JP2002507433A - Fluorescence assay for topoisomerase inhibitors - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は流体中で試験化合物、ＤＮＡ、およびトポイソメラーゼを混合するステップと、流体をインキュベーションするステップと、次いでＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）などのシアニン核酸染料を組み込むステップと、蛍光を測定するステップと、対照からの蛍光と比較するステップとを具える、トポイソメラーゼ阻害剤としての試験化合物の活性を測定する方法を含む。 (57) [Summary] The invention comprises mixing a test compound, DNA and topoisomerase in a fluid, incubating the fluid, then incorporating a cyanine nucleic acid dye such as PicoGreen®, measuring the fluorescence, Comparing the fluorescence of the test compound with the fluorescence from a topoisomerase inhibitor.
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明はトポイソメラーゼ酵素、特に細菌のトポイソメラーゼを阻害する基質
の検出および／または定量的測度を提供するための蛍光染料を用いる分析手順に
関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to analytical procedures using fluorescent dyes to provide a detection and / or quantitative measure of substrates that inhibit topoisomerase enzymes, particularly bacterial topoisomerases.
【０００２】 （発明の背景） ジャイレース、すなわち、トポイソメラーゼＩＩ型は、必須の細菌酵素であり
、一般的な市販抗菌薬であるフルオロキノロンによるジャイレースの阻害は、急
速な細胞死をもたらす細菌の複製を阻害する。他の機能のうちで、ジャイレース
は、ＤＮＡ代謝および細菌の生存および複製に必須である細菌のＤＮＡスーパー
コイルを仲介する（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．、「DNA topoisomerases」、Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５巻、（１９９６）、６３５〜６９２頁を参照） トポイソメラーゼアッセイの基礎としてＤＮＡでのトポイソメラーゼの活性を
用いることはあまり成功していない（Ａｎｄｒｅａ，Ｊ．Ｅ．；Ａｄａｃｈｉ，
Ｋ．；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｒ．；「Fluorometric assays for DNA topoisomeras
es and topoisomerase-targeted drugs: quantitation of catalytic activity
and DNA cleavage」、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０巻（１９９１）
、４９５〜５０１頁；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｃ．Ｇ．；Ｓａｉｋｉ，Ａ．Ｙ．Ｃ．；Ｍ
ａｃｋｉｎｎｏｎ，Ａ．Ｃ．、およびＸｕｅｉ，Ｘ．；「High throughput scre
en for inhibitors of bacterial DNA topoisomerase I using the scintillati
on proximity assay」；Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｓｃｒｅｅｎｉｇ、ｖｏｌ．１
（３）（１９９６）、１１９〜１２７頁；およびＳａｎｄｈｕ，Ｌ．Ｃ．；Ｗａ
ｒｔｅｒｓ，Ｒ．Ｌ．；およびＤｅｔｈｌｅｆｓｅｎ，Ｌ．Ａ．；「Fluorescen
ce studies of Hoechst 33342 with supercoiled and relaxed plasmid pBR322
DNA」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、６巻（１９８５）、１９１〜１９４頁を参照のこ と）。BACKGROUND OF THE INVENTION Gyrase, or topoisomerase type II, is an essential bacterial enzyme, and inhibition of gyrase by the common commercial antimicrobial fluoroquinolone causes bacterial cell death that results in rapid cell death. Inhibits replication. Among other functions, gyrase mediates bacterial DNA supercoils that are essential for DNA metabolism and bacterial survival and replication (Wang, JC, "DNA topoisomerases", Annu.
Rev .. Biochem. , 65, (1996), pages 635-692). The use of topoisomerase activity on DNA as a basis for topoisomerase assays has been less successful (Andrea, JE; Adachi,
K. Morgan, A .; R. ; “Fluorometric assays for DNA topoisomeras
es and topoisomerase-targeted drugs: quantitation of catalytic activity
and DNA cleavage ", Molec. Pharmacol. , 40 (1991)
495-501; Lerner, C. et al. G. FIG. Saiki, A .; Y. C. ; M
ackinnon, A .; C. And Xuei, X .; ; "High throughput scre
en for inhibitors of bacterial DNA topoisomerase I using the scintillati
on proximity assay "; Biomolec. Screening, vol. 1
(3) (1996), pp. 119-127; and Sandhu, L .; C. ; Wa
ters, R.R. L. And Dethlefsen, L .; A. ; "Fluorescen
ce studies of Hoechst 33342 with supercoiled and relaxed plasmid pBR322
DNA ", Cytometry, 6 (1985), 191-194).
【０００３】 弛緩型またはスーパーコイルのＤＮＡを識別するためのゲルベースの方法が文
献に報告されているが、自動または高処理スクリーニングアッセイとして使用で
きる可能性を有するジャイレースアッセイに関する情報はほとんどない。（Ｓ．
Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｆ．；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ａ．；およびＧｏｏｔｚ
，Ｔ．Ｄ．；「In vitro assays used to measure the activity of topoisomer
ases」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，ｖｏｌ
．３４（１）（１９９０）、１〜７頁を参照。）臭化エチジウムなどの蛍光染料
は種々のＤＮＡトポロジーに特異に結びつく傾向があることが知られているが、
結果は一貫性がない。（Ｆｏｇｌｅｓｏｎｇ，Ｐ．Ｄ．；「Fluoremetric metho
ds employing low concentrations of ethidium bromide for DNA topoisomeras
e and endonuclease assays」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１８２ （１９８９）、２８４〜２８８頁；およびＭｏｒｇａｎ，Ａ．Ｒ．；Ｌｅｅ，Ｊ
．Ｓ．；Ｐｕｌｌｅｙｂｌａｎｋ，Ｄ．Ｅ．；Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｌ．；および
Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｈ．；「Review: ethidium fluorescence assays. Part 1. Ph
ysicochemical studies」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖ ｏｌ．７（３）（１９７９）、５４７〜５６９頁を参照。）Although gel-based methods for identifying relaxed or supercoiled DNA have been reported in the literature, there is little information on gyrase assays that have the potential to be used as automated or high-throughput screening assays. (S.
Barrett, J .; F. Sutcliffe, J .; A. And Goodtz
, T .; D. ; "In vitro assays used to measure the activity of topoisomer
ases ", Antimicrob. Agents Chemother. , Vol
. 34 (1) (1990), pp. 1-7. ) Fluorescent dyes such as ethidium bromide are known to tend to specifically bind to various DNA topologies,
The results are inconsistent. (Foglesong, PD; "Fluoremetric metho
ds employing low concentrations of ethidium bromide for DNA topoisomeras
e and endonuclease assays ", Anal. Biochem. , Vol. 182 (1989), 284-288; and Morgan, A .; R. Lee, J
. S. Pulleyblank, D .; E. FIG. Murray, N .; L. And Evans, D .; H. ; “Review: ethidium fluorescence assays. Part 1. Ph
ysicochemical studies, "Nucleic Acid Research, vol. 7 (3) (1979), pages 547-569. )
【０００４】 （発明の概要） 本発明は、注目する試験化合物の存在下および非存在下の両方でＤＮＡを注目
するトポイソメラーゼとインキュベーションし、シアニン核酸染料を取り込み、
試験化合物が存在するときと存在しないときに染料からの蛍光を比較することに
よって、トポイソメラーゼ阻害剤としての試験化合物の活性を測定するための方
法を含む。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention involves incubating DNA with a topoisomerase of interest, both in the presence and absence of a test compound of interest, to incorporate a cyanine nucleic acid dye,
Methods include determining the activity of a test compound as a topoisomerase inhibitor by comparing the fluorescence from the dye in the presence and absence of the test compound.
【０００５】 （発明の詳細な説明） 市販の基質（弛緩型ＤＮＡ）酵素（ジャイレース）および緩衝剤がジャイレー
ス仲介ＤＮＡスーパーコイルを実施するのに入手可能である。ＤＮＡトポ異性体
（例えば、弛緩型ＤＮＡおよびスーパーコイルＤＮＡ）を識別するための核酸染
色としての、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州より市販されている）などのシアニ
ン核酸染料の同定および適用は、本発明の主要な発見を現わしている。Ｐｉｃｏ
Ｇｒｅｅｎ（登録商標）は、二重鎖ＤＮＡを定量するのに一般的に用いられてい
るが、ＤＮＡトポ異性体を効果的に識別する道具としては記載されていない。（
Ｓｉｎｇｅｒ，Ｖ．Ｌ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．；Ｙｕｅ，Ｓ．Ｔ．；およびＨ
ａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．；「Characterization of PicoGreen reagent and de
velopement of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DN
A quantitation」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２４９（
１９９７）、２２８〜２３８頁；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉ
ｎｃ．社の製品情報シート：「PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent and Kit
」、１９９６を参照のこと。）DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Commercially available substrate (relaxed DNA) enzymes (gyrase) and buffers are available to implement gyrase-mediated DNA supercoils. PicoGreen® (Molecular Probe) as a nucleic acid stain to distinguish DNA topo isomers (eg, relaxed DNA and supercoiled DNA)
es, Inc. The identification and application of cyanine nucleic acid dyes (commercially available from Eugene, Oregon) represents a major finding of the present invention. Pico
Green® is commonly used to quantify double-stranded DNA, but is not described as a tool for effectively distinguishing DNA topo isomers. (
Singer, V .; L. Jones, L .; J. Yue, S .; T. And H
Augland, R.A. P. ; "Characterization of PicoGreen reagent and de
velopement of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DN
A quantitation ", Analytical Biochem. vol. 249 (
1997) pp. 228-238; and Molecular Probes, I.
nc. Product information sheet: “PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent and Kit
, 1996. )
【０００６】 本発明アッセイは、二重鎖ＤＮＡのトポロジー異性体の識別を可能とするので
、ＤＮＡトポ異性体の相互変換を触媒するトポイソメラーゼ（例えば、ジャイレ
ース）の阻害剤（例えば、フルオロキノロン）を薬剤誘導性のＤＮＡトポロジー
の変化（例えば、スーパーコイルの減少）により同定することができる。Ｐｉｃ
ｏＧｒｅｅｎ（登録商標）などの染料は、二重鎖ＤＮＡの弛緩型トポロジー異性
体およびスーパーコイルトポロジー異性体に差を伴って結びつく。他の核酸染料
と異なり、弛緩型ＤＮＡのジャイレース仲介スーパーコイルの後、スーパーコイ
ルＤＮＡ（生成物）に結合の際、再現性を伴ってより強く蛍光を発し、従前のア
ッセイにより達成されたものよりもＤＮＡトポ異性体間でのより明確な識別が可
能となる。ジャイレースの阻害剤は、コントロールと比較した蛍光の減少によっ
て同定しうる。[0006] The assay of the present invention allows the discrimination of topological isomers of double-stranded DNA, so that inhibitors of topoisomerase (eg, gyrase) that catalyze the interconversion of DNA topoisomers (eg, fluoroquinolones) Can be identified by drug-induced changes in DNA topology (eg, reduced supercoil). Pic
Dyes such as oGreen® differentially associate the relaxed and supercoiled topology isomers of double-stranded DNA. Unlike other nucleic acid dyes, after the gyrase-mediated supercoiling of relaxed DNA, upon binding to supercoiled DNA (product), it fluoresces more strongly with reproducibility and is achieved by previous assays More distinct discrimination between DNA topo isomers is possible. Inhibitors of gyrase can be identified by a decrease in fluorescence compared to controls.
【０００７】 本発明は、トポイソメラーゼ阻害剤としての試験化合物の活性を測定するため
の方法を含み、その方法は、 （ａ）試験化合物、ＤＮＡ、およびトポイソメラーゼを流体中で一緒に混合する
ステップと、 （ｂ）ステップ（ａ）の流体をインキュベーションするステップと、 （ｃ）ステップ（ｂ）のインキュベーションした流体にシアニン核酸染料を組み
込むステップと、 （ｄ）ステップ（ｃ）の流体中の染料からの蛍光を測定するステップと、 （ｅ）ステップ（ａ）の流体から試験化合物を省きステップ（ａ）から（ｄ）を
繰り返すステップと、 （ｆ）ステップ（ａ）の流体から試験化合物およびトポイソメラーゼを省きステ
ップ（ａ）から（ｄ）を任意に繰り返すステップと、 （ｇ）ステップ（ｄ）および（ｅ）または（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）で測定さ
れた蛍光を比較するステップを含む。The invention includes a method for measuring the activity of a test compound as a topoisomerase inhibitor, comprising: (a) mixing a test compound, DNA, and topoisomerase together in a fluid; (B) incubating the fluid of step (a); (c) incorporating a cyanine nucleic acid dye into the incubated fluid of step (b); and (d) fluorescence from the dye in the fluid of step (c). (E) omitting the test compound from the fluid of step (a) and repeating steps (a) to (d); and (f) omitting the test compound and topoisomerase from the fluid of step (a). (A) arbitrarily repeating (d); (g) steps (d) and (e) or ( ), Comprising the step of comparing the fluorescence measured in (e) and (f).
【０００８】 ステップ（ａ）において、試験化合物、ＤＮＡ、およびトポイソメラーゼを完
全に混合して、好ましくは澄んだ懸濁液として、より好ましくは溶液となるよう
に、流体の液体成分を選択する。流体は水性ベースが好ましいが、他の溶媒また
は溶媒混合物（例えば、水／共溶媒混合物）ベースであっても良い。本目的用の
水と混合される共溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＮ
，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む。流体は好ましくは水溶液または
約２％までの共溶媒を含む水／共溶媒溶液である。[0008] In step (a), the liquid component of the fluid is selected such that the test compound, DNA, and topoisomerase are thoroughly mixed, preferably as a clear suspension, more preferably as a solution. The fluid is preferably aqueous based, but may be based on other solvents or solvent mixtures (eg, water / co-solvent mixtures). Co-solvents mixed with water for this purpose include, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO) and N
, N-dimethylformamide (DMF). The fluid is preferably an aqueous solution or a water / co-solvent solution containing up to about 2% co-solvent.
【０００９】 典型的には、注目するトポイソメラーゼ酵素を阻害しうる試験化合物の、濃度
範囲、および特に最低濃度を確めるために本発明の方法を用いて、２以上の濃度
の試験化合物を試験する。好ましくは約３から約８またはそれ以上の異なる濃度
の試験化合物を試験する。最高濃度から最低濃度の比は約１０2から約１０5であ
る。ステップ（ａ）の流体中の試験化合物の濃度は、好ましくは約０．１μｇ／
ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１μｇ／ｍｌから約１００μ
ｇ／ｍｌである。Typically, two or more concentrations of a test compound are tested using the methods of the present invention to establish a concentration range, and especially a minimum concentration, of the test compound capable of inhibiting the topoisomerase enzyme of interest. I do. Preferably about 3 to about 8 or more different concentrations of the test compound are tested. The ratio of the minimum density from the highest density is from about 10 2 to about 10 5. The concentration of the test compound in the fluid of step (a) is preferably about 0.1 μg /
ml to about 1000 μg / ml, more preferably from about 1 μg / ml to about 100 μg.
g / ml.
【００１０】 ＤＮＡは、トポイソメラーゼを相補するように選択され、そこではトポイソメ
ラーゼとの相互作用により変えらえるＤＮＡが必要とされる。例えば、ジャイレ
ース（トポイソメラーゼＩＩ型）は、ＤＮＡのスーパーコイルを促進する。ジャ
イレースとの相互作用には、弛緩型ＤＮＡが好ましい。適切な市販されている弛
緩型ＤＮＡは、Ｌｕｃｅｎｔ Ｌｔｄ．（Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）から
入手可能な弛緩型プラスミドｐＢＲ３２２である。[0010] The DNA is selected to complement the topoisomerase, where DNA that can be altered by interaction with topoisomerase is required. For example, gyrase (topoisomerase type II) promotes supercoiling of DNA. For interaction with gyrase, relaxed DNA is preferred. Suitable commercially available relaxed DNAs are available from Lucent Ltd. (Released, UK), a relaxed plasmid pBR322.
【００１１】 ステップ（ａ）の流体中のＤＮＡ濃度は、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌから
約１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌであ
る。ステップ（ａ）の流体中の試験化合物：ＤＮＡのモル比は、好ましくは約１
：１０-7から約１：１０-3、より好ましくは約１：１０-6から約１：１０-4であ
る。The DNA concentration in the fluid of step (a) is preferably from about 0.1 μg / ml to about 100 μg / ml, more preferably from about 1 μg / ml to about 50 μg / ml. The molar ratio of test compound: DNA in the fluid of step (a) is preferably about 1
: 10 -7 to about 1 -10 -3 , more preferably from about 1 -10 -6 to about 1 -10 -4 .
【００１２】 一般的に本発明方法を採用する目的は、注目するある種の生物、特に病原細菌
のトポイソメラーゼを阻害する化合物を同定することである。細菌トポイソメラ
ーゼを阻害する化合物は、そのような細菌を死に至らしめうる。トポイソメラー
ゼＩ型およびＩＩ型が知られており、本発明の方法に有用である。ジャイレース
はＤＮＡのスーパーコイルを促進することが知られている好ましいトポイソメラ
ーゼＩＩ型である。本発明方法の使用に好ましい市販されているトポイソメラー
ゼは、以下の、「野生型」ジャイレース、例えば、Ｌｕｃｅｎｔ Ｌｔｄ．から
入手可能な大腸菌からの「野生型」ジャイレースおよびＬｕｃｅｎｔ Ｌｔｄ．
から入手可能なＡ（Ｔｒｐ）2Ｂ2などの「キノロン耐性型ジャイレース」等を含
む。In general, the aim of employing the method of the invention is to identify compounds which inhibit the topoisomerase of certain organisms of interest, especially pathogenic bacteria. Compounds that inhibit bacterial topoisomerase can cause such bacteria to die. Topoisomerase types I and II are known and are useful in the methods of the invention. Gyrase is a preferred topoisomerase type II known to promote supercoiling of DNA. Preferred commercially available topoisomerases for use in the methods of the present invention include the following “wild-type” gyrase, for example, Lucent Ltd. "Wild-type" gyrase from E. coli available from Lucent Ltd.
And “Quinolone-resistant gyrase” such as A (Trp) 2 B 2 available from Toshiba Corporation.
【００１３】 ステップ（ａ）の流体は、好ましくは約０．００１μｇ／ｍｌから約１０μｇ
／ｍｌ、より好ましくは約０．０１μｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌの濃度のトポ
イソメラーゼを含む。ステップ（ａ）の流体は、ＤＮＡ：トポイソメラーゼのモ
ル比が、好ましくは約１０：１から約１：１００、より好ましくは約１：１から
約１：１０である。[0013] The fluid of step (a) preferably comprises from about 0.001 μg / ml to about 10 μg
/ Ml, more preferably from about 0.01 μg / ml to about 1 μg / ml. The fluid of step (a) preferably has a DNA: topoisomerase molar ratio of about 10: 1 to about 1: 100, more preferably about 1: 1 to about 1:10.
【００１４】 ステップ（ｂ）において、試験化合物によりＤＮＡの変化の促進が阻害されな
ければ、トポイソメラーゼがＤＮＡにおける変化を促進させるようにステップ（
ａ）の流体をインキュベーションする。インキュベーションは、好ましくは約０
．２時間から約２４時間、より好ましくは約１時間から約６時間の期間、好まし
くは約２０℃から約５５℃、より好ましくは約３５℃から約４０℃の温度で行う
。In step (b), if the test compound does not inhibit the promotion of the change in DNA, the step (topo isomerase) promotes the change in the DNA (
Incubate the fluid of a). Incubation is preferably at about 0
. It is carried out for a period of from 2 hours to about 24 hours, more preferably for about 1 hour to about 6 hours, preferably at a temperature of about 20 ° C to about 55 ° C, more preferably about 35 ° C to about 40 ° C.
【００１５】 ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）のインキュベーションした流体にシ
アニン核酸染料を組み込む。本発明アッセイに有用な好ましいシアニン核酸染料
は、Ｈａｕｇｌａｎｄら、およびＹｕｅらにそれぞれ、１９９５年７月２５日お
よび１９９７年８月１９日に付与された米国特許第５４３６１３４号および第５
６５８７５１号に開示されており、共に引用により本明細書に組み込む。Ｐｉｃ
ｏＧｒｅｅｎ（登録商標）は、本発明方法に有用な、非常に好ましいシアニン核
酸染料である。In step (c), a cyanine nucleic acid dye is incorporated into the incubated fluid of step (b). Preferred cyanine nucleic acid dyes useful in the assays of the present invention are described in Haugland et al. And Yue et al., US Pat.
No. 6,587,751, both of which are incorporated herein by reference. Pic
oGreen® is a highly preferred cyanine nucleic acid dye useful in the method of the invention.
【００１６】 染料をステップ（ｂ）でインキュベーションされた流体に添加し、ステップ（
ｃ）の流体中の染料の濃度は、好ましくは約０．０１μＭから約１０μＭ、より
好ましくは約０．１μＭから約１μＭである。ステップ（ｃ）の流体中のＤＮＡ
：染料のモル比は、好ましくは約１：１０13から約１：１０17、より好ましくは
約１：１０14から約１：１０16である ステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）の流体中の染料からの蛍光は既知の
方法を用いて測定される。波長または励起および発光は、一般的に各染料に特有
なものであり、過度の実験なしに容易に確認することができる。本発明方法に有
用なシアニン染料に好ましいのは、約４７０ｎｍから約５００ｎｍ、より好まし
くは約４８０ｎｍから約４９０ｎｍの励起、および好ましくは約５１０ｎｍから
約５４０ｎｍ、より好ましくは約５２０ｎｍから約５３０ｎｍの発光である。Adding a dye to the fluid incubated in step (b),
The concentration of the dye in the fluid of c) is preferably from about 0.01 μM to about 10 μM, more preferably from about 0.1 μM to about 1 μM. DNA in the fluid of step (c)
The molar ratio of the dye, preferably at from about 1:10 to 13 about 1:10 17, more preferably from about 1:10 to 14 about 1:10 16 step (d), the fluid in the step (c) The fluorescence from the dyes is measured using known methods. Wavelength or excitation and emission are generally specific to each dye and can be easily ascertained without undue experimentation. Preferred for the cyanine dyes useful in the method of the invention are excitation from about 470 nm to about 500 nm, more preferably from about 480 nm to about 490 nm, and preferably emission from about 510 nm to about 540 nm, more preferably from about 520 nm to about 530 nm. is there.
【００１７】 （実施例） 以下に、高処理スクリーニングアッセイを実施するのに有用な標準的９６ウェ
ルプレートを用いる、本発明アッセイ手順の使用の実施例を示すが、これらに限
定されるものでない。EXAMPLES The following are non-limiting examples of the use of the assay procedures of the invention using standard 96-well plates useful for performing high-throughput screening assays.
【００１８】 アッセイの日、ジャイレース阻害剤としての活性を試験する化合物を無菌２重
蒸留水で９００μＭに調製する。標準的マイクロピペットを用いて、１０μｌの
溶解させた試験化合物を蓋（Ｄｙｎａｔｅｃｈ＃００１−０１０−５５５０）付
き９６ウェル「Ｕ」形マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ＃０１１−
０１０−０７１５）の個々のウェルに配置する。カラム１２は陰性および陽性対
照（試験化合物の代りに無菌二重蒸留水１０μｌ）を含む。次に、６．０μｌの
５×インキュベーション緩衝液（３５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２４ｍ
Ｍ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ジチオトレイトール、１．８ｍＭ スペルミジン、６．５％グリセロール（ｗ／ｖ）、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清ア
ルブミン）、１．０μｌの３０ｍＭ ＡＴＰ、０．２５μｇの弛緩型ＤＮＡ（Ｌ
ｕｃｅｎｔ Ｌｔｄ．ＵＫ）を含むマスターミックス１０μｌを各ウェルに配置
した。次いで、５×貯蔵緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ジチオトレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％グリセ
ロール（ｗ／ｖ））中の希釈ジャイレース（Ｌｕｃｅｎｔ Ｌｔｄ．）１０μｌ
を、４つの「弛緩型」ＤＮＡ対照（カラム１２、Ａ〜Ｄ列）（これらはジャイレ
ースでなく貯蔵緩衝液を受け取る）を除き、全てのウェルにアリコートとして分
配する。９６ウェルプレートを次いで３７℃のインキュベーターに３時間配置す
る。On the day of the assay, compounds to be tested for activity as gyrase inhibitors are prepared at 900 μM in sterile double distilled water. Using a standard micropipette, 10 μl of the lysed test compound was added to a 96-well “U” shaped microtiter plate (Dynatech # 011-) with a lid (Dynatech # 001-010-5550).
010-0715). Column 12 contains negative and positive controls (10 μl of sterile double distilled water instead of test compound). Next, 6.0 μl of 5 × incubation buffer (35 mM Tris-HCl (pH 7.5),
M KCl, 4 mM MgCl 2 , 2 mM dithiothreitol, 1.8 mM spermidine, 6.5% glycerol (w / v), 0.1 mg / ml bovine serum albumin), 1.0 μl 30 mM ATP, 0.25 μg relaxation Type DNA (L
uent Ltd. 10 μl of the master mix containing UK) was placed in each well. Then, 5 × storage buffer (50 mM Tris HCl (pH 7.5), 100
10 μl of diluted gyrase (Lucent Ltd.) in mM KCl, 2 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, 50% glycerol (w / v)
Are distributed as aliquots into all wells except for the four "relaxed" DNA controls (column 12, rows AD), which receive storage buffer rather than gyrase. The 96-well plate is then placed in a 37 ° C. incubator for 3 hours.
【００１９】 インキュベーション後、１：４００希釈（ＴＥ緩衝液−１００Ｍトリス（ｐＨ
８．０）および１０Ｍ ＥＤＴＡ−Ｓｉｇｍａ、＃２７Ｈ６６５２）のＰｉｃｏ
Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，＃Ｐ
−７５８１）７０μｌを全てのウェルに添加し、蛍光を４８５ｎｍ励起および５
２５ｎｍ発光波長を用いてＦＬＵＯｓｔａｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄ
ｅｒ（ＢＭＧ Ｉｎｃ．）で測定する。After incubation, a 1: 400 dilution (TE buffer-100M Tris (pH
8.0) and Pico of 10M EDTA-Sigma, # 27H6652)
Green (registered trademark) (Molecular Probes, Inc., #P
-7581) 70 μl was added to all wells and fluorescence was excited at 485 nm and 5 μl.
FLUOstar Microplate read using 25 nm emission wavelength
er (BMG Inc.).
【００２０】 以下の結果が得られた： Ｆ（Ｓ−ＤＮＡ）＝スーパーコイルＤＮＡを伴うウェル（弛緩型ＤＮＡおよび
ジャイレース添加、試験化合物無添加）から測定された蛍光 Ｆ（Ｒ−ＤＮＡ）＝弛緩型ＤＮＡを伴うウェル（弛緩型ＤＮＡ添加、ジャイレ
ースも試験化合物も無添加）から測定された蛍光 Ｆ（ＴＣ）＝試験化合物を伴うウェル（弛緩型ＤＮＡ、ジャイレースおよび試
験化合物の全て添加）から測定された蛍光The following results were obtained: F (S-DNA) = Fluorescence measured from wells with supercoiled DNA (with relaxed DNA and gyrase, no test compound) F (R-DNA) = Fluorescence measured from wells with relaxed DNA (with relaxed DNA added, no gyrase or test compound added) F (TC) = wells with test compound (all relaxed DNA, gyrase and test compound added) Fluorescence measured from
【００２１】 下記の方程式を試験化合物の非存在下でのシグナルのノイズに対する比を計算
するのに用いる。 （弛緩型ＤＮＡおよびスーパーコイルＤＮＡの）差（％） ＝１００×［Ｆ（Ｓ−ＤＮＡ）−Ｆ（Ｒ−ＤＮＡ）］／Ｆ（Ｒ−ＤＮＡ） この算出された差％は、少なくとも約３０％であるべきであり、さもなくば実
験の結果は信頼性が無い場合がある。The following equation is used to calculate the ratio of signal to noise in the absence of test compound. Difference (%) between relaxed DNA and supercoiled DNA = 100 × [F (S-DNA) -F (R-DNA)] / F (R-DNA) The calculated% difference is at least about 30 % Or the results of the experiment may be unreliable.
【００２２】 特定の試験化合物により仲介されるジャイレース阻害の程度を計算するために
は、以下の方程式が用いられる。To calculate the degree of gyrase inhibition mediated by a particular test compound, the following equation is used.
【００２３】[0023]
【数１】 (Equation 1)
【００２４】 この計算用の、Ｆ（Ｓ−ＤＮＡ）およびＦ（Ｒ−ＤＮＡ）は通常各々約４つの
ウェルの蛍光の平均である。Ｆ（ＴＣ）は、通常試験される試験化合物の各レベ
ルでの蛍光の単一の読取り値である。For this calculation, F (S-DNA) and F (R-DNA) are usually the average of the fluorescence of about four wells each. F (TC) is a single reading of the fluorescence at each level of the test compound normally tested.
【００２５】 本発明の特定の実施態様を記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱せ
ずに本発明の種々の変更および修正が可能であることは当業者にとって明白であ
ろう。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内にあるそのような修正全てを網
羅することを意図するものである。While particular embodiments of the present invention have been described, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications of the present invention can be made without departing from the spirit and scope of the invention. The appended claims intend to cover all such modifications that fall within the scope of the invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メイキン ケリー モリーン アメリカ合衆国 47060 インディアナ州 ウェスト ハリソン モータシュド ロ ード 3071 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 BB20 BB25 CB21 DA20 DA80 FA29 FB12 GC15 4B063 QA01 QA05 QQ95 QR19 QR23 QR32 QR33 QR66 QX02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Makin Kelly Moline United States 47060 West Harrison Mort. QR66 QX02
Claims (10)
るための方法であって、 （ａ）試験化合物、ＤＮＡ、およびトポイソメラーゼを流体中で一緒に混合する
ステップと、 （ｂ）ステップ（ａ）の流体をインキュベーションするステップと、 （ｃ）ステップ（ｂ）のインキュベーションされた流体にＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（
登録商標）染料を組み込むステップと、 （ｄ）ステップ（ｃ）の流体中の染料からの蛍光を測定するステップと、 （ｅ）ステップ（ａ）の流体から試験化合物を省きステップ（ａ）から（ｄ）を
繰り返すステップと、 （ｆ）ステップ（ａ）の流体から試験化合物およびトポイソメラーゼを省きステ
ップ（ａ）から（ｄ）を任意に繰り返すステップと、 （ｇ）ステップ（ｄ）および（ｅ）において、またはステップ（ｄ）、（ｅ）お
よび（ｆ）において、測定された蛍光を比較するステップを含むことを特徴とす
る方法。1. A method for measuring the activity of a test compound as a topoisomerase inhibitor, comprising: (a) mixing a test compound, DNA, and topoisomerase together in a fluid; a) incubating the fluid; and (c) adding PicoGreen (PicoGreen) to the incubated fluid of step (b).
(D) measuring the fluorescence from the dye in the fluid of step (c); (e) omitting the test compound from the fluid of step (a) and removing steps (a) to ( repeating (d); (f) omitting the test compound and topoisomerase from the fluid of step (a) and optionally repeating steps (a) to (d); and (g) in steps (d) and (e). Or in steps (d), (e) and (f), comparing the measured fluorescence.
ップ（ｅ）における該ＤＮＡのスーパーコイルを誘導することを特徴とする請求
項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the DNA is a relaxed DNA and the topoisomerase induces a supercoil of the DNA in step (e).
ｇ／ｍｌから１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍ
ｌであり、ＤＮＡ濃度は、０．１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ、好ましくは
１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌであり、トポイソメラーゼの濃度は、０．００
１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから１μｇ／
ｍｌであり、ステップ（ｃ）の流体中の染料の濃度は、０．０１μＭから１０μ
Ｍ、好ましくは０．１μＭから１μＭであることを特徴とする請求項１または２
に記載の方法。3. The concentration of the test compound in the fluid of step (a) is 0.01 μm.
g / ml to 1000 μg / ml, preferably 1 μg / ml to 100 μg / m
and the DNA concentration is 0.1 μg / ml to 100 μg / ml, preferably 1 μg / ml to 50 μg / ml, and the concentration of topoisomerase is 0.00
1 μg / ml to 10 μg / ml, preferably 0.01 μg / ml to 1 μg / ml
ml, and the concentration of the dye in the fluid in step (c) is from 0.01 μM to 10 μM.
M, preferably 0.1 μM to 1 μM.
The method described in.
共溶媒を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the fluid of step (a) is aqueous-based and comprises 0% to 2% of a co-solvent.
℃から４０℃の温度で０．２時間から２４時間、好ましくは１時間から６時間の
期間インキュベーションすることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に
記載の方法。5. The method of claim 5, wherein the fluid of step (b) is at 20 ° C. to 55 ° C., preferably 35 ° C.
The method according to any of the preceding claims, wherein the incubation is carried out at a temperature between 0C and 40C for a period between 0.2 and 24 hours, preferably between 1 and 6 hours.
しくはジャイレース、より好ましくは野生型ジャイレースまたはキノロン耐性型
ジャイレースであることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方
法。6. The method according to claim 1, wherein the topoisomerase is topoisomerase type II, preferably gyrase, more preferably wild-type gyrase or quinolone-resistant gyrase. The described method.
１：１０-6から１：１０-4であり、ステップ（ａ）の流体中のＤＮＡ：トポイソ
メラーゼのモル比が、１：１から１：１０であり、ステップ（ｃ）の流体中のＤ
ＮＡ：染料のモル比は、１：１０14から１：１０16であることを特徴とする請求
項１から６のいずれか一項に記載の方法。7. The molar ratio of test compound: DNA in the fluid of step (a) is:
1:10 -6 to 1:10 -4 , the molar ratio of DNA: topoisomerase in the fluid of step (a) is 1: 1 to 1:10, and D in the fluid of step (c).
NA: the molar ratio of the dye is 1:10 method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that 14 to 1:10 16.
体中の少なくとも３つの異なる濃度の試験化合物を用いてステップ（ａ）から（
ｄ）を繰り返し、最高濃度の最低濃度との比は少なくとも１００であることを特
徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。8. Use of step (f) and preferably from step (a) using at least three different concentrations of the test compound in the fluid of step (a).
8. The method according to claim 1, wherein d) is repeated and the ratio of the highest concentration to the lowest concentration is at least 100.
および５２０ｎｍから５３０ｎｍ、好ましくは５２５ｎｍの発光波長を用いて蛍
光を測定することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。9. Excitation from 480 nm to 490 nm, preferably 485 nm.
9. The method according to claim 1, wherein the fluorescence is measured using an emission wavelength of 520 nm to 530 nm, preferably 525 nm.
ースはＡ（Ｔｒｐ）2Ｂ2または大腸菌からの野生型であることを特徴とする請求
項１から９のいずれか一項に記載の方法。10. DNA is relaxed plasmid pBR322, gyrase A (Trp) 2 B 2 or claim 1, wherein the wild-type from E. coli according to any one of 9 Method.
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