JP2002506633A - Compositions and uses of gene-based vaccines for eliciting a T cell response - Google Patents
Compositions and uses of gene-based vaccines for eliciting a T cell responseInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、加工され、抗原提示細胞(APC)上のMHCクラスI分子とともに提示される抗原、および加工され、APC上にMHCクラスII分子とともに提示される抗原をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドを含む組成物は、さらに本発明により提供される。前記方法により産生されるAPCおよびAPCs表面へのペプチドの提示の増加方法も、さらに提供される。また、本発明のポリヌクレオチド、APCsおよび免疫効果細胞を用いる、診断および免疫調節方法も提供される。 (57) [Summary] The present invention provides antigens that are engineered and presented with MHC class I molecules on antigen presenting cells (APCs), and polynucleotides that encode engineered antigens that are presented with MHC class II molecules on APCs. Compositions comprising these polynucleotides are further provided by the present invention. Also provided are methods of increasing the presentation of peptides on the surface of APCs and APCs produced by the methods. Also provided are diagnostic and immunomodulatory methods using the polynucleotides, APCs and immune effect cells of the invention.
Description
【0001】 関連出願への相互参照 本出願は、35U.S.C.119(e)に基づく優先権を、1998年3月
20日出願の米国仮特許出願第60/078,725号に基づいて主張し、当該
仮出願の内容は参考文献として本開示中に援用される。[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application is, 35U. S. C. 119 (e) is claimed in U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 078,725, filed March 20, 1998, the contents of which are incorporated herein by reference. You.
【0002】 技術分野 本発明は、分子免疫学および医学の分野に属する。特に、本発明は、患者にお
けるCD4およびCD8 T細胞応答を誘発するための組成物および方法を提供
する。TECHNICAL FIELD The present invention belongs to the fields of molecular immunology and medicine. In particular, the present invention provides compositions and methods for eliciting CD4 and CD8 T cell responses in a patient.
【0003】 発明の背景 哺乳類の免疫系は、外来抗原、癌細胞に存在する自己抗原、および正常組織に
存在する自己抗原に対する応答を生むことが可能である。免疫系は、B細胞、T
細胞の2種類の抗原特異的細胞を含む。B細胞は膜結合および分泌抗体の両方を
合成する。T細胞は、抗原細胞表面標識、および抗原分泌物によって抗原を認識
する方法により、表現型上特徴付けることができる。T細胞は特有の細胞膜分子
を発現する。これらのうちに含まれるのは、CD3とともに細胞表面に現れるT
細胞抗原受容体(TCR)、並びにCD5、CD28、およびCD45Rのよう
な修飾分子である。T細胞のサブ集団は、付加的な膜分子の存在により識別でき
る。ゆえに、例えば、クラスII MHC分子に伴うCD4認識抗原を発現し、
およびB細胞による抗体産生を促進する役割を含むヘルパー細胞として一般的に
機能するT細胞や、一方、クラスI MHC分子に伴うCD8認識抗原を発現し
、および細胞傷害性細胞として一般的に機能するT細胞である。BACKGROUND OF THE INVENTION [0003] The mammalian immune system is capable of producing a response to foreign antigens, self-antigens present on cancer cells, and self-antigens present on normal tissues. The immune system consists of B cells, T
Cells include two types of antigen-specific cells. B cells synthesize both membrane-bound and secreted antibodies. T cells can be phenotypically characterized by antigen cell surface labeling and methods of recognizing antigen by antigen secretions. T cells express unique cell membrane molecules. Included among these are T3s that appear on the cell surface with CD3.
Cellular antigen receptors (TCRs) and modifying molecules such as CD5, CD28, and CD45R. Subpopulations of T cells can be identified by the presence of additional membrane molecules. Thus, for example, expressing a CD4 recognition antigen associated with a class II MHC molecule,
And T cells that generally function as helper cells, including the role of promoting antibody production by B cells, and, on the other hand, express CD8-recognition antigens associated with class I MHC molecules and generally function as cytotoxic cells T cells.
【0004】 免疫細胞は、抗原におけるエピトープまたは抗原決定基として知られる、特定
部位を認識する。エピトープは、免疫細胞上の抗原特異的膜結合受容体、または
抗体のような溶解性相対物(counterpart)に結合する、免疫原また
は抗原の領域である。Bリンパ球の表面にある膜結合抗体、および分泌抗体の両
方は溶解性抗原を認識する。溶解性抗原を認識するB細胞と異なり、T細胞は、
抗原が、抗原提示細胞の表面で自己の主要組織適合複合体(MHC)遺伝子産物
に伴う場合にのみ抗原を認識する。この抗原は、抗原提示細胞表面、またはウイ
ルス感染細胞、癌細胞および移植片にあるMHC分子とともに提示されうる。[0004] Immune cells recognize specific sites, known as epitopes or antigenic determinants on antigens. An epitope is a region of an immunogen or antigen that binds to an antigen-specific membrane-bound receptor on immune cells, or a soluble counterpart, such as an antibody. Both membrane-bound and secreted antibodies on the surface of B lymphocytes recognize soluble antigens. Unlike B cells that recognize soluble antigens, T cells
Recognize an antigen only when it is associated with its major histocompatibility complex (MHC) gene product on the surface of antigen presenting cells. This antigen can be presented with MHC molecules on the surface of antigen presenting cells or on virus infected cells, cancer cells and grafts.
【0005】 疾患は、細菌、ウイルスおよび原生動物病原体を含む病原性生物による侵害、
および続く侵入物に対する不十分または無効な免疫応答により引き起こされうる
。疾患はまた、自己応答性Tリンパ細胞の活性化、アレルギー応答を誘発するT
リンパ細胞の活性化、または「自己抗原」と表現されるタンパク質である、ヒト
のタンパク質を模する抗原を産生しうるある種の細菌および寄生性感染に伴うT
リンパ細胞の自己応答活性化に起因しうる。これらの疾患は、非限定的に、ある
種の細菌または寄生物の感染の二次的現象として起きる自己免疫障害である自己
免疫疾患を含む。T細胞は、アレルギーおよび乾せんや血管炎のようなある種の
皮膚病を仲介する。さらに、予期しない外来抗原拒絶は、移植片拒否または不妊
症にさえつながる可能性があり、そして、そのような拒否は、特定のTリンパ細
胞集団の活性化に因る可能性がある。[0005] Diseases are infested by pathogenic organisms, including bacterial, viral and protozoan pathogens.
And subsequent poor or ineffective immune response to invaders. The disease may also activate self-reactive T lymphocytes, trigger an allergic response to T
Activation of lymphocytes or T-cells associated with certain bacterial and parasitic infections that can produce antigens that mimic human proteins, proteins that are described as "self-antigens"
It may be due to activation of lymphocyte self-response. These diseases include, but are not limited to, autoimmune diseases, which are autoimmune disorders that occur as a secondary event of the infection of certain bacteria or parasites. T cells mediate allergies and certain skin diseases such as psoriasis and vasculitis. In addition, unexpected foreign antigen rejection can lead to graft rejection or even infertility, and such rejection can be due to activation of certain T lymphocyte populations.
【0006】 外来抗原は、細菌、ウイルス、および原生生物のような病原体に随伴する巨大
分子であるアレルゲンおよび移植片を含む。 自己抗原は、正常な生理的条件下において、通常、非免疫原である。しかしな
がら、自己抗原は、自己免疫疾患の場合のように、免疫原ともなりうる。自己免
疫疾患は、ヨーロッパおよび北アメリカの成人のおよそ5%が罹患し、しばしば
慢性的に衰弱していく病である。Steinman(1993)Scienti
fic American 269:107−114。自己免疫は、自己抗原に
対して体液性または細胞仲介性応答を産生する、TまたはB細胞の自己反応性ク
ローンによって特徴づけられる。[0006] Foreign antigens include allergens and implants, which are macromolecules associated with pathogens such as bacteria, viruses, and protists. Autoantigens are usually non-immunogenic under normal physiological conditions. However, autoantigens can also be immunogens, as in autoimmune diseases. Autoimmune diseases are diseases that affect approximately 5% of adults in Europe and North America and are often chronically debilitating. Steinman (1993) Scienti
fic American 269: 107-114. Autoimmunity is characterized by autoreactive clones of T or B cells that produce a humoral or cell-mediated response to self antigens.
【0007】 腫瘍細胞抗原もまた自己抗原であり、疾患の制御または除去に有効な、癌細胞
除去に結びつく免疫応答をしばしば誘発しない。 さらに、自己抗原に対する免疫応答の誘発が望まれる特定の状況が他にある。
これらは、避妊法としての、ある抗原に対する免疫応答の誘発を含む。[0007] Tumor cell antigens are also autoantigens and often do not elicit an immune response that is effective in controlling or eliminating disease, which leads to cancer cell elimination. Further, there are other specific situations where it is desired to elicit an immune response to a self-antigen.
These include eliciting an immune response to an antigen as a method of contraception.
【0008】 動物への抗原の導入は、種々の目的のための抗原に対する免疫応答または免疫
応答の欠如を調節する目的、またはその抗原に対するそれからの免疫応答の欠如
は様々な目的で広く使用されてきた。これらは、病原体に対する種痘、癌細胞に
対する免疫応答の誘導、アレルギー反応の軽減、自己免疫障害の結果引き起こさ
れる自己抗原への免疫応答の軽減、同種異系移植片(allograft)拒否
の軽減、および避妊の目的での自己抗原への免疫応答の誘発を含む。[0008] The introduction of an antigen into an animal has been widely used for the purpose of modulating an immune response or lack of an immune response to an antigen for various purposes, or a lack of an immune response therefrom to that antigen. Was. These include vaccination against pathogens, induction of immune responses against cancer cells, reduced allergic reactions, reduced immune response to autoantigens resulting from autoimmune disorders, reduced allograft rejection, and contraception Eliciting an immune response to self-antigens for the purpose of
【0009】 ワクチンの決定的な標的は特殊化された専門の抗原提示細胞(”APC”)で
あり、そのうち最も免疫学上強力なものは骨髄由来樹状細胞(”DC”)である
。MHCクラスII分子による抗原ペプチドの提示が体液性応答を誘発する一方
、MHCクラスI分子存在下でのAPCsの表面への抗原ペプチドの提示は、細
胞性応答を引き起こす。Arcaら (1997)J.Immunol.20(
2):138−45は、GM−CSFを分泌するように形質転換された、免疫の
脆弱な腫瘍に対する免疫応答に関与するCD4+およびCD8+T細胞の相互作用
を解析した。著者は、CD4+細胞およびCD8+細胞は腫瘍の成長する間独立に
感作され、そして両者は養子移入(adoptive transfer)にお
いて効果細胞(effector cell)として機能する能力があることを
報告している。CD4+細胞およびCD8+細胞の両者は、免疫応答の脆弱な腫瘍
に対して同時に誘導された。[0009] The critical target of the vaccine is specialized specialized antigen presenting cells ("APC"), the most immunologically powerful of which are bone marrow-derived dendritic cells ("DC"). Presentation of antigenic peptides by MHC class II molecules elicits a humoral response, while presentation of antigenic peptides on the surface of APCs in the presence of MHC class I molecules provokes a cellular response. Arca et al. (1997) J. Am. Immunol. 20 (
2): 138-45 analyzed the interaction of CD4 + and CD8 + T cells involved in the immune response to vulnerable tumors transformed to secrete GM-CSF. The authors report that CD4 + and CD8 + cells are independently sensitized during tumor growth, and that both are capable of functioning as effector cells in adaptive transfer. . Both CD4 + and CD8 + cells were simultaneously induced on tumors with a weak immune response.
【0010】 一般的に、全ての有核細胞はMHCクラスI分子上に、(例えばウイルス抗原
のみならず自己抗原を含み)内因性に産生された抗原を提示する能力がある。し
かしながら、抗原提示細胞は内因性に産生された抗原をMHCクラスI分子上に
提示し、および可溶性の外因性(つまり細胞外)抗原をMHCクラスI分子およ
びMHCクラスII分子上に提示する能力があるが、一般的にMHCクラスI分
子上に可溶性の外来抗原を提示するのは比較的非効率的である。近年、外因性に
産生された抗原および可溶性の内因性抗原の抗原提示経路について、多く調べら
れた。細胞外抗原は、抗原提示細胞によって内在化され、エンドサイティック細
胞中で加工され、そこでMHCクラスII分子と遭遇し結合する。全ての有核細
胞において、その細胞中で合成されるウイルスおよび細胞タンパク質は細胞質中
のプロテオソームによってペプチドへと加水分解され、当該ペプチドの一部は抗
原加工に伴う運搬体(TAPs)によって小胞体へ運搬され、そこでMHCクラ
スI分子と遭遇および結合する。Raychaudhuri and Rock
(1998) Nature 16:1025−1031;and Linda
uer et al.(1998)J.Mol.Med.76:32−47. 同一の抗原提示細胞中においてMHCクラスIおよびMHCクラスII提示経
路の両方を利用することは、患者における与えられた抗原に対する体液性および
細胞性免疫応答を調節するのに、有効であろう。本発明は、本発明以前認識され
ていなかった上述の利益および関連する利益を提供する。In general, all nucleated cells are capable of presenting endogenously produced antigens (including, for example, viral antigens as well as self antigens) on MHC class I molecules. However, antigen presenting cells have the ability to present endogenously produced antigens on MHC class I molecules and the ability to present soluble exogenous (ie extracellular) antigens on MHC class I and MHC class II molecules. However, presenting soluble foreign antigens on MHC class I molecules is generally relatively inefficient. In recent years, the antigen presentation pathway of exogenously produced antigens and soluble endogenous antigens has been extensively investigated. Extracellular antigens are internalized by antigen presenting cells and processed in endocytic cells where they encounter and bind MHC class II molecules. In all nucleated cells, viruses and cellular proteins synthesized in the cell are hydrolyzed to peptides by proteosomes in the cytoplasm, and some of the peptides are transported to the endoplasmic reticulum by carriers (TAPs) involved in antigen processing. Transported, where it encounters and binds to MHC class I molecules. Raychaudhuri and Rock
(1998) Nature 16: 1025-1031; and Linda.
uer et al. (1998) J. Am. Mol. Med. 76: 32-47. Utilizing both the MHC class I and MHC class II presentation pathways in the same antigen presenting cell would be effective in modulating humoral and cellular immune responses to a given antigen in a patient. The present invention provides the above and related advantages that were not recognized before the present invention.
【0011】 発明の開示 本発明は、加工され、MHCクラスI分子と共に抗原提示細胞(APC)上に
提示される第一抗原をコードするポリヌクレオチド、並びに、加工され、MHC
クラスII分子と共にAPC上のに提示される第二抗原をコードする第二コード
配列を提供する。第一および第二抗原は、同じアミノ酸配列を有していても、有
していなくてもよい。ある態様では、本発明のポリヌクレオチドは(a)抗原を
コードするヌクレオチド配列を含む第一コード配列、並びに(b)抗原をコード
するヌクレオチド配列、およびコードされた抗原の小胞体(ER)中での保持を
促進するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第二コード配列、を
含んでよい。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to polynucleotides encoding a first antigen that are processed and presented on an antigen presenting cell (APC) with MHC class I molecules, as well as processed, MHC
A second coding sequence is provided which encodes a second antigen presented on the APC with the class II molecule. The first and second antigens may or may not have the same amino acid sequence. In some embodiments, the polynucleotide of the invention comprises (a) a first coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding the antigen, and (b) a nucleotide sequence encoding the antigen, and in the endoplasmic reticulum (ER) of the encoded antigen. A second coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that promotes retention of
【0012】 他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは(a)抗原をコードするヌクレオ
チド配列を含む第一コード配列、(b)抗原をコードするヌクレオチド配列、お
よびコードされた抗原の小胞体(ER)中での保持を促進するアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を含む第二コード配列、並びに(c)抗原をコードす
るヌクレオチド配列、およびコードされた抗原を非エンドソームMHCクラスI
I経路へ指向させる(または保持を促進する、または標的とする)アミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を含む第三コード配列、を含んでよい。In another aspect, the polynucleotide of the invention comprises (a) a first coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding the antigen, (b) a nucleotide sequence encoding the antigen, and an endoplasmic reticulum (ER) of the encoded antigen. A) a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that facilitates retention in, and (c) a nucleotide sequence that encodes the antigen, and a non-endosomal MHC class I
A third coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence directed (or promoted or targeted for retention) to the I pathway.
【0013】 これらの態様のいくつかにおいて、コードされた抗原は、自然発生的な抗原ま
たは自然発生的な抗原の断片である。他の態様では、抗原は合成抗原である。コ
ードされた抗原は、分泌または細胞表面タンパク質でありうる。[0013] In some of these embodiments, the encoded antigen is a naturally occurring antigen or a fragment of a naturally occurring antigen. In another aspect, the antigen is a synthetic antigen. The encoded antigen can be a secreted or cell surface protein.
【0014】 本発明はさらに、ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、APCへ本発明
のポリヌクレオチドを導入することを含む、APCの表面上の抗原提示を増加す
る方法を提供する。本発明はまた、これらの方法によって産生されるAPCsを
提供する。これらのAPCsは、クラスIおよびクラスIIMHC分子の双方に
おける、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原の提示を促進した
。[0014] The invention further provides a method of increasing antigen presentation on the surface of an APC, comprising introducing the polynucleotide of the invention into the APC under conditions suitable for expression of the polynucleotide. The present invention also provides APCs produced by these methods. These APCs promoted the presentation of the antigens encoded by the polynucleotides of the present invention on both class I and class II MHC molecules.
【0015】 本発明のポリヌクレオチドは、コードされた抗原に対する免疫応答を調節する
多様な方法において有用である。ある態様では、本発明のポリヌクレオチドは、
腫瘍抗原または腫瘍抗原に対応する合成抗原をコードし、それゆえ腫瘍抗原を細
胞表面に発現する腫瘍細胞に対するワクチンとして有用である。他の態様では、
本発明のポリヌクレオチドは、正常(つまり、非癌化)組織上の自己抗原をコー
ドする。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、病原性細菌、ウイルスお
よび原生生物等の生物に伴う外来(非自己)抗原をコードする。さらに他の態様
では、本発明のポリヌクレオチドは、拒否を媒介する同種異系移植片に存在する
抗原をコードする。[0015] The polynucleotides of the present invention are useful in a variety of ways to modulate the immune response to the encoded antigen. In one aspect, the polynucleotide of the invention comprises:
It is useful as a vaccine against tumor cells that encode a tumor antigen or a synthetic antigen corresponding to the tumor antigen and therefore express the tumor antigen on the cell surface. In other aspects,
A polynucleotide of the invention encodes a self-antigen on normal (ie, non-cancerous) tissue. In other aspects, the polynucleotides of the invention encode foreign (non-self) antigens associated with organisms such as pathogenic bacteria, viruses and protists. In yet another aspect, a polynucleotide of the invention encodes an antigen present on an allograft that mediates rejection.
【0016】 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチ
ド、および当該ポリペプチドを含む組成物を提供する。ポリペプチドは本発明の
免疫調節法において有用である。The present invention further provides polypeptides encoded by the polynucleotides of the present invention, and compositions comprising the polypeptides. Polypeptides are useful in the immunomodulation methods of the invention.
【0017】 ポリヌクレオチドを含む組成物もさらに本発明によって提供される。ポリヌク
レオチドは、ウイルスベクターおよびリポソームのような遺伝子運搬用ビヒクル
、および宿主細胞に含まれうる。これらのポリヌクレオチドは、抗原産物の産生
、発現および精製のためのポリヌクレオチドの発現方法だけでなく、診断および
治療の上でも有用である。[0017] Compositions comprising the polynucleotides are further provided by the present invention. Polynucleotides can be included in gene delivery vehicles such as viral vectors and liposomes, and host cells. These polynucleotides are useful in diagnostic and therapeutic methods, as well as in polynucleotide expression methods for the production, expression and purification of antigen products.
【0018】 ポリヌクレオチドは、患者における抗原に対する免疫応答の調節に使用しうる
。従って、本発明はさらに、有効な量のポリヌクレオチドを対象に投与すること
により、対象における抗原に対する細胞性および/または体液性免疫応答を調節
する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、露出したDNAとしてまたは遺伝子
運搬用ビヒクル上で運搬しうる。一側面において、ポリヌクレオチドを含む宿主
細胞が態様に投与される。[0018] Polynucleotides may be used to modulate the immune response to an antigen in a patient. Accordingly, the present invention further provides a method of modulating a cellular and / or humoral immune response to an antigen in a subject by administering an effective amount of the polynucleotide to the subject. Polynucleotides can be delivered as exposed DNA or on a gene delivery vehicle. In one aspect, a host cell comprising the polynucleotide is administered in an embodiment.
【0019】 本発明を実施するための態様 本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開された出願明細書は引用を同
定することにより参照される。これらの刊行物、特許および公開された出願明細
書は、本発明が関係する当該技術分野の事情をより十分に記載するよう、本開示
中へ参考文献として援用される。MODES FOR CARRYING OUT THE INVENTION Throughout this disclosure, various publications, patents and published application specifications are referenced by an identifying citation. These publications, patents, and published application specifications are hereby incorporated by reference into this disclosure to more fully describe the state of the art to which this invention pertains.
【0020】 定義 本発明の実施は、特に指示が無ければ、当該技術分野に含まれる免疫学、分子
生物学、微生物学、細胞生物学および組換えの慣用の技術を用いる。例えば、S
ambrook,FritschおよびManiatis, MOLECULA
R CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2nd e
dition(1989); CURRENT PROTOCOLS IN M
OLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel et al.
eds.,(1987)および改訂);the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):
PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPh
erson.B.D.Hames and G.R. Taylor eds.
(1995)),Harlow and Lane eds.(1989) A
NTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and
ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.
(1987)). 本明細書中で使用されているように、ある単語は以下の定義された意味を持ち
うる。Definitions The practice of the present invention will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of immunology, molecular biology, microbiology, cell biology and recombination included in the art. For example, S
ambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULA
R CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd e
edition (1989); CURRENT PROTOCOLS INM
OLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel et al.
eds. The series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.):
PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (MJ MacPh
erson. B. D. Hames and G.S. R. Taylor eds.
(1995)), Harlow and Lane eds. (1989) A
NTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and
ANIMAL CELL CULTURE (RI Freshney ed.
(1987)). As used herein, certain words may have the following defined meanings.
【0021】 明細書および請求の範囲の中で使用されているように、単数形の”a”、”a
n”および”the”は、特に記載が無ければ、複数形を含む。例えば、「細胞
」という単語は、複数の細胞群を含み、細胞の混合物を含む。As used in the specification and claims, the singular forms “a”, “a”
Unless otherwise specified, n "and" the "include plural forms, for example, the word" cell "includes a plurality of cell groups and includes a mixture of cells.
【0022】 「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という単語は、いかなる長さのヌク
レオチドの多量体型を相互変換的に言及する。ポリヌクレオチドは、デオキシリ
ボヌクレオチド、リボブクレオチド、および/またはその類型を含みうる。ヌク
レオチドは3次元構造を含み、および既知または未知のどのような機能を果たし
うる。「ポリヌクレオチド」という単語は、たとえば、1本鎖、2本鎖および3
重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、t
RNA、rRNA、リボザイム、cDNA組換え体ポリヌクレオチド、分枝ポリ
ヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の
単離RNA、核酸プローブおよびプライマーを含む。核酸分子はまた、修飾され
た分子を含みうる。The terms “polynucleotide” and “nucleic acid molecule” interchangeably refer to multimeric forms of nucleotides of any length. A polynucleotide can include deoxyribonucleotides, ribonucleotides, and / or types thereof. Nucleotides contain a three-dimensional structure and can perform any function, known or unknown. The term “polynucleotide” is used, for example, for single-stranded, double-stranded and three-stranded
Heavy helix molecule, gene or gene fragment, exon, intron, mRNA, t
Includes RNA, rRNA, ribozymes, cDNA recombinant polynucleotides, branched polynucleotides, plasmids, vectors, isolated DNA of any sequence, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes and primers. Nucleic acid molecules can also include modified molecules.
【0023】 ハイブリダイゼーションは、一つあるいはそれ以上のポリヌクレオチドが反応
して、ヌクレオチド残基の塩基間で水素結合を介し安定化された複合体を形成す
る反応を指す。水素結合は、ワトソンークリック塩基対、ホグスタイン結合、ま
たはその他の配列特異的様式によって生じうる。複合体は、二量体構造を形成す
る二本鎖、多量鎖を形成する三つあるいはそれ以上の鎖、自己ハイブリダイズす
る単量鎖、またはこれらのいかなる組み合わせでもありうる。ハイブリダイゼー
ション反応はPCR反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵
素的切断等の、より広範な方法の工程を構成しうる。Hybridization refers to the reaction of one or more polynucleotides to form a stabilized complex via hydrogen bonding between the bases of the nucleotide residues. Hydrogen bonding can occur by Watson-Crick base pairing, Hogstein binding, or other sequence-specific manner. The complex can be double-stranded to form a dimeric structure, three or more strands to form a heavy chain, self-hybridizing single-stranded, or any combination thereof. Hybridization reactions may constitute steps of a wider range of methods, such as initiating a PCR reaction, or enzymatic cleavage of a polynucleotide by a ribozyme.
【0024】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、およそ25℃からお
よそ37℃のインキュベーション温度、およそ6×SSCからおよそ10×SS
Cの濃度のハイブリダイゼーション緩衝液、およそ0%からおよそ25%の濃度
のホルムアミド、およびおよそ6×SSCの洗浄溶液を含む。緩やかな(mod
erate)ハイブリダイゼーション条件の例は、およそ40℃からおよそ50
℃のインキュベーション温度、およそ9×SSCからおよそ2×SSCの濃度の
ハイブリダイゼーション緩衝液、およそ30%からおよそ55%の濃度のホルム
アミド、およびおよそ5×SSCからおよそ2×SSCの洗浄溶液を含む。高度
にストリンジェントな条件の例は、およそ55℃からおよそ68℃のインキュベ
ーション温度、およそ1×SSCからおよそ0.1×SSCの濃度のハイブリダ
イゼーション緩衝液、およそ55%からおよそ75%の濃度のホルムアミド、お
よびおよそ1×SSC、0.1×SSCまたは脱イオン水の洗浄溶液を含む。一
般的に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、1、2回または
それ以上の洗浄段階および1、2、または15分の洗浄インキュベーション時間
を伴い、5分から24時間である。SSCは、0.15M NaClおよび15
mMクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を用いSSCと同等の使用がありうる
と理解されている。Examples of stringent hybridization conditions include incubation temperatures of about 25 ° C. to about 37 ° C., about 6 × SSC to about 10 × SS
Contains hybridization buffer at a concentration of C, formamide at a concentration of approximately 0% to approximately 25%, and a wash solution of approximately 6 × SSC. Moderate (mod
erate) Examples of hybridization conditions are from about 40 ° C. to about 50 ° C.
Incubation temperature of ° C., hybridization buffer at a concentration of about 9 × SSC to about 2 × SSC, formamide at a concentration of about 30% to about 55%, and a wash solution of about 5 × SSC to about 2 × SSC. Examples of highly stringent conditions include incubation temperatures of about 55 ° C. to about 68 ° C., hybridization buffer at a concentration of about 1 × SSC to about 0.1 × SSC, and concentrations of about 55% to about 75%. Contains a wash solution of formamide, and approximately 1 × SSC, 0.1 × SSC or deionized water. Generally, the incubation time for hybridization is from 5 minutes to 24 hours, with one, two or more washing steps and a wash incubation time of 1, 2, or 15 minutes. SSC contains 0.15 M NaCl and 15
mM citrate buffer. It is understood that other buffer systems may be used as well as SSC.
【0025】 ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域(またはポリペプチドまたはポ
リペプチド領域)が他の配列とある割合(例えば80%、85%、90%または
95%)の「配列同一性」があるとは、並列した場合、その割合の塩基(または
アミノ酸)が二つの配列を比較した場合に同じであることを意味する。この並列
および相同割合または配列同一性は、例えばCurrent Protocol
in Molecular Biology(F.M.Ausbel et
al.,eds.,1987;Supplement 30,section
7.7.18,Table7.7.1)の中で記載される、当該技術分野におい
て知られるソフトウエアプログラムを用いて決定しうる。好ましくは、並列には
デフォルトパラメーターが用いられる。好ましい並列プログラムは、デフォルト
パラメーターを用いる、BLASTである。特に、好ましいプログラムは、以下
のデフォルトパラメーターを用いるBLASTNおよびBLASRPである。遺
伝暗号=標準、選別=無し、鎖=両方、分離=60、期待値=10、マトリック
ス=BLOSUM62、記載=50配列、分配法=ハイスコア、データベース=
非重複、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CD
S translations+SwissProtein+SPupdate
+PIR.これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで検索
しうる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi−
bin/BLAST 本明細書中で使用されているように、「古典的MHCクラスI加工経路」とい
う語は、タンパク質がプロテオソームで加工(process)され、ERに運
搬され、そこでMHCクラスI分子に会合されることを意図している。A polynucleotide or polynucleotide region (or polypeptide or polypeptide region) has a certain percentage (eg, 80%, 85%, 90% or 95%) of “sequence identity” to another sequence, When aligned, it means that the proportion of bases (or amino acids) is the same when comparing the two sequences. The juxtaposition and homology percentages or sequence identities can be determined, for example, using the Current Protocol
in Molecular Biology (FM Ausbel et.
al. , Eds. , 1987; Supplement 30, section.
7.7.18, Table 7.7.1) and can be determined using software programs known in the art. Preferably, default parameters are used in parallel. A preferred parallel program is BLAST, using default parameters. In particular, preferred programs are BLASTN and BLASTP using the following default parameters. Genetic code = standard, selection = none, strand = both, separation = 60, expected value = 10, matrix = BLOSUM62, description = 50 sequences, distribution method = high score, database =
Non-overlapping, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CD
S translations + SwissProtein + SPUpdate
+ PIR. Details of these programs can be found at the following Internet addresses: http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / cgi-
bin / BLAST As used herein, the term "classical MHC class I processing pathway" refers to the process in which proteins are processed in the proteosome and transported to the ER where they associate with MHC class I molecules. Is intended to be.
【0026】 本明細書中で使用されているように、「小胞体保持配列」という語は、ペプチ
ド抗原のアミノ酸配列と同じ翻訳単位にある場合、同じ抗原が当該アミノ酸配列
と同じ翻訳単位にない場合と比べ、抗原が真核生物細胞の小胞体(ER)内に局
在しうる可能性を増加する、アミノ酸配列を意図する。「抗原がERに局在しう
る可能性を増す」とは、ER内の保持を促進するアミノ酸配列を欠く翻訳単位に
存在する同じ抗原より、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、
さらにより好ましくは少なくとも約10倍またはより高レベルにER内で見いだ
しうる、ER内の保持を促進するあるアミノ酸配列のアミノ酸配列と同じ翻訳単
位にある、与えられた抗原を意図する。抗原が小胞体内にあることを決定する方
法は当該技術分野において既知であり、そして、細胞を破壊し、亜細胞性成分を
分画し、そして、どの亜細胞性成分にそのタンパク質が局在するかを例えば免疫
測定により決定することを含む方法を含むは、これに限定されない。As used herein, the term “ER retention sequence” refers to the same translation unit as the amino acid sequence of a peptide antigen if the same antigen is not in the same translation unit as the amino acid sequence of the peptide antigen. An amino acid sequence is contemplated that increases the likelihood that an antigen may be located in the endoplasmic reticulum (ER) of a eukaryotic cell, as compared to when. "Increasing the likelihood that an antigen can be localized to the ER" means at least about 2 times, more preferably at least about 5 times, the same antigen present in the translation unit lacking an amino acid sequence that promotes retention in the ER.
Even more preferably, a given antigen is found in the same translation unit as the amino acid sequence of an amino acid sequence that promotes retention in the ER, which may be found in the ER at least about 10-fold or higher. Methods for determining that an antigen is in the endoplasmic reticulum are known in the art, and destroy cells, fractionate subcellular components, and localize the protein to any subcellular component. Including, but not limited to, determining whether to do so by, for example, an immunoassay.
【0027】 本明細書中で使用されているように、「古典的MHCクラスII加工経路」と
いう語は、タンパク質がエンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスにより抗
原提示細胞によって取り込まれ、そしてMHCクラスII分子に結合する前にエ
ンドソーム内で加工されることを意図する。これは本明細書中で、「エンドソー
ム経路による加工」とも言われる。本発明において、「エンドソーム(endo
some)」、「エンドサイティック区画(endocytic compar
tment)」、「エンドサイティック小胞(endocytic visic
le)」、および「核内体区画(endosomal compertment
)」は相互変換的に用いられる。As used herein, the term “classical MHC class II processing pathway” refers to a protein in which the protein is taken up by antigen presenting cells by endocytosis or phagocytosis and the MHC class II molecule It is intended to be processed in the endosome before binding to the. This is also referred to herein as "processing by the endosomal pathway". In the present invention, “endosome (endosome)
some), “endocytic compar”
tment) "," endocytic vesicles "
le) "and" endosomal compartments "
) "Are used interchangeably.
【0028】 本明細書中で使用されるように、「非エンドソームMHCクラスII経路によ
るタンパク質の加工を促進するアミノ酸配列」という語は、同じ翻訳単位中にペ
プチド抗原のアミノ酸配列とともにある場合、同じ抗原が当該アミノ酸配列と同
じ翻訳単位中に無い場合と比べ、抗原が、エンドソームでなく、そして、タンパ
ク質の断片化および引き続くMHCクラスII分子との結合が起こりうる場であ
る真核細胞の亜細胞性区画に局在する可能性を増すアミノ酸配列である。「可能
性を増す」とは、断片化および続くMHCクラスII分子との結合が起こりうる
、非エンドソーム亜細胞性区画における保持を促進する、アミノ酸配列のアミノ
酸配列と同じ翻訳単位にある、与えられた抗原が、そのような亜細胞性区画に少
なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、さらにより好ましくは少な
くとも約10倍またはより高レベルに、そのような亜細胞性区画における保持を
促進するアミノ酸配列を欠く翻訳単位に存在する同じ抗原より、そのような亜細
胞性区画に見いだしうることを意図する。加工および続くMHCクラスII分子
との結合が起こりうる非エンドソーム亜細胞性区画は、リソソーム、ゴルジ、お
よびメラノソームを含むが、これらに限定されない。タンパク質がある亜細胞性
区画内に存在するかの決定方法は、上述されている。As used herein, the term “amino acid sequence that facilitates processing of a protein by the non-endosomal MHC class II pathway” refers to the same amino acid sequence when present together with the amino acid sequence of a peptide antigen in the same translation unit. A subcellular eukaryotic cell in which the antigen is not endosomes and where protein fragmentation and subsequent binding to MHC class II molecules can occur, as compared to when the antigen is not in the same translation unit as the amino acid sequence. Amino acid sequences that increase the likelihood of being localized in the sexual compartment. "Increasing potential" is given in the same translational unit as the amino acid sequence of the amino acid sequence, which promotes retention in non-endosomal subcellular compartments where fragmentation and subsequent binding to MHC class II molecules can occur. Antigen promotes retention in such subcellular compartments to at least about 2-fold, more preferably at least about 5-fold, even more preferably at least about 10-fold or higher levels in such subcellular compartments It is contemplated that the same antigen present on the translation unit lacking the amino acid sequence may be found in such subcellular compartments. Non-endosomal subcellular compartments where processing and subsequent binding to MHC class II molecules can occur include, but are not limited to, lysosomes, Golgi, and melanosomes. Methods for determining whether a protein is present in a subcellular compartment are described above.
【0029】 「抗原」という語は、当該技術分野において熟知されており、そして、免疫原
性の物質、即ち免疫原、並びに免疫学的な非応答またはアレルギーを引き起こす
物質、即ちアレルゲンを含む。抗原は、一つまたは多数の抗原性決定基、即ちエ
ピトープを含む。本発明の記載において、「抗原」、「抗原性決定基」および「
エピトープ」という語は、相互変換的に使用される。本明細書中で使用されるよ
うに、「抗原」という語は、自然発生的抗原、合成抗原、外来抗原、自己抗原、
修飾自己抗原および変異抗原を含む。The term “antigen” is well known in the art and includes immunogenic substances, ie, immunogens, as well as substances that cause immunological non-responsiveness or allergy, ie, allergens. An antigen contains one or many antigenic determinants, ie, epitopes. In the description of the present invention, "antigen", "antigenic determinant" and "antigenic determinant"
The term "epitope" is used interchangeably. As used herein, the term “antigen” refers to naturally occurring antigens, synthetic antigens, foreign antigens, self antigens,
Includes modified self and mutant antigens.
【0030】 「天然または自然(nativeまたはnatural)」抗原は、エピトー
プを有するポリペプチド、タンパク質または断片であって、自然な生物源から単
離され、そして抗原受容体、特に患者におけるT細胞抗原受容体(TCR)に特
異的に結合しうる、前記ポリペプチド、タンパク質または断片である。A “native or natural” antigen is a polypeptide, protein or fragment having an epitope, which is isolated from a natural biological source and which is an antigen receptor, especially a T cell antigen receptor in a patient The polypeptide, protein or fragment capable of specifically binding to the body (TCR).
【0031】 合成抗原は、ペプチドが自然エピトープと同じTCRに結合するならば、自然
抗原に「対応する」と言われる。 本明細書中で「ポリペプチド」と相互変換的に使用される「ペプチド」という
語は、広義において二つまたはそれ以上のアミノ酸サブユニット、アミノ酸類似
物またはペプチド疑似体の化合物を言及するために用いられる。サブユニットは
ペプチド結合によって結合されていてもよい。他の態様において、サブユニット
は、例えばエステル、エーテルなどの他の結合により結合されていてもよい。本
明細書中で使用されるように、「アミノ酸」という語は、自然および/または非
自然のいずれか、またはグリシンおよびDまたはL光学異性体を含む合成アミノ
酸、並びにアミノ酸類似物およびペプチド疑似体を意図する。3つまたはそれ以
上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短いならば一般的にオリゴペプチドと
呼ばれる。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは一般的にポリペプチドまたはタン
パク質と呼ばれる。A synthetic antigen is said to “correspond” to a natural antigen if the peptide binds to the same TCR as the natural epitope. The term "peptide" as used interchangeably with "polypeptide" herein is used in a broad sense to refer to two or more amino acid subunits, amino acid analogs or peptidomimetic compounds. Used. The subunits may be linked by peptide bonds. In other embodiments, the subunits may be linked by other bonds, for example, esters, ethers, etc. As used herein, the term "amino acid" refers to either natural and / or non-natural or synthetic amino acids, including glycine and D or L optical isomers, as well as amino acid analogs and peptide mimetics Intended. Peptides of three or more amino acids are commonly referred to as oligopeptides if the peptide chain is short. If the peptide chain is long, the peptide is commonly called a polypeptide or protein.
【0032】 「配列モチーフ」という語は、分子(例えばアミノ酸またはヌクレオチド)の
集団において存在する様式をいう。典型的な様式は、親水性、疎水性、塩基性、
酸性、等のような特徴的なアミノ酸残基によって同定されうる。The term “sequence motif” refers to the manner in which a population of molecules (eg, amino acids or nucleotides) exists. Typical modes are hydrophilic, hydrophobic, basic,
It can be identified by characteristic amino acid residues such as acidic, and the like.
【0033】 「シグナル配列」は、新たに生合成された分泌または膜タンパク質を、非限定
的に、小胞体および亜細胞性区画(叉はエンドソーム)を含む細胞性膜へ向かっ
ておよび通して、指向する短アミノ酸配列である。シグナル配列は、ポリペプチ
ドのアミノ酸末端(N−末端)および/またはカルボキシ末端(C−末端)部分
でよく、そして一般的にポリペプチドが膜を通過したのち切断される。A “signal sequence” is used to direct newly biosynthesized secreted or membrane proteins towards and through the cellular membrane, including, but not limited to, the endoplasmic reticulum and subcellular compartments (or endosomes). It is a short amino acid sequence to be directed. The signal sequence may be at the amino-terminal (N-terminal) and / or carboxy-terminal (C-terminal) portion of the polypeptide, and is generally cleaved after the polypeptide has passed through the membrane.
【0034】 「遺伝子運搬ビヒクル」は、宿主細胞へ、挿入されたポリヌクレオチドを運び
うる分子として定義される。遺伝子運搬用ビヒクルの例は、リポソーム、天然ポ
リマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペ
プチド、多糖、リポ多糖、人工ウイルス包膜、金属粒子および細菌、バキュロウ
イルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス、バクテリオファー
ジ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、および多様な原核および真核宿主に
おいて発現するために記載された、当該技術分野において典型的に使用され、そ
して単純なタンパク質発現並びに、遺伝子治療に使用されうる他の組換え運搬用
ビヒクルである。“Gene delivery vehicle” is defined as a molecule that can carry an inserted polynucleotide into a host cell. Examples of gene delivery vehicles include liposomes, biocompatible polymers including natural and synthetic polymers, lipoproteins, polypeptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, artificial virus envelopes, metal particles and bacteria, baculoviruses, adenoviruses and retroviruses. Viruses such as viruses, bacteriophages, cosmids, plasmids, fungal vectors, and simple protein expression and genes typically used in the art described for expression in a variety of prokaryotic and eukaryotic hosts Other recombinant delivery vehicles that can be used for therapy.
【0035】 本明細書中で使用される「抗原提示マトリックス」という語は、抗原がT細胞
抗原受容体によってT細胞の表面に結合しうるような方法で、抗原を提示しうる
分子または分子群を意図する。抗原提示マトリックスは抗原提示細胞(APC)
の表面、APCの小胞調製物の上でよく、あるいはビーズ、プレートのような固
体支持体上の合成マトリックスの形でもよい。合成抗原提示マトリックスの例は
、β2−ミクログロブリンと複合体を形成する精製MHCクラスI分子、または
精製MHCクラスII分子、または固体支持体に接続したそれらの機能的部位で
ある。As used herein, the term “antigen presentation matrix” refers to a molecule or group of molecules that can present an antigen in such a way that the antigen can bind to the surface of a T cell via a T cell antigen receptor. Intended. Antigen presenting matrix is antigen presenting cell (APC)
On a vesicle preparation of APC, or in the form of a synthetic matrix on a solid support such as beads, plates. Examples of synthetic antigen-presenting matrices are purified MHC class I molecules, or complex MHC class II molecules, that complex with β2-microglobulin, or their functional sites attached to a solid support.
【0036】 本明細書中で使用されている「抗原提示細胞」の例は、主要組織適合遺伝子複
合体分子またはその部分、あるいは、一つまたは複数の非古典的MHC分子また
はその部分、に結合している抗原を表面に提示する細胞を意図する。適切なAP
Csの例は、以下で詳細に述べられ、およびマクロファージ、樹状細胞、B細胞
、APCsハイブリッド、および抗原提示母細胞のような細胞全体を含むが、こ
れらに限定されない。APCsハイブリッドの作製法は先に記載されている。例
えば国際特許出願第WO98/46785号およびWO95/16775参照。As used herein, an “antigen-presenting cell” is an example of a major histocompatibility complex molecule or a portion thereof, or one or more non-classical MHC molecules or portions thereof. A cell that presents its antigen on the surface is intended. Appropriate AP
Examples of Cs are described in detail below and include, but are not limited to, macrophages, dendritic cells, B cells, APCs hybrids, and whole cells such as antigen presenting mother cells. Methods for making APCs hybrids have been described previously. See, for example, International Patent Applications WO 98/46785 and WO 95/16775.
【0037】 樹状細胞(DCs)は、強力な抗原提示細胞である。DCsは、T細胞活性化
および増殖に必要なすべてのシグナルを供給することが示された。これらのシグ
ナルは2種類に分類しうる。免疫応答に特異性を与える第一の種類は、T細胞受
容体/CD3(”TCR/CD3”)複合体と、APCs表面で主要組織適合遺
伝子複合体(”MHC”)クラスIまたはIIタンパク質によって提示される抗
原ペプチドとの相互作用によって仲介される。この相互作用は、T細胞活性化が
起きるのに必要であるが十分でない。実際、第2の種類のシグナルなしでは、第
一の種類のシグナルは、T細胞免疫性アネルギーに帰着しうる。共刺激シグナル
と呼ばれる第二の種類のシグナルは、抗原特異的でもMHC限定的でもなく、お
よび第一のシグナル存在下で、T細胞の十分な増殖応答およびT細胞効果器機能
を引き起こしうる。本明細書中で使用されているように、「樹状細胞」は非限定
的にパルス樹状細胞、母細胞、または樹状細胞ハイブリッドを含む。[0037] Dendritic cells (DCs) are powerful antigen presenting cells. DCs have been shown to supply all signals necessary for T cell activation and proliferation. These signals can be classified into two types. The first type that confers specificity on the immune response is through the T cell receptor / CD3 ("TCR / CD3") complex and major histocompatibility complex ("MHC") class I or II proteins on the surface of APCs. It is mediated by interaction with the presented antigenic peptide. This interaction is necessary but not sufficient for T cell activation to occur. Indeed, without the second type of signal, the first type of signal may result in T cell immune anergy. A second type of signal, called a costimulatory signal, is neither antigen-specific nor MHC-restricted, and, in the presence of the first signal, can trigger a full proliferative response of T cells and T cell effector function. As used herein, "dendritic cells" include, but are not limited to, pulsed dendritic cells, mother cells, or dendritic cell hybrids.
【0038】 「抗原提示フォスター細胞(foster antigen present
ing cell)」は、内在性ペプチドの限定された結合から外来性抗原を取
込み、そして細胞表面に提示するように遺伝的に修飾された樹状細胞である。[0038] "Foster antigen present cells"
"ing cell" is a dendritic cell that has been genetically modified to take up an exogenous antigen from the limited binding of endogenous peptides and present it on the cell surface.
【0039】 「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」という語は、T細胞への抗原
提示および急性組織片拒否に必要とされる、細胞表面分子をコードする遺伝子複
合体をいう。ヒトにおいて、MHC複合体はHLA複合体としても知られる。M
HC複合体によってコードされるタンパク質は、「MHC分子」として知られ、
およびクラスI、およびクラスIIMHC分子に分類される。クラスIMHC分
子は、β2ミクログロブリンと非共有的に結合した、MHCにコードされるα鎖
からなる膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスIMHC分子は、ほとんどす
べての有核細胞によって発現され、そしてCD8+T細胞への抗原提示において 機能することが示された。クラスI分子は、ヒトにおけるHLA−A,−B,お
よび−Cを含む。クラスIIMHC分子もまた、非共有的に結合したIおよび9
鎖からなる、膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスIIMHCはまた、CD
+T細胞上に存在し、そしてヒトにおいてHLA−DP,−DQおよび−DRを
含むと知られる。「MHC限定(restriction)」という語は、加工
され、そして得られた抗原ペプチドがクラスIまたはクラスIIMHC分子とと
もに結合して提示さた後に限り、抗原認識することができるT細胞の特徴をいう
。MHCを同定しそして比較する方法は、当該技術分野においてよく知られてお
り、そしてAllen et al(1994)Human Imm.40:2
5−32;Santamaria et al.(1993)Human Im
m.37:39−50およびHurley et al.(1997)Tiss
ue Antigens50:401−415において記載されている。The term “major histocompatibility complex” or “MHC” refers to a gene complex encoding a cell surface molecule that is required for antigen presentation to T cells and acute debris rejection. In humans, the MHC complex is also known as the HLA complex. M
The protein encoded by the HC complex is known as "MHC molecule"
And class I and class II MHC molecules. Class I MHC molecules include a membrane heterodimeric protein consisting of an MHC-encoded α chain non-covalently associated with β2 microglobulin. Class I MHC molecules are expressed by almost all nucleated cells and have been shown to function in antigen presentation to CD8 + T cells. Class I molecules include HLA-A, -B, and -C in humans. Class II MHC molecules also have non-covalently attached I and 9
Includes membrane heterodimeric proteins consisting of chains. Class II MHC is also available on CD
It is present on + T cells and is known to contain HLA-DP, -DQ and -DR in humans. The term "MHC restriction" refers to the characteristic of a T cell that can be antigen-recognized only after it has been processed and the resulting antigenic peptide bound and presented with a class I or class II MHC molecule. Methods for identifying and comparing MHC are well known in the art and are described in Allen et al (1994) Human Imm. 40: 2
5-32; Santamaria et al. (1993) Human Im
m. 37: 39-50 and Hurley et al. (1997) Tiss
ue Antigens 50: 401-415.
【0040】 「共刺激分子」は、抗原提示細胞の表面に発現する受容体ーリガント対とT細
胞との間の相互作用において関与する。過去数年に渡り活発な研究は、休止T細
胞はサイトカイン遺伝子発現および増殖の誘導に、少なくとも二つのシグナルを
必要とすることを説得力をもって示した(Schwartz.R.H.(199
0)Science248:1349−1356;Jenkins.M.K.(
1992)Immunol Today13:69−73)。特異性を与える一
つのシグナルは、適切なMHC/ペプチド複合体とTCR/CD3複合体との相
互作用によって産生されうる。第2のシグナルは、抗原特異的でなく、そして「
共刺激」シグナルと呼ばれる。このシグナルは元来、「専門的」APCsと呼ば
れるマクロファージ、および樹状細胞のような骨髄由来アクセサリー細胞によっ
て供給される活性として定義される。いくつかの分子は共刺激活性を促進するこ
とが示された。これらは熱安定抗原(HSA)(Liu,Y.,et al.(
1992)J.Exp.Med.175:437−445),コンドロチン硫酸
塩修飾MHC不変鎖(Ii−CS)(Naujokas,M.F.,et al
.(1993)Cell 74:257−268),細胞内接着分子1(ICA
M−1)(Van Seventer.G.A(1990)J.Immunol
.144:4579−4586)、B7−1およびB7−2/B70(Schw
arz,R.H.(1992)Cell 71:1065−1068)である。
これらの分子はT細胞上の同種のリガンドとの相互作用により、共刺激を補助す
ると思われる。共刺激分子は、感受性T細胞の完全活性化獲得のために、正常な
生理条件下で必要である共刺激シグナル(単数又は複数)を媒介する。1つの典
型的な受容体ーリガンド対は、APCs表面のB7共刺激分子およびT細胞上の
その相補受容体CD28またはCTLA−4である(Freeman et a
l.(1993)Science 262:909−911;Young et
al.(1992)J.Clin Invest.90:229;Nabav
i et al.(1992)Nature 360:266−268)。他の
重要な共刺激分子は、CD40,CD53,CD80,CD86である。“Co-stimulatory molecules” are involved in the interaction between a T-cell and a receptor-ligant pair expressed on the surface of an antigen presenting cell. Active research over the past several years has convincingly shown that resting T cells require at least two signals to induce cytokine gene expression and proliferation (Schwartz. RH (199).
0) Science 248: 1349-1356; Jenkins. M. K. (
1992) Immunol Today 13: 69-73). One signal that confers specificity can be produced by the interaction of the appropriate MHC / peptide complex with the TCR / CD3 complex. The second signal is not antigen-specific and "
It is called the "co-stimulation" signal. This signal is originally defined as the activity supplied by macrophages, called "professional" APCs, and accessory cells derived from bone marrow, such as dendritic cells. Several molecules have been shown to promote costimulatory activity. These are thermostable antigens (HSA) (Liu, Y., et al.
1992). Exp. Med. 175: 437-445), chondrotin sulfate modified MHC invariant chain (Ii-CS) (Naujokas, MF, et al.).
. (1993) Cell 74: 257-268), Intracellular adhesion molecule 1 (ICA)
M-1) (Van Eventer. GA (1990) J. Immunol)
. 144: 4579-4586), B7-1 and B7-2 / B70 (Schw
arz, R .; H. (1992) Cell 71: 1065-1068).
These molecules appear to assist costimulation by interacting with cognate ligands on T cells. The costimulatory molecule mediates the costimulatory signal (s) required under normal physiological conditions for the acquisition of full activation of sensitive T cells. One exemplary receptor-ligand pair is the B7 costimulatory molecule on the surface of APCs and its complementary receptor CD28 or CTLA-4 on T cells (Freeman et a
l. (1993) Science 262: 909-911; Young et.
al. (1992) J.I. Clin Invest. 90: 229; Nabav
i et al. (1992) Nature 360: 266-268). Other important costimulatory molecules are CD40, CD53, CD80, CD86.
【0041】 「共刺激分子」という語は、T細胞の表面上にTCRに結合されているペプチ
ド/MHC複合体とともに機能する場合、ペプチドを結合しているT細胞の活性
化を達成する、共刺激効果を供給する、いかなる単一分子または分子の組み合わ
せも含む。従ってこの語は、B7、あるいはペプチド/MHC複合体とともにT
細胞表面のTCRが特異的にペプチドに結合する場合、同種のリガンドに結合し
、そしてT細胞の活性化に生じる、APC、その断片(単独、他の分子(単数又
は複数)との複合、または融合タンパク質の一部)等の抗原提示マトリックス上
の他の共刺激分子(単数または複数)を含む。共刺激分子は、例えばBeckm
an Coulterを含む多様な供給源から市場で入手可能である。野生型と
同様の生物学的活性を持つ分子、または精製された共刺激分子(例えば組換え的
に産生された、またはその変異体)は、常に明確に述べられるわけではないが、
本発明の思想および範囲内で使用されることが意図される。The term “co-stimulatory molecule” refers to a co-stimulatory molecule that, when functioning with the peptide / MHC complex bound to the TCR on the surface of the T cell, achieves activation of the T cell binding peptide. Includes any single molecule or combination of molecules that provides a stimulating effect. Thus, the term is used in conjunction with B7 or the peptide / MHC complex
If the cell surface TCR specifically binds to the peptide, APC, a fragment thereof (alone, complexed with other molecule (s), or Other co-stimulatory molecule (s) on the antigen presentation matrix, such as a portion of the fusion protein). Co-stimulatory molecules include, for example, Beckm
Available from a variety of sources, including an Coulter. Molecules with biological activity similar to wild-type or purified costimulatory molecules (eg, recombinantly produced or variants thereof) are not always explicitly stated,
It is intended to be used within the spirit and scope of the present invention.
【0042】 本明細書において使用のとおり、可換的に使用される「固相支持体」または「
固体支持体」は、特定の型の支持体に限定されない。むしろ多くの数の支持体は
入手可能であり、当業者に知られている。固相支持体は、シリカゲル、樹脂、誘
導プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲ
ルを含む。本明細書において使用のとおり、「固体支持体」は、合成抗原提示基
質細胞及びリポソームも含む。適切な固相支持体は、望まれる目的使用及び様々
なプロトコールへの適切性の基礎に基づいて選択されうる。例えば、ペプチド合
成のために、固相支持体は、ポリスチレン(例えば、Bachem Inc,.
Peninsula Laboratoriesより得られるPAM−res
in等)、POLYHIPE登録商標(Aminotech, Canadaよ
り得られる)、ポリアミン樹脂(Peninsula Laboratorie
sより得られる)、ポリエチレングリコールに移植されたポリスチレン樹脂(T
entaGel登録商標、Rapp Polymere, Tubingen,
Germany)またはポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/
Biosearch, Californiaより得られる)等の樹脂について
言及する可能性がある。As used herein, the terms “solid support” or “solid”, which are used interchangeably,
"Solid support" is not limited to a particular type of support. Rather, a large number of supports are available and known to those skilled in the art. Solid supports include silica gel, resins, derived plastic films, glass beads, cotton, plastic beads, alumina gel. As used herein, "solid support" also includes synthetic antigen-presenting substrate cells and liposomes. Suitable solid supports may be selected based on the desired end use and suitability for various protocols. For example, for peptide synthesis, the solid support may be a polystyrene (eg, Bachem Inc ,.
PAM-res obtained from Peninsula Laboratories
in, etc.), POLYHIPE registered trademark (obtained from Aminotech, Canada), polyamine resin (Peninsula Laboratorie)
s), and a polystyrene resin (T
entaGel registered trademark, Rapp Polymere, Tubingen,
Germany) or polydimethylacrylamide resin (Milligen /
(Obtained from Biosearch, California).
【0043】 「遺伝的に修飾された」という単語は、外来性遺伝子または核酸配列を含有す
る及び/または発現し、そして細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修
飾することを意味する。言い換えれば、それは細胞の内因性ヌクレオチドに対す
る何らかの付加、削除、または破壊に言及する。The term “genetically modified” means containing and / or expressing a foreign gene or nucleic acid sequence and modifying the genotype or phenotype of the cell or its progeny. In other words, it refers to any addition, deletion, or destruction of a cell's endogenous nucleotides.
【0044】 本明細書において使用のとおり、「サイトカイン」という単語は、細胞に様々
な効果、例えば成長または増殖、を及ぼす多くの因子のうちの任意の一つを言及
する。本発明の実施において、単独でまたは組み合わせで使用されるサイトカイ
ンの限定しない例は、インターロイキン−2(IL−2)、幹細胞因子(SCF
)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−6(IL−6)、
インターロイキン−12(IL−12)、G−CSF、顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン−1アルファ(IL−1I
)、インターロイキン−11(IL−11)、MIP−1I、白血病阻害因子(
LIF)、c−kitリガンド、トロンボポエチン(TPO)及びflt3リガ
ンドを含む。本発明はまた、一つまたはそれ以上のサイトカインが特異的に培地
から排除される培養条件を含む。サイトカインはいくつかの商社、例えばGen
zyme(Framingham.MA)、Genentech(South
San Fransisco, CA)、Amgen(Thousand Oa
ks, CA)、R&D Systems及びImmunex(Seattle
,WA)等から商業的に入手可能である。いつも明示的に見られるわけではない
が、野生型または精製サイトカインのような似た生物学的活性を有する分子(例
えば、組換えにより生産されたものまたはそれからのムテイン)が、発明の思想
及び範囲において使用されることが意図される、ということは意図される。As used herein, the term “cytokine” refers to any one of a number of factors that have various effects on a cell, such as growth or proliferation. Non-limiting examples of cytokines used alone or in combination in the practice of the present invention include interleukin-2 (IL-2), stem cell factor (SCF)
), Interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6),
Interleukin-12 (IL-12), G-CSF, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interleukin-1 alpha (IL-1I
), Interleukin-11 (IL-11), MIP-11, leukemia inhibitory factor (
LIF), c-kit ligand, thrombopoietin (TPO) and flt3 ligand. The invention also includes culturing conditions in which one or more cytokines are specifically excluded from the medium. Cytokines are available from several trading companies, such as Gen
zyme (Framingham. MA), Genentech (South)
San Francisco, CA), Amgen (Thousand Oa)
ks, CA), R & D Systems and Immunex (Seattle
, WA) are commercially available. Although not always explicitly seen, molecules having similar biological activities, such as wild-type or purified cytokines (eg, recombinantly produced or muteins therefrom), are contemplated by the spirit and scope of the invention. It is intended to be used in
【0045】 「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞に及び/またはその間に導入
する、自己複製する核酸分子を意味する。この単語は、主に核酸分子の挿入物を
細胞に導入する機能を有するベクター、主に核酸を複製する機能を有する複製ベ
クター、及びDNAまたはRNAの転写及び/または翻訳の機能を有する発現ベ
クターを含むことを意図する。また意図されるものに上記の機能の一つより多く
を提供するベクターもある。“Vector” means a self-replicating nucleic acid molecule that introduces an inserted nucleic acid molecule into and / or between host cells. This word refers to a vector having a function of mainly introducing a nucleic acid molecule insert into a cell, a replication vector having a function of mainly replicating a nucleic acid, and an expression vector having a function of transcription and / or translation of DNA or RNA. It is intended to include. Some vectors also provide more than one of the functions described above.
【0046】 「PCRプライマー」は、DNA塩基配列をTaq合成酵素などの熱安定合成
酵素、並びに一方は増幅される配列の一方の末端の(+)鎖に相補的であり、も
う一方は反対の末端の(−)鎖の相補的である二つのオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて増幅する方法である、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」
において使用されるプライマーについて言及する。新たに合成されたDNA鎖は
、同一のプライマー配列の追加的鋳型として引き続き使用されうるため、プライ
マーアニーリング、鎖延長、及び解離の連続した繰り返しが、所望の配列の等比
級数的及び高度に特異的な増幅を提供する(例えば、上述のPCR2:A PR
ACTICAL APPROACHを参照)。PCRはDNA標本において決め
られた配列の存在を検出するためにも用いることが可能である。A “PCR primer” is a DNA sequence which is complementary to a thermostable synthase such as Taq synthase, one is complementary to the (+) strand at one end of the sequence to be amplified, and the other is the opposite. "Polymerase chain reaction" or "PCR", a method of amplifying using two oligonucleotide primers that are complementary to the terminal (-) strand
Reference will be made to the primers used in. The newly synthesized DNA strand can subsequently be used as an additional template for the same primer sequence, so that successive repetitions of primer annealing, chain extension, and dissociation will result in an exponential and highly specific sequence of the desired sequence. (Eg, PCR2: APR as described above).
ACTICAL APPROACH). PCR can also be used to detect the presence of a defined sequence in a DNA sample.
【0047】 「宿主細胞」は、ベクターあるいは外因性核酸分子、ポリヌクレオチド及び/
またはタンパク質の混合物の受容者となりうる、またはなっている個々の細胞ま
たは細胞培養物を含むことを意図する。これはまた、単一の細胞の子孫を含むこ
とを意図し、子孫は、自然の、偶発の、または計画的な変異により、元の親細胞
と完全に同一(形態的または遺伝的、または全DNA相補性)である必要はない
。細胞は原核細胞あるいは真核細胞でよく、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、及
び哺乳類細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトを含むが、これだけに限
定されない。A “host cell” is a vector or exogenous nucleic acid molecule, polynucleotide and / or
Or, it is intended to include individual cells or cell cultures that can or have become recipients of a mixture of proteins. This is also intended to include the progeny of a single cell, wherein the progeny are completely identical (morphologically or genetically, or wholly) to the original parent cell by natural, accidental, or deliberate mutations. DNA complementation). The cells can be prokaryotic or eukaryotic, including but not limited to bacterial cells, yeast cells, animal cells, and mammalian cells such as mice, rats, monkeys or humans.
【0048】 「抗体」は、抗原に結合可能なイムノグロブリン分子である。本明細書におい
て使用の通り、この単語は無処理の(intact)イムノグロブリン分子だけ
でなく抗イディオタイプ抗体、変異型、断片、融合タンパク質、ヒト化タンパク
質、及び所期の特異性の抗原認識配列を含むイムノグロブリン分子の修飾物も含
む。“Antibodies” are immunoglobulin molecules that can bind to an antigen. As used herein, this word refers to intact immunoglobulin molecules as well as anti-idiotype antibodies, variants, fragments, fusion proteins, humanized proteins, and antigen recognition sequences of the desired specificity. And modified immunoglobulin molecules containing
【0049】 「抗体複合体」は、(上記で定義の通りの)抗体及びその結合パートナーまた
はリガンドの組み合わせである。 「免疫調整剤(immunomodulatory agent)」という単
語は、本明細書において使用の通り免疫反応を調節する分子、マクロ分子複合体
、または細胞であり、本発明の抗原ペプチド単独、あるいは本命最初中に記載の
種々の処方の任意のものを含む。種々の処方とは、;本発明の抗原ペプチドを含
むポリペプチド;本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド;APC及び合成抗原提示マトリックス(共刺激分子存在または非存在下
において)を含む抗原提示マトリックス上のクラスIまたはクラスII MHC
分子と結合する本発明の抗原ペプチド;他の分子またはマクロ分子構造物との共
有または非共有的に複合する発明の抗原ペプチド;及び、本発明のペプチドに特
異的な教育された抗原特異的免疫効果細胞である。An “antibody conjugate” is a combination of an antibody (as defined above) and its binding partner or ligand. The term "immunomodulatory agent" as used herein is a molecule, macromolecular complex, or cell that modulates an immune response and is described in the antigenic peptide alone, or at the outset of the invention. Including any of a variety of formulations. Various formulations include; a polypeptide comprising an antigenic peptide of the invention; a polynucleotide encoding a peptide or polypeptide of the invention; an antigen comprising an APC and a synthetic antigen-presenting matrix (in the presence or absence of a costimulatory molecule). Class I or Class II MHC on presentation matrix
An antigenic peptide of the invention that binds to a molecule; an antigenic peptide of the invention that is covalently or non-covalently complexed with another molecule or macromolecular structure; and an educated antigen-specific immunity specific for the peptide of the invention. Effect cells.
【0050】 「免疫反応の調整」という単語は、免疫反応の誘導(増加、誘発);及び免疫
反応の減少(抑圧)を含む。免疫調整法(またはプロトコール)とは、主題にお
ける免疫反応を調整する方法である。The term “modulating an immune response” includes the induction (increase, elicitation) of an immune response; and the reduction (suppression) of an immune response. An immunomodulation method (or protocol) is a method of modulating an immune response in a subject.
【0051】 本明細書において使用の通り「対象の免疫反応を誘導する」という単語は、当
該技術分野においてよく理解されている単語であり、少なくとも約2倍に、より
望ましくは少なくとも約5倍に、さらに望ましくは、少なくとも約10倍に、さ
らにより望ましくは少なくとも約100倍に、さらに望ましくは少なくとも約5
00倍に、さらに望ましくは少なくとも1000倍またはそれ以上、対象に抗原
(またはエピトープ)を提示する前の免疫反応(もし存在するならば)と比較し
て、対象に抗原(またはエピトープ)を提示した後の、抗原(またはエピトープ
)への免疫反応を検出(計測)可能にすることを意図する。抗原(またはエピト
ープ)に対する免疫反応は、抗原特異的(またはエピトープ特異的)抗体の生産
、及び抗原(またはエピトープ)に特異的に結合する分子を表面に発現する免疫
細胞の生産を含むがこれだけに限定されない。与えられた抗原(またはエピトー
プ)に対する免疫反応が誘導されたかを決定する方法は当該技術分野においてよ
く知られている。例えば、抗原特異的抗体は、当該技術分野において知られてい
るELISAを含むがそれだけに限定されない様々なイムノアッセイの一つを使
用すれば検知可能である。ELISAでは、例えば、試料中の抗体の固定された
抗原(またはエピトープ)への結合は、検知可能なラベルをした二次抗体(例え
ば、酵素ラベルしたマウス抗ヒトIg抗体)により検知できる。抗原特異的免疫
効果細胞は、FACS、またはCTLの場合においては51Cr−解離解析または 3 H−チミジン取り込み解析を含むがそれだけに限定されない、当業者に知られ た様々な解析法の一つにより検知可能である。As used herein, the term “induces an immune response in a subject” refers to the term
A word that is well understood in the art and is at least about twice as
Preferably at least about 5 times, more preferably at least about 10 times.
More preferably at least about 100-fold, more preferably at least about 5
00 fold, more preferably at least 1000 fold or more,
(Or epitope) before the immune response (if any)
The antigen (or epitope) after presenting the antigen (or epitope) to the subject
) Are intended to be detectable (measurable). Antigen (or epitome)
Response to antigen-specific (or epitope-specific) antibody production
Expressing on the surface a molecule that specifically binds to an antigen (or epitope)
Including but not limited to cell production. Given antigen (or epitome)
Methods for determining whether an immune response to
Well known. For example, antigen-specific antibodies are known in the art.
Using one of a variety of immunoassays, including but not limited to ELISA
It can be detected if used. In ELISA, for example, the immobilization of antibodies in a sample
Binding to an antigen (or epitope) is detected by a detectably labeled secondary antibody (eg,
(Enzyme-labeled mouse anti-human Ig antibody). Antigen-specific immunity
Effector cells are FACS or, in the case of CTL,51Cr-dissociation analysis or Three It can be detected by one of a variety of analytical methods known to those of skill in the art, including but not limited to H-thymidine incorporation analysis.
【0052】 「免疫効果細胞(immune effector cell)」という単語
は、抗原と結合可能である、または免疫反応を媒介する細胞を言及する。これら
の細胞は、非限定的に、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、及
び細胞傷害性T細胞(CTL)、例えば、CTL系列、CTLクローン、及び、
腫瘍、炎症、及びその他の浸潤由来のCTLを含む。ある疾病組織特定の抗原を
発現し、その抗原に特異的なCTLが単離されている。例えば、約80%の黒色
腫はgp100として知られる抗原を発現する。The term “immune effector cell” refers to a cell capable of binding an antigen or mediating an immune response. These cells include, but are not limited to, T cells, B cells, monocytes, macrophages, NK cells, and cytotoxic T cells (CTL), such as CTL lineages, CTL clones, and
Includes CTL from tumors, inflammation, and other invasions. A CTL that expresses an antigen specific to a diseased tissue and is specific to the antigen has been isolated. For example, about 80% of melanomas express an antigen known as gp100.
【0053】 「免疫効果分子」という単語は、本明細書において使用の通り、抗原特異的な
結合が可能な分子を言及し、抗体、T細胞抗原受容体、及び、クラス1及びクラ
ス2MHC分子を含む。The term “immune effect molecule”, as used herein, refers to a molecule capable of binding antigen-specifically, including antibodies, T cell antigen receptors, and class 1 and class 2 MHC molecules. Including.
【0054】 「未処理(naive)」免疫効果細胞は、抗原にさらされたことのない免疫
効果細胞である。 本明細書において使用の通り、「教育された抗原特異的免疫効果細胞」という
単語は、抗原に遭遇し、その抗原に特異的になった、上記で定義された通りの免
疫効果細胞である。教育された、抗原特異的免疫効果細胞は、抗原の結合により
活性化されうる。「活性化」は、細胞がもはやG0期になく、細胞型に特徴的な サイトカインを生産し始めることを意味する。例えば、活性化CD4+T細胞は
、IL−2を分泌し、休止期にあるCD4+T細胞と比較してより大量の高親和
性IL−2受容体をその表面に有する。A “naive” immune effector cell is an immune effector cell that has not been exposed to an antigen. As used herein, the term "educated antigen-specific immune effector cell" is an immune effector cell as defined above that has encountered an antigen and has become specific for that antigen. The educated, antigen-specific immune effector cells can be activated by antigen binding. "Activated" cells without anymore 0 phase G, meaning that begin to produce the characteristic cytokines cell types. For example, activated CD4 + T cells secrete IL-2 and have a higher amount of high affinity IL-2 receptor on their surface compared to quiescent CD4 + T cells.
【0055】 本発明のペプチドまたはポリペプチドは、B細胞及びT細胞などの抗原特異的
免疫効果細胞により優先的に認識される可能性がある。T細胞の関連において、
「認識された」という単語は、一つまたはそれ以上の抗原エピトープを含む本発
明のペプチドまたはポリペプチドが、認識される、つまり、抗原特異的T細胞の
表面に存在するT細胞抗原受容体(TCR)がエピトープと結合し、その結合が
T細胞の活性化または不応答を引き起こすような方法において、MHC分子と共
に(つまり結合して)APCの表面に提示されることである。「優先的に認識さ
れる」という単語は、本発明のポリペプチドが引き続き、無関係の抗原特異的な
T細胞により、上記定義の通りに認識されないことを意図する。エピトープが抗
原特異的T細胞により認識されるか決定する分析法は、当該技術分野において知
られており、本明細書において記載されている。The peptide or polypeptide of the present invention may be preferentially recognized by antigen-specific immune effector cells such as B cells and T cells. In the context of T cells,
The word "recognized" means that a peptide or polypeptide of the invention comprising one or more antigenic epitopes is recognized, ie, a T cell antigen receptor (T cell antigen receptor present on the surface of antigen-specific T cells) (TCR) binds to an epitope and is presented on the surface of the APC with the MHC molecule in a manner such that the binding causes activation or unresponsiveness of the T cell. The word "preferentially recognized" intends that the polypeptide of the invention will not subsequently be recognized by unrelated antigen-specific T cells as defined above. Assays for determining whether an epitope is recognized by antigen-specific T cells are known in the art and are described herein.
【0056】 「自己性(autogenic)」または「自家性(autologous)
」という単語は、本明細書において使用の通り、細胞の源を示す。つまり、個人
(「レシピエント」)に投与された細胞が、その個人(「ドナー」)または遺伝
的に同一の個人からもたらされたものであれば、その細胞は自己性である。自己
性細胞はまた、自己性細胞の子孫でもよい。この単語はまた、異なる細胞型の細
胞が、同一のドナーまたは遺伝的に同一のドナー由来の場合も示す。つまり、も
し、同じドナーまたはドナーと遺伝的に同一の個人由来である場合、または同じ
ドナーまたはドナーと遺伝的に同一な個人由来の細胞の子孫である場合、効果細
胞及び抗原提示細胞は自己性と呼ばれる。“Autogenic” or “autologous”
The word "" as used herein indicates a source of cells. That is, if the cells administered to an individual ("recipient") are from the individual ("donor") or a genetically identical individual, the cells are autologous. An autologous cell may also be a progeny of an autologous cell. The word also indicates when cells of different cell types are from the same donor or genetically identical donor. That is, if they are from the same donor or an individual genetically identical to the donor, or are descendants of cells from the same donor or an individual genetically identical to the donor, the effector and antigen presenting cells will be autologous. Called.
【0057】 同様に、「同種異系の(allogenic)」という単語は、本明細書にお
いて使用の通り、細胞の源を示す。つまり、個人(「レシピエント」)に投与さ
れる細胞が、もしレシピエントと遺伝的に同一でない個人由来である場合その細
胞は同種間である;特にこの単語は発現されたMHC分子における非同一性と関
連する。同種間細胞はまた、同種間細胞の子孫でも良い。この単語はまた、異な
る細胞型の細胞が遺伝的に非同一のドナー由来である場合、または遺伝的に非同
一のドナー由来の細胞の子孫である場合を示す。例えば、遺伝的に非同一のドナ
ー由来である場合、APCは効果細胞と同種間といって良い。Similarly, the word “allogenic”, as used herein, indicates the source of the cell. That is, if the cells administered to an individual ("recipient") are from an individual who is not genetically identical to the recipient, the cells are allogeneic; Related to gender. Allogeneic cells may also be progeny of allogeneic cells. The word also indicates when cells of different cell types are derived from genetically non-identical donors or are progeny of cells from genetically non-identical donors. For example, if the APC is derived from a genetically non-identical donor, the APC may be allogeneic with the effector cell.
【0058】 本明細書において使用の通り、「CD4+またはCD8+T細胞の集団に関連
した疾患または状態」という単語は、CD4+またはCD8+T細胞の集団に関
連しうるものである、つまり、これらの細胞は疾患の病原性にまず反応するもの
であり;これはまたCD4+またはCD8+T細胞の存在が疾患状態の指標とな
るものであり;これはまたCD4+またはCD8+T細胞の集団の存在は疾患の
第一の原因ではないが、疾患の病原性において鍵となる役割を果たすことにおけ
るものであり;これはまたCD4+またはCD8+T細胞の集団が外来性抗原の
望まれない拒絶を媒介することにおけるものである。CD4+またはCD8+T
細胞の集団に関連した状態の例は、自己免疫疾患、移植片拒絶、免疫調節障害、
及びアナフィラキシー性障害を含むがそれだけに限定されない。As used herein, the term “disease or condition associated with a population of CD4 + or CD8 + T cells” is one that can be associated with a population of CD4 + or CD8 + T cells, ie, these cells Which is first responsive to the pathogenicity of the disease; this also indicates that the presence of CD4 + or CD8 + T cells is indicative of a disease state; and that the presence of a population of CD4 + or CD8 + None, but in playing a key role in the pathogenesis of the disease; it is also in that the population of CD4 + or CD8 + T cells mediates unwanted rejection of foreign antigens. CD4 + or CD8 + T
Examples of conditions associated with populations of cells include autoimmune diseases, graft rejection, immune dysregulation,
And anaphylactic disorders.
【0059】 本明細書において使用の通り「新生細胞(neoplastic cell)
」、「新形成(neoplasia)」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」及び
「癌細胞」(互換的に使用される)という単語は、比較的自律的増殖を示し、そ
の結果、細胞増殖の制御の重要な欠損(つまり細胞***の脱抑制)により特徴づ
けられる異常成長表現型を示す細胞について言及する。新生細胞は、悪性または
良性であり得る。As used herein, “neoplastic cell”
The words "neoplasia", "tumor", "tumor cells", "cancer" and "cancer cells" (used interchangeably) indicate relatively autonomous growth, Reference is made to cells that exhibit an abnormal growth phenotype characterized by an important defect in the control of cell proliferation (ie, disinhibition of cell division). Neoplastic cells can be malignant or benign.
【0060】 腫瘍成長の「抑制」は、本明細書において記載の、教育された抗原特異的免疫
効果細胞に接触することなしに生育するのと比較したとき、短くなる成長状態を
示す。腫瘍細胞の成長は、腫瘍の大きさを測る、3H−チミジン取り込み解析を 用いて腫瘍細胞が増殖しているか決定する、または腫瘍細胞を数えることを含む
がそれだけに限定されない当該技術分野において知られている方法により査定可
能である。腫瘍細胞成長の「抑制」は以下の状態のひとつまたは全てを意味する
、腫瘍の生育が遅くなる、遅延する及び停止する、同様に腫瘍が縮小する。“Inhibition” of tumor growth refers to a shortened growth state as compared to growing without contacting the educated antigen-specific immune effect cells as described herein. Tumor cell growth is known in the art, including, but not limited to, measuring tumor size, using 3 H-thymidine incorporation analysis to determine if tumor cells are growing, or counting tumor cells. Can be assessed by the method "Inhibition" of tumor cell growth refers to one or all of the following conditions, in which the growth of the tumor is slowed, delayed and stopped, as well as the tumor shrinks.
【0061】 「培養」という単語は、様々な種類の培地上または中における、細胞または器
官のインビトロにおける増殖について言及する。培養における細胞生育の子孫は
親細胞と完全に同一(形態的、遺伝的、または表現型的に)でなくとも良いと理
解されている。「拡大(expended)」により、細胞の増殖または***が
意味される。The word “culture” refers to the in vitro growth of cells or organs on or in various types of media. It is understood that progeny of cell growth in culture may not be completely identical (morphologically, genetically, or phenotypically) to the parent cell. By "expanded" is meant the growth or division of a cell.
【0062】 「対象(subject)主題」は脊椎動物、望ましくは哺乳類、より望まし
くはヒトである。哺乳類は、マウス、サル、ヒト、農耕動物、競技動物、及びペ
ットを含むがそれだけに限定されない。A “subject subject” is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human. Mammals include, but are not limited to, mice, monkeys, humans, farm animals, sport animals, and pets.
【0063】 本明細書において使用の通り、「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転
写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程について
言及する。もしポリヌクレオチドがゲノムDNA由来である場合、発現は適切な
真核細胞宿主が選択されるならばmRNAのスプライシングを含む。発現に必要
な調節因子は、RNA合成酵素に結合するプロモーター配列及びリボソーム結合
のための翻訳開始配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、lacプロモータ
ーなどのプロモーター、及び翻訳開始のためのシャイン−ダルガーノ配列、及び
開始コドンAUG(Sambrookら、(1989)上述)を含む。同様に、
真核生物発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIのための異種または相同プロ
モーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG及びリボソーム解
離のための終止コドンを含む。これらベクターは、商業的に入手可能であるか、
または、当該技術分野においてよく知られる方法、例えば一般的ベクターの構築
のための下記に記載の方法、において記載される配列により組み立てられる。As used herein, “expression” refers to the process by which a polynucleotide is transcribed into mRNA and translated into a peptide, polypeptide, or protein. If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression includes splicing of the mRNA if a suitable eukaryotic host is selected. Regulators required for expression include a promoter sequence that binds RNA synthase and a translation initiation sequence for ribosome binding. For example, bacterial expression vectors include a promoter, such as the lac promoter, and a Shine-Dalgarno sequence for translation initiation, and an initiation codon AUG (Sambrook et al., (1989) supra). Similarly,
Eukaryotic expression vectors contain a heterologous or homologous promoter for RNA polymerase II, a downstream polyadenylation signal, an initiation codon AUG and a stop codon for ribosome dissociation. These vectors are commercially available or
Alternatively, it is assembled by the sequences described in methods well known in the art, such as those described below for the construction of general vectors.
【0064】 「単離された」または「精製された」細胞、核酸、ペプチド、またはタンパク
質の集団は、細胞及び自然には会合している物質からは個々に実質的に解離して
いる。実質的に解離している、または実質的に精製されているは、組成のうち少
なくとも50%は所期の集団を含む、望ましくは少なくとも70%、より望まし
くは少なくとも80%、さらに望ましくは少なくとも90%の、自然には所期の
の分子と会合する分子を解離していることを意味する。A population of “isolated” or “purified” cells, nucleic acids, peptides, or proteins is substantially dissociated individually from cells and naturally associated material. Substantially dissociated or substantially purified, wherein at least 50% of the composition comprises the desired population, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90% % Means dissociating molecules that naturally associate with the intended molecule.
【0065】 「組成物」は活性剤、及び他の化合物または組成物、不活性剤(例えば検知可
能な薬剤または標識)または、補助剤などの活性剤の混合物を意味する。 「医薬組成物」は、担体の活性剤の混合物を含み、不活性化または活性化であ
れ、診断または治療のためのインビトロ(in vitro)、インビボ(in
vivo)、またはエクソビボ(ex vivo)使用に適した組成物を作成
することを意図する。“Composition” means an active agent and a mixture of other compounds or compositions, an inactive agent (eg, a detectable agent or label), or an active agent such as an adjuvant. A "pharmaceutical composition" comprises a mixture of active agents in a carrier, whether inactivated or activated, for diagnosis or therapy in vitro, in vivo.
It is intended to make a composition suitable for in vivo or ex vivo use.
【0066】 本明細書において使用の通り、「医薬的に認容可能な担体」という単語は、リ
ン酸緩衝化塩溶液、水、及び油/水または水/油乳剤または様々な型の湿潤剤な
どの乳剤、等の一般的な薬学的担体を含む。組成物は、安定剤及び保存剤をも含
む。担体、安定剤及び補助剤の例としては、Martin, REMINGTO
N’S PHARM. SCI., 15th Ed. (Mack Publ
. Co., Easton(1975))を見よ。As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier” refers to phosphate buffered saline, water and oil / water or water / oil emulsions or various types of wetting agents and the like. And other common pharmaceutical carriers. The composition also contains a stabilizer and a preservative. Examples of carriers, stabilizers and adjuvants include Martin, REMINGTO
N'S PHARM. SCI. , 15th Ed. (Mack Publ
. Co. , Easton (1975)).
【0067】 本明細書において記載の通り、「含む」という単語は、組成物及び方法が列挙
される要素を含むがそれ以外を除外するわけではないことを意味することを意図
される。「本質的に成る」というのは、組成物及び方法を定義するために使用さ
れるとき、化合物の基礎的な重要性の他の要素を除外することを意味する。つま
り、本明細書に定義の通りの要素から本質的になる組成物は、単離及び精製法か
らの微量の汚染、並びに、リン酸緩衝化塩溶液、保存剤及び類似物などの薬学的
に認容可能な担体を除外しない。「から成る」とは、微量要素の他の成分及び、
本発明の組成物を投与するための実質的方法段階以上のものを除外することを意
味する。各々これらの移行単語により定義される態様は、本発明の範囲内にある
。As described herein, the word “comprising” is intended to mean that the compositions and methods include the recited elements but do not exclude others. “Consisting essentially of” when used to define compositions and methods, means excluding other elements of the basic importance of the compound. That is, a composition consisting essentially of the elements as defined herein will contain trace amounts of contamination from isolation and purification methods, as well as pharmaceutically acceptable amounts of phosphate buffered salt solutions, preservatives and the like. Does not exclude acceptable carriers. "Consisting of" means other components of the trace element, and
It is meant to exclude more than a substantial method step for administering the composition of the invention. The embodiments defined by each of these transition words are within the scope of the present invention.
【0068】 「有効な量」は、有益または望まれる結果を引き起こすために十分な量である
。有効な量は、一つまたはそれ以上の管理、効用、または適用量において投与可
能である。An “effective amount” is an amount sufficient to effect beneficial or desired results. An effective amount can be administered in one or more controlled, effective, or applied doses.
【0069】 本発明は、改良されたワクチン及び、抗原または対象における抗原に対する細
胞性及び体液性免疫反応を調節するためにワクチンを使用する方法を提供する。
本発明の目的のための抗原は、タンパク質抗原である。「タンパク質抗原」とい
う単語は、そのもっとも広い意味において使用され、単離された全長タンパク質
に加え最小のエピトープ、キメラ分子、合成抗原、を含む。エピトープは、変化
した抗原由来の可能性がある。下記記載の態様は腫瘍抗原を意図する一方、明示
的に位置しないが、免疫反応を誘導するいかなるタンパク質またはポリペプチド
は、本発明の範囲の中にあると意図されることは理解されている。そのような抗
原は、腫瘍抗原に限定されるだけでなく、ウイルス抗原、バクテリア抗原、及び
自己抗原を含む。このワクチンの抗原は、自己性、または異種性(つまり同種異
系)、単離された種由来の相同物、例えば、ヒト患者に投与されるマウス抗原、
である。The present invention provides improved vaccines and methods of using the vaccines to modulate cellular and humoral immune responses to an antigen or an antigen in a subject.
Antigens for the purposes of the present invention are protein antigens. The word "protein antigen" is used in its broadest sense and includes isolated full-length proteins as well as minimal epitopes, chimeric molecules, synthetic antigens. The epitope may be from an altered antigen. While the embodiments described below are intended as tumor antigens, but not explicitly positioned, it is understood that any protein or polypeptide that induces an immune response is intended to be within the scope of the present invention. Such antigens are not limited to tumor antigens, but also include viral, bacterial and autoantigens. The antigens of this vaccine can be autologous or heterologous (ie, allogeneic), homologues from an isolated species, such as mouse antigens administered to human patients,
It is.
【0070】 本発明のポリヌクレオチド 本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも二つのコード配列を含む。第一の配
列は、加工されて抗原提示細胞(APC)上にMHCクラスI分子と共に提示さ
れる第一の抗原をコードする。第二の配列は、加工されてAPC上にMHCクラ
スII分子と共に提示される第二の抗原をコードする。いくつかの態様において
、第一及び第二の抗原は、同じアミノ酸配列を有する。また別の態様において、
ポリヌクレオチドは、同じT細胞受容体により認識されるエピトープを含む抗原
をコードする。さらなる態様において、コードされた抗原は、同じ天然タンパク
質由来の異なるエピトープを含む。さらなる態様において、第一の及び第二の抗
原は、デフォルト変数を使用したアライメントプログラムを使用して決定される
ように、相互に少なくとも50%の同一のアミノ酸配列を共有する、あるいは、
ストリンジェントな条件下において相互にハイブリダイズするポリヌクレオチド
によりコードされる。Polynucleotides of the Invention The polynucleotides of the invention contain at least two coding sequences. The first sequence encodes a first antigen that is processed and presented with MHC class I molecules on antigen presenting cells (APCs). The second sequence encodes a second antigen that is processed and presented with MHC class II molecules on the APC. In some embodiments, the first and second antigens have the same amino acid sequence. In yet another aspect,
The polynucleotide encodes an antigen that contains an epitope recognized by the same T cell receptor. In a further aspect, the encoded antigens comprise different epitopes from the same native protein. In a further embodiment, the first and second antigens share at least 50% identical amino acid sequence with each other, as determined using an alignment program using default variables, or
Encoded by polynucleotides that hybridize to each other under stringent conditions.
【0071】 本発明のポリヌクレオチドは以下を含む: (a)抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一のコード配列;並びに (b)抗原をコードするヌクレオチド配列及び、コードされた抗原を小胞体(
ER)に保持することを促進するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
含む第二のコード配列。The polynucleotides of the present invention include: (a) a first coding sequence that includes a nucleotide sequence that encodes an antigen; and (b) a nucleotide sequence that encodes an antigen and the ER
(ER) a second coding sequence comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that facilitates retention.
【0072】 ポリヌクレオチドは、コードされた抗原をERに保持することを促進するアミ
ノ酸配列が、コードされた抗原のN末端またはC末端に添付されるように構築さ
れうる。あるいは、コードされた抗原をERに保持することを促進する配列は、
内部に生じても良い、つまり、コードされた抗原のN末端及びC末端の間である
。The polynucleotide can be constructed such that an amino acid sequence that facilitates retaining the encoded antigen in the ER is appended to the N-terminus or C-terminus of the encoded antigen. Alternatively, sequences that promote retention of the encoded antigen in the ER include:
It may occur internally, that is, between the N- and C-termini of the encoded antigen.
【0073】 ERに保持されることを促進する多くのアミノ酸配列は、当該技術分野におい
て知られている。例えば、Lys−Asp−Glu−Leu(KDEL)という
アミノ酸配列は、タンパク質のカルボキシ末端に添付されたとき、そのタンパク
質をERに保持することを促進する。Pelham (1990) Trend
s in Biochemical Sciences 15:483−486
。他には、カルボキシ末端ペプチドHis−Asp−Glu−Phe(HDEF
)が、添付されたタンパク質(標的)をERに保持することを促進することが報
告された。「KDEL」及び「HDEL」配列に加えて、「DDEL」、「AD
EL」、「SDEL」、「RDEL」、「KEEL」、「QEDL」、「HIE
L」、「HTEL」及び「KQDL」等のその他の配列は、小胞体に滞在するた
めのシグナルとして知られており、これらの配列を有するポリペプチドは通常E
Rに保持される。Pelham (1990) TIBS, 15:483。従
って、いくつかの態様において、コードされた抗原をERに保持することを促進
するアミノ酸配列は、KDEL、HDEL、DDEL、ADEL、SDEL、R
DEL、KEEL、QEDL、HIEL、HTEL、及びKQDLからなる集団
より選択される。Many amino acid sequences that facilitate retention in the ER are known in the art. For example, the amino acid sequence Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL), when attached to the carboxy terminus of a protein, promotes retention of the protein in the ER. Pelham (1990) Trend
s in Biochemical Sciences 15: 483-486.
. Others include the carboxy terminal peptide His-Asp-Glu-Phe (HDEF
) Was reported to promote retention of the attached protein (target) in the ER. In addition to the “KDEL” and “HDEL” sequences, “DDEL”, “ADEL”
EL, SDEL, RDEL, KEEL, QEDL, HIE
Other sequences such as "L", "HTEL" and "KQDL" are known as signals for staying in the endoplasmic reticulum, and polypeptides having these sequences are usually E. coli.
It is held in R. Pelham (1990) TIBS, 15: 483. Thus, in some embodiments, the amino acid sequence that promotes retention of the encoded antigen in the ER is KDEL, HDEL, DDEL, ADEL, SDEL, R
It is selected from the group consisting of DEL, KEEL, QEDL, HIEL, HTEL, and KQDL.
【0074】 いくつかの態様において、コードされた抗原を小胞体(ER)に保持すること
を促進するアミノ酸配列はKDELである。これらの態様において、抗原をコー
ドするヌクレオチド配列及びKDELをコードするヌクレオチド配列を含むコー
ド配列によりコードされる抗原が転写及び翻訳されるとき、翻訳単位はカルボキ
シ末端アミノ酸としてKDELを有する抗原を含む。[0074] In some embodiments, the amino acid sequence that facilitates retention of the encoded antigen in the endoplasmic reticulum (ER) is KDEL. In these embodiments, when the antigen encoded by the coding sequence comprising the nucleotide sequence encoding the antigen and the nucleotide sequence encoding KDEL is transcribed and translated, the translation unit comprises an antigen having KDEL as the carboxy-terminal amino acid.
【0075】 その他の態様において、コードされた抗原を小胞体(ER)に保持することを
促進するアミノ酸配列はHDEFである。これらの態様において、抗原をコード
するヌクレオチド配列及びHDEFをコードするヌクレオチド配列を含むコード
配列によりコードされる抗原が転写及び翻訳されるとき、翻訳単位はカルボキシ
末端アミノ酸としてHDEFを有する抗原を含む。In another embodiment, the amino acid sequence that facilitates retention of the encoded antigen in the endoplasmic reticulum (ER) is HDEF. In these embodiments, when the antigen encoded by the coding sequence comprising the nucleotide sequence encoding the antigen and the nucleotide sequence encoding HDEF is transcribed and translated, the translation unit comprises an antigen having HDEF as the carboxy terminal amino acid.
【0076】 その他の態様において、発明のポリヌクレオチドは以下を含む: (a)抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一のコード配列; (b)抗原をコードするヌクレオチド配列及び、コードされた抗原を小胞体(
ER)に保持することを促進するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
含む第二のコード配列;並びに (c)抗原をコードするヌクレオチド配列及び、コードされた抗原を非エンド
ソームMHCクラスII経路に指向させる(あるいは保持することを促進する、
または標的とする)アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む第三のコ
ード配列。In other embodiments, the polynucleotides of the invention comprise: (a) a first coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding an antigen; (b) a nucleotide sequence encoding an antigen; ER (
(ER) a second coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that facilitates retention; and (c) a nucleotide sequence encoding an antigen and directing the encoded antigen to a non-endosomal MHC class II pathway. (Or promote retention,
Or a target)) nucleotide sequence encoding an amino acid sequence.
【0077】 ポリヌクレオチドは、コードされた抗原を非エンドソームMHCクラスII経
路に指向させる向けるアミノ酸配列が、コードされた抗原のN末端またはC末端
に添付されるように構築されうる。あるいは、コードされた抗原を非エンドソー
ムMHCクラスII経路に指向させる配列は、内部に生じても良い、つまり、コ
ードされた抗原のN末端及びC末端の間である。The polynucleotide can be constructed such that an amino acid sequence that directs the encoded antigen to the non-endosomal MHC class II pathway is appended to the N-terminus or C-terminus of the encoded antigen. Alternatively, the sequence that directs the encoded antigen to the non-endosomal MHC class II pathway may occur internally, ie, between the N- and C-termini of the encoded antigen.
【0078】 非エンドソームMHCクラスII経路は、リソソーム、ゴルジ体、及びメラノ
ソームを含むがそれだけに限定されない。非エンドソームMHCクラスII経路
にタンパク質を指向させるアミノ酸配列は当該技術分野において知られている。
抗原をメラノソーム(Xuら、(1998) J. Invest. Derm
atol. 110:324−331;及びJimbowら、(1997) P
igment Cell Res. 10:206−213);リソソーム(K
ornfeldら、(1987) FASEB J. 1:462−468;及
びHasilikら(1992) Experientia 48:130−1
51);及びゴルジ体(Nilsson及びWarren(1994) Cur
r. Opinion Cell Biol. 6:517−521)に指向さ
せる(あるいは保持することを促進する、あるいは標的とする)アミノ酸配列は
、文献中において報告されており、本発明においても使用されうる。Non-endosomal MHC class II pathways include, but are not limited to, lysosomes, Golgi apparatus, and melanosomes. Amino acid sequences that direct proteins to non-endosomal MHC class II pathways are known in the art.
Antigens were purified from melanosomes (Xu et al., (1998) J. Invest. Derm.
atol. 110: 324-331; and Jimbow et al., (1997) P.
iigment Cell Res. 10: 206-213); lysosomes (K
Ornfeld et al., (1987) FASEB J. et al. 1: 462-468; and Hasilik et al. (1992) Experientia 48: 130-1.
51); and Golgi apparatus (Nilsson and Warren (1994) Cur.
r. Opinion Cell Biol. 6: 517-521) (or that promotes retention or targets) amino acid sequences have been reported in the literature and can be used in the present invention.
【0079】 いくつかの態様において、コードされた抗原は、自然に発生する抗原または自
然に発生する抗原の断片である。その他の態様において、抗原は合成抗原である
。抗原は「自己性」あるいは外来性でもよく、いかなる生物体由来でも良い。抗
原は、自家性または異種性(つまり同種異系または単離された種由来の相同物、
例えばヒトの患者に投与されるマウス抗原)でよい。各々のコード配列は、コー
ド配列の転写及び翻訳を制御する、操作的及び制御的配列に操作的に結合してい
る。これらの操作的及び制御的配列は当業者によく知られている。[0079] In some embodiments, the encoded antigen is a naturally occurring antigen or a fragment of a naturally occurring antigen. In other embodiments, the antigen is a synthetic antigen. Antigens may be "self" or foreign and may be derived from any organism. Antigens may be autologous or heterologous (ie, homologues from allogeneic or isolated species,
For example, a mouse antigen administered to a human patient). Each coding sequence is operably linked to operational and regulatory sequences that control the transcription and translation of the coding sequence. These operational and regulatory sequences are well known to those skilled in the art.
【0080】 本発明のポリヌクレオチドは、一つの態様において、gp100(Kawak
amiら、(1997) Intern. Rev. Immunol. 14
:173−192)、MUC−1(Hendersonら、(1996) Ca
ncer Res. 56:3763−3770)、MART−1(Kawak
amiら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 9
1:3515−3519; Kawakamiら、(1997) Intern
. Rev. Immunol. 14:173−192; Ribasら、(
1997) Cancer Res. 57:2865−2869)、HER−
2/neu(米国特許第5550214号)、MAGE(PCT/US92/0
4354)HPV16、18E6及びE7(Ressingら、(1996)
Cancer Res. 56(1):582−588; Restifo(1
996) Current Opinion in Immunol. 8:6
58−663; Stern (1996) Adv. Cancer Res
. 69:175−211; Tindleら、(1995) Clin. E
xp. Immunol. 101:265−271; van Drielら
、(1996) Annuals of Medicine 28:471−4
77)CEA(米国特許第5274087号)、PSA(Lundwall,
A. (1989) Biochem. Biophys. Research
Communications 161:1151−59)、前立腺膜特異的
抗原(PSMA)(Israeliら、(1993) Cancer Rese
arch 53:227−30)、チロシナーゼ(米国特許第5530096号
及び4898814号; Brichardら、(1993)J. Exp M
ed. 178:489−49);チロシナーゼ関連タンパク質1または2(T
RP−1及びTRP−2)、NY−ESO−1(Chenら、(1997) P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:1914
−18)、またはGA733抗原(米国特許第5185254号)等の以前に特
徴化された腫瘍関連抗原をコードするコード領域を含む。The polynucleotide of the present invention, in one embodiment, comprises gp100 (Kawak)
Ami et al., (1997) Intern. Rev .. Immunol. 14
173-192), MUC-1 (Henderson et al., (1996) Ca
ncres. 56: 3763-3770), MART-1 (Kawak)
Ami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 9
1: 3515-3519; Kawakami et al., (1997) Intern.
. Rev .. Immunol. 14: 173-192; Ribas et al., (
1997) Cancer Res. 57: 2865-2869), HER-
2 / neu (US Pat. No. 5,550,214), MAGE (PCT / US92 / 0).
4354) HPV 16, 18E6 and E7 (Ressing et al., (1996)
Cancer Res. 56 (1): 582-588; Restifo (1
996) Current Opinion in Immunol. 8: 6
58-663; Stern (1996) Adv. Cancer Res
. 69: 175-211; Tindle et al., (1995) Clin. E
xp. Immunol. 101: 265-271; van Driel et al., (1996) Annuals of Medicine 28: 471-4.
77) CEA (US Pat. No. 5,274,087), PSA (Lundwall,
A. (1989) Biochem. Biophys. Research
Communications 161: 1151-59), prostate membrane-specific antigen (PSMA) (Israeli et al., (1993) Cancer Rese).
arch 53: 227-30), tyrosinase (U.S. Patent Nos. 5,530,096 and 4,988,814; Brichard et al., (1993) J. Exp M.
ed. 178: 489-49); Tyrosinase-related protein 1 or 2 (T
RP-1 and TRP-2), NY-ESO-1 (Chen et al., (1997) P
rc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94: 1914
-18), or a previously characterized tumor-associated antigen, such as the GA733 antigen (US Pat. No. 5,185,254).
【0081】 いくつかの態様において、発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗原は
、分泌されたタンパク質、または細胞から分泌されるように組み替え改変された
抗原である。[0081] In some embodiments, the antigen encoded by the polynucleotide of the invention is a secreted protein or an antigen that has been recombinantly modified to be secreted from the cell.
【0082】 抗原の分泌される型は、野生型抗原をコードする配列にシグナル配列をスプラ
イシングする、または、抗原の細胞質及び膜貫通部をコードする配列を除去する
、及び/または、1)コードされたタンパク質を細胞質、核またはミトコンドリ
アなどの細胞内画分に指向する、または2)コードされたタンパク質を細胞膜に
挿入する(つまり膜貫通領域)、または3)コードされたタンパク質を疎水的ア
ンカー配列または小胞体維持シグナルなどの細胞内画分に保持する配列を除去す
ることにより合成することができる。The secreted form of the antigen may be spliced with a signal sequence to the sequence encoding the wild-type antigen, or remove sequences encoding the cytoplasmic and transmembrane regions of the antigen, and / or 1) encode the Directed to the intracellular fraction, such as the cytoplasm, nucleus or mitochondria, or 2) inserts the encoded protein into the cell membrane (ie, a transmembrane region), or 3) inserts the encoded protein into a hydrophobic anchor sequence or It can be synthesized by removing a sequence retained in an intracellular fraction such as an endoplasmic reticulum maintenance signal.
【0083】 より具体的には、分泌される抗原は、当業者に知られている標準的な組換えD
NA方法論を使用して、野生型抗原に分泌性シグナル配列を融合することにより
発現させることができる。分泌性シグナル配列は、典型的には要求されるタンパ
ク質のN末端に位置されるが、抗原の分泌を可能にするのに適するいずれの位置
にも配置されてもよい。例証として、図は、野生型の抗原をコードするDNA配
列に、小胞体標的配列(ERTS)等の分泌性シグナル配列をコードするDNA
配列を5’端に読み枠を合わせて融合させたものを含む、膜貫通型カセットを示
す。野生型遺伝子および修飾される遺伝子の間に内部リボソーム進入配列(IR
ES)が挿入され、両方の遺伝子がCMVプロモーターにより支配されるような
カセットの転写により生産される両シストロン性mRNAから翻訳されるように
保証する。適当な分泌性シグナル配列は、既知の分泌性のタンパク質のシグナル
配列またはシグナル配列の派生体を含む。多様な分泌性タンパク質が同定されて
いる。それらは、非限定的に線維芽細胞成長因子4−6、上皮性成長因子等のあ
る種の成長因子、およびインターロイキン2−6などのリンホカインを含む。More specifically, the secreted antigen is a standard recombinant D-protein known to those of skill in the art.
Expression can be achieved by fusing a secretory signal sequence to the wild-type antigen using NA methodology. The secretory signal sequence is typically located at the N-terminus of the required protein, but may be located at any suitable position to allow secretion of the antigen. As an illustration, the figure shows that the DNA sequence encoding the wild-type antigen has a DNA encoding a secretory signal sequence such as the endoplasmic reticulum target sequence (ERTS).
Shown is a transmembrane cassette containing the sequence fused to the 5 'end in reading frame. An internal ribosome entry sequence (IR) between the wild-type gene and the gene to be modified
ES) is inserted, ensuring that both genes are translated from the bicistronic mRNA produced by transcription of the cassette as governed by the CMV promoter. Suitable secretory signal sequences include known secretory protein signal sequences or signal sequence derivatives. A variety of secretory proteins have been identified. They include, but are not limited to, certain growth factors such as fibroblast growth factor 4-6, epidermal growth factor, and lymphokines such as interleukin 2-6.
【0084】 あるいは、分泌される抗原は、分泌性シグナル配列を抗原に付加すること、お
よび所望により1)コードされるタンパク質を細胞質、核およびミトコンドリア
などの細胞内区画へ指向する、または2)コードされるタンパク質を細胞の膜へ
挿入させる(すなわち、膜貫通領域)、または3)コードされるタンパク質を疎
水性アンカー配列または小胞体保持シグナルなどの細胞の区画内に保持させる、
配列を除去することにより発現されることも可能である。修飾された抗原は、粗
面小胞体/ゴルジ体混合体への侵入および細胞からの最終的分泌に必要な配列を
保持するが、膜固着に必要な配列を欠損する。Alternatively, the secreted antigen can be obtained by adding a secretory signal sequence to the antigen, and optionally 1) directing the encoded protein to intracellular compartments such as the cytoplasm, nucleus and mitochondria, or 2) encoding Causing the protein to be inserted into the membrane of the cell (ie, a transmembrane region), or 3) retaining the encoded protein in a compartment of the cell, such as a hydrophobic anchor sequence or an endoplasmic reticulum retention signal;
It can also be expressed by removing the sequence. The modified antigen retains the sequences necessary for entry into the rough endoplasmic reticulum / Golgi mixture and eventual secretion from cells, but lacks the sequences required for membrane anchoring.
【0085】 他の態様において、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗原は細胞
表面タンパク質である。いくつかのこれらの態様において、抗原をコードするポ
リヌクレオチドは、コードされるタンパク質が細胞の膜の中へ挿入させるアミノ
酸配列(すなわち、膜貫通領域)をコードする配列をさらに含む。[0085] In another embodiment, the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention is a cell surface protein. In some of these embodiments, the polynucleotide encoding the antigen further comprises a sequence encoding an amino acid sequence that allows the encoded protein to insert into the membrane of a cell (ie, a transmembrane region).
【0086】 本発明の核酸配列に関し”単離された”は、それの起源または操作により;(
i)自然において会合している全ての核酸と会合しない(例えば発現ベクターの
一部として宿主細胞において存在する)又は;(ii)自然において会合してい
る以外の核酸または他の化学成分と会合している;又は(iii)自然において
発生しない、RNAまたはDNAポリマー、ゲノム核酸の一部、cDNA、また
は合成核酸を意味する。”単離された”とは、さらに(i)例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)によりインビトロで増幅された;(ii)例えば、化学合
成により合成された;(iii)クローニングにより組換え的に生産された;ま
たは(iv)例えば切断およびゲル分離により、精製された、核酸配列をさらに
意味する。“Isolated” with respect to the nucleic acid sequences of the present invention, by their origin or operation;
i) does not associate with all nucleic acids that are associated in nature (eg, is present in the host cell as part of an expression vector); or (ii) associates with nucleic acids or other chemical components other than those associated with nature. Or (iii) a non-naturally occurring RNA or DNA polymer, a portion of a genomic nucleic acid, a cDNA, or a synthetic nucleic acid. "Isolated" further refers to (i) amplified in vitro, for example, by the polymerase chain reaction (PCR); (ii) synthesized, for example, by chemical synthesis; (iii) recombinantly produced by cloning Or (iv) further purified nucleic acid sequences, for example by cleavage and gel separation.
【0087】 本発明の核酸配列は、わずかに通常の技術を使用することにより特徴づけられ
る、単離される、合成されるおよび精製されることも可能である。上述のSam
brook et al.,(1989)を参照すること。The nucleic acid sequences of the present invention can also be characterized, isolated, synthesized and purified using slightly conventional techniques. Sam mentioned above
Brook et al. , (1989).
【0088】 本発明のポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞の中へポリヌクレオチドの形
質導入を確認するために、遺伝子またはAPCにおいて発現される遺伝子転写物
の検出のためのプライマーとして役立つこともまた可能である。この関連におい
て、増幅とは、適切な忠実度をもって標的配列を複製することの可能性のあるプ
ライマー依存性ポリメラーゼを使用するいかなる方法を意味する。増幅は、T7
DNAポリメラーゼ、E.coliのDNAポリメラーゼのKlenowフラグ
メント、および逆転写酵素等の天然のDNAポリメラーゼまたは組換えDNAポ
リメラーゼにより実行されることも可能である。プライマーの好ましい長さは上
述のプローブのために同定されるものと同じである。A polynucleotide of the present invention can also serve as a primer for the detection of a gene or gene transcript expressed in an APC, eg, to confirm transduction of the polynucleotide into a host cell. It is. In this context, amplification refers to any method that uses a primer-dependent polymerase that is capable of replicating the target sequence with appropriate fidelity. Amplification is T7
DNA polymerase, E. It can also be performed by a Klenow fragment of E. coli DNA polymerase and a natural or recombinant DNA polymerase such as reverse transcriptase. The preferred length of the primer is the same as that identified for the probe described above.
【0089】 本発明は、RNA転写のプロモーター、並びにDNAまたはRNAの複製およ
び/または一時的なおよび定常的な発現のための他の制御配列を、機能可能なよ
うに連接された単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。本明細書中で使
用されるが、”機能可能なように連結された(operably linked
)”という用語は、プロモーターがDNA分子からRNA転写を指向するような
様式にて配置されることを意味する。そのようなプロモーターの例はSP6、T
4およびT7である。ある態様において、細胞特異的プロモーターは、挿入され
たポリヌクレオチドの細胞特異的な発現のために使用される。プロモーターまた
はプロモーター/エンハンサー、並びに終止コドンおよび選択マーカー配列を有
し、さらに、挿入されたDNA断片がそのプロモーターに機能可能なように連結
されることも可能であるクローニングサイト有していてもよい、ベクターは当該
技術分野において周知であり、および商業的に入手可能である。一般的な方法論
およびクローニング戦略のため、GENE EXPRESSION TECHN
OLOGY(Goeddel ed.,Academic Press,Inc
.(1991))前記文献中で引用されている再考文献、並びにVECTORS
:ESSENTIAL DATA SERIES(Gacesa and Ra
mji,eds.,John Wiley & Sons,N.Y.(1994
))を参照。それらは多様な適切なベクターのための地図、機能的特性、商業的
供給者およびGenEMBL寄託番号の照会を含む。好ましくは、これらのベク
ターはインビトロでまたはインビボでRNAの転写が可能である。The present invention relates to an isolated RNA operably linked promoter for RNA transcription and other regulatory sequences for DNA and RNA replication and / or transient and constant expression. A polynucleotide is further provided. As used herein, "operably linked"
) "Means that the promoter is arranged in a manner that directs RNA transcription from the DNA molecule. Examples of such promoters are SP6, T
4 and T7. In some embodiments, a cell-specific promoter is used for cell-specific expression of the inserted polynucleotide. A promoter or promoter / enhancer, and a cloning site that has a stop codon and a selectable marker sequence, and may also be capable of operably linking the inserted DNA fragment to the promoter. Vectors are well known in the art and are commercially available. For general methodology and cloning strategies, see GENE EXPRESSION TECHN
OLOGY (Goeddel ed., Academic Press, Inc.
. (1991)) Reconsidered references cited in the above references, as well as VECTORS
: ESSENTIAL DATA SERIES (Gacesa and Ra
mji, eds. , John Wiley & Sons, N.W. Y. (1994
See)). They include queries for maps, functional properties, commercial suppliers and GenEMBL accession numbers for a variety of suitable vectors. Preferably, these vectors are capable of transcribing RNA in vitro or in vivo.
【0090】 APCの表面上のペプチドの提示を増加する方法 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを細胞へ形質導入することを含む、抗原
提示細胞の表面上にペプチドの提示を増強または増加するための方法を提供する
。本発明のポリペプチドは、加工され、抗原提示細胞(APC)上にMHCクラ
スI分子と共に提示される抗原、並びに、加工され、APC上にMHCクラスI
I分子と共に提示される抗原をコードするため、CD4+およびCD8+T細胞
へのペプチド抗原の提示の増加が観察される。Methods for Increasing the Presentation of Peptides on the Surface of APCs The present invention relates to methods for enhancing or increasing the presentation of peptides on the surface of antigen presenting cells, including transducing the polynucleotides of the invention into cells. To provide a way. The polypeptides of the present invention can be engineered and presented together with MHC class I molecules on antigen presenting cells (APCs), as well as the engineered MHC class I molecules on APCs.
Increased presentation of peptide antigens to CD4 + and CD8 + T cells is observed because they encode antigens presented with the I molecule.
【0091】 本発明は、本発明の方法により生産されるAPCをさらに提供する。これらの
APCは、MHCクラスIおよびクラスII分子の両方によりペプチド抗原の増
強された提示を示す。APC表面上に積まれるこれらの抗原の量は従来技術の方
法では達成されなかった。即ち、従来技術では、クラスIまたはクラスII提示
のどちらかのみを増強し、双方は増強しない。従って、これらの方法、およびそ
れにより生産されるAPCは従来技術に対して新規であり、そして非自明である
。The present invention further provides an APC produced by the method of the present invention. These APCs show enhanced presentation of peptide antigens by both MHC class I and class II molecules. The amount of these antigens loaded on the APC surface was not achieved with prior art methods. That is, in the prior art, only either class I or class II presentation is enhanced, but not both. Thus, these methods, and the APCs produced thereby, are novel and non-obvious to the prior art.
【0092】 APCの表面上へのペプチドの提示が増強されるまたは増加されるかどうかは
、発現(すなわち、転写および翻訳)に適する条件下において本発明のポリペプ
チドがその中へ形質導入されているAPCの表面上に提示されるコードされるペ
プチドに対するCD4+およびCD8+T細胞の反応と、ペプチドが対照APC
の表面上に発現されるときのペプチドに対するCD4+およびCD8+T細胞の
反応とを比較することにより決定されることも可能である。対照APCとは、す
なわち小胞体において保持を促進するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列、コードされる抗原を非エンドソーマルMHCクラスII経路の中へ指向する
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のどちらか、または両方を欠損する
ポリヌクレオチドによりコードされるペプチドが存在するAPCである。Whether the presentation of a peptide on the surface of an APC is enhanced or increased depends on the transduction of the polypeptide of the invention into it under conditions suitable for expression (ie, transcription and translation). Response of CD4 + and CD8 + T cells to the encoded peptide presented on the surface of the
Can also be determined by comparing the response of CD4 + and CD8 + T cells to the peptide when expressed on the surface of A control APC is either a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that promotes retention in the endoplasmic reticulum, a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that directs the encoded antigen into a non-endosomal MHC class II pathway, or both. Is an APC in which a peptide encoded by a polynucleotide lacking is present.
【0093】 本発明の方法。 T細胞の活性化を調べるための多様な方法が既知である。例えば、Gong
et al.(1997)Gene Therapy 4:1023−1028
、を参照すること。CD8+T細胞の活性化は、非限定的に、トリチウム化チミ
ジンの取り込み(DNA合成の指標)、および、例えばコロニーの同定により、
成長または増殖のための細胞集団の試験、を含むいかなる既知の方法により検出
されることも可能である。あるいは、テトラゾリウム塩MTT(3−(4,5−
ジメチル−タゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル臭化テトラゾリウム)を
加えてもよい。Mossman(1983)J.Immunol.Method
s 65:55−63;Niks and Otto(1990)J.Immu
nol.Methods 130:140−151。生菌のミトコンドリアにお
いて発見された、コハク酸脱水素酵素は、MTTをformazan青色に変換
する。よって、濃縮された青色は代謝的に活動的な細胞であることを示唆するだ
ろう。また別の他の態様において、放射能標識、例えばトリチウム化チミジン、
の取り込みを分析して、細胞の増殖の指標とすることも可能である。同様に、タ
ンパク質合成は35S−メチオニンの取り込みにより示されることも可能である。
古典的クロム遊離検定などの、細胞毒性および細胞死滅検定を使用して、エピト
ープ特異的CTL活性化を評価してもよい。CD4+T細胞の活性化を検出する ために、非限定的に、サイトカイン産生、および、例えば、トリチウム化チミジ
ンの取り込みによる、増殖の測定を含む多様ないかなる方法を使用するも可能で
ある。[0093] The method of the invention. Various methods for examining T cell activation are known. For example, Gong
et al. (1997) Gene Therapy 4: 1023-1028.
See, Activation of CD8 + T cells can be, but is not limited to, by incorporation of tritiated thymidine (an indicator of DNA synthesis) and, for example, by colony identification.
It can be detected by any known method, including examining a cell population for growth or proliferation. Alternatively, tetrazolium salt MTT (3- (4,5-
Dimethyl-tazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) may be added. Mossman (1983) J. Mol. Immunol. Method
s 65: 55-63; Niks and Otto (1990) J. Am. Immu
nol. Methods 130: 140-151. Succinate dehydrogenase, found in live mitochondria, converts MTT to formzan blue. Thus, the enriched blue color would suggest metabolically active cells. In yet another embodiment, a radiolabel, such as tritiated thymidine,
Can be analyzed as an indicator of cell proliferation. Similarly, protein synthesis can be indicated by incorporation of 35 S-methionine.
Epitope-specific CTL activation may be assessed using cytotoxicity and cell killing assays, such as the classic chromium release assay. Any of a variety of methods can be used to detect CD4 + T cell activation, including, but not limited to, measuring cytokine production and proliferation, eg, by incorporation of tritiated thymidine.
【0094】 本発明のポリヌクレオチドの産生 本発明の単離されたポリヌクレオチドを産生し、複製し、そして発現するため
のいかなる既知の方法が使用可能である。インビトロでおよびインビボで形質導
入のためのベクターおよび方法は、以下に簡単に記載されていて、および当該技
術分野において非常に既知である。外来性の核酸の取り込みおよび発現は、RT
−PCR、ノザンおよびサザンブロッティング分析、上述のSambrook
et al.(1989)の使用により確認されることも可能である。Production of the Polynucleotides of the Invention Any known method for producing, replicating and expressing the isolated polynucleotides of the present invention can be used. Vectors and methods for transduction in vitro and in vivo are described briefly below and are very well known in the art. Incorporation and expression of exogenous nucleic acids is performed at RT
-PCR, Northern and Southern blotting analysis, Sambrook as described above.
et al. (1989).
【0095】 本発明のポリヌクレオチドは、PCRを用いて複製されることが可能である。
PCR技術は、米国特許第4,683,195号、4,800,159号、4,
754,065号、および4,683,202号の主題であり、そしてPCR:
The POLYMERASE CHAIN REACTION(Mullis
et al.eds,Birkhauser Press,Boston(1
994))並びに、当該文献で引用されている参考文献に記載されている。[0095] The polynucleotides of the present invention can be replicated using PCR.
PCR technology is disclosed in U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,800,159,
754,065, and 4,683,202, and PCR:
The POLYMERASE CHAIN REACTION (Mullis
et al. eds, Birkhauser Press, Boston (1
994)) and references cited in the literature.
【0096】 あるいは、当業者はDNAを複製するために、本明細書中で提供される配列お
よびDNAを複製するための商業的なDNA合成機を使用することも可能である
。従って、本発明はまた、ポリヌクレオチドの直鎖状の配列、適切なプライマー
分子、酵素等の化学薬品、および複製のための指示を提供し、そしてポリヌクレ
オチドを獲得するための適当な配向においてヌクレオチドを化学的複製または連
結することによる、本発明のポリヌクレオチドを得るするための方法も提供する
。別個の態様において、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。さらに
また、当業者は適する複製ベクターの中へポリヌクレオチドを挿入し、そして複
製および増幅のための適する宿主細胞(原核生物または真核生物)の中へ当該ベ
クターを挿入することも可能である。このように増幅されたDNAは、当業者に
周知の方法により細胞から単離されることが可能である。この方法によるポリヌ
クレオチドを得るための方法、及びこのように得られたポリヌクレオチドは本明
細書中にさらに提供される。Alternatively, one skilled in the art can use a sequence provided herein and a commercial DNA synthesizer to replicate DNA to replicate DNA. Thus, the present invention also provides linear sequences of polynucleotides, appropriate primer molecules, chemicals such as enzymes, and instructions for replication, and nucleotides in the proper orientation to obtain the polynucleotide. Also provided are methods for obtaining the polynucleotides of the present invention by chemically replicating or linking In a separate embodiment, these polynucleotides are further isolated. Furthermore, one of skill in the art can insert the polynucleotide into a suitable replicating vector and insert the vector into a suitable host cell (prokaryotic or eukaryotic) for replication and amplification. The DNA thus amplified can be isolated from cells by methods well known to those skilled in the art. A method for obtaining a polynucleotide according to this method, and the polynucleotide so obtained, are further provided herein.
【0097】 RNAは適する宿主細胞の中へDNAポリヌクレオチドを最初に挿入すること
により獲得されることも可能である。DNAは、例えば適切な遺伝子運搬用ビヒ
クル(例えば、リポソーム、プラスミドまたはベクター)の使用によるまたは電
気穿孔法によるいかなる適切な方法により挿入されることも可能である。細胞が
複製し、そしてDNAがRNAへ転写されるとき;RNAは次いで、例えば上述
のSambrook et al.(1989)において記載されているとおり
、当業者に周知の方法を使用することにより単離されることも可能である。例え
ば、mRNAは、種々の溶菌酵素または化学溶液を使用して、上述のSambr
ook et al.(1989)において記載されている手順に従って単離す
ることができ、あるいは、製造者により提供される指示に従って、核酸結合樹脂
を用いて抽出することも可能である。[0097] RNA can also be obtained by first inserting a DNA polynucleotide into a suitable host cell. DNA can be inserted by any suitable method, for example, by using a suitable gene delivery vehicle (eg, liposomes, plasmids or vectors) or by electroporation. When the cell replicates and the DNA is transcribed into RNA; the RNA is then, for example, described in Sambrook et al. (1989), it can also be isolated by using methods well known to those skilled in the art. For example, mRNA can be prepared using various lytic enzymes or chemical solutions, as described above in Sambr.
OK et al. (1989), or can be extracted using a nucleic acid binding resin according to the instructions provided by the manufacturer.
【0098】 本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子運搬媒用ビヒクル 本発明は、(インビボで、エクスビボで、またはインビトロでのいずれかで)
細胞の中へ本発明のポリヌクレオチドの運搬のために適する運搬用ビヒクルもま
た提供する。本発明のポリヌクレオチドはクローニングまたは発現ベクターの中
へ含まれることも可能である。次いで、これらのベクター(特に発現ベクター)
は、例えば、細胞へ運搬および/または細胞の中へ侵入することを促進しうるい
かなる多数の形態をとるために操作されうる。Vehicles for Gene Carriers Comprising the Polynucleotides of the Invention The present invention provides (in vivo, ex vivo or in vitro)
A delivery vehicle suitable for delivery of a polynucleotide of the invention into a cell is also provided. A polynucleotide of the invention can be included in a cloning or expression vector. Then, these vectors (especially expression vectors)
Can be manipulated to take any of a number of forms that can facilitate, for example, transport into and / or entry into cells.
【0099】 これらの核酸を含む発現ベクターはタンパク質およびポリペプチドを生産する
ための宿主ベクター系を得るのに有用である。これらの発現ベクターはエピソー
ムとしてまたは染色体DNAの完全な一部分としてのどちらかで宿主生物体にお
いて複製可能でなければならないということを意味する。適する発現ベクターは
プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含むウイ
ルスベクター、コスミド、等を含む。アデノウイルスベクターは、インビトロで
およびインビボでの両方での多量の発現および効率的な細胞の形質転換のため、
インビボで組織への遺伝子の形質導入に特に有用である。核酸が、適する宿主細
胞、例えば原核生物または真核生物細胞、の中へ挿入される、および宿主細胞が
複製するとき、タンパク質が組換え的に産生されうる。適する宿主細胞はベクタ
ーに依存し、および周知の方法を使用して構築される哺乳細胞、動物細胞、ヒト
細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含みうる。上述のSa
mbrook et al.(1989)を参照すること。細胞の中へ外来性核
酸の挿入のためのウイルスベクターの使用に加えて、核酸は、細菌細胞の形質転
換;哺乳類細胞のリン酸カルシウム沈殿;またはDEAE−デキストラン;電気
穿孔法;または微量注入を使用する形質導入、などの当該技術分野において周知
の方法により宿主細胞へ挿入されることも可能である。この方法論のための上述
のSambrook et al.(1989)を参照すること。よって、本発
明は、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチド
を含む宿主細胞、例えば哺乳類細胞、動物細胞(ラットあるいはマウス)、ヒト
細胞、または細菌細胞などの原核細胞、もまた提供する。[0099] Expression vectors containing these nucleic acids are useful for obtaining host vector systems for producing proteins and polypeptides. These expression vectors mean that they must be capable of replicating in the host organism either as episomes or as a complete piece of chromosomal DNA. Suitable expression vectors include plasmids, adenoviruses, adeno-associated viruses, viral vectors including retroviruses, cosmids, and the like. Adenovirus vectors are used for high-level expression and efficient cell transformation both in vitro and in vivo.
It is particularly useful for transducing a gene into a tissue in vivo. When the nucleic acid is inserted into a suitable host cell, such as a prokaryotic or eukaryotic cell, and the host cell replicates, the protein can be produced recombinantly. Suitable host cells depend on the vector and may include mammalian, animal, human, monkey, insect, yeast, and bacterial cells constructed using well-known methods. Sa described above
mbrook et al. (1989). In addition to using viral vectors for the insertion of foreign nucleic acids into cells, nucleic acids may be used to transform bacterial cells; calcium phosphate precipitation of mammalian cells; or DEAE-dextran; electroporation; or microinjection. It can also be inserted into host cells by methods well known in the art, such as transduction. See Sambrook et al., Supra, for this methodology. (1989). Thus, the invention also provides a host cell, eg, a prokaryotic cell, such as a mammalian cell, an animal cell (rat or mouse), a human cell, or a bacterial cell, comprising a polynucleotide encoding a protein or polypeptide or an antibody.
【0100】 ベクターがインビボまたはエクスビボで遺伝子療法のために使用されるとき、
複製不能なレトロウイルスまたはアデノウイルスなどの、薬学的に受け入れられ
るベクターが好まれる。本発明の核酸を含む薬学的に受け入れられるベクターは
、挿入されるポリヌクレオチドの一時的なまたは定常的な発現のためのさらに修
飾されることも可能である。本明細書中で使用されているが、”薬学的に許容可
能なベクター”という用語は、限られてはいないが、選択的に標的し、そして分
裂細胞の中へ核酸を導入する能力を有するベクターまたは運搬ヒビクルを含む。
そのようなベクターの例は、感染される宿主細胞においてベクターの蔓延を妨げ
る、ウイルスの蛋白質を産生するその能力の欠如により定義される”複製不能性
”ベクターである。複製不能性レトロウイルスベクターの例はLNL6である。
Miller et al.(1989)BioTechniques 7:9
80−990。遺伝子マーカーのレトロウイルス関連遺伝子移転のための複製不
能性レトロウイルスの使用の方法論は非常に確立されている。Correll
et al.(1989)PNAS USA 86:8912;Bordign
on(1989)PNAS USA 86:8912−52;Culver(1
991)PNAS USA 88:3155;およびRill(1991)Bl
ood 79(10):2694−700。When the vector is used for gene therapy in vivo or ex vivo,
Pharmaceutically acceptable vectors, such as non-replicable retroviruses or adenoviruses, are preferred. Pharmaceutically acceptable vectors containing the nucleic acids of the invention can be further modified for transient or constant expression of the inserted polynucleotide. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable vector" is capable of, but not limited to, selectively targeting and having the ability to introduce nucleic acids into dividing cells. Includes vector or transport vehicle.
An example of such a vector is a "non-replicable" vector, defined by its lack of ability to produce viral proteins that prevents the spread of the vector in infected host cells. An example of a non-replicable retroviral vector is LNL6.
Miller et al. (1989) BioTechniques 7: 9.
80-990. The methodology of using non-replicable retroviruses for retrovirus-related gene transfer of genetic markers is very well established. Correl
et al. (1989) PNAS USA 86: 8912; Bordign.
on (1989) PNAS USA 86: 8912-52; Culver (1
991) PNAS USA 88: 3155; and Rill (1991) Bl.
wood 79 (10): 2694-700.
【0101】 一般的に、本発明において使用される細胞の遺伝的修飾は、本発明の合成抗原
ペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む導入するベクターによ
り達成される。ウイルス系及び非ウイルス系を含む多様な異なる遺伝子転移ベク
ターが使用されうる。In general, the genetic modification of the cells used in the present invention is achieved by an introducing vector comprising a polynucleotide comprising a sequence encoding a synthetic antigenic peptide of the present invention. A variety of different gene transfer vectors can be used, including viral and non-viral systems.
【0102】 本発明のポリヌクレオチドの運搬のための広く多様な非ウイルスビヒクルは、
当該技術分野において既知であり、および本発明において含まれる。あるいは、
本発明のポリヌクレオチドはむき出しのDNAとして細胞へ運搬されることも可
能である。WO97/40163。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、非
限定的に、カチオン性脂質;天然のポリマーおよび合成ポリマーを含む、生適合
性のポリマー;リポ蛋白質;ポリペプチド;多糖類;リポ多糖類;人工ウイルス
エンベロープ;金属粒子;および細菌を含む、多様な基質(運搬の形態)を用い
る多様な方法において関連する細胞へ運搬されうる。運搬ビヒクルは微粒子の形
態をとってもよい。これらの多様な基質の混合物または結合物もまた、運搬ビヒ
クルとして使用されうる。本発明のポリヌクレオチドは、これらの多様な運搬の
形態と非共有的または共有的に結合されていてもよい。A wide variety of non-viral vehicles for delivery of a polynucleotide of the invention include:
It is known in the art and is included in the present invention. Or,
The polynucleotide of the present invention can be delivered to cells as bare DNA. WO 97/40163. Alternatively, the polynucleotides of the present invention include, but are not limited to, cationic lipids; biocompatible polymers, including natural and synthetic polymers; lipoproteins; polypeptides; polysaccharides; lipopolysaccharides; It can be delivered to relevant cells in a variety of ways using a variety of substrates (forms of delivery), including metal particles; and bacteria. The delivery vehicle may take the form of particulates. Mixtures or conjugates of these various substrates can also be used as delivery vehicles. The polynucleotides of the present invention may be non-covalently or covalently associated with these various modes of delivery.
【0103】 非ウイルスベクターのカテゴリーにおいて含まれるものは、原核生物プラスミ
ドおよび真核生物プラスミドである。本発明のポリヌクレオチドがクローン化さ
れている非ウイルスベクター(すなわち、クローニングおよび発現ベクター)は
、本発明のポリヌクレオチドの源と同様に、組み換えポリペプチドの発現のため
に使用されうる。クローニングベクターは、それらが含むポリヌクレオチドの複
製コピーを得るため、または将来の回収のための保管所にポリヌクレオチドを蓄
える手段として、使用されることも可能である。発現ベクター(およびこれらの
発現ベクターを含む宿主細胞)はそれらが含むポリヌクレオチドから生産される
ポリペプチドを得るために使用されうる。それらは、例えば、発現ベクターにお
いてコードされるポリペプチドにより免疫反応を引き出すために、機能可能なよ
うに連結されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを個体におい
て発現することが好ましい場合にも、使用されうる。適するクローニングおよび
発現ベクターは、たとえば細菌、哺乳類、酵母および昆虫の発現系において使用
されるベクターのように、当該技術分野においていかなる既知のものを含む。具
体的なベクターおよび適する宿主細胞は当該技術分野において既知であり、よっ
て本明細書中において詳細に記載される必要はない。たとえば、Gacesa
and Ramji,Vectors,John Wiley&Sons(19
94)を参照。[0103] Included in the category of non-viral vectors are prokaryotic and eukaryotic plasmids. Non-viral vectors in which the polynucleotides of the present invention have been cloned (ie, cloning and expression vectors) can be used for expression of recombinant polypeptides, as well as sources of the polynucleotides of the present invention. Cloning vectors can also be used to obtain duplicate copies of the polynucleotides they contain, or as a means of storing the polynucleotides in a repository for future recovery. Expression vectors (and host cells containing these expression vectors) can be used to obtain polypeptides produced from the polynucleotides they contain. They may also be used when it is preferable to express the polypeptide encoded by the operably linked polynucleotide in an individual, for example, to elicit an immune response with the polypeptide encoded in the expression vector. Can be done. Suitable cloning and expression vectors include any known in the art, for example, vectors used in bacterial, mammalian, yeast, and insect expression systems. Specific vectors and suitable host cells are known in the art, and thus need not be described in detail herein. For example, Gacesa
and Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (19
94).
【0104】 クローニングおよび発現ベクターは典型的には、選択マーカー(例えば、ベク
ターが形質転換されている宿主細胞の生存または成長のために必要な蛋白質をコ
ードしている遺伝子)を含むが、もっともそのようなマーカー遺伝子は宿主細胞
の中へ共に導入される別個のポリヌクレオチド配列において行ってもよい。選択
遺伝子がその中へ形質導入されているそれらの宿主細胞だけが選択条件下におい
て生存および/または成長するであろう。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物
質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセー
ト等、に耐性を与える;(b)栄養要求性を相補する;または(c)混合培地か
ら利用できない重要な栄養を供給する、蛋白質をコードする。適当なマーカー遺
伝子の選択は宿主細胞に依存するだろう。そして、異なる宿主のための適切な遺
伝子は当該技術分野において既知である。クローニングおよび発現ベクターは宿
主により認識される複製系もまた典型的に含む。[0104] Cloning and expression vectors typically include a selectable marker, such as a gene encoding a protein necessary for the survival or growth of the host cell into which the vector is transformed, but not the most Such a marker gene may be performed in a separate polynucleotide sequence, which is introduced together into the host cell. Only those host cells into which the selection gene has been transduced will survive and / or grow under the selection conditions. Typical selection genes provide (a) resistance to antibiotics or other toxic substances such as ampicillin, neomycin, methotrexate, etc .; (b) complement auxotrophy; or (c) use from mixed media. Encoding protein, providing vital nutrients that cannot. Selection of the appropriate marker gene will depend on the host cell. And suitable genes for different hosts are known in the art. Cloning and expression vectors also typically include a replication system that is recognized by the host.
【0105】 適するクローニングベクターは標準技術に従って構成することができ、当該技
術分野において利用できる大多数のクローニングベクターから選択してもよい。
選択されるクローニングベクターは使用される予定の宿主細胞に従って変化する
であろう一方、有用なクローニングベクターは一般的に自己複製有能性を有する
であろうし、一つの個有の制限酵素の一つの標的を所有してもよく、および/ま
たはベクターを含む選択するクローンにおいて使用されうるマーカー遺伝子を運
搬していてもよい。適する例は、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、pU
C18、pUC19、Bluescript(例えば、pBS SK+)および
その誘導体、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pC
R1、RP4、ファージDNA、およびpSA3およびpAT28などのシャト
ルベクター、を含む。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、Bi
oRad、Strategene、およびInvitrogen等の商社から入
手可能である。[0105] Suitable cloning vectors can be constructed according to standard techniques, and may be selected from the majority of cloning vectors available in the art.
While the cloning vector chosen will vary according to the host cell to be used, useful cloning vectors will generally have the capacity for self-renewal and will have one of the unique restriction enzymes It may possess the target and / or may carry a marker gene that can be used in the clone of choice containing the vector. Suitable examples are plasmids and bacterial viruses such as pU
C18, pUC19, Bluescript (eg, pBS SK +) and its derivatives, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pC
R1, RP4, phage DNA, and shuttle vectors such as pSA3 and pAT28. These and many other cloning vectors are Bi
Available from trading companies such as oRad, Strategene, and Invitrogen.
【0106】 発現ベクターは一般的に、所期のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む複製可能なポリヌクレオチド構築物を含む。関心のあるポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサーおよびターミネイタ
ー等の、適する転写制御因子に実施可能的に連結されている。発現(すなわち、
翻訳)のため、一つまたはそれ以上の、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、お
よび終止コドン等の、翻訳制御因子もまた通常必要である。機能可能なように連
結されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、細胞膜において
横切るおよび/または留まるために、あるいは、細胞から分泌されることを可能
とするために、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列もまた含ま
れていても良い。酵母、鳥類、および哺乳類細胞を含む真核細胞において発現の
ために適する多数の発現ベクターが当該技術分野において既知である。哺乳類発
現ベクターの例は、細菌においてベクターの増殖を促進するための原核生物の配
列、および真核生物細胞において発現される一つまたはそれ以上の真核生物の転
写単位の両方を含む。真核生物細胞の形質移入のために適する哺乳類発現ベクタ
ーの例は、pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、p
SV2gpt、pSV2neo、pRSVneo、およびpHyg由来のベクタ
ーを含む。あるいは、ウシの乳頭腫ウイルス(BPV−1)またはEpstei
n−Barrウイルス(pHEB、pREP由来のベクター)等のウイルス誘導
体は、哺乳類細胞において発現のために使用されうる。酵母系のための発現ベク
ターの例は、それらはS.cerevisiaeの中へ構築体を形質導入するた
めの有用なクローニングおよび発現ベクターである、YEP24、YIP5、Y
EP51、YEP52、YES2およびYRP17、を含む。Broach e
t al.(1983)Experimental Manipulation
of Gene Expression,ed.M.Inouye,Acad
emic Press,p.83。昆虫細胞における発現のためのバキュロウイ
ルス発現ベクターは、(pVL1392、pVL1393およびpVL941等
の)pVL由来ベクター、pAcUW由来ベクターおよびpBlueBac由来
ベクターを含む。[0106] Expression vectors generally include a replicable polynucleotide construct that includes a polynucleotide that encodes the desired polypeptide. A polynucleotide encoding a polypeptide of interest is operably linked to a suitable transcriptional regulator, such as a promoter, enhancer, and terminator. Expression (ie,
For translation), one or more translational regulators, such as a ribosome binding site, a translation initiation site, and a stop codon, are also usually required. A polynucleotide encoding a signal peptide to allow the polypeptide encoded by the operably linked polynucleotide to cross and / or remain at the cell membrane or to be secreted from the cell An array may also be included. Numerous expression vectors suitable for expression in eukaryotic cells, including yeast, bird, and mammalian cells, are known in the art. Examples of mammalian expression vectors include both prokaryotic sequences for promoting the growth of the vector in bacteria, and one or more eukaryotic transcription units that are expressed in eukaryotic cells. Examples of suitable mammalian expression vectors for transfection of eukaryotic cells include pcDNAI / amp, pcDNAI / neo, pRc / CMV, p
Includes vectors derived from SV2gpt, pSV2neo, pRSVneo, and pHyg. Alternatively, bovine papillomavirus (BPV-1) or Epstei
Viral derivatives such as the n-Barr virus (pHEB, a vector derived from pREP) can be used for expression in mammalian cells. Examples of expression vectors for the yeast system are YEP24, YIP5, Y. Useful cloning and expression vectors for transducing the construct into S. cerevisiae.
EP51, YEP52, YES2 and YRP17. Broach
t al. (1983) Experimental Manipulation
of Gene Expression, ed. M. Inouye, Acad
emic Press, p. 83. Baculovirus expression vectors for expression in insect cells include pVL-derived vectors (such as pVL1392, pVL1393 and pVL941), pAcUW-derived vectors and pBlueBac-derived vectors.
【0107】 ウイルスベクターは、非限定的に、アデノ関連ウイルスを含む、アデノウイル
ス、単純疱疹ウイルス、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス、およびパル
ボウイルスに基づくウイルス等のDNAウイルスベクター;および、非限定的に
、レトロウイルスベクターを含む、RNAウイルスベクターを含む。レトロウイ
ルスベクターは、マウス白血病ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス等のレン
チウイルスを含む。Naldini et al.(1996)Science 272:263−267。[0107] Viral vectors include, but are not limited to, DNA virus vectors, such as adenoviruses, including herpes simplex virus, poxviruses such as vaccinia virus, and viruses based on parvovirus, including adeno-associated viruses; , RNA virus vectors, including retrovirus vectors. Retroviral vectors include mouse leukemia virus and lentivirus such as human immunodeficiency virus. Naldini et al. (1996) Science 272: 263-267.
【0108】 レトロウイルスゲノムの一部分として本発明のポリヌクレオチドを宿する複製
欠陥レトロウイルスベクターを使用することも可能である。そのようなベクター
は詳細に記載されている。(Miller et al.(1990)Mol.
Cell Biol.10:4239;Kolberg,R.(1992)J.
NIH Res.4:43;Cornetta et al.(1991)Hu
m.Gene Ther 2:215)。It is also possible to use a replication defective retroviral vector harboring a polynucleotide of the invention as part of the retroviral genome. Such vectors have been described in detail. (Miller et al. (1990) Mol.
Cell Biol. 10: 4239; Kolberg, R .; (1992) J.I.
NIH Res. 4:43; Cornetta et al. (1991) Hu
m. Gene Ther 2: 215).
【0109】 本発明の遺伝修飾において有用なアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベ
クターは既に当該技術分野において教示されている方法に従って産生されること
も可能である。(例えば、Karlsson et al.(1986)EMB
O 5:2377;Carter(1992)Current Opinion
in Biotechnology 3:533−539;Muzcyzka
(1992)Current Top.Microbiol.Immunol.
158;97−129;GENE TARGETING:A PRATICAL
APPROACH(1992)ed.A.L.Joyner,Oxford
University Press,NYを参照すること)。いくつかの異なる
方法が可能である。Adenovirus and adeno-associated virus vectors useful in the genetic modification of the present invention can also be produced according to methods already taught in the art. (See, eg, Karlsson et al. (1986) EMB.
O 5: 2377; Carter (1992) Current Opinion.
in Biotechnology 3: 533-539; Muzcyzka
(1992) Current Top. Microbiol. Immunol.
158; 97-129; GENE TARGETING: A PRATICAL
APPROACH (1992) ed. A. L. Joiner, Oxford
See University Press, NY). Several different methods are possible.
【0110】 本発明の方法において使用されうるウイルスベクターを記載しているさらなる
参考文献は以下を含む:Horwitz,M.S.,Adenoviridae
and Their Replication,in Fields,B.,
et al.(eds.)VIROLOGY,Vol.2,Raven Pre
ss New York,pp.1679−1721,1990);Graha
rn,F. et al.,pp.109−128 in METHODS I
N MOLECULAR BIOLOGY,Vol.7:GENE TRANS
FER AND EXPRESSION PROTOCOLS,Murray,
E.(ed.),Humana Press,Clifton,N.J.(19
91);Miller et al.(1995)FASEB Journal
9:190−199,Schreier(1994)Pharmaceuti
ca Acta Helvetiae 68:145−159;Schneid
er and French(1993)Circulation 88:19
37−1942;Curiel et al.(1992)Human Gen
e Therapy 3:147−154;Graham et al.,WO 95/00655(5 January 1995);Falck−Pede
rsen WO 95/16722(22 June 1995);Denef
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5);Haddada et al.WO94/26914(24 Novem
ber 1994);Perricaudet et al.WO 95/02
697(26 January 1995);Zhang et al.WO
95/25071(12 October 1995)。Further references describing viral vectors that can be used in the methods of the invention include: Horwitz, M .; S. , Adenoviridae
and Their Replication, in Fields, B.A. ,
et al. (Eds.) VIROLOGY, Vol. 2, Raven Pre
ss New York, pp. 1679-1721, 1990); Graha
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5); Haddada et al. WO94 / 26914 (24 Novem
ber 1994); Perricaudet et al. WO 95/02
697 (26 January 1995); Zhang et al. WO
95/25071 (12 October 1995).
【0111】 DCまたは他のAPCの形質導入効率は、発現されている腫瘍抗原の特異的な
蛍光抗体を使用する免疫蛍光法により評価してもよい(Kim et al.(
1997)J.Immunother.20:276−286)。あるいは、抗
体は、基質との反応で発色する産物を生じる酵素(例えばHRP)に結合されう
る。APCにより発現されている抗原ポリペプチドの現実の量はELISAによ
り評価してもよい。The transduction efficiency of DC or other APCs may be evaluated by immunofluorescence using fluorescent antibodies specific for the tumor antigen being expressed (Kim et al.
1997) J. Amer. Immunother. 20: 276-286). Alternatively, the antibody can be conjugated to an enzyme (eg, HRP) that produces a colored product upon reaction with a substrate. The actual amount of antigenic polypeptide expressed by APC may be assessed by ELISA.
【0112】 DC、または他のAPCのインビボでの形質導入は、静脈内、筋肉内、鼻腔内
、腹腔内、皮膚の(cutaneous)運搬を含む異なる経路を媒介して本発
明のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与することにより達成されう
る。使用されることも可能である一つの方法は、約1×1010−1×1012i.
u.(免疫単位)の総量を使用した多サイトでのAdベクターの皮膚の運搬であ
る。インビボでの形質導入のレベルは、発現されているAPCマーカーおよびペ
プチドエピトープに対する抗体での共染色により大まかに評価することができる
。染色法は、投与の部分からの生検試料、あるいは流入領域リンパ節由来あるい
はAPC(特にDCにおいて)が転移している可能性のある他の器官由来の細胞
、上で行ってよい。Condon et al.(1996)Nature M
ed.2:1122−1128;Wan et al.(1997)Human
Gene Therapy 8:1355−1363。投与の部位、あるいは
、形質導入されたAPCが転移している可能性のある他の器官において発現され
ている抗原の量は、組織ホモジネート上のELISAにより評価してもよい。In vivo transduction of DCs, or other APCs, involves polynucleotides of the invention via different pathways, including intravenous, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, cutaneous delivery. This can be achieved by administering a viral vector. One method that could be used is about 1 × 10 10 -1 × 10 12 i.
u. Multi-site Ad vector skin delivery using the total amount of (immune units). The level of transduction in vivo can be roughly assessed by co-staining with antibodies to the expressed APC marker and peptide epitope. Staining may be performed on biopsy samples from the site of administration, or on cells from draining lymph nodes or other organs into which APCs (especially in DCs) may have metastasized. Condon et al. (1996) Nature M
ed. 2: 1122-1128; Wan et al. (1997) Human
Gene Therapy 8: 1355-1363. The amount of antigen expressed at the site of administration or other organs into which transduced APCs may have metastasized may be assessed by ELISA on tissue homogenates.
【0113】 APCはまた、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿またはカチオン性脂質/プ
ラスミドDNA混合物などの非ウイルス遺伝子運搬法によりインビトロ/エクス
ビボにおいて形質導入してもよい。Arthur et al.(1997)C
ancer Gene Therapy 4:17−25。形質導入されたAP
Cは、次いで静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内経路の運搬より宿主細
胞へ、投与してよい。APCs may also be transduced in vitro / ex vivo by non-viral gene delivery methods such as electroporation, calcium phosphate precipitation or cationic lipid / plasmid DNA mixtures. Arthur et al. (1997) C
ancer Gene Therapy 4: 17-25. Transduced AP
C may then be administered to host cells by delivery via the intravenous, subcutaneous, intranasal, intramuscular or intraperitoneal route.
【0114】 DC、または他のAPCのインビボでの形質導入は、静脈内、筋肉内、鼻腔内
、腹腔内、皮膚の投与を経由して運搬されるカチオン性脂質/プラスミドDNA
混合体の投与により潜在的に達成されることも可能である。むき出しのプラスミ
ドDNAの皮膚への遺伝子銃運搬または注入もまた、DCの形質導入を導く。C
ondon et al.(1996)Nature Med.2:1122−
1128;Raz et al.(1994)PNAS 91:9519−95
23。プラスミドDNAの筋肉内運搬もまた免疫化のために使用しうる。Ros
ato et al.(1997)Human Gene Thrapy 8:
1451−1458。In vivo transduction of DC, or other APCs, is performed by intravenous, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, transdermal administration of cationic lipid / plasmid DNA.
It can also potentially be achieved by administration of the mixture. Gene gun delivery or injection of bare plasmid DNA into the skin also leads to DC transduction. C
ondon et al. (1996) Nature Med. 2: 1122-
1128; Raz et al. (1994) PNAS 91: 9519-95.
23. Intramuscular delivery of plasmid DNA may also be used for immunization. Ros
ato et al. (1997) Human Gene Trapy 8:
1451-1458.
【0115】 導入遺伝子発現の形質導入効率およびレベルは上記に記載されるウイルスベク
ターの方法と同様に評価しうる。 本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発
明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、ポリヌクレオチドの組換え複製および
本発明のペプチドの組換え産生に有用である。加えて、本発明のポリヌクレオチ
ドを含む宿主細胞は、本明細書中に記載されている方法において、対象において
免疫反応を誘導するために使用されることも可能である。The transduction efficiency and level of transgene expression can be evaluated in a manner similar to the viral vector method described above. Host cells containing the polynucleotide of the present invention The present invention further provides host cells containing the polynucleotide of the present invention. Host cells containing a polynucleotide of the present invention are useful for recombinant replication of the polynucleotide and for recombinant production of a peptide of the present invention. In addition, host cells containing the polynucleotides of the invention can be used to induce an immune response in a subject in the methods described herein.
【0116】 本発明のポリヌクレオチドの組換え複製、および本発明のペプチドの組換え生
産に適する宿主細胞は、原核生物または真核生物でよい。宿主系は当該技術分野
において既知であり、および本明細書中で詳細に記載される必要はない。宿主原
核生物は細菌細胞、例えばE.coli、B.subtilis、およびミコバ
クテリアを含む。宿主真核生物の中には、酵母、昆虫、鳥類、植物、C.elg
ans(または線虫)および哺乳類細胞がある。これらの細胞は、プロモーター
を誘導すること、形質転換体を選択すること、または要求される配列をコードす
る遺伝子を増幅することに適するように修飾され、慣用された栄養培地において
培養される。[0116] Suitable host cells for the recombinant replication of the polynucleotides of the invention and for the recombinant production of the peptides of the invention may be prokaryotic or eukaryotic. Host systems are known in the art and need not be described in detail herein. Host prokaryotes are bacterial cells, such as E. coli. coli, B.E. subtilis, and mycobacteria. Among host eukaryotes are yeast, insects, birds, plants, C. elg
ans (or nematodes) and mammalian cells. These cells are modified as appropriate for inducing a promoter, selecting a transformant, or amplifying a gene encoding a required sequence, and cultured in a conventional nutrient medium.
【0117】 宿主細胞が抗原提示細胞であるとき、宿主細胞は、腫瘍浸潤リンパ球などの免
疫効果細胞の集団を拡大するために使用することができ、そして免疫効果細胞は
養子免疫治療において有用である。抗原提示細胞は以下に、より詳細に記載され
ている。When the host cell is an antigen presenting cell, the host cell can be used to expand a population of immune effector cells, such as tumor infiltrating lymphocytes, and the immune effector cells are useful in adoptive immunotherapy. is there. Antigen presenting cells are described in more detail below.
【0118】 いくつかのこれらの態様において、単離される宿主細胞はAPCである。AP
Cは、非限定的に、樹状細胞(DC)、単球/マクロファージ、Bリンパ球また
は必要なMHC/共刺激性分子を発現する他の細胞型、を含む。[0118] In some of these embodiments, the isolated host cell is an APC. AP
C includes, but is not limited to, dendritic cells (DC), monocytes / macrophages, B lymphocytes or other cell types that express the required MHC / costimulatory molecules.
【0119】 いくつかの態様において、免疫効果細胞および/またはAPCは遺伝学的に修
飾されている。標準的な遺伝子転移を使用して、共刺激性分子および/または刺
激性サイトカインをコードする遺伝子を、免疫効果細胞の拡大の前に、同時に、
または後に挿入することも可能である。[0119] In some embodiments, the immune effector cells and / or APC are genetically modified. Using standard gene transfer, genes encoding costimulatory molecules and / or stimulatory cytokines can be simultaneously, prior to expansion of the immune effector cells,
Alternatively, it can be inserted later.
【0120】 ある態様において、サイトカインおよび/または共刺激性分子をコードする遺
伝子を含む宿主細胞は、非限定的に、パルス処理された樹状細胞、樹状細胞ハイ
ブリドまたは抗原提示フォスター細胞を含む樹状細胞などの専門的な抗原提示細
胞である。In certain embodiments, the host cell comprising a gene encoding a cytokine and / or costimulatory molecule includes, but is not limited to, a pulsed dendritic cell, a dendritic cell hybrid or a tree comprising an antigen presenting Foster cell. Specialized antigen presenting cells such as dendritic cells.
【0121】 抗原提示細胞 本発明において使用のための適するAPCは、MHC分子などの抗原提示分子
と会合してT細胞へ、外来性ペプチドまたは蛋白質、または内因性抗原を提示す
ることが可能である。APCは、非限定的に、マクロファージ、樹状細胞、CD
40活性化B細胞、抗原特異的B細胞、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、および遺
伝的に修飾された細胞を含む。Antigen Presenting Cells Suitable APCs for use in the present invention are capable of presenting a foreign peptide or protein, or endogenous antigen to T cells in association with an antigen presenting molecule such as an MHC molecule. . APC includes, but is not limited to, macrophages, dendritic cells, CD
Includes 40 activated B cells, antigen-specific B cells, tumor cells, virus infected cells, and genetically modified cells.
【0122】 APCは、非限定的に、末梢血単核細胞(PBMC)、混合された集合を含む
全血またはその画分、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球搬出法に
よって得られた細胞、リンパ節、例えば腫瘍から排出されるリンパ節、を含む、
多様な源から獲得されうる。適する供与体は、免疫化された供与体、免疫化され
ていない(天然の)供与体、処理済または未処理の供与体を含む。”処理された
”供与体は、一つまたはそれ以上の生物学的変性剤(modifier)にさら
されたものである。”未処理の”供与体は、一つまたはそれ以上の生物学的変性
剤にさらされていない。APCもまた一つまたはそれ以上の生物学的変性剤にイ
ンビトロで処理されていてもよい。APC can be obtained by, but not limited to, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), whole blood or a fraction thereof including mixed populations, spleen cells, bone marrow cells, tumor infiltrating lymphocytes, leukocyte export. Cells, lymph nodes, e.g., lymph nodes drained from a tumor,
Can be obtained from a variety of sources. Suitable donors include immunized donors, non-immunized (natural) donors, treated or untreated donors. A "treated" donor is one that has been exposed to one or more biological modifiers. A "raw" donor has not been exposed to one or more biological denaturants. APC may also have been treated in vitro with one or more biological denaturants.
【0123】 APCは一般には生存しているが、照射されたり、マイトマイシンC処理され
たり、弱毒化されたり、または化学的に固定されたりしてもよい。さらに、AP
Cは細胞全体である必要はない。その代わりとして、APCの小胞調製物が使用
されてもよい。APCs are generally viable, but may be irradiated, treated with mitomycin C, attenuated, or chemically fixed. In addition, AP
C need not be the whole cell. Alternatively, a vesicle preparation of APC may be used.
【0124】 APCは遺伝的に修飾される、すなわち、通常は、発現されていないか、また
は通常は、少量でしか発現していないポリペプチドまたはRNA分子を発現する
ような組換えポリヌクレオチド構築体を用いてトランスフェクトされていてもよ
い。ポリヌクレオチドの例は、非限定的に、MHC分子;B7等の共刺激分子;
および本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
む。The APC is genetically modified, ie, a recombinant polynucleotide construct that expresses a polypeptide or RNA molecule that is not normally expressed or is usually only expressed in small amounts. May be transfected. Examples of polynucleotides include, but are not limited to, an MHC molecule; a costimulatory molecule such as B7;
And polynucleotides encoding the peptides or polypeptides of the invention.
【0125】 通常は哺乳類においてインビボでAPCとして機能しない細胞は、APCとし
て機能するような様式において修飾されていてもよい。広く多様な細胞は、適切
に修飾されると、APCとして機能することも可能である。そのような細胞の例
は、昆虫細胞、たとえばDrosophilaまたはSpodoptera;お
よびヒト細胞系T2等の、フォスター細胞である。例えば、MHC分子、さらに
所望によりB7などのアクセサリー分子、などの一つまたはそれ以上の抗原提示
ポリペプチドの合成を指示する発現ベクターをこれらの細胞中に導入し、これら
の細胞抗原提示分子、および所望により、付属分子またはそれの機能的一部の表
面上での発現に影響を与えてもよい。あるいは、細胞膜中へ自分自身で挿入でき
る抗原提示ポリペプチドおよび付属分子は使用してもよい。例えば、グリコシル
ホスファチジルイノシトール(GPI)修飾ポリペプチドは細胞の膜の中へ自分
自身を挿入することができる。Hirose et al.(1995)Met
hods Enzymol.250:582−614;およびHuang et
al.(1994)Immunity 1:607−613。アクセサリー分
子は、非限定的に、CD28、CD80、またはCD86特異的抗体などの共刺
激性抗体;非限定的に、B7.1およびB7.2を含む共刺激分子;ICAM−
1およびLFA−3などの接着分子;およびFasリガンドおよびCD70等の
生存分子を含む。例えば、PCT Publication No.WO97/
46256を参照と。Cells that do not normally function as APCs in vivo in mammals may be modified in such a way as to function as APCs. A wide variety of cells, when appropriately modified, can also function as APCs. Examples of such cells are insect cells, such as Drosophila or Spodoptera; and Foster cells, such as the human cell line T2. For example, expression vectors that direct the synthesis of one or more antigen presenting polypeptides, such as MHC molecules, and optionally accessory molecules such as B7, are introduced into these cells, and these cellular antigen presenting molecules, and If desired, the expression of the accessory molecule or a functional part thereof on the surface may be affected. Alternatively, antigen presenting polypeptides and accessory molecules that can insert themselves into the cell membrane may be used. For example, a glycosylphosphatidylinositol (GPI) modified polypeptide can insert itself into the membrane of a cell. Hirose et al. (1995) Met
hods Enzymol. 250: 582-614; and Huang et.
al. (1994) Immunity 1: 607-613. Accessory molecules include, but are not limited to, co-stimulatory antibodies such as CD28, CD80, or CD86-specific antibodies; co-stimulatory molecules, including but not limited to B7.1 and B7.2; ICAM-
1 and adhesion molecules such as LFA-3; and surviving molecules such as Fas ligand and CD70. For example, PCT Publication No. WO97 /
See 46256.
【0126】 フォスター抗原提示細胞はAPCとして特に有用である。フォスターAPCは
、T2として呼ばれる、ヒト細胞系統174×CEM.T2由来である。T2は
、細胞表面のMHCクラスI分子と内因性ペプチドの結合を制限するそれの抗原
加工経路において変異を含む。Zweerink et al.(1993)J
.immunol.150:1763−1771。このことは、TAP1、TA
P2、LMP1、およびLMP2遺伝子(これらはMHCクラスI制限CD8+
CTLへ抗原提示のために必要である)を含むMHCクラスII領域における多
大な同種接合欠失に帰する。実際、”空の”MHCクラスI分子のみが、これら
の細胞の表面上に提示される。培養培地に加えられる外来性ペプチドは、当該ペ
プチドが対立遺伝子特異的に結合モチーフを含む限りこれらのMHC分子と結合
する。これらのT2細胞は、”フォスター(foster)”APCとして本明
細書中に参照される。それらは、本はsつめいとの関係において抗原を提示する
ために使用しうる。Foster antigen presenting cells are particularly useful as APCs. Foster APC is a human cell line 174 × CEM. It is derived from T2. T2 contains a mutation in its antigen processing pathway that limits the binding of endogenous peptides to MHC class I molecules on the cell surface. Zweerlink et al. (1993) J
. immunol. 150: 1763-1771. This means that TAP1, TA
P2, LMP1, and LMP2 genes (these are MHC class I restricted CD8 +
(Necessary for antigen presentation to CTLs) resulting in a large homozygous deletion in the MHC class II region. In fact, only "empty" MHC class I molecules are displayed on the surface of these cells. Exogenous peptides added to the culture medium will bind to these MHC molecules as long as the peptide contains a binding motif allele-specifically. These T2 cells are referred to herein as "foster" APCs. They can be used to present antigen in relation to books.
【0127】 特定の組換えMHC対立遺伝子(アリル)を有するT2細胞の形質導入は、M
HC限定性質の再支配を可能にする。アンカー残基は内因性アリルへの効果的な
結合を妨げるであろうため、組換えアリルに対して調製されたライブラリーは、
それらによって優先的に提示されるであろう。Transduction of T2 cells with specific recombinant MHC alleles (alleles)
Enables re-control of HC-limited properties. Libraries prepared for recombinant alleles will not prevent efficient binding to endogenous alleles,
They will be presented preferentially.
【0128】 MHC分子の高レベル発現はAPCをよりCTLに見やすくする。強力な転写
プロモーター(例えば、CMVプロモーター)を使用してするT2細胞において
所期のMHCアリルを発現することにより、(おそらく細胞表面上の反応性MH
Cペプチド複合体の高濃度のため)より強い反応性のAPCの結果となる。High-level expression of MHC molecules makes APCs more visible to CTLs. By expressing the desired MHC allele in T2 cells using a strong transcription promoter (eg, the CMV promoter) (possibly with reactive MH on the cell surface)
Stronger reactive APC results (due to the higher concentration of C-peptide complex).
【0129】 免疫効果細胞の活性化に影響を与えるようなそのような法則において、抗原提
示細胞が免疫効果細胞に抗原を提示することが可能であるかどうかを決定するた
めの方法は、当該技術分野において既知であり、および、例えば、効果細胞によ
る3H−チミジンの取り込み、効果細胞によるサイトカインの産生、および細胞 溶解性51−Cr遊離検定、を含む。In such rules that affect the activation of immune effector cells, methods for determining whether antigen presenting cells are capable of presenting antigen to immune effector cells are described in the art. It is known in the art and includes, for example, 3 H-thymidine incorporation by effector cells, production of cytokines by effector cells, and a cytolytic 51- Cr release assay.
【0130】 いくつかの態様において、本発明の抗原ペプチドは、ペプチドがCD4+また
はCD8+T細胞上のTCRにより結合されるように、MHCクラスIまたはク
ラスII分子において抗原提示細胞に提示されるが、抗原提示細胞はT細胞の活
性化のために必要な一つまたはそれ以上の共刺激性分子を欠損する。これらの抗
原提示細胞はT細胞アネルギー(不反応性)を誘導し、そして免疫反応の減少ま
たは抑制するための本明細書中に記載される方法においてに有用である。T細胞
アネルギーに影響を与えるようなそのような法則において、抗原提示細胞が免疫
効果細胞に抗原を提示することが可能であるかどうかを決定するための方法は、
当該技術分野において既知である。In some embodiments, the antigenic peptides of the invention are presented to antigen presenting cells in MHC class I or class II molecules such that the peptides are bound by the TCR on CD4 + or CD8 + T cells, Presenting cells lack one or more costimulatory molecules required for T cell activation. These antigen presenting cells induce T cell anergy (reactivity) and are useful in the methods described herein for reducing or suppressing an immune response. In such a law that affects T cell anergy, a method for determining whether an antigen presenting cell is capable of presenting an antigen to an immune effector cell comprises:
It is known in the art.
【0131】 以下は、APCの単離のための二つの基本的な手法の簡単な記載である。これ
らの手法は、(1)血液から骨髄前駆細胞(CD34+)を単離し、そしてAP
Cへ分化するためにそれらを刺激すること;あるいは(2)末梢血から委任され
る前のAPCを収集すること、を含む。最初の手法で法は、末梢血において多数
の循環するCD34+肝細胞を追加免疫するためにGM−CSFなどのサイトカ
インを用いて患者を処理しなければならない。The following is a brief description of two basic techniques for the isolation of APC. These approaches (1) isolate bone marrow progenitor cells (CD34 +) from blood and
Stimulating them to differentiate into C; or (2) collecting pre-committed APCs from peripheral blood. In the first approach, the method must treat patients with cytokines such as GM-CSF to boost large numbers of circulating CD34 + hepatocytes in peripheral blood.
【0132】 APCを単離するための二番目の研究方法は、血液において既に循環する比較
的大多数の委任される前の(precommited)APCを収集することで
ある。人の末梢血から委任されるAPCを単離するための前の技術は、メトライ
ズアミド勾配および粘着/非粘着工程(Freudenthal et al.
(1990)PNAS 87:7698−7702);Percoll勾配分離
(Mehta−Damani et al.(1994)J immunol.
153:996−1003);および蛍光活性化細胞選別技術(Thomas
et al.(1993)J.Immunol.151:6840−52)等
の、物理的手順の組み合わせを含んでいた。A second approach to isolating APCs is to collect a relatively large number of precommitted APCs that already circulate in the blood. Previous techniques for isolating committed APCs from human peripheral blood include metrizamide gradients and the sticky / non-sticky step (Freudenthal et al.
(1990) PNAS 87: 7698-7702); Percoll gradient separation (Mehta-Danini et al. (1994) J Immunol.
153: 996-1003); and a fluorescence activated cell sorting technique (Thomas).
et al. (1993) J. Amer. Immunol. 151: 6840-52).
【0133】 多数の細胞を互いに分離する技術の一つは向流遠心溶出法(CCE)として知
られている。この技術においては、細胞は同時に遠心され、そして絶えず流速を
増している緩衝液の流出によって洗い流されることに曝される。緩衝液の絶えず
増加する向流の流れが主として細胞サイズを基とした分別的細胞分離を導く。One technique for separating large numbers of cells from one another is known as countercurrent centrifugal elution (CCE). In this technique, cells are simultaneously centrifuged and exposed to being washed away by a constantly increasing flow of buffer. The constantly increasing countercurrent flow of the buffer leads to fractional cell separation based primarily on cell size.
【0134】 本発明の一側面において、APCはネズミ、サルまたはヒト等の哺乳類の白血
球細胞画分から分離されうる前駆体の(precommited)または成熟し
た樹状細胞である(WO 96/23060参照例)。白血球細胞は哺乳類の末
梢血由来でありうる。本方法は次の工程を含む。(a)白血球搬出法等の当該技
術分野において知られている方法により哺乳類源から得られる白血球細胞を供給
し、(b)工程(a)の白血球細胞画分を向流遠心溶出法により4またはそれ以
上のサブ画分に分離し、(c)カルシウムイオノフォア、GM−CSFおよびI
L−13またはGM−CSFおよびIL−4と細胞を接触させることにより工程
(b)由来の一つまたはそれ以上の画分における単球細胞の樹状細胞への転換を
刺激し、(d)工程(c)由来の樹状細胞に富んだ画分を同定し、そして(e)
好ましくは約4℃で工程(d)の富化画分を収集する。樹状細胞が富化画分を同
定する方法の一つは、蛍光活性化細胞分別によるものである。白血球細胞画分は
組換え(rh)rhIL−12、rhGM−SCF、またはrhIL−4等の他
のサイトカインの存在においてカルシウムイオノフォアで処理されることが可能
である。白血球細胞画分の細胞を分離工程の前に緩衝液で洗浄し、そしてCa+
+/Mg++非存在溶媒に懸濁してもよい。白血球細胞画分は白血球搬出法によ
って得られる。樹枝細胞は以下の標識(HLA−DR、HLA−DQ、またはB
7.2)の少なくとも一つが存在すること、および以下の標識(CD3、CD1
4、CD16、56、57、およびCD19、20)が同時に存在しないことに
よって同定されることが可能である。これらの細胞表面の標識に特異的なモノク
ローナル抗体は商業的に入手可能である。In one aspect of the present invention, the APC is a precursor or mature dendritic cell that can be separated from a leukocyte cell fraction of a mammal such as a mouse, monkey or human (see WO 96/23060). . The white blood cells can be from peripheral blood of a mammal. The method includes the following steps. (A) supplying leukocyte cells obtained from a mammalian source by a method known in the art such as a leukocyte export method, and (b) subjecting the leukocyte cell fraction of step (a) to 4 or 4 by countercurrent centrifugal elution. Separated into further sub-fractions, (c) calcium ionophore, GM-CSF and I
Stimulating the conversion of monocyte cells to dendritic cells in one or more fractions from step (b) by contacting the cells with L-13 or GM-CSF and IL-4; Identifying the dendritic cell-enriched fraction from step (c); and (e)
The enriched fraction of step (d) is collected, preferably at about 4 ° C. One method of identifying fractions enriched in dendritic cells is by fluorescence activated cell sorting. The leukocyte cell fraction can be treated with a calcium ionophore in the presence of other cytokines such as recombinant (rh) rhIL-12, rhGM-SCF, or rhIL-4. The cells of the leukocyte fraction are washed with buffer prior to the separation step and Ca +
+ / Mg ++ may be suspended in a non-existent solvent. The leukocyte cell fraction is obtained by a leukocyte export method. Dendritic cells were labeled with the following labels (HLA-DR, HLA-DQ, or BLA).
7.2) is present and at least one of the following labels (CD3, CD1
4, CD16, 56, 57 and CD19, 20) can be identified by their non-existence. Monoclonal antibodies specific for these cell surface labels are commercially available.
【0135】 より具体的には、本方法は、白血球搬出法に由来し、そして向流遠心溶出法(
CCE)によってさらに分画された白血球細胞および血小板のより富んだ収集物
を回収することを必要とする。Abrahamsen et al.(1991
)J.Clin.Apheresis.6:48−53。細胞試料は特定の溶出
ローター中に配置される。ローターは次いで、その後例えば3000rpmの一
定速度で回転される。一度ローターが望ましい速度に達したら、細胞の流速を調
節するために加圧空気が使われる。エルトリエーター内の細胞は同時に遠心され
および絶えず流速を増している緩衝液の流れによって洗い流されることに曝され
る。これは結果的に主として(しかし全てではないが)細胞サイズの差異を基と
した分画的細胞分離となる。More specifically, the method is derived from the leukapheresis method and is countercurrent centrifugal elution (
It requires collecting a richer collection of white blood cells and platelets further fractionated by CCE). Abrahamsen et al. (1991
J.). Clin. Apheresis. 6: 48-53. The cell sample is placed in a specific elution rotor. The rotor is then rotated at a constant speed of, for example, 3000 rpm. Once the rotor has reached the desired speed, pressurized air is used to regulate the flow rate of the cells. The cells in the elutriator are simultaneously centrifuged and exposed to being washed away by a constantly increasing flow of buffer. This results in a predominantly, but not exclusively, fractional cell separation based on differences in cell size.
【0136】 APCおよびさらに具体的にはDC収集物の性質制御および培養液におけるそ
れらの効果的な活性化は、単球および樹枝細胞の部分母集団の双方、さらに存在
しうる夾雑物であるT細胞をも測定する同時多色FACS解析技術に依存してい
る。それはDCが以下の標識、CD3(T細胞)、CD14(単球)、CD16
、56、57(NK/LAK細胞)、CD19、20(B細胞)を発現しないと
いう事実に基づいている。同時に、DCが血液中を循環している時点で、それら
は大量のHLA−DR、有意のHLA−DQおよびB7.2を発現する(しかし
B7.1はほとんどまたは全く発現しない)(付加的に、それらは単球および好
中球によっても発現される骨髄標識であるLeu M7およびM9を発現してい
る)。The control of the properties of APCs and, more specifically, the DC collection and their effective activation in the culture medium, both monocyte and dendritic cell subpopulations, are a possible contaminant, T It relies on a simultaneous multicolor FACS analysis technique that also measures cells. It is possible that the DCs are labeled as follows: CD3 (T cells), CD14 (monocytes), CD16
, 56, 57 (NK / LAK cells) and CD19, 20 (B cells). At the same time, as DC circulate in the blood, they express large amounts of HLA-DR, significant HLA-DQ and B7.2 (but little or no B7.1) (additionally. , They express Leu M7 and M9, bone marrow markers that are also expressed by monocytes and neutrophils).
【0137】 一旦回収されたら、富化DC/単球APC画分(たいていは150から190
)はプールされ、後の使用のために低温保存されるか、あるいは即座に短期培養
液にいれられてもよい。Once collected, the enriched DC / monocyte APC fraction (usually 150-190
) May be pooled and cryopreserved for later use, or immediately placed in short-term cultures.
【0138】 または、他の者は樹状細胞を正に制御(活性化)しおよび単球を活性化樹状細
胞の表現型に変換する方法を報告している。この方法は培養培地へのカルシウム
イオノフォアの添加が単球を活性化樹状細胞に変換するということを含む。たと
えば24から48時間の培養時間の開始にカルシウムイオノフォアA23187
を加えると結果的に、プールされた「単球+DC」画分の一様な活性化と表現型
的に樹状細胞への変換となる。特徴的には、活性化集団は一様にCD14(Le
u M3)陰性になり、およびHLA−DR、HLA−DQ、ICAM−1、B
7.1およびB7.2を正に制御する。Alternatively, others have reported methods of positively controlling (activating) dendritic cells and converting monocytes to the activated dendritic cell phenotype. The method involves that the addition of a calcium ionophore to the culture medium converts monocytes into activated dendritic cells. For example, calcium ionophore A23187 at the beginning of a culture time of 24 to 48 hours
Results in uniform activation of the pooled "monocyte + DC" fraction and phenotypic conversion to dendritic cells. Characteristically, the activated population is uniformly CD14 (Le
u M3) negative and HLA-DR, HLA-DQ, ICAM-1, B
Control 7.1 and B7.2 positively.
【0139】 サイトカインの特異的な組み合わせはカルシウムイオノフォアでなされる活性
化/変換を増幅する(または部分的に代替する)ために効果的に用いられている
。これらのサイトカインは精製または組変えヒト(「rh」)rhGM−CSF
、rhIL−2およびrhIL−4を含むが、これに限られない。いずれのサイ
トカインも単独で与えられた場合は最適な正制御には不適切である。[0139] Specific combinations of cytokines have been effectively used to amplify (or partially replace) the activation / conversion made with calcium ionophores. These cytokines are purified or recombinant human ("rh") rhGM-CSF
, RhIL-2 and rhIL-4. Both cytokines are inappropriate for optimal positive control when given alone.
【0140】 抗原提示フォスター細胞 抗原提示フォスター細胞は、内在性ペプチドの制限された結合から細胞表面に
外来抗原を吸収し提示するように遺伝的に修飾された樹状細胞である。ある態様
では、ヒト細胞系174xCEM.T2(T2と言及される)は内在性ペプチド
と細胞表面のI型MHC分子との結合を制限する抗原加工経路における突然変異
を含み(Zweerink et al.(1993)J.Immunol.1
50:1763−1771)、そしてそれ故に促進抗原提示細胞の製造に用いら
れることが可能である。(当該細胞系はATCCから取得可能である。)これは
、TAP1、TAP2、LMP1およびLMP2遺伝子(これらはI型MHC制
限CD8+CTLの抗原提示に必要である。)を含むII型MHC領域における
大きな同型接合型欠損によるものである。実際、「空の」I型MHC分子のみが
これらの細胞表面に提示される。培養培地に付加された外来ペプチドは、対立遺
伝子特異的に結合するモチーフを含む限り、これらのMHC分子に結合する。こ
れらのT2細胞は本明細書中では「フォスター」APCと言及されている。それ
らは本発明との関係において抗原を提示するために使用しうる。Antigen Presenting Foster Cells Antigen presenting Foster cells are dendritic cells that have been genetically modified to absorb and present foreign antigens on the cell surface from restricted binding of endogenous peptides. In some embodiments, the human cell line 174xCEM. T2 (referred to as T2) contains a mutation in the antigen processing pathway that limits the binding of endogenous peptides to cell surface type I MHC molecules (Zweerink et al. (1993) J. Immunol. 1).
50: 1763-1177), and therefore can be used in the production of facilitating antigen presenting cells. (The cell line is available from the ATCC.) This is a large isomorphism in the type II MHC region containing the TAP1, TAP2, LMP1 and LMP2 genes, which are required for antigen presentation of type I MHC restricted CD8 + CTL. This is due to a junction type defect. In fact, only "empty" type I MHC molecules are displayed on these cell surfaces. Foreign peptides added to the culture medium will bind to these MHC molecules as long as they contain a motif that binds allele-specifically. These T2 cells are referred to herein as "Foster" APCs. They can be used to present antigens in the context of the present invention.
【0141】 特異的な組換えMHC対立遺伝子のT2細胞の形質導入は、MHC制限特性の
再指向を可能にする。組換え対立遺伝子に調製されたライブラリーは、アンカー
残基が内生対立遺伝子に効果的に結合することを妨げると考えられるので、それ
らによって優先的に提示されると考えられる。Transduction of T2 cells with specific recombinant MHC alleles allows redirection of MHC restriction properties. Libraries prepared for recombinant alleles will be predominantly presented by them as they will prevent anchor residues from effectively binding to endogenous alleles.
【0142】 専門に処理されていないAPCの同種異系のMHC対立遺伝子の形質導入は組
換え細胞系の免疫発生において大いに助成する。(Leong et al.(
1994)Inter.J.Cancer 59:212−216;Ostra
nd−Rosenberg et al.(1991)Inter.J.Can
cer Suppl 6:61−68)。免疫発生はMHCタンパク質の発現量
に比例すると報告されている。T2細胞は理想的なAPCである。Transduction of allogeneic MHC alleles of non-specialized APCs greatly assists in the development of immunity in recombinant cell lines. (Leong et al.
1994) Inter. J. Cancer 59: 212-216; Ostra
nd-Rosenberg et al. (1991) Inter. J. Can
cer Suppl 6: 61-68). It has been reported that immune development is proportional to the expression level of MHC protein. T2 cells are the ideal APC.
【0143】 MHC分子の高発現はAPCをCTLにより認識可能にする。強力な転写プロ
モーター(例えば、CMVプロモーター)を用いたT2細胞における所期のMH
C対立遺伝子の発現は結果的により反応性のAPCとなる(おそらく高濃度の細
胞表面の反応性MHC−ペプチド複合体による)。MHC対立遺伝子のある型の
みが与えられたライブラリーと相互作用可能と考えられるので、もしライブラリ
ーが新たに形質導入された細胞に結合するよう設計されているならば内在性対立
遺伝子の提示または発現量は特異性を妥協しないと考えられることに注意すべき
である。High expression of MHC molecules makes APCs recognizable by CTL. Desired MH in T2 cells using a strong transcription promoter (eg, CMV promoter)
Expression of the C allele results in more reactive APCs (possibly due to high concentrations of cell surface reactive MHC-peptide complexes). Since only certain types of MHC alleles are believed to be able to interact with a given library, presentation of the endogenous allele or if the library is designed to bind to newly transduced cells. It should be noted that the expression level does not seem to compromise specificity.
【0144】 ハイブリド細胞はまた抗原を提示しうるので、よってそれにより本発明の方法
において有用である。 樹状細胞を利用したハイブリド細胞の調製 ハイブリド細胞(雑種細胞)は典型的にはAPCの表現型の特徴を保持する。
よって、樹状細胞で作製されたハイブリドは同様のMHC クラスIIタンパク
質および他の細胞表面標識を発現すると考えられる。さらに、ハイブリドはそれ
らが由来した細胞に発現されている抗原を発現すると考えられる。ハイブリドを
作製する方法はWO 96/30030およびGong et al.(199
7)Nature Medicine 3(5):558−561に記載されて
いる。[0144] Hybrid cells can also present antigen, and thus are useful in the methods of the invention. Preparation of Hybrid Cells Using Dendritic Cells Hybrid cells (hybrid cells) typically retain the phenotypic characteristics of APCs.
Thus, hybrids made with dendritic cells would express similar MHC class II proteins and other cell surface markers. Further, it is believed that the hybrids express antigens that are expressed on the cells from which they were derived. Methods for making hybrids are described in WO 96/3030 and Gong et al. (199
7) Nature Medicine 3 (5): 558-561.
【0145】 APCの集団は収集されおよび分離される。好ましくは、APC:抗原発現細
胞の比率は約1:100および約1000:1の間である。例えば、1つの側面
においては、抗原提示細胞を富化した画分は次いでAPC、好ましくは樹状細胞
に融合される。APCと抗原提示細胞間の融合は、例えばポリエチレングリコー
ル(PEG)またはセンダイウィルスを用いるいずれかの適切な方法で行われる
ことができる。好ましい実施態様においては、ハイブリド細胞はGong et
al.(1997)Nat. Med. 3(5):558−561によって
記載されている方法を用いて創造される。The population of APC is collected and separated. Preferably, the ratio of APC: antigen expressing cells is between about 1: 100 and about 1000: 1. For example, in one aspect, the fraction enriched in antigen presenting cells is then fused to APCs, preferably dendritic cells. Fusion between APC and antigen presenting cells can be performed by any suitable method, for example using polyethylene glycol (PEG) or Sendai virus. In a preferred embodiment, the hybrid cells are Gong et.
al. (1997) Nat. Med. 3 (5): 558-561.
【0146】 典型的に、融合していない細胞は培養液内で数日後には死に絶えると考えられ
るので、よって融合した細胞は単に培養液を数日間増殖させることによって親細
胞から分離されることが可能である。この実施態様としては、ハイブリド細胞は
より生存可能であること、そしてさらには軽度に組織培養表面に付着しているの
みであることの両方である。親細胞は容器に強度に付着している。それ故に、培
養の約5から10日後に、ハイブリド細胞は静かに取り除かれ、そしておよび新
しい容器に移されることが可能であり、一方未融合細胞は付着したままである。Typically, unfused cells are expected to die after a few days in culture, so fused cells may be separated from parent cells simply by growing the culture for several days. It is possible. In this embodiment, the hybrid cells are both more viable and even only lightly attached to the tissue culture surface. The parent cell is strongly attached to the container. Thus, after about 5 to 10 days of culture, the hybrid cells can be gently removed and transferred to a new container, while the unfused cells remain attached.
【0147】 あるいは、融合細胞は機能的なヒポキサンチンーグアニンホスホリボシル転移
酵素(「HGPRT」)を欠いていて、およびそのために化合物HATの処理に
耐性があるということが示されている。よって、これらの細胞を選択するために
はHATが培養培地に添加されることが可能である。しかし、慣用されたHAT
選択とは異なり、ハイブリド細胞培地は化合物に12日以上に曝されるべきでは
ない。上記に記載されたAPCは以下に記載されているように抗原提示について
解析され得る。Alternatively, the fused cells have been shown to lack functional hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase ("HGPRT") and thus be resistant to treatment with the compound HAT. Thus, HAT can be added to the culture medium to select for these cells. However, the conventional HAT
Unlike selection, the hybrid cell medium should not be exposed to the compound for more than 12 days. The APCs described above can be analyzed for antigen presentation as described below.
【0148】 ワクチンとしてのこれらの使用に加えて、それらは養子免疫療法(adopt
ive immunotherapy)に使用され得る免疫効果細胞集団を拡張
するために有用である。[0148] In addition to their use as vaccines, they are subject to adoptive immunotherapy (adopt
It is useful to expand the immune effector cell population that can be used for live immunotherapy.
【0149】 APCへの抗原の提示 以下はAPCに抗原を発現または提示する様々な方法を簡単に記載する。 Paglia et al.(1996)J.Exp.Med.183:31
7−322は、インビトロで全タンパク質と振盪培養されたAPCはMHC ク
ラス I制限CTLによって認識され、そしてこれらのAPCでの動物の免疫処
置がインビボにおける抗原特異的なCTLの発生を導くということを示している
。Hsu et al.(1996)Nature Medicine 2(1
):52−58;Celluzzi et al.(1996)J.Exp.M
ed.183:283−287;Mayordomo et al.(1995
)Nature Medicine 1(12):1297−1302;Bak
ker et al.(1995)Cancer Research 55:5
330−5334;およびMayordomo et al.(1997)St
em Cells 15:94−103は、癌免疫治療におけるペプチドを適用
した樹状細胞の効果的な使用を報告した。Presenting Antigens to APCs The following briefly describes various methods for expressing or presenting antigens to APCs. Paglia et al. (1996) J. Amer. Exp. Med. 183: 31
7-322 show that APCs cultured with whole proteins in vitro with shaking are recognized by MHC class I restricted CTLs, and that immunization of animals with these APCs leads to the generation of antigen-specific CTLs in vivo. Is shown. Hsu et al. (1996) Nature Medicine 2 (1
): 52-58; Celluzzi et al. (1996) J. Amer. Exp. M
ed. 183: 283-287; Mayordomo et al. (1995
) Nature Medicine 1 (12): 1297-1302; Bak
ker et al. (1995) Cancer Research 55: 5
330-5334; and Mayordomo et al. (1997) St
em Cells 15: 94-103 reported the effective use of peptide applied dendritic cells in cancer immunotherapy.
【0150】 さらに、DC等のAPCのサイトソルにおける抗原の提示を導く幾つかの異な
った技術が記載されている。これらは、(1)腫瘍細胞から分離されたRNAの
APCへの導入、(2)抗原の内在性発現を誘導するために組換えベクターのA
PCへの感染、および(3)リポソームを用いたDCサイトソルへの腫瘍抗原の
導入を含む。(Boczkowski et al.(1996)J.Exp.
Med.184:465−472;Rouse et al.(1994)J.
Virol.68:5685−5689;およびNair et al.(19
92)J.Exp.Med.175:609−612参照)。In addition, several different techniques have been described which lead to the presentation of antigen in the cytosol of APCs such as DC. These include (1) introduction of RNA isolated from tumor cells into APC, and (2) A of recombinant vector to induce endogenous expression of antigen.
PC infection, and (3) introduction of tumor antigens into DC cytosol using liposomes. (Boczkowski et al. (1996) J. Exp.
Med. 184: 465-472; Rose et al. (1994) J. Am.
Virol. 68: 5685-5689; and Nair et al. (19
92) J. Exp. Med. 175: 609-612).
【0151】 遺伝的に修飾された樹状細胞および免疫治療におけるそれらの使用は記載され
ている。Brossart et al.(1997)J.Immunol.3
270−3276およびWan et al.(1997)Human Gen
e Therapy 8:1355−1363;Gong et al.(19
97)Gene Therapy 4:1023−1028;Kim et a
l.(1997)J.Immunotherapy 20(4):276−28
6;およびSong et al.(1997)J.Exp.Med.186(
8):1247−1256は、抗原ペプチドを含むアデノウィルスをDCsを形
質導入するために使用でき、そして、次いで、動物にDCsを投与して免疫応答
を誘導することができると報告した。Cordon et al.(1996)
Nature Medicine 2(10):1122−1128は、裸の(
naked)DNAでの皮膚の遺伝子的な免疫処置が結果的に有力な抗原特異的
な、細胞傷害性Tリンパ球媒介性保護綿基を誘導することを示している。Art
hur et al.(1997)Cancer Gene Therapy
4(1):17−25はヒト樹状細胞における遺伝子移行方法を比較しおよび解
析している。[0151] Genetically modified dendritic cells and their use in immunotherapy have been described. Brossart et al. (1997) J. Am. Immunol. 3
270-3276 and Wan et al. (1997) Human Gen
e Therapy 8: 1355-1363; Gong et al. (19
97) Gene Therapy 4: 1023-1028; Kim et a
l. (1997) J. Am. Immunotherapy 20 (4): 276-28
6; and Song et al. (1997) J. Am. Exp. Med. 186 (
8): 1247-1256 reported that adenoviruses containing antigenic peptides could be used to transduce DCs, and that animals could then be administered DCs to induce an immune response. Cordon et al. (1996)
Nature Medicine 2 (10): 1122-1128 is a naked (
Genetic immunization of skin with naked DNA results in the induction of potent antigen-specific, cytotoxic T lymphocyte-mediated protective cotton. Art
hur et al. (1997) Cancer Gene Therapy
4 (1): 17-25 compare and analyze methods of gene transfer in human dendritic cells.
【0152】 しかし、上記のいずれも本明細書で特許請求されたような、細胞表面を提示す
るAPCの使用、および免疫応答を誘導するための分泌型抗原を報告していない
。However, none of the above report the use of APCs to present cell surfaces and the secreted antigens for inducing an immune response as claimed herein.
【0153】 APCへの遺伝子(単数又は複数)の挿入は適切な遺伝子運搬媒用ビヒクルの
作製および効率的な遺伝子導入の方法を必要とする。以下は所期の遺伝子のイン
ビトロおよびインビボ形質導入に有用である。Insertion of the gene (s) into the APC requires a method for producing an appropriate gene carrier vehicle and efficient gene transfer. The following are useful for in vitro and in vivo transduction of the desired gene.
【0154】 免疫効果細胞 本発明は、上記記載のAPCの使用により抗原特異的な免疫効果細胞の富化さ
れた集団の産生を刺激する。これにより、本発明は教育された抗原特異的な免疫
効果細胞(本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原に特異的である
)が富化された細胞集団を提供する。ある態様では、抗原は腫瘍細胞表面の抗原
に相当し、そして本発明の教育された抗原特異的な免疫効果細胞は、腫瘍細胞の
成長を抑制する。APCが使用されると、抗原特異的な免疫効果細胞はAPCを
消費することにより拡大され、そしてAPCsは培地中の枯死する。未処理の免
疫効果細胞が他の細胞により教育された状態になる方法はCoulie(199
7)Molec.Med.Today3:261−268に完全に記載されてい
る。Immune Effector Cells The present invention stimulates the production of an enriched population of antigen-specific immune effector cells by use of the APCs described above. Thus, the present invention provides a cell population enriched in the educated antigen-specific immune effector cells, which are specific for the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention. In some embodiments, the antigen corresponds to an antigen on the surface of a tumor cell, and the educated antigen-specific immune effector cells of the invention inhibit tumor cell growth. When APC is used, antigen-specific immune effector cells are expanded by consuming APC, and APCs die in the medium. A method by which untreated immune effector cells become educated by other cells is described in Coulie (199).
7) Molec. Med. Today 3: 261-268.
【0155】 上記記載のように調製されたAPCは未処理の免疫効果細胞と混合される。好
ましくは、細胞は例えばIL−2のようなサイトカインの存在下で培養してもよ
い。樹状細胞は有力な免疫刺激サイトカイン、例えばIL−12を分泌するので
、拡大の最初のおよび連続した循環の間に補足的なサイトカインを付加すること
は必要ではないかもしれない。いずれにせよ培養条件は抗原特異的な免疫効果細
胞がAPCよりはるかに高い効率で拡大する(即ち増殖する)というものである
。APCの多数融合および所望のサイトカインは、抗原特異的細胞の集団をさら
に拡大するために行ってもよい。APC prepared as described above is mixed with untreated immune effector cells. Preferably, the cells may be cultured in the presence of a cytokine, for example, IL-2. Because dendritic cells secrete potent immunostimulatory cytokines, such as IL-12, it may not be necessary to add supplemental cytokines during the initial and continuous circulation of expansion. In any case, the culture conditions are such that antigen-specific immune effect cells expand (ie, proliferate) with much higher efficiency than APCs. Multiple fusions of APC and desired cytokines may be performed to further expand the population of antigen-specific cells.
【0156】 一つの態様では、免疫効果細胞はT細胞である。別の態様では、免疫効果細胞
を例えばIL−2、IL−11またはIL−13をコードする導入遺伝子を形質
導入することによって遺伝学的に修飾してもよい。インビトロ、エクスビボおよ
びインビボの導入遺伝子を導入する方法は当該技術分野においてはよく知られて
いる。Sambrook et al.(1989)Supra参照。In one aspect, the immune effector cells are T cells. In another embodiment, the immune effector cells may be genetically modified, for example, by transducing a transgene encoding IL-2, IL-11 or IL-13. Methods for introducing transgenes in vitro, ex vivo and in vivo are well known in the art. Sambrook et al. (1989) See Supra.
【0157】 本発明の方法における使用に適した効果細胞集団は自己性または同種異系でも
よいが、好ましくは自己性である。効果細胞が同種異系(allogenic)
のときは、細胞は使用前に異型反応性の細胞を欠乏することが好ましい。これは
、例えば同種異型効果細胞および受容細胞集団を混合しおよび適当な時間それら
を振盪培養し、その後CD69+細胞を欠乏させるか、または異型反応性の細胞
を不活性化させるか、あるいは異型反応性の細胞集団においてアネルギーを誘導
させることによることを含めた何れかの既知の方法で行われることが可能である
。Effector cell populations suitable for use in the methods of the invention may be autologous or allogeneic, but are preferably autologous. Effector cells are allogeneic
In this case, the cells are preferably depleted of atypically reactive cells before use. This may include, for example, mixing the allogeneic effector cells and the recipient cell population and shaking them for a suitable period of time and then depleting CD69 + cells or inactivating atypically responsive cells, or Can be performed in any known manner, including by inducing anergy in the cell population.
【0158】 ハイブリド免疫効果細胞もまた使用可能である。免疫効果細胞のハイブリドは
当該技術分野において知られており、および様々な刊行物に記載されている。例
えば、国際特許出願WO 98/46785;およびWO95/16775参照
。[0158] Hybrid immune effect cells can also be used. Hybrids of immune effectors are known in the art and have been described in various publications. See, for example, International Patent Applications WO 98/46785; and WO 95/16775.
【0159】 効果細胞集団は未分離の細胞、即ち混合集団、例えばPBMC集団、全血等、
を含む可能性がある。効果細胞集団は細胞表面標識の発現を基とした正選択、細
胞表面標識の発現を基とした負の選択、インビトロまたはインビボで一つ以上の
抗原で刺激すること、インビトロまたはインビボで一つ以上の生物学的修飾剤で
処理すること、一つ以上の抗原または生物学的修飾剤で負に刺激すること、また
はこれらの何れかまたは全ての組み合わせによって操作されることが可能である
。The effector cell population is an unseparated cell, ie, a mixed population, such as a PBMC population, whole blood, etc.
May be included. Effector cell populations can be positively selected based on expression of cell surface labels, negative selection based on expression of cell surface labels, stimulated with one or more antigens in vitro or in vivo, one or more in vitro or in vivo. , Negatively stimulated with one or more antigens or biological modifiers, or manipulated by any or all combinations thereof.
【0160】 効果細胞は様々な源から得られる。その源は、混合集団、脾臓細胞、骨髄細胞
、リンパ球浸潤腫瘍細胞、白血球搬出法によって得られる細胞、生検試料、リン
パ節、例えば腫瘍細胞から排出したリンパ節を含む、PBMC、全血、あるいは
その画分を含むがこれに限られてはいない。適切なドナーは免疫化されたドナー
、免疫化されていない(未処理の)ドナー、治療されたまたは治療されていない
ドナーを含む。「治療された」ドナーは一つ以上の生物学的修飾剤に曝されたも
のである。「治療されていない」ドナーは一つ以上の生物学的修飾剤に曝されて
いないものである。The effector cells can be obtained from various sources. Sources include mixed populations, spleen cells, bone marrow cells, lymphocytic infiltrating tumor cells, cells obtained by leukapheresis, biopsy samples, lymph nodes, eg, PBMCs, including lymph nodes drained from tumor cells, whole blood, Alternatively, it includes, but is not limited to, its fraction. Suitable donors include immunized donors, unimmunized (untreated) donors, treated or untreated donors. A "treated" donor has been exposed to one or more biological modifiers. An “untreated” donor is one that has not been exposed to one or more biological modifiers.
【0161】 効果細胞を抽出および培養する方法はよく知られている。例えば、効果細胞は
白血球搬出法、連続流出細胞分離器を使用した機械的な除去療法によって得られ
ることが可能である。例えば、リンパ球および単球は何れかの既知の方法(フィ
コール−HypaqueTM勾配による分離、パーコール勾配分離または溶出を含
むがこれに限られていない。)によって、軟膜から分離され得る。フィコール−
HypaqueTMの濃度は望ましい集団、例えばT細胞が富化された集団を得る
ために調節されうる。親和性を基とした他の方法は知られており使用可能である
。これらは、例えば蛍光活性細胞分離(FACS)、細胞粘着、磁気ビーズ分離
等を含む。親和性を基とした方法は、細胞表面標識に特異的でありおよび様々な
商業的な供給源(American Type Culture Collec
tion(Manassas、MD)を含む)から入手可能である抗体またはそ
の一部を利用してもよい。親和性を基とした方法はあるいは細胞表面受容体のリ
ガンドまたはリガンド類似体を利用可能である。Methods for extracting and culturing effector cells are well known. For example, effector cells can be obtained by leukapheresis, mechanical ablation therapy using a continuous efflux cell separator. For example, lymphocytes and monocytes can be separated from buffy coats by any known method, including but not limited to separation by Ficoll-Hypaque ™ gradient, Percoll gradient separation or elution. Ficoll-
The concentration of Hypaque ™ can be adjusted to obtain a desired population, eg, a population enriched in T cells. Other methods based on affinity are known and can be used. These include, for example, fluorescence activated cell separation (FACS), cell adhesion, magnetic bead separation, and the like. Affinity-based methods are specific for cell surface labeling and are available from a variety of commercial sources (American Type Culture Collection).
antibodies (including Manassas, MD) or a portion thereof. Affinity-based methods can alternatively utilize ligands or ligand analogs of cell surface receptors.
【0162】 効果細胞集団は細胞表面標識の発現を基とした一つ以上の分離プロトコルに曝
されることが可能である。例えば、細胞は一つ以上の細胞表面ポリペプチドの発
現に基づく正選択に曝されうる。前記細胞表面ポリペプチドは、CD2、CD3
、CD4、CD8、TCR、CD45、CD45RO、CD45RA、CD11
b、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD40
L等の「分化クラスター」細胞表面標識、リンパ球活性化遺伝子3産物(LAG
3)、シグナルリンパ球活性化分子(SLAM)、T1/ST2等のリンパ球活
性化に関連がある他の標識、CCR3、CCR4、CXCR3、CCR5等のケ
モカイン受容体、CD62L、CD44、CLA、CD146、α4β7、αE
β7等のホーミング受容体、CD25、CD69およびOX40等の活性化標識
、およびCD1によって提示されているリポグリカンを含むが、これに限られて
はいない。効果細胞集団は非T細胞および/または特定のT細胞部分集団を欠失
させる負の選択に曝されることが可能である。負の選択は様々な分子(CD19
およびCD20等のB細胞標識、単球の標識CD14、NK細胞の標識CD56
を含むが、これに限られていない。)の細胞表面の発現を基として行われ得る。The effector cell population can be exposed to one or more separation protocols based on the expression of cell surface labels. For example, cells can be subjected to positive selection based on the expression of one or more cell surface polypeptides. The cell surface polypeptide is CD2, CD3
, CD4, CD8, TCR, CD45, CD45RO, CD45RA, CD11
b, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD40
L, etc. “Differentiated cluster” cell surface labeling, lymphocyte activating gene 3 product (LAG
3), Signal lymphocyte activating molecule (SLAM), other markers related to lymphocyte activation such as T1 / ST2, chemokine receptors such as CCR3, CCR4, CXCR3, CCR5, CD62L, CD44, CLA, CD146 , Α4β7, αE
Including but not limited to homing receptors such as β7, activation labels such as CD25, CD69 and OX40, and lipoglycans presented by CD1. The effector cell population can be exposed to negative selection to delete non-T cells and / or specific T cell subpopulations. Negative selection is based on various molecules (CD19
And labeled B cells such as CD20, labeled CD14 on monocytes, labeled CD56 on NK cells
Including, but not limited to. ) Can be performed based on the expression on the cell surface.
【0163】 効果細胞集団はインビボまたはインビトロで一つ以上の生物学的修飾遺伝子に
曝されることによって操作され得る。適切な生物学的修飾剤はIL−2、IL−
4、IL−10、TNF−α、IL−12、IFN−γ等のサイトカイン、植物
性血球凝集素(PHA)、ホルボールミリスチン酸酢酸(PMA)等のホルボー
ルエステル、コンカナバリン−Aおよびイオノマイシン等の非特異的修飾剤、抗
−CD2、抗−CD3、抗−IL−2受容体、抗−CD28等の細胞表面標識に
特異的な抗体、例えばリンホタクチンを含むケモカインを含むが、これに限られ
ていない。生物学的修飾剤は天然源から得られる天然の因子、組換えDNA技術
によって産生される因子、化学的に合成されたポリペプチドまたは他の分子、あ
るいは天然のの因子の機能的な活性を持つ何れかの誘導体でもよい。一つ以上の
生物学的修飾剤が使用される場合、曝露は同時または連続的であることが可能で
ある。The effector cell population can be engineered by exposing one or more biologically modified genes in vivo or in vitro. Suitable biological modifiers are IL-2, IL-
4, cytokines such as IL-10, TNF-α, IL-12 and IFN-γ, phytohemagglutinin (PHA), phorbol esters such as phorbol myristate acetic acid (PMA), concanavalin-A and ionomycin Non-specific modifiers, such as, but not limited to, antibodies specific for cell surface labeling, such as anti-CD2, anti-CD3, anti-IL-2 receptor, anti-CD28, and the like, including lymphokactin. Not. Biological modifiers have the functional activity of natural factors obtained from natural sources, factors produced by recombinant DNA technology, chemically synthesized polypeptides or other molecules, or natural factors. Any derivative may be used. If one or more biological modifiers are used, the exposure can be simultaneous or sequential.
【0164】 本発明は免疫効果細胞を包む組成物を提供し、ここにおいて免疫効果細胞には
、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原に特異的な抗原特異的細
胞で富化されたT細胞でもよい。「富化された」とは、細胞集団が少なくとも約
50倍、より好ましくは少なくとも約500倍、そしてさらにより好ましくは少
なくとも約5000倍またはそれ以上に、起源未処理細胞集団から富化されてい
ることがを意味する。抗原特異的な細胞を包む富化された細胞集団の比率は、実
質上、抗原特異的細胞が10%未満から100%まで変化することが可能である
。もし細胞集団がすくなくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ま
しくは少なくとも80%、およびさらににより好ましくは少なくとも90%の本
発明のペプチドに特異的な抗原特異的免疫効果細胞を包むならば、その集団は「
実質上純粋」であると言及される。抗原特異的である百分率は例えば、効果細胞
集団(例えばT細胞集団)が本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗
原を提示している抗原特異的細胞によって攻撃されるような3H−チミジン取り 込みアッセイによって容易に決定されることが可能である。The present invention provides a composition comprising an immune effector cell, wherein the immune effector cell comprises a T cell enriched with an antigen-specific cell specific for an antigen encoded by a polynucleotide of the invention. May be. "Enriched" means that the cell population is at least about 50-fold, more preferably at least about 500-fold, and even more preferably at least about 5000-fold or more, from the original untreated cell population. That means. The proportion of the enriched cell population that encompasses the antigen-specific cells can vary substantially from less than 10% to 100% antigen-specific cells. If the cell population encompasses at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, and even more preferably at least 90% of the antigen-specific immune effector cells specific for the peptide of the invention, The group is "
It is referred to as "substantially pure." The percentage that is antigen-specific is, for example, the 3 H-thymidine incorporation such that the effector cell population (eg, the T cell population) is attacked by antigen-specific cells presenting the antigen encoded by the polynucleotide of the invention. It can be easily determined by the assay.
【0165】 免疫効果細胞の拡大(expand) 本発明では上記記載のAPCの使用によって、抗原特異的な免疫効果細胞の富
化された集団の産生物を刺激する。抗原特異的免疫効果細胞は培養液中で死ぬA
PCの消費によって拡大される。未処理の免疫効果細胞が他の細胞によって教育
された状態になる方法は本質的に、Coulie(1997)Molec.Me
d.Today 3:261−268;Hwu et al.(1993)J,
Immunol.150:4104−4115;およびRosenburg e
t al.(1985)N.Eng.J.Med.(23):1485−149
2に記載されている。Expanding Immune Effector Cells In the present invention, the use of the APCs described above stimulates the product of an enriched population of antigen-specific immune effector cells. Antigen-specific immune effect cells die in culture A
Increased by PC consumption. The manner in which untreated immune effector cells become educated by other cells is essentially as described in Coulie (1997) Molec. Me
d. Today 3: 261-268; Hwu et al. (1993) J,
Immunol. 150: 4104-4115; and Rosenburg
t al. (1985) N.P. Eng. J. Med. (23): 1485-149
2.
【0166】 一つの態様においては、抗原特異的免疫効果細胞集団はCD4+およびCD8
+双方のT細胞の双方を包む。 ある側面において、細胞傷害性T細胞(即ちCD8+T細胞)は、対象の細胞
傷害性T細胞浸潤部位から単離されるポリクローナルT細胞である。あるいは、
そのような細胞は二つまたはそれ以上の対象またはヒト患者(対象はMHCハロ
タイプを共有している)の細胞傷害性T細胞浸潤部位から分離される可能性があ
る。他の態様においては、CTLは二つ以上の細胞傷害性T細胞系でもよい。ま
た別の他の態様においては、CTLは前述の何れかの組み合わせでもよい。[0166] In one embodiment, the antigen-specific immune effector cell population is CD4 + and CD8
+ Wraps both T cells. In one aspect, the cytotoxic T cells (ie, CD8 + T cells) are polyclonal T cells isolated from the site of cytotoxic T cell infiltration of a subject. Or,
Such cells may be isolated from the site of cytotoxic T cell infiltration in two or more subjects or human patients, where the subjects share an MHC haplotype. In other embodiments, the CTL may be more than one cytotoxic T cell line. In yet another aspect, the CTL may be any combination of the foregoing.
【0167】 本発明の更なる側面においては、細胞傷害性T細胞浸潤の部位は腫瘍である。
細胞または細胞系が得られる腫瘍は、MHCハロタイプを共有した異なる個体の
同型の腫瘍またはMHCハロタイプを共有する異なる対象由来の異型の腫瘍であ
ることが可能である。In a further aspect of the invention, the site of cytotoxic T cell infiltration is a tumor.
The tumor from which the cell or cell line is obtained can be a homologous tumor of a different individual sharing the MHC haplotype or an atypical tumor from a different subject sharing the MHC haplotype.
【0168】 あるいは、CTL浸潤はウィルス性感染、自己免疫炎症、移植拒絶の部位、炎
症またはリンパ球/白血球浸潤の同様部位からであることが可能である。 上記記載されているように調製されたAPCは未処理の免疫効果細胞と混合さ
れている。好ましくは、細胞はサイトカイン(例えばIL2)の存在下で培養さ
れてもよい。樹状細胞はIL12等の有力な免疫刺激サイトカインを分泌するの
で、拡大の最初および連続した循環の間に補足的なサイトカインを付加すること
は必要ではないかもしれない。いずれにせよ、培養条件は抗原特異的な免疫効果
細胞がAPCよりはるかに高い効率で拡大する(即ち増殖する)というものであ
る。ハイブリドおよび所期のサイトカインの多数の融合は抗原特異的細胞の集団
をさらに拡大するために行われることが可能である。Alternatively, CTL infiltration can be from viral infections, autoimmune inflammation, sites of transplant rejection, inflammation or similar sites of lymphocyte / leukocyte infiltration. APC prepared as described above is mixed with untreated immune effector cells. Preferably, the cells may be cultured in the presence of a cytokine (eg, IL2). Because dendritic cells secrete potent immunostimulatory cytokines such as IL12, it may not be necessary to add supplemental cytokines during the initial and continuous circulation of expansion. In any case, the culture conditions are such that the antigen-specific immune effect cells expand (ie, proliferate) with much higher efficiency than APCs. Multiple fusions of hybrid and desired cytokines can be made to further expand the population of antigen-specific cells.
【0169】 一つの態様においては、免疫効果細胞はT細胞であり、そしてAPCによって
提示されている腫瘍特異的な抗原に特異的である。 本発明のポリペプチド抗原 本発明は、さらに本発明のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド抗
体を提供する。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるペプチド抗原は
、何れかの既知の方法によって産生されうる。本発明の単離されたペプチドは適
切な固相合成手順を使用して合成してよい。StewardおよびYoung、
Solid Phase Peptide Synthesis、Freema
ntle、San Francisco、Calif.(1968)。好ましい
方法はメリフィールド方法である。Merrifield、Recent Pr
ogress in Hormone Res、23:451(1967)。こ
れらのペプチドの抗原活性は、例えば本明細書中に記載されているようなアッセ
イの使用に簡便に試行されることも可能である。In one embodiment, the immune effector cells are T cells and are specific for a tumor-specific antigen presented by APC. The polypeptide antigen of the present invention The present invention further provides a peptide antibody encoded by the polynucleotide of the present invention. Peptide antigens encoded by the polynucleotides of the present invention can be produced by any known method. An isolated peptide of the invention may be synthesized using a suitable solid phase synthesis procedure. Steward and Young,
Solid Phase Peptide Synthesis, Freema
ntle, San Francisco, Calif. (1968). The preferred method is the Merrifield method. Merrifield, Recent Pr
ogreess in Horne Res, 23: 451 (1967). The antigenic activity of these peptides can be conveniently tested, for example, using an assay as described herein.
【0170】 一旦本発明の単離されたペプチドが得られたら、クロマトグラフィー(例えば
、イオン交換、親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心、差異
溶解性を含む標準的な手法、またはタンパク質精製のための何れかの他の標準的
な技術によって精製されることが可能である。免疫親和性クロマトグラフィーに
は、抗原決定基は、当該ペプチドまたは関連した本発明のペプチドに対して作成
され、そして定常支持体に付加された抗体を含む親和性カラムにそれを結合させ
ることにより分離されることができる。Once the isolated peptides of the present invention are obtained, standard techniques including chromatography (eg, ion exchange, affinity, and size column chromatography), centrifugation, differential solubility, or protein purification It can be purified by any other standard technique. For immunoaffinity chromatography, the antigenic determinant is separated by binding it to an affinity column containing the antibody created for the peptide or related peptide of the invention and attached to a constant support. Can be done.
【0171】 あるいは、ヘキサ−His(Invitrogen)、マルトース結合ドメイ
ン(New Ingland Biolabs)、インフルエンザコート配列(
Kolodziej et al.(1991)Methods Enzymo
l.194:508−509)、およびグルタチオンーS−トランスフェラーゼ
等の親和性タグを、適切な親和性カラムを通り抜けることによって容易に精製で
きるように、本発明のペプチドに付加してもよい。本発明のペプチドをコードす
る配列を含むDNAを用いたDNA親和性カラムは精製に使用されうる。Alternatively, hexa-His (Invitrogen), maltose binding domain (New England Biolabs), influenza coat sequence (
Kolodziej et al. (1991) Methods Enzymo
l. 194: 508-509) and glutathione-S-transferase may be added to the peptides of the invention so that they can be easily purified by passing through an appropriate affinity column. A DNA affinity column using DNA containing a sequence encoding the peptide of the present invention can be used for purification.
【0172】 単離されたペプチドはタンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶構造解析
等の技術を用いて物理的に特徴づけられることも可能である。 また本発明の範囲に含まれるのは、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、
アシル化、タンパク質切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの結合によ
って、翻訳中または後に差異的に修飾される抗原ペプチドである。。(Ferg
uson et al.(1998)Ann.Rev.Biochem.57:
285−320) 抗原特異性アッセイ 本明細書に記載されている免疫効果細胞は免疫応答を変化させる能力のために
選択される。ある側面においては、免疫効果細胞は特異的な抗原を発現する細胞
を溶解する能力および抗原に対する体液性応答を増加する能力の双方について、
ために選択される。細胞の細胞溶解能力は様々な方法(トリチウム化チミジン取
り込み(DNA合成を示す)、および例えばコロニーの同定による成長または増
殖の集団の調査を含むが、これに限られてはいない)によって測定されることが
可能である(WO 94/21287参照)。他の態様においては、テトラゾリ
ウム塩MTT(3−(4、5−ジメチル−チアゾルー2ーイル)−2、5−ジフ
ェニルテトラゾリウムブロマイド)が付加されることも可能である(Mossm
an(1983)J.Immunol.Methods65:55−63;Ni
ks and Otto(1990)J.Immunol.Methods13
0:140−151)。生存細胞のミトコンドリアに見られるコハク酸デヒドロ
ゲナーゼはMTTをホルマザンブルーに変換する。よって、濃縮された青色が代
謝活性細胞を示すと考えられる。同様に、タンパク質合成は35Sーメチオニンの
取り込みによって示されることが可能である。さらに他の実施態様においては、
古典的なクロム放出アッセイ等の細胞傷害性および細胞死滅アッセイは抗原決定
基(epitope)特異的なCCTL活性を評価するために採用されることが
可能である。他の適したアッセイも当該技術分野において知られであろう。抗原
に対する体液性応答の刺激はELISAおよびLIAを含む何れかの既知の方法
を用いて抗原特異的な産物によって測定されうる。[0172] The isolated peptide can also be physically characterized using techniques such as proteolysis, nuclear magnetic resonance, and X-ray crystallography. Also included in the scope of the present invention are, for example, phosphorylation, glycosylation, cross-linking,
An antigenic peptide that is differentially modified during or after translation by acylation, proteolytic cleavage, binding to an antibody molecule, membrane molecule or other ligand. . (Ferg
uson et al. (1998) Ann. Rev .. Biochem. 57:
285-320) Antigen Specificity Assay The immune effector cells described herein are selected for their ability to alter the immune response. In one aspect, the immune effector cells have both an ability to lyse cells expressing a specific antigen and an ability to increase a humoral response to the antigen,
Selected for. The cell lysing ability of a cell is measured by a variety of methods, including but not limited to tritiated thymidine incorporation (indicating DNA synthesis) and investigation of populations of growth or proliferation, eg, by colony identification. (See WO 94/21287). In another embodiment, the tetrazolium salt MTT (3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) can be added (Mossm).
an (1983) J. Am. Immunol. Methods 65: 55-63; Ni
ks and Otto (1990) J. Am. Immunol. Methods13
0: 140-151). Succinate dehydrogenase, found in mitochondria of living cells, converts MTT to formazan blue. Therefore, it is considered that the concentrated blue color indicates metabolically active cells. Similarly, protein synthesis can be indicated by incorporation of 35 S-methionine. In still other embodiments,
Cytotoxicity and cell killing assays, such as the classic chromium release assay, can be employed to assess epitopic-specific CCTL activity. Other suitable assays will be known in the art. Stimulation of a humoral response to an antigen can be measured by an antigen-specific product using any known method, including ELISA and LIA.
【0173】 本発明の組成物 本発明は上記に言及されたペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主
細胞、抗原提示細胞、免疫効果細胞、ベクター、抗体およびその断片、許容可能
な固体または液体の担体をの何れかを含む組成物を提供する。組成物が医薬的に
使用される際は、それらは「医薬的に許容可能な担体」と診断的および治療学的
使用に組み合わされる。これらの組成物はまた本発明の診断学的および免疫調節
方法のための薬剤の調製に使用されることが可能である。Compositions of the Invention The present invention relates to peptides, polypeptides, polynucleotides, host cells, antigen presenting cells, immune effectors, vectors, antibodies and fragments thereof as described above, acceptable solid or liquid carriers. A composition comprising any of the following is provided. When the compositions are used pharmaceutically, they are combined with a "pharmaceutically acceptable carrier" for diagnostic and therapeutic uses. These compositions can also be used in the preparation of a medicament for the diagnostic and immunomodulatory methods of the present invention.
【0174】 本発明のポリヌクレオチド、抗原提示細胞および免疫効果細胞の使用方法 本発明は本発明のポリヌクレオチドおよび宿主細胞(APCおよび教育された
免疫効果細胞を含む)、即ち免疫調節剤を使用する診断学的および免疫調節的方
法を提供する。Methods of Using the Polynucleotides, Antigen Presenting Cells and Immune Cells of the Invention The present invention uses the polynucleotides of the invention and host cells (including APCs and educated immune cells), ie, immunomodulators. Diagnostic and immunomodulatory methods are provided.
【0175】 診学的手方法 本発明は本発明のポリヌクレオチドおよびAPCを使用する診断的方法を提供
する。本方法は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原に結合す
る抗原特異的なCD4+および/またはCD8+の存在を検出するために使用さ
れることが可能である。Diagnostic Methods The present invention provides diagnostic methods using the polynucleotides and APCs of the present invention. The method can be used to detect the presence of antigen-specific CD4 + and / or CD8 + that binds to an antigen encoded by a polynucleotide of the invention.
【0176】 本発明の診断的方法は以下を含む。(1)本発明のポリヌクレオチドによって
コードされる抗原の効力を予測するアッセイ、(2)本発明のポリヌクレオチド
によってコードされる抗原および/または天然の対応物に特異的な免疫効果細胞
の前駆体頻度(即ち、存在および数)を決定するためのアッセイ、および(3)
一度本発明の免疫調節的方法において使用された場合、本発明のポリヌクレオチ
ドによってコードされる抗原の効力を決定するためのアッセイ。The diagnostic methods of the present invention include: (1) an assay that predicts the efficacy of the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention; (2) a precursor of an immune effector cell specific to the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention and / or its natural counterpart. Assay to determine frequency (ie presence and number), and (3)
An assay for determining the potency of an antigen encoded by a polynucleotide of the invention, once used in an immunomodulatory method of the invention.
【0177】 本発明の診断学的方法は一般的に、適切な条件下で、および本発明のポリヌク
レオチドによってコードされる抗原(通常は本発明のAPCによって提示される
)とCD4+またはCD8+T細胞等の免疫効果細胞の表面上のTCR等の免疫
効果分子との間に起こる特異的な結合をさせるのに十分な時間実施される。「適
切な条件」および「十分な時間」は一般的に特異的な結合に適した条件および時
間である。適切な条件は約4℃および約40℃の間、好ましくは約4℃および約
37℃の間で、緩衝化された溶液で、そして5および9の間のpH範囲において
生じる。様々な緩衝化された溶液は当該技術分野において知られており、本発明
の診断学的方法に使用されることが可能であり、そして非限定的にリン酸緩衝食
塩水を含むが、これに限られてはいない。結合および反応の十分な時間は、試料
を本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原に曝した後に、一般的に
約1秒から約24時間の間であると考えられる。The diagnostic methods of the invention generally involve, under appropriate conditions, and antigens encoded by the polynucleotides of the invention (usually presented by the APCs of the invention) and CD4 + or CD8 + T cells, etc. The effect is carried out for a time sufficient to allow specific binding to take place with the immune effector molecule such as TCR on the surface of the cell. "Suitable conditions" and "sufficient time" are generally those conditions and times appropriate for specific binding. Suitable conditions occur between about 4 ° C and about 40 ° C, preferably between about 4 ° C and about 37 ° C, in a buffered solution, and in a pH range between 5 and 9. Various buffered solutions are known in the art and can be used in the diagnostic methods of the invention, and include, but are not limited to, phosphate buffered saline. Not limited. Sufficient time for binding and reaction will generally be between about 1 second and about 24 hours after exposing the sample to the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention.
【0178】 ある態様においては、本発明は本発明のAPCによって提示された、本発明の
ポリヌクレオチドによってコードされる抗原効力を予測する診断学的アッセイを
提供する。これらの実施態様の何れかにおいては、定義されたT細胞抗原決定基
は、腫瘍およびウィルス性病原体を臨床的に特徴付け、あらかじめインビボワク
チン試行の予測された効力を決定するために使用されうる。これは定義されたT
細胞抗原決定基を刺激剤として使用する患者の末梢血単核細胞の簡便な増殖アッ
セイによって遂行されることが可能である。応答を導き出すペプチドは患者の可
能性のある(viable)ワクチン候補である。In one aspect, the invention provides a diagnostic assay for predicting the efficacy of an antigen encoded by a polynucleotide of the invention, presented by an APC of the invention. In any of these embodiments, the defined T cell antigenic determinants can be used to clinically characterize tumors and viral pathogens and determine the predicted efficacy of in vivo vaccine trials in advance. This is the defined T
It can be accomplished by a simple proliferation assay of peripheral blood mononuclear cells of patients using cell determinants as stimulants. The peptide that elicits the response is a potential vaccine candidate for the patient.
【0179】 他の実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗
原に特異的でありおよびそのために活性化される潜在能力を有する休止(未処理
の)免疫効果細胞の前駆体の頻度(即ち、存在および数)を決定するようなアッ
セイが提供される。これらの態様においては、本発明のポリヌクレオチドによっ
てコードされる抗原をその表面に持つ抗原提示細胞を用いて、天然の抗原決定基
に特異的に結合する免疫効果細胞の生物学的試料における存在を検出するために
使用される。機能的なアッセイが抗原特異的な免疫効果細胞を決定する(および
定量化する)ために使用される。実例としては、PBMCが腫瘍のある対象物か
ら分離される。これらのPBMCの試料は同対象物由来の腫瘍細胞と適切な時間
共に培養される。これらPBMCの第二の試料は、腫瘍の表面に発現されている
天然の抗原決定基に相当する本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗
原でパルスされた代理のAPCと共に適当な時間培養される。腫瘍細胞および代
理のAPC双方は51Crで荷重される。腫瘍細胞および抗原をパルスされた代
理のAPCからの51Crの放出量を比較することによって、腫瘍に特異的な免
疫効果細胞前駆体の頻度およびポリヌクレオチドによってコードされる抗原に特
異的な免疫効果細胞前駆体の頻度を決定することが可能である。機能的なアッセ
イは免疫効果細胞増殖、サイトカイン産生、APCの特異的な溶解を含むが、こ
れに限られてはいない。In another embodiment, the frequency of precursors of resting (untreated) immune effector cells that have the potential to be specific and activated for the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention Such assays for determining (ie, presence and number) are provided. In these embodiments, the presence of an immune effector cell that specifically binds to a natural antigenic determinant in a biological sample is determined using antigen-presenting cells having an antigen encoded by the polynucleotide of the present invention on the surface thereof. Used to detect. Functional assays are used to determine (and quantify) antigen-specific immune effector cells. Illustratively, PBMCs are separated from tumor-bearing objects. These PBMC samples are co-cultured with tumor cells from the same subject for an appropriate time. A second sample of these PBMCs is cultured for an appropriate period of time with a surrogate APC pulsed with an antigen encoded by a polynucleotide of the invention corresponding to a natural antigenic determinant expressed on the surface of the tumor. Both tumor cells and surrogate APC are loaded with 51Cr. By comparing the amount of 51Cr released from tumor cells and surrogate APCs pulsed with the antigen, the frequency of tumor-specific immune effector cell precursors and the immune effector cells specific for the antigen encoded by the polynucleotide It is possible to determine the frequency of the precursor. Functional assays include, but are not limited to, immune effect cell proliferation, cytokine production, specific lysis of APCs.
【0180】 他の態様においては、本発明の免疫調節的方法を含む免疫調節的方法の効力は
、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原および/またはその天然
の対応物に対する免疫応答を調節する際に、本発明の診断学的アッセイを使用し
て試験されることが可能である。これらの診断学的アッセイは免疫治療剤の効力
を査定または測定するためにも有用である。これらの実施態様の何れかにおいて
は、本方法は、活性化CD4+またはCD8+T細胞である可能性があり、本発
明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原に曝された結果として活性化ま
たはアネルギー化されている免疫効果細胞の検出を可能にする。対象物由来の細
胞を含む試料は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗原に結合し
た結果として活性化またはアネルギー化されているCD4+またはCD8+T細
胞の存在を試験されることが可能である。ある実施態様においては、本方法は以
下の工程を含む。(a)本発明のポリペプチドによってコードされる抗原をその
表面にI型およびII型MHC分子に結合させて提示している固定されたAPC
を、適した条件下およびペプチドに特異的な抗原受容体をその表面に持つ免疫効
果細胞の結合を可能にするのに十分な時間、生物学的試料と接触させること、そ
れによって抗原特異的免疫効果細胞を固定すること、および(b)固定された免
疫効果細胞を、免疫効果細胞に特異的に結合する抗体等の検出可能に標識された
分子と接触させること。他の実施態様においては、本方法は以下の工程を含む。
(a)本発明のポリペプチドによってコードされる抗原をその表面にI型および
II型MHC分子に結合させて提示している固定された抗原特異的マトリックス
を、適した条件下およびペプチドに特異的な抗原受容体をその表面に持つ免疫効
果細胞の結合を可能にするのに十分な時間、生物学的試料と接触させること、そ
れによって抗原特異的免疫効果細胞を固定すること、および(b)固定された免
疫効果細胞上で機能的なアッセイを遂行すること。一度免疫効果細胞が本発明の
ポリペプチドによってコードされる抗原をその表面に提示している固定されたA
PCに結合されたならば、それはCD4、CD8、および活性化T細胞に特異的
な細胞表面標識(これに限らないが)を含めた特徴的な細胞表面分子を基として
標識されることが可能である。免疫効果細胞集団に特異的な様々な細胞表面標識
は当該技術分野において知られており、そして多数の刊行物に記載されている。
例えば、The Leukocyte Antigen Facts Book
、Barclay et al.eds.,1995,Academic Pr
ess参照。これらの標識の抗体はとりわけBeckman Coulterか
ら商業的に入手可能である。固定された免疫効果細胞はまた、与えられた活性化
またはアネルギー状態における与えられたT細胞の特徴であるサイトソルにおけ
るmRNAおよび/またはタンパク質の存在によって特徴づけられることが可能
である。特徴的なmRNAはポリメラーゼ連鎖反応を含む(これに限らないが)
何れかの既知の方法によって検出されることが可能である。細胞表面標識に検出
可能に標識された抗体は、適切な条件下および特異的な結合を可能にするのに十
分な時間、固定された免疫効果細胞に接触されることが可能である。もし必要ま
たは望ましいならば、標識された細胞は非結合標識から物理的に除去されること
が可能であり、および過剰な非結合標識は不活性化されることが可能である。免
疫効果細胞上の細胞表面標識に特異的な抗体に要求されることは、抗体が特異的
に結合するということとおよび抗体はTCRおよび固定された合成抗原ペプチド
抗原決定基の間の結合を干渉しないということである。In another aspect, the efficacy of an immunomodulatory method, including an immunomodulatory method of the invention, modulates an immune response to an antigen encoded by a polynucleotide of the invention and / or its natural counterpart. In some cases, it can be tested using the diagnostic assays of the present invention. These diagnostic assays are also useful for assessing or measuring the efficacy of an immunotherapeutic agent. In any of these embodiments, the method can be an activated CD4 + or CD8 + T cell, which is activated or anergized as a result of exposure to an antigen encoded by a polynucleotide of the invention. Allows the detection of certain immune effector cells. A sample containing cells from the subject can be tested for the presence of CD4 + or CD8 + T cells that have been activated or anergized as a result of binding to an antigen encoded by a polynucleotide of the invention. In one embodiment, the method includes the following steps. (A) Immobilized APC presenting the antigen encoded by the polypeptide of the present invention on its surface by binding to type I and type II MHC molecules
Contacting the biological sample under suitable conditions and for a time sufficient to allow the binding of immune effect cells having an antigen receptor specific for the peptide on its surface, thereby allowing antigen-specific immunization Fixing the effector cells and (b) contacting the immobilized immune effector cells with a detectably labeled molecule such as an antibody that specifically binds to the immune effector cells. In another embodiment, the method comprises the following steps.
(A) an immobilized antigen-specific matrix presenting the antigen encoded by the polypeptide of the invention bound to its surface with type I and type II MHC molecules, under suitable conditions and peptide-specific Contacting the biological sample with a biological sample for a time sufficient to allow binding of immune effector cells having a unique antigen receptor on its surface, thereby immobilizing antigen-specific immune effector cells; and (b) Performing a functional assay on fixed immune effector cells. Once the immune effector cells present on their surface the antigen encoded by the polypeptide of the invention, the immobilized A
Once bound to PC, it can be labeled based on characteristic cell surface molecules, including but not limited to CD4, CD8, and cell surface labels specific for activated T cells It is. Various cell surface labels specific for immune effector cell populations are known in the art and have been described in numerous publications.
For example, The Leukocyte Antigen Facts Book
Barclay et al. eds. , 1995, Academic Pr
See ess. Antibodies with these labels are commercially available, inter alia, from Beckman Coulter. Fixed immune effector cells can also be characterized by the presence of mRNA and / or protein in the cytosol, which is characteristic of a given T cell in a given state of activation or anergy. Characteristic mRNAs include (but are not limited to) the polymerase chain reaction
It can be detected by any known method. The antibody detectably labeled on the cell surface label can be contacted with the immobilized immune effector cells under appropriate conditions and for a time sufficient to allow specific binding. If necessary or desirable, the labeled cells can be physically removed from the unbound label, and excess unbound label can be inactivated. The requirement for an antibody specific for cell surface labeling on immune effect cells is that the antibody binds specifically and that the antibody interferes with the binding between the TCR and the immobilized synthetic antigenic peptide antigenic determinant. It is not.
【0181】 用いられ得る標識は当該技術分野の当業者に知られており、蛍光体、放射性同
位元素、発色基、および磁性粒子のような従来の標識物質を含むがそれらに限定
されない。酵素標識はルシフェラーゼ、例えば、Aequorea victo
ria由来のGFPまたは当該技術分野に知られた多用なGFPのうちのいずれ
かのような緑色蛍光タンパク質(GFP)、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼを含むがそれらに限定されない。例えば
Current Protocols in Molecular Biolo
gy (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, および定期的改訂版)を参照せよ。直接または間接的に標識を検出する任意の
試験が本発明における使用に適する。試験は、比色定量、蛍光または発光定量試
験、放射免疫試験またはその他の免疫学的試験を含む。Labels that can be used are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, conventional labeling substances such as phosphors, radioisotopes, chromophores, and magnetic particles. The enzyme label may be luciferase, eg, Aequorea victo
green fluorescent protein (GFP), such as GFP from ria or any of the many GFPs known in the art, β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase. For example, Current Protocols in Molecular Biolo
gy (FM Ausubel et al., eds., 1987, and periodic revisions). Any test that detects the label, directly or indirectly, is suitable for use in the present invention. Tests include colorimetric, fluorimetric or luminescent, radioimmunoassays or other immunological tests.
【0182】 免疫調節方法 本発明は、個体において本発明のポリペプチドによりコードさ
れる抗原、即ち対応する天然のエピトープに対する免疫応答を調節しする方法を
提供する。本発明の免疫調節法は、対象内での免疫応答を誘導または増大をもた
らす方法および、抑圧または減少させる方法を含み、対象に有効な量の本発明の
プリヌクレオチドまたはAPC、または免疫効果細胞を、ペプチド抗原に対する
免疫応答(またはその欠如)に対する望ましい影響をもたらすような処方または
条件下で、投与する方法を含む。本発明の免疫調節法は、ワクチン法、養子免疫
治療、およびT細胞不応答性またはアネルギーを誘導する方法を含む。Immunomodulatory Methods The present invention provides methods for modulating an immune response in an individual to an antigen encoded by a polypeptide of the present invention, ie, the corresponding natural epitope. The immunomodulation methods of the present invention include methods of inducing or increasing an immune response in a subject, and methods of suppressing or decreasing the immune response, wherein the subject is provided with an effective amount of a polynucleotide or APC of the present invention or an immune effector cell. And administration under conditions or conditions that produce the desired effect on the immune response (or lack thereof) to the peptide antigen. The immunomodulation methods of the invention include vaccine methods, adoptive immunotherapy, and methods of inducing T cell unresponsiveness or anergy.
【0183】 T細胞活性化を評価する様々な方法が知られている。CTL活性化は、トリチ
ウム化されたチミヂンの取り込み(DNA合成の指標)、および、例えばコロニ
ーの同定のような集団の生育または増殖についての個数検査を含むがそれらに限
定されない、任意の既知の方法により検出され得る。あるいは、テトラゾリウム
塩MTT(3−(4,5−ジメチル−2−タゾーリル)−2,5−ジフェニル
テトラゾリウム ブロマイド)が加えられ得る。 Mossman(1983)
J.Immunol. Methods 65:55−63;Niks and
Otto (1990) J.Immunol.Methods 130:1
40−151。生存している細胞のミトコンドリアに見られるコハク酸デヒドロ
ゲナーゼはMTTをフォルマザンブルーに変換する。したがって、濃縮された青
色が代謝的に活性のある細胞を示し得る。さらに別の態様においては、例えばト
リチウム化チミジンのような放射性標識の取り込みが検査され、細胞増殖が示さ
れ得る。同様に、タンパク質合成は35S−メチオニンの取り込みにより示され得
る。さらに別の態様においては古典的なクロミウム放出試験のような細胞傷害性
および細胞殺傷試験が、エピトープ特異的CTL活性化の評価に用いられ得る。
CD4+T細胞の活性化を検出するために、サイトカイン生産の測定、および例
えばトリチウム化されたチミジンの取り込みによる増殖の測定を含むがそれらに
限定されない、多様な方法のいずれかが用いられ得る。Various methods for assessing T cell activation are known. CTL activation may be performed by any known method, including but not limited to tritiated thymidine incorporation (an indicator of DNA synthesis), and number testing for population growth or growth, such as, for example, colony identification. Can be detected by Alternatively, tetrazolium salt MTT (3- (4,5-dimethyl-2-tazolyl) -2,5-diphenyl
Tetrazolium bromide) can be added. Mossman (1983)
J. Immunol. Methods 65: 55-63; Niks and
Otto (1990) Immunol. Methods 130: 1
40-151. Succinate dehydrogenase, found in the mitochondria of living cells, converts MTT to formazan blue. Thus, a concentrated blue color may indicate metabolically active cells. In yet another embodiment, incorporation of a radiolabel, such as, for example, tritiated thymidine, can be tested to indicate cell proliferation. Similarly, protein synthesis may be indicated by incorporation of 35 S-methionine. In yet another embodiment, cytotoxicity and cell killing tests, such as the classic chromium release test, can be used to assess epitope-specific CTL activation.
Any of a variety of methods can be used to detect activation of CD4 + T cells, including, but not limited to, measuring cytokine production and proliferation, for example, by incorporation of tritiated thymidine.
【0184】 標識された標的細胞からの51Crの放出は、生物学的試料中におけるペプチド
特異的CTLの数を見積もるために用いられ得る標準的な試験である。腫瘍細胞
または本発明のAPCは、標的と同様に、約200μCiのNa2 51CrO4 で37℃で60分間放射標識され、続いて洗浄された。T細胞および標的細胞(
〜1x104/ウェル)が、様々なエフェクター、標的比で96ウェルU−底プ
レート中で組み合わせられた。プレートは100xgで5分間遠心分離され、細
胞接触が開始され、4−16時間37℃で5%CO2とともに放置された。上清 中の51Crの放出が決定され、T細胞の不在(負の対照)または0.1%TRI
TONTM X−100(正の対照)と共に放置された標的と比較された。例えば
Mishell および Shigi,eds.Selected Metho
ds in Cellular Immunology (1980)W.H.
Freeman and Coを見よ。The release of 51 Cr from labeled target cells is a standard test that can be used to estimate the number of peptide-specific CTL in a biological sample. Tumor cells or APCs of the invention were radiolabeled with approximately 200 μCi of Na 2 51 CrO 4 at 37 ° C. for 60 minutes, followed by washing, as were the targets. T cells and target cells (
11 × 10 4 / well) were combined in a 96-well U-bottom plate with various effectors, target ratios. Plates were centrifuged at 100 × g for 5 minutes, cell contact was initiated and left for 4-16 hours at 37 ° C. with 5% CO 2 . The release of 51 Cr in the supernatant was determined and the absence of T cells (negative control) or 0.1% TRI
Compared to targets left with TON ™ X-100 (positive control). See, eg, Mishell and Shigi, eds. Selected Metho
ds in Cellular Immunology (1980) H.
See Freeman and Co.
【0185】 本発明のAPCの処方は望まれる結果によって異なり得る。一般的に、クラス
IおよびクラスIIMHC分子によりAPC上に、適切な共刺激分子とともに提
示されたペプチドはペプチドに対する免疫応答の誘導をもたらし得る。Tリンパ
球におけるアネルジー性(または非反応性の)状態はその表面に適切なMHC分
子を含むが適切な共刺激分子を持たない本発明のAPCによる抗原の提示によっ
て誘導され得る。The formulation of the APC of the present invention may vary depending on the desired result. In general, peptides presented on APCs by class I and class II MHC molecules with appropriate costimulatory molecules can result in the induction of an immune response to the peptide. The anergic (or non-reactive) state in T lymphocytes can be induced by the presentation of antigen by the APCs of the present invention containing the appropriate MHC molecules on their surface but without the appropriate costimulatory molecules.
【0186】 本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子輸送ビヒクル中で、または宿主細胞に挿
入されることで投与され、さらに組変えによりコードされたポリペプチドが転写
、翻訳および、加工され得る。医薬的に許容可能な担体中の、本発明のポリヌク
レオチドを含む単離された細胞は適切かつ有効な量のアジュバンド、サイトカイ
ン、または効果的なワクチン療法のための共刺激分子と組み合わせられ得る。い
くつかの態様においては、宿主細胞は、樹状細胞のようなAPCで有り得る。宿
主細胞は、適切な量のサイトカインおよび共刺激分子のいずれかまたは両方をコ
ードする、ポリヌクレオチドを挿入することにより、さらに修飾され得る。A polynucleotide of the present invention can be administered in a gene transfer vehicle or inserted into a host cell, and the recombinantly encoded polypeptide can be transcribed, translated, and processed. Isolated cells comprising a polynucleotide of the present invention in a pharmaceutically acceptable carrier can be combined with an appropriate and effective amount of an adjuvant, cytokine, or costimulatory molecule for effective vaccination. . In some embodiments, the host cell can be an APC, such as a dendritic cell. Host cells can be further modified by inserting a polynucleotide that encodes an appropriate amount of either or both of the cytokine and the costimulatory molecule.
【0187】 本発明の方法は、対象に、有効な量のサイトカインまたは共刺激分子を共投与
することでさらに修飾され得る。 本明細書にその意図された目的に有効なものとして提供される薬剤は、本発明
の免疫調節胞により治療されるべき疾患を有する対象またはそのような疾患に罹
患しやすい、または発生する危険のある個体に、投与され得る。試薬が、マウス
、ラット、またはヒトの患者のような対象に投与される場合、試薬は、医薬的に
許容可能な担体に加えられ、対象に対して全身投与または局所投与され得る。臨
床的な投与量は経験的に決定され、治療される病理または条件、治療される対象
、および治療の効率および有害性によって異なりえる。The methods of the present invention can be further modified by co-administering an effective amount of a cytokine or costimulatory molecule to the subject. An agent provided herein as effective for its intended purpose may be a subject having a disease to be treated by an immunomodulatory vesicle of the invention or a subject at risk of developing or at risk of developing such a disease. It can be administered to an individual. When the reagent is administered to a subject, such as a mouse, rat, or human patient, the reagent can be added to a pharmaceutically acceptable carrier and administered systemically or locally to the subject. Clinical dosages are empirically determined and may vary with the pathology or condition being treated, the subject being treated, and the efficiency and harm of the treatment.
【0188】 本発明のポリヌクレオチド、またはAPC、または免疫効果細胞の量は、部分
的には、意図される効果に依存し、究極的には医療または家畜医療の実践者の裁
量によって異なりえる。考慮されるべき要因は、治療される状況、投与の経路、
および組成物の性質、哺乳類の体重、体表部、年齢、および一般的な状態および
投与される特定のペプチドを含む。細胞が一旦投与された後、疾患の症状または
腫瘍質量の減少等の臨床的な応答の観察がなされる。投与は、例えば月ごとまた
は適切な様に繰り返されえる。当業者は、適切な投与治療が内科医または家畜医
療の実践者の裁量のもとになされることに同意しえる。The amount of the polynucleotide, or APC, or immune effector cell of the present invention will depend, in part, on the intended effect, and may ultimately vary at the discretion of the medical or veterinary practitioner. Factors to consider are the condition being treated, the route of administration,
And the nature of the composition, body weight, body surface, age, and general condition of the mammal and the particular peptide being administered. Once the cells have been administered, an observation of a clinical response such as disease symptoms or a decrease in tumor mass is made. Administration can be repeated, for example, monthly or as appropriate. Those of skill in the art can agree that appropriate dosing treatment will be at the discretion of the physician or veterinary practice.
【0189】 in vivoでの投与は、治療のあいだ連続的または断続的にある投与量で
効果を受けえる。最も効果的な投与法および投与量を決定する方法は当業者によ
く知られており、治療に用いられる組成物、治療の目的、治療される標的細胞、
および治療される対象によって異なりえる。単一または複数投与が、投与量およ
び治療する医師の選択した方法により、行われえる。適切な投与量処方および薬
剤を投与する方法が以下に示されえる。In vivo administration can be effected at certain doses, either continuously or intermittently during treatment. The most effective methods of administration and determination of dosage are well known to those skilled in the art,
And the subject to be treated. Single or multiple administrations can be carried out depending upon the dose and the method selected by the treating physician. Appropriate dosage formulations and methods of administering the drug may be set forth below.
【0190】 本発明の薬剤および組成物は医薬品の製造において用いられ得、ヒトおよび他
の動物の治療のためには、医薬組成物中の有効成分の様な慣用的な手法と共に投
与することで用いられえる。The medicaments and compositions of the present invention may be used in the manufacture of a medicament, for the treatment of humans and other animals, by administration with conventional means, such as the active ingredient in a pharmaceutical composition. Can be used.
【0191】 特に、本明細書において有効成分とも呼ばれる本発明の薬剤は、経鼻、局所的
(経皮、エアロゾル、経口(buccal)および舌下(sublingual
)を含む)、非経口的(皮下、筋内、静脈内および皮内を含む)および肺を含む
任意の適切な経路で、治療のために投与されえる。望ましい経路は受容者の状態
および年齢、および治療される疾患または条件により異なりえる。 癌治療および予防のためのワクチン 一つの態様において、本発明の免疫調節法は癌治療のためのワクチンを含む。
癌細胞は、免疫系によって潜在的に認識されえる多くの新しい抗原を含む。エピ
トープが同定される速度が与えられると、固形腫瘍をもつ患者からTILが単離
され、そのMHC拘束が決定され、、反応性エピトープのための適切なライブラ
リーに対するこれらのCTLが検査され、影響された個体に対する、個別の抗癌
ワクチンが作成されえる。これらのワクチンは、影響を受けた個体に対する治療
、および再発(またはその病気に対する家族性遺伝的危険性ををもつ患者におけ
る疾患の発生)に対する予防治療の両方になりえる。多くの場合高親和性ペプチ
ドが免疫原性であることが、機能性のT細胞レパートリーの穴は、あったとして
も比較的まれであることを示唆するため、腫瘍抗原特異的CTL応答が引き起こ
されていないとしても、癌になったことのない個体への予防接種は、予防治療と
して成功することが期待される(Sette et al. (1994) J
.Immunol., 153:5586−5592)。マウスにおいては、適
切なエピトープによるワクチン投与は、確立した腫瘍を除去するだけでなく、そ
うでなければ致死となる量の腫瘍細胞が与えられた後の腫瘍の再発に対しての防
御も行う。(Bystryn et al. (1993) Supra. 病原性生物により引き起こされる腫瘍に対するワクチン 本発明のポリヌクレオチドおよびAPCは病原性生物に対する免疫応答を誘導
(または増大または増強)するのにも有用である。これらは病原性ウィルス、細
菌、および原生生物を含む。In particular, the agents of the present invention, also referred to herein as active ingredients, may be administered nasally, topically (dermal, aerosol, buccal, and sublingual).
)), Parenterally (including subcutaneous, intramuscular, intravenous and intradermal) and pulmonary, by any suitable route. The desired route may vary depending on the condition and age of the recipient, and the disease or condition being treated. Vaccines for Cancer Treatment and Prevention In one embodiment, the immunomodulatory methods of the invention include a vaccine for cancer treatment.
Cancer cells contain many new antigens that can potentially be recognized by the immune system. Given the rate at which epitopes were identified, TILs were isolated from patients with solid tumors, their MHC restriction was determined, and their CTLs against the appropriate library for reactive epitopes were examined and affected. Individual anti-cancer vaccines can be made for the given individuals. These vaccines can be both a treatment for affected individuals and a prophylactic treatment for recurrence (or the occurrence of disease in patients with a familial genetic risk for the disease). In many cases, the immunogenicity of high affinity peptides suggests that holes in the functional T cell repertoire are relatively rare, if any, and thus elicit a tumor antigen-specific CTL response. If not, vaccination of individuals who have never had cancer is expected to be successful as a preventive treatment (Sette et al. (1994) J.
. Immunol. , 153: 5586-5592). In mice, vaccination with the appropriate epitope not only removes established tumors, but also protects against tumor recurrence after otherwise lethal amounts of tumor cells are given. (Bystryn et al. (1993) Supra. Vaccine Against Tumors Caused by Pathogenic Organisms) The polynucleotides and APCs of the invention are also useful for inducing (or increasing or enhancing) an immune response against pathogenic organisms. Include pathogenic viruses, bacteria, and protozoa.
【0192】 ウィルス感染は免疫治療に対する理想的な候補である。ウィルス病原に対する
免疫学的応答はAIDSを引き起こすHIVのようなレンチウィルスの場合のよ
うに、効果が無いことがある。高い頻度の自発的突然変異がこれらのウィルスを
免疫系から逃れるようにしている。しかしながら、感染した細胞上に提示された
CTLエピトープの飽和した性質が、突然変異に対しとても不寛容である必須遺
伝子における異なる多型の間に保存された抗原を同定し、より効率的なワクチン
の設計を可能にする。[0192] Viral infection is an ideal candidate for immunotherapy. Immunological responses to viral pathogens may be ineffective, as in the case of lentiviruses such as HIV, which cause AIDS. The high frequency of spontaneous mutations allows these viruses to escape the immune system. However, the saturating nature of CTL epitopes displayed on infected cells has identified antigens conserved between different polymorphisms in essential genes that are very intolerant to mutations, making a more efficient vaccine Enable design.
【0193】 養子免疫治療法 抗原特異的免疫効果細胞の拡大された集団および本発明のAPCには養子免疫
治療における利用およびワクチンとしての利用が見い出しえる。Adoptive Immunotherapy The expanded population of antigen-specific immune effect cells and the APCs of the invention find use in adoptive immunotherapy and as a vaccine.
【0194】 応用免疫治療法は、一つの側面においては、上記のAPCと共に未処理の免疫
効果細胞を培養することで作成された、教育された、抗原特異的免疫効果細胞の
、有意に純粋な集団を対象に投与することを含む。いくつかの態様においてはA
PCは樹状細胞である。Applied immunotherapies, in one aspect, comprise the production of educated, antigen-specific immune effector cells, produced by culturing untreated immune effector cells with the APCs described above, in a substantially pureer manner. Administering a population to a subject. In some embodiments, A
PC is a dendritic cell.
【0195】 一つの態様においては、本明細書に記載された養子免疫治療法は自家的である
。この場合、単一の対象から単離された親細胞を用いてAPCが作成される。拡
大された集団もまた、その対象から単離されたT細胞を用いる。最後に、抗原特
異的細胞の拡大された集団が同一の患者に投与される。In one embodiment, the adoptive immunotherapy described herein is autologous. In this case, an APC is created using parental cells isolated from a single subject. The expanded population also uses T cells isolated from the subject. Finally, the expanded population of antigen-specific cells is administered to the same patient.
【0196】 さらなる態様において、APCまたは免疫効果細胞は、有効な量のIL−2の
ような刺激性サイトカインまたは共刺激性分子とともに投与される。 T細胞アネルギーを誘導する方法 本発明の合成抗原ペプチドエピトープはT細胞不反応性またはアネルギーを誘
導する方法において有用である。これらの方法を用いて治療され得る障害は、自
己免疫障害、アレルギー、および同種異系移植拒否反応を含む。In a further aspect, the APC or immune effector cells are administered with an effective amount of a stimulatory cytokine or costimulatory molecule such as IL-2. Methods for Inducing T Cell Anergy The synthetic antigenic peptide epitopes of the invention are useful in methods for inducing T cell inactivity or anergy. Disorders that can be treated using these methods include autoimmune disorders, allergies, and allogeneic transplant rejection.
【0197】 自己免疫損傷は、肉体の免疫系が自己の組織に対して応答する疾患である。こ
れらは、関節炎、潰瘍性結腸炎、および多発性硬化症を含む。異物として認識さ
れる内在性因子に対応する抗原をコードする本発明のポリヌクレオチドは遺伝子
治療またはその他の手法を用いた治療の発達において用いられ得る。Autoimmune damage is a disease in which the body's immune system responds to its own tissues. These include arthritis, ulcerative colitis, and multiple sclerosis. Polynucleotides of the invention that encode antigens corresponding to endogenous factors that are recognized as foreign can be used in the development of therapy using gene therapy or other techniques.
【0198】 例えば、自己免疫を媒介するCTLに対する”自殺基質”として働き得る合成
CTL エピトープが、上記のように設計され得る。いわば、MHCアリルに対する高い
親和性を持つが、TCRを活性化することができないペプチドが、問題の抗原を
提示している細胞に対する細胞免疫応答を、効率的にマスクしうる。この手法の
補助として、HIVウィルスの長い潜伏期間が抗ウィルス免疫応答によるもので
あり、ウィルスが最終的に免疫系から逃れる機構は、MHC分子を占めるが、T
CR溶解性応答を刺激しないエピトープを作成することによってT細胞アネルギ
ーを誘導することであると信じられている。Klenerman et al.
(1995) Eur, J. Immunol., 25:1627−19
31。For example, synthetic CTL epitopes that can serve as “suicide substrates” for CTLs that mediate autoimmunity can be designed as described above. In a way, peptides with high affinity for MHC alleles, but which cannot activate the TCR, can effectively mask the cellular immune response against cells presenting the antigen in question. As an aid to this approach, the long latency period of the HIV virus is due to the antiviral immune response, and the mechanism by which the virus eventually escapes the immune system is occupied by MHC molecules.
It is believed to induce T cell anergy by creating epitopes that do not stimulate the CR lytic response. Klennerman et al.
(1995) Eur, J .; Immunol. , 25: 1627-19.
31.
【0199】 T細胞−抗原受容体複合体およびCD3単独を介した、他の信号の非存在下で
のT細胞のin vivoでの刺激は、T細胞アネルギーまたは麻痺を誘導する
。インターロイキン−2生産およびin vitroでの増殖によって測定され
るT細胞の活性化は、抗原特異的T細胞および抗原定時細胞の間の細胞間相互作
用により引き起こされる、抗原性および共刺激性信号の両方を必要とする。T細
胞表面のこれらのCD2タンパク質のCD58(LFA−3)タンパク質および
抗原提示細胞の相互作用、CD11a/CD18(LFA−1)タンパク質のC
D54(ICAM−1)タンパク質との相互作用、およびCD5タンパク質のC
D72タンパク質との相互作用といった様々な相互作用はそのようなin vi
troの共刺激信号を与え得る。抗原提示細胞由来のサイトカイン(例えばイン
ターロイキン−1およびインターロイキン−6)もまた、in vitroでの
T細胞活性化をもたらす共刺激信号を提供し得る。抗原性および共刺激信号の両
方の輸送は、インターロイキン−2遺伝子および他の中心的なT細胞活性化遺伝
子の安定な転写をもたらす。前述の共刺激信号はプロテインキナーゼCおよびカ
ルシウムに依存する。潜在的な抗原提示細胞はCD80(B7およびBB1)お
よびその他の関連する表面タンパク質を発現し、多くのT細胞はCD28および
CDLA−4といったB7結合タンパク質を発現する。CD28およびCDLA
−4によるCD80の結合はプロテインキナーゼCおよびカルシウムに依存しな
い共刺激経路を刺激し、活発なT細胞増殖をもたらす。B細胞の刺激もまた特異
的な抗原と細胞表面免疫グロブリンの間の相互作用に依存する。T細胞に由来す
るサイトカイン(例えばインターロイキン1および4)、特異的な受容体および
共受容体の特異的な対を通じたT細胞とB細胞の物理的な接触、またはその療法
が、B細胞の刺激に必須な信号または信号群を提供する。In vivo stimulation of T cells in the absence of other signals via the T cell-antigen receptor complex and CD3 alone induces T cell anergy or paralysis. Activation of T cells, as measured by interleukin-2 production and proliferation in vitro, is responsible for the generation of antigenic and costimulatory signals caused by cell-cell interactions between antigen-specific T cells and antigen-timed cells. You need both. Interaction of CD58 (LFA-3) protein of these CD2 proteins and antigen presenting cells on the surface of T cells, C of CD11a / CD18 (LFA-1) protein
Interaction with D54 (ICAM-1) protein and C5 of CD5 protein
Various interactions, such as interactions with the D72 protein, are such in vivo
tro may be provided. Cytokines from antigen presenting cells (eg, interleukin-1 and interleukin-6) can also provide a costimulatory signal that results in T cell activation in vitro. Transport of both antigenic and costimulatory signals results in stable transcription of the interleukin-2 gene and other central T cell activation genes. The aforementioned costimulatory signals are dependent on protein kinase C and calcium. Potential antigen presenting cells express CD80 (B7 and BB1) and other related surface proteins, and many T cells express B7 binding proteins such as CD28 and CDLA-4. CD28 and CDLA
Binding of CD80 by -4 stimulates a costimulatory pathway that is independent of protein kinase C and calcium, leading to active T cell proliferation. B cell stimulation also depends on the interaction between specific antigens and cell surface immunoglobulins. T cell-derived cytokines (eg, interleukins 1 and 4), physical contact of T cells with B cells through specific pairs of specific receptors and co-receptors, or therapies, Provides the signal or signals required for stimulation.
【0200】 慣用的な投与の経路が用いられる。T細胞を刺激する、またはアネルギーを産
する量(または上記のような治療上有効な量)の、本発明による免疫治療抗原−
スーパー抗原多量体は標的細胞に接触させられる。”T細胞のアネルギーを産す
る量”は、TCRによって媒介される細胞活性の、統計的に有意な阻害を産する
ことに有効な量を意図する。これは、T細胞活性化試験を用いていインビトロで
分析されうる。典型的には、T細胞アネルギーまたは活性化は、特異的な抗原に
対する応答としてのトリチウム化されたチミジンの取り込みによって検査される
。Conventional routes of administration are used. An immunotherapeutic antigen according to the invention in an amount that stimulates T cells or produces anergy (or a therapeutically effective amount as described above)-
The superantigen multimer is contacted with a target cell. "T cell anergy producing amount" intends an amount effective to produce a statistically significant inhibition of TCR mediated cellular activity. This can be analyzed in vitro using a T cell activation test. Typically, T cell anergy or activation is tested by incorporation of tritiated thymidine in response to a specific antigen.
【0201】 T細胞アネルギーが誘導され得る一つの方法は、MHCクラスIまたはクラス
II分子中に抗原を提示するが、T細胞を活性化するのに必要な共刺激分子を欠
いたAPCをT細胞に提示することである。例えば、それに対するT細胞クロー
ンが限定されているMHC抗原によって形質転換された、その他は正常な抗原提
示細胞(APC)である細胞が用いられ得る。APC以外の細胞宿主に形質転換
されたMHCとの関連において休止T細胞によって認識される適切なペプチドが
、休止T細胞に与えられる。クラスIIまたはMHCクラスI分子のαおよびβ
鎖を、不変鎖とともに常に発現する遺伝子を持つ、抗原提示細胞以外の哺乳類細
胞の導入の結果としてMHCが発現される。重要なことには、これらの細胞は、
MHCおよびペプチドが一緒になって共刺激信号をもたらす、抗原提示細胞に関
連した細胞表面タンパク質または分泌タンパク質のいずれかである、他のタンパ
ク質を提供しない。One way in which T cell anergy can be induced is to present APCs that present antigen in MHC class I or class II molecules but lack the costimulatory molecules necessary to activate T cells. It is to present to. For example, cells that have been transformed by an MHC antigen for which the T cell clone has been defined, and that are otherwise normal antigen presenting cells (APCs), may be used. Appropriate peptides recognized by resting T cells in the context of MHC transformed into cellular hosts other than APCs are provided to resting T cells. Α and β of class II or MHC class I molecules
MHC is expressed as a result of the introduction of a mammalian cell other than an antigen presenting cell that has a gene that constantly expresses the chain together with the invariant chain. Importantly, these cells
MHC and peptides do not provide other proteins, either cell surface proteins or secreted proteins associated with antigen presenting cells, that together provide a costimulatory signal.
【0202】 アネルギーが誘導されていることを決定するために、試験されるT細胞は、T
細胞の活性化に必要な共刺激分子と共にMHCクラスIおよびクラスII中に、
本発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗原を提示するAPCと共に培養
してもよい。培養物は48時間インキュベートされ、トリチウム化されたチミジ
ンによってパルス処理され、約18時間後に取り込みが測定された。T細胞が制
限されていないMHCを用いているため、またはT細胞が感受性でないペプチド
を用いているために、T細胞を刺激しない抗原提示細胞が、T細胞に提示されて
いる時の、対照以上の取り込みがない事は、活性化が無いことを示す。IL−2
、−3、または−4の検査、例えばCD71のような活性化に伴う細胞表面タン
パク質などの検査、またはその他の簡便な技術のような、活性化の程度を決定す
るその他の慣用的な検査を用い得る。別の方法は静止T細胞上に発現しているが
、アネルギー性T細胞には発現していないタンパク質の発現を決定することであ
る。米国特許番号5,747,299。To determine that anergy is being induced, the T cells tested are
In MHC class I and class II with costimulatory molecules required for cell activation,
The cells may be cultured with APCs presenting the antigen encoded by the polynucleotide of the present invention. Cultures were incubated for 48 hours, pulsed with tritiated thymidine, and uptake was measured after about 18 hours. Antigen-presenting cells that do not stimulate T cells, because they use MHC that is not restricted or that use peptides that are insensitive, are better than controls when presented to T cells. No uptake indicates no activation. IL-2
, -3, or -4, eg, cell surface proteins associated with activation such as CD71, or other conventional tests to determine the degree of activation, such as other convenient techniques. Can be used. Another method is to determine the expression of proteins that are expressed on quiescent T cells but not on anergic T cells. U.S. Patent No. 5,747,299.
【0203】 養子免疫治療 本発明の細胞および組成物は、癌ワクチンとして、および養子免疫治療におい
て有用である。自家抗原でパルス処理された樹状細胞の、臨床的に関連した免疫
応答を誘導する能力は以前に報告されているHsu et al.(1996)
Nature Med. 2(1):52−58。この臨床的な研究を案内とし
て用いて、本明細書に記載されたように、抗腫瘍免疫応答を誘導するために有効
な量のAPCを対象に投与することが可能である。樹状細胞(0日目)の単離お
よび精製の後、精製されてパルス処理された樹状細胞は2、28および56日目
および5から6ヶ月後に皮下注射によって投与された。16日目に患者は、パル
ス処理した樹状細胞の静脈内注射部位とは別の部位において、塩溶液中のスカシ
ガイヘモシアニンまたはイディオタイプタンパク質の皮下注射を受けた。Adoptive Immunotherapy The cells and compositions of the present invention are useful as cancer vaccines and in adoptive immunotherapy. The ability of dendritic cells pulsed with autologous antigen to induce a clinically relevant immune response has been previously reported by Hsu et al. (1996)
Nature Med. 2 (1): 52-58. Using this clinical study as a guide, it is possible to administer to a subject an effective amount of APC to induce an anti-tumor immune response, as described herein. Following isolation and purification of dendritic cells (day 0), purified and pulsed dendritic cells were administered by subcutaneous injection on days 2, 28 and 56 and 5 to 6 months later. On day 16, the patient received a subcutaneous injection of keyhole limpet hemocyanin or idiotype protein in saline at a site separate from the site of intravenous injection of pulsed dendritic cells.
【0204】 本発明の抗原特異的免疫効果細胞の拡大された集団は応用免疫治療における、
およびワクチンとしての利用をも見いだす。 養子免疫治療法は、一つの側面において、上記のように未処理の免疫効果細胞
をAPCとともに培養することで作製された、教育された抗原特異的免疫効果細
胞の実質的に純粋な集団を、対象に投与することを含む。APCは樹状細胞であ
ることが望ましい。[0204] The expanded population of antigen-specific immune effect cells of the invention can be used in applied immunotherapy.
And find use as a vaccine. Adoptive immunotherapy, in one aspect, comprises a substantially pure population of educated antigen-specific immune effectors created by culturing untreated immune effectors with APCs as described above, Administering to a subject. Preferably, the APC is a dendritic cell.
【0205】 一つの態様においては、本明細書に記載された養子免疫治療法は自家的なもの
である。この場合、APCは単一の対象から単離された親細胞を用いて作製され
る。拡大された集団はまた対象から単離されたT細胞を用いる。最後に、抗原特
異的細胞の拡大された集団は同一の患者に投与される。[0205] In one embodiment, the adoptive immunotherapy described herein is autologous. In this case, APCs are made using parental cells isolated from a single subject. The expanded population also uses T cells isolated from the subject. Finally, the expanded population of antigen-specific cells is administered to the same patient.
【0206】 別の態様においては、養子治療法は、同種異系間で行われる。ここではAPC を作製するために2またはそれ以上の患者からの細胞が用いられ、免疫効果細
胞の生産が刺激される。例えば、自家の生研を提供する対象からのT細胞および
/または樹状細胞が得られない場合に、他の健康な、または病気の対象由来の細
胞が、抗原特異的細胞を作製するのに用いられる。増幅された集団は細胞が単離
された対象のうちのいずれか、または全く別の対象に投与され得る。[0206] In another aspect, the adoptive therapy is performed in an allogeneic manner. Here, cells from two or more patients are used to generate APCs to stimulate the production of immune effector cells. For example, if T cells and / or dendritic cells from a subject providing in-house biotechnology are not available, cells from other healthy or diseased subjects may be used to generate antigen-specific cells. Can be The expanded population can be administered to any of the subjects from which the cells were isolated, or to a completely different subject.
【0207】 さらなる態様においてはAPCまたは免疫効果細胞は、有効な量の、例えばI
L−2のような刺激性サイトカインまたは共刺激分子と共に投与される。 本明細書においてその意図された目的に有効であると同定された薬剤は、腫瘍
を持つ対象、または腫瘍になりやすい、または危険のある個体に投与され得る。
マウス、ラット、またはヒトの患者のような対象に薬剤が投与される場合、薬剤
は医薬的に許容可能な担体に加えられ、全身的に、または局所的に、対象に投与
され得る。患者に有益な治療がなされ得るかを決定するために、腫瘍の退縮が検
査され得る。治療のための量は経験的に決定され、治療される病理、治療されて
いる対象および治療の有用性および毒性によって異なり得る。動物に与えられる
場合、この方法は薬剤の有効性をさらに確認するために有用である。In a further embodiment, the APC or immune effector cell is an effective amount of, eg, I
Administered with a stimulatory cytokine or costimulatory molecule such as L-2. An agent identified herein as effective for its intended purpose can be administered to a subject having a tumor or to an individual who is or is at risk of developing a tumor.
When the drug is administered to a subject, such as a mouse, rat, or human patient, the drug can be added to a pharmaceutically acceptable carrier and administered to the subject, either systemically or locally. Tumor regression can be examined to determine if beneficial treatment can be provided to the patient. The amount for treatment is empirically determined and may vary depending on the pathology being treated, the subject being treated and the usefulness and toxicity of the treatment. When given to animals, this method is useful for further confirming the efficacy of the drug.
【0208】 in vivo での投与は一つの投与量で、治療の間中連続的または断続的
に影響され得る。最も効果的な方法および投与量を決定する方法は当該技術分野
の技能を有するものによく知られ、治療に用いられる組成物、治療の目的、治療
される標的細胞、および治療される対象によって異なり得る。治療をする医師に
より選択された投与量およびパターンとともに、単一または複数投与が行われ得
る。適切な投与量処方および薬剤の投与法は以下に見いだされ得る。In vivo administration can be effected at one dose, continuously or intermittently throughout the treatment. The most effective methods and methods for determining dosage are well known to those of skill in the art and will vary with the composition used for treatment, the purpose of the treatment, the target cell being treated and the subject being treated. obtain. Single or multiple administrations can be carried out with the dose and pattern being selected by the treating physician. Appropriate dosage formulations and methods of administering the drug can be found below.
【0209】 未だ同定されていないタンパク質に対応するエピトープまたは野生型抗原性ペ
プチドもまた本発明の範囲に含まれる。腫瘍抗原を探すために一般的な方策は腫
瘍特異的なT細胞を単離し、これらの細胞によって認識される抗原を同定しよう
と試みることである。癌患者において、腫瘍部位に存在するリンパ球性浸潤に、
特異的なCTLが得られる。Weidmann, et al., supra
。これらのTILは、インジウムによって標識され、適切に輸送された場合、疾
患部位まで追跡でき得る唯一の細胞集団である。あるいは、仮想的な抗原に対す
る大きなライブラリーが作製され、試験され得る。”ファージ法”(Scott
and Smith (1990) Science 249:386−39
0:Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. A
cad. Sci. 87:6387−6382: Devlin et al
. (1990) Science 249:404−406)を用いて、非常
に大きなライブラリーが構築され得る。別の方法は、例えばGeysen法(G
eysen et al. (1986) Mol. Immunol.23:
709−715; Geysen et al.(1987) J.Immun
ol. Method 102:259−274)およびFodor et a
l. (1991) Science 251:767−773の方法のような
、主に化学的な方法を用いる。Furka et al.(1988)14th
Inter. Cong.Bio. Vol.5, Abst. FR:01
3; Furka(1991) Inter. J. Peptide Pro
tein Res.37:487−493)、Houghton(米国特許番号
4,683,211、1986年12月発行)およびRutter et al
.(米国特許番号5,010,175、1991年4月23日発行)は、アゴヌ
ストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を作製する方法
を記載する。[0209] Epitopes or wild-type antigenic peptides corresponding to proteins that have not yet been identified are also within the scope of the invention. A common strategy to look for tumor antigens is to isolate tumor-specific T cells and try to identify the antigen recognized by these cells. In cancer patients, lymphocytic infiltration existing at the tumor site
Specific CTL is obtained. Weidmann, et al. , Supra
. These TILs are the only population of cells that can be traced to the site of disease if labeled with indium and transported properly. Alternatively, large libraries for virtual antigens can be created and tested. "Phage method" (Scott
and Smith (1990) Science 249: 386-39.
0: Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. A
cad. Sci. 87: 6387-6382: Devlin et al.
. (1990) Science 249: 404-406), and very large libraries can be constructed. Another method is, for example, the Geysen method (G
eyesen et al. (1986) Mol. Immunol. 23:
709-715; Geysen et al. (1987) Immun
ol. Method 102: 259-274) and Fodor et a.
l. (1991) Uses mainly chemical methods, such as the method of Science 251: 767-773. Furka et al. (1988) 14th
Inter. Cong. Bio. Vol. 5, Abst. FR: 01
3; Furka (1991) Inter. J. Peptide Pro
tein Res. 37: 487-493), Houghton (U.S. Patent No. 4,683,211, issued December 1986) and Rutter et al.
. (US Patent No. 5,010,175, issued April 23, 1991) describes a method of making a mixture of peptides that can be tested as agonists or antagonists.
【0210】 本発明の更なる側面においては、固相エピトープ回収法(Solid−PHa
se Epitope REcovery,”SPHERE”PCT WO97
/35035に記載される)が、腫瘍薬剤を同定するために用いられ得る。簡潔
に述べると、SPHEREは、望ましくはペプチドである分子のライブラリーを
作製し、一種類の分子を解離可能な連結部を介して支持体に接続することによっ
て抗原を同定するのに用いられ得る。それぞれの支持体に結合した分子の少なく
とも一部が解離され得、そのペプチドを抗原特異的免疫効果細胞が認識するかを
決定され得る。[0210] In a further aspect of the present invention, a solid phase epitope recovery method (Solid-PHa
se Epitope Recovery, “SPHERE” PCT WO97
/ 35035) can be used to identify tumor agents. Briefly, SPHERE can be used to create a library of molecules, preferably peptides, and identify antigens by connecting one type of molecule to a support via a dissociable junction. . At least a portion of the molecule bound to the respective support can be dissociated, and it can be determined whether the peptide is recognized by the antigen-specific immune effector cells.
【0211】 従って、本発明はまた、さらに修飾されて対象における細胞性および液性免疫
応答を誘導するのに用いられ得る新規の野生型抗原をスクリーニングするための
検索をも提供する。in vitroまたはin vivoでの抗原およびその
生物学的活性は正の対照である。本明細書に記載された方法を用いて、単離され
た抗原およびその分泌型の生物学的活性がその生物学的活性について比較され得
る。Thus, the invention also provides a search to screen for novel wild-type antigens that can be further modified and used to induce cellular and humoral immune responses in a subject. The antigen in vitro or in vivo and its biological activity are positive controls. Using the methods described herein, the biological activity of the isolated antigen and its secreted form can be compared for its biological activity.
【0212】 さらに本発明は、エピトープの配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドプローブ
またはプライマーを作製することによる、そのようなタンパク質をコードするc
DNAまたはゲノムDNAをクローニングする方法を提供する。この方法および
、ノザン解析、サザン解析およびPCRといった方法を用いて試料中の配列を検
出する方法によって、核酸、および医薬的に許容可能な担体のような担体、固相
支持体または検出可能な標識を含む組成物が、さらに提供される。[0212] The present invention further relates to c-encoding such proteins by making degenerate oligonucleotide probes or primers based on the sequence of the epitope.
Methods for cloning DNA or genomic DNA are provided. By this method and the method of detecting sequences in a sample using methods such as Northern analysis, Southern analysis and PCR, nucleic acids and carriers such as pharmaceutically acceptable carriers, solid supports or detectable labels. Further provided is a composition comprising:
【0213】 前述の方法によって決定された治療用および診断用オリゴペプチド配列が、さ
らに本発明によって提供される。この方法および、ウェスタン解析、ELIZA
、Harlow and Lane(1989), supraといった方法を
用いて試料中のオリゴペプチド配列を検出する方法によって、オリゴペプチド配
列および、医薬的に許容可能なな担体のような担体、固相支持体または検出可能
な標識を含む組成物が、さらに提供される。[0213] Therapeutic and diagnostic oligopeptide sequences determined by the foregoing methods are further provided by the present invention. This method and Western analysis, ELISA
Oligopeptide sequences and carriers, such as pharmaceutically acceptable carriers, solid supports or detection by methods of detecting oligopeptide sequences in a sample using methods such as Harlow and Lane (1989), supra. Compositions comprising possible labels are further provided.
【0214】 以下の実施例は本発明を描写するために提供されるものでこれを限定するもの
ではない。The following examples are provided to illustrate, but not limit, the present invention.
【0215】[0215]
腫瘍関連抗原の同定 例えばKawakami et al.(1994)Proc. Natl.
Acad. Sci.91:3515−19に記載された発現クローニング法
のような、任意の慣用的な方法が、新規の腫瘍関連抗原を同定するために用いら
れえる。簡潔には、この方法において、腫瘍細胞に由来するmRNAに対応する
cDNAのライブラリーが、発現ベクターにクローニングされ、標的細胞に形質
転換された後、標的細胞は細胞傷害性T細胞と共にインキュベートされる。CT
Lを刺激することができるcDNAプールを同定し、連続的希釈および複雑性の
より少ないcDNAプールの再試験を通じて、CTLを刺激することができ、し
たがって同系の腫瘍抗原をコードする単一のcDNA配列を得ることができる。Identification of tumor-associated antigens See, eg, Kawakami et al. (1994) Proc. Natl.
Acad. Sci. Any conventional method can be used to identify novel tumor-associated antigens, such as the expression cloning method described in 91: 3515-19. Briefly, in this method, after a library of cDNAs corresponding to mRNA from tumor cells is cloned into an expression vector and transformed into target cells, the target cells are incubated with cytotoxic T cells. . CT
A single cDNA sequence capable of stimulating CTL through serial dilution and re-examination of the less complex cDNA pool, identifying a cDNA pool capable of stimulating L and thus encoding a syngeneic tumor antigen Can be obtained.
【0216】 SAGE(米国特許番号5,695,937)およびSPHERE(PCT
WO 97/35035に記載される)もまた本発明における利用において仮想
的な抗原を同定するために用いられ得る。SAGE (US Pat. No. 5,695,937) and SPHERE (PCT)
WO 97/35035) can also be used to identify hypothetical antigens in use in the present invention.
【0217】 抗原提示細胞に発現されたヌクレオチド配列を同定することにより、CTLの
ような拡大された免疫効果細胞により認識される抗原を同定するためにSAGE
解析が用いられ得る。簡潔には、SAGE解析は(1)抗原発現集団および(2
)抗原を発現していない細胞群由来の相補的デオキシリボ核酸(cDNA)を提
供することから始まる。双方のcDNAはプライマー部位で連結されえる。そし
て、例えばDNAを増幅するための適切なプライマーを用いて適切な配列タグが
作成される。二つの細胞種の間のこれらのタグの集合の違いを測定することによ
り、抗原発現細胞群において異常に発現している配列が同定されえる。SAGE to identify antigens recognized by expanded immune effector cells, such as CTL, by identifying nucleotide sequences expressed on antigen presenting cells
Analysis can be used. Briefly, SAGE analysis comprises (1) antigen-expressing population and (2)
1.) Begin by providing complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) from a population of cells that do not express the antigen. Both cDNAs can be ligated at the primer site. Then, for example, an appropriate sequence tag is created using an appropriate primer for amplifying DNA. By measuring the difference in the set of these tags between the two cell types, sequences that are abnormally expressed in the antigen-expressing cell population can be identified.
【0218】 抗原性エピトープを同定するために用いられ得る別の方法は、PCT WO9
7/35035に記載された固相エピトープ回収(Solid PHase E
pitope REcovery,SPHERE)法である。簡潔に、概要を述
べると、ペプチドライブラリーはビーズにのせられ、96ウェルプレートに挿入
される。1ウェルあたり1000ビーズのプレートは106ビーズを含み得、1 ウェルあたり100ビーズの96ウェルプレート10枚は105ビーズを含み得 る。検索当たり必要なCTL細胞および手作業の量を最小化するために、溶出し
たペプチドがさらにプールされ、任意の望まれる複雑さを持つウェルが得られる
ようにされ得る。例えば、可溶性ライブラリーでの実験に基づけば、2x106
CTL細胞しか含まない96ウェルプレート(プレート当たり10,000ペプ
チド)中で、107ペプチドを検索することが可能である。ある割り合いのペプ チドをビーズから解離させた後、γ線照射されたAPC、またはフォスターAP
C、およびクローン化されたCTL株と共にインキュベートされ、陽性のウェル
は3H−チミヂンの取り込みによって決定される。あるいは、上で指摘されたよ うに、サイトカイン生成または細胞溶解性51Cr放出検査が用いられ得る(C
outic et al.(1992)Int. J. Cancer,50’
289−291)。それぞれの陽性ウェル由来のビーズは分離され、それぞれの
ビーズから得られるさらなる割り合いのペプチドを利用して、個々に検査される
。つぎに陽性の個々のビーズが解読され、反応性のアミノ酸配列が同定される。
全ての陽性クローンの解析は、試験されたCTLクローンを刺激する、保存され
ている置換されたエピトープの部分的な描写を与え得る。この時、ペプチドは再
合成され、再試験され得る。特定のCTLが寛容である誘導体の完全な性質を列
挙するために、全ての保存された置換を表現する(最小の複雑さの)二番目のラ
イブラリーもまた合成され得る。同時に(同一のMHC拘束を持つ)複数のCT
Lをスクリーニングすることで、交差反応するエピトープの探索が可能になる。Another method that can be used to identify antigenic epitopes is PCT WO9
7/35035 (Solid PHase E)
(Pitope Recovery, SPHERE) method. Briefly, the peptide library is loaded onto beads and inserted into a 96-well plate. A plate with 1000 beads per well can contain 10 6 beads, and 10 96-well plates with 100 beads per well can contain 10 5 beads. In order to minimize the amount of CTL cells and manual work required per search, the eluted peptides can be further pooled to obtain wells of any desired complexity. For example, based on experiments with a soluble library, 2 × 10 6
In 96-well plates containing only CTL cells (per plate of 10,000 peptides), it is possible to search 10 7 peptide. After dissociating a percentage of the peptides from the beads, gamma-irradiated APC or Foster AP
C, and incubated with the cloned CTL line, positive wells are determined by 3 H-thymidine incorporation. Alternatively, as noted above, cytokine production or cytolytic 51Cr release assays may be used (C
outic et al. (1992) Int. J. Cancer, 50 '
289-291). Beads from each positive well are separated and individually tested using an additional percentage of peptides obtained from each bead. The individual positive beads are then decoded and the reactive amino acid sequence is identified.
Analysis of all positive clones can give a partial depiction of the conserved substituted epitope stimulating the CTL clone tested. At this time, the peptide can be resynthesized and retested. To enumerate the full nature of derivatives for which a particular CTL is tolerant, a second library (with minimal complexity) expressing all conserved substitutions can also be synthesized. Simultaneous CT (with the same MHC constraint)
Screening L allows the search for cross-reacting epitopes.
【0219】 あるいは、抗原の突然変異型タンパク質および同種異系および異種由来の抗原
である、以前に記載された抗原は本発明において有用である。MART−1およ
びgp100は、メラノーマ患者に由来するHLA−A2拘束腫瘍浸潤リンパ球
(Tumor−infiltrating Lymphocyte,TIL)に
より特異的に認識される色素細胞分化抗原であり、腫瘍退縮に関わるように見え
る(Kawakami et al.(1994)Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.91:6458−62;Kawakami et a
l.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:
91:3515−9)。近年、ヒトMART−1のマウス相同遺伝子が単離され
ている。マウスMART−1の全長のオープンリーディングフレームは、342
塩基対からなり、予測分子量約13KDaをもつ113アミノ酸残基のタンパク
質をコードする。ヒトおよびマウスMART−1のアミノ酸配列の比較は68.
6%の同一性を示した。Alternatively, previously described antigens, which are mutant proteins of the antigen and allogeneic and heterologous antigens, are useful in the present invention. MART-1 and gp100 are pigment cell differentiation antigens that are specifically recognized by HLA-A2 restricted tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) from melanoma patients and appear to be involved in tumor regression ( Kawakami et al. (1994) Proc.Natl.Aca.
d. Sci. U. S. A. 91: 6458-62; Kawakami et a
l. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91:
91: 3515-9). In recent years, mouse homologous genes of human MART-1 have been isolated. The full length open reading frame of mouse MART-1 is 342
It encodes a 113 amino acid residue protein consisting of base pairs and having a predicted molecular weight of about 13 KDa. 68. Comparison of amino acid sequences of human and mouse MART-1.
It showed 6% identity.
【0220】 別の態様においては、CD8+MHCクラスI拘束CTLエピトープを同定す
るための記載された方法はCD4+MHCクラスII拘束ヘルパーT細胞(Th
)エピトープの同定に応用され得る。この場合、MHCクラスIIアリル特異的
ライブラリーは、ハプロタイプ特異的アンカー残基が、適切な位置に現れるよう
に合成される。MHCクラスIIアグレトープモチーフは共通のアリルについて
同定されている(Rammensee(1995)Curr.Opin.Imm
unol.7:85−96;Altuvia et al.(1994) Mo
l.Immunol. 24:375−379; Reay et al. (
1994)J。Immunol. 152:3946−3957; Verre
ck et al. (1994) Eur.J. Immunol. 24:
375−379; Sinigaglia and Hammer (1994
) Curr. Opin. Immunol. 6:52−56; Rotz
schke and Falk (1994) Curr. Opin. Im
munol . 6:45−51)。ペプチドの全体の長さは12−20アミノ
酸残基で有り得、ライブラリーの複雑さを制限するために、以前に記載された方
法が用いられ得る。T2細胞ではなくBリンパ芽球腫細胞株(B−LCL)が抗
原提示に用いられることを除いて、スクリーニングの過程はMHCクラスI関連
エピトープについて記載されたものと同一である。望ましい側面においては、抗
原加工に欠損があるために(Mellins et al.(1991) J
.Exp. Med. 174:1607−1615)外来的に加えられた抗原
の特異的な提示が可能である、以前に記載されたB−LCLが用いられる。ライ
ブラリーは、CD4+MHCクラスIIアリル特異的Th細胞との反応性につい
て検索される。Mellins,et al. supra., の方法にした
がって3H−チミジンの取り込みによって、またはMHCクラスI関連エピトー
プ検索について以前に記載された方法のいずれかによって、反応性は測定され得
る。In another embodiment, the described method for identifying CD8 + MHC class I restricted CTL epitopes comprises CD4 + MHC class II restricted helper T cells (Th
) It can be applied to epitope identification. In this case, an MHC class II allele-specific library is synthesized such that haplotype-specific anchor residues appear at appropriate locations. MHC class II agretope motifs have been identified for common alleles (Rammensee (1995) Curr. Opin. Imm.
unol. 7: 85-96; Altuvia et al. (1994) Mo
l. Immunol. 24: 375-379; Ray et al. (
1994) J. Immunol. 152: 3946-3957; Verre
ck et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:
375-379; Sinigaglia and Hammer (1994
) Curr. Opin. Immunol. 6: 52-56; Rotz
Schke and Falk (1994) Curr. Opin. Im
munol. 6: 45-51). The overall length of the peptide can be 12-20 amino acid residues, and methods described previously can be used to limit the complexity of the library. The screening process is identical to that described for MHC class I-related epitopes, except that a B lymphoblastoma cell line (B-LCL) rather than T2 cells is used for antigen presentation. In a desirable aspect, there is a defect in antigen processing (Mellins et al. (1991) J.
. Exp. Med. 174: 1607-1615) The previously described B-LCL is used, which allows for specific presentation of exogenously added antigen. The library is searched for reactivity with CD4 + MHC class II allele-specific Th cells. See Mellins, et al. supra. Reactivity can be measured by incorporation of 3H-thymidine according to the method of, or by any of the methods previously described for MHC class I-related epitope retrieval.
【0221】 本発明の仮想的な抗原の免疫源性のin vitro での確認はCTLの生
産について検査する下記の方法を用いて確かめられ得る。しかしながら、弱い免
疫源性の抗原もまた、組成物の作製および本発明の方法において用いられ得る。The in vitro confirmation of the immunogenicity of the hypothetical antigens of the invention can be confirmed using the following method of testing for CTL production. However, weakly immunogenic antigens can also be used in making the compositions and methods of the invention.
【0222】 これらの配列および以下に要約された組変え発現技術を用いて、ポリペプチド
およびタンパク質は本発明のAPC上での提示のために作製され得る。 動物モデルにおける腫瘍防御 図面に示された転写カセットは、遺伝子の発現が同一タンパク質の細胞内およ
び分泌型の生産をもたらすようなアデノウィルスベクターに含まれる。Zhai
et al. (1996) J. Immunol. 156:700−1
0に記載されたような直接免疫感作のためにin vivoで、または、Rib
as et al. (1997) Cancer Reserch 57:2
865−9に記載されたように、宿主に由来する抗原提示細胞(望ましくは樹状
細胞)アデノウィルスベクターで形質転換されたており、遺伝的に修飾されたA
PCが続いて宿主に注入し返されるex vivoで、アデノウィルスベクター
が用いられ得る。野生型および分泌型の同一抗原をコードするアデノウィルスベ
クターが、C57BL/6マウスに、二箇所に皮下注射される(1箇所あたり1
.5E) IU)、in vivoでの免疫感作が行う。2週間後に、致死量(
2x104)のマウスB16F10メラノーマ腫瘍細胞の皮下注射が、動物に対 して行われた。動物は生存率を測定され、腫瘍の測定が行う。ex vivoの
樹状細胞治療のために、C57BL/6マウスから骨髄細胞が回収され、GM−
CSFおよびIL4とともにin vitroで培養されて樹状細胞が得られる
。樹状細胞は500のMOIでアデノウィルスベクターによって一晩感染され、
次の日に(5x105の)樹状細胞が洗浄され、尾部静脈注射を介して受容者C 57BL/6マウスに注入する。2週間後に、動物は上記のように致死量のマウ
スB16F10メラノーマ腫瘍細胞を皮下注射され、腫瘍の大きさおよび生存率
が時間の関数として記録する。Using these sequences and the recombinant expression techniques summarized below, polypeptides and proteins can be made for display on APCs of the invention. Tumor Protection in Animal Models The transcription cassette shown in the figures is contained in an adenovirus vector such that expression of the gene results in intracellular and secretory production of the same protein. Zhai
et al. (1996) Immunol. 156: 700-1
0 for direct immunization as described in
as et al. (1997) Cancer Research 57: 2
As described in 865-9, antigen-presenting cells (preferably dendritic cells) derived from the host have been transformed with an adenovirus vector and are genetically modified A
The adenovirus vector can be used ex vivo, where the PC is subsequently injected back into the host. Adenoviral vectors encoding the same wild-type and secreted antigens are injected subcutaneously into C57BL / 6 mice at two sites (one per site).
. 5E) IU), immunization in vivo is performed. Two weeks later, the lethal dose (
Subcutaneous injections of 2 × 10 4 ) mouse B16F10 melanoma tumor cells were performed on the animals. Animals are measured for survival and tumor measurements are made. For ex vivo dendritic cell therapy, bone marrow cells were collected from C57BL / 6 mice and GM-
The cells are cultured in vitro with CSF and IL4 to obtain dendritic cells. Dendritic cells were infected overnight with the adenovirus vector at an MOI of 500,
The next day (5 × 10 5 ) dendritic cells are washed and injected into the recipient C57BL / 6 mice via tail vein injection. Two weeks later, animals are injected subcutaneously with a lethal dose of mouse B16F10 melanoma tumor cells as described above, and tumor size and viability are recorded as a function of time.
【0223】 本発明は上記の態様との関連で記載されているが、前述の記載および以下の実
施例は描写を意図したものであり、本発明の範囲を制限するものではないことが
理解されるべきである。例えば、上記の組成物の何れかおよび/または方法も、
既知の治療法および組成物を組み合わせられ得る。本発明の範囲に含まれる他の
側面、利点、および修飾は、本発明に関係がある分野における当業者には明らか
である。While the present invention has been described in connection with the above embodiments, it is understood that the foregoing description and the following examples are intended to be illustrative, but not limiting, of the scope of the present invention. Should be. For example, any of the above compositions and / or methods may also include:
Known treatments and compositions can be combined. Other aspects, advantages, and modifications within the scope of the invention will be apparent to those skilled in the art to which the invention pertains.
【図1】 図は、本発明のポリヌクレオチドの一態様の概要である。図は、同じ抗原の細
胞内および分泌型をコードする単一転写カセットを示す。このポリヌクレオチド
は、E1、E3およびE4領域を欠損する、複製欠陥アデノウイルスベクターヘ
挿入しうる。適性なヘルパー細胞系は、感染ウイルスの産生に使用される。これ
と別に、ヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスは、ポリヌクレオチドを発
現しうる、感染、複製欠陥ウイルスが産生されるように、ウイルスベクターと共
に感染してよい。FIG. 1 is an outline of one embodiment of the polynucleotide of the present invention. The figure shows a single transcription cassette encoding the intracellular and secreted forms of the same antigen. This polynucleotide can be inserted into a replication defective adenovirus vector that lacks the E1, E3 and E4 regions. Suitable helper cell lines are used for the production of infectious virus. Alternatively, a helper plasmid or helper virus may be infected with the viral vector such that an infectious, replication-defective virus capable of expressing the polynucleotide is produced.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成13年4月3日(2001.4.3)[Submission date] April 3, 2001 (2001.4.3)
【手続補正1】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図1[Correction target item name] Fig. 1
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図1】 FIG.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 37/04 C12N 1/21 4H045 C07K 5/00 15/00 ZNAA C12N 1/21 A61K 37/02 5/06 C12N 5/00 E Fターム(参考) 4B024 AA01 BA31 CA01 DA02 DA05 DA11 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 4B065 AA01X AA57X AA87X AB01 BA01 CA24 CA45 4C084 AA13 BA44 CA18 CA36 DA01 MA02 NA14 ZB022 ZB212 ZB261 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 NA14 ZB02 ZB21 ZB26 ZC75 4C087 AA01 BB34 BB43 CA04 NA14 ZB02 ZB21 ZB26 4H045 AA10 BA13 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 37/04 C12N 1/21 4H045 C07K 5/00 15/00 ZNAA C12N 1/21 A61K 37/02 5 / 06 C12N 5/00 EF term (reference) 4B024 AA01 BA31 CA01 DA02 DA05 DA11 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 4B065 AA01X AA57X AA87X AB01 BA01 CA24 CA45 4C084 AA13 BA44 CA18 CA36 DA01 MA02 NA14 ZB022 ZB212 ZB01 MA0 MA0 MA05 NA14 ZB02 ZB21 ZB26 ZC75 4C087 AA01 BB34 BB43 CA04 NA14 ZB02 ZB21 ZB26 4H045 AA10 BA13
Claims (37)
抗原並びに、加工されてMHCクラスII分子と共にAPC上に提示される抗原
をコードするポリヌクレオチド。1. A polynucleotide encoding an antigen that is processed and presented on an antigen presenting cell (APC) together with an MHC class I molecule, as well as an antigen that is processed and presented on an APC together with an MHC class II molecule.
ER)における保持を促進するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含
む第二のコード配列 を含む、請求項1のポリヌクレオチド。2. A (a) first coding sequence comprising an antigen-encoding nucleotide sequence; and (b) an antigen-encoding nucleotide sequence and an endoplasmic reticulum of the encoded antigen (
2. The polynucleotide of claim 1, comprising a second coding sequence comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that facilitates retention in ER).
DEL、HDEL、DDEL、ADEL、SDEL、RDEL、KEEL、QE
DL、HIEL、HTEL、およびKQDLからなるグループから選択された請
求項2のポリヌクレオチド。3. The amino acid sequence that promotes maintenance of the encoded antigen in the endoplasmic reticulum (ER) is represented by K
DEL, HDEL, DDEL, ADEL, SDEL, RDEL, KEEL, QE
3. The polynucleotide of claim 2, wherein the polynucleotide is selected from the group consisting of DL, HIEL, HTEL, and KQDL.
MHCクラスII経路に指向させるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
を含む3番目のコード配列をさらに含む、請求項2のポリヌクレオチド。4. The polynucleotide of claim 2, further comprising a third coding sequence comprising a nucleotide sequence encoding an antigen and a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that directs the encoded antigen to a non-endosomal MHC class II pathway. .
リヌクレオチド。5. The polynucleotide of claim 2, wherein the antigen encoded by the first coding sequence is a secreted antigen.
ポリヌクレオチド。6. The polynucleotide of claim 2, wherein the antigen encoded by the first coding sequence is a cell surface antigen.
A、PSA、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関
連タンパク質1または2(TRP−1およびTRP−2)、NY−ESO−1お
よびGA733抗原からなるグループから選択される、請求項7のポリヌクレオ
チド。8. The tumor-associated antigen may be gp100, MUC-1, MART-1, HER-2, CE.
A, PSA, prostate-specific membrane antigen (PSMA), tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 or 2 (TRP-1 and TRP-2), NY-ESO-1 and GA733 antigens. Polynucleotide.
む組成物。15. A composition comprising a polynucleotide encoded by the polynucleotide of claim 1 and a carrier.
含む、請求項1のポリヌクレオチドを発現する方法。16. A method for expressing the polynucleotide of claim 1, comprising growing a cell under conditions suitable for expression of the polynucleotide of claim 1.
細胞に導入することを含む、抗原提示細胞の表面へのペプチドの提示を増大させ
る方法。17. A method for increasing the presentation of a peptide to the surface of an antigen-presenting cell, comprising introducing the polynucleotide into a cell under conditions suitable for expression of the polynucleotide of claim 1.
処理の免疫効果細胞を培養することを含む、教育された抗原特異的免疫効果細胞
の集団を産生する方法。19. A method of producing an educated population of antigen-specific immune effectors comprising culturing untreated immune effectors with antigen-presenting cells transduced by the polynucleotide of claim 1.
。20. A population of educated antigen-specific immune effector cells produced by the method of claim 19.
オチドを対象に投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を誘導
する方法。21. A method of inducing an immune response to an antigen in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the polynucleotide of claim 1 under conditions that induce an immune response to the antigen stomach.
法。22. The method of claim 21, further comprising administering to the subject an effective amount of a cytokine.
。24. The method of claim 21, further comprising administering to the subject an effective amount of a costimulatory molecule.
。25. The method of claim 24, wherein the gene encoding a costimulatory molecule is administered to the subject.
腺特異的膜抗原(PSMA)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1ま
たは2(TRP−1およびTRP−2)、NY−ESO−1およびGA733抗
原を含むグループから腫瘍関連抗原が選択される、請求項26の方法。27. gp100, MUC-1, MART-1, HER-2, CEA, PSA, prostate specific membrane antigen (PSMA), tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 or 2 (TRP-1 and TRP-2), 27. The method of claim 26, wherein a tumor-associated antigen is selected from the group comprising NY-ESO-1 and GA733 antigens.
対象に投与することを含む、対象における天然の抗原に対する免疫応答を誘導す
る方法。28. A method of inducing an immune response against a natural antigen in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the host cell of claim 11 under conditions that induce an immune response to the antigen.
法。29. The method of claim 28, further comprising administering to the subject an effective amount of a cytokine.
。31. The method of claim 28, further comprising administering to the subject an effective amount of a costimulatory molecule.
立腺特異的膜抗原(PSMA)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1
または2(TRP−1およびTRP−2)、NY−ESO−1およびGA733
抗原を含むグループから腫瘍関連抗原が選択される、請求項33の方法。34. gp100, MUC-1, MART-1, HER-2, CEA, PSA, prostate specific membrane antigen (PSMA), tyrosinase, tyrosinase-related protein 1
Or 2 (TRP-1 and TRP-2), NY-ESO-1 and GA733
34. The method of claim 33, wherein a tumor-associated antigen is selected from a group comprising the antigen.
投与することを含む、養子免疫治療の方法。37. A method of adoptive immunotherapy comprising administering to an individual an effective amount of a population of the educated antigen-specific immune effect cells of claim 20.
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