that can be Uridine is required at position 16.1 of the conventional hammerhead ribozyme. It is different from the target site.   ZFourN at position 3 '16.2Position is guanosine, adenosine, schiji Or uridine. N16.2Is guanosine, adenosine or Preferably, it is one of thiidine. N16.2Is guanosine or adenosine More preferably, it is either one. N16.2Is most preferably guanosine New Preferred substrates for cleavage by the disclosed compounds are N16.2Is guanosine, adenosine Or cytidine, X17Is adenosine. According to the disclosed compound Preferred substrates for cleavage are N16.2Is guanosine or adenosine, and X17But It is adenosine. The most preferred substrate for cleavage by the disclosed compounds is N16.2 Is guanosine and X17Is adenosine.   Flanking element Z1And ZFourAre each independently preferably 3 to 40, more preferably Preferably it contains 5 to 10 nucleotides or nucleotide analogs. Z1 And Z1'Interact to form a stem of at least three base pairs, and ZFourAnd ZFour 'Preferably interact to form a stem of at least three base pairs. . These stems are ZTwoAnd ZThreeIs more preferably adjacent to Z1 And Z1'Interact to form a stem of more than three base pairs and ZFourAnd ZFour’ Most preferably interact to form a stem of more than three base pairs.   Preferred RNA substrates are inhibitory secondary structures associated with the target region of the RNA. Which have very little. Which region of the RNA molecule contains the secondary structure, Thus, less preferred, which regions of the RNA molecule have little secondary structure, There are therefore many ways to determine which is more favorable. The region of single-stranded RNA A preferred method for determining is to selectively react with a region of single-stranded RNA or This region is mapped by recognizing it. Nucleoti Many chemicals that react with nitrogen on the Watson-Crick surface (DMS), diethyl pyrocarbonate (DEPC), catoxal (CMCT), Rubodiimide). Nucleotides involved in Watson-Crick base pairing Will react less to these chemicals than uninvolved nucleotides Shows sex. With chemically modified RNA (reverse transcriptase, RNase T1, cobra venom Using nuclease, nuclease S1, nuclease V1) Truncated oligonucleotides whose length depends on the base where the chemical reaction occurred Is created. Because chemical reactions occur preferentially in the single-stranded region of RNA, Surgery indicates where the secondary structure of the RNA is. For example, dimethyl sulfate and reverse transcription Methods such as enzyme mapping indicate where the region of the double-stranded RNA is. Reverse Transcriptases cannot replicate regions of double-stranded RNA under appropriate conditions, During analysis by acrylamide gel electrophoresis (PAGE), during replication There is a transcript aborted at the point where the strong secondary structure Indicates whether there is an RNA region. Examples of this method are described in Kamar et al., Bioche. mystery 33 (2): 583-592 (1994), Mandiyan and Bo ublik, Nucleic Acids Res. 18 (23): 7055-7 062 (1990), Bernal and Garcia-Arenal, RNA 3 ( 9): 1052-1067 (1997) and Ehresmann et al., Nuclei. c Acids Res. 15 (22): 9109-9128 (1987) Have been.   Another method for evaluating which regions of RNA are single-stranded is RNase H Mappin It is. In this method, short random DNA oligonucleotides are synthesized, It is mixed with the target RNA. The easily accessible region is this short DNA Hybridized with child. Next, this DNA-RNA hybrid region is Cleaved by ase H. Next, the labeled RNA molecule is Can be analyzed. The cleaved molecules are sequenced on a sequencing ladder. dder), the region of the single-stranded DNA can be deduced. This way Are described in Ho et al., Nature Biotechnology 16: 59- 63 (1988) and McSwiggen in US Patent No. 5,525,468. Has been described.   To determine accessible single-stranded regions of RNA, in vitro sorting (Szostak, TIBS 19: 89-93 (1992)). . For example, target RNA can be used for primer binding which can be used for PCR amplification It can be mixed with a random DNA oligonucleotide containing the region. Amplification and re- By repeating selection, it is possible to enrich DNA sequences that can bind to RNA Become. This allows access for oligonucleotide hybridization. Regions of the RNA that can be tested are identified. This selection or enrichment step is optional size selection It may be another technique or a technique for separating double-stranded nucleic acids. For example, Sephadex In column chromatography, large, binding DNA: RNA complexes and small What Unbound DNA molecules are separated, and nitrocellulose filtration methods NA is retained while unbound DNA molecules pass through.   There are also a number of methods for optimizing oligomers for a given substrate. For example Of oligomers without specific sequence requirements7Change the position and set the target Unwanted secondary structure can occur in oligomers designed for sequence This can help minimize gender. Also, 7-deazaguanosine or Certain base modifications, such as 7-deazaadenosine, may result in unwanted purine: purine phases. Used in areas with multiple guanosine or adenosine to prevent interaction Can be Similar substitutions can be made, for example, by Z1Or ZFourGroup that may exist in the area This can be achieved by introducing inosine into the anosine-rich region.   Catalyst core   Element ZTwoAnd ZThreeIs believed to form the catalyst core of the disclosed composition, preferably Consists of nucleotide analogs and a small number of ribonucleotides. Element ZTwoPassing And ZThreeWherein each W (of structural formula (I)) is1~ CFiveLinear or branched alkyl Le, CTwo~ CFiveLinear or branched alkenyl, CTwo~ CFiveLinear or branched alkynyl, C1~ CFiveLinear or branched alkoxy, CTwo~ CFiveLinear or branched alkenyloxy of , And CTwo~ CFiveIs preferably a linear or branched alkynyloxy. Also, Each XThree, XFour, X7And X ＾12W is NHTwo, OH-substituted C1~ CFourAl Kill, OH-substituted CTwo~ CFourAlkenyl, OH-substituted C1~ CFourOf alkoxy or OH-substituted CTwo~ CFourIs preferably alkenyloxy. Each XThree, XFour, X7 And X ＾12W is NHTwo, Methoxy, 2-hydroxyethoxy, ant More preferably, it is ruoxy or allyl. Also, X12W is- It is preferably H or -OH. In addition, each X13And X14In, W is C1 ~ CFourAlkyl, CTwo~ CFourAlkenyl, C1~ CFourOf the alkoxy, CTwo~ CFourof Alkenyloxy, OH-substituted C1~ CFourAlkyl, OH-substituted CTwo~ CFourAl Kenyl, OH-substituted C1~ CFourAlkoxy or OH-substituted CTwo~ CFourThe alkenyl of Preferably it is oxy. Each X13And X14In the above, W is methoxy, 2- More preferably, it is hydroxyethoxy or allyloxy.   Element ZTwoAnd ZThreeSubunits are preferably weaker with ribonucleotides Is a nucleotide analog that can only hybridize. Such a subunit Examples of substituted are substituted at the 2 'position of ribose, preferably having 1 to 5 carbon atoms. Unsubstituted or substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, A nucleotide analog containing an alkenyloxy or alkynyloxy group; You. For this purpose the element ZTwoAnd ZThreeNucleo salts that can be used in The groups are adenin-9-yl, purin-9-yl, uracil-1-yl, cytosine -1-yl, guanin-9-yl and hypoxanthin-9-yl.   The following nucleotides and nucleotide analogs (related to components of structural formula (I) Do) element ZTwoPreferred for:   XThreePosition: B = cytosin-1-yl, V = O, W = allyloxy; B = cytosine -1-yl, V = O, W = allyl;   XFourPosition: B = uracil-1-yl, V = O, W = allyloxy; B = uracil -1-yl, V = O, W = allyl; B = uracil-1-yl, V = O, W = OH ;   XFivePosition: B = guanine-9-yl, V = O, W = amino; B = guanine-9- Il, V = O, W = OH;   X6Position: B = adenin-9-yl, V = O, W = H; B = purin-9-yl, V = O, W = OH; B = adenine-9-yl, V = O, W = OH;   X7Position: B = uracil-1-yl, V = O, W = allyloxy; B = cytosine -1-yl, V = O, W = allyl;   X8Position: B = guanin-9-yl, V = O, W = amino; B = hypoxanthine -9-yl, V = O, W = OH; B = guanin-9-yl, V = O, W = OH;   X9Position: B = adenin-9-yl, V = O, W = H; B = purin-9-yl, V = O, W = OH; B = adenin-9-yl, V = O, W = allyloxy.   The following nucleotides and nucleotide analogs (related to components of structural formula (I) Do) element ZThreePreferred for:   X12Position: B = guanine-9-yl, V = O, W = H; B = 7-deazaguanine -9-yl, V = O, W = OH; B = guanin-9-yl, V = O, W = OH;   X13Position: B = adenine-9-yl, V = O, W = allyloxy; B = adenine -9-yl, V = O, W = 2-hydroxyethoxy; B = purin-9-yl, V ＯO, W = allyloxy;   X14Position: B = adenin-9-yl, V = O, W = allyloxy; B = purine- 9-yl, V = O, W = OH; B = adenin-9-yl, V = O, W = 2-hydr Roxyethoxy; B = purin-9-yl, V = O, W = allyloxy;   X15.1Position: B = hypoxanthin-9-yl or functional equivalent thereof, V = O, W = OH.   Element ZTwoAnd ZThreeInteract in such a way as to allow the formation of a catalyst structure . In a preferred composition, ZTwoAnd ZThreeIs a catalyst structure similar to the hammerhead catalyst structure Interact in such a way as to allow the formation of ZTwoAnd ZThreeInteract and touch One way in which the medium structure can be formed is to use ZTwoAnd ZThreeThe nucleotides comprising and / or Is through the interaction of nucleotide analogs. The disclosed composition comprises RNase H Has an RNA cleavage activity independent of That is, the disclosed composition relates to RNase H. Instead, cleavage of the RNA substrate can occur. The disclosed composition is RNase H Although it may be possible to facilitate the cleavage of RNA by RNA, it is preferred not to do so.   ZTwoAnd ZThreeThe desired interaction with is preferably ZTwo3 'end and / or ZThreeOf 5 Enhanced by coupling the element to the 'end. Single element (this description Z in the bookFive) Is the element ZTwoAnd ZThreeTo covalently bind Can be used for The structure of such a form of the disclosed composition is 5'-Z1-ZTwo-ZFive -ZThree-ZFour-3 '. Separate elements (herein Z6And Z7Called Is) ZTwoAnd ZThreeCan be coupled to, preferably interact (non-covalently) And the element ZTwoAnd ZThreeMay be stabilized or otherwise enhanced. This form The component (a) of the composition of 5′-Z1-ZTwo-Z6-3 ' (B) is 5'-Z7-ZThree-ZFour-3 '.   Element ZFive, Z6And Z7Are oligomer sequences, non-nucleotide linkers or oligos It is preferred that the combination is a combination of a gonomer sequence and a non-nucleotide linker. element ZFive, Z6And Z7Is more preferably an oligomer sequence. These ori Gomer sequences interact to form an intramolecular stem (ZFive) Or the intermolecular stem (Z6Passing And Z7Is most preferable. Such a stem is preferably Contains 2 to 30 base pairs and is preferably continuous (i.e., an unpaired salt No group). Element ZFive, Z6And Z7Is preferably a nucleotide, a nucleotide Consists of nalogs or both, or is an oligonucleotide analogue . ZFiveIs ZTwoAnd ZThreeInteract with itself in a way that stabilizes the interaction of It is preferred to use Similarly, Z6Is ZTwoAnd ZThreeStabilize the interaction of Z in an undulating manner7Preferably, it interacts with Elements are nucleotides and / or Or oligomer sequences and oligonucleotides composed of nucleotide analogs Preferably analogs or combinations thereof and capable of hybridizing to each other. No.   Element ZFiveIs ZTwoThe 3 'end ofThreeLinker that couples to the 5 'end of Can serve as. Element ZFiveIs preferably a non- Nucleotide molecules, or nucleotides, nucleotide analogs and oligonucleotides Oligomer sequences, including nucleotide analogs, Consists of any combination of analogs and oligomeric nucleotide analogs It is. Element ZFiveA preferred form of is that they react in a molecule to form a stem-loop structure. Nucleotides, nucleotide analogs, oligonucleotide analogs that can be formed Or a combination of nucleotides and nucleotide analogs. Element ZFivePreferred stem-loop structures are those containing from 2 to 30 base pairs. is there.   A preferred embodiment of the disclosed composition is that all nucleotides are 2'-O-allyl-ribo. 5'-Z which is a nucleotide or 2'-O-methyl-ribonucleotide1-ZTwo− ZFive-ZThree-ZFour-3 ', but XFour, XFive, X6, X8, X12, X15.1The rank is 2 ' It is a ribonucleotide whose position is not modified (W = OH).   Another preferred embodiment of the disclosed composition is that the nucleotides are all 2'-O-allyl- 5'-Z which is a ribonucleotide or 2'-O-methyl-ribonucleotide1− ZTwo-ZFive-ZThree-ZFour-3 ', but XFive, X6, X8, X12, X15.1The rank is 2 ' It is a ribonucleotide whose position is not modified (W = OH).   Another preferred embodiment of the disclosed composition is that the component (a) is 5'-Z1-ZTwo-Z6-3 ' And component (b) is 5′-Z7-ZThree-ZFour-3 ', the above component (a); (B) wherein all nucleotides are 2'-O-A A lyl-ribonucleotide or 2'-O-methyl-ribonucleotide, but XFour , XFive, X6, X8, X12, X15.1The position is unmodified at the 2 'position (W = OH) Ribonucleotide.   Another preferred embodiment of the disclosed composition is that the component (a) is 5'-Z1-ZTwo-Z6-3 ' And component (b) is 5′-Z7-ZThree-ZFour-3 ', the above component (a); (B) wherein all nucleotides are 2'-O-A A lyl-ribonucleotide or 2'-O-methyl-ribonucleotide, but XFive , X6, X8, X12, X15.1Position is a 2'-position unmodified (W = OH) ribo Nucleotides.   A preferred form of the disclosed composition is ZTwoHas a G at the 3 'end. Ta ira and co-workers (Amontov and Taira, J. Am. Chem. So c. 118: 1624-1628 (1996)) is a hammerhead-like ribozyme. R9Stacking energy from guanosine juxtaposed to the It has been shown to stabilize formation. Therefore, Z6The 5 'nucleotide of is G Is preferred.   The 3 'end of the disclosed compositions may be, for example, at the 3' position of a ribose sugar (e.g., as defined above). Substituted or unsubstituted alkyl, alkoxy, a Include alkenyl, alkenyloxy, alkynyl or alkynyloxy groups; By using modified nucleotide analogues) It can be protected against degradation by nucleases. The disclosed compositions also include 3'-3 ' -Linked dinucleotide structures (Ortigao et al., Antisense Rese arch and Development 2: 129-146 (1992)) And / or two modified phospho linkages such as two phosphorothioate linkages To prevent degradation at the 3 'end by exonuclease Can be stabilized.   The disclosed compositions can also enhance its uptake into cells and / or enhance the activity of certain cells. It may be linked to a prosthetic group to allow for localization. Such prosthetic group Examples are polyamino acids (e.g., polylysine), lipids, hormones or peptides. You. These prosthetic groups are usually directly or with a suitable linker (eg, 6-amino A linker based on hexanol or 6-mercaptohexanol) Linked via the 3 'or 5' end of the ligomer. These linkers are commercially available Suitable techniques for linking prosthetic groups to oligomers are known to those skilled in the art. I have.   Increasing the rate of hybridization will increase the biological activity of the disclosed compositions. Can be important in this way to achieve higher activity at lower concentrations of the composition Because it becomes possible. This may be a short-lived RNA substrate or less frequently Important for RNA substrates that do not occur. Substantial addition of hybridization For example, a positively charged peptide (eg, containing some lysine residues) This can be achieved by coupling to the end of the oligonucleotide (C orey, J .; Am. Chem. Soc. 117: 9373-9374 (199 5)). The disclosed compounds can be easily modified in this manner using the linkers described above. . Alternatively, the hybridization rate may include sperminyl residues. Can also be enhanced by incorporating subunits (Schmid and Behr , Tetrahedron Lett. 36: 1447-1450). Disclosure Such modifications of the product also enhance the ability to bind RNA substrates with secondary structure .   Oligomers synthesis   The disclosed compounds can be synthesized using any suitable method. Many synthetic methods are known Have been. The following techniques are preferred for the synthesis of the disclosed compounds. Purine ribonucleotide Appropriate 3 'terminus (Ortiga), such as a converted thymidine residue containing o et al, Antisense Research and Developmentmen t2: 129-146 (1992)) or 3'-exonuclease 2'-O with two phosphorothioate linkages at the 3 'end preventing possible degradation -Allyl-modified oligomer is a solid phase β- using any commercially available DNA / RNA synthesizer Can be synthesized by cyanoethyl phosphoramidite chemistry (Sinha et al., N. ucleic Acids Res. 12: 4539-4557 (1984)). A preferred method is to use 2'-O-tert-butyl dimethyl for ribonucleotides. Lucilyl (TBDMS) protection strategy (Usman et al., J. Am. Chem. Soc) . 109: 7845-7854 (1987)), and the required 3'-O-e All suphoramidites are commercially available. Furthermore, aminomethyl polystyrene of Use as a support material is preferred due to its advantageous properties (McCollum and Andrus, Tetrahedron Letters 32: 4069-4. 072 (1991)). Using commercially available fluorescein phosphoramidite, Fluorescein can be attached to the 5 'end of the substrate RNA during growth. In general, The desired oligomer can be synthesized using standard RNA cycles. Assemble After completion of the extraction, concentrated aqueous ammonia water / ethanol (3: 1 v / v) at 55 ° C. for 8 hours to remove all unstable base protecting groups. Remove. Ethanol suppresses early removal of 2'-O-TBDMS But at the position of the ribonucleotide otherwise obtained under the basic conditions of deprotection, Chain cleavage occurs (Usman et al., J. Am. Chem. Soc. 1). 09: 7845-7854 (1987)). After lyophilization, TBDMS protection The oligomer is triethylamine trihydrofluoride / triol at 60 ° C. for 2 hours. Treat with a mixture of ethylamine / N-methylpyrrolidone and silyl under neutral conditions Protecting groups are removed quickly and efficiently (Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23: 2677-2684 (1995)). Then completely The deprotected oligomer was prepared by the method of Cathala and Brunel (Nuclee ic Acids Res. 18: 201 (1990)). Can be Purification was performed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis or ion exchange HPL. C (Sproat et al., Nucleosides and Nucleotide s 14: 255-273 (1995)) and any combination of reverse phase HPLC. Can be implemented. For intracellular use, the synthesized oligomer must be It is preferable to convert to sodium salt by precipitation with sodium perchlorate in . The remaining traces of salt are then preferably passed through a small commercial disposable gel filtration column. Removed using. As a final step, the identity of this isolated oligomer Assisted laser desorption mass spectrometry (Pieles et al., Nucleic Acids Res. 21: 3191-3196 (1993)) and nucleosides Confirm by base composition analysis. In addition, the corresponding chemically synthesized short oligos Also preferred is a cleavage function test using this oligomer on a nucleotide substrate .   Cleavage of RNA substrate   RNA cleavage is facilitated by protein factors present in the nucleus or cytoplasm of the cell As such, the disclosed compounds have very high in vivo activity. Hammer Examples of such protein factors that can increase the activity of ribozymes include, for example, The nucleocapsid protein NCp7 of HIV1 (Muller et al.,J. Mol. Biol . 242: 422-429 (1994)) and heterologous nuclear ribonucleic acid. Nuclear protein A1 (Heidenreich et al.,Nucleic Acids Res . 23: 2232-2228 (1995)). Therefore, Long RNA transcripts are efficiently cleaved in cells by the disclosed compounds.   The disclosed compounds include one or several oligomers and , Optionally comprising pharmaceutically acceptable auxiliary substances, additives and carriers Can be used for adult products. Such pharmaceutical compositions include eukaryotes, prokaryotes and viruses. Viruses such as oncogenes or viral genes or RNA molecules in cells. It is suitable for the production of a drug that specifically inactivates the expression of a gene. Further application A range is the inactivation of plant or insect gene expression. Therefore, disclosed The composition can be used as pharmaceuticals for humans and animals and insecticides for plants. You.   Various methods are available for delivering the disclosed compounds to cells. An example For example, commonly disclosed compounds are incorporated into or on microparticles be able to. As used herein, microparticles are synthetic and Liposomes, virosomes, and microspheres formed from natural and / or natural polymers And microcapsules. Microcapsules and microspheres Methods of making such are known to those skilled in the art and include solvent evaporation, solvent casting, spray drying and And solvent elongation. Can be incorporated into various microparticles Examples of useful polymers include polysaccharides, polyanhydrides, polyorthoesters. , Polyhydroxides and proteins and peptides.   Liposomes are described in Kim et al., Biochim. Biophys. A cta 728: 339-348 (1983); Liu et al.,Bioc him. Biophys. Acta , 1104: 95-101 (1992); And Lee et al.,Biochim. Biophys. Acta., 110 3: 185-197 (1992); Wang et al.,Biochem., 2 8: Prepared by standard methods as reported by 9508-9514 (1989) it can. Such methods include the use of nucleic acid molecules in MOLT-3 leukemia cell line nuclei and cells. Used for delivery to the cytoplasm (Therry and Dritschil o,Nucl. Acids Res., 20: 5691-5698 (1992)). Alternatively, the disclosed compounds can be ionic or covalently microparticulated. Can be incorporated into the microparticles or bound to the outside of the microparticles. Wear.   Cationic liposomes or microcapsules can be used as an Microparticles that are particularly useful for delivering sexually charged compounds Alternatively, the compound can bind ionically to the positively charged outer surface of the liposome. Fe Igner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987); Felgner,Advanced D rug Delivery Reviews , 5: 163-187 (1990); Clarenc et al.,Anti-Cancer Drug Desi gn , 8: 81-94 (1993). Liposomes provide nucleic acids or nucleic acid-proteins to cells both in vitro and in vivo. It has been shown to be very effective for the delivery of protein complexes. Formed from a mixture Liposomes or microcapsules ionize negatively charged compounds Cationic liposomes or macromolecules to have a net positive charge that will bind to Microcapsules are fats containing a sufficient amount of one or more cationic side chains. It can be produced using a mixture of qualities. Used to produce cationic liposomes Examples of positively charged lipids used include the aminolipid dioleoylphosphatidyl Ethanolamine (PE, with a positively charged primary amino head); phosphatidyl Rucholine (PC, with a positively charged head that is not a primary amine); and N [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-triethylammonium ("DOTMA," Felgner et al.,Proc. Natl. Ac ad. Sci USA , 84: 7413-7417 (1987); Felgner.   et al.,Nature, 337: 387-388 (1989); Felg. ner,Advanced Drug Delivery Reviews, 5 : 163 -187 (1990)).   Preferred Shapes of Microparticles for Disclosed Composition Delivery Have Heme Micro particles. In these microparticles, the hem Intercalated or shared into the outer surface of microparticles Joined with a join. Microparticles with heme are used to Effective because it is preferentially bound and taken up by cells that express This has the advantage that the dosage required for the dosage may be significantly lower. Such targeted delivery also involves the use of relatively high drug concentrations in untargeted delivery methods. It also reduces possible systemic side effects. Micro party with hem Suitable lipids for the formation of vesicles are 1,2-dioleoyloxy-3- (trimethylan Monium) propane (DOTAP) and dioleoylphosphatidylethanol Luamine (DOPE). Manufacture and use of microparticles with hem Applications are described in PCT application WO 95/27480 by Innovir.   The disclosed compositions can also be encapsulated by cationic liposomes or cationic It can be coated on liposomes, which can be injected intravenously into mammals. This system consists of endothelium and Introduction of DNA into cells of various tissues of adult mice including bone marrow where hematopoietic cells exist (Eg, Zhu et al.,Science, 2 61: 209-211 (1993)).   Liposomes containing the disclosed compositions can be used to disclose the disclosed compounds to target cells. An effective amount for delivery, for example, systemically by intravenous or intraperitoneal administration. Wear. Other possible routes include those used with appropriate microparticles. Includes transdermal or oral administration. In general, liposome-bound The total amount of ligomer is not administered for the same desired or intended effect. It will be less than the amount of unbound oligomer that must be.   Polylactic and polyglycolic acid copolymers, polyethylene and polyortho Compositions containing various polymers such as esters and the disclosed compositions are Can be delivered locally to the appropriate cells using a catheter or syringe. That's it Other means of delivering such compositions locally to cells include the use of infusion pumps (eg, , Alza Corporation, Palo Alto, California i a) or a sustained release of the therapeutic composition to the area adjacent to the implant Incorporation of the composition into a possible polymeric implant (eg, Johnson a) nd Lloyd-Jones, eds., Drug Delivery Sy stems, Chichester, England: Ellis Horwo od Ltd., 1987).   For therapeutic applications, the active substance is preferably between 0.01 and 10,000 μg / kg body. It is administered at a concentration of 0.1 to 1000 μg / kg body weight, more preferably. Administration Can be administered, for example, by injection, inhalation as a spray (e.g., as an aerosol), orally (e.g., Topical or rectal (eg, as tablets, capsules, coated tablets, etc.) Suppositories).   The disclosed compositions can be used in a method for specific inactivation of gene expression. So that the product cleaves a predetermined RNA molecule that is present in the cell (cleavage Preferably occurs catalytically), an active concentration of the composition is taken up by the cells. US special A similar composition described in U.S. Pat. It has been successfully activated (Lingstadaas et al.,EMBO J. 1 4: 5224-5229 (1995)). This method works in vitro on cultured cells. And living organisms (such as prokaryotes or humans, animals or plants) (Eukaryote).   The disclosed compositions can also be used as RNA restriction enzymes to cleave RNA molecules. Can be used (eg, in vitro reactions without cells). The disclosed composition also comprises RN It can also be used in a reaction kit for restriction cleavage of the A molecule, for example, And suitable buffering substances. In this case, oligomers and buffering The substance can be in the form of a solution, suspension or solid, such as a powder or a lyophilizate. You. The reagents can be present together, separated from each other or optionally on a suitable carrier. You. The disclosed compositions can also be used as diagnostic reagents or to identify functions of unknown genes. Can also be used for   The invention will be further understood with reference to the following non-limiting examples.Example Example 1: Inosine substitution at position 15.1 can effectively cleave N 16.2 C 16.1 H 17 Cleavage reaction indicating that   N16.2C16.1H17Motif (where H17Is not guanosine) A set of 12 substrates was synthesized, including The oligomers and And the corresponding substrates are shown in Table 1. Each of the substrates has fluorescein at the 5 'end. And an inverted thymidine cap at the 3 'end was used. Four A set of two catalytic oligomers is synthesized, and a properly matched catalytic Offering rigomers. Each of these catalytic oligomers has a wild boar at the 15.1 position. Have U at position 16.1 of the substrate and A at position 15.1 of the catalytic oligomer Certain control substrates and catalytic oligomers were also synthesized.   Fl = fluorescein label   * T = 3'-3 'reverse thymidine   A, C, G, I, U = ribonucleotide (I is inosine)   a, c, g, u = 2'-O-allyl-ribonucleotide   The above substrates and catalyst oligomers require U at position 16.1 for cleavage. Reaction to determine the ability of inosine at position 15.1 to overcome Used in All reactions were performed using the following protocol. reaction The reaction is typically performed in 100 μl and the reaction is distilled and autoclaved. HTwoO, 10 mM MgClTwo, 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 μM ribozyme and 0.25 μM substrate are included. Catalyst oligomer, substrate And buffer were added together and heated at 95 ° C. for 5 minutes. Room over 5 minutes After cooling to warm, the reaction solution wasTwoAnd mix at 37 ° C Was. Take 10 μl at specific time intervals (10, 30, 60 and 120 minutes) and 3 μl of loading buffer (95% formamide, 100 mM EDTA pH 8.0, 0.05% bromophenol blue). The sample is Analyzed by 20% polyacrylamide gel electrophoresis. Gel is Molecu analyzed by lar Dynamics Fluorescence Imager Was. This type of cleavage reaction using the substrates and catalytic oligomers shown in Table 1 The results are shown in Table 2.  The numbers indicate the indicated time points (0, 10, 30, 60 and 120 minutes after the start of the reaction). (After) indicates the percentage of substrate cleaved. The result is C in 16.1 place That the substrate can be cleaved by a catalytic oligomer containing I at position 15.1. Is shown. Although there are differences between the various substrates at 120 minutes, The substrate with C is in all cases the catalytic oligomer with I at position 15.1 The data show that efficient cleavage can be achieved, with the substitution of I at position 15.1 being N16 .2 C16.1H17Indicates that it actually allows cleavage of the appropriate substrate containing the site ing.   C16.1And 12 substrates having16.1Has the corresponding of the control substrate The initial rate of cleavage by the catalytic oligomer (all shown in Table 1) is a single turn Was determined using bar kinetics. Single turnover kinetics is 2.5 μl 1 00 μM ribozyme solution, 2.5 μl of 10 μM 5 ′ fluorescein-labeled substrate Mix the solution and 10 μl of 100 mM Tris-HCl pH 7.4 solution. Was calculated by The mixture was diluted to a final volume of 90 μl and added to 95 ° C for 5 minutes. After heating, it was cooled to 37 ° C. 10 μl of 100 mM MgClTwoAdd solution To start the reaction. The final concentration of the reaction components was 250 nM substrate, 2. 5 μM ribozyme and 10 mM MgClTwoMet. 10 my at various times Take a milliliter sample and add 10 μl of 100 mM E to stop the reaction. DTA, mixed with bromophenol blue solution. The cleavage product is determined by PAGE Separated from unreacted substrate, Molecular Dynamics Fluore It was quantified by a science imager.   Data measured as the fraction of cleaved substrate versus time is based on Jankovs ky and Schwenzer,Nucl. Acids Res. 24: 4 33 (1996)         Fraction [P] = H0(1-ek21) / S0 Adapted. K calculated for various ribozymesTwoThe values of are shown in Table 3. I have.  Fl = fluorescein label   *T = 3'-3 'reverse thymidine   A, C, G, I, U = ribonucleotide (I is inosine)   a, c, g, u = 2'-O-allyl-ribonucleotide   The result is A16.2C16.1H17And G16.2C16.1H17Substrate with triplet Indicates that cutting is performed at a high speed. 15. Contrast with A in 1st place (G)16.2U16.1C17Cleavage of substrate with triplet) Is A16.2C16.1H17And G16.2C16.1H17Substrate with triplet (15. Cleaved by a catalytic oligomer having I at position 1)15.1-U16.1base Have a faster initial cleavage rate than the corresponding control reaction, including paired reactants Is shown.Example 2: GCH and catalytic oligomers containing only ribonucleotides And cutting speed with ACH triplet   All ribonucleases designed to cleave GCH and ACH triplets Substrate RNA cleavage by nucleotide oligomers (unmodified) was evaluated Was. The oligomer used was SEQ ID NO: 17 (cut after ACH triplet) ) (Table 1) and SEQ ID NO: 18 (cut after GCH triplet) (Table 1) Met. The corresponding short fluorescently labeled substrates, SEQ ID NOs: 4, 5 and 6 (ACH (Including the triplet) (Table 1) and SEQ ID NOs: 7, 8 and 9 (GC H triplet) (Table 1), SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 17, respectively. Used with the catalyst oligomer of D number: 18.   The reaction was carried out under single turnover kinetic conditions with 2.5 μM catalytic oligomer and 2 μM. Using 50 nM substrate, pH 6.0 in the presence of 10 mM Mg2 +, and 1 mM   Mg2+Performed at both pH 7.4 in the presence. All other conditions were as in Example 1. Identical to those used in.   Data was analyzed as in Example 1. All ribonucleotide catalyst oligomers And the k of the six combinations of the corresponding substratesTwoThe values are shown in Table 4. All ribonucleotides targeting GCA, GCC, ACA and ACC sites Oligomers are all ribonucleotides that target a GCU or ACU site It has a faster cleavage rate than do oligomers. In addition, the cleavage activity was 1 mM M g2+Table 4 shows that it is very fast in the presence. This level of Mg2+Is imbi Mg in bo2+Similar to concentration.Example 3: GC with a catalytic oligomer containing only six ribonucleotides Cutting speed with H and ACH triplets   6-ribonucleic acid designed to cleave GCH and ACH triplets The cleavage of substrate RNA by otide oligomers was evaluated. These oligomers Where the ribonucleotide is UFour, GFive, A6, G8, G12And I15.1Exist in place And all other positions were 2'-O-allyl-ribonucleotides (number (See Figure 2 for numbering). The oligomer used was SEQ ID NO: 17 ( (Cut after ACH triplet) (Table 1) and SEQ ID NO: 18 (GCH triplet) (Cut after let)) (Table 1). Corresponding short fluorescently labeled substrate, SEQ ID NO: 4, 5 and 6 (including the ACH triplet) (Table 1) and SEQ ID NO: 7, 8 and 9 (including the GCH triplet) (Table 1), each having the sequence ID number No.:17 and SEQ ID NO: 18 were used with the catalyst oligomer.   The reaction was carried out under single turnover kinetic conditions with 2.5 μM catalytic oligomer and 2 μM. Using 50 nM substrate, 10 mM Mg2+At pH 6.0 in the presence and 1 mM   Mg2+Performed at both pH 7.4 in the presence. All other conditions were as in Example 1. Identical to those used in.   Data was analyzed as in Example 1. 6-ribocatalyst oligomer and corresponding Calculated for six combinations of substratesTwoThe values are shown in Table 5.   These results indicate that UFour, GFive, A6, G8, G12And I15.1All resources except the place SEQ ID NO: 17 (ACH triplet) (Table 1) and SEQ ID NO: 18 (cut after GCH triplet) ) (Table 1) indicates that the catalyst oligomer has activity remaining. these The results also indicate that the catalytic oligomer is a physiological concentration of Mg2+Can cleave substrates Also shown.Example 4: GCA triplex with catalytic oligomers with different sugar modifications at the U 4 position Cutting speed   UFourThe cleavage of the substrate RNA by the oligomer having a modification at the position was evaluated. these Assays show that oligomers containing nuclease resistance modifications retain activity and retain activity. Shows that different modifications can be made to a given position of the catalytic oligomer as is. ing. The catalyst oligomer was based on SEQ ID NO: 18. Mutant I was made from SEQ ID NO: 18, except that 5 nucleotides were 2'-O-A Modified with a lyl-ribonucleotide (ribonucleotide is GFive, A6, G8, G12And I15.1And all other positions are 2'-O-allyl-ribonucleic acids. Otide; see FIG. 2 for numbering). Variant II has the sequence ID number: 18 and all 2'-O-allyl-ribonuclei except for 6 nucleotides. Modified with nucleotides (ribonucleotidesFour, GFive, A6, G8, G12You And I15.1And all other positions are 2'-O-allyl-ribonucleotides Met). Mutant III is GFive, A6, G8, G12And I15.1Ribonucleotide in position And UFourAt position 2'-amino-2'-deoxyuridine. other of All bases were 2'-O-allyl-ribonucleotides.   The reaction was carried out under single turnover kinetic conditions with 2.5 μM catalytic oligomer and 2 Using 50 nM substrate, 1 mM Mg2+Performed at pH 7.4 in the presence. other All conditions were identical to those used in Example 1.   Data was analyzed as in Example 1. The calculated kTwoValues are all ribonuclei 2.32 min for Otide body-10.10 min against mutant I-1, Mutation 0.87 min for body II-1, And 0.56 min for the mutant-1In Was. These results indicate that different modifications that inhibit RNase A activity are highly U that is RNase A sensitiveFourShow that you can do it while maintaining activity at the site I have. UFourContaining 2'-amino-2'-deoxyuridine at the 1-position The ze-resistant mutant is RNase A sensitive, containing ribouridine at this position. Is slightly less active than the highly active mutant. This means that Generates nuclease-resistant catalytic oligomer with activity close to that of all ribonucleotides Different at a given site while maintaining activity It is possible to make modifications.Example 5: 2'-O-methyl- and all 12 possible NCH triplets Comparison of Cleavage Activity of 2 and 2′-O-Allyl Modified Catalyst Oligomers   GFive, A6, G8, G12And I15.1Modifies nucleotides at all positions except for Cleavage of substrate RNA by oligomers bearing a Nc indicates cleavage at all NCH sites Was evaluated in order to GFive, A6, G8, G12And I15.1In all but the position 2'-O-allyl-ribonucleotide or 2'-O-methyl-ribonucleotide SEQ ID NO: 17 containing tide (cut after ACH triplet), sequence ID No .: 18 (cut after GCH triplet), SEQ ID NO: 19 (CCH triplet) After cleavage) and SEQ ID NO: 20 (cut after UCH triplet) Based catalyst oligomers were synthesized. SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 (ACH Containing the replet, cut by SEQ ID NO: 17), SEQ ID NO Nos. 7, 8 and 9 (including GCH triplet, SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 10, 11 and 12 (CCH triplet) Including Which is cleaved by SEQ ID NO: 19) and SEQ ID NO: 13, 1 4 and 15 (cut by SEQ ID NO: 20 containing UCH triplet) Was also synthesized. Sequence ID numbers: 4-20 are shown in Table 1.   The reaction was carried out under single turnover kinetic conditions with 2.5 μM catalytic oligomer and 2 μM. Performed at pH 7.4 in the presence of 10 mM magnesium ion using 50 nM substrate Was done. All other conditions were identical to those used in Example 1. data Was analyzed as in Example 1.   The data from these assays was applied to GCH, ACH, CCH and UCH substrates. In contrast, catalytic oligomers have been shown to be able to cleave their respective targets. Result is Also, many catalytic oligomers: 2'-O-allyl-ribo against a substrate combination Nucleotide-modified catalytic oligomer and corresponding 2'-O-methyl-ribonucleic acid It also shows that there is no practical difference with the otide catalyst oligomer. further There is no more than a two-fold difference between these two types of modifications for any combination. won.Example 6: GCA triplet with catalytic oligomers with different N 7 nucleobases Cutting speed at   Cleavage assays are based on different bases with different modifications,7Position, and And still show activity. All catalysts Gomer is GFive, A6, G8, G12And I15.1(They are ribonucleotides ) Contained 2'-O-allyl-ribonucleotides at all positions. You All catalyst oligomers were designed to cleave after the GCH triplet. Touch The sequence of the medium oligomer was as follows (N7(Places are shown in bold.) :   L = 5'-terminal hexanediol linker   *T = 3'-3 'reverse thymidine   A, G, and I are ribonucleotides.   a, c, g, u and i are 2'-allyloxy-2'-deoxyribonucleotides It is a tide.   q is 1- (2-O-allyl-β-D-ribofuranosyl) quinazoline-2,4- Zion.   n is 5-nitro-1- (2-O-allyl-β-D-ribofuranosyl) indone It is.   The reaction was carried out under single turnover-kinetic conditions with 2.5 μM catalytic oligomer and 2 μM. Performed at pH 7.4 in the presence of 10 mM magnesium ion using 50 nM substrate Was done. All other conditions were identical to those used in Example 1. data Was analyzed as in Example 1.   N7Graph showing time curves for product fractionation of mutant oligomers 4A and 4B. Data is N7All mutants in very well Indicates that it can be disconnected. The catalytic oligomer is a uracil analog, quinazoline- Bulk groups such as 2,4-dione are perfectly acceptable. Given Substrate has sites in the catalyst oligomer that can be deformed to optimize the catalyst structure Such information is important because it indicates what you are doing.Example 7: In vitro cleavage of a long substrate derived from hepatitis C virus   A long RNA substrate transcribed from a plasmid can be used with the disclosed compositions. Was used to indicate cleavage of such a substrate. Plasmid pN (1-4728) Contains the first 1358 bases of the hepatitis C virus genome (HCV). The array is The run-off transcript of the BamHI linearized plasmid producing a 1358 base transcript was Oriented as possible. Runoff transcription (3-5 μg) is 40 mM Tris- HCl (pH 7.5), 18 mM MgClTwo1 mM spermidine, 5 mM D TT, 2000 U / ml placental RNase inhibitor (Promega), 3 mM each ATP, UTP, CTP and GTP, 50 μCi [α-32P] GTP (Du Pont NEN) and 3000 U / ml T7 RNA polymerase (Ne w Performed in 100 μl reaction containing E. Biolabs (England Biolabs) Was done. The reaction was incubated at 37 ° C. for 2-3 hours and 100 μl of RNA Buffer (98% formamide, 10 mM EDTA, 0.025% xylem Adding cyanocyanol FF and 0.025% bromophenol blue) Stop the reaction more. The mixture is then heated at 90 ° C. for 3 minutes and quenched on ice for 4 minutes. Electrophoresis on a% polyacrylamide / 7M urea gel. 1358 nucleotides long Transcripts were visualized by shading with UV, bands were cut out, and RNA was 1 Extracted by time electrophoresis. RNA is recovered by overnight ethanol precipitation Was. After centrifugation and washing with 70% ethanol, the purified transcripts Resuspended in 1 of DEPC sterile water and the concentration was determined by UV measurement.   The following oligomers were designed to target HCV run-off transcripts.   L = 5'-terminal hexanediol linker   *T = 3'-3 'reverse thymidine   A, G, U, and I are ribonucleotides.   a, c, g and u are 2'-allyloxy-2'-deoxyribonucleotides It is.   These sequences target the GCA-345 site of the HCV genome present in the transcript. are doing.   The cleavage reaction was 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgClTwo, 3 0 nM radiolabeled transcript and 300 nM catalytic oligomer (SEQ ID NO: 28- 31) was carried out in a 10 μl reaction volume. Incubation is 3 Performed at 7 ° C for 10 minutes and with each tested oligomer for 60 minutes, the reaction is Stop by adding 10 μl of gel loading buffer containing 20 mM EDTA. At 90 ° C. for 5 minutes and cooled on ice for 5 minutes. Uncleaved transcripts and cleavage generation The products were separated by electrophoresis on a 4% polyacrylamide / 7M urea gel. Electrical After the electrophoresis, the gel was transferred onto Whatman 3MM filter paper and incubated at 80 ° C. for 2 hours. While drying. The band should be exposed to a PhosphorImager screen. And quantified by:   The results of these assays show that all four of the catalytic oligomers are HCV run-off transcribed. This indicates that the body could be cut. This is UFour, GFive, A6, G8, G12and I15.1Excluding the position (SEQ ID NO: 30) and GFive, A6, G8, G12And I1 5.1 Except for the position (SEQ ID NOs: 28, 29 and 31), Targeted catalytic oligomers containing lyl-ribonucleotides can cleave long RNAs Shows that you can.Example 8: Catalytic oligomers targeting GCA and GUA triplets Comparison of in vitro cleavage of long substrates derived from hepatitis C virus used   Cleavage assays are catalytic catalysts designed to cleave 1358 base HCV substrates. A rigomer was performed to show that it works at concentrations as low as 30 nM. La An off-transfer was prepared as in Example 7. The audio used in these assays Rigomers are:   L = 5'-terminal hexanediol linker*T = 3'-3 'reverse thymidine   A, G, U, and I are ribonucleotides.   a, c, g and u are 2'-allyloxy-2'-deoxyribonucleotides It is.   These catalytic oligomers are GCA345 triplets (SEQ ID NO: 28). Oligomers) and GUA378 triplets (SEQ ID NO: 32) are doing. Obtained when analyzing the cleavage reaction of the 1358 run-off transcript of HCV. Fragments are 347 and 1011 nucleosides for cleavage at the GCA345 site. 380 and 978 nucleotides for peptidic length and cleavage at the GUA378 site Otide length. The catalytic oligomer was 1 and 3 μM for a reaction time of 1 hour, and And 3 h reaction time, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 μM and 3 μM M concentrations were compared. All other reactions and conditions are the same as in Example 7.   After 3 hours at all concentrations of the tested catalytic oligomer, the oligomer becomes HC Analysis of the data indicated that the V transcript was cleaved. This corresponds to a 30 nM contact The medium oligomer concentration can cleave the 1358 base RNA fragment of HCV genome. Is shown.Example 9: Cleavage of human IL-2 mRNA in Jurkat cell lysate   The cleavage assay shows that catalytic oligomers targeting IL-2 mRNA This was done to show that native mRNA in the product solution could be cleaved. This These assays were performed on catalytic oligomers having the following sequences:   L = 5'-terminal hexanediol linker   *T = 3'-3 'reverse thymidine   A, G, U, and I are ribonucleotides.   a, c, g and u are 2'-allyloxy-2'-deoxyribonucleotides It is. This sequence corresponds to human interleukin-2 mRNA (EMBL nucleotide sequence data). GCA of the sequence name HSIL2R) in the 43rd edition of the database (where A is position 140) Designed to cut after.   Jurkat cells were transformed with phorbol 12-milli to induce IL-2 expression. State 13-5 with acetate (PMA) / phytohemagglutinin (PHA) Stimulated for hours. Crude cell lysates were prepared by freeze-thaw as follows: x107The cells are washed with phosphate buffer (PBS) and RNase-free 500 Resuspend in μl deionized water and incubate for 10 minutes at room temperature, then add , And thawed at 37 ° C. Cell debris is removed by low-speed centrifugation and cut The crude lysate was left for use in the assay.   Each cleavage reaction consisted of 62.5 μl cell lysate, 50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgClTwoAnd 100 μl of the reaction solution containing 1 μM catalytic oligomer. The reaction was carried out at 37 ° C. in the reaction solution with reaction times of 0, 10, 30, 60 and 120 minutes. . The following control experiments were performed, a control after 120 minutes without oligomer, IL- Two probe control, IL-2 and β-actin RNase digestion, and oligomer -Control after 10 minutes without-. For RNA, use BioGene X-Cell solution And purified using the RPA II kit from Ambion. Analyze by ribonuclease protection assay (RPA) according to the protocol specified in the specification. Was analyzed. Biotin-labeled antisense RNA probe for IL-2 and β -Actin RNA (internal standard) was prepared using the SP6 transcription kit. β- The template for the actin probe was purchased from Ambion and purchased from 334 nucleotides. And a 245 nucleotide long protected fragment were generated.   All IL-2 probe templates are IL-2 sequences from Jurkat cell RNA Was made by using RT-PCR to amplify the fragment of One The primers should be prepared so that the resulting DNA probe can be directly transcribed in the PCR reaction. A P6 transcription promoter site is also included. The probe is 487 nucleotides long Designed to have 487 nucleotides conserved after RPA analysis of IL-2 RNA Guide the guard fragment. RPA analysis after cleavage by catalytic oligomers was performed in addition to full length RNA 428 and 59 nucleotide protected fragments must be identified.   Protected RNA fragments were separated by polyacrylamide gel electrophoresis (5%). Blotted on iron membrane, BrightStar Biod from Ambion Visualization was performed by chemiluminescence detection using an eject kit. 500, 400, 3 Biotinylated RNA markers of 00 and 200 nucleotides in length were used. Cell lysates were prepared as described above and IL-2mR produced by intracellular transcription. Contains NA. The cell lysate contains the target substrate. Substrate and catalyst Reactions between ligomers generate 428 base and 59 base fragments of IL-2 mRNA. You. By using a labeled probe for this sequence, cleavage products can be detected. Wear. IL-2 mRNA is a catalytic oligomer in the presence of cell lysate, SEQ ID NO: 33. This is due to the presence of cellular material associated with mRNA in vivo. Shows that catalytic oligomers can cleave long native mRNAs You.Example 10: Excision of rat dopamine D2 receptor RNA in CHO cell lysate Interruption   The cleavage assay is a catalytic assay targeting rat dopamine D2 receptor mRNA. Oligomers can cleave intact mRNA in CHO cell lysate solution. And was implemented to show. The assay was performed on catalytic oligomers of the following sequence: Was:   L = 5'-terminal hexanediol linker   *T = 3'-3 'reverse thymidine   A, G, U, and I are ribonucleotides.   a, c, g and u are 2'-allyloxy-2'-deoxyribonucleotides It is. This sequence corresponds to the rat dopamine D2 receptor RNA (EMBL nucleotide sequence). GCA of sequence name RND2DOPR in database 43 edition (where A is 811 Was designed to cut after).   Crude cell lysates were prepared by freeze-thaw as described in Example 9 above. From CHO cells stably transfected with the papamine D2 receptor gene Was made. Each cleavage reaction consisted of 62.5 μl cell lysate, 50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgClTwoAnd 1 containing 0.5 μM catalytic oligomer The reaction is performed in a 00 μl reaction at 37 ° C. for reaction times of 10, 30, 60 and 120 minutes. It was given. The following control experiments were performed: RNase-cleaved dopamine D2 Receptor RNA and β-actin, dopamine D2 receptor RNA and β-actin control, rat dopamine D2 receptor RNA probe and β-actin Actin control, control after 10 minutes without oligomer, no oligomer 3 Control after 0 min and control after 60 min without oligomer.   RNA is purified from the reaction and used with RPA II kit from Ambion , Analyzed by ribonuclease protection assay according to the manufacturer's instructions Was done. Biotin-labeled antisense R for rat dopamine D2 receptor NA probe and mouse β-actin RNA (internal standard) are SP6 transcription kit Was prepared using The template for the β-actin probe is from Ambion Purchased 334 nucleotide RNA probe and 245 nucleotides long A protected fragment was generated.   The dopamine D2 receptor probe template was used to detect dopamine from CHO cell RNA. By using RT-PCR to amplify fragments of the D2 receptor sequence. Was made. One primer contains the resulting DNA probe in a PCR reaction. An SP6 transcription promoter site is also included for direct transcription. probe Seems to be 663 nucleotides after analysis of dopamine D2 receptor RNA. Designed to. RPA analysis after cleavage by catalytic oligomers adds to full-length RNA. However, a protected fragment of 394 and 269 nucleotides must be identified. Security Protected RNA fragments were separated by polyacrylamide gel electrophoresis (5%). Blot on a membrane, and BrightStar Biode from Ambion. Visualization was performed by chemiluminescence detection using a Tect kit.   The results indicate that the D2 receptor RNA was a catalytic oligomer, cut by SEQ ID NO: 34. It is shown that it is rejected. Cleavage products are detectable in 10 minutes and increase over time This shows that the catalyst oligomer was not substantially decomposed during the time.Example 11: Cleavage of human ICAM-1 mRNA in A549 cell lysate   The cleavage assay showed that the catalytic oligomer targeting ICAM-1 mRNA was A5 To demonstrate the ability to cleave intact mRNA in 49 cell lysate solutions It was given. These assays were performed on catalytic oligomers having the following sequences:   L = 5'-terminal hexanediol linker   *T = 3'-3 'reverse thymidine   A, G, U, and I are ribonucleotides.   a, c, g and u are 2'-allyloxy-2'-deoxyribonucleotides It is.   These sequences are designed to cut behind the ACA site, where the first One A is for human intracellular adhesion molecule-1 mRNA (ICAM-1) (EMBL nucleo Nucleotide 1205 (sequence name HSICAM01) in the nucleotide sequence database 43 edition (Column ID number: 35) and at position 1592 (sequence ID number: 36).   Crude cell lysates were prepared by the freeze-thaw method as described in Example 9 above, using ICAM. A54 after stimulation for 5 hours with 10 ng / ml hTNFα to induce -1 Made from 9 cells. Each cleavage reaction consisted of 62.5 μl of cell lysate, 50 m M Tris pH 7.5, 70 mM MgClTwoAnd 500 nM oligomer, 20 Final concentration of 0 nM oligomer, 100 nM oligomer, 50 nM oligomer In a 100 μl reaction containing medium oligomer, control without catalyst oligomer Performed at 37 ° C. for 2 hours. RNA is purified from the reaction and from Ambion Ribonuclease using RPA II kit and following the protocol of the instruction manual Analyzed by zeoprotection assay. Human ICAM-1 and GAPDH RNA Biotin-labeled antisense RNA probe for (internal standard) It was prepared using a kit. The template for GAPDH was purchased from Ambion. And a protected fragment of 316 nucleotides in length was generated.   The ICAM-1 probe template is a template for the ICAM-1 sequence from A549 cell RNA. Created by using RT-PCR to amplify the fragment. One step The primer is designed so that the resulting DNA probe can be directly transcribed in a PCR reaction. An SP6 transcription promoter site is also included. Probe is 598 nucleotides long 598 nucleotides after RPA analysis of ICAM-1 RNA. Deriving a protected fragment of tide. RPA analysis after cleavage by the catalytic oligomer revealed a full-length R In addition to NA, 552 and 46 nucleotides (1205 ACA site) and 43 Protective fragments of 3 and 165 nucleotides (1592 ACA site) must be identified Must.   Protected RNA fragments were separated by 5% polyacrylamide gel electrophoresis and Blot on a membrane, and BrightStar Biode from Ambion. Visualization was performed by chemiluminescence detection using a Tect kit. 500, 400, 30 Biotinylated RNA markers 0 and 200 nucleotides in length were used. Off Cleavage products were produced at all concentrations of the oligomers tested. 1592ACA Cleavage at the site was particularly effective using only 50 nM catalytic oligomer .

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． ＲＮＡ基質を切断する組成物であって、成分（ａ）および（ｂ）を含 み、 成分（ａ）は５’−Ｚ1−Ｚ2−３’を含み、および成分（ｂ）は５’−Ｚ3− Ｚ4−３’を含み、成分（ａ）および（ｂ）は別々の分子でも共有結合で結合さ れていてもよく、 式中、Ｚ1およびＺ4は（１）ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはその両 方を含むか、または（２）オリゴヌクレオチド類似体であるオリゴマー配列であ り、ここでオリゴマー配列はハイブリダイゼーションによりＲＮＡ基質と特異的 に相互作用する、 式中、Ｚ2は ５’−Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9−３’または ５’−Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8Ｘ9Ｘ9＾−３’であり、 式中、Ｚ3は ５’−Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15.1−３’または ５’−Ｘ＾12Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15.1−３’であり、 式中Ｚ2およびＺ3はヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはその両方を含み 、ここでヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は各々下記の構造を持っている ： 式中、各々のＢは独立してアデニン−９−イル、シトシン−１−イル、グアニ ン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９ −イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジアミノ プリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、７−デ アザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロピニル ウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル、 ６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリミドン −１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９−イル、 Ｎ2−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的等価物であり、 式中、各々のＶは独立してＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ2基であり、 式中、各々のＷは独立してＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮ ＨＲ1、−ＣＯＮＲ1Ｒ2、−ＮＨ2、−ＮＨＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＮＨＣＯＲ1、− ＳＨ、−ＳＲ1、−Ｆ、−ＯＮＨ2、−ＯＮＨＲ1、−ＯＮＲ1Ｒ2、−ＮＨＯＨ、 −ＮＨＯＲ1、−ＮＲ2ＯＨ、−ＮＲ2ＯＲ1、置換または非置換Ｃ1−Ｃ10直鎖ま たは分岐鎖アルキル、置換または非置換Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルケニル 、置換または非置換Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルキニル、置換または非置換 Ｃ1−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルコキシ、置換または非置換Ｃ2−Ｃ10直鎖または 分岐鎖アルケニルオキシ、置換または非置換Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルキ ニルオキシ、（ここで置換基は独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カルボキシ 、エステル、エーテル、カルボキサミド、ヒドロキシまたはメルカプトであり、 式中、Ｒ1およびＲ2は独立して置換または非置換アルキル、アルケニル、または アルキニル基であり、ここで置換基は独立してハロゲン、シアノ、アミノ、カル ボキシ、エステル、エーテル、カルボキサミド、ヒドロキシまたはメルカプトで ある）から成る群より選択され、 式中、ＤおよびＥは、隣接するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体との間 で一緒にホスホジエステルまたはホスホロチオエートジエステル結合を形成する か、または一緒になってヌクレオシド間結合の類似結合を形成する残基であり、 Ｘ15.1においてＢはヒポキサンチン−９−イルまたはその機能的等価物であり 、 Ｘ5、Ｘ8およびＸ12においてＢは独立してグアニン−９−イル、ヒポキサンチ ン−９−イルまたは７−デアザグアニン−９−イルであり； Ｘ6、Ｘ9、Ｘ13およびＸ14においてＢは独立してアデニン−９−イル、２，６ −ジアミノプリン−９−イル、プリン−９−イルまたは７−デアザアデニン−９ −イルであり； Ｘ4においてＢはウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、チミン−１−イ ルまたは５−プロピルニルウラシル−１−イルであり； Ｘ3においてＢシトシン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イルまたは５ −プロピニルシトシン−１−イルであり； Ｘ7、Ｘ9＾およびＸ＾12においてＢは独立してアデニン−９−イル、シトシン −１−イル、グアニン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、 ヒポキサンチン−９−イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル 、２，６−ジアミノプリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン −９−イル、７−デアザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イ ル、５−プロピニルウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノ プリン−９−イル、６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イ ル、２−ピリミドン−１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサ ンチン−９−イル、Ｎ2−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的等 価物である組成物。 ２． ＲＮＡ基質が ５’−Ｚ4’−Ｃ16.1−Ｘ17−Ｚ1’−３’ （式中、Ｚ1’およびＺ4’はＺ1およびＺ4と相互作用し、式中はＣ16.1シチ ジンであり、式中Ｘ17はアデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンであ り、切断はＸ17の３’リン酸で起こる）から成る請求項第１項に記載の組成物。 ３． Ｘ17がアデノシン、シチジンまたはウリジンである請求項第２項に記 載の組成物。 ４． 成分（ａ）および（ｂ）が共有結合で結合されて構造５’−Ｚ1−Ｚ2 −Ｚ5−Ｚ3−Ｚ4−３’（式中Ｚ5はリンカーである）を形成する請求項第１項に 記載の組成物。 ５． リンカーがオリゴマー配列、非ヌクレオチドリンカーおよびオリゴマ ー配列および非ヌクレオチドリンカーの組み合わせから成る群より選択される請 求項第４項に記載の組成物。 ６． オリゴマー配列が独立して（ａ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド類 似体を含んでいるかまたは（ｂ）オリゴヌクレオチド類似体である請求項第５項 に記載の組成物。 ７． 成分（ａ）および（ｂ）が別々の分子である請求項第１項に記載の組 成物、 ここで成分（ａ）は５’−Ｚ1−Ｚ2−Ｚ6−３’を含み、 ここで成分（ｂ）は５’−Ｚ7−Ｚ3−Ｚ4−３’を含み、 式中、Ｚ6およびＺ7は（１）ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはその両 方から成っているか、または（２）オリゴヌクレオチド類似体であるオリゴマー 配列であり、ここでオリゴマー配列はお互いに特異的に相互作用する。 ８． Ｚ1およびＺ4がリボヌクレオチドであるどんなピリミジンも含んでい ない請求項第１項に記載の組成物。 ９． Ｚ1およびＺ4がどんなリボヌクレオチドも含んでいない請求項第１項 に記載の組成物。 １０． Ｚ1およびＺ4がヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはそれらの両 方から成る請求項第１項に記載の組成物、ここでヌクレオチド、ヌクレオチド類 似体は各々下記の構造を持っている： 式中、各々のＢは独立してアデニン−９−イル、シトシン−１−イル、グアニ ン−９−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９ −イル、チミン−１−イル、５−メチルシトシン−１−イル、２，６−ジアミノ プリン−９−イル、プリン−９−イル、７−デアザアデニン−９−イル、７−デ アザグアニン−９−イル、５−プロピニルシトシン−１−イル、５−プロピニル ウラシル−１−イル、イソグアニン−９−イル、２−アミノプリン−９−イル、 ６−メチルウラシル−１−イル、４−チオウラシル−１−イル、２−ピリミドン −１−イル、キナゾリン−２，４−ジオン−１−イル、キサンチン−９−イル、 Ｎ2−ジメチルグアニン−９−イルまたはそれらの機能的等価物であり、 式中、各々のＶは独立してＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ2基であり、 式中、各々のＷは独立して置換または非置換Ｃ1−Ｃ10直鎖または分岐鎖アル キル、Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルケニル、Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖アル キニル、Ｃ1−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルコキシ、Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖ア ルケニルオキシ、Ｃ2−Ｃ10直鎖または分岐鎖アルキニルオキシから成る群より 選択され、 式中、ＤおよびＥは、隣接するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体との間 で一緒にホスホジエステルまたはホスホロチオエートジエステル結合を形成する か、または一緒になってヌクレオシド間結合の類似結合を形成する残基である。 １１． Ｚ1およびＺ4が各々独立して３から４０のヌクレオチド、ヌクレオチ ド類似体またはその組み合わせを含んでいる請求項第１項に記載の組成物。 １２． Ｚ2、Ｚ3またはその両方が、一つまたはいくつかのヌクレオチド類似 体を含んでいる組成物であって、ここで各々のＷはＣ1−Ｃ5直鎖または分岐鎖ア ルキル、Ｃ2−Ｃ5直鎖または分岐鎖アルケニル、Ｃ2−Ｃ5直鎖または分岐鎖アル キニル、Ｃ1−Ｃ5直鎖または分岐鎖アルコキシ、Ｃ2−Ｃ5直鎖または分岐鎖アル ケニルオキシまたはＣ2−Ｃ5直鎖または分岐鎖Ｃ2−Ｃ5アルキニルオキシから成 る群より選択される請求項第１項に記載の組成物。 １３． 各々の遊離３’末端がエキソヌクレアーゼ分解に対して保護されてい る請求項第１項に記載の組成物。 １４． 各々のＸ3、Ｘ4、Ｘ7およびＸ＾12において、Ｗが独立してＮＨ2、Ｏ Ｈ−置換Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＨ−置換Ｃ2−Ｃ4アルケニル、ＯＨ−置換Ｃ1− Ｃ4アルコキシまたはＯＨ−置換Ｃ2−Ｃ4アルケニルオキシである請求項第１項 に記載の組成物。 １５． 各々のＸ3、Ｘ4、Ｘ7およびＸ＾12において、Ｗが独立してＮＨ2、メ トキシ、２−ヒドロキシエトキシ、アリルオキシまたはアリルである請求項第１ ４項に記載の組成物。 １６． Ｘ12がリボヌクレオチドである請求項第１項に記載の組成物。 １７． Ｘ13およびＸ14またはその組み合わせがヌクレオチド類似体（式中、 各々のＷは独立してＣ1−Ｃ4アルキル、Ｃ2−Ｃ4アルケニル、Ｃ1−Ｃ4アルコキ シ、Ｃ2−Ｃ4アルケニルオキシ、ＯＨ−置換Ｃ1−Ｃ4アルキル、ＯＨ−置換Ｃ2 −Ｃ4アルケニル、ＯＨ−置換Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＯＨ−置換Ｃ2−Ｃ4ア ルケニルオキシである）である請求項第１項に記載の組成物。 １８． Ｘ13およびＸ14またはその組み合わせがヌクレオチド類似体（式中、 各々のＷは独立してメトキシ、２−ヒドロキシエトキシ、アリルオキシである） である請求項第１項に記載の組成物。 １９． Ｘ15.1がリボヌクレオチドである請求項第１項に記載の組成物。 ２０． ＲＮＡ基質の特異的切断のための方法であって、請求項第１項に記載 の組成物をＲＮＡ基質と接触させることを含む方法。 ２１． 遺伝子の機能を同定するための方法であって、 請求項第１項に記載の組成物および遺伝子を含んでいる細胞を接触 させること、ここで組成物は遺伝子の発現を減少させる、および 細胞中の変化を観察することを含む方法。 ２２． ＲＮＡ分子に関連する疾患を処置する方法であって、疾患を持つ患者 に請求項第１項に記載の組成物を投与することを含み、ここでＲＮＡ基質はその 疾患に関係するＲＮＡ分子である方法。 ２３． ＲＮＡ分子が過剰発現されているＲＮＡ分子である請求項第２２項に 記載の方法。[Claims]     1. A composition for cleaving an RNA substrate, comprising components (a) and (b). See   Component (a) is 5'-Z1-ZTwo-3 'and component (b) is 5'-ZThree− ZFour-3 ', wherein components (a) and (b) are covalently linked even in separate molecules. May be   Where Z1And ZFourMeans (1) nucleotides, nucleotide analogs or both Or (2) an oligomer sequence that is an oligonucleotide analog. Where the oligomer sequence is specific for the RNA substrate by hybridization. Interact with   Where ZTwoIs       5'-XThreeXFourXFiveX6X7X8X9-3 'or       5'-XThreeXFourXFiveX6X7X8X9X9＾ -3 ’,   Where ZThreeIs       5'-X12X13X14X15.1-3 'or       5'-X ＾12X12X13X14X15.1-3 '   Where ZTwoAnd ZThreeContains nucleotides, nucleotide analogs or both Where the nucleotides and nucleotide analogs each have the following structure :   Wherein each B is independently adenin-9-yl, cytosin-1-yl, guaniine N-9-yl, uracil-1-yl, uracil-5-yl, hypoxanthine-9 -Yl, thymin-1-yl, 5-methylcytosin-1-yl, 2,6-diamino Purin-9-yl, purin-9-yl, 7-deazaadenin-9-yl, 7-de Azaguanin-9-yl, 5-propynylcytosin-1-yl, 5-propynyl Uracil-1-yl, isoguanin-9-yl, 2-aminopurin-9-yl, 6-methyluracil-1-yl, 4-thiouracil-1-yl, 2-pyrimidone -1-yl, quinazolin-2,4-dione-1-yl, xanthin-9-yl, NTwo-Dimethylguanin-9-yl or a functional equivalent thereof,   Wherein each V is independently O, S, NH or CHTwoGroup,   Wherein each W is independently H, -OH, -COOH, -CONHTwo, -CON HR1, -CONR1RTwo, -NHTwo, -NHR1, -NR1RTwo, -NHCOR1, − SH, -SR1, -F, -ONHTwo, -ONHR1, -ONR1RTwo, -NHOH, -NHOR1, -NRTwoOH, -NRTwoOR1, Substituted or unsubstituted C1-CTenStraight chain Or branched alkyl, substituted or unsubstituted CTwo-CTenLinear or branched alkenyl , Substituted or unsubstituted CTwo-CTenStraight or branched chain alkynyl, substituted or unsubstituted C1-CTenLinear or branched alkoxy, substituted or unsubstituted CTwo-CTenLinear or Branched alkenyloxy, substituted or unsubstituted CTwo-CTenLinear or branched alkyl Nyloxy, wherein the substituents are independently halogen, cyano, amino, carboxy , Esters, ethers, carboxamides, hydroxy or mercapto, Where R1And RTwoIs independently substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or An alkynyl group, wherein the substituents are independently halogen, cyano, amino, With boxy, ester, ether, carboxamide, hydroxy or mercapto Selected from the group consisting of   Wherein D and E are between adjacent nucleosides or nucleoside analogs. Together form a phosphodiester or phosphorothioate diester bond Or residues that together form a similar bond of an internucleoside bond,   X15.1B is hypoxanthin-9-yl or a functional equivalent thereof ,   XFive, X8And X12B is independently guanine-9-yl, hypoxanchi 9-yl or 7-deazaguanin-9-yl;   X6, X9, X13And X14B is independently adenine-9-yl, 2,6 -Diaminopurin-9-yl, purin-9-yl or 7-deazaadenine-9 -Il;   XFourB is uracil-1-yl, uracil-5-yl, thymine-1-y Or 5-propylniluracil-1-yl;   XThreeB-cytosin-1-yl, 5-methylcytosin-1-yl or 5 -Propynylcytosin-1-yl;   X7, X9＾ and X ＾12B is independently adenine-9-yl, cytosine -1-yl, guanin-9-yl, uracil-1-yl, uracil-5-yl, Hypoxanthin-9-yl, thymin-1-yl, 5-methylcytosin-1-yl , 2,6-diaminopurin-9-yl, purin-9-yl, 7-deazaadenine -9-yl, 7-deazaguanin-9-yl, 5-propynylcytosine-1-y , 5-propynyluracil-1-yl, isoguanin-9-yl, 2-amino Purin-9-yl, 6-methyluracil-1-yl, 4-thiouracil-1-i , 2-pyrimidone-1-yl, quinazolin-2,4-dione-1-yl, Untin-9-yl, NTwo-Dimethylguanin-9-yl or functional equivalents thereof A composition that is a valence.     2. RNA substrate             5'-ZFour'-C16.1-X17-Z1'-3'     (Where Z1’And ZFour’Is Z1And ZFourInteracts with C16.1Sici Where X is17Is adenosine, guanosine, cytidine or uridine. And cutting is X17The composition according to claim 1, which occurs with 3 'phosphoric acid.     3. X17Is adenosine, cytidine or uridine. Composition.     4. Components (a) and (b) are covalently linked to form the structure 5'-Z1-ZTwo -ZFive-ZThree-ZFour-3 '(where ZFiveIs a linker). A composition as described.     5. Linker is oligomer sequence, non-nucleotide linker and oligomer -A member selected from the group consisting of a combination of a sequence and a non-nucleotide linker. The composition of claim 4.     6. Oligomeric sequences independently (a) nucleotides or nucleotides 6. The method according to claim 5, which comprises an analog or (b) is an oligonucleotide analog. A composition according to claim 1.     7. The set of claim 1, wherein components (a) and (b) are separate molecules. Adult,   Here, the component (a) is 5′-Z1-ZTwo-Z6-3 '   Here, the component (b) is 5′-Z7-ZThree-ZFour-3 '   Where Z6And Z7Means (1) nucleotides, nucleotide analogs or both Or an oligomer consisting of (2) an oligonucleotide analog Sequence, wherein the oligomer sequences interact specifically with each other.     8. Z1And ZFourContains any pyrimidines that are ribonucleotides 2. The composition of claim 1, wherein the composition is not present.     9. Z1And ZFourDoes not contain any ribonucleotides. A composition according to claim 1.   10. Z1And ZFourIs a nucleotide, nucleotide analog or both 2. The composition of claim 1, wherein the composition comprises Each analog has the following structure:   Wherein each B is independently adenin-9-yl, cytosin-1-yl, guaniine N-9-yl, uracil-1-yl, uracil-5-yl, hypoxanthine-9 -Yl, thymin-1-yl, 5-methylcytosin-1-yl, 2,6-diamino Purin-9-yl, Purin-9-yl, 7-deazaadenin-9-yl, 7-de Azaguanin-9-yl, 5-propynylcytosin-1-yl, 5-propynyl Uracil-1-yl, isoguanin-9-yl, 2-aminopurin-9-yl, 6-methyluracil-1-yl, 4-thiouracil-1-yl, 2-pyrimidone -1-yl, quinazolin-2,4-dione-1-yl, xanthin-9-yl, NTwo-Dimethylguanin-9-yl or a functional equivalent thereof,   Wherein each V is independently O, S, NH or CHTwoGroup,   Wherein each W is independently substituted or unsubstituted C1-CTenStraight or branched chain al Kill, CTwo-CTenLinear or branched alkenyl, CTwo-CTenStraight or branched chain al Quinyl, C1-CTenLinear or branched alkoxy, CTwo-CTenStraight or branched chain Lucenyloxy, CTwo-CTenFrom the group consisting of linear or branched alkynyloxy Selected,   Wherein D and E are between adjacent nucleosides or nucleoside analogs. Together form a phosphodiester or phosphorothioate diester bond Or residues that together form a similar bond of an internucleoside linkage.   11. Z1And ZFourAre each independently 3 to 40 nucleotides, nucleotides 2. The composition of claim 1, wherein the composition comprises a chloride analog or a combination thereof.   12. ZTwo, ZThreeOr both are similar to one or several nucleotides A composition comprising a body, wherein each W is C1-CFiveStraight or branched chain Luquil, CTwo-CFiveLinear or branched alkenyl, CTwo-CFiveStraight or branched chain al Quinyl, C1-CFiveLinear or branched alkoxy, CTwo-CFiveStraight or branched chain al Kenyloxy or CTwo-CFiveLinear or branched CTwo-CFiveAlkynyloxy 2. The composition according to claim 1, wherein the composition is selected from the group consisting of:   13. Each free 3 'end is protected against exonuclease degradation The composition of claim 1.   14． Each XThree, XFour, X7And X ＾12Wherein W is independently NHTwo, O H-substituted C1-CFourAlkyl, OH-substituted CTwo-CFourAlkenyl, OH-substituted C1− CFourAlkoxy or OH-substituted CTwo-CFour2. The compound according to claim 1, which is alkenyloxy. A composition according to claim 1.   15. Each XThree, XFour, X7And X ＾12Wherein W is independently NHTwo, 2. The method according to claim 1, wherein the compound is toxic, 2-hydroxyethoxy, allyloxy or allyl. Item 5. The composition according to Item 4.   16. X12The composition according to claim 1, wherein is a ribonucleotide.   17． X13And X14Or a combination thereof is a nucleotide analog (wherein Each W is independently C1-CFourAlkyl, CTwo-CFourAlkenyl, C1-CFourAlkoki Si, CTwo-CFourAlkenyloxy, OH-substituted C1-CFourAlkyl, OH-substituted CTwo -CFourAlkenyl, OH-substituted C1-CFourAlkoxy or OH-substituted CTwo-CFourA 2. The composition according to claim 1, wherein the composition is alkenyloxy.   18. X13And X14Or a combination thereof is a nucleotide analog (wherein Each W is independently methoxy, 2-hydroxyethoxy, allyloxy) The composition according to claim 1, which is:   19. X15.1The composition according to claim 1, wherein is a ribonucleotide.   20. A method for specific cleavage of an RNA substrate, as claimed in claim 1. Contacting the composition of claim 1 with an RNA substrate.   21. A method for identifying the function of a gene, comprising:             Contacting a cell containing the composition of claim 1 and a gene. Causing the composition to decrease gene expression, and             A method comprising observing a change in a cell.   22. A method for treating a disease associated with an RNA molecule, said patient having the disease Administering the composition of claim 1 wherein the RNA substrate comprises A method that is an RNA molecule associated with a disease.   23. 23. The method according to claim 22, wherein the RNA molecule is an overexpressed RNA molecule. The described method.
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