JP2002508662A

JP2002508662A - Catalytic subunit of human telomerase and its diagnostic and therapeutic use

Info

Publication number: JP2002508662A
Application number: JP50368599A
Authority: JP
Inventors: ハゲン，グスタフ; ジークムンド，ハンス−ウルリヒ; バイヘル，バルター; ビツク，マレザ; ツボフ，ドミトリ
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2002-03-19
Also published as: CA2294646A1; AU745420B2; EP0990037A2; WO1998059040A3; AU8214998A; WO1998059040A2

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトテロメラーゼの触媒サブユニットをコードするヌクレオチド配列及びそれから推定されるタンパク質配列に関する。さらに、本発明は、特に癌及び老化の処置における、この遺伝子／タンパク質の製薬学的、診断的または治療的使用を含む方法に関する。 (57) Abstract The present invention relates to nucleotide sequences encoding the catalytic subunit of human telomerase and protein sequences deduced therefrom. Furthermore, the present invention relates to methods involving the pharmaceutical, diagnostic or therapeutic use of this gene / protein, especially in the treatment of cancer and aging.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトテロメラーゼの触媒サブユニット並びにその診断的及び治療的使用染色体末端の構造及び機能真核細胞の遺伝物質は直線状染色体上に分散している。これらの遺伝単位の末端はギリシャ語のテロス（ｔｅｌｏｓ）（末端）及びメロス（ｍｅｒｏｓ）（部分またはセグメント）に由来してテロメアと呼ばれる。大部分のテロメアは主にチミン及びグアニンから構成される短い配列の反復からなる（Ｚａｋｉａｎ、１９９５）。同族の生物のテロメア配列はしばしば類似し、そしてこれらの配列は系統的により遠い種間でさえ保存されている。これまで調べられている全ての脊椎動物においてテロメアが配列ＴＴＡＧＧＧから構成されることは注目に値する（Ｍｅｙｎｅ等、１９８９）。テロメアは様々な重要な機能を発揮する。それらは染色体の融合（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ、１９４１）及びその結果として二動原体性遺伝単位の形成を防ぐ。２個の動原体を保有するこの種類の染色体は、ヘテロ接合性の喪失または遺伝子の重複もしくは損失のために癌の発生を導く可能性がある。さらに、テロメアは損傷を受けた遺伝単位と損なわれていない遺伝単位を識別する目的を満たす。例えば、酵母細胞はテロメアを欠いた染色体を保有すると分裂するのをやめた（Ｓａｎｄｅｌｌ及びＺａｋｉａｎ、１９９３）。テロメアは真核細胞におけるＤＮＡ複製と関係して別の重要な任務を果たす。原核生物の環状ゲノムと異なり、ＤＮＡポリメラーゼ複合体は真核生物の直線状染色体を完全に複製することができない。ＤＮＡ複製を開始するためにはＲＮＡプライマーが必要とされる。ＲＮＡプライマーが除かれ、岡崎フラグメントが伸長され、次に連結された後、その時点でＲＮＡプライマーをＤＮＡで置き換えることができないので、新しく合成されたＤＮＡ鎖は５ ’末端を欠いている。こういう理由で、特別な保護機構がないと染色体は細胞分裂毎に短くなる（「末端複製問題」、Ｈａｒｌｅｙ等、１９９０）。非コーディングテロメア配列はおそらく遺伝子の損失を防ぐための緩衝地帯に相当する（Ｓａｎｄｅｌｌ及びＺａｋｉａｎ、１９９３）。その上、テロメアは細胞老化を調節することにおいても重要な役割を果たす（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ、１９７３）。ヒト体細胞は培養時に限られた複製能力を示し；ある期間の後にそれらは老化するようになる。この状態で、細胞は増殖因子で刺激された後でさえもはや***せず；しかしながら、それらは死なないが、代謝的に活性のままである（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、１９９０）。細胞がそのテロメアの長さからそれがどのくらいなお***できるかを決定するという仮説は様々な報告により裏付けられる（Ａｌｌｓｏｐｐ等、１９９２）。従って、要約すると、テロメアは細胞の老化及び遺伝物質の安定化及び癌の予防において中心的役割を有する。酵素テロメラーゼはテロメアを合成する上記にように、直線状染色体を保有する生物は特別な保護機構なしではそれらのゲノムを不完全にしか複製できない。大部分の真核生物はテロメア配列を再生するために特別な酵素、すなわち、テロメラーゼを用いる。テロメラーゼはこれまで調べられている単細胞生物では構成的に発現される。それに反して、ヒトでは、テロメラーゼ活性は生殖細胞及び腫瘍細胞においてのみ検出され、一方、近くにある体細胞組織はいかなるテロメラーゼも含まなかった（Ｋｉｍ等、１９９４）。絨毛虫におけるテロメラーゼテロメアのように、テロメラーゼは絨毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）において最初に同定された。ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰの存在下で一本鎖オリゴヌクレオチドｄ（ＴＴＧＧＧＧ）₄ を伸長することによりテロメラーゼ活性が検出された（Ｇｒｅｉｄｅｒ及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ、１９８５）。この反応では、テトラヒメナテロメア配列ＴＴＧＧＧＧがプライマーに繰り返し付加された。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の不規則なテロメア配列、Ｔ（Ｇ）_1-3を有するオリゴヌクレオチドを出発材料として与えた場合でさえ、テロメラーゼはテトラヒメナのテロメア配列でプライマーを伸長した（Ｇｒｅｉｄｅｒ及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ、１９８５）。これらの結果から、テロメラーゼ自体がテロメアの配列の鋳型を保有すると結論が下された。いったんテロメラーゼ中のＲＮＡ成分の存在が最初に示されると（Ｇｒｅｉｄｅｒ及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ、１９８７）、しばらくしてからテロメラーゼのＲＮＡサブユニットの遺伝子がクローン化された（Ｇｒｅｉｄｅｒ及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ、１９８９）。このＲＮＡはテトラヒメナテロメア配列に相補的な領域（以下「相補的領域」と称する）を含む。ＲＮＡを消化し、それにより続いて活性の喪失が導かれることにより示されるように、テロメラーゼの活性はＲＮＡ成分に依存した。テロメラーゼＲＮＡの相補的領域を突然変異させる場合、対応する突然変異がテトラヒメナテロメア中にインビボで取り込まれた（Ｙｕ等、１９９０）。従って、テロメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの種類に属する。１９９５年にテトラヒメナテロメラーゼの最初のタンパク質サブユニット、すなわち、ｐ８０及びｐ９５が同定された（Ｃｏｌｌｉｎｓ等、１９９５）。ｐ９５は酵素をＤＮＡに固定し、そしてｐ８０はＲＮＡ成分に結合するという報告により以下のモデルが導かれた：テロメラーゼＲＮＡはその相補的領域により一本鎖３’突出にアニーリングする。３’突出は対応するヌクレオチドを５’−３’ 方向に取り込むことにより伸長される。テロメアの新生合成はおそらく延長工程及び転座工程を含む。いったんテロメア配列が合成されると、おそらくテロメラーゼはそれが再び完全なテロメア配列を付加することができる位置にくるまでＤＮＡに沿って動く。酵素がテロメアから解離する前に付加するヌクレオチドの数に関して異なる種のテロメラーゼ間で大きな差があるので（Ｐｒｏｗｓｅ等、１９９３）、このモデルは一般的に妥当でなくてもよい。これに加えて、最近、他の生物からのテロメラーゼサブユニットも同定されている。テトラヒメナテロメラーゼタンパク質といかなる相同性も示さない２つのタンパク質サブユニット、すなわち、ｐ１２３及びｐ４３が絨毛虫ユプロテス・アエジクラタス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓａｅｄｉｃｕｌａｔｕｓ）において見いだされている。テロメラーゼサブユニットｐ１２３はそのＮ末端に塩基性ドメイン及びＣ末端に逆転写酵素（ＲＴ）のドメインを示し、このタンパク質が触媒機能を有することが示唆される（Ｌｉｎｇｎｅｒ等、１９９７）。さらに、ｐ１２３はＬｕｎｄｂｌａｄにより見いだされたサッカロミセス・セレビシエタンパク質Ｅｓｔ２と著しい相同性を共有することが報告されている（Ｌｉｎｇｎｅｒ等、１９９７）。ｐ８０及びｐ９５はこれまでテロメラーゼ活性に必須のいかなる機能も保有することが示されていないが、可能性がある触媒テロメラーゼサブユニットｐ１２３／ｅｓｔ２ｐは重要な機能を有することが明白に示されており：ｅｓｔ２ｐＲＴの活性中心の突然変異は酵母細胞においてテロメアの著しい欠失をもたらした（Ｌｉｎｇｎｅｒ等、１９９７）。哺乳類細胞からのテロメラーゼ成分様々な生物、とりわけ、サッカロミセス・セレビシエ、マウス及びヒト（Ｓｉｎｇｅｒ及びＧｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ、１９９４；Ｂｌａｓｃｏ等、１９９６；Ｆｅｎｇ等、１９９５）のテロメラーゼのＲＮＡ成分が今までにクローン化されている。これまでに知られている全てのテロメラーゼＲＮＡは特定の生物のテロメア配列に相補的な領域を含んでなる。しかしながら、ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）の一次配列は絨毛虫またはサッカロミセス・セレビシエのＲＮＡ成分にいかなる類似性も示さない。一方、ヒト及びマウステロメラーゼＲＮＡ間で保存されている領域がある（Ｆｅｎｇ等、１９９５）。最近、ヒトテロメラーゼ関連タンパク質（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）（ｈＴＰ１）の単離が記述されている（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、１９９７）。テトラヒメナテロメラーゼｐ８０サブユニットとの相同性に基づいて、公共利用できないＥＳＴデータベースにおいて対応する遺伝子が見いだされた（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、１９９７）。ｈＴＰ１は２６２７アミノ酸からなり、Ｎ末端において、ｐ８０と多くても４６％の相同性を有する３個のドメインを示す。おそらくタンパク質／タンパク質相互作用をもたらす、アミノ酸トリプトファン及びアスパラギンの１６反復が、Ｃ末端領域中にさらなる構造要素として存在することが示された。ヒト腫瘍におけるテロメラーゼの活性化ヒトでは、本来、生殖細胞においてのみテロメラーゼ活性を示すことができ、正常な体細胞ではできなかった（Ｈａｓｔｉｅ等、１９９０；Ｋｉｍ等、１９９４）。より高感度の検出方法が開発された（Ｋｉｍ等、１９９４）後、低レベルのテロメラーゼ活性が造血細胞においても検出された（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ等、１９９５；Ｃｏｕｎｔｅｒ等、１９９５；Ｈｉｙａｍａ等、１９９５）。しかしながら、これらの細胞はそれにもかかわらずテロメアの減少を示した（Ｖａｚｉｒｉ等、１９９４；Ｃｏｕｎｔｅｒ等、１９９５）。これらの細胞における酵素の量がテロメア損失を補うために不十分であるかどうかまたは測定されたテロメラーゼ活性が例えば不完全に分化したＣＤ３４⁺３８⁺前駆細胞の副次集団に由来するかどうか（Ｈｉｙａｍａ等、１９９５）はまだ明らかにされていない。この点を明らかにするためには、単一の細胞中に存在するテロメラーゼ活性を検出することが必要である。しかしながら、全く興味深いことに、これまでに試験されている多数の腫瘍組織において著しいテロメラーゼ活性が検出されており（１７３４／２０３１、８５％；Ｓｈａｙ、１９９７）、一方、正常な体細胞組織では活性は見いだされていない（１／１９６、＜１％；Ｓｈａｙ、１９９７）。さらに、様々な研究により、ウイルス癌タンパク質で形質転換された老化細胞においてテロメアが減少し続けること及び増殖危機を切り抜けた副次集団においてのみテロメラーゼを確認できることが示された（Ｃｏｕｎｔｅｒ等、１９９２）。また、テロメアもこれらの不死化細胞において安定であった（Ｃｏｕｎｔｅｒ等、１９９２）。マウスにおける研究から得られた同様な結果（Ｂｌａｓｃｏ等、１９９６）により、テロメラーゼの再活性化が腫瘍発生の後期事象であるという仮定が裏付けられる。これらの結果に基づいて、テロメア配列の損失及び細胞老化をテロメラーゼ活性及び癌の発生に連結する「テロメラーゼ仮説」が示された。ヒトのような長寿の種では、テロメアの減少を腫瘍抑制機構とみなすことができる。いかなるテロメラーゼも含有しない分化した細胞は、テロメアが特定の長さに達すると***するのをやめる。そのような細胞が突然変異する場合、細胞がそのテロメアを伸長できる場合にのみそれから腫瘍が発生することができる。そうでなければ、細胞はその染色体が不安定になるまでテロメア配列を失い続け、最後に死ぬ。テロメラーゼの再活性化はおそらく腫瘍細胞がそれらのテロメアを安定させるために配備する主要な機構である。これらの報告及び認識から、テロメラーゼ活性を抑えることに基づく腫瘍の治療を開発することが可能であるはずである。細胞***抑制剤または短波照射を用いる通常の癌治療は、腫瘍細胞に損傷を与えることに加えて体の中の全ての*** する細胞に損傷を与える。しかしながら、腫瘍細胞以外に著しいテロメラーゼ活性を含有するのは生殖系細胞だけであるので、テロメラーゼインヒビターは腫瘍細胞をより特異的に攻撃し、従って、引き起こされる有害な副作用がより少ない。テロメラーゼ活性はこれまでに試験された全ての腫瘍組織において検出されているので、これらの治療薬を全ての型の癌に対して用いることが可能である。その場合、ゲノムが不安定になる程度に細胞のテロメアが短くなった時にテロメラーゼインヒビターの作用は起こる。通常、腫瘍細胞は正常な体細胞より短いテロメアを示すので、テロメラーゼインヒビターによりまず第一に除かれるのは癌細胞である。それに反して、生殖細胞のような、長いテロメアを保有する細胞はかなり後の段階まで損傷を受けない。従って、テロメラーゼインヒビターは癌治療を前進させる方法である。しかしながら、酵素のタンパク質構造もそれらの機能と共に同定されており、そして各種テロメア結合タンパク質のより深い理解が得られている場合にのみ、生理学的テロメラーゼインヒビターの性質及び攻撃点に関する問題に対して明白な答えを与えることができる。本発明は、必要な場合精製された形態の、触媒的に活性のあるヒトテロメラーゼサブュニット（ｐｈＴＣ）、そのタンパク質の活性部分、モジュレーター、特にそのタンパク質のアゴニスト、そのタンパク質の機能をまねる物質及びこれらの成分の組み合わせに関する。本発明はさらに以下のことに関する。 - ヒトタンパク質ｐｈＴＣをコードする核酸配列、具体的には： - ｈＴＣ遺伝子のゲノム配列、 - ｈＴＣ遺伝子のｃＤＮＡ配列、 - ｈＴＣ変異体のＤＮＡ配列、 - ｈＴＣ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列、 - 図１に示されるｈＴＣのＤＮＡ配列（配列番号１）を初めとする、上記の配列の一部。 - 他の哺乳類においてｈＴＣに相同なタンパク質をコードする核酸配列、具体的には： - ｈＴＣに相同な遺伝子のゲノム配列、 - ｈＴＣに相同な遺伝子のｃＤＮＡ配列、 - ｈＴＣに相同な遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列、 - 上記の配列の一部。 - ヒト及び他の哺乳類において、ｐｈＴＣタンパク質に関連するタンパク質をコードする核酸配列、具体的には： - ヒト及び他の哺乳類におけるｈＴＣ関連遺伝子のゲノム配列、 - ヒト及び他の哺乳類におけるｈＴＣ関連遺伝子のｃＤＮＡ配列、 - ヒト及び他の哺乳類におけるｈＴＣ関連遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列、 - 上記の配列の一部。 - 哺乳類細胞から単離される、上記のｐｈＴＣタンパク質（すなわち、図２及び配列番号２）。 - 検出試薬で標識されるｐｈＴＣタンパク質であって、検出試薬は好ましくは酵素、放射性標識元素または蛍光化学薬品である。 - ｐｈＴＣタンパク質に対して誘導される抗体。好ましい態様として、この抗体はポリクローナル抗体である。別の好ましい態様として、この抗体はモノクローナル抗体である。例えば、抗体を製造するために有効なｐｈＴＣポリペプチドまたはそのフラグメントの量を実質的に免疫適格である宿主に注入し、続いてこの抗体を単離することにより、この特質の抗体を製造することができる。さらに、モノクローナル抗体を産生する不死化した細胞系をそれ自体既知の方法で得ることができる。必要な場合、抗体を検出試薬で標識することができる。また、完全な抗体の代わりに適切な特異的結合特性を保有するフラグメントを用いることもできる。そのような検出試薬の好ましい例は酵素、放射性標識元素、蛍光化学薬品またはビオチンである。 - 上記のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの１０から５００ヌクレオチドまでの長さの連続した配列に同一であるかまたは全く相補的な配列を有する精製された形態のオリゴヌクレオチド。この特質のオリゴヌクレオチドは特にオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。ｈＴＣｍＲＮＡに結合した場合にテロメラーゼの活性を阻害するか、抑えるかまたは妨げるオリゴリボヌクレオチドが好ましい。 - 必要な場合、図１のＤＮＡ配列または標準的なハイブリダイゼーション条件下で先に挙げたＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列を含んでなる、ｐｈＴＣタンパク質またはこのタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはこの配列の縮重変異体。 - ｐｈＴＣまたはｐｈＴＣのフラグメントをコードするＤＮＡ配列またはこの配列の縮重変異体を含んでなる組み換えＤＮＡ分子であって、前述の配列は好ましくは図１のＤＮＡ配列を含んでなるか、または標準的なハイブリダイゼーション条件下で先に挙げたＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列を含んでなる。上記の組み換えＤＮＡ分子において、記述されたＤＮＡは好ましくは発現制御配列に連結される。特に好ましい発現制御配列の例はＳＶ４０ウイルスまたはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λファージの主オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター及び酵母α−接合因子プロモーターである。 - ｐｈＴＣタンパク質またはこのタンパク質の一部をコードするＤＮＡ配列またはこの配列の縮重変異体を含んでなる上記の組み換えＤＮＡ分子で形質転換されている単一細胞宿主。この組み換えＤＮＡ分子において、該ＤＮＡ配列は発現制御配列に連結されている。単一細胞宿主の好ましい例は：細胞培養のエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞並びに哺乳類細胞である。 - 先に記述したＤＮＡ分子またはこの分子の誘導体もしくはフラグメントのいずれかで形質転換される組み換えウイルス。 - 転写単位からなる外来ポリヌクレオチドを細胞中に導入する、ヒト細胞、好ましくは腫瘍性細胞におけるテロメラーゼ活性の抑制方法。この転写単位は少なくとも２９個の連続したヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含んでなり、その配列はｈＴＣＲＮＡ配列に実質的に同一であるかまたは実質的に相補的であり、そして該細胞において連結されたポリヌクレオチドの転写を制御する異種起源の転写調節配列に連結されている。好ましくは、上記の異種起源の転写調節配列はヒト細胞において構成的に活性のあるプロモーターを含んでなる。あるいはまた、異種起源の転写調節配列は調節物質を添加することによりヒト細胞において誘導するかまたは抑制することができるプロモーターを含んでなることができる。そのようなプロモーターの例は誘導性及び抑制性テトラサイクリン依存性プロモーター、熱ショックプロモーター及び金属イオン依存性プロモーターである。上記の外来ポリヌクレオチドは例えばヒトｈＴＣＤＮＡ成分からの転写単位を含有するウイルスゲノムであってもよい。特に好ましくは、該転写単位はヒトｈＴＣＲＮＡ成分に実質的に相補的なアンチセンスＲＮＡを生成する。また、図１の配列を含んでなることができる外来ポリヌクレオチドも特に好ましい。 - ヒト疾病の遺伝子治療のためのポリヌクレオチド。このポリヌクレオチドは少なくとも９個の連続したヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含んでなる転写単位からなり、その配列はｈＴＣＲＮＡ配列に実質的に同一であるかまたは実質的に相補的であり、そして該細胞において連結されたポリヌクレオチドの転写を制御する異種起源の転写調節配列に連結されている。 - 患者におけるテロメラーゼ関連疾患の検出方法であって、その方法は以下の工程：Ａ．診断値を得るために体液または細胞サンプル中のｐｈＴＣタンパク質を検出し；Ｂ．試験サンプルと同じ型の標準化した正常な細胞または体液中のｐｈＴＣタンパク質の標準値と診断値を比較し；Ｃ．標準比較値より高いまたは低い、そして病原性疾患も表すテロメラーゼ関連疾患を示す診断値を検出する、を含んでなる。好ましくは、患者における腫瘍性疾患を検出するためにこの方法を用いる。その場合、方法は以下の工程：Ａ．診断値を得るために細胞サンプル中のｐｈＴＣタンパク質を検出し；Ｂ．試験サンプルと同じ型の非腫瘍性細胞中のｐｈＴＣタンパク質の標準値と診断値を比較し；Ｃ．標準比較値より明らかに高い診断値は腫瘍性疾患を示す、を含んでなる。 - 細胞または細胞サンプル中のｐｈＴＣタンパク質の存在の決定方法であって、その方法はｈＴＣポリヌクレオチドを増幅することまたはｈＴＣポリヌクレオチドとｈＴＣポリヌクレオチド、プライマーもしくはｈＴＣに相補的な配列をハイブリダイズさせることに基づく。 - 細胞サンプル及び体液中のｐｈＴＣを検出するための試験キットであって、例えば、標識した免疫化学的に反応性の成分が：ｐｈＴＣに対するポリクローナル抗体、ｐｈＴＣに対するモノクローナル抗体、これらの抗体のフラグメントまたはこれらの成分の混合物であってもよい。 - ヒトにおける細胞障害もしくは破壊及び／または機能不全及び／または他の症状の予防及び／または処置方法であって、その方法は触媒的に活性のあるヒトテロメラーゼ、その機能的同等物またはその触媒的に活性のあるフラグメントの治療的に有効な量を投与することに基づく。また、ｐｈＴＣの生産及び／または活性を増進する物質；ｐｈＴＣの活性をまねることができる物質；ｐｈＴＣの生産及び／または活性を抑えることができる物質またはこれらの物質の混合物を用いることも考えることができる。また、特異的結合相手を用いてもよい。好ましくは、老化または癌疾患を予防または処置するためにその方法を用いる。ｐｈＴＣの活性に影響を与える、すなわち、抑制するかまたは増進することができる物質は本明細書においてモジュレーターと呼ばれる。そのようなモジュレーターはテロメラーゼアッセイにおいてテロメラーゼ活性に対するそれらの影響を試験することによりそれ自体既知の方法で見いだすことができる。テロメラーゼアッセイの例は実施例１５に示される。ｐｈＴＣのモジュレーターはテロメラーゼと関連する疾病を処置するために重要である。これに関連して特に老化過程または癌疾患の予防または処置を挙げることができる。 - ｈＴＣｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸であって、その核酸は該ｍＲＮＡとハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなり、アンチセンス核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。好ましくは、アンチセンス核酸は特定のｍＲＮＡの開始コドンに結合する。 - 転写中にｈＴＣｍＲＮＡに対するアンチセンスリボ核酸が生産されるＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ分子。この該アンチセンスリボ核酸は該ｈＴＣｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸配列を含んでなる。この組み換えＤＮＡ分子でｐｈＴＣ産生細胞系をトランスフェクトすることによりｐｈＴＣの減少した発現を有する細胞系を調製するためにこの特質のＤＮＡ分子を用いることができる。 - ｈＴＣｍＲＮＡを切断するリボザイム。このリボザイムは好ましくはテトラヒメナ型リボザイムまたはハンマーヘッド型リボザイムである。 - 転写によりこの特質のリボザイムの生産がもたらされるＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ分子。ｐｈＴＣ産生細胞系をトランスフェクトするためにこの組み換えＤＮＡ分子を用いることができる。 - 好ましくはヒトｈＴＣｍＲＮＡの配列に一致するかまたはこの配列に相補的な配列からなるプライマーと、１対のヒトｈＴＣポリヌクレオチドＰＣＲプライマーからなる組み合わせ。 - 好ましくはヒトｈＴＣ遺伝子の配列に一致するかまたはこの配列に相補的な少なくとも２９個の連続したヌクレオチドを含んでなるプローブと、ヒトｈＴＣ遺伝子のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含んでなる組み合わせ。 - インビボでテロメラーゼ／テロメア調節を調べるために用いることができる動物モデル。従って、例えば、腫瘍発生及び老化をノックアウト動物またはトランスジェニック動物を用いて直接調べることができる。タンパク質またはペプチドの場合、機能的同等物は、アミノ酸配列に関して区別できるが本質的に同じ機能を有する化合物である。これらの化合物の既知の例はイソ酵素またはタンパク質のいわゆる微小不均一性体である。オリゴ核酸またはポリ核酸の場合、機能的同等物は、ヌクレオチド配列が異なるが、同じタンパク質をコードする化合物であると理解される。そのような化合物の存在は、例えば、遺伝暗号が縮重していることに起因する可能性がある。図面の説明：図１：ヒトテロメラーゼの触媒サブユニット（ｈＴＣ）のｃＤＮＡ配列（配列番号１）。図２：図１に示されるｈＴＣＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）。図１に示されるＤＮＡ配列を位置６４から位置３４６１までアミノ酸配列に完全に翻訳することができる。アミノ酸残基をそれらの１文字コードにより示す。図３：異なるように処置されたＡＡ２８１２９６ＤＮＡを含有する臭化エチジウム染色したアガロースゲル。図は臭化エチジウム染色した０．８％アガロースゲルを示す。２つの異なるＤＮＡサイズ基準をレーン１及び８に添加し、３、２、０．５及び０．４ｋｂのＤＮＡフラグメント長を示す。ｐＴ７Ｔ３Ｄ中のＡＡ２８１２９６ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ（レーン３）、ＰｓｔＩ（レーン６）及びＸｈｏＩ（レーン７）で消化した。ｐＴ７Ｔ３Ｄ中の未消化のＡＡ２８１２９６ＤＮＡをレーン２に添加した。ｐＴ７Ｔ３Ｄ中のｈＴＣｃＤＮＡとプライマー１（５’ＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣ３’）及び４（５’ＣＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＧＣＴＣＧＧＣＣ３’）［レーン４］並びにプライマー６（５’ＧＣＴＣＧＴＡＧＴＴＧＡＧＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧ３’）及び７（５’ＧＣＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧ３’）［レーン５］でのＰＣＲ混合物（９４℃で１分、６０℃で２分、７２℃で３分）の１／１０をレーン４及び５に添加した。図４：ユプロテスｐ１２３（ｐ１２３）及びヒト（ｐｈＴＣ）触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質配列の比較からの詳細。この図に示されるＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムソフトウェア（Ｄｎａｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いるＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質比較の条件（Ｋｔｕｐｌｅ、ｇａｐペナルティー及びｇａｐ長ペナルティー）を挙げる。アミノ酸残基をそれらの１文字コードにより示す。また、ユプロテス・アエジクラタスｐ１２３及び同定されたＥＳＴ₊₁の間で同じアミノ酸も１文字コードから対応する文字を用いて強調する。同じではないが、機能が類似するかまたは匹敵するアミノ酸を：で表す。図５：ユプロテスｐ１２３（ｐ１２３）及び酵母（ｅｓｔ２ｐ）の触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質配列の比較の一部。この図に示されるＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムソフトウェア（Ｄｎａｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いるＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質比較の条件（Ｋｔｕｐｌｅ、ｇａｐペナルティー及びｇａｐ長ペナルティー）を挙げる。アミノ酸残基をそれらの１文字コードにより示す。同様に、ユプロテス・アエジクラタスｐ１２３及び酵母ｅｓｔ２ｐの間で同じアミノ酸を１文字コードからの対応する文字により際立たせる。同じではないが、機能が類似するかまたは匹敵するアミノ酸を：で表す。図６：酵母（ｅｓｔ２ｐ）及びヒト（ｐｈＴＣ）触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質配列の比較からの詳細。この図に示されるＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムソフトウェア（Ｄｎａｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いるＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質比較の条件（Ｋｔｕｐｌｅ、ｇａｐペナルティー及びｇａｐ長ペナルティー）を挙げる。アミノ酸残基をそれらの１文字コードにより示す。また、酵母ｅｓｔ２ｐ及び同定されたＥＳＴ₊₁の間で同じアミノ酸も１文字コードから対応する文字を用いて強調する。同じではないが、機能が類似するかまたは匹敵するアミノ酸を：で表す。図７：ユプロテスｐ１２３（ｐ１２３）、酵母（ｅｓｔ２ｐ）及びヒト（ｐｈＴＣ）触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質配列の比較からの詳細。標準条件下でＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムソフトウェア（Ｄｎａｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のＣｌｕｓｔａｌ法サブプログラムを用いてユプロテスｐ１２３（ｐ１２３）、酵母（ｅｓｔ２ｐ）及びヒト（ｐｈＴＣ）の間の図５に示される比較を実施した。アミノ酸残基をそれらの１文字コードにより示す。また、酵母ｅｓｔ２ｐ、ユプロテス・アエジクラタスｐ１２３及び同定されたＥＳＴ₊₁の間で同じアミノ酸も１文字コードから対応する文字を用いて強調する。さらに、３つ全てのタンパク質間で同じ領域をタンパク質配列の上に薄灰色の棒で表す。図８：実施例６から生成されたＤＮＡ配列（ＲＡＣＥラウンド１）（配列番号３）。図９：実施例６から生成されたＤＮＡ配列（ＲＡＣＥラウンド２）（配列番号４）。図１０：実施例６から生成されたＤＮＡ配列（ＲＡＣＥラウンド３）（配列番号５）。図１１：実施例８から生成されたＤＮＡ配列（ＲＡＣＥラウンド３）（配列番号６）。図１２：完全なｈＴＣｃＤＮＡ配列のクローニングの略図。開始及び終止コドンの位置を矢印で表す。長方形の黒色領域はタンパク質をコードする配列部分を表し、一方、淡灰色領域は５’及び３’非翻訳ｃＤＮＡ領域を表し、そして／またはイントロン配列を表す。全長ｃＤＮＡの長方形の濃灰色ブロックはテロメラーゼ特異的モチーフ（Ｔ）または７個の逆転写酵素モチーフ（番号１−７）のいずれかを表す。完全なｈＴＣｃＤＮＡを調製するために必要とされるＤＮＡフラグメントを同様に長方形として表し、それらの起源で表す。全ての長方形をそれらの相対的な位置に配置する。長方形ＡＡ２６１２９６により示されるｃＤＮＡフラグメントは実施例２において記述される。このフラグメント中の１８２ｂｐの欠失（実施例２参照）の相対的な位置は長方形中の隙間により示される。長方形ＲＡＣＥ１、ＲＡＣＥ２及びＲＡＣＥ３により示されるＤＮＡフラグメントの起源は実施例６において記述される。Ｃ５Ｆフラグメント長方形により示されるＤＮＡフラグメントの起源は実施例７において記述される。ｌａｍｂｄａ１２長方形により示されるＤＮＡフラグメントの起源は実施例９において記述される。ｈＴＣに関係のないｃＤＮＡをコードするｌａｍｂｄａ１２ＤＮＡフラグメントの３’部分（実施例９参照）はこの図に示されない。この図に示されるｌａｍｂｄａ１２及びＣ５ＦＤＮＡフラグメントを用いて５’及び３’スプラィス部位で完全なｈＴＣ−ｃＤＮＡ配列を一緒に連結した（実施例７参照）。これらのスプライス部位は様々なフラグメント（ＲＡＣＥ１、ＲＡＣＥ３、ｌａｍｂｄａ１２及びＣ５Ｆ）において同定された。図１３：ユプロテス及びヒト（ｈＴＣ）の触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質配列の比較からの詳細な断片。図はユプロテス及びヒト（ｈＴＣ）の触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質配列の比較からの断片を示す。四角に囲んだ領域中の逆転写酵素モチーフに注意を喚起する。囲みの下の数字は図２におけるそれぞれのアミノ酸位置をさす。アミノ酸残基をそれらの１文字コードにより示す。同一のアミノ酸をボールド体でしるす。逆転写酵素モチーフの共通配列（ＲＴ共通）において、ｈは疎水性アミノ酸を表し、そしてｐは極性アミノ酸を表す。これらの群のアミノ酸がユプロテス及びｈＴＣアミノ酸配列において保持される場合、ｐ及び／またはｈをボールド体でしるす。非常に高度に保存されるアミノ酸に灰色で下張りする。ＲＴ３では、さらなる相同アミノ酸を含むために四角で囲んだ領域を広げる。テロメラーゼ特異的モチーフは実施例９において記述される。図１４：実施例１１から生成されたＤＮＡ配列（３’バージョン）（配列番号７）。図１に示されるＤＮＡ配列と相同でない領域をボールド体で目立たせる。図１５：癌細胞系及び正常ヒト組織におけるｈＴＣ発現。図Ａ：異なるヒト細胞系からの約２μｇのポリ−Ａ⁺ＲＮＡを製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の説明書に従ってノーザンブロット上に固定した。具体的には、ＲＮＡは黒色腫（Ｇ３６１）、肺癌（Ａ５４９）、結腸の腺癌（ＳＷ４８０）、ラジ（Ｒａｊｉ）バーキットリンパ腫、白血病細胞系（ＭＯＬＴ−４）、慢性白血病細胞系（Ｋ−５６２）、子宮頸部腫瘍（ＨｅＬａ）及び白血病細胞系ＨＬ６０に由来した。４．４ｋｂ、６ｋｂ及び９．５ｋｂで示される転写産物はｈＴＣに特異的である（実施例１０参照）。図Ｂ：異なるヒト組織からの約２μｇのポリ− Ａ⁺ＲＮＡを製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の説明書に従ってノーザンブロット上に固定した。具体的には、ＲＮＡを心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び膵臓から単離した。ＲＮＡサイズ基準を示す。図１６：ヒトテロメラーゼアミノ酸配列からのペプチドに対するウサギ血清のウェスタンブロット分析（実施例１２）。各場合で、実施例１３からの２０μｌのバクテリアライセートを実施例１２からの抗血清を用いてウェスタンブロット（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）において分析した。ｐＭＡＬＥＳＴ構築物を保有するバクテリアからのライセートをレーン１、２、６及び７に添加した。ｐＭＡＬＡ１構築物を保有するバクテリアからのライセートをレーン３、４、８及び９に添加した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）で誘導しなかったバクテリアからのライセートをレーン１、３、６及び８に添加した。ＩＰＴＧで誘導したバクテリアからのライセートをレーン２、４、７及び９に添加した。基準サイズマーカー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの１０ｋＤａタンパク質ラダー、カタログ番号１００６４−０１２）をレーン５に添加した。５０ｋＤａ及び１２０ｋＤａのバンドを膜の端に示す。レーン１〜４を含む図ＡのＰＶＤＦ膜をペプチドＢに対する免疫前血清とインキュベートした（実施例１２参照）。レーン６〜９を含む図ＡのＰＶＤＦ膜をペプチドＣに対する免疫前血清とインキュベートした（実施例１２参照）。レーン１〜４を含む図ＢのＰＶＤＦ膜をペプチドＢに対する免疫血清とインキュベートした（実施例１２参照）。レーン６〜９を含む図ＢのＰＶＤＦ膜をペプチドＣに対する免疫血清とインキュベートした（実施例１２参照）。図１７：³⁵Ｓで標識され、インビトロで翻訳されたタンパク質のオートラジオグラム。完全なインビトロで翻訳されたｈＴＣ（実施例１５参照）をレーン１に添加した。ｐｈＴＣのＣ末端欠失型をレーン２に添加した。レーン３は製造業者により供給されたインビトロ翻訳の陽性コントロールを示す（実施例１５参照）。タンパク質の大きさを見積もるためのタンパク質サイズ基準を右側に示す。図１８：ＴＲＡＰアッセイからの³²Ｐで標識された生成物のオートラジオグラム（実施例１５を参照）。酵素またはタンパク質を添加しないＴＲＡＰアッセイ混合物を陰性コントロールとしてレーン１及び２に添加した。ＨｅＬａ細胞から部分的に精製されたヒトテロメラーゼを含有するＴＲＡＰアッセイ混合物を陽性コントロールとしてレーン３及び４に添加した。インビトロで翻訳されたｐｈＴＣを含有するＴＲＡＰアッセイ混合物を希釈せずにレーン５及び６に添加した。インビトロで翻訳されたｐｈＴＣを含有するＴＲＡＰアッセイ混合物を１：４希釈でレーン７及び８に添加した。インビトロで翻訳されたｐｈＴＣを含有するＴＲＡＰアッセイ混合物を１：１６の希釈でレーン９及び１０に添加した。インビトロで翻訳されたルシフェラーゼを含有するＴＲＡＰアッセイ混合物を陰性コントロールとしてレーン１１及び１２に添加した。図１９：直接テロメラーゼアッセイからの³²Ｐで標識された生成物のオートラジオグラム（実施例１５参照）。放射性標識された１０ｂｐマーカーをレーン１に添加した。５’放射性標識されたテロメアオリゴヌクレオチド（［ＴＴＡＧＧＧ］₃）をレーン２に添加した。レーン３は空のレーンである。ＨｅＬａ細胞から部分的に精製されたヒトテロメラーゼを直接アッセイに用い、合成生成物を陽性コントロールとしてレーン４に添加した。実施例１５からのインビトロで翻訳されたｐｈＴＣを直接アッセイに用い、合成生成物をレーン５に添加した。実施例実施例１現在、ヒトゲノムの５％未満が実際に転写され、タンパク質に翻訳されることが認められている。ゲノムが完全にシークエンスされる前でさえ、ヒト細胞中の約６０，０００−７０，０００遺伝子に関する重要な情報を得ることが、特別な方法でゲノムのこれらのコーディング部分を調べることにより可能である。ここ１０ないし１５年の間の高処理量ＤＮＡシークエンシング技術の自動化により、広く異なる起源のプラスミドｃＤＮＡライブラリーから多数のｃＤＮＡを集め、そして各場合で５’または３’末端をシークエンスすることが可能になっている。典型的に３００から４００ｂｐまでの長さのものであるこれらの短いＤＮＡ配列は発現配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ）または略してＥＳＴと呼ばれ、様々な専門データベース中に蓄積される。ＥＳＴアプローチは最初にＯｋｕｂｏ等（１９９２）により記述され、そしてＡｄａｍｓ等（１９９２）により大規模に移された。現在、約５０，０００のヒト細胞遺伝子が部分的にシークエンスされ、ＥＳＴ登録として記録されている。既知の遺伝子のＤＮＡ及びアミノ酸配列と比較することにより、関連するがこれまで知られていない遺伝子をこれらのＥＳＴデータベースにおいて同定することが可能である（Ｇｅｒｈｏｌｄ及びＣａｓｋｅｙ、１９９６）。ｔＢＬＡＳＴｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０）はこの目的のために特に有用であると分かっている検索アルゴリズムである。このアルゴリズムはＥＳＴデータベース中のあらゆるＤＮＡクローンを６つ全ての可能な読み枠で翻訳し、これらのアミノ酸配列を既知のタンパク質配列と比較する。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＥＳＴデータベースをユプロテス・アエジクラタス触媒テロメラーゼサブユニットｐ１２３（Ｌｉｎｇｎｅｒ等、１９９７）の最近公開されたタンパク質配列で検索した。これは読み枠＋１でｐ１２３と著しい相同性を示すと同定される受託番号ＡＡ２８１２９６を有するヒトＥＳＴをもたらした。読み枠＋１のこのアミノ酸配列を以下Ｅｓｔ₊₁ と称する。ｐ１２３とＥｓｔ₊₁の間の相同性は３０アミノ酸離れている２つの配列領域において最も顕著である。ｐ１２３のアミノ酸４３８からアミノ酸４８４までにわたる長い方の配列領域はＥｓｔ₊₁の対応する領域と３８％同一である。類似したアミノ酸も考慮に入れる場合、一致は実に５９％である。相同性の第二のブロックはｐ１２３タンパク質のアミノ酸５１３からアミノ酸５３０までにわたり、同定されたＥｓｔ₊₁の対応する配列セグメントと４４％の同一性を示す。類似した特性を有するアミノ酸残基を考慮すると６１％の一致が得られる。Ｐ（確率）値はＢＬＡＳＴ検索を評価するための重要なパラメーターである。Ｐは任意の配列を用いてＢＬＡＳＴ検索において特定のセグメント対を同様に見いだす確率を表し、０（非常に有意な結果）ないし１（有意でない結果）の間で数字上変わる。従って、例えば、ＮＣＢＩＥＳＴデータベースと酵母からのｐ１２３同等物（ｅｓｔ２ｐ）の比較は否定的な結果を与え：見いだされたＥＳＴはＰ＝１の確率であった（表１）。一方、公共利用できないＥＳＴデータベースにおいて見いだされたヒトテロメラーゼ関連タンパク質１（ｈＴＰ１）（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ等、１９９７）はＰ＝０．００４の確率を与える。表１：異なる既知の遺伝子を用いた３つのｔＢｌａｓｔｎ検索試験の比較ｐ１２３との比較により同定されたヒトＥＳＴＡＡ２８１２９６はＰ＝３．５ｘ１０^-6の確率を有する。これらのデータは同定されたＥＳＴがおそらくヒトテロメラーゼの触媒サブユニットのフラグメントをコードすることを示唆する。こういう理由で、対応する遺伝子を以下ｈＴＣ（ヒトテロメラーゼ、触媒（ｈｕｍａｎＴｅｌｏｍｅｒａｓｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃ））と略し、そして推定されるタンパク質をｐｈＴＣと略す。実施例２ｐ１２３との比較により同定されたＥＳＴは１９９７年４月２日にＥＳＴデータベースに入れられ、いかなる雑誌にも公開されていない。国立バイオテクノロジー情報センターから得られた情報により、このＥＳＴクローンを含むｃＤＮＡライブラリーを以下のように調製した：扁桃腺の胚中心からｍＲＮＡを調製した後、ｃＤＮＡ合成を実施し、二本鎖ｃＤＮＡフラグメントをベクターｐＴ７Ｔ３Ｄ−Ｐａｃ中にＮｃｏｌ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を用いて配向してクローン化した。ＥＳＴデータベースに入れられていた３８９ｂｐをＡｍｅｒｓｈａｍにより供給される−２８ｍ１３ｒｅｖ２プライマーを用いてシークエンスした（ＤＮＡ配列、図１の位置１６８５〜２０７３を参照）。ヒト遺伝暗号に従ってＥＳＴＡＡ２８１２９６のＤＮＡ配列を翻訳するためにＬａｓｅｒｇｅｎｅプログラムソフトウエア（ＤｎａｓｔａｒＩｎｃ．）を用いた。得られたアミノ酸配列（Ｅｓｔ₊₁）は図２の位置５４２〜６７０に相当する。Ｅｓｔ₊₁の推定されるタンパク質配列は２７個の塩基性、１１個の酸性、５１個の疎水性及び２８個の極性アミノ酸残基を含む１２９アミノ酸からなる。実施例１において同定されたＥＳＴ（ＡＡ２８１２９６）をエシェリキア・コリに形質転換されたプラスミドの形態でＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から商業的に入手し、実験で分析した：図３に示される臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルにおいて示されるように、調製したプラスミドＤＮＡを制限消化に供した後、約２．２ｋｂの大きさのＥＳＴＡＡ２８１２９６からのフラグメントがベクターｐＴ７Ｔ３Ｄから遊離される。同時に実施し、特定の内部プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＥＳＴＡＡ２８１２９６を調べ：予想されるＰＣＲ産物の長さは３２５及び３８０ｂｐであり、実験で認められたフラグメントの長さ（すなわち、図３のレーン４及び５）と一致する。従って、これはＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）により供給されたエシェリキア・コリクローンが同定されたＥＳＴをプラスミドとして保有することを示す。ＤＮＡを調製した後、二本鎖シークエンシングにより全部で２１７６ｂｐのインサートを同定した。クローンＡＡ２８１２９６及びＣ５Ｆフラグメント（実施例７参照）のＤＮＡ配列の比較により、１８２ｂｐの欠失（位置２３５２〜２５３３、図１）があり、その結果としてオープンリーディングフレームがこの領域で失われていることが示された。要約すると、クローンＡＡ２８１２９６のＤＮＡ配列は図１に示される配列情報（位置１６８５〜２３５１及び位置２５３４〜４０４２）から構成される。実施例３ｔＢＬＡＳＴｎ比較はｐ１２３とＥＳＴ₊₁の間で最大に一致する領域（ｐ１２３のアミノ酸４３８−５３０）のみを同定し、一方、介在するアミノ酸は考慮されない。より広い領域にわたってタンパク質配列の関連性について結論を引き出すことができるようにＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質比較を実施した（ｐ１２３のアミノ酸４３７−５５４）（図４参照）。これを実施した場合、３４％のアミノ酸が同一であると認められ、一方、５９％のアミノ酸が同一であるかまたは生化学的に類似すると認められた。この結果は、これらのタンパク質の関連性がｔＢＬＡＳＴｎプラグラムを用いて見いだされた相同性領域の外側にも続くことを示す。最近報告されているように（Ｌｉｎｇｎｅｒ等、１９７７）、ユプロテス・アエジクラタスｐ１２３及びサッカロミセス・セレビシエｅｓｔ２ｐは相互に相同である。ｐ１２３とｅｓｔ２ｐの間の類似の程度をｐ１２３と本明細書に記述されるＥｓｔ₊₁の間の相同性に関連づけるために、同じパラメーターを用いてＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎタンパク質比較を利用してｐ１２３の上記の領域（アミノ酸４３７−５５４）をｅｓｔ２ｐとも比較した。これにより、この選択領域において、ｐ１２３とｅｓｔ２ｐが２１％同一であり、そしてそれらのアミノ酸残基の２２％が同一であるかまたは生化学的に類似することが示された（図５参照）。従って、Ｅｓｈ₊₁とユプロテスｐ１２３の間の相同性はｐ１２３とｅｓｔ２ｐの間より著しく高い。実施例４Ｅｓｔ₊₁及びｅｓｔ２ｐとｐ１２３の相同性は、３つ全てのタンパク質が同じタンパク質ファミリーに属することを示唆する。この仮定を確かめるために、実施例３において記述された条件下でｅｓｔ２ｐをＥｓｔ₊₁と比較した（図６参照）。これにより、Ｅｓｔ₊₁がｅｓｔ２ｐに２０％同一であり、すなわち、ｅｓｔ２ｐに対するｐ１２３のものに匹敵する程度の相同性を示すことが明らかにされた。また、この比較的低いレベルの一致は、ｅｓｔ２ｐを用いたｔＢＬＡＳＴｎ検索において有意なＥＳＴが同定されなかったことも裏付ける（実施例１参照）。実施例５異なる種由来の触媒テロメラーゼサブユニットからなるタンパク質ファミリーに重要であるおそらく機能的なドメインを同定するためにｐ１２３、ｅｓｔ２ｐ及びｐｈＴＣを用いてコンピューター比較を実施した（図７参照）。この分析において、３つ全てのタンパク質に存在する２つの領域が特に顕著である（図７参照）。現在、ｐ１２３のアミノ酸４４７〜４６０（図１３、テロメラーゼモチーフ）に相当する領域に対していかなる明白な機能も特定することができない。ジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）ウィスコンシン配列分析パッケージ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ）を用いるモチーフ検索及びタンパク質データベース（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、８．６．１９９７のバージョン）における検索はいかなる重要な洞察も与えなかった。一方、ｐ１２３のアミノ酸５１２−５２６に相当する、ｐ１２３、ｅｓｔ２ｐ及びｐｈＴＣの間で相同なもう１つの領域は、逆転写酵素（ＲＴ）の共通モチーフを示す（図７及び１３）。Ｌｉｎｇｎｅｒ等（１９９７）はｐ１２３／ｅｓｔ２ｐが全部で６個のそのようなＲＴモチーフを含有し、それらがｐ１２３／ｅｓｔ２ｐの触媒機能のために必須であることを示した。図７及び１３に示されるように、調べられているｐｈＴＣの配列中にも２個のそのようなＲＴモチーフが保存されている。これらのモチーフはｐ１２３／ｅｓｔ２において最もＮ末端に位置するＲＴモチーフである（Ｌｉｎｇｎｅｒ等、１９９７）。逆転写酵素の一次配列は非常に異なり；数個のアミノ酸のみが別のモチーフ内で完全に保存される（Ｐｏｃｈ等、１９８９並びにＸｉｏｎｇ及びＥｉｃｋｂｕｓｈ、１９９０）。さらに、保存されるＲＴモチーフ間で異なる距離を有するために、レトロウイルスまたは長い末端反復配列（ＬＴＲ）レトロポゾンによりコードされる逆転写酵素は非ＬＴＲレトロポゾンまたはグループII型イントロンによりコードされる逆転写酵素と異なる（Ｘｉｏｎｇ及びＥｉｃｋｂｕｓｈ、１９９０）。ＲＴモチーフの構造に基づき、ｐ１２３、ｅｓｔ２ｐ及びｐｈＴＣは後者のＲＴ群に特定される。興味深いことに、これに関連して、ｐｈＴＣのＲＴモチーフの共通配列は仮定されるＲＴ共通モチーフに最もよく対応し；２つのＲＴモチーフ内の８個のアミノ酸残基のうち、ｐｈＴＣの場合には６個が存在し、一方、ｐ１２３及びｅｓｔ２ｐの場合には５個のみが存在する（図７及び１３）。これに関連して特にロイシン及びイソロイシンのような疎水性アミノ酸並びにアミノ酸リシン及びアルギニンが特定の位置にあることが顕著である（図７及び１３）。要約すると、本明細書により、ｐ１２３との相同性により同定されたＡＡ２８１２９６クローンがヒトテロメラーゼの触媒サブユニットのフラグメントであることを記述的レベルで示すことができた。実施例６ｈＴＣ−ｃＤＮＡの５’末端をクローニングするために、実施例８において記述される相同性スクリーニングに加えて３連続ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）反応を実施した。ヒト白血病細胞系Ｋ５６２またはヒト精巣組織からのＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をｃＤＮＡ源として用いた。個々のＲＡＣＥラウンドの実行及び得られた結果を以下に記述する。これに加えて、ＰＣＲにより連続したｃＤＮＡクローンから個々のフラグメントを増幅するためにＲＡＣＥラウンドにおいて得られた配列情報を用いた。ＲＡＣＥラウンド１：５０μｌの最終容量で、１０ｐｍｏｌのｄＮＴＰ−ミックスを５μｌのＫ５６２Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから、カタログ番号７４４１−１）に添加し、１ｘＫｌｅｎＴａｑＰＣＲ反応バッファー及び１ｘＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）中でＰＣＲ反応を実施した。ｈＴＣ−ＥＳＴクローンの５’領域からの１０ｐｍｏｌの内側の遺伝子特異的プライマーＧＳＰ２（５’−ＧＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧ−３’）及び１０ｐｍｏｌのＭａｒａｔｈｏｎアダプタープライマーＡＰ１（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）をプライマーとして添加した。ＰＣＲを４段階で実施した。９４℃で１分の変性後、次に、９４℃で３０秒間変性させ、続いて７２℃で４分間プライマーをアニーリングさせ、そしてＤＮＡ鎖を伸長させる５サイクルを実施した。次に、ＤＮＡを９４℃ で３０秒間変性させるが、次のプライマー伸長を７０℃で４分間行う５サイクルを続けた。最後に、３０秒のＤＮＡ変性後、プライマーアニーリング及び鎖伸長を６８℃で４分間行う２２サイクルを実施した。このＰＣＲ後、ＰＣＲ産物を１：５０に希釈した。この希釈物の５μｌを１ｘ１０ＫｌｅｎＴａｑＰＣＲ反応バッファー及び１ｘＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス中の１０ｐｍｏｌのｄＮＴＰ−ミックス並びに１０ｐｍｏｌのプライマーＧＳＰ２及び１０ｐｍｏｌの「ネスティッド」ＭａｒａｔｈｏｎアダプタープライマーＡＰ２（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）と一緒に２回目の「ネスティッド」ＰＣＲに用いた。ＰＣＲ条件は１回目のＰＣＲにおいて選択したパラメーターに相当する。唯一の例外として、最後のＰＣＲ段階で２２サイクルの代わりに１６サイクルのみを選択した。このネスティッドＲＡＣＥＰＣＲの産物として１１５３ｂｐの長さのＤＮＡフラグメントが得られた。このフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１中にクローン化し、完全な二本鎖シークエンシングに供した（図８及び配列番号３）。ヌクレオチド９７４〜１１５３は図１に示されるｈＴＣ−ｃＤＮＡのヌクレオチド領域１６２９〜１８０８に相当する。図１に示されるｈＴＣ−ｃＤＮＡ配列といかなる相同性も示さないｂｐ１からｂｐ９７３までにわたるヌクレオチド領域は、ｈＴＣ遺伝子のイントロン配列に相当する（データは示されない）。３’ スプライス共通配列がエキソン−イントロン移行部に位置する。イントロン配列の存在はｃＤＮＡ合成の出発材料として不完全にスプライスされたｍＲＮＡを用いたためである可能性がある。また、ｃＤＮＡ中のゲノムＤＮＡ混入も、見いだされるイントロン配列の説明である可能性がある。ＲＡＣＥラウンド２：第一のＲＡＣＥラウンドで得られた配列データに基づいて、ＲＡＣＥ産物１の５’領域からの遺伝子特異的プライマーＧＳＰ５（５’−ＧＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧ−３’）及びＡＰ１プライマーを用いて第二のＲＡＣＥを実施した。ヒト精巣からのＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから；カタログ番号７４１４− １）をｃＤＮＡ源として用いた。ＲＡＣＥラウンド１における１回目のＰＣＲと同じＰＣＲ条件を選択した。また、ＲＡＣＥラウンド２においても、１回目のＰＣＲの後に、希釈したＰＣＲ産物をｃＤＮＡ源として用いて２回目の「ネスティッド」ＰＣＲを続けた。ＲＡＣＥ産物１の５’領域からの遺伝子特異的プライマーＧＳＰ６（５’−ＧＧＣＡＣＡＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＡＴＧＧ −３’）及びＡＰ２プライマーを「ネスティッド」ＰＣＲプライマーとして用いた。条件はＲＡＣＥラウンド１からのネスティッドＰＣＲのパラメーターに相当した。ＲＡＣＥラウンド２のネスティッドＰＣＲからの４１２ｂｐの長さのＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＡクローニングベクターｐＣＲII−Ｔｏｐｏ中にクローン化し、完全にシークエンスした（図９及び配列番号４）。ｂｐ２６７からｂｐ４１２までの配列セグメントはＲＡＣＥ１からの産物の５’領域と完全に相同である。ｂｐ１からｂｐ２６６までの領域はＲＡＣＥ産物１を５’末端でのばす。このＲＡＣＥ産物２はおそらく全部ｈＴＣ遺伝子のイントロン領域である（データは示されない）。ＲＡＣＥラウンド３：第三のＲＡＣＥはさらに５’方向に位置するｈＴＣ−ｃＤＮＡ領域の同定をもたらした。ＲＡＣＥラウンド２からの配列結果に基づいて、遺伝子特異的プライマーＧＳＰ９（５’−ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣ−３ ’）をＲＡＣＥ産物２の５’領域から選択し、ＡＰ１プライマー及びヒト精巣からのＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）と一緒に新しいＲＡＣＥで用いた。ＲＡＣＥ条件はＲＡＣＥ１及び２の１回目のＰＣＲに用いたものと同じであった。ＲＡＣＥ産物２の５’領域からの遺伝子特異的プライマーＧＳＰ１０（５’−ＣＧＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＧＧ−３’）及びＡＰ２を用いて、ラウンド１及び２の「ネスティッド」ＰＣＲに従って、続いて行われる「ネスティッド」ＲＡＣＥにおいて、１０１２ｂｐの長さのフラグメント（図１０及び配列番号５）が増幅され、それをＴＡクローニングベクターｐＣＲII−ＴＯＰＯ中にクローン化した。続くシークエンシングにより、このＲＡＣＥフラグメントの３’領域（ｂｐ８１７−ｂｐ１０１２）が明白にｈＴＣ遺伝子のイントロン配列をなお示すことが明らかにされた。ｂｐ８８９からｂｐ１０１２までの領域はＲＡＣＥ産物２の５’領域と完全に相同である。一方、ｂｐ１からｂｐ８１６までのこのフラグメントの５’領域は図１に示されるｈＴＣ−ｃＤＮＡのｂｐ８１４−ｂｐ１６２９領域と同一である。可能性がある５’スプライス共通配列がエキソン−イントロン移行部に位置する。実施例７ＲＡＣＥ２及びクローンＡＡ２８１２９６から得られた配列情報から連続したフラグメントをクローン化するためにＰＣＲを実施した。ヒト精巣からのＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから；カタログ番号７４１４−１）をｃＤＮＡ源として用いた。ＰＣＲ混合物はＲＡＣＥ１に記述したとおりであったが（実施例６参照）、ＲＡＣＥ２の５’領域からのプライマーＣ５Ｆ（５’−ＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＧＧＴＧＡＴＣＴＣＴＧＣＣ−３’）及びクローンＡＡ２８１２９６の３’末端からのプライマーＣ３Ｂ（５’−ＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’）を用いた。ＰＣＲを２段階で実施した。９４℃で１分の変性後、次に、９４℃で３０秒間変性させ、その後、６８℃で４分間、プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡ鎖を伸長させる３６サイクルを実施した。以下Ｃ５Ｆフラグメントと称する２４８６ｂｐの長さのＤＮＡフラグメントがこのＰＣＲの産物として得られた。このフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＡクローニングベクターｐＣＲII−ＴＯＰＯ中にクローン化し、完全な二本鎖シークエンシングに供した。Ｃ５ＦフラグメントとＡＡ２８１２９６クローンのＤＮＡ配列の比較により、ＲＴモチーフ３とＲＴモチーフ４の間に１８２ｂｐのインフレーム挿入（位置２３５２〜２５３３、図１）があることが示された。３ＲＡＣＥラウンドからの配列とＣ５ＦフラグメントのＤＮＡのさらなる比較により、ＲＡＣＥ２においてすでに同定されたイントロンがＣ５Ｆの３’末端に存在することが明らかにされた。３’スプライス共通配列がエキソン−イントロン移行部に位置する。要約すると、Ｃ５ＦフラグメントのＤＮＡ配列は従って図９に示される配列情報（位置６４〜２７８）及び図１に示される配列データ（位置１６３６〜３９０８）からなる。実施例８ｈＴＣ−ｃＤＮＡの５’末端をクローニングするために、実施例６において記述したＲＡＣＥプロトコルに加えて相同性スクリーニング（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）を実施した。ヒト白血病細胞系Ｋ５６２からのヒト赤白血病５’−ストレッチプラス（ｓｔｒｅｔｃｈｐｌｕｓ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから、カタログ番号ＨＬ５０１６ｂ）をｃＤＮＡ源として用いた。このランダム及びオリゴ−ｄＴでプライミングされたライブラリーの約３ｘ１０⁶Ｐｆｕを平板培養し、Ａｕｓｕｂｅｌ等（１９８７）中に記述されたようにスクリーニングに用いた。７１９ｂｐの長さの放射性標識したｈＴＣ−ＤＮＡフラグメント（図１の位置１６８５〜２４０４に相当する）をプローブとして用いた。同じｈＴＣプローブでの再スクリーニング後、２０個の推定上陽性のλクローンからλクローン１２を陽性と確認した。プラーク精製及びλＤＮＡ調製（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）後、４ｋｂのインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に再クローン化し、シークエンスした（図１１及び配列番号６）。ＲＡＣＥクローンの配列及びクローンＡＡ２８１２９６のＤＮＡ配列とλクローン１２配列の比較により、相同性スクリーニングにおいて同定されたこのクローンがｈＴＣ−ｃＤＮＡの５’部分をコードし、そして図１の位置６３の推定上のＡＴＧ開始コドンを保有することが示された。このＡＴＧの５’に同じ読み枠の終止コドンはない。続く配列分析により、λクローン１２がおそらく位置１６５６から２００４までのイントロンを含むことが明らかにされる。非常によく保存された５’及び３’スプライス部位はこの仮説を裏付ける。ｈＴＣ−ｃＤＮＡをコードする配列は次に位置２００５から位置２３８２まで続く。λクローン１２の２３８３から３’末端までの配列は読み枠−４のはっきりと分かるオープンリーディングフレームを示す。対応するＤＮＡ配列の生物情報科学分析により、約４００ｂｐにわたって、この読み枠がｈＴＣｃＤＮＡと関係のない様々なＥＳＴと同一であることが示された。従って、λクローン１２は本質的にｈＴＣ−ｃＤＮＡの５’末端及び未知の機能の別のｃＤＮＡクローンからなるキメラクローンである。ＲＡＣＥ産物及び相同性スクリーニングの相対的配置を示す概略の要約を図１２に示す。λクローン１２（図１１の位置２１〜１６５５）、Ｃ５ＦＰＣＲ産物（図１の位置１６３６〜３９０８）及びＥＳＴＡＡ２８１２９６（図１の位置３９０９〜４０４２）からｈＴＣ−ｃＤＮＡの完全な配列（図１）を組み立てた。実施例９逆転写酵素共通配列（Ｐｏｃｈ等、１９８９、Ｘｉｏｎｇ及びＥｉｃｋｂｕｓｈ、１９９０）とｐｈＴＣタンパク質配列（図２及び配列番号２）を比較することにより全部で７個の逆転写酵素モチーフ（ＲＴモチーフ）を同定した（図１３）。これらのモチーフ内で、いくつかのアミノ酸はＲＴ共通配列とｐｈＴＣの間だけでなくユプロテステロメラーゼタンパク質との比較においても高度に保存されている。従って、例えば、２個のアスパラギン酸（図２の位置８６８及び８６９）はＲＴモチーフ５において完全に保存されている（図１３）。他の逆転写酵素から推定されたＲＴモチーフ７（Ｐｏｃｈ等、１９８９、Ｘｉｏｎｇ及びＥｉｃｋｂｕｓｈ、１９９０）はヒト触媒テロメラーゼサブユニットにおいてのみ示され、ユプロテスタンパク質では示されなかった（図１３）。テロメラーゼタンパク質においてのみ見いだすことができ、他の逆転写酵素では見いだすことができない構造的特徴も顕著である。テロメラーゼモチーフ（図２の位置５５３及び５６５）はいかなる以前に知られているタンパク質にも存在しないので、それはこのタンパク質ファミリーに特異的な構造である。触媒テロメラーゼタンパク質においてのみ同定されているさらなる特徴はＲＴモチーフ３と４の間の距離であり、１０７アミノ酸のその距離は他のＲＴより著しく大きい。これらの特徴は異なる種からのテロメラーゼの触媒サブユニットがおそらくＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの別の亜群を構成することを示す。実施例１０テロメラーゼＲＮＡサブユニット（ｈＴＲ）の発現はテロメラーゼ活性と相関せず、代わりに遍在的に認められる（Ｆｅｎｇ等、１９９５）。従って、触媒テロメラーゼサブユニットの発現がテロメラーゼ活性と関係するかどうかに関して問題が生じる。ｈＴＣ発現のレベルを分析するためにノーザンブロット実験（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）を実施した。正常なヒト組織からの多数のＲＮＡ調製物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから；カタログ番号７７６０−１）またはヒト癌細胞系からのＲＮＡサンプル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから；カタログ番号７７５７−１）で市販されているノーザンブロットを準備した。７１９ｂｐの長さの放射性標識したｈＴＣＤＮＡフラグメント（図１の位置１６８５〜２４０４）をプローブとして用いた。製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の説明書に従って膜をプローブとインキュベートした。プローブと交差ハイブリダイズする、約９．５ｋｂ及び４．４ｋｂの大きさの２つの主要なＲＮＡ転写産物並びに約６ｋｂのさらなるＲＮＡ転写産物が試験した８つのヒト細胞系（３つの白血病細胞系、３つの癌細胞系、１つの黒色腫及び１つのリンパ腫）において検出された（図１５、図Ａ）。比較すると、ｈＴＣｍＲＮＡは白血病細胞系Ｋ−５６２及びＨＬ−６０において最も強く発現された（図１５、図Ａ）。それに反して、試験した正常な組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び膵臓）ではｈＴＣ転写産物を検出することができなかった（図１５、図Ｂ）。これらの組織ではテロメラーゼ活性も検出することができなかったので（Ｋｉｍ等、１９９４）この結果は意外ではない。これらのデータは、ｈＴＣ発現の誘導が腫瘍発生中にテロメラーゼを活性化することに重要な役割を果たすことを示す。実施例１１様々なｃＤＮＡライブラリー（ヒト白血病細胞系Ｋ５６２及びヒト精巣からのＣｌｏｎｔｅｃｈＭａｒａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ並びにヒト前骨髄性白血病細胞系ＨＬ６０からのｃＤＮＡ）からのｈＴＣｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅に供した場合、大きさが相互にほんのわずか異なるいくつかのＰＣＲ産物がいつも得られた。異なるｈＴＣ−ＰＣＲ産物間の違いを解明するために、プライマーＣ５Ａ（５’−ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧＣ−３’）及びＣ３Ｂ（５’−ＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’）を用いてｂｐ１７８３からｂｐ３９０１までにわたる図１に示されるｈＴＣｃＤＮＡのフラグメントを増幅した。Ｋ５６２白血病細胞からのＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから；カタログ番号７４４１−１）をｃＤＮＡ源として用いた（ＰＣＲ１及び２）。第三のＰＣＲでは、プライマーＧＳＰ１フォワード（５’−ＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＧＡＧ−３’）及びＨＴＲＴ３Ａ（５’−ＧＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧ−３’）を用いてＨＬ６０ｃＤＮＡから図１のｈＴＣｃＤＮＡのｂｐ１６９５からｂｐ３４６３までのｈＴＣフラグメントを増幅した。３回のＰＣＲ反応の条件を以下に記述する：第一のＰＣＲでは、５０μｌの最終容量で、１０ｐｍｏｌのｄＮＴＰミックスを５μｌのＫ５６２Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡに添加し、１ｘＫｌｅｎＴａｑＰＣＲ反応バッファー及び１ｘＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）中でＰＣＲ反応を実施した。１０ｐｍｏｌの各々のプライマーＣ５Ａ及びＣ５Ｂを添加した。ＰＣＲを３段階で実施した。９４℃で１分の変性後、ＤＮＡをまず９４℃で３０秒間変性させ、次に６８℃で４分間、プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡ鎖を伸長させる３５ＰＣＲサイクルを続けた。最後に、６８℃で１０分間の鎖伸長を続けた。得られたＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＡクローニングベクターｐＣＲII−ＴＯＰＯ中にクローン化した。第二のＰＣＲでは、１０ｐｍｏｌの各々のプライマーＣ５Ａ及びＣ３Ｂ、１０ｐｍｏｌのｄＮＴＰミックス及び２ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬから）を５μｌのＫ５６２Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡに添加し、５０μｌの最終容量で１ｘＰＣＲバッファー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから）中でＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲを３段階で実施した。まずＤＮＡを９４℃で３分間変性させた。次に、連続的に、９４℃で４５秒間ＤＮＡを変性させ、次に６８℃で１分間プライマーアニーリングを行い、その後７２℃で３分間ＤＮＡ鎖を伸長させる３４サイクルを続けた。最終ＰＣＲ段階では、最後の鎖伸長を７２℃で１０分間実施した。得られたＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１中にクローン化した。第三のＰＣＲでは、まずＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍからのｃＤＮＡ合成キットを用いて製造業者の説明書に従ってヒト前骨髄性細胞系ＨＬ６０からのＤＮａｓｅＩで処理したポリ−ＡＲＮＡ２μｇからｃＤＮＡ合成を実施した。次に、このＨＬ６０ｃＤＮＡの１μｌを５０μｌの最終容量で１０ｐｍｏｌの各々のプライマーＧＳＰ１フォワード及びＨＴＲＴ３Ａ並びに１０ｐｍｏｌのｄＮＴＰミックスと混合し、１ｘＫｌｅｎＴａｑＰＣＲ反応バッファー及び１ｘＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）中の１．２５μｌのＤＭＳＯを添加した後、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲを３段階で続けた。９４℃で３分間の変性後、３７サイクルにわたって、ＤＮＡをまず９４℃で１分間変性させ、次に、６８℃で４分間、プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡ鎖を伸長させた。６８℃で１０分間のさらなるインキュベーションにより反応を終了した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローン化した。ＰＣＲ１及び２からクローン化されたｈＴＣｃＤＮＡフラグメントの完全な二本鎖シークエンシング並びにＰＣＲ３から得られたｈＴＣｃＤＮＡフラグメントの部分シークエンシングにより、図１に示されるｈＴＣｃＤＮＡに加えて、このｃＤＮＡの４つの変異体がヒト細胞に存在することが示された、すなわち：ヒトｈＴＣｃＤＮＡの変異体１はヌクレオチド２３４５〜２５２６までにわたる１８２ｂｐの長さの欠失を特徴とする。この欠失は読み取られるＲＴモチーフ４〜７を欠いている欠失したｈＴＣタンパク質で置き換えられているＯＲＦをもたらす。ヒトｈＴＣｃＤＮＡの変異体２はヌクレオチド２１８４〜２２１９までにわたる３６ｂｐの長さの欠失を示す。この欠失の結果としてＲＴモチーフ３が失われる。しかしながら、読み枠は保持され、ＲＴモチーフ３を選択的に欠いているタンパク質が生産される。ヒトｈＴＣｃＤＮＡの変異体３は変異体１及び２の組み合わせである。それはｂｐ２１８４から２２１９までの欠失及びｂｐ２３４５から２５２６までの欠失の両方を示す。ヒトｈＴＣｃＤＮＡの変異体４はｂｐ３２１９からｂｐ３８４２までのヌクレオチド領域の喪失を特徴とする。この欠けている配列はｈＴＣと相同でない配列で置き換えられている。ｂｐ３８４３から先では、配列は図１に示されるｈＴＣ配列と再び完全に同じである。変異体４の配列を図１４に示す。選択した５’ プライマーにより、それは図１に示されるｈＴＣｃＤＮＡのｂｐ１７８３から始まる。相同でない領域をボールド体で強調し、そして位置３２１９から位置３４５１まで（図１４及び配列番号７）はヒト子宮腫瘍からのＥＳＴ（受託番号ＡＡ２９９８７８）とＤＮＡレベルで９８．７％の程度で一致する。実施例１２ヒトテロメラーゼの触媒サブユニットに特異性を有する抗血清を得るために、利用できるヌクレオチド配列（図１）をアミノ酸配列（図２）に翻訳した。二次構造予測プログラム（ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアパッケージからのＰＲＯＴＥＡＮ、ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて、ある程度の確率で免疫応答を引き起こす２個のペプチドを選択した。これらは以下のペプチドであり、それらをアミノ酸の１文字コードで示す：下線を引いたシステインはテロメラーゼ配列由来ではないが、カップリングのためのリンカーとしてさらに付加した。チオール反応性カップリング試薬ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いてスカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニン（ＫＬＨ）にペプチドを連結した。各場合においてこれらの連結したペプチドで２匹のウサギを２から４週までの間隔で免疫した。免疫前に、免疫前血清を得るために５ｍｌの血液を抜き取った。４免疫後に、免疫血液を得るために同様に５ｍｌの血液を抜き取った。これらの血清をウェスタンブロッティング実験（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）において融合タンパク質との反応性に関して試験した（実施例１３）。実施例１３触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質を分析することができるようにバクテリア発現実験を実施した。これらの実験の構築物を以下に記述する：発現構築物ｐＭａｌＥＳＴのために、実施例２において記述したＡＡ２８１２９６クローン中のインサートを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切り出し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いて切断部位を埋め（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）；次に、そのインサートをバクテリア発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから）のマルトース結合タンパク質の与えられた読み枠中にクローン化した。ベクターｐＭＡＬ−Ｃ２を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、突出する一本鎖末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで取り除いた（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）。発現構築物ｐＭＡＬＡ１は位置１７８９から位置３９０８までの図１のヌクレオチド配列を含む。プライマーＣ５Ａ（５’−ＡＣＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＴＧ−３’）及びＣ３Ｂ（５’−ＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’）を用いてＰＣＲにより市販されているＫ５６２Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから、カタログ番号７４４１−１）からこのＤＮＡフラグメントを増幅し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴＡクローニングベクターｐＣＲII−ＴＯＰＯ中にクローン化した。ＰＣＲ条件は実施例７において記述したとおりであった。発現構築物ｐＭＡＬＡ１のために、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いてインサートを切り出し、クレノウフラグメントを用いて切断部位を埋め（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）；次に、制限酵素ＸｍｎＩで切断したバクテリア発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから）中にインサートをクローン化した。次に、バクテリア株エシェリキア・コリＤＨ５αにおけるタンパク質発現のためにこれらの構築物を用いた。発現条件はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓにより与えられる説明書（カタログ番号８００）中に記述されたとおりであった。調製したバクテリアライセートをウェスタンブロッティング実験（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）において試験した。実施例１４実施例１２からの抗血清を用いて、実施例１３からのバクテリアライセートをウェスタンブロット（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７）において分析した。マルトース結合タンパク質に相当する融合の部分は約４３ｋＤａの大きさであるので、ｐＭａｌＥＳＴ及びｐＭａｌＡ１構築物に対してそれぞれ約７４ｋＤａ及び１０６ｋＤａの融合タンパク質が予想される。１回目の免疫後の血清と免疫前血清を比較すると、Ｂ及びＣエピトープに対して特異的抗体が形成されたことが明らかになる（図１６）。さらに、それぞれ、予想される７４ｋＤａ及び１０６ｋＤａのタンパク質に加えて、抗血清と反応するより小さいタンパク質フラグメントも見られた。これらのより小さい産物はおそらく未成熟産物に由来する。ｐＭａｌＥＳＴを用いる発現からの融合タンパク質上には血清Ｂのエピトープのみが存在する。それに反して、ｐＭａｌＡ１からの融合タンパク質上には血清Ｂ及びＣのエピトープが存在する。こういう理由で、抗血清ＣはｐＭａｌＥＳＴ発現産物を認識せず、ｐＭａｌＡ１を用いた発現実験からの大きい方のタンパク質フラグメントのみを認識する。この結果は作製された抗血清の高度の特異性を強調する。実施例１５触媒テロメラーゼサブユニットのタンパク質を分析することができるためには、タンパク質成分はＲＮＡ成分と一緒にインビトロで再構成されるはずである。これらの実験のための構築物を以下に記述する：プライマーＨＴＲ９ＢＡＭ（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧ−３’）及びＨＴＲ２ＢＡＭ（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＧＴＧＡＣＧＧＡＴＧＣ−３’）を用いて２９３細胞ｃＤＮＡライブラリーから５０４ｎｔの長さのＲＮＡ成分（Ｆｅｎｇ等、１９９５）を増幅した。プライマーＨＴＲ９ＢＡＭはヌクレオチド１０から２９までＴ７プロモーターを含む。ＰＣＲでは、１００μｌの最終容量で、１０ｐｍｏｌのｄＮＴＰミックスを２９３細胞からの３μｌのｃＤＮＡに添加し、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏから）を含有する１ｘＰＣＲ反応バッファー中でＰＣＲ反応を実施した。１０ｐｍｏｌの各々のプライマーＨＴＲ９ＢＡＭ及びＨＴＲ２ＢＡＭを添加した。ＰＣＲを３段階で実施した。９４℃で１０分の変性後に、まず９４℃で１分間ＤＮＡを変性させ、その後、６２℃で２分間、プライマーをアニーリングさせ、ＤＮＡ鎖を伸長させる３５ＰＣＲサイクルを続けた。最後に、７２℃で４分間の鎖伸長を続けた。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで制限消化した後、ＲＮＡ成分がＴ７プロモーターの制御下にあるようにベクターｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ切断部位にクローン化した。この構築物を以下ＨＴＲ５０４と称する。３４１１ｂｐの長さのｃＤＮＡフラグメント（位置６０〜位置３４７０、図１）をベクターＰＣＲII ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）中にクローン化した。クローニングに関する詳細な情報は実施例８及び７並びに図１２に示される。ＨＴＣＦＬと称するこの構築物において、Ｔ７プロモーターはｈＴＣｃＤＮＡの前の５’に位置する。ｈＴＣＦＬ構築物を添加した後、市販されている転写／翻訳系において製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ；カタログ番号Ｌ４６１０）の説明書に従って触媒テロメラーゼタンパク質成分を合成した。³⁵Ｓで標識されたシステインを用いて予想される１２７ｋＤａの産物のインビトロ翻訳がうまくいったかどうかをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）において調べた（図１７）。製造業者（Ａｍｂｉｏｎ；カタログ番号１３４４）の説明書に従って転写系を用いるかまたはＰｏｋｒｏｖｓｋａｙａ及びＧｕｒｅｖｉｃｈ（１９９４）により記述された方法を用いてテロメラーゼＲＮＡ成分を合成した。インビトロ再構築のために、ｈＴＣＦＬ構築物を含有する５０μｌの上記の翻訳混合物に０．５μｇのｈＴＲＮＡを添加し、全部を３７℃で１０分間インキュベートした。この混合物の２μｌの酵素活性をＴＲＡＰアッセイ（Ｎ．Ｗ．Ｋｉｍ等、１９９４）を用いて調べた。ＨｅＬａ細胞から精製されたテロメラーゼ（Ｓｈａｙ等、１９９４）の同じ方法による活性の測定を陽性コントロールとして用いた。図１８において認めることができるように、再構築された酵素及び天然の酵素の両方が同じ生成物パターン、すなわち、テロメラーゼに特徴的なヌクレオチドラダーを生じる。また、この結果は、ＲＮＡと共に単一のタンパク質成分が酵素テロメラーゼ活性のために十分であることも立証する。記述したＴＲＡＰアッセイに加えて、直接テロメラーゼアッセイ（Ｓｈａｙ等、１９９４）において５μｌの再構築混合物をその活性に関して試験した。この実験においても、特徴的なヌクレオチドラダーにより、組み換えｈＴＣタンパク質及びテロメラーゼＲＮＡ成分の成功した再構築が立証される。要約すると、同定され、そして完全にクローン化されたｈＴＣ−ｃＤＮＡがヒトテロメラーゼの触媒サブユニットを構成することが機能レベルで本明細書により示すことができた。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONCatalytic subunit of human telomerase and its diagnostic and therapeutic use Structure and function of chromosome ends Eukaryotic cell genetic material is distributed on linear chromosomes. The end of these genetic units The end is Greek Teros (telos) (Terminal) and Meros (meros) (Part Minute or segment) and is called telomere. Most telomeres are composed of short sequence repeats composed mainly of thymine and guanine (Zakian, 1995). Telomere sequences in cognate organisms are often similar , And these sequences are systematically conserved between more remote species. Until now The telomere is composed of the sequence TTAGGG in all vertebrates examined. It is worth noting (Meyne et al., 1989). Telomeres perform a variety of important functions. They are chromosome fusions (McCli ntock, 1941) and consequently the formation of dicentric genetic units. This type of chromosome, which carries two centromeres, is known to have lost heterozygosity or Can lead to the development of cancer due to duplication or loss. In addition, telomeres distinguish damaged and intact genetic units Fulfill the purpose of doing. For example, yeast cells are known to carry chromosomes lacking telomeres. The tearing was stopped (Sandell and Zakian, 1993). Telomeres play another important role in connection with DNA replication in eukaryotic cells. Unlike prokaryotic circular genomes, DNA polymerase complexes are linear in eukaryotes. The chromosome cannot be completely replicated. DNA replication RNA primers are required to initiate PCR. RNA primer removed After the Okazaki fragment has been extended and subsequently ligated, The newly synthesized DNA strand is 5 ’End is missing. For this reason, chromosomes cannot be divided into cells without special protection mechanisms. It gets shorter with each split ("End replication problem", Harley et al., 1990). Non-cody The Ngtelomere sequence probably represents a buffer zone to prevent gene loss (S andell and Zakian, 1993). Moreover, telomeres also play an important role in regulating cellular senescence ( Olovnikov, 1973). Human somatic cells show limited replication potential in culture After a period of time they will age. In this state, the cells No longer divide even after being stimulated with; however, they do not die, It remains active graciously (Goldstein, 1990). The cell is the telomere There are various hypotheses that determine how long it can be split from its length Supported by reports (Allsopp et al., 1992). Thus, in summary, telomeres are responsible for cellular aging and genetic material stabilization and cancer prediction. Has a central role in defense.The enzyme telomerase synthesizes telomeres As mentioned above, organisms that carry linear chromosomes can Can only replicate incompletely. Most eukaryotes regenerate telomere sequences To do this, a special enzyme, telomerase, is used. Telomerase is this It is constitutively expressed in unicellular organisms that have been examined. On the contrary, in human Indicates that telomerase activity is And tumor cells only, while nearby somatic tissues may No merase was also included (Kim et al., 1994).Telomerase in villi Like telomeres, telomerase is a trophozoite tetrahymena thermophila (Te trahymena thermophila ) Was first identified. d Single-stranded oligonucleotide d (TTGGGG) in the presence of TTP and dGTP_Four Telomerase activity was detected by elongating (Greider and Bl). ackburn, 1985). In this reaction, the tetrahymena telomere sequence TTG GGG was repeatedly added to the primer. Saccharomyces cerevisiae (Sa ccharomyces cerevisiae ) Irregular telomeric sequence, T (G)_1-3Even when oligonucleotides with Romerase extended the primer with the telomere sequence of Tetrahymena (Greid er and Blackburn, 1985). From these results, telomerase self It was concluded that the body carried a template for the telomere sequence. Once the presence of the RNA component in telomerase is first shown (Greid er and Blackburn, 1987). The gene for the NA subunit has been cloned (Greider and Black). burn, 1989). This RNA is a region complementary to the Tetrahymena telomere sequence (Hereinafter referred to as “complementary regions”). Digests the RNA, which in turn Telomerase activity, as evidenced by the loss of sex Minute dependent. When mutating the complementary region of telomerase RNA, the corresponding Mutation was incorporated in vivo into Tetrahymena telomeres (Yu et al., 19 90). Thus, telomerase belongs to the class of RNA-dependent DNA polymerases You. In 1995, the first protein subunit of Tetrahymena telomerase, That is, p80 and p95 were identified (Collins et al., 1995). p9 5 immobilizes the enzyme on DNA and reports that p80 binds to the RNA component. The following model was derived: Telomerase RNA is more integrated by its complementary region Anneal the strand 3 'overhang. The 3 'overhang adds the corresponding nucleotide to the 5'-3' Stretched by taking in the direction. Telomere neosynthesis is probably an elongation step And a translocation step. Once the telomere sequence is synthesized, it is likely that the telomere Until D is in position where it can again add the complete telomere sequence. Move along NA. Number of nucleotides added before the enzyme dissociates from the telomere There is a large difference between telomerases of different species with respect to 993), this model may not generally be valid. In addition, telomerase subunits from other organisms have recently been identified. I have. Two that do not show any homology with the Tetrahymena telomerase protein The protein subunits, i.e. p123 and p43, are Aegiculatus (Euplotes aediculatusFound in) Have been. The telomerase subunit p123 has a basic domain at its N-terminus. And a reverse transcriptase (RT) domain at the C-terminus. (Lingner et al., 1997). Furthermore, p123 Is a Saccharomyces cerevisiae protein found by Lundblad It has been reported to share significant homology with Est2 (Lingne). r et al., 1997). p80 and p95 previously possess any function essential for telomerase activity Although not shown to be a potential catalytic telomerase subunit p12 3 / est2p is clearly shown to have an important function: est2p Mutation of the active center of RT results in marked deletion of telomeres in yeast cells (Lingner et al., 1997).Telomerase components from mammalian cells Various organisms, especially Saccharomyces cerevisiae, mice and humans (Si Nger and Gottschling, 1994; Blasco et al., 1996; Feng et al., 1995) RNA component of telomerase has been cloned to date. ing. All previously known telomerase RNAs are It comprises a region complementary to the mare sequence. However, human telomerase RNA The primary sequence of (hTR) is the RNA component of Villus or Saccharomyces cerevisiae. Does not show any similarity to On the other hand, between human and mouse telomerase RNA, There are regions that have been preserved (Feng et al., 1995). Recently, human telomerase-related protein (telomerase-assoc) Isolated protein (hTP1) has been described (Harr). inton et al., 1997). Tetrahymena telomerase p80 subunit Based on the homology of A gene was found (Harrington et al., 1997). hTP1 is 262 Consists of 7 amino acids and has at most 46% homology with p80 at the N-terminus 3 domains are shown. Probably results in protein / protein interaction ,amino Sixteen repeats of tryptophan acid and asparagine have additional structures in the C-terminal region It was shown to exist as an element.Activation of telomerase in human tumors In humans, telomerase activity can be shown only in germ cells, This was not possible with normal somatic cells (Hastie et al., 1990; Kim et al., 199 4). After more sensitive detection methods were developed (Kim et al., 1994), Telomerase activity was also detected in hematopoietic cells (Broccoli et al., 1 995; Counter et al., 1995; Hiyama et al., 1995). But However, these cells nevertheless showed reduced telomeres (Vazir i et al., 1994; Counter et al., 1995). Of enzymes in these cells Whether the amount is insufficient to compensate for telomere loss or telomere measured CD34 with incompletely differentiated activity⁺38⁺Derived from a subpopulation of progenitor cells (Hiyama et al., 1995) has not yet been determined. This point To detect telomerase activity present in a single cell It is necessary. However, quite interestingly, the large number of tumor sets tested to date Significant telomerase activity was detected in the weave (1734/2031, 8 5%; Shay, 1997), whereas activity is found in normal somatic tissues. No (1/196, <1%; Shay, 1997). In addition, various studies Reduced telomeres in senescent cells transformed with viral oncoproteins Telomerase identified only in subpopulations that survive and survive a proliferation crisis It has been shown to be possible (Counter et al., 1992). Also, telomeres Their immortality It was stable in transformed cells (Counter et al., 1992). In the mouse Similar results from the study (Blasco et al., 1996) indicate that telomere The hypothesis that ze reactivation is a late event in tumorigenesis is supported. Based on these results, loss of telomere sequences and cellular senescence could be attributed to telomerase activity. The "telomerase hypothesis" has been shown to be linked to gender and cancer development. Longevity like a human In some species, reduced telomeres can be considered a tumor suppressor. Any terrorism Differentiated cells without merase divide when telomeres reach a certain length Stop running. When such a cell is mutated, the cell extends its telomere Only then can a tumor develop. Otherwise, cells Continues to lose the telomere sequence until its chromosome becomes unstable, and eventually dies. Telomere Reactivation of the lase is probably arranged by tumor cells to stabilize their telomeres. It is the main mechanism to be equipped. Based on these reports and recognition, tumor cure based on suppression of telomerase activity It should be possible to develop treatment. Use cytostatic or short-wave irradiation Some common cancer treatments not only damage tumor cells, but also all divisions in the body Damage cells. However, significant telomerase activity is found in tumor cells as well. Because only germline cells contain sex, telomerase inhibitors are Attack cells more specifically and therefore cause fewer harmful side effects . Telomerase activity has been detected in all tumor tissues tested to date Therefore, these therapeutic agents can be used for all types of cancer. So In the case of, when the telomere of the cell becomes short enough to make the genome unstable, The action of the lomerase inhibitor occurs. Usually, tumor cells are shorter than normal somatic cells Telomeres, which are firstly eliminated by telomerase inhibitors Is a cancer cell. In contrast, cells with long telomeres, such as germ cells, The vesicles are not damaged until much later. Therefore, telomerase inhibitors It is a way to advance cancer treatment. However, the protein structures of the enzymes have been identified along with their functions, And only if a deeper understanding of the various telomere binding proteins is obtained, Obvious to questions regarding the nature and attack of physiological telomerase inhibitors Answers can be given. The present invention relates to a catalytically active human telomerer in purified form, if necessary. Zesabunit (phTC), the active part of the protein, modulator, Agonists of the protein, substances mimicking the function of the protein and these The combination of the components of The present invention further relates to the following. -A nucleic acid sequence encoding the human protein phTC, specifically: -the genomic sequence of the hTC gene, -cDNA sequence of hTC gene, -the DNA sequence of the hTC variant, -the sequence of the mRNA transcribed from the hTC gene, -Starting with the DNA sequence of hTC shown in Figure 1 (SEQ ID NO: 1) Part of the above array. -A nucleic acid sequence encoding a protein homologous to hTC in other mammals, Specifically: -genomic sequence of a gene homologous to hTC, -cDNA sequence of a gene homologous to hTC, -a sequence of mRNA transcribed from a gene homologous to hTC, -Part of the above array. -In humans and other mammals, proteins related to the phTC protein Encoding nucleic acid sequence, specifically: -Genomic sequences of hTC-related genes in humans and other mammals, -CDNA sequences of hTC-related genes in humans and other mammals, -MRN transcribed from hTC-related genes in humans and other mammals An array of A, -Part of the above array. -A phTC protein as described above isolated from mammalian cells (ie And SEQ ID NO: 2). -A phTC protein labeled with a detection reagent, wherein the detection reagent is preferably Enzymes, radiolabeled elements or fluorescent chemicals. -antibodies directed against the phTC protein. In a preferred embodiment, the antibody is a polyclonal antibody. In another preferred embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. For example, a phTC polypeptide or a flag thereof useful for producing antibodies. Injection into a substantially immunocompetent host, followed by isolation of the antibody Thus, an antibody of this characteristic can be produced. In addition, immortalized cell lines that produce monoclonal antibodies can be prepared in a manner known per se. Can be obtained by law. If necessary, the antibody can be labeled with a detection reagent. Also, fragments that possess the appropriate specific binding properties can be substituted for a complete antibody. It can also be used. Preferred examples of such detection reagents are enzymes, radiolabeled elements, fluorescent chemicals or Is biotin. -10 to 500 nucleotides of the above genomic DNA, cDNA or mRNA Have a sequence identical or completely complementary to a continuous sequence up to Oligonucleotide in manufactured form. Oligonucleotides of this nature are especially oligodeoxyribonucleotides or It may be an oligoribonucleotide or a peptide nucleic acid (PNA). Inhibits or suppresses telomerase activity when bound to hTC mRNA Oligoribonucleotides that prevent or prevent are preferred. -If necessary, the DNA sequence of Figure 1 or standard hybridization conditions A ph comprising a DNA sequence that hybridizes to the DNA sequences listed above, A DNA sequence encoding the TC protein or a fragment of this protein. Or a degenerate variant of this sequence. -a DNA sequence encoding phTC or a fragment of phTC or A recombinant DNA molecule comprising a degenerate variant of the sequence, wherein said sequence is preferred. Or comprising the DNA sequence of FIG. 1 or by standard hybridization. A DNA sequence that hybridizes to the above-listed DNA sequences under conditioned conditions. . In the above recombinant DNA molecules, the described DNA is preferably regulated for expression. Linked to an array. Examples of particularly preferred expression control sequences are the initial ones of the SV40 virus or adenovirus. Late or late promoters, lac, trp, TAC, TRC, λ Major operator and promoter regions, control region of fd coat protein , 3-phosphoglycerate kinase promoter, acid phosphatase promoter And the yeast α-mating factor promoter. -DNA sequences encoding the phTC protein or a part of this protein Or a recombinant DNA molecule as described above comprising a degenerate variant of this sequence. A single cell host. In this recombinant DNA molecule, the DNA sequence is expressed Linked to the control sequence. Preferred examples of single cell hosts include: Escherichia coli (E. FIG. coli ), Pseudomonas (Pseudomonas), Bacillus (Bacillus ), Streptomyces (Streptomyces), Yeast, CHO, R1. 1, BW, LM, COS1, COS7, BSC1, BSC40 and BMT1 0 cells, plant cells, insect cells and mammalian cells. -A DNA molecule as described above or a derivative or fragment of this molecule. Recombinant virus that is transformed in some way. -To introduce a foreign polynucleotide comprising a transcription unit into a cell, Preferably, a method for suppressing telomerase activity in neoplastic cells. This transcription unit is a polynucleotide of at least 29 contiguous nucleotides A sequence that is substantially identical to the hTC RNA sequence; Are substantially complementary and of the polynucleotide ligated in the cell. Heterogeneous transcription that controls transcription Linked to a regulatory sequence. Preferably, said heterologous transcriptional regulatory sequence is constitutively active in human cells Comprising a promoter with Alternatively, a heterologous transcriptional regulatory sequence may be added to a human by adding a regulatory substance. Comprising a promoter that can be induced or repressed in a cell be able to. Examples of such promoters are inducible and repressible tetracyclines. Promoter, heat shock promoter and metal ion dependent promoter. It is a tar. The foreign polynucleotide is, for example, a transcription unit from a human hTC DNA component. May be included. Particularly preferably, the transcription unit is an antigen substantially complementary to the human hTC RNA component. Produce antisense RNA. Also particularly preferred are foreign polynucleotides which can comprise the sequence of FIG. New -Polynucleotides for gene therapy of human diseases. This polynucleotide is A polynucleotide comprising a polynucleotide sequence of at least 9 contiguous nucleotides. A transcript unit, whose sequence is substantially identical to the hTC RNA sequence or Inversion of a polynucleotide that is substantially complementary and is ligated in the cell. It is linked to a heterologous transcriptional regulatory sequence that controls transcription. -A method for detecting a telomerase-related disease in a patient, the method comprising: Process: A. Check phTC protein in body fluids or cell samples for diagnostic values broth; B. PhTC cells in standardized normal cells or body fluids of the same type as the test sample Comparing the standard value of the protein with the diagnostic value; C. Telomerase-related higher or lower than the standard comparison value and also represents a pathogenic disease Detecting a diagnostic value indicative of recurrent disease, Comprising. Preferably, the method is used to detect a neoplastic disease in a patient. In that case, the method comprises the following steps: A. Detecting phTC protein in a cell sample to obtain a diagnostic value; B. Standard values of phTC protein in non-neoplastic cells of the same type as the test sample Comparing diagnostic values; C. A diagnostic value that is clearly higher than the standard comparison value indicates a neoplastic disease, Comprising. -A method for determining the presence of a phTC protein in a cell or a cell sample, The method comprises amplifying an hTC polynucleotide or an hTC polynucleotide. And hTC polynucleotides, primers or sequences complementary to hTC. Based on letting it hybridize. A test kit for detecting phTC in cell samples and body fluids, For example, the labeled immunochemically reactive component is: a polyclonal to phTC Antibodies, monoclonal antibodies to phTC, fragments of these antibodies, Alternatively, a mixture of these components may be used. -Cell damage or destruction and / or dysfunction and / or other A method for the prevention and / or treatment of a symptom, wherein the method comprises catalytically active human Of telomerase, a functional equivalent thereof or a catalytically active fragment thereof Based on administering a therapeutically effective amount. Also, phTC production and / or Substances that enhance the activity; substances that can mimic the activity of phTC; Use substances that can suppress production and / or activity or mixtures of these substances Can also be considered. Further, a specific binding partner may be used. Preferably, the method is used to prevent or treat aging or cancer disease . affecting the activity of phTC, ie suppressing or enhancing it The resulting substance is referred to herein as a modulator. Such a modular Are their effects on telomerase activity in telomerase assays Can be found in a manner known per se. Telomere An example of a zeoassay is provided in Example 15. Modulators of phTC are important for treating diseases associated with telomerase. It is important. In this context, mention is made in particular of the prevention or treatment of the aging process or of cancer diseases. be able to. -an antisense nucleic acid against hTC mRNA, said nucleic acid comprising An antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes with A or DNA. Preferably, the antisense nucleic acid binds to the start codon of a particular mRNA. Combine. -DNA from which an antisense ribonucleic acid against hTC mRNA is produced during transcription A recombinant DNA molecule containing a sequence. The antisense ribonucleic acid is comprising a nucleic acid sequence capable of hybridizing to mRNA. Transfecting a phTC producing cell line with this recombinant DNA molecule DNA of this nature to prepare cell lines with reduced expression of phTC Molecules can be used. -A ribozyme that cleaves hTC mRNA. The ribozyme is preferably a Tetrahymena ribozyme or a hammerhead. Type ribozyme. -Contains a DNA sequence whose transcription results in the production of a ribozyme of this quality; Recombinant DNA molecule. This recombinant DNA molecule is used to transfect a phTC producing cell line. Can be used. -Preferably corresponds to or complementary to the sequence of human hTC mRNA And a pair of human hTC polynucleotide PCR primers Combination consisting of mer. -Preferably identical to or complementary to the sequence of the human hTC gene A probe comprising at least 29 contiguous nucleotides, and a human hTC Combinations comprising polynucleotide hybridisation probes of genes Let's go. -Can be used to examine telomerase / telomere regulation in vivo Animal model. Thus, for example, knocking tumor development and aging Inspection can be performed directly using out- or transgenic animals. In the case of proteins or peptides, functional equivalents are defined with respect to the amino acid sequence. Compounds that can be distinguished but have essentially the same function. Known examples of these compounds are the so-called microheterogeneous isoenzymes or proteins. It is a sexual body. In the case of oligonucleic acids or polynucleic acids, functional equivalents differ in nucleotide sequence. However, it is understood that they are compounds encoding the same protein. Such a compound The presence of an object may be due, for example, to the degeneracy of the genetic code. Description of the drawings: Figure 1: cDNA sequence of human telomerase catalytic subunit (hTC) Number 1). FIG. 2: Amino acid sequence (sequence) deduced from the hTC DNA sequence shown in FIG. No. 2). The DNA sequence shown in FIG. 1 was completed from position 64 to position 3461 into the amino acid sequence. Can be fully translated. Amino acid residues are indicated by their one-letter code. FIG. 3: Ethidium bromide containing AA281296 DNA treated differently Um stained agarose gel. The figure shows a ethidium bromide stained 0.8% agarose gel. Two different D NA size standards were added to lanes 1 and 8, and 3, 2, 0.5 and 0.4 kb of D Shows the NA fragment length. Restricts AA281296 DNA in pT7T3D Enzymes EcoRI / NotI (lane 3), P Digested with stI (lane 6) and XhoI (lane 7). Not in pT7T3D Digested AA281296 DNA was added to lane 2. hT in pT7T3D C cDNA and primer 1 (5'GAGTGGTGTACGTCGTCGAGC TGCTCAGGTC3 ') and 4 (5'CACCCTCGAGGTGAGAC GCTCGGGCC3 ') [lane 4] and primer 6 (5' GCTCGTA GTTTGAGCACGCTTGAACAGTG3 ') and 7 (5'GCCAAGT TCCTGCACTGGCTGATGAG3 ') PCR mixture in [lane 5] (1 minute at 94 ° C., 2 minutes at 60 ° C., 3 minutes at 72 ° C.) Was added. Figure 4: Uprotes p123 (p123) and human (phTC) catalyzed telomeres. Details from a comparison of the protein sequences of the ze subunits. The Lasergene program software (Dnasta r, Inc. ) Using Lipman-Pearson protein comparison ( Ktuple, gap penalty and gap length penalty). Ami Formic acid residues are indicated by their one-letter code. Also, Yuprotes Aegisclata Sp123 and identified ESTs₊₁The same amino acid is also supported from one letter code To emphasize using Not the same, but similar or comparable in function Amino acids are represented by:. Figure 5: Catalytic telomeres of uprotes p123 (p123) and yeast (est2p) Part of the comparison of the protein sequences of the Rase subunit. The Lasergene program software (Dnasta r, Inc. ) Using Lipman-Pearson protein comparison ( Ktuple, gap penalty and gap length pena Lutey). Amino acid residues are indicated by their one-letter code. Likewise Amino acids between Euplotes aegiculatus p123 and yeast est2p Are distinguished by the corresponding character from the one-letter code. Not the same, but the features Similar or comparable amino acids are represented by:. Figure 6: Yeast (est2p) and human (phTC) catalyzed telomerase subunits. Details from comparisons of protein sequences. The Lasergene program software (Dnasta r, Inc. ) Using Lipman-Pearson protein comparison ( Ktuple, gap penalty and gap length penalty). Ami Formic acid residues are indicated by their one-letter code. In addition, yeast est2p and identified yeast EST₊₁The same amino acids between the letters are highlighted using the corresponding letters from the one-letter code I do. Amino acids that are not the same but have similar or comparable functions are represented by:. Figure 7: Euplotes p123 (p123), yeast (est2p) and human (ph TC) Details from comparison of the protein sequences of the catalytic telomerase subunit. standard Under conditions Lasergene program software (Dnastar, Inc.) . ) Using the Clustal method subprogram (p123). 5) between yeast (est2p) and human (phTC) did. Amino acid residues are indicated by their one-letter code. In addition, yeast est2p , Euplotes aegicratus p123 and identified ESTs₊₁Same between The acid is also emphasized using the corresponding character from the one-letter code. In addition, all three tags The same region between the proteins is represented by a light gray bar above the protein sequence. Figure 8: DNA sequence (RACE round 1) generated from Example 6 Column number 3). FIG. 9: DNA sequence generated from Example 6 (RACE round 2) (SEQ ID NO: 4). Figure 10: DNA sequence generated from Example 6 (RACE round 3) (SEQ ID NO: No. 5). Figure 11: DNA sequence generated from Example 8 (RACE round 3) (SEQ ID NO: No. 6). FIG. 12: Schematic representation of the cloning of the complete hTC cDNA sequence. Start and stop The position of the don is indicated by an arrow. The rectangular black area is the sequence part encoding the protein While the light gray areas represent the 5 'and 3' untranslated cDNA regions, and / Or represents an intron sequence. The rectangular dark gray block of the full-length cDNA is Of the enzyme specific motif (T) or the seven reverse transcriptase motifs (Nos. 1-7). Indicates one of them. The DNA fragments required to prepare the complete hTC cDNA Also represented as rectangles and their origin. All rectangles relative to each other Place it in the right place. CDNA fragment represented by rectangle AA261296 The procedure is described in Example 2. 182 bp deletion in this fragment (actually The relative position of (see Example 2) is indicated by the gap in the rectangle. Rectangular RACE 1. The origin of the DNA fragments represented by RACE2 and RACE3 This is described in Example 6. DNA fragment indicated by the C5F fragment rectangle The origin of the fragment is described in Example 7. by the lambda12 rectangle The origin of the indicated DNA fragments is described in Example 9. About hTC Lambda12 DNA fragment encoding unrelated cDNA The 3 'portion of the fragment (see Example 9) is not shown in this figure. Shown in this figure 5 'and 3' spra using lambda12 and C5F DNA fragments. The complete hTC-cDNA sequence was ligated together at the cis site (see Example 7). This These splice sites are composed of various fragments (RACE1, RACE3, lam). bda12 and C5F). Figure 13: Proteins of the utelotes and human (hTC) catalytic telomerase subunits. Detailed fragments from protein sequence comparisons. The figure shows the proteins of the catalytic telomerase subunit of uprotes and human (hTC). Shown are fragments from the comparison of protein sequences. Reverse transcriptase motif in the boxed area Call attention. The numbers below the boxes refer to the respective amino acid positions in FIG. . Amino acid residues are indicated by their one-letter code. Bold identical amino acids Sign with your body. In the consensus sequence of the reverse transcriptase motif (RT common), h is hydrophobic Represents an amino acid and p represents a polar amino acid. These groups of amino acids are P and / or h if retained in the Rotes and hTC amino acid sequences. Sign in the body. Underlays amino acids that are very highly conserved in gray. RT In 3, the boxed area is expanded to include additional homologous amino acids. Telomere The enzyme specific motif is described in Example 9. Figure 14: DNA sequence (3 'version) generated from Example 11 (SEQ ID NO: 7). Regions that are not homologous to the DNA sequence shown in FIG. 1 are highlighted in bold. Figure 15: hTC expression in cancer cell lines and normal human tissues. Figure A: Different human details About 2 μg of poly-A from the cell system⁺RNA from the manufacturer (Clon tech) according to the manufacturer's instructions. Specifically, RN A is melanoma (G361), lung cancer (A549), adenocarcinoma of the colon (SW480), (Raji) Burkitt's lymphoma, leukemia cell line (MOLT-4), chronic leukemia Cell line (K-562), cervical tumor (HeLa) and leukemia cell line HL60 Derived. Transcripts represented at 4.4 kb, 6 kb and 9.5 kb are specific to hTC. It is different (see Example 10). Figure B: Approximately 2 μg of poly- from different human tissues A⁺RNA was Northern blotted according to manufacturer's instructions (Clontech). Fixed on top. Specifically, RNA is used for heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney And isolated from the pancreas. Show RNA size criteria. Figure 16: Rabbit serum for peptides from human telomerase amino acid sequence Western blot analysis (Example 12). 20 μl from Example 13 in each case Western blot using antisera from Example 12 (Ausubel et al., 1987). Keep pMALEST construct Lysates from the bacteria containing were added to lanes 1, 2, 6, and 7. pM Lysates from bacteria carrying the ALA1 construct were run in lanes 3, 4, 8, and 9 was added. Induction by IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) Lysates from bacteria that were not added were added to lanes 1, 3, 6, and 8. Lysates from bacteria induced by IPTG were added to lanes 2, 4, 7, and 9. Added. Reference size marker (10 from Life Technologies) kDa protein ladder, catalog number 10064-012) added to lane 5 did. The 50 kDa and 120 kDa bands are shown at the edge of the membrane. Including lanes 1-4 The PVDF membrane in Figure A is converted to peptide B Incubated with corresponding pre-immune serum (see Example 12). Including lanes 6-9 The PVDF membrane of Figure A was incubated with pre-immune serum against peptide C (actual See Example 12). The PVDF membrane of FIG. Incubation with the sera (see Example 12). P in FIG. B including lanes 6-9 VDF membrane was incubated with immune serum against peptide C (see Example 12) ). Figure 17:³⁵Autoradio of proteins labeled with S and translated in vitro G. Complete in vitro translated hTC (see Example 15) in lane 1 Was added. The C-terminal truncated version of phTC was added to lane 2. Lane 3 is the manufacturer Shows a positive control for in vitro translation supplied by E. (see Example 15). . Protein size criteria for estimating protein size are shown on the right. Figure 18: From the TRAP assay³²Autoradiogram of product labeled with P (See Example 15). TRAP assay without enzyme or protein The mixture was added to lanes 1 and 2 as a negative control. From HeLa cells Positive TRAP assay mixture containing partially purified human telomerase Added to lanes 3 and 4 as control. PhT translated in vitro The TRAP assay mixture containing C was added undiluted to lanes 5 and 6. The TRAP assay mixture containing the in vitro translated phTC was diluted 1: 4. And added to lanes 7 and 8. T containing in vitro translated phTC The RAP assay mixture was added to lanes 9 and 10 at a 1:16 dilution. Imbi The TRAP assay mixture containing the luciferase translated in Troll was added to lanes 11 and 12. Figure 19: Direct telomerase assay³²Autora of product labeled with P Geogram (see Example 15). Lane 1 with 10 bp radiolabeled marker Was added. 5 'radiolabeled telomere oligonucleotides ([TTAGG G]_Three) Was added to lane 2. Lane 3 is an empty lane. HeLa cells The partially purified human telomerase is used directly in the assay, Added to Lane 4 as a sex control. In vitro translation from Example 15 The phTC obtained was used directly in the assay and the synthetic product was added to lane 5.Example Example 1 Currently, less than 5% of the human genome is actually transcribed and translated into protein Has been recognized. Even before the genome has been completely sequenced, Obtaining important information about about 60,000-70,000 genes is a special case. It is possible by examining these coding parts of the genome in a way. here By automating high-throughput DNA sequencing technology for 10 to 15 years, Collecting a large number of cDNAs from plasmid cDNA libraries of widely different origins, And in each case it is possible to sequence the 5 'or 3' end . These short DNA sequences, which are typically 300 to 400 bp in length, Columns are expressed sequence tags (expressedsequipmenttags) or This is called EST for short, and is stored in various specialized databases. EST appro Were originally described by Okubo et al. (1992), and Adams et al. (1992). 1992). Currently, about 50,000 human cell genes Partially sequenced and EST registered It is recorded as. By comparing the DNA and amino acid sequences of known genes, Genes previously unknown are identified in these EST databases. (Gerhold and Caskey, 1996). tBLAST n (Altschul et al., 1990) have been found to be particularly useful for this purpose. Search algorithm. This algorithm is in the EST database All DNA clones are translated in all six possible reading frames and these amino acids The sequence is compared to a known protein sequence. EST database of National Biotechnology Information Center (NCBI) Protectes aegiculatus catalytic telomerase subunitp123(Lingn er et al., 1997). This is a reading frame Accession number AA281296, identified as showing significant homology to p123 at +1 Resulting in a human EST having This amino acid sequence of reading frame +1 is called Est₊₁ Called. p123 and Est₊₁Between the two sequence regions that are 30 amino acids apart Most notably. From amino acid 438 to amino acid 484 of p123 The longer sequence region is Est₊₁38% identical to the corresponding region of It was similar If amino acids are also taken into account, the match is indeed 59%. Second block of homology The stretch extends from amino acid 513 to amino acid 530 of the p123 protein, Est defined₊₁Shows 44% identity with the corresponding sequence segment. It was similar Taking into account the amino acid residues with properties, a 61% match is obtained. P (probability) value is an important parameter for evaluating BLAST search It is. P uses an arbitrary sequence to identify a specific segment pair in a BLAST search. Similarly represents the probability of finding, 0 (very significant result) to 1 (insignificant result) Varies numerically between). Thus, for example, the NCBI EST database and yeast Comparison of the p123 equivalent from (est2p) gives a negative result: found The EST was the probability of P = 1 (Table 1). On the other hand, EST days that cannot be used by the public Human telomerase-related protein 1 (hTP1) found in the database (Harrington et al., 1997) gives a probability of P = 0.004. Table 1: Comparison of three tBlastn search tests using different known genes Human EST AA281296 identified by comparison with p123 has P = 3. 5x10^-6Has a probability of These data indicate that the identified ESTs are probably the catalytic subunits of human telomerase. Suggests encoding a knit fragment. For these reasons, respond The gene is referred to as hTC (human telomerase, catalyst (humanTelomera se,caticaly)) and putative protein is phTC Abbreviated.Example 2 The EST identified by comparison with p123 was EST data on April 2, 1997. Tabbed and not published in any magazine. National Biotechno According to the information obtained from G Information Center, the cDNA containing this EST clone The library was prepared as follows: After preparing mRNA from germinal centers of tonsils, cDNA synthesis was performed and double-stranded c The DNA fragment was cloned into the vector pT7T3D-Pac using Ncol and EcoR. The orientation was cloned using the I restriction enzyme cleavage site. 389 bp contained in the EST database were provided by Amersham. Sequenced using the supplied -28m13rev2 primer (DNA sequence). Row, see positions 1685-2073 in FIG. 1). To translate the DNA sequence of EST AA281296 according to the human genetic code Lasergene program software (Dnastar Inc.) Using. The obtained amino acid sequence (Est₊₁) Corresponds to positions 542 to 670 in FIG. I do. Est₊₁Deduced protein sequence is 27 basic, 11 acidic, 51 Consists of 129 amino acids, including 28 hydrophobic and 28 polar amino acid residues. The EST (AA281296) identified in Example 1 was replaced with Escherichia coli. Research Genetics, in the form of a plasmid transformed into Inc. (Huntsville) and analyzed experimentally: Shown in an agarose gel stained with ethidium bromide shown in FIG. After subjecting the prepared plasmid DNA to restriction digestion, The 2.2 kb fragment from EST AA 281296 is the vector Released from pT7T3D. Run simultaneously and use specific internal primers Examining EST AA 281296 by remerase chain reaction (PCR): expected The lengths of the PCR products used are 325 and 380 bp, and the experimentally observed Segment length (ie, lanes 4 and 5 in FIG. 3). So this Is Research Genetics, Inc. (Huntsville) The EST from which the Escherichia coli clones provided by To be held. After preparing the DNA, a total of 2176 bp of DNA was obtained by double-stranded sequencing. Inserts were identified. Clone AA281296 and C5F fragment ( Comparison of the DNA sequences of Example 7) revealed a 182 bp deletion (positions 2352-25). 33, FIG. 1), resulting in an open reading frame in this region. Was shown to have been lost. In summary, the DN of clone AA281296 The A sequence is the sequence information (positions 1685 to 2351 and positions 2534 to 2534) shown in FIG. 4042).Example 3 Comparison of tBLASTn between p123 and EST₊₁(P12) 3 amino acids 438-530) only, while the intervening amino acids were taken into account. Not. Conclude conclusions about the relevance of protein sequences over a larger area Lipman-Pearson protein comparison was performed to (Amino acids 437-554 of p123) (see Figure 4). If this is done, 3 4% of amino acids are identical While 59% of the amino acids are identical or biochemically similar It was recognized that. This result indicates that the relevance of these proteins is It shows that it continues outside the homology region found using the program. As recently reported (Lingner et al., 1977), Euplotes a. Ejikuratas p123 and Saccharomyces cerevisiae est2p are homologous to each other It is. The degree of similarity between p123 and est2p is described herein as p123. Est₊₁Using the same parameters to relate to the homology between Using the pman-Pearson protein comparison, the above region of p123 (A Amino acids 437-554) were also compared to est2p. As a result, this selection area The p123 and est2p are 21% identical and their amino acids 22% of the residues were shown to be identical or biochemically similar (see FIG. 5). See). Therefore, Esh₊₁The homology between p123 and euplotes p123 is that p123 and est Significantly higher than during 2p.Example 4 Est₊₁And the homology between est2p and p123 indicates that all three proteins are the same. It suggests that it belongs to a protein family. To confirm this assumption, Est2p was converted to Est under the conditions described in Example 3.₊₁(See FIG. 6) ). With this, Est₊₁Is 20% identical to est2p, ie, est2p It has been shown to show a degree of homology comparable to that of p123 to 2p. Was. Also, this relatively low level of agreement is due to tBLASTn using est2p. Supports that no significant EST was identified in the search (see Example 1) .Example 5 Protein family consisting of catalytic telomerase subunits from different species P123, est2p to identify possibly functional domains that are important for And a computer comparison was performed using phTC (see FIG. 7). In this analysis In particular, two regions present in all three proteins are particularly prominent (see FIG. 7). See). At present, amino acids 447 to 460 of p123 (FIG. 13, telomerase mochi) No obvious function can be specified for the area corresponding to f). The Genetics Computer Group r Group) (GCG) Wisconsin Sequence Analysis Package (Wiscons) Mochi using sin Sequence Analysis Package Search and protein database (Swissprot, 8.6.1997) Search) did not give any significant insights. On the other hand, p123, est2p corresponding to amino acids 512-526 of p123 And another region of homology between phTC and the common motif of reverse transcriptase (RT). (FIGS. 7 and 13). (1997) p123 / est 2p contains a total of 6 such RT motifs, which are p123 / es It was shown to be essential for the catalytic function of t2p. As shown in FIGS. 7 and 13 Thus, two such RT motifs are also present in the sequence of the phTC being examined. Is preserved. These motifs are located at the most N-terminal in p123 / est2. RT motif to be placed (Lingner et al., 1997). The primary sequence of reverse transcriptase is very different; only a few amino acids are Completely stored within the Chief (Poch et al., 1989 and Xiong and Ei ckbush, 1990). In addition, different distances between the conserved RT motifs To have a retrovirus or long terminal repeat (LTR) retroposon Reverse transcriptase encoded by non-LTR retroposon or group II Different from the reverse transcriptase encoded by tron (Xiong and Eickbus) h, 1990). Based on the structure of the RT motif, p123, est2p and ph TC is specified in the latter RT group. Interestingly, in this context, phTC The consensus sequence of the RT motif of the best corresponds to the putative RT consensus motif; Of the eight amino acid residues in one RT motif, six are present in the case of phTC On the other hand, in the case of p123 and est2p, only five exist (FIG. 7 and 13). In this connection, especially hydrophobic amino acids such as leucine and isoleucine Notably, the amino acids lysine and arginine are at specific positions (Fig. 7 and 13). In summary, AA28 identified herein by homology to p123 1296 clones are fragments of the catalytic subunit of human telomerase This can be shown at the descriptive level.Example 6 To clone the 5 'end of hTC-cDNA, the procedure described in Example 8 was used. In addition to the described homology screen, three consecutive RACE (rapid Amplification) reaction was performed. M from human leukemia cell line K562 or human testis tissue arathon-Ready cDNA (Clontech) as cDNA source Used. The execution of the individual RACE rounds and the results obtained are described below. In addition, individual fragmentation from successive cDNA clones was performed by PCR. The sequence information obtained in the RACE round was used to amplify the sequence.RACE Round 1: In a final volume of 50 μl, 10 pmol of dNTP-mix was added to 5 μl of K56 2 Marathon-Ready cDNA (from Clontech, catalog No. 7441-1) and the 1x Klen Taq PCR reaction buffer and And 1x Advantage Klen Taq Polymerase Mix (Clon The PCR reaction was performed in (from tech). 5 'region of hTC-EST clone 10pmol inner gene-specific primer GSP2 (5'-GCAA CTTGCTCCAGACACTTCTTCCGG-3 ') and 10 pmol of Marathon adapter primer AP1 (5'-CCATCCTAATA CGACTCACTATAGGGC-3 '; from Clontech) Was added. PCR was performed in four steps. After denaturation at 94 ° C for 1 minute, then Denature at 94 ° C. for 30 seconds, followed by annealing the primers at 72 ° C. for 4 minutes. And 5 cycles to extend the DNA strand were performed. Next, the DNA was heated to 94 ° C. 5 cycles of denaturing for 30 seconds at 70 ° C for 4 minutes Continued. Finally, after 30 seconds of DNA denaturation, primer annealing and chain extension Was performed at 68 ° C. for 4 minutes for 22 cycles. After this PCR, the PCR product was diluted 1:50. 5 μl of this dilution is 1x 10 Klen Taq PCR reaction buffer and 1x Advantage K 10 pmol in len Taq polymerase mix DNTP-mix and 10 pmol of primers GSP2 and 10 pmo l of "Nested" Marathon adapter primer AP2 (5'-A CTCACTATAGGGCTCGAGCGGGC-3 '; from Clontech ) Was used for a second "nested" PCR. The PCR condition was the first P Corresponds to the parameter selected in CR. The only exception is the last PC Only 16 cycles were selected in the R stage instead of 22 cycles. As a product of this nested RACE PCR, a DNA having a length of 1153 bp A fragment was obtained. This fragment was prepared using TA from Invitrogen. Cloning into cloning vector pCR2.1, complete double-stranded sequence (FIG. 8 and SEQ ID NO: 3). Nucleotides 974 to 1153 are nucleotides of the hTC-cDNA shown in FIG. This corresponds to the tide regions 1629 to 1808. HTC-cDNA sequence shown in FIG. Nucleotide region from bp1 to bp973 that does not show any homology to The area corresponds to the intron sequence of the hTC gene (data not shown). 3 ' The splice consensus sequence is located at the exon-intron transition. Intron sequence Uses incompletely spliced mRNA as starting material for cDNA synthesis It may have been. Genomic DNA contamination in cDNA was also found. Could be a description of the intron sequence to be performed.RACE Round 2: Based on the sequence data obtained in the first RACE round, the RACE product 1 Gene-specific primer GSP5 from the 5 'region (5'-GGCAGTGACC AGGAGGCAACGAGAGG-3 ') and AP A second RACE was performed with one primer. Marath from human testis on-Ready cDNA (from Clontech; catalog no. 7414-) 1) was used as a cDNA source. First PCR in RACE round 1 The same PCR conditions were chosen. Also, in RACE Round 2, the first P After CR, a second "Nesty" was performed using the diluted PCR product as a cDNA source. ”PCR was continued. Gene-specific primer from the 5 'region of RACE product 1 -GSP6 (5'-GGCACACTCGGCAGGAAACGCACATGG -3 ') and AP2 primers as "nested" PCR primers Was. Conditions correspond to nested PCR parameters from RACE round 1 did. RACE round 2 nested PCR from 412 bp long PCR product The product was cloned from the TA cloning vector pCRII-Topo from Invitrogen. And sequenced completely (FIG. 9 and SEQ ID NO: 4). bp26 The sequence segment from 7 to bp 412 is complete with the 5 'region of the product from RACE1. All are homologous. The region from bp1 to bp266 contains the RACE product 1 at the 5 'end. Extend. This RACE product 2 is probably all in the intron region of the hTC gene. Yes (data not shown).RACE Round 3: The third RACE also identified the hTC-cDNA region located in the 5 'direction. I did it. Based on sequence results from RACE round 2, gene-specific primers Mer GSP9 (5'-CCTCCTCTGTTCACTGCTCTGGGCC-3 ') From the 5' region of RACE product 2, AP1 primer and Marathon-Ready cDNA from human testis (From Clontech) in a new RACE. RACE condition is R It was the same as that used for the first PCR of ACE1 and ACE2. RACE product 2 Gene-specific primer GSP10 (5'-CGTAAGTT TATGCAAACTGGACAGG-3 ') and AP2, round 1 Followed by a "nested" R according to the "nested" PCR of In ACE, a fragment of 1012 bp length (FIG. 10 and SEQ ID NO: 5) Was amplified and cloned into the TA cloning vector pCRII-TOPO. It has become. Subsequent sequencing allows the 3 'region of this RACE fragment ( bp817-bp1012) still clearly shows the intron sequence of the hTC gene It was revealed. The region from bp889 to bp1012 is the RACE product Completely homologous to the 2 'region. On the other hand, this flag from bp1 to bp816 5 'region corresponds to bp814-bp16 of the hTC-cDNA shown in FIG. It is the same as 29 areas. Possible 5 'splice consensus sequence is exon-in Located at the Tron transition.Example 7 The sequence information obtained from RACE2 and clone AA281296 PCR was performed to clone the fragment. Mar from human testis athon-Ready cDNA (from Clontech; Cat. No. 74) 14-1) was used as a cDNA source. The PCR mixture was described in RACE1 Although primer was present (see Example 6), primer C5 from the 5 'region of RACE2 F (5'-CGAGTGGG ACACGGTGATCTCTGCCC-3 ') and clone AA281296. Primer C3B from the 3 'end (5'-GCACACCTTTGGTCACT CCAAAATTCC-3 ') was used. PCR was performed in two steps. 1 at 94 ° C Minutes of denaturation, then denature at 94 ° C. for 30 seconds, then plate at 68 ° C. for 4 minutes. 36 cycles of annealing the immers and elongating the DNA strand were performed. A 2486 bp long DNA fragment, hereinafter referred to as C5F fragment, Obtained as the product of this PCR. Is this fragment Invitrogen And cloned into their TA cloning vector pCRII-TOPO. It was subjected to main-strand sequencing. C5F fragment and AA281296 claw Comparison of the DNA sequences of the motifs revealed that 182 b p was shown to have an in-frame insertion (positions 2352-2533, FIG. 1). . Further comparison of sequence and DNA of C5F fragment from 3RACE rounds Puts the intron already identified in RACE2 at the 3 'end of C5F. It was revealed to exist. 3 'splice consensus sequence is exon-intro Located in the transition area. In summary, the DNA sequence of the C5F fragment is thus 9 (positions 64-278) and the sequence data (positions shown in FIG. 1). 1636 to 3908).Example 8 To clone the 5 'end of hTC-cDNA, the procedure described in Example 6 was used. In addition to the described RACE protocol, homology screening (Ausubel et al., 1987). Human erythroleukemia 5'-source from human leukemia cell line K562 Tretch plus cDNA library (from Clontech, catalog number HL5016b) Was used as a cDNA source. Primed with this random and oligo-dT About 3 × 10⁶Pfu was plated, and Ausubel et al. Used for screening as described in 7). 719 bp length radioactivity Labeled hTC-DNA fragment (corresponding to positions 1685 to 2404 in FIG. 1) Was used as a probe. After rescreening with the same hTC probe, 20 putatively positive lambda clones Clone 12 was confirmed to be positive. Plaque purification and λ DNA preparation (Au subbel et al., 1987), and insert the 4 kb insert into pBluescript. And was sequenced (Figure 11 and SEQ ID NO: 6). RACE clone sequence, DNA sequence of clone AA281296 and lambda By comparison of the clone 12 sequences, this clone identified in the homology screen was identified. 1 encodes the 5 'portion of the hTC-cDNA, and putatively at position 63 in FIG. ATG start codon. Same reading frame in 5 'of this ATG There is no stop codon. Subsequent sequence analysis indicated that lambda clone 12 was probably at position 16 It is revealed to contain 56 to 2004 introns. Very well kept The 5 'and 3' splice sites preserved support this hypothesis. hTC-cDNA The sequence that encodes then continues from position 2005 to position 2382. λ clone 1 Sequence from 2383 to 3 'end of 2 is clearly open in reading frame-4 3 shows a reading frame. By bioinformatic analysis of the corresponding DNA sequence, Over approximately 400 bp, the reading frame is hTC cD It was shown to be identical to various ESTs unrelated to NA. Therefore, λ claw Step 12 is essentially the 5 'end of the hTC-cDNA and another cDNA clone of unknown function. It is a chimeric clone consisting of a loan. A schematic summary showing the relative arrangement of RACE products and homology screens is shown in FIG. It is shown in FIG. λ clone 12 (positions 21 to 1655 in FIG. 11), C5FPCR product (Positions 1636-3908 in FIG. 1) and EST AA 281296 (positions in FIG. 1). 3909-4042), the complete sequence of hTC-cDNA (FIG. 1) was assembled. .Example 9 Reverse transcriptase consensus sequence (Poch et al., 1989, Xiong and Eickbus h, 1990) and the phTC protein sequence (FIG. 2 and SEQ ID NO: 2). As a result, a total of seven reverse transcriptase motifs (RT motifs) were identified (FIG. 13). ). Within these motifs, some amino acids are between the RT consensus sequence and phTC. Not only is it highly conserved when compared to the uprotest telomerase protein Have been. Thus, for example, two aspartic acids (positions 868 and 86 in FIG. 2) 9) is completely conserved in RT motif 5 (FIG. 13). Other reverse transcriptase RT motif 7 (Poch et al., 1989, Xiong and Ei) ckbush, 1990) shows only in the human catalytic telomerase subunit. And not shown for the Uprotes protein (FIG. 13). Can only be found in telomerase proteins, and in other reverse transcriptases The structural features that cannot be found are also prominent. Telomerase motif (Figure 2 positions 553 and 565) are present in any previously known protein Not so it is this protein family -Specific structure. Only identified in catalytic telomerase proteins An additional feature is the distance between RT motifs 3 and 4, which is 107 amino acids. Is significantly larger than other RTs. These features indicate that telomeres from different species The catalytic subunit of zeolites probably represents another subgroup of RNA-dependent DNA polymerases Indicates configuration.Example 10 Telomerase RNA subunit (hTR) expression correlates with telomerase activity No, but instead is ubiquitously recognized (Feng et al., 1995). Therefore, the catalyst Whether the expression of the romelases subunit is associated with telomerase activity Problems arise. Northern blot experiments (Ausubel) to analyze the level of hTC expression 1987). Numerous RNA preparations from normal human tissues (Clo ntech; catalog number 7760-1) or RNA from human cancer cell lines Commercially available as a sample (from Clontech; catalog number 7757-1) A Northern blot was prepared. 719 bp long radioactively labeled hTC D The NA fragment (positions 1685-2404 in FIG. 1) was used as a probe. Incubate membrane with probe according to manufacturer's instructions (Clontech) did. Approximately 9.5 kb and 4.4 kb sizes that cross-hybridize with the probe Two major RNA transcripts as well as about 6 kb of additional RNA transcript were tested. 8 human cell lines tested (3 leukemia cell lines, 3 cancer cell lines, 1 melanoma And one lymphoma) (Figure 15, Figure A). By comparison, hT C mRNA is most strongly expressed in leukemic cell lines K-562 and HL-60. (Fig. 15, Fig. A). On the contrary Normal tissues tested (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney and pancreas) Did not detect the hTC transcript (FIG. 15, FIG. B). these Since telomerase activity could not be detected in tissues (Kim et al. 94) This result is not surprising. These data indicate that induction of hTC expression activates telomerase during tumor development To play an important role inExample 11 Various cDNA libraries (from human leukemia cell line K562 and human testis) Clontech Marathon Ready cDNA and human promyelocytic CDNA from the leukemia cell line HL60) Several PCRs that differ only slightly in size when subjected to PCR amplification The product was always obtained. To elucidate the differences between different hTC-PCR products, Primer C5A (5'-CCGGAAGAGGTTCTGGAGCAAGTTT GC-3 ') and C3B (5'-GCACACCTTTGGTCACTCCAA) FIG. 1 from bp 1783 to bp 3901 using ATTCC-3 '). The indicated fragment of hTC cDNA was amplified. From K562 leukemia cells Marathon-Ready cDNA from Clontech; catalog No. 7441-1) was used as a cDNA source (PCR1 and 2). Third PC For R, the primer GSP1 forward (5'-GGCTGATGAGTGTGTG TAGTCGTGCGAG-3 ') and HTRT3A (5'-GGGTGGCC) 1 from the HL60 cDNA using ATCAGTCCAGGATGG-3 '). HTC fragment from bp 1695 to bp 3463 of hTC cDNA Was amplified. The conditions for the three PCR reactions are described below: In the first PCR, in a final volume of 50 μl, 10 pmol of dNTP mix Was added to 5 μl of K562 Marathon-Ready cDNA and 1 × Klen Taq PCR reaction buffer and 1x Advantage Klen Perform PCR reaction in Taq polymerase mix (from Clontech) did. 10 pmol of each primer C5A and C5B was added. PCR This was performed in three stages. After denaturation at 94 ° C for 1 minute, the DNA is first denatured at 94 ° C for 30 seconds. The primers were then annealed at 68 ° C. for 4 minutes to extend the DNA strand. The 35 PCR cycles continued. Finally, chain extension was continued at 68 ° C. for 10 minutes. . The resulting PCR product was cloned into a TA cloning vector from Invitrogen. Cloned into pCRII-TOPO. In the second PCR, 10 pmol of each primer C5A and C3B, 10 pmol dNTP mix and 2 U Taq DNA polymerase (Gibc o-BRL) with 5 μl of K562 Marathon-Ready cDNA And 1x PCR buffer (Perkin El) in a final volume of 50 μl. (from the mer). PCR was performed in three steps. First, DN A was denatured at 94 ° C for 3 minutes. Next, the DNA was continuously changed at 94 ° C for 45 seconds. Followed by primer annealing at 68 ° C for 1 minute, followed by 3 hours at 72 ° C. Continued 34 cycles of elongating the DNA strand for minutes. In the final PCR stage, the last Chain extension was performed at 72 ° C. for 10 minutes. The obtained PCR product is transferred to Invitroge n was cloned into the TA cloning vector pCR2.1. In the third PCR, first, the cD from Boehringer Mannheim was used. Human promyelocytic cell line HL60 using NA synthesis kit according to manufacturer's instructions CDNA synthesis from 2 μg of poly-A RNA treated with DNase I from did. Next, 1 μl of this HL60 cDNA was added at 10 pm in a final volume of 50 μl. ol of each primer GSP1 forward and HTRT3A and 10 pmo Mix with 1 dNTP mix and mix with 1xKlen Taq PCR reaction buffer and And 1x Advantage Klen Taq Polymerase Mix (Clon After addition of 1.25 μl of DMSO (from tech), the PCR reaction was performed. Was. The PCR was continued in three stages. After denaturation at 94 ° C for 3 minutes, 37 cycles The DNA was first denatured at 94 ° C. for 1 minute, and then Was annealed to extend the DNA strand. Further ingress at 68 ° C for 10 minutes The reaction was terminated by the incubation. Transfer PCR product to TA cloning vector Cloned into pCR2.1-TOPO. Complete hTC cDNA fragment cloned from PCR 1 and 2 HTC cDNA fragment obtained from double-stranded sequencing and PCR3 In addition to the hTC cDNA shown in FIG. It has been shown that four variants of this cDNA are present in human cells, ie : Human hTC cDNAMutant 1Is the nucleotide 2345 to 2526 It is characterized by a deletion as small as 182 bp. This deletion is read ORFs that have been replaced with a deleted hTC protein that lacks Bring. Human hTC cDNAMutant 2Corresponds to nucleotides 2184 to 2219 A 36 bp deletion is shown. RT motif 3 is lost as a result of this deletion It is. However, the reading frame is retained and selectively lacks RT motif 3. Protein is produced. Human hTC cDNAMutant 3Is a combination of variants 1 and 2. It Is a deletion from bp 2184 to 2219 and a deletion from bp 2345 to 2526 Showing both loss. Human hTC cDNAMutant 4Is the nucleotide from bp 3219 to bp 3842 Characterized by the loss of the reotide region. This missing sequence is a sequence that is not homologous to hTC. Has been replaced by a column. From bp 3843 onwards, the sequence is the hT shown in FIG. It is completely identical again to the C sequence. The sequence of Mutant 4 is shown in FIG. 5 'selected With the primers, it was derived from bp1783 of the hTC cDNA shown in FIG. Begin. Non-homologous regions are highlighted in bold and position 3219 to position 3 451 (FIG. 14 and SEQ ID NO: 7) from human uterine tumor (Accession A A299878) at the DNA level to the extent of 98.7%.Example 12 In order to obtain an antiserum having specificity for the catalytic subunit of human telomerase, The available nucleotide sequence (FIG. 1) was translated into an amino acid sequence (FIG. 2). secondary Structure prediction program (PROTE from DNAStar software package) AN, DNASTAR Inc. , Madison, WI, USA) Two peptides that elicited an immune response with some probability were selected. These are Below are the peptides, denoted by the one letter code for the amino acids: The underlined cysteine is not derived from the telomerase sequence, but As additional linkers. Thiol-reactive coupling reagent m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy Using keyhole li with succinimide ester (MBS) mpet) hemocyanin (KLH). In each case Two rabbits were immunized with these ligated peptides at intervals of 2 to 4 weeks. Exemption Prior to the immunization, 5 ml of blood was drawn to obtain preimmune serum. After 4 immunizations, Similarly, 5 ml of blood was drawn to obtain blood. Westernize these sera In a blotting experiment (Ausubel et al., 1987) Was tested for reactivity (Example 13).Example 13 Be ready to analyze catalytic telomerase subunit proteins A terrier expression experiment was performed. The construction of these experiments is described below: AA2812 as described in Example 2 for the expression construct pMalEST The insert in 96 clones was cut out with restriction enzymes EcoRI and NotI, and Fill the cleavage site with a Klenow fragment (Ausubel) 1987); the insert was then transformed into the bacterial expression vector pMAL-C. Maltose binding protein 2 (from New England Biolabs) It was cloned into a quality reading frame. Use vector pMAL-C2 as restriction enzyme Digest with PstI, Protruding single-stranded ends were removed with T4 DNA polymerase (Ausubel). Et al., 1987). The expression construct pMALA1 is the nucleic acid of FIG. 1 from position 1789 to position 3908. Including otide sequences. Primer C5A (5'-ACCGGAAGAGGTGTCT GGAGCAAGTTG-3 ') and C3B (5'-GCACACCTTTGGG) TCACTCCAAATTCC-3 ') 562 Marathon-Ready cDNA Library (Clonte ch, amplify this DNA fragment from catalog number 7441-1), In a TA cloning vector pCRII-TOPO from Invitrogen Cloned. PCR conditions were as described in Example 7. Expression The insert was cut out using the restriction enzyme EcoRI for the construct pMALA1. The Klenow fragment was used to fill the cleavage site (Ausubel et al., 198). 7); Next, a bacterial expression vector pMAL-C cut with a restriction enzyme XmnI. Clone insert into 2 (from New England Biolabs) It has become. Next, protein expression in the bacterial strain Escherichia coli DH5α was determined. These constructs were used for Expression conditions are New England Biola bs as described in the instructions given by the catalog (catalog number 800). Was. The prepared bacterial lysate was subjected to Western blotting experiment (Aus ubel et al., 1987).Example 14 Using the antiserum from Example 12, the bacterial lysate from Example 13 was used. The set was analyzed on a Western blot (Ausubel, 1987). The portion of the fusion corresponding to the maltose binding protein is approximately 43 kDa in size. Therefore, about 74 kDa each for the pMalEST and pMalA1 constructs. And a 106 kDa fusion protein is expected. Comparing the serum after the first immunization with the pre-immune serum, It was revealed that a specific antibody had been formed (FIG. 16). In addition, Reacts with antisera in addition to the expected 74 kDa and 106 kDa proteins Smaller protein fragments were also found. These smaller products are Probably from an immature product. Epitope of serum B on fusion protein from expression using pMalEST Only exists. In contrast, serum on the fusion protein from pMalA1 There are B and C epitopes. For this reason, antiserum C is pMalEST Larger protein from expression experiments using pMalA1, which does not recognize the expression product Recognize only quality fragments. This result demonstrates the high specificity of the antiserum produced. Emphasize.Example 15 To be able to analyze the protein of the catalytic telomerase subunit The protein component should be reconstituted in vitro with the RNA component. The constructs for these experiments are described below: Primer HTR9BAM (5'-CGCGGATCTCATAATACGACT CACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGCTG-3 ') and HT R2BAM (5'-CGCGGATCCCGGGCGA GGGGTGACGGATCC-3 ') using 293 cell cDNA library A 504 nt long RNA component (Feng et al., 1995) was amplified. Step Limer HTR9BAM contains a T7 promoter from nucleotides 10 to 29. No. For PCR, 10 pmol dNTP mix in a final volume of 100 μl Added to 3 μl cDNA from 293 cells, 0.5 μl Taq polymerase Perform PCR reaction in 1 × PCR reaction buffer containing (from Gibco) did. Add 10 pmol of each primer HTR9BAM and HTR2BAM Added. PCR was performed in three steps. After denaturation at 94 ° C for 10 minutes, Denature DNA for 1 minute, then anneal primer at 62 ° C for 2 minutes And a 35 PCR cycle to extend the DNA strand was continued. Finally, at 72 ° C Chain extension was continued for 4 minutes. After restriction digestion of the resulting PCR product with BamHI, Ba in vector pUC19 so that the RNA component is under the control of the T7 promoter It was cloned into the mHI cleavage site. This construct is referred to below as HTR504. The 3411 bp long cDNA fragment (positions 60-3470, FIG. 1) ) Is cloned into the vector PCRII TOPO (from Invitrogen) did. Detailed information on cloning is provided in Examples 8 and 7 and FIG. You. In this construct, termed HTC FL, the T7 promoter is hTC cD It is located 5 'before NA. After addition of the hTC FL construct, production in a commercially available transcription / translation system Catalytic telomere according to the manufacturer's instructions (Promega; Catalog No. L4610) The lase protein component was synthesized.³⁵Expected using cysteine labeled with S In vitro translation of the 127 kDa product The success or failure was reported by SDS-PAGE (Ausubel et al., 1987). (FIG. 17). Set up the transcription system according to the manufacturer's instructions (Ambion; Catalog No. 1344). Used or by Pokrovskaya and Gurevic (1994). The telomerase RNA component was synthesized using the method described. For in vitro reconstitution, 50 μl of the above containing the hTC FL construct Add 0.5 μg of hTRNA to the translation mixture and incubate at 37 ° C. for 10 minutes. Was added. The enzyme activity of 2 μl of this mixture was determined by TRAP assay (NWK). im et al., 1994). Telomerase purified from HeLa cells (Shay et al., 1994) as a positive control. Used. As can be seen in FIG. Both natural enzymes have the same product pattern, that is, the nuclei characteristic of telomerase. This produces leotide ladder. This result also indicates that a single protein It also demonstrates that the amount is sufficient for the enzyme telomerase activity. In addition to the TRAP assay described, a direct telomerase assay (Shay et al.) , 1994) was tested for its activity. this In experiments, the recombinant hTC protein was also characterized by the characteristic nucleotide ladder. Successful reconstruction of the quality and telomerase RNA components is demonstrated. In summary, the identified and fully cloned hTC-cDNA was Constructing the catalytic subunit of telomerase is described herein at the functional level. Could be shown.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 43/00 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 9/12 1/68 ＺＣ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/48 (31)優先権主張番号１９８１６４９６．３ (32)優先日平成10年４月14日(1998．4．14) (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バイヘル，バルタードイツ連邦共和国デー―51519オーデンタール・デユンナーアウエ15 (72)発明者ビツク，マレザドイツ連邦共和国デー―51065ケルン・アンドレアス―グリフイウス―シユトラーセ 26 (72)発明者ツボフ，ドミトリドイツ連邦共和国デー―51061ケルン・ロゲンドルフシユトラーセ59──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 35/00 C07K 16/40 43/00 C12N 9/12 C07K 16/40 C12Q 1/48 C12N 9/12 1/68 Z C12Q 1/48 C12N 15/00 ZNAA 1/68 A61K 37/48 (31) Priority claim number 1981694.3 (32) Priority date April 14, 1998 (April 14, 1998) ( 33) Priority Claimed Country Germany (DE) (81) Designated State EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD) , SZ , UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH , CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ , TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Bijer, Balter Germany 51515 Odental de Junnar Aue 15 (72) Inventor Bitz, Maleza Germany Federal Republic Day-51 065 Cologne Andreas- Rifuiusu - Shiyutorase 26 (72) inventor Tsubofu, Dmitri Federal Republic of Germany Day -51,061 Cologne and Russia Gen Dorf Shiyu Butler Se 59

Claims

【特許請求の範囲】１．触媒的に活性のあるヒトテロメラーゼサブユニット、その機能的同等物、その変異体及びその触媒的に活性のあるフラグメント。２．図２に示されるアミノ酸配列またはその機能的同等物を含んでなる、請求の範囲１に記載されたテロメラーゼ。３．請求の範囲１及び２に記載された化合物並びにそれらの機能的同等物をコードする核酸配列。４．図１に示されるＤＮＡ配列またはその機能的同等物を含んでなる、請求の範囲３に記載された核酸配列。５．請求の範囲３または４に記載された核酸配列に結合するアンチセンス核酸。６．必要な場合１つまたはそれ以上の標識で標識された、請求の範囲１及び２に記載されたテロメラーゼに対する抗体。７．テロメラーゼを製造するための請求の範囲３及び４に記載された核酸配列の使用。８．診断のための請求の範囲６に記載された抗体の使用。９．薬剤を製造するための請求の範囲６に記載された抗体の使用。１０．請求の範囲３及び４に記載された核酸配列、特にＤＮＡを含んでなるベクター。１１．請求の範囲１０に記載されたベクターを保有する微生物。１２．請求の範囲１及び２に記載されたテロメラーゼを含んでなるヒトテロメラーゼのモジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイ。１３．請求の範囲１１に記載された微生物を培養し、テロメラーゼを単離することを特徴とする、請求の範囲１及び２に記載されたテロメラーゼの製造方法。[Claims] 1. Catalytically active human telomerase subunit, its functional equivalent , Variants thereof and catalytically active fragments thereof. 2. A contract comprising the amino acid sequence shown in FIG. 2 or a functional equivalent thereof. The telomerase according to claim 1. 3. Compounds as claimed in claims 1 and 2 and their functional equivalents Encoding nucleic acid sequence. 4. Claims comprising the DNA sequence shown in Figure 1 or a functional equivalent thereof. 3. The nucleic acid sequence according to range 3. 5. An antisense nucleus that binds to the nucleic acid sequence according to claim 3 or 4. acid. 6. Claims 1 and 2 labeled with one or more labels where necessary. An antibody against the telomerase described in 2. 7. A nucleic acid sequence according to claims 3 and 4 for producing telomerase. Use of columns. 8. Use of the antibody according to claim 6 for diagnosis. 9. Use of the antibody according to claim 6 for producing a medicament. 10. It comprises the nucleic acid sequences according to claims 3 and 4, in particular DNA. vector. 11. A microorganism carrying the vector according to claim 10. 12. Human terrorism comprising the telomerase according to claims 1 and 2. Screening assays to identify modulators of merase. 13. Culturing the microorganism according to claim 11 and telomerase; Wherein the telomerase according to claims 1 and 2 is isolated. Production method.