JP2002505858A - Non-human transgenic mammal, method of production and use thereof - Google Patents
Non-human transgenic mammal, method of production and use thereofInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）が、その誘導機能において改変されている、非ヒト哺乳動物に関する。本発明はまた、かかる哺乳動物の生産方法および化学物質の試験、医薬および新規治療法のための、その使用に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a non-human mammal wherein the glucocorticoid receptor (GR) has been modified in its inducing function. The invention also relates to methods of producing such mammals and to their use for testing chemicals, medicaments and novel therapies.
Description
【０００１】 本発明は、改変グルココルチコイドレセプターを有する非ヒト哺乳動物に関す
る。さらに、本発明は、かかる哺乳動物の生産方法並びに化学物質の試験、医薬
（Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｎ）及び治療的アプローチのためのその使用に関す
る。[0001] The present invention relates to non-human mammals having modified glucocorticoid receptors. Furthermore, the invention relates to a method for the production of such mammals and to the use of them for testing chemicals, for medicaments (Arzneimimitteln) and for therapeutic approaches.
【０００２】 グルココルチコイドレセプター（以下、ＧＲという）は、多くの細胞に存在す
るレセプターでありグルココルチコイドの結合により活性化される。この型にお
いて、ＧＲは、標的遺伝子の発現を誘導する。これらは、例えば、産物が、糖新
生、赤血球前駆細胞の増殖又は胸腺細胞のアポトーシスに役割を果たす遺伝子で
ある。一方、活性化ＧＲも標的遺伝子の発現を抑制する。これらは、例えば、コ
ラゲナーゼ遺伝子などのＡＰ１により活性化される遺伝子、又はＴＮＦγ、Ｉｌ
−２もしくはＩｌ−６などのＮＦＫＢにより活性化される遺伝子である。[0002] Glucocorticoid receptor (hereinafter, referred to as GR) is a receptor present in many cells and is activated by binding of glucocorticoid. In this form, the GR induces expression of the target gene. These are, for example, genes whose products play a role in gluconeogenesis, erythroid progenitor cell proliferation or thymocyte apoptosis. On the other hand, the activated GR also suppresses the expression of the target gene. These include, for example, genes activated by AP1, such as the collagenase gene, or TNFγ, Il
Genes activated by NFKB, such as -2 or Il-6.
【０００３】 それは、ＧＲの機能を選択的に妨げると考えられる。具体的には、抑制機能は
、多くの異なる疾患を妨げる可能な起点であるので、該抑制機能は、この対象で
あると思われる。かかる疾患は、例えば、急性期反応の障害；敗血症ショック；
喘息；急性呼吸困難症候群；炎症性疾患；慢性関節リウマチ又は多発性硬化症な
どの自己免疫疾患；神経精神医学的疾患；視床下部−下垂体副腎軸椎の疾患；骨
粗鬆症；糖尿病；ステロイド−ミオパシー；皮膚病である。[0003] It is thought that it selectively interferes with the function of GR. In particular, the inhibitory function seems to be the subject, as it is a possible starting point that prevents many different diseases. Such diseases include, for example, impaired acute phase response; septic shock;
Asthma; acute dyspnea syndrome; inflammatory disease; autoimmune disease such as rheumatoid arthritis or multiple sclerosis; neuropsychiatric disease; hypothalamic-pituitary-adrenal axis vertebral disease; osteoporosis; It is a skin disease.
【０００４】 したがって、本発明の目的は、それにより、ＧＲの抑制機能を選択的に調べ、
任意に妨げることが可能な産物を提供することにある。[0004] Accordingly, an object of the present invention is to selectively examine the function of inhibiting GR,
It is to provide a product that can be arbitrarily prevented.
【０００５】 本発明によれば、これは、請求項により規定された主題により達成される。[0005] According to the invention, this is achieved by the subject-matter defined by the claims.
【０００６】 したがって、本発明の主題は、ＧＲが、その誘導機能に関して改変されたもの
である非ヒト哺乳動物に関する。具体的には、該誘導機能を除去する。Accordingly, a subject of the present invention relates to a non-human mammal wherein the GR has been modified with respect to its inducing function. Specifically, the inducing function is removed.
【０００７】 本発明は、ＧＲの個々の機能を互いに別々に改変しうるという本出願人の洞察
に基づく。本出願人は、抑制機能がこれにより影響を被ることなく、ＧＲの誘導
機能が、改変、具体的には除去されうることを見出した。さらに、本出願人は、
ＧＲの誘導機能がその二量体化及びＤＮＡ結合のそれぞれに関係し、ＧＲの誘導
機能が、例えば、ＧＲのＤループにおけるその変異、具体的にはＡ ４５８ Ｔ
の点変異により、改変、具体的には除去されうることを見出した。また、本出願
人は、その誘導機能に関して改変されたＧＲがなおも免疫抑制及び抗炎症活性を
有することを発見した。本出願人は、ＧＲが、その誘導機能に関して改変された
ものであるトランスジェニックマウス（実施例２及び３を参照のこと）から、本
出願人の洞察を得た。The present invention is based on Applicants' insight that the individual functions of GR can be modified independently of each other. The Applicant has found that the function of inducing GR can be modified, specifically eliminated, without the suppression function being affected thereby. Further, the applicant has
The inducing function of GR is involved in each of its dimerization and DNA binding, and the inducing function of GR is, for example, its mutation in the D loop of GR, specifically A 458 T
Can be modified, specifically removed, by the point mutation described above. Applicants have also discovered that GRs modified with respect to their inducing function still have immunosuppressive and anti-inflammatory activity. Applicants obtained their insights from transgenic mice whose GRs have been modified with respect to their inducing function (see Examples 2 and 3).
【０００８】 本発明によれば、本出願人の洞察は、ＧＲが改変、具体的には、その誘導機能
に関して除去されたものである非ヒト哺乳動物を提供することに用いられる。In accordance with the present invention, Applicants' insight is used to provide a non-human mammal wherein the GR has been modified, specifically, deleted for its inducing function.
【０００９】 「非ヒト哺乳動物」の表現は、ＧＲが、その誘導機能に関して改変されうるい
かなる哺乳動物をも含む。かかる哺乳動物の例示は、マウス、ラット、ウサギ、
ウマ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、サル、ブタ、イヌ及びネコであり、マウスが好まし
い。The expression “non-human mammal” includes any mammal whose GR can be modified with respect to its inducing function. Examples of such mammals include mice, rats, rabbits,
Horses, cattle, sheep, goats, monkeys, pigs, dogs and cats, with mice being preferred.
【００１０】 「誘導機能が改変、具体的には除去されたＧＲ」の表現は、抑制機能が変えら
れていないが、誘導機能の改変を示す非ヒト哺乳動物のＧＲを含む。該誘導機能
は、好ましくは除去される。これは、例えば、ＧＲの二量体化及びそのＤＮＡ結
合のそれぞれを変異させることにより、達成されうる。これは、ＧＲのＤループ
における変異、具体的にはＡ ４５８ Ｔの点変異により得られる。The expression “GR in which the inducible function is altered, specifically, removed” includes a non-human mammal GR in which the suppressive function is not changed but the inducible function is altered. The guidance function is preferably eliminated. This can be achieved, for example, by mutating each of the GR dimerization and its DNA binding. This is obtained by a mutation in the D loop of GR, specifically a point mutation of A 458T.
【００１１】 本発明のさらなる主題は、前記非ヒト哺乳動物から得られた細胞に関する。こ
れらの細胞は、例えば、初代培養物又は長期培養物などのいかなる形態で存在し
てもよい。[0011] A further subject of the invention relates to cells obtained from said non-human mammal. These cells may be in any form, such as a primary culture or a long-term culture.
【００１２】 本発明の非ヒト哺乳動物は、慣用の方法により提供されうる。（ａ）胚性幹細
胞のＧＲの誘導機能をコードするＤＮＡとベクターの対応する変異ＤＮＡとの間
の組換えが可能なベクターにより、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞をトランスフェ
クションするステップ、 （ｂ）（ａ）において安定にトランスフェクトされた細胞を単離し、非ヒト哺乳
動物の雌動物へ、該細胞を導入するステップ、並びに （ｃ）誘導機能が、改変、具体的には、除去されたものであるＧＲに関して、（
ｂ）で得られた子孫を解析するステップ を含む方法を行なうことが好ましい。The non-human mammal of the present invention can be provided by a conventional method. (A) transfecting a non-human mammalian embryonic stem cell with a vector capable of recombination between DNA encoding the GR inducing function of the embryonic stem cell and the corresponding mutant DNA of the vector, (b) B.) Isolating the cells stably transfected in (a) and introducing the cells into a female non-human mammal; and (c) modifying, specifically eliminating, the inducing function. Regarding the GR that is
analyzing the progeny obtained in b).
【００１３】 前記説明は、「非ヒト哺乳動物」及び「誘導機能が改変、具体的には除去され
たＧＲ」の表現に、相応じて適用する。The above description applies correspondingly to the expressions “non-human mammal” and “GR with altered, specifically eliminated, inducible function”.
【００１４】 さらに、「胚性幹細胞」の表現は、ＧＲの誘導機能をコードするＤＮＡの変異
に適した非ヒト哺乳動物のいかなる胚性幹細胞にも関する。該胚性幹細胞は、好
ましくはマウス、具体的にはＥ１４／１細胞に由来する。Further, the expression “embryonic stem cells” refers to any non-human mammal embryonic stem cells suitable for mutation of the DNA encoding the inducing function of GR. The embryonic stem cells are preferably derived from a mouse, specifically an E14 / 1 cell.
【００１５】 「ベクター」の表現は、胚性幹細胞のＤＮＡでの組換えにより、ＧＲの誘導機
能をコードするＤＮＡの改変を可能にするいかなるベクターをも含む。該改変は
、ＧＲの誘導機能を除去するようなものが好ましい。該ベクターが、ＧＲの二量
体化及びそのＤＮＡ結合のそれぞれに必要な領域における変異を有するＤＮＡを
含むことが好ましい。具体的には、該変異は、ＧＲのＤループをコードする領域
内にあってもよい。該変異は、特に好ましくは、Ａ ４５８ Ｔの点変異であり
うる。さらに、該ベクターが、所望の組換えを実施した幹細胞が存在するように
選別がなされるマーカーを含むことが好ましい。かかるマーカーは、例えば、Ｃ
ｒｅ／ｌｏｘＰ系により、ゲノムから再び取り除かれうるｌｏｘＰ／ｔｋｎｅｏ
カセットである。また、前記ベクターは、本発明の主題に関連する。かかるベク
ター、すなわち、実施例１及び図１のベクターのそれぞれは、１９９８年２月１
９日ＤＳＭ１２０２６の下、ｐｍＧＲ２−ｔｒとしてＤＳＭＺ〔ドイツ−タイプ
コレクション オブ マイクロ−オーガニズムズ アンド セルカルチャー〕
に寄託された。The expression “vector” includes any vector that allows the modification of the DNA encoding the inducible function of GR by recombination with the DNA of embryonic stem cells. The modification is preferably one that eliminates the inducing function of GR. Preferably, the vector contains DNA having mutations in regions required for GR dimerization and its DNA binding, respectively. Specifically, the mutation may be in a region encoding the D loop of GR. The mutation may particularly preferably be an A 458 T point mutation. Furthermore, it is preferable that the vector contains a marker that is selected so that a stem cell having undergone the desired recombination is present. Such markers are, for example, C
The loxP / tkneo can be removed again from the genome by the re / loxP system
It is a cassette. Said vector is also relevant to the subject of the present invention. Such vectors, ie, each of the vectors of Example 1 and FIG. 1, were prepared on February 1, 1998.
9th DSMZ as pmGR2-tr under DSM12026 [Germany-Type Collection of Micro-Organisms and Cell Culture]
Has been deposited.
【００１６】 また、当業者は、ステップ（ａ）〜（ｃ）を行なうための条件及び材料を知る
。（ｃ）でなされた解析に関して、当業者は、その産物が、糖新生、赤血球前駆
細胞の増殖又は胸腺細胞のアポトーシスに役割を果たす遺伝子の誘導を弱めるこ
と又は妨げることを証明しうることにより、例えば、プロセスを考慮するであろ
う。かかるプロセスは、以下の実施例において記載する。Also, those skilled in the art will know the conditions and materials for performing steps (a)-(c). With respect to the analysis performed in (c), one of skill in the art can demonstrate that the product attenuates or prevents the induction of genes that play a role in gluconeogenesis, erythroid progenitor cell proliferation or thymocyte apoptosis, For example, one would consider the process. Such a process is described in the examples below.
【００１７】 本発明は、ＧＲがその誘導機能に関して改変されるものである非ヒト哺乳動物
を提供する。この改変は、誘導機能の除去であってもよい。ＧＲの抑制機能は、
そのような哺乳動物及びそれ由来の細胞のそれぞれを用いて選択的に調べること
ができる。さらに、これにより、選択影響をＧＲの抑制機能によって得る、物質
、医薬及び治療的アプローチを見つけることができる。したがって、本発明は、
様々な疾患（ｖｅｒｓｃｈｉｅｄｅｎｓｔｅｎ Ｅｒｋｒａｎｋｕｎｇｅｎ）に
対し影響を与える基礎を提供する。かかる疾患は、例えば、例えば、急性期反応
の障害；敗血症ショック；喘息；急性呼吸困難症候群；炎症性疾患；慢性関節リ
ウマチ又は多発性硬化症などの自己免疫疾患；神経精神医学的疾患；視床下部−
下垂体副腎軸椎の疾患；骨粗鬆症；糖尿病；ステロイド−ミオパシー；皮膚病で
ある。[0017] The present invention provides a non-human mammal wherein the GR is modified with respect to its inducing function. This modification may be a removal of the inducing function. The GR suppression function
Each of such mammals and cells derived therefrom can be selectively examined. Furthermore, it allows to find substances, medicaments and therapeutic approaches where the selective effect is obtained by the inhibitory function of GR. Therefore, the present invention
It provides a basis for influencing various diseases (verschiedensten Erkrankungen). Such diseases include, for example, disorders of the acute phase response; septic shock; asthma; acute dyspnea syndrome; inflammatory diseases; autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or multiple sclerosis; neuropsychiatric diseases; −
Pituitary-adrenal axis vertebral disease; osteoporosis; diabetes; steroid-myopathy;
【００１８】 本発明を下記実施例により説明する。The present invention will be described by the following examples.
【００１９】 実施例１：本発明の非ヒト哺乳動物の調製 ＧＲが、その誘導機能に関して除去される非ヒト哺乳動物を提供する。この目
的のため、エキソン３および４を含む、約１１ｋｂのＧＲ遺伝子を有するベクタ
ーを使用する。さらに、該ベクターはエキソン４に点変異を示し、その結果、該
ベクターによりコードされるＧＲは、４５８位にアラニンのかわりにトレオニン
を有する。さらに、該ベクターは、ｌｏｘＰ−ｔｋｎｅｏ選択カセットを含む（
図１参照）。Example 1 Preparation of a Non-Human Mammal of the Invention A non-human mammal is provided in which the GR is eliminated for its inducing function. For this purpose, a vector having a GR gene of about 11 kb, including exons 3 and 4, is used. In addition, the vector exhibits a point mutation at exon 4, so that the GR encoded by the vector has threonine at position 458 instead of alanine. In addition, the vector contains a loxP-tkneo selection cassette (
(See FIG. 1).
【００２０】 このベクターを、胚性マウス幹細胞Ｅ１４／１に、エレクトロポレーションに
より導入する。安定にトランスフェクトされた細胞を、３５０μｇ／ｍｌのＧ４
１８による選抜により得る。これらの細胞を２０μｇのＣｒｅ発現プラスミドで
の一過的なトランェクションに供した後、1 μＭのガンシクロビルをそれに添加
する。したがって、選抜は、選択カセットを消失している細胞に対してなされる
。これらの細胞は、ＧＲ遺伝子において所与の点変異およびさらに、第３イント
ロンにおいて残存するｌｏｘ Ｐ部位に沿った約５０塩基対を含む。The vector is introduced into embryonic mouse stem cells E14 / 1 by electroporation. Stably transfected cells were transformed with 350 μg / ml G4
18 obtained by selection. After subjecting these cells to transient transduction with 20 μg of the Cre expression plasmid, 1 μM of ganciclovir is added to it. Thus, selection is made on cells that have lost the selection cassette. These cells contain a given point mutation in the GR gene and also about 50 base pairs along the lox P site remaining in the third intron.
【００２１】 後者の細胞をマウス胚盤胞にインジェクトし、次いで、かかる胚盤胞を雌性マ
ウスに導入する。ヘテロサイガス（heterozygote）マウスとホモサイガス（homo
zygote）マウスをつがいにすることにより得るキメラマウスを得る。[0021] The latter cells are injected into mouse blastocysts, which are then introduced into female mice. Heterozygote mice and homozygous mice
zygote) to obtain a chimeric mouse obtained by mating the mice.
【００２２】 実施例２：本発明の非ヒト哺乳動物の個々の機能の検出 実施例１において提供される非ヒト哺乳動物を使用する。それをＧＲの個々の
機能に特異的な実験に使用する。Example 2: Detection of individual functions of a non-human mammal of the present invention The non-human mammal provided in Example 1 is used. It is used for experiments specific to individual functions of GR.
【００２３】 （ａ）糖新生の酵素の誘導 それぞれ、１０μｇ／１００ｇのデキサメタゾンおよびＰＢＳを、各場合にお
いて、本発明のマウスおよび野生型マウスにインジェクトする。かかる動物を２
時間後に屠殺する。肝臓ＲＮＡを単離し、対照として、チロシンアミノトランス
フェラーゼ（ＴＡＴ）および／またはβ−アクチンのｍＲＮＡ発現をノーザンブ
ロットで測定する（図２ａ参照）。(A) Induction of enzymes of gluconeogenesis In each case 10 μg / 100 g of dexamethasone and PBS are injected into the mice according to the invention and the wild-type mice. Two such animals
Slaughter after hours. Liver RNA is isolated and, as controls, tyrosine aminotransferase (TAT) and / or β-actin mRNA expression is measured by Northern blot (see FIG. 2 a).
【００２４】 それは、本発明のマウスはなし得ないが、野生型マウスはＴＡＴ ｍＲＮＡを
誘導し得ることを示す。It shows that the mice of the present invention cannot do, but wild-type mice can induce TAT mRNA.
【００２５】 （ｂ）赤血球前駆細胞の増殖の誘導 胎仔性肝臓を、本発明のマウス胚および野生型マウス胚から各々単離し、個々
の細胞に分散する。次いで、これらの細胞を、ＳＣＦ、ｈＥｐｏ、ＩＧＦ−１お
よびデキサメタゾンを含む、改変ＣＦＵ−Ｅ培地において増殖させる。増殖速度
論を電子細胞計測器を用いて細胞を計数することにより日毎に作成する（図２ｂ
参照）。(B) Induction of Erythroid Progenitor Cell Proliferation Fetal liver is isolated from the mouse embryo of the present invention and the wild-type mouse embryo, respectively, and dispersed into individual cells. These cells are then grown in a modified CFU-E medium containing SCF, hEpo, IGF-1 and dexamethasone. Growth kinetics are generated daily by counting cells using an electronic cytometer (FIG. 2b).
reference).
【００２６】 それは、本発明のマウスはなし得ないが、野生型マウスは赤血球前駆体細胞の
増殖を誘導し得ることを示す。It shows that while the mice of the present invention cannot do so, wild-type mice can induce proliferation of erythroid progenitor cells.
【００２７】 （Ｃ）胸腺細胞のアポトーシスの誘導 胸腺細胞を、本発明の６〜１２週齢のマウスおよび野生型の対応する週齢のマ
ウスから各場合に単離し、それぞれ、デキサメタゾン（１０-6Ｍ）の存在下およ
び非存在下に２４時間、ＲＰＭＩ培地において培養する。次いで、かかる細胞を
プロピジウムイオダイド（propidium iodide）を用いて染色し、ＦＡＣＳにより
、それらの蛍光強度について解析する。ＤＮＡ含量のロスをアポトーシスのメジ
ャーとする。(C) Induction of apoptosis of thymocytes Thymocytes were isolated in each case from 6-12 week old mice of the present invention and wild-type corresponding weekly mice, and each was isolated from dexamethasone (10 −6) Culture in RPMI medium for 24 hours in the presence and absence of M). The cells are then stained with propidium iodide and analyzed by FACS for their fluorescence intensity. Loss of DNA content is a measure of apoptosis.
【００２８】 それは、本発明のマウスはなし得ないが、野生型マウスは胸腺細胞のアポトー
シスを誘導し得ることを示す。[0028] It shows that while the mice of the present invention cannot do so, wild-type mice can induce thymocyte apoptosis.
【００２９】 （ｄ）コラゲナーゼ遺伝子のＡＰ−１誘導性活性化の阻害 一次線維芽細胞を本発明のマウスおよび野生型マウスの胚から単離する。６時
間に渡り、該線維芽細胞を１０-6Ｍのデキサメタゾン、１０-7ＭのＴＰＡまたは
両方で処理した後、ＲＮＡを単離し、対照として、ＭＭＰ−１３（マウス３型コ
ラゲナーゼ遺伝子）およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現をノーザンブロットにおい
て測定する（図３参照）。(D) Inhibition of AP-1 Induced Activation of the Collagenase Gene Primary fibroblasts are isolated from mouse and wild-type mouse embryos of the present invention. After treating the fibroblasts for 6 hours with 10 -6 M dexamethasone, 10 -7 M TPA or both, RNA was isolated and, as controls, MMP-13 (mouse type 3 collagenase gene) and GAPDH. MRNA expression is measured on a Northern blot (see FIG. 3).
【００３０】 それは、野生型マウスおよび本発明のマウスもコラゲナーゼ遺伝子のＡＰ１誘
導性活性化を阻害し得ることを示す。It shows that wild-type mice and the mice of the invention can also inhibit AP1-induced activation of the collagenase gene.
【００３１】 従って、抑制機能は維持されているが、誘導機能が改変され、特に除去されて
いる、本発明の哺乳動物、たとえば、マウスはＧＲを発現することを明白にする
。Thus, it is evident that mammals, eg, mice, of the present invention that express the GR, while the suppressive function is maintained, but the inducible function is modified and particularly eliminated.
【００３２】 実施例３：それぞれ、免疫抑制活性および抗炎症活性に関し、それぞれ、本発明
の非ヒト哺乳動物およびその細胞を用いてなされた研究 ３．１ 一次胸腺細胞を用いてなされた研究 一次線維芽細胞を、それぞれ、本発明のマウスおよび野生型マウスから単離し
、それぞれ、０．５μｇ／ｍｌのイオノマイシンならびに１０μｇ／ｍｌのホル
ボールエステル（ＴＰＡ）と１０-6Ｍのデキサメタゾン（ｄｅｘ）とその組み合
わせ（Ｔ＋Ｄ）で６時間、処理する。全ＲＮＡの２μｇを、各場合に、「ＲＮア
ーゼプロテクションアッセイ」に供する。Example 3: Studies performed on non-human mammals of the invention and their cells, respectively, for immunosuppressive and anti-inflammatory activities 3.1 Studies performed on primary thymocytes Primary fibers The blast cells were isolated from a mouse of the present invention and a wild-type mouse, respectively, and 0.5 μg / ml of ionomycin and 10 μg / ml of phorbol ester (TPA) and 10 −6 M dexamethasone (dex), respectively. Process in combination (T + D) for 6 hours. 2 μg of total RNA are in each case subjected to the “RNase protection assay”.
【００３３】 それは、それぞれ、サイトカインｍＲＮＡ、たとえば、Ｉｌ−２およびＩＦＮ
γの同等の発現および同等の抑制が両方のマウスの一次胸腺細胞において得られ
ることを示す。[0033] It may be a cytokine mRNA, such as Il-2 and IFN, respectively.
4 shows that equivalent expression and equivalent suppression of γ is obtained in primary thymocytes of both mice.
【００３４】 ３．２ 腹膜マクロファージを用いてなされた研究 腹膜マクロファージを、それぞれ、本発明のマウスおよび野生型マウスから、
チオグリコレート処理の５日後に単離し、２４時間後に、それぞれ、１００ｎｇ
／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）ならびに１０-6Ｍのデキサメタゾンおよびリポ多
糖類の組み合わせ（Ｌ＋Ｄ）で２時間、処理する。全ＲＮＡの０．５μｇを、各
場合に、「ＲＮアーゼプロテクションアッセイ」に供する。3.2 Studies Performed Using Peritoneal Macrophages Peritoneal macrophages were isolated from mice of the invention and wild-type mice, respectively.
Isolated 5 days after thioglycolate treatment, 24 hours later, 100 ng each
/ Ml of lipopolysaccharide (LPS) and a combination of 10 −6 M dexamethasone and lipopolysaccharide (L + D) for 2 hours. 0.5 μg of total RNA is in each case subjected to an “RNase protection assay”.
【００３５】 それは、それぞれ、サイトカインｍＲＮＡ、たとえば、ＴＮＦαおよびＩｌ−
６の同等の発現および同等の抑制が両方のマウスの腹膜マクロファージにおいて
得られることを示す。[0035] It may be a cytokine mRNA, such as TNFα and Il-, respectively.
6 shows that equivalent expression and equivalent repression of 6 are obtained in peritoneal macrophages of both mice.
【００３６】 ３．３ マウスに関してなされた研究 （Ａ）１００μｇのＬＰＳ各々を、それぞれ、本発明のマウスおよび野生型マウ
スに投与する。マウスを０、６０分および１８０分で屠殺する。血清を各々単離
し、ＴＮＦα濃度を通常のＥＬＩＳＡキットにより測定する。3.3 Studies Performed on Mice (A) 100 μg of each LPS is administered to a mouse of the invention and a wild-type mouse, respectively. Mice are sacrificed at 0, 60 and 180 minutes. Each serum is isolated and the TNFα concentration is measured with a conventional ELISA kit.
【００３７】 それは、ＴＮＦαの誘導およびその抑制は両マウスにおいて同等であることを
示す。[0037] It shows that the induction of TNFα and its suppression are equivalent in both mice.
【００３８】 （Ｂ）それぞれ、本発明のマウスおよび野生型マウスの背中の皮膚を、各場合に
、それぞれ、ＴＰＡならびにＴＰＡおよびデキサメタゾンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ
）で処理する。血清を各々単離し、Ｉｌ−６濃度を通常のＥＬＩＳＡにより測定
する。(B) The skin on the backs of the mice of the invention and of the wild-type mice, respectively, was treated in each case with TPA and the combination of TPA and dexamethasone (T + D
). The sera are each isolated and the concentration of Il-6 is determined by conventional ELISA.
【００３９】 それは、Ｉｌ−６の誘導およびその抑制は両マウスにおいて同等であることを
示す。[0039] It shows that induction of Il-6 and its suppression are equivalent in both mice.
【００４０】 （Ｃ）それぞれ、本発明のマウスおよび野生型マウスの左耳を、各場合に、それ
ぞれ、ＴＰＡならびにＴＰＡおよびデキサメタゾンの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ）で処
理する。耳の特定の領域を各々取り除き、形成された浮腫の重さを測定する。(C) The left ears of the mice according to the invention and of the wild-type mice, respectively, are treated in each case with TPA and a combination of TPA and dexamethasone (T + D), respectively. Each specific area of the ear is removed and the edema formed is weighed.
【００４１】 それは、それぞれの処理の後の浮腫の重さは両マウスにおいて同等であること
を示す。It shows that the edema weight after each treatment is comparable in both mice.
【００４２】 それゆえ、本発明のマウスおよびその細胞は野生型マウスのそれに匹敵し得る
免疫抑制活性および抗炎症活性を有することを示す。Thus, it is shown that the mice of the invention and their cells have immunosuppressive and anti-inflammatory activities comparable to those of wild-type mice.
【図１】 図１は、ＧＲへの点変異Ａ ４８５ Ｔの導入を示す。（ａ）は、ＧＲのＤＮ
Ａ結合ドメインにおける２番目のジンクフィンガーのアミノ酸配列を示す。アラ
ニン４５８のトレオニンによる置換を示す。（ｂ）は、組換えのストラテジーを
述べる。星印は、点変異の位置をマークする。改変された座は、組換え後のＧＲ
座の構造を示し、末端座は、Ｃｒｅレコンビナーゼによる２つのｌｏｘＰ部位（
三角）のさらなる組換え後の構造を示す。（ｃ）は、ＰＣＲによる遺伝型を示す
。矢印により（ｂ）に示されたプライマーを用いて、２４０塩基対断片が増幅さ
れ、点変異により新たな認識部位を導入している制限酵素ＢｓｒＧ１により切断
される。点変異により作製された２つの１２０ｂｐ断片は、ゲル電気泳動により
未切断断片と区別化される。（ｄ）は、配列比較を示す。脳ＲＮＡは、ＲＴ−Ｐ
ＣＲにより増幅され、配列がＧＲのエキソン３及び５に存在するものであるプラ
イマーを用いた。得られた断片をサブクローン化し、配列決定する。２つの変異
塩基を示す。FIG. 1 shows the introduction of the point mutation A 485 T into GR. (A) is the DN of GR
2 shows the amino acid sequence of the second zinc finger in the A-binding domain. 3 shows the substitution of alanine 458 with threonine. (B) describes the recombination strategy. An asterisk marks the position of the point mutation. The modified locus is the GR after recombination.
1 shows the structure of the locus, with the terminal locus representing two loxP sites by Cre recombinase
The structure after further recombination of (triangles) is shown. (C) shows the genotype by PCR. Using the primer shown by arrow (b), a 240 bp fragment is amplified and cleaved by the restriction enzyme BsrG1, which introduces a new recognition site by point mutation. The two 120 bp fragments created by the point mutation are distinguished from the uncleaved fragment by gel electrophoresis. (D) shows a sequence comparison. Brain RNA is RT-P
Primers were used which were amplified by CR and whose sequences were present in exons 3 and 5 of GR. The resulting fragment is subcloned and sequenced. Two mutant bases are shown.
【図２】 図２は、ＧＲの誘導機能に関して、本発明のマウスと野生型マウスとの間の比
較を示す。（ａ）は、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の誘導を示
す。デキサメタゾンは、本発明のマウス及び野生型マウスにインジェクトし、Ｔ
ＡＴ及びβ−アクチンのそれぞれの肝臓ｍＲＮＡ発現を対照としてノーザンブロ
ットにより解析する。（ｂ）は、赤血球前駆細胞の増殖の誘導を示す。赤血球前
駆細胞を単離し、培養する。蓄積細胞数を決定する。（ｃ）は、胸腺細胞のアポ
トーシスの誘導を与える。デキサメタゾンでの処理後の生存細胞（網かけ棒）又
は対照（黒棒）の割合を示す。FIG. 2 shows a comparison between a mouse of the present invention and a wild-type mouse with respect to the inducing function of GR. (A) shows the induction of tyrosine aminotransferase (TAT). Dexamethasone is injected into mice of the invention and wild-type mice,
Liver mRNA expression of each of AT and β-actin is analyzed by Northern blot as a control. (B) shows the induction of proliferation of erythroid progenitor cells. Erythroid progenitor cells are isolated and cultured. Determine the number of accumulated cells. (C) gives the induction of thymocyte apoptosis. The percentage of viable cells (shaded bars) or controls (black bars) after treatment with dexamethasone is shown.
【図３】 図３は、ＡＰ−１により引き起こされた、コラゲナーゼ遺伝子の抑制の誘導阻
害を示す。本発明のマウス及び野生型マウスのそれぞれ由来の一次線維芽細胞を
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ＴＰＡ又は両方で処理し、ＭＭＰ−１３（マウス３
型コラゲナーゼ）及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を対照としてノーザンブロットに
より解析する。FIG. 3 shows the induced inhibition of collagenase gene repression induced by AP-1. Primary fibroblasts derived from each of the mice of the present invention and wild-type mice were treated with dexamethasone (Dex), TPA or both, and treated with MMP-13 (mouse 3).
Collagenase) and GAPDH mRNA levels are analyzed by Northern blotting as controls.
【図４】 図４は、サイトカインｍＲＮＡの誘導発現及びその抑制を示す。本発明のマウ
ス及び野生型マウスのそれぞれ由来の一次胸腺細胞を、イオノマイシン、ホルボ
ールエステル（ＴＰＡ）、デキサメタゾン（ｄｅｘ）及びそれらの組み合わせ（
Ｔ＋Ｄ）のそれぞれで処理する。Ｉｌ−２及びＴＮＦγのｍＲＮＡ発現を、「Ｒ
Ｎアーゼプロテクションアッセイ」により決定する。（Ａ）、（Ｃ）は、Ｉｌ−
２ ｍＲＮＡの誘導発現及び抑制並びにその定量に関する。（Ｂ）、（Ｄ）は、
ＩＦＮγ ｍＲＮＡの誘導発現及び抑制並びにその定量に関する。（ｃｏｎ）は
対照を意味し、（ｎ、ｄ）は検出不可を意味する。FIG. 4 shows the induced expression of cytokine mRNA and its suppression. Primary thymocytes from each of the mice of the present invention and wild-type mice were identified as ionomycin, phorbol ester (TPA), dexamethasone (dex) and combinations thereof (
T + D). The mRNA expression of Il-2 and TNFγ was determined using “R
Nase protection assay ". (A) and (C) show Il-
2 Induced expression and suppression of mRNA and its quantification. (B) and (D)
The present invention relates to induced expression and suppression of IFNγ mRNA and quantification thereof. (Con) means control, (n, d) means undetectable.
【図５】 図５は、サイトカインｍＲＮＡの発現を示す。本発明のマウス及び野生型マウ
スのそれぞれ由来のマクロファージをリポ多糖類（ＬＰＳ）及びＬＰＳとｄｅｘ
との組み合わせ（Ｌ＋Ｄ）のそれぞれで処理する。ＴＮＦα及びＩｌ−６のｍＲ
ＮＡの発現を、「ＲＮアーゼプロテクションアッセイ」により決定する。（Ａ）
、（Ｂ）、（Ｃ）は、Ｉｌ−６及び／又はＴＮＦα ｍＲＮＡの発現及び抑制並
びにその定量に関する。（ｃｏｎ）は、対照を意味する。FIG. 5 shows expression of cytokine mRNA. Macrophages derived from a mouse of the present invention and a wild-type mouse, respectively, were lipopolysaccharide (LPS) and LPS and dex.
And (L + D). MR of TNFα and Il-6
NA expression is determined by an "RNase protection assay". (A)
, (B), (C) relate to expression and suppression of Il-6 and / or TNFα mRNA and its quantification. (Con) means control.
【図６】 図６は、感染及び炎症のそれぞれの症例のマウスの反応を示す。（Ａ）本発明
のマウス及び野生型マウスのそれぞれをＬＰＳで処理し、ＴＮＦαの血清濃度を
測定する。（Ｂ）本発明のマウス及び野生型マウスのそれぞれの皮膚を、ＴＰＡ
及びＴＰＡとデキサメタゾン（Ｔ＋Ｄ）との組み合わせのそれぞれで処理し、Ｉ
ｌ−６の血清濃度を測定する。（Ｃ）本発明のマウス及び野生型マウスのそれぞ
れの耳をＴＰＡ及びＴＰＡとデキサメタゾンとの組み合わせ（Ｔ＋Ｄ）のそれぞ
れで処理し、耳の一定の領域を切り取り、その重量を、生じた浮腫のメジャーと
して測定した。FIG. 6 shows the response of mice in each case of infection and inflammation. (A) Each of the mouse of the present invention and a wild-type mouse is treated with LPS, and the serum concentration of TNFα is measured. (B) The skin of each of the mouse of the present invention and the wild-type mouse was
And treatment with each of the combinations of TPA and dexamethasone (T + D),
The serum concentration of 1-6 is measured. (C) The ears of each of the mice of the invention and wild-type mice were treated with each of TPA and the combination of TPA and dexamethasone (T + D), a certain area of the ear was cut out, and its weight was measured for the resulting edema. Was measured.
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年４月１４日（２０００．４．１４）[Submission date] April 14, 2000 (2000.4.14)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ライヒャルト，ホルガー ドイツ連邦共和国 エヒターディンゲン デー−70771 ロトブッヒェンヴェーク ８ (72)発明者 シュツ，ギュンテル ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69121 ツェペリーンシュトラーセ 86 (72)発明者 カストナー，クラウス アメリカ合衆国 ペンシルバニア 19081 スウォートモア，ユニバーシティー プ レース 622 (72)発明者 ヘルリッヒ，ペーター ドイツ連邦共和国 カールスルーエ デー −76229 フォーゲルザング ８ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 DA02 GA14 HA01 4B065 AA91X AB01 AC14 BA01 CA24 CA46 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY , CA, CH, CN, CU, CZ, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE , KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Reichart, Holger Echterdingen Day-70771 Lot Buchenweg 8 (72) Inventor Stu, Güntel Heidelberg, Germany-69121 Ceppelinstrasse 86 (72) Inventor Kastner, Claus United States Pennsylvania 19081 Swartmore, University Place 622 (72) Inventor Herlich, Peter Germany Karlsruhe Day -76229 Vogelsang 8 F-term (reference) 4B024 AA11 BA 63 DA02 GA14 HA01 4B065 AA91X AB01 AC14 BA01 CA24 CA46
Claims (10)
関して改変されているものである非ヒト哺乳動物。1. A non-human mammal wherein the glucocorticoid receptor (GR) has been modified with respect to its inducing function.
哺乳動物。2. The non-human mammal according to claim 1, wherein the inducing function is eliminated.
変異されているものである請求項１または２記載の非ヒト哺乳動物。3. The non-human mammal according to claim 1, wherein the GR is mutated with respect to its dimerization and DNA binding, respectively.
３いずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物。4. The compound according to claim 1, wherein GR has threonine at position 458.
3. The non-human mammal according to any one of 3.
クターの対応する変異ＤＮＡとの間の組換えを可能にするベクターで非ヒト哺乳
動物の胚性幹細胞をトランスフェクションする工程、 （ｂ）（ａ）において安定にトランスフェクトされた細胞を単離し、それを非ヒ
ト哺乳動物の雌性動物に導入する工程、ならびに （ｃ）誘導機能が改変されているＧＲについて、（ｂ）において得られた子孫を
解析する工程、 を含む、請求項１〜４いずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物の生産方法。5. A transfection of a non-human mammalian embryonic stem cell with a vector that allows recombination between DNA encoding the GR inducing function of the embryonic stem cell and the corresponding mutant DNA of the vector. (B) isolating the cells stably transfected in (a) and introducing them into a female non-human mammal, and (c) GR having a modified inducible function. analyzing the progeny obtained in b), the method for producing a non-human mammal according to any one of claims 1 to 4.
変異される請求項６記載の方法。7. The method of claim 6, wherein the GR is mutated with respect to its dimerization and DNA binding, respectively.
７いずれか１つに記載の方法。8. The compound according to claim 5, wherein GR has threonine at position 458.
7. The method according to any one of 7.
治療的アプローチのための請求項１〜４いずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物の
使用。9. Use of a non-human mammal as claimed in any one of claims 1 to 4 for testing substances, medicament and / or therapeutic approaches with respect to the inhibitory function of GR.
応の障害、敗血症ショック、喘息、急性呼吸困難症候群、炎症性疾患、慢性関節
リウマチまたは多発性硬化症等の自己免疫疾患、神経精神医学的疾患、視床下部
−下垂体−副腎軸椎の疾患、骨粗鬆症、糖尿病、ステロイドミオパシーまたは皮
膚病に関して理解されるべきものである請求項９記載の使用。10. The method of claim 1, wherein the substance, medicament and / or therapeutic approach is for the treatment of acute phase disorders, septic shock, asthma, acute dyspnea syndrome, inflammatory diseases, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or multiple sclerosis. 10. Use according to claim 9, which is to be understood in relation to a neuropsychiatric disorder, a hypothalamic-pituitary-adrenal axis vertebral disorder, osteoporosis, diabetes, steroid myopathy or dermatosis.
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