JP2002507544A - Modified antibodies with enhanced ability to elicit anti-idiotypic responses - Google Patents

Modified antibodies with enhanced ability to elicit anti-idiotypic responses

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JP2002507544A JP2000520812A JP2000520812A JP2002507544A JP 2002507544 A JP2002507544 A JP 2002507544A JP 2000520812 A JP2000520812 A JP 2000520812A JP 2000520812 A JP2000520812 A JP 2000520812A JP 2002507544 A JP2002507544 A JP 2002507544A
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amino acid
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、鎖内ジスルフィド結合を形成している１個以上の可変領域残基がスルフヒドリル基を含まないアミノ酸残基で置換されており、その結果鎖内ジスルフィド結合を形成しない改変型の免疫グロブリン分子に関する。この種の免疫グロブリン分子は抗イディオタイプ応答を引き出す能力が増している。本発明はさらに、本発明の改変型免疫グロブリンを用いて癌および／または感染症を予防または治療する方法を提供する。   (57) [Summary] The present invention relates to a modified immunoglobulin in which one or more variable region residues forming an intrachain disulfide bond are substituted with an amino acid residue not containing a sulfhydryl group, so that an intrachain disulfide bond is not formed. About molecules. This type of immunoglobulin molecule has increased ability to elicit anti-idiotypic responses. The present invention further provides a method for preventing or treating cancer and / or infectious disease using the modified immunoglobulin of the present invention.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】関連出願の相互参照 本出願は仮出願第60/065,716号(1997年11月14日出願)および仮出願第60/081,4
03号(1998年4月10日出願)の恩恵を主張するものであり、そのいずれの記載内容 も参照により本明細書中に含めるものとする。[0001] A related application of cross-reference this application provisional application No. 60 / 065,716 (November 14, 1997 application) and Provisional Patent Application No. 60 / 081,4
No. 03 (filed on April 10, 1998), the disclosure of which is incorporated herein by reference.

【０００２】 １．発明の分野 本発明は改変された免疫グロブリンおよびそのワクチン組成物に関するもので
あり、これらにおいては、１以上の可変領域において鎖内ジスルフィド結合を形 成するシステイン残基が、スルフヒドリル基をもたないためにジスルフィド結合
を形成しないアミノ酸残基に置き換えられている。本発明はまた、特定の疾病お よび障害、特に癌および感染症を治療または予防するための、本発明のワクチン 組成物の使用に関する。[0002] 1. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to modified immunoglobulins and vaccine compositions thereof, wherein the cysteine residue forming an intrachain disulfide bond in one or more of the variable regions does not have a sulfhydryl group. Has been replaced by an amino acid residue that does not form a disulfide bond. The present invention also relates to the use of the vaccine composition of the present invention for treating or preventing certain diseases and disorders, particularly cancer and infectious diseases.

【０００３】 ２．発明の背景 ２．１．免疫グロブリン構造 免疫グロブリン構造の基本単位は、非共有結合およびジスルフィド結合により 互いに連結された４個のポリペプチドと２個の同一の低分子量を有する(すなわ ち「Ｌ(light)」)鎖とからなる複合体である。１つの抗体中の各Ｌ鎖およびＨ鎖
は、そのアミノ末端に１つの可変領域、およびそのカルボキシ末端に１つの定常
ドメインを有する(図１)。可変領域は各抗体によって異なり、抗体抗原結合部位
を含有する。各可変ドメインは、４つの比較的保存されたフレームワーク領域と
相補性決定領域(すなわち「CDR」)と呼ばれる配列超可変性を有する３つの領域か らなる(図２)。大抵の場合、このCDRが抗原結合部位を形成して抗原特異性を付与
する。定常領域は可変ドメインより高度に保存されていて、ハプロタイプの違い
による僅かな変化を有するのみである。[0003] 2. BACKGROUND OF THE INVENTION 2.1. The basic unit of immunoglobulin structure immunoglobulin structure has four polypeptides and two identical low molecular weight which are connected to each other by a non-covalent and disulphide bonds (Sunawa Chi "L (light)") strand and Is a complex consisting of Each L and H chain in one antibody has one variable region at its amino terminus and one constant domain at its carboxy terminus (FIG. 1). The variable region differs for each antibody and contains the antibody-antigen binding site. Each variable domain consists of four relatively conserved framework regions and three regions with sequence hypervariability called complementarity determining regions (or "CDRs") (Figure 2). In most cases, this CDR forms the antigen binding site and confers antigen specificity. The constant regions are more conserved than the variable domains and have only minor changes due to haplotype differences.

【０００４】 Ｌ鎖をそのアミノ酸配列に基づいてκまたはλのいずれかに分類する。定常領
域のＨ鎖は多数のドメイン(CH1,CH2，CH3,...CHx)で構成され、その数は特定の 抗体のクラスに依存する。CH1領域は、抗体に柔軟性を付与するヒンジ領域によ りCH2領域と隔てられている。各Ｌ鎖の可変領域は各Ｈ鎖の可変領域と整列して おり、各Ｌ鎖の定常領域は各Ｈ鎖の第１定常領域と整列している。Ｈ鎖の定常領
域のCH2〜CHxドメインは、免疫グロブリン分子のエフェクター機能(例えば、補 体の結合、リンパ球、顆粒球、単球系細胞、キラー細胞、マスト細胞および他の
免疫エフェクター細胞により発現されたFc受容体への結合)に関与する「Fc領域 」を形成する。[0004] Light chains are classified as either kappa or lambda based on their amino acid sequence. The heavy chain of the constant region is composed of a number of domains (CH1, CH2, CH3,... CHx), the number of which depends on the particular antibody class. The CH1 region is separated from the CH2 region by a hinge region that confers flexibility on the antibody. The variable region of each L chain is aligned with the variable region of each H chain, and the constant region of each L chain is aligned with the first constant region of each H chain. The CH2-CHx domains of the heavy chain constant region are expressed by effector functions of immunoglobulin molecules (e.g., complement binding, lymphocytes, granulocytes, monocyte cells, killer cells, mast cells, and other immune effector cells). (Fc region) which is involved in the binding to the Fc receptor.

【０００５】 図３から分かるように、IgG分子のＬ鎖およびＨ鎖は可変領域ドメインおよび 定常領域ドメインを形成する。各ドメインは、２つの並行して伸びる約100アミ ノ酸長のタンパク質層からなるサンドイッチで構成され、前記タンパク質層は１
つのジスルフィド結合により連結されている(Roittら、Immunology, 第３版、Lo
ndon；Mosby, 1993, p4.4を参照されたい)。さらに、この２つの並行して伸びる
タンパク質層からなる前記ドメインは、βシート構造をとる２つの「逆並行」隣
接鎖を含有する(Stryer, 1975, Biochemistry, WH Freeman and Co., p.950を参
照されたい)。各ドメインは免疫グロブリンの折りたたみ(fold)に基づいて類似 の三次元構造をとる。[0005] As can be seen from Figure 3, the light and heavy chains of an IgG molecule form a variable region domain and a constant region domain. Each domain consists of a sandwich consisting of two parallel, approximately 100 amino acid-long protein layers, each comprising one protein layer.
(Roitt et al., Immunology, 3rd ed., Lo
ndon; see Mosby, 1993, p4.4). In addition, the domain, consisting of two parallel protein layers, contains two "anti-parallel" flanking strands that adopt a beta sheet structure (Stryer, 1975, Biochemistry, WH Freeman and Co., p. 950. Please see). Each domain adopts a similar three-dimensional structure based on the immunoglobulin fold.

【０００６】 ２．２．免疫療法および抗イディオタイプ抗体 現代医学において、免疫療法またはワクチン接種により、ポリオ、破傷風、結
核、水痘、麻疹、肝炎等の疾病が実質的に根絶された。ワクチン接種を用いるア
プローチは免疫系の感染症を予防する能力を利用するものであった。[0006] 2.2. Immunotherapy and Anti-Idiotype Antibodies In modern medicine, immunotherapy or vaccination has substantially eradicated diseases such as polio, tetanus, tuberculosis, varicella, measles, hepatitis and the like. Vaccination approaches have taken advantage of the ability of the immune system to prevent infections.

【０００７】 癌の治療への免疫療法の利用についても研究された。腫瘍免疫学の時代はPreh
nおよびMainによる実験から始まり、彼らはメチルコラントレン(MCA)誘導性肉腫 上の抗原が、移植アッセイにおいてこれらの抗原がマウスの正常組織で検出でき
ないという点で腫瘍特異的であることを示した(Prehnら、1957, J.Natl.Cancer
Inst. 18:79-778)。この見解は、MCA誘導性腫瘍に対する腫瘍特異的抵抗性が自 己宿主、すなわち該腫瘍の起源であるマウスにおいて引き出されうることを示す
さらなる実験により確認された(Kleinら、1990, Cancer Res. 20:151-1572)。[0007] The use of immunotherapy to treat cancer has also been studied. Preh is the age of tumor immunology
Beginning with experiments by n and Main, they showed that antigens on methylcholanthrene (MCA) -induced sarcomas were tumor-specific in that these antigens could not be detected in normal mouse tissues in transplantation assays (Prehn et al., 1957, J. Natl. Cancer.
Inst. 18: 79-778). This view was confirmed by further experiments showing that tumor-specific resistance to MCA-induced tumors can be elicited in the autologous host, the mouse that is the source of the tumor (Klein et al., 1990, Cancer Res. : 151-1572).

【０００８】 癌患者に免疫療法を使用することが望まれるのには多くの理由がある。まず第
１に、癌患者が手術の際に免疫抑制状態にある場合、麻酔およびその後の化学療
法によりその免疫抑制は悪化する可能性があるが、手術前の期間に適切な免疫療
法を用いれば、この免疫抑制を予防または逆転させることができる。これにより 感染性の合併症が殆ど無くなり、また創傷の治癒が促進される。第２に、腫瘍の 容積は手術後に最小となり、この場合、免疫療法が最も効果的であると思われる
。第３の理由は、腫瘍細胞は手術時に循環系に流れ込むので、この時期に適用し
た効果的な免疫療法によりこれらの細胞を除去することができるという可能性で
ある。[0008] There are many reasons why it is desirable to use immunotherapy for cancer patients. First, if a cancer patient is immunosuppressed during surgery, anesthesia and subsequent chemotherapy may exacerbate the immunosuppression, but if appropriate immunotherapy is used during the preoperative period, Can prevent or reverse this immunosuppression. This eliminates almost any infectious complications and promotes wound healing. Second, tumor volume is minimal after surgery, where immunotherapy appears to be the most effective. A third reason is that tumor cells flow into the circulatory system during surgery, and it is possible that effective immunotherapy applied at this time can remove these cells.

【０００９】 免疫療法には２つのタイプ、「能動免疫療法」および「受動免疫療法」がある
。「能動免疫療法」では、抗原をワクチン形態で患者に投与し、それにより防御
免疫応答を引き出す。「受動免疫療法」では付随する免疫応答を引き出すこと無
く抗体を患者に投与する必要がある。ある動物に由来する特定の抗体を免疫原と
して適切な第２の動物に注射すると、注射された抗体は免疫応答を引き出すであ
ろう。従来、抗体による治療は受動的であると特徴付けられている。これは、患
者が抗体の供給源ではないからである。しかしながら、受動という用語は誤解を
招きやすい。何故なら、患者は抗イディオタイプ２次抗体を産生し、次いでこの
２次抗体により元の抗原と交差反応性を有する免疫応答を引き起こすことができ
るからである。患者が２次抗体を生成する免疫療法は受動免疫療法より治療上有
効である場合が多いが、これは最初に抗体を注入したずっと後まで患者固有の免
疫系が特定の抗原を担持する細胞と戦い続けるからである。There are two types of immunotherapy, “active immunotherapy” and “passive immunotherapy”. In "active immunotherapy", an antigen is administered to a patient in the form of a vaccine, thereby eliciting a protective immune response. "Passive immunotherapy" requires that antibodies be administered to a patient without eliciting an associated immune response. Upon injection of a particular antibody from one animal as an immunogen into a suitable second animal, the injected antibody will elicit an immune response. Traditionally, treatment with antibodies has been characterized as passive. This is because the patient is not a source of the antibody. However, the term passive is misleading. This is because the patient produces a secondary anti-idiotype antibody, which can then elicit an immune response that is cross-reactive with the original antigen. Immunotherapy, in which patients produce secondary antibodies, is often more effective than passive immunotherapy, because the patient's unique immune system has cells with specific antigen-bearing cells long after the initial injection of antibodies. Because they keep fighting.

【００１０】 抗イディオタイプ応答では、免疫応答中に最初に産生された抗体または生物に
導入された抗体は、該生物が寛容でないユニークで新たなエピトープを担持し、
このため２次抗体(「Ab2」と記す)の産生を生じさせる。これらAb2のうち幾つかは
１次抗体、すなわち最初に産生されたまたは外因的に導入された抗体(「Ab1」と記
す)のイディオタイプ(すなわち抗原結合部位)に対して誘導されたものである。 これら２次抗体(すなわちAb2)は同様にイディオタイプを有し、３次抗体(「Ab3」 と記す)の産生を誘導する。これらAb3のうち幾つかはAb2の抗原結合部位等を認 識する。このことは「ネットワーク」理論として知られている。２次抗体の幾つか
は元の抗原の類似体である結合部位を有し、このため元の抗原の「内部イメージ」
を再現する。また、Ab2抗体のこの抗原結合部位を認識する３次抗体(すなわち「A
b3」)は元の抗原も認識する(図４)。In an anti-idiotypic response, the antibody initially produced during the immune response or introduced into an organism carries a unique new epitope to which the organism is not tolerated,
This results in the production of a secondary antibody (denoted "Ab2"). Some of these Ab2s are directed against the idiotype (i.e., antigen binding site) of the primary antibody, i.e., the originally produced or exogenously introduced antibody (denoted "Ab1"). . These secondary antibodies (ie, Ab2) also have an idiotype and induce the production of a tertiary antibody (denoted “Ab3”). Some of these Ab3 recognize the Ab2 antigen-binding site and the like. This is known as "network" theory. Some of the secondary antibodies have binding sites that are analogs of the original antigen, and thus the "internal image" of the original antigen
To reproduce. In addition, a tertiary antibody that recognizes this antigen-binding site of Ab2 antibody (ie, “A
b3 ") also recognizes the original antigen (FIG. 4).

【００１１】 従って、抗イディオタイプ抗体は抗原と構造および電荷の点で類似した結合部
位を有し、癌抗原それ自身のものと同じかまたはそれ以上の応答を引き出すこと
ができる。このため、強力な抗イディオタイプ応答を引き出しうる外因性抗体の
投与は一定の免疫応答を維持することで効果的なワクチンとして作用する。[0011] Thus, anti-idiotype antibodies have binding sites similar in structure and charge to the antigen and can elicit the same or better response than the cancer antigen itself. Thus, administration of an exogenous antibody that can elicit a strong anti-idiotypic response acts as an effective vaccine by maintaining a constant immune response.

【００１２】 これまで、抗イディオタイプワクチンはマウス抗体を含んでいた。これは、イ
ディオタイプ応答は典型的なヒト-抗マウス抗体(HAMA)応答の一部として生じる からである。強力な抗イディオタイプカスケードはAb1が構造的に損傷を受け、 該抗体がより異質なものとなった際に観察される(Madiyalakanら、1995, Hybrid
oma 14:199-203)。抗腫瘍抗体のイディオタイプに対して生じさせた、外因的に 産生させた抗イディオタイプ抗体が患者に直接投与されている(米国特許第4,918
,14)。投与後、患者の身体はこれらの抗イディオタイプ抗体だけでなく元の腫瘍
エピトープをも認識する抗-抗体を産生し、それにより補体活性化および異質部 分に対する他の免疫系応答を指令し、腫瘍エピトープを発現している腫瘍細胞を
攻撃する。Heretofore, anti-idiotype vaccines have included mouse antibodies. This is because the idiotypic response occurs as part of a typical human-anti-mouse antibody (HAMA) response. A strong anti-idiotype cascade is observed when Ab1 is structurally damaged and the antibody becomes more heterogeneous (Madiyalakan et al., 1995, Hybrid
oma 14: 199-203). Exogenously produced anti-idiotype antibodies raised against the idiotype of anti-tumor antibodies have been administered directly to patients (U.S. Pat.
,14). After administration, the patient's body produces anti-antibodies that recognize not only these anti-idiotypic antibodies but also the original tumor epitope, thereby directing complement activation and other immune system responses to foreign parts. Attack tumor cells expressing tumor epitopes.

【００１３】 しかしながら、抗イディオタイプワクチンが望ましい標的であって、その幾つ
かが同定されているものの、かかる抗イディオタイプ応答を再現性をもって生じ
させる抗体を送達することは現在も可能でない(Foonら、1995, J.Clin. Invest.
9:334-342；Madiyalakanら、1995, Hybridoma 14:199-203)。抗イディオタイプ
応答を誘発することができない理由の１つは、全ての抗体は非常に類似した構造
を有し、また自己分子に対する抗イディオタイプ応答が非常に限定される傾向に あるため、Ab1が(外因性のものであっても)依然として「自己」に非常に類似して いるということである。従って、当分野においては、特定の抗体に対して抗イデ
ィオタイプ応答を確実に誘発する方法が必要とされている。However, although anti-idiotype vaccines are desirable targets, some of which have been identified, it is not currently possible to deliver antibodies that reproducibly generate such anti-idiotype responses (Foon et al. , 1995, J. Clin. Invest.
9: 334-342; Madiyalakan et al., 1995, Hybridoma 14: 199-203). One of the reasons that anti-idiotypic responses cannot be elicited is that Ab1 has a very similar structure and tends to have a very limited anti-idiotypic response to self-molecules. It is still very similar to "self" (even if it is exogenous). Thus, there is a need in the art for a method to reliably elicit an anti-idiotypic response to a particular antibody.

【００１４】 ３．発明の概要 本発明は、１以上の鎖内ジスルフィド結合を形成する１以上の可変領域システ
イン残基がスルフヒドリル基を含有しないアミノ酸残基で置き換えられていて、
このため特定のジスルフィド結合を形成しない抗体が、可変領域のジスルフィド
結合がそのままである抗体よりもかなり強力な抗イディオタイプ応答を引き出す
という、本発明者らの認識に基づくものである。[0014] 3. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method wherein one or more variable region cysteine residues forming one or more intrachain disulfide bonds are replaced with amino acid residues that do not contain a sulfhydryl group.
This is based on the inventors' recognition that antibodies that do not form specific disulfide bonds elicit a much stronger anti-idiotypic response than antibodies in which the variable region disulfide bonds remain intact.

【００１５】 従って、本発明は、改変された免疫グロブリン分子または抗体(ならびに機能的
に活性なその断片、誘導体および類似体)、これらの免疫グロブリン分子を含有 するワクチン組成物を提供する。前記の免疫グロブリンの可変領域は、例えば、 限定するものではないが、１以上の鎖内または鎖間ジスルフィド結合を破壊する ことによって構造的な拘束が低減される傾向にある。具体的には、本発明は、可 変領域を含み、かつ該可変領域において１以上のアミノ酸が置換されている以外
は第２の免疫グロブリン分子と同一である、改変型の免疫グロブリンを提供する
。前記の第２の免疫グロブリン分子は免疫特異的に抗原と結合(すなわち、抗体-
抗原結合を測定するための当分野で公知の任意の方法により測定した、免疫グロ
ブリンとその抗原との特異的な結合であって、非特異的結合を除くが必ずしも他
の抗原との交差反応性は除かない)することが可能である。そして前記１以上の アミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成してい
る１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基を
もたないアミノ酸残基１個以上との置換である。好ましい実施形態においては、 第２の免疫グロブリン分子は免疫特異的に癌抗原に結合しうる。他の好ましい実
施形態においては、第２の免疫グロブリン分子は病原体の抗原または病原体に対
する細胞受容体に免疫特異的に結合しうる。Accordingly, the present invention provides modified immunoglobulin molecules or antibodies (and functionally active fragments, derivatives and analogs thereof), and vaccine compositions containing these immunoglobulin molecules. The variable regions of the immunoglobulins described above, for example, but not limited to, tend to reduce structural constraints by breaking one or more intra- or inter-chain disulfide bonds. Specifically, the present invention provides modified immunoglobulins that comprise a variable region and are identical to a second immunoglobulin molecule except for one or more amino acid substitutions in the variable region. . The second immunoglobulin molecule immunospecifically binds to the antigen (ie, antibody-
Specific binding between immunoglobulin and its antigen, measured by any method known in the art for measuring antigen binding, excluding non-specific binding but not necessarily cross-reactivity with other antigens Not excluded). And wherein said one or more amino acid substitutions does not have a sulfhydryl group at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. Substitution with one or more. In a preferred embodiment, the second immunoglobulin molecule is capable of immunospecifically binding to a cancer antigen. In another preferred embodiment, the second immunoglobulin molecule is capable of immunospecifically binding to a pathogen antigen or a cell receptor for the pathogen.

【００１６】 本発明はさらに、本発明の改変された免疫グロブリンを投与することにより被
験者の抗イディオタイプ応答を引き出す方法を提供する。特定の実施形態では、
本発明の改変された免疫グロブリンを使用して、具体的には本発明の免疫グロブ
リンを投与することにより、癌を治療または予防することができる。この免疫グ
ロブリン分子は癌抗原に免疫特異的に結合しうる免疫グロブリンから誘導された
もの(すなわち、本発明に従って改変して、鎖内ジスルフィド結合を形成する１ 個以上の可変領域のシステイン残基を、スルフヒドリル基をもたない１個のアミ
ノ酸残基と置き換えたもの)であり、前記癌抗原の発現は癌の特定のタイプに関 連している。さらに、他の実施形態では、本発明の改変された免疫グロブリンを
使用して、感染症を引き起こす病原体の抗原または病原体に対する細胞受容体と
免疫特異的に結合しうる免疫グロブリン分子から誘導された免疫グロブリン分子
を投与することにより、感染症を治療または予防することができる。The present invention further provides a method for eliciting an anti-idiotypic response in a subject by administering a modified immunoglobulin of the present invention. In certain embodiments,
The modified immunoglobulin of the present invention can be used to treat or prevent cancer, specifically by administering the immunoglobulin of the present invention. The immunoglobulin molecule is derived from an immunoglobulin capable of immunospecifically binding to a cancer antigen (i.e., modified according to the present invention to remove cysteine residues of one or more of the variable regions that form intrachain disulfide bonds). , A single amino acid residue without a sulfhydryl group), the expression of said cancer antigens being associated with a particular type of cancer. Further, in other embodiments, the modified immunoglobulins of the present invention are used to immunize immunogens derived from immunoglobulin molecules capable of immunospecifically binding to an antigen of a pathogen causing an infection or a cell receptor for the pathogen. By administering a globulin molecule, an infectious disease can be treated or prevented.

【００１７】 本発明はまた、本発明の改変された免疫グロブリン分子およびこの本発明の改
変された免疫グロブリン分子を含有するワクチン組成物を製造する方法を提供す
る。The present invention also provides a modified immunoglobulin molecule of the present invention and a method for producing a vaccine composition containing the modified immunoglobulin molecule of the present invention.

【００１８】 ５. 本発明の詳細な説明 本発明は、もとの改変されていない免疫グロブリンよりも強力な免疫応答、特
に、より強力な抗イディオタイプ応答を引き出す、改変された免疫グロブリン（
特に抗体、ならびにその機能的に活性な断片、誘導体および類似体）を提供する
。特に、本発明の改変免疫グロブリンは、改変されていない時には抗原に免疫特
異的に結合し、そして該免疫グロブリン分子の１つの可変領域に対する立体配置
上の拘束（conformational constraint）を低減させるように改変される免疫グ ロブリンである。好ましくはこの改変は、その免疫グロブリンの可変領域の中の
鎖内のジスルフィド結合の形成に関与しているシステインの少なくとも１つを、
スルフヒドリル基を持たないアミノ酸残基に置き換えてジスルフィド結合を形成
しないようにし（図５）、これにより該免疫グロブリンの該可変領域の少なくと
も１つの立体配置上の拘束を低減するように行われる。本発明の好適な実施の形
態において、該改変免疫グロブリン分子は、癌抗原に免疫特異的に結合すること
ができる免疫グロブリンから得られる。他の好適な実施形態において、該改変免
疫グロブリン分子は、感染性病原体の抗原、または感染性病原体のための細胞受
容体に免疫特異的に結合することができる免疫グロブリンに由来する。5. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to modified immunoglobulins that elicit a stronger immune response than the original unmodified immunoglobulin, in particular, a stronger anti-idiotype response.
In particular, antibodies, and functionally active fragments, derivatives and analogs thereof are provided. In particular, the modified immunoglobulins of the invention, when unmodified, immunospecifically bind to an antigen and are modified to reduce conformational constraints on one variable region of the immunoglobulin molecule. Immune globulin that is used. Preferably, the modification comprises at least one of the cysteines involved in the formation of intrachain disulfide bonds in the variable region of the immunoglobulin.
This is done in such a way that amino acid residues without sulfhydryl groups are substituted so as not to form disulfide bonds (FIG. 5), thereby reducing the conformational constraint of at least one of the variable regions of the immunoglobulin. In a preferred embodiment of the invention, the modified immunoglobulin molecule is obtained from an immunoglobulin capable of immunospecifically binding to a cancer antigen. In other preferred embodiments, the modified immunoglobulin molecule is derived from an immunoglobulin capable of immunospecifically binding to an antigen of an infectious pathogen, or a cell receptor for the infectious pathogen.

【００１９】 また本発明は、本発明の改変免疫グロブリン分子を含むワクチン組成物も提供
する。さらに本発明は、本発明の改変免疫グロブリン分子の投与により被験者に
おいて抗イディオタイプ応答を生じさせる方法を提供する。The present invention also provides a vaccine composition comprising the modified immunoglobulin molecule of the present invention. Further, the present invention provides a method for generating an anti-idiotypic response in a subject by administering a modified immunoglobulin molecule of the present invention.

【００２０】 具体的な実施の形態において、本発明は、その改変されていない状態において
癌抗原（特定の癌に関連して発現する）に免疫特異的に結合することができる本
発明の改変免疫グロブリン分子の投与により癌を治療または予防する方法を提供
する。該改変免疫グロブリンの投与により被験者において抗イディオタイプ応答
が引き出され、これにより該癌抗原に特異的な抗体が該被験者により産生される
。他の具体的な実施の形態において、該改変免疫グロブリンは、その改変されて
いない状態において、感染性病原体の抗原または感染性病原体に対する細胞受容
体に結合することができる。このような免疫グロブリンを使用して、感染性病原
体により引き起こされる感染症を治療または予防することができる。In a specific embodiment, the present invention provides a modified immunization of the present invention capable of immunospecifically binding to a cancer antigen (expressed in connection with a particular cancer) in its unmodified state. Methods for treating or preventing cancer by administering globulin molecules are provided. Administration of the modified immunoglobulin elicits an anti-idiotypic response in the subject, whereby antibodies specific for the cancer antigen are produced by the subject. In other specific embodiments, the modified immunoglobulin is capable of binding, in its unmodified state, to an antigen of the infectious agent or to a cellular receptor for the infectious agent. Such immunoglobulins can be used to treat or prevent infections caused by infectious agents.

【００２１】 限定するためではなく明瞭な開示のために、本発明の詳細な記載を以下のよう
に幾つかの節に分ける。For purposes of clarity and not for limitation, the detailed description of the present invention is divided into sections as follows.

【００２２】 ５．１ 改変型抗体 本発明の改変型免疫グロブリン（特に抗体）は、少なくともその改変されてい
ない状態において、抗原に免疫特異的に結合することができ、そして抗イディオ
タイプ応答を引き出すそれらの能力を強化するように改変された免疫グロブリン
である。このような免疫グロブリンは、例えば鎖内もしくは鎖間のジスルフィド
結合を除去したり還元させたりすることにより、化学的修飾により、あるいは当
分野で公知である他の任意の方法により、該免疫グロブリンの可変領域に対する
立体配置上の拘束を低減するように改変される。特に本発明は、可変領域を含み
、且つ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては第２の免疫グロブリン分
子と同一である、第１の免疫グロブリン分子を提供する。この中で、該第２の免
疫グロブリン分子は抗原に免疫特異的に結合することができ、該アミノ酸置換は
、前記第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成している１個以上
のシステイン残基に対応する１以上の位置でのスルフヒドリル基を持たないアミ
ノ酸残基１個以上による置換である。また本発明は、本発明の改変免疫グロブリ
ンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。5.1 Modified Antibodies The modified immunoglobulins (especially antibodies) of the present invention are capable of immunospecifically binding to an antigen and eliciting an anti-idiotypic response, at least in its unmodified state. Immunoglobulins that have been modified to enhance their ability. Such immunoglobulins can be isolated from the immunoglobulin by, for example, removing or reducing intra- or inter-chain disulfide bonds, by chemical modification, or by any other method known in the art. Modifications are made to reduce configurational constraints on the variable region. In particular, the present invention provides a first immunoglobulin molecule that comprises a variable region and is identical to a second immunoglobulin molecule except for one or more amino acid substitutions in the variable region. Wherein the second immunoglobulin molecule is capable of immunospecifically binding to an antigen, and wherein the amino acid substitution comprises at least one cysteine forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. Substitution at one or more positions corresponding to a residue by one or more amino acid residues without a sulfhydryl group. The invention also provides a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a modified immunoglobulin of the invention.

【００２３】 特定の抗体の可変領域中でジスルフィド結合を形成するシステイン残基の同定
は、当分野で公知である任意の方法により行うことができる。例えば、限定する
わけではないが、当分野では、鎖内のジスルフィド結合を形成するシステイン残
基が各種抗体クラス間および種間の間で高度に保存されていることは周知である
。従って、ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基は、どの残基がジ
スルフィド結合を形成するのかが分かっている他の抗体分子との配列比較により
、同定することができる。The identification of cysteine residues that form disulfide bonds in the variable region of a particular antibody can be performed by any method known in the art. For example, but not by way of limitation, it is well known in the art that cysteine residues forming intrachain disulfide bonds are highly conserved among various antibody classes and species. Thus, cysteine residues involved in disulfide bond formation can be identified by sequence comparison with other antibody molecules for which residues are known to form disulfide bonds.

【００２４】 表１は、多数の抗体分子についての、ジスルフィド結合を形成しているシステ
イン残基の位置のリストを提供する。Table 1 provides a list of the positions of cysteine residues forming disulfide bonds for a number of antibody molecules.

【００２５】[0025]

【表１】 （Kabat et al, 1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, 5t
h, Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland
.出典） 種 可変領域 亜種 ジスルフィド結合形成 システイン（位置） ヒト κＬ鎖 Ｉ 23,88 ヒト κＬ鎖 II 23,88 ヒト κＬ鎖 III 23,88 ヒト κＬ鎖 IV 23,88 ヒト λＬ鎖 Ｉ 23,88 ヒト λＬ鎖 II 23,88 ヒト λＬ鎖 IIII 23,88 ヒト λＬ鎖 IV 23,88 ヒト λＬ鎖 Ｖ 23,88 ヒト λＬ鎖 VI 23,88 マウス κＬ鎖 Ｉ 23,88 マウス κＬ鎖 II 23,88 マウス κＬ鎖 III 23,88 マウス κＬ鎖 IV 23,88 マウス κＬ鎖 Ｖ 23,88 マウス κＬ鎖 VI 23,88 マウス κＬ鎖 VII 23,88 マウス κＬ鎖 雑種(miscellaneous) 23,88 マウス λＬ鎖 23,88 チンパンジー λＬ鎖 23,88 ラット κＬ鎖 23,88 ラット λＬ鎖 23,88 ウサギ κＬ鎖 23,88 ウサギ λＬ鎖 23,88 イヌ κＬ鎖 23,88 ブタ κＬ鎖 23（88） ブタ λＬ鎖 23,88 モルモット λＬ鎖 23（88） ヒツジ λＬ鎖 23,88 ニワトリ λＬ鎖 23,88 シチメンチョウ λＬ鎖 23（88） ギンザメ(ratfish) λＬ鎖 23（88） サメ κＬ鎖 23,88 ヒト Ｈ鎖 Ｉ 22,92 ヒト Ｈ鎖 II 22,92 ヒト Ｈ鎖 III 22,92 マウス Ｈ鎖 Ｉ(A) 22,92 マウス Ｈ鎖 Ｉ(B) 22,92 マウス Ｈ鎖 II(A) 22,92 マウス Ｈ鎖 II(B) 22,92 マウス Ｈ鎖 II(C) 22,92 マウス Ｈ鎖 III(A) 22,92 マウス Ｈ鎖 III(B) 22,92 マウス Ｈ鎖 III(C) 22,92 マウス Ｈ鎖 III(D) 22,92 マウス Ｈ鎖 V(A) 22,92 マウス Ｈ鎖 V(B) 22,92 マウス Ｈ鎖 雑種（miscellaneous） 22,92 ラット Ｈ鎖 22,92 ウサギ Ｈ鎖 22,92 モルモット Ｈ鎖 22,92 ネコ Ｈ鎖 22（92） イヌ Ｈ鎖 22,92 ブタ Ｈ鎖 22（92） ミンク Ｈ鎖 22（92） アシカ Ｈ鎖 22（92） アザラシ Ｈ鎖 22（92） ニワトリ Ｈ鎖 22,92 カモ Ｈ鎖 22（92） ガチョウ Ｈ鎖 22（92） ハト Ｈ鎖 22（92） シチメンチョウ Ｈ鎖 22（92） カイマン Ｈ鎖 22,92 ツメガエル Ｈ鎖 22,92 カライワシ(elops) Ｈ鎖 22,92 金魚 Ｈ鎖 22,92 ギンザメ Ｈ鎖 22（92）サメ Ｈ鎖 22,92 [Table 1] (Kabat et al, 1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, 5t
h, Ed., US Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland
Source: Species Variable region Subspecies Disulfide bond forming cysteine (position) human κ light chain I 23,88 human κ light chain II 23,88 human κ light chain III 23,88 human κ light chain IV 23,88 human λ light chain I 23,88 Human λ light chain II 23,88 human λ light chain IIII 23,88 human λ light chain IV 23,88 human λ light chain V 23,88 human λ light chain VI 23,88 mouse κ light chain I 23,88 mouse κ light chain II 23,88 mouse κ light chain III 23,88 mouse κ light chain IV 23,88 mouse κ light chain V 23,88 mouse κ light chain VI 23,88 mouse κ light chain VII 23,88 mouse κ light chain hybrid (miscellaneous) 23,88 mouse λ light chain 23,88 Chimpanzee λ light chain 23,88 rat κ light chain 23,88 rat λ light chain 23,88 rabbit κ light chain 23,88 rabbit λ light chain 23,88 dog κ light chain 23,88 pig κ light chain 23 (88) pig λ light chain 23,88 guinea pig λ light chain 23 (88) sheep λ light chain 23,88 chicken λ light chain 23,88 turkey λ light chain 23 (88) Giant shark (ratfish) λ light chain 23 (88) Κ light chain 23,88 human heavy chain I 22,92 human heavy chain II 22,92 human heavy chain III 22,92 mouse heavy chain I (A) 22,92 mouse heavy chain I (B) 22,92 mouse heavy chain II (A) 22,92 mouse H chain II (B) 22,92 mouse H chain II (C) 22,92 mouse H chain III (A) 22,92 mouse H chain III (B) 22,92 mouse H chain III (C) 22,92 mouse heavy chain III (D) 22,92 mouse heavy chain V (A) 22,92 mouse heavy chain V (B) 22,92 mouse heavy chain hybrid (miscellaneous) 22,92 rat heavy chain 22,92 Rabbit H chain 22,92 Guinea pig H chain 22,92 Cat H chain 22 (92) Dog H chain 22,92 Pig H chain 22 (92) Mink H chain 22 (92) Sea lion H chain 22 (92) Seal H chain 22 (92) Chick H chain 22, 92 Duck H chain 22 (92) Goose H chain 22 (92) Pigeon H chain 22 (92) Turkey H chain 22 (92) Caiman H chain 22, 92 Xenopus H chain 22 , 92 Sea eagle (elops) H chain 22,92 Goldfish H chain 22,92 Great shark H chain 22 (92) Shark H chain 22, 92

【００２６】 （）で囲んだ位置番号は、そのタンパク質がその位置まで配列決定されていない
が、既知の配列との比較によりその残基が推測されることを示す。A position number enclosed in () indicates that the protein has not been sequenced to that position, but that the residue is deduced by comparison with a known sequence.

【００２７】 注目すべきことに、表１に挙げた抗体分子の全てについて、鎖内のジスルフィ
ド結合を形成するシステイン残基はＬ鎖可変ドメインの23位および88位にある残
基、およびＨ鎖可変ドメインの22位および92位にある残基である。これらの位置
番号は、Kabat (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5t
h Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland)
に記載された共通配列、または図7Aおよび図7Bにそれぞれ示されたＨ鎖および Ｌ鎖可変領域配列中に示された共通配列中の、その残基に対応する残基を指す（
「対応する」とは、該共通配列、または図7Aもしくは図7Bに記載されたＨ鎖もし
くはＬ鎖可変領域の配列と、特定の抗体配列と、を整列させて決定される）。Notably, for all of the antibody molecules listed in Table 1, the intra-chain disulfide bond forming cysteine residues are at residues 23 and 88 of the light chain variable domain, and the heavy chain Residues at positions 22 and 92 of the variable domain. These position numbers are described in Kabat (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5t.
h Ed., US Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland)
Or the residue corresponding to that residue in the consensus sequence shown in the H and L chain variable region sequences shown in FIGS. 7A and 7B, respectively.
“Corresponding” is determined by aligning the consensus sequence or the sequence of the H chain or L chain variable region described in FIG. 7A or 7B with the specific antibody sequence.)

【００２８】 従って、本発明の１実施形態において、該改変免疫グロブリン分子は、Ｌ鎖の
23位および/または88位の残基がスルフヒドリル基を含まないアミノ酸残基で置 換されている、ならびに/あるいは、Ｈ鎖の22位および/または92位の残基がスル
フヒドリル基を含まないアミノ酸残基で置換されている、抗体である。Thus, in one embodiment of the invention, the modified immunoglobulin molecule comprises a light chain
Amino acid residues at positions 23 and / or 88 are replaced with amino acids that do not contain a sulfhydryl group, and / or amino acids at positions 22 and / or 92 of the H chain that do not contain a sulfhydryl group An antibody substituted with a residue.

【００２９】 本発明の改変免疫グロブリンにおいて、ジスルフィド結合を形成するシステイ
ン残基に代わるアミノ酸残基は、スルフヒドリル基を含まない任意のアミノ酸残
基、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩（またはア
スパラギン酸）、グルタミン、グルタミン酸塩（またはグルタミン酸）、グリシ
ン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリ
ン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンなどである。
好適な実施形態において、該システイン残基は、グリシン、セリン、トレオニン
、チロシン、アスパラギンまたはグルタミン残基、最も好ましくはアラニン残基
により置換される。In the modified immunoglobulin of the present invention, the amino acid residue that substitutes for a cysteine residue forming a disulfide bond is any amino acid residue that does not contain a sulfhydryl group, for example, alanine, arginine, asparagine, aspartate (or asparagine). Acid), glutamine, glutamate (or glutamic acid), glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine or valine.
In a preferred embodiment, the cysteine residue is replaced by a glycine, serine, threonine, tyrosine, asparagine or glutamine residue, most preferably an alanine residue.

【００３０】 さらに、このジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、（例えば限定す
るわけではないが、常套的なタンパク質合成法を用いて）スルフヒドリル基を含
まない非古典的なアミノ酸（non-classical amino acid）または化学的アミノ酸
類似体で置換することができる。非古典的アミノ酸には、共通アミノ酸（common
amino acid）のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ 酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノ
プロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、
サルコシン、シトルリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリ
シン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、デザイナー
アミノ酸（designer amino acid）（例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミ
ノ酸、Nα-メチルアミノ酸）、および一般的なアミノ酸類似体が含まれるが、こ
れらに限定されない。さらに、該アミノ酸は、D（右旋性）であってもL（左旋性
）であってもよい。他の実施形態において、該ジスルフィド結合形成残基は欠失
される。In addition, the cysteine residues that form this disulfide bond may be non-classical amino acids that do not contain a sulfhydryl group (eg, using, but not limited to, conventional protein synthesis techniques). acid) or a chemical amino acid analog. Non-classical amino acids include common amino acids (common
D-isomer of amino acid), α-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, Abu, 2-aminobutyric acid, γ-Abu, ε-Ahx, -aminohexanoic acid, Aib, 2-aminoisobutyric acid, 3-aminopropion Acid, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline,
Sarcosine, citrulline, t-butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, β-alanine, fluoro-amino acid, designer amino acid (eg, β-methyl amino acid, Cα-methyl amino acid, Nα-methyl Amino acids), and common amino acid analogs. Further, the amino acid may be D (dextrorotary) or L (levorotary). In other embodiments, the disulfide bond forming residues are deleted.

【００３１】 特定の実施形態において、該ジスルフィド結合形成残基の置換は、Ｈ鎖可変領
域またはＬ鎖可変領域でおこるか、あるいはＨ鎖およびＬ鎖可変領域の両方にお
いて起こる。他の特定の実施形態において、特定のジスルフィド結合を形成する
残基のうちの一方が置換（または欠失）される。あるいは、特定のジスルフィド
結合を形成する残基の両方が置換（または欠失）されてもよい。In certain embodiments, the substitution of the disulfide bond forming residue occurs in the heavy or light chain variable region, or occurs in both the heavy and light chain variable regions. In certain other embodiments, one of the residues that form a particular disulfide bond is substituted (or deleted). Alternatively, both of the residues that form a particular disulfide bond may be substituted (or deleted).

【００３２】 他の実施形態において、本発明は、該可変領域中のジスルフィド結合形成残基
の第２の免疫グロブリン分子に比べて、１以上のアミノ酸がスルフヒドリル基を
含まないアミノ酸残基で置換されており、さらに１以上の他のアミノ酸置換（す
なわちジスルフィド結合形成残基とスルフヒドリル基を含まない残基との置換で
はないアミノ酸置換）を有する、免疫グロブリン分子を提供する。[0032] In another embodiment, the invention provides that the disulfide bond forming residue in the variable region has one or more amino acids replaced by an amino acid residue that does not include a sulfhydryl group, as compared to a second immunoglobulin molecule. And immunoglobulin molecules further comprising one or more other amino acid substitutions (ie, amino acid substitutions that are not substitutions of disulfide bond forming residues with residues that do not contain a sulfhydryl group).

【００３３】 特に、本発明は、可変領域を含み、および前記可変領域中の１個以上のアミノ
酸が置換されている以外は第２の免疫グロブリン分子と同じである第１の免疫グ
ロブリン分子を提供する。この中で、前記第２の免疫グロブリン分子は抗体に免
疫特異的に結合することができ、前記１個以上のアミノ酸置換の少なくとも１つ
は、前記第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成している１以上
のシステイン残基に対応する１以上の位置における、スルフヒドリル基を持たな
いアミノ酸残基の置換である。In particular, the present invention provides a first immunoglobulin molecule comprising a variable region and being the same as the second immunoglobulin molecule except that one or more amino acids in said variable region have been substituted. I do. Wherein the second immunoglobulin molecule is capable of immunospecifically binding to an antibody, and at least one of the one or more amino acid substitutions forms a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. Substitution of an amino acid residue without a sulfhydryl group at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues.

【００３４】 好適な実施形態において、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基とスル
フヒドリル基を持たない残基との置換ではないアミノ酸置換は、安定化変化（st
abilizing change）ではない。安定化変化は、抗体分子の安定性を高めるこれら
のアミノ酸変化として定義される。このような安定化アミノ酸変化は、該特定の
抗体分子中のその特定の位置が共通でないアミノ酸（例えば、Kabat et al., 19
91, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Depar
tment of Health and Human Services, Bethesda, Marylandに記載された沢山の
抗体分子についての共通配列により定義されたようなもの）を、その特定の位置
が共通な残基（例えばその抗体分子についての共通配列中のその位置にあるアミ
ノ酸など）で置換するこれらの変化である（例えばSteipeらの1996年2月1日付け
国際特許出願公開番号WO96/02574を参照されたい）。In a preferred embodiment, an amino acid substitution that is not a substitution of a cysteine residue forming a disulfide bond with a residue without a sulfhydryl group is a stabilizing change (st
Not an abilizing change). Stabilizing changes are defined as those amino acid changes that increase the stability of the antibody molecule. Such stabilizing amino acid changes can be attributed to amino acids that do not share a particular position in the particular antibody molecule (eg, Kabat et al., 19
91, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Depar
tent of Health and Human Services, as defined by the consensus sequence for many antibody molecules described in Bethesda, Maryland), and residues that share a particular position (eg, the consensus sequence for that antibody molecule). (See, for example, Steipe et al., International Patent Application Publication No. WO 96/02574, Feb. 1, 1996).

【００３５】 このような他のアミノ酸置換は、例えば、後述の第５.５節に記載されたよう に決定されるような、抗-抗イディオタイプ抗体の形成を誘導する改変免疫グロ ブリンの能力を変更しない任意の置換であってよい。例えば、このような他のア
ミノ酸置換には、機能的に同等なアミノ酸残基の置換が含まれる。例えば、１個
以上のアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する類似極性の他のアミノ酸で
置換することができる。該配列中のアミノ酸に代わるものは、そのアミノ酸が属
するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性
）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、
フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性ア
ミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、
アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸と
しては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。[0035] Such other amino acid substitutions may be, for example, the ability of the modified immunoglobulin to induce the formation of anti-anti-idiotype antibodies, as determined as described in Section 5.5 below. May be any substitution that does not change For example, such other amino acid substitutions include substitution of functionally equivalent amino acid residues. For example, one or more amino acid residues can be replaced with another amino acid of similar polarity that acts as a functional equivalent. Alternatives to an amino acid in the sequence can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline,
Phenylalanine, tryptophan and methionine. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. As positively charged (basic) amino acids,
Arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.

【００３６】 本発明の改変抗体は、任意の抗原に免疫特異的に結合することができる抗体か
ら得ることができる。好適な実施形態において、該改変抗体は、癌抗原、より好
ましくは腫瘍抗原に、免疫特異的に結合することができる抗体から得られる。特
定の実施形態において、該改変抗体は、多型性上皮ムチン抗原、ヒト大腸癌関連
タンパク質抗原、ヒト大腸癌関連炭水化物抗原、ヒト乳脂肪球（human milk fat
globule）、あるいは***、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、大腸、膵臓
、胃腸管、Bリンパ球またはTリンパ球の癌の抗原、あるいは特定の抗原の発現に
より特徴付けられる他の任意の癌の抗原（例えば後述の第５.２.１節に記載され
るもの等）に結合することができる抗体から得られる。好適な実施形態において
、該改変抗体は、Mab 31.1（American Type Culture Collection, 10801 Univer
sity Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2201より第12314番で入手可能）、
Mab 33.28（第12315番）またはMab HMFG-1（国際特許出願公開番号第WO90/05142
号および国際特許出願公開番号第WO92/04380号を参照されたい）から得られる。[0036] The modified antibodies of the present invention can be obtained from antibodies capable of immunospecifically binding to any antigen. In a preferred embodiment, the modified antibodies are obtained from antibodies capable of immunospecifically binding to a cancer antigen, more preferably a tumor antigen. In certain embodiments, the engineered antibody is a polymorphic epithelial mucin antigen, a human colon cancer-associated protein antigen, a human colon cancer-associated carbohydrate antigen, a human milk fat globule.
globule) or any other antigen characterized by the expression of a cancer of the breast, ovary, uterus, prostate, bladder, lung, skin, large intestine, pancreas, gastrointestinal tract, B or T lymphocytes, or a particular antigen Obtained from an antibody capable of binding to a cancer antigen (for example, those described in Section 5.2.1 below). In a preferred embodiment, the modified antibody is Mab 31.1 (American Type Culture Collection, 10801 Univer
sity Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2201, available at 12314),
Mab 33.28 (No. 12315) or Mab HMFG-1 (International Patent Application Publication No.WO90 / 05142)
And International Patent Application Publication No. WO 92/04380).

【００３７】 他の特定の実施形態において、本発明の該改変抗体は、感染性病原体の抗原ま
たは感染性病原体の細胞受容体に免疫特異的に結合することができる抗体から得
られる。好適な実施形態において、該感染性病原体の抗原は、細菌抗原、ウイル
ス抗原、または寄生体の抗原、あるいは感染性病原体の他の抗原（例えば後述の
第５.２.２節に記載されるこれらの感染性病原体など）である。In another specific embodiment, the modified antibodies of the invention are derived from antibodies capable of immunospecifically binding to an antigen of an infectious pathogen or a cell receptor of the infectious pathogen. In a preferred embodiment, the antigen of the infectious pathogen is a bacterial, viral, or parasite antigen, or another antigen of the infectious pathogen, such as those described in Section 5.2.2 below. Infectious pathogens).

【００３８】 本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ、クラス
またはサブクラスのものであってもよい。好適な実施形態において、該免疫グロ
ブリン分子は抗体分子、より好ましくはIgG、IgE、IgM、IgDおよびIgAからなる 群より選択されるタイプの抗体分子であり、最も好ましくはIgG分子である。あ るいは、該免疫グロブリン分子は、T細胞受容体、B細胞受容体、細胞表面付着分
子（例えば共受容体CD4、CD8またはCD19など）、またはMHC分子の恒常ドメイン （invariant domain）である。[0038] The immunoglobulin molecules of the invention may be of any type, class or subclass of immunoglobulin molecules. In a preferred embodiment, the immunoglobulin molecule is an antibody molecule, more preferably an antibody molecule of the type selected from the group consisting of IgG, IgE, IgM, IgD and IgA, most preferably an IgG molecule. Alternatively, the immunoglobulin molecule is a T cell receptor, a B cell receptor, a cell surface attachment molecule (eg, the co-receptor CD4, CD8 or CD19), or an invariant domain of an MHC molecule.

【００３９】 前記改変免疫グロブリンは、任意の天然抗体、好ましくはモノクローナル抗体
から得ることもできるし、合成抗体または遺伝子操作された抗体から得ることも
できる。本発明の一態様において、該改変免疫グロブリン分子は、結合対のメン
バーのための結合部位または抗原の一部が、該可変領域中のCDRのうちの１つに 挿入されたまたはその一部または全体と置き換わった抗体から得られる（例えば
Burchにより1998年11月13日に出願された同時係属出願である米国特許出願第 号「Immunoglobulin Molecules Having A Synthetic Variable Region And
Modified Specificity」（代理人整理番号6750-016）に記載されたものなど。当
該文献は、本明細書中に参考として全て組み込まれる）。[0039] The modified immunoglobulin can be obtained from any natural antibody, preferably a monoclonal antibody, or can be obtained from a synthetic or genetically engineered antibody. In one embodiment of the invention, the modified immunoglobulin molecule has a binding site or a portion of an antigen for a member of a binding pair inserted into one of the CDRs in the variable region or a portion or Obtained from whole replacement antibodies (eg,
U.S. Patent Application No., a co-pending application filed November 13, 1998 by Burch Issue `` Immunoglobulin Molecules Having A Synthetic Variable Region And
Modified Specificity ”(agent reference number 6750-016). The references are all incorporated herein by reference).

【００４０】 特に、前記合成抗体は、結合対の第１メンバーに免疫特異的に結合する抗体で
あり、該抗体のCDRの少なくとも１つが結合対の該第１メンバーのための結合部 位を含み、該結合部位は、結合対の他方のメンバーのアミノ酸配列から得られる
。本発明の１態様において、該結合部位のアミノ酸配列は、該CDRの中に天然で は見られない。さらに、該CDRの少なくとも一方は、抗原の一部、特にエピトー プを含むことができる。In particular, the synthetic antibody is an antibody that immunospecifically binds to a first member of a binding pair, wherein at least one of the CDRs of the antibody comprises a binding site for the first member of the binding pair. The binding site is obtained from the amino acid sequence of the other member of the binding pair. In one embodiment of the invention, the amino acid sequence of the binding site is not found naturally in the CDR. Furthermore, at least one of the CDRs can comprise part of an antigen, in particular an epitope.

【００４１】 前記結合部位のアミノ酸配列は、当分野において公知である任意の方法により
同定することができる。例えば、幾つかの例において、結合対の一方のメンバー
の配列は、該結合対の他方のメンバーの結合に直接関与することが既に分かって
いる。この場合、このような配列を用いて、該結合対の他方のメンバーを特異的
に認識する合成抗体のCDRを構築することができる。該結合対のこの一方のメン バーの中にある該結合対の他方のメンバーが結合するための該結合部位のアミノ
酸配列が分かっていない場合、該アミノ酸配列は当分野で公知である任意の方法
により測定することができる。これらの方法としては、例えば分子モデリング法
や実験的方法、例えば一方のメンバーの他方のメンバーに結合する部分（例えば
ペプチド等）をアッセイすることによる方法、または該メンバーを突然変異させ
てどの変異が結合を妨げるかを測定することによる方法等が含まれるが、これら
に限定されない。[0041] The amino acid sequence of the binding site can be identified by any method known in the art. For example, in some instances, the sequence of one member of a binding pair has already been found to be directly involved in binding the other member of the binding pair. In this case, such a sequence can be used to construct a CDR of a synthetic antibody that specifically recognizes the other member of the binding pair. If the amino acid sequence of the binding site for binding the other member of the binding pair within this one member of the binding pair is not known, the amino acid sequence can be determined by any method known in the art. Can be measured. These methods include, for example, molecular modeling and experimental methods, for example, by assaying the portion of one member that binds to the other member (eg, a peptide, etc.), or mutating that member to determine which mutation Examples include, but are not limited to, methods by measuring whether binding is prevented.

【００４２】 前記結合対は、互いに相互作用するタンパク質、核酸、炭水化物または脂質を
含む任意の２つの分子であってもよいが、好ましくは、該結合部位が由来する結
合相手は、タンパク質分子である。好ましい実施形態において、該改変免疫グロ
ブリンは、癌抗原、感染性病原体、病原体に対する細胞受容体、または受容体- リガンド結合対に関与する受容体もしくはリガンドのための結合配列を含む。The binding pair may be any two molecules, including proteins, nucleic acids, carbohydrates or lipids that interact with each other, but preferably the binding partner from which the binding site is derived is a protein molecule . In a preferred embodiment, the modified immunoglobulin comprises a binding sequence for a cancer antigen, an infectious pathogen, a cell receptor for the pathogen, or a receptor or ligand that participates in a receptor-ligand binding pair.

【００４３】 特定の実施形態において、前記結合対は、タンパク質-タンパク質相互作用対 であり、該相互作用は、同種相互作用（すなわち同じ２つのタンパク質間の相互
作用）または異種相互作用（すなわち異なる２つのタンパク質間の相互作用）で
ある。In certain embodiments, the binding pair is a protein-protein interaction pair, wherein the interaction is a homogenous interaction (ie, an interaction between the same two proteins) or a heterologous interaction (ie, two different proteins). Interaction between two proteins).

【００４４】 特定の実施形態において、第１メンバーは、リガンド-受容体結合対のメンバ ー、好ましくはリガンドが受容体に結合して細胞内シグナル伝達などの生理学的
応答を引き出す受容体-リガンド結合対のメンバーである。限定的なものではな い例として、該リガンドもしくは受容体は、ホルモン、オータコイド、成長因子
、サイトカイン、または神経伝達物質であってもよいし、ホルモン、オータコイ
ド、成長因子、サイトカイン、または神経伝達物質の受容体、あるいはシグナル
伝達に関与する任意の受容体もしくはリガンドであってもよい（シグナル伝達経
路の概説については、例えばCampbell, 1997, J. Pediat. 131:S42-S44; Hamilt
on, 1997, J. Leukoe. Biol. 62:145-155; Soede-Bobok & Touw, 1997, J. Mol.
Med. 75:470-477; Heldin, 1995, Cell 80:213-223; Kishimoto et al., 1994,
Cell 76:253-262; Miyajima et al., 1992, Annu. Rev. Immunol. 10:295-31;
および Cantley et al., 1991, Cell 64:281-302を参照されたい）。特定の実施
形態において、該結合対の一方のメンバーは、コレシストキニン、ガラニン（ga
lanin）、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、ケモカイン、レプチン（lept
in）、プロテアーゼ、ニューロペプチドY、ニューロキニン-1、ニューロキニン-
2、ニューロキニン-3、ボンベシン、ガストリン、コルチコトロピン放出ホルモ ン、エンドセリン、メラトニン、ソマトスタチン、血管作用性腸ペプチド、上皮
増殖因子、腫瘍壊死因子、ドーパミン、エンドセリン等のリガンド、あるいはこ
れらのリガンドの受容体であるが、これらに限定されない。他の実施形態におい
て、該結合対の一方のメンバーは、オピオイド受容体、グルコース輸送体、グル
タミン酸受容体、オーファニン（orphanin）受容体、エリトロポエチン受容体、
インスリン受容体、チロシンキナーゼ（TK）-受容体、KIT幹細胞因子受容体、神
経成長因子受容体、インスリン様成長因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容
体、ソマトトロピン受容体、グリア由来神経栄養因子受容体もしくはgp39受容体
、Ｇタンパク受容体クラスまたはβ2-アドレナリン受容体等の受容体、あるいは
これらの受容体のいずれかに結合するリガンドである（ただしこれらに限定され
ない）。他の実施形態において、該結合対のメンバーのうち一方は、リガンド依
存性イオンチャネル（例えばカルシウムチャネル、ナトリウムチャネルまたはカ
リウムチャネルが挙げられるが、これらに限定されない）である。ある実施形態
において、本発明は、受容体に免疫特異的に結合し、該受容体に結合するリガン
ドのアンタゴニスト（例えば限定するわけではないが、エンドルフィン、エンケ
ファリンまたはノシセプチン（nociceptin）のアンタゴニストが挙げられる）で
ある改変免疫グロブリンを提供する。他の実施形態において、本発明は、例えば
エンドルフィン、エンケファリンまたはノシセプチン受容体（ただしこれらに限
定されない）などの受容体に免疫特異的に結合し、該受容体のアゴニストである
合成改変抗体を提供する。好適な実施形態において、該改変免疫グロブリンは、
フィブロネクチン受容体には結合しない。他の好適な実施形態において、該結合
配列はArg-Gly-Aspではなく、結合配列の多量体ではなく、および好ましくは該 配列Arg-Gly-Aspの多量体ではない。In certain embodiments, the first member is a member of a ligand-receptor binding pair, preferably a receptor-ligand binding where the ligand binds to the receptor and elicits a physiological response such as intracellular signaling. Be a member of a pair. By way of non-limiting example, the ligand or receptor may be a hormone, an autakoid, a growth factor, a cytokine, or a neurotransmitter, or may be a hormone, an autakoid, a growth factor, a cytokine, or a neurotransmitter. Or any receptor or ligand involved in signal transduction (for a review of signal transduction pathways, see, for example, Campbell, 1997, J. Pediat. 131: S42-S44; Hamilt
on, 1997, J. Leukoe. Biol. 62: 145-155; Soede-Bobok & Touw, 1997, J. Mol.
Med. 75: 470-477; Heldin, 1995, Cell 80: 213-223; Kishimoto et al., 1994,
Cell 76: 253-262; Miyajima et al., 1992, Annu. Rev. Immunol. 10: 295-31;
And Cantley et al., 1991, Cell 64: 281-302). In certain embodiments, one member of the binding pair is cholecystokinin, galanin (ga
lanin), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, chemokines, leptin (lept
in), protease, neuropeptide Y, neurokinin-1, neurokinin-
2.Ligands such as neurokinin-3, bombesin, gastrin, corticotropin-releasing hormon, endothelin, melatonin, somatostatin, vasoactive intestinal peptide, epidermal growth factor, tumor necrosis factor, dopamine, endothelin, or receptors for these ligands , But is not limited thereto. In another embodiment, one member of the binding pair is an opioid receptor, a glucose transporter, a glutamate receptor, an orphanin receptor, an erythropoietin receptor,
Insulin receptor, tyrosine kinase (TK) -receptor, KIT stem cell factor receptor, nerve growth factor receptor, insulin-like growth factor receptor, granulocyte colony stimulating factor receptor, somatotropin receptor, glial-derived neurotrophic factor receptor Or a receptor that binds to any of these receptors, such as, but not limited to, the gp39 receptor, the G protein receptor class, or the β2-adrenergic receptor. In other embodiments, one of the members of the binding pair is a ligand-gated ion channel, such as, but not limited to, a calcium channel, a sodium channel or a potassium channel. In certain embodiments, the present invention includes antagonists of ligands that immunospecifically bind to and bind to the receptor, such as, but not limited to, antagonists of endorphin, enkephalin or nociceptin. ) Is provided. In another embodiment, the invention provides a synthetic engineered antibody that immunospecifically binds to a receptor, such as, but not limited to, an endorphin, enkephalin or nociceptin receptor, and is an agonist of the receptor. . In a preferred embodiment, the modified immunoglobulin is
Does not bind to fibronectin receptor. In other preferred embodiments, the binding sequence is not Arg-Gly-Asp, is not a multimer of the binding sequence, and is preferably not a multimer of the sequence Arg-Gly-Asp.

【００４５】 他の特定の実施形態において、前記改変免疫グロブリンは、転写因子のための
結合部位を含むCDRを有する。好適な態様において、該改変免疫グロブリンは、 特定のDNA配列には結合せず、特に、転写因子結合部位には結合しない。In another particular embodiment, the modified immunoglobulin has a CDR that includes a binding site for a transcription factor. In a preferred embodiment, the modified immunoglobulin does not bind to a specific DNA sequence, and in particular does not bind to a transcription factor binding site.

【００４６】 好適な実施形態において、前記改変免疫グロブリンは、癌抗原または腫瘍抗原
（例えば後述の第5.2.1節に詳細に記載される）のための結合部位のアミノ酸配 列を含む少なくとも１つのCDRを有する。より好ましくは、該抗原は、ヒト大腸 癌関連抗原または上皮ムチン抗原である。他の実施形態において、該改変免疫グ
ロブリンの少なくとも１つのCDRは、ヒト乳脂肪球受容体のための結合部位のア ミノ酸配列を含む。他の実施形態において、該改変免疫グロブリンは、***、卵
巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、膵臓、大腸、胃腸管、Bリンパ球またはTリ
ンパ球の腫瘍抗原のための結合部位のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのCDR を有する。In a preferred embodiment, the modified immunoglobulin comprises at least one amino acid sequence that comprises a binding site for a cancer or tumor antigen (eg, as described in detail in Section 5.2.1 below). Has CDR. More preferably, the antigen is a human colon cancer associated antigen or an epithelial mucin antigen. In another embodiment, at least one CDR of the modified immunoglobulin comprises an amino acid sequence of a binding site for a human milk fat globule receptor. In other embodiments, the modified immunoglobulin is an amino acid at the binding site for a tumor antigen on the breast, ovary, uterus, prostate, bladder, lung, skin, pancreas, colon, gastrointestinal tract, B lymphocytes or T lymphocytes. It has at least one CDR comprising a sequence.

【００４７】 本発明の他の好適な実施形態において、前記改変抗体の少なくとも１つのCDR は、感染性病原体（例えば後述の第5.2.2節に詳細に記載されたもの）の抗原の ための結合部位、あるいは感染性病原体の細胞受容体のための結合部位のアミノ
酸配列を含む。この場合好ましくは、該結合部位はプラスモディウム(Plasmodiu
m)抗原のアミノ酸配列ではなく、また結合部位Asn-Ala-Asn-ProもしくはAsn-Val
-Asp-Proでもない。さらに他の実施形態において、該改変抗体は細菌酵素または
ウイルス酵素のための結合部位を含むCDRを有する。In another preferred embodiment of the invention, the at least one CDR of the modified antibody comprises a binding for an antigen of an infectious agent (eg as described in detail in Section 5.2.2 below). Site or the amino acid sequence of the binding site for the cell receptor of the infectious agent. In this case, preferably, the binding site is Plasmodiu (Plasmodiu).
m) not the amino acid sequence of the antigen, and the binding site Asn-Ala-Asn-Pro or Asn-Val
-Not Asp-Pro. In yet other embodiments, the modified antibodies have CDRs that include binding sites for bacterial or viral enzymes.

【００４８】 前記合成抗体は、天然のもしくは以前から存在している抗体の配列に基づいて
（すなわち該配列の該CDRに挿入された結合部位の配列に基づいて）構築されて もよいし、あるいは、例えば図７Aおよび図７BのＬ鎖およびＨ鎖可変領域につい
ての共通配列等の既知の抗体の共通配列から合成することもできるし、他の任意
の抗体の共通配列もしくは生殖系列配列（すなわち非組換えゲノム配列）から合
成することもできる（例えば、Kabatら, 1991, Sequences of Proteins of Immu
nological Interest, 5th edition, NIH公開番号第91-3242, pp2147-2172に記載
されたこれらの抗体の共通配列および生殖系列配列など）。[0048] The synthetic antibody may be constructed based on the sequence of a naturally occurring or pre-existing antibody (ie, based on the sequence of the binding site inserted into the CDR of the sequence), or For example, it can be synthesized from a known antibody consensus sequence, such as the consensus sequence for the light and heavy chain variable regions of FIGS. Recombinant genomic sequence) (eg, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immu).
nological Interest, 5th edition, NIH Publication No. 91-3242, pp2147-2172, etc.).

【００４９】 各抗体分子は、Ｌ鎖に３つ、Ｈ鎖に３つ、計６つのCDR配列を有し、これらのC
DRのうち５つは生殖系CDR（すなわち動物の生殖系ゲノム配列から組み換えずに 直接得たもの）であり、残り１つは非生殖系CDR（すなわち該動物の生殖系ゲノ ム配列と配列が異なり、該生殖系配列の組換えにより生成された配列）である。
CDRが生殖系配列であるか非生殖系配列であるかは、CDRを配列決定したあと、該
配列を既知の生殖系配列（例えばKabat et al., 1991, Sequences of Proteins
of Immunological Interest, 5th edition, NIH 公開番号第91-3242, pp2147-21
72に記載されたものなど）と比較することにより決定することができる。該既知
の生殖系配列と有意な変異が見られる場合は、該CDRが非生殖系CDRであることを
示す。従って、結合部位または抗原のアミノ酸配列を含むCDRは、生殖系CDRであ
るか、あるいは非生殖系CDRである。Each antibody molecule has three CDR sequences in the L chain and three in the H chain, for a total of six CDR sequences.
Five of the DRs are germline CDRs (ie, those obtained directly from an animal's germline genomic sequence without recombination) and the other one is a non-germline CDR (ie, the germline genomic sequence and sequence of the animal (A sequence produced by recombination of the germline sequence).
Whether a CDR is a germline sequence or a non-germline sequence can be determined by sequencing the CDR and then converting the sequence to a known germline sequence (eg, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins).
of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication No. 91-3242, pp2147-21
72, etc.). A significant mutation in the known germline sequence indicates that the CDR is a non-germline CDR. Thus, the CDR comprising the amino acid sequence of the binding site or antigen is a germline CDR or a non-germline CDR.

【００５０】 前記結合部位または抗原配列は、該抗体のCDRのいずれかに挿入することがで きる。該抗体の異なるCDR中に該結合部位を挿入してから得られた改変抗体の該 結合対の特定のメンバーに結合する能力についてスクリーニングすること（例え
ば後述の第5.5節に記載）、あるいは該抗原性部位に対する免疫応答を引き出す こと（例えば後述の第5.5節に記載）は、当業者の技術範囲内である。このよう に、どのCDRが結合部位または抗原を最適に含むかを測定することができる。特 定の実施形態において、Ｈ鎖またはＬ鎖可変領域のいずれかのCDRを改変して、 該結合部位または抗原のアミノ酸配列を含ませる。他の特定の実施形態において
、該改変抗体は、Ｈ鎖可変領域の第１、第２もしくは第３CDRまたはＬ鎖可変領 域の第１、第２もしくは第３CDRが該結合部位または抗原のアミノ酸配列を含む 、可変ドメインを含む。本発明の他の実施形態において、２以上のCDRが該結合 部位もしくは抗原のアミノ酸配列を含むか、または２以上のCDR各々が、同じ分 子のための異なる結合部位を含むかもしくは異なる分子のための異なる結合部位
を含む。特に、実施形態において、２，３、４、５または６つのCDRを遺伝子操 作して、該結合対の第１メンバーのための結合部位を含ませる。好適な実施形態
において、１以上のCDRは、結合対の第１メンバーのための結合部位を含み、１ 以上の他のCDRは、免疫細胞（例えばT細胞、B細胞、NK細胞、K細胞、TIL細胞ま たは好中球などが挙げられるが、これらに限定されない）の表面上の分子のため
の結合部位を含む。例えば、癌抗原または感染症抗原のための結合部位、および
免疫細胞の表面上の分子のための結合部位を有する改変抗体を使用して、該免疫
細胞を、癌抗原を担持する癌細胞、または感染性病原体にターゲッティングする
ことができる。[0050] The binding site or antigen sequence can be inserted into any of the CDRs of the antibody. Screening for the ability of the modified antibody obtained after inserting the binding site into different CDRs of the antibody to bind to a particular member of the binding pair (eg, as described in Section 5.5 below), or It is within the skill of the art to elicit an immune response against the sexual site (eg, as described in Section 5.5 below). In this way, it is possible to determine which CDR optimally contains the binding site or antigen. In certain embodiments, the CDRs of either the heavy or light chain variable region are modified to include the amino acid sequence of the binding site or antigen. In another specific embodiment, the modified antibody is characterized in that the first, second or third CDR of the heavy chain variable region or the first, second or third CDR of the light chain variable region comprises the amino acid sequence of the binding site or antigen. And including the variable domain. In other embodiments of the invention, the two or more CDRs comprise the amino acid sequence of the binding site or antigen, or each of the two or more CDRs comprises a different binding site for the same molecule or a different molecule. For different binding sites. In particular, in embodiments, two, three, four, five or six CDRs are engineered to include a binding site for the first member of the binding pair. In a preferred embodiment, one or more of the CDRs comprises a binding site for a first member of a binding pair, and one or more of the other CDRs comprises an immune cell (eg, a T cell, B cell, NK cell, K cell, Including binding sites for, but not limited to, TIL cells or neutrophils. For example, using an engineered antibody having a binding site for a cancer or infectious disease antigen, and a binding site for a molecule on the surface of an immune cell, the immune cell can be used to convert a cancer cell carrying a cancer antigen, or It can be targeted to infectious agents.

【００５１】 本発明の特定の実施形態において、前記結合部位または抗原アミノ酸配列は、
CDRのアミノ酸配列自体をいずれも置換することなくCDRに挿入されるか、あるい
は該CDRのアミノ酸配列の一部または全てを、該結合部位または抗原のアミノ酸 配列に置換する。特定の実施形態において、該CDR配列の1,2,5,8,10,15または20
アミノ酸が該結合部位のアミノ酸配列に置換される。[0051] In certain embodiments of the invention, the binding site or antigenic amino acid sequence is
The CDR is inserted into the CDR without substituting any amino acid sequence itself, or a part or all of the amino acid sequence of the CDR is substituted with the amino acid sequence of the binding site or antigen. In certain embodiments, 1,2,5,8,10,15 or 20 of the CDR sequences
An amino acid is substituted for the amino acid sequence at the binding site.

【００５２】 前記CDR中に存在する結合部位または抗原のアミノ酸配列は、該結合対の該メ ンバーの結合に必要な、または該抗原に対する免疫応答を引き出すのに必要な、
最小の結合部位であることができる（当分野で公知である任意の方法により経験
的に決定することができる）。あるいは、該配列は、該結合対の該メンバーの結
合に必要なまたは該抗原に対する免疫応答を引き出すのに必要な最小結合部位ま
たは抗原配列より大きくてもよい。特定の実施形態において、該結合部位または
抗原のアミノ酸配列は、少なくとも４アミノ酸長であるか、または少なくとも6 、8、10、15または20アミノ酸長である。他の実施形態において、該結合部位の アミノ酸配列は、10、15、20または25アミノ酸長を超えない、すなわち5〜10、5
〜15、5〜20、10〜15、10〜20または10〜25アミノ酸長である。[0052] The amino acid sequence of the binding site or antigen present in the CDRs may be required for binding of the member of the binding pair or for eliciting an immune response to the antigen.
It can be the smallest binding site (can be determined empirically by any method known in the art). Alternatively, the sequence may be larger than the minimum binding site or antigen sequence required for binding of the member of the binding pair or for eliciting an immune response against the antigen. In certain embodiments, the amino acid sequence of the binding site or antigen is at least 4 amino acids in length, or at least 6, 8, 10, 15 or 20 amino acids in length. In other embodiments, the amino acid sequence of the binding site does not exceed 10, 15, 20, or 25 amino acids in length, i.e., 5-10,5
~ 15, 5-20, 10-15, 10-20 or 10-25 amino acids in length.

【００５３】 さらに、前記CDRの全長（即ち前記結合部位の配列と該CDR配列の残りの部分と
を合わせた長さ）は、該抗体を該抗原に結合させるのに適したアミノ酸数の長さ
である。CDRは、様々な数のアミノ酸残基を有することが観察されており、CDRの
観察されたサイズ範囲（図２に記載した略字により示される）が表２に記載され
ている。Further, the full length of the CDR (ie, the total length of the sequence of the binding site and the rest of the CDR sequence) is a length of the number of amino acids suitable for binding the antibody to the antigen. It is. The CDRs have been observed to have various numbers of amino acid residues, and the observed size ranges of the CDRs (indicated by the abbreviations described in FIG. 2) are listed in Table 2.

【００５４】[0054]

【表２】CDR 残基数 L１ 10〜17 L２ ７ L３ 7〜11 H１ 5〜7 H２ 9〜12 H３ 2〜25 (Kabat and Wu, 1971, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93のデータから編集したも
の)[Table 2] CDR number of residues L1 10-17 L27 L3 7-11 H15-7 H29 9-12 H32-25 (Kabat and Wu, 1971, Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-93 (Edited from data)

【００５５】 多くのCDR H3領域は、５〜９残基長であり、あるCDR H3領域は、それよりもも
っと長いことが観察されている。特に、多くの抗ウイルス抗体は、17〜24残基長
のＨ鎖CDR H3領域を有する。[0055] Many CDR H3 regions are 5-9 residues long, and some CDR H3 regions have been observed to be much longer. In particular, many antiviral antibodies have a heavy chain CDR H3 region of 17 to 24 residues in length.

【００５６】 従って、本発明の特定の実施形態において、該結合部位または抗原部分を含む
CDRは、表２中のその特定のCDRについて提供されたサイズ範囲内である。つまり
、該CDRがＬ鎖の第１CDR、すなわちL1である場合は、該CDRは10〜17アミノ酸残 基であり、該CDRがＬ鎖の第２CDR、すなわちL2である場合は、該CDRは７アミノ 酸残基であり、該CDRがＬ鎖の第３CDR、すなわちL3である場合は、該CDRは７〜1
1アミノ酸残基であり、該CDRがＨ鎖の第１CDR、すなわちH1である場合は、該CDR
は５〜７アミノ酸残基であり、該CDRがＨ鎖の第２CDR、すなわちH2である場合は
、該CDRは９〜12アミノ酸残基であり、該CDRがＨ鎖の第３CDR、すなわちH3であ る場合は、該CDRは２〜25アミノ酸残基である。他の特定の実施形態において、 該結合部位を含むCDRは、5〜10、5〜15、5〜20、11〜15、11〜20、11〜25または
16〜25アミノ酸長である。他の実施形態において、該結合部位を含むCDRは、少 なくとも５、10、15または20アミノ酸であるか、あるいは10、15、20、25または
30アミノ酸長を超えない。Thus, in certain embodiments of the invention, comprising the binding site or antigen portion
The CDRs are within the size range provided for that particular CDR in Table 2. That is, when the CDR is the first CDR of the L chain, that is, L1, the CDR is 10 to 17 amino acid residues, and when the CDR is the second CDR of the L chain, that is, L2, the CDR is 7 amino acids. When the amino acid residue is an amino acid residue and the CDR is the third CDR of the L chain, that is, L3, the CDR is 7 to 1
1 amino acid residue, and when the CDR is the first CDR of an H chain, that is, H1, the CDR
Is 5-7 amino acid residues, and if the CDR is the second CDR of the heavy chain, ie, H2, then the CDR is 9-12 amino acid residues and the CDR is the third CDR of the heavy chain, ie, H3. In some cases, the CDRs are between 2 and 25 amino acid residues. In other specific embodiments, the CDRs comprising the binding site are 5-10, 5-15, 5-20, 11-15, 11-20, 11-25 or
It is 16-25 amino acids long. In other embodiments, the CDR comprising the binding site is at least 5, 10, 15 or 20 amino acids, or 10, 15, 20, 25 or
Does not exceed 30 amino acids in length.

【００５７】 改変CDRを含む抗体を構築したあと、該改変抗体を更に改変してスクリーニン グし、より高い親和性または特異性を有する抗体を選択することができる。標的
となる抗原に対してより高い親和性または特異性を有する抗体は、当分野で公知
の任意の方法により作成および選択することができる。例えば、限定するわけで
はないが、合成改変抗体をコードする核酸を無作為に（すなわち化学的もしくは
部位指定突然変異誘発により）、あるいは該改変抗体をコードする核酸の特定の
位置に特定の突然変異を作成することにより、突然変異させたあと、該標的抗原
に対する結合親和性について、突然変異させたこれらの核酸分子から発現された
抗体をスクリーニングすることができる。スクリーニングは、発現された抗体分
子を別々にテストすることにより、または該突然変異配列のライブラリーを（例
えばタンパク質展示ファージ技術により）スクリーニングすることにより、行う
ことができる（例えば米国特許第5,223,409号、第5,403,484号、および第5,571,
698号（すべてLadnerらによる）；国際特許出願公開番号第WO92/01047号（McCaf
fertyら）または当分野で公知である他のタンパク質展示ファージ技術を参照さ れたい）。After constructing the antibody containing the modified CDR, the modified antibody can be further modified and screened to select an antibody having higher affinity or specificity. Antibodies with higher affinity or specificity for the target antigen can be generated and selected by any method known in the art. For example, but not limited to, randomly (ie, by chemical or site-directed mutagenesis) a nucleic acid encoding a synthetic engineered antibody, or at a particular position in a nucleic acid encoding the engineered antibody. The antibodies expressed from these mutated nucleic acid molecules can be screened for binding affinity for the target antigen after mutating. Screening can be performed by separately testing the expressed antibody molecules or by screening a library of the mutated sequences (eg, by protein display phage technology) (eg, US Pat. No. 5,223,409, Nos. 5,403,484 and 5,571,
No. 698 (all by Ladner et al.); International Patent Application Publication No. WO 92/01047 (McCaf
ferty et al.) or other protein display phage techniques known in the art).

【００５８】 特定の実施形態において、本発明は、本発明の改変免疫グロブリン分子の機能
的に活性な断片、誘導体または類似体を提供する。「機能的に活性な」とは、そ
の断片、誘導体または類似体が、該断片、誘導体または類似体が由来する抗体が
認識したのと同じ抗原を認識する抗-抗イディオタイプ抗体（すなわち三次抗体 またはAb3抗体）を誘導することができることを意味する（例えば後述の第5.5節
に記載された方法により測定される）。特に、好適な実施形態において、該免疫
グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、該抗原を特異的に認識する特定の
ＣＤＲ配列のＮ末端側にあるフレームワークおよびＣＤＲ配列を欠失させること
により増強され得る。どのＣＤＲ配列が該抗原に結合するかを決定するために、
当分野で公知の任意の結合アッセイ法により該抗原を用いた結合アッセイにおい
て、該ＣＤＲ配列を含む合成ペプチドを使用することができる。従って、好適な
実施形態において、本発明は、可変領域ドメイン中で１つのジスルフィド結合を
形成しているシステイン残基が、スルフヒドリル基を含まないアミノ酸残基で置
換されており、その可変ドメインの一部が該抗原を認識するＣＤＲ配列のＮ末端
側で欠失されている、改変免疫グロブリン分子を含む。In certain embodiments, the present invention provides functionally active fragments, derivatives or analogs of the modified immunoglobulin molecules of the present invention. “Functionally active” refers to an anti-anti-idiotype antibody (ie, a tertiary antibody) whose fragment, derivative or analog recognizes the same antigen as the antibody from which the fragment, derivative or analog was derived. Or Ab3 antibody) (for example, measured by the method described in Section 5.5 below). In particular, in a preferred embodiment, the idiotypic antigenicity of the immunoglobulin molecule is enhanced by deleting the framework and CDR sequences N-terminal to the specific CDR sequence that specifically recognizes the antigen. Can be done. To determine which CDR sequences bind to the antigen,
A synthetic peptide comprising the CDR sequence can be used in a binding assay using the antigen by any binding assay known in the art. Therefore, in a preferred embodiment, the present invention relates to a method wherein the cysteine residue forming one disulfide bond in the variable region domain is replaced with an amino acid residue not containing a sulfhydryl group, and A modified immunoglobulin molecule wherein the portion is deleted N-terminal to the CDR sequence that recognizes the antigen.

【００５９】 本発明の他の実施形態は、本発明の改変抗体の断片を含む。このような断片と
しては、該可変領域、Ｌ鎖定常領域およびＨ鎖のＣＨ1ドメインを含み、抗体分 子のペプシン消化により生成することができるF(ab')2断片、ならびに該F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるFab断片が 挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明は、本発明の改変抗体のＨ
鎖およびＬ鎖の２量体、またはその任意の極小断片（例えばFvsまたは単鎖抗体 （SCA）など）（例えば米国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242:423-
42；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；および
Ward et al., 1989, Nature 334:544-54に記載）、または本発明の改変抗体と同
じ特異性を有する任意の他の分子を提供する。[0059] Another embodiment of the present invention includes fragments of the modified antibodies of the present invention. Such fragments include the F (ab ') 2 fragment containing the variable region, the L chain constant region and the CH1 domain of the H chain, and can be generated by pepsin digestion of an antibody molecule, and the F (ab' ) Fab fragments that can be generated by reducing the disulfide bridge between the two fragments, including but not limited to. The present invention also relates to the modified antibody H of the present invention.
Chain and light chain dimers, or any minimal fragment thereof, such as, for example, Fvs or single chain antibodies (SCAs) (eg, US Pat. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423-).
42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883;
Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54), or any other molecule having the same specificity as the modified antibodies of the invention.

【００６０】 適切な生物学的活性のヒト抗体分子から得た遺伝子と一緒に適切な抗原特異性
のマウス抗体分子から得た遺伝子をスプライシングすることにより「キメラ抗体
」を産生するための技法が開発された（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. A
cad. Sci. 81:851-855；Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608；Takeda
et al., 1985, Nature 314:452-454）。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動 物種から得られる分子であり、例えばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域
およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する分子（例えばヒト化抗体）が
ある。Techniques have been developed for producing “chimeric antibodies” by splicing genes obtained from mouse antibody molecules of appropriate antigen specificity together with genes obtained from human antibody molecules of appropriate biological activity. (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. A
cad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda.
et al., 1985, Nature 314: 452-454). A chimeric antibody is a molecule in which different portions are derived from different animal species, such as a molecule having a variable region derived from a mouse monoclonal antibody and a constant region derived from a human immunoglobulin (eg, a humanized antibody).

【００６１】 好適な実施形態において、本発明の改変免疫グロブリンはヒト化抗体であり、
より好ましくは、フレームワーク領域がヒト抗体に由来し、ＣＤＲが非ヒト動物
（好ましくはマウス）の抗体に由来する可変ドメインを有する抗体である（Neub
erger et al. and Celltech Limitedによる国際特許出願第PCT/GB8500392を参照
のこと）。[0061] In a preferred embodiment, the modified immunoglobulins of the invention are humanized antibodies,
More preferably, the framework region is derived from a human antibody, and the CDR has a variable domain derived from a non-human animal (preferably mouse) antibody (Neub)
erger et al. and Celltech Limited International Application No. PCT / GB8500392).

【００６２】 ＣＤＲ移植（CDR grafting）は、抗体をヒト化する他の方法である。この方法
は、ヒト・フレームワークに対する完全な抗原特異性および結合親和性を移植す
るためにマウス抗体を再形成することを含む（Winter et al.米国特許第5,225,5
39号）。これまでに種々の抗原に対するＣＤＲ移植抗体の構築に成功しており、
例えばQueenら1989 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029)に記載されたIL-2 受容体に対する抗体、Riechmannら（1988, Nture, 332:323）に記載された細胞 表面受容体CAMPATHに対する抗体、Coleら（1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:2869）に記載されたＢ型肝炎に対する抗体、およびTempestら（1991, Bio-Te
chnology 9:267）に記載されたウイルス抗原-ＲＳウイルス（respiratory synci
tial virus）に対する抗原がある。マウスモノクローナル抗体のCDRをヒト抗体 に移植した、CDR移植抗体を作成する。移植後、多くの抗体は、該フレームワー ク領域中の更なるアミノ酸変化により親和性を維持するという恩恵を得る。これ
はおそらく、CDRの立体配置を維持するためにはフレームワーク残基が必要であ るためであろう。そして幾つかのフレームワーク残基は抗原結合部位の一部であ
ることが示された。しかし、任意の抗原部位を導入しないように該フレームワー
ク領域を保存するために、該配列を確立された生殖系配列と比較してコンピュー
タモデリングを行う。[0062] CDR grafting is another method of humanizing antibodies. This method involves reforming murine antibodies to implant full antigen specificity and binding affinity for the human framework (Winter et al. US Pat. No. 5,225,5
No. 39). So far, we have successfully constructed CDR-grafted antibodies against various antigens,
For example, an antibody against the IL-2 receptor described in Queen et al. 1989 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029), the cell surface receptor CAMPATH described in Riechmann et al. (1988, Nture, 332: 323). Against Cole et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88: 2869), and antibodies to hepatitis B described in Tempest et al. (1991, Bio-Te).
virus antigen-RS virus (respiratory synci) described in Chnology 9: 267)
tial virus). A CDR-grafted antibody is prepared by grafting the mouse monoclonal antibody CDR into a human antibody. After transplantation, many antibodies benefit from maintaining affinity by additional amino acid changes in the framework regions. This is probably because framework residues are required to maintain the CDR configuration. And some framework residues were shown to be part of the antigen binding site. However, to conserve the framework region so as not to introduce any antigenic sites, computer modeling is performed by comparing the sequence to established germline sequences.

【００６３】 他の実施形態において、本発明は、本発明の改変免疫グロブリンがそのＮ末端
またはＣ末端で該改変免疫グロブリンではない他のタンパク質のアミノ酸配列（
またはその一部、好ましくはそのタンパク質の少なくとも10、20または50アミノ
酸部分）に共有結合により融合された、本発明の改変免疫グロブリンの融合タン
パク質（またはその機能的に活性な断片）を提供する。好ましくは、該改変免疫
グロブリンまたはその断片は、その定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に共
有結合により結合される。好適な実施形態において、本発明は、該改変免疫グロ
ブリンがIL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、γ-インターフェロン、MHC由 来ペプチド、G-CSF、TNF、ポーリン（porins）、NK細胞抗原、または細胞エンド
サイトーシス受容体に共有結合した融合タンパク質を提供する。In another embodiment, the present invention provides that the modified immunoglobulin of the present invention has the amino acid sequence of another protein at its N-terminus or C-terminus that is not the modified immunoglobulin (
Alternatively, a modified immunoglobulin fusion protein of the invention (or a functionally active fragment thereof) is provided, which is covalently fused to a portion thereof, preferably to at least 10, 20, or 50 amino acid portions of the protein. Preferably, the modified immunoglobulin or fragment thereof is covalently linked to another protein at the N-terminus of its constant domain. In a preferred embodiment, the present invention provides that the modified immunoglobulin is IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, γ-interferon, MHC-derived peptide, G- Provide fusion proteins covalently linked to CSF, TNF, porins, NK cell antigen, or cell endocytosis receptor.

【００６４】 本発明の改変免疫グロブリンには、改変された類似体および誘導体、すなわち
任意のタイプの分子の共有結合により改変されたものであって、該共有結合が該
改変免疫グロブリンによる抗イディオタイプ応答の生成（例えば後述の第5.5節 に記載される方法のいずれかにより決定される）を妨げないものが含まれる。例
えば、限定するわけではないが、該改変免疫グロブリンの誘導体および類似体に
は、例えばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化（phosphylation）、ア
ミド化、既知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、 細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合等により更に改変された免疫グロ
ブリンが含まれる。数々の化学的修飾のうちの任意の修飾を、既知の技法により
行うことができる。これらの技法としては、特異的化学的切断、アセチル化、ホ
ルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されな
い。さらに、該類似体または誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸（例えばこの
節の中で先に記載したものなど）を含んでいてもよい。The modified immunoglobulins of the present invention include modified analogs and derivatives, ie, those modified by the covalent bond of any type of molecule, wherein the covalent bond is an anti-idiotype by the modified immunoglobulin. Responses that do not prevent the generation of a response (eg, as determined by any of the methods described in Section 5.5 below) are included. For example, without limitation, derivatives and analogs of the modified immunoglobulins include, for example, glycosylations, acetylations, PEGylations, phosphylations, amidations, derivatizations with known protecting / blocking groups, Immunoglobulins further modified by proteolytic cleavage, binding to cellular ligands or other proteins, etc., are included. Any of a number of chemical modifications can be made by known techniques. These techniques include, but are not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, and the like. In addition, the analog or derivative may include one or more non-classical amino acids, such as those described earlier in this section.

【００６５】 改変免疫グロブリン、ならびにその断片、類似体および誘導体を産生する方法
は、後述の第5.4節に記載される。Methods for producing modified immunoglobulins, and fragments, analogs and derivatives thereof, are described in Section 5.4, below.

【００６６】 5.2. 治療上の有用性 本発明は、治療薬(本明細書中では「治療薬」(Therapeutic)と記す)の投与によ って、被験者において抗イディオタイプ抗体および抗-抗イディオタイプ抗体の 生成を引き出す方法を提供する。このような治療薬は、本発明の改変型免疫グロ
ブリン、該改変型免疫グロブリンの作用活性を有する断片、類似体および誘導体
(例えば、5.1節に前掲したものなど)、ならびに本発明の改変型抗体をコードす る核酸、該核酸の作用活性を有する断片および誘導体(例えば、5.1節に前掲した
ものなど)を含む。5.2. Therapeutic Utility The present invention relates to the use of anti-idiotype antibodies and anti-anti-idio in a subject by administration of a therapeutic agent (herein referred to as “therapeutic”). It provides a way to elicit the production of type antibodies. Such therapeutic agents include the modified immunoglobulins of the present invention, fragments, analogs and derivatives having an activity of the modified immunoglobulins.
(Eg, those listed above in section 5.1), as well as nucleic acids encoding the modified antibodies of the present invention, and fragments and derivatives having an activity of the nucleic acid (eg, those listed above in section 5.1).

【００６７】 一般的に、被験者と同じ生物種である種に由来するかまたは種反応性を有する
生成物を投与することが好ましい。従って、好ましい実施形態において、本発明
の方法は、ヒト抗体から誘導した改変型抗体を使用する。他の実施形態において
、本発明の方法は、キメラ抗体またはヒト化抗体から誘導した改変型抗体を使用
する。In general, it is preferable to administer a product that is derived from or has species reactivity with the same species of organism as the subject. Thus, in a preferred embodiment, the method of the present invention uses a modified antibody derived from a human antibody. In other embodiments, the methods of the invention use modified antibodies derived from chimeric or humanized antibodies.

【００６８】 すなわち、本発明の改変型抗体を含むワクチン組成物(例えば、以下の5.3節に
記載したものなど)を、被験者に投与して、改変型抗体のイディオタイプを特異 的に認識する抗体(即ち、抗-イディオタイプ抗体またはAb2)の生成を引き出し、
次いでAb2が、Ab2のイディオタイプを特異的に認識する抗-抗-イディオタイプ抗
体(Ab3)の生成を引き出す。その結果、これらのAb3抗体は、改変型抗体と同様ま
たは類似した結合特異性をもつようになる。That is, a vaccine composition containing the modified antibody of the present invention (for example, those described in section 5.3 below) is administered to a subject, and the antibody that specifically recognizes the idiotype of the modified antibody is administered. (I.e., anti-idiotype antibody or Ab2) production,
Ab2 then elicits the production of an anti-anti-idiotype antibody (Ab3) that specifically recognizes the idiotype of Ab2. As a result, these Ab3 antibodies will have similar or similar binding specificities as the modified antibodies.

【００６９】 本発明は、本発明の改変型抗体を投与し、抗-イディオタイプ応答を引き出す(
即ち、Ab2およびAb3型抗体を生成する)方法を提供する。あるいはまた、本発明 は、本発明の改変型抗体を第１の被験者に投与してAb2抗体を生成し、Ab2抗体を
単離し、該Ab2抗体を第２の被験者に投与してこの第２の被験者中でAb3型抗体を
生成する方法を提供する。The present invention provides for administering an altered antibody of the invention to elicit an anti-idiotypic response (
Thus, a method for producing Ab2 and Ab3 type antibodies) is provided. Alternatively, the present invention provides that the modified antibody of the present invention is administered to a first subject to generate an Ab2 antibody, the Ab2 antibody is isolated, and the Ab2 antibody is administered to a second subject to obtain the second subject. Methods for producing Ab3 type antibodies in a subject are provided.

【００７０】 従って、本発明は、被験者において抗-イディオタイプ応答を生成する方法で あって、抗-イディオタイプ応答を誘導するのに十分な量の第１の免疫グロブリ ン分子(または該免疫グロブリン分子の作用活性を有する断片、類似体もしくは 誘導体)を投与することを含む方法を提供する。該第１の免疫グロブリンは、可 変領域を含み、該可変領域における１つ以上のアミノ酸置換を除いては第２の免
疫グロブリン分子と同一である。第２の免疫グロブリン分子は、免疫特異的に抗
原と結合可能である。前記１つ以上のアミノ酸置換は、該第２の免疫グロブリン
分子においてジスルフィド結合を形成する１つ以上のシステイン残基に対応する
１以上の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基による置換である
。別の実施形態において、本方法は、前記第２の免疫グロブリン分子のイディオ
タイプを認識する抗-イディオタイプ抗体を単離し、該抗-イディオタイプ抗体を
第２の被験者に投与することをさらに提供する。Accordingly, the present invention is directed to a method of generating an anti-idiotype response in a subject, the method comprising providing a first immunoglobulin molecule (or said immunoglobulin) in an amount sufficient to induce an anti-idiotype response. A fragment, analog or derivative having an active activity of the molecule). The first immunoglobulin contains a variable region and is identical to the second immunoglobulin molecule except for one or more amino acid substitutions in the variable region. The second immunoglobulin molecule is capable of immunospecifically binding to the antigen. The one or more amino acid substitutions are substitutions at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule with an amino acid residue having no sulfhydryl group. It is. In another embodiment, the method further provides isolating an anti-idiotype antibody that recognizes the idiotype of the second immunoglobulin molecule and administering the anti-idiotype antibody to a second subject. I do.

【００７１】 以下の分節においてより詳細に記載する特定の実施形態において、本発明の改
変型抗体は、病原体、病気の細胞または異常な細胞(例えば、細菌、寄生体、真 菌、ウイルス、腫瘍および癌が挙げられるがこれらに限定されない)に対する抗-
イディオタイプ応答を誘導するために使用できる。本発明の改変型抗体は、特定
の抗原に対する抗-抗-イディオタイプ応答を生成することによる治療または予防
を受け入れやすいあらゆる疾患または障害を治療または予防するために使用でき
る。In certain embodiments, which are described in more detail in the following sections, the modified antibodies of the invention may be used to detect pathogens, diseased or abnormal cells (eg, bacteria, parasites, fungi, viruses, tumors, and tumors). (Including but not limited to cancer)
Can be used to induce an idiotypic response. The modified antibodies of the invention can be used to treat or prevent any disease or disorder amenable to treatment or prevention by generating an anti-anti-idiotypic response to a particular antigen.

【００７２】 別の実施形態において、改変型抗体は、自己免疫疾患(例えば、慢性関節リウ マチ、狼瘡、潰瘍性大腸炎もしくは乾癬が挙げられるがこれらに限定されない) の治療、またはアレルギー治療に使用できる。本発明の方法およびワクチン組成
物は、被験者中の改変型免疫グロブリンに対する体液性応答および/または細胞 媒介性応答を引き出すために使用できる。１つの特定の実施形態において、本発
明の方法および組成物は、被験者において体液性応答を引き出す。別の特定の実
施形態において、本発明の方法および組成物は、被験者において細胞媒介性応答
を引き出す。好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物は、体液性
応答および細胞媒介性応答の両方を引き出す。In another embodiment, the modified antibodies are used to treat an autoimmune disease, including, but not limited to, rheumatoid arthritis, lupus, ulcerative colitis or psoriasis, or to treat allergy. it can. The methods and vaccine compositions of the present invention can be used to elicit a humoral and / or cell-mediated response to a modified immunoglobulin in a subject. In one particular embodiment, the methods and compositions of the present invention elicit a humoral response in a subject. In another specific embodiment, the methods and compositions of the present invention elicit a cell-mediated response in a subject. In a preferred embodiment, the methods and compositions of the present invention elicit both a humoral response and a cell-mediated response.

【００７３】 本発明を適用可能な被験者は、あらゆる哺乳動物または脊椎動物種であってよ
く、これらには、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えば、ニワトリ)、ヤギ、
ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット、サル、ウサギ、チンパンジーおよび
ヒトが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態において、被験者
はヒトである。特定の免疫グロブリン分子に対する抗-イディオタイプ応答が疾 患または障害を治療または予防するのに有効である本発明の組成物および方法は
、疾患または障害を予防するため、または特定の疾患または障害を治療するため
に使用できる。The subject to which the present invention can be applied can be of any mammalian or vertebrate species, including cows, horses, sheep, pigs, poultry (eg, chickens), goats,
Include, but are not limited to, cats, dogs, hamsters, mice, rats, monkeys, rabbits, chimpanzees and humans. In a preferred embodiment, the subject is a human. Compositions and methods of the invention in which an anti-idiotypic response to a particular immunoglobulin molecule is effective in treating or preventing a disease or disorder, may be used to prevent a disease or disorder, or to treat a particular disease or disorder. Can be used to treat.

【００７４】 5.2.1. 癌の治療および予防 本発明の改変型免疫グロブリン(あるいは該改変型免疫グロブリンの作用活性 を有する断片、誘導体もしくは類似体)、または該改変型免疫グロブリンをコー ドする核酸(あるいは該核酸の作用活性を有する断片、誘導体もしくは類似体)を
投与することによって、新生物、腫瘍、転移、または非制御下の細胞増殖によっ
て特徴付けられるあらゆる疾患または障害を含む癌を治療または予防できる。該
改変型免疫グロブリンは、治療または予防しようとする癌の癌細胞と関連する１
つ以上の抗原を特異的に認識する免疫グロブリンから誘導される。特定の治療薬
が特定の種類の癌を治療または予防するのに有効であるか否かは、当該分野で公
知のいかなる方法でも決定できる。例えば、そうした方法として以下の5.5節に 記載の方法が挙げられるがこれらに限定されない。5.2.1. Treatment and Prevention of Cancer Modified immunoglobulin of the present invention (or a fragment, derivative or analog having an activity of the modified immunoglobulin), or a nucleic acid encoding the modified immunoglobulin (Or a fragment, derivative or analog having an active activity of the nucleic acid) to treat or treat cancer, including neoplasms, tumors, metastases, or any disease or disorder characterized by uncontrolled cell growth. Can be prevented. The modified immunoglobulin is associated with a cancer cell of the cancer to be treated or prevented.
It is derived from an immunoglobulin that specifically recognizes one or more antigens. Whether a particular therapeutic agent is effective in treating or preventing a particular type of cancer can be determined by any method known in the art. For example, such methods include, but are not limited to, those described in Section 5.5 below.

【００７５】 例えば、限定するものではないが、以下の癌抗原と関連する癌を、これらの癌
抗原を認識する抗体から誘導される本発明の改変型抗体の投与によって治療また
は予防できる。即ち、KS1/4汎癌抗原(pan-carcinoma antigen)(PerezおよびWalk
er, 1990, J. Immunol. 142:32-37；Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415)、 卵巣癌抗原(CA125)(Yuら, 1991, Cancer Res. 51(2):48-475)、前立腺酸ホスフ ェート(prostatic acid phosphate)(Tailorら, 1990, Nucl. Acids Res. 18(1):
4928)、前立腺特異的抗原(HenttuおよびVihko, 1989, Biochem. Biophys. Res.
Commu. 10(2)):903-910；Israeliら, 1993, Cancer Res. 53:227-230)、黒色腫 関連抗原p97(Estinら, 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44)、黒色腫
抗原gp75(Vijayasardahylら, 1990, J. Exp. Med. 171(4)):1375-1380)、高分子
量黒色腫抗原(HMW-MAA)(Nataliら, 1987, Cancer 59:55-3；Mittelmanら, 1990,
J. Clin. Invest. 86:2136-2144)、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原(CEA)(F
oonら, 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294)、多型性上皮ムチン抗原、
ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原(例えばCEA、TAG-72(Yokataら, 1992,
Cancer Res. 52:3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammarら, 1993, Int. J. Cancer 5
3:751-758)；GICA19-9(Herlynら, 1982, J. Clin. Immunol. 2:135)、CTA-1およ
びLEA)、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19(Ghetieら, 1994, Blood 83:1329
-1336)、ヒトＢリンパ腫抗原-CD20(Reffら, 1994, Blood 83:435-445)、CD33(Sg
ourosら, 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430)、黒色腫特異的抗原(例えば、ガン グリオシドGD2(Salehら, 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシ ドGD3(Shitaraら, 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380)、ガングリ
オシドGM2(Livingstonら, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044)、ガングリオ シドGM3(Hoonら, 1993, Cancer Res. 53:5244-5250))、腫瘍特異的移植型の細胞
表面抗原(TSTA)(例えば、Ｔ抗原DNA腫瘍ウイルスを含むウイルス誘導性腫瘍抗原
、およびRNA腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原)、癌胎児性抗原-α-フェトプロテ
イン(結腸のCEA等)、膀胱癌胎児性抗原(Hellstromら, 1985, Cancer.Res.45:221
0-2188)、分化抗原(ヒト肺癌抗原L6、L20等)(Hellstromら, 1986, Cancer Res.
46:3917-3923)、繊維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Ch
atterjeeら, 1988, J. of Immun. 141:1398-1403)、ネオグリコプロテイン(neog
lycoprotein)、スフィンゴ脂質、EGFR(上皮増殖因子受容体)などの乳癌抗原、HE
R2抗原(P185HER2)、多形性上皮ムチン(PEM)(Hilkensら, 1992, Trends in Bio.
Chem. Sci. 17:359)、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1(Bernhardら, 1989, Science
245:301-304)、胎児赤血球および初期内胚葉で見いだされるＩ抗原などの分化 抗原(Feizi, 1985, Nature 314:53-57)、胃腺癌で見いだされるI(Ma)、***上皮
で見いだされるM18およびM39、骨髄性細胞で見いだされるSSEA-1、結腸直腸癌で
見いだされるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5およびD156-22、大腸腺癌で見いだされる
TRA-1-85(血液型Ｈ)、C14、肺腺癌で見いだされるF3、胃癌で見いだされるAH6、
Ｙハプテン、胎生期癌細胞で見いだされるLey、A431細胞で見いだされるEGF受容
体、TL5(血液型Ａ)、膵臓癌で見いだされるE1シリーズ(血液型Ｂ)、胎生期癌細 胞で見いだされるFC10.2、胃腺癌、腺癌で見いだされるCO-514(血液型Lea)、腺 癌で見いだされるNS-10、大腸腺癌で見いだされるCO-43(血液型Leb)、G49、EGF 受容体、(血液型ALeb/Ley)、大腸癌で見いだされる19.9、胃癌ムチン、骨髄性細
胞で見いだされるT5A7、黒色腫で見いだされるR24、胎生期癌細胞で見いだされ る4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、ならびに4-8細胞段 階胚(cell stage embryos)で見いだされるSSEA-3、SSEA-4。別の実施形態におい
て、抗原は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫由来のＴ細胞受容体誘導ペプチドである(Edels
on, 1998, The Cancer Journal 4:62を参照)。For example, but not by way of limitation, cancers associated with the following cancer antigens can be treated or prevented by administration of the modified antibodies of the present invention derived from antibodies that recognize these cancer antigens. That is, KS1 / 4 pan-cancinoma antigen (pan-carcinoma antigen) (Perez and Walk
er, 1990, J. Immunol. 142: 32-37; Bumal, 1988, Hybridoma 7 (4): 407-415), Ovarian cancer antigen (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51 (2): 48). -475), prostatic acid phosphate (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (1):
4928), prostate specific antigen (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res.
Commu. 10 (2)): 903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230), melanoma-associated antigen p97 (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81 (6): 445-44), melanoma antigen gp75 (Vijayasardahyl et al., 1990, J. Exp.Med.171 (4)): 1375-1380), high molecular weight melanoma antigen (HMW-MAA) (Natali et al., 1987, Cancer 59). : 55-3; Mittelman et al., 1990,
J. Clin. Invest. 86: 2136-2144), prostate-specific membrane antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) (F
oon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294), polymorphic epithelial mucin antigen,
Human milk fat globule antigen, colorectal tumor-associated antigen (e.g., CEA, TAG-72 (Yokata et al., 1992,
Cancer Res. 52: 3402-3408), CO17-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int.J. Cancer 5
3: 751-758); GICA19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), CTA-1 and LEA), Burkitt's lymphoma antigen-38.13, CD19 (Ghetie et al., 1994, Blood 83). : 1329
-1336), human B lymphoma antigen-CD20 (Reff et al., 1994, Blood 83: 435-445), CD33 (Sg
ouros et al., 1993, J. Nucl.Med. 34: 422-430), melanoma-specific antigens (e.g., ganglioside GD2 (Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398), ganglioside GD3 (Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36: 373-380), ganglioside GM2 (Livingston et al., 1994, J. Clin.Oncol. 12: 1036-1044), ganglioside GM3 (Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 5244-5250)), tumor-specific implantable cell surface antigen (TSTA) (eg, virus-inducible tumor antigens including T antigen DNA tumor virus, and envelope antigen of RNA tumor virus), carcinoembryonic antigen -α-fetoprotein (such as colon CEA), bladder carcinoembryonic antigen (Hellstrom et al., 1985, Cancer.Res. 45: 221
0-2188), differentiation antigens (human lung cancer antigen L6, L20, etc.) (Hellstrom et al., 1986, Cancer Res.
46: 3917-3923), fibrosarcoma antigen, human leukemia T cell antigen-Gp37 (Bhattacharya-Ch
atterjee et al., 1988, J. of Immun. 141: 1398-1403), neoglycoprotein (neog
lycoprotein), sphingolipids, breast cancer antigens such as EGFR (epidermal growth factor receptor), HE
R2 antigen (P185 HER2 ), polymorphic epithelial mucin (PEM) (Hilkens et al., 1992, Trends in Bio.
Chem. Sci. 17: 359), malignant human lymphocyte antigen-APO-1 (Bernhard et al., 1989, Science).
245: 301-304), differentiation antigens such as I antigen found in fetal erythrocytes and early endoderm (Feizi, 1985, Nature 314: 53-57), I (Ma) found in gastric adenocarcinoma, found in breast epithelium M18 and M39, SSEA-1 found in myeloid cells, VEP8 found in colorectal cancer, VEP9, Myl, VIM-D5, and D 1 56-22, found in colon adenocarcinoma
TRA-1-85 (blood group H), C14, F3 found in lung adenocarcinoma, AH6 found in gastric cancer,
Y hapten, EGF receptor found in Le y, A431 cells found in embryonal carcinoma cells, TL5 (blood group A), E 1 series found in pancreatic cancer (blood B), found in fetal KiganHoso cells FC10.2, gastric adenocarcinoma, CO-514 found in adenocarcinoma (blood group Le a ), NS-10 found in adenocarcinoma, CO-43 found in colon adenocarcinoma (blood group Le b ), G49, EGF receptor, found in (blood ALe b / Le y), 19.9 found in colon cancer, gastric cancer mucins, T 5 A 7 found in myeloid cells, R 24, embryonal carcinoma cells found in melanoma that 4.2, G D3, D1.1, OFA -1, G M2, OFA-2, G D2, M1: 22: 25: 8, and 4-8 are found in the cell stage Kaihai (cell stage embryos) SSEA- 3, SSEA-4. In another embodiment, the antigen is a T-cell receptor-derived peptide from cutaneous T-cell lymphoma (Edels
on, 1998, The Cancer Journal 4:62).

【００７６】 本発明の別の実施形態において、本発明の改変型抗体で治療された被験者は、
任意に、手術、放射治療または化学療法などの他の癌治療法によって治療されて
もよい。特に、癌を治療または予防するために使用する本発明の治療薬は、化学
療法剤の１つまたはこれらの組み合わせと共に投与されてもよい。化学療法剤と
しては、メトトレキセート、タキソール(taxol)、メルカプトプリン、チオグア ニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イフォスファミド(i
fosfamide)、ニトロソ尿素類、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン
、ダカルバジン、プロカルバジン、エトポシド、カンパセシン(campathecin)、 ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン(idarubicin)、ダウノルビシン
、ダクチノマイシン、プリカマイシン(plicamycin)、ミトザントロン、アスパラ
ギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン(vinorelbine)、パ クリタキセル、ドセタキセル(docetaxel)などが挙げられるがこれらに限定され ない。In another embodiment of the present invention, the subject treated with the modified antibody of the present invention comprises:
Optionally, it may be treated by other cancer treatments, such as surgery, radiation therapy or chemotherapy. In particular, the therapeutic agents of the invention used to treat or prevent cancer may be administered with one or a combination of chemotherapeutic agents. Chemotherapeutic agents include methotrexate, taxol, mercaptopurine, thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide, ifosfamide (i
fosfamide), nitrosoureas, cisplatin, carboplatin, mitomycin, dacarbazine, procarbazine, etoposide, campathecin, bleomycin, doxorubicin, idarubicin, daunorubicin, dactinomycin, plicamycin, asparaginase, asparaginase , Vincristine, vinorelbine, paclitaxel, docetaxel and the like, but are not limited thereto.

【００７７】 5.2.1.1. 悪性疾患 本発明の投与によって治療または予防できる悪性疾患および関連障害として、
表３に一覧したものが挙げられるが、これらに限定されない(このような障害の 報告についてはFishmanら, 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Ph
iladelphiaを参照のこと)。5.2.1.1. Malignant Diseases Malignant diseases and related disorders that can be treated or prevented by administration of the present invention include:
Examples include, but are not limited to, those listed in Table 3 (for reports of such disorders, see Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., JB Lippincott Co., Ph.D.
See iladelphia).

【００７８】[0078]

【表３】 [Table 3]

【００７９】 特定の実施形態において、卵巣、膀胱、***、結腸、肺、皮膚、膵臓もしくは
子宮における悪性変化もしくは異常増殖性変化(変質形成および異形成)、または
過増殖性障害(hyperproliferative disorders)が治療または予防される。別の特
定の実施形態においては、肉腫、黒色腫または白血病が治療または予防される。In certain embodiments, malignant or hyperproliferative changes (degeneration and dysplasia) in the ovary, bladder, breast, colon, lung, skin, pancreas or uterus, or hyperproliferative disorders To be treated or prevented. In another specific embodiment, a sarcoma, melanoma or leukemia is treated or prevented.

【００８０】 5.2.1.2. 前悪性状態 また、本発明の治療薬は、前悪性状態を治療するため、および新生物状態また
は悪性状態に進行するのを予防するためにも投与できる。これらには、表３に一
覧した障害が挙げられるがこれらに限定されない。このような予防的使用または
治療的使用は、新生物または癌に進行する前段階のものとわかっているまたは疑
われる状態(特に過形成、変質形成、または特に異形成を含む非新生細胞増殖が 生じた状態)に対して指示される(このような異常増殖状態の報告についてはRobb
insおよびAngell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philad
elphia, pp. 8-79を参照)。過形成は、構造または機能に有意な変化がなく、組 織または器官中の細胞数の増加を伴う、制御された細胞増殖の形態である。あく
まで一例として、子宮内膜過形成はたいてい子宮内膜癌に進行する。変質形成は
、あるタイプの成体細胞または完全に分化した細胞が別のタイプの成体細胞と置
き換わる、制御された細胞増殖の形態である。変質形成は、上皮細胞または結合
組織細胞で生じうる。非定型的な変質形成は、やや無秩序な変質形成性上皮を伴
う。異形成は、癌の前駆症状であることが多く、主に上皮で見いだされる。これ
は、非新生細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性の喪失、お
よび細胞の構造的配向の喪失を伴う。異形成細胞は、異常に大きく、濃く染色さ
れる核を有し、多態性を示すことが多い。異形成は、慢性刺激または慢性炎症が
生じる個所で特徴的に生じ、子宮頚部、呼吸気道、口腔および胆嚢でよく見いだ
される。5.2.1.2. Premalignant Conditions Therapeutic agents of the invention can also be administered to treat premalignant conditions and to prevent progression to a neoplastic or malignant condition. These include, but are not limited to, the disorders listed in Table 3. Such prophylactic or therapeutic uses may be for conditions known or suspected to be prior to progression to a neoplasm or cancer (especially non-neoplastic cell proliferation, including hyperplasia, alteration, or especially dysplasia). (Reported such abnormal growth conditions by Robb
ins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., WB Saunders Co., Philad
elphia, pp. 8-79). Hyperplasia is a form of controlled cell growth with no significant change in structure or function, accompanied by an increase in the number of cells in a tissue or organ. By way of example only, endometrial hyperplasia usually progresses to endometrial cancer. Metaplasia is a form of controlled cell growth in which one type of adult or fully differentiated cell replaces another type of adult cell. Metaplasia can occur in epithelial cells or connective tissue cells. Atypical metaplasia involves a somewhat disorderly metaplastic epithelium. Dysplasia is often a precursor to cancer and is found primarily in the epithelium. This is the most disorderly form of non-neoplastic cell proliferation, with loss of individual cell homogeneity and loss of structural orientation of the cells. Dysplastic cells have abnormally large, deeply stained nuclei and are often polymorphic. Dysplasia characteristically occurs where chronic irritation or inflammation occurs and is commonly found in the cervix, respiratory tract, oral cavity and gall bladder.

【００８１】 過形成、変質形成または異形成に特徴付けられる異常細胞増殖が存在する代わ
りに、またはそれに加えて、in vivoで呈示される、または患者由来の細胞サン プルによりin vitroで呈示される形質転換された表現型または悪性表現型の特徴
が１つ以上存在すれば、ワクチン組成物の予防的/治療的投与の必要性があるか もしれない。上記したように、形質転換された表現型のこのような特徴には、形
態変化、緩い下層付着(substratum attachment)、接触阻害(contact inhibition
)の喪失、足場依存性の喪失、プロテアーゼ放出、糖輸送の増加、血清要求の減 少、胎児抗原の発現、250,000ダルトンの細胞表面タンパク質の消失などが挙げ られる(形質転換された表現型または悪性表現型に関連する特徴については、同 上、pp.84-90も参照のこと)。[0081] Instead of, or in addition to, abnormal cell proliferation characterized by hyperplasia, metaplasia or dysplasia, presented in vivo or presented in vitro by patient-derived cell samples If one or more characteristics of the transformed or malignant phenotype are present, there may be a need for prophylactic / therapeutic administration of the vaccine composition. As noted above, these characteristics of the transformed phenotype include morphological changes, loose substratum attachment, contact inhibition
), Loss of anchorage dependence, increased protease release, increased glucose transport, decreased serum demand, expression of fetal antigens, loss of 250,000 dalton cell surface protein (transformed phenotype or malignancy). For phenotype-related features, see id., Pp. 84-90).

【００８２】 特定の実施形態において、上皮の外見上良性の過形成または異形成病変である
白斑症、またはin situ癌であるボーエン病は、予防的介入が望ましい前新生物 病変である。In certain embodiments, vitiligo, an apparently benign hyperplastic or dysplastic lesion of the epithelium, or Bowen's disease, an in situ cancer, is a preneoplastic lesion where preventive intervention is desirable.

【００８３】 別の実施形態において、線維嚢胞病(嚢胞性過形成、***異形成、特に腺疾患(
良性上皮過形成))は予防的介入が望ましい。In another embodiment, fibrocystic disease (cystic hyperplasia, breast dysplasia, especially glandular disease (
Benign epithelial hyperplasia)) requires prophylactic intervention.

【００８４】 別の実施形態においては、以下の悪性疾患素因のうち１つ以上を示す患者を、
本発明の治療薬を有効量投与して治療する。すなわち、悪性疾患に伴う染色体転
座(例えば、慢性骨髄性白血病を生じるフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ 腫を生じるt(14;18)等)、家族性ポリープ症またはガードナー症候群(大腸癌の可
能性のある前駆症状)、良性モノクローナル高ガンマグロブリン血症(多発性骨髄
腫の可能性のある前駆症状)、ならびにメンデル(遺伝学的)遺伝パターンを示す 癌または前癌性疾患(例えば、大腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺 伝性外骨症、多発性内分泌腺腫症、アミロイド生成および褐色細胞腫を伴う骨髄
甲状腺癌、ポイツ-ジェガーズ症候群、フォン・レックリングハウゼンの神経線 維腫症、網膜芽腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内黒色癌、色素性乾皮症、
毛細管拡張性運動失調、チェディアック-東症候群、白皮症、ファンコーニ再生 不良性貧血、ならびにブルーム症候群(Bloom's syndrome)；RobbinsおよびAngel
l, 197, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 11
2-113を参照)など)の患者と一親等の血縁関係にあるものである。In another embodiment, a patient exhibiting one or more of the following predispositions to malignancy:
Treatment is carried out by administering an effective amount of the therapeutic agent of the present invention. Chromosomal translocations associated with malignant disease (e.g., Philadelphia chromosome that causes chronic myeloid leukemia, t (14; 18) that causes follicular lymphoma, etc.), familial polyposis or Gardner syndrome (possible colorectal cancer Cancer or precancerous disease (e.g., colonic family) with benign monoclonal hypergammaglobulinemia (a possible precursor to multiple myeloma) and a Mendelian (genetic) inheritance pattern Polyposis, Gardner's syndrome, genetic exostosis, multiple endocrine neoplasia, myelothyroid carcinoma with amyloidogenesis and pheochromocytoma, Peutz-Jeghers syndrome, von Recklinghausen neurofibromatosis, retinoblast Tumor, carotid body tumor, skin black cancer, intraocular black cancer, xeroderma pigmentosum,
Ataxia-telangiectasia, Chediak-Higashi syndrome, albinism, Fanconi aplastic anemia, and Bloom's syndrome; Robbins and Angel
l, 197, Basic Pathology, 2d Ed., WB Saunders Co., Philadelphia, pp. 11
Etc.) are related to the first degree by the patient.

【００８５】 別の特定の実施形態において、本発明の治療薬は、卵巣、***、大腸、肺、膵
臓、皮膚、前立腺、胃腸、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、子宮の癌、黒色腫または肉
腫への進行を予防するために、ヒト患者に投与される。In another specific embodiment, the therapeutic agent of the invention is ovarian, breast, colon, lung, pancreas, skin, prostate, gastrointestinal, B lymphocytes, T lymphocytes, cancer of the uterus, melanoma or sarcoma Administered to human patients to prevent progression to

【００８６】 5.2.2. 感染症の治療 また、本発明は、本発明の治療薬を投与することによって、感染症を治療また
は予防する方法も提供する。本発明の治療薬は、特に、感染症を引き起こしてい
る抗原とまたは病原体に対する細胞受容体と免疫特異的に結合可能な免疫グロブ
リン分子から誘導された改変型免疫グロブリン分子(あるいは該改変型免疫グロ ブリン分子の作用活性を有する断片、誘導体もしくは類似体、または該改変型免
疫グロブリン分子をコードする核酸、該核酸の作用活性を有する断片、類似体も
しくは誘導体)である。以下に詳細に記載するように、病原体としては、ウイル ス、細菌、真菌、原生動物および寄生体が挙げられるがこれらに限定されない。5.2.2. Treatment of Infectious Disease The present invention also provides a method for treating or preventing an infectious disease by administering a therapeutic agent of the present invention. The therapeutic agent of the present invention is, in particular, a modified immunoglobulin molecule derived from an immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen causing an infection or to a cell receptor for a pathogen (or the modified immunoglobulin molecule). A fragment, derivative, or analog having an activity of a bulin molecule, or a nucleic acid encoding the modified immunoglobulin molecule; a fragment, analog, or derivative having an activity of the nucleic acid). As described in detail below, pathogens include, but are not limited to, viruses, bacteria, fungi, protozoa and parasites.

【００８７】 特定の実施形態においては、感染症を、以下に示す病原体の抗原のうちの１つ
を特異的に認識する免疫グロブリンから誘導された本発明の改変型免疫グロブリ
ン(あるいは該改変型免疫グロブリンの作用活性を有する断片、誘導体または類 似体、またはそれらをコードする核酸)の投与によって治療または予防する。す なわち、インフルエンザウイルス赤血球凝集素(Genbank受託番号JO2132；Air, 1
981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:739-743；Newtonら, 1983, Virology 128
:495-501)、ヒト呼吸シンシチアル（ＲＳ）ウイルスＧ糖タンパク質(Genbank受 託番号Z33429；Garciaら, 1994, J. Virol；Collinsら, 1984, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 81:783)、デング熱ウイルスのコアタンパク質、マトリックスタン パク質もしくは他のタンパク質(Genbank受託番号M19197；Hahnら, 1988, Virolo
gy 12:17-180)、麻疹ウイルス赤血球凝集素(Genbank受託番号M81899；Rotaら, 1
992, Virology 188:135-142)、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質gB(Genba
nk受託番号M14923；Bzikら, 198, Virology 155:322-333)、ポリオウイルスI VP
1(Eminiら, 1983, Nature 304:99)、gp120などのHIV Iエンベロープ糖タンパク 質(Putneyら, 198, Science 234:1392-1395)、Ｂ型肝炎表面抗原(Itohら, 198,
Nature, 308:19；Neurathら, 198, Vaccine 4:34)、ジフテリア毒素(Audibertら
, 1981, Nature 289:543)、連鎖球菌24Mエピトープ(Beachey, 1985, Adv. Exp.
Med. Biol. 185:193)、淋菌性ピリン(RothbardおよびSchoolnik, 1985, Adv. Ex
p. Med. Biol. 185:247)、仮性狂犬病ウイルスg50(gpD)、仮性狂犬病ウイルスII
(gpB)、仮性狂犬病ウイルスgIII(gpC)、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮
性狂犬病糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質195、伝染性胃腸炎マトリ ックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質38、ブタパルボウイルスキャ
プシドタンパク質、Serpulina hydodysenteriae防御抗原、ウシウイルス性下痢 糖タンパク質55、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ、 ブタインフルエンザ(flu)赤血球凝集素、ブタインフルエンザ(flu)ノイラミニダ
ーゼ、***ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ア
フリカブタ熱ウイルス、Mycoplasma hypopneumoniae、感染性ウシ鼻気管炎ウイ ルス(例えば、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅまたは糖タンパク質 Ｇ)、感染性喉頭気管炎ウイルス(例えば、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク
質Ｇまたは糖タンパク質Ｉ)、ラクロス(La Crosse)ウイルスの糖タンパク質(Gon
zales-Scaranoら, 1982, Virology 120:42)、新生子ウシ下痢ウイルス(Matsuno およびInouye, 1983, Infection and Immunity 39:155)、ベネズエラウマ脳脊髄
炎ウイルス(MathewsおよびRoehrig, 1982, J. Immunol. 129:273)、プンタトロ(
punta toro)ウイルス(Dalrympleら, 1981, Replication of Negative Strand Vi
ruses, BishopおよびCompans(編), Elsevier, NY中, p.17)、マウス白血病ウイ ルス(Steevesら, 1974, J. Virol. 14:187)、マウス乳腺癌ウイルス(Masscyおよ
びSchochetman, 1981, Virology 115:20)、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質お よび/またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原(例えば、1980年6月4日に発行された英国
特許広報第GB2034323A号；GanemおよびVarmus, 1987, Ann. Rev. Biochem, 5:51
-93；Tiollaisら, 1985, Nature 317:489-495を参照のこと)、ウマインフルエン
ザウイルスまたはウマヘルペスウイルスの抗原(例えば、ウマインフルエンザウ イルスＡ型/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型/マ
イアミ63ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型/ケンタッキー81 ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルスＩ型糖タンパク質Ｂ、ウマヘルペスウ
イルスＩ型糖タンパク質Ｄ、ウシＲＳウイルスまたはウシパラインフルエンザウ
イルスの抗原(例えば、ウシＲＳウイルス付着タンパク質(BRSV G)、ウシＲＳウ イルス融合タンパク質(BRSV F)、ウシＲＳウイルスヌクレオキャプシドタンパク
質(BRSV N)、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、およびウシ
パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼ)、ウシウイル ス下痢ウイルス糖タンパク質48または糖タンパク質53。別の特定の実施形態にお
いては、病原体に対する細胞受容体を認識する改変型免疫グロブリン(あるいは 該改変型免疫グロブリンの作用活性を有する断片、誘導体または類似体、または
該改変型免疫グロブリンをコードする核酸)を投与することによって、感染症を 治療または予防する。例えば、このような細胞受容体を対応する病原体とともに
表４に一覧するが、これらに限定されない。In certain embodiments, the modified immunoglobulin of the present invention (or the modified immunoglobulin of the invention derived from an immunoglobulin that specifically recognizes one of the antigens of the pathogens shown below for the infectious disease) Or a fragment, derivative or analog having the activity of a globulin, or a nucleic acid encoding the same). That is, influenza virus hemagglutinin (Genbank accession number JO2132; Air, 1
981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 739-743; Newton et al., 1983, Virology 128.
: 495-501), human respiratory syncytial (RS) virus G glycoprotein (Genbank accession number Z33429; Garcia et al., 1994, J. Virol; Collins et al., 1984, Proc. Natl. Aca
USA 81: 783), dengue virus core protein, matrix protein or other protein (Genbank accession number M19197; Hahn et al., 1988, Virolo
gy 12: 17-180), measles virus hemagglutinin (Genbank accession number M81899; Rota et al., 1).
992, Virology 188: 135-142), herpes simplex virus type 2 glycoprotein gB (Genba
nk accession number M14923; Bzik et al., 198, Virology 155: 322-333), poliovirus I VP.
1 (Emini et al., 1983, Nature 304: 99), HIV I envelope glycoprotein such as gp120 (Putney et al., 198, Science 234: 1392-1395), hepatitis B surface antigen (Itoh et al., 198,
Nature, 308: 19; Neuroth et al., 198, Vaccine 4:34), diphtheria toxin (Audibert et al.).
, 1981, Nature 289: 543), a streptococcal 24M epitope (Beachey, 1985, Adv. Exp.
Med. Biol. 185: 193), gonococcal pilin (Rothbard and Schoolnik, 1985, Adv.
p. Med. Biol. 185: 247), pseudorabies virus g50 (gpD), pseudorabies virus II
(gpB), pseudorabies virus gIII (gpC), pseudorabies virus glycoprotein H, pseudorabies glycoprotein E, transmissible gastroenteritis glycoprotein 195, transmissible gastroenteritis matrix protein, swine rotavirus glycoprotein 38, pig Parvovirus capsid protein, Serpulina hydodysenteriae protective antigen, bovine viral diarrhea glycoprotein 55, Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase, swine flu (flu) hemagglutinin, swine flu (flu) neuraminidase, foot-and-mouth disease virus, swine fever virus, Swine influenza virus, African swine fever virus, Mycoplasma hypopneumoniae, infectious bovine rhinotracheitis virus (e.g., infectious bovine rhinotracheitis virus glycoprotein E or glycoprotein G), infectious laryngotracheitis virus (e.g., infectious larynx Tube stomatitis virus glycoprotein G or glycoprotein I), lacrosse (La Crosse) virus glycoprotein (Gon
zales-Scarano et al., 1982, Virology 120: 42), neonatal calf diarrhea virus (Matsuno and Inouye, 1983, Infection and Immunity 39: 155), Venezuelan equine encephalomyelitis virus (Mathews and Roehrig, 1982, J. Immunol. 129: 273), Puntatro (
punta toro) virus (Dalrymple et al., 1981, Replication of Negative Strand Vi)
ruses, Bishop and Compans (eds.), Elsevier, NY, p. 17), murine leukemia virus (Steeves et al., 1974, J. Virol. 14: 187), mouse mammary adenocarcinoma virus (Masscy and Schochetman, 1981, Virology). 115: 20), hepatitis B virus core protein and / or hepatitis B virus surface antigen (eg, GB Patent Publication GB2034323A issued June 4, 1980; Ganem and Varmus, 1987, Ann. Rev. . Biochem, 5:51
-93; Tiollais et al., 1985, Nature 317: 489-495), antigens of equine influenza virus or equine herpes virus (eg, equine influenza virus A / Alaska 91 neuraminidase, equine influenza virus A / miamia). 63 neuraminidase, equine influenza virus type A / Kentucky 81 neuraminidase, equine herpesvirus type I glycoprotein B, equine herpesvirus type I glycoprotein D, bovine respiratory syncytial virus or bovine parainfluenza virus antigen (e.g., bovine respiratory syncytial virus attachment protein ( BRSV G), bovine RS virus fusion protein (BRSV F), bovine RS virus nucleocapsid protein (BRSV N), bovine parainfluenza virus type 3 fusion protein, and bovine parainfluenza virus type 3 hemagglutinin protein. Ilaminidase), bovine virus diarrhea virus glycoprotein 48 or glycoprotein 53. In another specific embodiment, a modified immunoglobulin that recognizes a cell receptor for a pathogen (or a fragment having an activity of the modified immunoglobulin, By administering a derivative or analog, or a nucleic acid encoding the modified immunoglobulin), to treat or prevent an infectious disease. It is not limited to these.

【００８８】[0088]

【表４】 [Table 4]

【００８９】 本発明の方法によって治療または予防できるウイルス性疾患には、Ａ型肝炎、
Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ
型(HSV-I)、単純ヘルペスII型(HSV-II)、牛疫、ライノウイルス、エコーウイル ス、ロタウイルス、RSウイルス、乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガ
ロウイルス、エキノウイルス(echinovirus)、アルボウイルス、ハンタウイルス 、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイル
ス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型(HIV-I)、ヒト免疫不全ウイル スII型(HIV-II)、ピコルナウイルス科のいずれか、エンテロウイルス属、カルシ
ウイルス科、ノーウォーク群ウイルスのいずれか、トガウイルス(デング熱ウイ ルス等)、アルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス属、狂犬病ウイ ルス、マルブルクウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オ
ルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウ
イルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウ
イルスII型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パ
ルボウイルス、エプスタイン-バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス-、オナガザ
ルヘルペスウイルスＩ(Ｂウイルス)、ポックスウイルスおよび脳炎によって引き
起こされるものが挙げられるが、これらに限定されない。[0089] Viral diseases that can be treated or prevented by the methods of the present invention include hepatitis A,
Hepatitis B, hepatitis C, influenza, varicella, adenovirus, herpes simplex I
Type (HSV-I), herpes simplex type II (HSV-II), rinderpest, rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus, papillomavirus, papovavirus, cytomegalovirus, echinovirus, echinovirus, arbovirus, Hantavirus, Coxsackievirus, mumps virus, measles virus, rubella virus, poliovirus, human immunodeficiency virus type I (HIV-I), human immunodeficiency virus type II (HIV-II), picornavirus Family, enterovirus, calciviridae, Norwalk group virus, togavirus (dengue virus, etc.), alphavirus, flavivirus, coronavirus, rabies virus, marburg virus, ebola virus, Parainfluenza virus, orthomyxovirus, bunya virus, Renavirus, reovirus, rotavirus, orbivirus, human T-cell leukemia virus type I, human T-cell leukemia virus type II, simian immunodeficiency virus, lentivirus, polyomavirus, parvovirus, Epstein-Barr virus, human herpes Virus-, gibbon herpesvirus I (B virus), poxvirus, and those caused by encephalitis, but are not limited to these.

【００９０】 本発明の方法によって治療または予防できる細菌性疾患は、グラム陰性細菌、
グラム陽性細菌、ミコバクテリアリケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア属( 例えば、髄膜炎菌および淋菌)、レジオネラ、コレラ菌、肺炎連鎖球菌等のスト レプトコッカス、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、ヘモフィルス属(例えば 、インフルエンザ)、クラミジア属、腸毒性大腸菌、赤痢菌属などの細菌によっ て引き起こされる疾患(ただしこれらに限定されない)、ならびに梅毒、ライム病
などの細菌性疾患である。Bacterial diseases that can be treated or prevented by the methods of the present invention include gram negative bacteria,
Gram-positive bacteria, mycobacterial rickettsia, mycoplasma, Neisseria spp. , Influenza), diseases caused by (but not limited to) bacteria such as Chlamydia spp., Enterotoxic Escherichia coli and Shigella, and bacterial diseases such as syphilis and Lyme disease.

【００９１】 本発明の方法により治療または予防できる原生動物性疾患は、プラスモディウ
ム属（マラリア原虫）、アイメリア属、リーシュマニア属、コクジディオア(kok
zidioa)属、トリパノソーマ属、真菌類(カンジダ属など)などの原生動物(ただし
これらに限定されない)によって引き起こされる。Protozoan diseases that can be treated or prevented by the method of the present invention include Plasmodium (Plasmodium malaria), Eimeria, Leishmania, Kokjidior (kok)
zidioa), protozoa such as, but not limited to, the genus Trypanosoma and the fungi (such as Candida).

【００９２】 本発明の特定の実施形態において、本発明の治療薬は、感染症の治療または予
防に有用な適切な抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤またはその他薬剤と共に投
与される。In certain embodiments of the invention, the therapeutics of the invention are administered with appropriate antibiotics, antifungals, antivirals, or other agents useful for treating or preventing an infection.

【００９３】 5.3. 遺伝子治療 遺伝子治療とは、改変型免疫グロブリン分子が誘導される免疫グロブリン分子
によって認識される抗原の発現に関連した疾患を患う被験者への核酸投与によっ
て行われる疾患の治療または予防を指す。例えば、疾患または障害は、特定の癌
原因物質もしくは腫瘍原因物質の発現と関連した癌、または病原体の特定の抗原
の発現(そのために病原体が特定の細胞受容体と結合する)と関連した感染症であ
り得る。本発明のこの実施形態において、治療用核酸は、細胞内(リーダー配列 がない場合)または細胞外(リーダー配列がある場合)に改変型免疫グロブリンを 産生する配列をコードする。5.3. Gene Therapy Gene therapy refers to the treatment or prevention of a disease caused by administration of a nucleic acid to a subject suffering from a disease associated with the expression of an antigen recognized by an immunoglobulin molecule from which a modified immunoglobulin molecule is induced. Point to. For example, a disease or disorder is a cancer associated with the expression of a particular carcinogen or tumor-causing agent, or an infectious disease associated with the expression of a particular antigen of a pathogen, thereby causing the pathogen to bind to a particular cell receptor. Can be In this embodiment of the invention, the therapeutic nucleic acid encodes a sequence that produces a modified immunoglobulin intracellularly (without a leader sequence) or extracellularly (with a leader sequence).

【００９４】 遺伝子治療方法の一般的な報告については、Goldspielら, 1993, Clinical Ph
armacy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 199
3, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260
:926-932；ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-
217を参照のこと。組換えDNA技術分野で一般的に公知で使用可能な方法は、Ausu
belら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & So
ns, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manua
l, Stockton Press, NY；ならびにDracopoliら(編), 1994, Current Protocols
in Human Genetics, John Wiley & Sons, NYの第12章および第13章に記載されて
いる。For a general report on gene therapy methods, see Goldspiel et al., 1993, Clinical Ph.D.
armacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 199.
3, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260.
: 926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-
See 217. Methods commonly known and available in the recombinant DNA art are Ausu
bel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & So
ns, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manua
l, Stockton Press, NY; and Dracopoli et al. (eds.), 1994, Current Protocols.
in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY, Chapters 12 and 13.

【００９５】 一態様において、治療用核酸は、改変型免疫グロブリン分子を発現する発現ベ
クターからなるものである。In one embodiment, the therapeutic nucleic acid comprises an expression vector that expresses a modified immunoglobulin molecule.

【００９６】 核酸の患者への送達は、直接的であってもよいし(この場合、患者は直接核酸 、核酸担持ベクターもしくは送達複合体に曝される)、または間接的であっても よい(この場合、細胞をまず核酸でin vitro形質転換してから、患者に移植する)
。これらの２つのアプローチは、それぞれin vivoまたはex vivo遺伝子治療法と
して知られている。Delivery of a nucleic acid to a patient may be direct (where the patient is directly exposed to the nucleic acid, nucleic acid-carrying vector or delivery complex) or indirect ( In this case, the cells are first transformed in vitro with the nucleic acid and then transplanted into the patient.)
. These two approaches are known, respectively, as in vivo or ex vivo gene therapy.

【００９７】 特定の実施形態において、核酸は、発現されて抗体を生成するべき場所に直接
in vivo投与される。これは、当該分野で知られている数ある方法のいずれによ っても達成できる。例えば、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し
、細胞内へ投与するか(例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他の ウイルスベクターを使用した感染による(米国特許第4,980,286号を参照))、裸の
DNAを直接注射するか、微粒子衝撃法(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)を
使用するか、脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト作用物質でコート
するか、生体高分子(例えば、ポリ-β-1->4-N-アセチルグルコサミンポリサッカ
リド；米国特許第5,635,493号を参照)中にカプセル化するか、リポソーム、微粒
子もしくはマイクロカプセル中に封入するか、核に侵入することがわかっている
ペプチドと連結して投与するか、核に侵入することがわかっているリガンドと連
結して投与するか、受容体媒介性エンドサイトーシスに供されるリガンドと連結
して投与するか(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を 参照)、などによって達成できる。別の実施形態において、核酸-リガンド複合体
(該リガンドは融合誘導ウイルスペプチドを含んでエンドソームを破壊する)を形
成することにより、核酸のリソソーム分解を回避できる。さらに別の実施形態に
おいて、特異的な受容体を標的とすることによって核酸をin vivoで標的指向さ せて細胞特異的取込みおよび発現をもたらしうる(例えば、1992年4月16日付けの
PCT公報第WO92/06180号(Wuら)；1992年12月23日付けの同第WO92/22635号(Wilson
ら)；1992年11月26日付けの同第WO92/20316号(Findeisら)；1993年7月22日付け 同第WO93/14188号(Young)を参照のこと)。あるいはまた、核酸を、細胞内に導入
し、相同組換えにより宿主細胞DNAに組み込んで発現させることができる(Koller
およびSmithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstra ら, 1989, Nature 342:435-438)。[0097] In certain embodiments, the nucleic acid is directly expressed where the antibody is to be produced.
Administered in vivo. This can be achieved by any of a number of methods known in the art. For example, nucleic acids can be constructed as part of a suitable nucleic acid expression vector and administered intracellularly (e.g., by infection using a defective or attenuated retrovirus or other viral vector (see U.S. Patent No.4,980,286). ), Naked
DNA can be injected directly, using microparticle bombardment (eg, a gene gun; Biolistic, Dupont), coated with lipids, cell surface receptors or transfectants, or biopolymers (eg, poly-β -1-> 4-N-acetylglucosamine polysaccharide; see US Pat. No. 5,635,493), or encapsulated in liposomes, microparticles or microcapsules, or known to enter the nucleus Administered in conjunction with a ligand known to enter the nucleus, or in conjunction with a ligand that undergoes receptor-mediated endocytosis (e.g., Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). In another embodiment, the nucleic acid-ligand complex
(The ligand disrupts endosomes, including the fusogenic viral peptide), thereby avoiding lysosomal degradation of the nucleic acid. In yet another embodiment, the nucleic acid can be targeted in vivo by targeting a specific receptor, resulting in cell-specific uptake and expression (e.g., dated April 16, 1992).
PCT Publication No. WO92 / 06180 (Wu et al.); WO92 / 22635 (Wilson) dated December 23, 1992
Et al .; WO 92/20316, Nov. 26, 1992 (Findeis et al.); WO 93/14188, Jul. 22, 1993 (Young)). Alternatively, the nucleic acid can be introduced into a cell and expressed by integrating it into host cell DNA by homologous recombination (Koller
And Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).

【００９８】 あるいはまた，細胞内エピトープに結合する、中和抗体などの一本鎖抗体も投
与できる。このような一本鎖抗体は、例えばMarascoら(Marascoら, 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893)に記載のような技術を利用して、例えば 、標的細胞集団中の一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することに
よって投与できる。アデノウイルスは、遺伝子治療において使用できる別のウイ
ルスベクターである。アデノウイルスは、それが軽い疾患を引き起こす呼吸上皮
(respiratory epithelia)に遺伝子を送達するのに特に関心の高いビヒクルであ る。アデノウイルスに基づく送達系のその他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非***細胞に感染できるという利点
を有している。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics an
d Development 3:499-503は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の報告を述べ ている。Boutら, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10は、遺伝子をアカゲザルの 呼吸上皮に形質導入するためにアデノウイルスベクターを使用することを示した
。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら, 1991, S
cience 252:431-434；Rosenfeldら, 1992, Cell 68:143-155；およびMastrangel
iら, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234に記載されている。アデノ随伴ウイル
ス(AAV)も、遺伝子治療における使用が提案されている(Walshら, 1993, Proc. S
oc. Exp. Biol. Med. 204:289-300)。Alternatively, single-chain antibodies, such as neutralizing antibodies, that bind to an intracellular epitope can be administered. Such single-chain antibodies are described, for example, in Marasco et al. (Marasco et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893), and can be administered, for example, by expressing the nucleotide sequence encoding a single-chain antibody in the target cell population. Adenoviruses are another viral vector that can be used in gene therapy. Adenovirus is a respiratory epithelium that causes mild disease
(respiratory epithelia). Other targets for adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells and muscle. Adenoviruses have the advantage that they can infect nondividing cells. Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics an
d Development 3: 499-503 describes a report on adenovirus-based gene therapy. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 3-10, have shown the use of adenovirus vectors to transduce genes into the respiratory epithelium of rhesus monkeys. Another example of the use of adenovirus in gene therapy is described in Rosenfeld et al., 1991, S.
cience 252: 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; and Mastrangel
i et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234. Adeno-associated virus (AAV) has also been proposed for use in gene therapy (Walsh et al., 1993, Proc.
oc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300).

【００９９】 使用される治療用核酸の形態および量は、疾患の種類、および治療用核酸の望
ましい効果の程度、患者の状態などに応じ、当業者によって決定できる。The form and amount of the therapeutic nucleic acid to be used can be determined by those skilled in the art depending on the type of disease, the desired effect of the therapeutic nucleic acid, the condition of the patient, and the like.

【０１００】 5.3. ワクチン製剤及び投与 本発明はまた、本発明の治療薬を含むワクチン製剤を提供し、そして、それは
、例えば、疾患の治療及び予防のために、ワクチン製剤がある抗原に対して保護
的な免疫（体液性及び／又は細胞仲介の）応答を誘導するために投与するのに好
適である。5.3. Vaccine Formulations and Administration The present invention also provides a vaccine formulation comprising a therapeutic agent of the invention, which is used, for example, for the treatment and prevention of disease, against an antigen for which the vaccine formulation is present. Suitable for administration to induce a protective immune (humoral and / or cell-mediated) response.

【０１０１】 そのようなワクチンの好適な調製物としては、液体溶液又は懸濁液のいずれか
の注射剤があり；注射に先立ち、液体中に溶解又は懸濁するのに好適な固体形態
を調製することもできる。調製物はまた、乳化されていてもよく、又はリポソー
ムのカプセルに包まれたポリペプチドであってもよい。活性な免疫原性成分は、
しばしば、製薬上許容される、そして活性成分と適合性の賦形剤と混合されてい
る。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロ
ース、グリセロール、エタノール、滅菌等張水性バッファー等及びそれらの組み
合わせである。さらに、所望ならば、ワクチン調製物はまた、湿潤剤若しくは乳
化剤、pH緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの少量
の補助物質を含むこともできる。Suitable preparations of such vaccines include injections, either as liquid solutions or suspensions; preparing solid forms suitable for dissolution or suspension in liquid prior to injection You can also. The preparation may also be emulsified or the polypeptide encapsulated in liposomes. The active immunogenic component is
Often, they are mixed with excipients that are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Suitable excipients are, for example, water, saline, buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, sterile isotonic aqueous buffer, and the like, and combinations thereof. In addition, if desired, the vaccine preparation may also contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, and / or adjuvants which increase the effectiveness of the vaccine.

【０１０２】 有効なアジュバントの例としては、これらに限定されないが、水酸化アルミニ
ウム、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン（thr-MDP）
、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、N−アセチ
ルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−（1',2'− ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルア ミンが挙げられる。Examples of effective adjuvants include, but are not limited to, aluminum hydroxide, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP)
N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1 ', 2'-dipalmitoyl-sn- Glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamine.

【０１０３】 アジュバントの有効性は、注射される、特定のアジュバントと共に製剤化され
る免疫グロブリンに対する抗イディオタイプ抗体の誘導を測定することによって
決定できる。The effectiveness of an adjuvant can be determined by measuring the induction of anti-idiotypic antibodies to immunoglobulins that are injected and formulated with a particular adjuvant.

【０１０４】 組成物は、液体溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、
又は粉末であり得る。経口製剤は、製薬級のマンニトール、ラクトース、澱粉、
ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシ
ウムなどの標準的な担体を含むことができる。The compositions include liquid solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations,
Or it may be a powder. Oral formulations include pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch,
Standard carriers such as magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate can be included.

【０１０５】 一般に、成分は、個別に又は単位服用量形態中に配合して、例えば、活性薬剤
量を表示するアンプル又はサシェッテ（sachette）などの密封された容器中の乾
燥した凍結乾燥粉末又は水なし濃縮物として供給される。組成物が注射で投与さ
れる場合は、滅菌希釈剤のアンプルが提供され、成分が投与の前に混合され得る
。In general, the components may be formulated individually or in unit dosage form, for example, as a dried lyophilized powder or water in a sealed container such as an ampoule or sachette indicating the amount of active agent. None supplied as concentrate. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile diluent is provided and the components can be mixed prior to administration.

【０１０６】 特定の実施形態では、本発明の凍結乾燥改変免疫グロブリンが、第１の容器で
提供され；第２の容器は、50％グリセリン、0.25％フェノール、及び防腐剤（例
えば、0.005％ブリリアントグリーン）の水溶液からなる希釈剤を含む。In certain embodiments, a lyophilized modified immunoglobulin of the invention is provided in a first container; a second container comprising 50% glycerin, 0.25% phenol, and a preservative (eg, 0.005% brilliant) Green) aqueous solution.

【０１０７】 本発明はまた、本発明のワクチン製剤の1以上の成分で充填された1以上の容器
を含む製薬パック又はキットも提供する。そのような容器（類）に関しては、医
薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって定めら
れた形態に注意しなければならず、そしてその注意は、ヒト投与のための製造、
使用又は販売の機関による承認を反映する。[0107] The invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the vaccine formulation of the invention. For such container (s), attention must be paid to the forms prescribed by governmental agencies that regulate the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products, and the precautions shall be taken for human administration. Manufacturing,
Reflects the approval of the institution of use or sale.

【０１０８】 組成物は、所望ならば、活性成分を含む1以上の単位服用量形態を含有し得る パック又はディスペンサー装置中に入れることができる。パックは、例えば、ブ
リスター（blister）パックなどの、金属又はプラスチックホイルを含むことが できる。パック又はディスペンサー装置には、投与のための指示書を添付するこ
とができる。適合性の製薬担体中で製剤化された本発明の化合物を含む組成物は
また、適当な容器中で調製されて、入れられ、そして示された症状の治療のため
のラベルも貼られる。The compositions can, if desired, be presented in a pack or dispenser device which can contain one or more unit dosage forms containing the active ingredient. The pack may for example comprise metal or plastic foil, such as a blister pack. The pack or dispenser device can be accompanied by instructions for administration. Compositions comprising a compound of the invention formulated in a compatible pharmaceutical carrier are also prepared, placed in a suitable container, and labeled for treatment of an indicated condition.

【０１０９】 ワクチンが投与される被験者は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトで
あるが、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、
ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス及びラットを含む非ヒト動
物であってもよい。The subject to which the vaccine is administered is preferably a mammal, most preferably a human, but is not limited to cattle, horses, sheep, pigs, poultry (eg,
Non-human animals including chickens, goats, cats, dogs, hamsters, mice and rats.

【０１１０】 本発明のワクチン製剤を導入するのに、多くの方法が使用でき；これらに限定
されないが、経口、大脳内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内経路
、及び乱切法によって（例えば、二股の針を使用して、皮膚の最上層を通して傷
をつける）又は任意の他の免疫の標準的な経路を含む。特定の実施形態では、乱
切法が採用される。Many methods can be used to introduce the vaccine formulation of the present invention; but are not limited to oral, intracerebral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal routes, And by means of a keratotomy (eg, using a bifurcated needle to cut through the top layer of skin) or any other standard route of immunity. In certain embodiments, a truncation technique is employed.

【０１１１】 製剤に採用される正確な用量の改変免疫グロブリン分子はまた、投与経路、及
び患者の状態（nature）にも依存するだろうし、標準臨床技術に従って、臨床医
の判断及び各患者の環境によって決定されるべきである。有効な免疫量は、ワク
チン調製物が投与される宿主中の改変免疫グロブリン分子に対する免疫応答（す
なわち、抗イディオタイプ反応）を生じさせるのに充分な量である。有効用量は
また、動物モデル試験システムから得られた用量−応答曲線から推定することも
できる。The precise dosage of the modified immunoglobulin molecule employed in the formulation will also depend on the route of administration, and the nature of the patient, and will be determined by the judgment of the clinician and each patient's environment, according to standard clinical techniques. Should be determined by An effective immunizing amount is an amount sufficient to produce an immune response (ie, an anti-idiotypic response) to the modified immunoglobulin molecule in the host to which the vaccine preparation is administered. Effective doses can also be extrapolated from dose-response curves obtained from animal model test systems.

【０１１２】 5.4. 改変免疫グロブリンの製造方法 本発明の改変免疫グロブリンは、免疫グロブリンの合成のための当業界で公知
の任意の方法、特に、化学合成又は組換え発現によって製造でき、好ましくは組
換え発現技術によって製造される。5.4. Methods for Producing Modified Immunoglobulins The modified immunoglobulins of the present invention can be produced by any method known in the art for the synthesis of immunoglobulins, in particular, by chemical synthesis or recombinant expression, preferably Produced by recombinant expression technology.

【０１１３】 本発明の改変免疫グロブリン、又はその断片、誘導体若しくはアナログの組換
え発現は、該改変免疫グロブリンをコードする核酸の構築を必要とする。もし、
改変免疫グロブリンのヌクレオチド配列が公知ならば、改変免疫グロブリンをコ
ードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることが
でき（例えば、Kutmeierら, 1994, BioTechniques 17:242に記載されているよう
に）、簡単に言うと、改変免疫グロブリンをコードする配列の部分を含むオーバ
ーラップしたオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングし、それらのオリゴヌ
クレオチドを連結し、次いで、例えば、後記の第6節に例示されるように、PCRに
よる連結オリゴヌクレオチドの増幅を含む。[0113] Recombinant expression of a modified immunoglobulin of the invention, or a fragment, derivative or analog thereof, requires the construction of a nucleic acid encoding the modified immunoglobulin. if,
If the nucleotide sequence of the modified immunoglobulin is known, the nucleic acid encoding the modified immunoglobulin can be assembled from chemically synthesized oligonucleotides (see, for example, Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242). Briefly, in brief, overlapping oligonucleotides containing portions of the sequence encoding the modified immunoglobulin are synthesized, annealed, the oligonucleotides ligated, and then, for example, as described in Section 6 below. As exemplified, it involves amplification of the ligated oligonucleotide by PCR.

【０１１４】 あるいは、改変免疫グロブリンをコードする核酸は、改変免疫グロブリンがそ
れから誘導される免疫グロブリンをコードする核酸から生産できる。特定の免疫
グロブリンをコードする核酸を含むクローンは利用できないが、該免疫グロブリ
ン分子の配列が公知ならば、該免疫グロブリンをコードする核酸は、適当な供給
源（例えば、抗体cDNAライブラリー、又は免疫グロブリンを発現する任意の組織
又は細胞から生産されたcDNAライブラリー）から、その配列の3'及び5'末端にハ
イブリダイズできる合成プライマーを使用するPCR増幅又は特定遺伝子配列に特 異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによって
得ることができる。Alternatively, a nucleic acid encoding a modified immunoglobulin can be produced from a nucleic acid encoding an immunoglobulin from which the modified immunoglobulin is derived. Clones containing nucleic acids encoding a particular immunoglobulin are not available, but if the sequence of the immunoglobulin molecule is known, the nucleic acid encoding the immunoglobulin can be obtained from a suitable source (eg, an antibody cDNA library, or an immunoglobulin). CDNA library produced from any tissue or cell that expresses globulin), PCR amplification using synthetic primers that can hybridize to the 3 'and 5' ends of the sequence, or oligonucleotides specific to specific gene sequences It can be obtained by hybridization using a probe.

【０１１５】 もし、特定の抗原を特異的に認識する免疫グロブリン分子が利用できないなら
ば（又はそのような免疫グロブリンをコードする核酸をクローニングするための
cDNAライブラリーの供給源が利用できないならば）、特定の抗原に特異的な免疫
グロブリンは、当業界で公知の任意の方法、例えば、ウサギなどの動物を免疫し
て、ポリクローナル抗体を生産するか、より好ましくは、例えば、Kohler及びMi
lstein（1975, Nature 256:495-497）に記載されているように、又はKozbonら（
1983, Immunology Today 4:72）若しくはColeら（1985, 「モノクローナル抗体 及び癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」中, Alan R Liss,
Inc.発行, 77-96頁）に記載されているようにモノクローナル抗体を産生するこ
とによって生産できる。あるいは、少なくとも免疫グロブリンのFab部分をコー ドするクローンは、特異的抗原に結合するFab断片のクローンのFab発現ライブラ
リー（例えば、Huseら, 1989, Science 246:1275-1281に記載されているような ）をスクリーニングすることによるか、又は抗体ライブラリーをスクリーニング
すること（例えば、Clacksonら, 1991, Nature 352:624；Haneら, 1997 Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 94:4937を参照されたい。）によって得られる。If immunoglobulin molecules that specifically recognize a particular antigen are not available (or for cloning nucleic acids encoding such immunoglobulins)
If a cDNA library source is not available), immunoglobulins specific for a particular antigen can be prepared by any method known in the art, for example, by immunizing an animal such as a rabbit to produce polyclonal antibodies. And more preferably, for example, Kohler and Mi
lstein (1975, Nature 256: 495-497) or as described in Kozbon et al. (
1983, Immunology Today 4:72) or Cole et al. (1985, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R Liss,
Inc., pp. 77-96) by producing monoclonal antibodies. Alternatively, a clone encoding at least the Fab portion of an immunoglobulin may be a Fab expression library of clones of Fab fragments that bind to a specific antigen (eg, as described in Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281). N) or screening antibody libraries (eg, Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997 Proc. N
See atl. Acad. Sci. USA 94: 4937. ).

【０１１６】 少なくとも免疫グロブリン分子の可変ドメインをコードする核酸が一旦得られ
れば、それは、任意の利用可能なクローニングベクター中に導入でき、そして、
免疫グロブリン分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクター中
に導入できる（例えば、PCT公開第WO86/05807号；PCT公開第WO89/01036号；米国
特許第5,122,464号；及びBebbington, 1991, 「酵素学における方法（Methods i
n Enzymology）」 2:136-145を参照されたい。）。完全な抗体分子を発現させる
核酸との同時発現のための、完全なＬ鎖及びＨ鎖を含むベクターも利用可能であ
る（同書を参照されたい。）。次いで、免疫グロブリンをコードする核酸は、任
意の他の所望のアミノ酸置換、欠失又は挿入と共に、スルフヒドリル基（メルカ
プト基）を含まないアミノ酸残基との鎖内ジスルフィド結合に関わる1以上の可 変領域のシステイン残基を置換（又は欠失）させるのに必要なヌクレオチド置換
又は欠失を導入するように改変され得る。そのような改変は、ヌクレオチド配列
中の特異的突然変異又は欠失を導入するための当業界で公知の任意の方法、例え
ば、これらに限定されないが、化学的突然変異誘発、in vitro位置指定突然変異
誘発（Hutchinsonら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551）、PCRを基礎とする方法
等によって行うことができる。Once a nucleic acid encoding at least the variable domain of an immunoglobulin molecule is obtained, it can be introduced into any available cloning vector, and
It can be introduced into a vector containing a nucleotide sequence encoding the constant region of an immunoglobulin molecule (eg, PCT Publication No. WO86 / 05807; PCT Publication No. WO89 / 01036; US Pat. No. 5,122,464; and Bebbington, 1991, “Enzymes Methods i
n Enzymology) 2: 136-145. ). Vectors containing complete L and H chains are also available for co-expression with nucleic acids that express intact antibody molecules (see ibid). The nucleic acid encoding the immunoglobulin can then be combined with any other desired amino acid substitutions, deletions or insertions, by one or more variable amino acids involved in intrachain disulfide bonds with amino acid residues that do not contain a sulfhydryl group (mercapto group). The region can be modified to introduce nucleotide substitutions or deletions necessary to replace (or delete) a cysteine residue. Such alterations can be made by any method known in the art for introducing specific mutations or deletions in a nucleotide sequence, such as, but not limited to, chemical mutagenesis, in vitro Mutagenesis (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), PCR-based methods, and the like.

【０１１７】 さらに、適当な抗原特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子と、適当な生物学的
活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とをつなぎ合わせることによる、キメラ
抗体の製造のために開発した技術（Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.
81:851-855；Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608；Takedaら, 1985, Natu
re 314:452-454）も使用できる。上記のように、キメラ抗体は、マウスモノクロ
ーナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン由来の定常領域とを有するもの
、例えば、ヒト化抗体などの、その中の異なる部分が別の動物種由来する分子で
ある。Furthermore, a technique developed for the production of a chimeric antibody by splicing a gene derived from an appropriate antigen-specific mouse antibody molecule and a gene derived from a human antibody molecule having appropriate biological activity. (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.
81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Natu
re 314: 452-454) can also be used. As described above, a chimeric antibody is one having a variable region derived from a mouse monoclonal antibody and a constant region derived from a human immunoglobulin, such as a humanized antibody, in which different portions are molecules derived from another animal species. It is.

【０１１８】 あるいは、単鎖抗体の製造のために記載された技術（米国特許第4,694,778号 ；Bird, 1988, Science 242:423-42；Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:5879-5883；及びWardら, 1989, Nature 334:544-54）が、単鎖抗体の製
造に投与できる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋によってFv領域のＨ鎖断片及びＬ鎖
断片を結合させて、単鎖ポリペプチドをもたらすことによって形成される。大腸
菌中の機能性Fv断片のアッセンブリのための技術も使用できる（Skerraら, 1988
, Science 242:1038-1041）。Alternatively, techniques described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,694,778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54) can be used for the production of single chain antibodies. Single chain antibodies are formed by linking the heavy and light chain fragments of the Fv region by amino acid crosslinking, resulting in a single chain polypeptide. Techniques for the assembly of functional Fv fragments in E. coli can also be used (Skerra et al., 1988).
, Science 242: 1038-1041).

【０１１９】 特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生産で
きる。例えば、そのようなフラグメントとしては、これらに限定されないが、抗
体分子のペプシン消化によって製造できるF(ab')2フラグメント及びF(ab')2フラ
グメントのジスルフィド架橋を分解することによって生産できるFabフラグメン トを含む。[0119] Antibody fragments that recognize specific epitopes can be produced by known techniques. For example, such fragments include, but are not limited to, F (ab ') 2 fragments that can be produced by pepsin digestion of antibody molecules and Fab fragments that can be produced by degrading the disulfide bridges of the F (ab') 2 fragments. Including

【０１２０】 本発明の改変免疫グロブリン分子をコードする核酸が一旦得られてしまえば、
該免疫グロブリン分子の製造のためのベクターは、当業界で周知の技術を使用す
る組換えDNA技術によって製造できる。次いで、改変免疫グロブリン分子は、組 換え的に発現でき、例えば、後記第6節に記載の方法（Bebbington, 1991, Metho
ds in Exzymology 2:136-145も参照されたい。）を使用する、当業界で公知の任
意の方法によって単離できる。簡単に言うと、COS細胞、又は任意の他の適当な 培養細胞を、一時的又は非一時的に、改変免疫グロブリンをコードする発現ベク
ターでトランスフェクトし、適当な期間培養して免疫グロブリンを発現させ、次
いで、上清をCOS細胞から取得することができ、そしてその上清は、分泌され、 発現された改変免疫グロブリンを含んでいる。Once the nucleic acid encoding the modified immunoglobulin molecule of the present invention has been obtained,
Vectors for the production of the immunoglobulin molecule can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. The modified immunoglobulin molecule can then be expressed recombinantly, for example, as described in Section 6 below (Bebbington, 1991, Metho
See also ds in Exzymology 2: 136-145. ) Can be isolated by any method known in the art. Briefly, COS cells, or any other suitable cultured cells, are transfected, either transiently or non-transiently, with an expression vector encoding a modified immunoglobulin and cultured for an appropriate period to express the immunoglobulin. The supernatant can then be obtained from the COS cells, and the supernatant contains the secreted and expressed modified immunoglobulin.

【０１２１】 免疫グロブリン分子コード配列並びに適当な転写及び翻訳調節シグナルを含む
発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法が使用できる。これらの方
法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組
換えが挙げられる。例えば、Sambrookら（1990, Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
）及びAusubelら（編集, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, Joh
n Wiley & Sons, NY）に記載された技術を参照されたい。To construct an expression vector containing an immunoglobulin molecule coding sequence and appropriate transcriptional and translational control signals, methods well known to those skilled in the art can be used. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. For example, see Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
) And Ausubel et al. (Edit, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, Joh
n Wiley & Sons, NY).

【０１２２】 発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞中に導入され、次いで、トラン
スフェクトされた細胞は、本発明の免疫グロブリンを製造するために従来の技術
によって培養される。The expression vector is introduced into host cells by conventional techniques, and the transfected cells are then cultured by conventional techniques to produce an immunoglobulin of the invention.

【０１２３】 本発明の組換え抗体を発現させるのに使用する宿主細胞は、大腸菌（Escheric
hia coli.）などの細菌細胞、又は、特に組換え免疫グロブリン完全分子の発現 のためには、好ましくは真核細胞のいずれかであり得る。特に、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由 来の主要媒介初期遺伝子プロモーター配列（major intermediate early gene pr
omoter element）などのベクターと共同した、免疫グロブリンの有効な発現系で
ある（Foeckingら, 198, Gene 45:101；Cockettら, 1990, Bio/Technology 8:2 ）。The host cells used to express the recombinant antibodies of the present invention are E. coli (Escheric
hia coli.), or, preferably, for expression of a complete recombinant immunoglobulin molecule, preferably a eukaryotic cell. In particular, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO) contain major intermediate early gene promoter sequences derived from human cytomegalovirus.
An efficient expression system for immunoglobulins in conjunction with vectors such as omoter elements (Foecking et al., 198, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio / Technology 8: 2).

【０１２４】 本発明の改変免疫グロブリン分子の発現のために、多様な宿主−発現ベクター
系が利用できる。そのような宿主−発現系は、それによって目的のコード配列が
製造され、続いて精製されるビヒクルを示すが、適当なヌクレオチドコード配列
によって形質転換又はトランスフェクトされたときに、in situで本発明の免疫 グロブリン分子を発現できる細胞をも示す。これらには、免疫グロブリンコード
配列を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発 現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）などの微生物；免
疫グロブリンコード配列を含む組換え酵母発現ベクターによって形質転換された
酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））；免疫 グロブリンコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウ
イルス）で感染された昆虫細胞系；免疫グロブリンコード配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザ
イクウイルス、TMV）によって感染されているか、又は免疫グロブリンコード配 列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）によって形質
転換された植物細胞系；又は、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されるプロモータ
ー（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから誘導さ
れるプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイ
ルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えば
、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞）があるが、これらに限定されない。[0124] A variety of host-expression vector systems are available for expressing the modified immunoglobulin molecules of the invention. Such host-expression systems show the vehicle by which the coding sequence of interest is produced and subsequently purified, but when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequence, the invention of the present invention in situ. Also shown are cells that can express the immunoglobulin molecules of the present invention. These include microorganisms such as bacteria (eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors, including immunoglobulin coding sequences; Yeast (eg, Saccharomyces, Pichia) transformed with a recombinant yeast expression vector; an insect cell line infected with a recombinant viral expression vector (eg, baculovirus) containing an immunoglobulin coding sequence; Recombinant viral expression vector containing a globulin coding sequence (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV), or a recombinant plasmid expression vector containing an immunoglobulin coding sequence (eg, a Ti plasmid) Trait by A transformed plant cell line; or comprising a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, an adenovirus late promoter, a vaccinia virus 7.5K promoter). Mammalian cell lines (eg, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 cells) that include the recombinant expression construct include, but are not limited to.

【０１２５】 細菌系では、免疫グロブリン分子を発現させる意図での使用に依存して、多数
の発現ベクターが有利に選択できる。例えば、免疫グロブリン分子の医薬組成物
の生産のために、多量のそのようなタンパク質が製造されるべきときには、容易
に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望まし
い。そのようなベクターとしては、これらに限定されないが、その中で免疫グロ
ブリンコード配列は、個別にlac Zコード領域とインフレームでベクター中に連 結でき、融合タンパク質が製造される、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら,
1983, EMBO J. 2:1791）；pINベクター（Inouye及びInouye, 1985, Nucleic Aci
ds Res. 13:3101-3109；Van Heeke及びSchuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:550
3-5509）等が挙げられる。pGEXベクターはまた、グルタチオンS−トランスフェ ラーゼ（GST）との融合タンパク質として、外来のポリペプチドを発現するのに 使用することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は、溶解性であり、
溶解された細胞から吸着及びマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの
結合、次いで、遊離のグルタチオンの存在下に溶出することによって容易に精製
できる。pGEXベクターは、トロンビン又はXa因子プロテアーゼ開裂部位を含むよ
うに設計され、クローン化された標的遺伝子産物を、GST部分から放出できる。[0125] In bacterial systems, a number of expression vectors may be advantageously selected depending upon the use intended to express the immunoglobulin molecule. For example, when large quantities of such proteins are to be produced for the production of pharmaceutical compositions of immunoglobulin molecules, vectors that direct high level expression of fusion protein products that are readily purified are desirable. Such vectors include, but are not limited to, the E. coli expression vector pUR278, in which the immunoglobulin coding sequence can be individually ligated in frame with the lacZ coding region and the fusion protein is produced. (Ruther et al.,
1983, EMBO J. 2: 1791); pIN vector (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Aci)
ds Res. 13: 3101-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 550.
3-5509) and the like. pGEX vectors can also be used to express foreign polypeptides, as fusion proteins with glutathione S-transferase (GST). Generally, such fusion proteins are soluble,
It can be easily purified from lysed cells by adsorption and binding to matrix glutathione-agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione. The pGEX vector is designed to contain a thrombin or factor Xa protease cleavage site so that the cloned target gene product can be released from the GST moiety.

【０１２６】 昆虫細胞系では、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Auto
grapha californica nuclear ppolyhedrosis virus）（AcNPV）が、外来遺伝子 を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、スポドプテラ・フル
ギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。免疫グロブリンコード 配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個別にクロ
ーン化でき、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御 下に置かれる。In an insect cell system, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (Auto
grapha californica nuclear ppolyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector to express foreign genes. The virus grows in Spodoptera frugiperda cells. The immunoglobulin coding sequence can be cloned separately into non-essential regions of the virus (eg, polyhedrin gene) and placed under the control of an AcNPV promoter (eg, polyhedrin promoter).

【０１２７】 哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルス系発現系が利用できる。アデノウイル
スを発現ベクターとして使用する場合には、目的の免疫グロブリンコード配列は
アデノウイルス転写／翻訳調節複合体（complex）、例えば、後期プロモーター 及び三部構成（tripartite）リーダー配列に連結できる。次いで、このキメラ遺
伝子は、in vitro又はin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入で きる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、E1又はE3領域）中への挿入は、感
染された宿主中で生存可能であり、免疫グロブリン分子を発現できる組換えウイ
ルスを与える（例えば、Logan及びShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1:355-359を参照されたい。）。挿入された免疫グロブリンコード配列の効率的 な翻訳には、特異的な開始シグナルをも必要とし得る。これらのシグナルとして
は、ATG開始コドン及び隣接配列がある。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻 訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調（in p
hase）しなければならない。これらの外因性の翻訳調節シグナル及び開始コドン
は、多様な起源、天然及び合成の両者であり得る。発現の効率は、適当な転写エ
ンハンサー配列、転写ターミネーター等の包含によって増強できる。（Bittner ら, 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544を参照されたい。）[0127] In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems are available. When an adenovirus is used as an expression vector, the immunoglobulin coding sequence of interest can be ligated to an adenovirus transcription / translation control complex, such as the late promoter and tripartite leader sequence. This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (eg, the E1 or E3 region) results in a recombinant virus that is viable in the infected host and can express immunoglobulin molecules (eg, Logan and Shenk, 1984). , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
See 1: 355-359. ). Efficient translation of the inserted immunoglobulin coding sequence may also require specific initiation signals. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences. In addition, the start codon is synchronized with the reading frame of the desired coding sequence (in p) to ensure translation of the entire insert.
hase). These exogenous translational control signals and initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. The efficiency of expression can be enhanced by including appropriate transcription enhancer sequences, transcription terminators, and the like. (See Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544.)

【０１２８】 さらに、挿入配列の発現をモジュレートするか、又は所望の特定の様式での遺
伝子産物を改変し及びプロセシングする宿主細胞株を選択できる。そのようなタ
ンパク質産物の改変（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、開裂
）は、そのタンパク質の機能に重要であろう。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセ
シング並びにタンパク質及び遺伝子産物の改変の特徴的及び特異的な機構を有し
ている。適当な細胞株又は宿主系は、発現された外来タンパク質の適正な改変及
びプロセシングを確実にするために選択できる。この目的を達成するために、初
期転写物の適当なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のた
めの細胞性機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳
動物宿主細胞としては、これらに限定されないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS 、MDCK、293、3T3、WI38が挙げられる。In addition, a host cell strain may be chosen which modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Modification (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of such protein products may be important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins and gene products. Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the correct modification and processing of the foreign protein expressed. To this end, eukaryotic host cells having the cellular machinery for proper processing of early transcripts, glycosylation, and phosphorylation of gene products can be used. Such mammalian host cells include, but are not limited to, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38.

【０１２９】 組換えタンパク質を長期間高い収率で製造するためには、安定した発現が好ま
しい。例えば、免疫グロブリン分子を安定に発現する細胞株を設計することがで
きる。ウイルスの複製起源を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細
胞は、適当な発現調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写
ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、及び選択マーカーによって制御され
ているDNAによって形質転換できる。外来DNAの導入に続き、設計された細胞は、
豊富化培地中で1〜2日間増殖され、次いで選択培地に切り替えることができる。
組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択のための耐性を与え、細胞に、それ
らの染色体中にプラスミドを安定に組み入れさせ、順にクローン化でき、細胞株
中に広がる中心（foci）を形成するように増殖する。この方法は、免疫グロブリ
ン分子を発現する細胞株を設計するために有利に使用できる。そのような設計さ
れた細胞株は、免疫グロブリン分子と直接的又は間接的に相互作用する化合物の
スクリーニング及び評価に特に有用であろう。For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. For example, cell lines that stably express immunoglobulin molecules can be designed. Rather than using an expression vector containing the viral origin of replication, the host cell is controlled by appropriate expression control sequences (eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.), and selectable markers. It can be transformed by DNA. Following the introduction of foreign DNA, the designed cells
Grow in enriched media for 1-2 days, then can be switched to selective media.
The selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance for selection, allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes, be cloned in turn, and form a foci that spreads through the cell line. Proliferate to This method can advantageously be used to design cell lines that express immunoglobulin molecules. Such designed cell lines would be particularly useful for screening and evaluating compounds that interact directly or indirectly with immunoglobulin molecules.

【０１３０】 これらに限定されないが、それぞれtk、hgprt又はaprt細胞中で採用できる、 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒ ポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzy
balski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）及びアデニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子を含む、多数の選 択系が使用できる。また、代謝拮抗物質耐性は、次の遺伝子の選択の基礎として
使用できる：メトトレキサートへの耐性を与えるdhfr（Wiglerら, 1980, Natl.
Acad. Sci. USA 77:357；O'Hartら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:152
7）；ミコフェノール酸（mycophenolic acid）への耐性を与えるgpt（Mulligan 及びBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドG-
418への耐性を与えるneo（Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及びWu, 1991, Bi
otherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573
-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及びMorgan及びAnderson, 1993,
Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；1993年5月, TIBTECH 11(5):155-215）。使用
可能な、組換えDNA技術業界で一般に知られている方法は、Ausubelら（編集）,
1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY；Kri
egler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Mannual, Stockto
n Press, NY；及びDracopoliら（編集）, 1994, Current Protocols in Human G
enetics, John Wiley & Sons, NYの第12及び13章；Colberre-Garapinら, 1981,
J. Mol. Biol. 150:1に記載されている。[0130] Without limitation, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska and Szy) can be employed in tk, hgprt or aprt cells, respectively.
Natl. Acad. Sci. USA 48: 202) and the adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) gene are available in a number of selection systems. Also, antimetabolite resistance can be used as a basis for selection of the following genes: dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wigler et al., 1980, Natl.
Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hart et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 152.
7); gpt (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072) which confers resistance to mycophenolic acid; aminoglycoside G-
Neo conferring resistance to 418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Bi
otherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573.
-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; and Morgan and Anderson, 1993,
Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215). Methods commonly known in the recombinant DNA technology industry that can be used are described in Ausubel et al.
1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kri
egler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Mannual, Stockto
n Press, NY; and Dracopoli et al. (ed.), 1994, Current Protocols in Human G
Enetics, John Wiley & Sons, Chapters 12 and 13 of NY; Colberre-Garapin et al., 1981,
J. Mol. Biol. 150: 1.

【０１３１】 あるいは、任意の融合タンパク質は、発現された融合タンパク質に特異的な抗
体を利用することによって容易に精製できる。例えば、Janknechtらによって報 告されたシステムは、ヒト細胞株中で発現された非変性融合タンパク質の素早い
（ready）精製を可能にする（Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:8972-897）。このシステムでは、目的の遺伝子がワクシニア組換えプラスミ
ド中にサブクローニングされ、遺伝子のオープンリーディングフレームが、6個 のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合される。このタグは、
融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして働く。組換えワクシニアウイ
ルスによって感染された細胞からの抽出物を、Ni2+−ニトリロ酢酸（nitriloace
tic acid）−アガロースカラムにかけられ、ヒスチジンタグ付きタンパク質を、
イミダゾール含有バッファーで選択的に溶出する。Alternatively, any fusion protein can be readily purified by utilizing an antibody specific for the expressed fusion protein. For example, the system reported by Janknecht et al. Allows for ready purification of non-denatured fusion proteins expressed in human cell lines (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA).
88: 8972-897). In this system, the gene of interest is subcloned into a vaccinia recombination plasmid, and the gene's open reading frame is translationally fused to an amino-terminal tag of six histidine residues. This tag
Serves as the matrix binding domain for the fusion protein. Extracts from cells infected by the recombinant vaccinia virus were subjected to Ni2 + -nitriloacetate (nitriloacetate).
tic acid)-applied to an agarose column to convert histidine-tagged protein
Selective elution with imidazole containing buffer.

【０１３２】 免疫グロブリン分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加できる（総説
として、Bebbington及びHentschel, 「DNAクローニングにおける哺乳動物細胞中
でのクローン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用（the
Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned
Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning）」, 第3巻, (Academic Press, New
York, 1987）を参照されたい。）。免疫グロブリンを発現するベクター系中の マーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤の濃度の増加
は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加させるだろう。増幅領域は、免疫グロブ
リン遺伝子と関係しているので、免疫グロブリンの製造もまた、増加するだろう
（Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。The level of expression of immunoglobulin molecules can be increased by vector amplification (for review, see Bebbington and Hentschel, "Use of vector based gene amplification for expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning ( the
Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned
Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning), Volume 3, (Academic Press, New
York, 1987). ). If the marker in the vector system expressing the immunoglobulin is amplifiable, increasing the concentration of the inhibitor present in the host cell culture will increase the number of copies of the marker gene. Since the amplified region is associated with immunoglobulin genes, production of immunoglobulins will also increase (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).

【０１３３】 宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、Ｈ鎖由来ポリペプチドをコードす
る第１ベクター及びＬ鎖由来ポリペプチドをコードする第２ベクター、によって
同時トランスフェクションされ得る（co-transfected）。この２つのベクターは
、Ｈ鎖及びＬ鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含
んでいてもよい。あるいは、Ｈ鎖及びＬ鎖ポリペプチドの両者をコードする単一
のベクターを使用することができる。その場合には、Ｌ鎖は、過剰の無毒性Ｈ鎖
を避けるために、Ｈ鎖の前に配置すべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322:
52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197）。Ｈ鎖及びＬ鎖のコ
ード配列は、cDNA又はゲノムDNAを含むことができる。[0133] Host cells can be co-transfected with two expression vectors of the present invention, a first vector encoding a heavy chain-derived polypeptide and a second vector encoding a light chain-derived polypeptide. . The two vectors may contain the same selectable marker that allows for equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Alternatively, a single vector encoding both the heavy and light chain polypeptides can be used. In that case, the light chain should be placed before the heavy chain to avoid excess non-toxic heavy chains (Proudfoot, 1986, Nature 322:
52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197). The coding sequences for the heavy and light chains can include cDNA or genomic DNA.

【０１３４】 本発明の改変免疫グロブリン分子は、一旦組換え的に発現されれば、それは、
免疫グロブリン分子の精製のための当業界で公知の任意の方法、例えば、クロマ
トグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインA（Prote
in A）後の特異的抗原に対するアフィニティーによる、及びサイジングカラムク
ロマトグラフィー）、遠心分離、ディファレンシャル溶解性（differential sol
ubility）によって、又はタンパク質の精製のための任意の標準的技術によって 精製できる。The modified immunoglobulin molecules of the present invention, once expressed recombinantly,
Any method known in the art for the purification of immunoglobulin molecules, for example, chromatography (eg, ion exchange, affinity, especially Protein A (Protein A)
in A) after affinity for specific antigen and sizing column chromatography), centrifugation, differential sol
ubility) or by any standard technique for protein purification.

【０１３５】 5.5. 治療的有用性の実証 本発明の改変抗体は、特定疾患の治療又は予防の有効性について、多様な方法
でスクリーニング又はアッセイできる。5.5. Demonstrating Therapeutic Utility The engineered antibodies of the invention can be screened or assayed for efficacy in treating or preventing a particular disease in a variety of ways.

【０１３６】 最初に、本発明の改変抗体を含むワクチン製剤の免疫潜在力（immunopotency ）は、ワクチンで免疫された試験動物の抗イディオタイプ応答をモニタリングす
ることによって測定できる。体液性応答の発生は、一般化された免疫応答の表れ
（indication）として起き、そしてその他の成分、特に細胞媒介免疫は、疾患に
対する防御にとって重要であろう。試験動物には、マウス、ウサギ、チンパンジ
ー及び結局のところヒト被験者を含む。本発明で作られるワクチンは、実験的に
チンパンジーに感染させるために作ることができる。しかしながら、チンパンジ
ーは、保護された種であるため、本発明のワクチンに対する抗体応答は、チンパ
ンジーでの有効性研究に用いるための、1個か2個の最良の候補免疫グロブリン分
子又は免疫グロブリン分子の最良の組み合わせを見出すことを目的として、多数
のより小さい、より高価でない動物で、先ず研究することができる。First, the immunopotency of a vaccine formulation comprising the modified antibodies of the invention can be measured by monitoring the anti-idiotypic response of test animals immunized with the vaccine. The development of a humoral response occurs as an indication of a generalized immune response, and other components, especially cell-mediated immunity, may be important for protection against disease. Test animals include mice, rabbits, chimpanzees and eventually human subjects. The vaccine made in the present invention can be made to experimentally infect chimpanzees. However, because chimpanzees are a protected species, the antibody response to the vaccines of the present invention will result in one or two of the best candidate immunoglobulin or immunoglobulin molecules to be used for efficacy studies in chimpanzees. A number of smaller, less expensive animals can be studied first with the aim of finding the best combination.

【０１３７】 被験者の免疫応答は、得られた免疫血清の抗体に対する反応性を、公知技術、
例えば、固相酵素免疫検定法（ELISA）、イムノブロット、放射免疫沈降法（rad
ioimmunoprecipitations）等によってアッセイするか；又は免疫宿主の感染から
の保護及び／又は疾患症状の減弱などの、種々のアプローチによって分析できる
。The immune response of a subject is determined by measuring the reactivity of the obtained immune serum to the antibody by a known technique,
For example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot, radioimmunoprecipitation (rad)
ioimmunoprecipitations) or can be analyzed by a variety of approaches, such as protecting the immunized host from infection and / or attenuating disease symptoms.

【０１３８】 好適な動物試験の1例として、本発明のワクチン組成物を、改変免疫グロブリ ン分子に対する抗イディオタイプ応答を誘導する能力についてウサギで試験でき
る。例えば、雄の特定病原体未感染の（SPF）若年成獣ニュージーランドホワイ トウサギを使用できる。試験群のそれぞれのウサギには、ワクチンの有効量を与
える。対照群のウサギには、自然に生じた抗体を含むワクチンの1 mMトリス−塩
酸 pH 9.0を注射する。血液サンプルは、1又は2週間毎にウサギから採取され、 血清を改変免疫グロブリン分子に対する抗イディオタイプ抗体及び改変抗体が指
向する（directed）抗原に対して特異的な抗−抗イディオタイプ抗体について、
例えば、ラジオイムノアッセイ（Abbott Laboratories社製）を用いて分析でき る。抗イディオタイプ抗体の存在は、ELISAを用いてアッセイできる。ウサギは それらの異系交配のために可変の応答を与え得るので、マウスでワクチンを試験
するのも有用だろう。As an example of a suitable animal test, the vaccine compositions of the present invention can be tested in rabbits for the ability to induce an anti-idiotypic response to the modified immunoglobulin molecule. For example, male specific pathogen-free (SPF) young adult New Zealand white rabbits can be used. Each rabbit in the test group receives an effective dose of the vaccine. Rabbits in the control group are injected with a vaccine containing naturally occurring antibodies, 1 mM Tris-HCl pH 9.0. Blood samples are taken from rabbits every one or two weeks and the serum is subjected to anti-idiotype antibodies directed against the modified immunoglobulin molecule and anti-anti-idiotype antibodies specific for the antigen directed to the modified antibody.
For example, it can be analyzed using a radioimmunoassay (Abbott Laboratories). The presence of anti-idiotype antibodies can be assayed using ELISA. It may also be useful to test the vaccine in mice, as rabbits can give a variable response due to their outcrossing.

【０１３９】 さらに、本発明の改変抗体は、動物又はヒトのいずれかの、最初に被験者に改
変抗体を投与し、次いで、注射された改変抗体に対する抗イディオタイプ応答の
一部として生産される抗−抗イディオタイプ抗体（すなわち、Ab3抗体）を単離 することによって試験できる。次いで、単離されたAb3は、特定抗原（例えば、 腫瘍抗原、感染症薬の抗原）への結合能力について、当業界で公知の任意のイム
ノアッセイ、例えば、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA 、「サンドイッチ」イムノアッセイ、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエ
スタンブロット、沈殿反応、凝集（agglytination）アッセイ、補体結合アッセ イ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等によっ て試験できる。In addition, the modified antibodies of the present invention can be produced by first administering the modified antibody to a subject, either an animal or a human, and then producing the antibody as part of an anti-idiotypic response to the injected modified antibody. -Can be tested by isolating anti-idiotypic antibodies (ie Ab3 antibodies). The isolated Ab3 can then be used to bind any specific antigen (eg, tumor antigen, infectious agent antigen) to any immunoassay known in the art, including, but not limited to, radioimmunoassay, ELISA Tested by “sandwich” immunoassay, in-gel sedimentation reaction, immunodiffusion assay, Western blot, sedimentation reaction, agglytination assay, complement binding assay, immunofluorescence assay, protein A assay, immunoelectrophoresis assay, etc. it can.

【０１４０】 改変抗体が癌又は腫瘍抗原に指向するある態様では、癌、腫瘍、又は他の新生
物疾患を治療する単離Ab3の有効性は、患者由来の癌又は腫瘍細胞を培養し、そ の細胞を、試験されるAb3抗体に接触させ、接触された細胞の増殖又は生存と、A
b3抗体と接触されていない細胞の増殖又は生存とを比較することによってスクリ
ーニングされ、接触された細胞の増殖又は生存の方が低いレベルであるというこ
とは、（本発明の改変抗体による免疫によって誘導された）Ab3抗体が患者の癌 の治療に有効であることを示す。当業界で標準の多くのアッセイが、そのような
生存率及び／又は増殖を評価するのに使用でき；例えば、細胞増殖は、3H−チミ
ジン取り込みを測定することによって、直接細胞計数によって、プロト癌遺伝子
（例えば、fos、myc）又は細胞周期マーカーなどの既知遺伝子の転写活性の変化
を検出することによってアッセイでき；細胞生存能力（viability）は、トリパ ンブルー染色によってアッセイでき、分化は、形態学等における変化に基づき視
覚的にアッセイできる。もし、改変抗体が感染症薬の抗原に指向するなら、単離
Ab3は、特定病原体に対する活性について任意のin vitro試験で活性を試験でき る。In some embodiments, wherein the engineered antibody is directed against a cancer or tumor antigen, the effectiveness of the isolated Ab3 in treating a cancer, tumor, or other neoplastic disease is to cultivate cancer or tumor cells from the patient. Are contacted with the Ab3 antibody to be tested, and the growth or survival of the contacted cells and A
The lower level of proliferation or survival of the contacted cells was screened by comparing the growth or survival of the cells that were not contacted with the b3 antibody. Shows that Ab3 antibodies are effective in treating cancer in patients. Many assays standard in the art can be used to assess such viability and / or proliferation; for example, cell proliferation is measured by measuring 3 H-thymidine incorporation, by direct cell counting, Changes in transcriptional activity of known genes, such as oncogenes (eg, fos, myc) or cell cycle markers, can be assayed; cell viability can be assayed by trypan blue staining, and differentiation can be assessed by morphology. Etc., and can be visually assayed based on changes in If the modified antibody is directed against the antigen of the infectious agent, isolate
Ab3 can be tested for activity in any in vitro test for activity against a particular pathogen.

【０１４１】 さらに、本発明の改変抗体はまた、in vivoで直接試験することもできる。本 発明の治療薬の効果をモニタリングするためには、改変抗体が指向する抗原の濃
度を、治療の前、間又は後の好適な時間間隔で測定する。抗原の量の何らかの変
化又は変化が無いことを同定し、被験者に関する治療の効果と相互に関連づける
ことができる。In addition, the modified antibodies of the present invention can also be tested directly in vivo. To monitor the effect of the therapeutic of the present invention, the concentration of the antigen directed by the modified antibody is measured at suitable time intervals before, during or after the treatment. Any change or no change in the amount of antigen can be identified and correlated with the effect of the treatment on the subject.

【０１４２】 特に、癌治療薬の場合、抗原の血清濃度は、乳癌などの、癌の重篤度、及び水
準以下の予後（poor prognosis）と直接関係している。一般に、抗原の濃度の低
下は、有効な治療と関係している。[0142] In particular, in the case of cancer therapeutics, the serum concentration of the antigen is directly related to the severity of the cancer, such as breast cancer, and poor prognosis. In general, a decrease in the concentration of an antigen is associated with an effective treatment.

【０１４３】 改変抗体が感染症薬の抗原に指向する場合、該改変抗体の有効性は、感染症薬
の抗原の濃度を、治療の前、間及び後の好適な時間に測定することによってモニ
タリングでき、抗原の濃度の低下は、改変抗体が有効であることを示す。Where the engineered antibody is directed against an antigen of the infectious agent, the effectiveness of the engineered antibody is monitored by measuring the concentration of the antigen of the infectious agent at appropriate times before, during, and after treatment. A possible decrease in the concentration of the antigen indicates that the modified antibody is effective.

【０１４４】 好ましい態様では、採用され得るアプローチは、異なる時点での抗原濃度の測
定及びこれらの値と、基準線濃度（baseline level）との比較である。基準線濃
度は、正常な、疾患に罹患していない個体中に存在するマーカー濃度；及び／又
は治療前、又は疾患の軽減している（remission）間、若しくは安定な期間の間 に存在する濃度のいずれかであり得る。そして、これらの濃度は、疾患の経過又
は治療の成果と関係づけることができる。In a preferred embodiment, approaches that can be taken are determination of antigen concentrations at different time points and comparison of these values with a baseline level. The baseline concentration is the concentration of the marker present in normal, non-diseased individuals; and / or the concentration present before treatment, or during remission of the disease, or during a stable period. May be any of These concentrations can then be related to the course of the disease or the outcome of the treatment.

【０１４５】 抗原濃度は、当業界で周知の任意の方法によって測定できる。例えば、ある抗
原は、ある抗原に対する任意の抗体を使用するウエスタンブロッティング免疫沈
降法などの公知の免疫診断法によって定量できる。[0145] Antigen concentration can be measured by any method known in the art. For example, an antigen can be quantified by a known immunodiagnostic method such as Western blotting immunoprecipitation using any antibody against the antigen.

【０１４６】 改変免疫グロブリンに対するin vivoでの免疫応答の強度は、当業界で公知の 任意の方法、例えば、これらに限定されないが、遅延型過敏症皮膚試験及びin v
itroでの細胞溶解性T−リンパ球活性のアッセイによって測定できる。The strength of the in vivo immune response to the modified immunoglobulin can be determined by any method known in the art, including, but not limited to, delayed hypersensitivity skin tests and in v
It can be measured by an assay for cytolytic T-lymphocyte activity in an itro.

【０１４７】 遅延型過敏症皮膚試験は、全体的な（overall）免疫能力及び抗原に対する細 胞性免疫の試験において非常に価値がある。皮膚試験の適切な技術は、抗原が、
滅菌4℃で貯蔵され、光から保護され、使用の直前に再構成されることを必要と する。25−又は27−ゲージニードルは、抗原の皮下よりもむしろ、皮内投与を確
実にする。抗原の皮内投与の24及び48時間後、紅斑及び硬結の両者の最大の寸法
（dimensions）を、定規で測定する。任意の与えられた抗原又は抗原群に対する
活性低下（hypoactivity）は、より高い濃度の抗原による試験によって、又は、
曖昧な状況では、媒介物試験による反復試験によって確認される。The delayed-type hypersensitivity skin test is of great value in testing for overall immunity and cellular immunity to antigens. An appropriate technique for skin testing is that the antigen
Stored at 4 ° C sterile, protected from light, and needs to be reconstituted immediately before use. A 25- or 27-gauge needle ensures intradermal rather than subcutaneous administration of the antigen. At 24 and 48 hours after intradermal administration of the antigen, the largest dimensions of both erythema and induration are measured with a ruler. Hypoactivity for any given antigen or group of antigens may be determined by testing with higher concentrations of the antigen, or
Ambiguous situations are confirmed by repeated testing with the vehicle test.

【０１４８】 細胞溶解性T−リンパ球の活性を試験するには、例えば、Ficoll-Hypaque遠心 分離濃度勾配技術によって、免疫された被験者から単離されたT−リンパ球を、1
0％ウシ胎児血清を含むRPMI培地3 ml中の、改変抗体が指向する抗原を有する細 胞で再刺激する。幾つかの実験では、培養培地中に33％の二次混合リンパ球培養
物上清又はIL-2がT細胞増殖因子の供給源として含まれている。免疫後の細胞溶 解性T−リンパ球の一次応答を測定するために、単離T細胞を、抗原を有する細胞
と共に又はそれ無しで培養する。6日後、培養物を4時間の51Cr放出アッセイで、
細胞傷害性について試験する。もし、免疫が有効であったならば、標的の自然に
起きる51Cr放出は、20％未満の濃度に達するはずである（Heikeら, J. Immunoth
erapy 15:15-174）。To test the activity of cytolytic T-lymphocytes, T-lymphocytes isolated from the immunized subject can be isolated, for example, by Ficoll-Hypaque centrifugation gradient technique, for 1 hour.
Restimulate with cells containing the antigen directed by the modified antibody in 3 ml of RPMI medium containing 0% fetal calf serum. In some experiments, 33% of secondary mixed lymphocyte culture supernatant or IL-2 is included in the culture medium as a source of T cell growth factor. To determine the primary response of cytolytic T-lymphocytes after immunization, isolated T cells are cultured with or without antigen-bearing cells. After 6 days, cultures were assayed in a 4 hour 51 Cr release assay.
Test for cytotoxicity. If the immunization was effective, the naturally occurring 51 Cr release of the target should reach concentrations of less than 20% (Heike et al., J. Immunoth
erapy 15: 15-174).

【０１４９】 他の態様では、改変免疫グロブリンは、改変抗体が指向する抗原と関係する特
定の疾患又は症状からの改善又は回復について被験者をモニタリングすることに
よって有効性を試験できる。改変抗体が腫瘍又は癌抗原に指向する場合、特定の
腫瘍又は癌の進行は、癌又は腫瘍をモニタリングするための任意の公知の診断又
はスクリーニング方法によって追跡できる。例えば、限定するつもりはないが、
癌又は腫瘍の進行は、特定の癌又は腫瘍抗原（又は特定の癌又は腫瘍と関係する
もう１つの抗原）の濃度を、被験者の血清中でアッセイすることによって又は抗
原に特異的な標識抗体を注射することによってのいずれかでモニタリングできる
。さらに、コンピュータ断層撮影（CT）スキャン又は超音波診断器などの他の映
像化手法、又は任意の他の映像化方法が、癌又は腫瘍の進行のモニタリングに使
用できる。生検も実施できる。ヒトでそのような試験を行う前に、改変免疫グロ
ブリンの有効性試験を、特定の癌又は腫瘍の動物モデルで実施できる。In another aspect, the modified immunoglobulins can be tested for efficacy by monitoring a subject for improvement or recovery from a particular disease or condition associated with the antigen directed by the modified antibody. Where the modified antibodies are directed against a tumor or cancer antigen, the progress of a particular tumor or cancer can be followed by any known diagnostic or screening method for monitoring a cancer or tumor. For example, we don't intend to limit,
The progression of a cancer or tumor can be determined by assaying the concentration of a particular cancer or tumor antigen (or another antigen associated with a particular cancer or tumor) in the serum of a subject or by using a labeled antibody specific for the antigen. It can be monitored either by injection. In addition, other imaging techniques, such as a computed tomography (CT) scan or an ultrasound system, or any other imaging method can be used to monitor the progress of a cancer or tumor. A biopsy can also be performed. Prior to conducting such tests in humans, efficacy testing of the modified immunoglobulins can be performed in animal models of certain cancers or tumors.

【０１５０】 感染症の場合、改変抗体の有効性は、該改変抗体を被験者（ヒト被験者又はそ
の疾患の動物モデルのいずれか）に投与し、次いで、特定の感染症薬の濃度又は
特定感染症の症状のいずれかをモニタリングすることによってアッセイできる。
感染症薬の濃度は、感染症薬濃度をアッセイするための当業界で公知の任意の方
法、例えば、ウイルスである場合には、ウイルス力価、又は細菌濃度（例えば、
患者からのサンプルの培養によって）等によって測定できる。感染症薬濃度はま
た、改変免疫グロブリンが指向する抗原又は感染症薬のもう１つの抗原の濃度を
測定することによって決定することもできる。感染症薬濃度の低下又は感染症症
状の改善は、改変抗体が有効であることを示している。In the case of infectious disease, the effectiveness of the modified antibody may be determined by administering the modified antibody to a subject (either a human subject or an animal model of the disease) and then administering the concentration of a particular infectious agent or a particular infectious disease. Can be assayed by monitoring any of the symptoms.
The concentration of the infectious agent can be determined by any method known in the art for assaying infectious agent concentrations, such as the viral titer if a virus, or the bacterial concentration (eg,
(By culturing a sample from a patient). The infectious agent concentration can also be determined by measuring the concentration of the antigen to which the modified immunoglobulin is directed or another antigen of the infectious agent. A decrease in infectious drug concentration or an improvement in infectious disease symptoms indicates that the modified antibody is effective.

【０１５１】 6．実施例：大腸癌に対する抗イディオタイプワクチンインデューサー 本実施例は、モノクローナル抗体MAb31.1（ハイブリドーマ分泌Mab31.1は、受
託番号第HB12314号として、American Type Tissue Collectionから入手できる）
から誘導された改変抗体の構築を記載する。Mab31.1は、ヒト大腸癌によって発 現される抗原を認識する。Mab31.1に基づく、本発明の改変抗体は、アラニンに よって置換されたＨ鎖及びＬ鎖の可変領域の両者からなる可変領域システイン残
基を有するように設計された。従って、得られた改変抗体は、Ｈ鎖及びＬ鎖可変
領域のいずれかで鎖内ジスルフィド結合を欠いている。6. Example: Anti-idiotype vaccine inducer against colorectal cancer This example demonstrates monoclonal antibody MAb31.1 (Hybridoma secreted Mab31.1 is available from the American Type Tissue Collection under accession number HB12314).
The construction of a modified antibody derived from is described. Mab 31.1 recognizes an antigen expressed by human colon cancer. The modified antibodies of the present invention, based on Mab 31.1, were designed to have a variable region cysteine residue consisting of both the heavy and light chain variable regions replaced by alanine. Thus, the resulting modified antibodies lack intrachain disulfide bonds in either the H chain or L chain variable regions.

【０１５２】 6.1. 改変抗体の構築 改変抗体の構築のためのストラテジーは、鎖内ジスルフィド結合に重要である
ことが知られている、特定のシステイン残基がアラニンに改変されている、Ｈ鎖
及びＬ鎖可変領域をコードする２つの設計された遺伝子を構築することであった
。アラニン残基は、Mab31.1から誘導された抗体のＨ鎖可変領域の22位及び92位 で、又はMab31.1から誘導された抗体のMab31.1Ｌ鎖可変領域の23位及び88位で、
システイン残基を置換していた。これらの設計された遺伝子を構築するために、
オリゴヌクレオチドのグループを（下記で検討するように）組み立て、定常領域
を提供する適当なベクター中に挿入した。6.1. Construction of Modified Antibodies Strategies for the construction of modified antibodies are known to be important for intrachain disulfide bonds, where certain cysteine residues have been modified to alanine, heavy chains and The goal was to construct two designed genes encoding the light chain variable region. The alanine residues are at positions 22 and 92 of the heavy chain variable region of the antibody derived from Mab 31.1, or at positions 23 and 88 of the Mab 31.1 light chain variable region of the antibody derived from Mab 31.1.
A cysteine residue has been substituted. To construct these designed genes,
Groups of oligonucleotides were assembled (as discussed below) and inserted into a suitable vector providing the constant region.

【０１５３】 鎖内ジスルフィド結合を欠損したCDRをコードする可変領域遺伝子を構築する ために、次のストラテジーを実行した。To construct a variable region gene encoding CDRs lacking intrachain disulfide bonds, the following strategy was performed.

【０１５４】 最初に、単鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングして、付着性の２本鎖DNA断 片（図10、ステップ１に図示したように）を作った。具体的には、目的の配列に
相当する、20塩基でオーバーラップする領域を有する長さ約80塩基のオリゴヌク
レオチドを、Geno Sys Biotech Inc.社の自動化技術を使用して合成した。これ らのオリゴヌクレオチドの具体的な配列を、図9A及び9Bに示す。図9Aは、2CAVHC
OL1と呼ばれるＨ鎖可変領域遺伝子を設計するのに使用される10オリゴのグルー プをリストしている。2CAVHCOL1は、コンセンサスＨ鎖可変領域遺伝子と比べ、2
個のシステイン残基を欠損していた。図9Bは、2CAVLCOL1と呼ばれるＬ鎖可変領 域遺伝子の設計に使用される12オリゴのグループをリストしている。2CAVLCOL1 は、コンセンサスＬ鎖可変領域遺伝子と比べ、2個のシステイン残基を欠損して いた。オリゴを所望の遺伝子に組み合わせるために、10又は12オリゴのグループ
を、下記のように、そして図10（図10に示されたオリゴ1〜10の正体は、表5で提
供される）に示されるように組み合わせた。組み合わせる前に、各オリゴヌクレ
オチドは、次のように5'リン酸化された：各オリゴ25μlをT4ポリヌクレオチド キナーゼ及び50 mM ATPの存在下に37℃で1時間インキュベートした。70℃で5分 間加熱して反応を停止させ、次いで、エタノール沈殿させた。一旦リン酸化され
れば、次いで、図10に示す、相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ1＋オリゴ10 、オリゴ2＋オリゴ9、オリゴ3＋オリゴ8、オリゴ4＋オリゴ7、オリゴ5＋オリゴ6
）を、滅菌マイクロ遠心分離チューブ中で混合し、水浴中65℃で5分間チューブ を加熱してアニーリングし、次いで、室温で30分冷却した。アニーリングにより
、付着末端を有する短い２本鎖DNA断片が得られた。First, single-stranded oligonucleotides were annealed to create cohesive double-stranded DNA fragments (as shown in FIG. 10, step 1). Specifically, an oligonucleotide having a length of about 80 bases and having a region overlapping with 20 bases, which corresponds to the target sequence, was synthesized using an automated technology of Geno Sys Biotech Inc. The specific sequences of these oligonucleotides are shown in FIGS. 9A and 9B. Figure 9A shows 2CAVHC
Lists a group of 10 oligos used to design the heavy chain variable region gene called OL1. 2CAVHCOL1 is compared to the consensus heavy chain variable region gene by 2
Cysteine residues were missing. FIG. 9B lists a group of 12 oligos used to design a light chain variable region gene called 2CAVLCOL1. 2CAVLCOL1 lacked two cysteine residues compared to the consensus light chain variable region gene. To combine the oligos into the desired gene, groups of 10 or 12 oligos are shown below and in FIG. 10 (the identity of oligos 1-10 shown in FIG. 10 is provided in Table 5). Combined to be. Before combining, each oligonucleotide was 5 ′ phosphorylated as follows: 25 μl of each oligo was incubated for 1 hour at 37 ° C. in the presence of T4 polynucleotide kinase and 50 mM ATP. The reaction was stopped by heating at 70 ° C. for 5 minutes, followed by ethanol precipitation. Once phosphorylated, the complementary oligonucleotides (oligo 1 + oligo 10, oligo 2 + oligo 9, oligo 3 + oligo 8, oligo 4 + oligo 7, oligo 5 + oligo 6) shown in FIG.
) Was mixed in a sterile microcentrifuge tube, annealed by heating the tube in a water bath at 65 ° C for 5 minutes, and then cooling at room temperature for 30 minutes. Annealing resulted in a short double-stranded DNA fragment with cohesive ends.

【０１５５】 次に、付着性２本鎖DNA断片を、設計された可変領域遺伝子が組み立てられる まで、より長い鎖に連結した（図10、ステップ2〜4）。具体的には、付着性２本
鎖DNA断片を、T4 DNAリガーゼ及び10 mM ATPの存在下に、16℃に維持された水浴
中で2時間連結させた。アニーリングされたオリゴ1/10をアニーリングされたオ リゴ2/9と混合し、アニーリングされたオリゴ3/8をアニーリングされたオリゴ4/
7と混合した。得られたオリゴを、オリゴ1/10/2/9及びオリゴ3/8/4/7と名付けた
。次に、オリゴ3/8/4/7をオリゴ5/6に連結した。次いで、得られたオリゴ3/8/4/
7/5/6をオリゴ1/10/2/9に連結し、全長の可変領域遺伝子を得た。Next, the cohesive double-stranded DNA fragment was ligated to a longer strand until the designed variable region gene was assembled (FIG. 10, steps 2-4). Specifically, the adherent double-stranded DNA fragments were ligated in the presence of T4 DNA ligase and 10 mM ATP for 2 hours in a water bath maintained at 16 ° C. Mix the annealed Oligo 1/10 with the annealed Oligo 2/9 and replace the annealed Oligo 3/8 with the annealed Oligo 4/9.
Mixed with 7. The resulting oligos were named oligo 1/10/2/9 and oligo 3/8/4/7. Next, oligo 3/8/4/7 was ligated to oligo 5/6. Then the resulting oligo 3/8/4 /
7/5/6 was ligated to oligos 1/10/2/9 to obtain a full-length variable region gene.

【０１５６】 あるいは、12オリゴのグループを使用するときには、付加の順序は：1＋12＝1
/12、2＋11＝2/11、3＋10＝3/10、4＋9＝4/9、5＋8＝5/8、6＋7＝6/7、1/12＋2/
11＝1/12/2/11、3/10＋4/9＝3/10/4/9、5/8＋6/7＝5/8/6/7、1/12/2/11＋3/10/4
/9＝1/12/2/11/3/10/4/9、1/12/2/11/3/10/4/9＋5/8/6/7＝全長の可変領域遺伝 子であった。設計された遺伝子の構築に用いられるオリゴヌクレオチドの名称は
、表5にリストされている。改変Ｈ鎖可変領域遺伝子は、2CAVHCOL1と表示した。
改変Ｌ鎖可変領域遺伝子は、2CAVLCOL1と表示した。Alternatively, when using groups of 12 oligos, the order of addition is: 1 + 12 = 1
/ 12, 2 + 11 = 2/11, 3 + 10 = 3/10, 4 + 9 = 4/9, 5 + 8 = 5/8, 6 + 7 = 6/7, 1/12 + 2 /
11 = 1/12/2/11, 3/10 + 4/9 = 3/10/4/9, 5/8 + 6/7 = 5/8/6/7, 1/12/2/11 + 3/10/4
/ 9 = 1/12/2/11/3/10/4/9, 1/12/2/11/3/10/4/9 + 5/8/6/7 = full-length variable region gene . The names of the oligonucleotides used to construct the designed genes are listed in Table 5. The modified heavy chain variable region gene was designated as 2CAVHCOL1.
The modified L chain variable region gene was designated as 2CAVLCOL1.

【０１５７】 次いで、得られた改変可変領域遺伝子を、ゲル電気泳動によって精製した。未
連結の過剰のオリゴ及び他の不完全なDNA断片を除去するために、連結された生 成物を、110V一定で2時間、1％低融解（low melting）アガロースゲルにかけた 。全長のDNA産物を含む主要なバンドを切り出し、滅菌された1.5 mlの遠心分離 チューブに入れた。アガロースからDNAを遊離させるため、ゲルスライスを40℃ で3時間、f3−アグラーゼ（Agrase）Iによって消化した。−20℃で1時間、0.3 M
NaOAc及びイソプロパノールによる沈殿、次いで、12,000 rpmで15分の遠心分離
によって、DNAを回収した。精製されたDNAペレットを、TEバッファー、pH 8.0の
50μlに再懸濁させた。次いで、設計された可変領域遺伝子を、PCRによって増幅
した。具体的には、設計された可変領域遺伝子100 ngを25 mM dNTP、プライマー
200 ng及びバッファー中の忠実性の高い、熱安定性Pfu DNAポリメラーゼ5Uと混 合した。得られたPCR産物を1％アガロースゲルで分析した。Next, the obtained modified variable region gene was purified by gel electrophoresis. The ligated product was run on a 1% low melting agarose gel at 110V constant for 2 hours to remove excess unligated oligos and other incomplete DNA fragments. The major band containing the full-length DNA product was excised and placed in a sterile 1.5 ml centrifuge tube. Gel slices were digested with f3-Agrase I at 40 ° C. for 3 hours to release DNA from agarose. 0.3 M at -20 ° C for 1 hour
DNA was recovered by precipitation with NaOAc and isopropanol, followed by centrifugation at 12,000 rpm for 15 minutes. Purify the purified DNA pellet with TE buffer, pH 8.0.
Resuspended in 50 μl. Then, the designed variable region gene was amplified by PCR. Specifically, 100 ng of the designed variable region gene was added to 25 mM dNTPs and primers.
200 ng and 5 U of high fidelity, thermostable Pfu DNA polymerase in buffer. The resulting PCR product was analyzed on a 1% agarose gel.

【０１５８】 設計された可変領域遺伝子に相当する精製されたDNAのそれぞれを、続いて、p
UC19細菌性ベクター中に挿入した。pUC19は、2686塩基対の、lacZ中に54塩基対 のポリリンカークローニング部位を含む高コピー数の大腸菌プラスミドベクター
及びAmp（アンピシリン）選択マーカーである。設計された可変領域遺伝子の挿 入のためのベクターを調製するために、10μgのpUC19を、37℃で3時間Hinc II（
50 U）で線状化し、平滑末端配列5' GTCを有するベクターを得た。自己再結合を
防止するために、線状ベクターDNAを、37℃で1時間、ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（CIP）25Uで脱リン酸化した。設計された可変領域遺伝子をpUC19ベクター 中に挿入するために、脱リン酸化線状ベクターDNAの約0.5μgをT4 DNAリガーゼ （1000 U）の存在下に、リン酸化可変領域遺伝子の3μgと混合し、16℃で12時間
インキュベートした。Each of the purified DNAs corresponding to the designed variable region genes was subsequently
Inserted into UC19 bacterial vector. pUC19 is a 2686 bp high copy number E. coli plasmid vector containing a 54 bp polylinker cloning site in lacZ and an Amp (ampicillin) selection marker. To prepare the vector for insertion of the designed variable region gene, 10 μg of pUC19 was added to Hinc II (37 ° C.) for 3 hours.
50 U) to obtain a vector having a blunt-end sequence 5 ′ GTC. To prevent self-ligation, the linear vector DNA was dephosphorylated with 25 U of bovine intestinal alkaline phosphatase (CIP) at 37 ° C. for 1 hour. To insert the designed variable region gene into the pUC19 vector, about 0.5 μg of the dephosphorylated linear vector DNA was mixed with 3 μg of the phosphorylated variable region gene in the presence of T4 DNA ligase (1000 U). And incubated at 16 ° C for 12 hours.

【０１５９】 次いで、設計された可変領域遺伝子を含む細菌性ベクターを、細菌細胞を形質
転換するために使用した。具体的には、新たに調製した完全DH5-α細胞50μlを 、設計された可変領域遺伝子を含むpUC19の1μgと混合し、エレクトロポレーシ ョンキュベット（0.2 cmギャップ；Bio-Rad社製）に移した。各キュベットを、 エレクトロポレーター（Bio-Rad Gene Pulser）中で2.5 kV／200Ω／25μFでパ ルスをかけた（pulsed）。その直後に、SOC培地1 mlを、各キュベットに添加し 、細胞を、37℃で1時間、遠心分離チューブ中で回収した。各形質転換由来の細 胞のアリコートを除去し、1:100に希釈し、次いで100μlを、アンピシリン（Amp
40 μg/ml）を含むLBプレート上にプレーティングした。このプレートを、Amp マーカーの存在のため、37℃で一晩インキュベートした。pUC19ベクターを含む 形質転換体のみが、LB/Ampプレート上で増殖した。[0159] The bacterial vector containing the designed variable region gene was then used to transform bacterial cells. Specifically, 50 μl of freshly prepared complete DH5-α cells were mixed with 1 μg of pUC19 containing the designed variable region gene, and transferred to an electroporation cuvette (0.2 cm gap; Bio-Rad). . Each cuvette was pulsed at 2.5 kV / 200Ω / 25 μF in an electroporator (Bio-Rad Gene Pulser). Immediately thereafter, 1 ml of SOC medium was added to each cuvette and cells were collected in a centrifuge tube at 37 ° C. for 1 hour. An aliquot of cells from each transformation was removed, diluted 1: 100, and 100 μl was added to ampicillin (Amp
(40 μg / ml) on an LB plate. The plate was incubated at 37 ° C. overnight due to the presence of the Amp marker. Only transformants containing the pUC19 vector grew on LB / Amp plates.

【０１６０】 単一の形質転換体コロニーを拾い、37℃で絶え間なく振とうしながら、3 mlの
LB/Amp滅菌ガラスチューブ中で一晩増殖させた。イージープレップカラム（Easy
Prep columns）（Pharmacia Biotech社製）を用いて、プラスミドDNAを単離し 、TEバッファー、pH 7.5の100μl中に懸濁させた。pUC19中の遺伝子挿入物の存 在を確認するために、各コロニーからのプラスミドDNAの25μlを、37℃で1時間 、制限エンドヌクレアーゼで消化し、1％アガロースゲルで分析した。この方法 により、遺伝子挿入物を含むプラスミドDNAは、制限部位（5'..GTCGAC..3'）の 欠失のために、酵素開裂に抵抗性であり、閉環（CC）DNAとして移動したが、挿 入物を有しないそれらのプラスミドは開裂され、線状（L）２本鎖DNA断片として
、ゲル上で移動した。Pick up a single transformant colony and shake 3 ml at 37 ° C. with constant shaking.
Grow overnight in LB / Amp sterile glass tubes. Easy Prep Column (Easy
Plasmid DNA was isolated using Prep columns (Pharmacia Biotech) and suspended in 100 μl of TE buffer, pH 7.5. To confirm the presence of the gene insert in pUC19, 25 μl of plasmid DNA from each colony was digested with restriction endonuclease at 37 ° C. for 1 hour and analyzed on a 1% agarose gel. By this method, plasmid DNA containing the gene insert was resistant to enzymatic cleavage and migrated as closed (CC) DNA due to the deletion of the restriction site (5 '.. GTCGAC..3'). Those plasmids without inserts were cleaved and migrated on a gel as linear (L) double-stranded DNA fragments.

【０１６１】 設計された可変領域遺伝子の正しい遺伝子配列を確認し、構築過程の間に生産
される不要な突然変異の可能性をなくすために、クローンに対しては、M13/pUC リバースプライマー（5'AACAGCTATGACCATG3'）を用いて、並びに、PCR遺伝子産 物に対しては、5'末端20塩基プライマー（5'GAATTCATGGCTTGGGTGTG3'）を用いて
、自動化されたABI377 DNAシーケンサーで、DNAシークエンシングを実施した。 全てのクローンが、正しい配列を含むことが確認された。To confirm the correct gene sequence of the designed variable region gene and to eliminate the possibility of unwanted mutations generated during the construction process, the clone was cloned with the M13 / pUC reverse primer (5 DNA sequencing was performed with an automated ABI377 DNA sequencer using 'AACAGCTATGACCATG3') and, for PCR gene products, using a 5 'terminal 20 base primer (5' GAATTCATGGCTTGGGTGTG3 '). All clones were confirmed to contain the correct sequence.

【０１６２】[0162]

【表５】 [Table 5]

【０１６３】 6.3. 作製した可変領域遺伝子の哺乳動物発現ベクターへの挿入 完全抗体のL鎖は可変領域と定常領域の両方を有する。完全抗体のH鎖は、可変
領域、定常領域およびヒンジ領域を含む。改変型可変領域遺伝子2CAVHCOL1また は2CAVLCOL1を、適切な定常領域を含むベクターに挿入した。L鎖においてシステ
イン残基を欠失している作製した可変領域遺伝子を、pMRRO10.1ベクターに挿入 した(図6A)。pMRRO10.1ベクターにはヒトκL鎖定常領域が含まれていた。作製し
たL鎖可変領域をこのベクターに挿入することにより、完全L鎖配列が得られた。
一方、H鎖においてシステイン残基を欠失している作製した可変領域遺伝子を、p
GAMMA1ベクターに挿入した(図6B)。pGAMMA1ベクターにはヒトおよびIgG1定常領 域およびヒンジ領域配列が含まれていた。作製したH鎖可変領域遺伝子をこのベ クターに挿入することにより、完全H鎖配列が得られた。6.3. Insertion of Generated Variable Region Gene into Mammalian Expression Vector The L chain of the complete antibody has both a variable region and a constant region. The heavy chain of a complete antibody contains the variable, constant and hinge regions. The modified variable region gene 2CAVHCOL1 or 2CAVLCOL1 was inserted into a vector containing an appropriate constant region. The prepared variable region gene lacking a cysteine residue in the L chain was inserted into the pMRRO10.1 vector (FIG. 6A). The pMRRO10.1 vector contained a human kappa light chain constant region. By inserting the prepared L chain variable region into this vector, a complete L chain sequence was obtained.
On the other hand, the prepared variable region gene lacking a cysteine residue in the H chain was replaced with p
It was inserted into the GAMMA1 vector (FIG. 6B). The pGAMMA1 vector contained human and IgG1 constant and hinge region sequences. The complete H chain sequence was obtained by inserting the prepared H chain variable region gene into this vector.

【０１６４】 H鎖遺伝子とL鎖遺伝子の両方を含む哺乳動物ベクターを作製するために、完全
L鎖配列および完全H鎖配列を、図6Cに示したように哺乳動物発現ベクターpNEPuD
GVに挿入した(Bebbington, C.R., 1991, In METHODS: A Companion to Methods
in Enzymology, 第2巻, pp.136-145)。得られたベクターは、改変型抗体のL鎖お
よびH鎖の両方をコードする。To create a mammalian vector containing both heavy and light chain genes,
The light chain sequence and the complete heavy chain sequence were converted to the mammalian expression vector pNEPuD as shown in FIG.
(Bebbington, CR, 1991, In METHODS: A Companion to Methods
in Enzymology, Vol. 2, pp. 136-145). The resulting vector encodes both the L and H chains of the modified antibody.

【０１６５】 6.4. 哺乳動物細胞における合成改変型抗体の発現 組み立てた抗体の産生を調べるために、哺乳動物発現ベクターをCOS細胞にト ランスフェクトした。COS細胞(起点欠損SV40ウイルスで形質転換されたアフリカ
ミドリザル腎細胞系CV-1)を合成抗体の短期一過性発現に用いた。というのは、 このCOS細胞はSV40複製起点を含む環状プラスミドをコピー数がかなり多くなる まで複製する能力を有するからである。抗体発現ベクターをC0S7細胞(American
Type Culture Collectionから入手)に移入した。トランスフェクトされた細胞を
ダルベッコ改良イーグル培地中で増殖させ、カルシウム沈殿法(Sullivanら, FEB
S Lett. 285:120-123, 1991)を用いて発現ベクターでトランスフェクトした。ト
ランスフェクトした細胞を72時間培養し、その後上清を回収した。トランスフェ
クトCOS細胞から得た上清をELISA法を用いて組み立てたIgGについてアッセイし た。ELISAには、抗ヒトIgG Fcでコーティングした96ウェルプレート上へのサン プルおよび標準物質の捕獲が含まれる。結合した組み立てIgGを、西洋ワサビペ ルオキシダーゼ(HRP)に連結した抗ヒトκ鎖および基質であるテトラメチルベン ジジン(TMB)を用いて検出した。発色現象は、サンプル中に存在する組み立て抗 体の量に比例していた。6.4. Expression of Synthetic and Modified Antibodies in Mammalian Cells To examine the production of assembled antibodies, mammalian expression vectors were transfected into COS cells. COS cells (African green monkey kidney cell line CV-1 transformed with origin-deficient SV40 virus) were used for short-term transient expression of synthetic antibodies. This is because the COS cells have the ability to replicate the circular plasmid containing the SV40 origin of replication until the copy number is significantly higher. The antibody expression vector was transferred to C0S7 cells (American
Type Culture Collection). The transfected cells are grown in Dulbecco's modified Eagle's medium and subjected to calcium precipitation (Sullivan et al., FEB
S Lett. 285: 120-123, 1991). The transfected cells were cultured for 72 hours, after which the supernatant was collected. Supernatants from transfected COS cells were assayed for assembled IgG using ELISA. ELISA involves capture of samples and standards on 96-well plates coated with anti-human IgG Fc. Bound assembled IgG was detected using horseradish oxidase (HRP) -linked anti-human kappa chain and the substrate tetramethylbenzidine (TMB). The color development was proportional to the amount of assembled antibody present in the sample.

【０１６６】 6.5. ヒト大腸癌細胞およびこれらの細胞により産生された抗原へ免疫特異的に 結合する改変型抗体 上記の第6.4節に示したように、改変型抗体を発現させ、単離した。次いで、 その結合能および特異性をLS-174T細胞WiDR細胞(ヒト大腸癌細胞系)およびこれ らの細胞から誘導された抗原を用いてアッセイした。6.5. Modified Antibodies that Immunospecifically Bind to Human Colorectal Cancer Cells and Antigens Produced by These Cells As described in Section 6.4 above, modified antibodies were expressed and isolated. The binding capacity and specificity were then assayed using LS-174T cell WiDR cells (human colon cancer cell line) and antigens derived from these cells.

【０１６７】 MA31.1結合の結合力および特異性を調べるために、ドットブロット分析を行っ
た(図11を参照されたい)。LS-174T細胞由来の膜調製物を、Bio-Blot装置(Bio-Ra
d)を用いてニトロセルロース膜に塗布した。非特異的結合をブロックした。脱脂
乳を用いてウェルを非特異的結合に対してブロックした。Mab31.1から誘導した ビオチン化抗体を全ウェル中でインキュベートした。次いで、非標識抗体を0.00
3〜20nMの濃度でニトロセルロース膜に塗布してインキュベートした。非結合抗 体を洗浄により膜から除去し、第二抗体であるアルカリホスファターゼ標識抗ヒ
トIgGを加えた。最後に、暗紫色の沈殿を生じさせるアルカリホスファターゼ基 質を加えたところ結合した標識抗体の存在が示された。図11にドットブロット分
析の結果を示す。この図により、標識抗体がLS-174T細胞に結合していることが 示された。さらに、非標識抗体はビオチン化抗体結合と競合したが、これはMab3
1.1から誘導された抗体の腫瘍細胞抗原への結合の特異性を示すものである。To determine the binding strength and specificity of MA31.1 binding, a dot blot analysis was performed (see FIG. 11). The membrane preparation from LS-174T cells was transferred to a Bio-Blot device (Bio-Ra
d) was applied to a nitrocellulose membrane. Non-specific binding was blocked. Wells were blocked for non-specific binding using skim milk. Biotinylated antibodies derived from Mab 31.1 were incubated in all wells. Then, unlabeled antibody was added to 0.00
It was applied to a nitrocellulose membrane at a concentration of 3 to 20 nM and incubated. Unbound antibody was removed from the membrane by washing, and a secondary antibody, alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG, was added. Finally, the addition of an alkaline phosphatase substrate that produces a dark purple precipitate indicated the presence of bound labeled antibody. FIG. 11 shows the results of the dot blot analysis. This figure showed that the labeled antibody was bound to LS-174T cells. In addition, unlabeled antibody competed with biotinylated antibody binding,
FIG. 4 shows the specificity of binding of antibodies derived from 1.1 to tumor cell antigens.

【０１６８】 6.6. 抗イディオタイプ応答 LS-174T細胞への改変型抗体の結合における効果を競合結合アッセイで調べた 。LS-174T細胞は、Mab31.1抗体により認識される抗原を発現するヒト大腸癌細胞
である。Mab31.1抗体のCDRの一つの配列を含むペプチドを作製した。これらのペ
プチド、改変型抗体およびMab31.1から誘導された対照抗体を、Mab31.1のCDR領 域およびそれらの抗体に対する抗血清を生じさせるためにマウスに投与した。注
射の2週間後と4週間後にマウスから血液サンプルを採取した。免疫化マウスから
得た抗血清を、図12AおよびBに示した結合競合アッセイに用いた。6.6. The effect on binding of the modified antibody to anti-idiotype responsive LS-174T cells was examined in a competitive binding assay. LS-174T cells are human colon cancer cells that express the antigen recognized by the Mab31.1 antibody. A peptide containing one CDR sequence of the Mab31.1 antibody was prepared. These peptides, modified antibodies and control antibodies derived from Mab31.1 were administered to mice to raise the CDR regions of Mab31.1 and antisera to those antibodies. Blood samples were collected from the mice two and four weeks after injection. Antisera from immunized mice were used in the binding competition assays shown in FIGS. 12A and B.

【０１６９】 抗血清およびビオチン化抗体を、そのLS-174細胞に結合する能力についてアッ
セイした。図12AおよびBに示されているように、CDR3およびCDR4ペプチドに対し
て生じた抗血清は、LS-174T細胞に対する対照抗体(Mab31.1から誘導された抗体 ）結合と劇的に競合した。さらに、CDR1およびCDR2に対して生じた抗血清もLS-1
74T細胞への対照抗体結合と有意に競合した。さらに、2CAVHCOL1および2CAVLCOL
1抗体(すなわち可変領域においてシステインのアラニンへの置換を有する改変型
抗体)を注射したマウス由来の抗血清は、Mab31.1から誘導した抗体を注射したマ
ウス由来の抗血清よりもMab31.1から誘導されたビオチン化抗体との結合と良好 に競合した(図12B)。この結果は、可変領域においてシステインのアラニンへの 置換を有する抗体の投与が、可変領域鎖内ジスルフィド結合を有する抗体よりも
大腸癌細胞抗原を認識する抗イディオタイプ抗体を良好に誘発することを示すも
のである。Antisera and biotinylated antibodies were assayed for their ability to bind to LS-174 cells. As shown in FIGS. 12A and B, antisera raised against CDR3 and CDR4 peptides dramatically competed with control antibody (Mab31.1-derived antibody) binding to LS-174T cells. In addition, antisera raised against CDR1 and CDR2 were also LS-1
Significantly competed with control antibody binding to 74T cells. In addition, 2CAVHCOL1 and 2CAVLCOL
Antibodies derived from mice injected with 1 antibody (i.e., modified antibodies having a substitution of cysteine with alanine in the variable region) were more derived from Mab31.1 than from mice injected with antibodies derived from Mab31.1. It competed well with the induced binding to the biotinylated antibody (FIG. 12B). This result indicates that administration of an antibody having a substitution of cysteine with alanine in the variable region elicits better anti-idiotype antibodies that recognize colon cancer cell antigens than antibodies having a variable region intrachain disulfide bond. Things.

【０１７０】[0170]

【表６】 [Table 6]

【０１７１】 実施例７：HMFG-1配列を含む合成改変型抗体の製造 HMFG-1抗体に免疫特異的に結合した抗イディオタイプ抗体を構築した。HMFG-1
は、多形性上皮ムチン(PEM)に結合することが知られた抗体である(Stewartら, 1
990, J. Clin Oncol 8:1941-50; Kosmasら, 1994, Cancer 73:3000-3010)。配列
ProAspThrArgProを有するPEMの抗原決定基を、本発明の方法により可変鎖領域に
挿入した。この短い配列は、ヒト多形性上皮ムチンの高度に免疫原性の領域であ
る(Gendlerら, 1988, J. Biol. Chem. 263:12820-12823)。HMFG-1の残基27A〜27
E(SerLeuLeuTyrSer)(表6)を、上記の第6節や図10にも記載したオリゴヌクレオチ
ド法を用いてProAspThrArgProで置換した。HMFG-1に免疫特異的に結合した抗イ ディオタイプ合成HMFG-1抗体を、HMFG-1のL鎖およびH鎖の可変領域として知られ
た配列を用いて産生させた。オリゴを、1+8=1/8, 2+7=2/7, 3+6=3/6, 4+5=4/5,
1/8+2/7=1/8/2/7, 3/6+4/5=3/6/4/5, 1/8/2/7+3/6/4/5=1/8/2/7/3/6/4/5の順で 加えた。表7には、HMFG-1と種々の共通CDR配列の比較を示す。HMFG-1に関する情
報およびモノクローナル抗体に関する情報は、WO 09/05142(Imperial Cancer Re
search Technology社)に記載されており、ヒト化HMFG-1は、WO 92/04380(Unilev
er)に記載されている。Example 7 Production of Synthetic Modified Antibody Containing HMFG-1 Sequence An anti-idiotype antibody immunospecifically bound to the HMFG-1 antibody was constructed. HMFG-1
Is an antibody known to bind to polymorphic epithelial mucin (PEM) (Stewart et al., 1
990, J. Clin Oncol 8: 1941-50; Kosmas et al., 1994, Cancer 73: 3000-3010). Array
The antigenic determinant of PEM with ProAspThrArgPro was inserted into the variable region by the method of the invention. This short sequence is a highly immunogenic region of human polymorphic epithelial mucin (Gendler et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 12820-12823). Residues 27A-27 of HMFG-1
E (SerLeuLeuTyrSer) (Table 6) was replaced with ProAspThrArgPro using the oligonucleotide method described in Section 6 above and also in FIG. Anti-idiotypic synthetic HMFG-1 antibodies immunospecifically bound to HMFG-1 were generated using sequences known as the variable regions of the HMFG-1 light and heavy chains. Oligos were 1 + 8 = 1/8, 2 + 7 = 2/7, 3 + 6 = 3/6, 4 + 5 = 4/5,
1/8 + 2/7 = 1/8/2/7, 3/6 + 4/5 = 3/6/4/5, 1/8/2/7 + 3/6/4/5 = 1 / Added in order of 8/2/7/3/6/4/5. Table 7 shows a comparison of HMFG-1 and various common CDR sequences. Information on HMFG-1 and information on monoclonal antibodies can be found in WO 09/05142 (Imperial Cancer Re
search Technology) and humanized HMFG-1 is described in WO 92/04380 (Unilev
er).

【０１７２】 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて図13に示したように組み立てた配列を増 幅した。HMFG-1をコードするヌクレオチド配列を含むように構築した、作製した
可変領域遺伝子を図13に示す。作製した可変領域遺伝子を、上記の第6節に記載 したように、抗体産生に適したベクター、例えばpNEPuDGVベクターに挿入した。
作製した遺伝子を構築するための別の方法は、これらに限定するものではないが
、Jayaramanら, 1989, Nucleic Acids Res. 17:4403; Sandhuら, 1992, Bio Tec
hniques 12:14; BarnettおよびErfie, 1990, H. Nucleic Acids Res 18:3094; C
iccarelliら, 1991, Nucleic Acids Res 19:6007; Michaelsら, 1992, Bio Tech
niques 12:45（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載された方法
などを用い得る。The sequence assembled as shown in FIG. 13 was amplified using the polymerase chain reaction (PCR). The prepared variable region gene constructed to include the nucleotide sequence encoding HMFG-1 is shown in FIG. The generated variable region gene was inserted into a vector suitable for antibody production, for example, a pNEPuDGV vector, as described in Section 6 above.
Alternative methods for constructing the generated gene include, but are not limited to, Jayaraman et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 4403; Sandhu et al., 1992, Bio Tec.
hniques 12:14; Barnett and Erfie, 1990, H. Nucleic Acids Res 18: 3094; C
iccarelli et al., 1991, Nucleic Acids Res 19: 6007; Michaels et al., 1992, Bio Tech.
niques 12:45, which are incorporated herein by reference, and the like.

【０１７３】[0173]

【表７】 [Table 7]

【０１７４】 本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態による範囲に限定されるもので
はない。実際、当業者には、上記の記載および添付の図面から、本明細書に記載
したものに加えて本発明の種々の変更が明らかであろう。そのような変更は添付
の特許請求の範囲に入るものである。The present invention is not limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the invention in addition to those described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying figures. Such modifications fall within the scope of the appended claims.

【０１７５】 種々の参考文献が本明細書に引用されているが、これらの開示は参照により全
体として本明細書に組み込まれる。Various references are cited herein, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、免疫グロブリン分子のＬ鎖およびＨ鎖の構造を示す概略図であり、各 鎖はアミノ末端領域(H2N-)に位置する可変領域１つとカルボキシ末端領域(-COOH
)に位置する定常領域１つからなる。FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of an L chain and an H chain of an immunoglobulin molecule. Each chain has one variable region located at an amino terminal region (H 2 N-) and a carboxy terminal region (−). COOH
) Consists of one constant region.

【図２】 図２は、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域(それぞれVLおよびVHと記す)中の４つのフ
レームワーク領域(FR1,FR2,FR3およびFR4)と３つの相補性決定領域(CDR1,CDR2お
よびCDR3)を示すIgGの概略図である。定常領域ドメインは、Ｌ鎖の定常ドメイン
についてはCL、Ｈ鎖の定常領域の３つのドメインについてはCH1、CH2およびCH3 と記す。FabはＬ鎖とＨ鎖両方の可変領域ならびにCLおよびCH1ドメイン含む抗体
断片部分を表す。FcはCH2およびCH3ドメインを含有する定常領域断片を表す。Figure 2, L chain and H chain variable regions (respectively referred to as V L and V H) of the four framework regions (FR1, FR2, FR3 and FR4) and three complementarity determining regions in the ( FIG. 2 is a schematic diagram of an IgG showing CDR1, CDR2 and CDR3). The constant region domains are referred to as C L for the constant domain of the L chain, and as CH 1 , CH 2 and CH 3 for the three domains of the constant region of the H chain. Fab represents the variable region and C L and CH 1 domain including antibody fragments part of both L and H chains. Fc represents a constant region fragment containing the CH 2 and CH 3 domains.

【図３】 図３は、図２に示した抗体の構造の概略図であるが、各ドメイン(それぞれVL,
VH,CL,CH1,CH2,およびCH3と呼ばれるループ構造)が、３次元構造を維持するジス
ルフィド結合(真っ黒の線で示す)により構造的に規定されていることを強調して
描いたものである(Roittら、Immnology, 第２版、London：Gower Medical Publi
shing, 1989, p5.3)。FIG. 3 is a schematic diagram of the structure of the antibody shown in FIG. 2; each domain (V L ,
V H, C L, CH 1 , CH 2, and loop structure) called CH 3, emphasizes that it is structurally defined by a disulfide bond that maintains the three-dimensional structure (indicated by solid black lines) (Roitt et al., Immunology, 2nd edition, London: Gower Medical Publi
shing, 1989, p5.3).

【図４】 図４は、抗イディオタイプカスケードにおける、リガンドに対するイディオタ
イプ抗体(Ab1)から抗イディオタイプ抗体(Ab2)および抗-抗イディオタイプ抗体(
Ab3)への内部イメージの発展を示す概略図である。FIG. 4 shows that in the anti-idiotype cascade, idiotype antibody (Ab1) to anti-idiotype antibody (Ab2) and anti-anti-idiotype antibody (Ab1) against the ligand.
It is a schematic diagram showing development of an internal image to Ab3).

【図５】 図５は、可変領域中のシステイン残基をアラニン残基に置き換えて鎖内ジスル
フィド結合を破壊することによる、免疫グロブリンの可変領域の改変。CH1、CH2
およびCH3は定常領域である。VHはＨ鎖可変領域であり、VLはＬ鎖可変領域であ る。FIG. 5: Modification of immunoglobulin variable regions by replacing cysteine residues in the variable region with alanine residues to break intrachain disulfide bonds. CH1, CH2
And CH3 are the constant regions. VH is the heavy chain variable region, and VL is the light chain variable region.

【図６】 (Ａ)ヒトκＬ鎖定常領域の配列を有する発現ベクターpMRRO 10.1 の構造であ る。(Ｂ)ヒトIgG1定常領域(CH1,CH2,CH3)Ｈ鎖をコードする配列およびヒンジ領 域の配列を含有する発現ベクターpGammalの構造である。(Ｃ)Ｌ鎖のκ定常ドメ インならびにＨ鎖の定常ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列を含有する
発現ベクターpNEPuDGVの構造である。３種のベクターについては全てBebbington
ら、1991, Methods in Enzymology 2:136-145を参照されたい。FIG. 6 (A) shows the structure of an expression vector pMRRO 10.1 having a human κ light chain constant region sequence. (B) Structure of the expression vector pGammal containing the sequence encoding the human IgG1 constant region (CH1, CH2, CH3) H chain and the sequence of the hinge region. (C) Structure of the expression vector pNEPuDGV containing the sequences encoding the kappa constant domain of the L chain and the constant domain and hinge region of the H chain. Bebbington for all three vectors
See 1991, Methods in Enzymology 2: 136-145.

【図７】 (Ａ)共通するＬ鎖可変領域ConVL1のアミノ酸配列および対応するヌクレオチド
配列(リーダー配列を含む)である。(Ｂ)共通するＨ鎖可変領域ConVH1のアミノ酸
配列および対応するヌクレオチド配列(リーダー配列を含む)である。FIG. 7 (A) shows the amino acid sequence of the common L chain variable region ConVL1 and the corresponding nucleotide sequence (including the leader sequence). (B) The amino acid sequence of the common H chain variable region ConVH1 and the corresponding nucleotide sequence (including the leader sequence).

【図８】 (Ａ)23位および88位のシステイン残基がアラニン残基(四角で囲んだ残基)に置
き換えられている、mAb31.1由来の抗体のＬ鎖可変領域の配列である2CAVLCOL1の
アミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を示す。(Ｂ)23位および88位のシ
ステイン残基がアラニン残基(四角で囲んだ残基)に置き換えられている、mAb31.
1由来の抗体のＨ鎖可変領域の配列である2CAVHCOL1のアミノ酸配列および対応す
るヌクレオチド配列を示す。(A) 2CAVLCOL1 which is the sequence of the variable region of the light chain of the mAb31.1-derived antibody in which the cysteine residues at positions 23 and 88 have been replaced with alanine residues (residues enclosed in squares). 1 shows the amino acid sequence and the corresponding nucleotide sequence. (B) mAb31, wherein the cysteine residues at positions 23 and 88 have been replaced by alanine residues (residues in squares).
1 shows the amino acid sequence and corresponding nucleotide sequence of 2CAVHCOL1, which is the sequence of the variable region of the H chain of the antibody derived from 1.

【図９】 (Ａ)ヒト大腸癌抗原に特異的なＨ鎖可変領域遺伝子である2CAVHCOL1を組み立 てる(assemble)のに使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列であ
る。(Ｂ)ヒト大腸癌抗原に特異的なＬ鎖可変領域遺伝子である2CAVLCOL1を組み 立てるのに使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列である。(Ｃ)
ConVL1と称されるＬ鎖共通領域を組み立てるのに使用したオリゴヌクレオチドの
オリゴヌクレオチド配列である。(Ｄ)ConVH1と称されるＨ鎖共通領域を組み立て
るのに使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列である。FIG. 9 (A) shows the oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to assemble 2CAVHCOL1, which is an H chain variable region gene specific for human colon cancer antigen. (B) The oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to assemble 2CAVLCOL1, which is an L chain variable region gene specific for human colon cancer antigen. (C)
This is the oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to assemble the common L chain region called ConVL1. (D) Oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to assemble the H chain common region called ConVH1.

【図１０】 図１０は、ヒト大腸癌抗原に特異的な合成改変型抗体をコードする遺伝子操作
された遺伝子を組み立てるために用いた一般的な工程の概略図である。FIG. 10 is a schematic diagram of the general steps used to assemble a genetically engineered gene encoding a synthetic, modified antibody specific for human colon cancer antigen.

【図１１】 図１１は、mAB31.1から誘導された抗体であるが、そのシステインがアラニン に変更されていない抗体、およびビオチン標識されている同じ抗体の、LS-174T 細胞由来の抗原調製物に対する競合結合アッセイについての結果を示すドットブ
ロットである。非標識抗体の濃度をｎＭ非標識抗体として示す。「blk」レーンは 抗原がないレーンである。FIG. 11 shows an antigen preparation derived from LS-174T cells of an antibody derived from mAB31.1 but whose cysteine has not been changed to alanine, and of the same antibody which has been biotin-labeled. 4 is a dot blot showing the results of a competitive binding assay for. The concentration of unlabeled antibody is shown as nM unlabeled antibody. The "blk" lane is a lane without antigen.

【図１２】 (Ａ)ビヒクルのみ、大腸癌細胞抗体に結合するが改変されていない対照抗体、
ならびにブラジキニン受容体結合部位を含有するCDR配列を有するペプチドCDR1 、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5およびCDR6をワクチン接種したマウス由来の抗血清の
存在下での、LS-174T細胞に対するビオチン標識抗大腸癌細胞抗体の競合結合ア ッセイの結果を、LS-174T細胞への対照結合に対する割合で表したものである。( Ｂ)ビヒクルのみ、大腸癌細胞抗体に結合するが改変されていない対照抗体、2CA
VHCOLI、および2CAVLCOLIをワクチン接種したマウス由来の抗血清の存在下での 、LS-174T細胞に対するビオチン標識抗大腸癌細胞抗体の競合結合アッセイの結 果である。(Ｃ)抗原(黒三角)へのビオチン標識(「ｂ」で示す)抗体(逆向きのＹ)の 結合を示す図である。(Ｄ)抗原(黒塗りの三角)への、抗イディオタイプ抗体(黒 矢印)によるビオチン標識(「ｂ」で示す)抗体(逆向きのＹ)の結合の阻害を示す図 である。FIG. 12 (A) Control antibody that binds to colorectal cancer cell antibody but not vehicle alone,
And biotin-labeled anti-colonic cancer against LS-174T cells in the presence of antisera from mice vaccinated with peptides CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 and CDR6 having a CDR sequence containing a bradykinin receptor binding site The results of the competitive binding assay for cell antibodies are expressed as a percentage of control binding to LS-174T cells. (B) Control antibody, 2CA, which binds to colorectal cancer cell antibody but not vehicle alone
FIG. 3 shows the results of a competitive binding assay of biotin-labeled anti-colorectal cancer cell antibodies to LS-174T cells in the presence of antisera from mice vaccinated with VHCOLI and 2CAVLCOLI. (C) shows the binding of a biotin-labeled (indicated by “b”) antibody (reverse Y) to an antigen (closed triangle). (D) shows the inhibition of the binding of a biotin-labeled (indicated by “b”) antibody (reverse Y) to an antigen (solid triangle) by an anti-idiotype antibody (black arrow).

【図１３】 HMFG1の結合配列を含有するCDRを有するＬ鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る。FIG. 13 is a nucleotide sequence of a light chain variable region having a CDR containing a binding sequence of HMFG1.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１２年６月１５日（２０００．６．１５）[Submission date] June 15, 2000 (2000.6.15)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【特許請求の範囲】[Claims]

【手続補正２】[Procedure amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００４７[Correction target item name] 0047

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００４７】 本発明の他の好適な実施形態において、前記改変抗体の少なくとも１つのCDR は、感染性病原体（例えば後述の第5.2.2節に詳細に記載されたもの）の抗原の ための結合部位、あるいは感染性病原体の細胞受容体のための結合部位のアミノ
酸配列を含む。この場合好ましくは、該結合部位はプラスモディウム(Plasmodiu
m)抗原のアミノ酸配列ではなく、また結合部位Asn-Ala-Asn-Pro（配列番号１） もしくはAsn-Val-Asp-Pro（配列番号２）でもない。さらに他の実施形態におい て、該改変抗体は細菌酵素またはウイルス酵素のための結合部位を含むCDRを有 する。In another preferred embodiment of the invention, the at least one CDR of the modified antibody comprises a binding for an antigen of an infectious agent (eg as described in detail in Section 5.2.2 below). Site or the amino acid sequence of the binding site for the cell receptor of the infectious agent. In this case, preferably, the binding site is Plasmodiu (Plasmodiu).
m) Not the amino acid sequence of the antigen, nor the binding site Asn-Ala-Asn-Pro (SEQ ID NO: 1) or Asn-Val-Asp-Pro (SEQ ID NO: 2). In still other embodiments, the modified antibodies have CDRs that include binding sites for bacterial or viral enzymes.

【手続補正３】[Procedure amendment 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１６１[Correction target item name] 0161

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０１６１】 設計された可変領域遺伝子の正しい遺伝子配列を確認し、構築過程の間に生産
される不要な突然変異の可能性をなくすために、クローンに対しては、M13/pUC リバースプライマー（5'AACAGCTATGACCATG3'）（配列番号３）を用いて、並びに
、PCR遺伝子産物に対しては、5'末端20塩基プライマー（5'GAATTCATGGCTTGGGTGT
G3'）（配列番号４）を用いて、自動化されたABI377 DNAシーケンサーで、DNAシ
ークエンシングを実施した。全てのクローンが、正しい配列を含むことが確認さ
れた。To confirm the correct gene sequence of the designed variable region gene and to eliminate the possibility of unwanted mutations generated during the construction process, the clone was cloned with the M13 / pUC reverse primer (5 'AACAGCTATGACCATG3') (SEQ ID NO: 3) and for the PCR gene product, the 5 'terminal 20 base primer (5' GAATTCATGGCTTGGGTGT
G3 ′) (SEQ ID NO: 4) was used to perform DNA sequencing on an automated ABI377 DNA sequencer. All clones were confirmed to contain the correct sequence.

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１７１[Correction target item name] 0171

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０１７１】 実施例７：HMFG-1配列を含む合成改変型抗体の製造 HMFG-1抗体に免疫特異的に結合した抗イディオタイプ抗体を構築した。HMFG-1
は、多形性上皮ムチン(PEM)に結合することが知られた抗体である(Stewartら, 1
990, J. Clin Oncol 8:1941-50; Kosmasら, 1994, Cancer 73:3000-3010)。配列
ProAspThrArgProを有するPEMの抗原決定基を、本発明の方法により可変鎖領域に
挿入した。この短い配列は、ヒト多形性上皮ムチンの高度に免疫原性の領域であ
る(Gendlerら, 1988, J. Biol. Chem. 263:12820-12823)。HMFG-1の残基27A〜27
E(SerLeuLeuTyrSer)(表7)を、上記の第6節や図10にも記載したオリゴヌクレオチ
ド法を用いてProAspThrArgProで置換した。HMFG-1に免疫特異的に結合した抗イ ディオタイプ合成HMFG-1抗体を、HMFG-1のL鎖およびH鎖の可変領域として知られ
た配列を用いて産生させた。オリゴを、1+8=1/8, 2+7=2/7, 3+6=3/6, 4+5=4/5,
1/8+2/7=1/8/2/7, 3/6+4/5=3/6/4/5, 1/8/2/7+3/6/4/5=1/8/2/7/3/6/4/5の順で 加えた。表7には、HMFG-1と種々の共通CDR配列の比較を示す。HMFG-1に関する情
報およびモノクローナル抗体に関する情報は、WO 09/05142(Imperial Cancer Re
search Technology社)に記載されており、ヒト化HMFG-1は、WO 92/04380(Unilev
er)に記載されている。Example 7: Production of synthetic modified antibody containing HMFG-1 sequence An anti-idiotype antibody immunospecifically bound to the HMFG-1 antibody was constructed. HMFG-1
Is an antibody known to bind to polymorphic epithelial mucin (PEM) (Stewart et al., 1
990, J. Clin Oncol 8: 1941-50; Kosmas et al., 1994, Cancer 73: 3000-3010). Array
The antigenic determinant of PEM with ProAspThrArgPro was inserted into the variable region by the method of the invention. This short sequence is a highly immunogenic region of human polymorphic epithelial mucin (Gendler et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 12820-12823). Residues 27A-27 of HMFG-1
E (SerLeuLeuTyrSer) (Table 7) was replaced with ProAspThrArgPro using the oligonucleotide method described in Section 6 above and also in FIG. Anti-idiotypic synthetic HMFG-1 antibodies immunospecifically bound to HMFG-1 were generated using sequences known as the variable regions of the HMFG-1 light and heavy chains. Oligos were 1 + 8 = 1/8, 2 + 7 = 2/7, 3 + 6 = 3/6, 4 + 5 = 4/5,
1/8 + 2/7 = 1/8/2/7, 3/6 + 4/5 = 3/6/4/5, 1/8/2/7 + 3/6/4/5 = 1 / Added in order of 8/2/7/3/6/4/5. Table 7 shows a comparison of HMFG-1 and various common CDR sequences. Information on HMFG-1 and information on monoclonal antibodies can be found in WO 09/05142 (Imperial Cancer Re
search Technology) and humanized HMFG-1 is described in WO 92/04380 (Unilev
er).

【手続補正５】[Procedure amendment 5]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０１７３[Correction target item name] 0173

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０１７３】[0173]

【表７】 [Table 7]

【手続補正６】[Procedure amendment 6]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】図面の簡単な説明[Correction target item name] Brief description of drawings

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、免疫グロブリン分子のＬ鎖およびＨ鎖の構造を示す概略図であり、各 鎖はアミノ末端領域(H2N-)に位置する可変領域１つとカルボキシ末端領域(-COOH
)に位置する定常領域１つからなる。FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of an L chain and an H chain of an immunoglobulin molecule. Each chain has one variable region located at an amino terminal region (H 2 N-) and a carboxy terminal region (−). COOH
) Consists of one constant region.

【図２】 図２は、Ｌ鎖およびＨ鎖の可変領域(それぞれVLおよびVHと記す)中の４つのフ
レームワーク領域(FR1,FR2,FR3およびFR4)と３つの相補性決定領域(CDR1,CDR2お
よびCDR3)を示すIgGの概略図である。定常領域ドメインは、Ｌ鎖の定常ドメイン
についてはCL、Ｈ鎖の定常領域の３つのドメインについてはCH1、CH2およびCH3 と記す。FabはＬ鎖とＨ鎖両方の可変領域ならびにCLおよびCH1ドメイン含む抗体
断片部分を表す。FcはCH2およびCH3ドメインを含有する定常領域断片を表す。Figure 2, L chain and H chain variable regions (respectively referred to as V L and V H) of the four framework regions (FR1, FR2, FR3 and FR4) and three complementarity determining regions in the ( FIG. 2 is a schematic diagram of an IgG showing CDR1, CDR2 and CDR3). The constant region domains are referred to as C L for the constant domain of the L chain, and as CH 1 , CH 2 and CH 3 for the three domains of the constant region of the H chain. Fab represents the variable region and C L and CH 1 domain including antibody fragments part of both L and H chains. Fc represents a constant region fragment containing the CH 2 and CH 3 domains.

【図３】 図３は、図２に示した抗体の構造の概略図であるが、各ドメイン(それぞれVL,
VH,CL,CH1,CH2,およびCH3と呼ばれるループ構造)が、３次元構造を維持するジス
ルフィド結合(真っ黒の線で示す)により構造的に規定されていることを強調して
描いたものである(Roittら、Immnology, 第２版、London：Gower Medical Publi
shing, 1989, p5.3)。FIG. 3 is a schematic diagram of the structure of the antibody shown in FIG. 2; each domain (V L ,
V H, C L, CH 1 , CH 2, and loop structure) called CH 3, emphasizes that it is structurally defined by a disulfide bond that maintains the three-dimensional structure (indicated by solid black lines) (Roitt et al., Immunology, 2nd edition, London: Gower Medical Publi
shing, 1989, p5.3).

【図４】 図４は、抗イディオタイプカスケードにおける、リガンドに対するイディオタ
イプ抗体(Ab1)から抗イディオタイプ抗体(Ab2)および抗-抗イディオタイプ抗体(
Ab3)への内部イメージの発展を示す概略図である。FIG. 4 shows that in the anti-idiotype cascade, idiotype antibody (Ab1) to anti-idiotype antibody (Ab2) and anti-anti-idiotype antibody (Ab1) against the ligand.
It is a schematic diagram showing development of an internal image to Ab3).

【図５】 図５は、可変領域中のシステイン残基をアラニン残基に置き換えて鎖内ジスル
フィド結合を破壊することによる、免疫グロブリンの可変領域の改変。CH1、CH2
およびCH3は定常領域である。VHはＨ鎖可変領域であり、VLはＬ鎖可変領域であ る。FIG. 5: Modification of immunoglobulin variable regions by replacing cysteine residues in the variable region with alanine residues to break intrachain disulfide bonds. CH1, CH2
And CH3 are the constant regions. VH is the heavy chain variable region, and VL is the light chain variable region.

【図６】 (Ａ)ヒトκＬ鎖定常領域の配列を有する発現ベクターpMRRO 10.1 の構造であ る。(Ｂ)ヒトIgG1定常領域(CH1,CH2,CH3)Ｈ鎖をコードする配列およびヒンジ領 域の配列を含有する発現ベクターpGammalの構造である。(Ｃ)Ｌ鎖のκ定常ドメ インならびにＨ鎖の定常ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列を含有する
発現ベクターpNEPuDGVの構造である。３種のベクターについては全てBebbington
ら、1991, Methods in Enzymology 2:136-145を参照されたい。FIG. 6 (A) shows the structure of an expression vector pMRRO 10.1 having a human κ light chain constant region sequence. (B) Structure of the expression vector pGammal containing the sequence encoding the human IgG1 constant region (CH1, CH2, CH3) H chain and the sequence of the hinge region. (C) Structure of the expression vector pNEPuDGV containing the sequences encoding the kappa constant domain of the L chain and the constant domain and hinge region of the H chain. Bebbington for all three vectors
See 1991, Methods in Enzymology 2: 136-145.

【図７】 (Ａ)共通するＬ鎖可変領域ConVL1のアミノ酸配列（配列番号７０）および対応
するヌクレオチド配列(リーダー配列を含む)（配列番号６９）である。(Ｂ)共通
するＨ鎖可変領域ConVH1のアミノ酸配列（配列番号７２）および対応するヌクレ
オチド配列(リーダー配列を含む)（配列番号７１）である。FIG. 7 (A) shows the amino acid sequence of the common L chain variable region ConVL1 (SEQ ID NO: 70) and the corresponding nucleotide sequence (including the leader sequence) (SEQ ID NO: 69). (B) shows the amino acid sequence of the common H chain variable region ConVH1 (SEQ ID NO: 72) and the corresponding nucleotide sequence (including the leader sequence) (SEQ ID NO: 71).

【図８】 (Ａ)23位および88位のシステイン残基がアラニン残基(四角で囲んだ残基)に置
き換えられている、mAb31.1由来の抗体のＬ鎖可変領域の配列である2CAVLCOL1の
アミノ酸配列（配列番号７４）および対応するヌクレオチド配列（配列番号７３
）を示す。(Ｂ)23位および88位のシステイン残基がアラニン残基(四角で囲んだ 残基)に置き換えられている、mAb31.1由来の抗体のＨ鎖可変領域の配列である2C
AVHCOL1のアミノ酸配列（配列番号７６）および対応するヌクレオチド配列（配 列番号７５）を示す。(A) 2CAVLCOL1 which is the sequence of the variable region of the light chain of the mAb31.1-derived antibody in which the cysteine residues at positions 23 and 88 have been replaced with alanine residues (residues enclosed in squares). Amino acid sequence (SEQ ID NO: 74) and the corresponding nucleotide sequence (SEQ ID NO: 73)
). (B) The sequence of the variable region of the heavy chain of the antibody derived from mAb 31.1, in which the cysteine residues at positions 23 and 88 have been replaced with alanine residues (residues enclosed in squares).
Figure 7 shows the amino acid sequence of AVHCOL1 (SEQ ID NO: 76) and the corresponding nucleotide sequence (SEQ ID NO: 75).

【図９】 (Ａ)ヒト大腸癌抗原に特異的なＨ鎖可変領域遺伝子である2CAVHCOL1を組み立 てる(assemble)のに使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列であ
る（配列番号１３〜２２）。(Ｂ)ヒト大腸癌抗原に特異的なＬ鎖可変領域遺伝子
である2CAVLCOL1を組み立てるのに使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレ オチド配列である（配列番号２３〜３４）。(Ｃ)ConVL1と称されるＬ鎖共通領域
を組み立てるのに使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列である
（配列番号３５〜５２）。(Ｄ)ConVH1と称されるＨ鎖共通領域を組み立てるのに
使用したオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列である（配列番号５３〜
６７）。FIG. 9 (A) shows the oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to assemble 2CAVHCOL1, which is a heavy chain variable region gene specific for human colon cancer antigen (SEQ ID NOS: 13 to 22). (B) Oligonucleotide sequences of oligonucleotides used to construct 2CAVLCOL1, an L chain variable region gene specific for human colon cancer antigen (SEQ ID NOS: 23 to 34). (C) The oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to assemble the common L chain region called ConVL1 (SEQ ID NOS: 35 to 52). (D) The oligonucleotide sequence of the oligonucleotide used to construct the H chain common region called ConVH1 (SEQ ID NO: 53 to
67).

【図１０】 図１０は、ヒト大腸癌抗原に特異的な合成改変型抗体をコードする遺伝子操作
された遺伝子を組み立てるために用いた一般的な工程の概略図である。FIG. 10 is a schematic diagram of the general steps used to assemble a genetically engineered gene encoding a synthetic, modified antibody specific for human colon cancer antigen.

【図１１】 図１１は、mAB31.1から誘導された抗体であるが、そのシステインがアラニン に変更されていない抗体、およびビオチン標識されている同じ抗体の、LS-174T 細胞由来の抗原調製物に対する競合結合アッセイについての結果を示すドットブ
ロットである。非標識抗体の濃度をｎＭ非標識抗体として示す。「blk」レーンは 抗原がないレーンである。FIG. 11 shows an antigen preparation derived from LS-174T cells of an antibody derived from mAB31.1 but whose cysteine has not been changed to alanine, and of the same antibody which has been biotin-labeled. 4 is a dot blot showing the results of a competitive binding assay for. The concentration of unlabeled antibody is shown as nM unlabeled antibody. The "blk" lane is a lane without antigen.

【図１２】 (Ａ)ビヒクルのみ、大腸癌細胞抗体に結合するが改変されていない対照抗体、
ならびにブラジキニン受容体結合部位を含有するCDR配列を有するペプチドCDR1 、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5およびCDR6をワクチン接種したマウス由来の抗血清の
存在下での、LS-174T細胞に対するビオチン標識抗大腸癌細胞抗体の競合結合ア ッセイの結果を、LS-174T細胞への対照結合に対する割合で表したものである。( Ｂ)ビヒクルのみ、大腸癌細胞抗体に結合するが改変されていない対照抗体、2CA
VHCOLI、および2CAVLCOLIをワクチン接種したマウス由来の抗血清の存在下での 、LS-174T細胞に対するビオチン標識抗大腸癌細胞抗体の競合結合アッセイの結 果である。(Ｃ)抗原(黒三角)へのビオチン標識(「ｂ」で示す)抗体(逆向きのＹ)の 結合を示す図である。(Ｄ)抗原(黒塗りの三角)への、抗イディオタイプ抗体(黒 矢印)によるビオチン標識(「ｂ」で示す)抗体(逆向きのＹ)の結合の阻害を示す図 である。FIG. 12 (A) Control antibody that binds to colorectal cancer cell antibody but not vehicle alone,
And biotin-labeled anti-colorectal cancer against LS-174T cells in the presence of antisera from mice vaccinated with peptides CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5 and CDR6 having a CDR sequence containing a bradykinin receptor binding site The results of the competitive binding assay for cell antibodies are expressed as a percentage of control binding to LS-174T cells. (B) Control antibody, 2CA, which binds to colorectal cancer cell antibody but not vehicle alone
FIG. 3 shows the results of a competitive binding assay of biotin-labeled anti-colorectal cancer cell antibodies to LS-174T cells in the presence of antisera from mice vaccinated with VHCOLI and 2CAVLCOLI. (C) shows the binding of a biotin-labeled (indicated by “b”) antibody (reverse Y) to an antigen (closed triangle). (D) shows the inhibition of the binding of a biotin-labeled (indicated by “b”) antibody (reverse Y) to an antigen (solid triangle) by an anti-idiotype antibody (black arrow).

【図１３】 HMFG1の結合配列を含有するCDRを有するＬ鎖可変領域のヌクレオチド配列であ
る（配列番号６８）。FIG. 13 shows the nucleotide sequence of the light chain variable region having the CDR containing the binding sequence of HMFG1 (SEQ ID NO: 68).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 31/18 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 16/12 16/12 16/20 16/20 16/30 16/30 16/42 16/42 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 CA04 CA05 CA07 EA04 4C084 AA13 NA14 ZB262 ZB332 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 AA15 AA33 BA09 BA10 BA17 BA18 BA20 BA21 BA24 BA45 BA47 BA48 BA51 BA53 BA55 BA59 BA63 BA64 BA69 BA73 BA78 BA79 BA83 BA88 BA89 BA92 BB01 BB33 BB36 BB37 BB41 EE03 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 31/18 A61P 31/18 35/00 35/00 C07K 16/08 C07K 16/08 16/12 16 / 12 16/20 16/20 16/30 16/30 16/42 16/42 C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL , IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZWF terms (reference) 4B024 AA01 AA11 BA44 CA04 CA05 CA07 EA04 4C084 AA13 NA14 ZB262 ZB332 ZB352 4C085 AA03 AA13 AA14 AA15 AA33 BA09 BA10 BA17 BA18 BA20 BA21 BA24 BA45 BA47 BA48 BA51 BA53 BA55 BA59 BA63 BA64 BA69 BA73 BA78 BA79 BA83 BA88 BA89 BA92 BB01 BB33 A10A30 BB37 A40 BB37 FA72 FA74

Claims (98)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量の第１の免疫
グロブリン分子および製薬上許容される担体を含有するワクチン組成物であって
、前記第１の免疫グロブリン分子が可変領域を含み、かつ該可変領域中の１以上
のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特異的に結合する能力がある第２の免疫
グロブリン分子と同一であり、そして前記１以上のアミノ酸置換が、第２の免疫
グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基
に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基１個以
上による置換である、上記ワクチン組成物。1. A vaccine composition comprising a first immunoglobulin molecule in an amount sufficient to elicit an anti-idiotypic response and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein said first immunoglobulin molecule comprises a variable region. And is identical to a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen, except for one or more amino acid substitutions in the variable region, and wherein the one or more amino acid substitutions are: A substitution at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule with one or more amino acid residues without a sulfhydryl group. Vaccine composition. 【請求項２】 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１記載のワクチン組成物
。2. The vaccine composition according to claim 1, wherein said antigen is a tumor antigen. 【請求項３】 前記抗原が癌抗原である、請求項２記載のワクチン組成物。3. The vaccine composition according to claim 2, wherein said antigen is a cancer antigen. 【請求項４】 前記抗原が多型性上皮ムチン抗原である、請求項３記載のワ
クチン組成物。4. The vaccine composition according to claim 3, wherein said antigen is a polymorphic epithelial mucin antigen. 【請求項５】 前記抗原がヒト大腸癌関連タンパク質抗原である、請求項３
記載のワクチン組成物。5. The method according to claim 3, wherein the antigen is a human colon cancer-associated protein antigen.
A vaccine composition as described. 【請求項６】 前記抗原がヒト大腸癌関連炭水化物抗原である、請求項３記
載のワクチン組成物。6. The vaccine composition according to claim 3, wherein the antigen is a human colon cancer-associated carbohydrate antigen. 【請求項７】 前記可変領域がＬ鎖可変領域であり、スルフヒドリル基をも
たない前記アミノ酸残基が第２の免疫グロブリン分子のＬ鎖可変領域の23位また
は88位に対応する位置にある、請求項１記載のワクチン組成物。7. The variable region is an L chain variable region, and the amino acid residue having no sulfhydryl group is located at a position corresponding to position 23 or 88 of the L chain variable region of the second immunoglobulin molecule. The vaccine composition according to claim 1. 【請求項８】 前記可変領域がＨ鎖可変領域であり、スルフヒドリル基をも
たない前記アミノ酸残基が第２の免疫グロブリン分子のＨ鎖可変領域の22位また
は92位に対応する位置にある、請求項１記載のワクチン組成物。8. The variable region is an H chain variable region, and the amino acid residue having no sulfhydryl group is located at a position corresponding to position 22 or 92 of the H chain variable region of the second immunoglobulin molecule. The vaccine composition according to claim 1. 【請求項９】 スルフヒドリル基をもたない前記アミノ酸残基がアラニンで
ある、請求項１、７または８記載のワクチン組成物。9. The vaccine composition according to claim 1, wherein the amino acid residue having no sulfhydryl group is alanine. 【請求項１０】 第２の免疫グロブリン分子がMab 31.1、Mab 33.28またはM
ab HMFG-1であり、前記１以上のアミノ酸置換がＬ鎖可変領域の23位および／ま たは88位でのアラニンによる置換を含む、請求項１記載のワクチン組成物。10. The method of claim 10, wherein the second immunoglobulin molecule is Mab 31.1, Mab 33.28 or Mab.
The vaccine composition of claim 1, wherein the vaccine composition is ab HMFG-1, wherein the one or more amino acid substitutions comprises a substitution of alanine at position 23 and / or 88 of the light chain variable region. 【請求項１１】 第２の免疫グロブリン分子がMab 31.1、Mab 33.28またはM
ab HMFG-1であり、前記１以上のアミノ酸置換がＨ鎖可変領域の22位および／ま たは92位でのアラニンによる置換を含む、請求項１記載のワクチン組成物。11. The method of claim 11, wherein the second immunoglobulin molecule is Mab 31.1, Mab 33.28 or Mab.
The vaccine composition of claim 1, which is ab HMFG-1, wherein the one or more amino acid substitutions comprises a substitution of alanine at position 22 and / or 92 of the heavy chain variable region. 【請求項１２】 前記抗原がヒト乳脂肪球抗原である、請求項３記載のワク
チン組成物。12. The vaccine composition according to claim 3, wherein said antigen is a human milk fat globule antigen. 【請求項１３】 前記抗原が***、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、
膵臓、大腸、胃腸管、Ｂ細胞またはＴ細胞の癌の抗原である、請求項３記載のワ
クチン組成物。13. The method of claim 13, wherein the antigen is breast, ovary, uterus, prostate, bladder, lung, skin,
4. The vaccine composition according to claim 3, which is an antigen of pancreatic, colon, gastrointestinal tract, B cell or T cell cancer. 【請求項１４】 前記抗原がKS 1/4汎癌抗原(pan-carcinoma antigen)、卵 巣癌抗原、前立腺酸ホスフェート、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原p97、黒 色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原、多型
性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原TAG-72、CO17-1A 、GICA19-9、CTA-1、LEA、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19、ヒトＢリンパ
腫抗原-CD20、CD33、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドG
M2、ガングリオシドGM3、腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原、癌胎児性抗原αフ ェトプロテインL6、ヒト肺癌抗原L20、ヒト白血病Ｔ細胞抗原-Gp37、ネオグリコ
プロテイン(neoglycoprotein)、スフィンゴ脂質、EGFR、HER2抗原、多型性上皮 ムチン、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1、Ｉ抗原M18、M39、SSEA-1、VEP8、VEP9、
My1、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85、C14、F3、AH6、Ｙハプテン、Ley、TL5、FC10
.2、胃腺癌抗原、CO-514、NS-10、CO-43、MH2、大腸癌に見られる19.9、胃癌ム チン、T5A7、R24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、SSE
A-3、SSEA-4、およびＴ細胞受容体由来のペプチドからなる群より選択される、 請求項３記載のワクチン組成物。14. The antigen may be KS 1/4 pan-carcinoma antigen, ovarian cancer antigen, prostate phosphate, prostate specific antigen, melanoma-associated antigen p97, melanoma antigen gp75, high molecular weight Melanoma antigen, prostate-specific membrane antigen, carcinoembryonic antigen, polymorphic epithelial mucin antigen, human milk fat globule antigen, colorectal tumor-associated antigen TAG-72, CO17-1A, GICA19-9, CTA-1, LEA , Burkitt's lymphoma antigen-38.13, CD19, human B lymphoma antigen-CD20, CD33, ganglioside GD2, ganglioside GD3, ganglioside G
M2, ganglioside GM3, tumor-specific implantable cell surface antigen, carcinoembryonic antigen α-fetoprotein L6, human lung cancer antigen L20, human leukemia T-cell antigen-Gp37, neoglycoprotein (neoglycoprotein), sphingolipid, EGFR , HER2 antigen, polymorphic epithelial mucin, malignant human lymphocyte antigen-APO-1, I antigen M18, M39, SSEA-1, VEP8, VEP9,
My1, VIM-D5, D 1 56-22, TRA-1-85, C14, F3, AH6, Y hapten, Le y, TL5, FC10
.2, gastric adenocarcinoma antigen, CO-514, NS-10 , CO-43, MH2, 19.9 found in colon cancer, gastric mucin, T 5 A 7, R 24 , 4.2, G D3, D1.1, OFA -1, G M2, OFA-2 , G D2, M1: 22: 25: 8, SSE
The vaccine composition according to claim 3, wherein the vaccine composition is selected from the group consisting of A-3, SSEA-4, and a peptide derived from a T cell receptor. 【請求項１５】 前記抗原が感染性病原体の抗原である、請求項１記載のワ
クチン組成物。15. The vaccine composition according to claim 1, wherein said antigen is an antigen of an infectious pathogen. 【請求項１６】 前記抗原がインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒト呼
吸シンシチアルウイルスＧ糖タンパク質、デング熱ウイルスのコアタンパク質、
デング熱ウイルスのマトリックスタンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝集素、単純
ヘルペスウイルス２型の糖タンパク質gB、ポリオウイルスI VP1、HIV Iのエンベ
ロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、連鎖球菌24Mエピト ープ、淋菌ピリン、仮性狂犬病ウイルスg50、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質 Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎ウイルス糖タンパク質19
5、伝染性胃腸炎ウイルスマトリックスタンパク質、ブタ・ロタウイルス糖タン パク質38、ブタ・パルボウイルスキャプシドタンパク質、Serpulina hydodysent
eriae防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢糖タンパク質55、ニューカッスル病ウイ ルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタ・インフルエンザウイルス赤血球凝
集素、ブタ・インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、感染性ウシ鼻気管炎ウ
イルス糖タンパク質Ｅ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タン
パク質Ｉ、La Crosse ウイルスの糖タンパク質、新生児ウシ下痢ウイルス、Ｂ型
肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ウマ・インフルエン
ザウイルスＡ型／Alaska 91 ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルス
Ａ型／Miami 63 ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／Kentu
cky 81 ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、ウマ ・ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ、ウシ呼吸シンシチアルウイルス付着タ
ンパク質、ウシ呼吸シンシチアルウイルス融合タンパク質、ウシ呼吸シンシチア
ルウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス
３型融合タンパク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイ
ラミニダーゼ、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質48、およびウシ下痢
ウイルス糖タンパク質53からなる群より選択される、請求項１５記載のワクチン
組成物。16. The antigen may be influenza virus hemagglutinin, human respiratory syncytial virus G glycoprotein, dengue virus core protein,
Dengue virus matrix protein, measles virus hemagglutinin, herpes simplex virus type 2 glycoprotein gB, poliovirus IVP1, HIV I envelope glycoprotein, hepatitis B surface antigen, diphtheria toxin, streptococcal 24M epitope, Neisseria gonorrhoeae pilin, pseudorabies virus g50, pseudorabies virus glycoprotein H, pseudorabies virus glycoprotein E, infectious gastroenteritis virus glycoprotein 19
5. Infectious gastroenteritis virus matrix protein, porcine rotavirus glycoprotein 38, porcine parvovirus capsid protein, Serpulina hydodysent
eriae protective antigen, bovine viral diarrhea glycoprotein 55, Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase, swine influenza virus hemagglutinin, swine influenza virus neuraminidase, infectious bovine rhinotracheitis virus glycoprotein E, infectious Laryngotracheitis virus glycoprotein G or glycoprotein I, glycoprotein of La Crosse virus, neonatal bovine diarrhea virus, hepatitis B virus core protein, hepatitis B virus surface antigen, equine influenza virus A / Alaska 91 neuraminidase, horse・ Influenza virus A / Miami 63 neuraminidase, equine influenza virus A / Kentu
cky 81 neuraminidase, equine herpesvirus type 1 glycoprotein B, equine herpesvirus type 1 glycoprotein D, bovine respiratory syncytial virus attachment protein, bovine respiratory syncytial virus fusion protein, bovine respiratory syncytial virus nucleocapsid A protein, a bovine parainfluenza virus type 3 fusion protein, a bovine parainfluenza virus type 3 hemagglutinin neuraminidase, a bovine viral diarrhea virus glycoprotein 48, and a bovine diarrhea virus glycoprotein 53. Item 16. The vaccine composition according to Item 15, 【請求項１７】 前記抗原が感染性病原体に対する細胞受容体である、請求
項１記載のワクチン組成物。17. The vaccine composition of claim 1, wherein said antigen is a cell receptor for an infectious agent. 【請求項１８】 前記細胞受容体がLPV受容体、アデニル酸シクラーゼ、BDV
表面糖タンパク質、N-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸受容体、CD4+、高度 に硫酸化されたタイプのヘパリン硫酸、p65、Galα1-4-Gal含有イソ受容体、CD1
6b、インテグリンVLA-2受容体、EV受容体、CD14、グリココンジュゲート受容体 、α／βＴ細胞受容体、崩壊促進因子受容体、細胞外エンベロープ糖タンパク質
受容体、免疫グロブリンFc受容体、ポックスウイルスM-T7、GALV受容体、CD14受
容体、Lewis(b)血液型抗原受容体、Ｔ細胞受容体、ヘパリン硫酸グリコアミノグ
リカン受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、CD11a、CD2、Ｇタンパク質共役受容
体、CD4、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、アネキシンII、CD13（アミノペプチ ダーゼＮ）、ヒト・アミノペプチダーゼＮ受容体、赤血球凝集素受容体、CR3受 容体、プロテインキナーゼ受容体、ガラクトースN-アセチルガラクトサミン阻害
性レクチン受容体、ケモカイン受容体、アネキシンＩ、actAタンパク質、CD46受
容体、髄膜炎菌ビルレンス関連opa受容体、CD46受容体、癌胎児性抗原ファミリ ー受容体、癌胎児性抗原ファミリーBg1a受容体、γインターフェロン受容体、糖
タンパク質gp70、rmc-1受容体、ヒトインテグリン受容体αvβ3、ヘパリン硫酸 プロテオグリカン受容体、CD66受容体、インテグリン受容体、膜コファクタータ
ンパク質、CD46、GM1、GM2、GM3、CD3、セラミド、赤血球凝集素−ノイラミニダ
ーゼタンパク質、赤血球Ｐ抗原受容体、CD36受容体、グリコホリンＡ受容体、イ
ンターフェロンγ受容体、KDEL受容体、粘膜ホーミングα4β7受容体、上皮増殖
因子受容体、α5β1インテグリンタンパク質、非グリコシル化J774受容体、CXCR
1-4受容体、CCR1-5受容体、CXCR3受容体、CCR5受容体、gp46表面糖タンパク質、
TNFR p55受容体、TNF p75受容体、可溶性インターロイキン-1β受容体からなる 群より選択される、請求項１７記載のワクチン組成物。18. The cell receptor, wherein the cell receptor is LPV receptor, adenylate cyclase, BDV
Surface glycoprotein, N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid receptor, CD4 + , highly sulfated heparin sulfate, p65, Galα1-4-Gal-containing isoreceptor, CD1
6b, integrin VLA-2 receptor, EV receptor, CD14, glycoconjugate receptor, α / β T cell receptor, decay accelerating factor receptor, extracellular envelope glycoprotein receptor, immunoglobulin Fc receptor, poxvirus M-T7, GALV receptor, CD14 receptor, Lewis (b) blood group antigen receptor, T cell receptor, heparin sulfate glycoaminoglycan receptor, fibroblast growth factor receptor, CD11a, CD2, G protein coupling Receptor, CD4, heparin sulfate proteoglycan, annexin II, CD13 (aminopeptidase N), human aminopeptidase N receptor, hemagglutinin receptor, CR3 receptor, protein kinase receptor, galactose N-acetylgalactosamine inhibitory lectin Receptor, chemokine receptor, annexin I, actA protein, CD46 receptor, meningococcal virulence-related opa receptor, CD46 receptor Receptor, carcinoembryonic antigen family receptor, carcinoembryonic antigen family Bg1a receptor, gamma interferon receptor, glycoprotein gp70, rmc-1 receptor, human integrin receptor αvβ3, heparin sulfate proteoglycan receptor, CD66 receptor , Integrin receptor, membrane cofactor protein, CD46, GM1, GM2, GM3, CD3, ceramide, hemagglutinin-neuraminidase protein, erythrocyte P antigen receptor, CD36 receptor, glycophorin A receptor, interferon gamma receptor, KDEL Receptor, mucosal homing α4β7 receptor, epidermal growth factor receptor, α5β1 integrin protein, non-glycosylated J774 receptor, CXCR
1-4 receptor, CCR1-5 receptor, CXCR3 receptor, CCR5 receptor, gp46 surface glycoprotein,
The vaccine composition according to claim 17, which is selected from the group consisting of TNFR p55 receptor, TNF p75 receptor, and soluble interleukin-1β receptor. 【請求項１９】 感染性病原体が細菌である、請求項１５または１７記載の
ワクチン組成物。19. The vaccine composition according to claim 15, wherein the infectious agent is a bacterium. 【請求項２０】 前記細菌がミコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ
、ナイセリア(Neisseria) spp.、レジオネラ、シゲラ(Shigella) spp.、コレラ 菌(Vibrio cholerae)、連鎖球菌、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)
、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ヘモフィ
ルス(Haemophilus) spp.、クラミジア(Chlamydia) spp.、および大腸菌(Escheri
chia coli)からなる群より選択されるか、あるいは梅毒またはライム病を引き起
こす、請求項１９記載のワクチン組成物。20. The bacterium is mycobacterium, rickettsia, mycoplasma, Neisseria spp., Legionella, Shigella spp., Vibrio cholerae, Streptococcus, Corynebacterium diphtheriae.
, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Haemophilus spp., Chlamydia spp., And Escherichia coli (Escheri)
20. The vaccine composition according to claim 19, which is selected from the group consisting of chia coli) or causes syphilis or Lyme disease. 【請求項２１】 感染性病原体がウイルスである、請求項１５または１７記
載のワクチン組成物。21. The vaccine composition according to claim 15, wherein the infectious agent is a virus. 【請求項２２】 前記ウイルスがＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフル
エンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスII型、牛疫、
ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、
乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、ア
ルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイル
ス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型
、ヒト免疫不全ウイルスII型、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、カリチウ
イルス科、ノーウォーク(Norwalk)グループのウイルス、トガウイルス、アルフ ァウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マルブルク(M
arburg)ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミク ソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、
オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスII
型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイ
ルス、エプスタイン-バーウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス-6、オナガザル・ ヘルペスウイルス１、およびポックスウイルスからなる群より選択される、請求
項２１記載のワクチン組成物。22. The virus, wherein the virus is hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, influenza, varicella, adenovirus, herpes simplex type I, herpes simplex type II, rinderpest,
Rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus,
Papilloma virus, Papova virus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Hantavirus, Coxsackievirus, Mumps virus, Measles virus, Rubella virus, Poliovirus, Human immunodeficiency virus type I, Human immunodeficiency virus II Type, picornavirus, enterovirus, caliciviridae, Norwalk group virus, togavirus, alphavirus, flavivirus, coronavirus, rabies virus, Malburg (M
arburg) virus, Ebola virus, Parainfluenza virus, Orthomixovirus, Bunyavirus, Arenavirus, Reovirus, Rotavirus,
Orbivirus, human T-cell leukemia virus type I, human T-cell leukemia virus II
22. A simian immunodeficiency virus, a lentivirus, a polyomavirus, a parvovirus, an Epstein-Barr virus, a human herpesvirus-6, a primate herpesvirus 1, and a poxvirus. Vaccine composition. 【請求項２３】 感染性病原体が寄生体である、請求項１５または１７記載
のワクチン組成物。23. The vaccine composition according to claim 15, wherein the infectious agent is a parasite. 【請求項２４】 前記寄生体がプラスモディウム（マラリア原虫）、アイメ
リア、リーシュマニア、コクジディオア(kokzidioa)、トリパノソーマ、および 真菌からなる群より選択される、請求項２３記載のワクチン組成物。24. The vaccine composition of claim 23, wherein said parasite is selected from the group consisting of Plasmodium (plasmodium malaria), Eimeria, Leishmania, kokzidioa, trypanosomes, and fungi. 【請求項２５】 第１の免疫グロブリン分子がIgG、IgE、IgM、IgDおよびIg
Aからなる群より選択されるタイプのものである、請求項１記載のワクチン組成 物。25. The method of claim 25 wherein the first immunoglobulin molecule is IgG, IgE, IgM, IgD and Ig.
The vaccine composition according to claim 1, which is of a type selected from the group consisting of A. 【請求項２６】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量の第１の免
疫グロブリン分子のフラグメントおよび製薬上許容される担体を含有するワクチ
ン組成物であって、前記フラグメントが可変領域を含み、かつ該可変領域中の１
以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特異的に結合する能力がある第２の
免疫グロブリン分子の対応するフラグメントと同一であり、そして前記１以上の
アミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成してい
る１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基を
もたないアミノ酸残基１個以上による置換である、上記ワクチン組成物。26. A vaccine composition comprising a sufficient amount of a fragment of a first immunoglobulin molecule to elicit an anti-idiotypic response and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein said fragment comprises a variable region; And 1 in the variable region
Except for the above amino acid substitutions, which are identical to the corresponding fragments of a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen, and wherein said one or more amino acid substitutions is The above vaccine composition, wherein the substitution is at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond, with one or more amino acid residues without a sulfhydryl group. 【請求項２７】 前記フラグメントが一本鎖免疫グロブリンである、請求項
２６記載のワクチン組成物。27. The vaccine composition according to claim 26, wherein said fragment is a single-chain immunoglobulin. 【請求項２８】 前記フラグメントがFabフラグメント、(Fab')2フラグメン
ト、Ｈ鎖二量体、Ｌ鎖二量体、またはFvフラグメントである、請求項２６記載の
ワクチン組成物。28. The vaccine composition of claim 26, wherein said fragment is a Fab fragment, (Fab ') 2 fragment, H chain dimer, L chain dimer, or Fv fragment. 【請求項２９】 前記フラグメントが定常領域をさらに含む、請求項２６記
載のワクチン組成物。29. The vaccine composition of claim 26, wherein said fragment further comprises a constant region. 【請求項３０】 可変領域がマウス免疫グロブリン由来であり、定常領域が
ヒト免疫グロブリン由来である、請求項２６記載のワクチン組成物。30. The vaccine composition of claim 26, wherein the variable region is derived from a mouse immunoglobulin and the constant region is derived from a human immunoglobulin. 【請求項３１】 可変領域がヒト抗体由来のフレームワーク領域とマウス免
疫グロブリン由来の相補性決定領域(CDR)を有する、請求項１記載のワクチン組 成物。31. The vaccine composition according to claim 1, wherein the variable region has a framework region derived from a human antibody and a complementarity determining region (CDR) derived from a mouse immunoglobulin. 【請求項３２】 第１の免疫グロブリン分子がIL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL
-7、IL-10、γ-インターフェロン、MHC由来ペプチド、G-CSF、TNF、ポーリン、N
K細胞抗原、または細胞性エンドサイトーシス受容体からなる群より選択される タンパク質のアミノ酸配列に共有結合で結合される、請求項１記載のワクチン組
成物。32. The first immunoglobulin molecule is IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL
-7, IL-10, γ-interferon, MHC-derived peptide, G-CSF, TNF, porin, N
2. The vaccine composition of claim 1, wherein the vaccine composition is covalently linked to an amino acid sequence of a protein selected from the group consisting of a K cell antigen or a cellular endocytosis receptor. 【請求項３３】 第１の免疫グロブリン分子のフラグメントがIL-2、IL-4、
IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、γ-インターフェロン、MHC由来ペプチド、G-CSF、TN
F、ポーリン、NK細胞抗原、または細胞性エンドサイトーシス受容体からなる群 より選択されるタンパク質のアミノ酸配列に共有結合で結合される、請求項２６
記載のワクチン組成物。33. The fragment of the first immunoglobulin molecule is IL-2, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, γ-interferon, MHC-derived peptide, G-CSF, TN
27. Covalently linked to an amino acid sequence of a protein selected from the group consisting of F, porin, NK cell antigen, or cellular endocytosis receptor.
A vaccine composition as described. 【請求項３４】 被験者に、抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量
の第１の免疫グロブリン分子を投与することからなる、被験者において抗イディ
オタイプ応答を生成させる方法であって、第１の免疫グロブリン分子が可変領域
を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特異
的に結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子と同一であり、前記１以上の
アミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成してい
る１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基を
もたないアミノ酸残基による置換である、上記方法。34. A method of generating an anti-idiotype response in a subject, comprising administering to the subject an amount of a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotype response. The immunoglobulin molecule comprises a variable region, and, except for one or more amino acid substitutions in the variable region, is the same as a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen; Is a substitution at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in a second immunoglobulin molecule with an amino acid residue having no sulfhydryl group. , The above method. 【請求項３５】 前記被験者から、第２の免疫グロブリン分子のイディオタ
イプを認識する抗体を単離し、該抗体を第２の被験者に投与することをさらに含
む、請求項３４記載の方法。35. The method of claim 34, further comprising isolating from said subject an antibody recognizing the idiotype of a second immunoglobulin molecule and administering said antibody to said second subject. 【請求項３６】 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項３４記載の方法。36. The method of claim 34, wherein said antigen is a tumor antigen. 【請求項３７】 前記抗原が癌抗原である、請求項３４記載の方法。37. The method of claim 34, wherein said antigen is a cancer antigen. 【請求項３８】 前記抗原が多型性上皮ムチン抗原である、請求項３６記載
の方法。38. The method of claim 36, wherein said antigen is a polymorphic epithelial mucin antigen. 【請求項３９】 前記抗原がヒト大腸癌関連タンパク質抗原である、請求項
３６記載の方法。39. The method of claim 36, wherein said antigen is a human colon cancer-associated protein antigen. 【請求項４０】 前記抗原がヒト大腸癌関連炭水化物抗原である、請求項３
６記載の方法。40. The antigen of claim 3, wherein the antigen is a human colon cancer-associated carbohydrate antigen.
6. The method according to 6. 【請求項４１】 前記可変領域がＬ鎖可変領域であり、スルフヒドリル基を
もたない前記アミノ酸残基が第２の免疫グロブリン分子のＬ鎖可変領域の23位ま
たは88位に対応する位置にある、請求項３５記載の方法。41. The variable region is an L chain variable region, and the amino acid residue having no sulfhydryl group is located at a position corresponding to position 23 or 88 of the L chain variable region of the second immunoglobulin molecule. 36. The method of claim 35. 【請求項４２】 前記可変領域がＨ鎖可変領域であり、スルフヒドリル基を
もたない前記アミノ酸残基が第２の免疫グロブリン分子のＨ鎖可変領域の22位ま
たは92位に対応する位置にある、請求項３５記載の方法。42. The variable region is an H chain variable region, and the amino acid residue having no sulfhydryl group is located at a position corresponding to position 22 or 92 of the H chain variable region of the second immunoglobulin molecule. 36. The method of claim 35. 【請求項４３】 スルフヒドリル基をもたない前記アミノ酸残基がアラニン
である、請求項３４記載の方法。43. The method of claim 34, wherein said amino acid residue without a sulfhydryl group is alanine. 【請求項４４】 第２の免疫グロブリン分子がMab 31.1、Mab 33.28またはH
MFG-1であり、前記アミノ酸置換がＬ鎖可変領域の23位および／または88位での アラニンによる置換を含む、請求項３４記載の方法。44. The second immunoglobulin molecule is Mab 31.1, Mab 33.28 or H
35. The method of claim 34, wherein the amino acid substitution comprises MFG-1 and the amino acid substitution at position 23 and / or 88 of the light chain variable region is alanine. 【請求項４５】 第２の免疫グロブリン分子がMab 31.1、Mab 33.28またはH
MFG-1であり、前記アミノ酸置換がＨ鎖可変領域の22位および／または92位での アラニンによる置換を含む、請求項３４記載の方法。45. The second immunoglobulin molecule is Mab 31.1, Mab 33.28 or H
35. The method of claim 34, wherein the amino acid substitution comprises MFG-1 and the amino acid substitution at position 22 and / or 92 of the heavy chain variable region is alanine. 【請求項４６】 前記抗原がヒト乳脂肪球抗原である、請求項３４記載の方
法。46. The method of claim 34, wherein said antigen is a human milk fat globule antigen. 【請求項４７】 前記抗原が***、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、
膵臓、大腸、胃腸管、Ｂ細胞またはＴ細胞の癌の抗原である、請求項３４記載の
方法。47. The antigen may be for breast, ovary, uterus, prostate, bladder, lung, skin,
35. The method of claim 34, which is an antigen of a pancreatic, colon, gastrointestinal tract, B cell or T cell cancer. 【請求項４８】 前記抗原がKS 1/4汎癌抗原(pan-carcinoma antigen)、卵 巣癌抗原、前立腺酸ホスフェート、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原p97、黒 色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原、多型
性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原TAG-72、CO17-1A 、GICA19-9、CTA-1、LEA、バーキットリンパ腫抗原-38.13、CD19、ヒトＢリンパ
腫抗原-CD20、CD33、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドG
M2、ガングリオシドGM3、腫瘍特異的移植型の細胞表面抗原、癌胎児性抗原αフ ェトプロテインL6、ヒト肺癌抗原L20、ヒト白血病Ｔ細胞抗原-Gp37、ネオグリコ
プロテイン(neoglycoprotein)、スフィンゴ脂質、EGFR、HER2抗原、多型性上皮 ムチン、悪性ヒトリンパ球抗原-APO-1、Ｉ抗原M18、M39、SSEA-1、VEP8、VEP9、
My1、VIM-D5、D156-22、TRA-1-85、C14、F3、AH6、Ｙハプテン、Ley、TL5、FC10
.2、胃腺癌抗原、CO-514、NS-10、CO-43、MH2、大腸癌に見られる19.9、胃癌ム チン、T5A7、R24、4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、M1:22:25:8、SSE
A-3、SSEA-4、およびＴ細胞受容体由来のペプチドからなる群より選択される、 請求項３６記載の方法。48. The antigen may be KS 1/4 pan-carcinoma antigen, ovarian cancer antigen, prostate acid phosphate, prostate specific antigen, melanoma-associated antigen p97, melanoma antigen gp75, high molecular weight Melanoma antigen, prostate-specific membrane antigen, carcinoembryonic antigen, polymorphic epithelial mucin antigen, human milk fat globule antigen, colorectal tumor-associated antigen TAG-72, CO17-1A, GICA19-9, CTA-1, LEA , Burkitt's lymphoma antigen-38.13, CD19, human B lymphoma antigen-CD20, CD33, ganglioside GD2, ganglioside GD3, ganglioside G
M2, ganglioside GM3, tumor-specific implantable cell surface antigen, carcinoembryonic antigen α-fetoprotein L6, human lung cancer antigen L20, human leukemia T-cell antigen-Gp37, neoglycoprotein (neoglycoprotein), sphingolipid, EGFR , HER2 antigen, polymorphic epithelial mucin, malignant human lymphocyte antigen-APO-1, I antigen M18, M39, SSEA-1, VEP8, VEP9,
My1, VIM-D5, D 1 56-22, TRA-1-85, C14, F3, AH6, Y hapten, Le y, TL5, FC10
.2, gastric adenocarcinoma antigen, CO-514, NS-10 , CO-43, MH2, 19.9 found in colon cancer, gastric mucin, T 5 A 7, R 24 , 4.2, G D3, D1.1, OFA -1, G M2, OFA-2 , G D2, M1: 22: 25: 8, SSE
37. The method of claim 36, wherein the method is selected from the group consisting of A-3, SSEA-4, and a peptide derived from a T cell receptor. 【請求項４９】 前記抗原が感染性病原体の抗原である、請求項３４記載の
方法。49. The method of claim 34, wherein said antigen is an antigen of an infectious pathogen. 【請求項５０】 前記抗原がインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒト呼
吸シンシチアルウイルスＧ糖タンパク質、デング熱ウイルスのコアタンパク質、
デング熱ウイルスのマトリックスタンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝集素、単純
ヘルペスウイルス２型の糖タンパク質gB、ポリオウイルスI VP1、HIV Iのエンベ
ロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、連鎖球菌24Mエピト ープ、淋菌ピリン、仮性狂犬病ウイルスg50、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質 Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎ウイルス糖タンパク質19
5、伝染性胃腸炎ウイルスマトリックスタンパク質、ブタ・ロタウイルス糖タン パク質38、ブタ・パルボウイルスキャプシドタンパク質、Serpulina hydodysent
eriae 防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢糖タンパク質55、ニューカッスル病ウイ
ルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタ・インフルエンザウイルス赤血球凝
集素、ブタ・インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、感染性ウシ鼻気管炎ウ
イルス糖タンパク質Ｅ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タン
パク質Ｉ、La Crosse ウイルスの糖タンパク質、新生児ウシ下痢ウイルス、Ｂ型
肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ウマ・インフルエン
ザウイルスＡ型／Alaska 91 ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルス
Ａ型／Miami 63 ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／Kentu
cky 81 ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、ウマ ・ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ、ウシ呼吸シンシチアルウイルス付着タ
ンパク質、ウシ呼吸シンシチアルウイルス融合タンパク質、ウシ呼吸シンシチア
ルウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス
３型融合タンパク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイ
ラミニダーゼ、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質48、およびウシ下痢
ウイルス糖タンパク質53からなる群より選択される、請求項４９記載の方法。50. The antigen is influenza virus hemagglutinin, human respiratory syncytial virus G glycoprotein, dengue virus core protein,
Dengue virus matrix protein, measles virus hemagglutinin, herpes simplex virus type 2 glycoprotein gB, poliovirus IVP1, HIV I envelope glycoprotein, hepatitis B surface antigen, diphtheria toxin, streptococcal 24M epitope, Neisseria gonorrhoeae pilin, pseudorabies virus g50, pseudorabies virus glycoprotein H, pseudorabies virus glycoprotein E, infectious gastroenteritis virus glycoprotein 19
5. Infectious gastroenteritis virus matrix protein, porcine rotavirus glycoprotein 38, porcine parvovirus capsid protein, Serpulina hydodysent
eriae protective antigen, bovine viral diarrhea glycoprotein 55, Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase, swine influenza virus hemagglutinin, swine influenza virus neuraminidase, infectious bovine rhinotracheitis virus glycoprotein E, infectious larynx Tracheitis virus glycoprotein G or glycoprotein I, glycoprotein of La Crosse virus, neonatal bovine diarrhea virus, hepatitis B virus core protein, hepatitis B virus surface antigen, equine influenza virus A / Alaska 91 neuraminidase, horse. Influenza virus type A / Miami 63 neuraminidase, equine influenza virus type A / Kentu
cky 81 neuraminidase, equine herpesvirus type 1 glycoprotein B, equine herpesvirus type 1 glycoprotein D, bovine respiratory syncytial virus attachment protein, bovine respiratory syncytial virus fusion protein, bovine respiratory syncytial virus nucleocapsid A protein, a bovine parainfluenza virus type 3 fusion protein, a bovine parainfluenza virus type 3 hemagglutinin neuraminidase, a bovine viral diarrhea virus glycoprotein 48, and a bovine diarrhea virus glycoprotein 53. Item 50. The method according to Item 49. 【請求項５１】 前記抗原が感染性病原体に対する細胞受容体である、請求
項３４記載の方法。51. The method of claim 34, wherein said antigen is a cell receptor for an infectious pathogen. 【請求項５２】 前記細胞受容体がLPV受容体、アデニル酸シクラーゼ、BDV
表面糖タンパク質、N-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸受容体、CD4+、高度 に硫酸化されたタイプのヘパリン硫酸、p65、Galα1-4-Gal含有イソ受容体、CD1
6b、インテグリンVLA-2受容体、EV受容体、CD14、グリココンジュゲート受容体 、α／βＴ細胞受容体、崩壊促進因子受容体、細胞外エンベロープ糖タンパク質
受容体、免疫グロブリンFc受容体、ポックスウイルスM-T7、GALV受容体、CD14受
容体、Lewis(b)血液型抗原受容体、Ｔ細胞受容体、ヘパリン硫酸グリコアミノグ
リカン受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、CD11a、CD2、Ｇタンパク質共役受容
体、CD4、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、アネキシンII、CD13（アミノペプチ ダーゼＮ）、ヒト・アミノペプチダーゼＮ受容体、赤血球凝集素受容体、CR3受 容体、プロテインキナーゼ受容体、ガラクトースN-アセチルガラクトサミン阻害
性レクチン受容体、ケモカイン受容体、アネキシンＩ、actAタンパク質、CD46受
容体、髄膜炎菌ビルレンス関連opa受容体、CD46受容体、癌胎児性抗原ファミリ ー受容体、癌胎児性抗原ファミリーBg1a受容体、γインターフェロン受容体、糖
タンパク質gp70、rmc-1受容体、ヒトインテグリン受容体αvβ3、ヘパリン硫酸 プロテオグリカン受容体、CD66受容体、インテグリン受容体、膜コファクタータ
ンパク質、CD46、GM1、GM2、GM3、CD3、セラミド、赤血球凝集素−ノイラミニダ
ーゼタンパク質、赤血球Ｐ抗原受容体、CD36受容体、グリコホリンＡ受容体、イ
ンターフェロンγ受容体、KDEL受容体、粘膜ホーミングα4β7受容体、上皮増殖
因子受容体、α5β1インテグリンタンパク質、非グリコシル化J774受容体、CXCR
1-4受容体、CCR1-5受容体、CXCR3受容体、CCR5受容体、gp46表面糖タンパク質、
TNFR p55受容体、TNF p75受容体、可溶性インターロイキン-1β受容体からなる 群より選択される、請求項５１記載の方法。52. The cell receptor is LPV receptor, adenylate cyclase, BDV
Surface glycoprotein, N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid receptor, CD4 + , highly sulfated heparin sulfate, p65, Galα1-4-Gal-containing isoreceptor, CD1
6b, integrin VLA-2 receptor, EV receptor, CD14, glycoconjugate receptor, α / β T cell receptor, decay accelerating factor receptor, extracellular envelope glycoprotein receptor, immunoglobulin Fc receptor, poxvirus M-T7, GALV receptor, CD14 receptor, Lewis (b) blood group antigen receptor, T cell receptor, heparin sulfate glycoaminoglycan receptor, fibroblast growth factor receptor, CD11a, CD2, G protein coupling Receptor, CD4, heparin sulfate proteoglycan, annexin II, CD13 (aminopeptidase N), human aminopeptidase N receptor, hemagglutinin receptor, CR3 receptor, protein kinase receptor, galactose N-acetylgalactosamine inhibitory lectin Receptor, chemokine receptor, annexin I, actA protein, CD46 receptor, meningococcal virulence-related opa receptor, CD46 receptor Receptor, carcinoembryonic antigen family receptor, carcinoembryonic antigen family Bg1a receptor, gamma interferon receptor, glycoprotein gp70, rmc-1 receptor, human integrin receptor αvβ3, heparin sulfate proteoglycan receptor, CD66 receptor , Integrin receptor, membrane cofactor protein, CD46, GM1, GM2, GM3, CD3, ceramide, hemagglutinin-neuraminidase protein, erythrocyte P antigen receptor, CD36 receptor, glycophorin A receptor, interferon gamma receptor, KDEL Receptor, mucosal homing α4β7 receptor, epidermal growth factor receptor, α5β1 integrin protein, non-glycosylated J774 receptor, CXCR
1-4 receptor, CCR1-5 receptor, CXCR3 receptor, CCR5 receptor, gp46 surface glycoprotein,
52. The method according to claim 51, wherein the method is selected from the group consisting of TNFR p55 receptor, TNF p75 receptor, and soluble interleukin-1β receptor. 【請求項５３】 感染性病原体が細菌である、請求項４９または５１記載の
方法。53. The method of claim 49 or 51, wherein the infectious agent is a bacterium. 【請求項５４】 前記細菌がミコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ
、ナイセリア(Neisseria) spp.、レジオネラ、シゲラ(Shigella) spp.、コレラ 菌(Vibrio cholerae)、連鎖球菌、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)
、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ヘモフィ
ルス(Haemophilus) spp.、クラミジア(Chlamydia) spp.、および大腸菌(Escheri
chia coli)からなる群より選択されるか、あるいは梅毒またはライム病を引き起
こす、請求項５３記載の方法。54. The bacterium is mycobacteria, rickettsia, mycoplasma, Neisseria spp., Legionella, Shigella spp., Vibrio cholerae, Streptococcus, Corynebacterium diphtheriae.
, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Haemophilus spp., Chlamydia spp., And Escherichia coli (Escheri)
54. The method of claim 53, wherein the method is selected from the group consisting of: chia coli) or causes syphilis or Lyme disease. 【請求項５５】 感染性病原体がウイルスである、請求項４９または５１記
載の方法。55. The method of claim 49 or 51, wherein the infectious agent is a virus. 【請求項５６】 前記ウイルスがＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフル
エンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスII型、牛疫、
ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、
乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、ア
ルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイル
ス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型
、ヒト免疫不全ウイルスII型、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、カリチウ
イルス科、ノーウォーク(Norwalk)グループのウイルス、トガウイルス、アルフ ァウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マルブルク(M
arburg)ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミク ソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、
オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスII
型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイ
ルス、エプスタイン-バーウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス-6、オナガザル・ ヘルペスウイルス１、およびポックスウイルスからなる群より選択される、請求
項５３記載の方法。56. The virus, wherein the virus is hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, influenza, varicella, adenovirus, herpes simplex type I, herpes simplex type II, rinderpest,
Rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus,
Papilloma virus, Papova virus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Hantavirus, Coxsackievirus, Mumps virus, Measles virus, Rubella virus, Poliovirus, Human immunodeficiency virus type I, Human immunodeficiency virus II Type, picornavirus, enterovirus, caliciviridae, Norwalk group virus, togavirus, alphavirus, flavivirus, coronavirus, rabies virus, Malburg (M
arburg) virus, Ebola virus, Parainfluenza virus, Orthomixovirus, Bunyavirus, Arenavirus, Reovirus, Rotavirus,
Orbivirus, human T-cell leukemia virus type I, human T-cell leukemia virus II
54. A simian immunodeficiency virus, a lentivirus, a polyomavirus, a parvovirus, an Epstein-Barr virus, a human herpes virus-6, a herb herpesvirus 1, and a poxvirus. the method of. 【請求項５７】 感染性病原体が寄生体である、請求項４９または５１記載
の方法。57. The method of claim 49 or 51, wherein the infectious agent is a parasite. 【請求項５８】 前記寄生体がプラスモディウム（マラリア原虫）、アイメ
リア、リーシュマニア、コクジディオア(kokzidioa)、トリパノソーマ、および 真菌からなる群より選択される、請求項５７記載の方法。58. The method of claim 57, wherein said parasite is selected from the group consisting of Plasmodium (plasmodium malaria), Eimeria, Leishmania, kokzidioa, trypanosomes, and fungi. 【請求項５９】 第１の免疫グロブリン分子がIgG、IgE、IgM、IgDおよびIg
Aからなる群より選択されるタイプのものである、請求項３４記載の方法。59. The first immunoglobulin molecule is IgG, IgE, IgM, IgD and Ig.
35. The method of claim 34, wherein the method is of a type selected from the group consisting of A. 【請求項６０】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量の第１の免
疫グロブリン分子のフラグメントを投与することからなる、被験者において抗イ
ディオタイプ応答を生成させる方法であって、前記フラグメントが可変領域を含
み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特異的に
結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子の対応するフラグメントと同一で
あり、そして前記１以上のアミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジス
ルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置
での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基による置換である、上記方法。60. A method of generating an anti-idiotype response in a subject, comprising administering a fragment of a first immunoglobulin molecule in an amount sufficient to elicit an anti-idiotype response, wherein said fragment is variable. The same as a corresponding fragment of a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen, except for one or more amino acid substitutions in the variable region, and Is a substitution at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in a second immunoglobulin molecule with an amino acid residue having no sulfhydryl group. , The above method. 【請求項６１】 前記被験者から、第２の免疫グロブリン分子のイディオタ
イプを認識する抗体を単離し、該抗体を第２の被験者に投与することをさらに含
む、請求項６０記載の方法。61. The method of claim 60, further comprising isolating from said subject an antibody recognizing an idiotype of a second immunoglobulin molecule, and administering said antibody to said second subject. 【請求項６２】 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項６０記載の方法。62. The method of claim 60, wherein said antigen is a tumor antigen. 【請求項６３】 前記抗原が癌抗原である、請求項６０記載の方法。63. The method of claim 60, wherein said antigen is a cancer antigen. 【請求項６４】 前記抗原が多型性上皮ムチン抗原である、請求項６０記載
の方法。64. The method of claim 60, wherein said antigen is a polymorphic epithelial mucin antigen. 【請求項６５】 前記抗原がヒト大腸癌関連タンパク質抗原である、請求項
６２記載の方法。65. The method of claim 62, wherein said antigen is a human colon cancer associated protein antigen. 【請求項６６】 前記抗原がヒト大腸癌関連炭水化物抗原である、請求項６
２記載の方法。66. The method of claim 6, wherein the antigen is a human colon cancer-associated carbohydrate antigen.
2. The method according to 2. 【請求項６７】 前記可変領域がＬ鎖可変領域であり、スルフヒドリル基を
もたない前記アミノ酸残基が第２の免疫グロブリン分子のＬ鎖可変領域の23位ま
たは88位に対応する位置にある、請求項６０記載の方法。67. The variable region is an L chain variable region, and the amino acid residue having no sulfhydryl group is located at a position corresponding to position 23 or 88 of the L chain variable region of the second immunoglobulin molecule. 61. The method of claim 60. 【請求項６８】 前記可変領域がＨ鎖可変領域であり、スルフヒドリル基を
もたない前記アミノ酸残基が第２の免疫グロブリン分子のＨ鎖可変領域の22位ま
たは92位に対応する位置にある、請求項６０記載の方法。68. The variable region is an H chain variable region, and the amino acid residue having no sulfhydryl group is located at a position corresponding to position 22 or 92 of the H chain variable region of the second immunoglobulin molecule. 61. The method of claim 60. 【請求項６９】 スルフヒドリル基をもたない前記アミノ酸残基がアラニン
である、請求項６０、６７または６８記載の方法。69. The method according to claim 60, 67 or 68, wherein said amino acid residue having no sulfhydryl group is alanine. 【請求項７０】 前記抗原がヒト乳脂肪球抗原である、請求項６３記載の方
法。70. The method of claim 63, wherein said antigen is a human milk fat globule antigen. 【請求項７１】 前記抗原が***、卵巣、子宮、前立腺、膀胱、肺、皮膚、
膵臓、大腸、胃腸管、Ｂ細胞またはＴ細胞の癌の抗原である、請求項６３記載の
方法。71. The antigen may be for breast, ovary, uterus, prostate, bladder, lung, skin,
64. The method of claim 63, which is an antigen of a pancreatic, colon, gastrointestinal tract, B cell or T cell cancer. 【請求項７２】 前記抗原が感染性病原体の抗原である、請求項６０記載の
方法。72. The method of claim 60, wherein said antigen is an antigen of an infectious pathogen. 【請求項７３】 前記抗原がインフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒト呼
吸シンシチアルウイルスＧ糖タンパク質、デング熱ウイルスのコアタンパク質、
デング熱ウイルスのマトリックスタンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝集素、単純
ヘルペスウイルス２型の糖タンパク質gB、ポリオウイルスI VP1、HIV Iのエンベ
ロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、連鎖球菌24Mエピト ープ、淋菌ピリン、仮性狂犬病ウイルスg50、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質 Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎ウイルス糖タンパク質19
5、伝染性胃腸炎ウイルスマトリックスタンパク質、ブタ・ロタウイルス糖タン パク質38、ブタ・パルボウイルスキャプシドタンパク質、Serpulina hydodysent
eriae 防御抗原、ウシ・ウイルス性下痢糖タンパク質55、ニューカッスル病ウイ
ルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、ブタ・インフルエンザウイルス赤血球凝
集素、ブタ・インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、感染性ウシ鼻気管炎ウ
イルス糖タンパク質Ｅ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タン
パク質Ｉ、La Crosse ウイルスの糖タンパク質、新生児ウシ下痢ウイルス、Ｂ型
肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ウマ・インフルエン
ザウイルスＡ型／Alaska 91 ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルス
Ａ型／Miami 63 ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／Kentu
cky 81 ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、ウマ ・ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄ、ウシ呼吸シンシチアルウイルス付着タ
ンパク質、ウシ呼吸シンシチアルウイルス融合タンパク質、ウシ呼吸シンシチア
ルウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス
３型融合タンパク質、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイ
ラミニダーゼ、ウシ・ウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質48、およびウシ下痢
ウイルス糖タンパク質53からなる群より選択される、請求項７２記載の方法。73. The antigen may be influenza virus hemagglutinin, human respiratory syncytial virus G glycoprotein, dengue virus core protein,
Dengue virus matrix protein, measles virus hemagglutinin, herpes simplex virus type 2 glycoprotein gB, poliovirus IVP1, HIV I envelope glycoprotein, hepatitis B surface antigen, diphtheria toxin, streptococcal 24M epitope, Neisseria gonorrhoeae pilin, pseudorabies virus g50, pseudorabies virus glycoprotein H, pseudorabies virus glycoprotein E, infectious gastroenteritis virus glycoprotein 19
5. Infectious gastroenteritis virus matrix protein, porcine rotavirus glycoprotein 38, porcine parvovirus capsid protein, Serpulina hydodysent
eriae protective antigen, bovine viral diarrhea glycoprotein 55, Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase, swine influenza virus hemagglutinin, swine influenza virus neuraminidase, infectious bovine rhinotracheitis virus glycoprotein E, infectious larynx Tracheitis virus glycoprotein G or glycoprotein I, glycoprotein of La Crosse virus, neonatal bovine diarrhea virus, hepatitis B virus core protein, hepatitis B virus surface antigen, equine influenza virus A / Alaska 91 neuraminidase, horse. Influenza virus type A / Miami 63 neuraminidase, equine influenza virus type A / Kentu
cky 81 neuraminidase, equine herpesvirus type 1 glycoprotein B, equine herpesvirus type 1 glycoprotein D, bovine respiratory syncytial virus attachment protein, bovine respiratory syncytial virus fusion protein, bovine respiratory syncytial virus nucleocapsid A protein, a bovine parainfluenza virus type 3 fusion protein, a bovine parainfluenza virus type 3 hemagglutinin neuraminidase, a bovine viral diarrhea virus glycoprotein 48, and a bovine diarrhea virus glycoprotein 53. Item 72. The method according to Item 72. 【請求項７４】 前記抗原が感染性病原体に対する細胞受容体である、請求
項６０記載の方法。74. The method of claim 60, wherein said antigen is a cell receptor for an infectious agent. 【請求項７５】 前記細胞受容体がLPV受容体、アデニル酸シクラーゼ、BDV
表面糖タンパク質、N-アセチル-9-O-アセチルノイラミン酸受容体、CD4+、高度 に硫酸化されたタイプのヘパリン硫酸、p65、Galα1-4-Gal含有イソ受容体、CD1
6b、インテグリンVLA-2受容体、EV受容体、CD14、グリココンジュゲート受容体 、α／βＴ細胞受容体、崩壊促進因子受容体、細胞外エンベロープ糖タンパク質
受容体、免疫グロブリンFc受容体、ポックスウイルスM-T7、GALV受容体、CD14受
容体、Lewis(b)血液型抗原受容体、Ｔ細胞受容体、ヘパリン硫酸グリコアミノグ
リカン受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、CD11a、CD2、Ｇタンパク質共役受容
体、CD4、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、アネキシンII、CD13（アミノペプチ ダーゼＮ）、ヒト・アミノペプチダーゼＮ受容体、赤血球凝集素受容体、CR3受 容体、プロテインキナーゼ受容体、ガラクトースN-アセチルガラクトサミン阻害
性レクチン受容体、ケモカイン受容体、アネキシンＩ、actAタンパク質、CD46受
容体、髄膜炎菌ビルレンス関連opa受容体、CD46受容体、癌胎児性抗原ファミリ ー受容体、癌胎児性抗原ファミリーBg1a受容体、γインターフェロン受容体、糖
タンパク質gp70、rmc-1受容体、ヒトインテグリン受容体αvβ3、ヘパリン硫酸 プロテオグリカン受容体、CD66受容体、インテグリン受容体、膜コファクタータ
ンパク質、CD46、GM1、GM2、GM3、CD3、セラミド、赤血球凝集素−ノイラミニダ
ーゼタンパク質、赤血球Ｐ抗原受容体、CD36受容体、グリコホリンＡ受容体、イ
ンターフェロンγ受容体、KDEL受容体、粘膜ホーミングα4β7受容体、上皮増殖
因子受容体、α5β1インテグリンタンパク質、非グリコシル化J774受容体、CXCR
1-4受容体、CCR1-5受容体、CXCR3受容体、CCR5受容体、gp46表面糖タンパク質、
TNFR p55受容体、TNF p75受容体、可溶性インターロイキン-1β受容体からなる 群より選択される、請求項７４記載の方法。75. The cell receptor may be LPV receptor, adenylate cyclase, BDV
Surface glycoprotein, N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid receptor, CD4 + , highly sulfated heparin sulfate, p65, Galα1-4-Gal-containing isoreceptor, CD1
6b, integrin VLA-2 receptor, EV receptor, CD14, glycoconjugate receptor, α / β T cell receptor, decay accelerating factor receptor, extracellular envelope glycoprotein receptor, immunoglobulin Fc receptor, poxvirus M-T7, GALV receptor, CD14 receptor, Lewis (b) blood group antigen receptor, T cell receptor, heparin sulfate glycoaminoglycan receptor, fibroblast growth factor receptor, CD11a, CD2, G protein coupling Receptor, CD4, heparin sulfate proteoglycan, annexin II, CD13 (aminopeptidase N), human aminopeptidase N receptor, hemagglutinin receptor, CR3 receptor, protein kinase receptor, galactose N-acetylgalactosamine inhibitory lectin Receptor, chemokine receptor, annexin I, actA protein, CD46 receptor, meningococcal virulence-related opa receptor, CD46 receptor Receptor, carcinoembryonic antigen family receptor, carcinoembryonic antigen family Bg1a receptor, gamma interferon receptor, glycoprotein gp70, rmc-1 receptor, human integrin receptor αvβ3, heparin sulfate proteoglycan receptor, CD66 receptor , Integrin receptor, membrane cofactor protein, CD46, GM1, GM2, GM3, CD3, ceramide, hemagglutinin-neuraminidase protein, erythrocyte P antigen receptor, CD36 receptor, glycophorin A receptor, interferon gamma receptor, KDEL Receptor, mucosal homing α4β7 receptor, epidermal growth factor receptor, α5β1 integrin protein, non-glycosylated J774 receptor, CXCR
1-4 receptor, CCR1-5 receptor, CXCR3 receptor, CCR5 receptor, gp46 surface glycoprotein,
75. The method of claim 74, wherein the method is selected from the group consisting of a TNFR p55 receptor, a TNF p75 receptor, and a soluble interleukin-1β receptor. 【請求項７６】 感染性病原体が細菌である、請求項７２または７４記載の
方法。76. The method of claim 72 or claim 74, wherein the infectious agent is a bacterium. 【請求項７７】 前記細菌がミコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ
、ナイセリア(Neisseria) spp.、レジオネラ、シゲラ(Shigella) spp.、コレラ 菌(Vibrio cholerae)、連鎖球菌、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)
、破傷風菌(Clostridium tetani)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ヘモフィ
ルス(Haemophilus) spp.、クラミジア(Chlamydia) spp.、および大腸菌(Escheri
chia coli)からなる群より選択されるか、あるいは梅毒またはライム病を引き起
こす、請求項７６記載の方法。77. The bacterium is mycobacteria, rickettsia, mycoplasma, Neisseria spp., Legionella, Shigella spp., Vibrio cholerae, Streptococcus, Corynebacterium diphtheriae.
, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Haemophilus spp., Chlamydia spp., And Escherichia coli (Escheri)
77. The method of claim 76, wherein the method is selected from the group consisting of chia coli) or causes syphilis or Lyme disease. 【請求項７８】 感染性病原体がウイルスである、請求項７２または７４記
載の方法。78. The method of claim 72 or 74, wherein the infectious agent is a virus. 【請求項７９】 前記ウイルスがＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフル
エンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスII型、牛疫、
ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、
乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、ア
ルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイル
ス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型
、ヒト免疫不全ウイルスII型、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、カリチウ
イルス科、ノーウォーク(Norwalk)グループのウイルス、トガウイルス、アルフ ァウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マルブルク(M
arburg)ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミク ソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、
オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスII
型、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイ
ルス、エプスタイン-バーウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス-6、オナガザル・ ヘルペスウイルス１、およびポックスウイルスからなる群より選択される、請求
項７８記載の方法。79. The virus, wherein the virus is hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, influenza, varicella, adenovirus, herpes simplex I, herpes simplex II, rinderpest,
Rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus,
Papilloma virus, Papova virus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Hantavirus, Coxsackievirus, Mumps virus, Measles virus, Rubella virus, Poliovirus, Human immunodeficiency virus type I, Human immunodeficiency virus II Type, picornavirus, enterovirus, caliciviridae, Norwalk group virus, togavirus, alphavirus, flavivirus, coronavirus, rabies virus, Malburg (M
arburg) virus, Ebola virus, Parainfluenza virus, Orthomixovirus, Bunyavirus, Arenavirus, Reovirus, Rotavirus,
Orbivirus, human T-cell leukemia virus type I, human T-cell leukemia virus II
79. A member selected from the group consisting of: simian immunodeficiency virus, lentivirus, polyomavirus, parvovirus, Epstein-Barr virus, human herpesvirus-6, gibbon herpesvirus 1, and poxvirus. the method of. 【請求項８０】 感染性病原体が寄生体である、請求項７２または７４記載
の方法。80. The method of claim 72 or 74, wherein the infectious agent is a parasite. 【請求項８１】 前記寄生体がプラスモディウム（マラリア原虫）、アイメ
リア、リーシュマニア、コクジディオア(kokzidioa)、トリパノソーマ、および 真菌からなる群より選択される、請求項８０記載の方法。81. The method of claim 80, wherein said parasite is selected from the group consisting of Plasmodium (plasmodium), Eimeria, Leishmania, kokzidioa, trypanosomes, and fungi. 【請求項８２】 前記フラグメントが一本鎖免疫グロブリンである、請求項
６０記載の方法。82. The method of claim 60, wherein said fragment is a single chain immunoglobulin. 【請求項８３】 前記フラグメントがFabフラグメント、(Fab')2フラグメン
ト、Ｈ鎖二量体、Ｌ鎖二量体、またはFvフラグメントである、請求項８２記載の
方法。83. The method of claim 82, wherein said fragment is a Fab fragment, (Fab ′) 2 fragment, H chain dimer, L chain dimer, or Fv fragment. 【請求項８４】 前記フラグメントが定常領域をさらに含む、請求項６０記
載の方法。84. The method of claim 60, wherein said fragment further comprises a constant region. 【請求項８５】 可変領域がマウス免疫グロブリン由来であり、定常領域が
ヒト免疫グロブリン由来である、請求項８４記載の方法。85. The method of claim 84, wherein the variable region is from a mouse immunoglobulin and the constant region is from a human immunoglobulin. 【請求項８６】 可変領域がヒト抗体由来のフレームワーク領域とマウス免
疫グロブリン由来の相補性決定領域(CDR)を有する、請求項６０記載の方法。86. The method of claim 60, wherein the variable region has a framework region from a human antibody and a complementarity determining region (CDR) from a mouse immunoglobulin. 【請求項８７】 癌の治療または予防を必要とする被験者において癌を治療
または予防する方法であって、被験者に、抗イディオタイプ応答を引き出すのに
十分な量の第１の免疫グロブリン分子および製薬上許容される担体を含有するワ
クチン組成物を投与することからなり、前記第１の免疫グロブリン分子が可変領
域を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、癌抗原に免疫
特異的に結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子と同一であり、前記１以
上のアミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成し
ている１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル
基をもたないアミノ酸残基による置換である、上記方法。87. A method of treating or preventing cancer in a subject in need of treatment or prevention of the cancer, comprising providing the subject with an amount of the first immunoglobulin molecule and a pharmaceutical agent sufficient to elicit an anti-idiotypic response. Administering a vaccine composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, wherein said first immunoglobulin molecule comprises a variable region and, except for one or more amino acid substitutions in said variable region, comprises the steps of: One or more cysteine residues that are identical to a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding, wherein said one or more amino acid substitutions form a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule; The above method, wherein the amino acid is substituted by an amino acid residue having no sulfhydryl group at one or more positions corresponding to the above. 【請求項８８】 感染症の治療または予防を必要とする被験者において感染
症を治療または予防する方法であって、被験者に、抗イディオタイプ応答を引き
出すのに十分な量の第１の免疫グロブリン分子および製薬上許容される担体を含
有するワクチン組成物を投与することからなり、前記第１の免疫グロブリン分子
が可変領域を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、感染
性病原体の抗原に免疫特異的に結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子と
同一であり、前記１以上のアミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジス
ルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置
での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基による置換である、上記方法。88. A method of treating or preventing an infection in a subject in need of treatment or prevention of the infection, the method comprising providing the subject with an amount of a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotypic response. And administering a vaccine composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the first immunoglobulin molecule comprises a variable region and, except for one or more amino acid substitutions in the variable region, A second immunoglobulin molecule that is identical to a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen of a sexual pathogen, wherein the one or more amino acid substitutions form a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. The above method, wherein the substitution is at one or more positions corresponding to the above cysteine residues with an amino acid residue having no sulfhydryl group. 【請求項８９】 感染症の治療または予防を必要とする被験者において感染
症を治療または予防する方法であって、被験者に、抗イディオタイプ応答を引き
出すのに十分な量の第１の免疫グロブリン分子および製薬上許容される担体を含
有するワクチン組成物を投与することからなり、前記第１の免疫グロブリン分子
が可変領域を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、感染
性病原体に対する細胞受容体に免疫特異的に結合する能力がある第２の免疫グロ
ブリン分子と同一であり、前記１以上のアミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン
分子中でジスルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基に対応する
１以上の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基による置換である
、上記方法。89. A method of treating or preventing an infection in a subject in need of treatment or prevention of the infection, comprising administering to the subject an amount of a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotypic response. And administering a vaccine composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the first immunoglobulin molecule comprises a variable region and, except for one or more amino acid substitutions in the variable region, The second immunoglobulin molecule is identical to the second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to a cellular receptor for a sexual pathogen, wherein the one or more amino acid substitutions form a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule Such a method, wherein the substitution is at one or more positions corresponding to the one or more cysteine residues with an amino acid residue without a sulfhydryl group. 【請求項９０】 前記感染症が梅毒、淋病、AIDS、赤痢、サルモネラ、Ａ型
肝炎、Ｃ型肝炎、ライム病、脳炎、ヘルペス、グラム陰性菌感染症、グラム陽性
菌感染症、および肺炎球菌感染症からなる群より選択される、請求項８８または
８９記載の方法。90. The infection is syphilis, gonorrhea, AIDS, dysentery, salmonella, hepatitis A, hepatitis C, Lyme disease, encephalitis, herpes, gram-negative, gram-positive, and pneumococcal infection. 90. The method of claim 88 or 89, wherein the method is selected from the group consisting of: 【請求項９１】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な第１の免疫グ
ロブリン分子を調製する方法であって、前記第１の免疫グロブリン分子が可変領
域を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特
異的に結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子と同一であり、前記１以上
のアミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成して
いる１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基
をもたないアミノ酸残基による置換であり、次の各ステップ： (a) 第２の免疫グロブリンをコードする核酸において、該ジスルフィド結合を
形成している１個以上のシステイン残基をコードするヌクレオチドを、スルフヒ
ドリル基をもたないアミノ酸残基をコードするヌクレオチドと置換することによ
り、第１の免疫グロブリン分子をコードする核酸を構築すること、 (b) ステップ(a)で構築した核酸を細胞に導入して、該細胞において第１の免 疫グロブリン分子を発現させること、および (c) 発現された第１の免疫グロブリン分子を回収すること、 を含んでなる、上記方法。91. A method for preparing a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotypic response, wherein the first immunoglobulin molecule comprises a variable region and one or more of the variable regions Is the same as a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen, except for the amino acid substitution of, wherein the one or more amino acid substitutions form a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. A substitution at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues by a non-sulfhydryl group-containing amino acid residue, each of the following steps: (a) encoding a second immunoglobulin; In a nucleic acid, a nucleotide encoding one or more cysteine residues forming the disulfide bond encodes an amino acid residue having no sulfhydryl group. Constructing a nucleic acid encoding the first immunoglobulin molecule by substituting the nucleotide for the first immunoglobulin molecule; and (b) introducing the nucleic acid constructed in step (a) into a cell, where the first immunoglobulin molecule is introduced into the cell. And (c) recovering the expressed first immunoglobulin molecule. 【請求項９２】 前記ヌクレオチドが部位特異的突然変異誘発により置換さ
れる、請求項９１記載の方法。92. The method of claim 91, wherein said nucleotides are replaced by site-directed mutagenesis. 【請求項９３】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な第１の免疫グ
ロブリン分子を調製する方法であって、前記第１の免疫グロブリン分子が可変領
域を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特
異的に結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子と同一であり、前記１以上
のアミノ酸置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成して
いる１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基
をもたないアミノ酸残基による置換であり、次の各ステップ： (a) 第１の免疫グロブリン分子をコードする人工遺伝子を含む核酸を合成する
こと、 (b) ステップ(a)で合成した核酸を細胞に導入して、該細胞において第１の免 疫グロブリン分子を発現させること、および (c) 発現された第１の免疫グロブリン分子を回収すること、 を含んでなる、上記方法。93. A method for preparing a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotypic response, wherein said first immunoglobulin molecule comprises a variable region and one or more of said variable regions Is the same as a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen, except for the amino acid substitution of, wherein the one or more amino acid substitutions form a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. Substitutions at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues by a non-sulfhydryl group-containing amino acid residue, each of the following steps: (a) encoding a first immunoglobulin molecule; (B) introducing the nucleic acid synthesized in step (a) into a cell to express a first immunoglobulin molecule in the cell; and (c) recovering the expressed first immunoglobulin molecule. 【請求項９４】 第２の免疫グロブリン分子がMab 31.1またはMab 33.28で ある、請求項９１または９３記載の方法。94. The method of claim 91 or 93, wherein said second immunoglobulin molecule is Mab 31.1 or Mab 33.28. 【請求項９５】 第２の免疫グロブリン分子がHMFG-1である、請求項９１ま
たは９３記載の方法。95. The method of claim 91 or 93, wherein said second immunoglobulin molecule is HMFG-1. 【請求項９６】 抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量の第１の免
疫グロブリン分子および製薬上許容される担体を含有するワクチン組成物であっ
て、前記第１の免疫グロブリン分子が可変領域を含み、かつ該可変領域中の１以
上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特異的に結合する能力がある第２の免
疫グロブリン分子と同一であり、前記１以上のアミノ酸置換の少なくともいくつ
かの置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成している１
個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基をもた
ないアミノ酸残基１個以上による置換であり、そして第２の免疫グロブリン分子
中でジスルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基に対応する１以
上の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基１個以上による置換で
はないアミノ酸置換が安定化させる変化ではない、上記ワクチン組成物。96. A vaccine composition comprising an amount of a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotype response and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the first immunoglobulin molecule is a variable region And is identical to a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen, except for one or more amino acid substitutions in the variable region, and comprises at least some of the one or more amino acid substitutions. The substitution forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule.
Substitution at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues by one or more amino acid residues that do not have a sulfhydryl group and that form a disulfide bond in a second immunoglobulin molecule. Such a vaccine composition, wherein the amino acid substitution at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues that is not a substitution by one or more amino acid residues without a sulfhydryl group is not a stabilizing change. 【請求項９７】 被験者に、抗イディオタイプ応答を引き出すのに十分な量
の第１の免疫グロブリン分子を投与することからなる、被験者において抗イディ
オタイプ応答を生成させる方法であって、前記第１の免疫グロブリン分子が可変
領域を含み、かつ該可変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫
特異的に結合する能力がある第２の免疫グロブリン分子と同一であり、前記１以
上のアミノ酸置換の少なくともいくつかの置換が、第２の免疫グロブリン分子中
でジスルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基に対応する１以上
の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基による置換であり、そし
て第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を形成している１個以上のシ
ステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ
酸残基１個以上による置換ではないアミノ酸置換が安定化させる変化ではない、
上記方法。97. A method of producing an anti-idiotypic response in a subject, comprising administering to the subject an amount of a first immunoglobulin molecule sufficient to elicit an anti-idiotypic response. Wherein said immunoglobulin molecule comprises a variable region and is identical to a second immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to an antigen except for one or more amino acid substitutions in said variable region, At least some of the above amino acid substitutions do not have a sulfhydryl group at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. A substitution with an amino acid residue and corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. At the above positions, the amino acid substitution that is not a substitution with one or more amino acid residues having no sulfhydryl group is not a change that stabilizes,
The above method. 【請求項９８】 可変領域を含む第１の免疫グロブリン分子であって、該可
変領域中の１以上のアミノ酸置換を除いては、抗原に免疫特異的に結合する能力
がある第２の免疫グロブリン分子と同一であり、前記１以上のアミノ酸置換の少
なくともいくつかの置換が、第２の免疫グロブリン分子中でジスルフィド結合を
形成している１個以上のシステイン残基に対応する１以上の位置での、スルフヒ
ドリル基をもたないアミノ酸残基による置換であり、そして第２の免疫グロブリ
ン分子中でジスルフィド結合を形成している１個以上のシステイン残基に対応す
る１以上の位置での、スルフヒドリル基をもたないアミノ酸残基１個以上による
置換ではないアミノ酸置換が安定化させる変化ではない、上記第１の免疫グロブ
リン分子。98. A first immunoglobulin molecule comprising a variable region, wherein the second immunoglobulin is capable of immunospecifically binding to an antigen, except for one or more amino acid substitutions in the variable region. The same as the molecule, wherein at least some of the one or more amino acid substitutions are at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in the second immunoglobulin molecule. A sulfhydryl at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues forming a disulfide bond in a second immunoglobulin molecule in the second immunoglobulin molecule. The first immunoglobulin molecule, wherein the amino acid substitution that is not a substitution with one or more ungrouped amino acid residues is not a stabilizing change.
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