JP2002504369A - Protease-activated receptor 4 and uses thereof. - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 マウスおよびヒトからのプロテアーゼ活性化レセプター４（ＰＡＲ４）をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡならびに、このようなｃＤＮＡから発現される組換えポリペプチドが開示される。細胞表面で発現されるこの組換えレセプターポリペプチド、レセプターフラグメントおよびアナログは、トロンビンとＰＡＲ４との間の相互作用の効果に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力について候補化合物をスクリーニングする方法において用いられる。アゴニストは、診断試験において、創傷を処置する、凝固を促進するための治療剤として、そして血小板を活性化する薬剤として用いられる。アンタゴニストは、血液凝集を制御するため、心発作を処置するため、そして正常な創傷治癒ならびにアテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺の炎症（ＡＲＤＳ）および糸球体硬化症を含む種々の疾患において生じるような傷に対する炎症および増殖性応答をブロックするため、治療剤として用いられる。プロテアーゼ活性化レセプター−４（またはレセプターフラグメントもしくはアナログ）に特異的な抗体および治療剤としてのそれらの使用もまた開示される。   (57) [Summary] Disclosed are cDNA and genomic DNA encoding protease-activated receptor 4 (PAR4) from mouse and human, as well as recombinant polypeptides expressed from such cDNA. The recombinant receptor polypeptides, receptor fragments and analogs expressed on the cell surface are used in methods of screening candidate compounds for their ability to act as agonists or antagonists on the effects of the interaction between thrombin and PAR4. Agonists are used in diagnostic tests as a therapeutic to treat wounds, to promote coagulation, and as an agent to activate platelets. Antagonists occur to control blood aggregation, to treat heart attacks, and in a variety of diseases including normal wound healing and atherosclerosis, restenosis, pulmonary inflammation (ARDS) and glomerulosclerosis It is used as a therapeutic to block the inflammatory and proliferative response to such wounds. Also disclosed are antibodies specific for protease-activated receptor-4 (or a receptor fragment or analog) and their use as therapeutics.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、プロテアーゼ活性化レセプター４タンパク質の核酸、それにコード
されるプロテアーゼ活性化レセプター４タンパク質、ならびにそのアゴニストお
よびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイに関する。FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to protease-activated receptor 4 protein nucleic acids, protease-activated receptor 4 protein encoded thereby, and screening assays for agonists and antagonists thereof.

【０００２】 （発明の背景） トロンビン（血管損傷の部位で生成される凝固プロテアーゼ）は、血小板、白
血球および間葉細胞を活性化する（Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．ら（１９９１）Ｃｅｌ
ｌ ６４：１０５７〜１０６８）。トロンビンによる血小板の活性化は、止血お
よび血栓症について重要であると考えられる。動物モデルにおいて、トロンビン
インヒビターは、ヒトにおいてほとんどの心発作（ａｔｔａｃｋ ａｎｄ ｓｔ
ｒｏｋｅ）の原因である血小板依存性血栓症をブロックする。ヒトにおける利用
可能なデータは、動脈内の血栓症が、血小板機能のインヒビターによりおよびト
ロンビンインヒビターによりブロックされ得ることを示唆する。従って、血小板
でのトロンビンの作用は、心発作を生じる凝塊の形成に寄与するようである。血
管内皮細胞ならびに平滑筋細胞、白血球および線維芽細胞へのトロンビンの他の
作用は、正常な創傷治癒および種々の疾患（アテローム性動脈硬化症、再狭窄、
肺の炎症（ＡＲＤＳ）および糸球体硬化症など）において生じるような、傷に対
する炎症性反応および増殖性反応を媒介し得る。トロンビンがどのように細胞を
活性化するかを完全に解明することは重要な目的である。BACKGROUND OF THE INVENTION Thrombin, a clotting protease produced at the site of vascular injury, activates platelets, leukocytes and mesenchymal cells (Vu, T.-KH et al. (1991) Cel.
l 64: 1057-1068). Activation of platelets by thrombin is thought to be important for hemostasis and thrombosis. In animal models, thrombin inhibitors are responsible for most heart attacks (stuck and st
block the platelet-dependent thrombosis that causes the disease. Available data in humans suggest that thrombosis in arteries can be blocked by inhibitors of platelet function and by thrombin inhibitors. Thus, the action of thrombin on platelets appears to contribute to the formation of clots that cause a heart attack. Other effects of thrombin on vascular endothelial cells and smooth muscle cells, leukocytes and fibroblasts are associated with normal wound healing and various diseases (atherosclerosis, restenosis,
It can mediate inflammatory and proliferative responses to wounds, such as occur in lung inflammation (ARDS) and glomerulosclerosis. It is an important goal to fully understand how thrombin activates cells.

【０００３】 トロンビンシグナル伝達を媒介するレセプターは、以前に同定されている（Ｖ
ｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６８；ＵＳ
Ｐ ５，２５６，７６６）。このレセプターは、活性化の新規なタンパク質分解
性機構を表し、そしてＰＡＲ１（プロテアーゼ活性化レセプター１）と呼ばれる
。ＰＡＲ１は、特定部位へのトロンビンの結合および特定部位でのＰＡＲ１のア
ミノ酸末端外部ドメインの切断により活性化される。レセプター切断は、その後
、膜貫通シグナル伝達の作用をするためにレセプターの本体に分子内で結合する
ことにより係留（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ペプチドリガンドとして機能する、新しい
アミノ末端を露出させる（Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４
：１０５７〜１０６８）。この係留リガンドドメインを模倣する合成ペプチドは
、ＰＡＲ１アゴニストとして機能し、そしてトロンビンおよびレセプター切断と
独立してそれを活性化する（Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６
４：１０５７〜１０６８）。[0003] Receptors that mediate thrombin signaling have been previously identified (V
u, T. -K. H. (1991) Cell 64: 1057-1068; US
P 5,256,766). This receptor represents a novel proteolytic mechanism of activation and is called PAR1 (Protease Activated Receptor 1). PAR1 is activated by binding of thrombin to a specific site and cleavage of the amino-terminal ectodomain of PAR1 at a specific site. Receptor cleavage then exposes a new amino terminus that functions as a tethered peptide ligand by binding intramolecularly to the body of the receptor to act for transmembrane signaling (Vu, TK). H. et al. (1991) Cell 64.
: 1057-1068). A synthetic peptide that mimics this tethered ligand domain functions as a PAR1 agonist and activates it independently of thrombin and receptor cleavage (Vu, TKH et al. (1991) Cell 6).
4: 1057-1068).

【０００４】 トロンビンの公知のどの細胞作用がＰＡＲ１によって媒介されるかを同定する
ために、最近、ＰＡＲ１ノックアウトマウスが作成された（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，
Ａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５１６〜５１９）。ＰＡＲ１遺伝子の
両方の対立遺伝子が破壊されたマウスの分析は、第２の血小板トロンビンレセプ
ターおよび明白なトロンビンレセプターの組織特異的役割についての決定的な証
明をもたらした。詳細には、マウスにおいて、ＰＡＲ１は血小板応答には重要で
はないが、線維芽細胞応答には重要である。[0004] To identify which known cellular actions of thrombin are mediated by PAR1, PAR1 knockout mice have recently been created (Connolly,
A et al. (1996) Nature 381: 516-519). Analysis of mice in which both alleles of the PAR1 gene have been disrupted has provided definitive evidence for a second platelet thrombin receptor and a distinct tissue-specific role of the thrombin receptor. In particular, in mice, PAR1 is not important for platelet response but is important for fibroblast response.

【０００５】 ＰＡＲ１の同定以後、２つの他のプロテアーゼ活性化レセプターがクローン化
された。第２のプロテアーゼ活性化レセプター（ＰＡＲ２）は、サブスタンスＫ
レセプターの関連物質を探索中にクローン化された（Ｎｙｓｔｅｄｔ，Ｓら（１
９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９１：９２０８〜９２１２）。ＰＡＲ２の生理学的
活性化因子は未知のままである；それはトロンビンにより活性化されない。第３
のプロテアーゼ活性化レセプター（ＰＡＲ３）もまたクローン化されたが、利用
可能なデータは、このレセプターが、マウスにおけるトロンビン媒介血小板応答
に関与するがヒトでは関与しないことを示唆する。[0005] Since the identification of PAR1, two other protease-activating receptors have been cloned. The second protease-activated receptor (PAR2) is a substance K
It was cloned during the search for related substances of the receptor (Nystedt, S et al. (1)
994) PNAS USA, 91: 9208-9212). The physiological activator of PAR2 remains unknown; it is not activated by thrombin. Third
Was also cloned, but available data suggest that this receptor is involved in the thrombin-mediated platelet response in mice but not in humans.

【０００６】 トロンビン媒介血小板活性化のより良好な理解の必要性が存在する。血小板依
存性動脈血栓症のような血小板媒介性の病理に関与する因子を同定および特徴づ
けする必要性がまた存在する。このような機構の理解は、関連した病理を処置す
るための新しい機構を提供する。[0006] There is a need for a better understanding of thrombin-mediated platelet activation. There is also a need to identify and characterize factors involved in platelet-mediated pathologies such as platelet-dependent arterial thrombosis. Understanding such mechanisms provides a new mechanism for treating related pathologies.

【０００７】 （発明の要旨） プロテアーゼ活性化レセプター４（ＰＡＲ４）が開示される。ＰＡＲ４は、ト
ロンビンアゴニストおよびアンタゴニストとしてその活性について化合物のライ
ブラリーをアッセイするにおいて有用である。ＰＡＲ４をコードするＤＮＡはま
た、機能的発現ベクターへのその挿入、細胞株において発現されるＤＮＡ、およ
びＰＡＲ４へのトロンビンの効果のアゴニストまたはアンタゴニストとして化合
物を同定するためのアッセイにおけるＤＮＡ発現産物の使用であるとして、開示
される。SUMMARY OF THE INVENTION A protease-activated receptor 4 (PAR4) is disclosed. PAR4 is useful in assaying libraries of compounds for their activity as thrombin agonists and antagonists. DNA encoding PAR4 may also be inserted into a functional expression vector, DNA expressed in a cell line, and use of the DNA expression product in an assay to identify a compound as an agonist or antagonist of the effect of thrombin on PAR4. Is disclosed.

【０００８】 本発明は、脊椎動物組織からのプロテアーゼ活性化レセプター４（ＰＡＲ４）
をコードする実質的に純粋なＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）（配列番号
１、配列番号３および配列番号４）およびその縮重配列；これにより、コードさ
れる、実質的に純粋なプロテアーゼ活性化レセプター４ポリペプチド；ならびに
マウスおよびヒトからの、それぞれ配列番号２および配列番号５のアミノ酸配列
に実質的に同一のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、ＰＡＲ４をコードするＤ
ＮＡ、またはＰＡＲ４をコードするＤＮＡに相補的なＤＮＡに、ストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列の特徴を有する。このようなＤＮＡ
配列は、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、より好ましくは５０ヌクレ
オチド長である。本発明はさらに、トロンビンにより活性化されるＰＡＲ４レセ
プターのフラグメントを含む。このようなフラグメントは、配列番号２および配
列番号５と同じアミノ酸配列を有し得るか、または配列番号２および配列番号５
のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり得る。このようなフラグメントは
、好ましくは、少なくとも１０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも３０アミ
ノ酸長である。[0008] The present invention relates to protease-activated receptor 4 (PAR4) from vertebrate tissue.
Substantially pure DNA (cDNA or genomic DNA) (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) and its degenerate sequence; whereby the encoded, substantially pure protease-activated receptor 4 polypeptides; and an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 from mouse and human, respectively. The present invention also provides a D4 encoding PAR4.
It has the characteristic of a DNA sequence that hybridizes under stringent conditions to DNA complementary to DNA encoding NA or PAR4. Such DNA
The sequence is preferably at least 25 nucleotides in length, more preferably 50 nucleotides in length. The invention further includes fragments of the PAR4 receptor that are activated by thrombin. Such a fragment may have the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5, or may have the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5.
At least 80% identical to the amino acid sequence of Such a fragment is preferably at least 10 amino acids long, more preferably at least 30 amino acids long.

【０００９】 種々の実施態様において、ＤＮＡ，レセプターまたはレセプターフラグメント
は、脊椎動物、好ましくはヒトまたはマウスに由来する。しかし、この遺伝子は
、化学的に合成され得る。[0009] In various embodiments, the DNA, receptor or receptor fragment is from a vertebrate, preferably a human or mouse. However, this gene can be synthesized chemically.

【００１０】 本発明の目的は、新規なレセプター、好ましくはＰＡＲ４およびその機能的等
価物をコードするヌクレオチド配列を提供することである。It is an object of the present invention to provide a nucleotide sequence encoding a novel receptor, preferably PAR4 and its functional equivalents.

【００１１】 別の目的は、ＰＡＲ４をコードするヌクレオチド配列を発現する遺伝的に操作
された細胞株を提供することである。Another object is to provide a genetically engineered cell line that expresses a nucleotide sequence encoding PAR4.

【００１２】 別の目的は、ＰＡＲ４レセプターに選択的に結合する抗体を提供することであ
る。Another object is to provide an antibody that selectively binds to the PAR4 receptor.

【００１３】 別の目的は、化合物または化合物のライブラリーが、ヌクレオチド配列により
発現されるレセプターを活性化またはブロックするその能力についてアッセイさ
れ得る方法を提供することである。Another object is to provide a method by which a compound or library of compounds can be assayed for its ability to activate or block a receptor expressed by a nucleotide sequence.

【００１４】 本発明の利点は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２またはＰＡＲ３レセプターを介して同定
され得ない新規なトロンビンアゴニストおよびアンタゴニストを同定することを
可能にする新規なトロンビンレセプターＰＡＲ４を開示することである。An advantage of the present invention is that it discloses a novel thrombin receptor PAR4 that allows to identify new thrombin agonists and antagonists that cannot be identified via the PAR1, PAR2 or PAR3 receptors.

【００１５】 本発明の特徴は、トロンビン活性化およびそれにより開始される一連の生化学
的事象に関するさらなる情報を得ることを可能にすることである。A feature of the present invention is that it allows to obtain further information on thrombin activation and the sequence of biochemical events triggered thereby.

【００１６】 本発明のこれらならびに他の目的、利点および特徴は、本開示を読むことによ
り当業者に明白となる。[0016] These and other objects, advantages and features of the present invention will become apparent to those of skill in the art upon reading the present disclosure.

【００１７】 （好ましい実施態様の説明） プロテアーゼ活性化レセプターアッセイおよびこれを用いる方法が記載される
前に、本発明が、記載される特定のＤＮＡ配列、材料、方法またはプロセスに限
定されず、当然、変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書にお
いて用いられる用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためであり、制限
されることは意図されない（なぜなら、本発明の範囲は、添付の請求の範囲によ
ってのみ制限されるからである）ことも理解される。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Before describing protease-activated receptor assays and methods of using the same, the invention is not limited to the particular DNA sequences, materials, methods or processes described, as a matter of course. It should be understood that this can vary. Also, the terms used in the specification are for the purpose of describing particular embodiments only, and are not intended to be limiting (since the scope of the present invention is limited only by the accompanying claims. Is also understood).

【００１８】 本明細書および添付の請求の範囲で用いられる場合、単数「ａ（１つの）」、
「ａｎｄ（および）」および「ｔｈｅ（この）」は、この文脈が明白に他を示さ
ない限りは、複数の対象物を含む。従って、例えば、「ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ（１つのＤＮＡ配列）」というときは、この配列の混合物および多数を含
み、「ａｎ ａｓｓａｙ（１つのアッセイ）」というのは、同じ一般的な型のア
ッセイを含み、そして「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ（この方法）」というのは、本明
細書において記載される型の１つ以上の方法または工程を含む。As used in this specification and the appended claims, the singular “a”,
"And" and "the" include plural objects unless the context clearly dictates otherwise. Therefore, for example, "a DNA sequence
"ance (a DNA sequence)" includes a mixture and multiples of this sequence, "an assay" includes the same general type of assay, and "the method (the “Method” includes one or more methods or steps of the type described herein.

【００１９】 本明細書において議論される刊行物は、単に、本出願の提出日前のその開示に
ついて提供される。本明細書中のいずれもが、本発明が以前の発明の効力により
このような公開の日付を早める権利を与えるわけではないという容認であるとは
みなされない。The publications discussed herein are provided solely for their disclosure prior to the filing date of the present application. Nothing herein is to be construed as an admission that the invention does not confer the right to advance such publication date by virtue of prior invention.

【００２０】 他に規定しない限り、本明細書におけるすべての技術用語および科学用語は、
本発明が属する分野の当業者により通常、理解されるのと同じ意味を有する。本
明細書において記載されるのと類似または等価の任意の方法および材料は、本発
明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料が本明細
書において記載される。本明細書において引用されるすべての刊行物は、刊行物
が組み合わせて引用される本発明の特定の局面を開示および記載する目的のため
に参考として本明細書に援用される。Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein are
It has the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are described herein. All publications cited herein are incorporated herein by reference for the purpose of disclosing and describing particular aspects of the invention in which the publications are cited in combination.

【００２１】 （定義） 「プロテアーゼ活性化レセプター４」、「ＰＡＲ４」、「ＰＡＲ４レセプター
」などは、トロンビンまたはトロンビンアゴニストによって特に活性化され、そ
れによりＰＡＲ４−媒介シグナル伝達事象（例えば、ホスホイノシチド加水分解
、Ｃａ²⁺流出、血小板凝集）を活性化する脊椎動物細胞表面タンパク質のすべて
または一部を意味する。このポリペプチドは、リガンド活性化特性（アゴニスト
活性化およびアンタゴニスト阻害特性を含む）および本明細書で記載される組織
分布を有するとして特徴付けられる。詳細には、ＰＡＲ４レセプターは、配列番
号２，４、および５のＤＮＡ配列により発現される。Definitions “Protease-activated receptor 4”, “PAR4”, “PAR4 receptor” and the like are specifically activated by thrombin or thrombin agonists, thereby causing PAR4-mediated signaling events (eg, phosphoinositide hydrolysis, Means all or part of vertebrate cell surface proteins that activate Ca ²⁺ efflux, platelet aggregation). The polypeptide is characterized as having ligand activating properties (including agonist activating and antagonist inhibiting properties) and a tissue distribution as described herein. Specifically, the PAR4 receptor is expressed by the DNA sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, and 5.

【００２２】 「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化）にか
かわらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。“Polypeptide” means any chain of amino acids, regardless of length or post-translational modification (eg, glycosylation).

【００２３】 「実質的に純粋」とは、本発明により提供されるプロテアーゼ活性化レセプタ
ー４ポリペプチドが、それが天然に会合するタンパク質および天然に存在する有
機分子を含まず、重量で、少なくとも６０％であることを意味する。好ましくは
、調製物は、重量で、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そ
して最も好ましくは少なくとも９９％のＰＡＲ４ポリペプチドである。実質的に
純粋なＰＡＲ４ポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出により、ＰＡ
Ｒ４ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、またはタンパク質の化
学的合成により獲得され得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロ
マトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析により測
定され得る。このタンパク質は、ゲル中のバンドに単離され得る場合、実質的に
純粋である。“Substantially pure” means that the protease-activated receptor 4 polypeptide provided by the invention is free of proteins and naturally occurring organic molecules with which it naturally associates, and at least 60% by weight. %. Preferably, the preparation is at least 75%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 99%, by weight, PAR4 polypeptide. A substantially pure PAR4 polypeptide can be used, for example, by extraction from natural sources,
It can be obtained by expression of a recombinant nucleic acid encoding an R4 polypeptide or by chemical synthesis of a protein. Purity can be measured by any appropriate method, for example, column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis or HPLC analysis. The protein is substantially pure if it can be isolated as a band in a gel.

【００２４】 「実質的に同一な」アミノ酸配列とは、保存的アミノ酸置換、例えば、１つの
アミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸について置換（例えば、ロイシンをバリン
に、リジンをアルギニンに、など）によって、またはレセプターの生物学的活性
を破壊しないアミノ酸配列の位置に位置する１つ以上の非保存的アミノ酸置換、
欠失または挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。このような等価の
レセプターは、以下に記載の方法を用いて、このようなレセプターを天然に産す
るかまたはそうするように誘導され得る任意の動物の組織もしくは細胞、あるい
はその等価物からの抽出により単離され得る；あるいは化学的合成により単離さ
れ得る；あるいは、組換えＤＮＡ技術の標準的技術により（例えば、このような
レセプターをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの単離により）単離され得
る。実質的に同一なレセプターは、同じ生物学的機能を有する（例えば、同じ化
合物により活性化される）。A “substantially identical” amino acid sequence is defined by conservative amino acid substitutions, for example, one amino acid substitution for another amino acid of the same class (eg, leucine for valine, lysine for arginine, etc.). One or more non-conservative amino acid substitutions at positions in the amino acid sequence that do not destroy the biological activity of the receptor;
An amino acid sequence that differs only by deletion or insertion is meant. Such equivalent receptors can be extracted from any animal tissue or cells capable of naturally producing or being induced to do so, or equivalents thereof, using the methods described below. Alternatively, it can be isolated by chemical synthesis; alternatively, it can be isolated by standard techniques of recombinant DNA technology (eg, by isolation of cDNA or genomic DNA encoding such a receptor). . Substantially identical receptors have the same biological function (eg, are activated by the same compound).

【００２５】 「由来する」とは、その生物体のゲノムによりコードされる、そしてその生物
体の細胞のサブセットの表面上に存在することを意味する。“Derived from” means encoded by the genome of the organism and present on the surface of a subset of cells of the organism.

【００２６】 「単離されたＤＮＡ」とは、本発明のＤＮＡが由来する生物体の天然に存在す
るゲノム中のすぐ近接する（すなわち共有結合された）完全コード配列（すなわ
ち、５’末端のものおよび３’末端のもの）とすぐ近接しない（すなわち、共有
結合的に連結されない）という点では、その天然の環境にないＤＮＡを意味する
。従って、この用語は、例えば、ベクターに；自律複製プラスミドもしくはウイ
ルスに；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換え
ＤＮＡ；あるいは、他の配列と独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制
限エンドヌクレアーゼ消化により作製されるｃＤＮＡまたはゲノムフラグメント
もしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。さらなる
ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である任意の組換えＤ
ＮＡもまた含む。“Isolated DNA” refers to the immediately contiguous (ie, covalently linked) complete coding sequence (ie, 5 ′ terminal) in the naturally occurring genome of the organism from which the DNA of the present invention is derived. In the immediate vicinity (i.e., not covalently linked) to those of the 3 'end and those of the 3' end means DNA that is not in its natural environment. Thus, the term is used, for example, in vectors; in autonomously replicating plasmids or viruses; or in recombinant DNA that is integrated into prokaryotic or eukaryotic genomic DNA; or, as a separate molecule independent of other sequences (eg, PCR Or cDNA produced by restriction endonuclease digestion or genomic fragments or cDNA fragments). Any recombinant D that is part of a hybrid gene encoding additional polypeptide sequence
NA is also included.

【００２７】 「単離されたＤＮＡ」とは、好ましくはベクター含有細胞においてＤＮＡによ
りコードされるタンパク質の発現を指向し得るベクター中にあり、そしてさらに
このようなベクターを含有する細胞（好ましくは、真核生物細胞、例えば、ＣＨ
Ｏ細胞（ＡＴＣＣ；カタログ番号ＣＣＬ ６１またはＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ
；カタログ番号ＣＲＬ １６５１；および上記引用文献（Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．
ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６８）に記載される型のＸｅｎ
ｏｐｕｓ卵母細胞を含む））ＤＮＡを意味し得る。好ましくは、このような細胞
は、このような単離されたＤＮＡで安定にトランスフェクトされる。“Isolated DNA” is preferably in a vector capable of directing the expression of a protein encoded by the DNA in a vector-containing cell, and further comprising a cell containing such a vector (preferably, Eukaryotic cells, for example CH
O cells (ATCC; Cat. No. CCL 61 or COS-7 cells (ATCC
Catalog number CRL 1651; and the above-cited references (Vu, T.-KH.
Xen of the type described in (1991) Cell 64: 1057-1068).
opus oocytes)) DNA. Preferably, such cells are stably transfected with such isolated DNA.

【００２８】 「形質転換細胞」および「トランスフェクトされた細胞」、「遺伝子的に操作
された細胞」などは、遺伝子操作によりＰＡＲ４をコードするＤＮＡ分子（また
はその生物学的に活性なフラグメントもしくはアナログをコードするＤＮＡ）を
導入された細胞（またはその祖先からの細胞）を意味する。このようなＤＮＡ分
子は、「発現のために位置される」、これは、ＤＮＡ分子が配列の転写および翻
訳を指向する（すなわち、ＰＡＲ４タンパク質またはそのフラグメントもしくは
アナログの産生を容易にする）ＤＮＡ配列に隣接して位置されることを意味する
。“Transformed cells” and “transfected cells”, “genetically engineered cells” and the like are DNA molecules encoding PAR4 by genetic manipulation (or biologically active fragments or analogs thereof). (Or a cell from an ancestor thereof) into which the DNA encoding the DNA has been introduced. Such a DNA molecule is “located for expression”, ie, a DNA sequence in which the DNA molecule directs transcription and translation of the sequence (ie, facilitates production of a PAR4 protein or fragment or analog thereof). Means that it is located adjacent to

【００２９】 「抗体」とは、抗原を結合し得る免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明
細書において用いられる場合の抗体は、抗体全体ならびに目的のエピトープ、抗
原または抗原性フラグメントを結合し得る任意の抗体フラグメント（例えば、Ｆ
（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むことを意味する。“Antibody” means an immunoglobulin protein capable of binding an antigen. Antibodies as used herein include whole antibodies as well as any antibody fragments (e.g., F antibodies) that can bind the epitope, antigen or antigenic fragment of interest.
(Ab ′) ₂ , Fab ′, Fab, Fv).

【００３０】 本発明の抗体は、ＰＡＲ４タンパク質について免疫反応性または免疫特異性で
あり、従ってＰＡＲ４タンパク質に特異的にそして選択的に結合する。ＰＡＲ４
についての抗体は、好ましくは免疫特異的である（すなわち、関連物質と実質的
に交差反応性でない）。用語「抗体」は全てのタイプの抗体（例えば、モノクロ
ーナル抗体）を含むが、本発明の抗体は、好ましくは、本明細書において記載さ
れるファージ提示方法論を用いて産生される。本発明の好ましい抗体は、精製さ
れた抗体である。精製された抗体とは、それが天然に会合する他のタンパク質、
炭水化物および脂質を十分に含まないことを意味する。このような抗体は、ＰＡ
Ｒ４タンパク質（またはその抗原性フラグメント）に「優先的に結合する」、す
なわち、他の抗原的に無関係な分子を実質的に認識せず、そして結合しない。[0030] The antibodies of the invention are immunoreactive or immunospecific for the PAR4 protein, and thus specifically and selectively bind to the PAR4 protein. PAR4
The antibodies for are preferably immunospecific (ie, not substantially cross-reactive with related substances). Although the term “antibody” includes all types of antibodies (eg, monoclonal antibodies), the antibodies of the invention are preferably produced using the phage display methodology described herein. The preferred antibodies of the present invention are purified antibodies. A purified antibody is another protein with which it naturally associates,
Means not rich in carbohydrates and lipids. Such antibodies are available from PA
"Preferentially binds" to the R4 protein (or antigenic fragment thereof), ie, substantially does not recognize and does not bind to other antigenically unrelated molecules.

【００３１】 本明細書において用いる場合、「特異的に活性化する」とは、プロテアーゼ活
性化レセプター４、レセプターポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはア
ナログを活性化し、本明細書に記載のようなＰＡＲ４媒介生物学的事象を開始し
、ただしプロテアーゼ活性化レセプター４ポリペプチドを天然に含むサンプル（
例えば、生物学的サンプル）中の他の分子に実質的に結合しない、トロンビン、
トロンビンアナログ、ＰＡＲ４アゴニスト、または他の化学薬剤（抗体のような
ポリペプチドを含む）のような薬剤を意味する。As used herein, “specifically activates” refers to activating a protease-activated receptor 4, a receptor polypeptide or a fragment or analog thereof, to a PAR4-mediated organism as described herein. Initiates a biological event, except for a sample that naturally contains the protease-activated receptor 4 polypeptide (
Thrombin, which does not substantially bind to other molecules in a biological sample),
Agents such as thrombin analogs, PAR4 agonists, or other chemical agents (including polypeptides such as antibodies) are meant.

【００３２】 本明細書において用いる場合、「特異的に阻害する」とは、例えばトロンビン
を阻害することにより、またはトロンビンもしくは他のＰＡＲ４活性化因子によ
りＰＡＲ４の活性化をブロックすることにより、プロテアーゼ活性化レセプター
４、レセプターポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログの活性化
を阻害する、トロンビンアナログ、ＰＡＲ４アンタゴニスト、または他の化学薬
剤（抗体のようなポリペプチドを含む）のような薬剤を意味する。好ましくは、
この薬剤は、それが結合するタンパク質の生物学的な活性をインビボまたはイン
ビトロで活性化または阻害する。As used herein, “specifically inhibits” refers to the activity of a protease, eg, by inhibiting thrombin, or by blocking the activation of PAR4 by thrombin or other PAR4 activators. Agent, such as a thrombin analog, a PAR4 antagonist, or other chemical agent (including a polypeptide such as an antibody) that inhibits the activation of a conjugated receptor 4, receptor polypeptide or fragment or analog thereof. Preferably,
The agent activates or inhibits, in vivo or in vitro, the biological activity of the protein to which it binds.

【００３３】 「生物学的活性」とは、プロテアーゼ活性化レセプター４がトロンビンまたは
ＰＡＲ４アゴニストに結合し、そして生物学的事象（例えば、本明細書で記載す
るホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺流出および血小板凝集など）の適切なカス
ケードをシグナル伝達する能力を意味する。“Biological activity” means that protease-activated receptor 4 binds to thrombin or a PAR4 agonist, and a biological event such as the phosphoinositide hydrolysis, Ca ²⁺ efflux and platelet described herein. (Eg, aggregation).

【００３４】 「実質的に増加」とは、コントロール（ここで、コントロールアッセイは、活
性化因子の非存在下で実施される）のレベルより少なくとも約２倍増える、好ま
しくは少なくとも約５倍増える、より好ましくはコントロールアッセイの活性に
対して少なくとも約１０倍増える活性または他の測定可能な表現型特性における
増加を意味する。“Substantially increase” means at least about 2-fold, preferably at least about 5-fold, above the level of a control (where the control assay is performed in the absence of the activator). More preferably, it means at least about a 10-fold increase in activity or other measurable phenotypic property relative to the activity of the control assay.

【００３５】 「実質的な低下」または「実質的な減少」とは、コントロールレベルの約８０
％である、好ましくはコントロールレベルの約５０％まで低下した、またはより
好ましくはコントロールレベルの約１０％以下まで低下した、活性または他の測
定可能な表現型特性における低下または減少を意味する。“Substantial reduction” or “substantial reduction” refers to about 80% of control level.
%, Preferably reduced to about 50% of the control level, or more preferably reduced to about 10% or less of the control level, by a reduction or reduction in activity or other measurable phenotypic properties.

【００３６】 用語「スクリーニング方法」および「アッセイ方法」は、ＰＡＲ４リガンドの
アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力について候補化合物をスク
リーニングする方法を記載するために用いられる。この方法は、以下：ａ）候補
アゴニスト化合物を組換えプロテアーゼ活性化レセプター４（またはＰＡＲ４ア
ゴニスト結合フラグメントまたはアナログ）と接触させる、工程；ｂ）レセプタ
ー、レセプターポリペプチドまたはレセプターフラグメントもしくはレセプター
アナログの活性化を測定する、工程；およびｃ）組換えレセプターと相互作用し
、そしてＰＡＲ４活性化を誘発またはブロックするものとしてアゴニスト化合物
を同定する、工程、を含む。相互作用は、分子内レセプター活性化ペプチドを露
出させるためのまたは分子内レセプター活性化ペプチドの模倣によるレセプター
の切断であり得る。係留リガンドは、遊離のアゴニストよりもブロックすること
がより困難であり得る。従って、トロンビンのブロックは、他のトロンビン基質
により応答をブロックするアンタゴニストについての厳密な試験である。これら
の用語は、非占有のレセプターへの効果を試験するアッセイ、および占有される
レセプターからのリガンドの置換を利用するアッセイを含む。The terms “screening method” and “assay method” are used to describe a method of screening a candidate compound for the ability of a PAR4 ligand to act as an agonist or antagonist. The method comprises the steps of: a) contacting a candidate agonist compound with a recombinant protease-activated receptor 4 (or PAR4 agonist binding fragment or analog); b) activating a receptor, receptor polypeptide or receptor fragment or receptor analog And c) identifying the agonist compound as interacting with the recombinant receptor and inducing or blocking PAR4 activation. The interaction can be cleavage of the receptor to expose the intramolecular receptor activating peptide or by mimicking the intramolecular receptor activating peptide. Tethered ligands can be more difficult to block than free agonists. Thus, blocking thrombin is a rigorous test for antagonists that block the response by other thrombin substrates. These terms include assays that test for effects on unoccupied receptors and assays that utilize displacement of ligand from occupied receptors.

【００３７】 「アゴニスト」とは、特定の活性を模倣する分子を意味し、この場合、これは
、活性化し、これにより相互作用から正常に生じる生物学的事象（ホスホイノシ
チド加水分解、Ｃａ²⁺流出、および血小板凝集）の誘発を活性化する様式でＰＡ
Ｒ４リガンドと相互作用する。好ましくは、アゴニストは、活性化因子または候
補アゴニストの非存在下でコントロールアッセイと比べたレセプター活性におけ
る実質的な増加を惹起する。アゴニストは、天然に存在するＰＡＲ４リガンドと
比べ、同じか、少ないか、または大きい活性を有し得る。By “agonist” is meant a molecule that mimics a specific activity, in which it activates, thereby resulting in a biological event that normally results from an interaction (phosphoinositide hydrolysis, Ca ²⁺ efflux , And platelet aggregation) in a manner that activates the induction of
Interacts with R4 ligand. Preferably, the agonist elicits a substantial increase in receptor activity compared to a control assay in the absence of an activator or candidate agonist. An agonist may have the same, less, or greater activity than a naturally occurring PAR4 ligand.

【００３８】 用語「アンタゴニストアッセイ」「アンタゴニストスクリーニング」などは、
天然に存在する活性化リガンドまたはアゴニストとＰＡＲ４との間の相互作用を
拮抗する能力について候補化合物をスクリーニングする方法をいう。この方法は
、以下：ａ）候補アンタゴニスト化合物を、一方では、組換えＰＡＲ４（または
アゴニスト結合フラグメントもしくはアナログ）を含む第１の化合物と、そして
他方では、トロンビンまたはＰＡＲ４アゴニストを含む第２の化合物と接触させ
る工程；ｂ）第１の化合物と第２の化合物とが相互作用するか、または候補化合
物によって相互作用から妨げられるかを決定する工程；およびｃ）第１の化合物
（ＰＡＲ４レセプター）の第２の化合物（ＰＡＲ４アゴニスト）への相互作用を
妨害し、それによりトロンビンまたはＰＡＲ４アゴニスト活性化生物学的事象（
例えば、ホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺流出、および血小板凝集）を実質的
に減少するものとしてアンタゴニスト性の化合物を同定する工程、を包含する。The terms “antagonist assay”, “antagonist screening” and the like
Refers to a method of screening candidate compounds for the ability to antagonize the interaction between a naturally occurring activating ligand or agonist and PAR4. The method comprises the steps of: a) combining a candidate antagonist compound, on the one hand, with a first compound comprising recombinant PAR4 (or an agonist binding fragment or analog) and, on the other hand, a second compound comprising thrombin or a PAR4 agonist. Contacting; b) determining whether the first compound and the second compound interact or are prevented from interacting by the candidate compound; and c) the first compound (PAR4 receptor). 2 that interfere with interaction with the compound (PAR4 agonist), thereby causing a thrombin or PAR4 agonist-activating biological event (
For example, identifying compounds that are antagonistic as substantially reducing phosphoinositide hydrolysis, Ca ²⁺ efflux, and platelet aggregation.

【００３９】 「アンタゴニスト」とは、ＰＡＲ４レセプターの活性化をブロックする分子を
意味する。これは、例えば、プロテアーゼ活性化レセプター４と相互作用し、こ
れによりこのような相互作用から生じる生物学的事象（例えば、ホスホイノシチ
ド加水分解、Ｃａ⁺⁺流出、および血小板分泌または血小板凝集）を誘発するトロ
ンビンの能力のような特定の活性を阻害することにより行われ得る。アンタゴニ
ストはＰＡＲ４レセプターに結合し得、そして、それによりＰＡＲ４レセプター
の活性化をブロックし得る。“Antagonist” refers to a molecule that blocks the activation of a PAR4 receptor. It interacts with, for example, protease-activated receptor 4, thereby triggering biological events resulting from such interactions, such as phosphoinositide hydrolysis, Ca ⁺⁺ efflux, and platelet secretion or platelet aggregation. This can be done by inhibiting certain activities, such as the ability of thrombin. Antagonists can bind to the PAR4 receptor and thereby block activation of the PAR4 receptor.

【００４０】 用語「処置」、「処置すること」、「処置する」などは、本明細書において、
所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に意味して用い
られる。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に妨げることに
関して予防的であり得、そして／または疾患および／またはこの疾患に起因する
副作用についての部分的または完全な治癒に関しては治療的であり得る。本明細
書において用いる場合「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処
置を包含し、そして以下： （ａ）疾患または症状の素因であり得るが、まだそれを有しているとは診断され
ていない被験体における発生から疾患または症状を防止すること （ｂ）疾患の症状を阻害する、すなわち、その進行を阻止すること；または （ｃ）疾患の症状を軽減する、すなわち、疾患の後退を生じさせること を含む。The terms “treatment,” “treating,” “treat,” and the like, as used herein,
Used generally to mean obtaining the desired pharmacological and / or physiological effect. This effect may be prophylactic with respect to completely or partially preventing the disease or its symptoms, and / or therapeutic with respect to partial or complete cure for the disease and / or side effects resulting from the disease. possible. As used herein, “treatment” includes any treatment of a disease in a mammal, especially a human, and includes the following: (a) may be predisposed to a disease or condition, but still has it. Preventing a disease or condition from occurring in an undiagnosed subject; (b) inhibiting the condition of a disease, ie, preventing its progression; or (c) reducing the disease condition, ie, a disease. Inducing retreat.

【００４１】 （好適な実施態様） 両方のスクリーニング方法の好適な実施態様において、組換えＰＡＲ４は、そ
の表面上にＰＡＲ４を通常、実質的に提示しない脊椎動物細胞（すなわち、ＰＡ
Ｒアクチベーターの存在下で有意なトロンビン媒介ホスホイノシチド加水分解も
Ｃａ²⁺流出も示さない細胞）によって安定に発現される；この脊椎動物細胞は、
哺乳動物細胞であり、Ｒａｔ１細胞またはＣＯＳ７細胞であり；そして候補アン
タゴニストまたは候補アゴニストは、トロンビンアナログ、ＰＡＲ４ペプチドフ
ラグメントもしくはアナログまたは他の化学薬剤（抗体のようなポリペプチドを
含む）である。Preferred Embodiments In a preferred embodiment of both screening methods, the recombinant PAR4 is a vertebrate cell that does not normally substantially display PAR4 on its surface (ie, PA
Cells that show no significant thrombin-mediated phosphoinositide hydrolysis or Ca ²⁺ efflux in the presence of the R activator);
A mammalian cell, a Rat1 cell or a COS7 cell; and the candidate antagonist or agonist is a thrombin analog, PAR4 peptide fragment or analog or other chemical agent (including a polypeptide such as an antibody).

【００４２】 本発明のレセプタータンパク質は、創傷ならびに胚発生におけるシグナル伝達
の媒介に応答して、脊椎動物の血小板、白血球、および間葉細胞の活性化に関与
するようである。このようなタンパク質（特にＰＡＲ４アンタゴニスト）は、血
栓症、アテローム硬化症、再狭窄、ならびに通常の創傷治癒に関する炎症および
種々の疾患（アテローム硬化症、再狭窄、肺炎症（ＡＲＤＳ）および糸球体硬化
症を含む）のような状態の処置のために有用な治療剤である。好ましい治療剤と
しては、以下が挙げられる：１）プロテアーゼ活性化レセプター４と相互作用す
る際にトロンビンの作用を模倣するか、もしくは分子内レセプター活性化ペプチ
ドの作用を模倣するアゴニスト（例えば、トロンビンアナログ、ＰＡＲ４ペプチ
ドフラグメントもしくはそのアナログ、または他の化合物）；および２）トロン
ビン：レセプター相互作用を妨害するか、またはレセプター分子内活性化ペプチ
ドを妨害することによって、トロンビンまたはプロテアーゼ活性化レプセター４
の機能をブロックするアンタゴニスト（例えば、トロンビンアナログ、抗体また
は他の化合物）。投与量は、現在の抗炎症性薬物に匹敵することが予測され、そ
して患者の年齢、性別、体重および状態に基づいて調節されるべきであり、少量
から始めて、そして応答性および毒性に基づいて徐々に増加させる。The receptor proteins of the present invention appear to be involved in the activation of vertebrate platelets, leukocytes, and mesenchymal cells in response to mediating signaling in wounds and embryonic development. Such proteins (particularly PAR4 antagonists) are useful for thrombosis, atherosclerosis, restenosis, and inflammation and various diseases associated with normal wound healing (atherosclerosis, restenosis, lung inflammation (ARDS) and glomerulosclerosis And therapeutic agents useful for the treatment of conditions such as Preferred therapeutic agents include the following: 1) agonists that mimic the action of thrombin when interacting with protease activated receptor 4 or that of an intramolecular receptor activating peptide (eg, thrombin analogs) PAR4 peptide fragments or analogs thereof, or other compounds); and 2) thrombin or protease-activated receptor 4 by interfering with the thrombin: receptor interaction or interfering with the receptor intramolecular activation peptide.
Antagonists that block the function of (eg, thrombin analogs, antibodies or other compounds). Dosage is expected to be comparable to current anti-inflammatory drugs, and should be adjusted based on the patient's age, gender, weight and condition, starting from small doses and based on responsiveness and toxicity Increase gradually.

【００４３】 レセプター成分は、いまや、組換え技術によって生成され得、そして候補アゴ
ニストおよびアンタゴニストは、形質転換して、培養した細胞を用いてスクリー
ニングされ得るために、本発明は、有用な治療剤の同定に対する簡単かつ迅速な
アプローチを提供する。ＰＡＲ４遺伝子の（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとして
の）単離は、ＰＡＲ４を細胞表面上に通常は有さない細胞型における発現を可能
にし、トロンビン：レセプター相互作用およびレセプター活性化を評価するため
のシステムを提供する。The present invention provides a useful therapeutic agent because receptor components can now be produced by recombinant techniques and candidate agonists and antagonists can be screened using transformed and cultured cells. Provides a simple and quick approach to identification. Isolation of the PAR4 gene (as cDNA or genomic DNA) allows expression in cell types that do not normally have PAR4 on the cell surface, and provides a system for assessing thrombin: receptor interactions and receptor activation. provide.

【００４４】 （実施例） 以下の実施例は、レセプタータンパク質およびこのようなタンパク質をコード
する配列を作製する方法ならびにこのようなＤＮＡ配列およびタンパク質を見出
すための方法論を実行する方法の、完全な開示および記載を当業者に提供するた
めに記載され、そして本発明とみなされる範囲を制限しないことが意図される。
使用される数値（例えば、数量、温度など）に関して正確さを確実にするための
取り組みがなされたが、いくらかの実験的誤差および偏位は認められるべきであ
る。他に示されなければ、部分または重量部分、分子量は、平均分子量の重量で
あり、温度はセ氏であり；そして圧力は大気圧またはその近辺である。EXAMPLES The following examples provide a complete disclosure of receptor proteins and methods of making sequences encoding such proteins and how to implement methodology for finding such DNA sequences and proteins. It is set forth to provide those skilled in the art and the description, and is not intended to limit the scope of what is considered the invention.
Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (eg, amounts, temperature, etc.) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts or parts by weight, molecular weight is weight by average molecular weight, temperature is in degrees Celsius; and pressure is at or near atmospheric.

【００４５】 いまや、マウスおよびヒト由来のプロテアーゼ活性化レセプター４の、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡおよびレセプタータンパク質のクローニングおよび特徴の記載
が理解される。ＰＡＲ４ ＤＮＡを含み、かつこれを発現し得る発現ベクター、
ならびに本発明のＤＮＡを含み、かつこれを発現する形質転換細胞もまた、記載
される。あり得るＰＡＲ４アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにレセプタ
ーアゴニストおよびレセプターアンタゴニストについてのスクリーニングアッセ
イもまた、記載される。Now, the cDN of the protease-activated receptor 4 of mouse and human origin
A, cloning and characterization of genomic DNA and receptor proteins are understood. An expression vector comprising and capable of expressing PAR4 DNA,
Also described are transformed cells containing and expressing the DNA of the present invention. Screening assays for potential PAR4 agonists and antagonists, as well as receptor agonists and receptor antagonists, are also described.

【００４６】 （実施例１：マウスおよびヒトプロテアーゼ活性化レセプター４の単離） 公の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２およびＰＡ
Ｒ３に対する相同性で配列を同定することによって潜在的なプロテアーゼ活性化
レセプター配列を検索した。１つの特定のＥＳＴであるクローン４００６８９を
、ＰＡＲ２配列を用いるデータベース検索において同定し、これは１１アミノ酸
ストレッチにわたって類似性を示した。このＥＳＴをさらに特徴付けした。Example 1 Isolation of Mouse and Human Protease-Activated Receptor 4 The publicly expressed sequence tag (EST) databases were identified as PAR1, PAR2 and PA
Potential protease-activating receptor sequences were searched by identifying the sequence by homology to R3. One particular EST, clone 400689, was identified in a database search using the PAR2 sequence, which showed similarity over an 11 amino acid stretch. This EST was further characterized.

【００４７】 このＥＳＴ配列を用いて、マウスおよびヒトのｃＤＮＡならびにゲノムクロー
ンをＰＣＲおよびハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ
．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の組み合わせによって得た。マウスおよびヒトのＰ
ＡＲ４のヌクレオチド配列、ならびにこれらのヌクレオチド配列に対応する推定
アミノ酸配列を図１〜４に示す。マウスＰＡＲ４ ｃＤＮＡは、レセプターに結
合した３９７アミノ酸の推定Ｇタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを含んでいた（図２）。ＰＡＲ４ ｃＤＮＡの５’配列は、推定トロンビ
ン切断部位をコードし、この新たなレセプターが新規のトロンビンレセプターで
あることを示唆する。この遺伝子を潜在的なプロテアーゼ活性化レセプターとし
てさらに特徴づけた。Using this EST sequence, mouse and human cDNAs and genomic clones can be ligated by PCR and hybridization techniques (eg, Sambrook, J.
. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory.
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
ory, New York). Mouse and human P
The nucleotide sequences of AR4 and the deduced amino acid sequences corresponding to these nucleotide sequences are shown in FIGS. The mouse PAR4 cDNA contained an open reading frame encoding a putative G protein of 397 amino acids bound to the receptor (FIG. 2). The 5 'sequence of the PAR4 cDNA encodes a putative thrombin cleavage site, suggesting that this new receptor is a novel thrombin receptor. This gene was further characterized as a potential protease-activated receptor.

【００４８】 マウスＰＡＲ４産物の推定されたタンパク質構造は、他のマウスプロテアーゼ
活性化レセプターと比較した場合、保存された領域における有意な相同性を示し
た。推定マウスＰＡＲ４アミノ酸配列と、マウスＰＡＲ１、ＰＡＲ２、およびＰ
ＡＲ３のアミノ酸配列との間の相同性を図６Ａおよび６Ｂにおけるアラインメン
トによって示す。少なくとも３つのレセプター分子によって共有されるアミノ酸
をボックスで囲み、そして陰をつける。The deduced protein structure of the mouse PAR4 product showed significant homology in the conserved regions when compared to other mouse protease-activated receptors. Deduced mouse PAR4 amino acid sequence and mouse PAR1, PAR2, and P
Homology between the amino acid sequence of AR3 is shown by the alignment in FIGS. 6A and 6B. Amino acids shared by at least three receptor molecules are boxed and shaded.

【００４９】 マウスＰＡＲ４遺伝子を含むゲノム領域を配列決定し、これによってプロテア
ーゼ活性化レセプターのエキソン組織化特徴：成熟レセプター分子の構造の大部
分をコードする第２のエキソンとは、約２５０ｂｐの特徴的なイントロンだけ離
れている、シグナルペプチド領域をコードする第１のエキソンが明らかになった
。ｍＰＡＲ４トロンビン切断部位は、タンパク質のアミノ末端で見出され、そし
てリガンドペプチドまたは「活性化ペプチド」をつなぐ、ｍＰＡＲ４に対応する
アミノ酸配列は、切断部位に直に隣接する（図８）。The genomic region containing the mouse PAR4 gene was sequenced, thereby exon-organizing features of the protease-activated receptor: a second exon encoding most of the structure of the mature receptor molecule is characterized by approximately 250 bp. The first exon encoding the signal peptide region, separated by a major intron, was revealed. The mPAR4 thrombin cleavage site is found at the amino terminus of the protein, and the amino acid sequence corresponding to mPAR4, which connects the ligand peptide or "activation peptide", is immediately adjacent to the cleavage site (Figure 8).

【００５０】 （マウスＰＡＲ４のクローニング） 以下に示す機能研究に用いたマウスＰＡＲ４ ｃＤＮＡを、マウスの１４〜１
５日胚のライブラリーからクローニングした。ＥＳＴクローン４００６８９の配
列を用いて、マウスの１４〜１５日胚由来のｃＤＮＡを用いる５’ＲＡＣＥ（Ｍ
ａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のために、２つの逆方向プラ
イマーを生成した：(Cloning of Mouse PAR4) The mouse PAR4 cDNA used in the functional studies described below was
Cloned from a 5 day embryo library. Using the sequence of EST clone 400689, 5'RACE (M
(arathon cDNA, Clonetech) two reverse primers were generated:

【００５１】[0051]

【化１】 用いた順方向プライマーは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ ＡＰ１およびＡＰ２であった
。２回の「ネスト化」ＰＣＲ反応を行い、１回目は、プライマーＡＰ１およびＲ
２を用い、そして２回目は、ＡＰ２およびＲ３を用いた。第１のＰＣＲ反応条件
は、以下のとおりである：最初の５サイクルは９５℃で５秒、７２℃で４分、次
の５サイクルは９５℃で５秒、７０℃で４分、および次の２５サイクルは９５℃
で２秒、６８℃で４分。第２のＰＣＲ反応条件は、９５℃で１分間、次いで、９
５℃で３０秒、６８℃で３分間を２５サイクルであった。９５０ｂｐの優性なバ
ンドは、ネスト化（ＡＰ２−Ｒ３）反応の後に認められた。産物を配列決定し、
このことによって第１の膜貫通ドメインに対してｍＰＡＲ４配列の５’を提供し
た。Embedded image The forward primers used were Clonetech AP1 and AP2. Two “nested” PCR reactions were performed, the first with primers AP1 and R
2 and a second time with AP2 and R3. The first PCR reaction conditions were as follows: first 5 cycles at 95 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 4 minutes, next 5 cycles at 95 ° C. for 5 seconds, 70 ° C. for 4 minutes, and 25 cycles at 95 ° C
For 2 seconds and 68 ° C. for 4 minutes. The second PCR reaction conditions were 95 ° C. for 1 minute, then 9
25 cycles of 30 seconds at 5 ° C and 3 minutes at 68 ° C. The 950 bp dominant band was observed after the nesting (AP2-R3) reaction. Sequencing the product,
This provided the 5 ′ of the mPAR4 sequence for the first transmembrane domain.

【００５２】 開始コドンに対する配列を、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮ
ＡならびにＡＰ１プライマーおよびＡＰ２プライマーを再び用いる５’ＲＡＣＥ
反応の第２のシリーズで得た。この最初の反応は、ＡＰ１および逆方向プライマ
ー、ＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧ（ＲＡＣＥ１）を使
用し、そして第２の反応は、ＡＰ２およびＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴ
ＴＧＡＧＡＧＣＴＧ（ＲＡＣＥ２）を使用した。ＡＰ１−ＲＡＣＥ１についての
反応条件は、９５℃で３０秒、６８℃で３分を２５サイクルであった。ネスト化
ＡＰ２−ＲＡＣＥ２反応についての条件は、ＰＣＲを３０サイクル行ったこと以
外は、同じであった。優性な３００ｂｐのバンドを得、そして配列決定した。The sequence for the start codon was replaced with Clonetech Marathon cDN.
A and 5'RACE using AP1 and AP2 primers again
Obtained in a second series of reactions. The first reaction used AP1 and the reverse primer, CCACAGCCACCACAAGCCCATAGAG (RACE1), and the second reaction used AP2 and CCCCAGCAAGCAGTGCT
TGAGAGCTG (RACE2) was used. The reaction conditions for AP1-RACE1 were 95 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 3 minutes, 25 cycles. The conditions for the nested AP2-RACE2 reaction were the same except that 30 cycles of PCR were performed. A dominant 300 bp band was obtained and sequenced.

【００５３】 ＥＳＴクローン４００６８９を両方の末端から配列決定して、ＥＳＴデータベ
ース中の配列を確認した。しかし、この配列は、ｂＥＮＤ（マウス脳内皮細胞株
）ライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによって得られたｃＤ
ＮＡおよびＢＡＣゲノムクローン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の両方から
後に得られたＤＮＡ配列とは異なった。本発明者らは、後者の配列が正しいと考
えている。EST clone 400689 was sequenced from both ends to confirm the sequence in the EST database. However, this sequence was obtained by hybridization screening of the bEND (mouse brain endothelial cell line) library.
It differed from DNA sequences obtained later from both NA and BAC genomic clones (Genome Systems). We believe that the latter sequence is correct.

【００５４】 最終的な機能的クローンをｂＥＮＤ ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、
ＥＳＴクローンによって示された開始コドンから停止コドンまでのＰＣＲ産物を
生成することによって得た。このクローンの３’末端を、ＮｃｏＩ部位でゲノム
フラグメントを用いてサブクローニングすることにより引き続いて置換した。本
来の産物および３’ゲノムフラグメントを含むクローンの両方を、卵母細胞中で
試験し、等しく活性であることを見出した。Using the final functional clone as a template with bEND cDNA,
Obtained by generating a PCR product from the start codon to the stop codon indicated by the EST clone. The 3 'end of this clone was subsequently replaced by subcloning with a genomic fragment at the NcoI site. Both the original product and the clone containing the 3 'genomic fragment were tested in oocytes and found to be equally active.

【００５５】 （ヒトＰＡＲ４） ヒトＰＡＲ４配列を縮重ＰＣＲスキームを用いて決定した。ヒトＰＡＲ４配列
を縮重ＰＣＲプライマーを用いて得て、ヒト総ゲノムＤＮＡから９００ｂｐの優
性な産物を増幅した。ＰＣＲ反応に使用したプライマーは以下である：(Human PAR4) The human PAR4 sequence was determined using a degenerate PCR scheme. The human PAR4 sequence was obtained using degenerate PCR primers to amplify a 900 bp dominant product from human total genomic DNA. The primers used in the PCR reaction are as follows:

【００５６】[0056]

【化２】 ここで、「Ｉ」は、イノシンを示す。反応条件は、９５℃で４分、次いで９５℃
で１分、５０℃で２．５分、７２℃で１．５分を５０サイクルであった。９００
ｂｐの産物の配列決定によって、新規のアミノ酸配列が明らかになった。これは
、マウスＰＡＲ４と８８％同一であった。Embedded image Here, “I” indicates inosine. The reaction conditions were 95 ° C. for 4 minutes, then 95 ° C.
For 1 minute, 50 ° C. for 2.5 minutes, and 72 ° C. for 1.5 minutes for 50 cycles. 900
Sequencing of the bp product revealed a novel amino acid sequence. It was 88% identical to mouse PAR4.

【００５７】 ヒト巨核球細胞株を、プローブとして上記の９００ｂｐ産物を用いるノーザン
によってＰＡＲ４発現についてスクリーニングし、そしてＫ５６２赤白血病細胞
株は陽性であることを見出した。次いで、５’ＲＡＣＥをＧＩＢＣＯ ５’ＲＡ
ＣＥキットおよびＫ５６２ ｍＲＮＡを使用して、製造業者の説明書に従って行
った。ネスト化ＰＣＲ反応を、２つの逆方向プライマーを使用して行った：ＣＧ
ＡＧＧＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧ（ＧＳＰ２Ａ）およびＴＧＣＧＴＧＴ
ＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧ（ＧＳＰ２Ｂ）。ＧＩＢＣＯ順方向アンカープライ
マーおよびＧＳＰ２Ａを用いる第１の反応の条件は、９５℃で４分、次いで、９
５℃で４５秒、５６℃で１分、および７２℃で１分を３５サイクルであった。半
（ｈｅｍｉ）ネスト化した第２の反応を、以下のとおり、ＧＩＢＣＯアンカープ
ライマーおよびＧＳＰ２Ｂを用いて行った：９５℃で４分、次いで、９５℃４５
秒、５０℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクル。優性な３５０ｂｐのバ
ンドを観察し、サブクローニングし、そして配列決定し、このことによってｈＰ
ＡＲ４開始コドンに配列を提供した。A human megakaryocyte cell line was screened for PAR4 expression by Northern using the 900 bp product described above as a probe, and the K562 erythroleukemia cell line was found to be positive. Then, 5'RACE is changed to GIBCO 5'RA
Performed according to the manufacturer's instructions using the CE kit and K562 mRNA. A nested PCR reaction was performed using two reverse primers: CG
AGGTTCATCAGCAGCATGG (GSP2A) and TGCGTGT
CCAGCAGGGACAG (GSP2B). The conditions of the first reaction using the GIBCO forward anchor primer and GSP2A were at 95 ° C. for 4 minutes, then 9
There were 35 cycles of 45 seconds at 5 ° C, 1 minute at 56 ° C, and 1 minute at 72 ° C. A second hemi-nested reaction was performed using the GIBCO anchor primer and GSP2B as follows: 4 min at 95 ° C, then 45 ° C at 95 ° C.
30 cycles of seconds, 1 minute at 50 ° C, and 1 minute at 72 ° C. The dominant 350 bp band was observed, subcloned, and sequenced, thereby confirming hP
The sequence was provided at the AR4 start codon.

【００５８】 同じキットおよびテンプレートを、３’ＲＡＣＥに使用した。使用した順方向
プライマーは以下である：The same kit and template were used for 3′RACE. The forward primers used were:

【００５９】[0059]

【化３】 ＧＩＢＣＯ ＵＡＰプライマーを逆方向プライマーとして使用し、半ネスト化Ｐ
ＣＲを行った。第１の反応は、９５℃で４分、次いで、９５℃で４５秒、５０℃
で１分、および７２℃で４分を３５サイクルから構成された。第２の反応は、９
５℃で４５秒、５０℃で１分、および７２℃で１分を３０サイクルから構成され
た。優性な１．６ｋｂバンドを観察し、サブクローニングし、そして配列決定し
、このことによって停止コドンに配列を提供した。Embedded image The GIBCO UAP primer was used as the reverse primer and the semi-nested P
CR was performed. The first reaction was performed at 95 ° C for 4 minutes, then at 95 ° C for 45 seconds at 50 ° C.
For 1 minute and 72 ° C. for 4 minutes for 35 cycles. The second reaction is 9
It consisted of 30 cycles of 45 seconds at 5 ° C, 1 minute at 50 ° C, and 1 minute at 72 ° C. A dominant 1.6 kb band was observed, subcloned, and sequenced, which provided the sequence for the stop codon.

【００６０】 機能的ｈＰＡＲ４クローンを、開始コドンから停止コドンを超えて５０ｂｐま
でのプライマーとＶｅｎｔポリメラーゼを用いて、２５サイクルのＰＣＲを使用
してＰＣＲによって作製した。テンプレートは、Ｋ５６２ ｃＤＮＡであった。
ＰＣＲ産物を配列決定し、そしてｃＲＮＡを生成するための卵母細胞発現ベクタ
ー（ｐＦＲＯＧＧＹ）にサブクローニングした。ヒトＰＡＲ４ ｃＲＮＡを、Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ卵母細胞にマイクロインジェクションして、機能を実証した。A functional hPAR4 clone was generated by PCR using primers from the start codon to beyond the stop codon to 50 bp and Vent polymerase using 25 cycles of PCR. The template was K562 cDNA.
The PCR product was sequenced and subcloned into an oocyte expression vector (pFROGGY) for producing cRNA. Human PAR4 cRNA is expressed as X
The function was demonstrated by microinjection into enopus oocytes.

【００６１】 （実施例２：ポリペプチド発現） 本発明に従うポリペプチドを、適切な発現ビヒクル中にｃＤＮＡフラグメント
（例えば、上記のｃＤＮＡ）をコードするＰＡＲ３の全てまたは一部を用いた適
切な宿主細胞の形質転換およびレセプターの発現によって生成し得る。Example 2 Polypeptide Expression A polypeptide according to the invention can be expressed in a suitable expression vehicle by using all or part of PAR3 encoding a cDNA fragment (eg, the cDNA described above) in a suitable host cell. And expression of the receptor.

【００６２】 分子生物学の当業者は、任意の広範な種々の発現系を使用して、組換えレセプ
タータンパク質を提供し得ることを理解する。使用される適切な宿主細胞は、発
明には重要ではない。レセプターを、原核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）ま
たは真核生物宿主（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅまたは哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ−６Ｍ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ／３Ｔ３ま
たはチャイニーズハムスター卵巣細胞））中で生成し得る。このような細胞は、
広範な供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能である。形質転換お
よび発現ビヒクルの選択の方法は、選択した宿主系に依存する。形質転換および
哺乳動物細胞トランスフェクション方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載され
；発現ビヒクルは、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｕｎｕａｌ（Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｈ．ら（１９８５）増補１
９８７）に提供される発現ベクターから選択され得る。[0062] Those of skill in the art of molecular biology understand that any of a wide variety of expression systems may be used to provide the recombinant receptor protein. The appropriate host cell used is not critical to the invention. The receptor may be a prokaryotic host (eg, E. coli) or a eukaryotic host (eg, Saccharomyces cerevisiae).
e or mammalian cells (eg, COS-6M, COS-7, NIH / 3T3 or Chinese hamster ovary cells). Such cells are
A wide variety of sources (eg, American Type Culture Col.)
lection, Rockville, MD). The method of transformation and selection of the expression vehicle will depend on the host system chosen. Transformation and mammalian cell transfection methods are described, for example, in Ausubel et al.
Rent Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, New York (1989)); expression vehicles are described, for example, in Cloning Vectors: A Labor.
Attorney Manual (Pouwels, PH et al. (1985) Supplement 1)
987).

【００６３】 特に好ましい発現系は、レセプタータンパク質またはそれらの生物学的に活性
なフラグメントを含み、かつ発現する発現ベクターで形質転換された、Ｖｕら（
Ｖｕら、Ｃｅｌｌ（１９９１）前出）のＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞および昆虫細胞
（ＳＦ９−バキュロウイルス）である。ヒトまたはマウスのＰＡＲ４をコードす
るＤＮＡもしくは適切なレセプターフラグメントもしくはアナログ（上記のよう
に）を、発現を可能にするように設計された方向で発現ベクターに挿入する。あ
るいは、ＰＡＲ４（または生物学的に活性なレセプターフラグメントもしくはア
ナログ）を、安定にトランスフェクトした哺乳動物細胞株で発現する。発現ビヒ
クルと共に使用され得る他の好ましい宿主細胞としては、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（
ＡＴＣＣ登録番号１６５８）が挙げられる。この発現は、本発明のスクリーニン
グ方法において使用され得る（下記）か、または所望であれば、組換えレセプタ
ータンパク質を以下のように単離し得る。[0063] A particularly preferred expression system is that of Vu et al. (Supra) transformed with an expression vector containing and expressing a receptor protein or biologically active fragment thereof.
Vu et al., Cell (1991) supra) Xenopus oocytes and insect cells (SF9-baculovirus). DNA encoding the human or mouse PAR4 or an appropriate receptor fragment or analog (as described above) is inserted into the expression vector in an orientation designed to allow expression. Alternatively, PAR4 (or a biologically active receptor fragment or analog) is expressed in a stably transfected mammalian cell line. Other preferred host cells that can be used with the expression vehicle include NIH / 3T3 cells (
ATCC registration number 1658). This expression can be used in the screening methods of the invention (described below) or, if desired, the recombinant receptor protein can be isolated as follows.

【００６４】 哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに適切な多くのベクターは、公に
入手可能である（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら（前出）を参照のこと）；このよう
な細胞株を構築する方法もまた、公に利用可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（前出））。１つの実施態様において、レセプター（またはレセプターフラグ
メントもしくはアナログ）をコードするｃＤＮＡを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクターにクローニングする。従って、宿主細胞
染色体へのプラスミドおよびＰＡＲ ４コード遺伝子の組み込みは、細胞培養培
地中に０．０１〜３００μＭのメトトレキセートを含めることによって選択され
る（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出に記載されるように）。この優性選択は、ほとんど
の細胞型で達成され得る。組換えタンパク質発現を、トランスフェクトした遺伝
子のＤＨＦＲ媒介増幅によって増加させ得る。遺伝子増幅を保有する細胞株を選
択する方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）に記載される；このような方法は、一
般的に漸増レベルのメトトレキセートを含む培地中に拡大した培養物を含む。こ
の目的のために通常使用されるＤＨＦＲ含有発現ベクターとしては、ｐＣＶＳＥ
ＩＩ−ＤＨＦＲおよびｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、に記
載される）が挙げられる。上記の任意の宿主細胞（または、好ましくは、ＤＨＦ
Ｒ欠損ＣＨＯ細胞株（例えば、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞、ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ
９０９６））は、安定にトランスフェクトされた細胞株のＤＨＦＲ選択またはＤ
ＨＦＲ媒介遺伝子増幅に好ましい宿主細胞である。Many vectors suitable for stable transfection of mammalian cells are publicly available (see, eg, Pouwels et al., Supra); methods for constructing such cell lines are also available. It is also publicly available (eg, Ausubel
(See above)). In one embodiment, the cDNA encoding the receptor (or receptor fragment or analog) is cloned into an expression vector containing the dihydrofolate reductase (DHFR) gene. Thus, integration of the plasmid and the PAR4 encoding gene into the host cell chromosome is selected by including 0.01-300 μM methotrexate in the cell culture medium (as described in Ausubel et al., Supra). This dominant selection can be achieved in most cell types. Recombinant protein expression can be increased by DHFR-mediated amplification of the transfected gene. Methods for selecting cell lines that carry gene amplification are described in Ausubel et al., Supra; such methods generally involve cultures expanded in media containing increasing levels of methotrexate. DHFR-containing expression vectors commonly used for this purpose include pCVSE
II-DHFR and pAdD26SV (A) (described in Ausubel et al., Supra). Any of the above host cells (or preferably, DHF
R-deficient CHO cell lines (eg, CHO DHFR cells, ATCC accession number CRL)
9096)) is based on the DHFR selection or D of stably transfected cell lines.
Preferred host cells for HFR-mediated gene amplification.

【００６５】 １つの特に好ましい安定な発現系は、ｐｃＤＮＡＩ／ＮＥＯ（ＩｎＶｉｔｒｏ
ｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）発現ベクターで安定にトランスフェクトさ
れたＲａｔ１細胞（ＡＴＣＣ）である。One particularly preferred stable expression system is pcDNAI / NEO (InVitro).
Gen, San Diego, CA) Rat1 cells (ATCC) stably transfected with an expression vector.

【００６６】 組換えレセプターの発現（例えば、本明細書中に記載される任意の発現系によ
って生成される）を、免疫学的手順（例えば、組換え細胞抽出物のウェスタンブ
ロットもしくは免疫沈降分析）またはインタクトな組換え細胞の免疫蛍光（例え
ば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、に記載される方法を使用して）によってアッセイ
し得る。組換えレセプタータンパク質を、レセプターに対する抗体を用いて検出
する。抗プロテアーゼ活性化レセプター４抗体を、免疫原として、インタクトな
レセプターまたは適切なプロテアーゼ活性化レセプター４エピトープを含むペプ
チドを用いて生成する方法は、以下に記載される。ＰＡＲ３フラグメントもしく
はアナログの発現を検出するために、抗体を、好ましくは、免疫原としてこのフ
ラグメントもしくはアナログ中に含まれるエピトープを使用して生成する。[0066] Expression of the recombinant receptor (eg, produced by any of the expression systems described herein) can be determined by immunological procedures (eg, western blot or immunoprecipitation analysis of recombinant cell extracts). Alternatively, it can be assayed by immunofluorescence of intact recombinant cells (eg, using the method described in Ausubel et al., Supra). The recombinant receptor protein is detected using an antibody against the receptor. Methods for producing anti-protease activating receptor 4 antibodies using an intact receptor or a peptide containing an appropriate protease activating receptor 4 epitope as an immunogen are described below. To detect expression of a PAR3 fragment or analog, an antibody is generated, preferably using the epitope contained in the fragment or analog as an immunogen.

【００６７】 一旦組換えＰＡＲ４タンパク質（またはそのフラグメントもしくはアナログ）
が発現されると、それは、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを使
用して単離される。１つの例において、抗ＰＡＲ４抗体をカラムに結合させ得、
そしてこれを使用して、インタクトなレセプターまたはレセプターフラグメント
もしくはアナログを単離し得る。アフィニティークロマトグラフィーの前に、レ
セプター保有細胞の溶解および分画を、標準的な方法によって行い得る（例えば
、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、を参照のこと）。一旦単離されると、組換えタンパ
ク質を、所望であれば、例えば、高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓ
ｈｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＷｏｒｋおよびＢ
ｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ、（１９８０）を参照のこと）によってさら
に精製し得る。Once the recombinant PAR4 protein (or a fragment or analog thereof)
When is expressed, it is isolated, for example, using immunoaffinity chromatography. In one example, an anti-PAR4 antibody can be bound to the column,
This can then be used to isolate an intact receptor or receptor fragment or analog. Prior to affinity chromatography, lysis and fractionation of receptor-bearing cells can be performed by standard methods (see, eg, Ausubel et al., Supra). Once isolated, the recombinant protein can be purified, if desired, for example, by high performance liquid chromatography (eg, Fis
her, Laboratory Technologies In Biochem
try and And Molecular Biology, Work and B
urdon, eds., Elesevier, (1980)).

【００６８】 本発明のレセプター、特に短いレセプターフラグメントはまた、化学合成によ
って（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
（１９８４）第２版、Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏ
ｃｋｆｏｌｄ，ＩＬに記載される方法によって）生成し得る。The receptors of the present invention, especially short receptor fragments, may also be synthesized chemically (eg, Solid Phase Peptide Synthesis).
(1984) Second Edition, The Pierce Chemical Co. , Ro
ckfold, IL).

【００６９】 （実施例３：組換えプロテアーゼ活性化レセプター４の活性化研究） ＰＡＲ４が、ＶｕらのＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞（Ｖｕら、Ｃｅｌｌ（１９９１
）前出）において発現した場合、トロンビンによって活性化されることを実証し
た。ＰＡＲ４がα−トロンビンによるシグナル伝達を媒介する能力を試験した。
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に、エピトープタグ化マウスＰＡＲ４（ｍＰＡＲ４）を
コードするｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。トロンビン誘発した⁴⁵Ｃ
ａ放出を、Ｖｕら（Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．ら（１９９１）前出）に記載のように
測定した。卵母細胞に、２．５または２５ｎｇいずれかのｍＰＡＲ４ ｃＲＮＡ
をマイクロインジェクションした。卵母細胞のコントロールセットに、２５ｎｇ
のマウスＰＡＲ１ ｃＤＮＡ（ＷＴ５）を注入した。レセプターの表面発現を、
Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．ら（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０：１６４３５−１６４４０；およびＩｓｈｉｉ，Ｋ．ら（１９９３）Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９７８０−９７８６、これらの参考文献は、そ
の全体が本明細書中で参考として援用される）の方法による、Ｍ１抗体結合によ
って確認し得る。Example 3 Activation Study of Recombinant Protease-Activated Receptor 4 PAR4 is a Xenopus oocyte from Vu et al. (Vu et al., Cell (1991)
) Demonstrated that when expressed in supra), it was activated by thrombin. The ability of PAR4 to mediate signaling by α-thrombin was tested.
Xenopus oocytes were microinjected with cRNA encoding epitope-tagged mouse PAR4 (mPAR4). ⁴⁵ C was thrombin-induced
a release was measured as described by Vu et al. (Vu, T.-KH et al. (1991) supra). Oocytes have either 2.5 or 25 ng mPAR4 cRNA
Was microinjected. 25 ng for oocyte control set
Of mouse PAR1 cDNA (WT5). Surface expression of the receptor
Ishii, K .; (Ishii, K. et al. (1995) J. Biol. Chem.
. 270: 16435-16440; and Ishii, K .; Et al. (1993) J
. Biol. Chem. 268: 9780-9786, these references, which are incorporated by reference herein in their entirety) can be confirmed by M1 antibody binding.

【００７０】 マウスＰＡＲ４ ｃＲＮＡを用いたＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞のマイクロインジ
ェクションは、トロンビン依存性⁴⁵Ｃａの流動化を付与した（図９）。これは、
この系におけるアゴニスト誘発ホスホイノシチド加水分解を反映した。α−トロ
ンビンは、ＰＡＲ１発現卵母細胞およびＰＡＲ４発現卵母細胞の両方において１
ｎＭの注入レベルでさえ、カルシウム流動化を誘導し得た。処理したｍＰＡＲ４
発現細胞は、両方の濃度でＣａ放出の約２５倍の増加を示し、そしてこれは、高
濃度のｍＰＡＲ４を発現する細胞と低濃度のｍＰＡＲ４を発現する細胞との間で
、有意に変化しなかった。さらに、ｍＰＡＲ４注入卵母細胞のｍＰＡＲ４の活性
化ペプチド（ＧＹＰＧＫＦ（配列番号１２））への曝露によって、ＰＡＲ４媒介 ⁴⁵ Ｃａ流動化をほぼ３３倍増加まで誘導した。これは、ＰＡＲ１媒介流動化に対
して２倍の増加である。ＰＡＲ１活性化ペプチドであるＳＦＬＬＲＮ（配列番号
１３）への曝露は、１００μＭの濃度ですらＰＡＲ４を活性化しなかった。Microinjection of Xenopus Oocytes Using Mouse PAR4 cRNA
Is dependent on thrombin⁴⁵Ca fluidization was provided (FIG. 9). this is,
Agonist-induced phosphoinositide hydrolysis in this system was reflected. α-Toro
Binbin is 1 in both PAR1- and PAR4-expressing oocytes.
Even injection levels of nM could induce calcium mobilization. MPAR4 processed
Expressing cells show an approximately 25-fold increase in Ca release at both concentrations, and
Between cells expressing low levels of mPAR4 and cells expressing low levels of mPAR4
, Did not change significantly. Furthermore, mPAR4 activity of mPAR4-injected oocytes
Exposure to Activated Peptide (GYPGKF (SEQ ID NO: 12)) ⁴⁵ Ca mobilization was induced to almost a 33-fold increase. This is in contrast to PAR1-mediated liquidation.
This is a two-fold increase. SFLLRN which is a PAR1 activating peptide (SEQ ID NO:
Exposure to 13) did not activate PAR4 even at a concentration of 100 μM.

【００７１】 ヒトＰＡＲ４ ｃＲＮＡもまた、上記のように標準的技術を用いて、ｈＰＡＲ
４ ｃＤＮＡからインビトロで転写した。Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に、２ｎｇの
ｃＲＮＡ／卵母細胞でマイクロインジェクションし、そしてアゴニストペプチド
に応答するカルシウムシグナル伝達を測定した（図１０）。１０ｎＭのトロンビ
ンは、機能的トロンビンレセプターとしてｈＰＡＲ４と一致して、ＰＡＲ４を発
現する卵母細胞においてカルシウム流動化の３０倍の増加を引き起こした。ヒト
ＰＡＲ４活性化ペプチドであるＧＹＰＧＱＶ（配列番号１４）もまた、１００μ
Ｍでカルシウム流動化を示した。マウス活性化ペプチドであるＧＹＰＧＫＦは、
ヒト活性化ペプチドより、なおさらに強力であったが、その一方で、ヒトＰＡＲ
１活性化ペプチドは有意な活性を示さなかった。陰性コントロール（注入してい
ない細胞および無関係なレセプターを発現する細胞）もまた、活性を示さなかっ
た。Human PAR4 cRNA was also prepared using standard techniques as described above, using hPAR
4 Transcribed in vitro from cDNA. Xenopus oocytes were microinjected with 2 ng cRNA / oocyte and calcium signaling in response to agonist peptide was measured (FIG. 10). 10 nM thrombin caused a 30-fold increase in calcium mobilization in oocytes expressing PAR4, consistent with hPAR4 as a functional thrombin receptor. GYPGQV, a human PAR4 activating peptide (SEQ ID NO: 14), was also
M indicated calcium mobilization. GYPGKF, a mouse activation peptide,
Even more potent than the human activating peptide, while the human PAR
One activation peptide did not show significant activity. Negative controls (uninjected cells and cells expressing an irrelevant receptor) also showed no activity.

【００７２】 （実施例４：組換えプロテアーゼ活性化レセプター４の特異性） ＰＡＲ４の活性化の特異性を、多くのアルギニン／リジン特異的セリンプロテ
アーゼおよびＰＡＲ４活性化ペプチドの、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞発現ＰＡＲ４
への導入によって試験した（図１１）。種々の濃度のアルギニン／リジン特異的
セリンプロテアーゼプラスミン、トリプシン、組織プラスミノーゲンアクチベー
ター（ＡＰＣ）、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、およびトロンビンを試験した。
ＰＡＲ４活性化ペプチドの改変体もまた、試験した。ｍＰＡＲ４レセプターをト
ロンビン、その活性化ペプチドであるＧＹＰＧＫＦ、および比較的低い特異性の
セリンプロテアーゼであるトリプシンでの処置の際に活性化した。ｍＰＡＲ４の
有意な活性化は、試験した他のプロテアーゼに対する応答においても認められず
、活性を欠くことが予測された改変体の活性化ペプチドＧＡＰＧＫＦの処理でも
認められなかった。Example 4: Specificity of Recombinant Protease Activated Receptor 4 The specificity of PAR4 activation was determined by the Xenopus oocyte expression PAR4 of many arginine / lysine specific serine proteases and PAR4 activating peptides.
(Fig. 11). Various concentrations of the arginine / lysine-specific serine protease plasmin, trypsin, tissue plasminogen activator (APC), factor VIIa, factor Xa, and thrombin were tested.
Variants of the PAR4 activating peptide were also tested. The mPAR4 receptor was activated upon treatment with thrombin, its activating peptide, GYPGKF, and trypsin, a relatively low specificity serine protease. No significant activation of mPAR4 was observed in response to the other proteases tested, nor was treatment of the variant activation peptide GAPGKF, which was predicted to lack activity.

【００７３】 ｍＰＡＲ４、ｍＰＡＲ１、およびｍＰＡＲ２シグナル伝達の特異性もまた、試
験した。プロテアーゼ誘発⁴⁵Ｃａ放出を、各レセプターの活性化ペプチドならび
にプロテアーゼであるトロンビンおよびトリプシンで刺激した、マウスのＰＡＲ
１、ＰＡＲ２またはＰＡＲ４を発現するＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において測定し
た（図１２）。各ＰＡＲは、そのそれぞれの活性化ペプチドによって特異的に活
性化され、そして他のｍＰＡＲの活性化ペプチドによっては特異的に活性化され
なかった。ｍＰＡＲ２およびｍＰＡＲ３は、トリプシンでの処理の際に小さな活
性化レベルを示したが、ＰＡＲ４は、はるかにより高い応答を示し、⁴⁵Ｃａ放出
が２４倍増加した。最終的に、ＰＡＲ１およびＰＡＲ４は、トロンビンに対する
有意な応答を示し、ＰＡＲ４発現卵母細胞は、トロンビンレセプターであるｍＰ
ＡＲ１よりトロンビンに対するより大きな応答を示した。The specificity of mPAR4, mPAR1, and mPAR2 signaling was also tested. PAR of mice stimulated with protease-induced ⁴⁵ Ca release by activating peptides of each receptor and the proteases thrombin and trypsin
1, measured in Xenopus oocytes expressing PAR2 or PAR4 (FIG. 12). Each PAR was specifically activated by its respective activation peptide and was not specifically activated by the activation peptides of the other mPARs. mPAR2 and mPAR3 showed small activation levels upon treatment with trypsin, while PAR4 showed a much higher response, with a ^45- fold increase in ⁴⁵ Ca release. Finally, PAR1 and PAR4 show a significant response to thrombin, and PAR4-expressing oocytes express the thrombin receptor mP
It showed a greater response to thrombin than AR1.

【００７４】 （実施例５：マウスおよびヒトにおけるＰＡＲ４の組織発現） マウス組織のノーザン分析は、ＰＡＲ４ ｍＲＮＡがマウス脾臓細胞中に最も
強いことを示した。ＰＡＲ４の脾臓発現のレベルは、巨核球（ＰＡＲ３に対する
予測作用部位）中のＰＡＲ３の発現と類似する。マウス組織におけるＰＡＲ４の
役割は、解明を待つが、脾臓におけるＰＡＲ４の発見は、トロンビンにより血小
板および他の造血細胞の活性化を媒介する際のＰＡＲ４の役割と一貫する。Example 5 Tissue Expression of PAR4 in Mice and Humans Northern analysis of mouse tissues showed that PAR4 mRNA was strongest in mouse spleen cells. The level of spleen expression of PAR4 is similar to the expression of PAR3 in megakaryocytes (the predicted site of action for PAR3). Although the role of PAR4 in mouse tissues is pending elucidation, the discovery of PAR4 in the spleen is consistent with the role of PAR4 in mediating thrombin activation of platelets and other hematopoietic cells.

【００７５】 マウス組織のインサイチュハイブリダイゼーションは、脾臓の巨核球（血小板
前駆体細胞）中のＰＡＲ４ ｍＲＮＡの存在を示す。ハイブリダイゼーションを
センス鎖のプローブコントロールで実行する場合のコントロールサンプルは、全
ての細胞型に対して陰性コントロールである。ＰＡＲ４ ｍＲＮＡについてのマ
ウス組織のノーザン分析は、脾臓においてシグナルを示し、脳、心臓、および他
の組織中では低レベルで見られる。脾臓は、マウスにおける造血器官であり、そ
してノーザンおよびインサイチュハイブリダイゼーションの両方のデータは、Ｐ
ＡＲ４がマウスにおいて巨核球中に最も多量に発現されることを示唆する。In situ hybridization of mouse tissue indicates the presence of PAR4 mRNA in spleen megakaryocytes (platelet precursor cells). When hybridization is performed with the sense strand probe control, the control sample is a negative control for all cell types. Northern analysis of mouse tissues for PAR4 mRNA shows a signal in the spleen and is found at low levels in brain, heart, and other tissues. The spleen is the hematopoietic organ in mice, and both Northern and in situ hybridization data
This suggests that AR4 is most highly expressed in megakaryocytes in mice.

【００７６】 インサイチュハイブリダイゼーション研究を、以下のように実行する。麻酔を
した成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定する。
試験される器官を、切開し、切り取り、そして４％パラホルムアルデヒド中で４
時間、液浸固定する。処理した組織を、パラフィン包埋し、そして５ｍｍの切片
を切断した。センスまたはアンチセンスの³⁵Ｓ−リボプローブを、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ^-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされたマウスＰＡＲ２ ｃＤＮＡからイ
ンビトロで転写する。ハイブリダイゼーション、洗浄、および現像の条件は、マ
ウスＰＡＲ１（Ｓｏｉｆｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ
．１４４：６０〜６９）について報告されている条件と同様である。ノーザン分
析を実行するために、マウスのメッセージに対する³²Ｐ標識プローブを、膜貫通
ドメイン２〜３を示すマウスのｃＤＮＡコドンに対応する、ＰＣＲで増幅したＤ
ＮＡフラグメントのランダムプライミング（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキット；Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって生成する。高ストリンジェンシーのハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄を、ノーザン分析についてのＣｌｏｎｅｔｅｃｈのプロト
コルによって実行した。The in situ hybridization studies are performed as follows. Anesthetized adult C57BL / 6 mice are perfused and fixed with 4% paraformaldehyde.
The organ to be tested is dissected, excised, and treated with 4% paraformaldehyde in 4%.
Fix by immersion for a time. Treated tissues were embedded in paraffin and 5 mm sections were cut. Sense or antisense ³⁵ S-riboprobes were added to pBlues
^{cript II SK - (Stratagene, San} Diego, CA) is transcribed in vitro from subcloned into the EcoRI site mice PAR2 cDNA of. Hybridization, washing, and development conditions were determined using mouse PAR1 (Soifer, SJ et al. (1993) Am. J. Pathol).
. 144: 60-69). To perform Northern analysis, a ³² P-labeled probe for mouse messages was prepared by PCR-amplified D corresponding to the mouse cDNA codon showing transmembrane domains 2-3.
Random priming of NA fragments (Prime-It II kit; S
(tratagene). High stringency hybridization and washing was performed according to Clonetech's protocol for Northern analysis.

【００７７】 （実施例６：ＰＡＲ４機能についてのアッセイ） 本発明の有用なレセプターフラグメントまたはアナログは、トロンビンと相互
作用し、そして活性化されてトロンビンレセプター相互作用と関連する事象のカ
スケードを開始させるフラグメントまたはアナログである。このような相互作用
を、インビトロでの機能性アッセイ方法（例えば、本明細書中に記載される、ホ
スホイノシチド加水分解アッセイ、⁴⁵Ｃａ流出アッセイ、または血小板凝集アッ
セイ）によって検出し得る。この方法は、成分として、トロンビン結合を許容す
るように形成される、トロンビンおよび組換えプロテアーゼ活性化レセプター４
（または適切なフラグメントもしくはアナログ）（例えば、本明細書中に記載さ
れるポリペプチド）を含む。トロンビンを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）または類似の供給元から入手し得る。Example 6: Assay for PAR4 Function Useful receptor fragments or analogs of the present invention interact with thrombin and activate them to initiate a cascade of events associated with thrombin receptor interaction. Or analog. Such interactions can be detected by in vitro functional assay methods, such as the phosphoinositide hydrolysis assay, ⁴⁵ Ca efflux assay, or platelet aggregation assay described herein. The method comprises, as components, thrombin and recombinant protease-activated receptor 4 formed to allow thrombin binding.
(Or suitable fragments or analogs) (eg, the polypeptides described herein). Thrombin was purchased from Sigma Chemical C
o. (St. Louis, MO) or similar sources.

【００７８】 好ましくは、プロテアーゼ活性化レセプター４の成分を、その表面上にレセプ
ターが天然に実質的に存在しない細胞によって、例えば、このような細胞が適切
な発現系においてレセプター成分をコードする核酸を含むように操作することに
よって産生する。適切な細胞は、例えば、組換えレセプターの産生に関して上記
で議論した細胞（例えば、Ｒａｔ１細胞またはＣＯＳ−７細胞）である。[0078] Preferably, the components of the protease-activated receptor 4 are converted by cells that are substantially free of the receptor on their surface, for example, by the nucleic acid encoding the receptor component in a suitable expression system. Produced by manipulation to include. Suitable cells are, for example, the cells discussed above for the production of recombinant receptors (eg, Rat1 cells or COS-7 cells).

【００７９】 （実施例７：プロテアーゼ活性化レセプター４アクチベーターのアンタゴニス
トおよびアゴニストについてのスクリーニング） （アンタゴニスト） 上記の議論のように、本発明の１つの局面は、トロンビン（または他のＰＡＲ
４活性化化合物）とプロテアーゼ活性化レセプター４との間の相互作用を阻害す
る化合物をスクリーニングする工程、それによってその相互作用により媒介され
る事象のカスケードを妨害するかまたは減少させる工程を特徴とする。このスク
リーニングのエレメントは、ＰＡＲ４アクチベーター、アンタゴニスト、および
ＰＡＲ４機能の検出を許容するように形成される、ＰＡＲ４アクチベーター（例
えば、トロンビン）、候補アンタゴニスト、および組換えＰＡＲ４（または上記
に概説するような、適切なレセプターフラグメントもしくはアナログ）である。
さらなるエレメントは、下流のシグナル伝達を検出するために使用される、⁴⁵Ｃ
ａ、Ｆｕｒａ−２、³Ｈ−イノシトール、または別の指示薬であり得る（Ｉｓｈ ｉｉ、Ｋ．ら（１９９３）前出；およびＮａｎｅｖｉｃｚ，Ｔ．ら（１９９６）
前出）。Example 7 Screening for Antagonists and Agonists of Protease-Activated Receptor 4 Activator Antagonists As discussed above, one aspect of the present invention relates to thrombin (or other PARs).
Screening for compounds that inhibit the interaction between C.4 activating compound) and protease-activated receptor 4, thereby preventing or reducing the cascade of events mediated by that interaction. . The elements of this screen are PAR4 activators (eg, thrombin), candidate antagonists, and recombinant PAR4 (or as outlined above) that are formed to allow detection of PAR4 activators, antagonists, and PAR4 function. , Suitable receptor fragments or analogs).
An additional element is ⁴⁵ C, which is used to detect downstream signaling.
a, Fura-2, ³ H-inositol, or another indicator (Ishii, K. et al. (1993) supra; and Naneviczs, T. et al. (1996)).
Supra).

【００８０】 トロンビン誘導性血小板凝集の阻害はまた、ＰＡＲ４レセプター活性化のアン
タゴニストをモニターする手段として使用され得る。トロンビンを、候補阻害化
合物（例えば、ペプチド）とともに５分間インキュベーションし、次いで、この
混合物を、洗浄した血小板に添加し、そして発光血小板凝集測定（ｌｕｍｉａｇ
ｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ）による血小板のＡＴＰ分泌として、血小板の活性化が続
く（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５１６〜
５１９（１９９６）；およびＵＳＰＮ ５，２５６，７６６を参照のこと）。あ
るいは、血小板を、候補ＰＡＲ４アンタゴニストとともに５分間インキュベーシ
ョンする。その後、トロンビンに対する応答を測定する。Inhibition of thrombin-induced platelet aggregation can also be used as a means to monitor antagonists of PAR4 receptor activation. Thrombin is incubated with a candidate inhibitory compound (eg, a peptide) for 5 minutes, then the mixture is added to the washed platelets, and the luminescent platelet aggregation assay (lumiag)
platelet ATP secretion followed by activation of platelets (eg, Connolly, AJ et al., Nature 381: 516-).
519 (1996); and USPN 5,256,766). Alternatively, platelets are incubated with the candidate PAR4 antagonist for 5 minutes. Thereafter, the response to thrombin is measured.

【００８１】 トロンビンを伴うスクリーニングアッセイにおいて可能性のあるアンタゴニス
トを含むことは、トロンビン媒介性の事象（例えば、血小板の凝集）を減少する
ものとしての、真正のレセプターアンタゴニストのスクリーニングおよび同定を
可能にする。Including potential antagonists in screening assays involving thrombin allows screening and identification of genuine receptor antagonists as reducing thrombin-mediated events (eg, platelet aggregation). .

【００８２】 適切な候補トロンビンアンタゴニストは、ＰＡＲ４フラグメント、特に、細胞
外性であると予測され、それゆえトロンビンまたは係留されたリガンドを結合す
るようであるタンパク質のフラグメントを含み；このようなフラグメントは、好
ましくは５個以上のアミノ酸を含む。候補ＰＡＲ４アンタゴニストは、トロンビ
ンアナログならびに他のペプチド化合物および非ペプチド化合物ならびに抗ＰＡ
Ｒ４抗体を含む。Suitable candidate thrombin antagonists include PAR4 fragments, especially fragments of proteins that are predicted to be extracellular and thus appear to bind thrombin or tethered ligand; Preferably it contains 5 or more amino acids. Candidate PAR4 antagonists include thrombin analogs and other peptide and non-peptide compounds and anti-PA
R4 antibody included.

【００８３】 （アゴニスト） 本発明の別の局面は、ＰＡＲ４アゴニストとして作用する化合物についてスク
リーニングする工程を特徴とする。トロンビンまたはアゴニストを用いるＰＡＲ
４の活性化は、事象のカスケード（例えば、ホスホイノシチド加水分解、Ｃａ₂ ＋流出、および血小板凝集）を導き、これは、トロンビンまたは他のアゴニスト
活性を測定するための都合のよい手段を提供する。(Agonist) Another aspect of the present invention features a step of screening for a compound that acts as a PAR4 agonist. PAR with thrombin or agonist
4 Activation of the cascade of events (e.g., phosphoinositide hydrolysis, Ca ₂ + efflux, and platelet aggregation) leads to, this provides a convenient means for measuring the thrombin or other agonist activity.

【００８４】 本発明のアゴニストスクリーニングアッセイは、ＰＡＲ４機能の検出を許容す
るように形成される、組換えＰＡＲ４（または、本明細書中で概略される、適切
なレセプターのフラグメントもしくはアナログ）を発現する組換え細胞を利用す
る。あるいは、ＰＡＲ４を天然で発現する細胞（例えば、白血球、血小板、また
は間葉細胞）を使用し得る。スクリーニングの他のエレメントは、ＰＡＲ４活性
化の検出可能な下流の基質（例えば、放射標識ホスホイノシチド（検出可能な産
物への放射標識ホスホイノシチドの加水分解は、候補アゴニストによるＰＡＲ４
活性化を示す））を含む。The agonist screening assays of the present invention express recombinant PAR4 (or a fragment or analog of the appropriate receptor as outlined herein) that is configured to permit detection of PAR4 function. Use recombinant cells. Alternatively, cells that naturally express PAR4 (eg, leukocytes, platelets, or mesenchymal cells) may be used. Other elements of the screen include a detectable downstream substrate for PAR4 activation (eg, radiolabeled phosphoinositide (hydrolysis of radiolabeled phosphoinositide to a detectable product is a method for PAR4 activation by candidate agonists).
Activation))).

【００８５】 ＰＡＲ４を発現する細胞からの⁴⁵Ｃａ流出は、候補アゴニストによるレセプタ
ー活性化を測定する手段として使用され得る（Ｗｉｌｌｉａｎｓ，Ｊ．Ａ．ら（
１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：４９３９〜４９４３；Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ
．ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５１〜１０６８；およびＵＳＰＮ ５，
２５６，７６６（これらの参考文献は、その全体が本明細書中で参考として援用
される））。ＰＡＲ４をコードするｃＲＮＡを発現する卵母細胞による⁴⁵Ｃａ放
出を、以下のように評価する。簡潔には、細胞内カルシウムプールを、５０μＣ
ｉ⁴⁵ＣａＣｌ₂（１０〜４０ｍＣｉ／ｍｇ Ｃａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む３ ００μｌのカルシウムを含まないＭＢＳＨ中で室温にて４時間、３０個の卵母細
胞の群をインキュベートすることによって標識する。標識した卵母細胞を洗浄し
、次いで、抗生物質を含まないＭＢＳＨ ＩＩ中で９０分間インキュベートする
。５つの卵母細胞の群を選択し、そして抗生物質を含まない０．５ｍｌ／ウェル
のＭＢＳＨ ＩＩを含む２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０４７
）における個々のウェル中に置く。この培地を取り出し、そして１０分毎に新鮮
な培地と交換し、収集した培地を、各１０分のインキュベーションの間に卵母細
胞により放出される⁴⁵Ｃａを決定するシンチレーション計測によって分析する。
この１０分のインキュベーションを、１単位時間当たりの⁴⁵Ｃａ放出の安定なベ
ースラインが達成されるまで継続する。２つのさらなる１０分の収集物を入手し
、次いで、アゴニストを含む試験培地を添加し、そしてアゴニスト誘導性⁴⁵Ｃａ
放出を決定する。[0085] ⁴⁵ Ca efflux from cells expressing PAR4 can be used as a means of measuring receptor activation by candidate agonists (Willians, JA et al. (
1988) PNAS USA 85: 4939-4943; -K. H
. (1991) Cell 64: 1051-1068; and USPN 5,
256,766 (these references are incorporated herein by reference in their entirety)). ⁴⁵ Ca release by oocytes expressing cRNA encoding PAR4 is evaluated as follows. Briefly, the intracellular calcium pool was reduced to 50 μC
Label by incubating a group of 30 oocytes in 300 μl calcium-free MBSH containing i ⁴⁵ CaCl ₂ (10-40 mCi / mg Ca; Amersham) for 4 hours at room temperature. The labeled oocytes are washed and then incubated in MBSH II without antibiotics for 90 minutes. A group of 5 oocytes was selected and a 24-well tissue culture plate (Falcon 3047) containing 0.5 ml / well MBSH II without antibiotics.
) In individual wells. The medium is removed and replaced with fresh medium every 10 minutes, and the collected medium is analyzed by scintillation counting to determine ⁴⁵ Ca released by oocytes during each 10 minute incubation.
This 10 minute incubation is continued until a stable baseline of ⁴⁵ Ca release per unit time is achieved. Two additional 10 minute harvests were obtained, then test media containing agonist was added and agonist-induced ⁴⁵ Ca
Determine release.

【００８６】 電圧クランプアッセイは、アゴニスト活性をモニターする代替的な方法を提供
する。単一電極電圧クランプ技術または２電極技術のいずれかを使用し得ること
を除いて、本質的には以前に記載された（Ｊｕｌｉｕｓ，Ｄ．ら Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ（１９８８）２４１：５５８〜５６３（その全体が本明細書中において参考と
して援用される））ように、アゴニスト誘導性の内向き塩素流を、ｃＲＮＡをコ
ードするトロンビンレセプターを発現する電圧クランプ化卵母細胞において測定
する。血小板凝集をまた、ＰＡＲ４レセプター活性化をモニターする手段として
使用し得る（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：
５１６〜５１９（１９９６）を参照のこと）。ヒト血小板は、ＰＡＲ１およびＰ
ＡＲ４の両方を使用し得る。[0086] Voltage clamp assays provide an alternative method of monitoring agonist activity. It was essentially described previously (Julius, D. et al. Science, except that either single-electrode voltage-clamp or two-electrode techniques could be used.
e (1988) 241: 558-563 (incorporated herein by reference in its entirety), agonist-induced inward chloride flux can be converted to voltage-clamped expression of a thrombin receptor encoding cRNA. Measured in oocytes. Platelet aggregation can also be used as a means of monitoring PAR4 receptor activation (eg, Connolly, AJ et al., Nature 381:
516-519 (1996)). Human platelets are PAR1 and P
Both AR4s can be used.

【００８７】 本発明に有用なアゴニストは、正常なトロンビン媒介性シグナル伝達経路を模
倣し、例えば、ホスホイノシチドの加水分解の上昇を導くアゴニストである。適
切な候補アゴニストは、トロンビンアナログまたはＰＡＲ４係留リガンドドメイ
ン、あるいはトロンビンまたはＰＡＲ４係留リガンドドメインの作用を模倣する
他の薬剤を含む。アゴニストは、アンタゴニストの発見を補助するために有用で
ある。Agonists useful in the present invention are those that mimic the normal thrombin-mediated signaling pathway, for example, leading to increased hydrolysis of phosphoinositide. Suitable candidate agonists include thrombin analogs or PAR4 tethered ligand domains, or other agents that mimic the effects of thrombin or PAR4 tethered ligand domains. Agonists are useful to aid in the discovery of antagonists.

【００８８】 （実施例８：抗プロテアーゼ活性化レセプター４抗体） プロテアーゼ活性化レセプター４（または免疫原性レセプターのフラグメント
もしくはアナログ）は、本発明において有用である抗体を惹起するために使用さ
れ得る。抗体の産生に好ましいレセプターのフラグメントは、細胞外であると推
測されるかまたは実験的に示されるフラグメントである。Example 8 Anti-Protease-Activated Receptor 4 Antibody Protease-activated receptor 4 (or a fragment or analog of an immunogenic receptor) can be used to raise antibodies that are useful in the present invention. Preferred fragments of the receptor for the production of antibodies are those that are presumed to be extracellular or have been shown experimentally.

【００８９】 ＰＡＲ４ペプチドに関する抗体を、以下のように産生する。ＰＡＲ４タンパク
質の全てまたは一部に対応するペプチドを、標準的な技術によりペプチド合成機
を使用して産生する。このペプチドを、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを用いてＫＬＨに結合させる。このＫＬＨペプチドを、
フロイントアジュバントと混合し、そして動物（例えば、モルモットまたはヤギ
）に注射し、ポリクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体を、上記のＰ
ＡＲ４ポリペプチドおよび標準的なハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５、１９７５；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：２９２；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ、（１９８１）；およびＡｕｓｕｂｅｌ
ら、前出を参照のこと）を使用して調製し得る。抗体を、ペプチド抗原親和性ク
ロマトグラフィーによって精製する。Antibodies to the PAR4 peptide are produced as follows. Peptides corresponding to all or part of the PAR4 protein are produced using a peptide synthesizer by standard techniques. This peptide is conjugated to KLH using m-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester. This KLH peptide is
Mixed with Freund's adjuvant and injected into animals (eg, guinea pigs or goats) to produce polyclonal antibodies. Monoclonal antibodies were prepared using the P
AR4 polypeptides and standard hybridoma technology (eg, Kohler
Et al., Nature (1975) 256: 495, 1975; Kohler et al., E
ur. J. Immunol. (1976) 6: 292; Kohler et al., Eur.
. J. Immunol. (1976) 6: 511; Hammerling et al., M.
onoclonal Antibodies and T Cell Hybr
idomas, Elsevier, NY, (1981); and Ausubel
(See, supra)). The antibodies are purified by peptide antigen affinity chromatography.

【００９０】 一旦産生されると、抗体を、ＰＡＲ４でトランスフェクトした細胞の表面に対
する特異的な結合によってか、ウエスタンブロットによってかまたは免疫沈降分
析によってＰＡＲ４を結合するそれらの能力について試験する（例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら、前出に記載される方法による）。Once produced, the antibodies are tested for their ability to bind PAR4 by specific binding to the surface of cells transfected with PAR4, by Western blot or by immunoprecipitation analysis (eg, Aus
ubel et al., supra).

【００９１】 ＰＡＲ４を特異的に認識する抗体は、有用なアンタゴニストについての候補で
あるようだとみなされる；このような候補を、トロンビンとＰＡＲ４との間の相
互作用を特異的に妨害するそれらの能力についてさらに試験する（本明細書中に
記載される機能性アンタゴニストアッセイを使用する）。トロンビンとＰＡＲ４
との結合またはＰＡＲ４の機能と拮抗する抗体は、本発明において有用なアンタ
ゴニストであるとみなされる。Antibodies that specifically recognize PAR4 are deemed to be candidates for useful antagonists; such candidates are identified as those those that specifically interfere with the interaction between thrombin and PAR4. Test further for potency (using functional antagonist assay described herein). Thrombin and PAR4
Antibodies that antagonize PAR4 function or PAR4 function are considered to be useful antagonists in the present invention.

【００９２】 （実施例９：ＰＡＲ４活性化ペプチドを使用するマウス血小板の活性化） ペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔｏｌ）で麻酔をしたマウスから
、腎静脈のレベルで下大静脈にカニューレ挿入することによって、血液を収集し
た。この血液を、３．１５％シトレート（１５％の総最終用量）と混合し、そし
て２００ｇで７分間スピンし、血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）を得た。ＥＤＴＡ
を添加して最終濃度を１０ｍＭにし、そしてＰＧＥ１を添加し、最終濃度を１μ
Ｍにした。このＰＲＰを５００ｇで１０分間スピンした。血小板のペレットを、
最初のＰＲＰ容積と等しい容積の血小板緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣＬ、１．０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、１ｍｇ．ｍｌ グルコース、０．２％ ＢＳＡ）および１ｍＭ ＥＤＴＡ および１μＭ ＰＧＥ１中に再懸濁し、そして再度、５００ｇで１０分間スピン
した。第２の血小板のペレットを、ＥＤＴＡまたはＰＧＥ１を含まない血小板緩
衝液中で再懸濁した。この容積を、ＯＤ₅₀₀が１．０になるように調整した。氷 上で最短３０分間の後、３００μｌの血小板の懸濁液を使用し、製造業者の指示
に従いＣｈｒｏｎｏｌｏｇ血小板凝集計において凝集および分泌を測定した。Example 9: Activation of Mouse Platelets Using PAR4 Activating Peptide Blood from mice anesthetized with pentobarbitol was cannulated into the inferior vena cava at the level of the renal vein. Collected. The blood was mixed with 3.15% citrate (15% total final dose) and spun at 200 g for 7 minutes to obtain platelet-rich plasma (PRP). EDTA
To a final concentration of 10 mM and PGE1 is added to a final concentration of 1 μm.
M. This PRP was spun at 500 g for 10 minutes. Platelet pellet,
A volume of platelet buffer equal to the initial PRP volume (20 mM Tris-HCl
pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM KCL, 1.0 mM MgC
l ₂ , 1 mg. ml glucose, 0.2% BSA) and 1 mM EDTA and 1 μM PGE1 and spun again at 500 g for 10 minutes. The second platelet pellet was resuspended in platelet buffer without EDTA or PGE1. The volume was adjusted to OD ₅₀₀ of 1.0. After a minimum of 30 minutes on ice, agglutination and secretion were measured on a Chronolog aggregometer using 300 μl of the platelet suspension according to the manufacturer's instructions.

【００９３】 ＰＡＲ４のペプチドＧＹＰＧＫＦを、５００μＭの最終濃度になるように添加
した。このペプチドに応じた分泌および凝集を、４〜１０分にわたって測定した
（図１３）。マウスの血小板はまた、ＰＡＲ３を発現するので、ＰＡＲ４ペプチ
ドに対する応答を、ＰＡＲ３がＰＡＲ４ペプチドに対する応答を媒介し得る可能
性を排除するために、ＰＡＲ３遺伝子ノックアウトマウス由来の血小板において
試験した。ＰＡＲ４ペプチドに対する注意すべき持続性応答が、これらの血小板
において示されたことに留意すること（図１４）。The PAR4 peptide GYPGKF was added to a final concentration of 500 μM. Secretion and aggregation in response to this peptide were measured over 4-10 minutes (FIG. 13). Since mouse platelets also express PAR3, responses to PAR4 peptides were tested in platelets from PAR3 gene knockout mice to rule out the possibility that PAR3 could mediate responses to PAR4 peptides. Note that a noteworthy sustained response to the PAR4 peptide was demonstrated in these platelets (FIG. 14).

【００９４】 （実施例１０：ＰＡＲ１活性化ペプチドに対して脱感作したヒト血小板の活性
化） ヒト血小板中でＰＡＲ４が機能的に発現されるか否かを試験するために、標準
的な技術によって、血小板を調製し、そして上記の通りに発光血小板凝集測定に
よって分析した。マウスのペプチドＧＹＰＧＫＦは、ヒトＰＡＲ４について同属
のヒトペプチドＧＹＰＧＱＶよりも強いアゴニストであるので、ＧＹＰＧＫＦを
使用した。ヒト血小板をＧＹＰＧＫＦにより活性化した。ヒト血小板はまた、Ｐ
ＡＲ１（マウス血小板におけるＰＡＲ３と同様）を発現する。ＰＡＲ４ペプチド
が、ＰＡＲ１と交差反応し得る可能性を除外するために、本発明者らは、ヒト血
小板を、ＰＡＲ１アゴニストであるＳＦＬＬＲＮを用いて脱感作した。これらの
血小板が、ＳＦＬＬＲＮを用いる第２のチャレンジに応答し得なかったが、ＧＹ
ＰＧＫＦに応答したことに留意すること（図１５）；従って、ＰＡＲ４ペプチド
は、ＰＡＲ１を通じて作用しておらず、これは、ＰＡＲ４がヒトの血小板におい
て機能的に発現されるという結論を強調する。Example 10 Activation of Human Platelets Desensitized to PAR1 Activating Peptide Standard techniques to test whether PAR4 is functionally expressed in human platelets Were prepared and analyzed by luminescent platelet aggregation measurements as described above. GYPGKF was used because the mouse peptide GYPGKF is a stronger agonist for human PAR4 than the cognate human peptide GYPGQV. Human platelets were activated by GYPGKF. Human platelets also
It expresses AR1 (similar to PAR3 in mouse platelets). To rule out the possibility that the PAR4 peptide could cross-react with PAR1, we desensitized human platelets with the PAR1 agonist SFLLRN. These platelets failed to respond to a second challenge with SFLLRN, but GY
Note that we responded to PGKF (FIG. 15); therefore, the PAR4 peptide was not acting through PAR1, which highlights the conclusion that PAR4 is functionally expressed in human platelets.

【００９５】 （実施例１１：ＰＡＲ４の治療的使用） 創傷治癒、血栓症、アテローム硬化症、再狭窄、炎症、および他のトロンビン
媒介性シグナル伝達障害の処置のために特に適切な治療剤は、適切な緩衝液（例
えば、生理学的生理食塩水）中に処方された上記のアゴニストおよびアンタゴニ
ストである。膜の界面でレセプターのフラグメントのコンホメーションを模倣す
ることが特に所望される場合、このフラグメントは、十分な数の近接する膜貫通
残基を含み得る。この場合において、このフラグメントを、（例えば、脂質小胞
中の、または細胞膜の破壊により得られるフラグメントに付着した）適切な脂質
画分と会合させ得る。あるいは、上記のように産生される抗ＰＡＲ４抗体を、治
療剤として使用し得る。再度、この抗体を、薬学的に受容可能な緩衝液（例えば
、生理学的食塩水）中で投与する。適切な場合、この抗体調製物を、適切なアジ
ュバントと組み合せ得る。Example 11 Therapeutic Uses of PAR4 Particularly suitable therapeutic agents for the treatment of wound healing, thrombosis, atherosclerosis, restenosis, inflammation, and other thrombin-mediated signaling disorders include: Agonists and antagonists as described above, formulated in a suitable buffer (eg, physiological saline). If it is particularly desired to mimic the conformation of a fragment of the receptor at the interface of the membrane, the fragment may include a sufficient number of contiguous transmembrane residues. In this case, the fragment may be associated with an appropriate lipid fraction (eg, attached to a fragment obtained in a lipid vesicle or by disruption of a cell membrane). Alternatively, anti-PAR4 antibodies produced as described above can be used as therapeutics. Again, the antibody is administered in a pharmaceutically acceptable buffer (eg, physiological saline). If appropriate, the antibody preparation can be combined with a suitable adjuvant.

【００９６】 上記に指示されるように処方され得るＰＡＲ４に対する抗体は、有用なアンタ
ゴニストである。他の治療的に有用なアンタゴニストは、ＰＡＲ４に由来するペ
プチドであり、これは、トロンビンに結合し、そしてトロンビンをブロックし、
そして薬学的に受容可能なキャリアおよび１つ以上の以下のものを含む処方物を
含む： ａ）単離された配列 ＰＡＰＲＧＹＰＧＱＶＣＡＮＤＳＤＴＬＥＬＰＤ（配列番号１５）； ｂ）切断不可能なトロンビンインヒビター ＰＡＰＲＰＹＰＧＱＶＣＡＮＤＳＤＴＬＥＬＰＤ（配列番号１６）、ここでは、
ＰＡＲ４切断部位を変異させて、切断をブロックしている； ｃ）切断不可能なトロンビンインヒビター ＰＡＲ（ｈＲ）ＧＹＰＧＱＶＣＡＮＤＳＤＴＬＥＬＰＤ（配列番号１７）、ここ
では、ＰＡＲ４切断部位Ｐ１を変異させて、切断をブロックしており、そしてｈ
Ｒは、βホモアルギニンである（余分なメチレン基が主鎖中にある）； ｄ）切断不可能なトロンビンインヒビター （ｄＦ）ＰＲＰＹＰＧＱＶＣＡＮＤＳＤＴＬＥＬＰＤ（配列番号１８）、ここで
は、良好な活性部位結合配列ｄＦＰＲで、ＰＮＰＲを置換しており、そしてｄＦ
はＤ−フェニルアラニンである； ｅ）ＧＹＰＧＱＶＣＡＮに対応する全ての配列または部分配列を、ＧＧＧのよ
うなスペーサー配列で置換する、上記ａ）〜ｄ）のいずれか； ｆ）アンタゴニストとして作用するａ）〜ｅ）のバリエーションおよび組合せ
。Antibodies to PAR4, which can be formulated as indicated above, are useful antagonists. Another therapeutically useful antagonist is a peptide derived from PAR4, which binds to and blocks thrombin,
And a formulation comprising a pharmaceutically acceptable carrier and one or more of the following: a) an isolated sequence PAPRGYPGQVCANDSDTTLELPD (SEQ ID NO: 15); b) a non-cleavable thrombin inhibitor PAPRPYPGQVCANDDSDTELPD (SEQ ID NO: 16). ),here,
Mutating the PAR4 cleavage site to block cleavage; c) Non-cleavable thrombin inhibitor PAR (hR) GYPGQVCANDSDTELELPD (SEQ ID NO: 17), where the PAR4 cleavage site P1 is mutated to block cleavage. And h
R is β-homoarginine (the extra methylene group is in the backbone); d) Non-cleavable thrombin inhibitor (dF) PRPYPGQVCANDSDDTELELPD (SEQ ID NO: 18), where the good active site binding sequence dFPR , PNPR, and dF
Is D-phenylalanine; e) any of the above a) to d), wherein all sequences or partial sequences corresponding to GYPGQVCAN are replaced by a spacer sequence such as GGG; f) a) to act as an antagonist Variations and combinations of e).

【００９７】 治療用調製物を、処置されるべき状態に従って投与する。通常は、所望の応答
を惹起する投薬量で、持続時間で、そして適切な時点で静脈内に投与する。適切
な時点とは、例えば、治療用調製物の投与が所望の応答を惹起する、創傷に関す
る時間、治療投与の間の時間間隔などをいう。あるいは、治療剤を経口で、鼻腔
内で、または局所的に、例えば、液体または噴霧として投与することは都合のよ
いことであり得る。この投薬量を、疾患の症状を実質的に減らすかまたは軽減す
る、動物に送達される治療剤の量であるように決定する。疾患の症状を実質的に
減らすかまたは軽減するために必要に応じて、処置を繰り返し得る。The therapeutic preparation is administered according to the condition to be treated. It is usually administered intravenously at a dosage that elicits the desired response, for a duration, and at an appropriate time. A suitable time point refers to, for example, the time associated with a wound, the time interval between therapeutic administrations, etc., at which administration of the therapeutic preparation elicits the desired response. Alternatively, it may be convenient to administer the therapeutic agent orally, intranasally, or topically, for example, as a liquid or a spray. The dosage is determined to be the amount of therapeutic delivered to the animal that substantially reduces or alleviates the symptoms of the disease. The treatment may be repeated as necessary to substantially reduce or alleviate the symptoms of the disease.

【００９８】 ＰＡＲ４アクチベーターアゴニストを、出血の処置に使用し得る。アンタゴニ
ストは、正常な創傷治癒、およびアテローム性硬化症、再狭窄、肺の炎症（ＡＲ
ＤＳ）、糸球体硬化症などを含む種々の疾患における傷害に対する炎症応答およ
び増殖応答を媒介する、心臓発作および発作を生じる血餅の形成を制御する際に
有用であり得る。[0098] PAR4 activator agonists can be used to treat bleeding. Antagonists demonstrate normal wound healing and atherosclerosis, restenosis, lung inflammation (AR
DS), may be useful in controlling heart attacks and the formation of stroke-causing clots that mediate inflammatory and proliferative responses to injury in a variety of diseases, including glomerulosclerosis and the like.

【００９９】 本発明の方法を使用し、トロンビン媒介性生物学的事象（例えば、ホスホイノ
シチドの加水分解または他の細胞シグナル伝達の事象）を変化させる際のそれら
の効果について、治療用のレセプターアクチベーターアゴニストおよびアンタゴ
ニストをまたは上記のアッセイによりスクリーニングし得る。非ヒト哺乳動物を
処置する場合、または非ヒト動物に対する治療剤をスクリーニングする場合、用
いられるＰＡＲ４またはレセプターフラグメントもしくはアナログあるいはその
抗体は、好ましくは、その種に特異的である。Therapeutic receptor activators for their effect in altering thrombin-mediated biological events (eg, phosphoinositide hydrolysis or other cell signaling events) using the methods of the present invention. Agonists and antagonists may be screened or by the assays described above. When treating non-human mammals or screening for therapeutics against non-human animals, the PAR4 or receptor fragment or analog or antibody thereof used is preferably specific for that species.

【０１００】 （他の実施態様） 本発明に従うポリペプチドは、（本明細書中に記載されるような）任意のプロ
テアーゼ活性化４レセプターを含む。このようなレセプターは、任意の供給源に
由来し得るが、好ましくは脊椎動物（例えば、ヒトまたはマウス）由来である。
これらのポリペプチドを使用し、例えば、トロンビン：レセプター相互作用を破
壊するアンタゴニストについて、またはコピーするアゴニストについてスクリー
ニングする。Other Embodiments A polypeptide according to the invention comprises any of the protease-activated 4 receptors (as described herein). Such receptors can be from any source, but are preferably from vertebrates (eg, human or mouse).
These polypeptides are used, for example, to screen for antagonists that disrupt thrombin: receptor interaction or for agonists that copy.

【０１０１】 本発明のポリペプチドはまた、トロンビンと相互作用し得るＰＡＲ４の任意の
アナログまたはフラグメントを含む。このようなアナログおよびフラグメントを
また使用して、ＰＡＲ４リガンドアンタゴニストまたはアゴニストについてスク
リーニングし得る。さらに、トロンビンに結合し、そして好ましくは可溶性であ
る（または不溶性でありそして脂質小胞中に処方される）、レセプターフラグメ
ントまたはアナログのサブセットをアンタゴニストとして使用して、循環濃度ま
たは局所濃度のいずれかの内因性トロンビンの濃度をインビボで低下させ得る。
レセプターアナログまたはフラグメントの効力は、トロンビンと相互作用するそ
の能力に依存する；このような相互作用を、ＰＡＲ４機能性アッセイ（例えば、
本明細書中に記載されるアッセイ）を使用して、容易にアッセイし得る。The polypeptides of the present invention also include any analog or fragment of PAR4 that can interact with thrombin. Such analogs and fragments can also be used to screen for PAR4 ligand antagonists or agonists. In addition, a subset of receptor fragments or analogs that bind to thrombin and that are preferably soluble (or insoluble and formulated in lipid vesicles) are used as antagonists to either circulating or local concentrations. Can reduce the concentration of endogenous thrombin in vivo.
The potency of a receptor analog or fragment depends on its ability to interact with thrombin; such interactions can be assessed using PAR4 functional assays (eg,
(Assays described herein).

【０１０２】 目的の特定のレセプターアナログは、保存的アミノ酸置換、例えば、１つのア
ミノ酸での同じクラスの別のアミノ酸の置換（例えば、ロイシンについてバリン
、リジンについてアルギニンなど）によってか、またはトロンビン媒介性事象を
シグナル伝達するレセプターの能力を（例えば、上記のようにアッセイした場合
に）破壊しないアミノ酸配列の位置に位置する、１以上の非保存的アミノ酸の置
換、欠失、もしくは挿入によって、異なるだけのアミノ酸配列を含む全長のレセ
プタータンパク質または部分的レセプタータンパク質を含む。The particular receptor analog of interest may be a conservative amino acid substitution, eg, substitution of one amino acid for another amino acid of the same class (eg, valine for leucine, arginine for lysine, etc.) or thrombin-mediated It only differs by the substitution, deletion or insertion of one or more non-conservative amino acids located at a position in the amino acid sequence that does not destroy the ability of the receptor to signal the event (eg, when assayed as described above). Or a full-length or partial receptor protein comprising the amino acid sequence of

【０１０３】 目的の特定のレセプターフラグメントは、トロンビンと相互作用し得るＰＡＲ
４の任意の部分、例えば、推定アミノ酸配列から予測される細胞外ドメイン全体
または細胞外ドメインの一部を含む。このようなフラグメントは、アンタゴニス
トとして有用であり得（上記の通り）、そしてまた、（例えば、レセプターとト
ロンビンとの間の相互作用を妨害することによって）インビボでＰＡＲ４の活性
を中和する抗体を産生するための免疫原として有用である。図８に例示される通
りの領域は、トロンビンを結合する可能性が最も高い。ヒトＰＡＲ４タンパク質
について、（Ｒ４７／Ｇ４８）切断部位の改変、例えば、Ｇ４８についてのプロ
リンの置換は、この部位を模倣するペプチドを切断不可能にする。このようなペ
プチドは、高親和性でトロンビンと結合する。A particular receptor fragment of interest is a PAR capable of interacting with thrombin.
4, including the entire extracellular domain or a part of the extracellular domain predicted from the deduced amino acid sequence. Such fragments may be useful as antagonists (as described above), and may also provide antibodies that neutralize PAR4 activity in vivo (eg, by interfering with the interaction between the receptor and thrombin). Useful as an immunogen for production. Regions as illustrated in FIG. 8 are most likely to bind thrombin. For the human PAR4 protein, modification of the (R47 / G48) cleavage site, eg, replacement of proline for G48, makes peptides mimicking this site uncleavable. Such peptides bind with high affinity to thrombin.

【０１０４】 新規なプロテアーゼ活性化レセプターの細胞外領域を、類似構造の関連タンパ
ク質（例えば、Ｇタンパク質共役レセプターファミリーの他のメンバー）と比較
することによって同定し得る；有用な領域は、このファミリーの十分に特徴付け
されているメンバーの細胞外ドメインに相同性を示す領域である。The extracellular region of the novel protease-activated receptor can be identified by comparing with related proteins of similar structure (eg, other members of the G-protein coupled receptor family); useful regions of this family Regions showing homology to the extracellular domain of well-characterized members.

【０１０５】 あるいは、一次アミノ酸配列から、二次タンパク質構造を、そしてそれゆえ、
細胞外ドメイン領域を、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ法（例えば、ＣｈｏｕおよびＦ
ａｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７８）４７：２５１を参
照のこと）のような疎水性／親水性の計算を使用して、半経験的に推定し得る。
親水性ドメイン、特に疎水性ストレッチに囲まれた親水性ドメイン（例えば、膜
貫通ドメイン）は、細胞外ドメインについての強力な候補としてそれ自体存在す
る。最後に、細胞外ドメインを、標準的な酵素消化分析（例えば、トリプシン消
化分析）を使用して、実験的に同定し得る。Alternatively, from the primary amino acid sequence, the secondary protein structure and, therefore,
The extracellular domain region is identified by the Chou-Fasman method (eg,
asman, Ann. Rev .. Biochem. (See (1978) 47: 251) can be estimated semi-empirically using hydrophobic / hydrophilic calculations.
Hydrophilic domains, particularly those surrounded by hydrophobic stretches (eg, transmembrane domains), themselves exist as strong candidates for extracellular domains. Finally, the extracellular domain can be identified experimentally using standard enzyme digestion assays (eg, trypsin digestion assays).

【０１０６】 候補フラグメント（例えば、任意の細胞外フラグメント）を、本明細書中に記
載のアッセイ（例えば、上記のアッセイ）によりトロンビンとの相互作用につい
て試験する。このようなフラグメントをまた、トロンビンとその内因性レセプタ
ー（例えば、ＰＡＲ４）との間の相互作用を拮抗する能力について、本明細書中
に記載のアッセイを使用して試験する。有用なレセプターフラグメント（上記の
通り）のアナログをまた産生し得、そしてスクリーニング成分またはアンタゴニ
ストとしての効力について（本明細書中に記載のアッセイを用いて）試験し得る
；このようなアナログはまた、本発明において有用であるとみなされる。The candidate fragments (eg, any extracellular fragments) are tested for interaction with thrombin by the assays described herein (eg, the assays described above). Such fragments are also tested for their ability to antagonize the interaction between thrombin and its endogenous receptor (eg, PAR4) using the assays described herein. Analogs of useful receptor fragments (as described above) can also be produced and tested for potency as screening components or antagonists (using the assays described herein); such analogs also It is considered useful in the present invention.

【０１０７】 トロンビンシグナル伝達を媒介するレセプターの同定は、トロンビンの所望さ
れない作用をブロックするか、またはその所望の活性を模倣する薬物の開発につ
いて可能性のある標的を提供する。トロンビンレセプターアンタゴニストは、不
安定な狭心症および心筋梗塞の環境において血小板依存性血栓症の阻害に、また
は血管傷害の環境において内皮細胞に対するトロンビンの前炎症性作用をブロッ
クするために使用し得る。トロンビンレセプターアゴニストは、創傷部位で止血
および線維芽細胞の増殖を促進するために使用され得る。The identification of receptors that mediate thrombin signaling provides a potential target for the development of drugs that block the undesired effects of thrombin or mimic its desired activity. Thrombin receptor antagonists may be used to inhibit platelet-dependent thrombosis in an environment of unstable angina and myocardial infarction, or to block the pro-inflammatory effect of thrombin on endothelial cells in an environment of vascular injury. Thrombin receptor agonists can be used to promote hemostasis and fibroblast proliferation at the site of a wound.

【０１０８】 露出している係留リガンドドメインペプチドは、ＰＡＲ４アゴニストまたはア
ンタゴニストの開発のためのリード構造を提供し得る。Exposed tethered ligand domain peptides may provide a lead structure for the development of PAR4 agonists or antagonists.

【０１０９】 最も実用的かつ好ましい実施態様であるとみなされる本発明を、本明細書中に
示し、そして記載する。しかし、本発明の範囲内にある好ましい実施態様からの
逸脱がなされ得ること、および自明な改変が、この開示を読めば当業者により生
じることが認識される。The invention, which is considered to be the most practical and preferred embodiment, is shown and described herein. However, it will be appreciated that departures from the preferred embodiments may be made within the scope of the invention, and that obvious modifications will occur to those skilled in the art upon reading this disclosure.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】 図１Ａおよび図１Ｂは、マウスプロテアーゼ活性化レセプター４遺伝子コード
領域ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（配列番号１）である。1A and 1B are the complete nucleotide sequence of the mouse protease activating receptor 4 gene coding region cDNA (SEQ ID NO: 1).

【図１Ｂ】 図１Ａおよび図１Ｂは、マウスプロテアーゼ活性化レセプター４遺伝子コード
領域ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（配列番号１）である。1A and 1B are the complete nucleotide sequence of the mouse protease activating receptor 4 gene coding region cDNA (SEQ ID NO: 1).

【図２】 図２は、図１のヌクレオチド配列によりコードされるレセプターの推定アミノ
酸配列（配列番号２）である。マウスＰＡＲ４をコードするアミノ酸配列は、３
９７アミノ酸を含む。推定アミノ酸配列はヌクレオチド１〜３（ＡＴＧ＝Ｍｅｔ
）で開始し、そしてヌクレオチド１１９２〜１１９４（ＴＧＡ＝停止）で終わる
。FIG. 2 is the predicted amino acid sequence of the receptor encoded by the nucleotide sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). The amino acid sequence encoding mouse PAR4 is 3
Contains 97 amino acids. The deduced amino acid sequence is represented by nucleotides 1 to 3 (ATG = Met
) And ends at nucleotides 1192-1194 (TGA = stop).

【図３】 図３は、レセプターコード配列のシグナルペプチドと切断部位との間の小さい
イントロン（２５０ｂｐ）を実証するゲノムのマウスＰＡＲ４（配列番号３）の
ヌクレオチド配列である。イントロン配列は下線を付している。FIG. 3 is the nucleotide sequence of genomic mouse PAR4 (SEQ ID NO: 3) demonstrating a small intron (250 bp) between the signal peptide of the receptor coding sequence and the cleavage site. Intron sequences are underlined.

【図４Ａ】 図４Ａおよび４Ｂは、ヒトプロテアーゼ活性化レセプター４遺伝子コード領域
ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（配列番号４）である。FIGS. 4A and 4B are the complete nucleotide sequence of the human protease-activated receptor 4 gene coding region cDNA (SEQ ID NO: 4).

【図４Ｂ】 図４Ａおよび４Ｂは、ヒトプロテアーゼ活性化レセプター４遺伝子コード領域
ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（配列番号４）である。FIGS. 4A and 4B are the complete nucleotide sequence of the human protease-activated receptor 4 gene coding region cDNA (SEQ ID NO: 4).

【図５】 図５は、図４のヌクレオチド配列によりコードされるレセプターの推定アミノ
酸配列（配列番号５）である。ヒトＰＡＲ４をコードするアミノ酸配列は、３８
５アミノ酸を含む。推定アミノ酸配列はヌクレオチド３〜５（ＡＴＧ＝Ｍｅｔ）
で開始し、そしてヌクレオチド１１５７〜１１５９（ＴＧＡ＝停止）で終わる。FIG. 5 is the predicted amino acid sequence of the receptor encoded by the nucleotide sequence of FIG. 4 (SEQ ID NO: 5). The amino acid sequence encoding human PAR4 is 38
Contains 5 amino acids. The deduced amino acid sequence is nucleotides 3-5 (ATG = Met)
And ends at nucleotides 1157-1159 (TGA = stop).

【図６Ａ】 図６Ａおよび６Ｂは、マウスＰＡＲ４、マウスＰＡＲ３、マウスＰＡＲ２およ
びマウスＰＡＲ１の遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号２、６〜８）の整列を
示す。相同性を示すために、ギャップ（空白により示す）が、５つの配列に導入
されている。少なくとも３つのＰＡＲの間の正確なアミノ酸適合は、影付きボッ
クスに含まれている。FIGS. 6A and 6B show the alignment of the deduced amino acid sequences of the genes for mouse PAR4, mouse PAR3, mouse PAR2 and mouse PAR1 (SEQ ID NOs: 2, 6-8). Gaps (indicated by blanks) have been introduced in the five sequences to indicate homology. Exact amino acid matches between at least three PARs are included in the shaded boxes.

【図６Ｂ】 図６Ａおよび６Ｂは、マウスＰＡＲ４、マウスＰＡＲ３、マウスＰＡＲ２およ
びマウスＰＡＲ１の遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号２、６〜８）の整列を
示す。相同性を示すために、ギャップ（空白により示す）が、５つの配列に導入
されている。少なくとも３つのＰＡＲの間の正確なアミノ酸適合は、影付きボッ
クスに含まれている。6A and 6B show the alignment of the deduced amino acid sequences of the genes for mouse PAR4, mouse PAR3, mouse PAR2 and mouse PAR1 (SEQ ID NOs: 2, 6-8). Gaps (indicated by blanks) have been introduced in the five sequences to indicate homology. Exact amino acid matches between at least three PARs are included in the shaded boxes.

【図７】 図７は、マウスＰＡＲ遺伝子の構造を示す。これは、エキソン１（シグナルペ
プチドをコードする）からエキソン２（成熟レセプタータンパク質をコードする
）を分離する短い（２５０ｂｐ）イントロンを表す（配列番号３、９〜１１）。FIG. 7 shows the structure of the mouse PAR gene. It represents a short (250 bp) intron that separates exon 2 (encoding the mature receptor protein) from exon 1 (encoding the signal peptide) (SEQ ID NOs: 3, 9-11).

【図８】 図８は、マウスＰＡＲ４レセプターのトロンビン切断部位および活性化ペプチ
ドを絵的に記載する。FIG. 8 pictorially depicts the thrombin cleavage site and the activation peptide of the mouse PAR4 receptor.

【図９】 図９は、異なるアゴニストに対する曝露の際のマウスＰＡＲ４を発現する卵母
細胞のカルシウム応答を示す棒グラフである。アゴニストとしては、トロンビン
、ＰＡＲ４の予想活性化ペプチド（ＧＹＰＧＫＦ）、およびＰＡＲ１の予想活性
化ペプチド（ＳＦＬＬＲＮ）が挙げられる。FIG. 9 is a bar graph showing the calcium response of mouse PAR4-expressing oocytes upon exposure to different agonists. Agonists include thrombin, a putative activation peptide of PAR4 (GYPGKF), and a putative activation peptide of PAR1 (SFLLRN).

【図１０】 図１０は、異なるアゴニストに対する曝露の際のヒトＰＡＲ４を発現する卵母
細胞のカルシウム応答を示す棒グラフである。アゴニストとしては、トロンビン
、ヒトＰＡＲ４の予想活性化ペプチド（ＧＹＰＧＱＶ）、ｍＰＡＲ４の予想活性
化ペプチド（ＧＹＰＧＫＦ）、およびＰＡＲ１の予想活性化ペプチド（ＳＦＬＬ
ＲＮ）が挙げられる。FIG. 10 is a bar graph showing the calcium response of oocytes expressing human PAR4 upon exposure to different agonists. As agonists, thrombin, a predicted activation peptide of human PAR4 (GYPGQV), a predicted activation peptide of mPAR4 (GYPGKF), and a predicted activation peptide of PAR1 (SFLL)
RN).

【図１１】 図１１は、種々のセリンプロテアーゼに対する曝露の際のマウスＰＡＲ４を発
現する卵母細胞のカルシウム応答を示す棒グラフである。FIG. 11 is a bar graph showing the calcium response of oocytes expressing mouse PAR4 upon exposure to various serine proteases.

【図１２】 図１２は、ＰＡＲの係留リガンドペプチドに対する曝露の際のＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞細胞型におけるＰＡＲ４の活性化を示す棒グラフである
。FIG. 12 is a bar graph showing PAR4 activation in Xenopus laevis oocyte cell type upon exposure of PAR to a tethered ligand peptide.

【図１３】 図１３は、ｍＰＡＲ活性化ペプチドＧＹＰＧＫＦに対する応答におけるＰＡＲ
３ノックアウトマウス血小板の凝集を示すグラフである。FIG. 13 shows PAR in response to the mPAR activating peptide GYPGKF.
It is a graph which shows aggregation of 3 knockout mouse platelets.

【図１４】 図１４は、ｍＰＡＲ活性化ペプチドＧＹＰＧＫＦに対する応答における野生型
マウス血小板のＡＴＰ分泌（上）、および凝集（下）を示すグラフである。FIG. 14 is a graph showing ATP secretion (upper) and aggregation (lower) of wild-type mouse platelets in response to the mPAR activating peptide GYPGKF.

【図１５】 図１５は、ＰＡＲ４予想活性化ペプチドによるＰＡＲ１活性化ペプチドに対し
て脱感作されたヒト血小板の活性化を示すグラフである。FIG. 15 is a graph showing activation of human platelets desensitized to a PAR1 activation peptide by a PAR4 predicted activation peptide.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１２年１１月１６日（２０００．１１．１６）[Submission date] November 16, 2000 (2000.11.16)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【特許請求の範囲】[Claims]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/02 Ｃ０７Ｋ 14/705 29/00 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/19 16/28 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 9/74 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/68 9/74 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) A61P 17/02 C07K 14/705 29/00 16/28 C07K 14/705 C12N 1/19 16/28 1 / 21 C12N 1/19 9/74 1/21 C12Q 1/00 Z 5/10 G01N 33/68 9/74 C12N 15/00 ZNAA C12Q 1/00 A61K 37/02 G01N 33/68 C12N 5/00 A

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 プロテアーゼ活性化レセプター４（ＰＡＲ４）をコードする
実質的に純粋なＤＮＡ。1. A substantially pure DNA encoding protease-activated receptor 4 (PAR4). 【請求項２】 前記ＤＮＡが配列番号２または配列番号５のアミノ酸配列を
コードする請求項１に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。2. The substantially pure DNA of claim 1, wherein said DNA encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. 【請求項３】 前記ＤＮＡが配列番号１、配列番号４、またはその縮重改変
体である、請求項２に記載の実質的に純粋なＤＮＡ。3. The substantially pure DNA of claim 2, wherein said DNA is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, or a degenerate variant thereof. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡの配列に５０％以上の配列同一性を
を有する実質的に純粋なＤＮＡであって、ここで該ＤＮＡは、ストリンジェント
な条件下で請求項１に記載のＤＮＡに相補的な配列に選択的にハイブリダイズす
る、実質的に純粋なＤＮＡ。4. A substantially pure DNA having a sequence identity of 50% or more with the sequence of the DNA according to claim 1, wherein said DNA under stringent conditions. A substantially pure DNA which selectively hybridizes to a sequence complementary to the DNA according to 1. 【請求項５】 請求項１に記載のＤＮＡに相補的な実質的に純粋なＤＮＡで
あって、ここで該ＤＮＡは、請求項１に記載のＤＮＡに５０％以上の配列同一性
を有し、かつ該ＤＮＡは、ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のＤＮＡ
に選択的にハイブリダイズする、実質的に純粋なＤＮＡ。5. A substantially pure DNA complementary to the DNA of claim 1, wherein said DNA has 50% or more sequence identity to the DNA of claim 1. And the DNA of claim 1 under stringent conditions.
Substantially pure DNA which selectively hybridizes to DNA. 【請求項６】 単離されたＰＡＲ４ポリペプチド。6. An isolated PAR4 polypeptide. 【請求項７】 配列番号２または配列番号５のアミノ酸配列を有する請求項
９に記載の単離されたポリペプチド。7. The isolated polypeptide according to claim 9, which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5. 【請求項８】 請求項６または７に記載のポリヌクレオチドのフラグメント
またはアナログ。8. A fragment or analog of the polynucleotide according to claim 6 or 7. 【請求項９】 アミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチドであって
、該ポリペプチドがトロンビンにより活性化され；そして該ポリペプチドがその
表面上で該ポリペプチドを発現する細胞においてホスホイノシチド加水分解を媒
介する、ポリペプチド。9. A substantially pure polypeptide having an amino acid sequence, wherein said polypeptide is activated by thrombin; and said polypeptide is phosphoinositide hydrolyzed in a cell expressing said polypeptide on its surface. A polypeptide that mediates 【請求項１０】 実質的に純粋なＰＡＲ４活性化ペプチド。10. A substantially pure PAR4 activating peptide. 【請求項１１】 請求項９に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体
。An antibody that selectively binds to the polypeptide of claim 9. 【請求項１２】 請求項１〜５に記載のＤＮＡを含有する、ベクター。12. A vector containing the DNA according to claim 1. 【請求項１３】 請求項１２に記載のベクターを含有する、細胞。13. A cell containing the vector according to claim 12. 【請求項１４】 アッセイデバイスであって、以下： 支持表面； および請求項１３に記載の細胞またはそれに由来する膜、 を含有する、アッセイデバイス。14. An assay device, comprising: a support surface; and the cell of claim 13 or a membrane derived therefrom. 【請求項１５】 治療的組成物であって、以下： ＰＡＲ４リガンドアゴニストおよび生理学的に受容可能なキャリア、 を含む、治療的組成物。15. A therapeutic composition, comprising: a PAR4 ligand agonist and a physiologically acceptable carrier. 【請求項１６】 治療的組成物であって、以下： ＰＡＲ４リガンドアンタゴニスト；および生理学的に受容可能なキャリア、 を含む、治療的組成物。16. A therapeutic composition, comprising: a PAR4 ligand antagonist; and a physiologically acceptable carrier.