JP2002508170A - Mammalian calcitonin-like polypeptide-1 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な哺乳動物Zcalc1ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および抗体および抗イディオタイプ抗体を包含する関連の組成物および方法。   (57) [Summary] Novel mammalian Zcalc1 polypeptides, polynucleotides encoding said polypeptides, and related compositions and methods, including antibodies and anti-idiotype antibodies.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 発明の背景 多細胞生物の細胞の増殖および分化は、ホルモンおよびポリペプチドの成長因
子によりコントロールされる。これらの拡散性分子は細胞が互いに連絡し、協力
して細胞および器官を形成し、かつ損傷した組織を修復および再生するように作
用できるようにする。ホルモンおよび成長因子の例は、ステロイドホルモン（例
えば、エストロゲン、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、FSH 、インターロ
イキン、血小板由来成長因子(PDGF)、表皮成長因子(EGF) 、顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子(GM-CSF)、エリトロポイエチン(EPO) およびカルシトニン
である。BACKGROUND OF THE INVENTION The proliferation and differentiation of cells in multicellular organisms is controlled by hormones and polypeptide growth factors. These diffusible molecules allow cells to communicate with each other, cooperate to form cells and organs, and act to repair and regenerate damaged tissue. Examples of hormones and growth factors include steroid hormones (eg, estrogen, testosterone), parathyroid hormone, FSH, interleukins, platelet derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), granulocyte-macrophage colony stimulating factor ( GM-CSF), erythropoietin (EPO) and calcitonin.

【０００２】 ホルモンおよび成長因子は、タンパク質への結合により細胞の代謝に影響を及
ぼす。タンパク質は、細胞内のシグナリング経路に連鎖した一体的膜タンパク質
、例えば、第2 メッセンジャー系であることができる。タンパク質の他のクラス
は、可溶性分子、例えば、転写因子である。[0002] Hormones and growth factors influence the metabolism of cells by binding to proteins. The protein can be an integral membrane protein linked to an intracellular signaling pathway, eg, a second messenger system. Another class of proteins are soluble molecules, such as transcription factors.

【０００３】 ポリペプチド様カルシトニンおよびカルシトニン遺伝子関係ペプチド(CGRP)は
特に重要であり、これらは骨関係障害または血管の障害の治療に使用することが
できる。これらのペプチドは有用であるが、それらの限界的有効性により制限さ
れる。したがって、骨および血管の障害の治療において有用である、新しいペプ
チドの発見および開発が要求されている。[0003] Polypeptide-like calcitonin and calcitonin gene-related peptide (CGRP) are of particular importance and can be used for the treatment of bone-related disorders or vascular disorders. These peptides are useful, but are limited by their marginal efficacy. Thus, there is a need for the discovery and development of new peptides that are useful in treating bone and vascular disorders.

【０００４】 発明の要約 本発明は、新規なポリペプチドおよび関係する組成物および方法によりこの要
求を扱う。1 つの面において、本発明は、「カルシトニン様ポリペプチド-1」ま
たは「Zcalc1」と命名する哺乳動物サイトカインをコードする単離されたポリヌ
クレオチドを提供する。シグナル配列は配列識別NO:2のアミノ酸残基1 からアミ
ノ酸残基21、アラニンに延びる。これは配列識別NO:2のアミノ酸残基22、グリシ
ンからアミノ酸残基83、セリンに延びる天然に存在する成熟配列( また、配列識
別NO:13 により定められる) を生ずる。カルボキシル末端をさらにプロセシング
すると、配列識別NO:2のアミノ酸残基22、グリシンから、アミノ酸残基70、スレ
オニンに至る成熟配列( また、配列識別NO:14 により定められる) が生ずる。活
性なヒトZcalc1ポリペプチドは、また、配列識別NO:2のアミノ酸残基38、システ
インら、アミノ酸残基70、スレオニンまで延びる成熟配列( また、配列識別NO:5
により定められる) から構成されたアミノ酸配列により表される33アミノ酸の配
列から構成されている。好ましい態様において、配列識別NO:5の残基33における
スレオニンはアミド化されている。追加の態様において、ポリペプチドは親和標
識をさらに含む。それ以上の態様において、ポリヌクレオチドはDNA である。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention addresses this need with novel polypeptides and related compositions and methods. In one aspect, the invention provides an isolated polynucleotide encoding a mammalian cytokine designated "calcitonin-like polypeptide-1" or "Zcalc1." The signal sequence extends from amino acid residue 1 to amino acid residue 21, alanine of SEQ ID NO: 2. This results in the naturally occurring mature sequence extending from amino acid residue 22 of SEQ ID NO: 2, amino acid residue 83 to glycine to serine (also defined by SEQ ID NO: 13). Further processing of the carboxyl terminus results in a mature sequence from amino acid residue 22, glycine of sequence identification NO: 2 to amino acid residue 70, threonine (also defined by sequence identification NO: 14). Active human Zcalc1 polypeptide is also a mature sequence extending to amino acid residue 38, cysteine, etc., amino acid residue 70, threonine of SEQ ID NO: 2 (also SEQ ID NO: 5).
(Defined by the formula (1)) consisting of a sequence of 33 amino acids represented by the amino acid sequence In a preferred embodiment, the threonine at residue 33 of SEQ ID NO: 5 is amidated. In additional embodiments, the polypeptide further comprises an affinity label. In a further embodiment, the polynucleotide is DNA.

【０００５】 Zcalc1の他のアレルはクローニングされており、配列識別NO:10 および11によ
り定められる。シグナル配列は配列識別NO:11 のアミノ酸残基1 からアミノ酸残
基21、アラニンに至る。シグナル配列を切断すると、配列識別NO:11 のアミノ酸
残基22、グリシンからアミノ酸残基248 、ロイシンに至る成熟配列が生ずる。Zc
alc1のこのアレルの活性部分は、配列識別NO:11 のアミノ酸残基38、システイン
からアミノ酸残基248 、ロイシンに至る配列から構成されている。このポリペプ
チドは、また、配列識別NO:12 により表される。[0005] Other alleles of Zcalc1 have been cloned and are defined by SEQ ID NOs: 10 and 11. The signal sequence extends from amino acid residue 1 to amino acid residue 21, alanine of SEQ ID NO: 11. Cleavage of the signal sequence results in a mature sequence from amino acid residue 22, glycine to amino acid residue 248 of sequence identification NO: 11, to leucine. Zc
The active portion of this allele of alc1 is composed of amino acid residue 38 of SEQ ID NO: 11, a sequence from cysteine to amino acid residue 248, and leucine. This polypeptide is also represented by SEQ ID NO: 12.

【０００６】 下記の保存的置換を配列識別NO:2および配列識別NO:11 において行うことがで
き、そしてZcalc1の活性は残るであろう。Trp をThr(これは配列識別NO:12 、13
、14および15についてアミノ酸残基10である) の代わりに位置31に挿入すること
ができる；Val またはThr をGlu 残基( これは配列識別NO:12 、13、14および15
についてアミノ酸残基11である) の代わりに位置32に挿入することができる；Ph
e をArg 残基( これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基12
である) の代わりに位置33に挿入することができる；Met をLeu(これは配列識別
NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基13である) の代わりに位置34に挿
入することができる；Thr をSer(これは配列識別NO:12 、13、14および15につい
てアミノ酸残基15である) の代わりに位置36に挿入することができる；Ile をVa
l(これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基19である) の代
わりに位置40に挿入することができる。さらに、Ile を配列識別NO:5の残基3 に
おけるVal の代わりに挿入することができ、そしてZcalc1の活性は残るであろう
。また、前述の変異型をコードするポリヌクレオチドが特許請求される。[0006] The following conservative substitutions can be made in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 11 and the activity of Zcalc1 will remain. Trp is replaced by Thr (this is sequence identification NO: 12, 13
, 14 and 15 can be inserted at position 31 instead of amino acid residue 10; Val or Thr is replaced by a Glu residue (this is SEQ ID NO: 12, 13, 14, and 15).
For amino acid residue 11) can be inserted at position 32; Ph
e to an Arg residue (this is amino acid residue 12 for sequence identification NOs: 12, 13, 14, and 15)
Can be inserted at position 33 instead of Met; Leu (this is the sequence
Thr can be inserted at position 34 instead of NO: 12, 13, 14 and 15; Thr is the amino acid residue for SEQ ID NOs: 12, 13, 14 and 15. 15) can be inserted at position 36; Ile is Va
1 (which is amino acid residue 19 for sequence identification NOs: 12, 13, 14, and 15) can be inserted at position 40. In addition, Ile can be inserted in place of Val at residue 3 of SEQ ID NO: 5, and the activity of Zcalc1 will remain. Also, polynucleotides encoding the above variants are claimed.

【０００７】 配列識別NO:11 において、下記の追加の変化を行うことができ、そしてZcalc1
の活性は残るであろう。Glu をArg の代わりに位置85に挿入することができる；
Phe をLeu の代わりに位置86に挿入することができる；Ile またはAla をGlu の
代わりに位置87に挿入することができる；Asp をGlu の代わりに位置88に挿入す
ることができる；Val またはIle をAla の代わりに位置89に挿入することができ
る；Thr をLeu の代わりに位置90に挿入することができる；Thr をAsn の代わり
に位置92に挿入することができる；Ile をLeu の代わりに位置93に挿入すること
ができる；Lys またはAsn をGlu の代わりに位置95に挿入することができる；Gl
y をArg の代わりに位置96に挿入することができ、そしてLeu またはPhe をIle
の代わりに位置97に挿入することができる。In sequence identification NO: 11, the following additional changes can be made, and Zcalc1
Will remain active. Glu can be inserted at position 85 instead of Arg;
Phe can be inserted at position 86 instead of Leu; Ile or Ala can be inserted at position 87 instead of Glu; Asp can be inserted at position 88 instead of Glu; Val or Ile Can be inserted at position 89 instead of Ala; Thr can be inserted at position 90 instead of Leu; Thr can be inserted at position 92 instead of Asn; Ile can be inserted at position 92 Can be inserted at position 93; Lys or Asn can be inserted at position 95 instead of Glu; Gl
y can be inserted at position 96 instead of Arg, and Leu or Phe
Can be inserted at position 97 instead of

【０００８】 配列識別NO:2および11における機能のために重要であると考えられるアミノ酸
残基は、位置30におけるAsp 、位置35におけるPro 、位置37におけるLys 、位置
38におけるCys 、位置39におけるGlu 、位置41におけるCys 、位置47におけるGl
u 、位置91におけるGlu 、位置94におけるCys 、位置108 におけるGly 、位置12
9 におけるLys 、および位置130 におけるGly である。 配列識別NO:5の態様について、重要な残基は位置1 におけるCys 、位置2 にお
けるGlu 、位置4 におけるCys 、および位置11におけるGlu である。The amino acid residues considered to be important for the function at sequence identification NOs: 2 and 11 are: Asp at position 30, Pro at position 35, Lys at position 37, position Lys
Cys at 38, Glu at position 39, Cys at position 41, Gl at position 47
u, Glu at position 91, Cys at position 94, Gly at position 108, position 12
Lys at 9 and Gly at position 130. For the embodiment of SEQ ID NO: 5, the key residues are Cys at position 1, Glu at position 2, Cys at position 4, and Glu at position 11.

【０００９】 本発明の第2 面において、(a) 転写プロモーター、(b) Zcalc1ポリペプチドを
コードするDNA セグメント、および(c) 転写ターミネーターを含んで成る発現ベ
クターが提供され、ここでプロモーター、DNA セグメント、およびターミネータ
ーは作用可能に連鎖されている。In a second aspect of the invention, there is provided an expression vector comprising (a) a transcription promoter, (b) a DNA segment encoding a Zcalc1 polypeptide, and (c) a transcription terminator, wherein the promoter, DNA The segments and the terminator are operably linked.

【００１０】 本発明の第3 面において、前述の発現ベクターが導入されている培養された真
核細胞が提供され、ここで前記細胞はDNA セグメントによりコードされるタンパ
ク質のポリペプチドを発現する。In a third aspect of the present invention there is provided a cultured eukaryotic cell into which said expression vector has been introduced, wherein said cell expresses a polypeptide of a protein encoded by a DNA segment.

【００１１】 本発明のそれ以上の面において、ペプチド結合により結合された第1 部分およ
び第2 部分から本質的に成るキメラポリペプチドが提供される。キメラポリペプ
チドの第1 部分は、(a) 配列識別NO:2に示すZcalc1ポリペプチド、(b) 配列識別
NO:5または配列識別NO:12 のアレル変異体、および(c) (a) または(b) に対して
少なくとも90％同一であるタンパク質のポリペプチドから本質的に成る。キメラ
ポリペプチドの第2 部分は、他のポリペプチド、例えば、親和標識から本質的に
成る。1 つの態様において、親和標識は免疫グロブリンFcポリペプチドである。
本発明は、また、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターおよびキメラポ
リペプチドを産生するようにトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。In a further aspect of the present invention there is provided a chimeric polypeptide consisting essentially of a first portion and a second portion connected by a peptide bond. The first part of the chimeric polypeptide comprises (a) the Zcalc1 polypeptide shown in SEQ ID NO: 2, (b) the sequence identification
Consisting essentially of an allelic variant of NO: 5 or NO: 12 and (c) a protein polypeptide that is at least 90% identical to (a) or (b). The second part of the chimeric polypeptide consists essentially of another polypeptide, for example, an affinity tag. In one embodiment, the affinity label is an immunoglobulin Fc polypeptide.
The present invention also provides expression vectors encoding the chimeric polypeptide and host cells transfected to produce the chimeric polypeptide.

【００１２】 本発明の追加の態様は、前述のアミノ酸配列を有するZcalc1ポリペプチドのエ
ピトープを支持する部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに
関する。本発明のZcalc1ポリペプチドのエピトープを支持する部分のアミノ酸配
列を有するペプチドまたはポリペプチドは少なくとも9 、好ましくは少なくとも
15、より好ましくは少なくとも30アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部
分を含むが、前述の本発明のポリペプチドの全体のアミノ酸配列までかつそれを
含む任意の長さのエピトープを支持する部分もまた本発明に包含される。また、
他のポリペプチドまたはキャリヤー分子に融合された、これらのポリペプチドの
任意のものは特許請求される。Zcalc1のこれらのエピトープを支持する部分から
産生された抗体を、細胞培地からのZcalc1の精製において使用することができる
。 本発明の追加の面において、前述のZcalc1ポリペプチドに特異的に結合する
抗体、およびまたZcalc1ポリペプチドに対する抗体を中和する抗イディオタイプ
抗体が提供される。An additional aspect of the present invention relates to a peptide or polypeptide having an amino acid sequence of a portion supporting an epitope of a Zcalc1 polypeptide having the aforementioned amino acid sequence. The peptide or polypeptide having the amino acid sequence of the portion supporting the epitope of the Zcalc1 polypeptide of the present invention has at least 9, preferably at least 9
Includes a portion of such a polypeptide having 15, and more preferably at least 30 amino acids, but also a portion supporting an epitope of any length up to and including the entire amino acid sequence of a polypeptide of the invention as described above. Included in the present invention. Also,
Any of these polypeptides, fused to other polypeptides or carrier molecules, are claimed. Antibodies generated from portions supporting these epitopes of Zcalc1 can be used in the purification of Zcalc1 from cell culture media. In an additional aspect of the invention, there are provided antibodies that specifically bind to the aforementioned Zcalc1 polypeptides, and also anti-idiotypic antibodies that neutralize antibodies to the Zcalc1 polypeptides.

【００１３】 本発明のこれらの面および他の面は、本発明の下記の詳細な説明および添付図
面を参照すると、明らかとなるであろう。[0013] These and other aspects of the invention will become apparent with reference to the following detailed description of the invention and the accompanying drawings.

【００１４】 発明の詳細な説明 本明細書において引用する参考文献のすべての教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [0014] The teachings of all references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

【００１５】 用語「アレル変異体」は、本明細書において、同一染色体遺伝子座を占有する
遺伝子の2 またはそれ以上の異なる形態の任意のものを表すために使用される。
アレルの変動は突然変異により天然に起こり、そして集団内に表現型の多形性を
生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサイレント（コードされたポリペプ
チドに変化なし）であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードすることができる。アレル変異体という用語は、また、本明細書に
おいて遺伝子のアレル変異体によりコードされるタンパク質を表すために使用さ
れる。The term “allelic variant” is used herein to refer to any of two or more different forms of a gene occupying the same chromosomal locus.
Allelic variation occurs naturally due to mutation and can result in phenotypic polymorphism within a population. The mutation in the gene can be silent (no change in the encoded polypeptide) or can encode a polypeptide having an altered amino acid sequence. The term allelic variant is also used herein to describe the protein encoded by an allelic variant of a gene.

【００１６】 用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状ま
たは円形のDNA 分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、
プロモーターおよびターミネーターの配列を包含し、そしてまた1 またはそれ以
上の複製起点、1 またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリア
デニル化シグナル、およびその他を含むことができる。発現ベクターは、一般に
、プラスミドまたはウイルスDNA から誘導されるか、あるいは双方の因子を含有
するすることができる。The term “expression vector” is used to describe a linear or circular DNA molecule comprising a segment encoding a polypeptide of interest, operably linked to additional segments that provide for its transcription. used. These additional segments are
It encompasses promoter and terminator sequences and can also include one or more origins of replication, one or more selectable markers, enhancers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors can generally be derived from plasmid or viral DNA, or contain both factors.

【００１７】 用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして、他の余分または望ましくな
いコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で
使用するために適当な形態であることを表す。The term “isolated” when applied to a polynucleotide, removes the polynucleotide from its natural genetic environment, and thus contains no other extra or undesirable coding sequences, and The protein is in a form suitable for use in the production system of the protein.

【００１８】 用語「作用可能に連鎖された」は、DNA セグメントについて言及するとき、セ
グメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転
写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通ってターミネー
ターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。The term “operably linked” when referring to DNA segments, such that transcription starts at the promoter and coding segments, such that the segments function in concert for their intended purpose, To indicate that the segment is positioned to progress through to the terminator.

【００１９】 「ポリヌクレオチド」は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。ポリ
ヌクレオチドはRNA およびDNA を包含し、天然源から単離されたもの、in vitro
で合成されたもの、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造した
ものであってよい。 用語「プロモーター」は、本明細書において、RNA ポリメラーゼの結合を司り
、かつ転写を開始するDNA 配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野におい
て認識されている意味において使用される。プロモーター配列は普通に、しかし
常にではないが、遺伝子の5'非コーディング領域の中に見出される。“Polynucleotide” is a single or double stranded polymer of deoxyribonucleotide or ribonucleotide bases, read in the direction of the 5 ′ → 3 ′ end. Polynucleotides include RNA and DNA, isolated from natural sources, in vitro
Or synthesized from a combination of natural and synthetic molecules. The term "promoter" is used herein in the art-recognized meaning to refer to the portion of the gene that contains the DNA sequence that controls RNA polymerase binding and initiates transcription. Promoter sequences are commonly, but not always, found in the 5 'non-coding region of a gene.

【００２０】 「可溶性タンパク質」は、細胞膜に結合しないタンパク質のポリペプチドであ
る。“Soluble protein” is a polypeptide of a protein that does not bind to cell membranes.

【００２１】 本発明の好ましい態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列識別NO
:1、またはそれに対する相補的配列に、ストリンジェント条件下にハイブリダイ
ゼーションするであろう。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン
強度およびpHにおいて特定の配列について熱的融点(Tm)よりも約5 ℃低いように
選択される。Tmは、ターゲット配列の50％が完全に合致するプローブにハイブリ
ダイゼーションする温度（規定されたイオン強度およびpH下に）である。典型的
なストリンジェント条件は、塩濃度がpH7 において約0.02M またはそれより低く
かつ温度が少なくとも約60℃である条件である。前述したように、本発明の単離
されたポリヌクレオチドはDNA およびRNA を包含する。DNA およびRNA を単離す
る方法は、この分野においてよく知られている。全体のRNA は、グアニジンＨＣ
ｌ抽出および引き続くCsCl勾配における遠心による単離により製造することがで
きる(Chirgwin et al.、Biochemistry 18:52-94 、1979) 。ポリ(A)+RNA は、Av
ivおよびLeder 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:1408-12 、1972) の方法に従い、
全体のRNA から製造される。相補的DNA(cDNA) は、既知の方法により、ポリ(A)+
RNA から製造される。次いで、Zcalc1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCR により、同定および単離する
。 さらに、本発明のポリヌクレオチドはDNA 合成装置を使用して合成することが
できる。一般に、選択する方法はホスホルアミダイト法である。化学的に合成さ
れた二本鎖DNA を用途、例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントの合成に必要
とする場合、各相補的鎖を別々に作る。短い遺伝子(60 〜80bp) の製造は技術的
に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、次いでそれらをアニールすることによ
って達成することができる。しかしながら、より長い遺伝子(>300bp)の製造につ
いて、特別の戦略を実施しなくてはならない。なぜなら、化学的DNA 合成の間の
各サイクルのカップリング効率はめったに100 ％とならないからである。この問
題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）をモジュール形態で20〜100 ヌクレ
オチド長さの一本鎖のフラグメントから組立てる。下記の文献を参照のこと：Gl
ick 、Bernard R.およびJack J.Pasternak、Molecular Biotechnology,Principl
es & Applications of Recombinant DNA、(ASM Press、ワシントンD.C.1994) 、
Itakura 、K. et al. 、Synthesis and use of synthetic olgonucleotides。An
n.Rev.Biochem.53:323-356(1984)、およびClimie、S. et al. 、Chemical synth
esis of the thymidylate synthase gene 。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:633-63
7(1990) 。In a preferred embodiment of the invention, the isolated polynucleotide has the sequence identification NO
: 1 or its complementary sequence under stringent conditions. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. below the thermal melting point (Tm) for a particular sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. Typical stringent conditions are those where the salt concentration is about 0.02M or less at pH 7 and the temperature is at least about 60 ° C. As mentioned above, the isolated polynucleotides of the present invention include DNA and RNA. Methods for isolating DNA and RNA are well known in the art. Total RNA is guanidine HC
1 and subsequent isolation by centrifugation on a CsCl gradient (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poly (A) + RNA is Av
iv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972),
Produced from total RNA. Complementary DNA (cDNA) is prepared by known methods using poly (A) +
Manufactured from RNA. The polynucleotide encoding the Zcalc1 polypeptide is then identified and isolated, for example, by hybridization or PCR. Further, the polynucleotide of the present invention can be synthesized using a DNA synthesizer. Generally, the method of choice is the phosphoramidite method. When chemically synthesized double-stranded DNA is required for an application, for example, the synthesis of a gene or gene fragment, each complementary strand is made separately. The production of short genes (60-80 bp) is technically simple and can be achieved by synthesizing complementary strands and then annealing them. However, specific strategies must be implemented for the production of longer genes (> 300 bp). This is because the coupling efficiency of each cycle during chemical DNA synthesis is rarely 100%. To overcome this problem, synthetic genes (double-stranded) are assembled in modular form from single-stranded fragments of 20-100 nucleotides in length. See the following document: Gl
ick, Bernard R. and Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principl
es & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington DC 1994),
Itakura, K. et al., Synthesis and use of synthetic olgonucleotides. An
n. Rev. Biochem. 53: 323-356 (1984), and Climie, S. et al., Chemical synth.
esis of the thymidylate synthase gene. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 633-63
7 (1990).

【００２２】 当業者は認識するように、配列識別NO:1、2 、5 、10、11および12に開示され
ている配列はヒトのアレルを表す。これらの配列のアレル変異体は、標準的手順
に従い異なる個体からのcDNAまたはゲノムのライブラリーをプロービングするこ
とによってクローニングすることができる。As those skilled in the art will recognize, the sequences disclosed in SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 10, 11, and 12 represent human alleles. Allelic variants of these sequences can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals according to standard procedures.

【００２３】 本発明は、さらに、他の種からの対応物のタンパク質およびポリヌクレオチド
（種オーソログ）を提供する。特に興味あるものは、他の哺乳動物種、例えば、
ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類からのZcal
c1ポリペプチドである。ヒトZcalc1タンパク質の種相同体は、本発明により提供
される情報および組成物を慣用のクローニング技術と組み合わせて使用して、ク
ローニングすることができる。例えば、タンパク質を発現する組織および細胞の
タイプから得られるｍRNA を使用して、ｃDNA をクローニングすることができる
。本明細書において開示する配列から設計されたプローブでノザンブロットをプ
ロービングすることによって、ｍRNA の適当な源を同定することができる。次い
で、陽性の組織または細胞系統のｍRNA からライブラリーを調製する。次いで、
種々の方法により、例えば、完全なまたは部分的ヒト又はマウスｃDNA でプロー
ビングするか、あるいは開示された配列をベースとする縮重プローブの１または
それ以上の組でプロービングすることによって、タンパク質をコードするｃDNA
を単離することができる。また、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、PCR(Mullis
、米国特許第4,683,202 号) により、本明細書において開示する、配列から設計
されたプライマーを使用して、cDNAをクローニングすることができる。追加の方
法において、cDNAライブラリーを使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフ
ェクトすることができ、そして問題のｃDNA の発現をタンパク質に対する抗体で
検出することができる。また、同様な技術をゲノムのクローンの単離に適用する
ことができる。使用しかつ特許請求において記載するように、言語「ポリペプチ
ドをコードする単離されたポリヌクレオチド、配列識別NO:2により定められる前
記ポリヌクレオチドは」は、配列識別NO:2のポリペプチドのすべてのアレル変異
体および種のオーソログを包含する。The present invention further provides counterpart proteins and polynucleotides from other species (species orthologs). Of particular interest are other mammalian species, for example,
Zcal from rats, pigs, sheep, cows, dogs, cats, horses, and other primates
c1 polypeptide. Species homologs of the human Zcalc1 protein can be cloned using the information and compositions provided by the present invention in combination with conventional cloning techniques. For example, cDNA can be cloned using mRNA obtained from tissue and cell types that express the protein. By probing a Northern blot with a probe designed from the sequences disclosed herein, a suitable source of mRNA can be identified. A library is then prepared from mRNA of positive tissues or cell lines. Then
The protein may be encoded by a variety of methods, for example, by probing with a fully or partially human or mouse cDNA, or by probing with one or more sets of degenerate probes based on the disclosed sequences. cDNA
Can be isolated. In addition, the polymerase chain reaction, namely, PCR (Mullis
According to U.S. Pat. No. 4,683,202), cDNAs can be cloned using sequence-designed primers disclosed herein. In an additional method, a cDNA library can be used to transform or transfect host cells, and expression of the cDNA in question can be detected with antibodies to the protein. Similar techniques can be applied to the isolation of genomic clones. As used and described in the claims, the language `` isolated polynucleotide encoding a polypeptide, said polynucleotide defined by SEQ ID NO: 2 '' refers to all of the polypeptides of SEQ ID NO: 2 And orthologs of species.

【００２４】 本発明は、また、配列識別NO: ２およびその種のオーソログのタンパク質のポ
リペプチドに対して実質的に相同である、単離されたタンパク質のポリペプチド
を提供する。「単離された」は、その自然環境、例えば、血液および動物の組織
、以外の条件において、タンパク質またはポリペプチドが見出されることを示す
。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチド、特に動
物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形態、すなわ
ち、９５％より大きい純度、より好ましくは９９％より大きい純度のポリペプチ
ドを提供することが好ましい。用語「実質的に相同」は、本明細書において、配
列識別NO:2またはその種のオーソログに対して50％、好ましくは60％、より好ま
しくは少なくとも80％の配列の同一性を有するポリペプチドを表すために使用さ
れる。このようなポリペプチドは配列識別NO:2またはその種のオーソログに対し
て少なくとも90％の同一性、より好ましくは95％またはそれ以上の同一性を有す
る。配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参
照のこと:Altschul et al.、Bull.Math.Bio. 48:603-616 、1986およびHenikoff
およびHenikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919 、1992。簡単に述べ
ると、表1(アミノ酸は標準的1 文字コードにより示されている) に示すように10
のギャップオープニングペナルティー、1 のギャップエクステンションペナルテ
ィー、およびHenikoffおよびHenikoff(ibid.) の「Blosom62」スコアリングマト
リックスを使用して、2 つのアミノ酸配列をアライニングさせてアラインメント
スコアを最適化する。次いで、同一性％は、次のようにして計算される： （同一の整合(matches) の総数)/( より長い配列の長さ＋2 つの配列をアライニ
ングさせるために、より長い配列の中に導入されたギャップの数) ×100The invention also provides an isolated protein polypeptide that is substantially homologous to the protein polypeptide of SEQ ID NO: 2 and an ortholog of that species. "Isolated" indicates that the protein or polypeptide is found in conditions other than its natural environment, such as blood and animal tissues. In a preferred form, the isolated polypeptide is substantially free of other polypeptides, especially other polypeptides from animals. It is preferred to provide the polypeptide in a highly purified form, ie, greater than 95% pure, more preferably greater than 99%. The term "substantially homologous" as used herein refers to a polypeptide having 50%, preferably 60%, more preferably at least 80% sequence identity to sequence identification NO: 2 or an ortholog of that species. Used to represent Such polypeptides have at least 90% identity, more preferably 95% or more identity to the sequence identifier NO: 2 or an ortholog of that species. The percentage of sequence identity is determined by conventional methods. See, for example, the following references: Altschul et al., Bull.Math.Bio. 48: 603-616, 1986 and Henikoff.
And Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992. Briefly, as shown in Table 1 (amino acids are indicated by the standard single letter code),
The two amino acid sequences are aligned to optimize the alignment score using a gap opening penalty of 1 and a gap extension penalty of 1 and the “Blosom62” scoring matrix of Henikoff and Henikoff (ibid.). The percent identity is then calculated as follows: (total number of identical matches) / (length of longer sequence + length of longer sequence to align two sequences (Number of gaps introduced) x 100

【００２５】[0025]

【表１】 [Table 1]

【００２６】 ポリヌクレオチド分子の配列の同一性は、前述した比を使用する同様な方法に
より決定される。 実質的に相同性のタンパク質およびポリペプチドは、1 またはそれ以上のアミ
ノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化は好
ましくは小さい特質を有する、すなわち、このような小さい特質は次の通りであ
る：保存的アミノ酸置換( 表2 参照) およびタンパク質またはポリペプチドのフ
ォルディングまたは活性に影響を実質的に与えない他の置換；小さい欠失、典型
的には1 〜約30アミノ酸の欠失；および小さいアミノ末端およびカルボキシル末
端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、約20〜25残基ま
での小さいリンカーペプチド、または精製を促進する小さいエクステンション(
親和標識) 、例えば、ポリ−ヒスチジントラクト、プロテインA(Nilsson et al.
、EMBO J. 、4:10752 、 1985;Nilsson et al.、Methods Enzymol. 198:3、1991
) 、グルタチオン S トランスフェラーゼ(SmithおよびJohnson 、Gene 67:31、
1988)、または他の抗原性エピトープまたは結合性ドメイン。一般に、Ford et
al. 、Protein Expression and Purification 2:95-107、1991、を参照のこと。
親和標識をコードするDNA は商業的供給会社( 例えば、Pharmacia Biotech 、ニ
ュージャージイ州ピスカタウェイ;New England Biolabs、マサチュセッツ州ベバ
ーリイ）から入手可能である。The sequence identity of the polynucleotide molecules is determined by a similar method using the ratios described above. Substantially homologous proteins and polypeptides are characterized as having one or more amino acid substitutions, deletions or additions. These changes preferably have small attributes, ie, such small attributes are: conservative amino acid substitutions (see Table 2) and substantially affect the folding or activity of the protein or polypeptide. Other substitutions that do not contribute; small deletions, typically from 1 to about 30 amino acids; and small amino and carboxyl terminal extensions, such as amino-terminal methionine residues, up to about 20-25 residues. Small linker peptides or small extensions to facilitate purification (
Affinity label), e.g., poly-histidine tract, protein A (Nilsson et al.
EMBO J., 4: 10752, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991.
), Glutathione S transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31,
1988), or other antigenic epitope or binding domain. In general, Ford et
al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991.
DNA encoding affinity labels is available from commercial suppliers (eg, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).

【００２７】 表2 保存的アミノ酸置換 塩基性： アルギニン リジン ヒスチジン 酸性： グルタミン酸 アスパラギン酸 極性： グルタミン アスパラギン 疎水性： ロイシン イソロイシン バリン 芳香族： フェニルアラニン トリプトファン チロシン 小型： グリシン アラニン セリン スレオニン メチオニン Table 2 Conservative amino acid substitution Basicity: arginine lysine histidine Acidity: glutamic acid aspartic acid Polarity: glutamine asparagine Hydrophobicity: leucine isoleucine valine Aromatic: phenylalanine tryptophan tyrosine Small: glycine alanine serine threonine methionine

【００２８】 本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野において知られてい
る手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従
い同定することができる[Cunningham およびWells 、Science 244:1081-1085 、
1989;Bass et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4498-4502(1991)]。後者の技術
において、単一のアラニンの突然変異を分子中のすべての残基において導入し、
そして、生ずる突然変異体分子を生物学的活性（例えば、リガンドの結合および
シグナルのトランスダクション）について試験して、分子の活性に対して決定的
であるアミノ酸残基を同定する。また、核磁気共鳴、結晶学またはホトアフィニ
ティーラベリングのような技術により決定した、結晶構造の物理的分析により、
リガンド−レセプターの相互作用の部位を決定することができる。例えば、下記
の文献を参照のこと:de Vos et al.、Science 255:306-312 、1992;Smith et al
. 、J.Mol.Biol. 224:899-904 、1992;Wlodaver et al.、FEBS Lett. 309:59-64
、1992。必須アミノ酸の同一性を、また、関係するタンパク質との相同性の分析
から推定することができる。Essential amino acids in the polypeptides of the invention can be identified according to procedures known in the art, for example, site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis [Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085,
1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502 (1991)]. In the latter technique, a single alanine mutation is introduced at every residue in the molecule,
The resulting mutant molecule is then tested for biological activity (eg, ligand binding and signal transduction) to identify amino acid residues that are critical for the activity of the molecule. Also, by physical analysis of the crystal structure, determined by techniques such as nuclear magnetic resonance, crystallography or photoaffinity labeling,
The site of ligand-receptor interaction can be determined. See, for example, the following references: de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al.
, J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64.
, 1992. The identity of the essential amino acids can also be deduced from analysis of homology to the protein involved.

【００２９】 既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載
されている方法により、多数のアミノ酸の置換を行い、試験することができる:R
eidhaar-Olson およびSauer 、Science 241:53-57 、1988またはBowie およびSa
uer 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156 、1989。簡単に述べると、これら
の著者らは、ポリペプチド中の2 またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、
次いで突然変異したポリペプチドを配列決定して、各位置において許容可能な置
換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用できる他の方法は、ファー
ジディスプレイ( 例えば、Lowman et al. 、Biochem. 30:10832-10837 、1991;L
adner et al.、米国特許第5,223,409 号;Huse 、WIPO公開WO92/06204号) および
領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al.、Gene 46:145 、1986;Ner et al.
、DNA 7:127 、1988) を包含する。Numerous amino acid substitutions can be made and tested by known mutagenesis and screening methods, for example, those described in the following literature: R
eidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57, 1988 or Bowie and Sa
uer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989. Briefly, these authors randomized two or more positions in a polypeptide simultaneously,
Disclosed are methods for sequencing the mutated polypeptide to determine the spectrum of allowable substitutions at each position. Other methods that can be used include phage display (e.g., Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; L.
adner et al., U.S. Pat.No. 5,223,409; Huse, WIPO publication WO 92/06204) and region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al.
DNA 7: 127, 1988).

【００３０】 前述したような突然変異誘発法を、高い処理量のスクリーニング法と組合わせ
て、宿主細胞におけるクローニングされた、突然変異化されたポリペプチドの活
性を検出することができる。これに関して好ましいアッセイは、細胞増殖アッセ
イおよびバイオセンサーをベースとするリガンド結合アッセイを包含し、これら
は後述される。活性タンパク質またはそれらの一部分（例えば、リガンド結合フ
ラグメント）をコードする突然変異化DNA 分子を宿主細胞から回収し、そして現
代的装置により迅速に配列決定することができる。これらの方法は問題のポリペ
プチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能とし、そして未知の
構造のポリペプチドに適用することができる。 前述の方法を使用して、当業者は、配列識別NO:2または配列識別NO:5またはそ
れらのアレル変異体に対して実質的に相同性でありかつ野生型タンパク質の性質
を保持する、種々のポリペプチドを製造することができる。表現かつ請求の範囲
に記載されているように、言語「配列識別NO:2、配列識別NO:5または配列識別NO
:11 または12により定めされるポリペプチド」は、ポリペプチドのすべてのアレ
ルおよび種のオーソログを包含する。[0030] Mutagenesis, as described above, can be combined with high-throughput screening methods to detect the activity of the cloned, mutated polypeptide in the host cell. Preferred assays in this regard include cell proliferation assays and biosensor-based ligand binding assays, which are described below. Mutated DNA molecules encoding active proteins or portions thereof (eg, ligand binding fragments) can be recovered from host cells and rapidly sequenced by modern equipment. These methods allow for the rapid determination of the importance of individual amino acid residues in the polypeptide of interest and can be applied to polypeptides of unknown structure. Using the methods described above, one of skill in the art will recognize a variety of sequences that are substantially homologous to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 or allelic variants thereof, and that retain the properties of the wild-type protein. Can be produced. As described in the expression and claims, the language `` sequence identification NO: 2, sequence identification NO: 5 or sequence identification NO:
"Polypeptides defined by: 11 or 12" encompasses all alleles and species orthologs of the polypeptides.

【００３１】 本発明のタンパク質のポリペプチドは、全長のタンパク質、タンパク質のフラ
グメント（例えば、リガンド結合フラグメント）および融合ポリペプチドを包含
し、慣用技術に従い遺伝子操作された宿主細胞において産生することができる。
適当な宿主細胞は、外因的DNA で形質転換またはトランスフェクトすることがで
き、培養により増殖させることができる細胞の型であり、そして細菌、真菌細胞
、および培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞の微生物の
培養された細胞は好ましい。クローニングされたDNA 分子を操作し、外因的DNA
を種々の宿主細胞の中に導入する技術は、下記の文献に記載されている:Sambroo
k et al.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、第2 版、Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press 、Cold Spring Harbor、NY、1989、およびびAusubel et
al., 前掲。[0031] Polypeptides of the proteins of the invention, including full-length proteins, protein fragments (eg, ligand binding fragments) and fusion polypeptides, can be produced in genetically engineered host cells according to conventional techniques.
Suitable host cells are types of cells that can be transformed or transfected with exogenous DNA, grown in culture, and include bacteria, fungal cells, and cultured higher eukaryotic cells. . Eukaryotic cells, especially cultured cells of multicellular microorganisms, are preferred. Manipulate cloned DNA molecules and use exogenous DNA
Techniques for introducing E. coli into various host cells are described in the following literature: Sambroo
k et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, and Ausubel et
al., supra.

【００３２】 一般に、Zcalc1ポリペプチドをコードするDNA 配列は、発現ベクター内に一般
に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現のための必要な他の
遺伝因子に、作用可能に連鎖される。ベクターは、また、1 またはそれ以上の選
択可能なマーカーおよび1 またはそれ以上の複製起点を普通に含有するが、当業
者は認識するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々のベクター上に
提供し、そして宿主細胞のゲノムの中への組込みにより外因的DNA の複製を得る
ことができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクター
および他の因子の選択は、当業者のレベル内の日常的設計事項である。多数のこ
のような因子は文献に記載されており、そして商業的供給会社から入手可能であ
る。In general, the DNA sequence encoding a Zcalc1 polypeptide is operably linked in an expression vector to other genetic elements required for its expression, including generally a transcription promoter and terminator. Vectors also usually contain one or more selectable markers and one or more origins of replication, but as the skilled artisan will appreciate, separate the selectable markers in certain systems. Provided on a vector, and integration of the exogenous DNA can be obtained by integration into the genome of the host cell. Selection of promoters, terminators, selectable markers, vectors and other factors is a matter of routine design within the level of ordinary skill in the art. Many such factors are described in the literature and are available from commercial suppliers.

【００３３】 Zcalc1ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に導入するために、分泌シグナ
ル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列として知られている
）を発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はタンパク質のそれである
ことができるか、あるいは他の分泌されたタンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ）から
誘導するか、あるいはde novo に合成することができる。分泌シグナル配列をZc
alc1 DNA配列に正しいリーディングフレームで結合する。分泌シグナル配列は普
通に問題のポリペプチドをコードするDNA 配列に対して５’に配置されるが、あ
る種の分泌シグナル配列は問題のDNA 配列の中のどこかに位置決定することがで
きる（例えば、Welch et al.、米国特許第5,037,743 号;Holland et al. 、米国
特許第5,143,830 号、参照) 。To introduce a Zcalc1 polypeptide into the secretory pathway of a host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence, prepro sequence or pre sequence) is provided in an expression vector. The secretory signal sequence can be that of a protein, or can be derived from other secreted proteins (eg, t-PA) or synthesized de novo. Secretion signal sequence Zc
Bind to the alc1 DNA sequence in the correct reading frame. Although secretory signal sequences are commonly placed 5 'to the DNA sequence encoding the polypeptide of interest, certain secretory signal sequences can be located anywhere within the DNA sequence of interest ( See, for example, Welch et al., US Pat. No. 5,037,743; Holland et al., US Pat. No. 5,143,830).

【００３４】 培養された哺乳動物細胞は、本発明において適当な宿主である。外因的DNA を
哺乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する：リン酸カルシ
ウム仲介トランスフェクション(Wigler et al.、Cell 14:725 、1978;Corsaroお
よびPearson 、Somatic Cell Genetics 7:603 、1981;Graham およびVan der Eb
、Virology 52:456 、1973) 、エレクトロポレーション(Neumann et al. 、EMBO
J. 1:841-845 、1982) 、DEAE- デキストラン仲介トランスフェクション(Ausub
el et al. 、編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Son
s,Inc.、NY、 1987)、およびリポソーム仲介トランスフェクション(Hawley-Nels
on et al. 、Focus 15:73 、1993;Ciccarone et al. 、Focus 15:80 、1993) 。
培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記の
特許文献に記載されている:Levinson et al.、米国特許第4,713,339 号;Hagen e
t al. 、米国特許第4,784,950 号;Palmiter et al.、米国特許第4,579,821 号；
およびRingold 、米国特許第4,656,134 号、これらは引用することによって本明
細書の一部とされる。適当な培養された哺乳動物細胞は下記のものを包含する：
COS-1(ATCC No.CRL 1650) 、COS-7(ATCC No.CRL 1651) 、BHK(ATCC No.CRL 1632
) 、BHK570(ATCC No.CRL 10314) 、293(ATCC No.CRL 1573;Graham et al.、 J.G
en.Virol. 36:59-72、1977) およびチャイニーズハムスター卵巣( 例えば、 CHO
-K1;ATCC No.CCL 61) 細胞系統。追加の適当な細胞系統はこの分野において知ら
れており、そして公共寄託機関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション( マリイランド州ロックビレ) から入手可能である。一般に、強い転
写プロモーター、例えば、 SV-40またはサイトメガロウイルスからのプロモータ
ーは好ましい。例えば、米国特許第4,956,288 号参照。他の適当なプロモーター
は、メタロチオネイン遺伝子からプロモーター( 米国特許第4,579,821 号および
米国特許第4,601,978 号) およびアデノウイルスの主要な後期プロモーターを包
含する。[0034] Cultured mammalian cells are suitable hosts in the present invention. Methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells include the following: calcium phosphate mediated transfection (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603). Graham and Van der Eb, 1981;
, Virology 52: 456, 1973), electroporation (Neumann et al., EMBO
J. 1: 841-845, 1982), DEAE-dextran-mediated transfection (Ausub
el et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Son
s, Inc., NY, 1987), and liposome-mediated transfection (Hawley-Nels
on et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993).
The production of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells is described, for example, in the following patent documents: Levinson et al., U.S. Pat.No. 4,713,339; Hagen e.
t al., U.S. Patent No. 4,784,950; Palmiter et al., U.S. Patent No. 4,579,821;
And Ringold, U.S. Pat. No. 4,656,134, which are incorporated herein by reference. Suitable cultured mammalian cells include:
COS-1 (ATCC No.CRL 1650), COS-7 (ATCC No.CRL 1651), BHK (ATCC No.CRL 1632)
), BHK570 (ATCC No.CRL 10314), 293 (ATCC No.CRL 1573; Graham et al., JG
en.Virol. 36: 59-72, 1977) and Chinese hamster ovaries (e.g., CHO
-K1; ATCC No. CCL 61) Cell line. Additional suitable cell lines are known in the art and are available from public depositories, for example, the American Type Culture Collection (Rockville, Md.). Generally, strong transcription promoters, such as promoters from SV-40 or cytomegalovirus, are preferred. See, for example, U.S. Pat. No. 4,956,288. Other suitable promoters include those from the metallothionein gene (US Pat. Nos. 4,579,821 and 4,601,978) and the major late promoter of adenovirus.

【００３５】 薬剤選択を一般に使用して、外来DNA が挿入された、培養された哺乳動物細胞
について選択する。このような細胞は普通に「トランスフェクタント」と呼ばれ
る。選択因子の存在において培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に移行させ
ることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい
選択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝
子である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G-418 またはその他の存在にお
いて実施される。また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベルを増加す
ることができる。これは「増幅」とも呼ばれる。低いレベルの選択因子の存在に
おいてトランスフェクタントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入さ
れた遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞について選択することによって、
増幅は実施される。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセー
トに対する耐性を付与する、ジヒドロフォレートリダクターゼである。他の薬剤
耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多薬剤耐性、プロマイシンアセチル
トランスフェラーゼ）を使用することもできる。[0035] Drug selection is generally used to select for cultured mammalian cells into which foreign DNA has been inserted. Such cells are commonly called "transfectants." Cells that are cultured in the presence of the selection factor and are capable of transferring the gene of interest to their progeny are called "stable transfectants." A preferred selectable marker is a gene encoding the resistance to the antibiotic neomycin. The selection is performed in the presence of a neomycin-type drug, eg, G-418 or other. Also, the selection system can be used to increase the expression level of the gene in question. This is also called "amplification". By culturing the transfectant in the presence of a low level of the selection factor, and then increasing the amount of the selection factor to select for cells that produce high levels of the product of the introduced gene,
Amplification is performed. A preferred amplifiable selectable marker is dihydrofolate reductase, which confers resistance to methotrexate. Other drug resistance genes (eg, hygromycin resistance, multidrug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used.

【００３６】 植物細胞、昆虫細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細
胞として使用することもできる。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペ
プチドの産生は、Guarino et al.、米国特許第5,162,222 号;Bang et al.、米国
特許第4,775,624 号；およびWIPO公開WO94/06463号に記載されている。植物細胞
中で遺伝子を発現するのためのベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス
(Agrobacterium rhizogenes)を使用することは、Sinkar et al. 、J.Biosci.(Ba
ngalore)11:47-58、1987、において概観されている。[0036] Other higher eukaryotic cells, including plant cells, insect cells and avian cells, can also be used as host cells. Transformation of insect cells and production of foreign polypeptides therein is described by Guarino et al., US Pat. No. 5,162,222; Bang et al., US Pat. No. 4,775,624; and WIPO Publication WO 94/06463. . Agrobacterium rhizogenes as a vector for expressing genes in plant cells
(Agrobacterium rhizogenes) is described in Sinkar et al., J. Biosci.
ngalore) 11: 47-58, 1987.

【００３７】 酵母細胞、特にサッカロミセス(Saccharomyces) 属の細胞を包含する真菌細胞
を、本発明において、例えば、タンパク質フラグメントまたはポリペプチドの融
合物を製造するために使用することもできる。外因的DNA で酵母細胞を形質転換
し、それから組換えポリペプチドを生産する方法は、例えば、下記の特許文献に
記載されている：Kawasaki、米国特許第4,599,311 号；Kawasaki et al. 、米国
特許第4,931,373 号；Brake 、米国特許第4,870,008 号；Welch et al.、米国特
許第5,037,743 号；およびMurry et al.、米国特許第4,845,075 号。選択可能な
マーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄養( 例えば、
ロイシン) の非存在において増殖する能力により、形質転換された細胞を選択す
る。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において使用する
ために好ましいベクター系は、Kawasaki et al.(米国特許第４，９３１，３７３
号) により開示されているPOT1ベクター系であり、これによりグルコース含有培
地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。Fungal cells, including yeast cells, particularly cells of the genus Saccharomyces, can also be used in the present invention, for example, to produce fusions of protein fragments or polypeptides. Methods for transforming yeast cells with exogenous DNA and producing recombinant polypeptides therefrom are described, for example, in the following patent documents: Kawasaki, US Pat. No. 4,599,311; Kawasaki et al., US Pat. Brake, U.S. Pat. No. 4,870,008; Welch et al., U.S. Pat. No. 5,037,743; and Murry et al., U.S. Pat. No. 4,845,075. Phenotype determined by the selectable marker, normal drug resistance or specific nutrition (e.g.,
Transformed cells are selected for their ability to grow in the absence of (leucine). A preferred vector system for use in Saccharomyces cerevisiae is described by Kawasaki et al. (U.S. Pat. No. 4,931,373).
The POT1 vector system disclosed in US Pat. No. 5,985,981 allows the selection of transformed cells by growth in a glucose-containing medium.

【００３８】 酵母において使用するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解
糖酵素遺伝子( 例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311 号；Ingsman et al.、
米国特許第4,615,974 号；およびBitter、米国特許第4,977,092 号、参照) およ
びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、米国特許第
4,990,446 号；米国特許第5,063,154 号；米国特許第5,139,936 号および米国特
許第4,661,454 号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、
シゾサッカラロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe) 、クルイベロマイ
セス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラギリス(Klu
yveromyces frgilis) 、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis) 、ピキア・
パストリス(Pichia pastoris) 、ピキア・メタノリカ(Pichia metanolica) 、ピ
キア・グイレルモンディイ(Pichia guillermondii)およびカンジダ・マルトサ(C
andida maltosa) を包含する、他の酵母のための形質転換系はこの分野において
知られている。例えば、Gleeson et al.、J.Gen.Microbiol. 132:3459-65(1986)
およびCregg 、米国特許第4,882,279 号、参照。McKnight et al. 、米国特許第
4,935,349 号の方法に従い、アスペルギルス(Aspergillus) 細胞を利用すること
ができる。アクレモニウム・クリソゲヌム(Acremonium chrysogenum)は、Sumino
et al. 、米国特許第5,162,228 号に開示されている。ニューロスポラ(Neurosp
ora)を形質転換する方法は、Lambowitz 、米国特許第4,486,533 号に開示されて
いる。Suitable promoters and terminators for use in yeast include glycolytic enzyme genes (eg, Kawasaki, US Pat. No. 4,599,311; Ingsman et al.,
US Pat. No. 4,615,974; and Bitter, US Pat. No. 4,977,092) and from the alcohol dehydrogenase gene. U.S. Patent No.
See U.S. Pat. No. 5,063,154; U.S. Pat. No. 5,139,936 and U.S. Pat. No. 4,661,454. Hansenula polymorpha,
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis (Klu
yveromyces frgilis), Ustilago maydis, Pichia
Pastoris (Pichia pastoris), Pichia metanolica (Pichia metanolica), Pichia guillermondii (Pichia guillermondii) and Candida maltosa (C
andida maltosa) are known in the art for other yeast transformation systems. For example, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65 (1986).
And Cregg, U.S. Pat. No. 4,882,279. McKnight et al., U.S. Patent No.
According to the method of 4,935,349, Aspergillus cells can be used. Acremonium chrysogenum is Sumino
et al., US Patent No. 5,162,228. Neurospora
Ora) is disclosed in Lambowitz, U.S. Pat. No. 4,486,533.

【００３９】 形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素
および選択した宿主細胞の成長に必要な培地中で培養する。規定された培地およ
び複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野において知られており、
そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよび無機質を含む。培
地は、また、必要に応じて、成長因子のような成分を含有することができる。一
般に、外因的に添加されたDNA を含有する細胞について成長培地を選択する。こ
の選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の欠如により実施され、必須栄養
素は発現ベクター上に担持されるか、あるいは宿主細胞の中に共トランスフェク
トされた選択可能なマーカーにより補足される。The transformed or transfected host cells are cultured according to conventional procedures in nutrients and media required for growth of the selected host cells. Various suitable media are known in the art, including defined and complex media,
And generally contains carbon sources, nitrogen sources, essential amino acids, vitamins and minerals. The medium can also optionally contain components such as growth factors. Generally, a growth medium is selected for cells containing exogenously added DNA. This selection is performed, for example, by drug selection or lack of essential nutrients, which are either carried on an expression vector or supplemented by a selectable marker co-transfected into a host cell.

【００４０】 本発明の1 つの面において、新規なタンパク質は培養した細胞により産生され
、そしてこの細胞を使用してタンパク質の1 またはそれ以上のレセプター、例え
ば、天然のレセプター、ならびに天然のリガンドのアゴニストおよびアンタゴニ
ストについてスクリーニングする。In one aspect of the invention, the novel proteins are produced by cultured cells, and the cells are used to produce one or more receptors for the proteins, eg, natural receptors, as well as agonists of natural ligands And screen for antagonists.

【００４１】 本発明の他の態様は、本発明のZcalc1ポリペプチドのエピトープを支持する部
分からなるペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエ
ピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。
抗体が結合することができるタンパク質の領域は「抗原性エピトープ」と定義さ
れる。例えば、Geysen、H.M. et al. 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(
1984) 参照。Another aspect of the present invention provides a peptide or polypeptide comprising a portion that supports an epitope of a Zcalc1 polypeptide of the present invention. The epitope of the polypeptide portion is an immunogenic or antigenic epitope of a polypeptide of the invention.
The region of the protein to which an antibody can bind is defined as an "antigenic epitope." For example, Geysen, HM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (
1984).

【００４２】 抗原性エピトープを支持する（すなわち、抗体が結合することができるタンパ
ク質分子の領域を含有する）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関すると、タ
ンパク質配列の一部分を模擬する、比較的短い合成ペプチドは、部分的に模擬さ
れたタンパク質と反応する抗血清を日常的に誘発することができることは、この
分野においてよく知られている。Sutcliffe 、J.G. et al. 、Science 219:660-
666(1983) 参照。タンパク質反応性血清を誘発することができるペプチドは、タ
ンパク質の一次配列においてしばしば表示され、1 組の簡単な化学的ルールによ
り特徴づけることができ、そして無傷の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピ
トープ）に制限されず、アミノ末端またはカルボキシル末端に制限されない。極
端に疎水性であるペプチドおよび6 またはそれより少ない残基のペプチドは、一
般に、模擬されたタンパク質に結合する抗体の誘発において無効である；より長
い可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含有するペプチドは通常有効である。With respect to the selection of peptides or polypeptides that support an antigenic epitope (ie, contain a region of the protein molecule to which an antibody can bind), relatively short synthetic peptides that mimic a portion of the protein sequence It is well known in the art that antisera that react with partially mimicked proteins can be routinely induced. Sutcliffe, JG et al., Science 219: 660-
See 666 (1983). Peptides capable of inducing protein-reactive sera are often displayed in the primary sequence of the protein, can be characterized by a set of simple chemical rules, and have intact immunodominant regions (ie, immunogenic epitopes). ) And is not limited to the amino or carboxyl terminus. Extremely hydrophobic peptides and peptides with 6 or fewer residues are generally ineffective at eliciting antibodies that bind to the simulated protein; longer soluble peptides, especially those containing proline residues, Usually valid.

【００４３】 したがって、本発明の抗原性エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチ
ドは、本発明のペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体を包含する、
抗体を発生させるために有用である。本発明の抗原性エピトープを支持するペプ
チドおよびポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列内に含有される少なくとも9
、好ましくは15〜約30アミノ酸を含有する。しかしながら、30〜50アミノ酸を含
有するか、あるいは本発明のポリペプチドの全体のアミノ酸配列までの任意の長
さおよびそれを含む、本発明のアミノ酸配列の大きい部分からなるペプチドまた
はポリペプチドは、また、タンパク質と反応する抗体を誘導するために有用であ
る。Accordingly, peptides and polypeptides that support an antigenic epitope of the invention include monoclonal antibodies that specifically bind to a peptide of the invention.
Useful for generating antibodies. Peptides and polypeptides that support the antigenic epitopes of the invention have at least 9 amino acids contained within the amino acid sequences of the invention.
, Preferably containing 15 to about 30 amino acids. However, peptides or polypeptides comprising 30 to 50 amino acids or any length up to and including the entire amino acid sequence of a polypeptide of the invention, and consisting of a large portion of the amino acid sequence of the invention, also include It is useful for inducing antibodies that react with proteins.

【００４４】 好ましくは、エピトープを支持するペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中の
実質的な溶解度を提供する（すなわち、配列は比較的親水性の残基を含み、そし
て疎水性残基は回避することが好ましい）；そしてプロリン残基を含有する配列
は特に好ましい。本発明は、また、本明細書に記載するZcalc1ポリペプチドのエ
ピトープを支持する部分からなるポリペプチドフラグメントまたはペプチドを提
供する。このようなフラグメントまたはペプチドは「免疫原性エピトープ」を含
むことができ、この免疫原性エピトープは、全体のタンパク質を免疫原性として
使用するとき、抗体の応答を誘発するタンパク質の部分である。免疫原性エピト
ープを支持するペプチドは標準的方法を使用して同定することができる（例えば
、Geysen et al. 、前掲参照）。また、米国特許第4,708,781 号明細書には、所
望のタンパク質の免疫原性エピトープを支持するペプチドを同定する方法がさら
に記載されている。本発明の抗原性エピトープを支持するペプチドおよびポリペ
プチドは、本明細書に記載するポリペプチドに結合する抗体を発生させるために
有用であり、次いでこれらの抗体を使用して、天然のまたは変性された形態のタ
ンパク質を精製するか、あるいはウェスタンブロットにおいてZcalc1ポリペプチ
ドを検出するために使用することができる。Preferably, the amino acid sequence of the peptide supporting the epitope provides substantial solubility in aqueous solvents (ie, the sequence contains relatively hydrophilic residues and avoids hydrophobic residues) And sequences containing proline residues are particularly preferred. The invention also provides a polypeptide fragment or peptide consisting of a portion that supports an epitope of a Zcalc1 polypeptide described herein. Such a fragment or peptide can include an "immunogenic epitope", which is the portion of the protein that elicits an antibody response when the whole protein is used as immunogenic. Peptides that support an immunogenic epitope can be identified using standard methods (see, eg, Geysen et al., Supra). Also, US Pat. No. 4,708,781 further describes a method for identifying a peptide that supports an immunogenic epitope of a desired protein. Peptides and polypeptides that support the antigenic epitopes of the invention are useful for generating antibodies that bind to the polypeptides described herein, and then are used to generate native or denatured antibodies using these antibodies. The purified form of the protein can be used to detect Zcalc1 polypeptide in Western blots.

【００４５】 タンパク質の単離： 分画および／または慣用の精製方法および培地を使用して、発現された組換え
ポリペプチド（またはキメラポリペプチド）を精製することができる。例えば、
下記の文献を参照のこと：Affinity Chromatography:Principle & Methods 、Ph
armacia LKB Biotechnology 、スイス国ウップサラ、1988；Methods in Enzymol
. 、Vol.182 、″Guide to Protein Purification ″、 M.Deutscher( 編) 、Ac
ademic Press、サンディエゴ、1990。また、下記の文献を参照のこと：Protein
Purification Principles and Practice、第3 版、Scopes、Rovert K. 、Spring
er-Verlag 、New York、NY、1994。あるいは、問題のポリペプチドおよび親和標
識の融合物（例えば、ポリヒスチジン、マルトース結合タンパク質、免疫グロブ
リンのドメイン）を構築して精製を促進することができる。Protein Isolation: The expressed recombinant polypeptide (or chimeric polypeptide) can be purified using fractionation and / or conventional purification methods and media. For example,
See the following references: Affinity Chromatography: Principle & Methods, Ph
armacia LKB Biotechnology, Uppsala, Switzerland, 1988; Methods in Enzymol
, Vol.182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher (eds.), Ac
ademic Press, San Diego, 1990. See also the following document: Protein
Purification Principles and Practice, Third Edition, Scopes, Rovert K., Spring
er-Verlag, New York, NY, 1994. Alternatively, fusions of the polypeptide of interest and an affinity tag (eg, polyhistidine, maltose binding protein, domains of immunoglobulins) can be constructed to facilitate purification.

【００４６】 ポリペプチドの化学的合成 ポリペプチド、 特に本発明のポリペプチドは、また、排除固相合成、部分的
固相法、フラグメント縮合または古典的溶液合成により合成することができる。
ポリペプチドは好ましくは、例えば、Merrifield、J.Am.Chem.Soc. 85:2149(196
3)に記載されているように、固相ペプチド合成により製造される。アルファ−ア
ミノ末端が保護されたアミノ酸を使用して、この合成は実施される。不安定性側
鎖を有する3 官能性アミノ酸を、また、適当な基で保護して、ポリペプチドの組
立ての間に望ましくない化学的反応が起こるのを防止する。 Chemical Synthesis of Polypeptides Polypeptides, particularly the polypeptides of the present invention, can also be synthesized by exclusion solid phase synthesis, partial solid phase methods, fragment condensation or classical solution synthesis.
The polypeptide is preferably, for example, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (196
Produced by solid phase peptide synthesis as described in 3). This synthesis is performed using an amino acid with a protected alpha-amino terminus. Trifunctional amino acids with labile side chains are also protected with appropriate groups to prevent undesired chemical reactions from taking place during assembly of the polypeptide.

【００４７】 アルファ−アミノ保護基を選択的に除去して、引き続いてアミノ末端において
反応が起こるようにする。アルファ−アミノ保護基を除去する条件は、側鎖の保
護基を除去しない。アルファ−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の分野
において有用であることが知られている基である。アシル型保護基（例えば、ホ
ルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオ
チニル）、芳香族ウレタン型保護基[ 例えば、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)
、置換ベンジルオキシカルボニルおよび9-フルオレニルメチルオキシ−カルボニ
ル(Fmoc)] 、脂肪族ウレタン保護基[ 例えば、t-ブトキシカルボニル(tBoc)、イ
ソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル] およびアルキ
ル型保護基( 例えば、ベンジル、トリフェニルメチル) が包含される。好ましい
保護基はtBocおよびFmocであり、こうしてペプチドは、それぞれ、tBocおよびFm
oc化学により合成されると言われる。The alpha-amino protecting group is selectively removed such that a subsequent reaction occurs at the amino terminus. Conditions that remove the alpha-amino protecting group do not remove the side chain protecting group. Alpha-amino protecting groups are groups known to be useful in the field of stepwise polypeptide synthesis. Acyl-type protecting group (eg, formyl, trifluoroacetyl, acetyl), aryl-type protecting group (eg, biotinyl), aromatic urethane-type protecting group [eg, benzyloxycarbonyl (Cbz)
, Substituted benzyloxycarbonyl and 9-fluorenylmethyloxy-carbonyl (Fmoc)], aliphatic urethane protecting groups [eg, t-butoxycarbonyl (tBoc), isopropyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl] and alkyl-type protecting groups ( For example, benzyl, triphenylmethyl). Preferred protecting groups are tBoc and Fmoc, and thus the peptides are tBoc and Fm, respectively.
It is said to be synthesized by oc chemistry.

【００４８】 選択される側鎖の保護基はカップリングの間にインタクトであり続けていなく
てはならず、そしてアミノ末端の保護基の脱保護の間に、またはカップリング条
件の間に除去されてはならない。側鎖の保護基は、また、合成の完結後に、仕上
げられたポリペプチドを変更しないであろう反応条件を使用して除去されなくて
はならない。tBoc化学において、３官能性アミノ酸のための側鎖の保護基は大部
分ベンジルに基づく。Fmoc化学において、側鎖の保護基は大部分ブチルまたはト
リチルに基づく。tBoc化学において、好ましい側鎖の保護基はアルギニンについ
てトシル、アスパラギン酸についてシクロヘキシル、システインについて4-メチ
ルベンジル( およびアセトアミドメチル) 、グルタミン酸、セリンおよびスレオ
ニンについてベンジル、ヒスチジンについてベンジルオキシメチル（およびジニ
トロフェニル）、リジンについて2-Cl- ベンジルオキシカルボニル、トリプトフ
ァンについてホルミルそしてチロシンホルミル2-ブロモベンジルである。Fmoc化
学において、好ましい側鎖の保護基は、アルギニンについて2,2,5,7,8-ペンタメ
チルクロマン-6- スルホニル(Pmc) または2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベン
ゾフラン-5- スルホニル(Pbf) 、アスパラギン、システイン、グルタミンおよび
ヒスチジンについてトリチル、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオ
ニンおよびチロシンについてt-ブチル、リジンおよびトリプトファンについてtB
ocである。 ホスホペプチドの合成のために、ホスフェート基の直接的または組立て後の組
込みを使用する。直接的組込みの戦略において、セリン、スレオニンまたはチロ
シン上のホスフェート基は、Fmoc化学においてメチル、ベンジル、またはt-ブチ
ルにより保護するか、あるいはtBoc化学においてメチル、ベンジルまたはフェニ
ルにより保護することができる。ホスフェート保護なしのホスホチロシンの直接
的組込みをFmoc化学において使用することができる。組立て後の組込みの戦略に
おいて、セリン、スレオニンまたはチロシンの非保護のヒドロキシル基を固相上
でジ-t- ブチル- 、ジベンジル- またはジメチル-N,N'-ジイソプロピル- ホスホ
アミダイトで誘導化し、次いでt-ブチルヒドロ- ペルオキシドで酸化する。The selected side-chain protecting group must remain intact during the coupling and may be removed during deprotection of the amino-terminal protecting group or during coupling conditions. must not. Side chain protecting groups must also be removed after completion of the synthesis using reaction conditions that will not alter the finished polypeptide. In tBoc chemistry, the side-chain protecting groups for trifunctional amino acids are largely based on benzyl. In Fmoc chemistry, side-chain protecting groups are mostly based on butyl or trityl. In tBoc chemistry, the preferred side chain protecting groups are tosyl for arginine, cyclohexyl for aspartic acid, 4-methylbenzyl (and acetamidomethyl) for cysteine, benzyl for glutamic acid, serine and threonine, and benzyloxymethyl (and dinitrophenyl) for histidine. , 2-Cl-benzyloxycarbonyl for lysine, formyl and tyrosine formyl 2-bromobenzyl for tryptophan. In Fmoc chemistry, the preferred side chain protecting group is 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) or 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-for arginine. 5-sulfonyl (Pbf), t-butyl for asparagine, cysteine, glutamine and histidine, t-butyl for aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine and tyrosine, tB for lysine and tryptophan
oc. For the synthesis of phosphopeptides, direct or post-assembly incorporation of phosphate groups is used. In a direct incorporation strategy, the phosphate group on serine, threonine or tyrosine can be protected by methyl, benzyl, or t-butyl in Fmoc chemistry or by methyl, benzyl or phenyl in tBoc chemistry. Direct incorporation of phosphotyrosine without phosphate protection can be used in Fmoc chemistry. In a post-assembly integration strategy, the unprotected hydroxyl group of serine, threonine or tyrosine is derivatized on a solid phase with di-t-butyl-, dibenzyl- or dimethyl-N, N'-diisopropyl-phosphoramidite, and then Oxidizes with t-butyl hydro-peroxide.

【００４９】 固相合成は、通常、アルファ- アミノ保護( 側鎖保護) アミノ酸を適当な固体
の支持体にカップリングさせることによってカルボキシル末端から実施される。
クロロメチル、クロロトリチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させるとき、
エステル結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはC 末端に遊離のカルボキシ
ル基を有するであろう。あるいは、アミド樹脂、例えば、ベンズヒドリルアミン
またはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂(tBoc 化学について) およびリンク
(Rink)アミドまたはＰＡＬ樹脂(Fmoc 化学について) を使用するとき、アミド結
合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端にカルボキシアミド基を有する
であろう。これらの樹脂は、ハンドルまたはリンカーを含むか、あるいは含まな
い、結合した第１アミノ酸を含むか、あるいは含まない、ポリスチレン−または
ポリアミド−をベースとするか、あるいはポリエチレングリコール−グラフト化
されているかどうかにかかわらず、商業的に入手可能であり、そしてそれらの製
造は下記の文献に記載されている:Stewart、et al.、″Solid Phase Peptide Sy
nthesis ″( 第２版) 、(Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード、19
84) およびBayer およびRapp、 Chem.Pept.Prot. 3:3、1986; およびAtherton、
et al. 、Solid Phase Peptide Synthesis;A Practical Approach、IRL Press
、Oxford、1989。[0049] Solid phase synthesis is usually performed from the carboxyl terminus by coupling an alpha-amino protected (side chain protected) amino acid to a suitable solid support.
When coupled to chloromethyl, chlorotrityl or hydroxymethyl resin,
An ester bond will form and the resulting polypeptide will have a free carboxyl group at the C-terminus. Alternatively, an amide resin, such as a benzhydrylamine or p-methylbenzhydrylamine resin (for tBoc chemistry) and link
When (Rink) amide or PAL resin (for Fmoc chemistry) is used, an amide bond will form and the resulting polypeptide will have a carboxamide group at the C-terminus. These resins are polystyrene- or polyamide-based or polyethylene glycol-grafted, with or without handles or linkers, with or without attached first amino acids. Regardless, they are commercially available, and their preparation is described in the following literature: Stewart, et al., "Solid Phase Peptide Sy.
nthesis "(second edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 19
84) and Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986; and Atherton,
et al., Solid Phase Peptide Synthesis; A Practical Approach, IRL Press
Oxford, 1989.

【００５０】 必要に応じて側鎖において、およびアルファ−アミノ基において保護された、
Ｃ末端のアミノ酸を、種々の活性化剤、例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミ
ド(DCC) 、N,N'- ジイソプロピルカーボジイミド(DIPCDI)およびカルボニルジイ
ミダゾール(CDI) を使用して、ヒドロキシメチル樹脂に結合させる。それはクロ
ロメチルまたはクロロトリチル樹脂に直接的にそのセシウムテトラメチルアンモ
ニウム塩の形態で、あるいはトリエチルアミン(TEA) またはジイソプロピルエチ
ルアミン(DIEA)の存在において結合させることができる。アミド樹脂への第1 ア
ミノ酸の結合は、カップリング反応の間のアミド結合の形成と同一である。好ま
しい方法において、活性化はDCC およびDMAPにより達成され、これは保護された
アミノ酸を対称無水物に活性化し、この無水物は樹脂上の活性基を反応する。樹
脂の支持体への結合後、保護化学( 例えば、tBoc、Fmoc) に依存して種々のの試
薬を使用して、アルファ−アミノ保護基を除去する。Fmocは一般にピペリジンに
より除去される。Fmoc除去の程度は、300 〜320nm において、あるいは導電性セ
ルによりモニターすることができる。アルファ−アミノ保護基を除去した後、残
りの保護されたアミノ酸を要求される順序で段階的にカップリングして、所望の
配列を得る。Optionally protected in the side chain and at the alpha-amino group,
The C-terminal amino acid is coupled to a hydroxymethyl resin using various activators such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) and carbonyldiimidazole (CDI) . It can be bound directly to the chloromethyl or chlorotrityl resin in the form of its cesium tetramethylammonium salt or in the presence of triethylamine (TEA) or diisopropylethylamine (DIEA). The binding of the first amino acid to the amide resin is identical to the formation of an amide bond during the coupling reaction. In a preferred method, activation is achieved by DCC and DMAP, which activates the protected amino acid to a symmetrical anhydride, which reacts the active group on the resin. After attachment of the resin to the support, the alpha-amino protecting group is removed using various reagents depending on the protection chemistry (eg, tBoc, Fmoc). Fmoc is generally removed by piperidine. The extent of Fmoc removal can be monitored at 300-320 nm or by a conductive cell. After removal of the alpha-amino protecting group, the remaining protected amino acids are coupled stepwise in the required order to yield the desired sequence.

【００５１】 副反応の発生を防止するために、各カップリング反応に引き続いてキャッピン
グ工程を実施することができる。キャッピング溶液(0.5M の無水酢酸、0.125Mの
DIEA、0.015MのHOBt) は未反応アミンをキャップする。カップリングの効率が99
％またはそれより高い場合、キャッピングは不必要である。副反応の防止以外に
、単一または二重のカップリングが成功しない場合、キャッピングが必要である
ことがある。キャッピングは、また、長さが選択したペプチドに類似するフラグ
メント化ペプチドの同時の合成を防止することを促進する。これらのフラグメン
ト化ペプチドは精製を困難とすることがある。In order to prevent the occurrence of side reactions, a capping step can be performed following each coupling reaction. Capping solution (0.5M acetic anhydride, 0.125M
DIEA, 0.015 M HOBt) caps the unreacted amine. Coupling efficiency of 99
At% or higher, capping is unnecessary. Capping may be necessary if single or double coupling is not successful, other than to prevent side reactions. Capping also helps prevent simultaneous synthesis of fragmented peptides that are similar in length to the selected peptide. These fragmented peptides can make purification difficult.

【００５２】 種々の活性化剤、例えば、下記のものをカップリング反応に使用することがで
きる：DCC 、DIPCDI、2-クロロ-1,3- ジメチルイミジウムヘキサフルオロホスフ
ェート(CIP) 、ベンゾトリアゾール-1- イル- オキシ- トリス-(ジメチルアミノ
)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP) およびそのピロリジン類似体
(PyBOP) 、ブロモ- トリス- ピロリジノ- ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ
ート(PyBroP)、O-( ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチル- ウロ
ニムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびそのテトラフルオロボレート類似
体(TBTU)またはそのピロリジン類似体(HBPyU) 、O-(7- アザベンゾトリアゾール
-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチル- ウロニムヘキサフルオロホスフェート(HATU)
およびそのテトラフルオロボレート類似体(TATU)またはそのピロリジン類似体(H
APyU) 。カップリング反応において使用する最も普通の触媒添加剤は、4-ジメチ
ルアミノピリジン(DMAP)、3-ヒドロキシ-3,4- ジヒドロ-4- オキソ-1,2,3- ベン
ゾトリアジン(HODhbt)、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(BOBt)および1-ヒドロ
キシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt)を包含する。好ましくは、HOBt-HPBTUをDI EAとともに使用する。各保護されたアミノ酸は過剰量(>2.0 当量) で使用し、そ
してカップリングは通常N-メチルピロリドン(NMP) 中で、あるいはDMF 、CH₂Cl₂ またはそれらの混合物中で実施する。各段階において、例えば、Kaiser、et al.
、Anal.Biochem. 34:595、1970、に記載されているように、ニンヒドリン反応に
より、カップリング反応の完結の程度をモニターすることができる。不完全なカ
ップリングが見出された場合、カップリング反応を延長し、反復し、そしてカオ
トロープ塩を添加することができる。カップリング反応は商業的に入手可能な計
器、例えば、ABI 型430A、431Aおよび433Aペプチド合成装置を使用して自動的に
実施することができる。Various activators can be used in the coupling reaction, for example: DCC, DIPCDI, 2-chloro-1,3-dimethylimidium hexafluorophosphate (CIP), benzotriazole- 1-yl-oxy-tris- (dimethylamino
) -Phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and its pyrrolidine analog
(PyBOP), bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBroP), O- (benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBTU) and its Tetrafluoroborate analog (TBTU) or its pyrrolidine analog (HBPyU), O- (7-azabenzotriazole
-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HATU)
And its tetrafluoroborate analog (TATU) or its pyrrolidine analog (H
APyU). The most common catalytic additives used in coupling reactions are 4-dimethylaminopyridine (DMAP), 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HODhbt), N -Hydroxybenzotriazole (BOBt) and 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt). Preferably, HOBt-HPBTU is used with DIEA. Each protected amino acid is used in excess (> 2.0 equivalents) and the coupling is usually carried out in N-methylpyrrolidone (NMP) or in DMF, CH ₂ Cl ₂ or mixtures thereof. In each step, for example, Kaiser, et al.
34: 595, 1970, the degree of completion of the coupling reaction can be monitored by the ninhydrin reaction. If incomplete coupling is found, the coupling reaction can be extended, repeated, and chaotrope salts added. The coupling reaction can be performed automatically using commercially available instruments, for example, ABI type 430A, 431A and 433A peptide synthesizers.

【００５３】 所望のペプチドが完全に組立てられた後、適切な掃去剤とともに試薬を使用し
てペプチド−樹脂を切り放す。掃去剤( 例えば、H₂O 、エタンジチオール、フェ
ノールおよびチオアニソール) とともにTFA により、Fmocペプチドは通常切り放
し、脱保護される。tBocペプチドは通常液状HFで1 〜2 時間-5〜0 ℃において切
り放し、脱保護され、これはポリペプチドを樹脂から切り放し、側鎖の保護基の
大部分を除去する。掃去剤、例えば、アニソール、ジメチルサルファイドおよび
p-チオクレゾールを通常液状HFとともに使用して、切り放しの間にポリペプチド
の中に存在するアミノ酸残基のアルキル化およびアシル化からカチオンが形成す
るのを防止する。トリプトファンのホルミル基およびヒスチジンのジニトロフェ
ニル基を、HFの切り放し前にDMF 中で、それぞれ、ピペリジンおよびチオフェノ
ールにより、除去することが必要である。システインのアセトアミドメチル基は
、酢酸水銀(II)により除去するか、あるいはヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム
(III) またはテトラフルオロホウ酸銀( これは同時にシステインをシスチンに酸
化する) により除去することができる。tBocペプチドの切り放しおよび脱保護の
ために使用される他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA) およびト
リメチルシリルトリフルオロアセテート(TMSOTf)を包含する。After the desired peptide is completely assembled, the peptide-resin is cleaved using a reagent with a suitable scavenger. Fmoc peptides are usually cleaved and deprotected by TFA with scavengers (eg, H ₂ O, ethanedithiol, phenol and thioanisole). The tBoc peptide is cleaved and deprotected, usually in liquid HF for 1-2 hours at -5 to 0 ° C., which cleaves the polypeptide from the resin and removes most of the side chain protecting groups. Scavengers such as anisole, dimethyl sulfide and
p-Thiocresol is usually used with liquid HF to prevent cation formation from alkylation and acylation of amino acid residues present in the polypeptide during cleavage. It is necessary to remove the formyl group of tryptophan and the dinitrophenyl group of histidine by piperidine and thiophenol, respectively, in DMF before cleavage of HF. The acetamidomethyl group of cysteine can be removed with mercury (II) acetate or with iodine, thallium trifluoroacetate.
(III) or silver tetrafluoroborate, which simultaneously oxidizes cysteine to cystine. Other strong acids used for cleavage and deprotection of tBoc peptides include trifluoromethanesulfonic acid (TFMSA) and trimethylsilyl trifluoroacetate (TMSOTf).

【００５４】 使用 Zcalc1は多数の組織、例えば、胎児脳、胎盤、胃、子宮、前立腺、心臓、肝臓
、骨格筋、腎臓、小腸、結腸、副腎および下垂体において広く発現される。Zcal
c1は構造がカルシトニン関係ペプチド(CGRP)に類似し、そしてCGRPは神経調節物
質であるので、Zcalc1はまた種々の末梢器官において神経調節物質として使用す
ることができる、Path.Biol.44(10):867-874(1996)。CGRPはまたネズミ腸平滑筋
細胞におけるT 細胞の増殖を促進することが示され、したがって、感染の間ある
いは化学療法または放射線療法後のT 細胞の増殖を促進するために使用すること
ができる。Haogaboam 、C.M. et al. 、J.Neuroimmunol.75:123-134(1997) 。ま
た、Zcalc1はカルシトニンに対する類似性を有し、それに対して約25％同一であ
る。カルシトニンは過カルシウム血症の患者におけるCa2+およびリン酸塩の濃度
を低下させ、単一投与の作用は6 〜10時間持続する。この作用は骨吸収の減少か
ら生じ、そして骨のターンオーバー速度が高い患者においてより大きい。 Uses Zcalc1 is widely expressed in a number of tissues, including the fetal brain, placenta, stomach, uterus, prostate, heart, liver, skeletal muscle, kidney, small intestine, colon, adrenal gland and pituitary. Zcal
Since c1 is similar in structure to calcitonin related peptide (CGRP) and CGRP is a neuromodulator, Zcalc1 can also be used as a neuromodulator in various peripheral organs, Path.Biol.44 (10) : 867-874 (1996). CGRP has also been shown to promote T cell proliferation in murine intestinal smooth muscle cells and can therefore be used to promote T cell proliferation during infection or after chemotherapy or radiation therapy. Haogaboam, CM et al., J. Neuroimmunol. 75: 123-134 (1997). Zcalc1 also has similarity to calcitonin, to which it is about 25% identical. Calcitonin reduces Ca2 + and phosphate levels in patients with hypercalcemia, and the effects of a single dose last for 6-10 hours. This effect results from reduced bone resorption and is greater in patients with high bone turnover rates.

【００５５】 カルシトニンは骨格再形成の増加の障害、例えば、パジェット病（変形性骨炎
）において有効であり、そしてオステオポローシスを有する一部の患者において
有効である。パジェット病、変形性骨炎は、質量の増加の反復現象により特徴づ
けられる骨の疾患である。疼痛および病理学的骨折を生ずることがある、長い骨
の湾曲および平坦な骨の変形が存在しうる。患者は最初に100 単位／日のサケカ
ルシトニンで治療され、サケカルシトニンを使用するとき、週3 回の50単位に投
与量減少するとき、好適な結果が通常得られる。合成ヒトカルシトニンを使用す
るとき、パジェット病についての初期の皮下投与量は0.5mg である。破骨性骨吸
収の強力なインヒビターとして、カルシトニンはまたオステオポローシスの患者
において骨質量の適度の増加をもたらす。増加は骨ターンオーバーの高い固有の
速度を有する患者において最も印象的であり、プラトーに到達する10％〜15％前
にまで近づく。同様な方法において、Zcalc1はこれらの疾患の治療に使用するこ
とができる。[0055] Calcitonin is effective in disorders of increased skeletal remodeling, such as Paget's disease (osteoarthritis), and in some patients with osteoporosis. Paget's disease, osteoarthritis, is a bone disease characterized by repetitive phenomena of increased mass. There may be long bone curvatures and flat bone deformities that can cause pain and pathological fractures. Patients are initially treated with salmon calcitonin at 100 units / day, and favorable results are usually obtained when salmon calcitonin is used and the dose is reduced to 50 units three times a week. When using synthetic human calcitonin, the initial subcutaneous dose for Paget's disease is 0.5 mg. As a potent inhibitor of osteoclastic bone resorption, calcitonin also results in a modest increase in bone mass in patients with osteoporosis. The increase is most impressive in patients with a high inherent rate of bone turnover, approaching 10% to 15% before reaching the plateau. In a similar manner, Zcalc1 can be used to treat these diseases.

【００５６】 Zcalc1は溶液として調製し、パジェット病、過カルシウム血症およびオステオ
ポローシスの治療において0.5mg/日の投与量で2 または3 日／週で皮下投与する
ことができる。いっそう重度の症例は1mg/日（0.5mg ×2 回／日）を必要とする
ことがある。治療前に、最初の3 カ月間および慢性治療の間の3 〜6 カ月毎に、
血清アルカリ性ホスファターゼおよび尿ヒドロキシプロリンの外分泌を測定すべ
きである。Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics
第9 版（McGraw-Hill 、1995) 参照。Zcalc1 can be prepared as a solution and administered subcutaneously at a dose of 0.5 mg / day for 2 or 3 days / week in the treatment of Paget's disease, hypercalcemia and osteoporosis. More severe cases may require 1 mg / day (0.5 mg x 2 times / day). Prior to treatment, for the first 3 months and every 3-6 months during chronic treatment,
Exocrine secretion of serum alkaline phosphatase and urinary hydroxyproline should be measured. Goodman &Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics
See ninth edition (McGraw-Hill, 1995).

【００５７】 CGRPを使用するのと同一の方法において、Zcalc1をまたレイノー病を治療す
るために個体に投与することができる。Bunker、C.B.、et al.、 Lancet 342:80
-83(1993) 。レイノー現象は、偶発的な指の虚血により特徴づけられ、低温暴露
および引き続く再加温後における指の白色化、チアノーゼ、および指および足指
の発赤の順次の発生により臨床的に発現される。重度の症例において、Zcalc1は
オステオポローシスの治療と同一の方法および投与量範囲で個体に投与すること
ができる。In the same way that CGRP is used, Zcalc1 can also be administered to an individual to treat Raynaud's disease. Bunker, CB, et al., Lancet 342: 80
-83 (1993). Raynaud's phenomenon is characterized by accidental finger ischemia and is manifested clinically by the sequential development of finger whitening, cyanosis, and finger and toe redness after cold exposure and subsequent rewarming . In severe cases, Zcalc1 can be administered to an individual in the same manner and dosage range as in the treatment of osteoporosis.

【００５８】 また、Ｉ型糖尿病の進行を阻止するためにZcalc1を使用できる可能性が存在す
る。下記の文献を参照のこと：Khachatryan A 、et al.、 J.Immunol.158:1409-
1416(1997)。それにおいては、ラットインスリン促進剤のコントロール下に修飾
されたCGRP遺伝子を配置することによって、β−膵臓細胞中でCGRPを産生するよ
うに、非肥満型糖尿病(NOD) マウスは操作されている。ベータ細胞によるCGRPの
産生は、雄NOD マウスにおいてインスリン依存性真性糖尿病を防止し、そして雌
NOD マウスにおいて63％その発生率を減少した。こうして、真性糖尿病を予防す
るためにZcalc1をまた個体に投与することができる。Zcalc1は個体にＩ型糖尿病
の症候の発症において投与して、Ｉ型糖尿病の病理学に関係づけられてきたサイ
トカインのCD4 T 細胞の産生を阻害するであろう。Zcalc1は溶液として調製し、
そして真性糖尿病の症候の発症において0.5mg/日の投与量で30日間皮下投与する
ことができる。膵臓の炎症が減少されない場合、投与量をさらに30日間1mg/日（
0.5mg ×2 回／日）に増加することができる。Zcalc1の投与は、症状がおさまっ
た後、規則的であるが、低い頻度で必要とすることがある。There is also the possibility that Zcalc1 can be used to prevent the progression of type I diabetes. See the following document: Khachatryan A, et al., J. Immunol. 158: 1409-
1416 (1997). Therein, non-obese diabetic (NOD) mice have been engineered to produce CGRP in β-pancreatic cells by placing the modified CGRP gene under the control of a rat insulin enhancer. Production of CGRP by beta cells prevents insulin-dependent diabetes mellitus in male NOD mice and
The incidence was reduced by 63% in NOD mice. Thus, Zcalc1 can also be administered to an individual to prevent diabetes mellitus. Zcalc1 will be administered to an individual at the onset of symptoms of Type I diabetes to inhibit the production of CD4 T cells, a cytokine that has been implicated in the pathology of Type I diabetes. Zcalc1 is prepared as a solution,
It can be administered subcutaneously at a dose of 0.5 mg / day for 30 days for the onset of symptoms of diabetes mellitus. If pancreatic inflammation is not reduced, the dose may be increased to 1 mg / day for another 30 days (
0.5 mg x 2 times / day). Administration of Zcalc1 may be necessary regularly but less frequently after symptoms subside.

【００５９】 本発明は、また、有意な治療上の価値を有する試薬を提供する。Zcalc1ポリペ
プチド（天然に存在するまたは組換え）、そのフラグメント、抗体およびそれら
に対して抗イディオタイプ抗体は、Zcalc1ポリペプチドに対する結合のアフィニ
ティーを有するとして同定された化合物と一緒に、異常な生理学または発症に関
連する症状、例えば、異常な増殖、例えば、癌の症状、または変性的症状の治療
において有用であろう。例えば、Zcalc1ポリペプチドによる異常な発現または異
常なシグナリングに関連する疾患または障害は、Zcalc1ポリペプチドのアゴニス
トまたはアンタゴニストについてのターゲットであろう。The present invention also provides reagents that have significant therapeutic value. Zcalc1 polypeptides (naturally occurring or recombinant), fragments thereof, antibodies and anti-idiotypic antibodies thereto, together with compounds identified as having affinity for binding to Zcalc1 polypeptides, may have abnormal physiological or It may be useful in treating conditions associated with development, such as abnormal growth, for example, cancer, or degenerative conditions. For example, a disease or disorder associated with abnormal expression or abnormal signaling by a Zcalc1 polypeptide would be a target for an agonist or antagonist of the Zcalc1 polypeptide.

【００６０】 Zcalc1ポリペプチドに対する抗体を精製し、次いで患者に投与することができ
る。これらの試薬は療法上の使用のために追加の活性または不活性の成分、例え
ば、薬学上許容される担体または希釈剤ならびに生理学的に無害の安定剤および
賦形剤と組合わせることができる。これらの組合わせを滅菌濾過し、例えば、投
与用バイアル中の凍結乾燥または安定化水性調製物形態の貯蔵により投与形態に
することができる。本発明は、また、相補的結合性ではない形態を包含する、抗
体、それらの結合性フラグメントまたは抗体の一本鎖抗体の使用を提供する。[0060] Antibodies to the Zcalc1 polypeptide can be purified and then administered to a patient. These reagents can be combined with additional active or inert ingredients for therapeutic use, such as pharmaceutically acceptable carriers or diluents and physiologically harmless stabilizers and excipients. These combinations can be sterile filtered and made into dosage forms, for example, by lyophilization or storage of stabilized aqueous preparations in dosage vials. The present invention also provides for the use of antibodies, binding fragments thereof, or single-chain antibodies of the antibodies, including forms that are not complementary binding.

【００６１】 CRGPはまた効力のある血管拡張剤であり、そして更年期顔面紅潮の原因となる
因子として、Chen J. 、et al.、 Lancet 342:49(1993)そして神経内分泌性腫瘍
に関連する紅潮の原因となる因子として関連づけられた。こうして、Zcalc1に対
するアンタゴニスト、例えば、Zcalc1に対する抗体を個体に投与して、このよう
な紅潮を軽減することができる。また、Zcalc1は高血圧症、すなわち、高血圧を
治療する血管拡張剤として投与することができる。[0061] CRGP is also a potent vasodilator and as factors contributing to menopausal hot flushes, Chen J., et al., Lancet 342: 49 (1993) and flushes associated with neuroendocrine tumors. Was associated as a causative factor. Thus, an antagonist to Zcalc1, for example, an antibody to Zcalc1, can be administered to an individual to reduce such flushing. Zcalc1 can also be administered as a vasodilator to treat hypertension, ie, hypertension.

【００６２】 また、CGRPが紫外線誘導免疫抑制に関係するというデータが存在する。Gillar
don F.、 Eur.J.Pharmacol.293:395-400(1995)。こうして、Zcalc1に対する抗体
はこの免疫抑制を軽減するために使用することができる；あるいはZcalc1は移植
された器官の拒絶反応を予防するために使用することができる。There is also data indicating that CGRP is involved in UV-induced immunosuppression. Gillar
don F., Eur. J. Pharmacol. 293: 395-400 (1995). Thus, antibodies to Zcalc1 can be used to reduce this immunosuppression; or Zcalc1 can be used to prevent rejection of the transplanted organ.

【００６３】 有効な治療のために必要な量は、多数の異なる因子、例えば、投与方法、ター
ゲット部位、患者の生理学的状態、および他の投薬に依存するであろう。こうし
て、治療の投与量は安全性および効能を最適とするように力価決定すべきである
。典型的には、in vitroで使用する投与量は、これらの試薬のin vivo 投与に有
用な量における有用な手引きをさらに提供することができる。特定の障害の治療
のために有効な投与量の動物試験は、ヒトの投与の予測的指示を提供する。投与
方法は、経口、静脈内、腹腔、筋肉内、または経皮の投与を包含する。薬学上許
容される担体は、なかでも、水、生理食塩水、緩衝液を包含する。投与量の範囲
は通常1 μg 〜1000μg ／kg体重／日であろう。しかしながら、通常、医師はこ
れより高いまたは低い投与量を決定することができる。薬剤の処方および投与量
範囲の完全な説明については、下記の文献を参照のこと：Remington's Pharmace
utical Sciences 、第18版、(Mack Publshing Company 、ベンシルバニア州イー
ストン）、およびGoodman およびGilman's:The Pharmacological Bases of Ther
apeutics、第9 版、(Pergamon Press 1996) 。The amount required for effective treatment will depend on a number of different factors, for example, the mode of administration, the target site, the physiological condition of the patient, and other medications. Thus, the dosage of the treatment should be titrated to optimize safety and efficacy. Typically, dosages used in vitro can provide further guidance in the amounts useful for in vivo administration of these reagents. Animal testing of effective doses for treatment of a particular disorder provides predictive indication of human administration. Methods of administration include oral, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, or transdermal. Pharmaceutically acceptable carriers include, among others, water, saline, and buffers. The dose range will usually be from 1 μg to 1000 μg / kg body weight / day. However, usually a physician will be able to determine higher or lower dosages. For a complete description of drug formulations and dosage ranges, see: Remington's Pharmaceuticals
utical Sciences, 18th Edition, (Mack Publshing Company, Easton, Ben.), and Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Ther
apeutics, 9th edition, (Pergamon Press 1996).

【００６４】 核酸をベースとする療法上の治療 哺乳動物が突然変異したZcalc1遺伝子を有するか、あるいはZcalc1遺伝子を欠
如する場合、Zcalc1遺伝子を哺乳動物細胞の中に導入することができる。1 つの
態様において、Zcalc1ポリペプチドをコードする遺伝子をin vivo においてウイ
ルスベクターの中に導入する。このようなベクターは弱毒化または欠陥DNA ウイ
ルス、例えば、下記のものを包含するが、これらに限定されない：単純ヘルペス
ウイルス(HSV) 、乳頭腫ウイルス、EBウイルス（EBV ）、アデノウイルス、アデ
ノ関連ウイルス（AAV ）、およびその他。ウイルス遺伝子の全体またはほとんど
全体を欠如する、欠陥ウイルスは好ましい。欠陥ウイルスは、細胞の中への導入
後、感染性ではない。欠陥ウイルスの使用は、ベクターが他の細胞を感染しうる
ことを無視して、細胞への特定の、局在化された領域への投与を可能とする。特
定のベクターの例は次の通りであるが、これらに限定されない：欠陥ヘルペスウ
イルス1 （HSV1）ベクター[Kaplitt et al. 、Molec.Cell.Neurosci.2:320-330(
1991)]、弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Stratford-Perricaudet et a
l.、 J.Clin.Invest.90:626-630(1992) に記載されているベクター、および欠陥
アデノ関連ウイルスベクター[Samulski et al.、J.Virol.61:3096-3101(1987);S
amulski et al.、J.Virol.63:3822-3828(1989)] 。さらに、遺伝子は、例えば、
下記の文献に記載されているように、レトロウイルスの中に導入することができ
る：Anderson et al. 、米国特許第5,399,346 号;Mann et al.、 Cell 33:153(1
983);Temin et al. 、米国特許第4,650,764 号;Temin et al. 、米国特許第4,98
0,289 号;Markowitz et al. 、J.Virol.62:1120(1988);Temin et al.、米国特許
第5,124,263 号; 国際特許公開No.WO95/07358 号、1995年3 月16日発行) ；およ
びBlood 、82:845(1993)。The nucleic acid-based therapeutic treatment If the mammal has a mutated Zcalc1 gene or lacks the Zcalc1 gene, the Zcalc1 gene can be introduced into mammalian cells. In one embodiment, the gene encoding the Zcalc1 polypeptide is introduced into a viral vector in vivo. Such vectors include attenuated or defective DNA viruses, such as, but not limited to: herpes simplex virus (HSV), papillomavirus, EB virus (EBV), adenovirus, adeno-associated virus. (AAV), and others. Defective viruses that lack all or almost all of the viral genes are preferred. The defective virus is not infectious after introduction into the cell. The use of a defective virus allows administration to a specific, localized area of the cell, ignoring that the vector can infect other cells. Examples of specific vectors include, but are not limited to: defective herpesvirus 1 (HSV1) vector [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-330 (
1991)], attenuated adenovirus vectors such as Stratford-Perricaudet et a
l., J. Clin. Invest. 90: 626-630 (1992), and defective adeno-associated virus vectors [Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3101 (1987); S.
amulski et al., J. Virol. 63: 3822-3828 (1989)]. Further, the gene, for example,
It can be introduced into retroviruses as described in the following references: Anderson et al., US Pat. No. 5,399,346; Mann et al., Cell 33: 153 (1
983); Temin et al., U.S. Pat.No. 4,650,764; Temin et al., U.S. Pat.
No. 0,289; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120 (1988); Temin et al., U.S. Pat.No. 5,124,263; International Patent Publication No. WO 95/07358, issued March 16, 1995); Blood, 82: 845 (1993).

【００６５】 あるいは、ベクターはリポソームを使用するin vivo リポフェクションにより
導入することができる。合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする
遺伝子のin vivo トランスフェクションのためのリポソームを製造することがで
きる[Felgner et al. 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7413-7417(1987); 参照Ma
ckey et al. 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:8027-8031(1988)] 。in vivo にお
いて特定の器官の中に外因的遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は
、ある種の実際的利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲッティ
ングは、1 つの有益な領域を表す。特定の細胞にトランスフェクションを向ける
ことは1 つの有益な領域を表すことが明らかである。特定の細胞の型にトランス
フェクションを向けることは、細胞の異種性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓
、腎臓、および脳において特に有利であることが明らかである。脂質をターゲッ
ティングの目的で他の分子に化学的にカップリングさせることができる。ターゲ
ッテッドペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、およびタンパク質、
例えば、抗体、非ペプチド分子をリポソームに化学的にカップリングすることが
できるであろう。Alternatively, the vector can be introduced by in vivo lipofection using liposomes. Synthetic cationic lipids can be used to produce liposomes for in vivo transfection of the gene encoding the marker [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417. (1987); reference Ma
ckey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027-8031 (1988)]. The use of lipofection to introduce exogenous genes into specific organs in vivo has certain practical advantages. Molecular targeting of liposomes to specific cells represents one beneficial area. It is clear that directing transfection to specific cells represents one beneficial area. Directing the transfection to a particular cell type appears to be particularly advantageous in tissues with cellular heterogeneity, such as the pancreas, liver, kidney, and brain. Lipids can be chemically coupled to other molecules for targeting purposes. Targeted peptides, such as hormones or neurotransmitters, and proteins;
For example, antibodies, non-peptide molecules could be chemically coupled to liposomes.

【００６６】 細胞を体から取出し、ベクターを裸のDNA プラスミドとして導入し、次いで形
質転換された細胞を体の中に再移植することが可能である。遺伝子療法のための
裸のDNA ベクターは、既知の方法、例えば、下記の方法により所望の宿主細胞の
中に導入することができる：トランスフェクション、エレクトロポレーション、
マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン
、リン酸カルシウム沈澱法、遺伝子ガンの使用またはDNA ベクタートランスポー
ター[ 例えば、下記の文献を参照のこと：Wu et al. 、J.Biol.Chem.267:963-96
7(1992);Wu et al. 、J.Biol.Chem.263:14621-14624(1988)]。It is possible to remove cells from the body, introduce the vector as a naked DNA plasmid, and then retransplant the transformed cells into the body. Naked DNA vectors for gene therapy can be introduced into desired host cells by known methods, for example, the following methods: transfection, electroporation,
Microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, use of gene guns or DNA vector transporters [See, eg, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963 -96
7 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988)].

【００６７】 また、Zcalc1ポリペプチドを使用して、Zcalc1ポリペプチドに特異的に結合す
る抗体を製造することができる。次いで、これらの抗体を使用して抗イディオタ
イプ抗体を製造することができる。本明細書において使用するとき、用語「抗体
」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント、
例えば、F(ab')2 およびFab フラグメント、およびその他を包含し、遺伝子操作
された抗体を含む。抗体は、10⁷/M またはそれより大きいKaで結合する場合、特
異的に結合すると定義される。抗体の結合アフィニティーは、当業者により容易
に測定することができる( 例えば、Scatchard 、前掲，参照）。In addition, an antibody that specifically binds to a Zcalc1 polypeptide can be produced using the Zcalc1 polypeptide. These antibodies can then be used to produce anti-idiotype antibodies. As used herein, the term “antibody” refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, antigen-binding fragments thereof,
For example, including F (ab ') 2 and Fab fragments, and others, including engineered antibodies. Antibodies, when bound in 10 ⁷ / M or greater Ka, are defined to be specifically binding. Antibody binding affinity can be readily determined by one of skill in the art (see, eg, Scatchard, supra).

【００６８】 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する方法は、この分野に
おいてよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Sambrook et al.
、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、第2 版、Cold Spring Harbor、NY
、1989; およびHurrel、J.G.R.編、Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniqu
es and Applications 、CRC Press,Inc.、フロリダ州ボカレイトン、1982) 。当
業者にとって明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒ
ツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットから、ポリクローナル抗
体を発生させることができる。この分野において知られている種々のアッセイを
利用して、Zcalc1ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出することができる
。典型的なアッセイは、Antibodies:A Laboratory Manual、HarlowおよびLane(
編)(Cold Spring Harbor Laboratory Press 、1988) に詳細に記載されている。
このようなアッセイの代表的な例は下記のものを包含する：並流免疫電気泳動、
ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ(ELISA) 、ド
ットブロット、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。Methods for producing polyclonal and monoclonal antibodies are well known in the art (see, eg, Sambrook et al.
, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, NY
, 1989; and Hurrel, JGR, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniqu
es and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1982). As will be apparent to one of skill in the art, polyclonal antibodies can be generated from a variety of warm-blooded animals, such as horses, cows, goats, sheep, dogs, chickens, rabbits, mice, and rats. Various assays known in the art can be used to detect antibodies that specifically bind to a Zcalc1 polypeptide. Typical assays are described in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
Representative examples of such assays include: co-current immunoelectrophoresis,
Radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELISA), dot blot, inhibition or competition assay, and sandwich assay.

【００６９】 抗体は、1) それらが限界のレベルの結合活性を示す場合、および2) それら
が先行技術のポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合する
と決定される。第1 に、本発明における抗体がZcalc1ポリペプチド、ペプチドま
たはエピトープと、10⁶/M またはそれより大きい、好ましくは10⁷/M またはそれ
より大きい、より好ましくは10⁸/M またはそれより大きい、最も好ましくは10⁹/
M またはそれより大きい、結合アフィニティー(Ka)で結合する場合、それらは特
異的に結合する。抗体の結合アフィニティーは、当業者により、例えば、スキャ
ッチャード分析により容易に測定することができる。Antibodies are determined to specifically bind 1) if they exhibit marginal levels of avidity, and 2) if they do not significantly cross-react with prior art polypeptide molecules. First, an antibody according to the present invention may comprise a Zcalc1 polypeptide, peptide or epitope and 10 ⁶ / M or greater, preferably 10 ⁷ / M or greater, more preferably 10 ⁸ / M or greater, Most preferably 10 ⁹ /
They bind specifically when binding with a binding affinity (Ka) of M or greater. Antibody binding affinity can be readily determined by one skilled in the art, for example, by Scatchard analysis.

【００７０】 第２に、抗体が先行技術ポリペプチドと有意に交差反応しない場合、抗体は特
異的に結合すると決定される。例えば、標準的ウェスタンブロット分析を使用し
て、抗体がZcalc1を検出するが、既知の関係するポリペプチドを検出しない場合
、抗体は関係するポリペプチド分子と有意に交差反応しない(Ausubel et al. 、
ibid.)。既知の関係するポリペプチドの例は、オーソログ、すなわち、タンパク
質のファミリーのメンバーである同一種からのタンパク質（例えば、IL-16)、Zc
alc1ポリペプチド、および非ヒトZcalc1である。そのうえ、抗体を既知の関係す
るポリペプチド「に対してスクリーニング」して、本発明のポリペプチドに特異
的に結合する集団を単離することができる。例えば、Zcalc1に対して発生させた
抗体は不溶性マトリックスに付着した関係するポリペプチドに吸着される；Zcal
c1に対して特異的な抗体は適切な緩衝条件下にマトリックスを通して流れるであ
ろう。このようなスクリーニングは、密接に関係するポリペプチドに対して非交
差反応性のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の単離を可能とする（
下記の文献を参照のこと：Antibodies:A Laboratory Manual、HarlowおよびLane
( 編) 、Cold Spring Harbor Laboratory Press 、1988;Current Protocols in
Imunology 、Cooligan、et al.、( 編) 、National Institutes of Health 、Jo
hn Wiley & Sons,Inc.、1995) 。特異的抗体のスクリーニングおよび単離は、こ
の分野においてよく知られている。下記の文献を参照のこと：Fundamental Immu
nology、 Paul(編) 、Raven Press 、1993;Getzoff et al. 、Adv.in Immunol.
、43:1-98 、1988;Monoclonal Antibodies:Principle and Practice 、 Goding
、 J.W.(編) 、Academic Press Ltd. 、1996;Benjamin et al.、Ann.Rev.Immuno
l. 2:67-101 、1984。Second, if the antibody does not significantly cross-react with the prior art polypeptide, it is determined that the antibody specifically binds. For example, using standard Western blot analysis, if the antibody detects Zcalc1, but does not detect a known related polypeptide, the antibody will not significantly cross-react with the related polypeptide molecule (Ausubel et al.,
ibid.). Examples of known related polypeptides are orthologs, ie, proteins from the same species that are members of a family of proteins (eg, IL-16), Zc
alc1 polypeptide and non-human Zcalc1. Moreover, antibodies can be "screened" for known related polypeptides to isolate populations that specifically bind to a polypeptide of the invention. For example, antibodies raised against Zcalc1 are adsorbed to related polypeptides attached to an insoluble matrix;
Antibodies specific for c1 will flow through the matrix under appropriate buffer conditions. Such screening allows the isolation of polyclonal and monoclonal antibodies that are non-cross-reactive with closely related polypeptides (
See the following references: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in
Imunology, Cooligan, et al., (Eds.), National Institutes of Health, Jo
hn Wiley & Sons, Inc., 1995). Screening and isolation of specific antibodies is well known in the art. See the following article: Fundamental Immu
nology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol.
, 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Goding
JW (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immuno
l. 2: 67-101, 1984.

【００７１】 この分野において知られている種々のアッセイを利用して、Zcalc1タンパク質
またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出しすることができる。典型的なア
ッセイは、Antibodies:A Laboratory Manual、 Harlow およびLane( 編)(Cold S
pring Harbor Laboratory Press 、1988) に詳細に記載されている。このような
アッセイの代表的な例は下記のものを包含する：並流免疫電気泳動、ラジオイム
ノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ(ELISA) 、ドットブロッ
トまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンド
イッチアッセイ。さらに、抗体を野生型／突然変異のZcalc1タンパク質またはペ
プチドに対する結合についてスクリーニングすることができる。Various assays known in the art can be used to detect antibodies that specifically bind to a Zcalc1 protein or peptide. A typical assay is described in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.) (Cold S.
pring Harbor Laboratory Press, 1988). Representative examples of such assays include: co-current immunoelectrophoresis, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, enzyme-linked immunoassay (ELISA), dot or western blot assay, inhibition or competition assay, and Sandwich assay. In addition, antibodies can be screened for binding to wild-type / mutated Zcalc1 protein or peptide.

【００７２】 タンパク質を発現する細胞の標識化のために、アフィニティー精製のために、
可溶性タンパク質のポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイにおいて
、およびin vitroおよびin vivo においてリガンドの結合およびシグナルのトラ
ンスダクションをブロックするアンタゴニストとして、Zcalc1に対する抗体を使
用することができる。抗イディオタイプ抗体を使用して、Zcalc1のレセプターを
発見することができる。For labeling cells expressing the protein, for affinity purification,
Antibodies to Zcalc1 can be used in diagnostic assays to measure circulating levels of soluble protein polypeptides, and as antagonists that block ligand binding and signal transduction in vitro and in vivo. Using anti-idiotypic antibodies, the receptor for Zcalc1 can be discovered.

【００７３】 タンパク質を発現する細胞の標識化のために、アフィニティー精製のために、
可溶性タンパク質のポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイにおいて
、およびin vitroおよびin vivo においてリガンドの結合およびシグナルのトラ
ンスダクションをブロックするアンタゴニストとして、Zcalc1に対する抗体を使
用することができる。For labeling cells expressing proteins, for affinity purification,
Antibodies to Zcalc1 can be used in diagnostic assays to measure circulating levels of soluble protein polypeptides, and as antagonists that block ligand binding and signal transduction in vitro and in vivo.

【００７４】 放射ハイブリッドマッピングは、哺乳動物の染色体の高い分解能の、隣接する
地図を構築するために開発された、幹細胞の遺伝的技術である［Cox et al.、 S
cience 250:245-50(1990) ］。遺伝子の配列の部分的または完全な知識は、染色
体の放射性ハイブリッドマッピングパネルとともに使用するために適当なPCR プ
ライマーの設計を可能とする。全体のヒトゲノムをカバーする、放射性ハイブリ
ッドマッピングパネル、例えば、Stanford G3 RH PanelおよびGeneBridge 4 RH
Panel は商業的に入手可能である(Research Genetics,Inc. 、アラバマ州ハンツ
ヴィレ) 。これらのパネルは、迅速な、PCR をベースとする染色体の局在化およ
び遺伝子、配列標識化部位(STSs)、および問題の領域内の他の非多形性および多
形性マーカーの順序決定を可能とする。これは、問題の新しく発見された遺伝子
と前にマッピングされたマーカーとの間の、直接的に比例する物理的距離の確立
を包含する。遺伝子の位置の正確な知識は、下記の目的を包含する、多数の目的
に有用である：1) 配列が存在するcontigの一部分であるかどうかの決定、及び
追加の取り囲む遺伝的配列の種々の形態、例えば、YAC-、BAC-またはcDNAクロー
ンの獲得；2) 同一染色体領域に対する連鎖を示す、遺伝性疾患の可能な候補の
遺伝子の提供；および3) 特定の遺伝子がどんな機能を有することができるかの
決定に役立つ、モデルの生物、例えば、マウスの交差参照。Radiation hybrid mapping is a stem cell genetic technique that has been developed to construct high-resolution, adjacent maps of mammalian chromosomes [Cox et al., S
cience 250: 245-50 (1990)]. Partial or complete knowledge of the sequence of a gene allows the design of appropriate PCR primers for use with the chromosomal radioactive hybrid mapping panel. Radioactive hybrid mapping panels covering the entire human genome, such as the Stanford G3 RH Panel and GeneBridge 4 RH
The Panel is commercially available (Research Genetics, Inc., Huntsville, Alabama). These panels provide rapid, PCR-based chromosomal localization and sequencing of genes, sequence labeling sites (STSs), and other non-polymorphic and polymorphic markers within the region of interest. Make it possible. This involves establishing a directly proportional physical distance between the newly discovered gene in question and the previously mapped marker. Accurate knowledge of the location of a gene is useful for a number of purposes, including the following: 1) determining whether a sequence is part of an existing contig; Obtaining morphology, eg, YAC-, BAC- or cDNA clones; 2) providing potential candidate genes for hereditary diseases, showing linkage to the same chromosomal region; and 3) determining what functions a particular gene has. Cross references in model organisms, eg, mice, to help determine what can be done.

【００７５】 結果が示すように、Zcalc1はWICGR 放射ハイブリッド地図上のヒト染色体7 フ
レームワークマーカーD7S651から3.25cR＿3000遠方にマッピングされた。取り囲
むマーカーを使用すると、Zcalc1遺伝子は統合されたLDB 染色体7 地図上の7q22
.1領域中に位置決定される(The Genetic Location Database、Universty of Sou
thhampton 、WWW server:http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public ＿html/)
。As the results show, Zcalc1 mapped 3.25cR_3000 distant from the human chromosome 7 framework marker D7S651 on the WICGR emission hybrid map. Using the surrounding markers, the Zcalc1 gene was integrated into 7q22 on the integrated LDB chromosome 7 map.
.1 location in the area (The Genetic Location Database, University of Sou
thhampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)
.

【００７６】 本発明は、また、診断用途において使用する試薬を提供する。例えば、Zcalc1
遺伝子、Zcalc1 DNAまたはRNA からなるプローブ、またはそれらのサブ配列を使
用して、Zcalc1遺伝子が染色体7q22.1上に存在するかどうか、あるいは突然変異
が起こったかどうかを決定することができる。Zcalc1遺伝子座における検出可能
な染色体の異常は、異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変
化および転位を包含するが、これらに限定されない。このような異常は、本発明
のポリヌクレオチドを用いて、分子遺伝的技術、例えば、制限フラグメントの長
さの多形性(RFLP)分析、PCR 技術を用いる短い縦列反復(STR) 分析、およびこの
分野において知られている他の遺伝的連鎖分析技術(Sambrook et al.、ibid.;Au
subel 、et al.、ibid.;Marian、Chest 108:255-265 、1995) を使用することに
よって、検出することができる。The present invention also provides reagents for use in diagnostic applications. For example, Zcalc1
Probes consisting of the gene, Zcalc1 DNA or RNA, or subsequences thereof, can be used to determine if the Zcalc1 gene is present on chromosome 7q22.1 or if a mutation has occurred. Detectable chromosomal abnormalities at the Zcalc1 locus include, but are not limited to, aneuploidy, altered gene copy number, insertions, deletions, altered restriction sites, and translocations. Such abnormalities can be detected using the polynucleotides of the present invention by molecular genetic techniques, such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, short tandem repeat (STR) analysis using PCR technology, and the like. Other genetic linkage analysis techniques known in the art (Sambrook et al., Ibid .; Au
subel, et al., ibid .; Marian, Chest 108: 255-265, 1995).

【００７７】 実施例1 ． Zcalc1 の化学的合成 合成および精製 Fmoc- アミド樹脂から出発してABI/PEペプチド合成装置431A型[Applied Biosy
stems/Perkin Elmer(ABI/PE)、フォスターシティー、カリフォルニア州）を使用
する固相ペプチド合成により、Zcalc1、配列識別NO:5を合成した。Fmoc- アミド
樹脂（0.68mmol/g）をABI/PEから購入した。アミノ酸をアナスペク・インコーポ
レーテッド（AnaSpec,Inc.、カリフォルニア州サンジョーズ）から前もって秤量
された1mmol のカートリッジで購入した。ピペリジンを除外する、すべての試薬
はABI/PEから購入した。ピペリジンはアルドリッヒ(Aldrich、ミゾリー州セント
ルイス) から購入した。合成手順はABI/PE431A型マニュアルから採用した。ペプ
チド・コンパニオン・ソフトウェア(Peptides International 、ケンタッキー州
ルイスビレ）により予測されるように、配列の高い凝集部の間に二重カップリン
グサイクルを使用した。二重カップリング部位はN 末端からアミノ酸残基1 〜３
、およびアミノ酸残基23〜２４に位置した。キャッピング工程は配列識別NO:5の
アミノ酸残基11〜１５およびアミノ酸残基23〜24に位置した。 Embodiment 1 Chemical synthesis and purification of Zcalc1 Starting from Fmoc-amide resin, ABI / PE peptide synthesizer model 431A [Applied Biosy
Zcalc1, sequence identification NO: 5 was synthesized by solid phase peptide synthesis using stems / Perkin Elmer (ABI / PE), Foster City, CA. Fmoc-amide resin (0.68 mmol / g) was purchased from ABI / PE. Amino acids were purchased from AnaSpec, Inc., San Joes, CA, in pre-weighed 1 mmol cartridges. All reagents, except for piperidine, were purchased from ABI / PE. Piperidine was purchased from Aldrich (Aldrich, St. Louis, Mo.). The synthesis procedure was adopted from the ABI / PE431A type manual. A double coupling cycle between high aggregates of the sequence was used, as predicted by the peptide companion software (Peptides International, Louisville, KY). Double coupling site is from amino acid residue 1-3 from N-terminal
, And amino acid residues 23-24. The capping step was located at amino acid residues 11-15 and 23-24 of SEQ ID NO: 5.

【００７８】 ペプチド切断プロトコール（ABI/PE発行）に概略的に示されている標準的TFA
切断手順に従い、ペプチドを固相から切断した。C18 、10μm の調製用カラムを
使用するRP-HPLC により、ペプチドを精製した。カラムから溶離される画分を集
め、エレクトロスプレー質量分析により正しい質量および純度について分析した
。この分析により、Zcalc1ペプチドはプールの1 つの中に存在し、純粋であるこ
とが示された。ペプチドを含有するプールを保持し、凍結乾燥させた。Standard TFA as outlined in the peptide cleavage protocol (published by ABI / PE)
Following the cleavage procedure, the peptide was cleaved from the solid phase. The peptide was purified by RP-HPLC using a C18, 10 μm preparative column. Fractions eluted from the column were collected and analyzed for correct mass and purity by electrospray mass spectrometry. This analysis indicated that the Zcalc1 peptide was present in one of the pools and was pure. The pool containing the peptide was retained and lyophilized.

【００７９】ジサルファイド結合の形成 2 つのシスチン残基の間でジサルファイド結合を形成するために、ペプチドは
化学的酸化反応を行い、これにより水素結合が破壊され、ジサルファイド結合が
再形成した。凍結乾燥されたペプチドをNH₄HCO₃ 、pH8.3 および15％DMSO中で1m
g/mlの濃度において一夜酸化させた。（この酸化手順はJ.P.Tam 、Journal of t
he American Chemical Society、1991、113 、6657-6662 により開発された）。
酸化後、C18 、5 μm の半調製用カラムを使用して、ペプチドを脱塩した。溶離
されたペプチド画分をプールし、ジサルファイド含量について分析した。 Formation of Disulfide Bonds To form a disulfide bond between two cystine residues, the peptide undergoes a chemical oxidation reaction, which breaks hydrogen bonds and reforms disulfide bonds. Lyophilized peptides were collected in NH ₄ HCO ₃ , pH 8.3 and 15% DMSO for 1m.
Oxidation overnight at a concentration of g / ml. (This oxidation procedure is described in JPTam, Journal of t.
he American Chemical Society, 1991, 113, developed by 6657-6662).
After oxidation, the peptides were desalted using a C18, 5 μm semi-preparative column. Eluted peptide fractions were pooled and analyzed for disulfide content.

【００８０】 MALDI-TOF 質量分析装置を使用する分析は、ペプチドが正しい質量範囲で存在
することを示した。酸化された物質を非酸化の天然の物質と比較すると、2 つの
ペプチドが同一であることが示された。Analysis using a MALDI-TOF mass spectrometer indicated that the peptide was present in the correct mass range. Comparison of the oxidized material with the non-oxidized natural material showed that the two peptides were identical.

【００８１】ジサルファイド結合の分析 酸化されたペプチドおよび天然のペプチドの双方について、エンドプロテイナ
ーゼGlu-C を使用する酵素消化を実施した。Glu-C 酵素は、炭酸アンモニウム緩
衝液、 pH7.8中でグルタミン酸のC 末端におけるペプチド結合を切断する。酸化
されたペプチドのジサルファイド結合の位置のために、C-E(AA 1-2) フラグメン
トは追加の質量18（水について）をもってAA 3-8フラグメントに結合して止まる
であろう。フラグメントAA 1-2およびAA 3-8は検出されず、位置1 におけるCys
と位置3 におけるCys との間のジサルファイド結合の適切な形成が示された。質
量分析のクロマトグラフィーは、酸化されたペプチドおよび天然のペプチドの双
方について類似した。C 末端のスレオニンがアミド化された、配列識別NO:5のポ
リペプチドが製造された。 Analysis of Disulfide Bonds Enzymatic digestion using the endoproteinase Glu-C was performed on both oxidized and native peptides. The Glu-C enzyme cleaves the peptide bond at the C-terminus of glutamate in ammonium carbonate buffer, pH 7.8. Due to the position of the disulfide bond of the oxidized peptide, the CE (AA1-2) fragment will bind and stop at the AA3-8 fragment with an additional mass 18 (for water). Fragments AA 1-2 and AA 3-8 were not detected and Cys at position 1
Proper formation of a disulfide bond between and and Cys at position 3 was shown. Mass spectrometry chromatography was similar for both oxidized and native peptides. A polypeptide having sequence identification NO: 5 in which the C-terminal threonine was amidated was produced.

【００８２】 前述の手順を使用して、配列識別NO:12 のZcalc1のアレル変異体をまた合成す
ることもできる。The above procedure can also be used to synthesize allelic variants of Zcalc1 with SEQ ID NO: 12.

【００８３】 実施例2 プライマーZC15,546( 配列識別NO:6) およびZC15,547( 配列識別NO:7) を使用
して、DNA 上にライゲーションされたMARATHONR(登録商標)(Clontech、カリフォ
ルニア州パロアルト) リンカーを有する多数のcDNAライブラリーについて、ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR) を実施した。PCR 条件は次の通りであった。 Example 2 MARATHONR® (Clontech, Palo Alto, CA) ligated onto DNA using primers ZC15,546 (SEQ ID NO: 6) and ZC15,547 (SEQ ID NO: 7). ) A polymerase chain reaction (PCR) was performed on a number of cDNA libraries with linkers. The PCR conditions were as follows.

【００８４】 反応PCR 混合物は、40μl の10×PCR 緩衝液、8 μl のEXTAG(双方はTakara、
マディソン・ウィスコンシン、から) 、8 μl の2.5mM のヌクレオシド三リン酸
混合物(Takara)および300 μl の水を含有した。PCR 反応を94℃において1.5 分
間インキュベートし、次いで35サイクルを実施し、各サイクルは94℃において15
秒間、58℃において20秒間および72℃において30秒間から構成されていた。反応
を72℃において10分間のインキュベーションで停止させ、4 ℃において保持した
。The reaction PCR mixture was composed of 40 μl of 10 × PCR buffer, 8 μl of EXTAG (both Takara,
Madison, Wisconsin), 8 μl of a 2.5 mM nucleoside triphosphate mixture (Takara) and 300 μl of water. The PCR reaction was incubated at 94 ° C for 1.5 minutes, then 35 cycles were performed, each cycle at 94 ° C for 15 minutes.
For 20 seconds at 58 ° C and 30 seconds at 72 ° C. The reaction was stopped by incubation at 72 ° C for 10 minutes and kept at 4 ° C.

【００８５】 配列識別NO:3に対応する360bp のDNA が胎児脳、胎盤、胃、子宮および前立腺
のcDNAにおいて見られた。淡いバンドが脳cDNAにおいてまた見られた。A 360 bp DNA corresponding to sequence identification NO: 3 was found in fetal brain, placenta, stomach, uterus and prostate cDNA. A faint band was also seen in brain cDNA.

【００８６】 実施例3 ノザンブロット分析 ヒト多重組織ブロット1 、2 、3(Clontech) をプロービングして、Zcalc1の組
織分布を決定した。実施例2 において製造したDNA をアガロースゲル上で単離し
た。DNA をゲルスラブからQIAquickゲル抽出キット(Qiagen)で抽出した。100ng
のこのDNA をREIPRIME (登録商標) 標識化システム(Amersham)を使用して32P で
標識化し、そしてNucTrap プローブ精製カラム(Stratagene)で非組込み放射能を
除去した。多重組織ノザンおよびヒトRNA マスターブロットを10mlの1mg のサケ
***DNA を含有するEXPRESSHYB (登録商標) 溶液( サケ***DNA を5 分間沸騰し
、次いで1 分間氷冷し、10mlのExpressHyb溶液に添加し、これを混合し、ブロッ
トに添加した) と3 時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションを65℃に
おいて一夜実施した。初期の洗浄条件次の通りであった：2 ×SSC 、0.05％のSD
S 、室温、40分間、数回の溶液の交換、次いで0.1 ×SSC 、0.05％のSDS 、50℃
、40分間、1 回の溶液の交換。次いでブロットをフィルムに対して-80 ℃におい
て2.5 時間露出した。 Example 3 Northern Blot Analysis Human multiple tissue blots 1, 2, 3 (Clontech) were probed to determine the tissue distribution of Zcalc1. The DNA produced in Example 2 was isolated on an agarose gel. DNA was extracted from the gel slab with a QIAquick gel extraction kit (Qiagen). 100ng
Of this DNA was labeled with 32P using the REIPRIME® labeling system (Amersham) and non-incorporated radioactivity was removed with a NucTrap probe purification column (Stratagene). Multiple tissue Northern and human RNA master blots were added to 10 ml of EXPRESSHYB® solution containing 1 mg of salmon sperm DNA (boil salmon sperm DNA for 5 minutes, then ice-cooled for 1 minute, added to 10 ml of ExpressHyb solution, This was mixed and added to the blot) and incubated for 3 hours. Hybridization was performed at 65 ° C. overnight. Initial wash conditions were as follows: 2 x SSC, 0.05% SD
S, room temperature, 40 minutes, several changes of solution, then 0.1 x SSC, 0.05% SDS, 50 ° C
One solution change for 40 minutes. The blot was then exposed to the film for 2.5 hours at -80 ° C.

【００８７】 ほぼ0.75kbの転写物が下記の組織を包含する多数の組織において溶融組織ブロ
ット上に見られた：心臓、肝臓、骨格筋、腎臓、小腸および結腸。また、ドット
ブロットは下記の組織を包含する多数の組織においてシグナルを有した：心臓、
副腎、腎臓、肝臓、小腸、下垂体および結腸。A transcript of approximately 0.75 kb was found on the fused tissue blot in a number of tissues, including the following tissues: heart, liver, skeletal muscle, kidney, small intestine and colon. The dot blot also had signals in a number of tissues, including the following tissues: heart,
Adrenal gland, kidney, liver, small intestine, pituitary and colon.

【００８８】 実施例4 Zcalc1 の染色体の帰属および配置 商業的に入手可能な「GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel 」(Research Ge
netics,Inc. 、アラバマ州ハンツヴィレ) を使用して、Zcalc1は染色体7 にマッ
ピングされた。GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel は、93の放射ハイブリッ
ドクローンの各々からのPCR 可能なDNA 、および2 つの対照(HFLドナーおよびA2
3 レシピエント) を含有する。公共入手可能なWWW サーバー(http://www-genome
.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl)は、ヒトゲノムのゲノム・リサーチの
ラディエイション・ハイブリッド地図についてWhitehead Institute/MIT Center
( 「WICGR 」ラディエイション・ハイブリッド地図（これはGeneBridge 4 Radia
tion Hybrid Panel を使用して構築された）に関するマッピングを可能とする。 Example 4 Chromosome Assignment and Location of Zcalc1 Commercially available "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" (Research Ge
Zcalc1 was mapped to chromosome 7 using netics, Inc., Huntsville, Ala. The GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel contains PCRable DNA from each of the 93 radiation hybrid clones, and two controls (HFL donor and A2
3 recipients). Publicly available WWW server (http: // www-genome
.wi.mit.edu / cgibin / contig / rhmapper.pl) is the Whitehead Institute / MIT Center for the Radiation Hybrid Map of Genomic Research on the Human Genome.
(WICGR Radiation Hybrid Map (This is GeneBridge 4 Radia
(built using the Hybrid Hybrid Panel).

【００８９】 「GeneBridge 4 RH Panel 」を使用するZcalc1のマッピングについて、20μl
の反応物をPCR 可能な96ウェルのマイクロタイタープレート(Stratagene 、カリ
フォルニア州ラジョラ）中で構成し、「RoboCycler Gradient 96」 サーマルサイ
クラー(Stratagene)において使用した。95PCR 反応物の各々は、下記の成分から
成っていた：2 μl の10×KlenTaq PCR 反応緩衝液(CLONTECH Laboratories,Inc
. 、カリフォルニア州パロアルト) 、1.6 μl のdNTP混合物（2.5mM づつ、PERK
IN-ELMER、フォスターシティー、カリフォルニア州）、1 μl のセンスプライマ
ー、（配列識別NO:8）5'AGC GGT GAT TGT TTG TAG 3'、1 μl のアンチセンスプ
ライマー、（配列識別NO:9）5'TGG GCA AGC GTT CTG TGT 3'、2 μl の「RediLo
ad」(Research Genetics,Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ) 、0.4 μl の50×Adva
ntage KlenTaq ポリメラーゼ混合物(Clontech Laboratories,Inc. ）、25ngの個
体のハイブリッドクローンまたは対照からのDNA および総体積を20μｌとするた
めの×μl のddH2O 。反応物に等しい量の鉱油をオーバーレイし、シールした。
PCR サイクラーの条件は次の通りであった：初期の1 サイクルの95℃において５
分の変性、35サイクルの95℃において1 分の変性、64℃において1 分のアニーリ
ングおよび72℃において1.5 分のエクステンション、次いで最後の1 サイクルの
72℃において7 分のエクステンション。反応物を2 ％のアガロースゲル(Life Te
chnologies、マリイランド州ガイサースバーグ）上の電気泳動により分離した。For mapping of Zcalc1 using “GeneBridge 4 RH Panel”, 20 μl
Reactions were assembled in PCR-capable 96-well microtiter plates (Stratagene, La Jolla, CA) and used in a "RoboCycler Gradient 96" thermal cycler (Stratagene). Each of the 95 PCR reactions consisted of the following components: 2 μl of 10 × KlenTaq PCR reaction buffer (CLONTECH Laboratories, Inc.
, Palo Alto, Calif.), 1.6 μl dNTP mixture (2.5 mM each, PERK
IN-ELMER, Foster City, CA), 1 μl sense primer, (SEQ ID NO: 8) 5′AGC GGT GAT TGT TTG TAG 3 ′, 1 μl antisense primer, (SEQ ID NO: 9) 5 'TGG GCA AGC GTT CTG TGT 3', 2 μl of 'RediLo
ad '' (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4 μl of 50 × Adva
ntage KlenTaq polymerase mix (Clontech Laboratories, Inc.), DNA from 25 ng individual hybrid clones or controls and xμl ddH2O for a total volume of 20 μl. An amount of mineral oil equal to the reaction was overlaid and sealed.
The conditions for the PCR cycler were as follows: 5 cycles at 95 ° C for one initial cycle.
Denaturation at 35 ° C for 1 minute at 95 ° C, annealing at 64 ° C for 1 minute and extension at 72 ° C for 1.5 minutes, followed by a final cycle.
Extension for 7 minutes at 72 ° C. The reaction was run on a 2% agarose gel (Life Te
chnologies, Gaithersburg, Md.).

【００９０】 結果により、Zcalc1はWICGR 放射ハイブリッド地図上のヒト染色体7 フレーム
ワークマーカーD7S651から3.25cR＿3000遠位のマッピングされることが示された
。取り囲むマーカーを使用すると、Zcalc1は統合されたLBD 染色体7 地図上の7q
22.1領域に位置決定される(The Genetic Location Database、University of So
uthhampton、 WWWサーバー:http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public ＿html
/)。The results showed that Zcalc1 maps 3.25cR_3000 distal to the human chromosome 7 framework marker D7S651 on the WICGR radiation hybrid map. Using the surrounding markers, Zcalc1 integrates LBD chromosome 7 7q on the map.
22.1 Determined in area (The Genetic Location Database, University of So
uthhampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html
/).

【配列表】 [Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ムーア，エマ イー． アメリカ合衆国，ワシントン 98199，シ アトル，サーティース アベニュ ウエス ト 3507 (72)発明者 レイモンド，フェネラ シー． アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ノースイースト エイティーシッ クスス ストリート 2626──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/08 C12N 15/00 ZNAA (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK) , ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR) , NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI GB, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK , MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Moore, Emma. United States, Washington 98199, Seattle, Surtees Avenue West 3507 (72) Inventor Raymond, Feneracy. United States, Washington 98115, Seattle, Northeast 80s Street 2626

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列識別NO:2、5 、11、12、13、14または15のアミノ酸配列
から構成された哺乳動物ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチ
ド。1. An isolated polynucleotide encoding a mammalian polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 5, 11, 12, 13, 14 or 15. 【請求項２】 ポリヌクレオチドが請求項1 に記載の前記ポリペプチドの1
つに対して少なくとも90％同一であるポリペプチドをコードする、請求項1 に記
載のポリヌクレオチド。2. The polynucleotide of claim 1, wherein the polynucleotide is one of the polypeptides of claim 1.
The polynucleotide of claim 1 which encodes a polypeptide that is at least 90% identical to one another. 【請求項３】 ポリヌクレオチドが配列識別NO:2および11において下記のア
ミノ酸残基の変動を有する請求項1 に記載のポリヌクレオチドをコードする請求
項1 に記載のポリヌクレオチド：位置31におけるアミノ酸残基（これは配列識別
NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基10である）はTrp またはThr であ
る；位置32におけるアミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13、14および15につ
いてアミノ酸残基11である）はVal 、Thr またはGlu である；位置33におけるア
ミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基12で
ある）はPhe またはArg である；位置34におけるアミノ酸残基（これは配列識別
NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基13である）はMet またはLeu であ
る；位置36におけるアミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13、14および15につ
いてアミノ酸残基15である）はThr またはSer である；位置40におけるアミノ酸
残基（これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基19である）
はIle またはVal である。3. The polynucleotide of claim 1 which encodes the polynucleotide of claim 1 having the following amino acid residue variations in SEQ ID NOs: 2 and 11: the amino acid residue at position 31. Group (this is the sequence identification
Amino acid residue 10 for NO: 12, 13, 14, and 15 is Trp or Thr; amino acid residue at position 32 (which is amino acid residue 11 for sequence identification NO: 12, 13, 14, and 15). Is) Val, Thr or Glu; the amino acid residue at position 33 (which is amino acid residue 12 for SEQ ID NO: 12, 13, 14, and 15) is Phe or Arg; the amino acid at position 34 Residues (this is the sequence
Amino acid residue 13 for NO: 12, 13, 14 and 15 is Met or Leu; amino acid residue at position 36 (which is amino acid residue 15 for sequence identification NOs: 12, 13, 14 and 15) Is Thr or Ser; the amino acid residue at position 40 (this is amino acid residue 19 for SEQ ID NOs: 12, 13, 14, and 15)
Is Ile or Val. 【請求項４】 下記の作用可能に連鎖された因子： 転写プロモーター； 哺乳動物ポリペプチドをコードするDNA セグメント、前記ポリペプチドは配列
識別NO:2、5 、11、12、13、14もしくは15または前記ポリペプチドに対して少な
くとも90％同一であるポリペプチドから構成されている；および 転写ターミネーター； を含んで成る発現ベクター。4. An operably linked factor comprising: a transcription promoter; a DNA segment encoding a mammalian polypeptide, wherein said polypeptide has the sequence identification NO: 2, 5, 11, 12, 13, 14, or 15; An expression vector comprising a polypeptide that is at least 90% identical to said polypeptide; and a transcription terminator. 【請求項５】 配列識別NO:2、5 、11、12、13、14または15のアミノ酸配列
から構成された哺乳動物ポリペプチドから構成された、単離されたポリペプチド
。5. An isolated polypeptide comprising a mammalian polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 5, 11, 12, 13, 14, or 15. 【請求項６】 ポリペプチドが請求項5 に記載の前記ポリペプチドに対して
少なくとも90％同一である、請求項5 に記載の単離されたポリペプチド。6. The isolated polypeptide of claim 5, wherein said polypeptide is at least 90% identical to said polypeptide of claim 5. 【請求項７】 配列識別NO:2および11において下記のアミノ酸残基の変動を
有する請求項5 に記載の単離されたポリペプチド：位置31におけるアミノ酸残基
（これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基10である）はTr
p またはThr である；位置32におけるアミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13
、14および15についてアミノ酸残基11である）はVal 、Thr またはGlu である；
位置33におけるアミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13、14および15について
アミノ酸残基12である）はPhe またはArg である；位置34におけるアミノ酸残基
（これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ酸残基13である）はMe
t またはLeu である；位置36におけるアミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13
、14および15についてアミノ酸残基15である）はThr またはSer である；位置40
におけるアミノ酸残基（これは配列識別NO:12 、13、14および15についてアミノ
酸残基19である）はIle またはVal である。7. The isolated polypeptide of claim 5, which has the following amino acid residue variation in SEQ ID NOs: 2 and 11: the amino acid residue at position 31 (which is SEQ ID NO: 12; Amino acid residue 10 for 13, 14 and 15) is Tr
p or Thr; the amino acid residue at position 32 (this is SEQ ID NO: 12, 13
, 14 and 15 is amino acid residue 11) is Val, Thr or Glu;
The amino acid residue at position 33, which is amino acid residue 12 for SEQ ID NO: 12, 13, 14, and 15, is Phe or Arg; the amino acid residue at position 34, which is SEQ ID NO: 12, Amino acid residue 13 for 13, 14 and 15) is Me
t or Leu; the amino acid residue at position 36 (this is SEQ ID NO: 12, 13
, 14 and 15 are Thr or Ser; position 40
(This is amino acid residue 19 for sequence identification NOs: 12, 13, 14, and 15) is Ile or Val. 【請求項８】 配列識別NO:2、5 、11、12、13、14もしくは15である哺乳動
物ポリペプチドまたは前記ポリペプチドに対して少なくとも90％同一であるポリ
ペプチドに特異的に結合する抗体。8. An antibody which specifically binds to a mammalian polypeptide having the sequence identification NO: 2, 5, 11, 12, 13, 14 or 15 or a polypeptide at least 90% identical to said polypeptide. . 【請求項９】 配列識別NO:2、5 、11、12、13、14もしくは15から構成され
た哺乳動物ポリペプチドまたは前記ポリペプチドに対して少なくとも90％同一で
あるポリペプチドに特異的に結合する抗体の抗イディオタイプ抗体。9. Specific binding to a mammalian polypeptide consisting of SEQ ID NO: 2, 5, 11, 12, 13, 14 or 15 or a polypeptide at least 90% identical to said polypeptide Anti-idiotypic antibodies.