JP2002508974A - Novel promoter elements for sustained gene expression - Google Patents
Novel promoter elements for sustained gene expressionInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、作動可能に連結されたトランスジーンの持続性発現のための新規なプロモーターエレメントに向けられている。１の態様において、プロモーターエレメントはサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）由来である。本発明の特定の具体例において、ＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを含むアデノウイルスベクターまたはプラスミドを用いて、標的細胞におけるトランスジーンの持続性発現を達成する。本発明は、また、ＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトランスジーンの発現増加を実現するエンハンサーエレメントにも向けられている。１の態様において、エンハンサーエレメントはヒトアルブミン遺伝子由来である。 (57) [Summary] The present invention is directed to novel promoter elements for sustained expression of an operably linked transgene. In one embodiment, the promoter element is derived from the cytomegalovirus immediate early promoter (CMV). In certain embodiments of the invention, an adenoviral vector or plasmid containing a CMV-derived promoter element is used to achieve sustained expression of the transgene in target cells. The present invention is also directed to an enhancer element that achieves increased expression of a transgene operably linked to a CMV-derived promoter element. In one embodiment, the enhancer element is from the human albumin gene.
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、標的細胞へデリバリーされるトランスジーンの持続性発現のための
新規なプロモーターエレメントに向けられている。該プロモーターエレメントは
、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）に由来する。本発明は、
また、トランスジーンに作動可能に連結された本発明の新規なプロモーターエレ
メントの上流（または５’）に配置される場合に、トランスジーンの発現レベル
を増加させるエンハンサーエレメントに向けられる。本発明の特定の具体例にお
いて、トランスジーンに作動可能に連結されたＣＭＶ由来のプロモーターエレメ
ントを含むアデノウイルスベクターまたはプラスミドがトランスジーンの持続性
発現を達成するために使用される。[0001] The present invention is directed to novel promoter elements for sustained expression of transgenes delivered to target cells. The promoter element is derived from the cytomegalovirus immediate early promoter (CMV). The present invention
It is also directed to an enhancer element that increases the level of expression of the transgene when located upstream (or 5 ′) of the novel promoter element of the present invention operably linked to the transgene. In certain embodiments of the invention, an adenoviral vector or plasmid containing a CMV-derived promoter element operably linked to the transgene is used to achieve sustained expression of the transgene.
【０００２】 発明の背景 生物学上活性で有用な生産物（例えば、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、タンパ
ク質、ホルモン、酵素など）がレシピエント細胞において生産されるようなレシ
ピエント細胞へのトランスジーンの移入は、有効遺伝子移入の重要な態様である
。考慮すべき２つの重要なパラメーター、すなわち、かかるトランスジーンのレ
シピエント細胞および組織への効果的な移入ならびに標的細胞におけるトランス
ジーンの持続性または連続的発現がある。BACKGROUND OF THE INVENTION Transfer of a transgene to a recipient cell such that a biologically active and useful product (eg, RNA, antisense RNA, protein, hormone, enzyme, etc.) is produced in the recipient cell Is an important aspect of effective gene transfer. There are two important parameters to consider: effective transfer of such transgenes to recipient cells and tissues and sustained or continuous expression of the transgene in target cells.
【０００３】 標的細胞へのトランスジーンの移入は多くの調査および実験の焦点であり、か
かる移入を成し遂げるための種々の方法およびモダリティーの開発を導いた。ト
ランスジーン移入は、特にレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス
、ワクシニアおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターの使用および開
発を必要とした。また、トランスジーン移入は、プラスミド、ネイクド（naked ）ＤＮＡ、脂質およびこれら全ての組み合わせを用いて実現された。イン・ビボ
でのトランスジーンデリバリーの場合、多くの関心がウイルスベクター、特にア
デノウイルス由来のベクターの使用に集中してきた。[0003] Transgene transfer into target cells has been the focus of many investigations and experiments and has led to the development of various methods and modalities to accomplish such transfer. Transgene transfer required the use and development of viral vectors, such as retroviruses, adenoviruses, herpes viruses, vaccinia and adeno-associated viruses, among others. Also, transgene transfer was achieved using plasmids, naked DNA, lipids, and combinations of all of these. In the case of transgene delivery in vivo, much attention has focused on the use of viral vectors, particularly those derived from adenovirus.
【０００４】 アデノウイルスは、エンベロープを持たない約３６ｋｂのゲノムサイズを有す
る核ＤＮＡウイルスであり、古典的な遺伝学および分子生物学における研究を通
してよく特徴付けられている（Horwitz, M. S., "Adenoviridae and Their Repl
ication", Virology, 第２版、 Fieldsら編、Raven Press, New York, 1990）。
ウイルス遺伝子は、ウイルスタンパク質の２つの時間的クラスを示す初期（Ｅ１
−Ｅ４として知られる）および後期（Ｌ１−Ｌ５として知られる）転写単位に分
類される。初期および後期ウイルスタンパク質発現の間の境界は、ウイルスＤＮ
Ａ複製である。ヒトアデノウイルスは、赤血球の凝集反応、腫瘍形成力、核酸お
よびアミノ酸組成および関連、および抗原性の関係を包含する特性に基づく多く
の血清型（およそ４７種類を数え、６個の亜群Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、ＥおよびＦに分
類される）に分けられる。[0004] Adenoviruses are non-enveloped nuclear DNA viruses with a genome size of about 36 kb and are well characterized through studies in classical genetics and molecular biology (Horwitz, MS, "Adenoviridae and Their Repl
ication ", Virology, 2nd edition, edited by Fields et al., Raven Press, New York, 1990).
The viral genes represent two temporal classes of viral proteins, early (E1
-Known as E4) and late (known as L1-L5) transcription units. The boundary between early and late viral protein expression is due to viral DN
A copy. Human adenovirus has a number of serotypes (approximately 47 and six subgroups A, based on properties including red blood cell agglutination, tumorigenicity, nucleic acid and amino acid composition and associations, and antigenic relationships). B, C, D, E and F).
【０００５】 組換えアデノウイルスは、***および非***細胞の両方に対する親和性、最少
の病原性ポテンシャル、ベクターストックの調製のため複製して高力価となる能
力、および大きなインサートを運搬するポテンシャルを包含する、トランスジー
ン移入ベクターとしての使用のためのいくつかの利益を有する（Berkner, K. L.
Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene The
rapy 1: 51-64, 1994）。[0005] Recombinant adenoviruses have an affinity for both dividing and non-dividing cells, minimal pathogenic potential, the ability to replicate to high titers for vector stock preparation, and the potential to carry large inserts. It has several advantages for use as transgene transfer vectors, including, (Berkner, KL
Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene The
rapy 1: 51-64, 1994).
【０００６】 アデノウイルスベクターのクローニング容量は、ベクター中に存在するアデノ
ウイルスゲノムのサイズに比例する。例えば、約８ｋｂのクローニング容量は、
ウイルスの生育に重要でないウイルスゲノムの特定領域、例えば、Ｅ３の欠失、
および運搬中にその機能が２９３細胞（Graham, F. L., J. Gen. Virol. 36: 59
-72, 1977）またはＡ５４９細胞（Imlerら、Gene Therapy 3: 75-84, 1996）か ら回復されうるＥ１のようなゲノム領域の欠失によって製作できる。かかるＥ１
欠失ベクターは複製欠損になる。最適な運搬容量のためのベクターＤＮＡ容量の
上限は、野生型ゲノムの長さの約１０５％−１０８％である。さらなるアデノウ
イルスゲノム修飾は、運搬中に他のウイルス遺伝子産物、例えば、Ｅ２ａ（Zhou
ら、J. Virol. 70: 7030-7038, 1996）の相補、Ｅ４（Krougliakら、Hum. Gene
Ther. 6: 1575-1586, 1995; Wangら、Gene Ther. 2: 775-783, 1995）の相補ま たはタンパク質ＩＸ（許可された米国特許出願番号第０８／８９５，１９４号、
出典明示により本明細書の一部とする；Caravokyriら、J. Virol. 69: 6627-663
3, 1995; Krougliakら、Hum. Gene Ther. 6: 1575-1586, 1995）の相補を供給す
る細胞系統を使用するベクター設計において可能である。最大運搬容量は、全て
のウイルスコーディング配列を欠失させたアデノウイルスベクターを用いて達成
できる（Kochanekら、proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5731-5736, 1996; Fish
erら、Virogy 217: 11-22, 1996）。[0006] The cloning capacity of an adenovirus vector is proportional to the size of the adenovirus genome present in the vector. For example, a cloning capacity of about 8 kb
Deletion of certain regions of the viral genome not important for virus growth, eg, E3,
293 cells (Graham, FL, J. Gen. Virol. 36:59)
-72, 1977) or by deleting a genomic region such as E1 that can be recovered from A549 cells (Imler et al., Gene Therapy 3: 75-84, 1996). Such E1
The deletion vector becomes replication defective. The upper limit of vector DNA capacity for optimal transport capacity is about 105% -108% of the length of the wild-type genome. Further adenovirus genomic modifications may result in other viral gene products, such as E2a (Zhou
Complement of J. Virol. 70: 7030-7038, 1996), E4 (Krougliak et al., Hum. Gene).
Ther. 6: 1575-1586, 1995; Wang et al., Gene Ther. 2: 775-783, 1995) complementation or protein IX (Allowed US Patent Application Serial No. 08 / 895,194;
Incorporated herein by reference; Caravokyri et al., J. Virol. 69: 6627-663.
3, 1995; Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6: 1575-1586, 1995). Maximum carrying capacity can be achieved using an adenoviral vector in which all viral coding sequences have been deleted (Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5731-5736, 1996; Fish).
er et al., Virogy 217: 11-22, 1996).
【０００７】 アデノウイルスベクターによって今日までに発現されたトランスジーンは、特
に、ｐ５３（Willsら、Human Gene Therapy 5: 1079-188, 1994）；ジストロフ ィン（Vincentら、Nature Genetics 5: 130-134, 1993）; エリトロポイエチン （Descampsら、Human Gene therapy 5: 979-985, 1994）；オルニチントランス カルバミラーゼ（Stratford-Perricaudetら、Human Gene Therapy 1: 241-256,
1990; Weら、J. Biol. Chem. 271; 3639-3646, 1996）；アデノシンデアミナー ゼ（Mitaniら、Human Gene Therapy 5: 941-948, 1994）；インターロイキン− ２（Haddadaら、Human Gene Therapy 4: 703-711, 1993）およびα１−アンチト
リプシン（Jaffeら、Nature Genetics 1: 372-378, 1992）；トロンボポイエチ ン（Ohwadaら、Blood 88: 778-784, 1996）；およびシトシンデアミナーゼ（Ohw
adaら、Hum. Gene Ther. 7: 1567-1576, 1996）を包含する。Transgenes expressed to date by adenoviral vectors include, among others, p53 (Wills et al., Human Gene Therapy 5: 1079-188, 1994); dystrophin (Vincent et al., Nature Genetics 5: 130-134). Erythropoietin (Descamps et al., Human Gene therapy 5: 979-985, 1994); ornithine trans carbamylase (Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1: 241-256,
1990; We et al., J. Biol. Chem. 271; 3639-3646, 1996); Adenosine deaminase (Mitani et al., Human Gene Therapy 5: 941-948, 1994); Interleukin-2 (Haddada et al., Human Gene). Therapy 4: 703-711, 1993) and α1-antitrypsin (Jaffe et al., Nature Genetics 1: 372-378, 1992); thrombopoietin (Ohwada et al., Blood 88: 778-784, 1996); and cytosine deaminase (Ohw).
ada et al., Hum. Gene Ther. 7: 1567-1576, 1996).
【０００８】 呼吸管細胞に対するアデノウイルスの特別な親和性は、白人において最も一般
的な常染色体劣性疾患である嚢胞性繊維症（ＣＦ）のためのトランスジーン移入
におけるアデノウイルスの使用に関連している。気道上皮におけるｃＡＭＰ調節
性Ｃｌ-チャネルを妨げる嚢放性繊維症膜貫通調節（ＣＦＴＲ）遺伝子における 変異は、肺機能不全をもたらす（Zabnerら、Nature Genetics 6: 75-83, 1994）
。ＣＦＴＲ遺伝子を運搬するように操作されたアデノウイルスベクターが開発さ
れ（Richら、Human Gene Therapy 4: 461-476, 1993）、研究は、これらのベク ターがＣＦＴＲをＣＦ患者の鼻の上皮（Zabnerら、Cell 75: 207-216, 1993）、
コトンラットおよび霊長類の気道上皮（Zabnerら、Nature Genetics 6: 75-83,
1994）およびＣＦ患者の呼吸器上皮（Crystalら、Nature Genetics 8: 42-51, 1
994）へデリバリーする能力を有することを示した。近年の研究では、ＣＦＴＲ をコードしているＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターをＣＦ患者の気道上
皮細胞へ投与することにより、処置した上皮細胞において機能性塩化物イオンチ
ャネルを回復できることが示された（Zabnerら、J. Clin. Invest. 97: 1504-15
11, 1996;米国特許第５，６７０，４８８号、１９９７年９月２３日発行）。さ らに、組織特異的プロモーター配列の使用によって、組織特異的発現をアデノウ
イルスベクターから得ることができる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのエンハンサ
ーエレメントおよびエンハンサーを含有しない最小プロモーターを含有する肝臓
特異的プロモーターに結合しており、ＳＡＲエレメントによって取り囲まれてい
てもよい治療的トランスジーンがアデノウイルスゲノム中に挿入されていること
を特徴とする肝臓特異的アデノウイルス発現ベクターを記載しているＰＣＴ公報
ＷＯ９７／０４１１７号を参照のこと。The particular affinity of adenovirus for respiratory tract cells is associated with the use of adenovirus in transgene transfer for cystic fibrosis (CF), the most common autosomal recessive disease in Caucasians I have. CAMP regulatory Cl in airway epithelium - mutations in嚢放fibrosis transmembrane regulation prevents the channel (CFTR) gene, resulting in pulmonary dysfunction (Zabner et al., Nature Genetics 6: 75-83, 1994 )
. An adenovirus vector engineered to carry the CFTR gene was developed (Rich et al., Human Gene Therapy 4: 461-476, 1993), and studies indicate that these vectors convert CFTR into the nasal epithelium (Zabner) of CF patients. Cell 75: 207-216, 1993),
Airway epithelium of cotton rats and primates (Zabner et al., Nature Genetics 6: 75-83,
1994) and respiratory epithelium of CF patients (Crystal et al., Nature Genetics 8: 42-51, 1
994). Recent studies have shown that administration of an adenovirus vector containing DNA encoding CFTR to airway epithelial cells of CF patients can restore functional chloride ion channels in treated epithelial cells ( Zabner et al., J. Clin. Invest. 97: 1504-15.
11, 1996; U.S. Pat. No. 5,670,488, issued Sep. 23, 1997). In addition, by using a tissue-specific promoter sequence, tissue-specific expression can be obtained from the adenovirus vector. For example, a therapeutic transgene that is bound to a liver-specific promoter containing the enhancer element of hepatitis B virus and a minimal promoter that does not contain an enhancer, and that may be surrounded by SAR elements, is inserted into the adenovirus genome. See PCT Publication No. WO 97/04117, which describes a liver-specific adenovirus expression vector characterized in that:
【０００９】 今日までのトランスジーン移入研究におけるアデノウイルスベクターの使用は
、トランスジーン発現の持続性がしばしば一過性であることを示している。少な
くともいくらかの制限が複製欠損ベクターからでさえも発現されるウイルスタン
パク質に対する細胞性免疫応答の発生に起因し、アデノウイルス感染細胞を破壊
するかまたは該細胞に不利に影響を及ぼしうる病理学的炎症性応答を引き起こし
ている（Yangら、J. Virol. 69: 2004-2015, 1995; Yangら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 4407-4411, 1994; Zsengellerら、Hum Gene Ther. 6: 457-467,
1995; Worgallら、Hum. Gene Ther. 8: 37-44, 1997; Kaplanら、Hum. Gene The
r. 8: 45-56, 1997）。アデノウイルスは細胞ゲノム中に組み込まれないので、 ビリオンまたは感染細胞を破壊する宿主免疫応答がアデノウイルスに基づくトラ
ンスジーン移入を制限する可能性がある。長期の発現は、組換えアデノウイルス
ベクターがアデノウイルスベクターと免疫抑制剤の両方を与えられたヌードマウ
スまたはマウス中に導入される場合に、達成できる（Dai, Yら、1995, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 92: 1401-1405）。これらの結果は、免疫応答がアデノウイ
ルスベクターから通常得られる短期の発現の後に起こるという考えを支持する（
Verma, I.N.およびSomia, N., 1997, Science 389: 239-242）。不利な免疫応答
は、アデノウイルスベクターの多量の投与および反復投与に対する一連の障害を
引き起こす（Crystal, R., Science 270: 404-410, 1995）。[0009] The use of adenoviral vectors in transgene transfer studies to date has shown that the persistence of transgene expression is often transient. Pathological inflammation that can destroy or adversely affect adenovirus-infected cells, at least in part due to the development of a cellular immune response to viral proteins expressed even from replication-defective vectors Sexual response (Yang et al., J. Virol. 69: 2004-2015, 1995; Yang et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91: 4407-4411, 1994; Zsengeller et al., Hum Gene Ther. 6: 457-467,
1995; Worgall et al., Hum. Gene Ther. 8: 37-44, 1997; Kaplan et al., Hum. Gene The
r. 8: 45-56, 1997). Since the adenovirus is not integrated into the cell genome, host immune responses that destroy virions or infected cells may limit adenovirus-based transgene transfer. Long-term expression can be achieved when the recombinant adenovirus vector is introduced into nude mice or mice given both the adenovirus vector and the immunosuppressant (Dai, Y et al., 1995, Proc.
tl. Acad. Sci. USA 92: 1401-1405). These results support the idea that the immune response occurs after short-term expression normally obtained from adenoviral vectors (
Verma, IN and Somia, N., 1997, Science 389: 239-242). An adverse immune response causes a series of obstacles to high and repeated administration of adenoviral vectors (Crystal, R., Science 270: 404-410, 1995).
【００１０】 トランスジーン発現の持続を制限する一因となる宿主免疫応答を回避するため
に、一般に、免疫応答自体の調節または免疫応答を減少させるベクターの操作の
いずれかを含む種々の戦略が用いられてきた。免疫抑制剤とベクターを一緒に投
与することは、トランスジーン発現を延長し（Fangら、Hum. Gene Ther. 6: 103
9-1044, 1995; Kayら、Nature Genetics 11: 191-197, 1995; Zsellengerら、Hu
m. Gene Ther. 6: 457-467, 1995）、ベクターの反復投与を可能にすることが示
された。Engellhardtら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6196-6200 (1994)）
は、幅広い免疫抑制剤の使用により、アデノウイルスベクターの反復投与に付随
する免疫学的問題を克服できることを証明した。同様に、Daiら（Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 92: 1401-1405 (1995)）は、細胞除去剤（cytoablative）を使用
して、第１世代のアデノウイルスベクターに対する宿主の免疫応答を克服する同
様の結果を示した。しかしながら、免疫抑制剤はアデノウイルスベクターから得
られる発現の期間を延長できるが、患者よりもむしろベクターを操作して発現期
間の延長を達成することが望ましい（Verma, I.N.およびSomia, N., 1997, Scie
nce 389: 239-242）。[0010] To evade the host immune response, which contributes to limiting the persistence of transgene expression, various strategies are generally used, including either the modulation of the immune response itself or the manipulation of vectors to reduce the immune response. I have been. Co-administration of an immunosuppressant and a vector prolongs transgene expression (Fang et al., Hum. Gene Ther. 6: 103
9-1044, 1995; Kay et al., Nature Genetics 11: 191-197, 1995; Zsellenger et al., Hu.
m. Gene Ther. 6: 457-467, 1995), which was shown to allow for repeated administration of the vector. Engellhardt et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6196-6200 (1994))
Have demonstrated that the use of a wide range of immunosuppressants can overcome the immunological problems associated with repeated administration of adenovirus vectors. Similarly, Dai et al. (Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 92: 1401-1405 (1995)) have shown similar results to overcome host immune responses to first generation adenovirus vectors using cytoablatives. However, while immunosuppressants can extend the duration of expression obtained from adenovirus vectors, it is desirable to manipulate the vector rather than the patient to achieve an extended expression period (Verma, IN and Somia, N., 1997). , Scie
nce 389: 239-242).
【００１１】 組換えベクター中に含有されるゲノムアデノウイルス配列に対する修飾が、宿
主免疫応答を減少させるために試みられた（Yangら、Nature Genetics 7: 362-3
69, 1994; Lieberら、J. Virol. 70: 8944-8960, 1996; Gorzigliaら、J. Virol
. 70: 4173-4178; Kochanekら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5731-5736, 1
996; Fisherら、Virology 217: 11-22, 1996）。アデノウイルスＥ３ｇｐ１９Ｋ
タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ抗原との複合体を形成でき、細胞質網状構造中に
それらを保有し、細胞表面提示および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（Woldら、
Trends Microbiol. 437-443, 1994）による感染細胞の死を妨げ、組換えアデノ ウイルスベクターにおいてその存在が有益であることを示唆する。[0011] Modifications to genomic adenovirus sequences contained in recombinant vectors have been attempted to reduce the host immune response (Yang et al., Nature Genetics 7: 362-3).
69, 1994; Lieber et al., J. Virol. 70: 8944-8960, 1996; Gorziglia et al., J. Virol.
70: 4173-4178; Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5731-5736, 1
996; Fisher et al., Virology 217: 11-22, 1996). Adenovirus E3gp19K
Proteins can form complexes with MHC class I antigens, retain them in the cytoplasmic network, cell surface presentation and cytotoxic T lymphocytes (CTL) (Wold et al.,
Trends Microbiol. 437-443, 1994), preventing the death of infected cells, suggesting its presence in recombinant adenovirus vectors.
【００１２】 アデノウイルスベクターによってデリバリーされるトランスジーンの発現にお
ける持続性の欠如は、また、発現カセットまたは転写単位に含有されるプロモー
ターまたはトランスジーンの選択によって強要される制限が原因であるかもしれ
ない（Guoら、Gene Therapy 3: 802-801, 1996; Tripathyら、Nature Med. 2: 5
45-550, 1996）。[0012] The lack of persistence in the expression of transgenes delivered by adenoviral vectors may also be due to limitations imposed by the choice of promoter or transgene contained in the expression cassette or transcription unit. (Guo et al., Gene Therapy 3: 802-801, 1996; Tripathy et al., Nature Med. 2: 5
45-550, 1996).
【００１３】 アデノウイルスベクターをヌードおよび免疫適格マウス中に導入した実験は、
アデノウイルスゲノムのＥ４領域が、特にトランスジーンがトランスジーンを調
節する野生型ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結される場合、持続性トランス
ジーン発現に寄与したことを明らかにした（Kaplanら、Hum. Gene Ther. 8: 45-
56, 1997; Armentanoら、J. Virol. 71: 2408-2416, 1997; ＰＣＴ公報ＷＯ９８
／４６７８１号）。[0013] Experiments in which the adenovirus vector was introduced into nude and immunocompetent mice,
It has been shown that the E4 region of the adenovirus genome contributed to persistent transgene expression, especially when the transgene was operably linked to a wild-type CMV promoter that regulates the transgene (Kaplan et al., Hum. Gene Ther. 8: 45-
56, 1997; Armentano et al., J. Virol. 71: 2408-2416, 1997; PCT Publication WO98.
/ 46781).
【００１４】 アデノウイルスベクターの使用のほかに、トランスジーンを含むプラスミドを
使用して標的細胞にトランスジーンをデリバリーしてもよい。また、プラスミド
が連続的に存在することにより、長期にわたって遺伝学的欠損の補正を提供でき
るので（嚢胞性繊維症の場合、ベクターは機能性ＣＦＴＲタンパク質を肺上皮細
胞または他の細胞の細胞膜に提供して、非機能性または欠損している内在性タン
パク質を置換する）、遺伝子移入ビヒクルとして使用するためのプラスミドは、
個体のレシピエント細胞または組織において複製できることが望ましい。標的細
胞または組織中で複製できないプラスミドは、比較的短期間だけそこで維持され
た後に崩壊し、よって、過剰な反復投与を必要とするといういくらかの心配があ
る。[0014] In addition to using adenovirus vectors, transgenes may be delivered to target cells using plasmids containing the transgene. Also, the continuous presence of the plasmid can provide long-term correction of genetic defects (in the case of cystic fibrosis, the vector provides a functional CFTR protein to the cell membrane of lung epithelial cells or other cells). To replace non-functional or defective endogenous proteins), a plasmid for use as a gene transfer vehicle comprises:
It is desirable to be able to replicate in the recipient cells or tissues of the individual. Plasmids that cannot replicate in the target cell or tissue are destroyed after being maintained there for only a relatively short period of time, and thus have some concern that they require excessive repeated administration.
【００１５】 細胞において欠損または不完全遺伝子産物の長期間の補正は、おそらく、標的
細胞の染色体中に組み込まれるように設計されたベクター（例えば、レトロウイ
ルス上でパターン化されたベクター）を用いて達成できる。しかしながら、かか
る戦略は、（１）ベクターが染色体の必須領域に組み込まれる、（２）ベクター
がオンコジーンの隣接領域に組み込まれ、それを活性化することを包含する危険
性を含む。[0015] Long-term correction of defective or incomplete gene products in cells will probably be achieved using vectors designed to integrate into the chromosome of the target cell (eg, vectors patterned on retroviruses). Can be achieved. However, such strategies involve the danger that involves (1) the vector integrating into an essential region of the chromosome, (2) the vector integrating into and activating the adjacent region of the oncogene.
【００１６】 したがって、１の戦略は、他の方法によって、標的細胞中のプラスミドの連続
的維持を提供することであった。１のかかる戦略は、標的の核とは別に（すなわ
ち、エピソームに）維持されることが可能なプラスミドを構築することである。
C. Mc Whinneyら（Nucleic Acids Research, 18, 1233-1242, 1990）は、ヒトｃ
−ｍｙｃ遺伝子のエキソン１の５’に隣接して存在する２．４ｋｂ ＨｉｎｄＩ ＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントが複製起点を含有することを決定し、該フラグメン
トをプラスミド中でクローン化し、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした場合
、薬剤選択下で３００世代以上の間、該プラスミドを細胞中で持続させることが
示された。複製は、半保存的であることが示された（C. McWhinneyら）。細胞１
世代あたりプラスミド集団の約５％が、遺伝子治療のための治療用プラスミドの
設計に関して有益であろう実質的な安定化を示す薬剤選択を有さずに失われた。Thus, one strategy has been to provide, by other methods, continuous maintenance of the plasmid in the target cells. One such strategy is to construct a plasmid that can be maintained separately (ie, episomal) from the target nucleus.
C. Mc Whinney et al. (Nucleic Acids Research, 18, 1233-1242, 1990) report that human c
The 2.4 kb HindI II-XhoI fragment located adjacent to 5 ′ of exon 1 of the myc gene was determined to contain an origin of replication, and the fragment was cloned in a plasmid and transfected into HeLa cells. In some cases, the plasmid was shown to persist in cells for over 300 generations under drug selection. Replication was shown to be semi-conserved (C. McWhinney et al.). Cell 1
About 5% of the plasmid population per generation was lost without drug selection showing substantial stabilization which would be beneficial for designing therapeutic plasmids for gene therapy.
【００１７】 複製エピソームベクターの１例として、１コピーの２．４ｋｂ ＨｉｎｄＩＩ Ｉ−ＸｈｏＩフラグメントがｐＣＦ１骨格のＣＭＶエンハンサー／プロモーター
領域の５’側に隣接して配置されるｐＣＦ１−ＣＡＴ（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１
８３７２号、図１８Ａ）を構築してもよい。別法では、２〜約４コピーの一列に
並んだ２．４ｋｂフラグメントを同様に配置させてもよい。２．４ｋｂフラグメ
ント（または、その複数コピー）の挿入の結果としてもたらされるプラスミドサ
イズの増加は、付加的な利益を提供すると予想される。すなわち、プラスミドを
解きやすくし、よって、ＤＮＡポリメラーゼの活性化を促進することが予想され
る。ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８３７２号を参照のこと（出典明示により本明細書
の一部とする）。該複製起点またはその複数コピーの使用は、得られるプラスミ
ドのヒト細胞中での十分な複製を可能にする。他の複製起点を含む他のＤＮＡも
また使用してもよい（例えば、ヒトβ−グロブリン遺伝子またはマウスＤＨＦＲ
遺伝子に見られるように）。サイトメガロウイルスプロモーターおよびエンハン
サー、イントロン、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ、牛成長ホルモンポリアデニル化シグナ ル、カナマイシン耐性トランスポゾンＴｎ９０３および４コピーのヒトｃ−ｍｙ
ｃ遺伝子の２．４ｋｂ ５’フランキング領域を含有するプラスミドは、ＷＯ９ ６／１８３７２号の図２０に示される。As an example of a replication episomal vector, pCF1-CAT in which one copy of a 2.4 kb HindII I-XhoI fragment is located adjacent to the 5 ′ side of the CMV enhancer / promoter region of the pCF1 backbone (PCT Publication WO96 / 1
No. 8372, FIG. 18A). Alternatively, an in-line 2.4 kb fragment of 2 to about 4 copies may be similarly positioned. The increase in plasmid size resulting from the insertion of the 2.4 kb fragment (or multiple copies thereof) is expected to provide additional benefits. In other words, it is expected that the plasmid will be easy to disassemble, and thus the activation of DNA polymerase will be promoted. See PCT Publication No. WO 96/18372, which is hereby incorporated by reference. The use of the origin of replication, or multiple copies thereof, allows for sufficient replication of the resulting plasmid in human cells. Other DNAs containing other origins of replication may also be used (eg, the human β-globulin gene or mouse DHFR
As seen in the gene). Cytomegalovirus promoter and enhancer, intron, CFTR cDNA, bovine growth hormone polyadenylation signal, kanamycin resistant transposon Tn903 and 4 copies of human c-my
A plasmid containing the 2.4 kb 5 'flanking region of the c gene is shown in FIG. 20 of WO96 / 18372.
【００１８】 また、標的細胞および組織における持続性トランスジーン発現のためのアデノ
ウイルスベクターおよびプラスミドのさらなる最適化は、作動可能に連結された
トランスジーンに持続性発現を与えるプロモーターのような発現調節エレメント
の設計を含んでもよい。特定のウイルス遺伝子とは無関係に機能してトランスジ
ーンの持続性発現を与えるプロモーターエレメントは、ウイルスゲノム含量の少
ないベクターの使用を可能にし、ベクターの運搬容量を増加させる一方で、宿主
免疫反応の可能性または複製能力のあるウイルスの発生を減少させる。[0018] Further optimization of adenovirus vectors and plasmids for persistent transgene expression in target cells and tissues can be achieved by expression control elements such as promoters that confer sustained expression on an operably linked transgene. May include the design of Promoter elements that function independently of specific viral genes and provide for sustained expression of the transgene enable the use of vectors with low viral genome content and increase vector carrying capacity while enabling a host immune response Reduces the occurrence of sexually or replicative viruses.
【００１９】 発明の概要 本発明は、作動可能に連結されたトランスジーンの持続性発現のための新規な
プロモーターエレメントに向けられる。１の態様において、エレメントは、サイ
トメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）由来である。本発明の１の具体
例において、トランスジーンに作動可能に連結されたＣＭＶ−由来のプロモータ
ーエレメントを含むアデノウイルスベクターをレシピエント細胞に投与する。本
発明のもう１つ別の具体例において、トランスジーンに作動可能に連結された本
発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを含むプラスミドをレシピエント細
胞に投与する。プラスミドは、また、ＷＯ９６／１８３７２号または米国特許第
５，６５０，０９６号に開示されたように、脂質と結合させて細胞にデリバリー
してもよい。また、本発明の範囲内には、本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエ
レメントに作動可能に連結される場合、該プロモーターエレメントに作動可能に
連結されたトランスジーンの発現を増加させるヒトアルブミン遺伝子由来のエン
ハンサーエレメントがある。本発明は、また、本発明のエンハンサーおよびプロ
モーターエレメントを含むかかるアデノウイルスベクターおよびプラスミドのト
ランスジーン移入における使用を記載する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to novel promoter elements for sustained expression of an operably linked transgene. In one embodiment, the element is from the cytomegalovirus immediate early promoter (CMV). In one embodiment of the invention, an adenoviral vector comprising a CMV-derived promoter element operably linked to a transgene is administered to recipient cells. In another embodiment of the present invention, a plasmid comprising a CMV-derived promoter element of the present invention operably linked to a transgene is administered to recipient cells. Plasmids may also be coupled to lipids and delivered to cells as disclosed in WO 96/18372 or US Pat. No. 5,650,096. Also within the scope of the present invention is an enhancer derived from the human albumin gene that, when operably linked to a CMV-derived promoter element of the present invention, increases the expression of a transgene operably linked to the promoter element. There are elements. The present invention also describes the use of such adenoviral vectors and plasmids containing the enhancer and promoter elements of the present invention in transgene transfer.
【００２０】 発明の詳細な記載 本発明は、作動可能に連結されたトランスジーンの持続性発現のための新規な
プロモーターエレメントに向けられている。１の態様において、エレメントは、
サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）由来である。本発明の１の
具体例において、トランスジーンに作動可能に連結された本発明のＣＭＶ由来の
プロモーターエレメントを含むアデノウイルスベクターを使用して、標的細胞に
投与される場合にトランスジーンの持続性発現を達成する。もう１つ別の具体例
において、トランスジーンに作動可能に連結されたＣＭＶ由来のプロモーターエ
レメントを含むプラスミドを使用して、標的細胞に投与される場合にトランスジ
ーンの持続性発現を達成する。また、ＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに作
動可能に連結されたトランスジーンの発現増加を実現するエンハンサーエレメン
トも、本発明の範囲内である。１の態様において、エンハンサーエレメントはヒ
トアルブミン遺伝子由来である。本発明は、また、少なくとも本発明のＣＭＶ由
来のプロモーターエレメントおよびトランスジーンを含む発現カセットまたは転
写単位に向けられている。発現カセットまたは転写単位は、また、エンハンサー
エレメントを含んでいてもよい。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is directed to a novel promoter element for the sustained expression of an operably linked transgene. In one embodiment, the element is
It is derived from the cytomegalovirus immediate early promoter (CMV). In one embodiment of the invention, the sustained expression of the transgene when administered to a target cell using an adenovirus vector comprising a CMV-derived promoter element of the invention operably linked to the transgene. To achieve. In another embodiment, a plasmid comprising a CMV-derived promoter element operably linked to the transgene is used to achieve sustained expression of the transgene when administered to target cells. Also, enhancer elements that increase expression of a transgene operably linked to a CMV-derived promoter element are within the scope of the invention. In one embodiment, the enhancer element is from the human albumin gene. The present invention is also directed to an expression cassette or transcription unit comprising at least a CMV-derived promoter element and a transgene of the present invention. The expression cassette or transcription unit may also include an enhancer element.
【００２１】 トランスジーンは、とりわけ、担体ベクターに対して異種性のタンパク質（例
えば、酵素、ホルモン、細胞表面分子）、リボザイム、ＲＮＡおよびアンチセン
スＲＮＡをコードする核酸分子として定義される。かかるトランスジーンは、例
えば、限定するものではないが、ウイルスベクター、プラスミド、リポソームを
包含する脂質、ネイクドＤＮＡ、それらの組み合わせまたはトランスジーンのデ
リバリーについて当業者に既知の他の方法によって、細胞または組織にデリバリ
ーしてもよい。持続性発現は、長時間、トランスジーンの持続した発現レベルを
生じ、維持することとして定義される。A transgene is defined as a nucleic acid molecule that encodes, inter alia, proteins (eg, enzymes, hormones, cell surface molecules), ribozymes, RNA and antisense RNA that are heterologous to the carrier vector. Such transgenes can be, for example, but not limited to, viral vectors, plasmids, lipids, including liposomes, naked DNA, combinations thereof, or other methods known to those of skill in the art for delivering transgenes to cells or tissues. May be delivered to Sustained expression is defined as producing and maintaining a sustained expression level of the transgene for an extended period of time.
【００２２】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは、野生型サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）前初期プロモーター由来のヌクレオチド配列を含有し（Boshartら 、Cell 41: 521-530, 1985、出典明示により本明細書の一部とする）（図１）（
配列番号１）、作動可能にそれに連結されたトランスジーンの持続性発現を提供
するプロモーターエレメントとして定義される。The CMV-derived promoter element of the present invention contains a nucleotide sequence derived from the wild-type cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985, herein incorporated by reference). (Fig. 1) (
SEQ ID NO: 1) is defined as a promoter element that provides for sustained expression of a transgene operably linked thereto.
【００２３】 本発明の特定の具体例は、ヌクレオチド−２９５〜−１４を含有するＣＭＶ由
来のプロモーターエレメント（図２）（配列番号２）、ＣＭＶプロモーターのヌ
クレオチド２９９〜−１９を含有するＣＭＶ由来のプロモーターエレメント（図
３）（配列番号３）、および野生型ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド−２４２
〜−１４を含有するＣＭＶ由来のプロモーターエレメント（図４）（配列番号４
）を包含する（ΔＣＭＶプロモーターエレメントと称する）。Certain embodiments of the present invention include a CMV-derived promoter element containing nucleotides -295-14 (FIG. 2) (SEQ ID NO: 2), a CMV-derived CMV-derived promoter containing nucleotides 299-19. Promoter element (Figure 3) (SEQ ID NO: 3), and nucleotide -242 of the wild-type CMV promoter
CMV-derived promoter element containing ~ 14 (Fig. 4) (SEQ ID NO: 4)
) (Referred to as ΔCMV promoter element).
【００２４】 本発明の範囲内にある他のプロモーターエレメントもまた、ＣＭＶプロモータ
ーのヌクレオチド配列由来であり、標的細胞において作動可能に連結されたトラ
ンスジーンに持続性発現を与える。野生型ＣＭＶプロモーターがアデノウイルス
Ｅ４配列に依存して持続性発現を与える場合（例えば、ＷＯ９８／４６７８１号
参照）、本発明のプロモーターエレメントは、Ｅ４領域を欠くアデノウイルスベ
クター中に入れて細胞へデリバリーされるとき、トランスジーンの持続性発現を
与えるその能力によって同定されうる。もう１つ別の具体例において、持続性発
現を与えることができるプロモーターエレメントを例えば、転写レプレッサータ
ンパク質が結合できるＣＭＶプロモーター配列内の部位の欠失によって構築して
もよい。野生型ＣＭＶプロモーターからのかかる部位の除去は、より持続された
発現を導く（図６参照）。かかるレプレッサータンパク質の例は、ＹＹ１（Liu ら、Nucleic Acids Research 22: 2453-2459, 1994; Gualbertoら、Mol. Cell B
iol. 12: 4209-4214, 1992; Galvinら、Mol. Cell Biol. 17: 3723-3732, 1997)
；ＭＤＢＰ（Zhangら、Nucleic Acids Res. 18: 6253-6260; Zhangら、Virology
182: 865-869; Supekarら、Nucleic Acids Res. 16: 8029-8044, 1988)；ＩＥ ２（Liuら、J. Virol. 65: 897-603, 1991)、ＣＲＥＢ／ＣＲＥＭ（Foulkesら、
Cell 64: 739-749, 1991; Karpinskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4820
-4824, 1992; Lamphら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4320-4324, 1990; Le
maigreら、Nucleic Acids Res. 21: 2907-2911, 1993）およびＤｒ１（Kimら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 820-825, 1997; Whiteら、Science 266: 448-4
50, 1994）を包含する。３つのＹＹ１結合部位が、野生型ＣＭＶプロモーター中
、転写開始部位に相対的に−３００〜−５２２に位置する。また、ＣＲＥＢに対
する少なくとも５個の潜在的な結合部位およびメチル化依存性結合タンパク質に
対する３個の結合部位が存在する。さらに、Ｄｒ１のようなレプレッサーもまた
、コアプロモーター複合体上で作用できる。当業者は、組換えＤＮＡ技術の標準
的技法によって、これらの部位のいずれかを容易に除去することができる。別法
では、本発明の範囲内にある他のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは、持続
性発現を達成するために、転写アクチベーター部位に対応するいずれかのヌクレ
オチドを保持するかまたは加えることができる。かかるアクチベーターは、例え
ば、ＮＦｋａｐｐａβ（Boshartら、Cell 41: 521-530, 1985; Changら、J. Vir
ol. 64: 264-277, 1990; Nellerら、Nucleic Acids Res. 19: 3715-3721, 1991 ）を包含する。転写レプレッサーおよびアクチベータータンパク質が結合する天
然ＣＭＶプロモーター中のヌクレオチド配列は、当業者に既知である。[0024] Other promoter elements within the scope of the present invention are also derived from the nucleotide sequence of the CMV promoter and provide for sustained expression of the operably linked transgene in the target cell. If the wild-type CMV promoter provides for sustained expression dependent on the adenovirus E4 sequence (see, eg, WO 98/46781), the promoter element of the present invention can be delivered to cells in an adenovirus vector lacking the E4 region. Can be identified by its ability to confer sustained expression of the transgene. In another embodiment, a promoter element capable of providing sustained expression may be constructed, for example, by deletion of a site within the CMV promoter sequence to which a transcriptional repressor protein can bind. Removal of such sites from the wild-type CMV promoter leads to more sustained expression (see FIG. 6). Examples of such repressor proteins include YY1 (Liu et al., Nucleic Acids Research 22: 2453-2459, 1994; Gualberto et al., Mol. Cell B
iol. 12: 4209-4214, 1992; Galvin et al., Mol. Cell Biol. 17: 3723-3732, 1997).
MDBP (Zhang et al., Nucleic Acids Res. 18: 6253-6260; Zhang et al., Virology
182: 865-869; Supekar et al., Nucleic Acids Res. 16: 8029-8044, 1988); IE 2 (Liu et al., J. Virol. 65: 897-603, 1991), CREB / CREM (Foulkes et al.
Cell 64: 739-749, 1991; Karpinski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4820.
-4824, 1992; Lamph et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4320-4324, 1990; Le.
maigre et al., Nucleic Acids Res. 21: 2907-2911, 1993) and Dr1 (Kim et al., P.
roc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 820-825, 1997; White et al., Science 266: 448-4.
50, 1994). Three YY1 binding sites are located at -300 to -522 relative to the transcription start site in the wild-type CMV promoter. Also, there are at least five potential binding sites for CREB and three binding sites for methylation-dependent binding proteins. In addition, repressors such as Dr1 can also act on the core promoter complex. One of skill in the art can easily remove any of these sites by standard techniques of recombinant DNA technology. Alternatively, other CMV-derived promoter elements within the scope of the invention can carry or add any nucleotides corresponding to transcriptional activator sites to achieve sustained expression. Such activators include, for example, NFkappaβ (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985; Chang et al., J. Vir.
ol. 64: 264-277, 1990; Neller et al., Nucleic Acids Res. 19: 3715-3721, 1991). The nucleotide sequences in the native CMV promoter to which the transcription repressor and activator protein bind are known to those skilled in the art.
【００２５】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは、制限酵素消化、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および部位特異的突然変異誘発のような分子生物学の標準
的技法を用いて操作することができる。ＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは
、ＤＮＡフラグメントを連結するための分子生物学において既知の標準的技法に
よって、特定のトランスジーンに作動可能に連結することができる。さらに、プ
ロモーターエレメントがトランスジーンの持続性発現に関する能力を保持できる
ようにする本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメント内のヌクレオチド置換
は、本発明の範囲内である。かかるヌクレオチド置換は、例えば、上記の転写レ
プレッサータンパク質（例えば、ＹＹ１）の結合部位を改変させ、その結果、レ
プレッサーがもはや結合できなくなる置換を包含する。The CMV-derived promoter elements of the present invention can be manipulated using standard techniques of molecular biology such as restriction enzyme digestion, polymerase chain reaction (PCR) and site-directed mutagenesis. A CMV-derived promoter element can be operably linked to a particular transgene by standard techniques known in molecular biology for joining DNA fragments. In addition, nucleotide substitutions within the CMV-derived promoter element of the invention that allow the promoter element to retain its ability for sustained expression of the transgene are within the scope of the invention. Such nucleotide substitutions include, for example, those that alter the binding site of the above-described transcriptional repressor protein (eg, YY1) so that the repressor can no longer bind.
【００２６】 トランスジーンの持続性発現を与える能力を有する本発明の好ましいＣＭＶ由
来のプロモーターエレメントは、ヌクレオチド−２９５〜−１４、−２９９〜−
１９および−２１３〜−１４を含有するものを包含する。本発明の範囲内にある
ＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを作製するための野生型ＣＭＶプロモータ
ーの他の末端切断型は、限定するものではないが、ヌクレオチド−４０６〜−１
９；−２９９〜−１０；−２９９〜＋１；および−２９９〜＋３１；−２７７〜
−１９；−２７７〜−１４；および−２１３〜−１９を含有するものを包含する
。Preferred CMV-derived promoter elements of the present invention that have the ability to confer sustained expression of the transgene include nucleotides -295-14, -299-
19 and -213 to -14. Other truncated forms of the wild-type CMV promoter for making CMV-derived promoter elements within the scope of the present invention include, but are not limited to, nucleotides -406 to -1.
9; -299 to -10; -299 to +1; and -299 to +31;
-19; -277 to -14; and -213 to -19.
【００２７】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは、また、例えば、本発明のＣ
ＭＶ由来のプロモーターエレメントの５’末端に付加することができる転写因子
結合部位を含むことができる。かかる部位は、当業者に既知である。[0027] The CMV-derived promoter element of the present invention also includes, for example, the CV of the present invention.
It may include a transcription factor binding site that can be added to the 5 'end of the MV-derived promoter element. Such sites are known to those skilled in the art.
【００２８】 したがって、本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは、作動可能に連
結されたトランスジーンの持続性発現に寄与する細胞性プロモーター配列を包含
してもよい。かかる配列は、例えば、限定するものではないが、アクチン、ムチ
ンおよび他の構成性細胞プロモーター由来であることができる。Thus, a CMV-derived promoter element of the invention may include a cellular promoter sequence that contributes to the sustained expression of an operably linked transgene. Such sequences can be, for example, without limitation, from actin, mucin and other constitutive cell promoters.
【００２９】 また、本発明の範囲内には、持続性トランスジーン発現に関してアデノウイル
スＥ４領域に対する依存性を示すＣＭＶ以外の、例えば、ラウス肉腫ウイルス（
ＲＳＶ）の野生型プロモーター由来のプロモーターエレメントがある。例えば、
作動可能に連結されたトランスジーンに持続性発現を与えることができるプロモ
ーターエレメントを製作するように、転写レプレッサータンパク質ＹＹ１が結合
できる血清応答エレメント（ＳＲＥ）を欠失するかまたは改変させるようにＲＳ
Ｖ由来のプロモーターエレメントを構築することができる（Gualbertoら、Mol.
Cell Biol. 12: 4209-4214, 1992）。Also within the scope of the present invention are those other than CMV, such as Rous sarcoma virus (
RSV) wild-type promoter. For example,
To create a promoter element capable of conferring sustained expression on an operably linked transgene, the RS is deleted or modified to delete or modify a serum response element (SRE) to which the transcription repressor protein YY1 can bind.
V-derived promoter elements can be constructed (Gualberto et al., Mol.
Cell Biol. 12: 4209-4214, 1992).
【００３０】 デリバリーでき、本発明のプロモーターエレメントから発現できるトランスジ
ーンは、限定するものではないが、酵素、血液製剤、ホルモン、インターロイキ
ンおよびインターフェロンのようなリンホカイン、凝固薬、成長因子、神経伝達
物質、腫瘍抑制物質、アポリポタンパク質、抗原、および抗体、および他の生物
学上活性なタンパク質をコードするものを包含する。本発明のプロモーターエレ
メントに作動可能に連結されていてもよい特定のトランスジーンは、限定するも
のではないが、嚢胞性繊維症膜貫通調節遺伝子（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、
グルコセレブロシダーゼ、腫瘍壊死因子、ｐ５３、網膜芽腫（Ｒｂ）、ヒッペル
・リンドウ（ＶＨＬ）、ｐ１０癌抑制遺伝子、ｐ１６、Ｇｌｕｔ４、およびアデ
ノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を包含する。アンチセンス分子およびリボザイム
をコードしているトランスジーンもまた、本発明の範囲内である。本発明の遺伝
子移入ビヒクル、例えば、アデノウイルスベクターまたはプラスミドは、本発明
のＣＭＶ由来または他のプロモーターエレメントに作動可能に連結された１以上
のトランスジーンを含有していてもよい。Transgenes that can be delivered and expressed from the promoter elements of the invention include, but are not limited to, enzymes, blood products, hormones, lymphokines such as interleukins and interferons, coagulants, growth factors, neurotransmitters , Tumor suppressors, apolipoproteins, antigens, and antibodies, and those encoding other biologically active proteins. Particular transgenes that may be operably linked to a promoter element of the invention include, but are not limited to, cystic fibrosis transmembrane regulatory gene (CFTR), dystrophin,
Includes glucocerebrosidase, tumor necrosis factor, p53, retinoblastoma (Rb), hippel gentian (VHL), p10 tumor suppressor gene, p16, Glut4, and adenosine deaminase (ADA). Transgenes encoding antisense molecules and ribozymes are also within the scope of the invention. A gene transfer vehicle, eg, an adenoviral vector or plasmid, of the present invention may contain one or more transgenes operably linked to a CMV-derived or other promoter element of the present invention.
【００３１】 本発明にしたがって、遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターまたはプラ
スミドは、トランスジーンをコードしているＤＮＡに作動可能に連結された本発
明のプロモーターエレメントを含むだけでなく、別のプロモーターまたはエンハ
ンサーのようないずれか他の発現調節配列、ポリアデニル化エレメント、および
それに作動可能に連結されたトランスジーンの発現を調節または増加させるため
に使用されうるいずれか他の調節エレメントを含んでいてもよい。限定するもの
ではないが、エンハンサーエレメントの例は、アポＥエンハンサーエレメント（
Shachter N.S.ら、1993, J Lipid Res. 34: 1699-707; Allan C.M.ら、1995, J.
Biol. Chem. 270: 26278-81）、α１アンチトリプシンエンハンサーエレメント
（Morgan Kら、1997, Biochim. Biophys. Acta. 1362: 67-67）、ヒトフィブリ ノーゲンエンハンサーエレメント（Hu C.H.ら、1995, J. Biol. Chem. 270: 283
42-9）、ヒトシトクロムＰ４５０１Ａ１遺伝子エンハンサーエレメント（Kress,
Sら、Eur. J. Biochem. 258: 803-812, 1998）、ヒトカルボキシエステルリパ ーゼ遺伝子エンハンサーエレメント（Lidberg, U.ら、J. Biol. Chem. 273: 314
17-31426, 1998）、ブタアルファ−骨格アクチン遺伝子エンハンサーエレメント
（Reecy, J.M.ら、Anim. Biotechnol. 9: 101-120, 1998）および野生型ヒトア ルブミン遺伝子の転写開始部位から上流−１．７および−６ｋｂに位置するヒト
アルブミン遺伝子エンハンサーエレメント（Hayashi, Y.ら、J. Biol. Chem. 26
7: 14580-14585, 1992; 出典明示により本明細書の一部とする）を包含する。In accordance with the present invention, an adenoviral vector or plasmid for gene transfer not only includes the promoter element of the present invention operably linked to the transgene-encoding DNA, but also contains another promoter or It may include any other expression control sequences, such as enhancers, polyadenylation elements, and any other control elements that can be used to regulate or increase the expression of a transgene operably linked thereto. . A non-limiting example of an enhancer element is an ApoE enhancer element (
Shachter NS et al., 1993, J Lipid Res. 34: 1699-707; Allan CM et al., 1995, J.
Biol. Chem. 270: 26278-81), α1 antitrypsin enhancer element (Morgan K et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta. 1362: 67-67), human fibrinogen enhancer element (Hu CH et al., 1995, J. Biol). Chem. 270: 283
42-9), human cytochrome P4501A1 gene enhancer element (Kress,
S et al., Eur. J. Biochem. 258: 803-812, 1998), human carboxyester lipase gene enhancer element (Lidberg, U. et al., J. Biol. Chem. 273: 314).
17-31426, 1998), the porcine alpha-skeletal actin gene enhancer element (Reecy, JM et al., Anim. Biotechnol. 9: 101-120, 1998) and -1.7 upstream and downstream from the transcription start site of the wild-type human albumin gene. The human albumin gene enhancer element located at -6 kb (Hayashi, Y. et al., J. Biol. Chem. 26
7: 14580-14585, 1992; incorporated herein by reference.
【００３２】 本発明の特定の具体例において、本発明のエンハンサーエレメントは、ヒトア
ルブミン遺伝子エンハンサー配列由来であり、トランスジーンに作動可能に連結
された本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントの５’側に配置されるとき
、トランスジーンの発現レベルを増加させる（図１１）。トランスジーンの持続
性発現を促進するいずれか他の発現調節配列、または調節エレメントの使用もま
た、本発明の範囲内である。かかる配列またはエレメントは、組織特異的発現を
生じることができるか、または外因性物質または刺激による誘導に影響されやす
い。転写単位または発現カセット中のトランスジーンの３’末端に位置しうるポ
リアデニル化シグナルは、限定するものではないが、牛成長ホルモン（ＢＧＨ）
およびＳＶ４０由来のものを包含する。In a particular embodiment of the invention, the enhancer element of the invention is derived from the human albumin gene enhancer sequence and is 5 ′ to the CMV-derived promoter element of the invention operably linked to a transgene. When deployed, it increases the expression level of the transgene (FIG. 11). The use of any other expression control sequences or elements that promote the sustained expression of the transgene is also within the scope of the invention. Such sequences or elements can result in tissue-specific expression or are susceptible to induction by exogenous substances or stimuli. Polyadenylation signals that may be located at the 3 'end of the transgene in the transcription unit or expression cassette include, but are not limited to, bovine growth hormone (BGH)
And those derived from SV40.
【００３３】 本発明のヒトアルブミン遺伝子由来のエンハンサーエレメントは、野生型ヒト
アルブミン遺伝子（Hayashi, Y.ら、J. Biol. Chem. 267: 14580-14585, 1992）
の転写開始部位から上流１．７ｋｂ（ＴＴＧＴＣＡＡＴＴＡＧＴＡＡＣＡＡ；配
列番号５）および６．０ｋｂ（ＧＣＣＡＡＡＣＡ；配列番号６）に見られるエン
ハンサー配列由来のヌクレオチド配列を含有するエンハンサーエレメントとして
定義され、本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに作動可能に連結され
たトランスジーンの発現増加を提供する。The enhancer element derived from the human albumin gene of the present invention may be a wild-type human albumin gene (Hayashi, Y. et al., J. Biol. Chem. 267: 14580-14585, 1992).
Is defined as an enhancer element containing a nucleotide sequence derived from the enhancer sequence found at 1.7 kb (TTGTCAATTAGTAACAA; SEQ ID NO: 5) and 6.0 kb (GCCAAAACA; SEQ ID NO: 6) upstream from the transcription start site of the CMV of the present invention. To provide for increased expression of a transgene operably linked to the promoter element of E. coli.
【００３４】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトラン
スジーンの発現を増加させる能力を有する本発明の好ましいヒトアルブミン遺伝
子由来のエンハンサーエレメントは、１７ヌクレオチドエンハンサーエレメント
（−１．７ｋｂエンハンサーエレメント）（図５）（配列番号７）を含む野生型
ヒトアルブミン遺伝子の転写開始部位から−１７９７〜−１７３７塩基上流に配
置される６５ヌクレオチド配列を含む。本発明の範囲内のもう１つ別のエンハン
サーエレメントは、ヒトアルブミン遺伝子転写開始部位から−６キロベースに位
置する（−６ｋｂエンハンサーエレメント）（配列番号６）。A preferred human albumin gene-derived enhancer element of the invention having the ability to increase expression of a transgene operably linked to a CMV-derived promoter element of the invention is a 17 nucleotide enhancer element (-1.7 kb). Enhancer element) (FIG. 5) (SEQ ID NO: 7), including a 65 nucleotide sequence located −1797 to −1737 bases upstream from the transcription start site of the wild-type human albumin gene. Another enhancer element within the scope of the present invention is located -6 kilobases from the human albumin gene transcription start site (-6 kb enhancer element) (SEQ ID NO: 6).
【００３５】 本発明の特定の具体例において、アデノウイルスベクターを用いて、所望のタ
ンパク質の持続性発現を達成するために、本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエ
レメントに作動可能に連結されたトランスジーンを標的細胞にデリバリーするこ
とができる。しかしながら、本発明のプロモーターエレメントは、また、限定す
るものではないが、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスお
よび当業者に既知の他のウイルス由来のベクターを包含する遺伝子移入に有用な
他のウイルスベクターと一緒に使用してもよい。In certain embodiments of the present invention, a transgene operably linked to a CMV-derived promoter element of the present invention is used to achieve sustained expression of a desired protein using an adenovirus vector. It can be delivered to target cells. However, the promoter elements of the present invention also include other viruses useful for gene transfer, including, but not limited to, vectors from retroviruses, herpes viruses, adeno-associated viruses, and other viruses known to those of skill in the art. May be used with vectors.
【００３６】 本発明に使用できるアデノウイルスベクターの特定の例は、例えば、Ａｄ２／
ＣＦＴＲ−１およびＡｄ２／ＣＦＴＲ−２および米国特許第５，６７０，４８８
号（１９９７年９月２３日発行、出典明示により本明細書の一部とする）記載の
他のベクターを包含する。アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の欠失、Ｅ４領
域の部分的または完全な欠失、および例えば、Ｅ２およびＥ３領域内の欠失を含
んでいてもよい。例えば、本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントは、Ｅ
４領域の不在下での持続性発現を与えるので、ベクターは、アデノウイルスゲノ
ムのＥ４領域の全てまたは一部を含有できるか、または全く含有できない。した
がって、かかるベクターは、所望により、Ｅ４領域由来のＯＲＦ３、ＯＲＦ４ま
たはＯＲＦ６オープンリーディングフレームを含んでいてもよい。ベクターは、
好ましくは複製欠損であり、すなわち、それらは、宿主細胞中で生産的感染を生
じることができない。本発明の範囲内には、また、例えば、１以上の異種キャプ
シドタンパク質またはそのフラグメントを有するＡｄ２骨格を含有するキメラウ
イルスベクターがある（ＰＣＴ公報ＷＯ９８／２２６０９号および許可された米
国特許出願番号第０８／７５２，７６０号（１９９６年１１月２０日出願）を参
照（出典明示により本明細書の一部とする））。他のアデノウイルスベクターは
、米国特許第５，７０７，６１８号および米国特許第５，８２４，５４４号（ど
ちらも、出典明示により本明細書の一部とする）由来のベクターを包含する。特
定の具体例において、その全てがイン・ビボでの遺伝子移入に使用されるベクタ
ーの望ましい特性である運搬容量の増加および宿主免疫応答または複製能力のあ
るウイルスの発生の可能性の減少を伴うかかるベクターの設計を考慮して、Ｅ４
欠失アデノウイルスベクター中のトランスジーンの持続性発現を与えるために本
発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを使用することができる。[0036] Specific examples of adenovirus vectors that can be used in the present invention include, for example, Ad2 /
CFTR-1 and Ad2 / CFTR-2 and US Pat. No. 5,670,488
(Issued September 23, 1997, incorporated herein by reference). Adenovirus vectors may contain deletions of the E1 region, partial or complete deletions of the E4 region, and, for example, deletions in the E2 and E3 regions. For example, the CMV-derived promoter element of the present invention may be
The vector may contain all, part, or none of the E4 region of the adenovirus genome, as it provides for sustained expression in the absence of the four regions. Accordingly, such vectors may optionally include an ORF3, ORF4 or ORF6 open reading frame from the E4 region. The vector is
Preferably they are replication deficient, ie they are not capable of producing a productive infection in the host cell. Also within the scope of the present invention are, for example, chimeric viral vectors containing an Ad2 backbone with one or more heterologous capsid proteins or fragments thereof (PCT Publication WO 98/22609 and granted US Patent Application No. 08 No./752,760, filed Nov. 20, 1996, which is hereby incorporated by reference. Other adenovirus vectors include those from US Patent Nos. 5,707,618 and 5,824,544, both of which are incorporated herein by reference. In certain embodiments, all of which involve increased delivery capacity and reduced likelihood of generating a host immune response or a replication competent virus, all of which are desirable properties of vectors used for in vivo gene transfer. Considering the vector design, E4
The CMV-derived promoter element of the invention can be used to provide for sustained expression of the transgene in a deleted adenovirus vector.
【００３７】 さらに好ましい具体例において、アデノウイルスベクターは、また、よく研究
されたグループＣアデノウイルス由来のアデノウイルス血清型、特にＡｄ２およ
びＡｄ５を用いて構築することができる。Ａｄ１７もまた好ましい血清型である
。さらに、他のグループＣまたはグループＣではないアデノウイルス由来の本発
明で使用するアデノウイルスベクターもまた、本発明の範囲内であり、１以上の
血清型由来のヌクレオチド配列を含有するキメラアデノウイルスベクターを包含
する。In a further preferred embodiment, adenovirus vectors can also be constructed using well-studied adenovirus serotypes from group C adenovirus, particularly Ad2 and Ad5. Ad17 is also a preferred serotype. In addition, adenovirus vectors for use in the present invention from other Group C or non-Group C adenoviruses are also within the scope of the present invention, and chimeric adenoviral vectors containing nucleotide sequences from one or more serotypes. Is included.
【００３８】 本発明で使用するアデノウイルスベクターを構築するために、当業者によく知
られた分子生物学および微生物学の技法を用いて、かかるベクターがどのように
設計、構築および増殖されるかに関する文献の実質的な内容を参照してもよい。
例えば、当業者は、本発明のプロモーターエレメント、好ましくはＣＭＶ由来の
プロモーターエレメントに作動可能に連結されたトランスジーンを骨格ベクター
ゲノム中に操作するために、分子生物学の標準的技法を使用することができる（
Berkner, K.L., Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66, 1992）。例えば、ア
デノウイルスゲノムフラグメント中に挿入されたトランスジーンおよび本発明の
いずれかの作動可能に連結されたＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを含有す
るプラスミドを、関連のアデノウイルスベクター由来の線状ウイルスゲノムと一
緒にゲノムフラグメントとウイルスの間で相同組換えが起こる条件下で、レシピ
エント細胞中へコトランスフェクトしてもよい。好ましい具体例において、トラ
ンスジーンおよび本発明の作動可能に連結されたＣＭＶ由来のプロモーターエレ
メントはＥ１欠失部位に挿入される。結果として、トランスジーンは、プラスミ
ド中にクローン化された部位でアデノウイルスゲノム中に挿入され、組換えアデ
ノウイルスベクターを生産する。アデノウイルスベクターは、また、標準的連結
技法を用いて構築してもよい。[0038] How to construct, construct and propagate such vectors using molecular biology and microbiology techniques well known to those skilled in the art to construct adenovirus vectors for use in the present invention. Reference may be made to the substantial content of the literature relating to
For example, one skilled in the art would use standard techniques of molecular biology to engineer a transgene operably linked to a promoter element of the invention, preferably a CMV-derived promoter element, into a backbone vector genome. Can be (
Berkner, KL, Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 39-66, 1992). For example, a plasmid containing a transgene inserted into an adenovirus genomic fragment and a promoter element from any operably linked CMV of the present invention may be combined with a linear viral genome from an associated adenovirus vector. May be co-transfected into recipient cells under conditions where homologous recombination occurs between the genomic fragment and the virus. In a preferred embodiment, the transgene and the operably linked CMV-derived promoter element of the invention are inserted into the E1 deletion site. As a result, the transgene is inserted into the adenovirus genome at the site cloned into the plasmid, producing a recombinant adenovirus vector. Adenovirus vectors may also be constructed using standard ligation techniques.
【００３９】 アデノウイルスベクターの構築は、当該分野において幅広く利用可能なアデノ
ウイルスＤＮＡ配列情報、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのような核酸配列データベー
スに基づくものであってもよい。Construction of adenovirus vectors may be based on adenovirus DNA sequence information widely available in the art, for example, nucleic acid sequence databases such as GenBank.
【００４０】 複製欠損アデノウイルスストックの調製は、ベクターから欠失されたウイルス
遺伝子を補足する細胞系統、例えば、欠失したアデノウイルスＥ１ゲノム配列を
含有する２９３またはＡ５４９細胞を用いて完成させてもよい。ＨＥＲ３細胞（
Ａｄ１２によって形質転換されたヒト胚性網膜芽腫）もまた使用できる。適当な
相補細胞系統におけるプラークの増幅後、ウイルスを凍結融解によって回収し、
続いて、塩化セシウム遠心分離を用いて精製してもよい。別法では、例えば、Ｐ
ＣＴ公報ＷＯ９７／０８２９８号（出典明示により本明細書の一部とする）に開
示のように、ウイルス精製をクロマトグラフ技法を用いて行ってもよい。Preparation of a replication-defective adenovirus stock can also be accomplished using a cell line that complements the viral gene deleted from the vector, eg, 293 or A549 cells containing the deleted adenovirus E1 genomic sequence. Good. HER3 cells (
Human embryonic retinoblastoma transformed with Ad12) can also be used. After plaque amplification in a suitable complementing cell line, the virus is recovered by freeze-thawing,
Subsequently, purification may be performed using cesium chloride centrifugation. Alternatively, for example, P
Virus purification may be performed using chromatographic techniques, as disclosed in CT publication WO 97/08298, which is hereby incorporated by reference.
【００４１】 複製欠損アデノウイルスベクターストックの力価は、相補細胞系統、例えば、
２９３細胞中のプラーク形成によって決定できる。アデノウイルスヘキソンタン
パク質に対する抗体を用いるエンドポイント希釈を用いて、標的細胞のウイルス
生産または感染効率を定量してもよい（Armentanoら、Hum. Gene. Ther. 6: 134
3-1353, 1995、出典明示により本明細書の一部とする）。The titer of a replication-defective adenovirus vector stock can be determined by complementing cell lines, eg,
It can be determined by plaque formation in 293 cells. Endpoint dilution with antibodies to adenovirus hexon protein may be used to quantify virus production or infection efficiency of target cells (Armentano et al., Hum. Gene. Ther. 6: 134
3-1353, 1995, incorporated herein by reference.)
【００４２】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを含有するアデノウイルスベク
ターの例は、ΔＣＭＶ−βｇａｌ−１であり、それは、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子に作動可能に連結したヌクレオチド−２９５〜−１４を含むＣＭＶ由来のプ
ロモーターエレメントおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをＥ１欠失中に含
み、さらにＥ４領域を欠失している。An example of an adenoviral vector containing a CMV-derived promoter element of the present invention is ΔCMV-βgal-1, which is a CMV comprising nucleotides -295 to -14 operably linked to the β-galactosidase gene. The derived promoter element and the SV40 polyadenylation signal are included in the E1 deletion, and the E4 region is further deleted.
【００４３】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトラン
スジーンをデリバリーするために用いてもよいプラスミドは、標準的な組換えＤ
ＮＡ技法を用いて操作することができる。かかるプラスミドの大規模な生産およ
び精製を当業者に既知の技法を用いて実施してもよい（例えば、Current Protoc
ols in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc., New York
, 1995）。プラスミドは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マ
イクロインジェクションおよび当業者に既知の他のＤＮＡ移入法のような技法を
用いて、標的細胞へデリバリーされる。また、プラスミドを脂質、例えば、米国
特許第５，６５０，０９６号およびＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８３７２号（両方と
も、出典明示により本明細書の一部とする）に開示されるＮ4−スペルミンコレ ステリルカルバメートおよびＮ4−スペルミジンコレステリルカルバメートのよ うな陽イオン性脂質と一緒にデリバリーしてもよい。本発明のプロモーターエレ
メントに作動可能に連結されたトランスジーンをネイクドＤＮＡ形態で標的細胞
へデリバリーすることもまた、本発明の範囲内である。A plasmid that may be used to deliver a transgene operably linked to a CMV-derived promoter element of the invention is a standard recombinant D
It can be operated using NA techniques. Large-scale production and purification of such plasmids may be performed using techniques known to those of skill in the art (eg, Current Protocol
ols in Molecular Biology, Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., New York
, 1995). Plasmids are delivered to target cells using techniques such as transfection, electroporation, microinjection, and other DNA transfer methods known to those of skill in the art. Plasmids may also be used as lipids, such as the N 4 -spermine cholesterol disclosed in US Pat. No. 5,650,096 and PCT Publication WO 96/18372, both of which are hereby incorporated by reference. It may be delivered together with a cationic lipid such as ril carbamate and N 4 -spermidine cholesteryl carbamate. It is also within the scope of the present invention to deliver a transgene operably linked to a promoter element of the invention to a target cell in naked DNA form.
【００４４】 トランスジーンがマーカーまたはリポーター遺伝子である場合、本発明のＣＭ
Ｖ由来のプロモーターエレメントを用いる発現の持続性を決定するために使用で
きる。限定するものではないが、その例は、クロラルフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）に作動可能に連結された本発明のＣＭＶ由来のプロモ
ーターエレメントを生じるように末端切断されていてもよい野生型ＣＭＶプロモ
ーターに作動可能に連結されたＣＡＴ遺伝子を含有するｐＣＦ１−ＣＡＴ（ＰＣ
Ｔ公報ＷＯ９６／１８３７２号、図１８Ａ）のようなプラスミドである。本発明
の範囲内の他のマーカー遺伝子は、限定するものではないが、β−ガラクトシダ
ーゼおよびルシフェラーゼをコードする遺伝子を包含する。マーカー遺伝子から
発現されるタンパク質は、標準的技法によって容易に検出できる。When the transgene is a marker or reporter gene, the CM of the present invention
It can be used to determine the persistence of expression using V-derived promoter elements. Non-limiting examples include a wild-type CMV promoter that may be truncated to yield a CMV-derived promoter element of the present invention operably linked to chloralphenicol acetyltransferase (CAT). PCF1-CAT containing a operably linked CAT gene (PC
Plasmids as described in T publication WO 96/18372, FIG. 18A). Other marker genes within the scope of the present invention include, but are not limited to, genes encoding β-galactosidase and luciferase. The protein expressed from the marker gene can be easily detected by standard techniques.
【００４５】 好ましい具体例において、プラスミドｐＣＦＡ−２９９／−１９ＣＡＴ（下記
実施例４）をプラスミド骨格として用いて、標的細胞へトランスジーンを移入す
るためのプラスミドを構築するが、該プラスミドにおいてＣＡＴマーカー遺伝子
は目的のトランスジーンで置換されている。In a preferred embodiment, a plasmid for transferring the transgene into target cells is constructed using the plasmid pCFA-299 / -19CAT (Example 4 below) as the plasmid backbone, wherein the CAT marker gene Has been replaced with the desired transgene.
【００４６】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトラン
スジーンを含むアデノウイルスベクターまたはプラスミドによる標的細胞の感染
は、また、米国特許第５，６５０，０９６号および１９９６年６月２０日に公開
されたＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８３７２号（両方とも、出典明示により本明細書
の一部とする）に開示される陽イオン性脂質のような陽イオン性分子の使用によ
って、促進されうる。陽イオン性分子と複合体を形成したアデノウイルスベクタ
ーもまた、１９９６年１１月２２日に出願された米国特許出願第０８／７５５，
０３５号およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／２２１４４号（出典明示により本明細書の
一部とする）に記載されている。Infection of target cells with an adenovirus vector or plasmid containing a transgene operably linked to a CMV-derived promoter element of the invention is also described in US Pat. No. 5,650,096 and June 1996. This may be facilitated by the use of cationic molecules such as the cationic lipids disclosed in PCT Publication WO 96/18372, published on the 20th, both of which are hereby incorporated by reference. . Adenovirus vectors complexed with cationic molecules have also been disclosed in US patent application Ser. No. 08/755, filed Nov. 22, 1996.
No. 035 and PCT Publication WO 98/22144 (herein incorporated by reference).
【００４７】 陽イオン性両親媒性物質は、極性および非極性ドメインの両方を含む化学構造
を有するので、該分子は、その非極性ドメインを用いて脂質膜を脂質膜を横切る
侵入を容易にすると同時に、その陽イオン性極性ドメインを用いて該膜を横切っ
て輸送されるべき生物学上有用な分子に接着することができる。Because cationic amphiphiles have a chemical structure that includes both polar and non-polar domains, the molecule may use its non-polar domains to facilitate penetration of lipid membranes across lipid membranes. At the same time, the cationic polar domain can be used to adhere to biologically useful molecules to be transported across the membrane.
【００４８】 本発明のアデノウイルスベクターまたはプラスミドと複合体を形成するために
使用されうる陽イオン性両親媒性物質は、限定するものではないが、米国特許第
５，６５０，０９６号、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８３７２号およびＰＣＴ公報Ｗ
Ｏ９８／４３９９４号に開示される陽イオン性脂質；ＤＯＴＭＡ（Felgnerら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987）（Ｎ−［１−（２，３−ジ オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）
；ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）（Behrら、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986, 1989）；ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチル
オキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）（Fe
lgnerら、J. Biol. Chem. 269: 2550-2561, 1994）；およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３
Ｂ［Ｎ−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール
）（米国特許第５，２８３，１８５号）を包含する。当該分野で認識されている
かまたは後に見出されうる他の陽イオン性両親媒性物質の使用もまた、本発明の
範囲内である。[0048] Cationic amphiphiles that can be used to form a complex with the adenovirus vector or plasmid of the present invention include, but are not limited to, US Pat. No. 5,650,096, PCT Publication WO 96/18372 and PCT Publication W
Cationic lipids disclosed in O98 / 43994; DOTMA (Felgner et al., P.
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987) (N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride).
DOGS (dioctadecylamidoglycylspermine) (Behr et al., Proc. Natl;
Acad. Sci. USA 86: 6982-6986, 1989); DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide) (Fe
Igner et al., J. Biol. Chem. 269: 2550-2561, 1994); and DC-chol (3
B [NN ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol) (U.S. Pat. No. 5,283,185). The use of other cationic amphiphiles that are recognized in the art or that may be found later are also within the scope of the present invention.
【００４９】 本発明の好ましい具体例において、本発明のベクターおよびプラスミドと複合
体を形成し、該ベクターおよびプラスミドの移入を容易にするのに有用な陽イオ
ン性両親媒性物質は、米国特許第５，６５０，０９６号および１９６年６月２０
日に公開されたＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８３７２号（両方とも、出典明示により
本明細書の一部とする）に開示される脂質である。プラスミドおよび／またはウ
イルスのデリバリーにおいて使用されるべき本明細書に記載の好ましい陽イオン
性両親媒性物質は、とりわけ、ＷＯ９６／１８３７２号の図１、７および９に示
されるような、そのプロトン付加、部分的プロトン付加および脱プロトン形態を
包含するＧＬ−５３、ＧＬ−６７、ＧＬ−７５、ＧＬ−８７およびＧＬ−８９を
包含する。さらなる具体例は、そのプロトン付加、部分的プロトン付加および脱
プロトン形態を包含する上記の特許公報に開示されるような非Ｔ型の両親媒性物
質の使用を包含する。最も好ましくは、本発明のベクターおよびプラスミドをデ
リバリーするために使用できる陽イオン性両親媒性物質は、式（Ｉ）： で示されるＮ4−スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ−６７）または式 （ＩＩ）： で示されるＮ4−スペルミジンコレステリルカルバメート（ＧＬ−５３）のいず れかである。In a preferred embodiment of the invention, cationic amphiphiles useful for forming complexes with the vectors and plasmids of the invention and facilitating the transfer of said vectors and plasmids are described in US Pat. 5,650,096 and June 20, 196
Lipids disclosed in PCT Publication No. WO 96/18372, published on Jan. 10, 2005, both of which are hereby incorporated by reference. Preferred cationic amphiphiles described herein to be used in the delivery of plasmids and / or viruses include, inter alia, their protonation, as shown in FIGS. 1, 7 and 9 of WO 96/18372. GL-53, GL-67, GL-75, GL-87 and GL-89, including partially protonated and deprotonated forms. Further embodiments include the use of non-T amphiphiles as disclosed in the above-mentioned patent publications, including their protonated, partially protonated and deprotonated forms. Most preferably, the cationic amphiphile that can be used to deliver the vectors and plasmids of the present invention is an N 4 -spermine cholesteryl carbamate (GL-67) of formula (I): : One of N 4 -spermidine cholesteryl carbamate (GL-53) represented by:
【００５０】 本発明で使用されるアデノウイルスベクターおよびプラスミドを含む組成物の
形成において、ベクターの細胞へのデリバリーを容易にするために、１以上のジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような陽イオン性両
親媒性物質を中性補脂質と一緒に処方してもよい。これらの複合体中で使用され
うる他の補脂質は、限定するものではないが、ジフィタノイルホスファチジルエ
タノールアミン、リゾ−ホスファチジルエタノールアミン、他のホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジルコリン、リゾ−ホスファチジルコリンおよび
コレステロールを包含する。陽イオン性両親媒性物質の補脂質に対する好ましい
モル比は１：１である。しかしながら、かなりの範囲を包含して該比率を変化さ
せることも本発明の範囲内である。本発明の特に好ましい具体列において、細胞
へデリバリーするためのアデノウイルスベクターと複合体を形成する前に、式（
Ｉ）： で示される陽イオン性両親媒性物質Ｎ4−スペルミンコレステロールカルバメー ト（ＧＬ−６７）および中性の補脂質ＤＯＰＥを各々、１：２のモル比で配合す
る。In forming a composition comprising the adenoviral vector and plasmid used in the present invention, one or more dioleoylphosphatidylethanolamines (DOPE), such as dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), may be used to facilitate delivery of the vector to cells. Cationic amphiphiles may be formulated with neutral co-lipids. Other co-lipids that can be used in these complexes include, but are not limited to, diphytanoyl phosphatidylethanolamine, lyso-phosphatidylethanolamine, other phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, lyso-phosphatidylcholine, and cholesterol. I do. The preferred molar ratio of cationic amphiphile to co-lipid is 1: 1. However, it is within the scope of the present invention to vary the ratio to encompass a significant range. In a particularly preferred embodiment of the invention, prior to forming a complex with an adenovirus vector for delivery to cells, the formula (
I): The cationic amphiphile N 4 -spermine cholesterol carbamate (GL-67) and the neutral co-lipid DOPE represented by are each mixed in a molar ratio of 1: 2.
【００５１】 陽イオン性両親媒性物質を本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを含
むアデノウイルスベクターと一緒に含有する複合体の形成において、好ましい範
囲の１０7−１０10感染単位のウイルスをウイルス粒子あたり１０4−１０6範囲 の陽イオン性両親媒性分子と配合してもよい。陽イオン性両親媒性物質とプラス
ミドを含有する複合体の形成において、好ましい範囲０．４ｍＭ−１ｍＭの陽イ
オン性両親媒性物質を３ｍＭ−８ｍＭ範囲のプラスミドと配合して複合体を形成
させてもよい。In forming a complex containing a cationic amphiphile together with an adenovirus vector containing a CMV-derived promoter element of the present invention, a preferred range of 10 7 -10 10 infectious units of virus is reduced to virus particles per 10 4 -10 6 range it may be blended with the cationic amphiphilic molecules. In forming a complex containing a cationic amphiphile and a plasmid, a preferred range of 0.4 mM-1 mM cationic amphiphile is combined with a 3 mM-8 mM range of plasmid to form a complex. Is also good.
【００５２】 本発明のＣＭＶ由来のプロモーターエレメントを含有するアデノウイルスベク
ター由来の感染効率は、標準的技法によってアッセイできる。かかる方法は、限
定するものではないが、プラーク形成、例えば、アデノウイルスヘキソンタンパ
ク質に対する抗体を用いるエンドポイント希釈、および放射能標識化ウイルスを
用いる細胞結合アッセイを包含する。改善された感染効率は、対照ウイルスに関
して、少なくとも１オーダーの規模の感染の増加として特徴付けることができる
。The efficiency of infection from an adenovirus vector containing a CMV-derived promoter element of the invention can be assayed by standard techniques. Such methods include, but are not limited to, plaque formation, eg, endpoint dilution using antibodies to adenovirus hexon protein, and cell binding assays using radiolabeled virus. Improved infection efficiency can be characterized as an increase in infection of at least one order of magnitude relative to the control virus.
【００５３】 標的細胞の感染後の本発明のプロモーターエレメントを含むアデノウイルスベ
クター由来のトランスジーンの持続性発現またはトランスフェクション、エレク
トロポレーションまたは標的細胞へプラスミドを移入する他の方法後の本発明の
プロモーターエレメントを含むプラスミド由来の持続性発現は、標準的技法によ
ってアッセイできる。本発明のプロモーターエレメントを含むアデノウイルスベ
クターまたはプラスミドがマーカーまたは他のトランスジーンをコードする場合
、発現を決定するための適切な分子アッセイは、例えば、限定するものではない
が、ノーザンブロット、Ｓ１分析または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）によるトランスジーンｍＲＮＡの測定を包含する。トランスジーンによっ
てコードされるタンパク質の存在は、ウェスタンブロット、免疫沈澱、免疫細胞
化学または当業者に既知の他の技法によって検出してもよい。β−ガラクトシダ
ーゼをコードしているアデノウイルスベクターで感染された細胞のＸ−ｇａｌ染
色のようなマーカー特異的アッセイもまた使用できる。[0053] Sustained expression or transfection of a transgene derived from an adenovirus vector containing a promoter element of the invention following infection of the target cell, electroporation or other methods of transferring the plasmid to the target cell. Sustained expression from a plasmid containing a promoter element can be assayed by standard techniques. If the adenoviral vector or plasmid containing the promoter element of the present invention encodes a marker or other transgene, suitable molecular assays to determine expression include, but are not limited to, Northern blot, S1 analysis Or reverse transcription polymerase chain reaction (RT-P
CR) to measure transgene mRNA. The presence of the protein encoded by the transgene may be detected by Western blot, immunoprecipitation, immunocytochemistry or other techniques known to those skilled in the art. Marker specific assays such as X-gal staining of cells infected with an adenovirus vector encoding β-galactosidase can also be used.
【００５４】 本発明のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトランスジーンを含
むアデノウイルスベクター由来のトランスジーン発現の持続性を決定するために
組織培養において使用できる好ましい標的細胞は、限定するものではないが、肝
細胞、気道上皮細胞、筋細胞および内皮細胞などの初代細胞を包含する。本発明
のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトランスジーンを含有するプ
ラスミド由来のトランスジーン発現の持続性を決定するための好ましい標的細胞
は、ＨｅＬａまたはＣＯＳ細胞または初代細胞のような確立された細胞系統を包
含する。本発明のプロモーターエレメントに作動可能に連結されたトランスジー
ンを含むプラスミドでトランスフェクトされるかまたは本発明のプロモーターエ
レメントに作動可能に連結されたトランスジーンを含むウイルスで感染されうる
いずれかの細胞または細胞系統は、かかるトランスジーンの発現レベルおよび発
現持続を測定するアッセイに適当である。本発明のプロモーターエレメントに作
動可能に連結されたトランスジーンを含むアデノウイルスベクターまたはプラス
ミドからのトランスジーンの、例えば、動物および／またはヒト肝細胞における
持続性発現を示すことにより、かかるプラスミドまたはウイルスが動物またはヒ
トの肝臓においてトランスジーンの持続性発現を達成できる能力を有することを
予測できる。Preferred target cells that can be used in tissue culture to determine the persistence of transgene expression from an adenovirus vector that includes a transgene operably linked to a promoter element of the present invention are not limited. Include primary cells such as hepatocytes, airway epithelial cells, muscle cells and endothelial cells. Preferred target cells for determining the persistence of transgene expression from a plasmid containing a transgene operably linked to a promoter element of the invention are HeLa or established cells such as COS cells or primary cells. Strains. Any cell transfected with a plasmid comprising a transgene operably linked to a promoter element of the invention or capable of being infected with a virus comprising a transgene operably linked to a promoter element of the invention or Cell lines are suitable for assays that measure the level and duration of expression of such transgenes. By exhibiting sustained expression of a transgene from an adenovirus vector or plasmid comprising a transgene operably linked to a promoter element of the invention, for example, in animal and / or human hepatocytes, One can expect to have the ability to achieve sustained expression of the transgene in animal or human liver.
【００５５】 本発明の構築物および組成物を用いるイン・ビボでのトランスジーン発現の持
続性および感染効率を決定するために、動物モデルは、潜在的な宿主免疫応答の
背景に対するトランスジーン発現持続性を評価するために特に適切である。かか
るモデルは、デリバリーの容易さ、トランスジーンの個性、適切な分子アッセイ
および臨床状態の評価のような特定のパラメーターに関して選択されうる。トラ
ンスジーンがその不在または突然変異が特定の病態に関連するタンパク質をコー
ドする場合、病態を代表する動物モデルを用いて、特定の表現型結果およびトラ
ンスジーンの持続性発現による臨床上の改善を評価してもよい。To determine the persistence of transgene expression in vivo and the efficiency of infection using the constructs and compositions of the present invention, animal models may be used to determine the persistence of transgene expression against a background of potential host immune response. Especially suitable for assessing Such models can be selected for particular parameters such as ease of delivery, transgene identity, appropriate molecular assays and assessment of clinical status. If the transgene encodes a protein whose absence or mutation is associated with a particular condition, use animal models representative of the condition to assess the specific phenotypic consequences and clinical improvement due to the sustained expression of the transgene May be.
【００５６】 例えば、ノックアウトマウス（例えば、Ｆａｂｒｙノックアウトマウス（Ohsh
imaら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2540-2544）およびＣＦＴＲノ ックアウトマウス（Zeiher, B.G.ら、1995, J. Clin. Invest. 98: 2051-2064）
を、少なくともＣＭＶ由来のプロモーターエレメントおよびトランスジーンを含
む本発明の発現カセットを含むベクターで感染させるかまたはトランスフェクト
してもよい。かかるノックアウトマウスを用いて、目的とするトランスジーンの
生物学的活性および持続性発現を評価してもよい。特に、限定するものではない
が、少なくともＣＭＶ由来のプロモーターエレメントおよびトランスジーンとし
てα−ガラクトシダーゼを含む本発明の発現カセットをＦａｂｒｙノックアウト
マウスに投与して、該遺伝子の持続性トランスジーン発現、発現したトランスジ
ーンの生物学的活性およびノックアウトマウスの臨床上の改善を評価してもよい
（１９９８年１０月２９日に出願された米国特許出願第０９／１８２，２４５号
および１９９８年１０月２９日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２
８８６号を参照（出典明示により本明細書の一部とする））。同様に、少なくと
もＣＭＶ由来のプロモーターエレメントおよびトランスジーンとしてＣＦＴＲを
含む本発明の発現カセットをＣＦＴＲノックアウトマウスに投与して、持続性ト
ランスジーン発現、発現したトランスジーンの生物学的活性およびノックアウト
マウスの臨床上の改善を評価してもよい（Scaria, A.ら、1998, Journal of Vir
ology 72: 7302-7309、１９９７年４月１４日に出願された米国特許出願第０８ ／８３９，５５３号およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／４６７８０号参照（出典明示に
より本明細書の一部とする））。For example, a knockout mouse (eg, a Fabry knockout mouse (Ohsh
Natl. Acad. Sci. USA 94: 2540-2544) and CFTR knockout mice (Zeiher, BG et al., 1995, J. Clin. Invest. 98: 2051-2064).
May be infected or transfected with a vector comprising an expression cassette of the invention comprising at least a CMV-derived promoter element and a transgene. Such knockout mice may be used to evaluate the biological activity and sustained expression of the transgene of interest. In particular, but not limited to, the expression cassette of the present invention containing at least a CMV-derived promoter element and α-galactosidase as a transgene is administered to a Fabry knockout mouse to produce a sustained transgene expression of the gene and a transgene expressed. Gene biological activity and clinical improvement of knockout mice may be assessed (US patent application Ser. No. 09 / 182,245, filed Oct. 29, 1998 and filed Oct. 29, 1998). PCT Application PCT / US98 / 22
No. 886 (herein incorporated by reference). Similarly, expression cassettes of the present invention comprising at least a CMV-derived promoter element and CFTR as a transgene are administered to CFTR knockout mice to achieve sustained transgene expression, biological activity of the expressed transgene, and clinical use of the knockout mouse. The above improvement may be assessed (Scaria, A. et al., 1998, Journal of Vir
ology 72: 7302-7309, US patent application Ser. No. 08 / 839,553, filed Apr. 14, 1997, and PCT Publication WO 98/46780, which are hereby incorporated by reference.
【００５７】 また、特定のアデノウイルスベクターが、例えば、初代培養細胞、組織外植体
または永久細胞系統を用いるヒトモデル系においてのみ高い感染効率を示す可能
性がある。ヒト細胞に関して、アデノウイルスベクターの感染効率のモデルを作
るための動物モデル系を入手できないような環境において、当該分野で認められ
たヒト培養細胞モデルを参考にすることが適切であり、信頼できる。Also, certain adenovirus vectors may exhibit high infection efficiencies only in human model systems using, for example, primary cells, tissue explants or permanent cell lines. Regarding human cells, it is appropriate and reliable to refer to an art-recognized human cultured cell model in an environment where an animal model system for creating a model of the infection efficiency of an adenovirus vector is not available.
【００５８】 アデノウイルスベクターまたはプラスミドがアッセイされうる適切な動物は、
限定するものではないが、マウス、ラット、サルおよびウサギを包含する。ベク
ターが試験されうる適当なマウス系統は、限定するものではないが、Ｃ３Ｈ、Ｃ
５７ＢＬ／６（野生型およびヌード）およびＢａｌｂ／ｃ（Taconic Farms, Ger
mantown, New Yorkから入手可能である）を包含する。A suitable animal in which an adenovirus vector or plasmid can be assayed is
Including but not limited to mice, rats, monkeys and rabbits. Suitable mouse strains on which the vector can be tested include, but are not limited to, C3H, C3H
57BL / 6 (wild type and nude) and Balb / c (Taconic Farms, Ger
available from mantown, New York).
【００５９】 ベクターまたはプラスミド投与に対する宿主免疫応答を評価することが望まし
い場合、免疫適格および免疫欠損動物における試験を比較して、免疫系によって
生じる特定の不利な応答を定義付けてもよい。免疫欠損動物、例えば、ヌードマ
ウスの使用は、もたらされる宿主応答とは無関係に、ベクターまたはプラスミド
の働きおよびトランスジーン発現の持続性を特徴付けるために用いてもよい。If it is desirable to assess the host immune response to vector or plasmid administration, tests in immunocompetent and immunodeficient animals may be compared to define the particular adverse response generated by the immune system. The use of immunodeficient animals, such as nude mice, may be used to characterize the function of the vector or plasmid and the persistence of transgene expression, independent of the host response elicited.
【００６０】 トランスジーンが嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）をコードす
る遺伝子であって、試験動物の呼吸器上皮に投与される特定の具体例において、
ＣＦＴＲの発現は、適切な動物モデル、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６またはＢａｌｂ
／ｃマウス、コトンラットまたはアカゲザルの肺においてアッセイしてもよい。In certain embodiments, the transgene is a gene encoding a cystic fibrosis transmembrane regulatory protein (CFTR), which is administered to the respiratory epithelium of a test animal,
Expression of CFTR is determined in a suitable animal model, for example, C57BL / 6 or Balb.
/ C mice, cotton rats or rhesus monkey lung.
【００６１】 発現を決定するために用いてもよい分子マーカーは、例えば、ノーザンブロッ
ト、Ｓ１分析またはＲＴ−ＰＣＲによるＣＦＴＲ ｍＲＮＡの測定を包含する。 ＣＦＴＲタンパク質の存在は、ウェスタンブロット、免疫沈澱、免疫細胞化学ま
たは当業者に既知の他の方法によって検出されうる。また、機能的ＣＦＴＲ分子
の存在を示す機能的塩素イオンチャネルの存在を決定するために、機能的ＣＦＴ
Ｒタンパク質を欠損している細胞がアデノウイルスベクターによって感染された
組織培養体において、かかるアッセイを用いてもよい。例えば、Zabnerら、J. C
lin. Invest. 97: 1504-1511 (1996)を参照のこと。[0061] Molecular markers that may be used to determine expression include, for example, measurement of CFTR mRNA by Northern blot, S1 analysis or RT-PCR. The presence of the CFTR protein can be detected by Western blot, immunoprecipitation, immunocytochemistry or other methods known to those skilled in the art. Also, to determine the presence of a functional chloride channel indicating the presence of a functional CFTR molecule, a functional CFT
Such an assay may be used in a tissue culture in which cells lacking the R protein have been infected with an adenovirus vector. For example, Zabner et al., J. C.
lin. Invest. 97: 1504-1511 (1996).
【００６２】 本発明のプロモーターエレメントを含むアデノウイルスベクターおよびプラス
ミドは、多くのイン・ビボおよびイン・ビトロでの有用性を有する。ベクターお
よびプラスミドを用いて、欠損または機能不全タンパク質を補修するために、生
物学的に活性なタンパク質をコードしているトランスジーンの正常なコピーを標
的細胞に移入することができる。ベクターおよびプラスミドを用いて、対応する
内在性遺伝子のレベルから形質導入したトランスジーンの発現レベルを区別する
ことを可能にする標識化トランスジーン（例えば、ヌクレオチド改変を含有する
）を移入することができる。また、アデノウイルスベクターを用いて、特定のウ
イルス表面タンパク質配列によって媒介される特定のウイルス性タンパク質−細
胞性タンパク質相互作用を定義付けることができる。また、アデノウイルスベク
ターを用いて、アデノウイルスベクターによる、例えば、限定するものではない
が、ヒト鼻ポリープ細胞を感染させるためのＡｄ１７繊維タンパク質を含有する
キメラアデノウイルスベクターを用いて、特定の標的細胞の感染効率を最適化す
ることができる（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／２２６０９号（出典明示により
本明細書の一部とする）。個体の癌細胞にトランスジーンを移入するためにアデ
ノウイルスベクターを使用することが望ましい場合、特定型の標的癌細胞を選択
的に感染させ、無差別感染を回避するアデノウイルスベクターを選択することが
できる。トランスジーン移入を必要とする個体の腫瘍から初代細胞を単離する場
合、細胞をアデノウイルスベクターおよびプラスミドのパネルに対して試験して
、トランスジーンデリバリーに最適な感染効率を有するベクターまたはプラスミ
ドを選択する。さらに、ベクターを用いて、腫瘍抗原をコードしているトランス
ジーンを樹状細胞に移入することができ、次いで、個体にデリバリーして抗腫瘍
免疫応答を顕在化できる。また、アデノウイルスベクターを用いて、アデノウイ
ルスベクターの遺伝子移入容量を損なう特定のアデノウイルス血清型に対する望
ましくない免疫応答を回避できる。Adenoviral vectors and plasmids containing the promoter elements of the present invention have many in vivo and in vitro utilities. Vectors and plasmids can be used to transfer a normal copy of a transgene encoding a biologically active protein into target cells to repair defective or dysfunctional proteins. Vectors and plasmids can be used to transfer a labeled transgene (eg, containing a nucleotide modification) that allows one to distinguish the level of expression of the transduced transgene from the level of the corresponding endogenous gene. . In addition, adenovirus vectors can be used to define specific viral protein-cellular protein interactions mediated by specific viral surface protein sequences. Also, using an adenovirus vector, a specific target cell, such as, but not limited to, a chimeric adenovirus vector containing an Ad17 fiber protein for infecting human nasal polyp cells. (Eg, PCT Publication WO 98/22609, which is hereby incorporated by reference). Use of adenovirus vectors to transfer transgenes into cancer cells of an individual If desired, adenoviral vectors can be selected that selectively infect a particular type of target cancer cells and avoid random transmission.Primary cells can be isolated from tumors of individuals in need of transgene transfer. If detached, try the cells against a panel of adenovirus vectors and plasmids. To select a vector or plasmid that has the optimal infection efficiency for transgene delivery, and that the vector can be used to transfer a transgene encoding a tumor antigen into dendritic cells, And adenoviral vectors can be used to elicit an anti-tumor immune response, and adenoviral vectors can be used to avoid unwanted immune responses to certain adenoviral serotypes that impair the gene transfer capacity of the adenoviral vector.
【００６３】 本発明は、さらに、本発明のプロモーターエレメントを含むアデノウイルスベ
クターおよびプラスミドを含む組成物であって、かかる分子を必要とする個体の
細胞に１以上の所望のトランスジーンをデリバリーし、生物学上活性なタンパク
質をコードしているトランスジーンの発現を引き起こして、特定の表現型結果に
達するかまたは生物学上活性なタンパク質を生産するのに十分な量で、細胞また
は組織に投与できる組成物に向けられている。陽イオン性両親媒性物質−プラス
ミド複合体または陽イオン性両親媒性物質−ウイルス複合体は、同様に、トラン
スジーンのデリバリーが必要な個体に投与するための組成物に処方されうる。The present invention further provides a composition comprising an adenoviral vector and a plasmid comprising the promoter element of the present invention, wherein the composition comprises delivering one or more desired transgenes to cells of an individual in need of such a molecule; Can be administered to a cell or tissue in an amount sufficient to cause expression of a transgene encoding a biologically active protein to achieve a particular phenotypic result or to produce the biologically active protein Directed to the composition. The cationic amphiphile-plasmid conjugate or cationic amphiphile-virus conjugate can also be formulated into a composition for administration to an individual in need of transgene delivery.
【００６４】 組成物は、いずれかの適切な溶媒を包含する生理学上許容される担体を含むこ
とができる。本明細書で使用する場合、限定するものではないが、「生理学上許
容される担体」なる語は、いずれかのおよび全ての溶媒、分散培地、コーティン
グ剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含する。いずれか
の通常の培地または薬剤が活性成分と配合禁忌である場合を除き、組成物におけ
るその使用が意図される。The composition can include a physiologically acceptable carrier, including any suitable solvents. As used herein, and without limitation, the term "physiologically acceptable carrier" refers to any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic And an absorption delaying agent. Except insofar as any conventional media or agent is contraindicated with the active ingredient, its use in the composition is contemplated.
【００６５】 本発明のアデノウイルスベクターまたはプラスミドを含む組成物の投与経路は
、通常の生理学上許容される経路、例えば、限定するものではないが、標的器官
または組織への直接的デリバリー、鼻腔内、静脈内、筋内、皮下、皮内、経口お
よび他の非経口的投与経路を包含する。The route of administration of the composition comprising the adenovirus vector or plasmid of the present invention will be by any of the usual physiologically acceptable routes, including, but not limited to, direct delivery to a target organ or tissue, intranasal And intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral and other parenteral routes of administration.
【００６６】 本発明は、さらに、１以上のトランスジーンを細胞中にデリバリーすることに
より、トランスジーンが正常な生物学的または表現型効果に関して生物学上活性
なタンパク質を生産することが望まれるイン・ビボまたはエクス・ビボ応用に本
発明の組成物を用いる方法に向けられている。イン・ビボでの応用は、組成物に
処方され、個体の細胞にデリバリーされる１以上のアデノウイルスベクターまた
はプラスミドの直接的投与を含む。エクス・ビボでの応用は、イン・ビトロで維
持される自己細胞へベクターまたはプラスミドを含む組成物を直接移入し、次い
で、形質導入された細胞をレシピエントに再投与することを含む。The present invention further provides for the delivery of one or more transgenes into cells so that the transgene produces a protein that is biologically active with respect to normal biological or phenotypic effects. -It is directed to methods of using the compositions of the present invention for ex vivo or ex vivo applications. In vivo applications include direct administration of one or more adenoviral vectors or plasmids formulated into the composition and delivered to the cells of the individual. Ex vivo applications include transferring the composition containing the vector or plasmid directly to autologous cells maintained in vitro, and then re-administering the transduced cells to the recipient.
【００６７】 生物学上活性なタンパク質をコードしているトランスジーンの発現のために個
体に投与し、特定の表現型結果を達成すべきアデノウイルスベクターまたはプラ
スミドの投与量は、治療すべき状態、個体の年齢、体重および生物学的または臨
床状況、および生物学上活性なタンパク質の供給を必要とする特定の分子欠損を
包含する種々のパラメーターに関して、決定される。投与量は、好ましくは、分
子アッセイまたは臨床マーカーによって測定するとき、投与が特定の表現型結果
を引き起こすように選択される。例えば、個体に投与されるＣＦＴＲトランスジ
ーンを含有するアデノウイルスベクターまたはプラスミドの感染効率の決定は、
例えば、ノーザンブロット、Ｓ１またはＲＴ−ＰＣＲ分析によるＣＦＴＲ ｍＲ ＮＡの測定またはウェスタンブロットによって検出されるＣＦＴＲタンパク質の
測定、免疫沈澱、免疫細胞化学、または当業者に既知の他の技法を包含する分子
アッセイによって行うことができる。ＣＦＴＲトランスジーンのデリバリーの表
現型結果を評価するために使用できる適切な臨床研究は、限定するものではない
が、肺機能のＰＦＴ評価および肺の放射線学的評価を包含する。ＣＦＴＲをコー
ドするトランスジーンの生産的デリバリーは、また、トランスジーンを含むベク
ターを投与された嚢胞性繊維症を有する個体の細胞中の機能的塩化物チャネルの
存在を検出することによって立証されうる（Zabnerら、1996, J. Clin. Invest.
97: 1504-1511およびScaria, A.ら、1998, Journal of Virology 72: 7302-730
9）。トランスジーン発現およびトランスジーン発現に付随する表現型改変は、 病態に最も適切な特定の生物学的パラメーターを用いて、同様にアッセイするこ
とができる。The dosage of an adenovirus vector or plasmid administered to an individual for expression of a transgene encoding a biologically active protein to achieve a particular phenotypic result depends on the condition to be treated, It is determined with respect to various parameters including the age, weight and biological or clinical status of the individual, and certain molecular deficiencies that require the supply of biologically active proteins. The dose is preferably selected such that the dose causes a particular phenotypic result as measured by molecular assays or clinical markers. For example, determining the efficiency of infection of an adenovirus vector or plasmid containing a CFTR transgene administered to an individual comprises:
For example, molecular assays involving Northern blot, measurement of CFTR mRNA by S1 or RT-PCR analysis or measurement of CFTR protein detected by Western blot, immunoprecipitation, immunocytochemistry, or other techniques known to those skilled in the art. Can be done by Suitable clinical studies that can be used to assess the phenotypic consequences of delivery of the CFTR transgene include, but are not limited to, PFT assessment of lung function and radiological assessment of the lung. Productive delivery of a transgene encoding CFTR can also be demonstrated by detecting the presence of a functional chloride channel in cells of an individual with cystic fibrosis that has been administered a vector containing the transgene ( Zabner et al., 1996, J. Clin. Invest.
97: 1504-1511 and Scaria, A. et al., 1998, Journal of Virology 72: 7302-730
9). Transgene expression and phenotypic alterations associated with transgene expression can be similarly assayed using the specific biological parameters most appropriate for the condition.
【００６８】 生物学上活性なタンパク質をコードしているトランスジーンの発現を提供し、
特定の表現型結果を達成するのに十分な本発明のプロモーターエレメントを含む
アデノウイルスベクターの投与量は、ヒトの場合、約１０8〜１０11感染単位（ Ｉ．Ｕ．）の範囲である。Providing expression of a transgene encoding a biologically active protein,
Dosages of an adenoviral vector containing a promoter element of the invention sufficient to achieve a particular phenotypic result range from about 10 8 to 10 11 infectious units (IU) for humans.
【００６９】 特に、投与の容易さおよび投与量の均一性のための投与単位形で非経口組成物
を処方することが有利である。本明細書で使用する場合、投与単位形なる語は、
治療すべき対象のための単一投与量として適応される物理的に別個の単位をいい
、各単位は、特定の表現型結果を生じるように計算された予め決定した量の活性
成分を必要な生理学上許容される担体と共に含有する。本発明の新規な投与単位
形に関する詳細は、アデノウイルスベクターまたはプラスミドの独特の特徴およ
び配合の分野固有の制限に従い、かつ直接依存する。主要活性成分（アデノウイ
ルスベクターまたはプラスミド）を通常の有効な投与のために、上記の投与単位
形において生理学上許容される担体と一緒に有効量で配合する。In particular, it is advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. As used herein, the term dosage unit form is:
Refers to physically discrete units adapted as a single dose for the subject to be treated, each unit requiring a predetermined amount of the active ingredient calculated to produce a particular phenotypic result. It is contained together with a physiologically acceptable carrier. The details regarding the novel dosage unit forms of the present invention are dependent on and directly depend on the unique characteristics of the adenovirus vector or plasmid and the field-specific limitations of the formulation. The principal active ingredient (adenoviral vector or plasmid) is formulated in a dosage unit form as described above, together with a physiologically acceptable carrier, in an effective amount for effective administration.
【００７０】 本発明のアデノウイルスベクターおよびプラスミドの投与による最大の利益お
よび特定表現型結果の達成は、反復投与を必要としうる。かかる反復投与は、同
一のアデノウイルスベクターまたはプラスミドの使用を含んでもよく、または別
法では、ウイルス性抗原発現を変化させ、宿主免疫応答を減少させるために異な
るアデノウイルスベクターをローテーションさせて使用することを含んでもよい
。[0070] Maximal benefit and the achievement of a particular phenotypic result by administration of the adenoviral vectors and plasmids of the present invention may require repeated administration. Such repeated administrations may involve the use of the same adenovirus vector or plasmid, or alternatively, use different adenovirus vectors in rotation to alter viral antigen expression and reduce host immune response. May be included.
【００７１】 本発明の実施は、別記しないかぎり、当該分野の技術範囲内であるタンパク質
化学、分子ウイルス学、微生物学、組換えＤＮＡ技術および製薬学の通常の技法
を用いる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、J
ohn Wiley & Sons, Inc., New York, 1995およびRemington's Pharmaceutical S
ciences, 第１７版、Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985を参照のこと。 本発明は、さらに、以下の特定の実施例によって説明されるが、それらは、い
かなる方法においても、本発明の範囲を制限しようとするものではない。The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of protein chemistry, molecular virology, microbiology, recombinant DNA technology and pharmacy, which are within the skill of the art. For example, Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., J.
ohn Wiley & Sons, Inc., New York, 1995 and Remington's Pharmaceutical S
See Sciences, 17th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985. The present invention is further described by the following specific examples, which are not intended to limit the scope of the invention in any way.
【００７２】 実施例１： ラット肝細胞におけるトランスジーン発現に対するＣＭＶ由来のプロモーター エレメントの効果 ΔＣＭＶβｇａｌ−１は、Ａｄ２／βｇａｌ−５を基礎とし（完全なＥ４欠失
、Armentanoら、1997, J. Virol. 71: 2408-2416, 1997）、ヌクレオチド配列−
２９５〜−１４（図２参照；配列番号２）を含有する末端切断型ＣＭＶプロモー
ターであるプロモーターエレメントを含有する。プレ−ウイルスプラスミド、ｐ
ＡｄＣＭＶβｇａｌ（Armentanoら、1997, J. Virol. 71: 2408-2416, 1997）を
制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩおよびＳｎａＢＩで切断し、ＳｎａＢＩ部位（
−２４２）の上流のＣＭＶプロモーターの全配列を除去した。除去された配列を
ＣｌａＩ−ＳｎａＢＩオリゴヌクレオチドアダプター（ＣＭＶプロモーター配列
−２９５〜−２４２を含有する；図４、配列番号４参照）で置き換えて、−２９
５位置までプロモーター配列を伸長した。得られたプラスミド、ｐＡｄΔＣＭＶ
βｇａｌ−１をＢｓｔＢＩで切断し、ＶＫ２−２０細胞中でＰｓｈＡＩ消化した
Ａｄ２／βｇａｌ−５ ＤＮＡと組み換えて、ΔＣＭＶβｇａｌを作製した。 Example 1 Effect of CMV-Derived Promoter Element on Transgene Expression in Rat Hepatocytes ΔCMVβgal-1 is based on Ad2 / βgal-5 (complete E4 deletion, Armentano et al., 1997, J. Virol. 71: 2408-2416, 1997), nucleotide sequence-
It contains a promoter element which is a truncated CMV promoter containing 295 to -14 (see FIG. 2; SEQ ID NO: 2). Pre-virus plasmid, p
AdCMVβgal (Armentano et al., 1997, J. Virol. 71: 2408-2416, 1997) was cut with the restriction endonucleases ClaI and SnaBI and the SnaBI site (
The entire sequence of the CMV promoter upstream of -242) was removed. The removed sequence was replaced with a ClaI-SnaBI oligonucleotide adapter (containing the CMV promoter sequence -295-242; see FIG. 4, SEQ ID NO: 4) to give -29
The promoter sequence was extended to 5 positions. The resulting plasmid, pAdΔCMV
βgal-1 was cut with BstBI, and recombined with PshAI-digested Ad2 / βgal-5 DNA in VK2-20 cells to generate ΔCMVβgal.
【００７３】 ラット肝細胞をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから０．０５％コラゲナ
ーゼで灌流することによって単離し、Ｈｅｐａｔｏ−Ｓｔｉｍ培地（Beckton-Di
ckison）で数回洗浄し、肝細胞分化環境（hepatocyte differentiation environ
ment）（Becton-Dickinson）中で培養した。次の日に、肝細胞を感染多重度５０
でＡｄ２／βｇａｌ−４、Ａｄ２／βｇａｌ−２またはΔＣＭＶβｇａｌ−１に
感染させた。実験過程を通して、培地を１日おきに交換した。所定の時点で、培
養体をディスパーゼで処理して、細胞を細胞外マトリックスから除去した。図７
参照のこと。細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、再びペレット化し、溶菌バ
ッファー中に再懸濁した。上清をガラクトライト（Galactolight）アッセイによ
ってβ−ガラクトシダーゼ活性について分析し、タンパク質をＢＣＡにより決定
した。図７に示されるように、Ａｄ２／βｇａｌ−２由来の発現は、Ａｄ２／β
ｇａｌ−４と比べて減少し、持続性ではない。ΔＣＭＶβｇａｌ−１由来の発現
は、Ａｄ２／βｇａｌ−４と比べて減少せず、また、持続性のようである。ΔＣ
ＭＶβｇａｌ−１ベクターはＥ４欠失しているので、該結果は、ΔＣＭＶプロモ
ーター由来のβ−ｇａｌ発現がＥ４を必要としないことを示す。Rat hepatocytes were isolated from Sprague-Dawley rats by perfusion with 0.05% collagenase, and purified from Hepato-Stim medium (Beckton-Dime
ckison) and washed several times with hepatocyte differentiation environ
ment) (Becton-Dickinson). The next day, hepatocytes were multiplied by 50
Infected with Ad2 / βgal-4, Ad2 / βgal-2 or ΔCMVβgal-1. The medium was changed every other day throughout the course of the experiment. At predetermined time points, cultures were treated with dispase to remove cells from the extracellular matrix. FIG.
See also. Cells were pelleted, washed with PBS, pelleted again, and resuspended in lysis buffer. Supernatants were analyzed for β-galactosidase activity by Galactolight assay and protein was determined by BCA. As shown in FIG. 7, the expression derived from Ad2 / βgal-2 was Ad2 / βgal-2.
It is reduced compared to gal-4 and is not persistent. Expression from ΔCMVβgal-1 is not reduced compared to Ad2 / βgal-4 and appears to be persistent. ΔC
Since the MVβgal-1 vector is E4 deleted, the results indicate that β-gal expression from the ΔCMV promoter does not require E4.
【００７４】 実施例２ ヒト肝細胞におけるトランスジーン発現に対するＣＭＶ由来のプロモーターエ レメントの効果 ヒト肝細胞はCloneticsから入手し、肝細胞維持培地（Clonetics）中で維持し
た。培養体を感染多重度５０でＡｄ２／βｇａｌ−４、Ａｄ２／βｇａｌ−２ま
たはΔＣＭＶβｇａｌ−１単独に感染させるか、または運搬中にＥ４機能を供給
できるベクターであるＡｄ２／ＣＭＶＡＡＴと一緒に共同感染させた。細胞を所
定の時点（図８）にてディスパーゼとのインキュベーションによって採集し、実
施例１のように、β−ガラクトシダーゼ活性について分析した。[0074] Effect Human hepatocytes promoter et Remento from CMV for transgene expression in Example 2 Human liver cells were obtained from Clonetics, it was maintained in hepatocytes maintenance media (Clonetics). Cultures are infected at a multiplicity of infection of 50 with Ad2 / βgal-4, Ad2 / βgal-2 or ΔCMVβgal-1 alone, or co-infected with Ad2 / CMVAAT, a vector capable of providing E4 function during transit. Was. Cells were harvested at predetermined time points (FIG. 8) by incubation with dispase and analyzed for β-galactosidase activity as in Example 1.
【００７５】 図８の結果は、Ａｄ２／βｇａｌ−４由来の発現が１１日目まで持続でき、運
搬中にＥ４機能を供給するウイルスの共同感染によってさらに増加しなかったこ
とを示す。Ａｄ２／βｇａｌ−２由来の発現は、Ａｄ２／βｇａｌ−４から観察
された発現と比べて、３日目および１１日目に減少した。さらに、培養体をＡｄ
２／ＣＭＶＡＡＴと共同感染させた場合、発現が３日目および１１日目に増加し
、Ａｄ２／βｇａｌ−４感染培養体において検出されたレベルに達した。ΔＣＭ
Ｖβｇａｌ−１由来の３日目および１１日目の発現は、Ａｄ２／βｇａｌ−４で
見られたレベルの範囲にあり、Ａｄ２／ＣＭＶＡＡＴとの共同感染によってさら
に増加しなかった。該結果は、ΔＣＭＶプロモーターエレメントが高い発現レベ
ルの維持にＥ４を必要とせず、運搬中にＥ４を供給することによって、もはや影
響されないことを示す。The results in FIG. 8 show that expression from Ad2 / βgal-4 could be sustained up to day 11 and was not further increased by co-infection of the virus supplying E4 function during transit. Expression from Ad2 / βgal-2 was reduced on days 3 and 11 compared to the expression observed from Ad2 / βgal-4. In addition, the culture is
When co-infected with 2 / CMVAAT, expression increased on days 3 and 11, reaching the levels detected in Ad2 / βgal-4 infected cultures. ΔCM
Day 3 and day 11 expression from Vβgal-1 was in the range of levels seen with Ad2 / βgal-4 and was not further increased by co-infection with Ad2 / CMVAAT. The results show that the ΔCMV promoter element does not require E4 to maintain high expression levels and is no longer affected by supplying E4 during transit.
【００７６】 実施例３： Ｂａｌｂ／ｃ肺におけるトランスジーン発現に対するＣＭＶ由来のプロモータ ーエレメントの効果 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスは、３ｘ１０9ｉ．ｕ．のＡｄ２／βｇａｌ−４ま たはΔＣＭＶβｇａｌ−１を鼻腔内に滴下するか、または両方のベクターで同時
感染させた。滴下後３および１４日目にマウスを殺し、肺をガラクトライトアッ
セイによってβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。単一感染および共同
感染の結果は、各々、時点あたりｎ＝２およびｎ＝３を示す。[0076] Example 3: Effect Balb / c nude mice of promoter elements from CMV for transgene expression in Balb / c lung, 3x10 9 i. u. Ad2 / βgal-4 or ΔCMVβgal-1 was instilled intranasally or co-infected with both vectors. Mice were sacrificed 3 and 14 days after instillation and lungs were analyzed for β-galactosidase activity by galactolite assay. Single infection and co-infection results show n = 2 and n = 3 per time point, respectively.
【００７７】 ΔＣＭＶプロモーターエレメントからの発現は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺にお
いて持続し、それは、該プロモーターエレメントがＥ４ ＯＲＦの不在下で長期 のイン・ビボ発現をもたらすことができることを示す。ΔＣＭＶプロモーターエ
レメントは該実験系においてＥ４とは無関係に機能できるが、運搬中にＥ４を供
給できるベクターの共同感染によって、発現は１４日目に約４倍に増加した（図
９）。[0077] Expression from the ΔCMV promoter element persisted in the lungs of Balb / c mice, indicating that the promoter element can provide long-term in vivo expression in the absence of the E4 ORF. Although the ΔCMV promoter element can function independently of E4 in the experimental system, co-infection with a vector that can supply E4 during transit increased expression approximately four-fold on day 14 (FIG. 9).
【００７８】 実施例４ マウスにおけるプラスミド由来のトランスジーン発現に対するＣＭＶ由来のプ ロモーターエレメントの効果 プラスミドｐＣＦ１−２９９／−１９−ＣＡＴは、まず、ｐＣＦ１−ＳＥＡＰ
（分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）およびＰＣＦＡと呼ばれる付加的
な上流のポリリンカーのための遺伝子を含有するｐＣＦ１プラスミド）（Yewら 、Hum Gene Ther. 8: 575-584, 1997）をＰｍｅＩおよびＢｇｌＩで消化し、Ｄ ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで末端を平滑化し、次いで、再連結
することによって構築した。該ベクターをＮｏｔＩで消化してＳＥＡＰを切り出
し、ＣＡＴ ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位に連結してｐＣＦ１−２９９−ＣＡＴを形 成させた。次いで、該ベクターをＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、クレノウで
平滑化し、次いで再連結した。該プラスミドにおけるプロモーターエレメントは
、図３の配列（配列番号３）を含む。[0078] Effect plasmid pCF1-299 / -19-CAT of profile motor elements from CMV for transgene expression from the plasmid in Example 4 mice, first, pCF1-SEAP
(PCF1 plasmid containing a gene for an additional upstream polylinker called secreted alkaline phosphatase (SEAP) and PCFA) (Yew et al., Hum Gene Ther. 8: 575-584, 1997) with PmeI and BglI. It was constructed by digestion, blunting the ends with the Klenow fragment of DNA polymerase I, and then religating. The vector was digested with NotI to excise SEAP, and the CAT cDNA was ligated to the NotI site to form pCF1-299-CAT. The vector was then digested with SacI and XbaI, blunted with Klenow, and then religated. The promoter element in the plasmid contains the sequence of FIG. 3 (SEQ ID NO: 3).
【００７９】 陽イオン性脂質：ＤＯＰＥ：ｐＤＮＡ複合体は、以前の記載のように調製した
（Leeら、Hum. Gene Ther. 7: 1701-1717, 1996; 米国特許第５，６５０，０９ ６号およびＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８３７２号、出典明示により本明細書の一部
とする）。簡単に言えば、等量のリポソームおよびプラスミドＤＮＡを最終濃度
０．６ｍＭ ＧＬ−６７：１．２ｍＭ ＤＯＰＥ：３．６ｍＭ ｐＣＦＡ−２９９ ／−１９−ＣＡＴまで混合し、室温で１５分間静置させた。以前の記載のように
、ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に１００μｌの脂質：ｐＤＮＡ複合体を滴
下した（Leeら、Hum. Gene Ther. 7: 1701-1717, 1996; 米国特許第５，６５０ ，０９６号、ＷＯ９６／１８３７２号）。複合体形成から１５分以内にマウスに
滴下した。滴下後の別の日に、肺を採取し、後の処置のために−８０℃で冷凍し
た。ＣＡＴ活性は、上記の引用文献に記載のようにアッセイした。The cationic lipid: DOPE: pDNA complex was prepared as previously described (Lee et al., Hum. Gene Ther. 7: 1701-1717, 1996; US Pat. No. 5,650,096). And PCT Publication WO 96/18372, incorporated herein by reference.) Briefly, equal amounts of liposomes and plasmid DNA were mixed to a final concentration of 0.6 mM GL-67: 1.2 mM DOPE: 3.6 mM pCFA-299 / -19-CAT and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. . As described previously, 100 μl of the lipid: pDNA complex was instilled intranasally into nude BALB / c mice (Lee et al., Hum. Gene Ther. 7: 1701-1717, 1996; US Pat. No. 5,650, No. 096, WO 96/18372). The mice were instilled within 15 minutes of complex formation. Another day after instillation, lungs were harvested and frozen at -80 ° C for later treatment. CAT activity was assayed as described in the above cited references.
【００８０】 結果は、ｐＣＦ１−２９９／−１９ＣＡＴ由来の発現の初期レベルがｐＣＦ１
−ＣＡＴよりも低いことを示す（滴下後２日目に、ｐＣＦ１−２９９／−１９−
ＣＡＴ由来のＣＡＴ １ｎｇに対してｐＣＦ１−ＣＡＴ由来のＣＡＴ ２６ｎｇ）
。しかしながら、ｐＣＦ１−２９９／−１９−ＣＡＴ由来の発現は、滴下後３５
日目に２日目の発現レベルの約４０％が存在するのに対し、ｐＣＦ１−ＣＡＴ由
来の発現では２日目の発現の１％未満であり、ｐＣＦ１−ＣＡＴよりも持続性で
ある（図１０）。The results show that the initial level of expression from pCF1-299 / −19CAT was pCF1
-CAT (pCF1-299 / −19-
1 ng of CAT derived from CAT and 26 ng of CAT derived from pCF1-CAT)
. However, the expression from pCF1-299 / -19-CAT was 35
Approximately 40% of the expression level on day 2 is present on day 2, whereas expression from pCF1-CAT is less than 1% of expression on day 2 and is more persistent than pCF1-CAT (FIG. 10).
【００８１】 実施例５ ２９３細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞におけるアデノウイルスベクターにより提供 されるトランスジーン発現に対するＣＭＶ−由来のプロモーターエレメントに作 動可能に連結されたヒトアルブミン遺伝子由来のエンハンサーエレメントの効果 プラスミドｐＢｓ１．７−２ＨＩ−ＡＧＡＬ、ｐＢｓ１．７−３ＨＩ−ＡＧＡ
ＬおよびｐＢｓ１．７−５ＨＩ−ＡＧＡＬを以下のように構築した。−１．７ｋ
ｂヒトアルブミン由来のエンハンサーエレメントを含む２本鎖６５ｂｐフラグメ
ント（配列番号７）を２個の相補性オリゴ（Operon, Alameda, CAによって合成 された）を標準的技法によってアニールすることにより作製した。例えば、Curr
ent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.
, New York, 1995を参照のこと。−１．７ｋｂヒトアルブミン由来のエンハンサ
ーエレメントを含むアニールした２本鎖６５ｂｐフラグメントは、ＣｌａＩ制限
部位に連結できる５’突出部を有する。複数コピーをＣｌａＩ制限酵素で消化し
たｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｓｋ＋（Strategene, La Jolla, CA）中に連結し
た。２、３または５コピーを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｓｋ＋ベクタ
ーを単離し、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化した。消化したベクターを野生型
ＣＭＶプロモーター（−２４２〜−１４）（配列番号４）のＳｎａＢＩ−Ｘｂａ
Ｉ消化フラグメント、ハイブリッドイントロン（ｐＡＤβ、Clonetech）、野生 型α−ガラクトシダーゼｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに連結
した。プラスミドｐＢｓ１．７−２ＨＩ−ＡＧＡＬ、ｐＢｓ１．７−３ＨＩ−Ａ
ＧＡＬおよびｐＢｓ１．７−５ＨＩ−ＡＧＡＬは、各々、２、３および５コピー
の６５ｂｐ−１．７ヒトアルブミン由来エンハンサーエレメントを含有する。[0081] Example 5 293 cells and create dynamic promoter element from CMV- for transgene expression provided by the adenoviral vector in Hep3B cells linked to human albumin gene from the effects of an enhancer element plasmid pBs1.7 -2HI-AGAL, pBs1.7-3HI-AGA
L and pBs1.7-5HI-AGAL were constructed as follows. -1.7k
b A double-stranded 65 bp fragment containing the enhancer element from human albumin (SEQ ID NO: 7) was generated by annealing two complementary oligos (synthesized by Operon, Alameda, CA) by standard techniques. For example, Curr
ent Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.
See New York, 1995. The annealed double-stranded 65 bp fragment containing the -1.7 kb human albumin-derived enhancer element has a 5 'overhang that can be ligated to a ClaI restriction site. Multiple copies were ligated into pBluescriptIIsk + (Strategene, La Jolla, CA) digested with ClaI restriction enzyme. The pBluescriptIIsk + vector containing 2, 3 or 5 copies was isolated and digested with EcoRV and XbaI. The digested vector was digested with SnaBI-Xba of the wild-type CMV promoter (-242 to -14) (SEQ ID NO: 4).
I digested fragment, hybrid intron (pADβ, Clonetech), wild type α-galactosidase cDNA and SV40 polyadenylation signal. Plasmids pBs1.7-2HI-AGAL, pBs1.7-3HI-A
GAL and pBs1.7-5HI-AGAL contain 2, 3 and 5 copies of a 65 bp-1.7 human albumin-derived enhancer element, respectively.
【００８２】 ２９３細胞は、Frank Grahamから入手し、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１０ ％牛胎児血清を補足したＤＭＥＭ中で維持した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（肝細胞性細胞
系統；ＡＴＣＣ）は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム を含有するアールのＢＳＳ（平衡塩類溶液）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．
０ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％胎仔牛血清を補足したイーグルの最少
必須培地中で維持した。293 cells were obtained from Frank Graham and maintained in DMEM supplemented with 1 mM L-glutamine and 10% fetal calf serum. Hep3B cells (hepatocyte cell line; ATCC) are Earl's BSS (Balanced Salt Solution) containing 2 mM L-glutamine, 1.5 g / L sodium bicarbonate, 0.1 mM non-essential amino acids, 1.
Maintained in Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum.
【００８３】 細胞系統をＣａＰＯ4沈殿法によって所定のプラスミド（図１１）でトランス フェクトした。Graham, F. L.およびvan der Eb, A.J., 1973, Virology 52: 45
6-467を参照のこと。 トランスフェクション後４８時間後に、細胞を遠心分離により採集し、培地上
清を収集した。培地上清は、（Desnickら、1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157 およびJohnson, D.L.ら、1975, Clin. Chim. Acta. 63: 81）に記載のように、 蛍光基質４−メチルアンベリフェリル（methylumbelliferyl）−α−Ｄ−ガラク
トピラノシド（４−ｍｕ−α−ｇａｌ）を用いてアッセイした。該方法は、α−
ガラクトシダーゼＢに対するインヒビターを包含するように、Mayesら（Clin. C
him. Acta. 112: 247-251 (1981)）による記載のように修飾した。The cell lines were transfected with the given plasmid (FIG. 11) by the CaPO 4 precipitation method. Graham, FL and van der Eb, AJ, 1973, Virology 52: 45
See 6-467. 48 hours after transfection, cells were harvested by centrifugation and medium supernatant was collected. Culture supernatants were prepared as described in (Desnick et al., 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157 and Johnson, DL et al., 1975, Clin. Chim. Acta. 63:81) with the fluorescent substrate 4- Assay was performed using methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-mu-α-gal). The method comprises the steps of:
Mayes et al. (Clin. C.) have included inhibitors for galactosidase B.
him. Acta. 112: 247-251 (1981)).
【００８４】 図１１の結果は、２９３細胞において、α−ガラクトシダーゼ活性における差
が−１．７ｋｂエンハンサーエレメントによって生じないことを示す。−１．７
ｋｂエンハンサーエレメントに連結された末端切断型ＣＭＶプロモーターエレメ
ントを有する構築物の発現レベルは、全長のＣＭＶプロモーターによって得られ
る発現レベルに匹敵する（図１１Ａ）。しかしながら、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において
、末端切断型ＣＭＶプロモーター（−２４２〜−１４）および２、３または５コ
ピーの−１．７ｋｂエンハンサーエレメントを有する構築物は、全て、エンハン
サー領域を欠如している野生型ＣＭＶプロモーターから得られる発現レベルより
も有意に高い発現レベルを与え、５コピーのエンハンサーを含有する構築物由来
の発現が最も高い発現レベルを生じた（図１１Ｂ）。The results in FIG. 11 show that in 293 cells, no difference in α-galactosidase activity is caused by the −1.7 kb enhancer element. -1.7
The expression level of the construct with the truncated CMV promoter element linked to the kb enhancer element is comparable to that obtained with the full length CMV promoter (FIG. 11A). However, in Hep3B cells, constructs with truncated CMV promoter (−242 to −14) and 2, 3 or 5 copies of the −1.7 kb enhancer element are all wild-type CMV promoters lacking the enhancer region. Gave significantly higher expression levels than those obtained from, expression from the construct containing 5 copies of the enhancer resulted in the highest expression level (Figure 11B).
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】 ヌクレオチド−５２３〜−１４を示すＣＭＶ前初期プロモーター
の配列（配列番号１）。FIG. 1: Sequence of the CMV immediate early promoter showing nucleotides -523 to -14 (SEQ ID NO: 1).
【図２】 ヌクレオチド−２９５〜−１４を示す本発明のＣＭＶ由来のプロ
モーターエレメントの配列（配列番号２）。FIG. 2 shows the sequence of the CMV-derived promoter element of the present invention showing nucleotides -295 to -14 (SEQ ID NO: 2).
【図３】 ヌクレオチド−２９９〜−１９を示す本発明のＣＭＶ由来のプロ
モーターエレメントの配列。FIG. 3 shows the sequence of the CMV-derived promoter element of the present invention showing nucleotides -299 to -19.
【図４】 ヌクレオチド−２４２〜−１４を示す本発明のＣＭＶ由来のプロ
モーターエレメントの配列（配列番号４）。FIG. 4 shows the sequence of the CMV-derived promoter element of the present invention showing nucleotides -242 to -14 (SEQ ID NO: 4).
【図５】 ヒトアルブミン遺伝子の転写開始部位から１．７キロ塩基上流に
見られる６５ヌクレオチド配列を示す本発明のヒトアルブミン遺伝子由来のエン
ハンサーエレメントの配列（配列番号４）。FIG. 5 shows the sequence of the enhancer element derived from the human albumin gene of the present invention (SEQ ID NO: 4), which shows a 65 nucleotide sequence found 1.7 kilobases upstream from the transcription start site of the human albumin gene.
【図６】 ＣＭＶプロモーター中の転写レプレッサー結合部位の概略図。FIG. 6 is a schematic diagram of a transcription repressor binding site in the CMV promoter.
【図７】 本発明のプロモーターを用いるラット肝細胞におけるβ−ガラク
トシダーゼの発現。FIG. 7: Expression of β-galactosidase in rat hepatocytes using the promoter of the present invention.
【図８】 本発明のプロモーターを用いるヒト肝細胞におけるβ−ガラクト
シダーゼの発現。FIG. 8: Expression of β-galactosidase in human hepatocytes using the promoter of the present invention.
【図９】 本発明のプロモーターを用いるＢａｌｂ／ｃ肺中のβ−ガラクト
シダーゼの発現。FIG. 9: Expression of β-galactosidase in Balb / c lung using the promoter of the invention.
【図１０】 本発明のプロモーターを用いるマウスにおけるＣＡＴの発現。FIG. 10 shows CAT expression in mice using the promoter of the present invention.
【図１１】 ２９３細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞において本発明のＣＭＶ由来
のプロモーターエレメントの５’に配置されるヒトアルブミン遺伝子由来のエン
ハンサーエレメントの使用によって、該ＣＭＶ由来のプロモーターエレメントに
作動可能に連結されたトランスジーンの発現の増加。FIG. 11 shows the use of a human albumin gene-derived enhancer element located 5 ′ of a CMV-derived promoter element of the present invention in 293 cells and Hep3B cells to enable a trans-operably linked CMV-derived promoter element. Increased gene expression.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ネルソン・ユー アメリカ合衆国01568マサチューセッツ州 ウエスト・アップトン、ロックデイル・ヒ ル・サークル25番 (72)発明者 ジョン・マーシャル アメリカ合衆国01747マサチューセッツ州 ホープデイル、ノースロップ・ストリート 25番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA12 BA80 CA01 CA04 CA09 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA06 GA11 HA17 4C084 AA13 NA10 ZB091 ZB261 ZC021 ZC031 ZC191 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 ZB09 ZB26 ZC02 ZC03 ZC19 ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuing on the front page (72) Nelson You, Inventor, 01568 Rockdale Hill Circle, West Upton, Massachusetts, United States 01568 John Marshall, Northrop Street, Hopedale, Mass. 01747, United States of America No. 25 F term (reference) 4B024 AA01 AA20 BA12 BA80 CA01 CA04 CA09 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA06 GA11 HA17 4C084 AA13 NA10 ZB091 ZB261 ZC021 ZC031 ZC191 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 ZB09 ZB26 ZC02 ZC19
Claims (54)
むＣＭＶ由来のプロモーターエレメントであって、標的細胞において該プロモー
ターエレメントに作動可能に連結されたトランスジーンの持続性発現を与えるプ
ロモーターエレメント。1. A CMV-derived promoter element comprising a truncated version of a wild-type cytomegalovirus promoter, wherein the promoter element confers sustained expression of a transgene operably linked to said promoter element in a target cell.
前初期プロモーターである請求項１記載のＣＭＶ由来のプロモーターエレメント
。2. The CMV-derived promoter element according to claim 1, wherein the cytomegalovirus promoter is a cytomegalovirus immediate-early promoter.
択されるヌクレオチド配列を有する請求項１記載のＣＭＶ由来のプロモーターエ
レメント。3. The CMV-derived promoter element according to claim 1, which has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
Ｖ由来のプロモーターエレメント。4. The CM according to claim 1, which has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
V-derived promoter element.
Ｖ由来のプロモーターエレメント。5. The CM according to claim 1, which has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
V-derived promoter element.
ＣＭＶ由来のプロモーターエレメント。6. The CMV-derived promoter element according to claim 1, which has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
Ｖ由来のプロモーターエレメントを含む発現カセットであって、該ＣＭＶ由来の
プロモーターエレメントが標的細胞においてトランスジーンの持続性発現を与え
る発現カセット。7. The CM of claim 1 operably connected to a transgene.
An expression cassette comprising a V-derived promoter element, wherein the CMV-derived promoter element confers sustained expression of a transgene in a target cell.
号３および配列番号４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する請求
項７記載の発現カセット。8. The expression cassette according to claim 7, wherein the CMV-derived promoter element has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
オチド配列を有する請求項７記載の発現カセット。9. The expression cassette according to claim 7, wherein the CMV-derived promoter element has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
レオチド配列を有する請求項７記載の発現カセット。10. The expression cassette according to claim 7, wherein the CMV-derived promoter element has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
レオチド配列を有する請求項７記載の発現カセット。11. The expression cassette according to claim 7, wherein the CMV-derived promoter element has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
ー。12. An adenovirus vector comprising the expression cassette according to claim 7.
項１２記載のアデノウイルスベクター。13. The adenovirus vector according to claim 12, comprising an adenovirus genome lacking the E4 region.
列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有する請求項１２記載のアデノウイルスベクター。14. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
列番号２のヌクレオチド配列を有する請求項１２記載のアデノウイルスベクター
。15. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
列番号３のヌクレオチド配列を有する請求項１２記載のアデノウイルスベクター
。16. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
列番号４記載のヌクレオチド配列を有する請求項１２記載のアデノウイルスベク
ター。17. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
調節タンパク質およびヒトα−ガラクトシダーゼからなる群より選択されるタン
パク質をコードする請求項１２記載のアデノウイルスベクター。18. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the transgene of the expression cassette encodes a protein selected from the group consisting of human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein and human α-galactosidase.
調節タンパク質をコードする請求項１２記載のアデノウイルスベクター。19. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the transgene of the expression cassette encodes a human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein.
ゼをコードする請求項１２記載のアデノウイルスベクター。20. The adenovirus vector according to claim 12, wherein the transgene of the expression cassette encodes human α-galactosidase.
列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有する請求項２１記載のプラスミド。22. The plasmid according to claim 21, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
列番号２のヌクレオチド配列を有する請求項２１記載のプラスミド。23. The plasmid according to claim 21, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
列番号３のヌクレオチド配列を有する請求項２１記載のプラスミド。24. The plasmid according to claim 21, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
列番号４のヌクレオチド配列を有する請求項２１記載のプラスミド。25. The plasmid according to claim 21, wherein the CMV-derived promoter element of the expression cassette has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
調節タンパク質およびヒトα−ガラクトシダーゼからなる群より選択されるタン
パク質をコードする請求項２１記載のプラスミド。26. The plasmid according to claim 21, wherein the transgene of the expression cassette encodes a protein selected from the group consisting of human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein and human α-galactosidase.
調節タンパク質をコードする請求項２１記載のプラスミド。27. The plasmid of claim 21, wherein the transgene of the expression cassette encodes a human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein.
ゼをコードする請求項２１記載のプラスミド。28. The plasmid according to claim 21, wherein the transgene of the expression cassette encodes human α-galactosidase.
持続性発現を得る方法であって、アデノウイルスベクターまたはプラスミドが標
的細胞または組織により取り込まれ、そこでトランスジーンが発現されるような
条件下で、標的細胞または組織を、標的細胞または組織においてトランスジーン
の持続性発現を与えるトランスジーンに作動可能に連結されたＣＭＶ由来のプロ
モーターエレメントを含む発現カセットを含むアデノウイルスベクターまたはプ
ラスミドと接触させることを特徴とする方法。29. A method of providing a transgene to a target cell or tissue and obtaining sustained expression therein, wherein the adenovirus vector or plasmid is taken up by the target cell or tissue, where the transgene is expressed. Under appropriate conditions, a target cell or tissue is adenovirus vector or plasmid containing an expression cassette containing a CMV-derived promoter element operably linked to a transgene that confers sustained expression of the transgene in the target cell or tissue. A method comprising contacting.
増加を与えるＣＭＶ由来のプロモーターエレメントの５’側に配置されるエンハ
ンサーエレメントを含む請求項７記載の発現カセット。30. The expression cassette according to claim 7, further comprising an enhancer element located 5 'to a CMV-derived promoter element that increases the expression of the transgene in the recipient cell.
る請求項３０記載の発現カセット。31. The expression cassette according to claim 30, wherein the enhancer element is derived from a human albumin gene.
配列番号７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する請求項３０記載
の発現カセット。32. The expression cassette according to claim 30, wherein the enhancer element has a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7.
を有する請求項３０記載の発現カセット。33. The expression cassette according to claim 30, wherein the enhancer element has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
を有する請求項３０記載の発現カセット。34. The expression cassette according to claim 30, wherein the enhancer element has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
配列を有する請求項３０記載の発現カセット。35. The expression cassette according to claim 30, wherein the enhancer element has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
レオチド配列を有し、エンハンサーエレメントが配列番号７のヌクレオチド配列
を有する請求項３０記載の発現カセット。36. The expression cassette according to claim 30, wherein the CMV-derived promoter element has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and the enhancer element has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
ター。37. An adenovirus vector comprising the expression cassette according to claim 36.
求項３７記載のアデノウイルスベクター。38. The adenovirus vector of claim 37, comprising the adenovirus genome wherein the E4 region has been deleted.
調節タンパク質およびヒトα−ガラクトシダーゼからなる群より選択されるタン
パク質をコードする請求項３７記載のアデノウイルスベクター。39. The adenovirus vector according to claim 37, wherein the transgene of the expression cassette encodes a protein selected from the group consisting of human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein and human α-galactosidase.
調節タンパク質をコードする請求項３７記載のアデノウイルスベクター。40. The adenovirus vector according to claim 37, wherein the transgene of the expression cassette encodes a human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein.
ゼをコードする請求項３７記載のアデノウイルスベクター。41. The adenovirus vector according to claim 37, wherein the transgene of the expression cassette encodes human α-galactosidase.
調節タンパク質およびヒトα−ガラクトシダーゼからなる群より選択されるタン
パク質をコードする請求項４２記載のプラスミド。43. The plasmid according to claim 42, wherein the transgene of the expression cassette encodes a protein selected from the group consisting of human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein and human α-galactosidase.
調節タンパク質をコードする請求項４２記載のプラスミド。44. The plasmid of claim 42, wherein the transgene of the expression cassette encodes a human cystic fibrosis transmembrane regulatory protein.
ゼをコードする請求項４２記載のプラスミド。45. The plasmid according to claim 42, wherein the transgene of the expression cassette encodes human α-galactosidase.
続性発現を得る方法であって、アデノウイルスベクターまたはプラスミドが標的
細胞または組織により取り込まれ、そこでトランスジーンが発現されるような条
件下で、標的細胞または組織を、標的細胞または組織においてトランスジーンの
持続性発現を与えるトランスジーンに作動可能に連結されたＣＭＶ由来のプロモ
ーターエレメントおよびトランスジーンの発現増加を与えるＣＭＶ由来のプロモ
ーターエレメントの５’側に配置されるエンハンサーエレメントを含む発現カセ
ットを含むアデノウイルスベクターまたはプラスミドと接触させることを特徴と
する方法。46. A method of providing a transgene to a target cell or tissue and obtaining sustained expression therein, wherein the adenovirus vector or plasmid is taken up by the target cell or tissue where the transgene is expressed. Under the conditions, a CMV-derived promoter element operably linked to the transgene that confers sustained expression of the transgene in the target cell or tissue and a CMV-derived promoter element that confers increased expression of the transgene Contacting with an adenovirus vector or a plasmid containing an expression cassette containing an enhancer element located on the 5 ′ side of the above.
性両親媒性物質を含む複合体。47. A complex comprising the adenovirus vector of claim 12 and a cationic amphiphile.
性両親媒性物質を含む複合体。49. A complex comprising the adenovirus vector of claim 37 and a cationic amphiphile.
質を含む複合体。51. A complex comprising the plasmid of claim 21 and a cationic amphiphile.
質を含む複合体。53. A complex comprising the plasmid of claim 42 and a cationic amphiphile.
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