JP2002508155A - 植物ガラクトースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

植物ガラクトースデヒドロゲナーゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼに関し、特に本発明は、Ｌ−ガラクトースのＬ−ガラクトノラクトンへの転化を触媒する酵素に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、従来知られていない酵素およびその使用、特に、限定されるもので
はないが、植物中でのＬ−アスコルビン酸（Ｌ−トレオ−２−ヘキセノノ−１，
４−ラクトン）を産生する経路におけるＬ−ガラクトースのＬ−ガラクトノラク
トンへの酸化を触媒する酵素に関する。
【０００２】 ビタミンＣとして一般に知られているＬ−アスコルビン酸（「アスコルベート
」）は、葉中で１〜５ｍＭ、葉緑体中では２５ｍＭまでの濃度に達する植物にお
ける主要な代謝物質である。それは酸化防止剤として機能し、光合成および膜貫
通電子伝達の場合、ならびに種々のストレスの多い条件、例えば空気汚染物質、
温度両極端および干魃に対して植物を保護する場合に推定される役割を有する。
Ｌ−アスコルビン酸は細胞膨張および細胞***において役割を果たす、というこ
とも示唆されている。
【０００３】 植物由来Ｌ−アスコルビン酸は、ヒトおよびいくつかの動物（例えばその他の
霊長類およびテンジクネズミ）の食物中のビタミンＣの主要供給源でもあるが、
これは、彼等がこの不可欠な酸化防止剤を自分自身で合成できないためである。
食物中のＬ−アスコルビン酸の不足は、壊血病の症状を引き起こすコラーゲン欠
乏を生じ得る。特に、適正な食餌を摂っていない高齢者の間の無症状性壊血病が
目下問題となっている。
【０００４】 動物におけるＬ−アスコルビン酸の完全生合成経路は長きに亘ってよく知られ
てきたが、しかしその重要性および広範な分布にもかかわらず、植物においては
分からないままであった。
【０００５】 植物におけるＬ−アスコルビン酸の最も有効な前駆体は、Ｌ−ガラクトノ−１
，４−ラクトンである。ミトコンドリア酵素であるＬ−ガラクトノ−１，４−ラ
クトンデヒドロゲナーゼは、種々の植物（この転化を促す）から単離されている
（Mapson, L.W. & Breslow, Biochem, J.68, 395-406（1958）およびOba, K. et
al., J. Biochem. 117, 120-127（1995））。しかしながら、アスコルベートの
生理学的前駆体としてのこの化合物の役割は論じられていない。それは植物中で
検出されておらず、そしてさらに有意には、その提案されたＤ−ガラクツロン酸
からの産生（ Mapson, L.W. et al. Biochem, J.64,13-22（1956））はヘキソー
ス炭素骨格の反転を要するが、これは、グルコースからのアスコルベート合成中
には起きないことを、広範な放射性標識トレーサー試験が実証している（Loewus
, F.A., Phytochemistry 2, 109-128（1963））。しかしながら、植物が炭素鎖 の反転を伴わずにＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを産生し得る場合、アスコ
ルベート生合成における前駆体としてのその関与の根拠として強いものとなる。
【０００６】 本発明者らは、植物中でのＬ−アスコルベートの産生は、糖ヌクレオチドであ
るＧＤＰ−Ｄ−マンノースおよびＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースの相互交換により起
きる、ということを意外にも確定した。Ｄ−マンノースおよびＬ−ガラクトース
は、植物中の細胞アスコルベートの有効な前駆体であることが判明している。本
発明者らは、炭素鎖の反転を伴わずにＬ−ガラクトースのＬ−ガラクトノラクト
ンへの酸化を触媒する新規の酵素も精製し、その後、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースを
Ｌ−ガラクトースおよびＬ−ガラクトノラクトンに転化する植物の能力を実証し
た。植物がＬ−アスコルビン酸を合成する新規に発見した経路を、図５に示す。
ＧＤＰ−糖誘導体（ＧＤＰ−Ｄ−マンノースおよびＧＤＰ−Ｌ−ガラクトース）
は、細胞壁多糖および糖タンパク質の合成において植物に利用される。
【０００７】 現在該経路は明らかにされており、Ｌ−アスコルビン酸の過剰産生を可能にす
るトランスジェニック植物を開発して、ストレスの多い条件下での穀物収率を改
良し、そして果物および野菜の栄養的質を改良する両方の機会が存在している。 トランスジェニック高等生物の産生は、ヒトが消費するためにビタミンＣのレ
ベルを増強した食物を提供する。
【０００８】 Ｌ−アスコルベートのこれらの新規の供給源は、近年栄養失調による壊血病が
問題になっている高齢者および第三世界住民における壊血病の防止に役立つ。 さらに、Ｌ−アスコルベートの利用可能性の増大は、本化合物の考え得る医学
的用途のさらなる研究を可能にし、ならびにヒトの食餌を強化するためのビタミ
ンＣサプリメントとしての使用のための高品質低コストＬ−アスコルベートのレ
ベル増大を提供する。
【０００９】 さらに、精製および産業的開発のための発酵によるＬ−アスコルベートの大規
模製造のためのトランスジェニック微生物を作製することもできる。 さらに、本発明者らによる植物中でのＬ−アスコルベートの産生をもたらす経
路の確定は、アスコルベート生合成経路から炭素を転換する酵素の発現の低減に
関与する植物組織中のアスコルベート含量を増大するための方法の開発を導いた
。この原理を用いて、当業者はアスコルベートレベルの増大を伴うトランスジェ
ニック生物を開発し得る。
【００１０】 さらに、本発明者らは、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ酵素を抑制または
不活性化する植物除草剤として作用する新規の化合物を開発した。除草剤は、種
々のメカニズムにより植物を枯死または損傷する化合物であり、雑草を制御する
ために農業および園芸に用いられる。本発明は、動物に対するそれらの低毒性に
よって大きな効用を有する新種の除草剤を提供する。Ｌ−ガラクトースデヒドロ
ゲナーゼを抑制または不活性化する化学的化合物は、合成され得るし、除草剤と
して用いられ得る。本発明者らは、このような除草作用に対する耐性を示すトラ
ンスジェニック植物も開発した。
【００１１】 本発明の第一の態様は、単離された酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（
公称：Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼ（Ｌ−ガラクトース
：ＮＡＤＰ（Ｐ）+酸化還元酵素））を提供する。本発明のこの態様は、配列番 号１のアミノ酸配列の少なくとも一部分あるいはその配列の均等物またはその配
列の複数の部分を包含するポリペプチドであって、遺伝コードの同義性によって
Ｌ−ガラクトースのＬ−ガラクトノラクトンへの転化を触媒するポリペプチドも
提供する。
【００１２】 「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で用いられる場合、文献中に記載
され、例えばタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとして当業者とされる者
によく知られている存在物を包含する。
【００１３】 好ましくは、ポリペプチドは単離されたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼで
ある。 好ましくは、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼはＮＡＤ（Ｐ）依存性である
。 好ましくは、触媒的転化は酸化反応である。 好ましくは、酸化反応はＣ１での酸化を包含する。 好ましくは、転化は植物内で起こる。
【００１４】 本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を提供する。
【００１５】 本発明の第三の態様は、遺伝子発現制御系内に本発明の第二の態様のＤＮＡ配
列を組み入れることにより本発明の第一の態様のポリペプチドを発現するよう設
計された生物体を提供する。
【００１６】 好ましくは、生物体の全体または部分はポリペプチドを過剰発現する。 好ましくは、生物体は植物である。「植物」という用語は、本明細書中で用い
る場合、藻類を含む。特に、好ましくは植物は、アラビドプシス サリアナ（Ar
abidopsis thaliana）、リコペルシコン エスクレンタム（Lycopersicon escul
entum）、およびリコペルシコン ツベロサム（Lycopersicon tuberosum）から 選択される。
【００１７】 あるいは、生物体は細菌、または真菌、例えば酵母菌、特にサッカロミセス属
、または動物である。生物体が動物である場合には、それは好ましくは哺乳類で
ある。 好ましくは、ＤＮＡ配列は、酸化的ストレスを引き起こすものを含めた環境的
ストレスに対する耐性増大を、そのポリペプチドを発現するよう設計された生物
体に付与するポリペプチドをコードする。
【００１８】 本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様のポリペプチドの少なくとも一部
分を包含するプローブを提供する。プローブは、他の種の中で類似の酵素または
同一酵素を突き止めるために用いられ得る。
【００１９】 本発明の第五の態様は、本発明の第一の態様のポリペプチドをコードする本発
明の第二の態様のＤＮＡ配列の少なくとも一部分、またその配列の均等物あるい
はその配列の複数の部分を包含するプローブを提供する。プローブは、このよう
なＤＮＡ配列と均等なＲＮＡも包含する。どちらのヌクレオチドプローブを用い
ても、他の種における類似の酵素または同一酵素を突き止め得る。
【００２０】 本発明の第六の態様は、化学的または生物学的手段による本発明の第一の態様
のポリペプチドの生成を提供する。
【００２１】 本発明の第七の態様は、本発明の第一の態様のポリペプチドの全体または一部
を用いる診断的検査、検定またはモニタリング方法を提供する。
【００２２】 本発明の第八の態様は、本発明の第四および第五の態様のプローブを用いる診
断的検査、検定またはモニタリング方法を提供する。 好ましくは、診断的検査、検定またはモニタリング方法は、微生物学的、動物
細胞または生物診断的検査、検定およびモニタリング方法を包含する。生物診断
的検査としては、無傷細胞は含まれない全体的または部分的細胞抽出物、あるい
はその他の流体、例えば尿または唾液を用いる検定、例えばＬ−ガラクトースに
関する特異的検定が挙げられる。
【００２３】 本発明の第九の態様は、Ｌ−アスコルビン酸またはその前駆体を生成する多酵
素経路または方法であって、経路の工程の１つが本発明の第一の態様のＬ−ガラ
クトースデヒドロゲナーゼまたはポリペプチドにより触媒される経路または方法
を提供する。
【００２４】 好ましくは、経路は、酵素：ヘキソキナーゼ、グルコース（ヘキソース）−ホ
スフェートイソメラーゼ、ホスホマンノースイソメラーゼ、ホスホマンノースム
ターゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース
−３，５−エピメラーゼ、ＧＤＰ Ｌ−ガラクトースピロホスホリラーゼ、ＧＤ
Ｐ−Ｌ−ガラクトースホスホリラーゼ、Ｌ−ガラクトース−１−ホスフェートホ
スファターゼ、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼおよびＬガラクトノ１−４−
ラクトンデヒドロゲナーゼのうちのいずれかまたはすべてを含む。経路は、in v
itroまたはin vivoで提供され得る。
【００２５】 これらの中間体のいずれか、特にＧＤＰ−Ｄ−マンノースまたはＧＤＰ−Ｌ−
ガラクトースは、多種の最終生成物を伴う他の多酵素経路に関する分岐点であり
得る。
【００２６】 本発明の第十の態様は、本発明の第九の態様の経路により生成されるアスコル
ビン酸を提供する。
【００２７】 本発明の第十一の態様は、本発明の第九の態様の経路の中間体として生成され
る化合物を提供する。
【００２８】 本発明の第十二の態様は、本発明の第九の態様の経路により生成される前駆体
化合物から得られる化合物を提供する。
【００２９】 本発明の第十三の態様は、本発明の第十一の態様のアスコルビン酸を包含する
食物サプリメントを提供する。
【００３０】 本発明の第十四の態様は、生物体の全体またはいずれかの部分が増大レベルの
本発明の第十一の態様のアスコルビン酸を含有する生物体を提供する。
【００３１】 好ましくは、生物体は植物である。 好ましくは、植物としては、アラビドプシス サリアナ（Arabidopsis thalia
na）、リコペルシコン エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）、リコペ ルシコン ツベロサム（Lycopersicon tuberosum）、およびサッカロミセス属（
Sacchromyces species）が挙げられる。
【００３２】 本発明を、ここでは、単に例として配列番号１および図１〜４および６〜７を
参照しながら、説明する。
【００３３】 １．植物中のＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンの産生 炭素鎖の反転を含まず、したがってアスコルベート合成におけるＬ−ガラクト
ノ−１，４−ラクトンデヒドロゲナーゼと関係するものとされる、植物中のガラ
クトノ−ラクトンの可能性のある供給源を調べるために、Ｌ−ガラクトースを１
週齢オオムギ苗（Hordeum vulgare cv. Golden Promise）の一次葉の薄片に供給
した。これは、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトースにより誘導されたものと同
様に、葉アスコルベート濃度の迅速且つ実質的増大を生じた（図１）。Ｌ−ガラ
クトースの供給は、Ａ．サリアナの葉、および発芽中のエンドウ苗（Pisum sati
vum cv. Meteor）の胚子軸においても、アスコルベート濃度を劇的に増大した。
Ｌ−アスコルベートとしての生成物の同定は、アスコルベートオキシダーゼとの
反応性、酸性ＤＣＰＩＰを還元する能力により、そしてＴＬＣおよびＨＰＬＣを
用いたＬ−アスコルベートとの共クロマトグラフィー（co-chromatography）に より確証された（Chen, YT et al., Biochem. J., 55, 821-23（1953）; Conkli
n, PL et al., Plant Physiol. 115, 1277-1285（1997））。本発明者らは、そ れが外生的にエンドウ胚子軸に供給された後のＬ−ガラクトースの蓄積を示すこ
とができた。Ｌ−ガラクトースは、そのトリメチルシリル誘導体のガスクロマト
グラフィーにより測定された（Andrews, M.A., Carbohydrate Research 194:1-1
9（1989））。Ｌ−ガラクトースは外部供給の除去の１時間後には検出できなか ったが、これは、それが迅速且つ有効に代謝されたことを示す。
【００３４】 したがって、Ｌ−ガラクトースは、植物におけるＬ−アスコルベートの有効な
前駆体である。Ｃ１でのＬ−ガラクトースの酸化はＬ−ガラクトノラクトンの産
生を生ずることとなり、そしてこの活性の存在は、Ａ．サリアナの葉およびエン
ドウ胚子軸の無細胞抽出物で調べられた。これらはともに、Ｌ−ガラクトース依
存性ＮＡＤおよびＮＡＤＰ還元を支持していた。エンドウ胚子軸からの酵素活性
は、以下のように精製された。
【００３５】 ２．Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼの精製 暗中で６日間発芽させたエンドウ苗の芽から、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナ
ーゼを抽出した。芽を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）およ
び５％（ｖ／ｖ）グリセロール（０．５ｇの芽／ｍｌ）中でホモジナイズした。
ホモジネートを寒冷しゃ（cheesecloth）を通して濾した後、２６，０００ｇで 、４℃で２０分間遠心分離した。上清を硫酸アンモニウム（２９．１ｇ／１００
ｍｌ）で５０％飽和状態として、前と同様に遠心分離した。次に上清を硫酸アン
モニウム（１２．５ｇ／１００ｍｌ）で７０％飽和状態として、前と同様に遠心
分離した。Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性を含有するペレットを、５０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴおよび
２０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に再懸濁した。
【００３６】 ２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ
および１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4で予め平衡させたフェニルセファロース（登録商 標）（Pharmacia）を詰めたクロマトグラフィーカラム（３００ｘ７ｍｍ）に試 料を入れた。タンパク質を平衡緩衝液中の１〜０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4の勾配で 溶出し、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するそれらの分画をプール
した。次にこの試料を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤ ＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴに対して１６時間透析し、次に、２５ｍＭのトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴで予め平衡させた
陰イオン交換ゲル（ＤＥＡＥ−セファロース（登録商標）、Pharmacia）を詰め たカラム（６５０ｘ１６ｍｍ）に入れた。カラムを、平衡緩衝液中のＫＣｌ勾配
（０〜０．６Ｍ）で溶出した。Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有する
分画をプールした。次にこの試料を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、 １ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴに対して１６時間透析した。次に、透析
試料を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍ ＭのＤＴＴで予め平衡させたＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅセファロース（登録商
標）（Pharmacia）を詰めたカラム（３００ｘ１７ｍｍ）に入れた。カラムを、 ２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５中の１０ｍＭのニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド（ＮＡＤ）−２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５中の１０ｍ ＭのＮＡＤの勾配で洗浄した。後者の緩衝液は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナ
ーゼ活性を溶出した。次に活性分画を、膜を通した遠心分離（Centricon 30, Am
icon Corporation）により濃縮した。濃縮試料を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴで予め平衡させたゲル濾過
カラム（スーパーロース１２（登録商標）、４５０ｘ２５ｍｍ、Pharmacia）に 入れた。タンパク質を、同一緩衝液で溶出した。Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナ
ーゼ活性を溶出するのに必要な緩衝液の容量を測定した。この容量を、既知の分
子量の標準タンパク質の溶出容量と比較した。この比較から、Ｌ−ガラクトース
デヒドロゲナーゼの相対分子量（Ｍｒ）は、１５２，０００であると測定された
。
【００３７】 次にＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性を有するゲル濾過カラムからの分
画を、アセトンを試料に付加することにより濃縮して、最終アセトン濃度を８０
％（ｖ／ｖ）とした。−２０℃で１時間放置後、沈澱タンパク質を１２，０００
ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。次にタンパク質を水中に再溶解
させて、等容量の二重強度Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Hames and Rickwood, 1990）
と混合し、３分間沸騰させた。次に、変性タンパク質にソディウムドデシルサル
フェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）処理を施した
。これは、前記と同様に調製した１０μの試料を、標準手法（Hames and Rickwo
od, 1990）にしたがって調製したゲルに入れることにより実行した。ゲル中のア
クリルアミドの濃度は１０％であった。５０ボルトで１５分間、その後１００ボ
ルトでブロモフェノールブルーマーカーがゲルの末端に達するまで、試料を電気
泳動処理した。この時点で、タンパク質をクーマシーブルー（Hames, B.D. and
Rickwood, D.（1990）. Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Appro
ach. IRL Press/Oxford University Press, Oxford）または銀（Bio-Rad Silver
Stain Plus, メーカーの使用説明書による手法）で染色して可視化した。変性 ポリペプチドのＭｒを、それらの移動距離を既知のＭｒのタンパク質標準と比較
することにより測定した。Ｍｒ３９，８００のポリペプチドが、Ｌ−ガラクトー
スデヒドロゲナーゼ活性を有するゲル濾過カラムからの分画中に存在する、とい
うことが確定された。これは定量的にこれらの分画中の主要タンパク質であり、
そして、染色強度で確定されるその量は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活
性に対して正確な比率で変化した（図７のＡ、ＢおよびＣ参照）。図７において
：
【００３８】 ａ）ゲルは３９．８ｋＤで主バンドを示し、これは分画のＬ−ガラクトースデヒ
ドロゲナーゼ活性と一致する。それぞれ４５、４９、５２、５７、６４および７
０ｍｌ後に溶出した試料ａ〜ｆに関して、活性は０、６、１７、２３．４、２７
．８、６．９９および０ｍＡｂｓ／分であった。 ｂ）左手レーンにおける５つのタンパク質標準の移動を基にした校正曲線。標準
は、リゾチーム（１４．４ｋＤ）、ダイズトリプシンインヒビター（２１．５）
、カルボニックアンヒドラーゼ（３１）、オボアルブミン（４５）およびウシ血
清アルブミン（６６．２）である。 ｃ）タンパク質標準と比較したバンド移動を基礎にした分画ｂ〜ｄに対応するバ
ンド１〜３に関するタンパク質サイズの定量。
【００３９】 他のポリペプチドは、このパターンに従わなかった。このポリペプチドはＬ−
ガラクトースデヒドロゲナーゼのサブユニットである、と結論づけられる。した
がって、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼは、各々Ｍｒ３９，８００を有する
４つのサブユニットから成るＭｒ１５２，０００のホモ四量体タンパク質である
。
【００４０】 ３．エンドウＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼのＮ末端配列の決定 前記と同様に精製したＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼの試料を、８０％（
ｖ／ｖ）アセトンで沈澱させた後、０．１％ｍＭのトリフルオロ酢酸０．１ｍｌ
中に再溶解させた。メーカーの使用説明書にしたがって、試料をＰｒｏＳｏｒｂ
（商標）試料調製装置に適用した（Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster
City, California, USA）。メーカーの使用説明書にしたがって、３−フェニル −２−チオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体のオンライン分析を装備した
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４７７Ａタンパク質シー
ケンシング計器を用いて、エドマン分解法にて（Findlay and Geishow, 1989） 自動シーケンシングを実施した。Ｃ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーカラ
ム上での分離後に、これらを２６９ｎｍでモニタリングした。この方法は、タン
パク質のアミノ末端から開始して、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼの最初の
１９アミノ酸の配列を検出した。配列は、配列番号１で示される。
【００４１】 得られた部分ペプチド配列を用いて、ＢＬＡＳＴＰ検索を実行した（Altshul,
Stephen F. et al,（1997）, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402）。部分ペプチ
ド配列は、未知の機能を有するアラビドプシス サリアナの推定ペプチド配列（
寄託番号3549669）と７２％の同一性を有する。７２％同一性は、アラビドプシ ス サリアナ配列のアミノ酸５〜２２に関して観察された。
【００４２】 配列同一性のレベルから、このアラビドプシス サリアナの推定上のタンパク
質は、実際、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ酵素であると考えられる。
【００４３】 ４．酵素活性の同定 以下の０．１ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）および種々のＬ−ガラクトース濃度を有する
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中での３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ生成により、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性に関して酵素を検定し
た。酵素はＮＡＤを選択することが示されたが、これは一連のその他の糖（Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコースおよびＤ−アラ
ビノース）に関する非常に低い活性を示す。以下に示すように、ラクトン検定お
よびガスクロマトグラフィー−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）により、反応生成
物の同一性を確定した。
【００４４】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ検定からの反応生成物をＮａＯＨ溶液でｐ
Ｈ９．５に調整して、室温で２時間放置し、存在するあらゆるアルドノラクトン
およびウロノラクトンを脱ラクトン化した。次にそれをＤｏｗｅｘ１−ホルメー
ト（陰イオン交換樹脂）のカラムに入れた。水および０．１Ｍ蟻酸でカラムを引
き続き溶出した。蟻酸分画を１００℃で１０分間加熱し、次に気流下で乾燥して
、存在するあらゆるアルドン酸またはウロン酸を再ラクトン化した。次に乾燥試
料をトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体に転化した（Andrews, 1989同上）。Ｈ ｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｕｌｔｒａ２カラム（５０ｍ、内径０．３７ｍ
ｍ、架橋化５％Ｐｈｅ Ｍｅシリコーン、０．１７μｍフィルム厚）上でのキャ
ピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により誘導体を分離し、フレームイオ
ン化検出器で検出した。温度プログラムは１４５℃で１０分間、５℃／分で１７
０℃に上げて５分間保持した後、１０分保持し、２５℃／分で３０５℃に上げて
、５分間保持するというものであった。反応生成物は、純粋Ｌ−ガラクトノ−１
，４−ラクトンと同一相対保持時間を有する１つのピークを生じた（内部標準と
してＤ−アラビトールを用いた）。ＧＣと同一温度プログラムを用いて、Ｈｅｗ
ｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｕｌｔｒａ１カラム（５０ｍ、内径０．２ｍｍ、架
橋化Ｍｅシリコーン、０．３３μｍフィルム厚）上でのガスクロマトグラフィー
−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）により、同一ＴＭＳ誘導体を分析した。その結
果生じた生成物の質量スペクトルは、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンと同一
であった。ヒドロキシルアミンとラクトンとの反応、およびその後の第二鉄イオ
ンとの着色錯体を基礎にした検定を用いて、反応混合物からの生成物を定量した
（Kim S-T et al., Biochem. Biophys. Acta, 1297,1-8（1996））。
【００４５】 反応混合物からの生成物は、ラクトンに関するヒドロキシルアミン検定との陽
性応答を示し、ＮＡＤＨ生成およびラクトン産生（Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラ
クトン均等物における）間の化学量論値は約１：１であった。
【００４６】 生成物は主としてＬ−ガラクトノ−１，５−ラクトンであったと思われるが、
これは相対的に不安定で、自発的に１，４形態に転化する。Ｌ−ガラクトースに
関するＫmは、０．３ｍＭであった（図２）。本酵素はＬ−ソルボソンを酸化し 得たが、別のものは、植物アスコルベート生合成における中間体を示唆した（Sa
ito, K, et al., Plant Physiol. 94, 1496-1500（1990））が、しかし非常に低
い親和性を有した（図２）。生成物はＬ−アスコルビン酸であって、これが標識
化Ｌ−ソルボソンがアスコルベートに転化される理由を説明し得ることが示唆さ
れる（Saito, K, et al., Plant Physiol. 94, 1496-1500（1990））。Ｌ−ソル
ボソンは、Ｃ２でのケト基およびＣ３でのヒドロキシル基を除いて、Ｌ−ガラク
トースと同一形状を有する。
【００４７】 したがって、本発明者らは、高親和性および特異性を有するＬ−ガラクトース
からＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンを生成し得る新規の高等植物の酵素（Ｌ
−ガラクトースデヒドロゲナーゼ）を発見した。
【００４８】 非ホスホリル化アルドースのＣ１を酸化するその他の既知のデヒドロゲナーゼ
は、シュードモナス フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）における Ｄ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ（Maier, E.& Kurtz, G.D., Methods in Enz
ymology 89, 176-181（1982））、哺乳類におけるＬ−フコースデヒドロゲナー ゼ（Schachter, H. et al., J. Biol. Chem. 244, 4785-4792（1969））、およ びカンジダ アルビカンス（Candida albicans）におけるＤ−アラビノースデヒ
ドロゲナーゼ（Kim S-T et al., Biochem. Biophys Acta. 1297, 1-8（1996））
である。
【００４９】 Ｌ−ガラクトースは非セルロース性細胞壁ポリマー中に生じ、このことは、植
物がこの化合物を合成し得ることを示す（Baydoun EAH & Fry SC, J. Plant Phy
siol. 132, 484-490（1988））。細胞壁中のＬ−ガラクトース残基は、ＧＤＰ−
Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を介して生成されるヌクレオチド糖
であるＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースに由来し、このことは、クロレラ（Chlorella ）（Barber, G.A., J. Biol. Chem.254, 7600-7603（1979））および多数の高等
植物（ Barber, G.A., Arch. Biochem Biophys.147, 619-623（1971））で報告 されている。
【００５０】 ５．ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性の検出 ５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％ポリビニルポリピロリドンを含
有する１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中での組織のホモジナイ
ズと、その後の５０００ｒｐｍ（１２，０００ｇ）で２０分間の遠心分離により
、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼを検出した。次に上清を粗製
抽出物として直接用いるか、または９０％飽和硫酸アンモニウムサルフェートで
沈澱させた後、セファデックスＧ−２５（Pharmacia PD10カラム）で脱塩した。
粗製抽出物または沈殿物を、２ｍＭのＥＤＴＡを含有する２５ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０中のＧＤＰ−Ｄ−［Ｕ14Ｃ］マンノースとともに２５℃でイン キュベートした。反応生成物を、強陰イオン交換（ＳＡＸ）カラムを通した。中
性分画を強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラムで脱イオン化した後、薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）処理した。ＧＤＰ−糖を２Ｍの蟻酸を用いてＳＡＸカラムか
ら溶出し、次に２Ｍのトリフルオロ酢酸を用いて８０℃で１時間加水分解した後
、ＴＬＣ処理して、遊離糖質を生成した。アセトン／ブタノール／水（８：１：
１ ｖ／ｖ）溶媒を用いて、０．３Ｍのソディウムジヒドロゲンオルトホスフェ
ートを含浸させたシリカプレート（Whatman）上でのＴＬＣにより、糖質を分離 した（Ghebreqzabher M. et al., J. Chromatogr., 127, 133-162（1976））。 ＴＬＣプレートを、Ｂｅｒｔｈｏｌｄが作製した線状分析器で走査して、放射活
性を検出した。アニリン／ジフェニルアミン染色により検出された正格標準とそ
れらの同時クロマトグラフィーにより、放射活性ピークを同定した（Dawson RMC
et al., Data for Biochemical Research. Clarendon Press. Oxford（1969）3
nd ed.）。Ｄ−およびＬ−ガラクトースは分解されず、そこで反応生成物の同定
は、この化合物を選択的に除去するためにＤ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを
用いて確証された（Roberts R.M & Harper E. Phytochemistry, 12, 2679-2682 （1986））。
【００５１】 ６．Ｌ−ガラクトース産生 本発明者らは、エンドウ胚子軸からの粗製抽出物および沈殿タンパク質（図３
）、ならびにＡ．サリアナの葉からのタンパク質沈殿物の両方を用いて、ＧＤＰ
−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ活性を検出し得た。しかしながら、遊
離Ｌ−ガラクトースは、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼには必要である。遊
離Ｌ−ガラクトースは植物抽出物中に検出されなかったが、しかし大多数のクロ
マトグラフィー技法は、この糖のＤ−およびＬ異性体間のちがいを識別しない。
それにもかかわらず、エンドウ胚子軸の粗製抽出物から遊離Ｌ−ガラクトースの
実質的産生を実証することができた（図３）。遊離Ｄ−マンノースは評価できる
ほどの量で生成されなかったため（図３）、この加水分解は、抽出物中の非特異
的ホスファターゼまたはピロホスホリラーゼ活性の結果ではなかったと思われる
。インキュベーション期間中の抽出物へのＮＡＤの付加は、中性糖分画からのＬ
−ガラクトースの全体的損失を生じた。有意のピークは、Ｌ−ガラクトノラクト
ンが同時溶出されたこれらの分画中で同定され（図３）、これは、これらの抽出
物がＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性も保持したことを示唆する。
【００５２】 結果は、植物がＧＤＰマンノースを介してアスコルベートを合成する能力を有
することを示唆する。この工程がin vivoで起きるか否かを確証するために、放 射性標識化Ｄ−マンノースを、蒸散流を介してＡ．サリアナの葉に供給した。次
に組織抽出物を調製し、下記のようにイオン交換クロマトグラフィーにより分別
した。
【００５３】 ７．放射性標識化前駆体を供給された葉中の放射活性アスコルベート含量の測
定 葉柄を介して放射性標識化前駆体を供給された葉組織を、インキュベーション
期間直後に−７０℃で凍結させた。次に葉組織を液体窒素を含入する乳鉢および
乳棒中で粉末に粉砕した。粉末が解氷する前に、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する５
％過塩素酸１ｍｌを加え、組織をさらに均質にした。次に抽出物を１２，０００
ｇで２分間遠心分離し、上清を収集した。２．５μｌのメチルオレンジを指示薬
として付加し、溶液を５ＭのＫＣＯ3（約６０μｌ）の付加により中和した。抽 出物を１０分間放置後、１２，０００ｇで１分間遠心分離した。上清を回収し、
等容量の１０％ジチオトレイトールと混合し、１０分間放置して、あらゆる酸化
アスコルベートの還元を促した。
【００５４】 次に抽出物を、酸性化合物（例えばアスコルベート）が結合するＳＡＸカラム
を通した。次にカラムを５ｍｌの脱イオン水で洗浄した後、６０ｍＭの蟻酸５ｍ
ｌを用いてアスコルビン酸を溶出した。２Ｍの蟻酸５ｍｌを用いて、さらにあら
ゆる酸性化合物を後に溶出した。６０ｍＭの分画を直ちに冷凍し、凍結乾燥した
。次にアスコルビン酸を２００μｌの１０ｍＭ蟻酸中で再形成し、そして１００
μｌをＨＰＬＣ系上に注入した。２１０ｎｍでのそのＵＶ吸光度により、アスコ
ルビン酸を検出した。溶出物の分画収集とその後の液体シンチレーション計数に
より、アスコルビン酸中の放射能を測定した。ＨＰＬＣ溶出物の分画を０．２分
毎に回収し、これらの４ｍｌのシンチレーション液（Emulsifier Safe）の各々 に付加した。液体シンチレーション計数器を用いて、各々の放射活性を測定した
。ＵＶ検出器からのアスコルベートピークに対応するそれらの分画中の全放射活
性を、葉組織中の放射性アスコルベートの全量を計算するのに用いた。
【００５５】 外生的供給Ｄ−マンノースの細胞壁構成成分中への有効な取込みは、Ｄ−マン
ノースが植物中の主要解糖経路を介して広範に代謝されず、その代わり、ヌクレ
オチド糖中間体の産生に利用される、という示唆をもたらした（Roberts RM Arc
h. Biochem. Biophys. 145, 685-692（1971））。したがって、Ｄ−マンノース からアスコルベートへの放射性標識の有意の取込みが予測され得る。アスコルベ
ート中への放射性標識の取込みレベルは、イオン交換画分とその後のＨＰＬＣに
よるアスコルベートの精製により検出される（Conklin P.L. et al., Plant Phy
siol. 115, 1277-85（1997））。図４は、４時間の［Ｕ−14Ｃ］−Ｄ−グルコー
ス（中白記号）と［Ｕ−14Ｃ］−Ｄ−マンノース（中黒記号）の葉柄供給後のＡ
．サリアナの葉からのアスコルビン酸中で回収された放射能を示す。このグラフ
は、アスコルベートのＨＰＬＣ分析中に回収された溶出物分画中に存在する全放
射活性の割合を示す。非標識化アスコルベートの保持時間は矢印で示されている
。アスコルベートの前に溶出している有意ピークは、デヒドロゲナーゼと考えら
れる。Ｄ−グルコースからアスコルベートに取り込まれた放射性標識の割合は、
通常は低く、約１％またはそれ未満である。［Ｕ−14Ｃ］−Ｄ−マンノースを供
給されたＡ．サリアナの葉では、アスコルベートへの標識の取込みは１０％であ
ることが分かった（図４）。同一結果は、髄根を用いて見出された（データは示
されていない）。これは、Ｄ−マンノースのアスコルベートへの有効な転化の明
らかな指標である。高濃度の外生マンノースは、アスコルベートプールサイズに
影響を及ぼさず、このことは、Ｌ−ガラクトースはマンノース−６−ホスフェー
トに容易にリン酸化されることが知られているため、Ｌ−ガラクトースへのその
転化が速度限定工程であることを示唆する（Harris G.C. et al. Plant Physiol
. 82, 1081-89（1986））。
【００５６】 ８．酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはその他の経路酵素の増強レ
ベルの発現を可能にし、そして増大レベルのアスコルビン酸合成を可能にする遺
伝子組み換え植物
【００５７】 これらの結果は、従来のすべての証拠と一致する高等植物におけるアスコルベ
ート生合成のための経路の提案を可能にした（図５）。提案された反応のすべて
を触媒する植物抽出物の能力が実証され、新規の酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロ
ゲナーゼが検出された。本経路は、Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンのアスコ
ルベートへの酸化の容易性と、従来の標識データとの間の見掛けの不一致を一致
させる。Ｌ−ガラクトノ−１，４−ラクトンがＤ−マンノースおよびＬ−ガラク
トースを介してＤ−グルコースから生成される提案された経路は、植物中でのＤ
−グルコースのアスコルベートへの転化において、炭素鎖の反転は認められず、
Ｃ６でのヒドロキシメチル基の保存が認められ、そしてＣ５でのエピマー化が認
められるというLoewusの記述と一致する（Grhn, M. et al., Pelargonium crisp
um L. L’Her. Plant Physiol. 70, 1233（1982））。オソン（osones）（Ｄ− グルコソンおよびＬ−ソルボソン）からアスコルベートへ標識を取り込む植物の
能力も、この概略と一致し（Saito K. et al., Plant Physiol. 94, 1496-1500 （1990））、そしてＬソルボソンはＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼに対する
基質類似体であることを実証した（図２）。従来報告されている非常に低い親和
性「Ｌ−ソルボソンデヒドロゲナーゼ」活性（Loewus, M.W., et al., Plant Ph
ysiol. 94, 1492-1495（1990））は、したがって、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲ
ナーゼであり得る。
【００５８】 植物組織中のアスコルベート濃度を増大するための他のアプローチは、経路か
ら分岐し、代替的生成物をもたらす反応を触媒する酵素の活性の低減を包含する
。これは、当業者に周知の技術を用いて、アンチセンス配向でこれらの酵素をコ
ードする遺伝子を発現するトランスジェニック植物を産生することにより成され
る（Miki, I.L.A. and Iyer, V.N.（1997）. In:Plant Metabolism, ed, Dennis
, D.H. et al., pp.561-579, Longman）。
【００５９】 微生物（微小藻類、細菌および酵母菌を含む）におけるアスコルベート産生を
増大するためのさらに別のアプローチでは、アスコルベート経路では増大される
反応を触媒する酵素の活性、および／またはアスコルベート経路から分岐する反
応を触媒する酵素の活性を低減させて、発酵法によるアスコルベートの有意の高
収率を生じさせる。酵素活性のこのような調節は、遺伝的に改変された微生物の
使用により成し遂げられる。本明細書中で用いる場合、遺伝子改変微生物、例え
ば大腸菌は、その正常（即ち野生型または天然発生）形態から改変された（即ち
突然変異化または組み換え化）ゲノムを有する。微生物の遺伝子改変は、古典的
菌株開発および／または分子遺伝学的技法を用いて達成され得る。このような技
法は、一般に、例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressに示されている（この記載内容は、 参照により本明細書中に含まれる）。さらに、微生物の遺伝子改変のための技法
は、該文献中に詳細に記載されている。遺伝子改変微生物としては、天然遺伝的
変異体、ならびに、改変が微生物内に所望の作用を提供するような方法で核酸分
子が挿入、欠失または改変された（即ち、例えばヌクレオチドの挿入、欠失、置
換および／または反転により突然変異化された）微生物が挙げられる。本発明に
よれば、遺伝子改変微生物としては、組換え技術を用いて改変された遺伝子改変
も含まれる。本明細書中で用いる場合、遺伝子発現の、遺伝子の機能の、または
遺伝子生成物（即ち遺伝子によりコードされるタンパク質）の機能の低減を引き
起こす遺伝子改変は、遺伝子の不活性化（完全または部分的）、欠失、中断、妨
害または下向き調節として言及され得る。例えば、このような遺伝子によりコー
ドされるタンパク質の機能の低減を引き起こす遺伝子における遺伝子改変は、遺
伝子の完全欠失（即ち、遺伝子は存在せず、したがってタンパク質は存在しない
）、タンパク質の不完全または無翻訳（例えば、タンパク質は発現されない）を
引き起こす遺伝子における突然変異、あるいはタンパク質の天然機能を低減する
か、または無くす遺伝子における突然変異（例えば、酵素の活性または作用を低
減するか、または無くすタンパク質が発現される）から引き起こされ得る。遺伝
子の発現または機能の増大を生じる遺伝子改変は、遺伝子の増幅、過剰産生、過
剰発現、活性化、増強、付加または上向き調節として言及され得る。
【００６０】 本発明の一実施態様では、微生物の遺伝子改変は、アスコルベート代謝経路に
関与するタンパク質の作用を増大し、または本発明のアスコルベート代謝経路と
競合する経路に関与するタンパク質の作用を低減する。このような遺伝子改変と
してはあらゆる種類の改変が挙げられ、特に、組換え技術により、ならびに古典
的突然変異誘発により作製される改変が挙げられる。例えば、一実施態様では、
本発明の微生物は、本明細書中に記載したアスコルベート経路に沿う以外のＧＤ
Ｐ−Ｄ−マンノースの転化を触媒するあらゆる酵素の作用を低減する遺伝子改変
を有する。例えば、アスコルベートの産生と競合する経路では、ＧＤＰ−Ｄ−マ
ンノースはＧＤＰ−Ｄ−マンヌロン酸（ＧＤＰ−Ｄ−マンノースデヒドロゲナー
ゼにより）、ＧＤＰ−Ｄ−ラムノース、ＧＤＰ−Ｌ−フコースおよび多糖の前駆
体であるその他の化合物に転化される。本明細書中で考察される改変のためのこ
のような反応を触媒する酵素をコードする特定の遺伝子の同定のために、このよ
うな競合経路に関する文献を本明細書中では参照する。酵素の作用（または活性
）の低減に対する参照は、酵素の機能性低減を生じ、酵素のより高い活性（例え
ば特異的活性またはin vivo酵素活性）、酵素の抑制または分解の増大、ならび に酵素の発現不足を含む問題の微生物中でのあらゆる遺伝子改変に言及する、と
いうことに留意すべきである。例えば、元のプロモーターの場合よりも低レベル
の発現を生じるプロモーターの使用により遺伝子コピー数は低減され、また発現
レベルは低減され、あるいは遺伝子工学的または従来の突然変異誘発により遺伝
子が変えられて、酵素の作用を低減し得る。例えば、本発明の酵素の作用は、酵
素の産生を妨害または低減し、酵素活性を低減し、あるいは酵素の活性を抑制す
ることにより低減され得る。酵素の産生を妨害または低減することには、増殖培
地中の誘導化合物の存在を必要とするプロモーターの制御下に酵素をコードする
遺伝子を置くことが含まれる。インデューサーが培地から枯渇するようになる条
件を確立するために、酵素をコードする遺伝子の（したがって酵素合成の）発現
は避けられ得る。酵素の活性の妨害または低減は、米国特許第4,743,546号（こ の記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたのと同様の切断
技術アプローチを用いることも含み得る。このアプローチを用いるために、目的
の酵素をコードする遺伝子は、ゲノムからの遺伝子の特異的制御化切断を可能に
する特定の遺伝子配列間にクローン化される。切断は、例えば、米国特許第4,74
3,546号に記載されているような培養の培養温度のシフトにより、あるいは何ら かのその他の物理的または栄養的シグナルによって促される。
【００６１】 別の例としては、本発明の微生物は、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースおよび本明細書
中に記載したアスコルベート経路にさらに沿ったＧＤＰ−Ｄ−マンノースへの前
駆体の転化を触媒する、あらゆる酵素の作用を増大する遺伝子改変を有する。例
えば、図５を参照すると、６つの酵素のうちの１つ又はそれ以上の作用は、本明
細書中で考察するように、増大され得る。本明細書中で考察されるような改変の
ためにこのような反応を触媒する酵素をコードする特定の遺伝子の同定のために
、このような代謝工程に関する文献を本明細書中では参照する。
【００６２】 ９．トランスジェニック植物の作製 マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、これまでに同定され、
クローン化されている。アンチセンス配向でベクター中に含入されるこの遺伝子
は、その場合、確立された技法を用いて植物を遺伝的に形質転換させ得る（Miki
, I.L.. and Iyer, V.N.（1997）. Plant Metabolism, ed. Dennis, D.H. et al
., pp. 561-579, Longman）。その結果生じる植物は、マンノシルトランスフェ ラーゼ活性の低減を示し、したがって、アスコルビン酸合成へのＧＤＰ−マンノ
ースの高レベルの迂回を示す。特定の組織、例えば果実を標的にしたアンチセン
ス遺伝子の発現（これらの特定の組織中での遺伝子発現を駆動することが知られ
ている遺伝子プロモーターを用いて）は、これらの特定組織中のアスコルベート
濃度の増大を提供する。必要とされる明確な農学的、官能的または栄養的特徴に
よって、次に達成されたアンチセンス抑制のレベルによって最適均衡化表現型を
示す植物に関して後代をスクリーニングする必要がある。この遺伝子操作の副作
用として、細胞壁の多糖組成を変えることとなる可能性がある。
【００６３】 １０．除草剤標的としての植物酵素の使用 異なる生化学的経路によりＬ−アスコルビン酸を産生する動物は周知である。
ヒトはＬ−アスコルビン酸を合成できない。この経路におけるＬ−ガラクトース
デヒドロゲナーゼの独特の役割により、本発明者らは、植物Ｌ−ガラクトースデ
ヒドロゲナーゼの特異的阻害剤または不活性剤を包含する除草剤を開発すること
ができる。この除草剤は他の生物に対してほとんど毒性を示さないが、これらの
化合物の設計は、天然基質の構造についての知識および／または酵素の触媒部位
の構造に基づく傾向にあるが、必ずというわけではない。
【００６４】 本発明の酵素をコードする遺伝子は、制限ゲノム消化をプローブするために用
いられ得るオリゴヌクレオチドを設計するためのペプチド配列情報を使用し、そ
の後の標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いたシングルコロニーブロッティ
ングを用いることによりクローン化され得る。
【００６５】 さらに、改変化酵素がその特定の除草剤によりもはや抑制されないように、例
えば無作為または特定部位の突然変異誘発を用いて、Ｌ−ガラクトースデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を改変することにより、このような除
草剤に対する耐性を有する穀物植物が産生され得る。次に改変された遺伝子は、
トランスジェニック植物の産生のために当業者に用いられる標準技法によりあら
ゆる適切な穀物植物中に導入される。その結果生じるトランスジェニック植物は
、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを標的とした除草剤に耐性である。
【００６６】 １１．除草剤耐性植物の産生 アスコルベート生合成における鍵的酵素としてのＬ−ガラクトースデヒドロゲ
ナーゼの同定は、従来記載されているような酵素の単離、精製およびin vitro検
定を可能にした。本発明者らは、基質（Ｌ−ガラクトース）に類似した、そして
Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼの活性部位と結合する阻害剤を合成した。こ
のような阻害剤の例は、反応の天然生成物であるＬ−ガラクトノ−１，４−ラク
トンで、非競合的方法で酵素の活性を抑制する（図６）。例えば炭素原子５およ
び６のヒドロキシル基のアルキル化によるこの基質のさらに別の化学的改変は、
Ｌ−アスコルビン酸へのそのさらなる代謝を防止し、それにより除草剤としての
その効力を増大する。同じ原理が、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを抑制ま
たは不活性化するその他のあらゆる化合物に適用され得る。in vivoで検定した 精製または部分的精製酵素の活性に及ぼすそれらの作用を示すことにより、Ｌ−
ガラクトースデヒドロゲナーゼの潜在的阻害剤および不活性剤が検出される。
【００６７】 エンドウ胚子軸からのＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを、前記と同様に精
製する。０．１ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）を含有する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、
ｐＨ７．５中での、３４０ｎｍでの、下記のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成により、Ｌ−ガ
ラクトースデヒドロゲナーゼ活性に関して酵素を検定する。
【００６８】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを標的にした除草剤に対する耐性を有する
植物は、改変化酵素がその特定の除草剤により、もはや抑制されないように、Ｌ
−ガラクトースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡ配列を改変するこ
とにより（例えば、無作為または特定部位の突然変異誘発（Directed Mutagenes
is. A Practical Approach. Ed. MJ. McPherson, IRL Press, Oxford, 1991）を
用いて）、産生され得る。次に、トランスジェニック植物の産生のために当業者
に用いられる標準技法（例えば、Filliati et al., Biotechnology 5, 728-730 （1987）、およびMcCormick et al., Plant Cell Reports（1986）5, 81-84）に
より、改変された遺伝子をあらゆる適切な穀物植物中に導入し、そこで発現させ
る。その結果生じるトランスジェニック植物は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナ
ーゼを標的とした除草剤に耐性である。
【００６９】 １２．トランスジェニック生物におけるアスコルビン酸のレベルの増大 葉の可溶性糖質内容物の１０％までがＬ−アスコルベートを包含するため、ア
スコルベート生合成の経路の同定は、植物糖質代謝における大きな隙間を満たす
。ジャガイモおよびトマトのような植物におけるアスコルベート生合成の制御を
調べること、そしてヒトの栄養および酸化的ストレスに対する植物の耐性のため
に潜在的に有益であるその含量を操作することが、目下、可能である。それらの
組織中の増大レベルのアスコルビン酸を有するトランスジェニック生物が作製さ
れ得る。
【００７０】 これは、好ましくは高レベルの標的ポリペプチドの発現を指図し得る遺伝子ベ
クター中への標的遺伝子配列の挿入を包含する。このようなポリペプチドは、酵
素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ、またはその他のアスコルビン酸生合成経
路酵素を包含する。
【００７１】 植物の場合、例として、ｐＰＢ１１２１といったベクターが一般に知られてい
る。別のものはｐＧＰＴＶ−ｋａｎである。各々、いわゆるバイナリーアグロバ
クテリウムベクター系の構成成分であるｐＰＢ１１２１またはｐＧＰＴＶ−ｋａ
ｎの場合、酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ、またはその他の経路酵素の
新規のヌクレオチドコード配列は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはそ
の他の経路酵素遺伝子が、機能的プロモーター遺伝子、特にこの場合、植物のほ
とんどの器官における酵素合成を指図するＣａＭＶの３５Ｓプロモーターと転写
的に融合するように、βグルクロニダーゼレポーター遺伝子の先行切断を介して
挿入され得る。特に組織特異的作用、例えば高アスコルベートトマトが必要とさ
れる場合には、その他のプロモーターも３５Ｓの代わりに用いられ得る。このよ
うな遺伝子構築物は、次に、ベクター系のアグロバクテリウム構成成分に伝達さ
れる。これの好ましい例は、トマトやジャガイモといったナス科の形質転換に適
したアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株である。この伝達を成し遂げるために
、大腸菌中で継代培養され、増幅されたｐＰＢ１１２１またはｐＧＰＴＶ−ｋａ
ｎの遺伝子構築物のＤＮＡを、塩化カルシウム中で予備培養し、液体窒素中で凍
結させて、−７０℃で保持し、そして解氷して調製されたコンピテントアグロバ
クテリウム細胞の３７℃培養に付加する。
【００７２】 前記のように構築されたアグロバクテリウム株を用いて新規の遺伝子構築物を
植物に伝達する能力は、同時培養（co-cultivation）として当業者に既知の手法
によっており、それによりアグロバクテリウム株が選定植物種の組織外植片とと
もにin-situで培養される。その後、抗生物質による処理（カウンターセレクシ ョン）によりアグロバクテリウムをを排除し、非形質転換化組織に対して致死性
であるカナマイシンのような二次抗生物質によって、形質転換化植物組織を選択
する。形質転換化植物組織は、関与する植物種によって確立された組織培養法に
より新芽および根に再分化するよう誘導される。このようにして、ＴＯ世代から
回収された形質転換化植物を、変更レベルの酵素Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナ
ーゼ、またはその他の経路酵素を産生する能力に関して検査する。次にこのよう
な植物を自家受粉させて、新規の特性に関して分離するＴ１種子集団を生成する
。新規の特性に関してゼロ（無接合体）、一接合性または二接合性であるＴ１種
子から成長させた個々の植物を、慣用的ＰＣＲ法により同定し得る。次に、この
ような植物を用いて、一接合性または二接合性植物が無接合性対照より多くのア
スコルビン酸を産生し得ることを実証する。
【００７３】 例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換およびトマト植物の回収について
の詳細な手法を以下に示す。本手法は、 Filliati et al., Biotechnology 5, p
728-730（1987）、およびMcCormick et al., Plant Cell Reports（1986）5, p8
1-84により発表されたものに由来する。
【００７４】 トマトの種子（変種Ailsa craig）を、先ず７０％エタノール中で洗浄し、次 に滅菌のために１０％ドメストス（Domestos）中に３時間保持した後、最終の濯
ぎをして、２８℃の滅菌水中に一晩浸す。次に、発芽培地を含入する滅菌透明タ
ブ中で、２５℃で１６／２４時間の明期で、種子を発芽させる。７〜１０日後の
形質転換のために子葉を用意し、１子葉当たり０．５〜１．０ｃｍの部分が２つ
生じるように注意深く横断して、形質転換用に調製する。外植片を、培養タバコ
細胞の支持細胞層上の滅菌濾紙上で８時間予備インキュベートする。前記のアグ
ロバクテリウム株の培養を、ＭＳ培地＋３％スクロース中に再懸濁して、ＯＤ59 0 を０．４〜０．５とし、外植片をこれに浸漬させた後、フィーダ層に再び戻し て、放置して４０時間同時培養させる。
【００７５】 次に外植片を、ペトリ皿中の５００ｇ／ｍｌのセファタキシン（アグロバクテ
リウムに対する対抗選択）および１００ｇ／ｍｌのカナマイシン（形質転換化植
物細胞の選択）を含有する寒天選択および対抗選択培地の表面に移す。このよう
にして外植片を培養し、２週間置きに新鮮な培地に移す。新芽の発芽が開始した
ら、外植片をガラス培養容器に移し、芽が伸びてきたらそれらを元の植物体から
切断して、元のレベルの半分の抗生物質選択を含有する発根培地上に置く。発芽
し根が出た小植物をその上で成長させて、順化期間の湿度条件を提供するよう注
意しながら、標準園芸法にしたがって、土壌に移すか、またはその他の成長培地
に移す。
【００７６】 一旦培養したこのような植物は、それらの組織中のアスコルビン酸レベルの増
大を示す。アスコルビン酸のこの過剰生成は、ストレスの多い条件下での植物収
率の増大を提供する。アスコルベートのレベル増大を示すこのような植物は、ア
スコルビン酸の細胞内レベルの増大により、栄養的質が増大した果実または野菜
を産生し得る。
【００７７】 配列番号１は、エンドウ苗（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）からのＬ−ガラク
トースデヒドロゲナーゼの部分的ポリペプチド配列を示す。 配列番号１ Alanine-glutamate-leucine-arginine-glutamate-leucine-glycine-arginine-
threonine-glycine-leucine-lysine-leucine-glycine-leucine-valine-glycine-
phenylalanine-glycine
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、異なる基質に曝露されたオオムギ葉部分におけるアスコル
ベート産生を示すグラフである。
【図２】 図２は、硫酸アンモニウム沈降および疎水性相互作用クロマトグラ
フィーによりエンドウ胚子軸から部分的に精製されたＬ−ガラクトースデヒドロ
ゲナーゼの動力学的特徴を示すグラフである。
【図３】 図３は、糖質中への放射能標識取込みのレベルを示す一連のラジオ
クロマトグラムである。
【図４】 図４は、Ａ．サリアナ葉から回収されたアスコルビン酸中の放射能
レベルを示すグラフである。
【図５】
【図６】 図６は、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼに及ぼすＬ−ガラクト
ノ−１，４−ラクトンの抑制作用を示す一組のグラフである。
【図７】 図７は、セファロース１２ゲル
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/04 ４Ｂ０６５ 5/10 Ｃ１２Ｐ 17/04 ４Ｈ０１１ 9/04 Ｃ１２Ｑ 1/32 Ｃ１２Ｐ 17/04 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/32 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ Ｂ Ｃ (31)優先権主張番号 ９８０７３６０．４ (32)優先日 平成10年４月７日(1998．4．7) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スミノフ，ニック イギリス デボン イーエックス４ ４キ ューアール エクセター ユニバーシティ ー オブ エクセター リード ホール アスコーベックス リミテッド (72)発明者 ホィーラー，グレン イギリス デボン イーエックス４ ４キ ューアール エクセター ユニバーシティ ー オブ エクセター リード ホール アスコーベックス リミテッド Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CD02 CD07 CD09 CD10 CD13 CD14 CD21 4B024 AA08 AA11 BA08 BA10 CA09 DA01 DA02 DA05 DA11 FA02 GA11 GA17 HA01 HA12 4B050 CC01 CC04 DD13 LL05 LL10 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ05 QQ08 QQ24 QQ61 QQ68 QQ93 QR04 QR32 QR56 QS34 4B064 AE45 CA06 CA11 CC24 DA11 4B065 AA01X AA57X AA72X AA83X AA89X AA90X AB01 AC14 BA02 CA18 CA28 CA53 4H011 AB01 BB19 DH11

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ。
  2. 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一部分またはその配
    列の機能的均等物、あるいはその配列の複数の部分を包含するポリペプチドであ
    って、遺伝コードの同義性によってＬ−ガラクトースのＬ−ガラクトノラクトン
    への転化を触媒するポリペプチド。
  3. 【請求項３】 単離されたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ、またはポリ
    ペプチドはＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼである請求項２記載のポリペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼはＮＡＤ（Ｐ）依存性で
    ある、請求項２または３記載の単離されたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼま
    たはポリペプチド。
  5. 【請求項５】 触媒的転化が酸化反応である請求項２〜４のいずれか一項記
    載の単離されたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはポリペプチド。
  6. 【請求項６】 酸化反応がＣ１での酸化を包含する請求項１記載の単離され
    たＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたは請求項５記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 前記転化が植物内で起きる請求項２〜６のいずれか一項記載
    の単離されたＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはポリペプチド。
  8. 【請求項８】 請求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガラクトースデヒド
    ロゲナーゼまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
  9. 【請求項９】 遺伝子発現制御系内に請求項８記載のＤＮＡ配列を組み入れ
    ることにより請求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガラクトースデヒドロゲナ
    ーゼまたはポリペプチドを発現するように設計された生物体。
  10. 【請求項１０】 生物体の全体またはいずれかの部分がポリペプチドを過発
    現する請求項９記載の生物体。
  11. 【請求項１１】 酸化的ストレスを引き起こすものを含めた環境的ストレス
    に対する耐性増大を付与するポリペプチドを前記ＤＮＡ配列がコードする請求項
    ９または請求項１０記載の生物体。
  12. 【請求項１２】 請求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガラクトースデヒ
    ドロゲナーゼまたはポリペプチドの少なくとも一部分を包含するプローブ。
  13. 【請求項１３】 請求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガラクトースデヒ
    ドロゲナーゼまたはポリペプチドをコードする請求項８記載のＤＮＡ配列の少な
    くとも一部分またはその配列の均等物またはその配列の複数の部分を包含するプ
    ローブ。
  14. 【請求項１４】 化学的手段または生物学的手段による請求項２〜７のいず
    れか一項記載のＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはポリペプチドの生産。
  15. 【請求項１５】 請求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガラクトースデヒ
    ドロゲナーゼまたはポリペプチドの全体または部分を用いる診断的検査、検定ま
    たはモニタリング方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５記載のプローブを用いる診断的検査、検定また
    はモニタリング方法。
  17. 【請求項１７】 検査、検定、およびモニタリング方法が微生物学的、動物
    細胞または生物診断的検査、検定およびモニタリング方法を包含する請求項１５
    または１６記載の診断的検査、検定またはモニタリング方法。
  18. 【請求項１８】 Ｌ−アスコルビン酸を生成する単離された多酵素経路また
    は方法であって、経路の工程の１つが請求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガ
    ラクトースデヒドロゲナーゼまたはポリペプチドにより触媒される経路または方
    法。
  19. 【請求項１９】 経路がヘキソキナーゼ、グルコース（ヘキソース）−ホス
    フェートイソメラーゼ、ホスホマンノースイソメラーゼ、ホスホマンノースムタ
    ーゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−
    ３，５−エピメラーゼ、ＧＤＰ Ｌ−ガラクトースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ
    −Ｌ−ガラクトースホスホリラーゼ、Ｌ−ガラクトース−１−ホスフェートホス
    ファターゼ、Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼおよびＬガラクトノ１−４−ラ
    クトンデヒドロゲナーゼの内のいずれかまたはすべてを含む請求項１８記載のア
    スコルビン酸生成の多酵素経路または方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１８または１９記載の経路により生成されるＬ−ア
    スコルビン酸。
  21. 【請求項２１】 請求項１８または１９記載の経路の中間体として生成され
    る化合物。
  22. 【請求項２２】 請求項１８または１９記載の経路により生成される前駆体
    化合物から得られる化合物。
  23. 【請求項２３】 請求項２０記載のアスコルビン酸を包含する食物サプリメ
    ント。
  24. 【請求項２４】 生物体の全体またはいずれかの部分が増大レベルの請求項
    ２０記載のアスコルビン酸を含有する生物体。
  25. 【請求項２５】 請求項１８または１９記載の多酵素経路を操作するように
    設計された生物体。
  26. 【請求項２６】 経路中の１つ又はそれ以上の酵素を過剰発現するよう設計
    された請求項２４または２５記載の生物体。
  27. 【請求項２７】 アスコルビン酸生合成経路から炭素を転換させる経路に関
    与する少なくとも１つの酵素の活性を低減することにより増大レベルのＬ−アス
    コルビン酸を発現するように設計された請求項２４〜２６のいずれか一項記載の
    生物体。
  28. 【請求項２８】 前記少なくとも１つの酵素が多糖または糖タンパク質合成
    に関与する請求項２７記載の生物体。
  29. 【請求項２９】 酵素がグリコシルトランスフェラーゼである請求項２８記
    載の生物体。
  30. 【請求項３０】 酵素がマンノシルトランスフェラーゼである請求項２８記
    載の生物体。
  31. 【請求項３１】 前記少なくとも１つの酵素が前記少なくとも１つの酵素を
    コードするＤＮＡ配列のアンチセンスコピーの発現により下向き調節される請求
    項２７、２８、２９または３０記載の生物体の産生方法。
  32. 【請求項３２】 アンチセンスＤＮＡ配列の発現が組織または器官特異的プ
    ロモーターにより制御される請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３１〜３２のいずれか一項記載の方法により産生さ
    れる植物。
  34. 【請求項３４】 環境的ストレスに対する増強化耐性を有する請求項３３記
    載の植物。
  35. 【請求項３５】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼのアンチセンスコピー
    を包含する請求項３３または３４記載の植物。
  36. 【請求項３６】 生物体が植物である請求項９〜１１および２４〜３０のい
    ずれか一項記載の生物体。
  37. 【請求項３７】 植物がアラビドプシス サリアナ（Arabidopsis thaliana
    ）、リコペルシコン エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）、およびリ コペルシコン ツベロサム（Lycopersicon tuberosum）から選択される、請求項
    ３６記載の生物体。
  38. 【請求項３８】 細菌、酵母またはその他の真菌、植物藻類または動物であ
    る請求項９〜１１および２４〜３０のいずれか一項記載の生物体。
  39. 【請求項３９】 非天然Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを発現するよう
    に設計された植物を用いるＬ−アスコルビン酸の非微生物的生成方法。
  40. 【請求項４０】 非天然Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを発現するよう
    設計された微生物を用いるＬ−アスコルビン酸の微生物的生成方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３９または４０記載の方法により生成されるアスコ
    ルビン酸。
  42. 【請求項４２】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼを阻害する化合物を包
    含する除草剤組成物。
  43. 【請求項４３】 化合物がＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼの発現または
    Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼにより触媒される反応を阻害する請求項４２
    記載の除草剤組成物。
  44. 【請求項４４】 請求項４２または４３記載の除草剤組成物において用いる
    のに適した化合物の単離方法であって、インビトロでのＬ−ガラクトースデヒド
    ロゲナーゼ活性における被験化合物の影響を測定することを包含する方法。
  45. 【請求項４５】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼが少なくとも部分的に
    精製される請求項４４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４２または４３記載の組成物において用いるのに適
    した化合物の単離方法であって、インビボでのＬ−ガラクトースデヒドロゲナー
    ゼ活性における被験化合物の影響を測定することを包含する方法。
  47. 【請求項４７】 Ｌ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ活性がアスコルビン酸
    合成の測定により決定される請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４２または４３記載の除草剤組成物に耐性である請
    求項２〜７のいずれか一項記載のＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはポリ
    ペプチドの一形態をコードするＤＮＡ配列。
  49. 【請求項４９】 請求項４２または４３記載の除草剤組成物に耐性である植
    物の精製方法であって、請求項４８記載のＤＮＡ配列で植物を形質転換し、それ
    により請求項２〜７記載のＬ−ガラクトースデヒドロゲナーゼまたはポリペプチ
    ドの除草剤耐性形態が発現されることを包含する方法。
  50. 【請求項５０】 請求項４９記載の方法により得られる植物およびそれから
    得られる繁殖可能体。
  51. 【請求項５１】 枯れさせる植物を請求項４２または４３記載の除草剤組成
    物と接触させることを包含する除草方法。
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