JP2002508748A - アジュバントとしてのウイルス様粒子の使用 - Google Patents

アジュバントとしてのウイルス様粒子の使用

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Abstract

(57)【要約】 非複製ウイルス様粒子（VLP）を含むアジュバント処方物が提要される。VLPは任意のいくつかのウイルス由来であり得、そして選択された抗原（ここで、抗原は粒子とは異なる）に対する免疫学的応答を増強するに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 アジュバントとしてのウイルス様粒子の使用 技術分野 本発明は、一般に、選択された抗原に対する免疫応答を増強する薬剤に関する 。特に、本発明は、アジュバントおよびコアジュバントとしてのウイルス様粒子 （VLP）の使用、VLPを含む処方物、ならびに本発明の組成物の作成および使用の ための方法に関する。 背景 ワクチン組成物には、しばしば、細胞媒介性免疫応答および体液性免疫応答を 増強するための免疫学的アジュバントが含まれる。例えば、投与された抗原を吸 着および/または沈殿させ、そして注入部位での抗原を保持し得る貯蔵（depot） アジュバントが、しばしば使用される。代表的な貯蔵アジュバントには、アルミ ニウム化合物および油中水エマルジョンが含まれる。しかし、貯蔵アジュバント （しかし、抗原性を増加している）は、皮下または筋肉内に注入された場合、し ばしば、肉芽腫、膿瘍および廠痕のような重篤な持続性の局部反応を刺激する。 リポ多糖およびムラミルジペプチドのような他のアジュバントは、注入および/ またはライター症状（インフルエンザ様症状、全身性の関節の不快、そして時に は、前部ブドウ膜炎、関節炎、および尿道炎）における発熱性応答を惹起し得る 。 吸着または包括された抗原を有する粒子キャリアは、これらの問題を迂回する ための試みにおいて使用されている。このようなキャリアは、免疫系に対して選 択された抗原の複数コピーを示し、そして局部リンパ節における抗原の捕獲およ び保持を促進する。粒子はマクロファージによって貴食され、そしてサイトカイ ン放出によって抗原提示を増強し得る。粒子キャリアの例には、ポリメチルメタ クリル酸ポリマ一由来の粒子キャリア、ならびにPEGとして公知である、ポリ（ ラクチド）およびポリ（ラクチド-コ-グリコリド）由来の微粒子が含まれる。他 のより毒性の系を上回る重要な利点を提供する場合、抗原含有PLG微粒子は、 いくつかの欠点をこうむる。例えば、微粒子の産生は困難であり、かつ抗原を変 性しそしてその免疫原性を破壊し得る苛酷な化学物質の使用を伴う。さらに、抗 原不安定性が、小微粒子の調製に使用される高剪断力に起因して、および使用さ れるエマルジョン内の界面効果に起因して、生じ得る。 リポソームはまた、これらの問題を克服するために使用されている。リポソー ムは、薬剤を捕獲する（entrap）ために使用されるリン脂質のような脂質成分か ら形成される微小な小胞である。薬物送達システムとしてのリポソームの使用は 上記のいくつかの問題を軽減するが、リポソームは、貯蔵および使用の間低い安 定性を示し、そしてリポソームの大規模な産生および製造は問題が多い。 ウイルス粒子は、宿主の免疫系に対して捕獲されたまたはそれと結合された抗 原の適切な提示のためのマトリックスとして使用され得る。例えば、米国特許第 4,722,840号は、ウイルス由来の構造タンパク質の粒子形成フラグメント（例え ば、異種ポリペプチドに融合した、Ｂ型肝炎ウイルスウイルス（HBV）表面抗原 （HBsAg）の粒子形成フラグメント）からなるハイブリッド粒子を記載する。Tin dleら、Virology（1994）200:547-557は、ヒトパピローマウイルス（HPV）型16E 7形質転換タンパク質のエピトープを含むキメラHBVコア抗原粒子の産生および使 用を記載する。 Adamsら、Nature（1987）329:68-70は、酵母におけるハイブリッドHIVgp120:T y VLPの組換え産生を記載し、Brownら、Virology（1994）198:477-488は、ヒト パルボウイルスB19のVP2タンパク質、ならびにヒト単純ヘルペスウイルス１型お よびマウス肝炎ウイルスA59由来のエピトープからなるキメラタンパク質の産生 を記載する。Wagnerら、Virology（1994）200:162-175、Brandら、J．Virol．Me th．(1995)51:153-168およびWagnerら、Virology（1996）220:128-140は、キメ ラHIV-1 p55gag粒子のアセンブリを記載する。米国特許第5,503,833号は、治療 剤のカプセル化および送達のためのロタウイルスVP6スフェア（sphere）の使用 を記載する。 上記の抗原提示システムにかかわらず、種々の薬学的組成物およびワクチンに おける使用のための有効かつ安全なアジュバントの継続した必要が存在する。 発明の要旨 本発明者らは、驚くことに、VLPとの選択された抗原の組合わせ（ここで、抗 原はVLPと異なる）は、問題の抗原に対する免疫応答の増強を提供することを見 い出した。 １つの実施態様において、次いで、本発明は、VLPアジュバント、選択された 抗原、および薬学的に受容可能な賦形剤を含むワクチン組成物に関する。選択さ れた抗原は、VLPとは異なる。特に好ましい実施態様において、VLPは、肝炎表面 抗原の１つ以上の粒子形成ポリペプチド、またはパピローマウイルスL1および/ もしくはL2タンパク質の粒子形成ポリペプチドに由来し、そして選択された抗原 は、MenC/Hibオリゴ糖結合体またはHPV E7である。 別の実施態様において、本発明は、VLPアジュバントおよび選択された抗原を 脊椎動物体に投与する工程を包含する、脊椎動物体における増強された免疫応答 を産生するための方法に関する。抗原はVLPとは異なり、そしてVLPは、脊椎動物 体における抗原に対する増強された免疫応答を惹起するのに有効な量で投与され る。VLPは、抗原投与の前、後、または同時に被検体に投与され得る。 なお別の実施態様において、本発明は、VLPを提供する工程およびVLPと薬学的 に受容可能な賦形剤とを組合わせる工程を包含するアジュバント処方物を調製す るための方法に関する。 本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中に関して当業者に容易に達 成される。 図面の簡単な説明 図１は、Ｂ型肝炎ウイルスVLP（HBV）を含むワクチンに対する胎仔ヒヒの抗体 を示す。結果は、IU/mlにおける抗体濃度の相乗平均として示される。 図２は、HBV VLPを含むワクチンに対する、胎仔ヒヒの抗体応答を示す。結果 は、IU/mlにおける抗体濃度の相乗平均として示される。 図３は、HBV VLPを含むワクチンに対する、胎仔ヒヒの抗カプセル抗体応答を 示す。結果は、IU/mlにおける抗体濃度の相乗平均として示される。 図４は、HBV VLPを含むワクチンに対する、胎仔ヒヒの抗カプ七ル抗体応答を 示す。結果は、IU/mlにおける抗体濃度の相乗平均として示される。 図５Aおよび５Bは、HBV VLPを含むワクチンに対する、胎仔ヒヒの血清抗体応 答を示す、図５Aは、ELISAによって決定されるIgG抗カプセル抗体応答を示す。 図５Bは、相補的媒介性細菌抗体を示す。 図６は、ウサギ体液性免疫応答における、HPV6b L1 VLPとE7ワクチンとの組合 わせの効果を示す。 発明の詳細な説明 本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術範囲内である、ウイル ス学、化学、生化学、組換え技術、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する 。このような技術は文献において十分に説明される。例えば、Virology，第3版 、第Ｉ巻および第ＩＩ巻(B.N．FieldsおよびD.M．Knipe編，1996)；Remlngton's Pharmaceutical Sciences，第１８版(Easton，Pennsylvania:Mack Publishing Company，1990)；Methods In Enzymology(S．ColowickおよびN.Kaplan編、Acade mic Press，Inc.);Handbook of Experimental Immunology，第I巻-第IV巻（D.M ．WeirおよびC.C．Blackwell編，1986，Blackwell Scientific Publications)； Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；およびDN A Cloning:A Practical Approach，第I巻および第II巻（D.Glover,編）を参照の こと。 本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」 および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明確に示さない限り、複数形の表示 を含む。 Ａ．定義 本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして下記のように定義され ることを意図する。 本明細書中で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは 、以下でさらに議論されるいくつかのウイルスのいずれかから誘導される複製し ていない空のウイルス殻をいう。ＶＬＰは一般に、１つ以上のウイルスタンパク 質 （例えば、カプシド、コート、殻、表面および/またはエンベロープタンパク質 といわれるタンパク質を含むが、これらに限定されない）、あるいはこれらのタ ンパク質から誘導される粒子形成ポリペプチドから構成される。VLPは適切な発 現系において、タンパク質の組換え発現によって自発的に形成し得る。特定のVL Pを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下でより十分に議 論される。ウイルスタンパク質の組換え発現後の、VLPの存在は、当該分野で公 知の従来の技術（例えば、電子顕微鏡検査法、X線結晶学など）を使用して検出 し得る。例えば、Bakerら、Biophys.J.(1991)60:1445-1456;HagenseeらJ．Virol .(1994)68:4503-4505を参照のこと。例えば、低温電子顕微鏡検査が、問題のＶ ＬＰ調製物のガラス化水性サンプルについて実施され得、そして、画像が適切な 曝露条件下で記録される。 特定のウイルスタンパク質から誘導される「粒子形成ポリペプチド」によって 、全長または全長に近いウイルスタンパク質、ならびにそれらのフラグメント、 または内部欠失を有するウイルスタンパク質（これは、ＶＬＰ形成に有利な条件 下でＶＬＰを形成する能力を有する）が意味される。従って、ポリペプチドは、 参照分子の全長配列、フラグメント、短縮型および部分的配列、ならびにアナロ グおよび前駆体形態を含み得る。それゆえ、この用語は、ポリペプチドがVLPを 形成する能力を保持する限り、この配列に対する欠失、付加および置換を意味す る。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然の変化を含む。なぜならコ ートタンパク質における変化が、しばしばウイルス単離物の間に生じるからであ る。この用語はまた、タンパク質がVLPを形成する能力を保持する限りは、参照 タンパク質において天然では生じない欠失、付加および置換を含む。 好ましい置換は、天然に保存されている置換（すなわち、アミノ酸側鎖におい て関連するアミノ酸のファミリー内に生じる置換）である。具体的には、アミノ 酸は、一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性--アスパラギン酸およ びグルタミン酸：（２）塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極 性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン 、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷で極性--グリシン、アスパ ラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルア ラ ニン、トリプトファンおよびチロシンは、時には芳香族アミノ酸として分類され る。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシンの孤立置換、グルタミン酸 でのアスパラギン酸の孤立置換、セリンでのスレオニンの孤立置換、または構造 的に関連するアミノ酸での類似の保存的置換が、生物学的活性に主要な効果を有 さないことは、合理的に予想可能である。それゆえ、参照分子と実質的に同じア ミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない少数のアミ ノ酸置換を保有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義内にある。 抗原がVLP内に捕捉されず、ならびに/または抗原およびVLPが融合タンパク質 として共に発現されない場合、VLPは選択された抗原とは「異なる」。しかし、V LPは、たとえ抗原とVLPとの間に疎物理的会合が存在しても、選択された抗原と は「異なる」と考えられる。 「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して体液性および/または細胞性抗原特異 的応答を行う、１つ以上のエピトープ（直線状、コンフォメーション状のいずれ かまたはその両方）を含有する分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と交換 可能に使用される。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を含む が、３〜４程度の少ないアミノ酸でもあり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、Ｃ ＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９アミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細 胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０アミノ酸を含む。用語「抗原」は、両 方のサブユニット抗原（すなわち、天然において抗原が関連している生物全体か ら分離および別々にされる抗原）、ならびに殺傷された、弱毒化された、または 不活化された、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫または他の微生物を意味する。抗 イディオタイプ抗体、またはそのフラグメント、および合成ペプチドミモトープ （mimotope）(これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る)のような抗体もまた 、本明細書中で使用される抗原の定義のもとに捕捉される。同様に、インビボ（ 例えば、遺伝子治療およびDNA免疫適用）において抗原または抗原決定基を発現 するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定 義に含まれる。 本発明の目的のために、抗原は、以下でより十分に記載されるように、いくつ かの既知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌のいずれかから誘導され得る。こ の用語はまた、種々の任意の腫瘍抗原を意図する。さらに、本発明の目的のため に、「抗原」とは、本明細書に定義されるように、タンパク質が免疫応答を誘発 する能力を保持する限り、例えば、ネイティブ配列に対して（一般的に天然にお いて保存的な）欠失、付加および置換のような改変を含むタンパク質をいう。こ れらの改変は、部位特異的突然変異誘発によってのような計画的なものであり得 るか、または抗原を産生する宿主の変異によってのような偶発的なものであり得 る。 抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する抗原 に対する体液性および／または細胞性免疫応答の、被検体における発生である。 本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介される免 疫応答をいい、一方「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血 球によって媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害 性Ｔ細胞（「CTL」）による抗原特異的応答を含む。CTLは、主要組織適合遺伝子 複合体（MHC）によってコードされかつ細胞の表面で発現されるタンパク質に結 合して提示されるペプチド抗原についての特異性を有する。CTLは、細胞内微生 物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促 進を助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を 含む。ヘルパーＴ細胞は、非特異的エフェクター細胞の機能の剌激を助けるよう に作用し、そして非特異的エフェクター細胞の活性をそれらの表面にMHC分子に 結合してペプチド抗原を提示する細胞に対して集中させるように作用する。「細 胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞およ び／または他の白血球によって産生される他のこのような分子（CD4+およびCD8+ Ｔ細胞に由来するものを含む）の産生をいう。 細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でMHC分子と結 合した抗原の提示によって、脊椎動動物被検体を感作するように働き得る。細胞 媒介性免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞で、またはその付近に指 向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来の防御を可 能にするように生成され得る。 特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ増殖（lympho prollferation）（リンパ球活性化）アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイ、ま たは感作された被検体における抗原に特異的なＴリンパ球についてのアッセイの ような多数のアッセイにより決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で 周知である。例えば、Ericksonら、J.Immunol．(1993)151:4189-4199；Doeら、E ur.J.Immunol．(1994)24:2369-2376を参照のこと。 従って、本明細書中で使用されるような免疫学的な応答は、CTLの産生、およ び／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目 的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、 １つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるい は目的の組成物もしくはワクチンに存在する抗体に特異的に指向される、サプレ ッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性の中 和、および／または抗体-補体、すなわち抗体依存性細胞細胞傷害性（ADCC）の 媒介に役立って、免疫された宿主に保護を提供し得る。このような応答は、当該 分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る 。 選択された抗原を本発明のVLPアジュバントとともに含むワクチン組成物、ま たは本発明のVLPアジュバントと同時投与されるワクチン組成物は、VLPアジュバ ントまたはコアジュバント（coadjuvant）を伴わないで投与される抗原の等価な 量によって誘発される免疫応答よりも大きな免疫応答を誘発する能力を有する場 合、「増強された免疫原性」を提示する。従って、ワクチン組成物は、「増強さ れた免疫原性」を提示し得る。なぜなら、抗原はより強力に免疫原性であるから である。または、なぜなら、より低い用量またはより少ない用量の抗原は、抗原 が投与される被検体における免疫応答を達成するのに必要であるからである。こ のような増強された免疫原性は、VLP組成物および抗原コントロールを動物に投 与し、そして当該分野で周知のラジオイムノアッセイおよびELISAのような標準 的なアッセイを用いて、この２つに対する抗体力価および/または細胞媒介性免 疫を比較することによって、決定され得る。 本発明の目的のために、VLPアジュバントの「有効な量」は、同時投与される 抗原に対する免疫学的な応答を増強する量である。 「脊椎動物被検体」によって、脊索動物門亜門の任意のメンバーを意味し、こ れはヒトおよび他の霊長類（チンパンジーならびに他の無尾猿（ape）および有 尾猿（monkey）種のような非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、 およびウマのような農場動物；イヌおよびネコのような家庭用動物；マウス、ラ ット、およびモルモットのような齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、七面鳥、お よび他のキジ類の鳥、カモ類、ガンなどのような家庭内、野生、および狩猟用鳥 類を含む鳥類を含むが制限されない。この用語は、特定の齢を意味しない。従っ て、成体および新生児個体の両方が含まれることが意図される。上記の系は、任 意の上記の脊椎動物種における使用が意図される。なぜなら、これらの脊椎動物 の全ての免疫系は、同様に機能するからである。 「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」によって、生物学的また は他の点で所望でない物質、すなわち、何らか所望でない生物学的効果を引き起 こさず、またはその物質が含まれる組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用 せずに、VLPアジュバント処方物とともに個体に投与され得る物質を意味する。 「生理学的pH」または「生理学的な範囲のpH」によって、約7.2以上8.0以下の 包括的範囲の、より代表的には約7.2以上7.6以下の範囲のpHを意味する。 核酸分子を記載するために本明細書中で用いられる「組換え」とは、以下の起 源もしくは操作によって、ゲノム、cDNA、半合成、または合成起源のポリヌクレ オチドを意味する：(1)天然において関連するポリヌクレオチドの全てまたは一 部に関連しない；および/または(2)天然において連結するポリヌクレオチド以外 のポリヌクレオチドに連結する。タンパク質またはポリペプチドに関して用いら れる用語「組換え」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポ リペプチドを意味する。単一細胞実体として培養される原核生物微生物もしくは 真核生物細胞株を示す「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株 」、「細胞培養物」、および他のこのような用語は、交換可能に使用され、そし て組換えベクターまたは他の移入DNAのためのレシピエントとして使用され得る 、または使用されてきた細胞をいい、そしてトランスフェクトされた最初の細胞 の子孫の細胞を含む。単一の親細胞の子孫は、偶然的もしくは意図的な変異に起 因して、もとの親と形態的に、またはゲノムもしくは全DNA相補体において、必 ずしも完全に同一でなくともよいことが理解される。関連する特性(例えば、 所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在)によって特徴付けられる 、親に十分類似する親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ 、そして上記の用語によって包含される。 本明細書中で使用されるように、「処置」とは、以下のいずれをも言う：(1) 伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、(ii)症状の低減ま たは排除、および(iii)問題の病原体の実質的なまたは完全な排除。処置は、(感 染前に)予防的にまたは(感染後に)治療的にもたらされ得る。 B.一般的方法 本発明の中心は、VLPが、選択された抗原とともに投与される場合、脊椎動物 被験体における体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答を増強するための アジュバントまたはコアジュバントとして作用し得るという発見である。驚くべ きことに、増強した免疫原性を生じさせるために、抗原は、VLP内に捕捉される 必要はない。従って、本発明は、結合剤、過酷な化学処理などの使用を必要とし ない。なぜなら、目的の抗原は、VLPにカプセル化または化学的に結合体化され ないからである。さらに、抗原サイズは、限定されない。なぜなら、この系は、 抗原のカプセル化に依存しないからである。従って本発明の系は、広範な範囲の 抗原とともに有用であり、かつ多数の感染を予防および/または処置するための 強力なツールを提供する。 アジュバントとして使用するためのVLPは、適切な条件下で粒子を形成する能 力を有する、ウイルスタンパク質、ウイルスタンパク質に由来する、粒子形成ポ リペプチド、またはウイルスタンパク質もしくはそのフラグメントの組み合わせ から形成され得る。粒子形成ウイルスタンパク質の必要条件とは、宿主細胞の細 胞質で粒子が形成される場合、タンパク質は、ウイルス様構造の形成が生じるよ うに、そして使用される組換え発現系の細胞においてウイルス様構造へポリペプ チドが自動的に構築されるように発現される宿主細胞中で十分に安定でなければ ならないということである。このタンパク質が培養培地中に分泌される場合、VL Pが形成されるように条件が調節され得る。さらに、粒子形成タンパク質は、発 現宿主中で細胞傷害性であるべきではなく、VLPが使用される宿主中で複製可能 であるべきではない。 例えば、いくつかのタンパク質は、pHが適切なレベルになると、自律的にVLP を形成し得ることが公知である。同様に、いくつかのタンパク質は、VLPを形成 させるために、十分な量のタンパク質が存在することが必要である。 広範な範囲のウイルスタンパク質から粒子を形成させるための方法および適切 な条件は、当該分野で公知である。例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)表面に由来す るタンパク質(例えば、表面抗原(sAg)、およびプレ表面配列(pre-S1およびpre-S 2(以前は、pre-Sとよばれた)、ならびにこれらの配列の任意の組み合わせ))は、 適切な宿主細胞における発現の際、例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、またはXeno pusの細胞における発現の際に、自律的に粒子を形成し得る。従って、本発明に おける使用のためのHBV VLPとしては、sAg、pre-S1またはpre-S2、および上記の 任意の組み合わせ(例えば、sAg/pre-S1、sAg/pre-S2、sAg/pre-S1/pre-S2、およ びpre-S1/pre-S2)の粒子形成タンパク質が挙げられ得る。例えば、HBV構造の議 論については、Mackett,MおよびWilliamson,J.D.,Human Vaccines and Vaccinat ion、159-176頁の「HBV vaccines--from laboratory to license：a case study 」、および種々のHBV粒子の組換え産生の記載については米国特許第4,722,840号 、同第5,098,704号、同第5,324,513号、Beamesら、J.Virol．(1995)69:6833-683 8、Birnbau・ら、J.Vlrol.(1990)64：3319-3330、Zhouら、J.Virol.(1991)65:54 57-5464を参照のこと。 さらに、パピロマウイルス構造タンパク質L1およびL2由来の粒子形成ポリペプ チドは、本明細書中においてVLPアジュバントおよびコアジュバントとして単独 または組み合わせてのいずれかの使用が見出される。本発明に伴う使用のための L1およびL2タンパク質は、任意の種々のヒトおよび他の動物のパピロマウイルス 、ならびにそのサブグループ(HPV-1、HPV-2、HPV-5、HPV-6、HPV-8、HPV-11、HP V-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、およびHPV-45を含むがこれらに限定されない) 由来であり得る。L1およびL2の配列は、種々のHPV型について公知である。例え ば、種々のHPV型の配列については、Human Papillomaviruses:A Compilation an d Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences(Myers,G.ら編)、Los A lamos National Laboratory,Los Alamos，New Mexico,1994-1996を参照のこと。 L1およびL2から、単独または組み合わせてのいずれかでVLPを形成するための 方法が公知であり、例えば、米国特許第5,437,951号(昆虫細胞におけるL1VLPの 産生)；WO 95/20659(ワクシニアウイルスベクターを使用する真核生物細胞にお けるL2 VLPの産生)；WO 93/02184(ワクシニアウイルスベクターを使用する真核 生物細胞におけるL1/L2 VLPの産生)；Kirnbauerら、J.Virol.(1993)67:6929-693 6(昆虫細胞におけるL1およびL1/L2 VLPの産生)；Heinoら、Virology(1995)214:3 49-359(哺乳動物細胞におけるL1およびL1/L2 VLPの産生)；Sasagawaら、Virolog y(1995)206:126-135(酵母細胞におけるL1およびL1/L2 VLPの産生)；Zhouら、Vir ology(1991)185:251-257(ワクシニアウイルスベクターに感染した上皮細胞にお けるL1/L2 VLPの産生)に報告される。 同様に、いくつかのレトロウイルスタンパク質は、発現の際にVLPを形成する ことが公知である。例えば、ロタウイルスVP6 VLPは、米国特許第5,503,833号に 記載のように産生され得る。一般的に、VP6球状粒子は、組換え産生されたVP6を 含む溶解物のpHが約pH4.0以上になると、自律的に形成する。ウシロタウイルスV P2は、バキュロウイルス系における発現の際に自律的にVLPを形成する。例えば 、Labbeら、J.Virol.(1991)65：2946-2952を参照のこと。 酵母レトロトランスポゾンTyは、VLPに構築されるタンパク質のセットをコー ドする。例えば、Mellorら、Nature(1985)318：583-586；Garfinkelら、Cell(19 85)42：507-517；Adamsら、Cell(1987)49：111-119を参照のこと。Ty VLPは、酵 母における発現の際にTyエレメント１次翻訳(primary translation)産物p1、な らびにp1とp3との組み合わせ(pre-Ty VLP)、およびp1とp3の粒子形成タンパク質 分解産物から形成され得る。例えば、Adamsら、Nature(1987)329：68-70を参照 のこと。 本発明における使用のためのVLPはまた、ヒトパルボウイルスB19由来のウイル スタンパク質(例えば、昆虫細胞において発現されるウイルスタンパク質VP1およ び/またはVP2(Brownら、Virology(1994)198:477-488)を参照のこと)および昆虫 細胞で発現されたポリオーマウイルス由来のVP1、VP2および/またはVP3タンパク 質(Delosら、Virology(1993)194:393-398；Forstovaら、Human Gene Therapy(19 95)6:297-306))に由来し得る。レトロウイルスgagタンパク質(例えば、ラウ ス肉腫ウイルス(RSV)およびモロニーマウス白血病ウイルス(MLV)に由来するもの )もまた、真核生物細胞で発現される場合、自律的にVLPを形成するHIV-1グルー プ特異的コア抗原p55gag、およびその欠失変異体と同様に、本明細書中において 使用が見出される。例えば、Wagnerら、Arch.Virol.(1992)127：117-137；Wagne rら、Virology(1994)200:162-175；Brandら、J.Virol.Meth.(1995)51:153-168、 およびWagnerら、Virology(1996)220:128-140を参照のこと。 上記で説明したように、VLPは、目的の粒子形成ポリペプチドが適切な宿主細 胞において組換え発現される場合、自律的に形成し得る。従って、本発明におけ る使用のためのVLPは、当該分野で周知の組換え技術を使用して、簡便に調製さ れる。この点で、問題の粒子形成ポリペプチドをコードする遺伝子は、公知の技 術を使用して、DNAライブラリーから、またはこの遺伝子を含む細胞および組織 から直接単離され得る。例えば、DNAを得て、単離するために使用した技術の記 載については、Sambrookら(前出)を参照のこと。粒子形成ポリペプチドをコード する遺伝子はまた、公知の配列に基づいて、合成的に生成され得る。ヌクレオチ ド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に適切なコドンを用いて設計され得る。一 般的に、配列が発現される意図された宿主に好ましいコドンが選択される。完全 配列は、一般的に、標準的方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから 構築され、完全なコード配列に構築される。例えば、Edge、Nature(1981)292：7 56；Nambairら、Sclence(1984)223：1299；Jayら、J.Biol.Chem(1984)259:6311 を参照のこと。 一旦、所望の粒子形成ポリペプチドについてのコード配列が、単離されるか、 または合成されると、それらは、発現のための任意の適切なベクターまたはレプ リコンにクローニングされ得る。非常に多くのクローニングベクターが当業者に 公知である。そして適切なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。 一般的には、Sambrookら(前出)を参照のこと。次いで、ベクターを使用して、適 切な宿主細胞を形質転換する。適切な発現系としては、当該分野で周知の細菌、 哺乳動物、バキュロウイルス/昆虫、ワクシニア、セムリキ森林ウイルス(SFV)、 哺乳動物、酵母およびXenopusの発現系が挙げられるが、これらに限定されない 。特に好ましい発現系は、哺乳動物、ワクシニア、昆虫、および酵母の系である 。 例えば、多くの哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、American Type Cult ure Collection(ATCC)から入手可能な不死化細胞株(例えば、チャイニーズハム スター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、乳児ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞 (COS)、ヒト肝臓ガン腫細胞(例えば、Hep G2)ならびにその他)が挙げられるが、 これらに限定されない。同様に、E.coli、Bacillus subtilis,およびStreptococ cus spp.のような細菌宿主は、本発明の発現構築物での使用が見出される。本発 明において有用な酵母宿主としては、特に、Saccharomyces cerevisiae、Candid a albicans、Candida maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragili s、Kluyveromyces lactis、Pichiaguillerimondii、Pichia pastoris、Schizosa ccharomyces pombeおよびYarrowia lipolyticaが挙げられる。バキュロウイルス 発現ベクターでの使用のための昆虫細胞は、とりわけ、Aedes aegypti、Autogra pha californica、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugip erda、およびTrichoplusia niが挙げられる。例えば、SummerおよびSmith、Texa s Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)を参照のこと。 ウイルスベクター（例えば、ポックス科のウイルス(ワクシニアウイルスおよ びトリポックスウイルスを含む)に由来するもの）は、真核生物細胞において粒 子の産生のために使用され得る。さらに、Tomeiら、J.Virol.(1993)67：4017-40 26およびSelbyら、J.Gen.Virol.(1993)74:1103-1113に記載されるように、ワク シニアベースの感染/トランスフェクション系もまた、本発明での使用が見出さ れる。この系において、細胞を、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼをコー ドするワクシニアウイルス組換え体でインビトロでまずトランスフェクトする。 このポリメラーゼは、これが、T7プロモータを有するテンプレートのみを転写す るという点で、精巧な特異性を提示する。感染に続いて、細胞は、T7プロモータ ーによって駆動される、目的のDNAでトランスフェクトされる。ワクシニアウイ ルス組換え体から細胞質において発現されるポリメラーゼは、次いで、宿主翻訳 機構によってタンパク質に翻訳されるRNAに、トランスフェクトされたDNAを転写 する。この方法は、大量のRNAおよびこの翻訳産物の高レベルで、一過性の、細 胞質産生を提供する。 選択した発現系および宿主に依存して、VLPを、粒子形成ポリペプチドが発現 され、そしてVLPが形成され得る条件下で発現ベクターによって形質転換された 宿主細胞を増殖させることによって生成する。適切な増殖条件の選択は、当該分 野の技術の範囲内である。VLPが細胞内的に形成される場合、細胞は、化学的、 物理的、または機械的手段を用いて破壊される。この手段は、細胞を溶解するが 、VLPを実質的にインタクトなままにする。このような方法は、当業者に公知で あり、そして例えば、Protein Purification Applications:A Practical Approa ch，(E.L.V．HarrisおよびS．Angal編，1990)において記載される。 次いで、勾配遠心分離（例えば、塩化セシウム(CsCl)およびスクロース勾配） などによるような、その完全性を保存する方法（例えば、Kirnbauerら、J．Viro l．(1993)67：6926-6936を参照のこと）、ならびに標準的な精製技術（例えば、 イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィー）を用いて、 粒子を単離する。 本発明のVLPアジュバントは、一旦得られると、所望の抗原を含むワクチン組 成物に取り込まれ得るか、または抗原を含む組成物と同時に、その直前に、また はその次にのいずれかで、別々に投与され得る。ワクチン組成物は、感染の処置 および/または予防の両方に使用され得る。さらに、本発明のアジュバント処方 物は、インビボにおいて、すなわちDNA免疫と組み合わせて産生される抗原の活 性を増強するために使用され得る。 VLPアジュバントは、１つ以上の選択された病原体に対して、もしくは病原体 に由来するサブユニット抗原に対して脊椎動物被験体を免疫するため、または１ つまたはいくつかの抗原に対する免疫応答を始動させるための組成物において使 用され得る。VLPアジュバントとともに投与され得る抗原は、タンパク質、ポリ ペプチド、抗原性タンパク質フラグメント、オリゴサッカライド、ポリサッカラ イドなどを含む。同様に、所望の抗原をコードするオリゴヌクレオチドまたはポ リヌクレオチドは、インビボ発現のためにVLPアジュバントとともに投与され得 る。 抗原は、広範な種々のウイルス、細菌、真菌、植物、原虫、および他の寄生虫 に由来し得る。例えば、本発明は、以下を含む、ヘルペスウイルスファミリーに 由来する広範な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための利用法を見 出す：単純ヘルペスウイルス(HSV)１型および２型に由来するタンパク質（例え ば、HSV-1およびHSV-2 gB、gD、gH、VP16、およびVP22）；水痘−帯状ウイルス( VZV)、エプスタインバーウイルス(EBV)、およびサイトメガロウイルス（CMV）に 由来する抗原（CMV gBおよびgHを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス由 来の抗原（例えば、HHV6およびHHV7）。（例えば、サイトメガロウイルスのタン パク質コードの状況の概説について、Cheeら、Cytomegaloviruses（J．K．McDou gall編、Springer-Verlag 1990）125-169頁；種々のHSV-1コードタンパク質の議 論について、McGeochら、J．Gen．Virol．(1988)69:1531-1574；HSV-1およびHSV -2のgBおよびgDタンパク質、ならびにそれをコードする遺伝子の議論について、 米国特許第5,171,568号；EBVゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定につい て、Baerら、Nature（1984）310:207-211；そしてVZVの概説について、Davison およびScott，J．Gen．Virol．(1986)67:1759-1816を参照のこと）。 さらに、肝炎ファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウ イルス（HBV）、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）、デルタ型肝炎ウイルス(HDV)、Ｅ型 肝炎ウイルス（HEV）、およびＧ型肝炎ウイルスを含む）由来の抗原に対する免 疫応答はまた、VLPアジュバントを用いて簡便に増強され得る。例示の目的で、H CVゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質（E1（Ｅとしてもまた公知）および E2（E2/NSIとしてもまた公知）を含む）をコードし、これによって本発明に関す る利用法を見出す（E1およびE2を含む、HCVタンパク質の議論について、Houghto nら、Hepatology（1991）14:381-388を参照のこと）。HDV由来のδ-抗原はまた 、本発明のVLPアジュバント系とともに使用され得る（例えば、δ-抗原の説明に ついて、米国特許第5,389,528号を参照のこと）。 同様に、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用となるウイルスの別の 例である。詳細には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質HAおよびNA は、免疫応答を生じさせることについて特に有益である。インフルエンザＡの多 くのHAサブタイプが同定されている（Kawaokaら、Virology（1990）179:759-767 ；Websterら、「Antigenic Variation among type A influenza viruses」127-16 8頁；P．Palese and D.W．Kingsbury(編)、Genetics of influenza viruses，Sp ringer-Verlag，New York）。従って、任意のこれらの抗原に対する免疫応答 は、それらが本発明のVLPアジュバントとともに投与される場合、増強され得る 。 VLPアジュバントと組み合わせて使用されるべき特に有用な他の抗原は、ヒト パピローマウイルス（HPV）由来の抗原およびその抗原に由来するポリペプチド （例えば、E6およびE7を含む、１つ以上の種々の早期タンパク質）、ダニ媒介性 脳炎ウイルス、HIV-1（HTLV-III、LAV、ARV、hTLRなどとしてもまた公知）由来 の抗原およびそれに由来するポリペプチドを含み、この抗原は、単離物HIVIIIb 、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMNに由来する抗原、例えばgp120、gp41、gp160 、gag、およびpolを含むが、それらに限定されない（例えば、種々のHIV単離物 のエンベロープ遺伝子配列の比較について、Myersら、Los Alamos Database，Lo s Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；Myersら、Hum an Retroviruses and Aids，1990，Los Alamos，New Mexico：Los Alamos Natio nal Laboratory;およびModrowら、J．Virol．(1987)61:570-578を参照のこと） 。 他のウイルスに由来するタンパク質はまた、本発明の方法における利用法を見 出し、そのタンパク質は、例えば、とりわけ以下を含むがそれらに限定されない ：Picornaviridae（例えば、ポリオウイルスなど）；Caliciviridae；Togavirid ae（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；Flaviviridae；Coronaviri dae；Reoviridae；Birnaviridae；Rhabodoviridae（例えば、狂犬病ウイルスな ど）；Filovlridae；Paramyxoviridae（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイル ス、RSウイルスなど）；Orthomyxoviridae（例えば、インフルエンザウイルスＡ 型、Ｂ型、およびＣ型など）；Bunyaviridae；Arenaviridae；Retroviridae（例 えば、HTLV-1;HTLV-II;HIV-1；HIV-2）；サル免疫不全ウイルス（SIV）のファミ リーのメンバー由来のタンパク質。例えば、これらのウイルスおよび他のウイル スの説明について、Virology、第３版（W.K．Joklik編、1988）；Fundamental V irology、第２版（B.N．FieldsおよびD.M．Knipe編、1991）を参照のこと）。 特に好ましい細菌抗原は、ジフテリア、破傷風、百日咳、髄膜炎、および他の 病原性状態を引き起こす生物に由来し、その抗原は、以下を含むがそれらに限定 されない：Corynebacterium diphtheriae、Clostridium tetani、Bordetella pe rtusis、Neisseria meningitidis（Meningococcus血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、およ びW135（MenA、B、C、Y、およびW135）を含む）、HaemophilusインフルエンザＢ 型（Hib）、およびHelicobacter pylori由来の抗原。寄生虫抗原の例は、マラリ アおよびライム病を引き起こす生物由来の抗原を含む。 上記の生物由来の抗原の組み合わせは、単一のワクチン中の複数の病原体に対 する免疫を誘発するために、簡便に使用され得る。例えば、特に好ましい組み合 わせは、細菌毒素に由来する非毒性変異体キャリア（例えば、CRM197として公知 のジフテリア毒素の非毒性変異体）に結合した、MenCおよびHib由来の細菌表面 オリゴサッカライドの組み合わせである。この結合は、細菌髄膜炎を予防するた めに有用であり、そして国際公開番号WO 96/14086（1996年５月17日公開）に記 載される。 さらに、本明細書中に記載の方法は、種々の悪性ガンを処置するための手段を 提供する。例えば、本発明の系を使用して、問題のガンに特異的な特定のタンパ ク質（例えば、活性化オンコジーン、胎児性抗原、または活性化マーカー）に対 する体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を増強し得る。そのような 腫瘍抗原は、とりわけ以下を含む：MAGE１、２、３、４などを含む、任意の種々 のMAGE（メラノーマ関連抗原Ｅ）(Boon，T．Scientifc American(1993年３月)： 82-89)；任意の種々のチロシナーゼ；MART 1（Ｔ細胞によって認識されるメラノ ーマ抗原）、変異体ras；変異体p53；p97メラノーマ抗原；CEA（癌胎児性抗原） 。 本発明を使用して、広範な種々の抗原に対する免疫応答を増加させ、それによ って大多数の疾患を処置または予防し得ることは容易に明白である。 先に説明したように、VLP処方物は、目的の１つ以上の抗原を含んでもよく、 含まなくてもよい。例えば、抗原は、同じ部位または異なる部位にてVLP組成物 から別々に投与され得る。任意の事象において、１つ以上の選択された抗原は、 抗原が投与される個体において免疫応答が生じさせられ得るように、「治療有効 量」で投与される。必要とされる正確な量は、とりわけ以下の因子に依存して変 化する：処置される被験体；処置されるべき被験体の年齢および全体的な状態； 抗体を合成し、そして/または細胞媒介性免疫応答を増加させる、被験体の免疫 系の能力；所望される防御の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の 抗原およびその投与形態。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る 。従って、「治療有効量」は、日常的な試行を通して決定され得る、比較的広い 範囲に落ち着く。一般に、抗原の「治療有効」量は、約0.1μg〜約1000μg、よ り好ましくは約１μg〜約100μgのオーダーの量である。 同様に、VLPアジュバントは、VLPアジュバントなしでの抗原単独の投与と比較 して、抗原が先に規定されるような「増強された免疫原性」を提示するような量 で存在する。増強された免疫応答を誘発するために有効である量は、当業者によ って容易に決定され得る。 組成物は、さらに、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」 （例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含み得る。さら に、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝剤などのような補助物質が、そのような ビヒクルに存在し得る。生物学的緩衝剤は、薬理学的に受容可能であり、そして アジュバント処方物に所望のpH（すなわち、薬理学的範囲のpH）を与える実質的 に任意の溶液であり得る。緩衝剤溶液の例は、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食 塩水、Tris緩衝化生理食塩水、Hank's緩衝化生理食塩水、イーグル最小必須培地 （「MEM」）などのような増殖培地などを含む。 抗原は、組成物を受ける個体に対して有害な抗体の産生を、それ自体では誘導 しない分子であるキャリアと、必要に応じて組み合わされる。適切なキャリアは 、代表的には、大きな徐々に代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッ カライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマー 、脂質凝集体（例えば、オイル性小滴またはリポソーム）、および不活性ウイル ス粒子である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらの キャリアは、さらなる免疫刺激剤として機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリ ア、破傷風、コレラなどに由来のトキソイドのような細菌トキソイドに結合され 得る。 本発明のVLPに加えて、コアジュバントはまた、薬学的組成物の有効性を増強 するために使用され得る。そのようなコアジュバントは、以下を含むが、それら に限定されない：(1)アルミニウム塩（alum）（例えば、水酸化アルミニウム、 リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；(2)水中油エマルジョン処方物 （これは、他の特定の免疫剌激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこ と）または細菌細胞壁成分を、含むまたは含まない）、例えば(a)Model 110Yミ クロフルイダイザ(microfluidizer)(Microfluidics，Newton，MA)のようなミク ロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方された、５％Squalene、0.5 ％Tween 80、および0.5％Span 85を含む（必ずしも必要ではないが、必要に応じ て種々の量のMTP-PEを含む（以下を参照のこと））を含む、MF59（国際公開番号 WO 90/14837、（ｂ）より大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するために、 サブミクロンエマルジョンにミクロフルイダイズされたか、またはボルテックス された、10％Squalane、0.4％Tween 80、５％プルロニックブロック化(pluronic -blocked)ポリマーL121、およびthr-MDP（以下を参照のこと）を含む、SAF、な らびに（ｃ）２％Squalene、0.2％Tween 80、およびモノホスホリピドＡ（MPL） 、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群からの１ つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはMPL＋CWS（DetoxTM）を含む、RibiTMアジ ュバント系（RAS）（Ribi Immunochem，Hamilton，MT)；（３）サポニンアジュ バント、例えば、StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)が使用さ れ得るか、またはそれから生成される粒子（例えば、ISCOM（免疫刺激複合体） ）；（４）フロイント完全アジュバント(CFA)およびフロイント不完全アジュバ ント(IFA)；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（IL-1、IL-2など ）、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など）；（６ ）粘膜アジュバント（例えば、コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)、E．coli熱不 安定性毒素(LT)、およびその変異体由来のアジュバント）（例えば、国際公開番 号WO 95/17211、WO 93/13202、およびWO 97/02348を参照のこと）；そして（７ ）組成物の有効性を増強する、免疫刺激剤として作用する他の物質。alumおよび MF59が好ましい。 ムラミルペプチドは、以下を含むが、それらに限定されない：N-アセチル-ム ラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル-ノルムラミル (normuramyl)-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L- アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセ ロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ(huydroxyphosphoryloxy））-エチルアミン(M TP-PE)など。 一旦処方されると、本発明の組成物は、非経口的、例えば、注射によって、投 与され得る。組成物は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注射 され得る。投与の他の態様は、経口および肺投与、坐剤、粘膜および経皮適用を 含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得 る。複数用量スケジュールは、ワクチン接種の主要な治療単位（course）が１〜 10の別々の用量、続いて、免疫応答を維持および／または増強するように選択し た、続く時間間隔で与えられる他の用量（例えば、第二の用量について１〜４ヶ 月で、および必要に応じて数ヵ月後に続きの用量）であり得る。投薬計画もまた 、少なくとも一部は、被験体の必要によって決定され、そして実施者の判断に依 存する。さらに、疾患の予防が所望される場合、ワクチンは一般に、目的の病原 体での一時感染の前に投与される。処置が所望される場合、例えば、症状または 再発の減少が所望される場合、ワクチンは、一般に、一次感染に続いて投与され る。 C.実験 以下は、本発明を行うための特定の実施態様の例である。実施例は、例示の目 的にのみ提供され、そしていかなる様式においても本発明の範囲を制限すること を意図するものではない。 使用した数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを確認する努力を行っ たが、いくつかの実験誤差および偏差は当然許容されるべきである。 実施例１ B型肝炎ウイルス(HBV)VLPおよびHaemophilus influenzae ｂ型（Hib）および ／またはHib/Meningococcal C(MenC)結合体を含むワクチンの乳児ヒヒにおける 免疫原性を評価するために、以下の研究を行った。 材料および方法 A.ワクチン 本研究で使用したHib/MenC結合体ワクチンおよびHib結合体ワクチンは、タン パク質キャリアCRM197に独立して結合体化したオリゴ糖を含み、そして国際公開 番号第WO 96／14086（1996年5月17日公開）に記載のように産生した。 使用したVLPは、組換えB型肝炎ウイルス（HBV）プレS2／S抗原であった。VLP を産生するために、Pre-S2/sAg遺伝子を発現ベクターに組込み、そしてこれを使 用して、DG44チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞（これはまた、dhfr遺伝子 でトランスフェクトされている）をトランスフェクトした。細胞の増殖およびHB V粒子の発現を本質的にMichelら、Bio/Technology（1985年6月）3：561-566およ びPatzerら、Bio/Technology（1986年7月）4：630-636に記載されるように実施 した。 コントロールワクチン処方物は、ミョウバンに吸着した酵母由来のHBV S抗原 を含んだ。 ワクチン接種の日に、複合多糖ワクチンおよびHBV VLP処方物をともに再構成 して、約５μgの用量の各糖、合計20μgのCRM197タンパク質、および2．5μgのH BV VLPを提供した。 B.ワクチン群 研究開始時に1．5〜４ヶ月齢の乳児ヒヒを、表１に示すように各5匹の動物の 群を割り当てた。 *N=6動物／群（研究開始時に1．5〜４月齢） 血液サンプルを各免疫の前に収集し、そして第三の免疫の２週間後に収集した。 結果 図１および２は、市販のE1A（Abbott）によって決定される場合、HBV VLPに対 する乳児ヒヒの血清抗体応答を示す。結果を、IU/mlで抗体濃度の相乗平均とし て、±95％C1、対数スケールで、HBV VLPを含むワクチンが与えられた４群につ いてを示す。 理解され得るように、MF59とともに与えられたHBV VLP単独は、高度に免疫原 性で、これは、単回注射後に100IU／mlより大きな、第二の注射後に1000IU/mlよ り大きな、および第三の注射後に100,000IU／mlより大きな、相乗平均力価を達 成した。 対照的に、ミョウバンとともに与えたコントロールワクチンは、はるかに低く 免疫原性であり、1回の注射には応答せず、そして実験ワクチンと比較して、第 二および第三の注射に対して10分の１の応答をした。示さないが、MenC/Hib結合 体ワクチンがVLPなしで与えられた第5群においては、検出可能な肝炎抗体応答は 存在しなかった。これらの結果は、健常成体における臨床実験において観察され たこれらの２つのワクチン間の免疫原性における差異に対応する。 HibまたはHib/MenC結合体の存在は、B型肝炎／MF59単独を受ける群の応答と比 較して、肝炎抗体応答を減少させた。このことは、第一または第二の注射後にお いて特に真実であった。しかし、MF59アジュバント化した組合せワクチンの第三 の注射後に、HBVに対するそれぞれの抗体応答はなお、コントロールワクチンで ワクチン接種した動物の応答より10倍高かった（相乗平均は49,000および38,000 IU／ml対コントロールHBVについて5000IU／ml）（p≦0.01）。 Hib結合体ワクチンに対する乳児ヒヒの血清抗莢膜抗体応答を、放射性抗原結 合アッセイを用いて決定した。図３および４は、μg／mlでの対数スケールで、M F59とともに与えられたHib/MenC、HBV/HibおよびM4F59、ならびにMF59をともな うHBV／Hib／MenC含むワクチンを与えられた３つの群についての相乗平均抗体濃 度を示す。 ３つすべての群は、Hibに対する強力な抗体応答を示した。興味深いことに、H BV VLPの存在は、Hib抗体応答を増加させるようであった。例えば、第三の注射 後に、相乗平均抗体濃度は、Hib/MenCおよびMFをともなうHBVに受ける群では、3 5μg／mlであり、対して、HBVなしでHib/MenC/MF59を受ける群については10.8μ g／mlであった。MenCなしのHBV/Hibに対するHib応答は、さらにより高かった（1 00μg／ml）。 MenC結合体ワクチンに対する乳児ヒヒの血清抗体応答もまた測定した。結果を 、図5Aおよび5Bに示す。図5Aは、ELISAによって決定されたIgG抗莢膜（capsular ）抗体応答を示す。図5Bは、補体媒介性の細菌抗体応答を示す。HBV VLPを含むM F59アジュバント化したMenC組合せワクチンに対する抗体応答は、MF59を伴うHib ／MenCワクチン単独を与えられた動物の応答と同等かまたはより高かった。これ は、ELISAによって決定されるIgG結合抗体、および殺菌アッセイで決定した抗体 機能活性の両方について真実であった。 表2に、すべての群についての第三の注射後の幾何的抗体応答をまとめる。理 解され得るように、ミョウバンに吸着させたコントロールワクチン、またはMF59 を伴う実験的HBV VLP調製物を与えた動物は、HBVに対してのみ応答した。さらに 、応答の大きさは、実験的MF59アジュバント化したワクチンに対して20倍を超え てより高かった。 HibまたはHibおよびMenCを含む２つの組合せワクチンに対するHBV抗体応答は 、HBV/MF59単独を与えた動物の応答のおよそ2分の１であった。それにもかかわ らず、それらはなお、コントロールワクチンで観察された応答よりも８〜10倍高 かった。すでに注記したように、HBV VLPを含む２つの組合せワクチンに対するH ib抗体応答は、HBV VLPなしでHib/MenC/MF59を与えた動物（群5）の応答よりも 高かった。 MenC結合体に関して、HBV VLPがIgG MenC抗体応答を増強し得るという証拠も もまた存在した。 *P=0.07：+P≦0.03 実施例２ 実験をまた、ヒトパピローマウイルス6b（HPV 6b）L1VLPおよびびHPV E7を含 むワクチンの免疫原性を評価するために、以下のようにウサギにおいて行った。 材料および方法 A.ワクチン 本研究のワクチンにおいて使用した組換えタンパク質を、記載のようにHPV 6b からクローニングした。Schwarz、EMBO J．(1983)2：2341-2348を参照のこと。 ウイルス様粒子（VLP）ワクチンは、粒子へと自己会合し、そしてイオン交換お よびゲル濾過クロマトグラフィーを介して精製したバキュロウイルス由来の後期 1（L1）タンパク質からなった。VLPは、サイズが約50nmであり、そしてHPVビリ オンに類似していた（Greer、J.Clin.Micro．(1995)33：2058-2063）。第二の ワクチンは、E.coli由来のEarly 7（E7）タンパク質からなった。 ワクチン接種の日に、ワクチンを、VLPワクチンが17μgのHPV 6 L1 VLPを含み 、一方でE7ワクチン用量が50μgのE7を含み、そしてL1/E7組合せワクチン用量が 17μgのVLPおよび50μgのE7を含むように調製した。すべてのワクチンの合計容 量は、0.5mlであり、そして0.25mlは、MF59コアジュバントであった。 B.ワクチン群 若い成体雌性ニュージーランド白色ウサギを、表３に示すように、３つの可能 な群（１群当たり20匹）の１つに割り当てた。動物は、VLP、E7、またはL1また はＥ７の組合せのいずれかを含むワクチンを受けた。 C.免疫化および採血スケジュール ウサギに、０、３、および６週目の間に筋肉内（後肢）ワクチン接種を与えた 。血液サンプルを、０、４、５、７、および８週目の間に収集した。 D.抗原特異的抗体応答の決定 抗体応答を、抗原特異的ELISAを用いて測定した。力価を、光学密度0.5をもた らす希釈にて各血清について決定した。結果 E7およびL111抗原についてのウサギ血清力価の結果を、図６にまとめる。対数 スケールで提示した結果は、群についての抗体力価の相加平均である。MF59ワク チ ンを伴うE7単独から生成された抗体力価は、第二のおよび第三のワクチン接種後 のVLPよりも有意に低かった（313対106,000；p<0.0001；および1,400対65,000； p<0.0001）。しかし、E7/VLP組合せによって生成された抗E7平均力価は、MF59を 伴うE7単独と比較した場合、組合せE7/L1ワクチン（およびMF59）を注射した動 物において増加したようであった（825対313；1,567対1,363）。さらに、E7/L1 の力価の中央値は、５％レベルで5週目および8週目に有意に高かった（それぞれ 、p値は0.0018および0.0125）。さらに、非応答動物の数は、E7/L1について、E7 についてより統計学的に有意に低かった（p値0.023、フィッシャーの完全検定（ exact test））。 データは、MF59を伴うVLP単独が高度に免疫原性であって、これは、第一の注 射後に482、ならびに第二および第三の注射後に106,000および65,000の力価をも たらした。しかし、第二の免疫後の組合せVLP/E7ワクチン群についての抗VLP平 均力価は減少し（106,000対89,000）、そして３免疫後は有意に減少した（65,00 0対35,000；p=0.001）。 従って、新規のVLPアジュバント組成物およびこれを使用しそして作製するた めの方法が開示される。本発明の好ましい実施態様をいくらか詳細に記載したが 、添付の請求の範囲によって規定されるような明らかな改変が本発明の精神およ び範囲を逸脱せずになされ得ることが理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 グリアー，キャサリン イー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608, エミリービル，ホートン ストリート ア ール440 4560，カイロン コーポレイシ ョン内 (72)発明者 バン ネスト，ガリー エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608, エミリービル，ホートン ストリート ア ール440 4560，カイロン コーポレイシ ョン内

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ウイルス様粒子（VLP）アジュバント、選択された抗原、および薬学的に受 容可能な賦形剤を含むワクチン組成物であって、該選択された抗原が該VLPとは 異なる、ワクチン組成物。 ２．さらにコアジュバントを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。 ３．前記コアジュバントがMF59を含む、請求項２に記載のワクチン組成物。 ４．前記VLPが、肝炎表面抗原の１つ以上の粒子形成ポリペプチドから形成され る、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。 ５．前記粒子形成ポリペプチドが、sAg、pre-S1、およびpre-S2からなる群から 選択される少なくとも１つの肝炎表面抗原である、請求項４に記載のワクチン組 成物。 ６．前記VLPが、sAgおよびpre-S2から形成される、請求項５に記載のワクチン組 成物。 ７．前記VLPが、パピローマウイルスL1および/またはL2の粒子形成ポリペプチド から形成される、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。 ８．前記選択された抗原が、MenC/Hibオリゴ糖結合体である、請求項１〜７のい ずれかに記載のワクチン組成物。 ９．前記選択された抗原がHPV E7である、請求項１〜７のいずれかに記載のワク チン組成物。 １０．脊椎動物被験体における増強された免疫応答を産生するのに有用な組成物 の製造のための、ウイルス様粒子（VLP）アジュバントおよび該VLPとは異なる選 択された抗原の、使用。 １１．前記VLPが、肝炎表面抗原の１つ以上の粒子形成ポリペプチドから形成さ れる、請求項１０に記載の使用。 １２．前記粒子形成ポリペプチドが、sAg、pre-S1、およびpre-S2からなる群か ら選択される少なくとも１つの肝炎表面抗原である、請求項１１に記載の使用。 １３．前記VLPが、sAgおよびpre-S2から形成される、請求項１２に記載の使用。 １４．前記VLPが、パピローマウイルスL1および/またはL2の粒子形成ポリペプチ ドから形成される、請求項１０に記載の使用。 １５．前記選択された抗原が、MenC/Hibオリゴ糖結合体である、請求項１０〜１ ４のいずれかに記載の使用。 １６．前記選択された抗原がHPV E7である、請求項１０〜１４のいずれかに記載 の使用。 １７．アジュバント処方物を調製する方法であって、ウイルス様粒子（VLP）を 提供する工程、およびVLPを薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせる工程を包 含する、方法。 １８．選択された抗原を、該VLPおよび該薬学的に受容可能な賦形剤とを組み合 わせる工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
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