JP2002506631A - Anti-inositol phosphoglycan monoclonal antibody - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗ＩＰＧ抗体、特にハイブリドーマ細胞系２Ｆ７、２Ｄ１及び５Ｈ６によって生産される特有なモノクローナル抗体と、前子癇あるいは糖尿病、特にＩ型糖尿病の治療と診断における、これらの及び他の類似の抗体の使用に関する。免疫原担体に接合したＩＰＧにより動物を免疫化することによる抗ＩＰＧ抗体の製造方法もまた開示される。   (57) [Summary] The present invention relates to anti-IPG antibodies, particularly the unique monoclonal antibodies produced by the hybridoma cell lines 2F7, 2D1 and 5H6, and these and other similar antibodies in the treatment and diagnosis of pre-eclampsia or diabetes, especially type I diabetes. About the use of Also disclosed are methods for producing anti-IPG antibodies by immunizing animals with IPG conjugated to an immunogenic carrier.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

発明の分野 本発明は、イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）に特異的に結合することが
できる抗体、これらの抗体を作製するための方法及び診断と治療的な、特にアッ
セイにおける使用に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to antibodies capable of specifically binding to inositol phosphoglycan (IPG), methods for making these antibodies, and uses in diagnostic and therapeutic, especially assays.

【０００２】[0002]

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】[Prior Art and Problems to be Solved by the Invention]

発明の背景 細胞についての成長因子の効果の多くは、イノシトールホスホグリカン（ＩＰ
Ｇ）二次メッセンジャーのファミリーによって仲介されると思われる(Rademache
rら、1994)。それは、ＩＰＧｓの供給源が、細胞膜中に位置しているグリコシル
ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）の「遊離」型であると考えられる。ＩＰ
Ｇｓは、細胞表面上のレセプターへの成長因子の結合に続いてホスファチジルイ
ノシトール特異的ホスホリパーゼの効果によって放出されると考えられる。ＩＰ
Ｇｓが、インスリン、神経発育因子、肝細胞増殖因子、インスリン様成長因子Ｉ
（ＩＧＦ−Ｉ）、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子βを含む
多数の成長因子の効果、Ｂ細胞及びＴ細胞上でのＩＬ−２の効果、副腎皮質細胞
のＡＣＴＨシグナリング、顆粒膜細胞のＩｇＥ、ＦＳＨとｈＣＧ刺激、甲状腺細
胞の甲状腺刺激ホルモン刺激、早期発育耳及びラット乳腺における細胞増殖を仲
介する証拠がある。BACKGROUND OF THE INVENTION Many of the effects of growth factors on cells are due to inositol phosphoglycan (IP
G) Is likely mediated by a family of second messengers (Rademache
r et al., 1994). It is believed that the source of IPGs is the "free" form of glycosylphosphatidylinositol (GPI) located in the cell membrane. IP
Gs is believed to be released by the effect of phosphatidylinositol-specific phospholipase following binding of growth factors to receptors on the cell surface. IP
Gs is insulin, nerve growth factor, hepatocyte growth factor, insulin-like growth factor I
(IGF-I), effects of a number of growth factors including fibroblast growth factor, transforming growth factor β, effects of IL-2 on B and T cells, ACTH signaling in adrenocortical cells, granulosa cells There is evidence that mediates IgE, FSH and hCG stimulation, thyroid stimulating hormone stimulation of thyroid cells, early developmental ears and cell proliferation in rat mammary gland.

【０００３】 可溶性ＩＰＧ分画は、ラット組織（肝臓、腎臓、筋肉脳、脂肪、心臓）及びウ
シ肝臓を含む各種の動物組織から得られている。ＩＰＧの生物学的活性もまた、
マラリアに感染させたＲＢＣとマイコバクテリアにおいて検出されている。我々
は、それらの生物学的活性の基礎をなす、別個のＡとＰ型サブファミリーに、Ｉ
ＰＧ二次メッセンジャーのファミリーを分割している。ラットにおいて、Ａ及び
Ｐ型中間体の放出は、組織特異的となることが示されている(Kunjaraら、1995) 。[0003] The soluble IPG fraction has been obtained from various animal tissues, including rat tissues (liver, kidney, muscle brain, fat, heart) and bovine liver. The biological activity of IPG also
It has been detected in RBC and mycobacteria infected with malaria. We have identified the distinct A and P type subfamilies that underlie their biological activity as I
It splits the family of PG second messengers. In rats, the release of A and P-type intermediates has been shown to be tissue specific (Kunjara et al., 1995).

【０００４】 抗ＩＰＧ特異性を有するポリクローナル抗体の生産について従来技術において
いくつかの参考文献がある(Romeroら、1990；Huangら、1993；Nestlerら、1991;
Represaら、1991を参照)。これらの文献において、単一のポリクローナル抗体が
、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)の変異体表面タンパク質（Ｖ
ＳＧ）のＧＰＩアンカーに対して生起したことが開示される。その著者らは、可
溶性ＩＰＧｓが精製及び特徴付けされていないような抗ＩＰＧ抗体を得るための
この交差反応抗原を使用することを強いており、そしてそれは特異的な抗ＩＰＧ
抗体を直接生起するためには利用することができない。この免疫化プロトコール
を用いて生産したポリクローナル抗体は、ＧＰＩアンカー含有タンパク質のＧＰ
Ｉアンカー部分とも反応する。該文献は、このポリクローナル抗体がヒト胎盤の
ステロイド生成に関するインスリンの作用を阻害し、筋肉細胞についてのインス
リンの作用を阻害し、ラット横隔膜におけるインスリンの作用を阻害し且つ雛鳥
蝸牛前庭神経節（ＣＶＧ）における神経発育因子の作用を阻害することを報告し
ている。There are several references in the prior art for the production of polyclonal antibodies with anti-IPG specificity (Romero et al., 1990; Huang et al., 1993; Nestler et al., 1991;
See Represa et al., 1991). In these references, a single polyclonal antibody was identified as a mutant surface protein of Trypanosoma brucei (V
SG) GPI anchor. The authors have compelled to use this cross-reactive antigen to obtain anti-IPG antibodies whose soluble IPGs have not been purified and characterized, and that
It cannot be used to raise antibodies directly. A polyclonal antibody produced using this immunization protocol is a GPI anchor containing protein, GP
It also reacts with the I anchor part. The document states that this polyclonal antibody inhibits the action of insulin on steroidogenesis in human placenta, inhibits the action of insulin on muscle cells, inhibits the action of insulin on rat diaphragm and chick cochlear vestibular ganglion (CVG) Have been reported to inhibit the action of nerve growth factors in Arabidopsis.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]

発明の開示 本発明は、Ｐ及びＡ型イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧｓ）に特異的なポ
リクローナル及びモノクローナル抗体の生産、特にこれらの物質に特異的に結合
できるモノクローナル抗体の最初の生産に関する。本発明はまた、抗ＩＰＧ抗体
の使用、特に糖尿病及び前子癇(pre-eclampsia)の診断における使用にも関する 。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to the production of polyclonal and monoclonal antibodies specific for P and A inositol phosphoglycans (IPGs), and in particular to the initial production of monoclonal antibodies capable of specifically binding to these substances. The invention also relates to the use of anti-IPG antibodies, particularly in the diagnosis of diabetes and pre-eclampsia.

【０００６】 糖尿病の分野において、主要な問題は、Ｉ型糖尿病に進行する(developing ty
pe I diabetes)危険性のある患者の同定に関する。この状態(condition)は、典 型的には５歳と１１歳の間で典型的に生じ、膵臓におけるβ細胞を攻撃する、こ
れらの細胞を破壊する及び炎症を招く患者の免疫系によってもたらされる。もし
Ｉ型糖尿病に進行する危険性のある患者をこの攻撃が始まる前に同定できるなら
ば、それはインスリン又は糖尿病用の代替の治療を提供することによって危険な
機関の間に膵臓を閉鎖することによってその攻撃を改良するあるいは予防する可
能性を開く。危険な期間が経過した後、例えば思春期の後、この治療を中止する
ことができ、且つ患者の膵臓はインスリン生産の再開が与えられる。現在は、そ
のような患者を同定する確実な方法はない。[0006] In the field of diabetes, a major problem progresses to type I diabetes.
pe I diabetes) For identification of patients at risk. This condition typically occurs between the ages of 5 and 11 and is caused by the patient's immune system attacking, destroying and inflaming beta cells in the pancreas. . If patients at risk of developing type I diabetes could be identified before the onset of this attack, it could be by closing the pancreas during the risky institution by providing insulin or an alternative treatment for diabetes. Open the possibility of improving or preventing the attack. After a dangerous period of time, for example, after puberty, the treatment can be discontinued and the patient's pancreas is given a resumption of insulin production. Currently there is no reliable way to identify such patients.

【０００７】 前子癇について、母性内皮機能不全及び凝固システムの活性化に伴う問題、増
加した血管透過性及び血管収縮に対する二次的な母性期間における虚血の原因と
なる、全ての妊娠の１０−１２％に影響を与えるこの状態の診断のための簡単な
アッセイは、目下のところ無い。 従って、第１の態様において、本発明は、抗イノシトールホスホグリカン（Ｉ
ＰＧ）モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系であって、受託番号
９８０５１２０１、９８０３１２１２及び９８０３０９０１の下に欧州寄託機関
（Eyropean Collection of Cell Cultures(ＥＣＡＣＣ)）に寄託されたハイブリ
ドーマ細胞系２Ｆ７、２Ｄ１及び５Ｈ６から選択されるハイブリドーマ細胞系を
提供する。[0007] For preeclampsia, problems associated with maternal endothelial dysfunction and activation of the coagulation system, increased vascular permeability and vasoconstriction, secondary to ischemia in the second maternity period, 10- There is currently no simple assay for the diagnosis of this condition affecting 12%. Accordingly, in a first aspect, the present invention provides an anti-inositol phosphoglycan (I
PG) a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody, from the hybridoma cell lines 2F7, 2D1 and 5H6, deposited with the European Depositary under the Accession Nos. 98051201, 98031212 and 98030901 (ECACC). Provide a hybridoma cell line of choice.

【０００８】 更なる態様において、本発明は、上記ハイブリドーマ細胞系から獲得可能な或
いは該寄託した１以上の細胞系によって作られたモノクローナル抗体により結合
されるＩＰＧのエピトープに結合することができる抗ＩＰＧモノクローナル抗体
を提供する。特に、該抗体は、ラット肝臓から得ることができるようなＡ型ＩＰ
Ｇｓによる免疫化の後で生産され、さらにヒト胎盤から得ることができるような
Ｐ型ＩＰＧｓに結合する。この驚くべき結果は、これらＩＰＧｓ上の共通エピト
ープを該抗体が認識することを示す。かくして、好適な実施態様において、本発
明は、上記モノクローナル抗体の一つとして、Ｐ又はＡ型ＩＰＧの同じか或いは
実質上同じエピトープに結合することができる抗体を提供する。好ましくは、本
発明の抗体は、ＧＰＩ固定化タンパク質の共通反応決定基（common reactive de
terminant(CRD)）には結合しない。これの実験的な例証は、後述する実施例６中
に記載される。In a further aspect, the present invention relates to an anti-IPG capable of binding to an epitope of IPG obtainable from said hybridoma cell line or bound by a monoclonal antibody produced by said deposited one or more cell lines. Provide a monoclonal antibody. In particular, the antibodies are of type A IP as obtainable from rat liver.
It is produced after immunization with Gs and binds to P-type IPGs as further obtainable from human placenta. This surprising result indicates that the antibody recognizes a common epitope on these IPGs. Thus, in a preferred embodiment, the invention provides, as one of the above monoclonal antibodies, an antibody capable of binding to the same or substantially the same epitope of P or A type IPG. Preferably, the antibody of the present invention is a GPI-immobilized protein having a common reactive determinant.
terminant (CRD)). An experimental illustration of this is described in Example 6 below.

【０００９】 何れかの実施態様において、該抗体は、中和抗体であり、Ｐ又はＡ型ＩＰＧｓ
の生物学的特性の１以上を減じるか又は阻害するアンタゴニストとして用いるこ
とができる。 更なる態様において、本発明は、医薬的治療方法における使用のための上記抗
体及び該抗体を含む薬学組成物を提供する。[0009] In any embodiment, the antibody is a neutralizing antibody and the P or A type IPGs
Can be used as antagonists to reduce or inhibit one or more of the biological properties of E. coli. In a further aspect, the present invention provides the above-described antibodies and pharmaceutical compositions comprising the antibodies for use in a method of pharmaceutical treatment.

【００１０】 更なる態様において、診断アッセイにおける使用のための組成物の調製のため
の上記抗体の使用を提供する。好ましい実施態様において、該アッセイは、前子
癇或いは糖尿病用とされる。好適な実施態様において、その使用は、Ｉ型糖尿病
に進行する危険のある患者の診断用である。[0010] In a further aspect, there is provided the use of the above antibody for the preparation of a composition for use in a diagnostic assay. In a preferred embodiment, the assay is for pre-eclampsia or diabetes. In a preferred embodiment, the use is for the diagnosis of a patient at risk of developing type I diabetes.

【００１１】 好ましい実施態様において、本発明は、患者がＩ型糖尿病に進行する危険性が
あるかどうかを診断する方法を提供し、該方法は： （ａ）患者からの生物学的試料と、Ｐ及び／又はＡ型ＩＰＧｓに特異的に結合
できる抗体とを接触させること；及び （ｂ）抗ＩＰＧ抗体に対する該試料中のＩＰＧｓの結合を測定すること、 を含む。In a preferred embodiment, the present invention provides a method for diagnosing whether a patient is at risk for developing Type I diabetes, comprising: (a) a biological sample from a patient; Contacting with an antibody that can specifically bind to P and / or A type IPGs; and (b) measuring the binding of IPGs in the sample to anti-IPG antibodies.

【００１２】 任意に、該方法は、Ｉ型糖尿病を有するあるいはその危険性のあることがアッ
セイにおいて示された患者に対して、インスリン及び／又はＰ型ＩＰＧｓ及び／
又はＡ型ＩＰＧｓを、例えば危険な期間、投与する更なる工程を含む。[0012] Optionally, the method comprises administering insulin and / or P-type IPGs and / or P-type IPGs to patients who have or are shown to be at risk for type I diabetes.
Or including the additional step of administering Type A IPGs, eg, for a dangerous period of time.

【００１３】 代替の実施態様において、本発明は、患者における前子癇の診断方法を提供し
、該方法は： （ａ）患者からの生物学的試料と、請求項２乃至６のいずれか１項記載の抗Ｉ
ＰＧ抗体とを接触させること；及び （ｂ）抗ＩＰＧ抗体に対する試料中のＩＰＧｓの結合を測定すること、 を含む。In an alternative embodiment, the invention provides a method of diagnosing pre-eclampsia in a patient, the method comprising: (a) a biological sample from the patient and any one of claims 2-6. Anti-I as described
Contacting with a PG antibody; and (b) measuring the binding of IPGs in the sample to the anti-IPG antibody.

【００１４】 任意に、該方法は、前子癇を有するあるいはその危険性のあることがアッセイ
において示された患者に対して、Ｐ型ＩＰＧアンタゴニストを投与する更なる工
程を含む。[0014] Optionally, the method comprises the further step of administering a P-type IPG antagonist to the patient having, or shown at risk for, pre-eclampsia in the assay.

【００１５】 例示的なアッセイのプロトコルは、以下により詳細に記載される。典型的に、
抗ＩＰＧ抗体に対する試料中のＩＰＧｓの結合は、例えば非糖尿病患者からの、
或いは糖尿病の特有の型を有することが知られる個人、例えば進行したＩ型糖尿
病を持つ或いは前子癇を持つことが知られた患者からの標準品において行われる
結合の量と比較される。An exemplary assay protocol is described in more detail below. Typically,
The binding of IPGs in the sample to anti-IPG antibodies can be, for example, from non-diabetic patients.
Alternatively, the amount is compared to the amount of binding performed in a standard from an individual known to have a particular type of diabetes, eg, a patient with advanced type I diabetes or known to have pre-eclampsia.

【００１６】 一実施態様において、該アッセイは、炭水化物負荷（例えばグルコース）を患
者に投与すること、及び付加後の経時的なＩＰＧ応答を測定することによって実
行することができる。患者試料から測定したＩＰＧプロフィール或いはレベルは
、次いで診断を行うための標準から得られたプロフィール或いはレベルと比べる
ことができる。利便的に、該抗体は、寄託したモノクローナル抗ＩＰＧ抗体の群
から選択され、或いは抗体は、ここに記載した方法を用いて調製される。In one embodiment, the assay can be performed by administering a carbohydrate load (eg, glucose) to the patient and measuring the IPG response over time after addition. The IPG profile or level measured from the patient sample can then be compared to a profile or level obtained from a standard for making a diagnosis. Conveniently, the antibodies are selected from the group of deposited monoclonal anti-IPG antibodies, or the antibodies are prepared using the methods described herein.

【００１７】 更なる態様において、本発明は、Ｐ又はＡ型ＩＰＧｓの免疫精製においてここ
に記載した抗体の使用を提供する。In a further aspect, the present invention provides the use of the antibodies described herein in immunopurification of type P or A IPGs.

【００１８】 更なる態様において、本発明は、抗ＩＰＧ抗体の製造方法を提供し、該方法は
、抗体応答を引き出すための１以上の可溶性ＩＰＧｓによって動物を免疫化する
ことを含み、ここで該ＩＰＧｓは免疫原担体に接合されない。[0018] In a further aspect, the invention provides a method of producing an anti-IPG antibody, the method comprising immunizing an animal with one or more soluble IPGs to elicit an antibody response, wherein the method comprises: IPGs are not conjugated to immunogenic carriers.

【００１９】 本発明は、ＩＰＧｓが小さな分子であり且つ炭水化物であるという事実にも関
わらず、それによって動物を免疫化することによって抗体を生じさせることが可
能であるということを、驚くべきことに見出している。さらに、担体に対するＩ
ＰＧｓの接合は、ＩＰＧｓ上のエピトープが接合反応によって阻止又は変更され
ないその手段が必要とされないという事実は、ＩＰＧｓのエピトープの完全な相
補体に対して生起される抗体を与える。該方法は、後述の実施例で実証されるよ
うに、ポリクローナルとモノクローナル抗体の両方の生産に適用可能である。好
ましくは、その動物は、ＩＰＧの可溶形態を用いた腹腔内ルートを経て免疫化さ
れる。The present invention surprisingly has shown that despite the fact that IPGs are both small molecules and carbohydrates, they are able to raise antibodies by immunizing animals. Heading. In addition, I
The fact that conjugation of PGs is not required that means that epitopes on IPGs are not blocked or altered by the conjugation reaction gives antibodies raised against the full complement of epitopes on IPGs. The method is applicable to the production of both polyclonal and monoclonal antibodies, as demonstrated in the examples below. Preferably, the animal is immunized via the intraperitoneal route with a soluble form of IPG.

【００２０】 本発明の実施態様が、実施例として、そして添付の図面の参照とともに、制限
されることなく、ここに記載されるであろう。Embodiments of the present invention will now be described by way of example and without limitation with reference to the accompanying drawings.

【００２１】[0021]

【発明の実施の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

ＩＰＧとＩＰＧアナログ 研究により、Ａ型メディエイタが、例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナー
ゼ（阻害）、アデニル酸シクラーゼ（阻害）およびｃＡＭＰホスホジエステラー
ゼ（刺激）などの多くのインスリン依存性酵素の活性を調節することが示されて
いる。これに対して、Ｐ型メディエイタは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼホスフ
ァターゼ（刺激）、グリコーゲンシンターゼホスファターゼ（刺激）およびｃＡ
ＭＰ依存性プロテインキナーゼ（阻害）などのインスリン依存性酵素の活性を調
節する。Ａ型メディエイタは、脂肪細胞におけるインスリンの脂質生成活性を模
倣するのに対し、Ｐ型メディエイタは、筋肉におけるインスリンの糖原生成活性
を模倣する。ＡおよびＰ型メディエイタはどちらも、無血清培地中の線維芽細胞
に添加すると、マイトジェンとなる。線維芽細胞の増殖を刺激するメディエイタ
の性能は、細胞をＥＧＦ受容体で形質転換した場合に増強される。Ａ型メディエ
イタは、ＣＶＧにおける細胞増殖を刺激できる。IPGs and IPG analogs Studies show that type A mediators regulate the activity of many insulin-dependent enzymes, such as, for example, cAMP-dependent protein kinase (inhibition), adenylate cyclase (inhibition), and cAMP phosphodiesterase (stimulation). It is shown. In contrast, P-type mediators include pyruvate dehydrogenase phosphatase (stimulation), glycogen synthase phosphatase (stimulation) and cA
Regulates the activity of insulin-dependent enzymes such as MP-dependent protein kinase (inhibition). A-type mediators mimic the lipogenic activity of insulin in adipocytes, whereas P-type mediators mimic the glycogenic activity of insulin in muscle. Both A and P-type mediators become mitogens when added to fibroblasts in serum-free medium. The ability of mediators to stimulate fibroblast proliferation is enhanced when cells are transformed with the EGF receptor. Type A mediators can stimulate cell proliferation in CVG.

【００２２】 Ａ型およびＰ型活性を有する可溶性ＩＰＧ画分は、ラット組織（肝臓、腎臓、
筋肉脳、脂肪、心臓）およびウシ肝臓を含む様々な動物組織から得られている。
また、ＡおよびＰ型ＩＰＧの生物学的活性が、ヒトの肝臓および胎盤、マラリア
に寄生されたＲＢＣおよびマイコバクテリアにおいて検出されている。ヒトの胎
盤の栄養膜細胞層とＢＣ３Ｈ１筋細胞におけるインスリン作用、もしくはラット
横隔膜と雛鳥蝸牛前庭神経細胞（chick cochleovestibular ganglia）における ウシ由来ＩＰＧ作用を、阻害するポリクローナル交差反応性抗イノシトールグリ
カン抗体の性能により、多くの構造上の特徴が種を超えて保存されていることが
示される。しかしながら、従来の技術では、いくつかの生物学的画分におけるＡ
およびＰ型ＩＰＧ活性について報告されているものの、該活性の原因物質の精製
または特徴付けについて、以下の参照文献において報告されるまで、開示されて
いなかったことに留意することが重要である。The soluble IPG fraction having A-type and P-type activity is isolated from rat tissues (liver, kidney,
(Muscle brain, fat, heart) and bovine liver.
Biological activity of A and P-type IPGs has also been detected in human liver and placenta, RBC and mycobacteria infested with malaria. The ability of polyclonal cross-reactive anti-inositol glycan antibodies to inhibit insulin action in human placental trophoblast layer and BC3H1 myocytes, or bovine IPG action in rat diaphragm and chick cochleovestibular ganglia, It is shown that many structural features are conserved across species. However, in the prior art, A in some biological fractions
It is important to note that although reported for P-type IPG activity, purification or characterization of the causative agent of the activity was not disclosed until reported in the following references.

【００２３】 Ａ型物質は、炭化水素を含み、またＺｎ²⁺イオンと任意でホスファートを含み
、脂質生成活性を制御し、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを阻害する特性を
有するシクリトールである。また、これらはアデニル酸シクラーゼを阻害し、無
血清培地中のＥＧＦ−形質転換線維芽細胞に添加した時にマイトジェンとなり、
脂肪細胞において脂質生成を刺激する。Type A substances are cyclitols that contain hydrocarbons and also Zn ²⁺ ions and optionally phosphates, have the properties of controlling lipogenic activity and inhibiting cAMP-dependent protein kinase. They also inhibit adenylate cyclase and become mitogens when added to EGF-transformed fibroblasts in serum-free medium,
Stimulates lipogenesis in adipocytes.

【００２４】 Ｐ型物質は、炭化水素を含み、またＭｎ²⁺および／またはＺｎ²⁺イオンと任意
でホスファートを含み、糖原生成代謝を制御し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼホ
スファターゼを活性化する特性を有するシクリトールである。また、これらはグ
リコーゲンシンターゼホスファターゼの活性を刺激し、無血清培地中の線維芽細
胞に添加した時にマイトジェンとなり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファタ
ーゼを刺激する。The P-type substance contains hydrocarbons and also Mn ²⁺ and / or Zn ²⁺ ions and optionally phosphates, has the properties of controlling glycogen metabolism and activating pyruvate dehydrogenase phosphatase. It is cyclitol. They also stimulate the activity of glycogen synthase phosphatase, become mitogens when added to fibroblasts in serum-free medium, and stimulate pyruvate dehydrogenase phosphatase.

【００２５】 Ａ型およびＰ型ＩＰＧを得るための方法は、Caroら、１９９７とＷＯ９８／１
１１１６とＷＯ９８／１１１１７において、詳細に記載されている。ＡおよびＰ
型ＩＰＧの遊離ＧＰＩ前駆体を得るための方法が次に記載される。Methods for obtaining A-type and P-type IPGs are described in Caro et al., 1997 and WO 98/1.
1116 and WO 98/11117. A and P
A method for obtaining a free GPI precursor of type IPG will now be described.

【００２６】 糖脂質は、ラットの肝臓膜から、Matoら（1987）において記載されている方法
を若干改変して（Varela-Nietoら、1993）、一部、精製した。３００ｇの物質か
ら連続遠心分離により、膜画分を得た。クロロホルム／メタノール抽出後、無極
性脂質を除去し、全脂質を得た。連続酸／塩基シリカゲルＧ６０ｔ．ｌ．ｃによ
り、他のリン脂質からＧＰＩを分離した（以下参照）。脂質を、ｔ．ｌ．ｃプレ
ートからメタノールで抽出し、乾燥させ、Sep-Pak 18カートリッジにかけ、メタ
ノールで溶出し、乾燥させた。ＧＰＩを、シリカゲルＧ６０ｔ．ｌ．ｃプレート
の起始部上にスポットし、酸性溶媒系[クロロホルム：アセトン：メタノール： 酢酸：水（５０：２０：１０：１０：５、体積比）]中と塩基性溶媒系[クロロホ
ルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水（４５：４５：３：５：１０、体積
比）]中で、二回展開させた。あるいは、ＧＰＩ分子を、Clementeら（1995）とA
vilaら（1992）に記載されたように二次元ｔ．ｌ．ｃによって、または、Gaulto
n（1991）に記載されたように、高速（ＨＰ）ｔ．ｌ．ｃプレートを用い、クロ ロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水（４０：４５：３：５：１５、
体積比）中で展開させて、さらに分解した。脂質の移動を、検出されるべきリン
脂質標準と共に、ヨウ素で染色して、測定した。精製したＧＰＩから遊離ＩＰＧ
を生成させるために、製造元の指示書に従い、バシラス・スリンギエンシス（Ba
cillus thuringiensis）から得たＰＩ−ＰＬＣ１単位とともに、ＧＰＩを三時間
インキュベーションした。インキュベーション後、試料をSep-Pak 18カートリッ
ジ上に負荷して、反応を終結させた。溶出水（５ｍｌ）を乾燥させた。Glycolipids were partially purified from rat liver membranes with a minor modification of the method described in Mato et al. (1987) (Varela-Nieto et al., 1993). A membrane fraction was obtained from 300 g of material by continuous centrifugation. After chloroform / methanol extraction, nonpolar lipids were removed to obtain total lipids. Continuous acid / base silica gel G60 t. l. c separated GPI from other phospholipids (see below). The lipid is t. l. The c-plate was extracted with methanol, dried, applied to a Sep-Pak 18 cartridge, eluted with methanol and dried. GPI was converted to silica gel G60 t. l. The spot was spotted on the starting portion of the c-plate, and the solution was mixed in an acidic solvent system [chloroform: acetone: methanol: acetic acid: water (50: 20: 10: 10: 5, volume ratio)] and a basic solvent system [chloroform: methanol: Ammonium hydroxide: water (45: 45: 3: 5: 10, volume ratio)]. Alternatively, GPI molecules are described in Clemente et al. (1995) and A
vila et al. (1992). l. by c or Gaulto
n (1991), high speed (HP) t. l. Using a c-plate, chloroform: methanol: ammonium hydroxide: water (40: 45: 3: 5: 15,
(Volume ratio) and further decomposed. Lipid migration was measured by staining with iodine, along with the phospholipid standard to be detected. Free IPG from purified GPI
To produce Bacillus thuringiensis (Ba) according to the manufacturer's instructions.
GPI was incubated with 1 unit of PI-PLC from Cillus thuringiensis for 3 hours. After incubation, the samples were loaded on Sep-Pak 18 cartridges to terminate the reaction. The elution water (5 ml) was dried.

【００２７】 抗体 ＰおよびＡ型ＩＰＧに特異的に結合できる抗体を、ここに開示する。これらの
抗体は、当該分野において標準的な技術を用いて改変することができる。また、
ここに最初に例示する抗体と類似する抗体を、ここに教示することと公知の方法
とを組み合わせて製造することもできる。抗体を生成するこれらの方法は、哺乳
動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を、
ＩＰＧまたはそれらのフラグメントで免疫することを含む。抗体は、当該分野に
おいて公知の様々な技術を用いて、免疫した動物から得ることができ、好ましく
は、興味のある抗原に対する抗体の結合を用いて、スクリーニングすることがで
きる。抗体および／または抗体生成細胞の動物からの単離は、動物を屠殺する工
程によって行うことができる。Antibodies Disclosed herein are antibodies that can specifically bind to P and A type IPG. These antibodies can be modified using techniques standard in the art. Also,
Antibodies similar to those first exemplified herein can also be produced by combining the teachings herein with known methods. These methods of producing antibodies involve the use of mammals (eg, mice, rats, rabbits, horses, goats, sheep or monkeys)
Immunization with IPG or fragments thereof. Antibodies can be obtained from the immunized animal using various techniques known in the art, and preferably screened using the binding of the antibody to the antigen of interest. Isolation of the antibody and / or antibody-producing cells from the animal can be performed by killing the animal.

【００２８】 ＩＰＧで哺乳動物を免疫する代替えまたは補足として、ＩＰＧに対する特異抗
体を、例えば、ラムダバクテリオファージもしくは表面に機能的なイムノグロブ
リン結合ドメインを示すバクテリオファージフィラメントを用いて、発現させた
イムノグロブリンの可変ドメインの組み換え生成ライブラリーから得ることがで
きる；例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照。ライブラリーは、いかなるＩＰＧ
（もしくはフラグメント）によっても免疫されていない生物から得られた配列か
ら構築された天然のもの、または興味のある抗原に曝された生物から得られた配
列を用いて構築されたものとすることができる。As an alternative or supplement to immunizing mammals with IPG, immunoglobulins expressed using a specific antibody against IPG, for example using a lambda bacteriophage or a bacteriophage filament displaying a functional immunoglobulin binding domain on its surface Can be obtained from recombinant production libraries of the variable domains of; see, for example, WO 92/01047. The library can be any IPG
(Or fragments) may be native, constructed from sequences obtained from an organism that has not been immunized, or may be constructed using sequences obtained from an organism that has been exposed to the antigen of interest. it can.

【００２９】 ここに用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、十分に均質な抗体集
団（すなわち、少量で存在するかもしれない自然に生じる得る変異体は別として
、集団を含む各抗体が同一である）から得られた抗体を表す。モノクローナル抗
体は、KohlerとMilstein,Nature,256:495,1975によって最初に記載された方法、
または組み換え方法（Cabillyら、米国特許第４８１６５６７号もしくはMageとL
amoyi、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,79-97 頁、Marcel Dekker社、New York,1987を参照）によって作製することができる。The term “monoclonal antibody” as used herein refers to a sufficiently homogeneous population of antibodies (ie, apart from naturally occurring variants that may be present in small amounts, each antibody comprising the population is identical) ) Represents the antibody obtained. Monoclonal antibodies are a method first described by Kohler and Milstein, Nature, 256: 495, 1975,
Or recombination methods (Cabilly et al., US Pat. No. 4,816,567 or Mage and L
amoyi, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Marcel Dekker, New York, 1987).

【００３０】 ハイブリドーマ法において、免疫のために用いられるＩＰＧと特異的に結合す
る抗体を生成する、もしくは生成することができるリンパ球を引き出すために、
皮下、腹腔内、または筋内経路で、マウスまたは他の適した宿主動物を抗原で免
疫する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。次いで、リ
ンパ球を、適した融合剤、例えばポリエチレングリコールなどを用いてミエロー
マ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる[Goding,Monoclonal antib
odies:Principles and Practice,pp.59-103（Academic Press,1986）参照]。実 施例において示した腹腔内経路を介した、可溶性ＩＰＧでの免疫は、ＩＰＧに対
する特異抗体の生成に驚異的に有効であった。In the hybridoma method, to elicit lymphocytes that produce or can produce antibodies that specifically bind to IPG used for immunization,
Mice or other suitable host animals are immunized with the antigen by the subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular route. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusing agent, such as polyethylene glycol, to form hybridoma cells [Goding, Monoclonal antib
odies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. Immunization with soluble IPG via the intraperitoneal route shown in the examples was surprisingly effective at generating specific antibodies to IPG.

【００３１】 このように調製したハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親ミエロー
マ細胞の増殖もしくは生存を阻害する一以上の物質を含む、適した培地中に播種
し、培養することができる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴもしくはＨＰＲＴ）を欠
く場合、ハイブリドーマ用培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞
の増殖を阻害する。The hybridoma cells thus prepared can be preferably seeded and cultured in a suitable medium containing one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells. For example, if the parental myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma medium typically contains hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT medium), and these substances Inhibits the growth of HGPRT-deficient cells.

【００３２】 好ましいミエローマ細胞は、有効に融合し、選択された抗体生成細胞によって
安定した高レベルでの抗体発現が支持され、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を有
するものである。Preferred myeloma cells are those that fuse efficiently, are supported by stable high-level antibody expression by the selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium.

【００３３】 ハイブリドーマ細胞を培養する培地は、ＩＰＧに対するモノクローナル抗体の
生成でアッセイする。好ましくは、特異結合は、固相酵素免疫検定アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）によって測定される。本発明のモノクローナル抗体は、ＰおよびＡ型
ＩＰＧのどちらか、または両方に、特異的に結合するものである。[0033] The medium in which the hybridoma cells are cultured is assayed for production of monoclonal antibodies to IPG. Preferably, the specific binding is performed by an enzyme-linked immunosorbent assay (E
LISA). The monoclonal antibody of the present invention specifically binds to one or both of P and A type IPG.

【００３４】 抗体が結合するエピトープは、寄託された抗体の一つに結合することが知られ
ている合成化合物を用い、例えば、寄託されたモノクローナル抗体２Ｆ７、２Ｄ
１または５Ｈ６との十分な同一性、もしくは同一の結合特異性を抗体が有するか
どうかを参照して、マッピングすることができる。また、これは、与えられた抗
ＩＰＧ抗体が、寄託された抗体の一つと、特定のＩＰＧエピトープに対して競合
するかどうかを測定する競合実験において、行うこともできる。従って、本発明
は、例示された抗体が結合するＩＰＧエピトープと結合することができる抗体を
含む。好ましくは、このエピトープは、ラット肝臓Ａ型ＩＰＧおよびヒト胎盤Ｐ
型ＩＰＧの両方に存在する。ラット肝臓Ａ型ＩＰＧを用いて作製された例示のモ
ノクローナルは、以下の実施例で示すように、前子癇を診断するためのアッセイ
において驚異的に有効である。The epitope to which the antibody binds may be a synthetic compound known to bind to one of the deposited antibodies, eg, the deposited monoclonal antibody 2F7, 2D
Mapping can be performed by referring to whether the antibody has sufficient identity to 1 or 5H6, or the same binding specificity. This can also be performed in competition experiments that determine whether a given anti-IPG antibody competes with one of the deposited antibodies for a particular IPG epitope. Accordingly, the present invention includes antibodies capable of binding to the IPG epitope to which the exemplified antibodies bind. Preferably, this epitope comprises rat liver type A IPG and human placenta P
Present in both type IPGs. Exemplary monoclonals made using rat liver type A IPG are surprisingly effective in assays for diagnosing preeclampsia, as shown in the examples below.

【００３５】 本発明の好ましい実施態様において、モノクローナル抗体は、マイクロモルを
超える親和性、または、例えばスキャッチャード分析により測定された時（Muns
onとPollard、Anal. Biochem.107:220,1980参照）に、より大きな親和性（すな わち１０^-6モルよりも大きな親和性）を有するであろう。In a preferred embodiment of the invention, the monoclonal antibody has an affinity of greater than micromolar, or as determined, for example, by Scatchard analysis (Muns
on and Pollard, see Anal. Biochem. 107: 220, 1980) will have a greater affinity (ie, greater than 10 ^-6 moles).

【００３６】 所望する特異性と親和性の中和抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定した
後に、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で培養す
る。この目的のために適した培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変イーグル培地ま
たはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物にお
ける腹水腫瘍として、インビボで増殖させることができる。After identifying the hybridoma cells that produce neutralizing antibodies of the desired specificity and affinity, the clones are subcloned by limiting dilution and cultured by standard methods. Suitable media for this purpose include Dulbecco's modified Eagle's medium or RPMI-1640 medium. In addition, hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals.

【００３７】 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来のイムノグロブ
リン精製法、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー
などによって、好適に、培地、腹水液、または血清から分離される。The monoclonal antibody secreted by the subclone may be purified by conventional immunoglobulin purification methods, such as protein A sepharose, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography, preferably in media, ascites fluid. , Or separated from serum.

【００３８】 本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該分野において公知の方
法、例えば齧歯類抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合でき
るオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に単離、配列決定される。本発明
のハイブリドーマ細胞は、抗体またはそれらのフラグメントをコードする核酸の
好ましい供給源である。単離後、核酸は、発現ベクターまたはクローニングベク
ターに結紮し、次いでこれを宿主細胞に形質転換し、組み換え宿主培養細胞にお
いてモノクローナル抗体が生成されるように、これを培養することができる。Nucleic acids encoding the monoclonal antibodies of the present invention can be readily prepared using methods known in the art, for example, using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the rodent antibody. Isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of nucleic acids encoding the antibodies or fragments thereof. After isolation, the nucleic acid can be ligated into an expression or cloning vector, which can then be transformed into a host cell and cultured such that the monoclonal antibody is produced in recombinant host culture cells.

【００３９】 所望する結合特性を有する抗体を生成することができるハイブリドーマは、抗
体（抗体フラグメントを含む）をコードする核酸を含み、それらを発現すること
ができる宿主細胞として、本発明の範囲内である。また、本発明は、抗体が生成
し、好ましくは分泌される条件下で、抗体を生成することができる細胞を培養す
ることを含む、抗体の生成方法を提供する。[0039] Hybridomas capable of producing antibodies having the desired binding properties include, within the scope of the present invention, host cells that contain nucleic acids encoding the antibodies (including antibody fragments) and that can express them. is there. The present invention also provides a method for producing an antibody, comprising culturing cells capable of producing the antibody under conditions under which the antibody is produced and preferably secreted.

【００４０】 本発明の抗体は、様々な方法で改変することができる。さらに言えば、「抗体
」という用語は、必要とされる特異性を示す結合ドメインを有する全ての結合物
質を網羅するものとして解釈されるべきである。従って、本発明は、抗原または
エピトープ、ここではＰもしくはＡ型イノシトールホスホグリカンに、結合する
ことができる抗体に類似した形状を有する、合成分子と分子を含む、抗体フラグ
メント、誘導体、抗体の機能的均等物および相同体を網羅するものである。The antibodies of the present invention can be modified in various ways. Furthermore, the term "antibody" should be construed as covering all binding substances having a binding domain exhibiting the required specificity. Thus, the present invention relates to antibody fragments, derivatives, functionalities of antibodies, including synthetic molecules and molecules having a shape similar to antibodies capable of binding to an antigen or epitope, here a P or A type inositol phosphoglycan. It is intended to cover equivalents and homologs.

【００４１】 抗原または他の結合対を結合することができる抗体フラグメントの実施例は、
ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨとＣ
Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬとＶＨドメイ
ンからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；単離
されたＣＤＲ領域とＦ（ａｂ’）₂フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィドブ リッジによって連結された二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントで
ある。また、単一鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。Examples of antibody fragments that can bind an antigen or other binding pair include:
Fab fragment consisting of VL, VH, C1 and CH1 domains; VH and C
Fd fragment consisting of VL and VH domains of a single arm of an antibody; dAb fragment consisting of VH domain; isolated CDR region and F (ab ') ₂ fragment; disulfide bridge at hinge region Is a bivalent fragment comprising two Fab fragments joined by Also included are single chain Fv fragments.

【００４２】 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝変異またはそ
の他の変異を受けることができる。さらに、当業者によって、モノクローナル抗
体は、元の抗体の特異性を保持するその他の抗体、ヒト化抗体またはキメラ分子
を作製するための組み換えＤＮＡテクノロジーの技術を受けることができると解
されるであろう。そのような技術は、抗体の、イムノグロブリンの可変領域また
は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの
、定常領域または枠組み領域をつなげた定常領域に導入することを含むことがで
きる。例えば、ＥＰ−Ａ−０１８４１８７、ＧＢ−Ａ−２１８８６３８またはＥ
Ｐ−Ａ−０２３９４００を参照。キメラ抗体のクローニングと発現は、ＥＰ−Ａ
−０１２０６９４とＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。[0042] Hybridomas producing the monoclonal antibodies of the present invention can be subject to genetic or other mutations. Furthermore, it will be appreciated by those skilled in the art that a monoclonal antibody may be amenable to the technology of recombinant DNA technology to produce other antibodies, humanized antibodies or chimeric molecules that retain the specificity of the original antibody. Would. Such techniques include introducing the DNA encoding the immunoglobulin variable or complementarity determining regions (CDRs) of the antibody into the constant regions of different immunoglobulins that link the constant or framework regions. Can be. For example, EP-A-0184187, GB-A-218838 or E
See PA-0239400. The cloning and expression of the chimeric antibody was performed according to EP-A
-0120694 and EP-A-0125023.

【００４３】 薬学的組成物 本発明の抗体は、薬学的組成物中に配合することができる。この実施例では、
Ｐ型ＩＰＧレベルの上昇を伴う病状の前子癇の治療において、Ｐ型ＩＰＧに対す
る特異抗体を用いている。Ｐ型ＩＰＧアンタゴニストを用いた前子癇の治療方法
は、ＷＯ９８／１０７９１において記載されている。Pharmaceutical Compositions The antibodies of the present invention can be formulated in pharmaceutical compositions. In this example,
In the treatment of pre-eclampsia, a condition with elevated P-type IPG levels, specific antibodies to P-type IPG have been used. Methods for treating pre-eclampsia with P-type IPG antagonists are described in WO 98/10791.

【００４４】 薬学的組成物は、一以上の抗体に加えて、薬学的に受容できる賦形剤、担体、
緩衝液、安定剤または当該分野において公知であるその他の物質を含むことがで
きる。そのような物質は、無毒であり、活性成分の効能に干渉しないものである
。担体またはその他の物質の厳密な性質は、投与経路、例えば口、静脈、皮膚も
しくは皮下、鼻、筋内、腹腔内経路に依存する。[0044] The pharmaceutical composition comprises, in addition to the one or more antibodies, a pharmaceutically acceptable excipient, carrier,
Buffers, stabilizers or other materials known in the art can be included. Such substances are non-toxic and do not interfere with the efficacy of the active ingredient. The exact nature of the carrier or other material will depend on the route of administration, eg, oral, venous, dermal or subcutaneous, nasal, intramuscular, intraperitoneal.

【００４５】 経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形状であ
ることができる。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固型担体を含むこ
とができる。液体の薬学的組成物は、通常、液体の担体、例えば水、石油、動物
性油、植物性油、鉱物性油、または合成油であることができる。生理食塩水、ブ
ドウ糖もしくは他のサッカリド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコー
ル、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールが含まれる。[0045] Pharmaceutical compositions for oral administration can be in tablet, capsule, powder or liquid form. A tablet may include a solid carrier such as gelatin or an adjuvant. Liquid pharmaceutical compositions will usually be liquid carriers, such as water, petroleum, animal, vegetable, mineral or synthetic oils. Saline solutions include dextrose or other saccharide solutions or glycols, such as ethylene glycol, propylene glycol, or polyethylene glycol.

【００４６】 静脈、皮膚もしくは皮下注射または苦痛部位への注射の場合は、活性成分が、
発熱性因子を含まず、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、腸管外で受容
できる水溶液の形状とするであろう。当業者は、適切な溶液を、例えば等張性の
媒体、例えば塩化ナトリウム液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などを用いて、
調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤、および／またはそ
の他の添加剤を必要に応じて含むことができる。In the case of intravenous, cutaneous or subcutaneous injection or injection into a site of distress, the active ingredient may comprise
It will be in the form of a parenterally acceptable aqueous solution that is free of pyrogenic factors and has suitable pH, isotonicity and stability. Those skilled in the art will appreciate that a suitable solution can be prepared using, for example, an isotonic medium such as sodium chloride solution, Ringer's solution, lactated Ringer's solution,
Can be prepared. Preservatives, stabilizers, buffers, antioxidants, and / or other additives may optionally be included.

【００４７】 好ましくは、本発明の薬学的に有用な化合物は、「予防に有効な量で」または
「治療に有効な量で」（場合によっては、予防が治療であると見なされるが）投
与され、これは個々に効果が示される十分量である。典型的には、これにより、
例えば、有益な範囲で、Ｐおよび／またはＡ型ＩＰＧの一以上の生物学的活性に
拮抗する抗体を用いて、治療的に有用な効果が患者にもたらされるであろう。実
際に投与される抗体の量、投与の速度と時間推移は、治療される病状の性質と重
篤度に依存する。治療の処方、例えば投薬の決定などは、通常の臨床医と他の医
者の責任の範囲内であり、典型的には、治療される障害、各患者の病状、送達部
位、投与方法および臨床医に公知のその他のファクターが考慮される。上記技術
と方法の実施例は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版、Oslo,A（版
）、1980において記載されている。Preferably, the pharmaceutically useful compounds of the present invention are administered “in a prophylactically effective amount” or “in a therapeutically effective amount” (although in some cases prophylaxis is considered therapeutic). This is a sufficient amount to show the effect individually. Typically this gives
For example, antibodies that, to the extent beneficial, antagonize one or more of the biological activities of P and / or Type A IPG will have a therapeutically beneficial effect in the patient. The actual amount of antibody administered, rate and time-course of administration, will depend on the nature and severity of the condition being treated. Prescribing treatment, such as dosing decisions, is within the responsibilities of the usual clinician and other physicians, and typically includes the disorder being treated, the condition of each patient, the site of delivery, the mode of administration, and the clinician. Other factors that are known from US Pat. Examples of the above techniques and methods are described in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oslo, A (ed.), 1980.

【００４８】 実施例として、ＩＰＧに関連した病状の型と重篤度に応じて、組成物は、約０
．０１から２０ｍｇ抗体／ｋｇ患者体重、より好ましくは０．０２から１０ｍｇ
抗体／ｋｇ患者体重の初期用量で投与することができる。上記のように、他の用
量処方計画および組成物中に含まれる抗体の適切な量は、当業者であれば容易に
決定することができる。By way of example, depending on the type and severity of the condition associated with IPG, the composition may comprise about 0
. 01 to 20 mg antibody / kg patient weight, more preferably 0.02 to 10 mg
It can be administered at an initial dose of antibody / kg patient weight. As noted above, other dosage regimens and appropriate amounts of antibody to include in the composition can be readily determined by one skilled in the art.

【００４９】 イムノアッセイ 上記抗体は、異なる様々なアッセイ形式で、本発明の診断面において用いるこ
とができる。抗体は、ＩＰＧに特異的に結合できる結合剤として、または試験試
料に曝した後に、被検体によって占められた結合剤の結合部位の画分を測定する
ための現像剤として用いることができる。Immunoassays The antibodies described above can be used in the diagnostic aspects of the invention in a variety of different assay formats. The antibody can be used as a binding agent that can specifically bind to IPG or as a developer after exposure to a test sample to determine the fraction of the binding site of the binding agent occupied by the analyte.

【００５０】 いくつかの場合において、抗体の使用、特にアッセイにおける現像剤としての
抗体の使用は、検出できて、好ましくは測定できるシグナルを、直接的もしくは
間接的に産出することができる、標識もしくはレポーター分子で、それらを標識
することを含む。レポーター分子の連結は、直接的もしくは間接的に、例えばペ
プチド結合を介した共有結合または非共有結合とすることができる。ペプチド結
合を介した連結は、抗体とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組み換え
発現により得ることができる。Hunterら、Nature,144:945,1962；Davidら、Bioc
hemistry 13:1014,1974；Painら、J.Immunol.Meth.40:219,1981；およびNygren 、J.Histochem.and Cytochem.30:407,1982に記載された方法を含む、抗体を検出
可能部分に別々に結合させるための当該分野において公知のあらゆる方法を、用
いることができる。In some cases, the use of an antibody, particularly an antibody as a developer in an assay, can produce a detectable, preferably measurable, signal, directly or indirectly, on a label or Labeling them with a reporter molecule. The linkage of the reporter molecule can be direct or indirect, for example, via a peptide bond, covalent or non-covalent. Linkage via a peptide bond can be obtained by recombinant expression of a gene fusion encoding the antibody and the reporter molecule. Hunter et al., Nature, 144: 945,1962; David et al., Bioc
hemistry 13: 1014, 1974; antibody detectable moieties, including the methods described in Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219,1981; and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407,1982. Any method known in the art for separately conjugating to the can be used.

【００５１】 好ましい一態様は、スペクトル的に単離された吸光もしくは発光特性を有する
、各蛍光色素、蛍光体もしくはレーザー染料との各抗体の共有結合による。適し
た蛍光色素は、フルオロレセイン、ローダミン、ルシフェリン、フィコエリスリ
ンおよびテキサスレッドを含む。適した発色性染料は、ジアミノベンジジンを含
む。他の検出できる標識は、放射性同位元素標識、例えば、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、^{3 5} Ｓ、¹²⁶Ｉまたは^99mＴｃと、検出できる反応生成物をもたらす反応を触媒し、 シグナルを増幅することができる酵素標識、例えばアルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。One preferred embodiment is by covalent attachment of each antibody to each fluorescent dye, fluorophore or laser dye having spectrally isolated absorption or emission properties. Suitable fluorescent dyes include fluororesin, rhodamine, luciferin, phycoerythrin and Texas Red. Suitable chromogenic dyes include diaminobenzidine. Label capable other detection radioisotope labels, for ^{example, 3 H, 14 C, 32} P, 3 and ⁵ S, ¹²⁶ I or ^99m Tc, and catalyzes a reaction resulting in a reaction product that can be detected, to amplify the signal Enzyme labels, such as alkaline phosphatase, β
-Including galactosidase or horseradish peroxidase.

【００５２】 他のレポーターは、視覚的に観察される、電気的に検出される、もしくは別様
に記録される、検出可能なシグナルを、直接的もしくは間接的にもたらすことが
できる、着色された、磁性もしくは常磁性の、生物学的もしくは化学的に活性な
試薬である、高分子コロイド粒子または例えばラテックスビーズなどの微粒子物
質を含む。これらの分子は、例えば、着色するもしくは変色する、または電気的
特性を変化させる反応を、触媒する酵素であることができる。これらは、エネル
ギー状態間の電気的遷移により、特徴的なスペクトル吸収もしくは発光を生じる
ような、分子反応性であることができる。これらは、バイオセンサーと結合して
用いられた化学的な存在を含むことができる。Other reporters are colored, which can directly or indirectly provide a detectable signal that is visually observed, electrically detected, or otherwise recorded. , Magnetic or paramagnetic, biologically or chemically active reagents, including polymeric colloidal particles or particulate matter such as latex beads. These molecules can be, for example, enzymes that catalyze reactions that change color or discolor or change electrical properties. These can be molecularly reactive such that electrical transitions between energy states cause characteristic spectral absorption or emission. These can include the chemical entities used in conjunction with the biosensor.

【００５３】 あるいは、またはさらに、抗体は、試料中に存在する他の物質に優先して、Ｉ
ＰＧと特異的に結合できることから、抗体を結合剤として用いることができる。
好適には、結合剤は、アッセイ中にそれらを容易に操作できるように、固型支持
物上に、例えば定義した部位で、固定化する。これは、例えば、固型支持物に抗
体を化学的に結合させるためのビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプト
アビジンを用いるなど、物理吸着または化学吸着などの当該分野に公知の技術を
用いて行うことができる。通常、試料中に存在するＰおよびＡ型ＩＰＧが結合剤
に結合できるように、適切な条件下で、結合試薬と試料を接触させる。次いで、
結合剤の結合部位の画分占有率を、現像剤を用いて測定することができる。Alternatively, or in addition, the antibody may have a higher I.sub.2 value than other substances present in the sample.
Since it can specifically bind to PG, an antibody can be used as a binder.
Suitably, the binding agents are immobilized on a solid support, for example, at defined sites, so that they can be easily manipulated during the assay. This can be done using techniques known in the art, such as physical adsorption or chemisorption, such as using biotin / avidin or biotin / streptavidin to chemically bind the antibody to the solid support. it can. Usually, the sample is contacted with the binding reagent under suitable conditions so that the P and A type IPG present in the sample can bind to the binding agent. Then
The fraction occupancy of the binding site of the binding agent can be measured using a developer.

【００５４】 上記のように、現像剤は、当該分野における公知の技術を用いて検出すること
ができるように、（例えば、放射能標識、蛍光標識または酵素標識で）標識する
。従って、放射能標識は、シンチレーションカウンターまたは他の放射線計数装
置を用いて検出することができ、蛍光標識は、レーザーもしくは共焦点顕微鏡を
用いて検出することができ、酵素標識は、基質における酵素標識の作用、典型的
には、色の変化を生じる作用によって検出することができる。結合剤の占有結合
部位に対して、現像剤が被検体と競合する競合的方法において、または結合剤と
結合した、もしくは占有結合部位に結合した被検体と標識化現像剤が結合する非
競合的方法において、現像剤を用いることができる。両方の方法により、被検体
によって占有された結合部位の画分が示され、これにより試料中の被検体濃度が
、例えば被検体の既知濃度を含む試料を用いて得られた標準と比較して、示され
る。As noted above, the developer is labeled (eg, with a radioactive, fluorescent, or enzymatic label) so that it can be detected using techniques known in the art. Thus, a radioactive label can be detected using a scintillation counter or other radiation counter, a fluorescent label can be detected using a laser or confocal microscope, and an enzyme label can be detected using an enzyme label on a substrate. , Typically, an effect that causes a color change. In a competitive manner in which the developer competes with the analyte for the occupied binding site of the binder, or in a non-competitive manner in which the labeled developer binds the analyte bound to the binder or bound to the occupied binding site In the method, a developer can be used. Both methods show the fraction of the binding site occupied by the analyte, which allows the analyte concentration in the sample to be compared to a standard obtained using a sample containing, for example, a known concentration of the analyte. , Shown.

【００５５】 診断的アッセイは、患者からの生物学的試料を用いて行われる。これらの試料
は、直接的に用いられることができ、またはいくつかの事例においては、アッセ
イを行う前に処置、例えば干渉する可能性のある試料中の物質を除去することな
どを必要とすることができる。適した生物学的試料の例は、血液、尿、汗、組織
または血清である。[0055] Diagnostic assays are performed using biological samples from patients. These samples can be used directly or, in some cases, require treatment before performing the assay, such as removing potentially interfering substances in the sample. Can be. Examples of suitable biological samples are blood, urine, sweat, tissue or serum.

【００５６】 一実施態様において、本発明は、Ｉ型糖尿病が進行している恐れのある患者を
診断する方法に関し、該方法は、以下の工程を含む： （ａ）患者から得られた生物学的試料を、Ｐおよび／またはＡ型ＩＰＧと特異
的に結合できる抗体を固定化した固型支持物と接触させること； （ｂ）固型支持物を、抗体の未占有結合部位、結合ＩＰＧまたは抗体の占有結
合部位に結合できる標識化現像剤と接触させること；および、 （ｃ）試料中におけるＩＰＧの濃度に相応する値を得るために、工程（ｂ）に
おいて特異的に結合している現像剤の標識を検出すること。In one embodiment, the present invention relates to a method of diagnosing a patient at risk of developing type I diabetes, comprising the following steps: (a) Biology obtained from the patient Contacting the target sample with a solid support having immobilized thereon an antibody capable of specifically binding to P and / or A type IPG; (b) contacting the solid support with an unoccupied binding site for the antibody, bound IPG or Contacting with a labeled developer capable of binding to the occupied binding site of the antibody; and (c) developing specifically bound in step (b) to obtain a value corresponding to the concentration of IPG in the sample. To detect the label of the agent.

【００５７】 さらなる実施態様において、本発明は、患者における前子癇を診断するための
方法を提供し、該方法は以下を含む： （ａ）患者の生物学的試料を、請求項２から５のいずれか一つの抗ＩＰＧ抗体
と接触させること；および、 （ｂ）試料中におけるＩＰＧの抗ＩＰＧ抗体に対する結合を測定すること。In a further embodiment, the present invention provides a method for diagnosing pre-eclampsia in a patient, the method comprising: (a) obtaining a biological sample of the patient according to claims 2 to 5 Contacting with any one anti-IPG antibody; and (b) measuring the binding of IPG to the anti-IPG antibody in the sample.

【００５８】 典型的には、試料中におけるＩＰＧの抗ＩＰＧ抗体に対する結合を、対照試料
、例えば糖尿病でない人、または特定の型の糖尿病であることがわかっている人
、例えば進行性Ｉ型糖尿病もしくは前子癇標準を有することがわかっている患者
の試料において生じた結合量と比較する。以下に例示した方法において、これは
、最初に患者にグルコース負荷し、グルコース負荷後のＩＰＧの応答を測定する
ことによって、アッセイする。次いで、診断するために、試料から測定されたＩ
ＰＧの推移またはレベルを、標準から得られた推移またはレベルと比較する。Typically, the binding of IPG to an anti-IPG antibody in a sample is determined by a control sample, eg, a non-diabetic person, or a person known to have a particular type of diabetes, eg, progressive type I diabetes or Compared to the amount of binding generated in a sample of a patient known to have a pre-eclampsia standard. In the method exemplified below, this is assayed by first loading the patient with glucose and measuring the response of the IPG after the glucose load. The I measured from the sample is then
The course or level of PG is compared to the course or level obtained from the standard.

【００５９】 従って、好ましくは、該方法は、患者がＩ型糖尿病を進行している恐れがある
かどうか、または前子癇を有するかどうかを診断するために、試料中のＩＰＧ濃
度に相応する値を、既知標準から得られた値に相関させる工程を、さらに含む。Thus, preferably, the method comprises the step of diagnosing whether the patient is at risk of developing type I diabetes, or having pre-eclampsia, the value corresponding to the IPG concentration in the sample. Further correlating with a value obtained from a known standard.

【００６０】 本発明の抗体は、あらゆる公知の方法、例えば競合的結合アッセイ、直接的お
よび間接的サンドウィッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclona
l Antibodies: A Manual of Techniques,pp147-158（CRC Press社、1987）参照]
、において用いられることができる。The antibodies of the present invention can be prepared by any known method, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays [Zola, Monoclona
l Antibodies: A Manual of Techniques, pp147-158 (CRC Press, 1987)]
, Can be used.

【００６１】 サンドウィッチアッセイは、各々、検出されるＩＰＧの異なる免疫性部位もし
くはエピトープに、結合できる二つの抗体の使用を含む。サンドウィッチアッセ
イにおいて、試験試料の被検体を、固型支持物上に固定化されている一次抗体と
結合させた後、該被検体に二次抗体を結合させて、不溶性の三部複合体を形成さ
せる。二次抗体は、それ自体を検出できる部分で標識することができ、または検
出できる部分で標識した抗イムノグロブリン抗体を用いて測定することができる
（間接的サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一つの
型は、検出できる部分が酵素であるＥＬＩＳＡアッセイである。The sandwich assay involves the use of two antibodies, each of which can bind to a different immune site or epitope of the IPG to be detected. In a sandwich assay, a test sample analyte is bound to a primary antibody immobilized on a solid support, and then a secondary antibody is bound to the analyte to form an insoluble three-part complex. Let it. The secondary antibody can be labeled with a moiety that can detect itself, or can be measured using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable moiety (indirect sandwich assay). For example, one type of sandwich assay is an ELISA assay where the detectable moiety is an enzyme.

【００６２】 また、本発明の抗体は、インビボでのイメージングに有用であり、ここで、抗
体は、放射性同位元素などの検出できる部分で標識され、宿主に、好ましくは血
流中に投与され、宿主における標識化抗体の存在と局在がアッセイされる。この
抗体は、核磁気共鳴、Ｘ線透視、または当該分野において公知のその他の検出手
段によって、宿主において検出できるあらゆる部分で、標識することができる。The antibodies of the present invention are also useful for in vivo imaging, wherein the antibodies are labeled with a detectable moiety, such as a radioisotope, and administered to a host, preferably in the bloodstream, The presence and localization of the labeled antibody in the host is assayed. The antibody can be labeled with any moiety that can be detected in the host by nuclear magnetic resonance, fluoroscopy, or other detection means known in the art.

【００６３】 アフィニティー精製 また、本発明の抗体は、アフィニティー精製剤としても有用である。この方法
において、抗体は、適した支持物、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ^R樹脂もしくは濾紙 上に、当該分野に公知の方法を用いて固定化する。次いで、精製すべきＩＰＧを
含む試料と固定化した抗体を接触させた後、固定化抗体に結合するＩＰＧ以外の
試料中の全物質を完全に除去するであろう適した溶剤で、支持物を洗浄する。最
後に、支持物を、抗体からＩＰＧを遊離させるであろう他の適した溶剤、例えば
グリシン緩衝液、ｐＨ３−５で洗浄する。また、この方法は、与えられたＩＰＧ
ファミリーメンバーを、ＩＰＧの混合物から、他のファミリーメンバーに優先し
てＩＰＧを特異的に結合できる抗体を用いることによって、分離するために用い
ることができる。Affinity Purification The antibodies of the present invention are also useful as affinity purification agents. In this manner, the antibodies suitable support material, for example Sephadex ^R resin or filter paper, immobilized using methods known in the art. The sample containing IPG to be purified is then contacted with the immobilized antibody, and the support is then washed with a suitable solvent that will completely remove all material in the sample other than IPG that binds to the immobilized antibody. Wash. Finally, the support is washed with another suitable solvent that will release IPG from the antibody, such as glycine buffer, pH 3-5. Also, the method is based on a given IPG
Family members can be used to separate from a mixture of IPGs by using antibodies capable of specifically binding IPGs over other family members.

【００６４】[0064]

【実施例】【Example】

実施例１ イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）に対するポリクローナルおよびモノク
ローナル抗体の作製 連続薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってラット肝臓から精製されたＧ
ＰＩをＰＩ−ＰＬＣ処理して得られたイノシトールホスホグリカン（可溶型）を
、以下に記載のように、ニュージーランドウサギとＢａｌｂ／ｃマウスを免疫す
るために用いた。あるいは、ヒトＩＰＧを、Ｃａｒｏら、１９９７において記載
された方法を用いて得ることもできた。Example 1 Generation of Polyclonal and Monoclonal Antibodies to Inositol Phosphoglycan (IPG) G Purified from Rat Liver by Continuous Thin Layer Chromatography (TLC)
Inositol phosphoglycan (soluble form) obtained by treating PI with PI-PLC was used to immunize New Zealand rabbits and Balb / c mice as described below. Alternatively, human IPG could be obtained using the method described in Caro et al., 1997.

【００６５】 ウサギの免疫方法 二匹のニュージーランドウサギを麻酔し、次いで１ｍｌのフロイント完全アジ
ュバント（ＣＦＡ）と共に、１ｍｌのＰＢＳ中に混合した７５０μｇのＩＰＧ（
可溶型）で免疫した。抗原−アジュバントエマルジョンを皮内注射（ｉｄ）で１
．５ｍｌ、筋内（ｉｍ）注射で０．５ｍｌ投与した。Rabbit Immunization Method Two New Zealand rabbits were anesthetized and then 750 μg of IPG (1 μm) mixed in 1 ml PBS with 1 ml Freund's complete adjuvant (CFA).
(Soluble form). Intradermal injection (id) of antigen-adjuvant emulsion to 1
. 5 ml, 0.5 ml by intramuscular (im) injection.

【００６６】 一ヶ月後、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を用いた以外は、この方
法を繰り返して行い、皮下（ｓｃ）注射で１．５ｍｌ、筋内（ｉｍ）注射で０．
５ｍｌ投与した。これを再度、６０、９０、１２０及び１５０日目に繰り返した
。One month later, the procedure was repeated, except that Freund's Incomplete Adjuvant (IFA) was used, 1.5 ml for subcutaneous (sc) injection and 0.1 ml for intramuscular (im) injection.
5 ml was administered. This was repeated again on days 60, 90, 120 and 150.

【００６７】 マウスの免疫方法 生後六週目のメスのＢａｌｂ／ｃマウス四匹を、２５０μｌのＣＦＡと共に、
２５０μｌＰＢＳ中に混合した６０μｇのＩＰＧ（可溶型）で免疫した。抗原−
アジュバントエマルジョンを、腹腔内（ｉｐ）注射で投与した。Method of Immunization of Mice Four female Balb / c mice, 6 weeks old, were combined with 250 μl of CFA,
Immunization was performed with 60 μg IPG (soluble) mixed in 250 μl PBS. Antigen
The adjuvant emulsion was administered by intraperitoneal (ip) injection.

【００６８】 ２１日後、ＩＦＡを用いた以外は同様にして、注射を繰り返した。４２と６３
日目に、全ての動物にＩＦＡをｉｐで投与した。８４日目に、最良のレスポンダ
ー（responder）に、６０μｇのＩＰＧを含む１００μｌＰＢＳを静脈内（ｉｖ ）注射し、６０μｇのＩＰＧを含む１００μｌＰＢＳをｉｐ注射した。８７日後
、最良のレスポンダーの脾細胞をミエローマ細胞に通常の技術を用いて融合した
。モニターテスト採血を定期的に行った。After 21 days, the injection was repeated in the same manner except that IFA was used. 42 and 63
On the day, all animals received IFA ip. On day 84, the best responders were injected intravenously (iv) with 100 μl PBS containing 60 μg IPG and ip injected with 100 μl PBS containing 60 μg IPG. After 87 days, the best responder splenocytes were fused to myeloma cells using conventional techniques. Monitor test blood samples were taken periodically.

【００６９】 実施例２ 間接的ＥＬＩＳＡアッセイ 以下の間接的ＥＬＩＳＡアッセイ方法を、モノクローナル抗体をスクリーニン
グするために用いた。Example 2 Indirect ELISA Assay The following indirect ELISA assay method was used to screen monoclonal antibodies.

【００７０】 全ての工程で１００μｌ／ウェルを添加する。 （１）ＰＢＳで１：８００希釈したＩＰＧを、F96Polysorp Nunc-Immunoプレ ートに添加する。少なくとも７日間、４℃でインキュベーションする。 （２）ＰＢＳで三回洗浄する。 （３）蒸留水中のＥＬＩＳＡ用ブロッキング剤（Boehringer Mannheim）（１ ：１０ｖ／ｖ）を、室温で２時間添加する。 （４）ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で、三回洗浄する。 （５）精製したモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体（ＰＢＳで
、１：１２．５から１：３２００までの間で希釈したもの）を、４℃で一晩添加
する。 （６）ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で、三回洗浄する。 （７）モノクローナル抗体を前添加している場合は、抗マウスＩｇＭビオチン
化全抗体（ヤギ由来）（Amersham）を、または、ポリクローナル抗体を前添加し
ている場合は、抗ウサギＩｇビオチン化種特異的全抗体（ロバ由来）（Amersham
）を、それぞれＰＢＳで１：１０００希釈し、室温で１時間３０分間添加する。 （８）ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で、三回洗浄する。 （９）ＰＢＳで１：５００希釈した、ストレプトアビジン−ビオチン化西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体（Amersham）を、室温で１時間３０分間添加する。 （１０）ＰＢＳで三回洗浄する。 （１１）２，２−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン・スルホナート
（６））二アンモニウム結晶塩（ＡＢＴＳ）を、ＡＢＴＳ用緩衝液（Boehringer Mannheim）に添加する：ＡＢＴＳ用緩衝液は蒸留水（１：１０ｖ／ｖ）に添加 する。１ｍｇのＡＢＴＳを、１ｍｌの希釈したＡＢＴＳ用緩衝液に添加する。 （１２）Multiskan Plus P2.01において、４０５ｎｍのフィルターを用い、５
−１５分後における吸光度を読み取る。Add 100 μl / well for all steps. (1) Add IPG diluted 1: 800 with PBS to F96 Polysorp Nunc-Immuno plate. Incubate at 4 ° C. for at least 7 days. (2) Wash three times with PBS. (3) A blocking agent for ELISA (Boehringer Mannheim) (1:10 v / v) in distilled water is added at room temperature for 2 hours. (4) Wash three times with PBS-Tween20 (0.1%). (5) Add purified monoclonal and / or polyclonal antibody (diluted in PBS from 1: 12.5 to 1: 3200) at 4 ° C. overnight. (6) Wash three times with PBS-Tween20 (0.1%). (7) Anti-mouse IgM biotinylated whole antibody (from goat) (Amersham) if monoclonal antibody is pre-added, or anti-rabbit Ig biotinylated species specific if polyclonal antibody is pre-added Target antibody (from donkey) (Amersham
) Are each diluted 1: 1000 in PBS and added at room temperature for 1 hour 30 minutes. (8) Wash three times with PBS-Tween20 (0.1%). (9) Add streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase complex (Amersham) diluted 1: 500 in PBS for 1 hour 30 minutes at room temperature. (10) Wash three times with PBS. (11) Add 2,2-azino-di- (3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)) diammonium crystal salt (ABTS) to a buffer for ABTS (Boehringer Mannheim): The buffer for ABTS is distilled. Add to water (1:10 v / v). Add 1 mg ABTS to 1 ml diluted ABTS buffer. (12) In Multiskan Plus P2.01, using a 405 nm filter, 5
Read the absorbance after 15 minutes.

【００７１】 コメント： 用いた溶媒は、リン酸緩衝塩（ＰＢＳ）ｐＨ７．２またはＰＢＳ−Tween20（ ０．１％）である。Comments: The solvent used is phosphate buffered saline (PBS) pH 7.2 or PBS-Tween20 (0.1%).

【００７２】 工程１：ＩＰＧ（可溶型）は、間接的ＥＬＩＳＡにおいて用いる（初期濃度は
約６０μＭ）。作用希釈度は、通常、１：４００から１：８００の間である。Step 1: IPG (soluble form) is used in an indirect ELISA (initial concentration about 60 μM). The working dilution is usually between 1: 400 and 1: 800.

【００７３】 複数のインキュベーション時間で実験を行った。おそらくインキュベーション
時間を長くすればするほど、固相に結合するＩＰＧ分子の数が増加するため、イ
ンキュベーション時間が４℃で少なくとも７日間の場合に、最良でより再現性に
優れた結果を得た。Experiments were performed with multiple incubation times. Perhaps longer incubation times resulted in the best and more reproducible results when the incubation time was at least 7 days at 4 ° C., since the number of IPG molecules bound to the solid phase increased.

【００７４】 工程３：ＥＬＩＳＡ用ブロッキング剤は、Boehringer Mannheimの登録商品で ある。溶液を調製するために、我々は、１００ｍｌの蒸留水に内容物（２７ｇ）
を溶解しなければならい。室温で水を約３０分間攪拌する。該濃度は、−２０℃
で分注して保存する場合に安定である。使用する場合は、一アリコートを、再蒸
留水で１：１０の割合で希釈し、５０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、
ｐＨｃａ．７．４中、精製されたゼラチンのタンパク質分解によって得られたタ
ンパク混合物１％（ｗ／ｖ）を含む作用溶液を作製する。Step 3: The blocking agent for ELISA is a registered product of Boehringer Mannheim. To prepare the solution, we add the contents (27 g) to 100 ml of distilled water.
Must be dissolved. Stir the water at room temperature for about 30 minutes. The concentration is −20 ° C.
Stable when dispensing and storing. If used, one aliquot was diluted 1:10 in double distilled water and mixed with 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl,
pHca. In 7.4, make a working solution containing 1% (w / v) of the protein mixture obtained by proteolysis of the purified gelatin.

【００７５】 工程５：精製したモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を、間接
的ＥＬＩＳＡに用いる（初期濃度は約２ｍｇ／ｍｌ）。作用希釈度は、通常、１
：１００から１：２００の間であり、各々、得られる最終濃度は、２０μｇ／ｍ
ｌと１０μｇ／ｍｌである。Step 5: The purified monoclonal and / or polyclonal antibodies are used for an indirect ELISA (initial concentration about 2 mg / ml). The working dilution is usually 1
: Between 100 and 1: 200, each yielding a final concentration of 20 μg / m
1 and 10 μg / ml.

【００７６】 迅速なアッセイの場合、インキュベーション時間は、室温で２時間とすること
ができる。For rapid assays, the incubation time can be 2 hours at room temperature.

【００７７】 工程７：抗ウサギと抗マウス抗体を、保存用ボトルから直接１：１０００希釈
で用いる。保存用ボトルは、２−８℃で保存する。これらの条件下で、製品は、
あらゆる残留液が除去された後でも、少なくとも６ヶ月間安定である。Step 7: Use anti-rabbit and anti-mouse antibodies at a 1: 1000 dilution directly from the storage bottle. Store the storage bottles at 2-8 ° C. Under these conditions, the product
It is stable for at least 6 months even after any residual liquid has been removed.

【００７８】 １ｍｌのビオチン化剤を、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンと０．０５％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝塩中に補
充する。One ml of biotinylating agent was added to 1% (w / v) bovine serum albumin and 0.05%
(W / v) Replenish in 0.1 M phosphate buffer salt, pH 7.5, containing sodium azide.

【００７９】 工程９：ストレプトアビジン−ビオチン化／ＨＲＰを、保存用ボトルから直接
１：５００希釈で用いる。保存用ボトルは２−８℃で保存する。これらの条件下
で、製品は、あらゆる残留液が除去された後も、少なくとも３ヶ月間安定である
。Step 9: Use streptavidin-biotinylated / HRP at a 1: 500 dilution directly from the storage bottle. Store the storage bottle at 2-8 ° C. Under these conditions, the product is stable for at least 3 months after any residual liquid has been removed.

【００８０】 複合体を、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンと抗菌剤を含むリン酸緩衝塩ｐ
Ｈ７．５２ｍｌ中に補充する。The conjugate was prepared using phosphate buffer p containing 1% (w / v) bovine serum albumin and an antimicrobial agent.
Refill in 7.52 ml H.

【００８１】 工程１１：ＡＢＴＳ緩衝液は、Boehringer Mannheimの登録商品である。該溶 液は、ホウ酸ナトリウム、クエン酸およびリン酸化水素二ナトリウムからなる。
該溶液は、−２０℃で１ｍｌのアリコートで保存する。使用する場合は、再蒸留
水で１：１０の割合で一アリコートを希釈する。Step 11: ABTS buffer is a registered product of Boehringer Mannheim. The solution consists of sodium borate, citric acid and disodium hydrogen phosphate.
The solution is stored in 1 ml aliquots at -20 ° C. If used, dilute an aliquot 1:10 in double distilled water.

【００８２】 実施例３ サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ 以下のＥＬＩＳＡ方法を、寄託したモノクローナル抗体を用いたＩＰＧアッセ
イの実施例として提供する。Example 3 Sandwich ELISA Assay The following ELISA method is provided as an example of an IPG assay using the deposited monoclonal antibody.

【００８３】 全ての工程で、１００μｌ／ウェルを添加する。 （１）抗ＩＰＧモノクローナル抗体を、ＰＢＳ中１：１００希釈し、Ｆ９６Ｍ
ａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレートに添加した。該プレートを、
４℃で少なくとも二日間インキュベーションした。 （２）該プレートを、ＰＢＳで三回洗浄した。 （３）蒸留水中のＥＬＩＳＡ用ブロッキング剤（Boehringer Mannheim）（１ ．５：１０ｖ／ｖ）を、室温で２時間添加した。 （４）該プレートを、ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で三回洗浄した。 （５）ＰＢＳ中１：４で希釈したヒト血清を、４℃で一晩、プレートに添加し
た。 （６）該プレートを、ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で三回洗浄した。 （７）精製したポリクローナル抗体（ＰＢＳ中、１：１００希釈したもの）を
、４℃で一晩添加した。 （８）該プレートを、ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で三回洗浄した。 （９）抗ウサギＩｇビオチン化種特異的全抗体（ロバ由来）（Amersham）を、
ＰＢＳ中１：１０００希釈し、室温で１時間３０分間、プレートに添加した。 （１０）ＰＢＳ−Tween20（０．１％）で三回洗浄した。 （１１）ＰＢＳ中１：５００希釈した、ストレプトアビジン−ビオチン化西洋
ワサビペルオキシダーゼ複合体（Amersham）を、室温で１時間３０分間添加した
。 （１２）該プレートを、ＰＢＳで三回洗浄した。 （１３）２，２−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン・スルホナート
（６））二アンモニウム結晶塩（ＡＢＴＳ）を、ＡＢＴＳ用緩衝液（Boehringer Mannheim）に添加した。該ＡＢＴＳ緩衝液は、蒸留水に添加した（１：１０ｖ ／ｖ）。１ｍｇのＡＢＴＳを、希釈したＡＢＴＳ用緩衝液１ｍｌに添加した。 （１４）Multiskan Plus P2.01において、４０５ｎｍのフィルターを用い、１
５−３０分後における吸光度を読み取る。Add 100 μl / well for all steps. (1) Anti-IPG monoclonal antibody was diluted 1: 100 in PBS, and F96M
Axisorp Nunc-Immuno plates were added. The plate is
Incubate at 4 ° C for at least 2 days. (2) The plate was washed three times with PBS. (3) A blocking agent for ELISA (Boehringer Mannheim) (1.5: 10 v / v) in distilled water was added at room temperature for 2 hours. (4) The plate was washed three times with PBS-Tween20 (0.1%). (5) Human serum diluted 1: 4 in PBS was added to the plate at 4 ° C. overnight. (6) The plate was washed three times with PBS-Tween20 (0.1%). (7) A purified polyclonal antibody (diluted 1: 100 in PBS) was added at 4 ° C. overnight. (8) The plate was washed three times with PBS-Tween20 (0.1%). (9) Anti-rabbit Ig biotinylated species-specific whole antibody (from donkey) (Amersham)
Dilute 1: 1000 in PBS and add to the plate for 1 hour 30 minutes at room temperature. (10) The plate was washed three times with PBS-Tween20 (0.1%). (11) Streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase complex (Amersham) diluted 1: 500 in PBS was added for 1 hour 30 minutes at room temperature. (12) The plate was washed three times with PBS. (13) 2,2-Azino-di- (3-ethylbenzthiazoline sulfonate (6)) diammonium crystal salt (ABTS) was added to a buffer solution for ABTS (Boehringer Mannheim). The ABTS buffer was added to distilled water (1:10 v / v). 1 mg of ABTS was added to 1 ml of diluted ABTS buffer. (14) In Multiskan Plus P2.01, using a 405 nm filter,
Read the absorbance after 5-30 minutes.

【００８４】 コメント： 用いた溶媒は、リン酸緩衝塩（ＰＢＳ）ｐＨ７．２またはＰＢＳ−Tween20（ ０．１％）である。Comments: The solvent used is phosphate buffered saline (PBS) pH 7.2 or PBS-Tween20 (0.1%).

【００８５】 工程１：実施例では、サンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて、精製した
モノクローナル抗体２Ｄ１を用いた（初期濃度は２．５ｍｇ／ｍｌ）。作用希釈
度は、通常、１：１００から１：２００の範囲であり、最終濃度は、それぞれ２
５μｇ／ｍｌと１２．５μｇ／ｍｌである。該アッセイにおいて用いたインキュ
ベーション時間は、変更することができる。迅速なアッセイの場合は、インキュ
ベーション時間を、室温で２時間もしくは４℃で一晩に変更することができる。
しかしながら、インキュベーション時間が、４℃で少なくとも二日間である場合
に、改善された結果が得られる。この改善は、インキュベーション時間を長くす
ればするほど、固相に結合するモノクローナル抗体分子の数が増加することによ
る。Step 1: In the examples, the purified monoclonal antibody 2D1 was used in a sandwich ELISA assay (2.5 mg / ml initial concentration). Working dilutions usually range from 1: 100 to 1: 200, with final concentrations of 2
5 μg / ml and 12.5 μg / ml. The incubation time used in the assay can be varied. For rapid assays, the incubation time can be changed to 2 hours at room temperature or overnight at 4 ° C.
However, improved results are obtained when the incubation time is at least 2 days at 4 ° C. This improvement is due to the fact that the longer the incubation time, the greater the number of monoclonal antibody molecules bound to the solid phase.

【００８６】 工程３：ＥＬＩＳＡ用のブロッキング剤は、Boehringer Mannheimの登録商品 である。溶液を調製するために、内容物（２７ｇ）を、１００ｍｌの蒸留水中、
室温で約３０分間攪拌して溶解させた。該濃度は、−２０℃で分注して保存する
場合に安定である。使用する場合は、アリコートを、再蒸留水で１：１０の割合
で希釈し、５０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨｃａ．７．４中、精
製されたゼラチンのタンパク質分解によって得られたタンパク混合物１％（ｗ／
ｖ）を含む作用溶液を作製した。Step 3: The blocking agent for ELISA is a registered product of Boehringer Mannheim. To prepare the solution, the contents (27 g) are taken up in 100 ml of distilled water
Stir at room temperature for about 30 minutes to dissolve. The concentration is stable when dispensed and stored at -20 ° C. If used, aliquots are diluted 1:10 in double distilled water, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pHca. In 7.4, a 1% (w / w) protein mixture obtained by proteolysis of purified gelatin
Working solution containing v) was prepared.

【００８７】 工程５：ヒト血清は、複数の希釈度（１：１、１：２、１：４・・・）で検査
した。作用希釈度は、通常、１：２から１：４の間である。複数の希釈度におけ
るＩＰＧを、標準（陽性対照）として用いた。血清不含のウェルを、陰性対照と
して用いた。Step 5: Human serum was tested at multiple dilutions (1: 1, 1: 2, 1: 4 ...). Working dilutions are usually between 1: 2 and 1: 4. IPG at multiple dilutions was used as a standard (positive control). Serum-free wells were used as negative controls.

【００８８】 迅速なアッセイの場合、インキュベーション時間は、室温２時間とした。For the rapid assay, the incubation time was 2 hours at room temperature.

【００８９】 工程７：精製したポリクローナル抗体を、サンドウィッチＥＬＩＳＡにおいて
用いた（初期濃度は２ｍｇ／ｍｌ）。作用希釈度は、１：１００から１：２００
の間であり、最終濃度は、それぞれ２０μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌである。Step 7: The purified polyclonal antibody was used in a sandwich ELISA (initial concentration 2 mg / ml). The working dilution is from 1: 100 to 1: 200
And final concentrations are 20 μg / ml and 10 μg / ml, respectively.

【００９０】 工程（９）：抗ウサギを、２８℃で保存される保存用ボトルから、直接１：１
０００希釈で用いた。これらの条件下で、製品は、少なくとも６ヶ月間安定であ
る。Step (9): Anti-rabbit was directly 1: 1 from a storage bottle stored at 28 ° C.
Used at 000 dilution. Under these conditions, the product is stable for at least 6 months.

【００９１】 １ｍｌのビオチン化剤を、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンと０．０５％
（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝塩中に補
充する。One ml of biotinylating agent was added to 1% (w / v) bovine serum albumin and 0.05%
(W / v) Replenish in 0.1 M phosphate buffer salt, pH 7.5, containing sodium azide.

【００９２】 工程（１１）：ストレプトアビジン−ビオチン化／ＨＲＰを、２−８℃で保存
される保存用ボトルから、直接１：５００希釈で用いた。これらの条件下で、製
品は、少なくとも３ヶ月間安定である。Step (11): Streptavidin-biotinylated / HRP was used at a 1: 500 dilution directly from a storage bottle stored at 2-8 ° C. Under these conditions, the product is stable for at least 3 months.

【００９３】 複合体を、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンと抗菌剤を含むリン酸緩衝塩ｐ
Ｈ７．５２ｍｌ中に補充する。The conjugate was prepared using phosphate buffered saline containing 1% (w / v) bovine serum albumin and an antimicrobial agent.
Refill in 7.52 ml H.

【００９４】 工程（１３）：ＡＢＴＳ緩衝液は、Boehringer Mannheimの登録商品である。 該溶液は、ホウ酸ナトリウム、クエン酸およびリン酸化水素二ナトリウムからな
る。 該溶液は、−２０℃で１ｍｌのアリコートで保存する。使用する場合は、再蒸留
水で１：１０の割合で一アリコートを希釈する。Step (13): ABTS buffer is a registered product of Boehringer Mannheim. The solution consists of sodium borate, citric acid and disodium hydrogen phosphate. The solution is stored in 1 ml aliquots at -20 ° C. If used, dilute an aliquot 1:10 in double distilled water.

【００９５】 図１は、ＩＰＧの濃度に対してプロットしたアッセイ応答（吸光度）の用量−
応答曲線を示し、該抗体をＩＰＧアッセイに用いることができることを示す。FIG. 1 shows the dose of the assay response (absorbance) plotted against the concentration of IPG-
Figure 4 shows a response curve, indicating that the antibody can be used in an IPG assay.

【００９６】 実施例４ Ｉ型糖尿病と対照のアッセイ 異なる患者において、グルコース負荷（７５ｇ）に応答したＩＰＧレベルを測
定するために、実施例３で記載した方法を用いた。図２から図４は、グルコース
負荷後の患者におけるＩＰＧレベルの変化をプロットした。図に示したＩＰＧの
推移および／またはレベルは、これらを、Ｉ型糖尿病が進行している恐れがある
と疑われる患者の試料から得た推移もしくはレベルと比較することによって、Ｉ
型糖尿病が進行している危険率を診断するために用いることができる。特に、Ｉ
ＰＧレベルの変化を検査することは、患者において他の成長因子のセカンドメッ
センジャーとして作用するＩＰＧの作用から、グルコース負荷により引き起こさ
れたＩＰＧレベルの変化を分離するという利点がある。Example 4 Type I Diabetes and Control Assays The method described in Example 3 was used to measure IPG levels in response to a glucose load (75 g) in different patients. FIGS. 2-4 plot changes in IPG levels in patients after glucose loading. The changes and / or levels of IPG shown in the figure can be used to compare the changes or levels of IPG by comparing them with those obtained from a sample of a patient suspected of developing type I diabetes.
It can be used to diagnose the risk of developing type 2 diabetes. In particular, I
Examining changes in PG levels has the advantage of separating the changes in IPG levels caused by glucose loading from the effects of IPG, which acts as a second messenger of other growth factors in the patient.

【００９７】 図２は、糖尿病の家族性履歴を有さない対照の患者において得られた応答を示
す。このように、グルコース投与後、患者におけるＩＰＧレベルは、負荷後２時
間前後で最大まで上昇し、次いで、バックグラウンドレベルまで再び減少した。FIG. 2 shows the response obtained in control patients without a familial history of diabetes. Thus, after glucose administration, IPG levels in patients increased to a maximum around 2 hours after loading, and then decreased again to background levels.

【００９８】 図４は、炭水化物過敏症を有する患者、すなわち、インスリンを介したグルコ
ースの代謝と、続くＩＰＧ産生をできない患者から得た第二の対照の推移を示す
。このように、グルコース負荷に続くＩＰＧ推移は、おおむね水平である。FIG. 4 shows the course of a second control from a patient with carbohydrate hypersensitivity, ie, insulin-mediated metabolism of glucose and subsequent patients unable to produce IPG. Thus, the IPG transition following the glucose load is generally horizontal.

【００９９】 図３は、Ｉ型糖尿病の家族性履歴を有する患者から得られた推移を示す。ＩＰ
Ｇにおける上昇が観察されず、グルコース変化に応答したインスリン遊離が不十
分であることが示される。FIG. 3 shows the transitions obtained from patients with a familial history of type I diabetes. IP
No increase in G was observed, indicating insufficient insulin release in response to glucose changes.

【０１００】 実施例５ 抗ＩＰＧ抗体２Ｄ１の特性 モノクローナル抗体２Ｄ１の特性を、ＣＶＧ培養において、ＩＧＰ−Ｉを用い
、または用いずに、２Ｄ１抗ＩＰＧ抗体の存在下における細胞増殖を測定して、
さらに調べた。Example 5 Properties of Anti-IPG Antibody 2D1 The properties of monoclonal antibody 2D1 were determined by measuring cell growth in CVG culture with or without IGP-I in the presence of 2D1 anti-IPG antibody,
Further investigation.

【０１０１】 ＣＶＧを、Ｅ３．５のニワトリ胚子から、Varela-Nietoら、1991に記載された
ように単離し、４ウェルのマルチディッシュ（NUNC）において、Earle's塩、２ ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび抗生物質を含むＭ１９９培
地０．２５ｍｌ中で、２４時間培養した。インキュベーションは、３７℃、５％
ＣＯ₂の湿潤雰囲気下で行った。CVG was isolated from E3.5 chicken embryos as described in Varella-Nieto et al., 1991, and in a 4-well multi-dish (NUNC), Earle's salt, 2 mM L-glutamine, 25 mM Were cultured in 0.25 ml of M199 medium containing HEPES and antibiotics for 24 hours. Incubation at 37 ° C, 5%
The test was performed under a humid atmosphere of CO ₂ .

【０１０２】 図５の顕微鏡写真は、以下の条件下：無添加の対照培地（Ａ）、２５μｇ／ｍ
ｌの２Ｄ１抗体（Ｂ）、１ｎＭのＩＧＦ−Ｉ単独（Ｃ）、１ｎＭのＩＧＦ−Ｉと
２５μｇ／ｍｌの２Ｄ１（Ｄ）、におけるＣＶＧ増殖を示す。単独ではＣＧＶの
増殖を刺激しない１００ｎＭの合成化合物β−メチル−３，４−ビス（リン酸二
ナトリウム）ガラクトース（ＧＰ２）（Ｅ）の外因性添加は、ＩＧＦ−Ｉにより
誘導されたＣＶＧの増殖における２Ｄ１の阻害作用をレスキューすることができ
た（Ｆ）。ＣＶＧの増殖に単独でわずかに作用するＩＰＧＡ型（１／１００）（
Ｇ）は、２Ｄ１抗体によって引き起こされた増殖阻害作用を完全に回復させた（
Ｈ）。The micrograph of FIG. 5 shows the following conditions: control medium (A) without addition, 25 μg / m
2 shows CVG proliferation in 1 L of 2D1 antibody (B), 1 nM IGF-I alone (C), 1 nM IGF-I and 25 μg / ml 2D1 (D). Exogenous addition of 100 nM of the synthetic compound β-methyl-3,4-bis (disodium phosphate) galactose (GP2) (E), which alone does not stimulate CGV proliferation, results in IGF-I induced proliferation of CVG. Was able to rescue the inhibitory effect of 2D1 in (F). IPGA type (1/100), which slightly affects CVG proliferation alone (
G) completely restored the growth inhibitory effect caused by the 2D1 antibody (
H).

【０１０３】 図６Ａは、ＩＧＦ−Ｉ存在下で培養したＣＶＧにおける２Ｄ１抗体の阻害の割
合を示す。これらの実験において、ＣＶＧは、上記のように単離した。ＤＮＡ合
成は、ＣＶＧ外植片を、１０μＣｉ／ｍｌの[³Ｈ]チミジンを含むＭ１９９培地 中で、２４時間培養することによって測定した。外植片によって取り込まれた放
射能を、１０％のトリクロロ酢酸で抽出し、シンチレーション計数により定量し
た。（Ａ）２５から１００μｇ／ｍｌまで濃度を増加させた２Ｄ１抗体の存在下
で、１ｎＭのＩＧＦ−Ｉとともに培養したＣＶＧにおける阻害の割合。（Ｂ）図
５（Ａ−Ｈ）において示した添加実験と平行して、培養したＣＶＧへの、酸で沈
降できる[³Ｈ]チミジンの取り込み。１００μＭの合成アナログＣ３の外因性添 加により、ＩＧＦ−Ｉによって誘導されたＣＶＧの増殖における２Ｄ１の阻害効
果をレスキューすることはできなかった（Ｉ）。データーは、一つの条件当たり
、四つのＣＶＧの平均を用い、少なくとも３つの異なる実験の代表的なものであ
る。FIG. 6A shows the percentage of 2D1 antibody inhibition in CVG cultured in the presence of IGF-I. In these experiments, CVG was isolated as described above. DNA synthesis was measured by culturing CVG explants in M199 medium containing 10 μCi / ml [ ³ H] thymidine for 24 hours. Radioactivity taken up by the explants was extracted with 10% trichloroacetic acid and quantified by scintillation counting. (A) Percentage of inhibition in CVG cultured with 1 nM IGF-I in the presence of increasing concentrations of 2D1 antibody from 25 to 100 μg / ml. (B) Incorporation of [ ³ H] thymidine, which can be precipitated with acid, into cultured CVG, in parallel with the addition experiment shown in FIG. 5 (AH). Exogenous addition of 100 μM synthetic analog C3 failed to rescue the inhibitory effect of 2D1 on IGF-I-induced proliferation of CVG (I). Data are representative of at least three different experiments, using an average of four CVGs per condition.

【０１０４】 実施例６ 抗ＩＰＧ抗体５Ｈ６の特性 上記のように、ＶＳＧのＧＰＩアンカーに対して作製された従来技術のポリク
ローナル抗体は、フラクションを含むＩＰＧと交差反応することが見出された。
図７は、ＩＰＧに対して作製されたポリクローナル抗体が、ＧＰＩアンカーと交
差反応したことを示す。このように、これらの結果は一致し、ＩＰＧとＧＰＩア
ンカーとの間で、ある交差反応性が存在することを示す。これに対し、可溶性、
および膜結合性ＶＳＧに対するモノクローナル抗体５Ｈ６の反応性を試験した場
合、図７（左手カラム）に、ＩＰＧに対して作製されたポリクローナル抗体（中
央カラム）と全く交差反応しないことを示す。これらの実験において、ＧＰＩア
ンカーに共通する共通反応性決定基（ＣＲＤ）に対して作製したポリクローナル
抗体を、陽性対照として用いた（右手カラム）。このように、図７は、抗体５Ｈ
６が、可溶性もしくは膜結合性ＶＳＧのどちらとも交差反応しないのに対して、
両ポリクローナル抗体が強く反応することを示す。この特性により、本発明の抗
体は、交差反応するポリクローナル抗体から識別できる。これは、ポリクローナ
ル抗体が特異的にＩＰＧを検出しないことを示唆するものであるが、二つの抗Ｉ
ＰＧ抗体[一つが非常に特異的であり（モノクローナル）、他方が普通の反応性 である（ポリクローナル）]を必要とするＥＬＩＳＡサンドウィッチアッセイに おいて、価値のある試薬であることを、同様に示す。Example 6 Properties of Anti-IPG Antibody 5H6 As described above, prior art polyclonal antibodies raised against the GPI anchor of VSG were found to cross-react with IPG containing fractions.
FIG. 7 shows that polyclonal antibodies raised against IPG cross-reacted with the GPI anchor. Thus, these results are consistent, indicating that there is some cross-reactivity between IPG and GPI anchor. In contrast, soluble,
When testing the reactivity of the monoclonal antibody 5H6 against membrane-bound VSG and FIG. 7 (left hand column), it shows no cross-reactivity with the polyclonal antibody generated against IPG (middle column). In these experiments, a polyclonal antibody raised against a common reactivity determinant (CRD) common to GPI anchors was used as a positive control (right hand column). Thus, FIG. 7 shows that antibody 5H
6 does not cross-react with either soluble or membrane-bound VSG,
This shows that both polyclonal antibodies react strongly. This property allows antibodies of the invention to be distinguished from cross-reacting polyclonal antibodies. This suggests that the polyclonal antibody does not specifically detect IPG, but that two anti-I
Similarly shown to be a valuable reagent in an ELISA sandwich assay that requires a PG antibody [one is very specific (monoclonal) and the other is normally reactive (polyclonal)] .

【０１０５】 図８は、モノクローナル抗体５Ｈ６が、Ｐ型ホスファターゼアッセイにおいて
、ラット肝臓からのＰ型ＩＰＧの作用を阻害できることを示す。このように、こ
れと類似抗体は、Ｐ型ＩＰＧアンタゴニストとして、例えば前子癇などのＰ型Ｉ
ＰＧレベルの上昇を伴う状態の治療に用いることができる。FIG. 8 shows that monoclonal antibody 5H6 can inhibit the action of P-type IPG from rat liver in a P-type phosphatase assay. Thus, antibodies analogous thereto can be used as P-type IPG antagonists, such as P-type I such as pre-eclampsia.
It can be used to treat conditions associated with elevated PG levels.

【０１０６】 実施例８ 尿中ＩＰＧレベルのアッセイ（例えば、前子癇の診断における使用）。 以下のアッセイは、抗ＩＰＧモノクローナル２Ｄ１−捕捉抗体と、二次抗体と
してポリクローナルウサギＩｇＧ抗ＩＰＧ抗体を用いて行った。該アッセイは、
前子癇の試料と対照の妊娠患者の尿試料を用いて行った。Example 8 Urine IPG Level Assay (eg, for Use in Diagnosing Preeclampsia) The following assays were performed using an anti-IPG monoclonal 2D1-capture antibody and a polyclonal rabbit IgG anti-IPG antibody as a secondary antibody. The assay is
The test was performed using a sample of pre-eclampsia and a urine sample of a control pregnant patient.

【０１０７】 Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍｌの２Ｄ１抗体５０ｍ
ｌでコートし、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、プレートを、２０
０ｍｌのブロッキング剤でブロッキングし、水槽中に浮かせた密閉容器中、３７
℃で一時間インキュベーションした。[0107] Maxisorb plates were loaded with 50 mg of 2.5 mg / ml 2D1 antibody in PBS.
and incubated overnight at 4 ° C. The plate is then
Blocked with 0 ml of a blocking agent, 37 in a closed container floated in a water tank.
Incubated for 1 hour at ° C.

【０１０８】 ブロッキング剤で２０倍希釈した尿試料５０ｍｌ／ウェルを添加し、３７℃で
２時間インキュベーションした。次いで、ウェルを空にし、０．０５％Tween20 ／ＰＢＳ約１００ｍｌで五回洗浄した。次いで、ブロッキング剤で１／５００希
釈した２ｍｇ／ｍｌのポリクローナルウサギＩｇＧ抗ＩＰＧ抗体５０ｍｌ／ウェ
ルを添加し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。次いで、ウェルを、
１００ｍｌの０．０５％Tween20／ＰＢＳで五回洗浄し、ブロッキング剤で１／ ６０００希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ５０ｍｌ／ウェルを添加した。こ
れを、３７℃で１時間インキュベーションし、ウェルを再び洗浄し、室温で予め
温めたＴＭＢ溶液５０ｍｌ／ウェルを添加した。これを室温で１０分間インキュ
ベーションした後、着色反応を、１ＭのＨＣｌ５０ｍｌを添加して止めた。アッ
セイの結果を、４５０ｎｍにおける吸光度を読みとることによって得た。A 50 ml / well urine sample diluted 20-fold with a blocking agent was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The wells were then emptied and washed five times with about 100 ml of 0.05% Tween20 / PBS. Then, 50 mg / well of 2 mg / ml polyclonal rabbit IgG anti-IPG antibody diluted 1/500 with a blocking agent was added and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. The wells are then
After washing 5 times with 100 ml of 0.05% Tween 20 / PBS, 50 ml / well of goat anti-rabbit IgG-HRP diluted 1/6000 with a blocking agent was added. This was incubated at 37 ° C. for 1 hour, the wells were washed again and 50 ml / well of pre-warmed TMB solution at room temperature were added. After incubation for 10 minutes at room temperature, the color reaction was stopped by adding 50 ml of 1M HCl. The results of the assay were obtained by reading the absorbance at 450 nm.

【０１０９】 図９に、前子癇患者の二つの試料を非前子癇の対照と比較したアッセイの結果
を示す。図１０に、前子癇患者の１２試料を含む２４試料の盲目試験から得られ
た結果を示す。これにより、アッセイが、偽陽性なく、前子癇患者１２試料中１
０試料を同定できたことが示される。FIG. 9 shows the results of an assay comparing two samples of pre-eclamptic patients with a non-pre-eclamptic control. FIG. 10 shows the results obtained from a blind test of 24 samples, including 12 samples of pre-eclampsia patients. This allowed the assay to be tested in 1 out of 12
This indicates that 0 samples could be identified.

【０１１０】 図１１は、血小板計数と、前子癇女性の尿に対する２Ｄ１モノクローナル抗体
の反応との間の相関を示す。反比例の相関が、ｐ＜０．０５で有意である。前子
癇女性において、血小板計数が減少している。図は、２Ｄ１反応性物資のレベル
が高くなればなるほど、血小板計数がより減少することを示し、２Ｄ１抗体が、
前子癇の女性における病理に相関する因子を検出していることを示唆している。FIG. 11 shows the correlation between platelet counts and the response of the 2D1 monoclonal antibody to urine of pre-eclamptic women. The inverse correlation is significant at p <0.05. In pre-eclamptic women, platelet counts are reduced. The figure shows that the higher the level of 2D1 reactive material, the lower the platelet count, and the 2D1 antibody shows
This suggests that we are detecting a factor that correlates with pathology in preeclamptic women.

【０１１１】 図１２は、血漿アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）と、前子癇の女
性の尿に対する２Ｄ１の結合反応性との相関を示す。ＡＳＴ（肝臓由来）レベル
は、前子癇の女性において上昇し、該相関は、ＩＰＧレベルが、この疾患におけ
る病理に相関することを示唆する。FIG. 12 shows the correlation between plasma aspartate transaminase (AST) and 2D1 binding reactivity to urine of pre-eclamptic women. AST (liver-derived) levels are elevated in pre-eclamptic women, suggesting that IPG levels correlate with pathology in this disease.

【０１１２】 寄託 本出願を支持するハイブリドーマ２Ｆ７、２Ｄ１および５Ｈ６は、Rademacher Group Limited（ＲＧＬ）、The Windeyer Building,46 Cleveland Street, Lon
don W1P 6DB,UKによって、ブタペスト条約に基づくEurepean Collection of Cel
l Culturesに寄託された。寄託物には、受託番号９８０５１２０１、９８０３１
２１２および９８０３０９０１が付与されている。ＲＧＬは、これらの物質の寄
託を管理する適切な国際法、例えば規則２８と２８ａＥＰＣなどに従って、該物
質を第三者が利用できるようにすることに無条件かつ破棄できない承諾をする。
また、規則２８（４）ＥＰＣに基づく専門家の免責が、これによって要求される
。Deposits Hybridomas 2F7, 2D1 and 5H6 that support this application were prepared by Rademacher Group Limited (RGL), The Windeyer Building, 46 Cleveland Street, Lon.
don W1P 6DB, UK, Eurepean Collection of Cel based on the Budapest Treaty
l Deposited in Cultures. Deposits include accession numbers 98052011, 98031
212 and 98030901 are given. RGL gives unconditional and non-destructible consent to make these materials available to third parties, in accordance with appropriate international law governing the deposit of these materials, such as Regulations 28 and 28a EPC.
Also, exemption of professionals under Rule 28 (4) EPC is required thereby.

【０１１３】 参考文献： ここに記載した参考文献は、全てが参考により完全に組み込まれる。References: The references mentioned here are all fully incorporated by reference.

【参考文献】 [References]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、サンドウィッチＥＬＩＳＡ試験において抗ＩＰＧ抗体を
用いたＩＰＧ濃度に対してプロットした吸収の用量応答曲線を示す。FIG. 1 shows a dose response curve of absorption plotted against IPG concentration using an anti-IPG antibody in a sandwich ELISA test.

【図２】 図２は、ヒト血清中のＩＰＧレベルが、Ｉ型糖尿病の家族性病歴
(familiar history)のないコントロール患者においてグルコース（７５ｇ）の経
口付加後の経時によってどのように変化するかを示す。FIG. 2 shows that IPG levels in human sera are dependent on familial history of type I diabetes.
FIG. 7 shows how it changes with time after oral administration of glucose (75 g) in control patients without (familiar history).

【図３】 図３は、ヒト血清中のＩＰＧレベルが、Ｉ型糖尿病の家族性病歴
を持った患者においてグルコース（７５ｇ）の経口付加後の経時によってどのよ
うに変化するかを示す。FIG. 3 shows how IPG levels in human serum change over time after oral addition of glucose (75 g) in patients with a familial history of type I diabetes.

【図４】 図４は、ヒト血清中のＩＰＧレベルが、炭水化物不耐性(carbohy
drate intolerance)に罹った患者においてグルコース（７５ｇ）の経口付加後の
経時によって℃のように変化するかを示す。FIG. 4. FIG. 4 shows that IPG levels in human serum were measured for carbohydrate intolerance (carbohy).
shows how it changes like ° C over time after oral addition of glucose (75 g) in patients suffering from drate intolerance.

【図５】 図５は、雛鳥蝸牛前庭神経節（ＣＶＧ）培養においてモノクロー
ナル抗体２Ｄ１の特徴の調査を示す。FIG. 5 shows the characterization of monoclonal antibody 2D1 in chick cochlear vestibular ganglion (CVG) culture.

【図６】 図６は、雛鳥蝸牛前庭神経節（ＣＶＧ）培養においてモノクロー
ナル抗体２Ｄ１の特徴の調査を示す。FIG. 6 shows an investigation of the characteristics of monoclonal antibody 2D1 in chick cochlear vestibular ganglion (CVG) culture.

【図７】 図７は、モノクローナル抗体５Ｈ６、ＩＰＧｓに対して生じたポ
リクローナル抗体、ＧＰＩ固定タンパク質に共通な交差反応決定基（ＣＲＤ）に
対して生じたポリクローナル抗体の特異的な結合を比較する実験の結果を示す。FIG. 7 shows experiments comparing the specific binding of monoclonal antibody 5H6, a polyclonal antibody raised against IPGs, and a polyclonal antibody raised against a cross-reactive determinant (CRD) common to GPI-anchored proteins. The result is shown.

【図８】 図８は、モノクローナル抗体５Ｈ６がラット肝臓からのＰ型ＩＰ
Ｇの作用を阻害できることを実証するＰＤＨホスファターゼアッセイの結果を示
す。FIG. 8 shows that monoclonal antibody 5H6 was expressed in P-type IP from rat liver.
FIG. 11 shows the results of a PDH phosphatase assay demonstrating that G action can be inhibited.

【図９】 図９は、尿ＩＰＧレベルを測定するために本発明の抗ＩＰＧ抗体
を用いる前子癇ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。FIG. 9 shows the results of a pre-eclampsia ELISA assay using an anti-IPG antibody of the invention to measure urinary IPG levels.

【図１０】 図１０は、尿ＩＰＧレベルを測定するために抗ＩＰＧ抗体２Ｄ
１を用いたブラインドした前子癇アッセイの結果を示す。FIG. 10. Anti-IPG antibody 2D to measure urinary IPG levels.
1 shows the results of a blind pre-eclampsia assay using No. 1.

【図１１】 図１１は、抗ＩＰＧモノクローナル抗体２Ｄ１を用いた前子癇
の尿におけるＩＰＧアッセイと血小板計測との間の相関関係を示す。FIG. 11 shows the correlation between IPG assay and platelet counts in urine of pre-eclampsia using anti-IPG monoclonal antibody 2D1.

【図１２】 図１２は、抗ＩＰＧモノクローナル抗体２Ｄ１を用いた前子癇
の尿におけるＩＰＧアッセイと血漿ＡＳＴ活性との間の相関関係を示す。FIG. 12 shows the correlation between the IPG assay in preeclamptic urine using the anti-IPG monoclonal antibody 2D1 and plasma AST activity.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/577 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ジーザス・プリエト スペイン・Ｅ−31002・パムプロナ・テュ デラ・22−４ (72)発明者 フィリップ・ウィリアムズ イギリス・オックスフォード・ＯＸ２・９ Ｂ５・ボットリー・エインシャム・ロー ド・29 (72)発明者 トーマス・ウィリアム・レイドメイチャー イギリス・オックスフォード・ＯＸ１・５ ＥＹ・ボアーズ・ヒル・ザ・リッジウェ イ・フォックスコーム（番地なし)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 16/18 C12P 21/08 C12N 5/10 C12Q 1/68 A C12P 21/08 G01N 33/577 B C12Q 1/68 C12N 15/00 C G01N 33/577 5/00 B (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, A , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW Jesus Prieto Spain E-31002 Pamplona Tudella 22-4 (72) Inventor Philip Williams UK Oxford OX2.9 B5 Botley Ainsham Road 29 (72) Inventor Thomas William・ Raid May Catcher over the United Kingdom, Oxford · OX1 · 5 EY · Boars Hill The Rijjiwe Lee Fox comb (no address)

Claims (25)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 抗イノシトールホスホグリカン（ＩＰＧ）モノクローナル抗
体を生産するハイブリドーマ細胞系であって、受託番号９８０５１２０１、９８
０３１２１２及び９８０３０９０１の下に欧州寄託機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託さ
れたハイブリドーマ細胞系２Ｆ７、２Ｄ１及び５Ｈ６から選択されるハイブリド
ーマ細胞系。1. A hybridoma cell line producing an anti-inositol phosphoglycan (IPG) monoclonal antibody, comprising the accession numbers 98052011, 98.
A hybridoma cell line selected from the hybridoma cell lines 2F7, 2D1 and 5H6 deposited with the European Depositary (ECACC) under 031212 and 98030901. 【請求項２】 請求項１記載のハイブリドーマ細胞系から得られた抗ＩＰＧ
モノクローナル抗体。2. An anti-IPG obtained from the hybridoma cell line according to claim 1.
Monoclonal antibody. 【請求項３】 請求項２記載のモノクローナル抗体に結合されるＩＰＧのエ
ピトープに結合することができる抗ＩＰＧモノクローナル抗体。3. An anti-IPG monoclonal antibody capable of binding to an epitope of IPG bound to the monoclonal antibody according to claim 2. 【請求項４】 抗体が、ラット肝臓から得られる及びヒト胎盤から得られる
Ａ型ＩＰＧ中に存在するエピトープに結合することができる請求項３記載の抗Ｉ
ＰＧ抗体。4. The anti-I of claim 3, wherein the antibody is capable of binding to an epitope present in type A IPG obtained from rat liver and from human placenta.
PG antibody. 【請求項５】 抗体が、ＧＰＩ固定タンパク質の共通反応決定因子（ＣＲＤ
）にさらに実質上結合しない請求項２乃至４のいずれか１項記載の抗ＩＰＧモノ
クローナル抗体。5. The method according to claim 1, wherein the antibody is a common response determinant (CRD
The anti-IPG monoclonal antibody according to any one of claims 2 to 4, wherein the anti-IPG monoclonal antibody further does not substantially bind to the above. 【請求項６】 抗体がＩＰＧ生物学的活性を中和化する請求項２乃至５のい
ずれか１項記載の抗ＩＰＧ抗体。6. The anti-IPG antibody according to claim 2, wherein the antibody neutralizes an IPG biological activity. 【請求項７】 医療的処置の方法において使用するための請求項２乃至６の
いずれか１項記載の抗ＩＰＧモノクローナル抗体。7. An anti-IPG monoclonal antibody according to any one of claims 2 to 6 for use in a method of medical treatment. 【請求項８】 請求項２乃至６のいずれか１項記載の抗ＩＰＧモノクローナ
ル抗体を含む組成物。8. A composition comprising the anti-IPG monoclonal antibody according to any one of claims 2 to 6. 【請求項９】 請求項１記載のハイブリドーマ細胞系を培養すること、及び
かくして生産された抗体を単離することを含む抗ＩＰＧ抗体の製造方法。9. A method for producing an anti-IPG antibody, comprising culturing the hybridoma cell line according to claim 1, and isolating the antibody thus produced. 【請求項１０】 診断アッセイにおける使用のための組成物の調製のための
請求項１乃至６のいずれか１項の抗ＩＰＧ抗体の使用。10. Use of an anti-IPG antibody according to any one of claims 1 to 6 for the preparation of a composition for use in a diagnostic assay. 【請求項１１】 診断アッセイが、糖尿病又は前子癇の診断用である請求項
１０記載の使用。11. Use according to claim 10, wherein the diagnostic assay is for the diagnosis of diabetes or pre-eclampsia. 【請求項１２】 診断アッセイが、Ｉ型糖尿病に進行する患者の危険性を測
定するためのものである請求項１１記載の使用。12. Use according to claim 11, wherein the diagnostic assay is for determining the risk of a patient to progress to type I diabetes. 【請求項１３】 抗ＩＰＧ抗体が、ＩＰＧｓに特異的に結合できる結合剤と
して使用される請求項１０乃至１２のいずれか１項記載の使用。13. The use according to any one of claims 10 to 12, wherein the anti-IPG antibody is used as a binding agent capable of specifically binding to IPGs. 【請求項１４】 抗ＩＰＧ抗体が診断アッセイにおける現像剤としての使用
のために標識される請求項１０乃至１３のいずれか１項記載の使用。14. The use according to any one of claims 10 to 13, wherein the anti-IPG antibody is labeled for use as a developer in a diagnostic assay. 【請求項１５】 前子癇の治療のための医薬の調製のための請求項１乃至６
のいずれか１項記載の抗ＩＰＧ抗体の使用。15. A method according to claim 1, for preparing a medicament for treating pre-eclampsia.
Use of the anti-IPG antibody according to any one of the above. 【請求項１６】 患者がＩ型糖尿病に進行する危険性があるかどうかを診断
する方法であり、 （ａ）患者からの生物学的試料と、Ｐ及び／又はＡ型ＩＰＧｓに特異的に結合
できる抗体とを接触させること；及び （ｂ）抗ＩＰＧ抗体に対する該試料中のＩＰＧｓの結合を測定すること、 を含む方法。16. A method for diagnosing whether a patient is at risk of developing Type I diabetes, comprising: (a) binding a biological sample from the patient to P and / or Type A IPGs specifically; Contacting with a possible antibody; and (b) measuring the binding of IPGs in the sample to the anti-IPG antibody. 【請求項１７】 炭水化物負荷を患者に与えること、及びＩＰＧプロフィー
ルを得るために負荷経時後のＩＰＧ応答を測定することの最初の工程を含む請求
項１６記載の方法。17. The method according to claim 16, comprising the first steps of providing a patient with a carbohydrate load and measuring the IPG response after load to obtain an IPG profile. 【請求項１８】 患者試料から測定したＩＰＧプロフィールが、正常な被験
者及びＩ型糖尿病を有する患者から得られたプロフィール又はレベルと比較され
る請求項１６又は１７記載の方法。18. The method of claim 16 or claim 17, wherein the IPG profile measured from the patient sample is compared to profiles or levels obtained from normal subjects and patients with type I diabetes. 【請求項１９】 Ｉ型糖尿病を有するあるいはその危険性のあることがアッ
セイにおいて示された患者に対して、インスリン及び／又はＰ型ＩＰＧｓ及び／
又はＡ型ＩＰＧｓを投与する更なる工程を含む請求項１６乃至１８のいずれか１
項記載の方法。19. Patients who have or are at risk for having type I diabetes in an assay are provided with insulin and / or P-type IPGs and / or
Or comprising the additional step of administering type A IPGs.
The method described in the section. 【請求項２０】 患者における前子癇の診断方法であって、 （ａ）患者からの生物学的試料と、請求項２乃至６のいずれか１項記載の抗Ｉ
ＰＧ抗体とを接触させること；及び （ｂ）抗ＩＰＧ抗体に対する試料中のＩＰＧｓの結合を測定すること、 を含む診断方法。20. A method of diagnosing pre-eclampsia in a patient, comprising: (a) a biological sample from the patient;
Contacting with a PG antibody; and (b) measuring the binding of IPGs in the sample to the anti-IPG antibody. 【請求項２１】 前子癇を有するあるいはその危険性のあることがアッセイ
において示された患者に対して、Ｐ型ＩＰＧアンタゴニストを投与する更なる工
程を含む請求項２０記載の方法。21. The method of claim 20, comprising the further step of administering a P-type IPG antagonist to a patient who has or is shown to be at risk for pre-eclampsia. 【請求項２２】 抗ＩＰＧ抗体が固体支持体上に固定化される請求項１６乃
至２１のいずれか１項記載の方法。22. The method according to claim 16, wherein the anti-IPG antibody is immobilized on a solid support. 【請求項２３】 Ｐ又はＡ型ＩＰＧｓの免疫精製における請求項２乃至６の
いずれか１項記載のモノクローナル抗体の使用。23. Use of the monoclonal antibody according to any one of claims 2 to 6 in immunopurification of P or A type IPGs. 【請求項２４】 抗ＩＰＧ抗体の製造方法であって、１以上の可溶性ＩＰＧ
ｓあるいは抗体応答を引き出すためのその脂質接合体によって動物を免疫化する
ことを含み、該ＩＰＧｓが免疫原担体に接合されないことを特徴とする製造方法
。24. A method for producing an anti-IPG antibody, comprising one or more soluble IPGs.
or a lipid conjugate thereof for eliciting an antibody response, the method comprising immunizing an animal, wherein the IPGs are not conjugated to an immunogenic carrier. 【請求項２５】 動物がＩＰＧの可溶形を用いて腹腔内ルートを経て免疫化
される請求項２４記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the animal is immunized via the intraperitoneal route with a soluble form of IPG.