JP2002504336A - Insecticidal toxins from Photolabdus - Google Patents

Insecticidal toxins from Photolabdus

Info

Publication number
JP2002504336A
JP2002504336A JP2000532529A JP2000532529A JP2002504336A JP 2002504336 A JP2002504336 A JP 2002504336A JP 2000532529 A JP2000532529 A JP 2000532529A JP 2000532529 A JP2000532529 A JP 2000532529A JP 2002504336 A JP2002504336 A JP 2002504336A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
nucleotides
nucleic acid
expression
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000532529A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
キャリー クレイマー，バンス
ケント モーガン，マイケル
ロバート アンダーソン，アーン
プリム ハート，ホープ
ウェイン ウォーレン，グレゴリー
マリー ダン，マーサ
ション チェン，ジェン
Original Assignee
ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト filed Critical ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
Publication of JP2002504336A publication Critical patent/JP2002504336A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 その発現が新規の殺昆虫毒素を生じるフォトラブドゥス属のPhotorhabdus luminescensから単離される新規の核酸配列が、本明細書中で開示される。本発明は、昆虫を防除し得る殺昆虫毒素を含有する組成物および処方物も開示する。本発明はさらに、毒素の製造方法に、そして例えば有害昆虫を防除するために微生物中に、あるいは昆虫耐性を付与するためにトランスジェニック植物中に、上記ヌクレオチド配列を用いる方法にも関する。   (57) [Summary] Disclosed herein is a novel nucleic acid sequence isolated from Photorhabdus luminescens of the genus Photolabdus whose expression results in a novel insecticidal toxin. The present invention also discloses compositions and formulations containing insecticidal toxins that can control insects. The invention further relates to a method for the production of toxins and to the use of the above nucleotide sequences in microorganisms, for example for controlling insect pests, or in transgenic plants for conferring insect resistance.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 本発明は、フォトラブドゥス属のPhotorhabdus luminescensからの新規の毒素
、その発現が前記の毒素を生じる核酸配列、ならびに昆虫を制御するための毒素
および対応する核酸配列の製造方法および使用方法に関する。The present invention relates to a novel toxin from Photorhabdus luminescens of the genus Photolabdus, a nucleic acid sequence whose expression gives rise to said toxin, and a method for the production and use of toxins and corresponding nucleic acid sequences for controlling insects About.

【０００２】 有害昆虫は、作物損害の主因である。種々の属の昆虫の侵襲により、米国だけ
で毎年約77億ドルが失われている。野外作物の損害の他に、有害昆虫は野菜およ
び果物栽培者に、そして観賞用花卉の生産者にとって重荷であり、そしてそれら
は庭師および自家所有者にとって迷惑である。 有害昆虫は、昆虫成長の抑制、昆虫給餌または生殖の妨害、あるいは昆虫の死
を通じて作用する化学殺虫剤の集中的適用により主に制御され得る。良好な昆虫
制御はこのようにして達成され得るが、しかしこれらの化学物質は、時としてそ
の他の有益な昆虫にも影響を及ぼし得る。化学殺虫剤の広範な使用に起因する別
の問題は、耐性昆虫変種の出現である。これは種々の耐性管理戦略により一部は
軽減されてきたが、しかし代替的害虫制御剤の必要性が増大している。生物学的
昆虫制御剤、例えばｄ−内毒素のような殺昆虫毒素を発現するバシラス属のBaci
llus thuringiensis株は、満足のいく結果を伴って適用され、化学殺虫剤に対す
る代替物または補足物を提供してきた。近年、これらのｄ−内毒素のいくつかを
コードする遺伝子が単離され、異種宿主中でのそれらの発現は、経済的に重要な
有害昆虫の制御のための別の道具を提供することが示されている。特に、トラン
スジェニック植物中での殺昆虫毒素、例えばバシラス属のBacillus thuringiens
isのｄ−内毒素の発現は、選定有害昆虫に対する有効な防御を提供し、そしてこ
のような毒素を発現するトランスジェニック植物は商業化され、農業経営者に化
学的昆虫制御剤の適用を低減させた。さらに、この場合でも、耐性が発生する可
能性は残り、２〜３の特定の有害昆虫だけが制御可能である。その結果として、
農業経営者に経済的利益を提供し、そして環境的に許容可能な新規の且つ有効な
昆虫制御剤を発見する必要性は、長い間感得されてはいたが、しかし依然として
実現していない。[0002] Pests are a major cause of crop damage. About $ 7.7 billion is lost annually in the United States alone due to infestations of insects of various genera. In addition to field crop damage, pests are a burden to vegetable and fruit growers, and to ornamental flower producers, and they are annoying to gardeners and homeowners. Pests can be controlled primarily by inhibiting insect growth, disrupting insect feeding or reproduction, or by intensive application of chemical insecticides that act through insect death. Good insect control can be achieved in this way, but these chemicals can sometimes also affect other beneficial insects. Another problem resulting from the widespread use of chemical pesticides is the emergence of resistant insect varieties. This has been alleviated in part by various resistance management strategies, but the need for alternative pest control agents has increased. Bacillus Baci expressing insecticidal toxins such as biological insect control agents, e.g.
The llus thuringiensis strain has been applied with satisfactory results and has provided an alternative or supplement to chemical pesticides. Recently, genes encoding some of these d-endotoxins have been isolated and their expression in heterologous hosts may provide another tool for the control of economically important pests. It is shown. In particular, insecticidal toxins in transgenic plants, such as Bacillus thuringiens of the genus Bacillus
Expression of d-endotoxin of is provides effective protection against selected pests, and transgenic plants expressing such toxins have been commercialized, reducing the application of chemical insect control agents to farmers. I let it. Furthermore, even in this case, the possibility of developing resistance remains, and only a few specific insect pests can be controlled. As a result,
The need to find new and effective insect control agents that provide economic benefits to farmers and that are environmentally acceptable has been long felt, but not yet realized.

【０００３】 本発明は、新規の昆虫制御剤の必要性を記載する。特に必要なのは、経済的に
重要な有害昆虫を標的とし、そして既存の昆虫制御剤に耐性である昆虫系統を有
効に防除する防除剤である。さらに、その適用が環境に及ぼす負担を最小限にす
る薬剤が望ましい。 新規の昆虫制御剤の探索において、ヘテロラブドゥス属（Heterorhabdus)およ
びステイネルネマ属（Steinernema)からのある綱の線虫類はそれらの殺昆虫特性
のために、特に関心が持たれている。それらは昆虫の幼虫を殺害し、それらの子
供は死んだ幼虫中で育つ。実際、殺昆虫活性は、線虫体内に生息する共生細菌に
よる。これらの共生細菌は、ヘテロラブドゥス属（Heterorhabdus)の場合にはフ
ォトラブドゥス（Photorhabdus）、そしてステイネルネマ属（Steinernema)の場
合にはヘテロラブドゥス（Heterorhabdus)およびキセノラブドゥス（Xenorhabdu
s)である。[0003] The present invention describes the need for new insect control agents. What is particularly needed is a control agent that targets economically important pests and effectively controls insect lines that are resistant to existing insect control agents. In addition, agents that minimize the environmental impact of their application are desirable. In the search for new insect control agents, certain classes of nematodes from the genus Heterorhabdus and the genus Steinernema are of particular interest because of their insecticidal properties. They kill insect larvae, and their children grow up in dead larvae. In fact, insecticidal activity is due to commensal bacteria that live in the nematode body. These commensal bacteria are Photorhabdus in the case of Heterorhabdus, and Heterorhabdus and Xenorhabdus in the case of Steinernema.
s).

【０００４】 本発明は、その発現が、経済的に重要な有害昆虫、特に植物を食い荒らす有害
昆虫に対して非常に有毒である毒素を生じるフォトラブドゥス属のPhotorhabdus
luminescensから単離される核酸配列ならびにそれと実質的に同様の配列に関す
る。本発明はさらに、核酸配列の発現に起因する毒素、ならびに生存、成長また
は生殖する有害昆虫の能力を阻害し、あるいは作物植物における昆虫関連損害お
よび損傷を制限し得る毒素を含有する組成物および処方物に関する。本発明はさ
らに、例えば昆虫を制御するための微生物中での、または昆虫耐性を付与するた
めのトランスジェニック植物中での毒素の製造方法ならびに核酸配列の使用方法
に、そして例えば、昆虫感受性領域を予防的に処理し、あるいは昆虫に対する防
御または耐性を付与するために昆虫侵食領域毒素または組成物または処方物を適
応する、毒素ならびに毒素を包含する組成物および処方物の使用方法に関する。[0004] The present invention relates to Photorhabdus of the genus Photorhabdus, the expression of which produces a toxin that is highly toxic to economically important pests, especially pests that feed on plants.
The invention relates to nucleic acid sequences isolated from luminescens as well as sequences substantially similar thereto. The present invention further provides compositions and formulations containing toxins resulting from the expression of nucleic acid sequences, and toxins that can inhibit the ability of insect pests to survive, grow or reproduce, or limit insect-related damage and damage in crop plants. About things. The invention further relates to methods for producing toxins and using nucleic acid sequences, e.g., in microorganisms to control insects or in transgenic plants to confer insect resistance, and The present invention relates to toxins and methods of using compositions and formulations that include toxins, which prophylactically treat or adapt an insect invading area toxin or composition or formulation to provide protection or resistance to insects.

【０００５】 新規の毒素は、昆虫に対して非常に活性である。例えば、多数の経済的に重要
な有害昆虫、例えば鱗翅目のコナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Tric
hoplusia ni （イラクサキンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、
Heliothis virescens （タバコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Mand
uca sexta （スズメガ）、Spodoptera exigua （シロイチモンジヨトウ）および
Spodoptera frugiperda （シロナヨトウ）、ならびに鞘翅目のDiabrotica virgi
fera virgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi（
ウリハムシの一種）およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）は、
１つ又はそれ以上の毒素により制御され得る。毒素は、多面的昆虫制御戦略に用
いられて、環境に及ぼす最小の影響力で最大効率をもたらす。[0005] The new toxins are very active against insects. For example, a number of economically important pests such as Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) of the order Lepidoptera, Trixa
hoplusia ni (nettle), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga),
Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Mand
uca sexta (Sphingidae), Spodoptera exigua (Syringe armyworm) and
Spodoptera frugiperda (Sycamore) and Diabrotica virgi of the order Coleoptera
fera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi (
A kind of beetle) and Leptinotarsa decimlineata (color beetle)
It can be controlled by one or more toxins. Toxins have been used in versatile insect control strategies to provide maximum efficiency with minimal impact on the environment.

【０００６】 一局面によれば、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列
番号１のヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列
番号１のヌクレオチド3342-4118 、配列番号１のヌクレオチド4515-9269 、配列
番号１１のヌクレオチド15,171-18,035 、配列番号１１のヌクレオチド31,393-3
5,838 から成る群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に同様のヌクレオチ
ド配列、（ｂ）配列番号１１のヌクレオチド23,768-31,336 を包含するヌクレオ
チド配列、あるいは（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と等コード化
するヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子であって、その発現が昆虫に対し
て活性な少なくとも１つの毒素を生じる核酸分子を提供する。According to one aspect, the present invention provides (a) nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotide 3342 of SEQ ID NO: 1. 4118, nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 31,393-3 of SEQ ID NO: 11
A nucleotide sequence substantially similar to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 5,838, (b) a nucleotide sequence encompassing nucleotides 23,768-31,336 of SEQ ID NO: 11, or (c) a nucleotide sequence of (a) or (b) An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes an isotope that produces at least one toxin that is active against insects.

【０００７】 この局面の一実施態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド
412-1665、配列番号１のヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド27
58-3318 、配列番号１のヌクレオチド3342-4118 または配列番号１のヌクレオチ
ド4515-9269 と実質的に類似のヌクレオチド配列と等コード化する。好ましくは
、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１のヌク
レオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１のヌク
レオチド3342-4118 または配列番号１のヌクレオチド4515-9269 と実質的に類似
している。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号２〜６から成る群
から選択されるアミノ酸配列をコードする。最も好ましくは、ヌクレオチド配列
は、配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１のヌクレオチド1686-2447
、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１のヌクレオチド3342-4118
または配列番号１のヌクレオチド4515-9269 を包含する。[0007] In one embodiment of this aspect, the nucleotide sequence comprises the nucleotide of SEQ ID NO: 1.
412-1665, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotide 27 of SEQ ID NO: 1
58-3318, which is equivalent to a nucleotide sequence substantially similar to nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1 or nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1. Preferably, the nucleotide sequence is nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1 or nucleotides 4515-15 of SEQ ID NO: 1. Substantially similar to 9269. More preferably, the nucleotide sequence encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-6. Most preferably, the nucleotide sequence is nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1
Nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1
Or nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1.

【０００８】 この局面の別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１１のヌクレオ
チド15,171-18,035 と実質的に類似するヌクレオチド配列と等コード化する。好
ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１１のヌクレオチド15,171-18,035 と
実質的に類似する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号１２で記載
したアミノ酸配列をコードする。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番
号１１のヌクレオチド15,171-18,035 を包含する。[0008] In another embodiment of this aspect, the nucleotide sequence is equivalent to a nucleotide sequence substantially similar to nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11. Preferably, the nucleotide sequence is substantially similar to nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11. More preferably, the nucleotide sequence encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12. Most preferably, the nucleotide sequence comprises nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11.

【０００９】 この局面のさらに別の実施態様では、ヌクレオチド配列は配列番号１１のヌク
レオチド31,393-35,838 と実質的に類似するヌクレオチド配列と等コード化する
。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,83
8 と実質的に類似する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号１４で
記載したアミノ酸配列をコードする。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、配
列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 を包含する。[0009] In yet another embodiment of this aspect, the nucleotide sequence is equivalent to a nucleotide sequence substantially similar to nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11. Preferably, the nucleotide sequence is nucleotides 31,393-35,83 of SEQ ID NO: 11.
Substantially similar to 8. More preferably, the nucleotide sequence encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14. Most preferably, the nucleotide sequence comprises nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11.

【００１０】 この局面のさらに別の実施態様では、ヌクレオチドは配列番号１３で記載した
アミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号１１のヌクレオチド23,768-31,33
6 を包含する。 一実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、NRRL寄託番号B-21835 と呼ば
れる大腸菌DH5a株中に保有される約9.7kb のＤＮＡ断片を包含する。In yet another embodiment of this aspect, the nucleotide encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, preferably nucleotides 23,768-31,33 of SEQ ID NO: 11
6 is included. In one embodiment, the nucleotide sequence of the present invention includes an approximately 9.7 kb DNA fragment retained in E. coli strain DH5a designated NRRL Accession No. B-21835.

【００１１】 別の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、NRRL寄託番号B-30077 と呼
ばれる大腸菌DH5a株中に保有される約38kbのＤＮＡ断片を包含する。 さらに別の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、NRRL寄託番号B-3007
8 と呼ばれる大腸菌DH5a株中に保有される約22.2kbのＤＮＡ断片を包含する。 本発明の一実施態様によれば、本発明の核酸分子の発現に起因する毒素は、鱗
翅目昆虫に対する活性を有する。好ましくは、この実施態様によれば、毒素は、
コナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia ni （イラクサキン
ウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis virescens （タバ
コガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exigua （シロイチモ
ンジヨトウ）およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ）に対する活性を有
する。In another embodiment, the nucleotide sequence of the present invention includes an approximately 38 kb DNA fragment harbored in E. coli strain DH5a designated NRRL Accession No. B-30077. In yet another embodiment, the nucleotide sequence of the invention has the NRRL accession number B-3007.
8 contains a DNA fragment of about 22.2 kb which is carried in E. coli DH5a strain. According to one embodiment of the invention, the toxin resulting from the expression of a nucleic acid molecule of the invention has activity against Lepidoptera. Preferably, according to this embodiment, the toxin is
Plutella xylostella (Pryllid moth), Trichoplusia ni (Diplomata), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga), Heliothis virescens (Helicopter moth), Helicoverpa zea (Hyborg moth), Spodoptera exigua (Spotoptera exogua) and Spodoptera frog (Spodoptera falcon) Having.

【００１２】 本発明の別の実施態様によれば、本発明の核酸分子の発現に起因する毒素は、
鱗翅目および鞘翅目の昆虫に対する活性を有する。好ましくはこの実施態様によ
れば、毒素はコナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Ostrinia nubilalis
（アワノメイガ）およびManduca sexta （スズメガ）、ならびにDiabrotica vir
gifera virgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi
（ウリハムシの一種）およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）に
対する殺昆虫活性を有する。According to another embodiment of the present invention, a toxin resulting from the expression of a nucleic acid molecule of the present invention comprises:
It has activity against Lepidoptera and Coleoptera insects. Preferably, according to this embodiment, the toxin is Plutella xylostella (Pryllid), Ostrinia nubilalis
(Awanomeiga) and Manduca sexta (Spongebob) and Diabrotica vir
gifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi
(A kind of beetle) and Leptinotarsa decimlineata (colorado potato beetle).

【００１３】 別の局面では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１の
ヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１の
ヌクレオチド3342-4118 、配列番号１のヌクレオチド4515-9269 、配列番号１１
のヌクレオチド15,171-18,035 、配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 か
ら成る群から選択されるヌクレオチド配列の連続する20塩基対ヌクレオチド部分
と配列が同一である20塩基対ヌクレオチド部分を包含する単離核酸分子であって
、その発現が昆虫に対して活性である少なくとも１つの毒素を生じる核酸分子を
提供する。In another aspect, the invention relates to nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: One nucleotide 4515-9269, SEQ ID NO: 11
An isolated nucleic acid molecule comprising a 20 base pair nucleotide portion that is identical in sequence to a continuous 20 base pair nucleotide portion of a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotides 15,171-18,035 and nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11. Thus, there is provided a nucleic acid molecule whose expression results in at least one toxin which is active against insects.

【００１４】 この局面の一実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１のヌクレオ
チド412-1665、配列番号１のヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチ
ド2758-3318 、配列番号１のヌクレオチド3342-4118 または配列番号１のヌクレ
オチド4515-9269 の連続する20塩基対ヌクレオチド部分と配列が同一である20塩
基対ヌクレオチド部分を包含する。In one embodiment of this aspect, the isolated nucleic acid molecule of the invention comprises nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 Or a 20 base pair nucleotide sequence that is identical in sequence to the contiguous 20 base pair nucleotide portion of nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1 or nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1.

【００１５】 この局面の別の実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１１のヌク
レオチド15,171-18,035 の連続20塩基対ヌクレオチド部分と配列が同一である20
塩基対ヌクレオチド部分を包含する。 この局面のさらに別の実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号１１
のヌクレオチド31,393-35,838 の連続20塩基対ヌクレオチド部分と配列が同一で
ある20塩基対ヌクレオチド部分を包含する。[0015] In another embodiment of this aspect, the isolated nucleic acid molecule of the invention has a sequence that is 20 identical in sequence to the contiguous 20 base pair nucleotide portion of nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11.
Includes base pair nucleotide moieties. In yet another embodiment of this aspect, the isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises SEQ ID NO: 11.
A 20 base pair nucleotide sequence identical in sequence to the contiguous 20 base pair nucleotide portion of nucleotides 31,393-35,838.

【００１６】 さらに別の局面では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番
号１のヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番
号１のヌクレオチド3342-4118 、配列番号１のヌクレオチド4515-9269 、配列番
号１１のヌクレオチド66-1898 、配列番号１１のヌクレオチド2416-9909 、配列
番号１１のヌクレオチド2817-3395 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド9966
-14,633 、配列番号１１のヌクレオチド14,699-15,007 、配列番号１１のヌクレ
オチド15,171-18,035 、配列番号１１のヌクレオチド17,072-17,398 の相補体、
配列番号１１のヌクレオチド18,235-19,167 の相補体、配列番号１１のヌクレオ
チド19.385-20,116 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド20217-20,963の相補
体、配列番号１１のヌクレオチド22,172-23,086 の相補体、配列番号１１のヌク
レオチド23,768-31,336 、配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 、配列番
号１１のヌクレオチド35,383-35,709 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド36
,032-36,661 の相補体、および配列番号１１のヌクレオチド36,654-37,781 の相
補体から成る群から選択されるフォトラブドゥス ルミネッセンス（Photorhabd
us luminescens）からのヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子を提供する。In yet another aspect, the present invention provides a method comprising the steps of: nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1, Nucleotide 4515-9269 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 66-1898 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 2416-9909 of SEQ ID NO: 11, complement of nucleotides 2817-3395 of SEQ ID NO: 11, nucleotide 9966 of SEQ ID NO: 11
-14,633, nucleotides 14,699-15,007 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11, the complement of nucleotides 17,072-17,398 of SEQ ID NO: 11,
The complement of nucleotides 18,235-19,167 of SEQ ID NO: 11, the complement of nucleotides 19.385-20,116 of SEQ ID NO: 11, the complement of nucleotides 20217-20,963 of SEQ ID NO: 11, the complement of nucleotides 22,172-23,086 of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11 nucleotides 23,768-31,336, SEQ ID NO: 11 nucleotides 31,393-35,838, SEQ ID NO: 11 nucleotides 35,383-35,709 complement, SEQ ID NO: 11 nucleotides 36
, 032-36,661, and the complement of SEQ ID NO: 11, nucleotides 36,654-37,781 (Photorhabd).
(A. luminescens) comprising an isolated nucleic acid molecule.

【００１７】 本発明は、本発明の核酸分子と操作可能的に連結される異種プロモーター配列
を包含するキメラ遺伝子も提供する。さらに本発明は、このようなキメラ遺伝子
を包含する組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、このようなキメラ遺
伝子を包含する宿主細胞を提供する。本発明のこの局面の宿主細胞は、細菌細胞
、酵母菌細胞または植物細胞、好ましくは植物細胞であり得る。さらに本発明は
、このような植物細胞を包含する植物を提供する。好ましくは植物はトウモロコ
シである。The invention also provides a chimeric gene comprising a heterologous promoter sequence operably linked to a nucleic acid molecule of the invention. Further, the present invention provides a recombinant vector containing such a chimeric gene. Further, the present invention provides a host cell containing such a chimeric gene. The host cell of this aspect of the invention may be a bacterial cell, a yeast cell or a plant cell, preferably a plant cell. Further, the present invention provides a plant including such a plant cell. Preferably, the plant is corn.

【００１８】 さらに別の局面では、本発明は、本発明のＤＮＡ分子の発現により産生される
毒素を提供する。 一実施態様によれば、本発明の毒素は鱗翅目昆虫に対する、好ましくはコナガ
属のPlutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia ni （イラクサキンウワバ
）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis virescens （タバコガ）
、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exigua （シロイチモンジヨ
トウ）およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ）に対する活性を有する。In yet another aspect, the present invention provides a toxin produced by expression of a DNA molecule of the present invention. According to one embodiment, the toxins of the invention are directed against lepidopteran insects, preferably Plutella xylostella (Pryllid moth), Trichoplusia ni (Erythrophilus vulgaris), Ostrinia nubilalis (Hymenoptera), Heliothis virescens.
, Helicoverpa zea (Bombyx mori), Spodoptera exigua (Syringa officinalis) and Spodoptera frugiperda (Syringa officinalis).

【００１９】 別の実施態様によれば、本発明の毒素は、鱗翅目および鞘翅目の昆虫に対する
、好ましくはコナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Ostrinia nubilalis
（アワノメイガ）およびManduca sexta （スズメガ）、ならびにDiabrotica vir
gifera virgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi
（ウリハムシの一種）およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）に
対する活性を有する。According to another embodiment, the toxin according to the invention is preferably for the insects of the order Lepidoptera and Coleoptera, preferably Plutella xylostella (Pryllidae), Ostrinia nubilalis
(Awanomeiga) and Manduca sexta (Spongebob) and Diabrotica vir
gifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi
(A kind of beetle) and Leptinotarsa decimlineata (colorado potato beetle).

【００２０】 一実施態様では、毒素は、NRRL寄託番号B-21835 と呼ばれる大腸菌株により産
生される。 別の実施態様では、毒素は、NRRL寄託番号B-30077 と呼ばれる大腸菌株により
産生される。 さらに別の実施態様では、毒素は、NRRL寄託番号B-30078 と呼ばれる大腸菌株
により産生される。In one embodiment, the toxin is produced by an E. coli strain designated NRRL Accession No. B-21835. In another embodiment, the toxin is produced by an E. coli strain designated NRRL accession number B-30077. In yet another embodiment, the toxin is produced by an E. coli strain designated NRRL Accession No. B-30078.

【００２１】 一実施態様では、本発明の毒素は、配列番号２〜６から成る群から選択される
アミノ酸配列を包含する。 別の実施態様では、本発明の毒素は、配列番号１２〜１４から成る群から選択
されるアミノ酸配列を包含する。 本発明は、昆虫に対して活性である毒素の製造方法であって、（ａ）本発明の
核酸分子と操作可能的に連結される異種プロモーター配列をそれ自体が包含する
キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を得て、そして（ｂ）細胞中で核酸分子を発現
して、昆虫に対して活性である少なくとも１つの毒素を生じる工程を包含する方
法を提供する。In one embodiment, a toxin of the invention comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-6. In another embodiment, a toxin of the invention comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12-14. The present invention provides a method for producing a toxin that is active against insects, comprising: (a) a host containing a chimeric gene that itself contains a heterologous promoter sequence operably linked to the nucleic acid molecule of the present invention. Obtaining a cell and (b) expressing the nucleic acid molecule in the cell to produce at least one toxin that is active against insects.

【００２２】 さらに別の局面では、本発明は、本発明の核酸分子を植物に導入することを包
含する昆虫耐性植物の産生方法であって、核酸分子が昆虫を制御するのに有効な
量で植物中で発現可能である方法を提供する。一実施態様によれば、昆虫は、好
ましくは、コナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia ni （イ
ラクサキンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis viresc
ens （タバコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exigua （
シロイチモンジヨトウ）およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ）から成
る群から選択される鱗翅目昆虫である。別の実施態様によれば、昆虫は、好まし
くはコナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Ostrinia nubilalis（アワノ
メイガ）およびManduca sexta （スズメガ）、ならびにDiabrotica virgifera v
irgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi（ウリハ
ムシの一種）およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）から成る群
から選択される鱗翅目および鞘翅目の昆虫である。In yet another aspect, the present invention provides a method for producing an insect resistant plant comprising introducing a nucleic acid molecule of the present invention into a plant, wherein the nucleic acid molecule is present in an amount effective to control insects. Methods are provided that are expressible in plants. According to one embodiment, the insects are preferably Plutella xylostella (Pryllidae), Trichoplusia ni (Northern Wolverine), Ostrinia nubilalis (Heteroptera), Heliothis viresc of the genus Pterosa.
ens (Helicoverpa), Helicoverpa zea (Helicoverpa), Spodoptera exigua (
It is a lepidopteran insect selected from the group consisting of Syringa armyworm and Spodoptera frugiperda. According to another embodiment, the insects are preferably Plutella xylostella (Pryllid moth), Ostrinia nubilalis (Apocynum) and Manduca sexta (Sparrow), and Diabrotica virgifera v
Lepidoptera and Coleoptera insects selected from the group consisting of irgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi (a kind of beetle), and Leptinotarsa decimlineata (color beetle).

【００２３】 さらに別の局面では、本発明は、昆虫の制御方法であって、有効量の本発明の
毒素を昆虫に送達することを包含する方法を提供する。一実施態様によれは、昆
虫は、好ましくは、Plutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia ni （イラ
クサキンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis virescen
s （タバコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exigua （シ
ロイチモンジヨトウ）およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ）から成る
群から選択される鱗翅目昆虫である。別の実施態様によれば、昆虫は、好ましく
はPlutella xylostella （コナガ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）およ
びManduca sexta （スズメガ）、ならびにDiabrotica virgifera virgifera（ウ
リハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi（ウリハムシの一種）
およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）から成る群から選択され
る鱗翅目および鞘翅目の昆虫である。好ましくは、毒素は経口的に昆虫に送達さ
れる。In yet another aspect, the invention provides a method of controlling an insect, comprising delivering an effective amount of a toxin of the invention to the insect. According to one embodiment, the insects are preferably Plutella xylostella (conga), Trichoplusia ni (nettle), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga), Heliothis virescen.
s (Tobacco moth), Helicoverpa zea (Bombyx mori), Spodoptera exigua (Syringe armyworm) and Spodoptera frugiperda (Syringa armyworm). According to another embodiment, the insects are preferably Plutella xylostella (Aconitum), Ostrinia nubilalis (Anomeiga) and Manduca sexta (Sphingidae), and Diabrotica virgifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi (a kind of beetle).
And Leptinotarsa decimlineata (Colorado potato beetle). Preferably, the toxin is delivered to the insect orally.

【００２４】 本発明のさらに別の局面は、核酸分子が所望のサイズの二本鎖無作為断片の集
団に開裂された本発明の核酸分子を突然変異化するための方法であって、（ａ）
二本鎖無作為断片に、各々が二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一構造の領
域と異種構造の領域を包含する１つ又はそれ以上の一本または二本鎖オリゴヌク
レオチドを付加し、（ｂ）その結果生じる二本鎖無作為断片およびオリゴヌクレ
オチドの混合物を一本鎖断片に変性し、（ｃ）その結果生じる一本鎖断片の集団
を、対の一方の成員に関して他方の複製をプライムするのに十分な同一構造の領
域で一本鎖断片のアニーリングを生じてアニール化断片の対を生成し、それによ
り突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを生成する条件下でポリメラーゼとともに
インキュベートし、そして（ｄ）第二および第三工程を少なくともさらに２回反
復するが、この場合、第二工程をさらに１回実施した結果生じる混合物が前回の
第三工程からの突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを含有し、さらにもう１回実
行すると突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドがさらに生じる工程を包含する方法
の提供である。[0024] Yet another aspect of the invention is a method for mutating a nucleic acid molecule of the invention wherein the nucleic acid molecule has been cleaved into a population of double-stranded random fragments of a desired size, comprising: )
Adding to the double-stranded random fragment one or more single or double-stranded oligonucleotides, each comprising a region of identical structure and a region of heterogeneous structure relative to the double-stranded template polynucleotide; b) denaturing the resulting mixture of double-stranded random fragments and oligonucleotides into single-stranded fragments, and (c) priming the resulting population of single-stranded fragments with respect to one member of the pair and to the other copy. Annealing with a polymerase under conditions that cause annealing of the single-stranded fragment in a region of sufficient identity to produce a pair of annealed fragments, thereby producing a mutated double-stranded polynucleotide; and (D) repeating the second and third steps at least two more times, in which case the mixture resulting from one more execution of the second step is suddenly from the previous third step; Catabolism containing double-stranded polynucleotide is further provided a method including once by running mutated double-stranded polynucleotide further occurs process.

【００２５】 本発明のその他の局面および利点は、本発明の以下の説明および非限定的実施
例から、当業者に明らかになる。 定義 本発明の毒素の「活性」とは、経***性昆虫制御剤としての毒素機能が有毒作
用を有するか、または昆虫給餌を乱すかまたは妨げ、これが昆虫の死を引き起こ
すこともあることを意味する。本発明の毒素が昆虫に送達されると、その結果は
典型的には昆虫の死であり、あるいは昆虫は、昆虫に毒素を利用可能にする供給
源を餌にしない。[0025] Other aspects and advantages of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the following description and non-limiting examples of the present invention. Definitions "Activity" of a toxin of the present invention means that the function of the toxin as an orally active insect control agent has a toxic effect or disrupts or prevents insect feeding, which may also cause insect death. . When the toxin of the invention is delivered to an insect, the result is typically the death of the insect, or the insect does not feed on a source that makes the toxin available to the insect.

【００２６】 「会合される／操作可能的に連結される」とは、物理的に、または機能的に関
連がある２つの核酸配列を指す。例えば、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列は
、２つの配列が操作可能的に連結される場合、ＲＮＡまたはタンパク質をコード
するＤＮＡ配列と「会合される」といわれ、あるいはレギュレーターＤＮＡ配列
がコードまたは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼし得るよう位置される
。“Associated / operably linked” refers to two nucleic acid sequences that are physically or functionally related. For example, a promoter or regulatory DNA sequence is said to be "associated" with a DNA sequence that encodes an RNA or protein when the two sequences are operably linked, or when a regulator DNA sequence is linked to a coding or structural DNA sequence. It is located so that it can affect the expression level.

【００２７】 「キメラ遺伝子」とは、プロモーターまたは調節核酸配列が操作可能的に連結
されるかまたは会合される組換え核酸配列、レギュレーター核酸配列が会合核酸
配列の転写または発現を調節しうるよう、ｍＲＮＡをコードするかまたはタンパ
ク質として発現される核酸配列である。キメラ遺伝子のレギュレーター核酸配列
は、普通は、天然に見出されるような会合核酸配列に操作可能的に連結されない
。A “chimeric gene” is a recombinant nucleic acid sequence to which a promoter or regulatory nucleic acid sequence is operably linked or associated, or a regulator nucleic acid sequence, which can regulate the transcription or expression of the associated nucleic acid sequence. A nucleic acid sequence that encodes mRNA or is expressed as a protein. The regulator nucleic acid sequence of the chimeric gene is usually not operably linked to the associated nucleic acid sequence as found in nature.

【００２８】 「コード配列」とは、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲ
ＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに転写される核酸配列である。好
ましくは、ＲＮＡは次に、生物体中で転写されてタンパク質を産生する。 昆虫を「防除する」とは、毒性作用を介して、生存、成長、給餌および／また
は生殖する有害昆虫の能力を抑制し、あるいは作物植物における昆虫関連損害ま
たは損傷を制限することを意味する。昆虫を「制御する」とは、昆虫を殺害する
ことを意味し得る場合もあるし、そうでない場合もあり得るが、しかし好ましく
は、昆虫を殺害することを意味する。“Coding sequence” refers to RNA, for example, mRNA, rRNA, tRNA, snR
A nucleic acid sequence that is transcribed into NA, sense RNA or antisense RNA. Preferably, the RNA is then transcribed in the organism to produce a protein. By "controlling" insects is meant inhibiting the ability of the pest to survive, grow, feed and / or reproduce through toxic effects, or limit insect-related damage or damage in crop plants. "Controlling" an insect may or may not mean killing the insect, but preferably means killing the insect.

【００２９】 毒素を「送達する（届ける、deliver)」とは、毒素が昆虫と接触するようにな
り、毒性作用を生じて、昆虫を制御することを意味する。毒素は、多数の既知の
経路で、例えば、昆虫が摂取することにより経口的に、またはトランスジェニッ
ク植物発現、処方タンパク質組成物（単数または複数）、噴霧可能タンパク質組
成物（単数または複数）、毒餌マトリックス、あるいはあらゆるその他の当業界
で既知の毒素送達系を介して、昆虫と接触させることにより送達され得る。“Delivering” a toxin means that the toxin comes into contact with the insect, causing toxic effects and controlling the insect. Toxins can be produced by a number of known routes, for example, orally by ingestion by insects, or by transgenic plant expression, formulated protein composition (s), sprayable protein composition (s), bait bait It can be delivered by contact with insects via a matrix or any other art-known toxin delivery system.

【００３０】 「発現カセット」とは、本明細書中で用いる場合には、適切な宿主細胞中での
特定のヌクレオチド配列の発現を指示し得る核酸配列であって、終止コドンと操
作可能的に連結される当該ヌクレオチド配列と操作可能的に連結されるプロモー
ターを包含する核酸配列を意味する。それは、典型的には、ヌクレオチド配列の
適正な翻訳に必要な配列も包含する。当該ヌクレオチド配列を包含する発現カセ
ットはキメラでもよく、これは、その構成成分の少なくとも１つがその他の構成
成分の少なくとも１つに関して異種構造であることを意味する。発現カセットは
、天然であるがしかし異種発現に有用な組換え形態で得られたものでもあり得る
。しかしながら、典型的には、発現カセットは宿主に関して異種であり、即ち、
発現カセットの特定の核酸配列は宿主中に天然では生じない、そして形質転換事
象により宿主細胞または宿主細胞の先祖中に導入されていなければならない。発
現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が何らかの特定の外的刺激
に曝された場合にのみ転写を開始する構成性プロモーターの、または誘導可能プ
ロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーター
はさらに、特定の組織、期間または発生段階に特異的であり得る。An “expression cassette”, as used herein, is a nucleic acid sequence capable of directing the expression of a particular nucleotide sequence in a suitable host cell, and is operably associated with a stop codon. A nucleic acid sequence that includes a promoter operably linked to the nucleotide sequence to be linked is meant. It also typically includes sequences necessary for proper translation of the nucleotide sequence. The expression cassette containing the nucleotide sequence may be chimeric, meaning that at least one of its components is heterologous with respect to at least one of the other components. The expression cassette may also be obtained in a recombinant form that is natural but useful for heterologous expression. However, typically, the expression cassette is heterologous with respect to the host, i.e.,
The particular nucleic acid sequence of the expression cassette is not naturally occurring in the host, and must have been introduced into the host cell or host cell ancestor by transformation events. Expression of the nucleotide sequence in the expression cassette can be under the control of a constitutive promoter, which initiates transcription only when the host cell is exposed to some particular external stimulus, or of an inducible promoter. In the case of multicellular organisms, such as plants, the promoter may further be specific for a particular tissue, period or stage of development.

【００３１】 「遺伝子」とは、ゲノム内に位置し、前記のコード配列の他に、発現の制御に
関与する、言い換えればコード部分の転写および翻訳に関与するその他の、主と
して調節性の核酸配列を包含する限定領域である。遺伝子は、その他の５‘およ
び３’非翻訳化配列および終止配列も包含し得る。存在し得るさらなる素子は、
例えばイントロンである。A “gene” is a gene located in the genome that, in addition to the coding sequences described above, is involved in the control of expression, in other words, other mainly regulatory nucleic acid sequences involved in the transcription and translation of the coding part. Is a limited area that includes The gene may also include other 5 'and 3' untranslated sequences and termination sequences. Further elements that may be present are
For example, an intron.

【００３２】 「当該遺伝子」とは、植物に移入された場合に、所望の特徴、例えば抗生物質
耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、疾患耐性またはその他の害虫に対する耐性、除
草剤耐用性、栄養的価値の改良、産業工程での性能の改良、または生殖能力の変
化を植物に付与する任意の遺伝子を指す。「当該遺伝子」は、植物中での商業的
に有益な酵素または代謝物質の産生のために植物に移入されるものでもあり得る
。“The gene” refers to a desired characteristic, such as antibiotic resistance, virus resistance, insect resistance, disease resistance or other pest resistance, herbicide tolerance, nutritional value, when introduced into a plant. Or any gene that imparts a plant with an improvement in its performance in an industrial process, or a change in fertility. "The gene" can also be one that is transferred to a plant for the production of a commercially valuable enzyme or metabolite in the plant.

【００３３】 「異種」核酸配列とは、それが導入される宿主細胞とは天然では会合されない
核酸配列であって、例えば、天然核酸配列の非天然複数コピーである。 「同種」核酸配列とは、それが導入される宿主細胞と天然で会合される核酸配
列である。 「同種組換え」とは、同種核酸分子間の核酸断片の相互的交換である。A “heterologous” nucleic acid sequence is a nucleic acid sequence that is not naturally associated with the host cell into which it is introduced, for example, non-naturally occurring multiple copies of the natural nucleic acid sequence. A "cognate" nucleic acid sequence is a nucleic acid sequence that is naturally associated with the host cell into which it is introduced. "Homologous recombination" is the reciprocal exchange of nucleic acid fragments between homologous nucleic acid molecules.

【００３４】 「殺昆虫性」とは、好ましくは昆虫を殺害することによりそれらを制御し得る
毒性生物学的活性と定義される。 核酸配列は、核酸配列が参照核酸配列によりコードされるポリペプチドと同一
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、参照核酸配列と「等コー
ド化する（isocoding with) 」。“Insecticidal” is defined as a toxic biological activity that can preferably control insects by killing them. A nucleic acid sequence is "isocoded with" a reference nucleic acid sequence if the nucleic acid sequence encodes a polypeptide having the same amino acid sequence as the polypeptide encoded by the reference nucleic acid sequence.

【００３５】 「単離」核酸分子または単離酵素は、人の手により、その元の環境から離れて
存在し、したがって天然の産物ではない核酸分子または酵素である。単離核酸分
子または酵素は精製形態で存在し得るし、あるいは、非ネイティブ環境、例えば
組換え宿主細胞中に存在し得る。 「核酸分子」または「核酸配列」とは、あらゆる供給源から単離され得る一本
鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの線状セグメントである。本発明の情況では
、核酸分子は、好ましくはＤＮＡのセグメントである。An “isolated” nucleic acid molecule or enzyme is a nucleic acid molecule or enzyme that is present in the human environment away from its original environment, and is thus not a natural product. An isolated nucleic acid molecule or enzyme can be in a purified form, or can be in a non-native environment, eg, a recombinant host cell. A "nucleic acid molecule" or "nucleic acid sequence" is a linear segment of single- or double-stranded DNA or RNA that can be isolated from any source. In the context of the present invention, the nucleic acid molecule is preferably a segment of DNA.

【００３６】 「ＯＲＦ」とは、開放読取枠を意味する。 「植物」とは、発生のあらゆる段階のあらゆる植物、特に種子植物である。 「植物細胞」とは、プロトプラストおよび細胞壁を包含する、植物の構造的お
よび生理学的単位である。植物細胞は、単離単一細胞または培養細胞の形態であ
り得るし、あるいはより高度な組織化単位、例えば植物組織、植物器官または全
植物体の一部として存在し得る。“ORF” means an open reading frame. A "plant" is any plant at any stage of development, especially a seed plant. "Plant cells" are the structural and physiological units of a plant, including protoplasts and cell walls. Plant cells can be in the form of isolated single cells or cultured cells, or can be present as higher organized units, such as plant tissues, plant organs or parts of whole plants.

【００３７】 「植物細胞培養」とは、植物単位、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植
物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子および発生の種々の段階の
胚の培養を意味する。 「植物物質」とは、葉、茎、根、花または花部分、果実、花粉、卵細胞、接合
子、種子、切断物、細胞または組織培養、あるいは植物のその他のあらゆる部分
または生成物を指す。“Plant cell culture” refers to the culture of plant units, such as protoplasts, cell culture cells, cells in plant tissue, pollen, pollen tubes, ovules, embryo sac, zygotes, and embryos at various stages of development. means. "Plant material" refers to a leaf, stem, root, flower or flower part, fruit, pollen, egg cell, zygote, seed, cut, cell or tissue culture, or any other part or product of a plant.

【００３８】 「植物器官」とは、植物の異なる且つ視覚的に構造化および分化した部分、例
えば根、茎、葉、花蕾または胚である。 「植物組織」とは、本明細書中で用いる場合、構造および機能単位に組織化さ
れた植物細胞の一群を意味する。植物界のまたは培養中の植物のあらゆる組織が
含まれる。この用語は、全植物体、植物器官、植物種子、組織培養および構造的
および／または機能的単位に組織化されるあらゆる群の植物細胞を含むが、これ
らに限定されない。前記のような、またはそうでなければこの定義に包含される
あらゆる特定の種類の植物組織とともに、またはそれらの非存在下での、この用
語の使用は、あらゆる他の種類の植物組織を排除するものではない。“Plant organs” are different and visually structured and differentiated parts of a plant, such as roots, stems, leaves, florets or embryos. "Plant tissue", as used herein, refers to a group of plant cells organized into structural and functional units. All tissues of the plant kingdom or in culture are included. The term includes, but is not limited to, whole plants, plant organs, plant seeds, tissue cultures and any group of plant cells organized into structural and / or functional units. The use of this term, with or in the absence of any particular type of plant tissue as described above or otherwise included in this definition, excludes any other type of plant tissue Not something.

【００３９】 「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための結合部位を含有し、
ＤＮＡの転写を開始するコード領域の上流の非翻訳ＤＮＡ配列である。プロモー
ター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他の素子も含み得る。 「プロトプラスト」とは、細胞壁を有さない、または細胞壁の一部のみを有す
る単離植物細胞である。A “promoter” contains a binding site for RNA polymerase II,
Untranslated DNA sequence upstream of the coding region that initiates DNA transcription. The promoter region can also include other elements that act as regulators of gene expression. "Protoplasts" are isolated plant cells that have no cell wall or have only a portion of the cell wall.

【００４０】 「調節素子」とは、ヌクレオチド配列の発現を制御するのに関与する配列を指
す。調節素子は、当該ヌクレオチドおよび終止コドンと操作可能的に連結したプ
ロモーターを包含する。それらは、典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳
に必要な配列を包含する。 その最も広義において、「実質的に類似した」という用語は、ヌクレオチド配
列に関して本明細書中で用いる場合、参照ヌクレオチド配列に対応するヌクレオ
チド配列を意味するが、この場合、対応する配列は、参照ヌクレオチド配列によ
りコードされるポリペプチドと実質的に同一の構造および機能を有するポリペプ
チドをコードし、例えば、ポリペプチド機能に影響を及ぼさないアミノ酸変化だ
けが起こる。望ましくは、実質的に類似したヌクレオチド配列は、参照ヌクレオ
チド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。実質的に類似したヌク
レオチド配列と参照ヌクレオチド配列との間の同一性のパーセンテージは、望ま
しくは少なくとも80％、さらに望ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくと
も90％、さらに好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％で
ある。参照ヌクレオチド配列と「実質的に類似した」ヌクレオチド配列は、2XSS
C 、0.1 ％SDS 中で50℃で洗浄しながら、7 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）
、0.5MのNaPO4 、1mM のEDTA中で50℃でハイブリダイズし、さらに望ましくは、
1XSSC 、0.1 ％SDS 中で50℃で洗浄しながら、7 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S ）、0.5MのNaPO4 、1mM のEDTA中で50℃で、さらに望ましくは、0.5XSSC 、0.
1 ％SDS 中で50℃で洗浄しながら、7 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）、0.5M
のNaPO4 、1mM のEDTA中で50℃で、好ましくは、0.1XSSC 、0.1 ％SDS 中で50℃
で洗浄しながら、7 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）、0.5MのNaPO4 、1mM の
EDTA中で50℃で、さらに好ましくは、0.1XSSC 、0.1 ％SDS 中で65℃で洗浄しな
がら、7 ％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）、0.5MのNaPO4 、1mM のEDTA中で50
℃でハイブリダイズする。“Regulatory element” refers to a sequence involved in controlling the expression of a nucleotide sequence. Regulatory elements include a promoter operably linked to the nucleotide and stop codon. They typically include sequences necessary for proper translation of the nucleotide sequence. In its broadest sense, the term "substantially similar" as used herein in reference to a nucleotide sequence means a nucleotide sequence corresponding to a reference nucleotide sequence, wherein the corresponding sequence is a reference nucleotide sequence. Encode a polypeptide having substantially the same structure and function as the polypeptide encoded by the sequence, for example, only those amino acid changes that do not affect polypeptide function occur. Desirably, the substantially similar nucleotide sequence encodes a polypeptide encoded by the reference nucleotide sequence. The percentage of identity between a substantially similar nucleotide sequence and a reference nucleotide sequence is desirably at least 80%, more desirably at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably At least 99%. A nucleotide sequence "substantially similar" to the reference nucleotide sequence is 2XSS
C, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS) while washing at 50 ° C in 0.1% SDS
, 0.5 M NaPO 4 , 1 mM EDTA at 50 ° C., more preferably
1XSSC, 7% sodium dodecyl sulfate (SD) while washing at 50 ° C in 0.1% SDS
S), 0.5 M NaPO 4 , 1 mM EDTA at 50 ° C., more preferably 0.5 X SSC, 0.
7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5M, washing at 50 ° C in 1% SDS
NaPO 4 at 50 ° C. in 1 mM EDTA, preferably at 50 ° C. in 0.1 × SSC, 0.1% SDS
Wash with 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaPO 4 , 1 mM
Washing at 50 ° C. in EDTA, more preferably at 65 ° C. in 0.1 × SSC, 0.1% SDS, 50% in 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaPO 4 , 1 mM EDTA.
Hybridize at ℃.

【００４１】 「合成」とは、天然配列中には存在しない構造的特徴を包含するヌクレオチド
配列を指す。例えば、双子葉および／または単子葉遺伝子のＧ＋Ｃ含量および正
常コドン分布をより厳密に似せた人工配列は、合成であるといわれる。 「形質転換」とは、宿主細胞または生物体中に異種核酸を導入するための方法
である。特に、「形質転換」とは、当該生物体のゲノム中へのＤＮＡ分子の安定
組込みを意味する。“Synthetic” refers to a nucleotide sequence that includes structural features that are not present in the native sequence. For example, artificial sequences that more closely mimic the G + C content and normal codon distribution of dicotyledonous and / or monocotyledonous genes are said to be synthetic. “Transformation” is a method for introducing a heterologous nucleic acid into a host cell or organism. In particular, "transformation" refers to the stable integration of a DNA molecule into the genome of the organism.

【００４２】 「形質転換化／トランスジェニック／組換え体」とは、異種核酸分子が導入さ
れた細菌または植物のような宿主生物体を指す。核酸分子は宿主のゲノム中に安
定に組み込まれ得るか、または核酸分子は染色体外分子としても存在し得る。こ
のような染色体外分子は、自己複製し得る。形質転換細胞、組織または植物は、
形質転換工程の最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含する
と理解される。「非形質転換化」、「非トランスジェニック」または「非組換え
」宿主とは、野生型生物体、例えば異種核酸分子を含有しない細菌または植物を
指す。“Transformed / transgenic / recombinant” refers to a host organism, such as a bacterium or plant, into which a heterologous nucleic acid molecule has been introduced. The nucleic acid molecule may be stably integrated into the genome of the host, or the nucleic acid molecule may be present as an extrachromosomal molecule. Such extrachromosomal molecules can self-replicate. The transformed cell, tissue or plant is
It is understood that not only the final product of the transformation step, but also its transgenic progeny. A “non-transformed”, “non-transgenic” or “non-recombinant” host refers to a wild-type organism, eg, a bacterium or plant that does not contain a heterologous nucleic acid molecule.

【００４３】 ヌクレオチドは、以下の標準略語によりそれらの塩基で示される：アデニン（
Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）。アミノ酸は同様に
、以下の標準略語で示される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；
Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイ
ン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、
グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；
Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；
Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｐ；Ｐ）、セリン（Ｓ
ｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロ
シン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。さらに、（Ｘａａ；Ｘ）はあ
らゆるアミノ酸を表す。Nucleotides are designated by their base by the following standard abbreviations: adenine (
A), cytosine (C), thymine (T) and guanine (G). Amino acids are likewise indicated by the following standard abbreviations: alanine (Ala; A), arginine (Arg;
R), asparagine (Asn; N), aspartic acid (Asp; D), cysteine (Cys; C), glutamine (Gln; Q), glutamic acid (Glu; E),
Glycine (Gly; G), histidine (His; H), isoleucine (Ile;
I), leucine (Leu; L), lysine (Lys; K), methionine (Met;
M), phenylalanine (Phe; F), proline (Prp; P), serine (S
er; S), threonine (Thr; T), tryptophan (Trp; W), tyrosine (Tyr; Y) and valine (Val; V). Further, (Xaa; X) represents any amino acid.

【００４４】 配列表中の配列の簡単な説明 配列番号１は、明示したヌクレオチド位置に以下のＯＲＦを含有するpCIB9359
-7中に包含された約9.7kb のＤＮＡの配列である。 名称 開始 終止 orf1 412 1665 orf2 1686 2447 orf3 2758 3318 orf4 3342 4118 orf5 4515 9269 配列番号２は、配列番号１のorf1によりコードされた〜46.4 kDaのタンパク質
の配列である。BRIEF DESCRIPTION OF THE SEQUENCES IN THE SEQUENCE LISTING SEQ ID NO: 1 contains the following ORF at the indicated nucleotide positions in pCIB9359
-7 kb of DNA sequence contained in -7. Name Start Stop orf1 412 1665 orf2 1686 2447 orf3 2758 3318 orf4 3342 4118 orf5 4515 9269 SEQ ID NO: 2 is the sequence of a 446.4 kDa protein encoded by orf1 of SEQ ID NO: 1.

【００４５】 配列番号３は、配列番号１のorf2によりコードされた〜28.1 kDaのタンパク質
の配列である。 配列番号４は、配列番号１のorf3によりコードされた〜20.7 kDaのタンパク質
の配列である。 配列番号５は、配列番号１のorf4によりコードされた〜28.7 kDaタンパク質の
配列である。SEQ ID NO: 3 is the sequence of a 228.1 kDa protein encoded by orf2 of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 4 is the sequence of the 220.7 kDa protein encoded by orf3 of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 5 is the sequence of the 228.7 kDa protein encoded by orf4 of SEQ ID NO: 1.

【００４６】 配列番号６は、配列番号１のorf5によりコードされた〜176 kDa のタンパク
質の配列である。 配列番号７〜１０は、オリゴヌクレオチドである。 配列番号１１は、明示したヌクレオチド位置に以下のＯＲＦを含有するpNOV24
00中に包含された約38kbのＤＮＡの配列である（下降している数値および「Ｃ」
は、ＯＲＦが相補的鎖であることを示す）。SEQ ID NO: 6 is the sequence of the 176176 kDa protein encoded by orf5 of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NOs: 7 to 10 are oligonucleotides. SEQ ID NO: 11 is a pNOV24 containing the following ORF at the indicated nucleotide positions:
The sequence of the approximately 38 kb DNA encompassed in 00 (decreasing numbers and "C"
Indicates that the ORF is the complementary strand).

【００４７】 名称 開始 終止 orf7 66 1898 （部分配列） hph3 2416 9909 orf18 3395 2817 C orf4 9966 14,633 orf19 14,699 15,007 orf5 15,171 18,035 orf22 17,398 17,072 C orf10 19,167 18,235 C orf14 20,116 19,385 C orf13 20,963 20,217 C orf11 23,086 22,172 C hph2 23,768 31,336 orf2 31,393 35,838 orf21 35,079 35,383 C orf16 36,661 36,032 C orf8 37,781 36,654 C 配列番号１１は、以下の制限部位も含み、このうちのいくつかは実施例１７に
記載したサブクローニング工程に用いられる。Name Start End orf7 66 1898 (partial sequence) hph3 2416 9909 orf18 3395 2817 C orf4 9966 14,633 orf19 14,699 15,007 orf5 15,171 18,035 orf22 17,398 17,072 C orf10 19,167 18,235 C orf14 20,116 19,385 C orf13 20,963 20,217 C862, ph 2323 23,768 31,336 orf2 31,393 35,838 orf21 35,079 35,383 C orf16 36,661 36,032 C orf8 37,781 36,654 C SEQ ID NO: 11 also contains the following restriction sites, some of which are used in the subcloning step described in Example 17.

【００４８】 制限部位 ヌクレオチド位置（単数または複数） AccIII 2835 BamHI 18,915 BsmBI 11,350 Bst1 1071 29,684 EagI 13,590; 31,481 Eco721 34,474 MluI 2444;5116;9327;26,204 NotI 13,589 PacI 9915;23,353;37,888 PvuI 8816 SapI 35,248 SexAI 28,946 SgfI 8815 SpeI 2157;3769;7831;11,168 SphI 755 StuI 35,690 Tth111I 21,443 配列番号１２は、配列番号１１のorf5によりコードされるタンパク質の配列で
ある。Restriction site nucleotide position (s) AccIII 2835 BamHI 18,915 BsmBI 11,350 Bst1 1071 29,684 EagI 13,590; 31,481 Eco721 34,474 MluI 2444; 5116; 9327; 26,204 NotI 13,589 PacI 9915; 23,353; 37,888 PvuI 8816 SapI 35946g 8815 SpeI 2157; 3769; 7831; 11,168 SphI 755 StuI 35,690 Tth111I 21,443 SEQ ID NO: 12 is the sequence of the protein encoded by orf5 of SEQ ID NO: 11.

【００４９】 配列番号１３は、配列番号１１のhph2によりコードされるタンパク質の配列で
ある。 配列番号１４は、配列番号１１のorf2によりコードされるタンパク質の配列で
ある。 配列番号１５〜２２はオリゴヌクレオチドである。SEQ ID NO: 13 is the sequence of the protein encoded by hph2 of SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 14 is the sequence of the protein encoded by orf2 of SEQ ID NO: 11. SEQ ID NOS: 15 to 22 are oligonucleotides.

【００５０】 寄託 以下の物質は、International Recognition of the Deposit of Microorganis
ms for the Purposes of Patent Procedure に関するブダペスト条約の条件下で
、Agricultural Research Service, Patent Culture Collection（NRRL）, 1815
North University Street, Peoria, Illinois 61604に寄託されている。寄託物
質の利用可能背に関する制限はすべて、特許付与時に取り外されて、撤回できな
い。Deposits The following materials were obtained from the International Recognition of the Deposit of Microorganis
Under the terms of the Budapest Treaty on the ms for the Purposes of Patent Procedure, the Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), 1815
Deposited at North University Street, Peoria, Illinois 61604. All restrictions on the availability of deposited materials are removed at the time of grant and cannot be revoked.

【００５１】 クローン 寄託番号 寄託日時 pCIB9359-7 NRRL B-21835 1997年9 月17日 pNOV2400 NRRL B-30077 1998 年12月3 日 pNOV1001 NRRL B-30078 1998 年12月3 日 その発現が殺昆虫毒素を生じる新規の核酸配列 本発明は、その発現が新規の毒素を生じる核酸配列、ならびに有害昆虫を制御
するための毒素の製造および使用に関する。核酸配列は、腸内細菌科の一員であ
るフォトラブドゥス属のPhotorhabdus luminescensから得られる。P. luminesce
nsは、ヘテロラブディティス属Heterorhabditis の線虫類の共生細菌である。線
虫類は昆虫幼虫をコロニー化し、それらを殺害して、それらの子孫は死んだ幼虫
を餌にする。殺昆虫活性は、共生P. luminescens細菌により実際に生成される。
本発明人は、P. luminescensから本発明のヌクレオチド配列を単離した最初の者
である（ATCC菌株番号29999 ）。本発明の核酸配列の発現は、鱗翅目昆虫、例え
ばコナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia ni （イラクサキ
ンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis virescens （タ
バコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Manduca sexta （スズメガ）、
Spodoptera exigua （シロイチモンジヨトウ）およびSpodoptera frugiperda （
シロナヨトウ）、ならびに鞘翅目のDiabrotica virgifera virgifera（ウリハム
シの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi（ウリハムシの一種）および
Leptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）を制御するために用いられ得る
毒素を生じる。Clone Deposit number Deposit date pCIB9359-7 NRRL B-21835 September 17, 1997 pNOV2400 NRRL B-30077 December 3, 1998 pNOV1001 NRRL B-30078 December 3, 1998 Expression of insecticidal toxin The present invention relates to nucleic acid sequences whose expression gives rise to novel toxins, and to the production and use of toxins for controlling pest insects. The nucleic acid sequence is obtained from Photorhabdus luminescens of the genus Photolabdus, a member of the Enterobacteriaceae family. P. luminesce
ns is a nematode symbiotic bacterium of the genus Heterorhabditis. Nematodes colonize insect larvae and kill them, and their offspring feed on dead larvae. Insecticidal activity is actually produced by symbiotic P. luminescens bacteria.
We are the first to isolate the nucleotide sequence of the present invention from P. luminescens (ATCC strain no. 29999). Expression of the nucleic acid sequences of the present invention can be achieved by the expression of lepidopteran insects, such as Plutella xylostella (Pryllid moth), Trichoplusia ni (Erythrophilus terrestris), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga), Heliothis virescens (Tobacco moth), Helicoverpa zea (Mushroom moth), Manduca sexta (Suzumega),
Spodoptera exigua (Syringe armyworm) and Spodoptera frugiperda (
White armyworm), and Coleoptera Diabrotica virgifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi (a kind of beetle) and
Produces a toxin that can be used to control Leptinotarsa decimlineata (Colorado potato beetle).

【００５２】 好ましい一実施態様では、本発明は、配列番号１で記述される約9.7 kbの核酸
配列と実質的に類似したヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子であって、そ
の発現が昆虫制御活性を生じる核酸分子を包含する（実施例１〜１１でさらに説
明する）。５つの開放読取枠（ＯＲＦ）が、配列番号１で記述される核酸配列中
に存在して、予測サイズ45 kDa、28 kDa、21 kDa、29 kDaおよび176 kDa のタン
パク質をコードする。５つのＯＲＦは、オペロン様構造で整列される。異種宿主
中で発現される場合、P. luminescensからの〜9.7 kDa のＤＮＡ断片は、鱗翅目
昆虫、例えばコナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia ni （
イラクサキンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis vire
scens （タバコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exigua
（シロイチモンジヨトウ）およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ）に対
する昆虫制御活性を生じて、配列番号１で示した〜9.7 kbのヌクレオチド配列の
発現が、このような昆虫制御活性には必要であり且つ十分であることを示す。好
ましい実施態様では、本発明は、その発現が殺昆虫毒素を生じるＤＮＡ分子を包
含し、これは大腸菌CIB9359-7 株に寄託されている（NRRL寄託番号B-21835 ）。In one preferred embodiment, the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence substantially similar to the nucleic acid sequence of about 9.7 kb set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the expression is insect-regulated. Includes nucleic acid molecules that produce activity (further described in Examples 1-11). Five open reading frames (ORFs) are present in the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and encode proteins of predicted sizes of 45 kDa, 28 kDa, 21 kDa, 29 kDa and 176 kDa. The five ORFs are arranged in an operon-like structure. When expressed in a heterologous host, a DNA fragment of 9.79.7 kDa from P. luminescens can be used to produce lepidopteran insects such as Plutella xylostella (Pryllidae), Trichoplusia ni (
Nettle, nettle, Ostrinia nubilalis, Heliothis vire
scens, Helicoverpa zea, Spodoptera exigua
Expression of the 9.79.7 kb nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is necessary and sufficient for such insect control activities, resulting in insect control activity against (Sycamore armyworm) and Spodoptera frugiperda (Acacia litura). It indicates that. In a preferred embodiment, the invention encompasses a DNA molecule whose expression results in an insecticidal toxin, which has been deposited with E. coli strain CIB9359-7 (NRRL accession number B-21835).

【００５３】 別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号１１で記述され、大腸菌pNOV
2400株中で寄託された（NRRL寄託番号B-30077 ）約38 kb の核酸断片と実質的に
類似したヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子であって、その発現が昆虫制
御活性を生じる核酸分子を包含する（実施例１２〜１８参照）。さらに好ましい
実施態様では、本発明は、大腸菌Pnov1001株中で寄託された（NRRL寄託番号B-30
078 ）〜22 kb の核酸断片と実質的に類似したヌクレオチド配列を包含する単離
核酸分子であって、その発現が昆虫制御活性を生じる核酸分子を包含する。最も
好ましい実施態様では、本発明は、配列番号１１で記述されるＤＮＡ断片のヌク
レオチド23,768-31,336 （hph2）、31,393-35,838 （orf2）および15,171-18,03
5 （orf5）に対応する３つのＯＲＦと実質的に類似したヌクレオチド配列を包含
する単離核酸分子、ならびにそれらによりコードされるタンパク質を包含する。
異種宿主中で同時発現される場合、これら３つのＯＲＦは、鱗翅目昆虫、例えば
コナガ属のPlutella xylostella （コナガ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイ
ガ）およびManduca sexta （スズメガ）、ならびに鞘翅目昆虫、例えばDiabroti
ca virgifera virgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata h
owardi（ウリハムシの一種）およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハム
シ）に対する昆虫制御活性を生じて、これら３つのＯＲＦ（hph2、orf2およびor
f5）の同時発現がこのような昆虫制御活性には必要であり且つ十分である、とい
うことを示す。In another preferred embodiment, the present invention is described in SEQ ID NO: 11, wherein E. coli pNOV
An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence substantially similar to a nucleic acid fragment of about 38 kb deposited in the 2400 strain (NRRL accession number B-30077), the expression of which results in insect control activity. (See Examples 12 to 18). In a further preferred embodiment, the invention has been deposited in E. coli strain Pnov1001 (NRRL accession number B-30).
078) An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence substantially similar to a -22 kb nucleic acid fragment, the expression of which results in insect control activity. In a most preferred embodiment, the invention relates to nucleotides 23,768-31,336 (hph2), 31,393-35,838 (orf2) and 15,171-18,03 of the DNA fragment described by SEQ ID NO: 11.
Includes isolated nucleic acid molecules that include nucleotide sequences substantially similar to the three ORFs corresponding to 5 (orf5), as well as the proteins encoded by them.
When co-expressed in a heterologous host, these three ORFs include lepidopteran insects, for example, Plutella xylostella (Pryllidae), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga) and Manduca sexta (Sparrow), and Coleoptera, such as Diabroti
ca virgifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata h
owardi (a kind of beetle) and Leptinotarsa decimlineata (colored potato beetle), resulting in these three ORFs (hph2, orf2 and or
We show that co-expression of f5) is necessary and sufficient for such insect control activity.

【００５４】 本発明は、本発明の核酸配列を含有するベクターも包含する。このようなベク
ターでは、核酸配列は、好ましくは、ヌクレオチド配列を発現し得る宿主細胞中
でのヌクレオチド配列の発現のための調節素子を包含する発現カセット中に含ま
れ得る。このような調節素子は、通常はプロモーターおよび終止コドンを包含し
、好ましくは、本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドの有効な翻訳
を可能にする素子も含む。核酸配列を含むベクターは、好ましくは染色体外分子
として、特定の宿主細胞中での複製が通常は可能であり、したがって、宿主細胞
中で本発明の核酸配列を増幅するために用いられる。一実施態様では、このよう
なベクターのための宿主細胞は、微生物、例えば細菌、特に大腸菌である。別の
実施態様では、このような組換えベクターのための宿主細胞は、内部寄生植物ま
たは着性植物である。このようなベクターのための好ましい宿主細胞は、真核細
胞、例えば酵母菌、植物細胞または昆虫細胞である。植物細胞、例えばトウモロ
コシ細胞は、最も好ましい宿主細胞である。別の好ましい実施態様では、このよ
うなベクターはウイルスベクターであり、特定の宿主細胞、例えば昆虫細胞また
は植物細胞中のヌクレオチド配列の複製に用いられる。組換えベクターは、宿主
細胞中への本発明のヌクレオチド配列の形質転換のためにも用いられ、それによ
りヌクレオチド配列はこのような宿主細胞のＤＮＡ中に安定的に組み込まれる。
一実施態様では、このような宿主細胞は原核細胞である。好ましい実施態様では
、このような宿主細胞は真核細胞、例えば酵母菌細胞、昆虫細胞または植物細胞
である。最も好ましい実施態様では、宿主細胞は植物細胞、例えばトウモロコシ
細胞である。The present invention also includes a vector containing the nucleic acid sequence of the present invention. In such a vector, the nucleic acid sequence may preferably be included in an expression cassette that includes regulatory elements for expression of the nucleotide sequence in a host cell capable of expressing the nucleotide sequence. Such regulatory elements usually include a promoter and a stop codon, and preferably also include elements that enable efficient translation of a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence of the present invention. Vectors containing nucleic acid sequences are usually capable of replication in particular host cells, preferably as extrachromosomal molecules, and are therefore used to amplify the nucleic acid sequences of the present invention in host cells. In one embodiment, the host cell for such a vector is a microorganism, such as a bacterium, especially E. coli. In another embodiment, the host cell for such a recombinant vector is an endophytic or epiphytic plant. Preferred host cells for such vectors are eukaryotic cells, such as yeast, plant cells or insect cells. Plant cells, such as corn cells, are the most preferred host cells. In another preferred embodiment, such a vector is a viral vector and is used for the replication of a nucleotide sequence in a particular host cell, such as an insect cell or a plant cell. Recombinant vectors are also used for transforming the nucleotide sequence of the present invention into a host cell, whereby the nucleotide sequence is stably integrated into the DNA of such a host cell.
In one embodiment, such a host cell is a prokaryotic cell. In a preferred embodiment, such host cells are eukaryotic cells, such as yeast cells, insect cells or plant cells. In a most preferred embodiment, the host cell is a plant cell, for example, a corn cell.

【００５５】 好ましい実施態様では、本発明の殺昆虫毒素は、各々、本発明のヌクレオチド
配列によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドを包含する。別の好まし
い実施態様では、殺昆虫毒素は、P. luminescensの精製株、例えばATTC寄託番号
29999 を有する株から生成される。本発明の毒素は、バイオアッセイにおいて有
害昆虫に対して検査した場合、昆虫制御活性を有する；そして殺昆虫毒素のこれ
らの特性は、実施例１〜１８でさらに説明される。本発明に記載した殺昆虫毒素
はさらに、それらの分子量が、サイズ分別実験により見出されたように、6,000
より大きい。殺昆虫毒素は、４℃で２週間保存された後、十分な殺昆虫活性を保
持する。凍結乾燥され、22℃で2 週間保存された後に、十分な殺昆虫活性を保持
するものも示されている。しかしながら、本発明の殺昆虫毒素は、100 ℃で５分
間インキュベーション後には、それらの殺昆虫活性を失う。In a preferred embodiment, the insecticidal toxins of the invention each include at least one polypeptide encoded by a nucleotide sequence of the invention. In another preferred embodiment, the insecticidal toxin is a purified strain of P. luminescens, such as ATTC accession number
Generated from strains with 29999. The toxins of the invention have insect control activity when tested against pest insects in bioassays; and these properties of insecticidal toxins are further described in Examples 1-18. The insecticidal toxins described in the present invention further have a molecular weight of 6,000, as found by size fractionation experiments.
Greater than. The insecticidal toxin retains sufficient insecticidal activity after storage at 4 ° C. for 2 weeks. Some have been shown to retain sufficient insecticidal activity after lyophilization and storage at 22 ° C for 2 weeks. However, the insecticidal toxins of the present invention lose their insecticidal activity after incubation at 100 ° C for 5 minutes.

【００５６】 さらに別の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、in vitro組換えまた
はＤＮＡシャッフリングとして知られている技術における無作為突然変異の組み
入れにより修飾され得る。この技術は、Stemmer et al., Nature 370:389-391（
1994）および米国特許第5,605,793 号（これらの記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる）に記載されている。ヌクレオチド配列の突然変異体コピーは本
発明の元のヌクレオチド配列を基礎にして生成され、そして特性の改良、例えば
殺昆虫活性の増大、安定性増大または異なる特異性または標的有害昆虫範囲を示
す変異体が回収される。その方法は、本発明のヌクレオチド配列を包含する、所
望のサイズの二本鎖無作為断片に開裂されている鋳型二本鎖ポリヌクレオチドか
ら突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを生成する工程を包含し、そしてその結果
生じる二本鎖無作為断片の集団に、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一構
造の領域と異種構造の領域を包含する１つ又はそれ以上の一本または二本鎖オリ
ゴヌクレオチドを付加する工程を包含し；その結果生じる二本鎖無作為断片とオ
リゴヌクレオチドの混合物を一本鎖断片に変性し；その結果生じる一本鎖断片の
集団を、対の一員が他方の複製をプライムするのに十分である前記の同一構造領
域で前記の一本鎖断片のアニーリングを生じてアニール化断片の対を生成し、そ
れにより突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを生成する条件下でポリメラーゼと
ともにインキュベートし；そして第二および第三工程を少なくともさらに２回反
復するが、この場合、第二工程をさらに１回実施した結果生じる混合物が前回の
第三工程からの突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを含有し、さらにもう１回実
行すると突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドがさらに生じる工程を包含する。好
ましい実施態様では、二本鎖無作為断片の集団中の単一種の二本鎖無作為断片の
濃度は、総ＤＮＡの１重量％未満である。さらに好ましい実施態様では、鋳型二
本鎖ポリヌクレオチドは、少なくとも約100 種のポリヌクレオチドを包含する。
さらに別の好ましい実施態様では、二本鎖無作為断片のサイズは、約５bp〜５kb
である。さらに好ましい実施態様では、方法の第四工程は、第二および第三工程
を少なくとも10回反復することを包含する。In yet another embodiment, the nucleotide sequences of the present invention may be modified by in vitro recombination or by incorporating random mutations in a technique known as DNA shuffling. This technology is described in Stemmer et al., Nature 370: 389-391 (
1994) and U.S. Patent No. 5,605,793, the contents of which are incorporated herein by reference. Mutant copies of the nucleotide sequence are generated based on the original nucleotide sequence of the present invention, and are variants that exhibit improved properties, such as increased insecticidal activity, increased stability, or a different specificity or target insect pest range Is collected. The method includes generating a mutated double-stranded polynucleotide from a template double-stranded polynucleotide that has been cleaved into a double-stranded random fragment of a desired size, including the nucleotide sequence of the present invention. And the resulting population of double-stranded random fragments comprises one or more single or double-stranded oligonucleotides comprising regions of identical structure and heterologous structures to the double-stranded template polynucleotide. Denaturing the resulting mixture of double-stranded random fragments and oligonucleotides into single-stranded fragments; transforming the resulting population of single-stranded fragments into members of a pair Annealing of the single-stranded fragment at the same structural region sufficient to prime to produce a pair of annealed fragments, thereby producing a mutated double-stranded polynucleotide Incubate with the polymerase under producing conditions; and repeat the second and third steps at least two more times, in which case the mixture resulting from performing one more second step is abrupt from the previous third step A step containing a mutated double-stranded polynucleotide, which, when performed one more time, further results in a mutated double-stranded polynucleotide. In a preferred embodiment, the concentration of a single species of double-stranded random fragment in the population of double-stranded random fragments is less than 1% by weight of total DNA. In a further preferred embodiment, the template double-stranded polynucleotide comprises at least about 100 different polynucleotides.
In yet another preferred embodiment, the size of the double-stranded random fragment is between about 5 bp and 5 kb.
It is. In a further preferred embodiment, the fourth step of the method comprises repeating the second and third steps at least 10 times.

【００５７】 異種微生物宿主中でのヌクレオチド配列の発現 生物学的昆虫制御剤として、殺昆虫毒素は、ヌクレオチド配列を発現し得る異
種宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現により生成される。第一の実施態様で
は、その染色***置に少なくとも１つの本発明のヌクレオチド配列の修飾を包含
するP. luminescens細胞が記載される。このような修飾は既存の調節素子の突然
変異または欠失を包含し、したがってヌクレオチド配列の発現の変更またはヌク
レオチド配列の発現を制御する新規の調節素子の組入れをもたらす。別の実施態
様では、染色体中への挿入により、またはヌクレオチド配列を含有する染色体外
複製分子の導入により、１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列の付加的コピーが
P. luminescens細胞に付加される。Expression of Nucleotide Sequences in Heterologous Microbial Hosts As biological insect control agents, insecticidal toxins are produced by expression of a nucleotide sequence in a heterologous host cell capable of expressing the nucleotide sequence. In a first embodiment, P. luminescens cells are described that include at least one nucleotide sequence modification of the invention at their chromosomal location. Such modifications include mutations or deletions of existing regulatory elements, thus resulting in altered expression of the nucleotide sequence or the incorporation of new regulatory elements that control the expression of the nucleotide sequence. In another embodiment, additional copies of one or more nucleotide sequences are obtained by insertion into the chromosome or by introduction of an extrachromosomal replicating molecule containing the nucleotide sequence.
Added to P. luminescens cells.

【００５８】 別の実施態様では、少なくとも１つの本発明のヌクレオチド配列が、プロモー
ターおよび終止コドンを包含する適切な発現カセット中に挿入される。ヌクレオ
チド配列の発現は構成的であり、あるいは転写を開始するための種々の種類の刺
激に応答する誘導可能プロモーターが用いられる。好ましい実施態様では、毒素
が発現される細胞は、微生物、例えばウイルス、細菌（bacteria) 、真菌（fung
ns) である。好ましい実施態様では、ウイルス、例えばバキュウロウイルスは、
そのゲノム中に本発明のヌクレオチド配列を含有し、そしてヌクレオチド配列の
ウイルス複製および発現に適した適切な真核細胞の感染後に多量の対応する殺昆
虫毒素を発現する。このようにして生成された殺昆虫毒素は、殺昆虫剤として用
いられる。あるいは、ヌクレオチド配列を含有するよう工学処理されたバキュウ
ロウイルスは、in vivo で昆虫に感染し、殺昆虫毒素の発現により、またはウイ
ルス感染と殺昆虫毒素の発現との組合せにより、それらを殺害するために用いら
れる。In another embodiment, at least one nucleotide sequence of the invention is inserted into a suitable expression cassette that includes a promoter and a stop codon. Expression of the nucleotide sequence is constitutive, or an inducible promoter is used that responds to various types of stimuli to initiate transcription. In a preferred embodiment, the cells in which the toxin is expressed are microorganisms, such as viruses, bacteria, fungi.
ns). In a preferred embodiment, the virus, eg, a baculovirus,
It contains a nucleotide sequence of the invention in its genome and expresses a large amount of the corresponding insecticidal toxin after infection of an appropriate eukaryotic cell suitable for viral replication and expression of the nucleotide sequence. The insecticidal toxin thus produced is used as an insecticide. Alternatively, baculoviruses engineered to contain nucleotide sequences infect insects in vivo and kill them by expression of insecticidal toxins or by a combination of viral infection and expression of insecticidal toxins. Used for

【００５９】 細菌細胞は、本発明のヌクレオチド配列の発現のための宿主でもある。好まし
い実施態様では、植物組織内で生存し、複製し得る非病原性共生細菌、いわゆる
内部寄生植物、または葉圏または根圏をコロニー化し得る非病原性共生細菌、い
わゆる着生植物が用いられる。このような細菌としては、アグロバクテリウム属
、アルカリジーン属、アゾスピリルム属、アゾバクター属、バシラス属、クラビ
バクター属、エンテロバクター属、エルウィニア属、フラボバクター属、クレブ
シエラ属、シュードモナス属、リゾビウム属、セラチア属、ストレプトミセス属
およびキサントモナス属の細菌が挙げられる。共生真菌、例えばトリコデルマ属
およびグリオクラジウム属も、同じ目的のための本発明のヌクレオチド配列の発
現のための考え得る宿主である。[0059] Bacterial cells are also hosts for expression of the nucleotide sequences of the present invention. In a preferred embodiment, a non-pathogenic commensal bacterium capable of surviving and replicating in plant tissue, a so-called endoparasitic plant, or a non-pathogenic commensal bacterium capable of colonizing the phylosphere or rhizosphere, a so-called epiphytic plant, is used. Such bacteria include Agrobacterium, Alkaline gene, Azospirillum, Azoobacter, Bacillus, Claviobacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia And bacteria of the genera Streptomyces and Xanthomonas. Symbiotic fungi, such as Trichoderma and Gliocladium, are also possible hosts for expression of the nucleotide sequences of the invention for the same purpose.

【００６０】 これらの遺伝子操作のための技術は、異なる利用可能な宿主に特異的であり、
当業界で既知である。例えば、発現ベクターpKK223-3およびpKK223-2は、tac ま
たはtrc プロモーターの後ろに、転写または翻訳融合で、大腸菌中で異種遺伝子
を発現するために用いられ得る。多ＯＲＦをコードするオペロンの発現のために
は、最も簡単な手法は、転写融合で、ベクター、例えばpKK223-3中にオペロンを
挿入して、異種遺伝子のコグネイトリボソーム結合部位を使用可能にすることで
ある。グラム陽性種、例えばバシラス属における過剰発現のための技術も当業界
で知られており、本発明の情況で用いられ得る（Quax et al., In: Industrial
Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al.,
American Society for Microbiology, Washington （1993））。過剰発現のため
の代替的系は、例えば酵母菌ベクターによっており、ピキア属Pichia、サッカロ
ミセス属Saccharomyces およびクルイベロミセス属Kluyveromyces の使用が挙げ
られる（Sreekrishna, In: Industrial microorganisms: basic and applied mo
lecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for
Microbiology, Washington （1993）; Dequin & Barre, Biotechnology 12:173
-177（1994）; van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139（1990））。The techniques for these genetic manipulations are specific for different available hosts,
Known in the art. For example, the expression vectors pKK223-3 and pKK223-2 can be used to express a heterologous gene in E. coli in a transcription or translation fusion behind a tac or trc promoter. For expression of an operon encoding a multi-ORF, the simplest approach is to insert the operon into a vector, such as pKK223-3, by transcriptional fusion, to enable the use of the cognate ribosome binding site of a heterologous gene. That is. Techniques for overexpression in Gram-positive species such as Bacillus are also known in the art and can be used in the context of the present invention (Quax et al., In: Industrial
Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al.,
American Society for Microbiology, Washington (1993)). Alternative systems for overexpression are, for example, by yeast vectors, and include the use of Pichia sp., Saccharomyces sp. Saccharomyces and Kluyveromyces sp. Kluyveromyces (Sreekrishna, In: Industrial microorganisms: basic and applied mo
lecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for
Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology 12: 173
-177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8: 135-139 (1990)).

【００６１】 別の好ましい実施態様では、記載されたヌクレオチド配列のうちの少なくとも
１つが、生物制御特徴を有するシュードモナス属のPseudomonas fluorescens CG
A267356 株（公告済み出願EU0472494 およびWO94/01561に記載されている）に移
入され、そこで発現される。別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド
配列は、これも生物制御特徴を有するPseudomonas aureofaciens 30-84株に移入
される。異種生物制御株中での発現は、選定宿主中での複製に適したベクターの
選択およびプロモーターの適切な選定を必要とする。グラム陰性およびグラム陽
性細菌および真菌中での発現のための技術は、当業界で周知である。In another preferred embodiment, Pseudomonas fluorescens CG of Pseudomonas spp. Wherein at least one of the nucleotide sequences described has bioregulatory characteristics.
It is transferred to the A267356 strain (described in published applications EU0472494 and WO94 / 01561) and expressed there. In another preferred embodiment, the nucleotide sequence of the present invention is transferred to Pseudomonas aureofaciens strain 30-84, which also has biocontrol characteristics. Expression in a heterologous control strain requires the selection of a suitable vector for replication in the selected host and the appropriate selection of a promoter. Techniques for expression in Gram-negative and Gram-positive bacteria and fungi are well known in the art.

【００６２】 植物組織中でのヌクレオチド配列の発現 特に好ましい実施態様では、本発明の殺昆虫毒素の少なくとも１つが、高等生
物、例えば植物中で発現される。この場合、有効量の毒素を発現するトランスジ
ェニック植物は、有害昆虫からそれ自体を防御する。昆虫がこのようなトランス
ジェニック植物を食べ始めると、それは発現された毒素も摂食する。これは、昆
虫が植物組織をさらに噛むのを躊躇させ、あるいは昆虫を傷つけまたは殺害する
ことさえあり得る。本発明のヌクレオチド配列は、発現カセット中に挿入され、
次にこれは、好ましくは前記の植物のゲノム中に安定的に組み込まれる。別の好
ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は、非病原性自己複製ウイルス中に含入
される。本発明にしたがって形質転換された植物は、単子葉類または双子葉類で
あって、それらの例としては、トウモロコシ（maize)、コムギ、オオムギ、ライ
ムギ、サツマイモ、インゲン、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラ
ワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマ
ネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、トウナス、カボチャ、アサ、ズッキーニ、
リンゴ、ナシ、カリン、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アン
ズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、
パパイヤ、マンゴー、ダイズ、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、サトウダ
イコン、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファル
ファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、シロイヌナズナArabidopsis および
木本植物、例えば針葉樹および落葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。Expression of Nucleotide Sequences in Plant Tissue In a particularly preferred embodiment, at least one of the insecticidal toxins of the invention is expressed in higher organisms, such as plants. In this case, the transgenic plant expressing an effective amount of the toxin protects itself from pests. When an insect begins to eat such a transgenic plant, it also consumes the expressed toxin. This may cause the insects to hesitate to further bite the plant tissue, or even damage or kill the insects. The nucleotide sequence of the present invention is inserted into an expression cassette,
It is then preferably stably integrated into the genome of said plant. In another preferred embodiment, the nucleotide sequence is contained in a non-pathogenic self-replicating virus. Plants transformed according to the present invention are monocotyledonous or dicotyledonous and include, for example, maize, wheat, barley, rye, sweet potato, kidney beans, peas, chicory, lettuce, cabbage , Cauliflower, broccoli, turnip, radish, spinach, asparagus, onion, garlic, pepper, celery, tounas, pumpkin, asa, zucchini,
Apple, pear, quince, melon, plum, cherry, peach, nectarine, apricot, strawberry, grape, raspberry, blackberry, pineapple, avocado,
Papaya, mango, soybean, tomato, sugar corn, sugar cane, sugar beet, sunflower, rape, clover, tobacco, carrot, cotton, alfalfa, rice, potato, eggplant, cucumber, Arabidopsis Arabidopsis and woody plants such as conifers and deciduous trees But not limited thereto.

【００６３】 所望のヌクレオチド配列が特定の植物種中で形質転換されれば、伝統的交配技
術を用いて、それはその種中で増殖され得るし、あるいは同一種のその他の変種
、例えば特に市販の変種中に移され得る。 本発明のヌクレオチド配列は、好ましくは、トランスジェニック植物中で発現
され、したがって、トランスジェニック植物中で対応する毒素の生合成を生じる
。この方法では、昆虫に対する耐性増強を示すトランスジェニック植物が生成さ
れる。トランスジェニック植物中でのそれらの発現のためには、本発明のヌクレ
オチド配列は、修飾および最適化を必要とし得る。多くの場合、微生物からの遺
伝子は修飾を伴わずに高レベルで植物中で発現され得るが、しかしトランスジェ
ニック植物中での低発現は、植物中では好ましくないコドンを有する微生物ヌク
レオチド配列に起因し得る。全生物が、コドン使用に関して特定の好みを有し、
本明細書中に記載したヌクレオチド配列のコドンは、それによりコードされるア
ミノ酸を保持しながら、植物の好みに合うよう変えられ得る、ということが当業
界で知られている。さらに、植物中での高発現は、少なくとも約35％のＧＣ含量
、好ましくは約45％より高い、さらに好ましくは約50％より高い、そして最も好
ましくは約60％より高いＧＣ含量を有するコード配列から最良に達成される。低
ＧＣ含量を有する微生物ヌクレオチド配列は、メッセージを不安定にし得るATTT
A モチーフ、ならびに不適切なポリアデニル化を引き起こし得るAATAAAモチーフ
の存在のために、植物中で不十分に発現し得る。好ましい遺伝子配列は単子葉類
および双子葉類植物種の両方で適切に発現され得るが、しかし配列は、これらの
選択は異なることが示されている（Murray et al., Nucl. Acids Res. 17:477-4
98（1989））ように、単子葉類または双子葉類の特定のコドン選択およびＧＣ含
量選択を引き起こすように修飾され得る。さらに、ヌクレオチド配列は、メッセ
ージの先端切断を引き起こし得る不合理なスプライス部位の存在に関してスクリ
ーニングされる。前記のようなヌクレオチド内でなされる必要がある変化はすべ
て、公告済特許出願EP0385962 （Monsanto）、EP0359472 （Lubrizol）およびWO
93/07278（Ciba-Geigy）に記載された方法を用いた特定部位の突然変異誘発、Ｐ
ＣＲおよび合成遺伝子構築の周知の技術を用いて成される。Once the desired nucleotide sequence has been transformed in a particular plant species, it can be propagated in that species using traditional breeding techniques, or other variants of the same species, for example, commercially available species. Can be transferred during varieties. The nucleotide sequences of the present invention are preferably expressed in transgenic plants, thus resulting in the biosynthesis of the corresponding toxin in the transgenic plants. In this way, transgenic plants that show enhanced resistance to insects are produced. For their expression in transgenic plants, the nucleotide sequences of the present invention may require modification and optimization. In many cases, genes from microorganisms can be expressed in plants at high levels without modification, but low expression in transgenic plants is due to microbial nucleotide sequences having undesirable codons in plants. obtain. All organisms have specific preferences for codon usage,
It is known in the art that the codons of the nucleotide sequences described herein can be altered to suit plant preferences while retaining the amino acids encoded thereby. In addition, high expression in a plant can result in a coding sequence having a GC content of at least about 35%, preferably greater than about 45%, more preferably greater than about 50%, and most preferably greater than about 60%. Best achieved from Microbial nucleotide sequences with low GC content can cause ATTT to destabilize messages
It can be poorly expressed in plants due to the presence of the A motif, as well as the AATAAA motif, which can cause inappropriate polyadenylation. Preferred gene sequences can be expressed properly in both monocotyledonous and dicotyledonous plant species, but sequences have been shown to differ in their selection (Murray et al., Nucl. Acids Res. 17 : 477-4
98 (1989)) and can be modified to cause specific codon and GC content selection in monocots or dicots. In addition, nucleotide sequences are screened for the presence of unreasonable splice sites that can cause truncation of the message. All changes that need to be made in nucleotides such as those described above are published patent applications EP0385962 (Monsanto), EP0359472 (Lubrizol) and WO
Site-directed mutagenesis using the method described in 93/07278 (Ciba-Geigy), P.
This is done using well-known techniques of CR and synthetic gene construction.

【００６４】 翻訳の有効な開始のためには、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を要する
。例えば、それらは、植物中で有効であることが知られている配列の含入により
修飾され得る。Joshi は、植物のための適切なコンセンサスを示唆し（NAR 15:6
643-6653（1987））、そしてClontechはさらに別のコンセンサス翻訳イニシエー
ターを示唆している（1993/1994 カタログ、210 ページ）。これらのコンセンサ
スは、本発明のヌクレオチド配列に関する使用に適している。配列は、ＡＴＧを
含めてそこまで（しかし修飾されていない第二アミノ酸は残す）の、あるいはＡ
ＴＧの後のＧＴＣを含めてそこまで（トランスジーンの第二アミノ酸を修飾する
可能性を有する）のヌクレオチド配列を包含する構築物中に組み入れられる。For efficient initiation of translation, sequences adjacent to the initiation methionine require modification. For example, they can be modified by the inclusion of sequences known to be effective in plants. Joshi suggested appropriate consensus for plants (NAR 15: 6
643-6653 (1987)), and Clontech suggest yet another consensus translation initiator (1993/1994 catalog, page 210). These consensuses are suitable for use with the nucleotide sequences of the present invention. The sequence may be up to and including ATG (but leaving the unmodified second amino acid) or
It is incorporated into constructs that include the nucleotide sequence up to and including the GTC after the TG (with the potential to modify the second amino acid of the transgene).

【００６５】 トランスジェニック植物中でのヌクレオチド配列の発現は、植物中で機能性で
あることが示されたプロモーターにより駆動される。プロモーターの選定は、発
現のための時間的および空間的要件によって、そして標的種によっても変わる。
したがって、葉、穂、花序（例えば、穂状花序、円錐花序、円塊花序等）、根、
および／または若木における本発明のヌクレオチド配列の発現が好ましい。しか
しながら、多くの場合、１つより多い種類の有害昆虫に対する防御が探索され、
したがって、多組織における発現が望ましい。双子葉類からの多数のプロモータ
ーは単子葉類で操作可能であり、その逆も言えることが示されているが、しかし
理想的には、双子葉類プロモーターは双子葉類中での発現のために選択され、そ
して単子葉類プロモーターは単子葉類中での発現のためである。しかしながら、
選択されるプロモーターの出所に対する制限はない。所望の細胞中でのヌクレオ
チド配列の発現を駆動するに際して、それらが操作可能であることで十分である
。[0065] Expression of a nucleotide sequence in a transgenic plant is driven by a promoter that has been shown to be functional in the plant. The choice of promoter will also depend on the temporal and spatial requirements for expression, and also on the target species.
Thus, leaves, spikes, inflorescences (eg, spikes, panicles, inflorescences, etc.), roots,
And / or expression of the nucleotide sequence of the present invention in young trees. However, in many cases protection against more than one type of pest is sought,
Therefore, expression in multiple tissues is desirable. A number of promoters from dicots have been shown to be operable in monocots, and vice versa, but ideally, dicot promoters are preferred for expression in dicots. And the monocot promoter is for expression in monocots. However,
There is no restriction on the source of the selected promoter. In driving the expression of the nucleotide sequences in the desired cells, it is sufficient that they be operable.

【００６６】 構成的に発現される好ましいプロモーターとしては、アクチンまたはユビキチ
ンをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびにCaMV 35Sおよび19S プロモ
ーターが挙げられる。本発明のヌクレオチド配列は、化学的に調節されるプロモ
ーターの調節下でも発現され得る。これは、作物植物が誘導化学物質で処理され
る場合のみ、殺昆虫毒素が合成されるのを可能にする。遺伝子発現の化学的誘導
のための好ましい技術は、公告済み出願EP0332104 （Ciba-Geigy）および米国特
許第5,614,395 号に詳述されている。化学的誘導のための好ましいプロモーター
は、タバコPR-1a プロモーターである。Preferred promoters that are constitutively expressed include promoters from genes encoding actin or ubiquitin, and the CaMV 35S and 19S promoters. The nucleotide sequences of the present invention can also be expressed under the control of a chemically regulated promoter. This allows insecticidal toxins to be synthesized only if the crop plants are treated with the derived chemical. Preferred techniques for the chemical induction of gene expression are described in detail in published application EP0332104 (Ciba-Geigy) and US Pat. No. 5,614,395. A preferred promoter for chemical induction is the tobacco PR-1a promoter.

【００６７】 好ましい範疇のプロモーターは、創傷誘導性であるものである。創傷部位で、
そして植物性病原性感染の部位でも発現される多数のプロモーターが記載されて
いる。理想的には、このようなプロモーターは感染の部位で局所的に活性である
だけであるべきで、この方法では、殺昆虫毒素は、侵襲有害昆虫を殺害するため
の殺昆虫毒素を合成する必要がある細胞中に蓄積するだけである。この種の好ま
しいプロモーターとしては、下記に記載されているものが挙げられる：Stanford
et al., Mol. Gen. Genet. 215:200-208 （1989）; Xu et al., Plant Molec.
Biol. 22:573-588（1993）; Logemann et al., Plant Cell 1:151-158 （1989）
;Rohmeler & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 （1993）; Firek et al.
Plant Molec. Biol. 22:129-142（1993）; およびWarner et al. Plant J. 3:1
91-201（1993）。A preferred category of promoters are those that are wound inducible. At the wound site,
A number of promoters that are also expressed at sites of phytopathogenic infection have been described. Ideally, such a promoter should only be locally active at the site of infection, in which case the insecticidal toxin would need to synthesize an insecticidal toxin to kill the invading insect pest. It only accumulates in some cells. Preferred promoters of this type include those described below: Stanford
et al., Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989); Xu et al., Plant Molec.
Biol. 22: 573-588 (1993); Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989).
; Rohmeler & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993); Firek et al.
Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993); and Warner et al. Plant J. 3: 1.
91-201 (1993).

【００６８】 好ましい組織特異的発現パターンは、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的お
よび花特異的を含む。緑色組織中での発現に適したプロモーターとしては、光合
成に関与する遺伝子を調節する多数のものが挙げられ、これらのうちの多くは単
子葉類および双子葉類の両方からクローン化されている。好ましいプロモーター
は、ホスホエノールカルボキシレート遺伝子からのトウモロコシPEPCプロモータ
ーである（Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 （1989））。根
特異的発現のための好ましいプロモーターは、Framond （FEBS 290:103-106（19
91）;EP0452269（Ciba-Geigy））により記載されたものであり、これはトウモロ
コシtrpA遺伝子の発現を駆動する。Preferred tissue-specific expression patterns include green tissue-specific, root-specific, stem-specific and flower-specific. Suitable promoters for expression in green tissue include many that regulate genes involved in photosynthesis, many of which have been cloned from both monocots and dicots. A preferred promoter is the maize PEPC promoter from the phosphoenol carboxylate gene (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Preferred promoters for root-specific expression are Framond (FEBS 290: 103-106 (19
91); EP0452269 (Ciba-Geigy)), which drives the expression of the maize trpA gene.

【００６９】 本発明の特に好ましい実施態様は、根選択または根特異的様式で本発明のヌク
レオチド配列の少なくとも１つを発現するトランスジェニック植物である。さら
に好ましい実施態様は、創傷誘導性または病原感染誘導性様式でヌクレオチド配
列を発現するトランスジェニック植物である。 適切なプロモーターの選択の他に、植物中での殺昆虫毒素の発現のための構築
物は、異種ヌクレオチド配列の下流に結合される適切な転写ターミネーターを必
要とする。いくつかのこのようなターミネーターが利用可能であり、当業界で既
知である（例えば、CaMVからのtm1 、rbcSからのE9）。植物中で機能することが
知られているあらゆる利用可能なターミネーターが、本発明の状況下で用いられ
得る。A particularly preferred embodiment of the present invention is a transgenic plant which expresses at least one of the nucleotide sequences according to the invention in a root-selective or root-specific manner. A further preferred embodiment is a transgenic plant that expresses the nucleotide sequence in a wound-inducing or pathogenic infection-inducing manner. In addition to selecting an appropriate promoter, constructs for expression of insecticidal toxins in plants require an appropriate transcription terminator that is linked downstream of the heterologous nucleotide sequence. Several such terminators are available and known in the art (eg, tm1 from CaMV, E9 from rbcS). Any available terminator known to function in plants can be used in the context of the present invention.

【００７０】 多数のその他の配列が、本発明に記載した発現カセット中に組み入れられ得る
。これらは、発現を増強することが示されている配列、例えばイントロン配列（
例えば、Adh1およびbronze1 から）およびウイルスリーダー配列（例えば、TMV
、MCMVおよびAMV から）を含む。 植物中の異なる細胞局所限定を本発明のヌクレオチド配列の発現の目標にする
のが好ましい。いくつかの場合、サイトゾルにおける局所限定が好ましい。トラ
ンスジーンコード化酵素の亜細胞局所限定は、当業界で周知の技術を用いて実行
される。典型的には、既知の細胞小器官標的化遺伝子生成物からの標的ペプチド
をコードするＤＮＡが操作され、ヌクレオチド配列の上流に融合される。多数の
このような標的配列は葉緑体に関して知られており、それらの異種構築物中での
機能が示されている。本発明のヌクレオチド配列の発現は、小胞体に対して、ま
たは宿主細胞の液胞に対しても標的化される。これを達成するための技術は、当
業界で周知である。[0070] A number of other sequences can be incorporated into the expression cassettes described in the present invention. These are sequences that have been shown to enhance expression, such as intron sequences (
For example, from Adh1 and bronze1) and viral leader sequences (eg, TMV
, MCMV and AMV). It is preferred that different cell localizations in the plant are targeted for expression of the nucleotide sequences of the invention. In some cases, local limitation in the cytosol is preferred. Subcellular localization of the transgene encoding enzyme is performed using techniques well known in the art. Typically, DNA encoding a target peptide from a known organelle targeting gene product is engineered and fused upstream of the nucleotide sequence. Many such target sequences are known for chloroplasts and have demonstrated their function in heterologous constructs. Expression of the nucleotide sequences of the present invention is also targeted to the endoplasmic reticulum or to the vacuole of a host cell. Techniques for accomplishing this are well known in the art.

【００７１】 植物形質転換に適したベクターは、本明細書中の別の箇所に記載されている。
アグロバクテリウム媒介性形質転換に関しては、バイナリーベクターまたは少な
くとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を保有するベクターが適しているが、一方
、直接遺伝子移入に関しては、あらゆるベクターが適しており、当該構築物のみ
を含有する線状ＤＮＡが好ましい。直接遺伝子移入の場合、単一ＤＮＡ種による
形質転換または同時形質転換が用いられ得る（Schocher et al., Biotechnology
4:1093-1096（1986））。直接遺伝子移入およびアグロバクテリウム媒介性移入
の両方に関して、形質転換は、通常は（しかし必ずしもというわけではなく）、
抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセート）または除
草剤（バスタbasta ）に対する耐性を提供し得る選択可能マーカーを用いて試み
られる。しかしながら、選択可能マーカーの選定は、本発明に取って重要ではな
い。Suitable vectors for plant transformation are described elsewhere herein.
For Agrobacterium-mediated transformation, a binary vector or a vector carrying at least one T-DNA border sequence is suitable, while for direct gene transfer any vector is suitable and only the construct is used. Containing linear DNA is preferred. For direct gene transfer, transformation with a single DNA species or co-transformation may be used (Schocher et al., Biotechnology
4: 1093-1096 (1986)). For both direct and Agrobacterium-mediated transfer, transformation is usually (but not always)
Attempts are made with selectable markers that can provide resistance to antibiotics (kanamycin, hygromycin or methotrexate) or herbicides (basta basta). However, the choice of selectable marker is not critical to the invention.

【００７２】 別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチドゲノム
中に直接形質転換される。プラスチド形質転換の主な利点は、プラスチドが一般
に、実質的修飾を伴わずに細菌遺伝子を発現し得ること、そしてプラスチドが単
一プロモーターの制御下で多数の開放読取枠を発現し得ることである。プラスチ
ド形質転換技術は、下記において広範に記載されている：米国特許第5,451,513
号、第5,545,817 号および第5,545,818 号、ならびにＰＣＴ出願WO95/16783、な
らびにMcBride et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305。葉
緑体形質転換のための基本技術は、例えば、biolisticsまたはプロトプラスト形
質転換（例えば、塩化カルシウムまたはＰＥＧ媒介性形質転換）を用いて、選択
可能マーカーと側面を接するクローン化プラスチドＤＮＡの領域を当該遺伝子と
一緒に適切な標的組織中に導入することを包含する。ターゲッティング領域と呼
ばれる１〜1.5 kbのフランキング領域は、プラスチドゲノムとの相同的組換えを
促し、したがってプラストームの特定の領域の置換または修飾を可能にする。最
初に、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する耐性を付
与する葉緑体16S ｒＲＮＡおよびrps12 遺伝子における点突然変異は、形質転換
のための選択可能マーカーとして利用される（Svab, Z., Hajdukiewicz, P., an
d Maliga, P.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.
M., and Maliga, P.（1992）Plant Cell 4, 39-45 ）。これは、標的葉の約１／
100 衝撃の頻度で、安定ホモプラスミー性形質転換を生じた。これらのマーカー
間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲッ
ティングベクターの作製を可能にした（Staub, J.M., and Maliga, P. （1993）
EMBO J.12, 601-606）。形質転換頻度の実質的増大は、劣性ｒＲＮＡまたはｒ−
タンパク質抗生物質耐性遺伝子の、優性選択可能マーカー、即ちスペクチノマイ
シン−解毒酵素アミノグリコシド−３‘−アデニルトランスフェラーゼをコード
する細菌aadA遺伝子との置換により得られる（Svab, Z., and Maliga, P.（1993
）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917）。従来、このマーカーは緑藻類ク
ラミドモナス属Chlamydomonas reinhardtii のプラスチドゲノムの高頻度形質転
換のためにうまく用いられてきた（Goldschmidt-Clermont, M.（1991）Nucl. Ac
ids Res. 19:4083-4089 ）。プラスチド形質転換に有用なその他の選択可能マー
カーは当業界で知られており、本発明の範囲内に含まれる。典型的には、ホモプ
ラスチド状態に達するには、形質転換後、約15〜20細胞***周期が必要である。
相同的組換えにより各植物細胞中に存在する環状プラスチドゲノムの数千のコピ
ーのすべてに遺伝子が挿入されるプラスチド発現は、可溶性植物タンパク質全体
の10％を容易に越え得る発現レベルを可能にするために、核発現遺伝子を上回る
利点である厖大なコピー数を利用する。好ましい実施態様では、本発明のヌクレ
オチド配列は、プラスチドターゲッティングベクター中に挿入され、所望の植物
宿主のプラスチドゲノム中で形質転換される。本発明のヌクレオチド配列を含有
するプラスチドゲノムと成因的相同の植物が得られ、ヌクレオチド配列の高発現
を選択的に可能にする。[0072] In another preferred embodiment, the nucleotide sequence of the invention is transformed directly into the plastid genome. The main advantage of plastid transformation is that plastids can generally express bacterial genes without substantial modification, and that plastids can express multiple open reading frames under the control of a single promoter. . Plastid transformation techniques are described extensively in: US Patent No. 5,451,513.
Nos. 5,545,817 and 5,545,818, and PCT application WO 95/16783, and McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Basic techniques for chloroplast transformation include, for example, using biolistics or protoplast transformation (eg, calcium chloride or PEG-mediated transformation) to map regions of the cloned plastid DNA flanking the selectable marker. Transfection into a suitable target tissue together with the gene. A flanking region of 1-1.5 kb, called the targeting region, promotes homologous recombination with the plastid genome, thus allowing for the replacement or modification of certain regions of the plastome. Initially, point mutations in the chloroplast 16S rRNA and rps12 genes that confer resistance to spectinomycin and / or streptomycin are used as selectable markers for transformation (Svab, Z., Hajdukiewicz, P ., an
d Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.
M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). This is about 1 /
At a frequency of 100 shocks, stable homoplasmic transformation occurred. The presence of a cloning site between these markers allowed the construction of a plastid targeting vector for the introduction of foreign genes (Staub, JM, and Maliga, P. (1993).
EMBO J.12, 601-606). The substantial increase in transformation frequency is due to recessive rRNA or r-
Obtained by replacing the protein antibiotic resistance gene with a dominant selectable marker, the bacterial aadA gene encoding the spectinomycin-detoxifying enzyme aminoglycoside-3'-adenyltransferase (Svab, Z., and Maliga, P., et al. 1993
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Heretofore, this marker has been successfully used for high frequency transformation of the plastid genome of the green alga Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Ac
ids Res. 19: 4083-4089). Other selectable markers useful for plastid transformation are known in the art and are included within the scope of the present invention. Typically, about 15-20 cell division cycles are required after transformation to reach the homoplastid state.
Plastid expression, in which the gene is inserted into all thousands of copies of the cyclic plastid genome present in each plant cell by homologous recombination, allows expression levels that can easily exceed 10% of the total soluble plant protein To this end, it exploits the huge copy number, an advantage over nuclear expressed genes. In a preferred embodiment, the nucleotide sequence of the present invention is inserted into a plastid targeting vector and transformed into the plastid genome of the desired plant host. Plants that are homologous to the plastid genome containing the nucleotide sequence of the present invention are obtained and selectively enable high expression of the nucleotide sequence.

【００７３】 殺昆虫組成物の処方 本発明は、本発明の殺昆虫毒素の少なくとも１つを含有する組成物も含む。有
害昆虫を有効に制御するために、このような組成物は、好ましくは、十分量の毒
素を含有する。このような量は、防御される作物によって、標的化される特定の
害虫によって、そして環境条件、例えば湿度、温度または土壌の種類によって変
わる。好ましい実施態様では、殺昆虫毒素を含有する組成物は、さらに精製せず
に毒素を発現する宿主細胞を包含する。別の好ましい実施態様では、殺昆虫毒素
を発現する細胞は、殺昆虫剤としてのそれらの使用前に凍結乾燥される。別の実
施態様では、殺昆虫毒素は、宿主細胞から分泌されるように工学処理される。そ
れらが発現される宿主細胞からの毒素の精製が望ましい場合、殺昆虫毒素の種々
の程度の精製が達成される。Formulation of Insecticidal Compositions The present invention also includes compositions containing at least one of the insecticidal toxins of the present invention. In order to effectively control pests, such compositions preferably contain a sufficient amount of toxin. Such amounts vary depending on the crop to be protected, the particular pest targeted and on environmental conditions such as humidity, temperature or soil type. In a preferred embodiment, compositions containing insecticidal toxins include host cells that express the toxin without further purification. In another preferred embodiment, cells expressing insecticidal toxins are lyophilized prior to their use as insecticides. In another embodiment, the insecticidal toxin is engineered to be secreted from the host cell. Where purification of the toxin from the host cell in which they are expressed is desired, varying degrees of purification of the insecticidal toxin are achieved.

【００７４】 本発明はさらに、本明細書中に記載した１つ又はそれ以上の化合物または化合
物群と均質に混合される本発明の殺昆虫毒素の少なくとも１つを含有する組成物
の調製を包含する。本発明は、殺昆虫毒素または殺昆虫毒素を含有する組成物の
植物への適用を包含する植物の処理方法にも関する。殺昆虫毒素は、組成物の形
態で作物領域に、または処理される植物に、同時にまたは逐次、さらに別の化合
物とともに適用される。これらの化合物は、肥料または微量栄養素供給体または
植物成長に影響を及ぼすその他の調製物であり得る。それらは、選択的除草剤、
殺昆虫剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはこれらの製剤の
いくつかの混合物でもあり得るし、所望により、処方業界で普通に常用される担
体、界面活性剤または適用促進アジュバントと一緒に用いられ得る。適切な担体
およびアジュバントは、固体または液体であり得るし、処方技術に常用される物
質、例えば天然または再生無機物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合
剤または肥料に対応し得る。The present invention further encompasses the preparation of a composition containing at least one insecticidal toxin of the present invention that is intimately mixed with one or more compounds or compounds described herein. I do. The present invention also relates to a method of treating a plant comprising applying to the plant an insecticidal toxin or a composition containing an insecticidal toxin. The insecticidal toxin is applied in the form of a composition to the crop area or to the plant to be treated, simultaneously or sequentially, with another compound. These compounds can be fertilizers or micronutrient donors or other preparations that affect plant growth. They are selective herbicides,
It can also be an insecticide, fungicide, bactericide, nematicide, molluscicide or a mixture of some of these preparations, if desired, a carrier commonly used in the formulation industry, a surfactant, It can be used together with an agent or an application enhancing adjuvant. Suitable carriers and adjuvants can be solid or liquid and can correspond to the substances customary in formulation technology, for example natural or regenerated inorganic substances, solvents, dispersants, wetting agents, tackifiers, binders or fertilizers .

【００７５】 本発明の殺昆虫毒素を適用する好ましい方法は、土壌、水または植物の群葉と
いった、有害昆虫を宿している環境に噴霧することによる。適用回数および適用
率は、有害昆虫による侵食の種類および程度による。殺昆虫毒素は、液体組成物
を植物の場所に含浸させる（全身作用）ことにより、あるいは土壌に固体形態で
、例えば粒状形態で化合物を適用する（土壌適用）ことにより、土壌を介して根
を通って植物に浸透し得る。殺昆虫毒素は、殺昆虫毒素を含有する液体処方物を
用いて種子に含浸させることにより、または固体処方物をそれらにコーティング
することにより、種子に適用され得る（コーティング）。特別な場合、さらに別
の種類の適用、例えば植物の茎または蕾の選択的処理も考え得る。殺昆虫毒素は
、地面の上または下に位置する毒餌としても提供され得る。A preferred method of applying the insecticidal toxins of the present invention is by spraying into an environment harboring the pests, such as soil, water or plant foliage. The frequency and rate of application depends on the type and extent of erosion by the pests. Insecticidal toxins cause roots to penetrate through the soil by impregnating the location of the plant with the liquid composition (systemic action) or by applying the compound to the soil in solid form, for example in particulate form (soil application). Can penetrate plants through. The insecticidal toxins can be applied to the seeds by impregnating the seeds with a liquid formulation containing the insecticidal toxins, or by coating them with a solid formulation (coating). In special cases, further types of application are also conceivable, for example selective treatment of plant stems or buds. The insecticidal toxins can also be provided as baits located above or below the ground.

【００７６】 殺昆虫毒素は、好ましくは、処方業界で慣用的に用いられるアジュバントと一
緒に、非修飾化形態で用いられ、したがって、既知の方法で乳化濃縮物、被覆可
能ペースト、直接噴霧可能または稀釈可能溶液、稀釈乳濁液、湿潤性粉末、可溶
性粉末、ダスト、顆粒に処方され、そして例えばポリマー物質中に封入される。
組成物の性質と同様に、適用方法、例えば噴霧、霧吹き、散粉、散布または注入
は、意図される目的物および一般的環境にしたがって選択される。The insecticidal toxins are preferably used in unmodified form, together with adjuvants conventionally used in the formulation industry, and are therefore emulsified concentrates, coatable pastes, directly sprayable or It is formulated into dilutable solutions, diluted emulsions, wettable powders, soluble powders, dusts, granules, and encapsulated, for example, in polymeric materials.
As with the nature of the composition, the method of application, such as spraying, atomizing, dusting, dusting or pouring, is selected according to the intended purpose and the general environment.

【００７７】 殺昆虫毒素、そして適切な場合には固体または液体のアジュバントを含有する
処方物、組成物または製剤は、既知の方法で、例えば殺昆虫毒素を増量剤、例え
ば溶媒、固体担体と、そして適切な場合には界面活性化合物（界面活性剤）と、
均質に混合および／または粉砕することにより、調製される。 適切な溶媒としては、芳香族炭化水素、好ましくは炭素数が８〜12の分画、例
えばキシレン混合物または置換ナフタレン、フタレート、例えばジブチルフタレ
ートまたはジオクチルフタレート、脂肪族炭化水素、例えばシクロヘキサンまた
はパラフィン、アルコールおよびグリコール、ならびにそれらのエーテルおよび
エステル、例えばエタノール、エチレングリコール、モノメチルまたはモノエチ
ルエーテル、ケトン、例えばシクロヘキサノン、強極性溶媒、例えばＮ−メチル
−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド、ならび
にエポキシド化植物油、例えばエポキシド化ヤシ油またはダイズ油、あるいは水
が挙げられる。Formulations, compositions or formulations containing the insecticidal toxin, and, if appropriate, a solid or liquid adjuvant, can be prepared in a known manner, eg, by adding the insecticidal toxin to a bulking agent, eg, a solvent, a solid carrier, And, where appropriate, a surfactant compound (surfactant);
It is prepared by mixing and / or grinding homogeneously. Suitable solvents include aromatic hydrocarbons, preferably those having 8 to 12 carbon atoms, such as xylene mixtures or substituted naphthalenes, phthalates, such as dibutyl phthalate or dioctyl phthalate, aliphatic hydrocarbons, such as cyclohexane or paraffin, alcohols And glycols and their ethers and esters, such as ethanol, ethylene glycol, monomethyl or monoethyl ether, ketones such as cyclohexanone, strong polar solvents such as N-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide or dimethylformamide, and epoxidized vegetable oils For example, epoxidized coconut oil or soybean oil, or water.

【００７８】 例えば、ダストおよび分散性粉末に用いられる固体担体は、普通は天然無機充
填剤、例えば方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャ
イトである。物理的特性を改良するために、高分散化ケイ酸または高分散化吸収
剤ポリマーを付加することもできる。適切な粒状化吸着性担体は、多孔質型、例
えば軽石、粉砕煉瓦、海泡石またはベントナイトであり、適切な非収着性担体は
、例えば方解石または砂のような物質である。さらに、莫大な数の無機または有
機性の予備粒状化物質、例えばドロマイトまたは粉砕植物残渣が用いられ得る。For example, the solid carriers used in dusts and dispersible powders are usually natural inorganic fillers, such as calcite, talc, kaolin, montmorillonite or attapulgite. In order to improve the physical properties, a highly dispersed silica or a highly dispersed absorbent polymer can be added. Suitable granulated adsorptive carriers are of the porous type, for example pumice, crushed brick, sepiolite or bentonite, and suitable non-sorbent carriers are for example substances such as calcite or sand. In addition, a vast number of inorganic or organic pre-granulated substances, such as dolomite or ground plant residues, can be used.

【００７９】 適切な界面活性化合物は、良好な乳化、分散および湿潤特性を有する非イオン
性、陽イオン性および／または陰イオン性界面活性剤である。「界面活性剤」と
いう用語は、界面活性剤の混合物を包含するとも理解される。適切な陽イオン性
界面活性剤は、水溶性石鹸および水溶性合成界面活性化合物の両方であり得る。 適切な石鹸は、高級脂肪酸（炭素数10〜22の鎖）のアルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩、あるいは非置換または置換アンモニウム塩、例えばオレイン酸また
はステアリン酸の、あるいは、例えばヤシ油または獣油から得られる天然脂肪酸
混合物のナトリウムまたはカリウム塩である。脂肪酸メチルタウリン塩も用いら
れ得る。Suitable surfactant compounds are non-ionic, cationic and / or anionic surfactants having good emulsifying, dispersing and wetting properties. The term "surfactants" is also understood to include mixtures of surfactants. Suitable cationic surfactants can be both water-soluble soaps and water-soluble synthetic surface-active compounds. Suitable soaps are alkali metal salts, alkaline earth metal salts, or unsubstituted or substituted ammonium salts of higher fatty acids (chains with 10 to 22 carbon atoms), such as oleic acid or stearic acid, or, for example, coconut oil or animal oil. Sodium or potassium salts of natural fatty acid mixtures obtained from oils. Fatty acid methyltaurine salts can also be used.

【００８０】 しかしながら、さらにしばしば、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪スルホネ
ート、脂肪スルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキル
アリールスルホネートが用いられる。 脂肪スルホネートまたはスルフェートは、通常は、アルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩、あるいは非置換または置換アンモニウム塩の形態であり、アルキル
基のアルキル部分も含めた炭素数8 〜22のアルキル基を有し、その例としては、
例えばリグノンスルホン酸の、ドデシルスルホネートの、または天然脂肪酸から
得られる脂肪アルコールスルフェートのナトリウムまたはカルシウム塩がある。
これらの化合物は、脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物の硫酸エステルお
よびスルホン酸の塩も包含する。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ま
しくは、２個のスルホン酸基と炭素数８〜22の１個の脂肪酸基を含有する。アル
キルアリールスルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナフ
タレンスルホン酸、または成る他レンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物
のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。対応するホス
フェート、例えば４〜14モルのエチレンオキシドを有するｐ−ノニルフェノール
の付加物のリン酸エステルの塩も適している。However, more often so-called synthetic surfactants are used, especially fatty sulfonates, fatty sulfates, sulfonated benzimidazole derivatives or alkylarylsulfonates. The fatty sulfonate or sulfate is usually in the form of an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, or an unsubstituted or substituted ammonium salt, and has an alkyl group having 8 to 22 carbon atoms including the alkyl portion of the alkyl group. , For example,
For example, the sodium or calcium salts of lignone sulfonic acid, dodecyl sulfonate, or fatty alcohol sulfate obtained from natural fatty acids.
These compounds also include the sulfuric acid esters of fatty alcohol / ethylene oxide adducts and the salts of sulfonic acids. The sulfonated benzimidazole derivative preferably contains two sulfonic acid groups and one fatty acid group having 8 to 22 carbon atoms. Examples of alkylaryl sulfonates are the sodium, calcium or triethanolamine salts of dodecylbenzene sulfonic acid, dibutyl naphthalene sulfonic acid, or other rensulfonic acid / formaldehyde condensation products. Also suitable are corresponding phosphates, for example salts of the phosphoric acid ester of an adduct of p-nonylphenol with 4 to 14 moles of ethylene oxide.

【００８１】 非イオン性界面活性剤は、好ましくは、脂肪族または脂環式アルコールの、あ
るいは飽和または不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエー
テル誘導体であって、前記の誘導体は３〜30個のグリコールエーテル基および８
〜20個の炭素原子を（脂肪族）炭化水素部分に、そして６〜18個の炭素原子をア
ルキルフェノールのアルキル部分に含有する。The nonionic surfactant is preferably a polyglycol ether derivative of an aliphatic or cycloaliphatic alcohol, or of a saturated or unsaturated fatty acid and an alkyl phenol, said derivative comprising 3 to 30 glycols. Ether group and 8
It contains -20 carbon atoms in the (aliphatic) hydrocarbon moiety and 6-18 carbon atoms in the alkyl moiety of the alkylphenol.

【００８２】 さらに適切な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコール、エチレンジ
アミンプロピレングリコールおよびアルキル鎖に１〜10個の炭素原子を含有する
アルキルポリプロピレングリコールを伴うポリエチレンオキシドの水溶性付加物
であって、付加物は、20〜250 個のエチレングリコールエーテル基と10〜100 個
のプロピレングリコールエーテル基を含有する。これらの化合物は、通常は、１
〜５個のエチレングリコール単位／プロピレングリコール単位を含有する。Further suitable nonionic surfactants are water-soluble adducts of polyethylene oxide with polyethylene glycol, ethylene diamine propylene glycol and alkyl polypropylene glycol containing 1 to 10 carbon atoms in the alkyl chain, The adduct contains from 20 to 250 ethylene glycol ether groups and from 10 to 100 propylene glycol ether groups. These compounds usually contain 1
Contains ~ 5 ethylene glycol units / propylene glycol units.

【００８３】 非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール
、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付
加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール
およびオクチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソル
ビタンおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレエートの脂肪酸エステルも
適切な非イオン性界面活性剤である。Representative examples of nonionic surfactants are nonylphenol polyethoxyethanol, castor oil polyglycol ether, polypropylene / polyethylene oxide adduct, tributylphenoxypolyethoxyethanol, polyethylene glycol and octylphenoxyethoxyethanol. Polyoxyethylene sorbitan and fatty acid esters of polyoxyethylene sorbitan trioleate are also suitable nonionic surfactants.

【００８４】 陽イオン性界面活性剤は、好ましくは、Ｎ置換基として少なくとも１つのＣ8
〜Ｃ22のアルキル基と、さらに別の置換基として低級非置換またはハロゲン化ア
ルキル、ベンジルまたは低級ヒドロキシアルキル基を有する第四級アンモニウム
塩である。塩は、好ましくは、ハロゲン化物、メチルスルホネートまたはエチル
スルフェートの形態であり、例えばステアリルトリメチルアンモニウムクロリド
またはベンジルジ（２−クロロエチル）エチルアンモニウムブロミドである。The cationic surfactant preferably has at least one C 8 as an N substituent.
Quaternary ammonium salts having an alkyl group of -C22 and a lower unsubstituted or halogenated alkyl, benzyl or lower hydroxyalkyl group as another substituent. The salt is preferably in the form of a halide, methylsulphonate or ethylsulphate, for example stearyltrimethylammonium chloride or benzyldi (2-chloroethyl) ethylammonium bromide.

【００８５】 当処方業界で常用される界面活性剤は、例えば、“McCutcheon's Detergents
and Emulsifiers Annual, ” MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 197
9 、ならびにSisely and Wood,“Encyclopedia of Surface Active Agents,”Ch
emical Publishing Co., Inc. New York, 1980に記載されている。 実施例 以下の詳細な実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。これらの実施
例は、説明のためにのみ提供されたものであり、別記しない限り、本発明を限定
するよう意図されていない。ここで用いられる標準組換えＤＮＡおよび分子クロ
ーニング技術は当業界で周知であり、下記の文献に記載されている：Ausubel （
ed. ）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc
. （1994）; T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning
: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
, NY（1989）; およびT.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experim
ents with Gene Fusions, Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r, NY （1984）。Surfactants commonly used in the formulation industry include, for example, “McCutcheon's Detergents
and Emulsifiers Annual, ”MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 197
9 and Sisely and Wood, “Encyclopedia of Surface Active Agents,” Ch.
emical Publishing Co., Inc. New York, 1980. Examples The invention will be further described with reference to the following detailed examples. These examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention unless otherwise indicated. The standard recombinant DNA and molecular cloning techniques used herein are well known in the art and are described in the following references: Ausubel (
ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.
(1994); T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning.
: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
, NY (1989); and TJ Silhavy, ML Berman, and LW Enquist, Experim
ents with Gene Fusions, Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r, NY (1984).

【００８６】 Ａ．その発現が鱗翅目昆虫に対して活性な毒素を生じるヌクレオチド配列の単
離 実施例１：フォトラブドゥスルミネッセンスからのコスミドライブラリーの構
築 フォトラブドゥスルミネッセンスPhotorhabdus luminescens ATCC 29999株を
、バイオアッセイのためのATCCプロトコールに記載されているように、25℃で３
日間、栄養ブロス中で増殖させる。ＤＮＡ単離のために、培養を24時間増殖させ
る。100mM のトリスｐＨ８、10MmのEDTA中に再懸濁した新鮮な増殖化細胞を、2m
g/mlのリゾチームで、37℃で30分間処理することにより、総ＤＮＡを単離する。
プロテイナーゼＫを付加して最終濃度を100mg/mlとし、SDS を付加して、最終濃
度を0.5 ％SDS として、標本を45℃でインキュベートする。溶液が透明且つ粘着
性になった後に、SDS 濃度を１％に上げて、300mM のＮａＣｌおよび等容積のフ
ェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールを付加して、5 分間静かに混合
し、3Kで遠心分離する。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出
を２回反復する。水性相を0.7 容積のイソプロパノールと混合し、標本を遠心分
離する。ペレットを0.7 容積のエタノールで３回洗浄し、核酸を0.5XＴＥ中に静
かに再懸濁する。A. Isolation of a nucleotide sequence whose expression results in a toxin that is active against Lepidoptera insects Example 1: Construction of a cosmid library from photolabdusluminescence 3 ° C at 25 ° C as described in the ATCC protocol.
Grow in nutrient broth for days. The culture is grown for 24 hours for DNA isolation. Freshly grown cells resuspended in 100 mM Tris pH 8, 10 M EDTA were added to 2 mM
Total DNA is isolated by treatment with g / ml lysozyme at 37 ° C. for 30 minutes.
The sample is incubated at 45 ° C. with the addition of proteinase K to a final concentration of 100 mg / ml and SDS added to a final concentration of 0.5% SDS. After the solution becomes clear and sticky, increase the SDS concentration to 1%, add 300 mM NaCl and an equal volume of phenol-chloroform-isoamyl alcohol, mix gently for 5 minutes and centrifuge at 3K. . The phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction is repeated twice. The aqueous phase is mixed with 0.7 volumes of isopropanol and the specimen is centrifuged. The pellet is washed three times with 0.7 volumes of ethanol and the nucleic acid is gently resuspended in 0.5XTE.

【００８７】 ＤＮＡを、全量6mg のＤＮＡを含有する100ml 容積中で、0.3 単位のSau3A ／
ＤＮＡ１mgで、37℃で3.5 分間処理する。次に反応液を65℃で30分間加熱して、
酵素を不活性化する。次に２単位の仔ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼを付加
翅、37℃で30分間インキュベートする。標本を等容積のフェノール−クロロホル
ム−イソアミルアルコールと混合し、遠心分離する。水性相を取り出し、0.7 容
積のイソプロパノールで沈澱させて、遠心分離する。上清を新しい試験管に移し
、エタノールで沈澱させて、核酸を100hg/mlの濃度で0.5XＴＥ中に再懸濁させる
。The DNA was prepared in a 100 ml volume containing a total of 6 mg of DNA by 0.3 units of Sau3A /
Treat with 1 mg of DNA at 37 ° C for 3.5 minutes. Then heat the reaction at 65 ° C for 30 minutes,
Inactivate the enzyme. Next, 2 units of calf small intestine alkaline phosphatase are incubated at 37 ° C. for 30 minutes at the addition wing. The specimen is mixed with an equal volume of phenol-chloroform-isoamyl alcohol and centrifuged. The aqueous phase is removed, precipitated with 0.7 volumes of isopropanol and centrifuged. Transfer the supernatant to a new tube, precipitate with ethanol and resuspend the nucleic acid in 0.5XTE at a concentration of 100 hg / ml.

【００８８】 BamHI クローニング部位を利用して、供給元の説明通りに、スーパーコスSupe
rCosコスミドベクター（Stratagene, La Jolla, CA）を調製する。100hg/mlで調
製されたスーパーコスを、６℃で一夜、５ml容積中で２：１のモル比で、Sau3A
消化P. luminescensＤＮＡと結紮する。供給元の説明通りに、Gigapack XL III
（Stratagene）を用いて、結紮混合物をパッケージングする。パッケージされた
ファージを用いて、供給元の説明通りにXL-1MR（Stratagene）細胞に感染させる
。50mg/ml のカナマイシンを含有するＬ−寒天上にコスミドライブラリーをプレ
ート化して、37℃で16時間インキュベートする。500 コロニーを、新鮮なＬ−ka
n プレート上に、50コロニー／プレートで寄せ集める。他のプレートから、細胞
をＬブロスで洗い落として、20％グリセロールと混合し、−80℃で凍結させる。Using the BamHI cloning site, as described by the supplier,
Prepare an rCos cosmid vector (Stratagene, La Jolla, CA). Supercos, prepared at 100 hg / ml, was mixed with Sau3A at a molar ratio of 2: 1 in 5 ml volume at 6 ° C. overnight.
Ligation with digested P. luminescens DNA. Gigapack XL III as described by the supplier
Package the ligation mixture using (Stratagene). The packaged phage is used to infect XL-1 MR (Stratagene) cells as described by the supplier. The cosmid library is plated on L-agar containing 50 mg / ml kanamycin and incubated at 37 ° C for 16 hours. 500 colonies, fresh L-ka
n Collect 50 colonies / plate on plate. From another plate, wash the cells with L-broth, mix with 20% glycerol and freeze at -80 ° C.

【００８９】 実施例２：昆虫バイオアッセイ 固体人工コナガ飼料上での大腸菌培養の50μl のアリコート化により、コナガ（
Plutella xylostella)バイオアッセイを実施する（Biever and Boldt, Annals o
f Entomological Society of America, 1971; Shelton et al., J. Ent. Sci. 2
6:17）。4 mlの飼料を１ozの透明プラスチックカップ（Bioserve product #9051
）中に注ぎ入れる。飼料適合実験室コロニーからの５匹のコナガ新生幼虫を各飼
料含入カップに入れた後、白色紙製蓋（Bioserve product #9049）で覆う。10匹
の幼虫を濃度当たりで検定する。カップのトレーを、72゜Ｆで3 日間、14:10 （
時間）明：暗周期で、インキュベーター中に入れる。次に、各カップ中の製造幼
虫の数を記録する。コナガに関して記載したのと同様に、しかし試験される昆虫
に必要な飼料を用いて、他の昆虫に関するバイオアッセイを実施する。Example 2 Insect Bioassay A 50 μl aliquot of an E. coli culture on solid
Plutella xylostella) bioassay (Biever and Boldt, Annals o
f Entomological Society of America, 1971; Shelton et al., J. Ent. Sci. 2
6:17). Add 4 ml of feed to a 1 oz clear plastic cup (Bioserve product # 9051
Pour inside. Five new moth larvae from a feed-adapted laboratory colony are placed in each feed-containing cup and then covered with a white paper lid (Bioserve product # 9049). Ten larvae are assayed per concentration. Cup tray at 72 ゜ F for 3 days at 14:10 (
Time) Light: Put in incubator with dark cycle. Next, the number of manufactured larvae in each cup is recorded. Bioassays for the other insects are performed as described for the moth, but using the feed required for the insect being tested.

【００９０】 非稀釈および1:100 稀釈P. luminescensのブロスは、コナガに対して100 ％の
死亡率を生じる。 P. luminescens のブロスは、ウリハムシの一種のDiabrotica
virgifera virgiferaに対しても100 ％の死亡率を生じる。コナガおよびタバコ
ガ Heliothis virescensに対する活性を有する３つのクローンは、昆虫バイオア
ッセイにより500 の大腸菌クローンをスクリーニング後に得られる。これらのコ
スミドクローンは、pCIB9349、pCIB9350およびpCIB9351の番号を与えられる。Undiluted and 1: 100 diluted P. luminescens broths result in 100% mortality against Japanese moth. P. luminescens broth is Diabrotica
Virgifera Virgifera also produces 100% mortality. Three clones with activity against the moth and tobacco Heliothis virescens are obtained after screening 500 E. coli clones by insect bioassay. These cosmid clones are given the numbers pCIB9349, pCIB9350 and pCIB9351.

【００９１】 実施例３：クローンpCIB9349、pCIB9350およびpCIB9351からの昆虫制御活性に
関与するヌクレオチドの単離 ３つのクローンpCIB9349、pCIB9350およびpCIB9351は、制限酵素マッピングに
より重複コスミドであることが判明している。PacIで消化後、クローンpCIB9349
およびpCIB9351は各々２つのＤＮＡ断片を生じ、pCIB9350は３つのＤＮＡ断片を
生じる。各断片は単離され、自己結紮される。酵素PacIはスーパーコスベクター
を切断しない；したがって、それと連結した断片だけが再単離される。結紮混合
物をDH5 α大腸菌細胞中で形質転換する。単離形質転換細菌コロニーを、50μg/
mlのカナマイシンを含有するＬブロス中で増殖させ、Sambrook等が記載したよう
にアルカリ性ミニプレッププロトコールを用いることにより、プラスミドＤＮＡ
を単離する。ＤＮＡをNotI/PacI で消化し、２つのクローンpCIB9355およびpCIB
9356も、バイオアッセイにより、殺昆虫活性を含有することが見出される。クロ
ーンpCIB9355をNotIで消化すると、17 kb および4 kbＤＮＡ断片が生成される。
17 kb 断片を単離し、NotIで予め切断したBluescriptベクター中に結紮し、DH5
α大腸菌細胞中に形質転換する。単離形質転換細菌コロニーを前記と同様に増殖
させて、アルカリ性ミニプレッププロトコールによりプラスミドＤＮＡを単離す
る。17 kb 挿入物を含有するクローンはpCIB9359と呼ばれ、バイオアッセイによ
り検査される。結果を焦れ５に示す。3 μg の17 kb 挿入物を単離し、0.3 単位
のSau3A ／ＤＮＡ１μg で、37℃で4 、6 および8 分間処理し、75℃で15分間加
熱する。標本をプールし、BamHI で予め切断されたpUC19 に結紮して、仔ウシ小
腸アルカリ性ホスファターゼで処理する。結紮物をDH5 α細胞中に形質転換し、
Sambrook等が記載したようにXgaI/Ampを含有するＬ寒天上でプレート化して、37
℃で一夜増殖させる。白色コロニーを摘み取って、100 μg/mlを含有するＬブロ
ス中で増殖させて、前記と同様にプラスミドＤＮＡを単離する。ＤＮＡをEcoRI/
HindIII で消化し、新規の制限パターンをシーケンシングする。シーケンシング
プライマーをGenosys Biotechnologies （Woodlands, TX ）から注文する。チェ
インターミネーター法を用いて、シーケンシングを実施する。Applied Biosyste
ms Inc。377 型自動ＤＮＡシーケンサー（Foster City, CA ）を用いて、シーケ
ンシングを完了する。Gene Codes Corporation（Ann Arbor, MI ）からの3.0 を
用いて、配列を組み立てる。Example 3: Isolation of nucleotides involved in insect control activity from clones pCIB9349, pCIB9350 and pCIB9351 The three clones pCIB9349, pCIB9350 and pCIB9351 were found to be overlapping cosmids by restriction enzyme mapping. After digestion with PacI, clone pCIB9349
And pCIB9351 each yield two DNA fragments, and pCIB9350 yields three DNA fragments. Each fragment is isolated and self-ligated. The enzyme PacI does not cut the Supercos vector; therefore, only the fragment ligated thereto is re-isolated. The ligation mixture is transformed into DH5α E. coli cells. The isolated transformed bacterial colonies were
Growth in L-broth containing ml kanamycin and plasmid DNA by using the alkaline miniprep protocol as described by Sambrook et al.
Is isolated. The DNA was digested with NotI / PacI and the two clones pCIB9355 and pCIB
9356 is also found to contain insecticidal activity by bioassay. Digestion of clone pCIB9355 with NotI produces 17 kb and 4 kb DNA fragments.
A 17 kb fragment was isolated, ligated into Bluescript vector previously cut with NotI, and DH5
Transform into α E. coli cells. The isolated transformed bacterial colonies are grown as above and the plasmid DNA is isolated by the alkaline miniprep protocol. The clone containing the 17 kb insert is called pCIB9359 and is tested by bioassay. The results are shown in Burn 5. 3 μg of the 17 kb insert is isolated, treated with 0.3 units of 1 μg of Sau3A / DNA at 37 ° C. for 4, 6 and 8 minutes and heated at 75 ° C. for 15 minutes. Specimens are pooled, ligated into pUC19 pre-cut with BamHI and treated with calf intestinal alkaline phosphatase. Transforming the ligature into DH5α cells,
Plate on L agar containing XgaI / Amp as described by Sambrook et al.
Grow overnight at ° C. White colonies are picked and grown in L-broth containing 100 μg / ml, and plasmid DNA is isolated as described above. EcoRI / DNA
Digest with HindIII and sequence the new restriction pattern. Sequencing primers are ordered from Genosys Biotechnologies (Woodlands, TX). Sequencing is performed using the chain terminator method. Applied Biosyste
ms Inc. Sequencing is completed using a Type 377 automated DNA sequencer (Foster City, CA). Assemble the sequence using 3.0 from Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI).

【００９２】 実施例４：pCIB9359からの9.7 kb EcoRI/XbaI 断片のサブクローニング pCIB9359をEcoRI およびXbaIで消化し、ＤＮＡを0.8 ％シープラーク／ＴＢＥ
ゲル上で動かした。9.7 kb断片（配列番号１）を単離し、EcoRI およびXbaIで予
め消化しておいたpUC19 中に結紮した。結紮混合物をDH5 α大腸菌細胞中で形質
転換させた。形質転換細菌を増殖し、プラスミドＤＮＡを前記と同様に単離した
。 pUC19中の9.7 kb断片を含有するベクターをpCIB9359-7と命名し、バイオアッ
セイ結果を実施例５に示す。Example 4: Subcloning of 9.7 kb EcoRI / XbaI fragment from pCIB9359 pCIB9359 was digested with EcoRI and XbaI and the DNA was 0.8% sea plaque / TBE
Run on gel. A 9.7 kb fragment (SEQ ID NO: 1) was isolated and ligated into pUC19 that had been previously digested with EcoRI and XbaI. The ligation mixture was transformed into DH5α E. coli cells. The transformed bacteria were grown and plasmid DNA was isolated as described above. The vector containing the 9.7 kb fragment in pUC19 was named pCIB9359-7 and the bioassay results are shown in Example 5.

【００９３】 実施例５：コスミドクローンpCIB9359oyおよびpCIB9359-7に関するバイオアッ
セイ結果 クローンpCIB9359およびpCIB9359-7をそれぞれ含有する大腸菌9359および9359
-7の培養を、昆虫バイオアッセイにおいて、以下の昆虫に対する殺昆虫活性に関
して検査する。Example 5: Bioassay results for cosmid clones pCIB9359oy and pCIB9359-7 E. coli 9359 and 9359 containing clones pCIB9359 and pCIB9359-7, respectively
-7 are tested in an insect bioassay for insecticidal activity against the following insects:

【００９４】[0094]

【表１】 [Table 1]

【００９５】 クローンは、コナガ、タバコガ、オオタバコガ、イラクサキンウワバおよびア
ワノメイガに対しては殺昆虫活性を、そしてシロイチモンジヨトウおよびシロナ
ヨトウに対しては有意の昆虫制御活性を示す。 実施例６：サブクローニングによるpCIB9359-7の活性領域の同定 pCIB9359-7のサブクローンを含有する大腸菌株の培養を、コナガP. xylostell
a に対する昆虫バイオアッセイにおいて殺昆虫活性に関して検査する。The clones show insecticidal activity against moth moth, tobacco moth, Helicoverpa armigera, nettle moth and A. litura, and significant insect control activity against Syringa serrata and Scotch. Example 6: Identification of the active region of pCIB9359-7 by subcloning Culture of an E. coli strain containing the pCIB9359-7 subclone was performed using P. xylostell
Test for insecticidal activity in an insect bioassay for a.

【００９６】[0096]

【表２】 [Table 2]

【００９７】 実施例７：滴定によるpCIB9359-7昆虫制御活性の特性化 pCIB9359-7を含有する大腸菌9359-7株の培養の稀釈液を、昆虫バイオアッセイ
において殺昆虫活性に関して検査する。稀釈液を、総容積100 μl 中の大腸菌XL
-1の培養で調製し、１カップ当たり昆虫５匹の割合で飼料カップに移す。結果は
、昆虫死亡率のパーセンテージ（％）を示す。Example 7: Characterization of pCIB9359-7 insect control activity by titration Dilutions of a culture of E. coli 9359-7 containing pCIB9359-7 are tested for insecticidal activity in an insect bioassay. E. coli XL in a total volume of 100 μl
-1 and transferred to feed cups at a rate of 5 insects per cup. The results show the percentage of insect mortality (%).

【００９８】[0098]

【表３】 [Table 3]

【００９９】 大腸菌9359-7の培養は、稀釈後も依然として実質的殺昆虫活性を示す。 実施例８：pCIB9359-7活性の安定性 毒素の安定性を、異なる温度および条件で２週間保存後に、検査する。100 μ
g/mlのアンピシリンを含有する300ml の幼虫ブロスを大腸菌9359-7株に接種し、
37℃で一夜増殖させる。標本を滅菌15mlねじ蓋付管に入れ、22℃および4 ℃で保
存する。別の標本を遠心分離し、上清を除去して、凍結乾燥し、22℃で保存する
。標本をこれらの条件下で２週間保存した後、コナガに対してバイオアッセイを
実行する。凍結乾燥物質を依然と同一容積中に再懸濁する。全標本を攪拌しなが
ら再懸濁する。The culture of E. coli 9359-7 still shows substantial insecticidal activity after dilution. Example 8: Stability of pCIB9359-7 activity The stability of the toxin is tested after storage for two weeks at different temperatures and conditions. 100 μ
E. coli 9359-7 strain was inoculated with 300 ml larval broth containing g / ml ampicillin,
Grow overnight at 37 ° C. Specimens are placed in sterile 15 ml screw cap tubes and stored at 22 ° C and 4 ° C. Another specimen is centrifuged, the supernatant is removed, lyophilized and stored at 22 ° C. After storing the specimens under these conditions for two weeks, the bioassay is performed on the Japanese moth. The lyophilized material is still resuspended in the same volume. Resuspend all samples with agitation.

【０１００】[0100]

【表４】 [Table 4]

【０１０１】 これは、22℃、4 ℃および凍結乾燥で少なくとも２週間、毒素がそれらの活性
を保持し、したがって非常に安定であることを実証する。 実施例９：pCIB9359-7活性のサイズ分別 殺昆虫毒素のおよそのサイズを確定する。大腸菌宿主DH5 α中のP. luminesce
nsコスミドクローンpCIB9359-7およびpUC19 を、50％Terrificブロスおよび50％
ルリアブロスを含有し、50μg/mlのアンピシリンを補充した培地中で増殖させる
。培養（各株の３本の試験管）を培養試験管中の３mlの前記培地中に接種して、
37℃で一夜、ローラーホイール上でインキュベートする。各菌株の培養を併合し
、Branson 450 型音波処理機、マイクロチップを用いて、10秒周期で、周期間に
氷上で冷却しながら約６回、音波処理する。音波処理物をSorvall SS34ローター
で6000RPM で10分間遠心分離する。その結果生じる上清を0.2 μのフィルターを
通して濾過する。濾液の3ml 分画を、10mlの50mMのＮａＣｌ、25mMのトリスベー
ス、ｐＨ7.0 で予め平衡させておいたBio-Rad Econo-Pac 10DGカラムに適用する
。標本投入中に収集されたフロースルーを廃棄する。ＮａＣｌ−トリス平衡緩衝
液各4ml をその後付加しながら、標本を分別する。２つの4ml 分画を、検査用に
取っておく。第一分画は、約6,000 重量ｍｏｌより大きいすべての物質を含有す
る。第二分画は、6,000 重量ｍｏｌより小さい物質を含有する。全培養ブロス、
音波処理物および音波処理物上の濾過上清の標本を、10DGかラムからの３つの分
画とともに、バイオアッセイで、コナガ新生幼虫に及ぼす活性に関して検査する
。This demonstrates that the toxins retain their activity for at least 2 weeks at 22 ° C., 4 ° C. and lyophilization and are therefore very stable. Example 9: Size fractionation of pCIB9359-7 activity The approximate size of the insecticidal toxin is determined. P. luminesce in E. coli host DH5α
The ns cosmid clones pCIB9359-7 and pUC19 were replaced with 50% Terrific broth and 50%
Grow in medium containing luria broth and supplemented with 50 μg / ml ampicillin. Cultures (3 tubes of each strain) were inoculated into 3 ml of the medium in culture tubes,
Incubate on roller wheel at 37 ° C overnight. The cultures of each strain are combined and subjected to sonication using a Branson 450 type sonicator and microchip at a cycle of 10 seconds for about 6 times while cooling on ice during the cycle. The sonicates are centrifuged at 6000 RPM for 10 minutes in a Sorvall SS34 rotor. The resulting supernatant is filtered through a 0.2 μ filter. The 3 ml fraction of the filtrate is applied to a Bio-Rad Econo-Pac 10DG column pre-equilibrated with 10 ml of 50 mM NaCl, 25 mM Tris base, pH 7.0. Discard the flow-through collected during sample loading. Specimens are sorted while subsequently adding 4 ml each of NaCl-Tris equilibration buffer. Two 4 ml fractions are set aside for testing. The first fraction contains all substances greater than about 6,000 weight mol. The second fraction contains less than 6,000 mol mol by weight. Whole culture broth,
The sonicate and a sample of the filtered supernatant on the sonicate, along with three fractions from 10DG or ram, are tested in a bioassay for activity on the newborn moth larvae.

【０１０２】 培養、音波処理物および音波処理物の濾過上清、ならびに9359-7標本からの第
一カラム分画は、コナガに関して高活性である。9359-7からの第二カラム分画は
、わずかに活性である（多少の阻止のみ）。9359-7からの第三分画には、活性は
見出されない。DH5-pUC19 からの標本は、いかなる活性も有さない。これは、毒
素の分子量が約6,000 であることを示す。The cultures, sonicates and filtered supernatants of the sonicates, as well as the first column fractions from 9359-7 specimens, are highly active with Conger. The second column fraction from 9359-7 is slightly active (only some inhibition). No activity is found in the third fraction from 9359-7. Specimens from DH5-pUC19 do not have any activity. This indicates that the molecular weight of the toxin is about 6,000.

【０１０３】 実施例１０：pCIB9359-7活性の熱不活性化 毒素の熱安定性を確定する。大腸菌pCIB9359-7株の一夜培養を、ルリアブロス
とTerrificブロスの50:50 混合物中で増殖させる。培養は、試験管ローラー上の
培養管中で37℃で増殖させる。培養の1ml 標本を1.5ml エッペンドルフ管中に入
れ、沸騰水浴中に入れる。５分後に標本を取り出して、室温に冷却させる。この
標本を培養の未処理部分と一緒に、コナガに関して検定する。50μl の標本を飼
料上に散布して乾燥させ、コナガの新生幼虫を表面に適用する。検定物を室温で
５日間インキュベートする。Example 10: Heat inactivation of pCIB9359-7 activity The toxin thermostability is determined. An overnight culture of E. coli strain pCIB9359-7 is grown in a 50:50 mixture of Luria Broth and Terrific Broth. Cultures are grown at 37 ° C. in culture tubes on test tube rollers. A 1 ml specimen of the culture is placed in a 1.5 ml Eppendorf tube and placed in a boiling water bath. After 5 minutes the specimen is removed and allowed to cool to room temperature. The specimen, along with the untreated portion of the culture, is assayed for P. occidentalis. 50 μl of the specimen are sprayed on the feed, dried and the new moth larvae of Plutella are applied to the surface. Incubate the assay at room temperature for 5 days.

【０１０４】 未処理標本は、100 ％の死亡率を生じる。熱処理標本および飼料単独対照は、
観察可能な死亡率を何も生じない。これは、毒素が熱感受性であることを示す。 実施例１１：pCIB9359-7の葉浸漬バイオアッセイ 毒素の殺昆虫活性を葉浸漬バイオアッセイで検査する。直径約２cmの６枚の葉
の各々をカブの若木から切り取り、4ml 〜5ml の再懸濁毒素を含入する1oz プラ
スチックカップ（Jet Plastica）に入れて、ぴったり被覆し、十分に湿るまで振
盪する。処理葉を、300 μl の水で湿らせた吸収パッド上の50mmペトリ皿（Gelm
an Sciences ）中に入れる。葉の表面が乾燥したように見えるまで皿のカバーを
開けたままにしておいて、次に葉が乾燥しないようにしっかりカバーを載せる。Untreated specimens produce 100% mortality. Heat treated specimens and feed alone control
It produces no observable mortality. This indicates that the toxin is heat sensitive. Example 11: Leaf dipping bioassay of pCIB9359-7 The insecticidal activity of the toxin is tested in a leaf dipping bioassay. Each of the six leaves, about 2 cm in diameter, is cut from the turnip saplings and placed in a 1 oz plastic cup (Jet Plastica) containing 4-5 ml of resuspended toxin, covered tightly and shaken until moist enough. I do. Treat leaves with a 50 mm Petri dish (Gelm) on an absorbent pad moistened with 300 μl water.
an Sciences). Leave the dish cover open until the leaf surface appears dry, and then place the cover firmly on to prevent the leaf from drying.

【０１０５】 １０匹のコナガ新生幼虫を各ペトリ皿試験場に入れる。さらに、毒素を含有し
ない0.1 ％Bond展着剤/ 固着剤の処理を、対照として供給する。試験場を、葉の
乾燥徴候に関して毎日モニタリングし、水を付加するか、または必要な場合には
葉を取り換える。３日後、葉および試験場を解剖顕微鏡下で検査して、各試験場
中の生存幼虫の数を記録する。[0105] Ten new moth larvae are placed in each Petri dish test station. In addition, a 0.1% Bond spreader / fixer treatment without toxin is provided as a control. The test site is monitored daily for signs of leaf dryness and water is added or leaves are replaced if necessary. Three days later, the leaves and test fields are examined under a dissecting microscope and the number of live larvae in each test field is recorded.

【０１０６】 9359-7に関しては100 ％の死亡率が見出されるが、毒素を含有しない対照では
認められず、これは、毒素が葉浸漬検定においても殺昆虫製であることを示す。 Ｂ．その発現が鱗翅目および鞘翅目昆虫に対して活性な毒素を生じる核酸配列
の単離 実施例１２：フォトラブドゥスルミネッセンスからの総ＤＮＡ単離 フォトラブドゥスルミネッセンスPhotorhabdus luminescens ATCC 29999株を
、Ｌブロス中で14〜18時間増殖させる。100 μg/mlプロテイナーゼＫを含有し、
ＴＥで最終容積600 μl とした0.5 ％SDS 中に再懸濁した培養1.5ml から、総Ｄ
ＮＡを単離する。37℃で１時間インキュベーション後、100 μl の5MＮａＣｌお
よび80μｌのCTAB／ＮａＣｌを付加し、培養を65℃で10分間インキュベートする
。等容積のクロロホルムを付加し、培養を静かにかき回しながら混合する。水性
相をフェノールで１回、クロロホルムで１回抽出する。核酸を10μg のＲＮアー
ゼＡで室温で30分間処理する。水性相を0.6 容積のイソプロパノールと混合し、
標本を遠心分離する。ペレットを70％エタノールで１回洗浄し、核酸を100 〜20
0ul のＴＥ中に静かに再懸濁する。A 100% mortality was found for 9359-7, but not in the control containing no toxin, indicating that the toxin was also insecticidal in the leaf soak assay. B. Isolation of Nucleic Acid Sequences whose Expression Generates Toxins Active against Lepidoptera and Coleoptera Insects Example 12: Total DNA Isolation from Photolabdusluminescence Photolabhasduluminescens ATCC 29999 strain in L-broth And grow for 14-18 hours. Containing 100 μg / ml proteinase K,
From 1.5 ml of culture resuspended in 0.5% SDS to a final volume of 600 μl with TE, total D
Isolate NA. After 1 hour incubation at 37 ° C., 100 μl of 5 M NaCl and 80 μl of CTAB / NaCl are added and the culture is incubated at 65 ° C. for 10 minutes. Add an equal volume of chloroform and mix while gently stirring the culture. The aqueous phase is extracted once with phenol and once with chloroform. The nucleic acids are treated with 10 μg of RNase A for 30 minutes at room temperature. The aqueous phase is mixed with 0.6 volumes of isopropanol,
Centrifuge the specimen. Wash the pellet once with 70% ethanol and remove nucleic acids from 100 to 20
Gently resuspend in 0 ul TE.

【０１０７】 実施例１３：プローブのＰＣＲ増幅 プローブ＃１を増幅するためにオリゴ5'-ACACAGCAGGTTCGTCAG-3'（配列番号７
）および5'-GGCAGAAGCACTCAACTC-3'（配列番号８）を用いて、そしてプローブ＃
２を増幅するためにオリゴ5'-ATTGATAGCACGCGGCGACC-3'（配列番号９）および5'
-TTGTAACGTGGAGCCGAACTGG-3'（配列番号１０）を用いて、フォトラブドゥスルミ
ネッセンスPhotorhabdus luminescens ATCC 29999株ゲノムＤＮＡから、２つの
プローブをＰＣＲ増幅する。オリゴはGenosys Biotechnologies, Inc. （Texas
）に注文する。約10〜50ngのゲノムＤＮＡを鋳型として用いる。0.8 μM のオリ
ゴ、200 μM のｄＮＴＰ、1Xtaq ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液および2.5 単位のTa
q ＤＮＡポリメラーゼが反応液中に含まれる。反応条件を以下に示す： 94℃−1 分 94℃− 30 秒／60℃−30秒／72℃−30秒（25周期） 72℃−5 分 4 ℃−不定時間浸漬 反応は、好ましくは、ＰＣＲ系9600（Perkin Elmer）サーモサイクラーで実行す
る。Example 13: PCR amplification of probe Oligo 5'-ACACAGCAGGTTCGTCAG-3 '(SEQ ID NO: 7) to amplify probe # 1
) And 5′-GGCAGAAGCACTCAACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 8) and probe #
Oligo 5'-ATTGATAGCACGCGGCGACC-3 '(SEQ ID NO: 9) and 5' to amplify 2
Two probes are PCR-amplified from genomic DNA of Photorhabdus luminescens ATCC 29999 strain using -TTGTAACGTGGAGCCGAACTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 10). Oligos are available from Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas
) To order. About 10-50 ng of genomic DNA is used as a template. 0.8 μM oligo, 200 μM dNTPs, 1 × taq DNA polymerase buffer and 2.5 units Ta
q DNA polymerase is contained in the reaction solution. The reaction conditions are as follows: 94 ° C-1 minute 94 ° C-30 seconds / 60 ° C-30 seconds / 72 ° C-30 seconds (25 cycles) 72 ° C-5 minutes 4 ° C-Immersion for an indefinite period Run on PCR system 9600 (Perkin Elmer) thermocycler.

【０１０８】 実施例１４：フォトラブドゥスルミネッセンスライブラリーのプロービング 実施例１で記載したP. luminescensコスミドライブラリーからの600 クローン
を、２回、Ｌ−amp プレートに寄せ集める。コロニーを一夜増殖させた後、4 ℃
に移す。：にをコロニー／プラークスクリーンハイブリダイゼーショントランス
ファー膜（Biotechnology Systems NEN Research Products ）上に載せる。膜を
、0.75mlの0.5NＮａＯＨ中で２〜３分間、２回インキュベートする。次に、膜を
、0.75mlの1.0Mトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5 中で２〜３分間、２回インキュベート
する。膜を室温で乾燥させる。Example 14: Probing a Photolab Doss Luminescence Library 600 clones from the P. luminescens cosmid library described in Example 1 are pooled twice on L-amp plates. After growing the colonies overnight, 4 ° C
Transfer to : Place on a colony / plaque screen hybridization transfer membrane (Biotechnology Systems NEN Research Products). The membrane is incubated twice in 0.75 ml of 0.5N NaOH for 2-3 minutes. The membrane is then incubated twice for 2-3 minutes in 0.75 ml of 1.0 M Tris-HCl, pH 7.5. The membrane is dried at room temperature.

【０１０９】 実施例１３で記載したプローブ＃１およびプローブ＃２を、メーカーの説明（
Ambionカタログ＃1455）通りに、DECAプライムIIキットを用いて標識する。メー
カーの説明（Boehringer Mannheim カタログ＃1273973 ）通りに、クイックスピ
ンカラムを用いて、非組入ヌクレオチドを標識化プローブから除去する。標識化
プローブを取り込まれた放射能に関して測定する。特異的活性は、10,000,000cp
m である。膜を2XSSC で予め湿らせて、65℃で12〜16時間、プローブとハイブリ
ダイズさせる。１組のコロニーリフトをプローブ＃１とハイブリダイズさせ、他
方の組をプローブ＃２とハイブリダイズさせる。膜をCHURCH洗浄溶液１および２
（Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 （1984））
で洗浄して、コダックフィルムに曝露させる。The probe # 1 and the probe # 2 described in Example 13 were replaced by the description of the manufacturer (
Label with DECA Prime II kit as per Ambion catalog # 1455). Non-incorporated nucleotides are removed from the labeled probe using a quick spin column as described by the manufacturer (Boehringer Mannheim catalog # 1273973). The labeled probe is measured for incorporated radioactivity. Specific activity is 10,000,000 cp
m. The membrane is pre-wetted with 2XSSC and hybridized with the probe at 65 ° C for 12-16 hours. One set of colony lifts is hybridized with probe # 1 and the other set is hybridized with probe # 2. Clean membrane with CHURCH cleaning solution 1 and 2
(Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984))
And exposed to Kodak film.

【０１１０】 ２１のコロニーはプローブ＃１とハイブリダイズすることが確認され、７コロ
ニーはプローブ＃２とハイブリダイズすることが確認された。プローブ＃１を用
いて単離されるコロニー中の遺伝子はhph1と命名され、プローブ＃２を用いて単
離されるコロニー中の遺伝子はhph2と命名される。 実施例１５：昆虫バイオアッセイ 実施例１４で同定したクローンを、昆虫バイオアッセイにおいて、以下の昆虫
に対する殺昆虫活性に関して検査する：Diabrotica virgifera virgifera（ウリ
ハムシの一種（WCR ））、Diabrotica undecimpunctata howardi（ウリハムシの
一種（SCR ））、 Ostrinia nubilalis （アワノメイガ（ECB ））およびPlutel
la xylostella （コナガ（DBM ））。It was confirmed that 21 colonies hybridized with the probe # 1, and 7 colonies hybridized with the probe # 2. The gene in the colony isolated using probe # 1 is named hph1, and the gene in the colony isolated using probe # 2 is named hph2. Example 15: Insect bioassay The clones identified in Example 14 are tested in an insect bioassay for insecticidal activity against the following insects: Diabrotica virgifera virgifera (Wheat leaf beetle (WCR)), Diabrotica undecimpunctata howardi. (SCR), Ostrinia nubilalis (ECB) and Plutel
la xylostella (Konaga (DBM)).

【０１１１】 Diabrotica virgifera virgifera（ウリハムシの一種（WCR ））、Diabrotica
undecimpunctata howardi（ウリハムシの一種（SCR ））検定は、飼料混入法を
用いて実施する。XL-1 Blue MR細胞（Stratagene）中のコスミドライブラリーの
一夜培養500 μl を音波処理し、次に500 μl の飼料と混合する。飼料が固化し
たら、それをペトリ皿中に分配して、20匹の幼虫を飼料の上に導入する。皿のト
レーをインキュベーター中に３〜５日間入れて、検定期間の終了時に死亡率（％
）を記録する。Diabrotica virgifera virgifera (a kind of beetle beetle (WCR)), Diabrotica
The test for undecimpunctata howardi (Spotted beetle (SCR)) is carried out using a feed mixing method. Sonicate 500 μl of overnight culture of the cosmid library in XL-1 Blue MR cells (Stratagene) and then mix with 500 μl of feed. Once the feed has solidified, it is dispensed into petri dishes and 20 larvae are introduced onto the feed. Place the dish trays in the incubator for 3-5 days, and at the end of the assay period mortality (%
).

【０１１２】 Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）およびPlutella xylostella （コナガ）
検定は、表面処理法により実施する。飼料をペトリ皿に注ぎ入れ、それを固化さ
せる。200 〜300 μl 容積の大腸菌培養を飼料表面に分配し、全飼料表面を覆っ
て、細菌ループを補助的に用いて、培養を広げる。表面が乾燥したら、１０匹の
幼虫を飼料表面に導入する。皿のトレーをインキュベーター中に３〜５日間入れ
る。アワノメイガを用いた検定物を、完全暗所で30℃でインキュベートする。コ
ナガを用いた検定物は、72゜Ｆで14:10 （時間）明：暗周期でインキュベートす
る。検定期間終了時に、死亡率（％）を記録する。[0112] Ostrinia nubilalis and Plutella xylostella
The test is performed by a surface treatment method. Pour the feed into a Petri dish and allow it to solidify. A 200-300 μl volume of E. coli culture is distributed on the feed surface, covering the entire feed surface and expanding the culture with the aid of a bacterial loop. When the surface is dry, 10 larvae are introduced to the feed surface. Place dish tray in incubator for 3-5 days. Incubate the Assay with Awanomeiga at 30 ° C. in complete darkness. Assays using Konaga are incubated at 72 ° F with a 14:10 (hours) light: dark cycle. At the end of the test period, record the mortality (%).

【０１１３】 hph2を含有するコスミドを、一連の活性：例えばWCR のみ；SCR のみ；WCR お
よびSCR;SCR およびECB; WCR、SCR およびECB;あるいはWCR 、SCR 、ECB および
DBM 活性に関して同定する。 ＤＮＡプローブを用いてP. luminescensコスミドライブラリーをプロービング
する他に、ウリハムシ（WCR ）バイオアッセイにより、600 クローンをスクリー
ニングする。ウリハムシ（WCR ）に対する活性を用いて、クローンを同定する。
クローンはプローブ＃２とハイブリダイズする。The cosmids containing hph2 were tested for a series of activities: for example WCR only; SCR only; WCR and SCR; SCR and ECB; WCR, SCR and ECB; or WCR, SCR, ECB and
Identify for DBM activity. In addition to probing the P. luminescens cosmid library with a DNA probe, 600 clones are screened by the rice beetle (WCR) bioassay. Clones are identified using their activity against rice beetle (WCR).
The clone hybridizes with probe # 2.

【０１１４】 これらのバイオアッセイから、WCR 、SCR 、ECB およびDBM に対する活性を有
するコスミド514 が、シーケンシングのために選択される。 実施例１６：コスミド514 のシーケンシング ABI377計器上での染料ターミネーター化学を用いて、コスミド514 をシーケン
シングする。コスミド514 のヌクレオチド配列は、配列番号１１として記述され
る。コスミド514 はpNOV2400と呼ばれ、大腸菌中でNRRLに寄託され、寄託番号は
B-30077 である。From these bioassays, cosmid 514, which has activity against WCR, SCR, ECB and DBM, is selected for sequencing. Example 16: Sequencing of Cosmid 514 Cosmid 514 is sequenced using dye terminator chemistry on an ABI377 instrument. The nucleotide sequence of cosmid 514 is set forth as SEQ ID NO: 11. Cosmid 514, called pNOV2400, has been deposited with NRRL in E. coli and has a deposit number of
B-30077.

【０１１５】 実施例１７：コスミド514 の殺昆虫領域のサブクローニング 514a コスミド514 内の9011塩基対断片（配列番号１１）は、制限酵素SpeI（New En
gland Biolabs （Massachusetts ））でコスミドを消化し、残りの514 を結紮（
T4ＤＮＡリガーゼ, NEB ）することにより取り出される。サブクローン514aは、
塩基対11,169-37,948 と結紮された塩基対1-2157からのコスミド514 ＤＮＡから
成る。Example 17: Subcloning of the insecticidal region of cosmid 514 514a The 9011 base pair fragment in cosmid 514 (SEQ ID NO: 11) was constructed using the restriction enzyme SpeI (New En
gland Biolabs (Massachusetts)), digest the cosmid and ligate the remaining 514
T4 DNA ligase, NEB). Subclone 514a
Consists of cosmid 514 DNA from base pairs 1-2157 ligated to base pairs 11,169-37,948.

【０１１６】 Ｈ2 Ｏ2 ／pET34 hph2およびort2（配列番号１１、塩基対23,768-35,838 ）をpET34b（Novagen, Wisconsin）中にクローン化する。制限部位を各遺伝子の両端で工学処理して、
クローニングを促す。ＰＣＲを用いて制限部位を遺伝子に付加する。BamHI 部位
は、hph2のＡＴＧのすぐ上流のhph2の5'末端にあり、SacI部位は、停止コドンを
コードするＤＮＡトリプレットの直後のhph2の3'末端に付加される。BamHI 部位
とhph2の開始コドンとの間にグアニジンが付加されて、pET34b中のセルロース結
合ドメインタグを有する枠内にhph2遺伝子を置く。Ort2は、hph2の停止コドンと
orf2の開始コドンとの間の56塩基対の上流にSacI部位を有する。56塩基対はhph2
-orf2 構築物中に含まれて、514 コスミド中のそれらの構成を模倣する。orf2は
、停止コドン直後の3'末端にXhoI部位を有する。制限部位をhph2およびorf2に付
加するために用いられるオリゴを以下に示す： hph2-A 5'-CGGGATCCGATGATTTTAAAAGG-3'（配列番号１５） hph2-B 5'-GCGCCATTGATTTGAG-3' （配列番号１６） hph2-C 5'-CATTAGAGGTCGAACGTAC-3'（配列番号１７） hph2-D 5'-GAGCGAGCTCTTACTTAATGGTGTAG-3' （配列番号１８） orf2-A3 5'-CAGCGAGCTCCATGCAGAATTCACAGAC-3' （配列番号１９） orf2-B 5'-GGCAATGGCAGCGATAAG-3' （配列番号２０） orf2-C 5'-CATTAACGCAGGAAGAGC-3' （配列番号２１） orf2-D 5'-GACCTCGAGTTACACGAGCGCGTCAG-3' （配列番号２２） hph2遺伝子に対応するBamHI-SacI 7583 塩基対断片およびorf2に対応するSacI
-XhoI 4502塩基対orf2（hph2およびorf2開放読取枠間の56塩基対を含む）をBamH
I-XhoI消化ベクターＤＮＡ pET34bと結紮する。The H 2 O 2 / pET34 hph2 and ort2 (SEQ ID NO: 11, base pairs 23,768-35,838) are cloned into pET34b (Novagen, Wisconsin). Engineering restriction sites at both ends of each gene,
Encourage cloning. Restriction sites are added to the gene using PCR. A BamHI site is at the 5 'end of hph2, just upstream of the ATG of hph2, and a SacI site is added at the 3' end of hph2, immediately after the DNA triplet encoding the stop codon. Guanidine is added between the BamHI site and the start codon of hph2 to place the hph2 gene in frame with the cellulose binding domain tag in pET34b. Ort2 with hph2 stop codon
It has a SacI site upstream of 56 base pairs between the start codon of orf2. 56 base pairs is hph2
-orf2 Included in the construct to mimic their composition in 514 cosmids. orf2 has an XhoI site at the 3 'end immediately after the stop codon. Oligos used to add restriction sites to hph2 and orf2 are shown below: hph2-A 5'-CGGGATCCGATGATTTTAAAAGG-3 '(SEQ ID NO: 15) hph2-B 5'-GCGCCATTGATTTGAG-3' (SEQ ID NO: 16) hph2 -C 5'-CATTAGAGGTCGAACGTAC-3 '(SEQ ID NO: 17) hph2-D 5'-GAGCGAGCTCTTACTTAATGGTGTAG-3' (SEQ ID NO: 18) orf2-A3 5'-CAGCGAGCTCCATGCAGAATTCACAGAC-3 '(SEQ ID NO: 19) orf2-B 5'- GGCAATGGCAGCGATAAG-3 '(SEQ ID NO: 20) orf2-C 5'-CATTAACGCAGGAAGAGC-3' (SEQ ID NO: 21) orf2-D 5'-GACCTCGAGTTACACGAGCGCGTCAG-3 '(SEQ ID NO: 22) BamHI-SacI 7583 base pairs corresponding to the hph2 gene SacI corresponding to fragment and orf2
-XhoI 4502 bp orf2 (including 56 bp between hph2 and orf2 open reading frame) to BamH
Ligation with I-XhoI digested vector DNA pET34b.

【０１１７】 Orf5/pBS（NotI-BamHI） コスミド514 の5325塩基対NotI-BamHI断片を、pBS-SKのAflIII-NotI （415bp
）およびBamHI-AflIII（2530bp）断片を用いて、pBS-SK中にクローン化した。 O5-H2-O2 H2O2/pET34の12,031塩基対BamHI-XhoI断片を、Orf5/pBSの8220塩基対XhoI-Bam
HI断片中にクローン化した。Orf5 / pBS (NotI-BamHI) The 5325 base pair NotI-BamHI fragment of cosmid 514 was replaced with the AflIII-NotI (415 bp) of pBS-SK.
) And the BamHI-AflIII (2530 bp) fragment were cloned into pBS-SK. The 12,031 base pair BamHI-XhoI fragment of O5-H2-O2 H2O2 / pET34 was replaced with the 8220 base pair XhoI-Bam of Orf5 / pBS.
Cloned into HI fragment.

【０１１８】 O51011H2O2 サブクローン514aからの7298塩基対BamHI-MluI断片を、サブクローンO5-H2-O2
の9588bp MluI-XhoIおよび8220bp XhoI-BamHI 断片と結紮する（T4ＤＮＡリガー
ゼ、NEB ）。その結果生じる〜22kbのサブクローンO51011H2O2（WCR およびECB
に対する活性を有する）はpNOV1001と呼ばれ、大腸菌DH5 α中でNRRLに寄託され
、寄託番号はB-30078 である。The 5298 base pair BamHI-MluI fragment from O51011H2O2 subclone 514a was subcloned O5-H2-O2
Of 9588 bp MluI-XhoI and 8220 bp XhoI-BamHI fragments (T4 DNA ligase, NEB). The resulting 2222 kb subclone O51011H2O2 (WCR and ECB
Is referred to as pNOV1001 and has been deposited with NRRL in E. coli DH5α and has the deposit number B-30078.

【０１１９】 AKH2O2 H2O2/pET34の12,074塩基対BamHI-AvrII 断片をpK184 NheI-BamHI断片（2228bp
）中に結紮（T4ＤＮＡリガーゼ、NEB ）して、複製のp15aオリジン中にhph2およ
びorf2を含有するクローン、即ちカナマイシン耐性ベクターを生成する。 実施例１８：サブクローンの殺昆虫活性 前記と同様のバイオアッセイを、単独で及び組合せて、前記のサブクローンを
発現する大腸菌培養を用いて実施する。大腸菌、例えばDH5 αまたはHB101 中で
のAKH2O2およびOrf5/pBSの同時発現は、鱗翅目のPlutella xylostella（コナガ
）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）およびManduca sexta （スズメガ）、
ならびに鞘翅目のDiabrotica virgifera virgifera（ウリハムシの一種）、Diab
rotica undecimpunctata howardi（ウリハムシの一種）およびLeptinotarsa dec
imlineata （コロラドハムシ）に対する殺昆虫活性を生じることが判明している
。したがって、hph2（配列番号１１、塩基対23,768-31,336 ）、orf2（配列番号
１１、塩基対31,393-35,838 ）およびorf5（配列番号１１、塩基対15,171-18,03
5 ）の同時発現は、これらの昆虫を制御するのに十分である。さらに、別々のプ
ラスミド上でのこれら３つのＯＲＦの各々の発現は昆虫制御活性を生じ、これは
３つの遺伝子生成物が存在する限り、それらが遺伝的に連鎖して活性であらねば
ならないというわけではないことを実証する。The 12,074 base pair BamHI-AvrII fragment of AKH2O2 H2O2 / pET34 was replaced with the pK184 NheI-BamHI fragment (2228 bp).
) (T4 DNA ligase, NEB) to generate a clone containing hph2 and orf2 in the p15a origin of replication, a kanamycin resistance vector. Example 18: Insecticidal activity of subclones The same bioassay as described above, alone and in combination, is performed using E. coli cultures expressing the subclones. Co-expression of AKH2O2 and Orf5 / pBS in Escherichia coli, such as DH5α or HB101, has been reported for Lepidoptera Plutella xylostella (Conaga), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga) and Manduca sexta (Suzumega),
And Coleoptera Diabrotica virgifera virgifera (a kind of beetle), Diab
rotica undecimpunctata howardi (a kind of beetle) and Leptinotarsa dec
It has been shown to produce insecticidal activity against imlineata (Colorado potato beetle). Thus, hph2 (SEQ ID NO: 11, base pairs 23,768-31,336), orf2 (SEQ ID NO: 11, base pairs 31,393-35,838) and orf5 (SEQ ID NO: 11, base pairs 15,171-18,03)
5) co-expression is sufficient to control these insects. Furthermore, expression of each of these three ORFs on separate plasmids results in insect control activity, which means that as long as the three gene products are present, they must be genetically linked and active. Demonstrate that is not.

【０１２０】 Ｃ．異種微生物宿主中での本発明の核酸配列の発現 本発明のヌクレオチド配列の異種発現に適した微生物は、植物または根圏をコ
ロニー化し得るすべての微生物である。そういうモノとして、それらは有害昆虫
と接触するようし向けられる。これらの例としては、グラム陰性微生物、例えば
シュードモナス属、エンテロバクター属およびセラチア属、グラム陽性微生物、
例えばバシラス属、ならびに真菌類のトリコデルマ属、グリオクラジウム属およ
びビール酵母菌Saccharomyces cerevisiaeが挙げられる。特に好ましい異種宿主
は、Pseudomonas fluorescens 、Pseudomonas putida、Pseudomonas cepacia 、
Pseudomonas aureofaciens、Pseudomonas aurantiaca、Enterobacter cloacae、
霊菌Serratia marscesens 、枯草菌Bacillus subtilis 、Bacillus cereus 、Tr
ichoderma viride、Trichoderma harianum、Gliocladium virensおよびビール酵
母菌Saccharomyces cerevisiaeである。C. Expression of the Nucleic Acid Sequences of the Invention in Heterologous Microbial Hosts Suitable microorganisms for heterologous expression of the nucleotide sequences of the invention are any microorganisms capable of colonizing a plant or rhizosphere. As such, they are directed into contact with pests. Examples of these include gram-negative microorganisms, such as Pseudomonas, Enterobacter and Serratia, Gram-positive microorganisms,
Examples include the genus Bacillus, and the fungi Trichoderma, Gliocladium and the brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae. Particularly preferred heterologous hosts are Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia,
Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aurantiaca, Enterobacter cloacae,
Serratia marscesens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Tr
ichoderma viride, Trichoderma harianum, Gliocladium virens and brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae.

【０１２１】 実施例１９：大腸菌およびその他のグラム陰性細菌中でのヌクレオチド配列の
発現 多数の遺伝子が、異種的方法でグラム陰性細菌中で発現されてきた。発現ベク
ターpKK223-3（Pharmacia カタログ＃27-4935-01）は、大腸菌中での発現を可能
にする。このベクターは、lac リプレッサーにより調節され、IPTGにより誘導さ
れる強力なtac プロモーターを有する（Brosius, J. et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 81 ）。大腸菌中での使用のために、多数のその他の発現系が開発さ
れてきた。熱誘導性発現ベクターpPL （Pharmacea #27-4946-01 ）は、タンパク
質の高レベルの発現を可能にする、厳密に調製されたバクテリオファージλを使
用する。lac プロモーターは発現の別の手段を提供するが、しかしプロモーター
はlac プロモーターと同様の高レベルでは発現されない。これらの発現系ベクタ
ーのいくつかに広範な宿主範囲レプリコンを付加すると、密接に関連したグラム
陰性細菌、例えばシュードモナス、エンテロバクター、セラチアおよびエルウィ
ニア属の細菌中でのヌクレオチド配列の発現が可能である。例えば、pLRKD211（
Kaiser & Kroos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5816-5820 （1984））は、多
数のグラム陰性細菌中での複製を可能にする広範な宿主範囲レプリコンori T を
含有する。Example 19: Expression of nucleotide sequences in E. coli and other Gram-negative bacteria A number of genes have been expressed in Gram-negative bacteria in a heterologous manner. The expression vector pKK223-3 (Pharmacia catalog # 27-4935-01) allows for expression in E. coli. This vector has a strong tac promoter regulated by the lac repressor and induced by IPTG (Brosius, J. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81). Numerous other expression systems have been developed for use in E. coli. The heat-inducible expression vector pPL (Pharmacea # 27-4946-01) uses a tightly prepared bacteriophage λ that allows for high level expression of the protein. The lac promoter provides another means of expression, but the promoter is not expressed at the same high levels as the lac promoter. The addition of a broad host range replicon to some of these expression system vectors allows expression of the nucleotide sequence in closely related Gram-negative bacteria such as Pseudomonas, Enterobacter, Serratia and Erwinia bacteria. For example, pLRKD211 (
Natl. Acad. Sci. USA 81: 5816-5820 (1984)) contains a broad host range replicon ori T that allows replication in a large number of Gram-negative bacteria.

【０１２２】 大腸菌中では、IPTGによる誘導は、tac （即ちtrp-lac ）プロモーターの発現
のために必要である。この同一プロモーター（例えば、広宿主範囲プラスミドpL
RKD211上の）がシュードモナス中に導入されると、それはIPTGによる誘導を伴わ
ずに、構成的に活性である。このtrp-lac プロモーターは、このような遺伝子の
構成的発現のためのシュードモナスまたはあらゆるその他の密接に関連した細菌
中での発現のために、あらゆる遺伝子または当該オペロンの前方に置かれ得る。
したがって、その発現が殺昆虫毒素を生じるヌクレオチド配列は、強力な構成性
プロモーターの後ろに置かれ、植物または根圏コロニー化特性を有する細菌に移
入されて、この生物体を殺昆虫剤にする。その他の考え得るプロモーターは、グ
ラム陰性細菌中でのヌクレオチド配列の構成性発現のために用いられ得る。これ
らの霊としては、例えばシュードモナス調節遺伝子gafAおよびlemA（WO94/01561
）からのプロモーター、ならびにPseudomonas savastanoi IAAオペロンプロモー
ター（Gaffney et al., J. Bacteriol. 172:5593-5601 （1990））が挙げられる
。In E. coli, induction by IPTG is required for expression of the tac (ie, trp-lac) promoter. This same promoter (eg, the broad host range plasmid pL
When RKD211) is introduced into Pseudomonas, it is constitutively active without induction by IPTG. The trp-lac promoter can be placed in front of any gene or operon for expression in Pseudomonas or any other closely related bacteria for constitutive expression of such genes.
Thus, the nucleotide sequence whose expression results in an insecticidal toxin is placed behind a strong constitutive promoter and is transferred to a plant or a bacterium having rhizosphere colonization properties, rendering the organism an insecticide. Other possible promoters can be used for constitutive expression of the nucleotide sequence in Gram-negative bacteria. These spirits include, for example, the pseudomonas regulatory genes gafA and lemA (WO94 / 01561
), As well as the Pseudomonas savastanoi IAA operon promoter (Gaffney et al., J. Bacteriol. 172: 5593-5601 (1990)).

【０１２３】 実施例２０：グラム陽性細菌中でのヌクレオチド配列の発現 グラム陽性細菌中でのヌクレオチド配列の異種発現は、殺昆虫毒素の別の産生
手段である。バシラス属およびストレプトミセス属に関する発現系は、もっとも
よく特性化されている。肺炎連鎖球菌Streptococcus pneumoniaeからのエリスロ
マイシン耐性遺伝子（ermR）のためのプロモーターは、グラム陽性好気性菌およ
び嫌気性菌中で、ならびに大腸菌中でも活性であることが示されている（Trieu-
Cuot et al., Nucl. Acids Res. 18:3660 （1990））。チオストレプトン遺伝子
からのさらに別の抗生物質耐性プロモーターは、ストレプトミセスクローニング
ベクター中で用いられている（Bibb, Mol. Gen. Genet. 199:26-36（1985））。
シャトルベクターpHT3101 も、バシラス属中での発現に適している（Lereclus,
FEMS Microbiol Lett 60:211-218（1989））。このアプローチの有意の利点は、
多数のグラム陽性細菌が、より長い保存寿命を有する殺昆虫剤を生成する処方物
中に用いられ得る花粉を生じることである。バシラス属およびストレプトミセス
属は、土壌の活動的移住開拓者である。Example 20: Expression of nucleotide sequences in Gram-positive bacteria Heterologous expression of nucleotide sequences in Gram-positive bacteria is another means of producing insecticidal toxins. Expression systems for Bacillus and Streptomyces have been the best characterized. The promoter for the erythromycin resistance gene (ermR) from S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae has been shown to be active in Gram-positive aerobic and anaerobic bacteria, as well as in E. coli (Trieu-
Cuot et al., Nucl. Acids Res. 18: 3660 (1990)). Yet another antibiotic resistance promoter from the thiostrepton gene has been used in Streptomyces cloning vectors (Bibb, Mol. Gen. Genet. 199: 26-36 (1985)).
The shuttle vector pHT3101 is also suitable for expression in Bacillus (Lereclus,
FEMS Microbiol Lett 60: 211-218 (1989)). A significant advantage of this approach is that
A number of Gram-positive bacteria produce pollen that can be used in formulations that produce insecticides with longer shelf life. Bacillus and Streptomyces are active migrant settlers of soil.

【０１２４】 実施例２１：真菌類におけるヌクレオチド配列の発現 Trichoderma harianumおよびGliocladium virensは、野外での種々のレベルの
生物制御を提供することが示されている（米国特許第5,165,928 号および米国特
許第4,996,157 号（ともにCornell Research Foundation ））。その発現が殺昆
虫毒素を生じるヌクレオチド配列は、このような真菌類において発現され得る。
これは、当業界で周知の多数の方法により成し遂げられ得る。１つは、ＰＥＧま
たは電気穿孔媒介法による真菌のプロトプラスト媒介性形質転換である。あるい
は、粒子衝撃を用いて、際せ再生化成熟構造に発達する能力を有するプロトプラ
ストまたはその他の真菌細胞を形質転換し得る。元々、アスペルギルス属の形質
転換のために開発され、目下、真菌類の形質転換のために広範に用いられている
ベクターpAN7-1（Curragh et al., Mycol. Res. 97（3 ）:313-317（1992）; To
oley et al., Curr. Genet. 21:55-60（1992）; Punt et al., Gene 56:117-124
（1987））は、ヌクレオチド配列を含有するよう工学処理される。このプラスミ
ドは、Aspergillus nidulans gpdプロモーターおよびtrpCターミネーターと側面
を接する大腸菌ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含有する（Punt et al., Gene
56:117-124（1987））。Example 21 Expression of Nucleotide Sequences in Fungi Trichoderma harianum and Gliocladium virens have been shown to provide varying levels of biocontrol in the field (US Pat. Nos. 5,165,928 and 4,996,157). (Both Cornell Research Foundation)). Nucleotide sequences whose expression results in an insecticidal toxin can be expressed in such fungi.
This can be accomplished by a number of methods well known in the art. One is protoplast-mediated transformation of fungi by PEG or electroporation-mediated methods. Alternatively, particle bombardment can be used to transform protoplasts or other fungal cells that have the ability to develop into a rejuvenated mature structure. Vector pAN7-1, originally developed for the transformation of the genus Aspergillus and currently widely used for the transformation of fungi (Curragh et al., Mycol. Res. 97 (3): 313- 317 (1992); To
oley et al., Curr. Genet. 21: 55-60 (1992); Punt et al., Gene 56: 117-124.
(1987)) are engineered to contain a nucleotide sequence. This plasmid contains the E. coli hygromycin B resistance gene flanking the Aspergillus nidulans gpd promoter and the trpC terminator (Punt et al., Gene
56: 117-124 (1987)).

【０１２５】 好ましい実施態様では、本発明の核酸は酵母菌のビール酵母菌Saccharomyces
cerevisiae中で発現される。一緒に殺昆虫活性を付与する配列番号１１の３つの
ＯＲＦ（hph2、orf2およびorf5）の各々は、GAL1誘導性プロモーターおよびCYC1
ターミネーターを有する個々のベクター中にクローン化される。各ベクターは、
アンピシリン耐性および２μのレプリコンを有する。ベクターは、それらの酵母
菌増殖マーカーが異なる。 hph2 はp424（TRP1, ATCC 87329）中に、orf2はp423
（HIS3, ATCC 87327）中に、およびorf5はp425（LEU2, ATCC 87331）中にクロー
ン化される。３つの構築物は、別個におよび一緒に、ビール酵母菌中に形質転換
される。３つのＯＲＦは一緒に発現され、タンパク質発現および殺昆虫活性に関
して検査される。In a preferred embodiment, the nucleic acid of the invention is a yeast brewer's yeast Saccharomyces.
It is expressed in cerevisiae. Each of the three ORFs of SEQ ID NO: 11 (hph2, orf2 and orf5), which together confer insecticidal activity, contains a GAL1 inducible promoter and CYC1
It is cloned into individual vectors with terminators. Each vector is
Has ampicillin resistance and 2μ replicon. Vectors differ in their yeast growth markers. hph2 is in p424 (TRP1, ATCC 87329) and orf2 is p423
(HIS3, ATCC 87327) and orf5 is cloned into p425 (LEU2, ATCC 87331). The three constructs are transformed separately and together into brewer's yeast. The three ORFs are expressed together and tested for protein expression and insecticidal activity.

【０１２６】 Ｄ．トランスジェニック植物におけるヌクレオチド配列の発現 本出願に記載した核酸配列を、慣用的組換えＤＮＡ技術を用いて、植物細胞中
に組み入れ得る。一般に、これは、当業界で既知の標準クローニング法を用いて
、コード配列が異種である（即ち常態では存在しない）発現系中に本発明のコー
ド配列を挿入することを包含する。ベクターは、挿入タンパク質コード配列の転
写および翻訳に必要な素子を含有する。当業界で既知の多数のベクター系、例え
ばプラスミド、バクテリオファージウイルスおよびその他の修飾ウイルスが用い
られ得る。適切なベクターとしては、ウイルスベクター、例えばλベクター系、
λgtI1，λgtI0およびシャロン４；プラスミドベクター、例えばpBI121、pBR322
、pACYC177、pACYC184、pAR シリーズ、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18 、pUC19
、pLG339、pRK290、pKC37 、pKC101、pCDNAII ；およびその他の同様の系が挙げ
られるが、これらに限定されない。発現系の構成成分を、発現を増大するために
修飾し得る。例えば、切頭配列、ヌクレオチド置換またはその他の修飾を用い得
る。本明細書中に記載した発現系を用いて、適切な条件下であらゆる作物植物細
胞をほとんど形質転換し得る。形質転換細胞は、本発明のヌクレオチド配列がト
ランスジェニック植物に昆虫耐性を付与するように、全植物体に再生され得る。D. Expression of Nucleotide Sequences in Transgenic Plants The nucleic acid sequences described in this application can be incorporated into plant cells using conventional recombinant DNA techniques. In general, this involves inserting the coding sequence of the present invention into an expression system in which the coding sequence is heterogeneous (ie, not normally present) using standard cloning techniques known in the art. Vectors contain the necessary elements for transcription and translation of the inserted protein coding sequence. Many vector systems known in the art can be used, such as plasmids, bacteriophage viruses and other modified viruses. Suitable vectors include viral vectors, such as the λ vector system,
λgtI1, λgtI0 and Sharon 4; plasmid vectors such as pBI121, pBR322
, PACYC177, pACYC184, pAR series, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19
, PLG339, pRK290, pKC37, pKC101, pCDNAII; and other similar systems. Components of the expression system may be modified to increase expression. For example, truncated sequences, nucleotide substitutions or other modifications may be used. Using the expression systems described herein, almost any crop plant cell can be transformed under appropriate conditions. Transformed cells can be regenerated into whole plants such that the nucleotide sequences of the present invention confer insect resistance on the transgenic plants.

【０１２７】 実施例２２：コード配列および隣接配列の修飾 本出願中に記載したヌクレオチド配列を、トランスジェニック植物宿主中での
発現のために修飾し得る。ヌクレオチド配列を発現し、その細胞中に殺昆虫毒素
を産生する宿主植物は、昆虫侵襲に対する耐性増強を示し、したがってこのよう
な侵襲に伴う作物損失に耐えるよう良好に備えを有する。Example 22 Modification of Coding Sequence and Flanking Sequences The nucleotide sequences described in this application can be modified for expression in a transgenic plant host. Host plants that express the nucleotide sequence and produce insecticidal toxins in their cells exhibit increased resistance to insect infestation and are therefore well prepared to withstand crop losses associated with such infestation.

【０１２８】 微生物供給源から得られる遺伝子の植物中でのトランスジェニック発現は、植
物中でのそれらの発現を達成し、最適化するためにそれらの遺伝子の修飾を必要
とする。特に、別々の酵素をコードするが、しかし元の微生物中の同一転写物に
よりコードされる細菌ＯＲＦは、別個の転写物に関して植物中で最良に発現され
る。これを成し遂げるために、各微生物ＯＲＦを別々に単離し、ＯＲＦの５‘末
端に植物プロモーター配列を、そしてＯＲＦの３’末端に植物転写ターミネータ
ーを提供するカセット内でクローン化する。単離ＯＲＦ配列は、好ましくは、開
始ＡＴＧコドンおよび終止ＳＴＯＰコドンを含むが、しかし開始ＡＴＧおよび終
止ＳＴＯＰコドンの向こうに付加的配列を含み得る。さらに、ＯＲＦは、切頭化
されるが、しかし依然として必要な活性を保持する。特に長ＯＲＦに関しては、
活性を保持する切頭化バージョンが、トランスジェニック生物中での発現のため
には好ましい。「植物プロモーター」および「植物転写ターミネーター」とは、
植物細胞内で操作するプロモーターおよび転写ターミネーターを意味するものと
する。これは、非植物供給源、例えばウイルス（一例は、カリフラワーモザイク
ウイルスである）から得られるプロモーターおよび転写ターミネーターを含む。Transgenic expression in plants of genes obtained from microbial sources requires modification of those genes to achieve and optimize their expression in plants. In particular, bacterial ORFs that encode separate enzymes but are encoded by the same transcript in the original microorganism are best expressed in plants with respect to separate transcripts. To accomplish this, each microbial ORF is separately isolated and cloned in a cassette that provides a plant promoter sequence at the 5 'end of the ORF and a plant transcription terminator at the 3' end of the ORF. The isolated ORF sequence preferably includes a start ATG codon and a stop STOP codon, but may include additional sequences beyond the start ATG and stop STOP codon. In addition, the ORF is truncated, but still retains the required activity. Especially for long ORFs,
Truncated versions that retain activity are preferred for expression in transgenic organisms. "Plant promoter" and "plant transcription terminator"
Promoters and transcription terminators that operate in plant cells are meant. This includes promoters and transcription terminators obtained from non-plant sources, such as viruses (one example is cauliflower mosaic virus).

【０１２９】 いくつかの場合には、ＯＲＦコード配列および隣接配列に対する修飾は必要な
い。当該ＯＲＦを含有する断片を単離し、そしてそれを植物プロモーターの下流
に挿入することで十分である。例えば、Gaffney 等（Science 261:754-756 （19
93））は、コード配列の修飾を伴わずに、そして、依然としてnahGＯＲＦに結合
されたままのＡＴＧの上流のｘbpのシュードモナス遺伝子およびＳＴＯＰコドン
の下流のｙbpを伴って、CaMV 35SプロモーターおよびCaMV tmIターミネーターの
制御下で、トランスジェニック植物中でシュードモナスnahG遺伝子を首尾よく発
現した。好ましくは、隣接微生物配列は、ＡＴＧの上流およびＳＴＯＰコドンの
下流に結合されたままであるべきである。実際、このような構築は、制限部位の
利用可能性により得る。In some cases, no modifications to the ORF coding sequence and adjacent sequences are required. It is sufficient to isolate the fragment containing the ORF and insert it downstream of the plant promoter. For example, Gaffney et al. (Science 261: 754-756 (19
93)), without modification of the coding sequence, and with the Pseudomonas gene xbp upstream of the ATG and ybp downstream of the STOP codon, still without modification to the nahGORF, CaMV 35S promoter and CaMV tmI terminator Pseudomonas nahG gene was successfully expressed in transgenic plants under the control of Preferably, adjacent microbial sequences should remain linked upstream of the ATG and downstream of the STOP codon. Indeed, such a construction results from the availability of restriction sites.

【０１３０】 他の場合には、微生物供給源から得られる遺伝子の発現は、発現における問題
を提供し得る。これらの問題は当業界で十分特性化されており、バシラス属のよ
うなある種の供給源から得られる遺伝子に関して特に一般的である。これらの問
題は、本発明のヌクレオチド配列にも当てはまり、これらの遺伝子の修飾は、当
業界で周知の技術を用いて成され得る。以下の問題が発生し得る： １．コドン使用法 植物における好ましいコドン使用法は、ある種の微生物における好ましいコド
ン使用法とは異なる。クローン化微生物ＯＲＦ内でのコドンの使用と植物遺伝子
（そして特に、標的植物からの遺伝子）におけるコドンの使用との比較は、好ま
しくは変更さるべきＯＲＦ内のコドンの確認を可能にする。典型的には、植物進
化は、単子葉類の第三塩基位置における強いヌクレオチドＣおよびＧ選択傾向を
有するが、一方、双子葉類はしばしば、この位置にヌクレオチドＡまたはＴを使
用する。特定の標的トランスジェニック種のための好ましいコドン使用を組み入
れるために遺伝子を修飾することにより、ＧＣ／ＡＴ含量および不合理なスプラ
イシングに関して後述する問題の多くが克服される。[0130] In other cases, expression of genes obtained from microbial sources can present problems in expression. These problems have been well characterized in the art and are particularly common with genes obtained from certain sources, such as Bacillus. These issues also apply to the nucleotide sequences of the present invention, and modifications of these genes can be made using techniques well known in the art. The following problems can occur: Codon usage The preferred codon usage in plants differs from the preferred codon usage in certain microorganisms. Comparison of the use of codons in the cloned microbial ORF with the use of codons in plant genes (and in particular, genes from the target plant) allows identification of codons in the ORF which are preferably to be changed. Typically, plant evolution has a strong propensity for nucleotide C and G selection at the third base position in monocots, while dicots often use nucleotides A or T at this position. Modifying a gene to incorporate preferred codon usage for a particular target transgenic species overcomes many of the problems described below regarding GC / AT content and irrational splicing.

【０１３１】 ２．ＧＣ／ＡＴ含量 植物遺伝子は、典型的には、35％より大きいＧＣ含量を有する。ＡおよびＴヌ
クレオチドが豊富なＯＲＦ配列は、植物におけるいくつかの問題を引き起こし得
る。第一に、ATTTA のモチーフは、メッセージの不安定化を生じると考えられ、
多数の短命ｍＲＮＡの３‘末端に見出される。第二に、メッセージ内の不適切な
位置でのポリアデニル化信号、例えばAATAAAの発生は、転写の早期切頭化を引き
起こすと考えられる。さらに、単子葉類は、スプライス部位として富ＡＴ配列を
認識し得る（下記参照）。[0131] 2. GC / AT content Plant genes typically have a GC content greater than 35%. ARF sequences rich in A and T nucleotides can cause several problems in plants. First, the ATTTA motif is thought to cause message instability,
It is found at the 3 'end of many short-lived mRNAs. Second, the occurrence of a polyadenylation signal, eg, AATAAA, at an inappropriate position in the message is likely to cause premature truncation of transcription. In addition, monocots can recognize AT-rich sequences as splice sites (see below).

【０１３２】 ３．開始メチオニンに隣接する配列 植物は、それらのメッセージが限定されたリボソーム結合部位を保有しないとい
う点で微生物と異なる。むしろ、リボソームはメッセージの５‘末端に結合し、
翻訳を開始するための最初の利用可能なＡＴＧに関して精査する、と考えられる
。それにもかかわらず、ＡＴＧに隣接するある種のヌクレオチドに対する選択が
存在し、微生物遺伝子の発現は、ＡＴＧでの真核生物コンセンサス翻訳イニシエ
ーターの含入により増強され得る、と考えられる。Clontech（1993/1994 カタロ
グ、210 ページ）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、植
物における大腸菌uidA遺伝子の発現のためのコンセンサス翻訳イニシエーターと
しての一配列を示唆している。さらに、Joshi （NAR 15:6643-6653（1987））（
この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、ＡＴＧに隣接する多数
の植物配列を比較して、別のコンセンサス配列を示唆している。植物中での微生
物ＯＲＦの発現に際して困難に遭遇する状況では、開始ＡＴＧでのこれらの配列
の１つの含入は、翻訳を改良し得る。このような場合、コンセンサス配列の最後
の３つのヌクレオチドは、第二ＡＡ残基のそれらの修飾のために、修飾配列中の
含入には適切でない。開始メチオニンに隣接する好ましい配列は、異なる植物種
間で異なり得る。GenBank データベースに位置する14のトウモロコシ遺伝子の探
索は、以下の結果を提供した：[0132] 3. Sequences flanking the initiating methionine Plants differ from microorganisms in that their messages do not possess a defined ribosome binding site. Rather, the ribosome binds to the 5 'end of the message,
It will be scrutinized for the first available ATG to initiate translation. Nevertheless, it is believed that there is a preference for certain nucleotides adjacent to the ATG, and that microbial gene expression can be enhanced by inclusion of a eukaryotic consensus translation initiator at the ATG. Clontech (Catalog 1993/1994, page 210), which is incorporated herein by reference, suggests a sequence as a consensus translation initiator for expression of the E. coli uidA gene in plants. I have. In addition, Joshi (NAR 15: 6643-6653 (1987))
The description of which is incorporated herein by reference) compares a number of plant sequences adjacent to the ATG and suggests another consensus sequence. In situations where difficulties are encountered in expressing the microbial ORF in plants, the inclusion of one of these sequences in the starting ATG may improve translation. In such cases, the last three nucleotides of the consensus sequence are not suitable for inclusion in the modified sequence due to their modification of the second AA residue. Preferred sequences flanking the initiating methionine may vary between different plant species. A search for 14 corn genes located in the GenBank database provided the following results:

【０１３３】[0133]

【表５】 [Table 5]

【０１３４】 この分析は、ヌクレオチド配列が組み入れられている所望の植物種、ならびに好
ましいヌクレオチドを組み入れるために修飾されるＡＴＧに隣接する配列に関し
て成され得る。 ４．不合理なスプライス部位の除去 非植物供給源からクローン化され、植物中での発現のために最適化されていな
い遺伝子は、５‘または３’スプライス部位として植物中で認識され、開列され
、したがって切頭化または欠失化メッセージを生成し得るモチーフも含有し得る
。これらの部位は、当業界で周知の技術を用いて除去し得る。This analysis can be performed on the desired plant species into which the nucleotide sequence has been incorporated, as well as on the sequence adjacent to the ATG that is modified to incorporate the preferred nucleotide. 4. Elimination of irrational splice sites Genes cloned from non-plant sources and not optimized for expression in plants are recognized in plants as 5 'or 3' splice sites and opened, thus It may also contain motifs that can generate truncated or deleted messages. These sites can be removed using techniques well known in the art.

【０１３５】 コード配列および隣接配列の修飾のための技術は、当業界で周知である。微生
物ＯＲＦの初期発現が低く、そして前記のような配列に変更させるのが適切であ
るとみなされる場合には、当業界で周知の方法により、合成遺伝子の構築が達成
され得る。これらは、例えば、公告済み特許開示EP0385962 （Monsanto）、EP03
59472 （Lubrizol）およびWO93/07278（Ciba-Geigy）（これらの記載内容は、参
照により本明細書中に含まれる）に記載されている。ほとんどの場合、トランス
ジェニック植物へのそれらの移入の前に、短期検定プロトコール（当業界で周知
）を用いて遺伝子構築物の発現を検定するのが好ましい。Techniques for modifying coding sequences and flanking sequences are well known in the art. If the initial expression of the microbial ORF is low and it is deemed appropriate to alter the sequence as described above, construction of synthetic genes can be achieved by methods well known in the art. These are, for example, the published patent disclosures EP0385962 (Monsanto), EP03
59472 (Lubrizol) and WO 93/07278 (Ciba-Geigy), the contents of which are incorporated herein by reference. In most cases, it is preferred to assay the expression of the genetic construct using a short-term assay protocol (known in the art) prior to their transfer into the transgenic plant.

【０１３６】 実施例２３：植物発現カセットの構築 トランスジェニック植物中での発現を意図されたコード配列は、植物中で発現
可能な適切なプロモーター脳死路の発現カセット中に先ず組み立てられる。発現
カセットは、トランスジーンの発現に必要な、または選択される任意のさらなる
配列も包含し得る。このような配列としては、転写ターミネーター、発現を増強
するための外来配列、例えばイントロン、生命維持配列、ならびに特定の細胞小
器官および細胞区画に対する遺伝子生成物の標的化を意図された配列が挙げられ
るが、これらに限定されない。これらの発現カセットは、次に、下記の植物形質
転換ベクターに容易に移入し得る。以下は、典型的発現カセットの種々の構成成
分の説明である。Example 23: Construction of a plant expression cassette A coding sequence intended for expression in a transgenic plant is first assembled into an expression cassette for a suitable promoter brain tract that can be expressed in the plant. The expression cassette may also include any additional sequences required or selected for expression of the transgene. Such sequences include transcription terminators, foreign sequences to enhance expression, such as introns, life support sequences, and sequences intended to target gene products to specific organelles and cell compartments. However, it is not limited to these. These expression cassettes can then be easily transferred into the plant transformation vectors described below. The following is a description of the various components of a typical expression cassette.

【０１３７】 １．プロモーター 発現カセット中に用いられるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物
におけるトランスジーンの空間的および時間的発現パターンを確定する。選択プ
ロモーターは、特定の種類の細胞（例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根の皮質細
胞）中で、または特定の組織または器官（例えば、根、葉または花）中でトラン
スジーンを発現し、そして選択は、遺伝子生成物の蓄積の望ましい位置を反映す
る。あるいは、選択プロモーターは、種々の誘導条件下での遺伝子の発現を駆動
し得る。プロモーターは、それらの強度が、即ち転写を促す能力が異なる。利用
される宿主細胞系によって、遺伝子のネイティブプロモーターを含めた多数の適
切なプロモーターのいずれかを用い得る。以下は、発現カセット中に用いられ得
るプロモーターの例であるが、これらに限定されない。[0137] 1. Promoter The selection of the promoter used in the expression cassette will determine the spatial and temporal expression pattern of the transgene in the transgenic plant. The selection promoter expresses the transgene in a particular type of cell (eg, leaf epidermal cells, mesophyll cells, root cortical cells) or in a particular tissue or organ (eg, root, leaf or flower); And the choice reflects the desired location of accumulation of the gene product. Alternatively, a selection promoter can drive expression of the gene under various inducing conditions. Promoters differ in their strength, ie, their ability to promote transcription. Depending on the host cell system employed, any of a number of suitable promoters can be used, including the native promoter for the gene. The following are non-limiting examples of promoters that can be used in the expression cassette.

【０１３８】 ａ．構成的発現、ユビキチンプロモーター： ユビキチンは、多数の種類の細胞中に蓄積することが知られている遺伝子生成
物であり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物中に用いるためにいく
つかの種からクローン化されている（例えば、ヒマワリ−Binet et al., Plant
Science 79:87-94（1991）; トウモロコシ−Christensen et al., Plant Molec.
Biol. 12:619-632 （1989）; およびシロイヌナズナ−Norris et al., Plant M
ol. Biol. 21:895-906（1993））。トウモロコシユビキチンプロモーターはトラ
ンスジェニック単子葉類系で開発され、単子葉類形質転換のために構築されたそ
の配列およびベクターは、特許公告EP0342926 （Lubrizol）（この記載内容は、
参照により本明細書中に含まれる）に開示されている。Taylor等（Plant Cell R
ep. 12:491-495（1993））は、トウモロコシユビキチンプロモーターおよび最初
のイントロンを包含するベクター（pAHC25）、ならびに微小射出衝撃により導入
される場合の多数の単子葉類の細胞懸濁液中のその高活性を記載する。シロイヌ
ナズナユビキチンプロモーターは、本発明のヌクレオチド配列とともに使用する
ために理想的である。ユビキチンプロモーターは、単子葉類および双子葉類の両
方のトランスジェニック植物中での遺伝子発現に適している。適切なベクターは
、pAHC25の誘導体、あるいは、適切なユビキチンプロモーターおよび／またはイ
ントロン配列の導入により修飾される、本出願に記載した形質転換プロモーター
のいずれかである。A. Constitutive expression, ubiquitin promoter: Ubiquitin is a gene product known to accumulate in many types of cells, and its promoter has been cloned from several species for use in transgenic plants. (Eg, sunflower-Binet et al., Plant
Science 79: 87-94 (1991); Maize-Christensen et al., Plant Molec.
Biol. 12: 619-632 (1989); and Arabidopsis-Norris et al., Plant M.
ol. Biol. 21: 895-906 (1993)). The corn ubiquitin promoter was developed in a transgenic monocot system, and its sequences and vectors constructed for monocot transformation are described in Patent Publication EP0342926 (Lubrizol), which is described in
(Included herein by reference). Taylor et al. (Plant Cell R
ep. 12: 491-495 (1993)) in a vector containing the corn ubiquitin promoter and the first intron (pAHC25), and in a cell suspension of multiple monocots when introduced by microinjection shock. The high activity is described. The Arabidopsis ubiquitin promoter is ideal for use with the nucleotide sequences of the present invention. The ubiquitin promoter is suitable for gene expression in both monocotyledonous and dicotyledonous transgenic plants. Suitable vectors are either derivatives of pAHC25, or any of the transformation promoters described in this application, which are modified by the introduction of a suitable ubiquitin promoter and / or intron sequence.

【０１３９】 ｂ．構成性発現、CaMV 35Sプロモーター： プラスミドpCGN1761の構築は、公告済特許出願EP0392225 （実施例２３）（こ
の記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されている。pCGN1761
は、プロモーターとターミネーターとの間に独特のEcoRI 部位を有する「二重」
CaMV 35Sプロモーターおよびtml 転写ターミネーターを含有し、pUC 型主鎖を有
する。既存のEcoRI 部位の他に、NotIおよびXhoI部位を含む修飾化ポリリンカー
を有するpCGN1761の誘導体が構築される。この誘導体は、pCGN1761ENX と呼ばれ
る。pCGN1761ENX は、トランスジェニック植物中での35S プロモーター制御下で
のそれらの発現のためにそのポリリンカー内でのｃＤＮＡ配列またはコード配列
（微生物ＯＲＦ配列を含む）のクローニングに有用である。このような構築物の
全35S プロモーターコード配列−tml ターミネーターカセットは、例えば下記の
ような形質転換ベクターへの移入のために、プロモーターに対して５‘のHindII
I 、SphI、SaIIおよびXbaI部位、ならびにターミネーターに対して３’のXbaI、
BamHI およびBgII部位により切り出され得る。さらに、二重35S プロモーター断
片は、別のプロモーターを用いた置換のための、 HindIII、SphI、SaII、XbaIま
たはPstIによる５‘切り出し、ならびにポリリンカー制限部位（EcoRI 、NotIま
たはXhoI）のいずれかによる３’切り出しにより除去され得る。所望により、ク
ローニング部位周囲の修飾は、翻訳を増強し得る配列の導入によりなされ得る。
これは、過剰発現が望ましい場合に、特に有用である。例えば、pCGN1761は、米
国特許第5,639,949 号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）の
実施例３７に記載されたような翻訳開始部位の最適化により修飾され得る。B. Constitutive expression, CaMV 35S promoter: The construction of plasmid pCGN1761 is described in published patent application EP0392225 (Example 23), which is incorporated herein by reference. pCGN1761
Is a "double" with a unique EcoRI site between the promoter and the terminator
Contains the CaMV 35S promoter and tml transcription terminator and has a pUC-type backbone. A derivative of pCGN1761 is constructed that has a modified polylinker containing NotI and XhoI sites in addition to the existing EcoRI site. This derivative is called pCGN1761ENX. pCGN1761ENX is useful for cloning cDNA or coding sequences (including microbial ORF sequences) within its polylinker for their expression under the control of the 35S promoter in transgenic plants. The entire 35S promoter coding sequence-tml terminator cassette of such a construct would provide 5 ′ HindII to the promoter for transfer into a transformation vector, eg, as described below.
I, SphI, SaII and XbaI sites, and XbaI 3 ′ to the terminator,
It can be excised by BamHI and BgII sites. In addition, the double 35S promoter fragment was excised by 5 'excision with HindIII, SphI, SaII, XbaI or PstI for replacement with another promoter, and by either a polylinker restriction site (EcoRI, NotI or XhoI). It can be removed by 3 'excision. If desired, modifications around the cloning site can be made by introducing sequences that can enhance translation.
This is particularly useful when overexpression is desired. For example, pCGN1761 can be modified by optimization of the translation initiation site as described in Example 37 of US Pat. No. 5,639,949, which is incorporated herein by reference.

【０１４０】 ｃ．構成性発現、アクチンプロモーター： アクチンのいくつかのアイソフォームは、ほとんどの種類の細胞中で発現され
ることが知られており、したがって、アクチンプロモーターは構成性プロモータ
ーのための良好な選択である。特に、イネActI遺伝子からのプロモーターがクロ
ーン化され、特性化されている（McElroy et al., Plant Cell2:163-171 （1990
））。プロモーターの1.3kb 断片は、イネプロトプラスト中での発現に必要なす
べての調節素子を含有することが判明した。さらに、ActIプロモーターを基礎に
した多数の発現ベクターが、単子葉類における使用のために特に構築されている
（ McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150-160 （1991））。これらは、Ac
tI- イントロン１、AdhI 5' フランキング配列およびAdhI- イントロン１（トウ
モロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）、ならびにCaMV 35Sプロモー
ターを組み入れる。最高発現を示すベクターは、35S とActI- イントロンまたは
AdhI 5' フランキング配列およびAdhI- イントロンの融合体である。開始ＡＴＧ
（GUS レポーター遺伝子の）周囲の配列の最適化も、発現を増強した。McElroy
等（ Mol. Gen. Genet. 231:150-160 （1991））により記載されたプロモーター
発現カセットは、遺伝子発現のために容易に修飾され得るし、単子葉類宿主中で
用いるのに特に適している。例えば、プロモーター含有断片は、McElroy 構築物
から除去され、pCGN1761ENX 中の二重35S プロモーターを置換するために用いら
れ、次にこれは、特定の遺伝子配列の挿入に利用可能である。このようにして構
築される融合遺伝子は、次に適切な形質転換ベクターに移入され得る。別の報告
では、イネActIプロモーターは、その第一イントロンとともに、培養オオムギ細
胞中での高発現を指図することが判明している（Chibbar et al. Plant Cell Re
p. 12:506-509 （1993））。C. Constitutive expression, actin promoter: Several isoforms of actin are known to be expressed in most types of cells, and thus the actin promoter is a good choice for a constitutive promoter. In particular, the promoter from the rice ActI gene has been cloned and characterized (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990
)). The 1.3 kb fragment of the promoter was found to contain all the regulatory elements necessary for expression in rice protoplasts. In addition, a number of expression vectors based on the ActI promoter have been specifically constructed for use in monocots (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). These are Ac
Incorporate the tI-intron 1, AdhI 5 'flanking sequence and AdhI-intron 1 (from corn alcohol dehydrogenase gene), and the CaMV 35S promoter. Vectors showing the highest expression are 35S and ActI-intron or
Fusion of AdhI 5 'flanking sequence and AdhI-intron. Start ATG
Optimization of surrounding sequences (of the GUS reporter gene) also enhanced expression. McElroy
(Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) can be easily modified for gene expression and are particularly suitable for use in monocot hosts. I have. For example, a promoter-containing fragment is removed from the McElroy construct and used to replace the double 35S promoter in pCGN1761ENX, which is then available for insertion of specific gene sequences. The fusion gene thus constructed can then be transferred to a suitable transformation vector. In another report, the rice ActI promoter, together with its first intron, was found to direct high expression in cultured barley cells (Chibbar et al. Plant Cell Re
p. 12: 506-509 (1993)).

【０１４１】 ｄ．誘導性発現、PR-1プロモーター： pCGN1761ENX 中の二重35S プロモーターは、適切に高発現レベルを生じる選り
抜きの任意の他のプロモーターで置換され得る。例として、米国特許第5,614,39
5 号に記載された化学的に調節可能なプロモーターの１つは、二重35S プロモー
ターを置換し得る。選り抜きのプロモーターは、好ましくは制限酵素によりその
供給源から切り離されるが、しかしあるいは、適切な末端制限部位を保有するプ
ライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。ＰＣＲ増幅はなされるべきであり、その
場合、プロモーターは、標的ベクター中での増幅プロモーターのクローニング後
に、増幅エラーに関して点検するために再シーケンシングされるべきである。化
学的／病原体調節可能タバコPR-1a プロモーターは、プラスミドpCIB1004（構築
に関しては、EP0332104 の実施例２１参照（この記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる））から切断され、プラスミドpCGN1761ENX に移入される（Ukne
s et al., 1992）。pCIB1004はNcoIにより開裂され、その結果生じる線状化断片
の３‘オーバーハングはT4ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって平滑にされる
。断片は次に、HindIII により開裂され、その結果生じるPR-1a プロモーター含
有断片はゲル精製されて、二重35S プロモーターが除去されたpCGN1761ENX 中に
クローン化される。これは、XhoIによる開裂およびT4ポリメラーゼによる平滑化
と、その後のHindIII による開裂およびpCIB1004プロモーター断片がクローン化
される断片を含有する大型ベクターターミネーターの単離によりなされる。これ
は、PR-1a プロモーターおよびtmI ターミネーター、ならびに独特のEcoRI およ
びNotI部位を伴う介在ポリリンカーを有するpCGN1761ENX 誘導体を生じる。選択
コード配列はこのベクターに挿入され、そして融合生成物（即ち、プロモーター
−遺伝子−ターミネーター）はその後任意の選択形質転換ベクター、例えば下記
のものに移入され得る。種々の化学的調節剤、例えば、米国特許第5,523,311 号
および第5,614,395 号に開示されたベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸およ
びサリチル酸化合物を用いて、本発明により形質転換された植物中の選択コード
配列の発現を誘導し得る。D. Inducible expression, PR-1 promoter: The dual 35S promoter in pCGN1761ENX can be replaced with any other promoter of choice that produces suitably high expression levels. By way of example, U.S. Pat.No. 5,614,39
One of the chemically regulatable promoters described in No. 5 can replace the dual 35S promoter. The selected promoter is preferably cleaved from its source by a restriction enzyme, but can alternatively be PCR amplified using primers bearing appropriate terminal restriction sites. PCR amplification should be done, in which case the promoter should be resequenced after cloning of the amplification promoter in the target vector to check for amplification errors. The chemical / pathogen regulatable tobacco PR-1a promoter was cut from plasmid pCIB1004 (for construction, see Example 21 of EP0332104, which is incorporated herein by reference) and the plasmid pCGN1761ENX was added. Populated (Ukne
s et al., 1992). pCIB1004 is cleaved by NcoI and the resulting 3 ′ overhang of the linearized fragment is made blunt by treatment with T4 DNA polymerase. The fragment is then cleaved with HindIII, and the resulting PR-1a promoter-containing fragment is gel purified and cloned into pCGN1761ENX with the double 35S promoter removed. This is done by cleavage with XhoI and blunting with T4 polymerase, followed by HindIII cleavage and isolation of the large vector terminator containing the fragment into which the pCIB1004 promoter fragment is cloned. This results in a pCGN1761ENX derivative with the PR-1a promoter and tmI terminator, and an intervening polylinker with unique EcoRI and NotI sites. The selection coding sequence is inserted into this vector, and the fusion product (ie, promoter-gene-terminator) can then be transferred to any selection transformation vector, such as those described below. Expression of selection coding sequences in plants transformed according to the present invention using various chemical modulators, such as the benzothiadiazole, isonicotinic and salicylic acid compounds disclosed in U.S. Patent Nos. 5,523,311 and 5,614,395. Can be induced.

【０１４２】 ｅ．誘導性発現、エタノール誘導性プロモーター： ある種のアルコールまたはケトン、例えばエタノールにより誘導可能なプロモ
ーターも、本発明のコード配列の誘導性発現を付与するために用いられ得る。こ
のようなプロモーターは、例えば、アスペルギルス属のAspergillus nidulansか
らのalcA遺伝子プロモーターである（Caddick et al.（1998）Nat. Biotechnol.
16:177-180 ）。A. nidulans においては、alcA遺伝子はある骨デヒドロゲナー
ゼをコードし、その発現は、化学的誘導物質の存在下でAlcR転写因子により調節
される。本発明の目的のために、最小35S プロモーターに融合されたalcA遺伝子
プロモーター配列を包含するプラスミドpalcA:CAT 中のCAT コード配列（Caddic
k et al.（1998）Nat. Biotechnol. 16:177-180 ）が本発明のコード配列により
置換されて、alcA遺伝子プロモーターの制御下でコード配列を有する発現カセッ
トを生成する。これは、当業界で周知の方法を用いて実行される。E. Inducible Expression, Ethanol-Inducible Promoters: Promoters inducible by certain alcohols or ketones, such as ethanol, can also be used to confer inducible expression of a coding sequence of the present invention. Such a promoter is, for example, the alcA gene promoter from Aspergillus nidulans (Caddick et al. (1998) Nat. Biotechnol.
16: 177-180). In A. nidulans, the alcA gene encodes a bone dehydrogenase, the expression of which is regulated by the AlcR transcription factor in the presence of a chemical inducer. For the purposes of the present invention, the CAT coding sequence (Caddic) in plasmid parcA: CAT containing the alcA gene promoter sequence fused to a minimal 35S promoter.
(1998) Nat. Biotechnol. 16: 177-180) is replaced by the coding sequence of the present invention to produce an expression cassette having the coding sequence under the control of the alcA gene promoter. This is performed using methods well known in the art.

【０１４３】 ｆ．誘導性発現、グルココルチコイド−誘導性プロモーター： ステロイドホルモンを基礎にした系を用いた方法の核酸配列の発現の誘導も意
図される。例えば、グルココルチコイド媒介性誘導系が用いられ（Aoyama and C
hua （1997）The Plant Journal 11:605-612）、グルココルチコイド、例えば合
成グルココルチコイド、好ましくはデキサメタソンの、好ましくは0.1mM 〜1mM
、さらに好ましくは10mM〜100mM の範囲の濃度での適用により、遺伝子発現が誘
導される。本発明の目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子配列が本発明の核酸配
列により置換されて、35S 最小プロモーターに融合されたGAL4上流活性化配列の
６つのコピーの制御下で本発明の核酸配列を有する発現カセットを生成する。こ
れは、当業界で周知の方法を用いて実行される。トランス作用因子は、ラットグ
ルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン（Picard et al.,（1988））に
融合されたヘルペスウイルスタンパク質VP16のトランス活性化ドメイン（Trieze
nberg et al.（1988）Genes Devel. 2:718-729）に融合されたGAL4ＤＮＡ結合ド
メイン（Keegan et al. （1986））を包含する。融合タンパク質の発現は、当業
界で既知の、または本明細書に記載した植物中での発現に適した任意のプロモー
ターにより制御される。この発現カセットは、6XGAL4/ 最小プロモーターに融合
される本発明の核酸配列を包含する植物中にも含まれる。したがって、融合タン
パク質の組織または器官特異性が達成され、殺昆虫毒素の誘導性組織または器官
特異性がもたらされる。F. Inducible Expression, Glucocorticoid-Inducible Promoter: Induction of expression of a nucleic acid sequence in a method using a steroid hormone-based system is also contemplated. For example, a glucocorticoid-mediated induction system has been used (Aoyama and C
hua (1997) The Plant Journal 11: 605-612), of a glucocorticoid such as a synthetic glucocorticoid, preferably dexamethasone, preferably 0.1 mM to 1 mM.
, And more preferably, application at a concentration in the range of 10 mM to 100 mM induces gene expression. For the purposes of the present invention, the expression having the nucleic acid sequence of the invention under the control of six copies of the GAL4 upstream activation sequence fused to the 35S minimal promoter, wherein the luciferase gene sequence has been replaced by the nucleic acid sequence of the invention. Generate a cassette. This is performed using methods well known in the art. The trans-acting factor is a transactivation domain of the herpesvirus protein VP16 (Trieze) fused to the hormone-binding domain of the rat glucocorticoid receptor (Picard et al., (1988)).
nberg et al. (1988) Genes Devel. 2: 718-729) and the GAL4 DNA binding domain (Keegan et al. (1986)). Expression of the fusion protein is controlled by any promoter suitable for expression in plants known in the art or described herein. This expression cassette is also included in plants that contain a nucleic acid sequence of the invention fused to the 6XGAL4 / minimal promoter. Thus, tissue or organ specificity of the fusion protein is achieved, resulting in inducible tissue or organ specificity of the insecticidal toxin.

【０１４４】 ｇ．根特異的発現： 遺伝子発現の別のパターンは、根発現である。適切な根プロモーターは、de F
ramond（FEBS 290:103-106（1991））により、そして公告済特許出願EP0452269
（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）にも記載されている。こ
のプロモーターは、選択遺伝子の挿入とその後の当該形質転換ベクターへの全プ
ロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットの移入のために、適切なベクター
、例えばpCGN1761ENX に移入される。G. Root-specific expression: Another pattern of gene expression is root expression. A suitable root promoter is de F
ramond (FEBS 290: 103-106 (1991)) and published patent application EP0452269
(This description is also included herein by reference). This promoter is transferred into a suitable vector, such as pCGN1761ENX, for insertion of the selection gene and subsequent transfer of the entire promoter-gene-terminator cassette into the transformation vector.

【０１４５】 ｈ．創傷誘導性プロモーター： 創傷誘導性プロモーターは、遺伝子発現に適している。多数のこのようなプロ
モーターが記載されており（例えば、Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-58
8 （1993）; Logemann et al. Plant Cell 1:151-158（1989）; Rohrmeier & Le
hle, Plant Molec. Biol. 22:783-792（1993）; Firek et al. Plant Molec. Bi
ol. 22:129-142（1993）; Warner et al. Plant J. 3:191-201（1993））、そし
てすべてが本発明に関する使用に適している。Logemann等は、双子葉類ジャガイ
モwunI遺伝子の５‘上流配列を記載する。Xu等は、双子葉類ジャガイモ（pin2）
からの創傷誘発性プロモーターが単子葉類のイネにおいて活性であることを示す
。さらに、Rohrmeier & Lehle は、創傷誘導性で、標準技法を用いてコグネイト
プロモーターを単離するために用いられ得るトウモロコシWipIｃＤＮＡのクロー
ニングを記載する。同様に、Firek 等およびWarner等は、局所創傷および病原体
侵襲部位で発現される単子葉類のAsparagus officinalis からの創傷誘導性遺伝
子を記載している。当業界で周知のクローニング技術を用いて、これらのプロモ
ーターは適切なベクターに移入され、本発明に属する遺伝子に融合され、そして
植物創傷部位でこれらの遺伝子を発現するために用いられ得る。H. Wound-inducible promoter: Wound-inducible promoters are suitable for gene expression. Many such promoters have been described (eg, Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-58).
8 (1993); Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158 (1989); Rohrmeier & Le
hle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993); Firek et al. Plant Molec. Bi
ol. 22: 129-142 (1993); Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993)), and all are suitable for use with the present invention. Logemann et al. Describe the 5 'upstream sequence of the dicotyledon potato wunI gene. Xu etc. are dicotyledon potatoes (pin2)
Shows that the wound-inducible promoter from E. coli is active in monocotyledonous rice. In addition, Rohrmeier & Lehle describes the cloning of a maize Wipl cDNA that is wound inducible and can be used to isolate the cognate promoter using standard techniques. Similarly, Firek et al. And Warner et al. Describe a wound-inducing gene from the monocotyledon Asparagus officinalis expressed at local wounds and sites of pathogen infestation. Using cloning techniques well known in the art, these promoters can be transferred into a suitable vector, fused to the genes belonging to the present invention, and used to express these genes at plant wound sites.

【０１４６】 ｉ．髄−優先発現： 特許出願WO93/07278（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は
、髄細胞中で選択的に発現されるトウモロコシtrpA遺伝子の単離を記載する。転
写起始から〜1726bpまで延びる遺伝子配列およびプロモーターが示されている。
標準分子生物学的技法を用いて、このプロモーターまたはその一部は、それが35
S プロモーターを置換し得るベクター、例えばpCGN1761に移入され、髄優先方式
で外来遺伝子の発現を駆動するために用いられ得る。実際、髄優先プロモーター
またはその一部を含有する断片は任意のベクターに移入され、トランスジェニッ
ク植物中での利用のために修飾され得る。I. Medullary-preferred expression: Patent application WO 93/07278, which is incorporated herein by reference, describes the isolation of a maize trpA gene that is selectively expressed in marrow cells. Gene sequences and promoters extending from the transcription initiation to 11726 bp are shown.
Using standard molecular biology techniques, this promoter or a portion thereof
It can be transferred into a vector that can replace the S promoter, such as pCGN1761, and used to drive expression of the foreign gene in a pith-preferred manner. Indeed, the fragment containing the pith-preferred promoter or a portion thereof can be transferred to any vector and modified for use in transgenic plants.

【０１４７】 ｊ．葉特異的発現： ホスホエノールカルボキシラーゼ（PEPC）をコードするトウモロコシ遺伝子は
、Hudspeth & Grula（Plant Molec. Biol. 12:579-589 （1989））により記載さ
れている。標準分子生物学的技法を用いて、この遺伝子のためのプロモーターは
、トランスジェニック植物中での葉特異的方式での任意の遺伝子の発現を駆動す
るために用いられ得る。J. Leaf-specific expression: The maize gene encoding phosphoenol carboxylase (PEPC) has been described by Hudspeth & Grula (Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989)). Using standard molecular biology techniques, a promoter for this gene can be used to drive expression of any gene in a leaf-specific manner in transgenic plants.

【０１４８】 ｋ．花粉特異的発現： WO93/07278は、花粉細胞中で発現されるトウモロコシカルシウム依存性プロテ
インキナーゼ（CDPK）遺伝子の単離を記載する。遺伝子配列およびプロモーター
は、転写の起始から1400bpまで延びる。標準分子生物学的技法を用いて、このプ
ロモーターまたはその一部は、それが35S プロモーターを置換し得るベクター、
例えばpCGN1761に移入され、花粉特異的方式で本発明の核酸配列の発現を駆動す
るために用いられ得る。K. Pollen-specific expression: WO93 / 07278 describes the isolation of a maize calcium-dependent protein kinase (CDPK) gene expressed in pollen cells. The gene sequence and promoter extend from the beginning of transcription to 1400 bp. Using standard molecular biology techniques, this promoter or a portion thereof is a vector in which it can replace the 35S promoter,
For example, it can be transferred to pCGN1761 and used to drive expression of a nucleic acid sequence of the invention in a pollen-specific manner.

【０１４９】 ２．転写ターミネーター 種々の転写ターミネーターは、発現カセット中で用いるために利用可能である
。これらは、トランスジーンを越えた転写の終止およびその正しいポリアデニル
化に関与する。適切な転写ターミネーターは、植物中で機能することが知られて
いるものであり、その例としては、CaMV 35Sターミネーター、tmI ターミネータ
ー、ノパリンシンターゼターミネーターおよびエンドウ豆rbcS E9 ターミネータ
ーが挙げられる。これらは、単子葉類および双子葉類の両方で用いられ得る。さ
らに、遺伝子のネイティブ転写ターミネーターが用いられ得る。[0149] 2. Transcription terminators A variety of transcription terminators are available for use in expression cassettes. These are involved in the termination of transcription across the transgene and its correct polyadenylation. Suitable transcription terminators are those known to function in plants, examples of which include the CaMV 35S terminator, the tmI terminator, the nopaline synthase terminator and the pea rbcS E9 terminator. These can be used in both monocots and dicots. In addition, the native transcription terminator of the gene may be used.

【０１５０】 ３．発現の増強または調節のための配列 多数の配列が、転写単位内から遺伝子発現を増強することが判明しており、こ
れらの配列は、トランスジェニック植物中でのそれらの発現を増大するために本
発明の遺伝子と一緒に用いられ得る。 種々のイントロン配列が、特に単子葉細胞において、発現を増強することが示
されている。例えば、トウモロコシAdhI遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細
胞に導入された場合、そのコグネイトプロモーター下で野生型遺伝子の発現を有
意に増強することが判明している。イントロン１は特に有効であることが判明し
ており、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築
物中での発現を増強した（Callis et al., Genes Develop. 1:1183-1200 （1987
））。同一実験系において、トウモロコシbronze1 遺伝子からのイントロンは、
発現増強に際して同様の作用を示した。イントロン配列は、植物形質転換ベクタ
ー中に、典型的には非翻訳リーダー内に、ルーチンに組み入れられている。[0150] 3. Sequences for Enhancing or Regulating Expression A number of sequences have been found to enhance gene expression from within transcription units, and these sequences may be used to enhance their expression in transgenic plants. It can be used with the gene of the invention. Various intron sequences have been shown to enhance expression, especially in monocot cells. For example, it has been found that the intron of the maize AdhI gene, when introduced into maize cells, significantly enhances the expression of the wild-type gene under its cognate promoter. Intron 1 has been found to be particularly effective and has enhanced expression in fusion constructs with the chloramphenicol acetyltransferase gene (Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987).
)). In the same experimental system, the intron from the maize bronze1 gene was
A similar effect was exhibited upon enhancing expression. Intron sequences are routinely incorporated into plant transformation vectors, typically within a non-translated leader.

【０１５１】 ウイルスから得られる多数の非翻訳リーダー配列も発現を増強することが知ら
れており、これらは、単子葉細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイ
ルス（TMV 、「Ｗ配列」）、トウモロコシ萎黄病斑点ウイルス（MCMV）およびア
ルファルファモザイクウイルス（AMV ）からのリーダー配列は、発現増強に有効
であることが示されている（例えば、Gallie et al. Nucl Acids Res. 15:8693-
8711（1987）; Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15:65-79 （1990））。A number of non-translated leader sequences derived from viruses are also known to enhance expression, and are particularly effective in monocot cells. In particular, leader sequences from tobacco mosaic virus (TMV, “W sequence”), maize yellow spot virus (MCMV) and alfalfa mosaic virus (AMV) have been shown to be effective in enhancing expression (eg, Gallie et al. Nucl Acids Res. 15: 8693-
8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

【０１５２】 ４．細胞内の遺伝子生成物の標的化 遺伝子生成物をターゲッティングするための種々のメカニズムは、植物中に存
在することが知られて織り、これらのメカニズムの機能を制御する配列は多少詳
細に特性化されている。例えば、葉緑体に対する遺伝子生成物のターゲッティン
グは、成熟タンパク質を賛成するために葉緑体が輸入中に開裂される種々のタン
パク質のアミノ末端に見出されるシグナル配列により制御される（例えば、Coma
i et al. J. Biol. Chem. 263:15104-15109 （1988））。これらのシグナル配列
は、葉緑体中への異種生成物の輸入を実行するために異種遺伝子生成物と融合さ
れ得る（van den Broeck, et al. Nature 313:358-363 （1985））。適切なシグ
ナル配列をコードするＤＮＡは、RUBISCO タンパク質、CAB タンパク質、EPSPシ
ンターゼ酵素、GS2 タンパク質および葉緑体局在化されることが知られているそ
の他の多数のタンパク質をコードするｃＤＮＡの５‘末端から単離され得る（米
国特許第5,639,949 号の実施例３７の「葉緑体ターゲッティングによる発現」の
項も参照）。[0152] 4. Targeting gene products in cells Various mechanisms for targeting gene products are known to exist in plants and weave, and the sequences that control the function of these mechanisms have been characterized in some detail. ing. For example, targeting of gene products to chloroplasts is controlled by signal sequences found at the amino terminus of various proteins that are cleaved during import to support the mature protein (eg, Coma).
i et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). These signal sequences can be fused with a heterologous gene product to effect import of the heterologous product into the chloroplast (van den Broeck, et al. Nature 313: 358-363 (1985)). The DNA encoding the appropriate signal sequence is the 5 'end of the cDNA encoding RUBISCO protein, CAB protein, EPSP synthase enzyme, GS2 protein and many other proteins known to be localized in chloroplasts. (See also “Expression by Chloroplast Targeting” in Example 37 of US Pat. No. 5,639,949).

【０１５３】 その他の遺伝子生成物は、他の細胞小器官、例えばミトコンドリアおよびペル
オキシソームに局在化される（例えば、Unger et al. Plant Molec. Biol. 13:4
11-418（1989））。これらの生成物をコードするｃＤＮＡも、これらの細胞小器
官に対する異種遺伝子生成物のターゲッティングを実行するために操作され得る
。このような配列の例は、核コード化ＡＴＰアーゼおよびミトコンドリアに特異
的なアスパルテートアミノトランスフェラーゼアイソフォームである。ターゲッ
ティング細胞タンパク質体は、Rogers等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512
-6516 （1985））により記載されている。Other gene products are localized to other organelles such as mitochondria and peroxisomes (eg, Unger et al. Plant Molec. Biol. 13: 4
11-418 (1989)). The cDNAs encoding these products can also be manipulated to perform targeting of heterologous gene products to these organelles. Examples of such sequences are nuclear-encoded ATPase and mitochondrial-specific aspartate aminotransferase isoforms. The targeting cell protein body is described by Rogers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512
-6516 (1985)).

【０１５４】 さらに、他の細胞区画に対する遺伝子生成物のターゲッティングを引き起こす
配列が特性化されている。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラスト、およびアリ
ューロン細胞からの細胞外分泌に対するターゲッティングに関与する（Koehler
& Ho, Plant Cell 2:769-783（1990））。さらに、アミノ末端配列は、カルボキ
シ末端配列と一緒に、遺伝子生成物に対する液胞型ターゲッティングに関与する
（Shinshi et al. Plant Molec. Biol.14:357-368 （1990））。In addition, sequences that cause targeting of the gene product to other cellular compartments have been characterized. Amino-terminal sequences are involved in targeting ER, apoplasts, and extracellular secretion from aleurone cells (Koehler
& Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). In addition, the amino terminal sequence, together with the carboxy terminal sequence, is involved in vacuolar targeting to gene products (Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).

【０１５５】 前記の適切なターゲッティング配列と当該トランスジーン配列との融合により
、トランスジーン生成物を任意の細胞小器官または細胞区画に向けることができ
る。例えば、葉緑体ターゲッティングに関しては、RUBISCO 遺伝子、CAB 遺伝子
、EPSPシンターゼ遺伝子またはGS2 遺伝子からの葉緑体シグナル配列が、枠内で
、トランスジーンのアミノ末端ＡＴＧに融合される。選択されるシグナル配列は
既知の開裂部位を含むべきであり、そして構築された融合物は、開列に必要な開
裂部位後のあらゆるアミノ酸を考慮すべきである。いくつかの場合には、この要
件は、開裂部位とトランスジーンＡＴＧとの間の少数のアミノ酸の付加により、
あるいは、トランスジーン配列内のいくつかのアミノ酸の置換により満たされ得
る。葉緑体輸入のために構築された融合物は、in vitro転写構築物のin vitro翻
訳による葉緑体取込みとその後の、Bartlett等（Edelmann et al. （Eds.）Meth
ods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091 （1982））お
よびWasmann 等（Mol. Gen. Genet. 205:446-453（1986））により記載された技
術を用いるin vitro葉緑体取込みの効力に関して検査され得る。これらの構築技
術は当業界で周知であり、ミトコンドリアおよびペルオキシソームに等しく適用
可能である。The transgene product can be directed to any organelle or cell compartment by fusion of the appropriate targeting sequence with the transgene sequence. For example, for chloroplast targeting, a chloroplast signal sequence from the RUBISCO gene, CAB gene, EPSP synthase gene or GS2 gene is fused in frame to the amino-terminal ATG of the transgene. The signal sequence chosen should contain a known cleavage site, and the constructed fusion should take into account any amino acids after the cleavage site required for cleavage. In some cases, this requirement is due to the addition of a few amino acids between the cleavage site and the transgene ATG.
Alternatively, it can be satisfied by substitution of some amino acids in the transgene sequence. Fusions constructed for chloroplast import include chloroplast uptake by in vitro translation of in vitro transcribed constructs, followed by Bartlett et al. (Edelmann et al. (Eds.) Meth.
ods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091 (1982)) and the efficacy of in vitro chloroplast uptake using the technique described by Wasmann et al. (Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Can be inspected. These construction techniques are well known in the art and are equally applicable to mitochondria and peroxisomes.

【０１５６】 細胞ターゲッティングに関する前記のメカニズムは、それらのコグネイトプロ
モーターと一緒にだけでなく、異種プロモーターとも一緒に、ターゲッティング
シグナルが誘導するプロモーターの場合とは異なる発現パターンを有するプロモ
ーターの転写調節下で特異的細胞ターゲッティング目標を実行するために、利用
され得る。The mechanism described above for cell targeting, not only with their cognate promoters, but also with heterologous promoters, under the transcriptional regulation of promoters with a different expression pattern than the promoters driven by the targeting signal It can be used to perform specific cell targeting goals.

【０１５７】 実施例２４：植物形質転換ベクターの構築 植物形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターが植物形質転換業界の当業
者に知られており、本発明に属する遺伝子は、あらゆるこのようなベクターと一
緒に用いられ得る。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の
ための標的種によっている。ある種の標的種に関しては、異なる抗生物質または
除草剤選択マーカーが選択され得る。形質転換にルーチンに用いられる選択マー
カーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するnptII
遺伝子（Messing & Vierra, Gene 19:259-268 （1982）; Bevan et al., Nature
304:184-187（1983））。除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するba
r 遺伝子（White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062（1990）; Spencer et al.
, Theor. Appl. Genet. 79:625-631（1990））、抗生物質ハイグロマイシンに対
する耐性を付与するhph 遺伝子（Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4
:2929-2931）、およびメタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子（Bo
urouis et al., EMBO J. 2（7 ）:1099-1104（1983））、ならびにグリフォセー
トに対する耐性を付与するEPSPS 遺伝子（米国特許第4,940,935 号および第5,18
8,642 号）が挙げられる。Example 24: Construction of Plant Transformation Vectors A large number of transformation vectors available for plant transformation are known to those skilled in the plant transformation art, and the genes belonging to the invention It can be used with a vector. The choice of vector will depend on the preferred transformation technique and target species for transformation. For certain target species, different antibiotic or herbicide selection markers may be selected. Selection markers routinely used for transformation include nptII, which confers resistance to kanamycin and related antibiotics.
Gene (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature
304: 184-187 (1983)). Ba confers resistance to the herbicide phosphinothricin
r gene (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990); Spencer et al.
Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), the hph gene that confers resistance to the antibiotic hygromycin (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4).
: 2929-2931) and the dhfr gene (Bo that confers resistance to metatrexate)
urouis et al., EMBO J. 2 (7): 1099-1104 (1983)), and the EPSPS gene that confers resistance to glyphosate (US Pat. Nos. 4,940,935 and 5,18).
8,642).

【０１５８】 １．アグロバクテリウム形質転換に適したベクター 多数のベクターが、アグロバクテリウムのAgrobacterium tumefaciens を用い
た形質転換に利用可能である。これらは、典型的には、少なくとも１つのＴ−Ｄ
ＮＡボーダー配列を保有し、その例としては、例えばpBIN19（Bevan, Nucl. Aci
ds Res. （1984））およびpXYZのようなベクターが挙げられる。以下に、アグロ
バクテリウム形質転換に適した２つの典型的ベクターの構築を記載する。[0158] 1. Vectors Suitable for Agrobacterium Transformation Many vectors are available for transformation of Agrobacterium with Agrobacterium tumefaciens. These typically have at least one TD
Possesses the NA border sequence, for example, pBIN19 (Bevan, Nucl.
ds Res. (1984)) and pXYZ. The following describes the construction of two exemplary vectors suitable for Agrobacterium transformation.

【０１５９】 ａ．pCIB200 およびpCIB2001： バイナリーベクターpCIB200 およびpCIB2001は、アグロバクテリウムに関して
用いるための組換えベクターの構築に用いられ、以下の方式で構築される。pTJS
75kan は、pTJS75のNarI消化により作成され（Schmidhauser & Helinski, J. Ba
cteriol. 164:446-455（1985））、テトラサイクリン耐性遺伝子の切り出しと、
その後の、NPTII を保有するpUC4K からのAccI断片の挿入を可能にする（ Messi
ng & Vierra, Gene 19:259-268（1982）; Bevan et al., Nature 304:184-187（
1983）；McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276（1990））。Xh
oIリンカーは、左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー、植物選択性nos/nptII キメラ遺
伝子およびpUC ポリリンカーを含有するPCIB7 のEcoRV 断片に結紮され（Rothst
ein et al., Gene 53:153-161 （1987））、そしてXhoI消化断片は、SaII消化pT
JS75kan 中にクローン化されて、pCIB200 を作成する（EP0332104 の実施例１９
も参照）。 pCIB200は、以下の独自のポリリンカー制限部位を含有する：EcoRI
、SstI、KpnI、BglII 、XbaIおよびSaII。pCIB2001は、付加的制限部位のポリリ
ンカー中への挿入により作成されるpCIB200 の誘導体である。pCIB2001のポリリ
ンカー中の独自の制限部位は、 EcoRI、SstI、KpnI、BglII 、XbaI、SaII、MluI
、BclI、AvrII 、ApaI、HpaIおよびStuIである。これらの独自の制限部位の他に
、 pCIB2001 は、植物および細菌カナマイシン選択、アグロバクテリウム媒介性
形質転換のための左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー、大腸菌と他の宿主との間の可
動性のためのRK2-由来trfA機能、ならびにRK2 からのOriTおよびOriV機能を有す
る。pCIB2001ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含有する植物発現カセ
ットのクローニングに適している。A. pCIB200 and pCIB2001: Binary vectors pCIB200 and pCIB2001 are used to construct recombinant vectors for use with Agrobacterium and are constructed in the following manner. pTJS
75kan was made by NarI digestion of pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Ba
cteriol. 164: 446-455 (1985)), excision of the tetracycline resistance gene,
The subsequent insertion of the AccI fragment from pUC4K carrying NPTII is possible (Messi
ng & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (
1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Xh
The oI linker was ligated to the EcoRV fragment of PCIB7 containing the left and right T-DNA borders, the plant-selective nos / nptII chimeric gene and the pUC polylinker (Rothst
ein et al., Gene 53: 153-161 (1987)), and the XhoI digested fragment
Cloned into JS75kan to create pCIB200 (Example 19 of EP0332104)
See also). pCIB200 contains the following unique polylinker restriction sites: EcoRI
, SstI, KpnI, BglII, XbaI and SaII. pCIB2001 is a derivative of pCIB200 created by insertion of an additional restriction site into the polylinker. The unique restriction sites in the polylinker of pCIB2001 are EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SaII, MluI
, BclI, AvrII, ApaI, HpaI and StuI. In addition to these unique restriction sites, pCIB2001 is used for plant and bacterial kanamycin selection, left and right T-DNA borders for Agrobacterium-mediated transformation, for mobility between E. coli and other hosts. RK2-derived trfA function, and OriT and OriV functions from RK2. The pCIB2001 polylinker is suitable for cloning plant expression cassettes that contain their own regulatory signals.

【０１６０】 ｂ．pCIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体 バイナリーベクターpCIB10は、植物中での選択のためのカナマイシン耐性をコ
ードする遺伝子、ならびにＴ−ＤＮＡ右および左ボーダー配列を含有し、そして
大腸菌とアグロバクテリウムの両方でそれを複製させる広範宿主範囲プラスミド
pRK252からの配列を組み入れる。その構築は、Rothstein 等（Gene 53:153-161
（1987））により記載されている。Gritz 等（Gene 25:179-188 （1983））によ
り記載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼに関する遺伝子を組
み入れる種々の誘導体が構築される。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ
（pCIB743 ）または胚グロマイシンとカナマイシン（pCIB715 、 pCIB717）に関
するトランスジェニック植物細胞の選択を可能にする。B. pCIB10 and its Hygromycin-Selective Derivatives The binary vector pCIB10 contains the gene encoding kanamycin resistance for selection in plants, as well as the T-DNA right and left border sequences, and is expressed in both E. coli and Agrobacterium. A broad host range plasmid to replicate
Incorporate the sequence from pRK252. Its construction is described by Rothstein et al. (Gene 53: 153-161).
(1987)). Various derivatives have been constructed that incorporate the gene for hygromycin B phosphotransferase described by Gritz et al. (Gene 25: 179-188 (1983)). These derivatives allow the selection of transgenic plant cells for hygromycin alone (pCIB743) or embryonic gromycin and kanamycin (pCIB715, pCIB717).

【０１６１】 ２．非アグロバクテリウム形質転換に適したベクター Agrobacterium tumefaciens を用いない形質転換は、選択される形質転換ベク
ター中のＴ−ＤＮＡ配列に関する要件を回避し、したがって、これらの配列を欠
くベクターが、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する前記のようなベクターに加えて、利用
され得る。アグロバクテリウムに頼らない形質転換技術としては、粒子衝撃によ
る形質転換、プロトプラスト取込み（例えば、ＰＥＧおよび電気穿孔）ならびに
マイクロインジェクションが挙げられる。ベクターの選択は、形質転換されてい
る種に対する好ましい選択に大いに拠っている。以下に、非アグロバクテリウム
形質転換に適した典型的ベクターの構築を記載する。[0161] 2. Transformation without Agrobacterium tumefaciens, a vector suitable for non-Agrobacterium transformation, circumvents the requirement for T-DNA sequences in the transformation vector of choice, and therefore, vectors lacking these sequences may be In addition to the above vectors containing sequences, they can be utilized. Transformation techniques that do not rely on Agrobacterium include particle bombardment, protoplast uptake (eg, PEG and electroporation), and microinjection. The choice of vector is largely dependent on the preferred selection for the species being transformed. The following describes the construction of a typical vector suitable for non-Agrobacterium transformation.

【０１６２】 ａ．pCIB3064： pCIB3064は、除草剤バスタ（またはホスフィノトリシン）による選択と組合せ
た直接遺伝子移入技術に適したpUC 由来ベクターである。プラスミドpCIB246 は
、大腸菌GUS 遺伝子とCaMV 35S転写ターミネーターとの操作可能的融合でCaMV 3
5Sプロモーターを包含し、ＰＣＴ公告済出願WO93/07278に記載されている。この
ベクターの35S プロモーターは、開始部位の２つのＡＴＧ配列５’を含有する。
これらの部位は、ＡＴＧを除去し、制限部位SspIおよびPvuII を生成するような
方法で、標準ＰＣＲ技術を用いて突然変異化される。新規の制限部位は、独自の
SalI部位から96および37bp離れ、実際の開始部位から101 および42bp離れている
。その結果生じるpCIB246 の誘導体は、pCIB3025と呼ばれる。次に、SalIおよび
SacIによる消化によってpCIB3025からGUS 遺伝子が切り出され、末端が平滑にさ
れ、再結紮されてプラスミドpCIB3060を生じる。プラスミドPjit82は、John Inn
es Centre, Norwichから得られ、ストレプトミセス属のStreptomyces viridochr
omogenesからのbar 遺伝子を含有する400bp の小断片が切り出され、pCIB3060の
HpaI部位に挿入される（Thompson et al., EMBO J. 6:2519-2523（1987））。こ
れは、除草剤選択のためのCaMV 35Sプロモーターおよびターミネーターの制御下
のbar 遺伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子（大腸菌中での選択のため）、
ならびに独自の部位SphI、PstI、HindIII およびBamHI を有するポリリンカーを
包含するpCIB3064を生じる。このベクターは、それら自体の調節シグナルを含有
する植物発現カセットのクローニングに適している。A. pCIB3064: pCIB3064 is a pUC-derived vector suitable for direct gene transfer techniques in combination with selection with the herbicide vasta (or phosphinothricin). Plasmid pCIB246 contains a CaMV 3 in an operable fusion of the E. coli GUS gene with the CaMV 35S transcription terminator.
It includes the 5S promoter and is described in PCT published application WO 93/07278. The 35S promoter of this vector contains the two ATG sequences 5 'of the start site.
These sites are mutated using standard PCR techniques in such a way as to remove the ATG and generate the restriction sites SspI and PvuII. New restriction sites have their own
96 and 37 bp away from the SalI site and 101 and 42 bp away from the actual start site. The resulting derivative of pCIB246 is called pCIB3025. Next, SalI and
The GUS gene is excised from pCIB3025 by digestion with SacI, blunted and religated to yield plasmid pCIB3060. Plasmid Pjit82 is located at John Inn
Streptomyces viridochr, obtained from es Centre, Norwich
A small 400 bp fragment containing the bar gene from omogenes was cut out and pCIB3060
Inserted at the HpaI site (Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2523 (1987)). This includes the bar gene under the control of the CaMV 35S promoter and terminator for herbicide selection, the gene for ampicillin resistance (for selection in E. coli),
And pCIB3064, which includes a polylinker with unique sites SphI, PstI, HindIII and BamHI. This vector is suitable for cloning plant expression cassettes that contain their own regulatory signals.

【０１６３】 ｂ．pSOG19およびpSOG35： pSOG35は、メトトレキセートに対する耐性を付与する選択可能マーカーとして
大腸菌遺伝子ジヒドロフォレエートレダクターゼ（ＤＦＲ）を利用する形質転換
ベクターである。ＰＣＲは、35S プロモーター（〜800bp ）、トウモロコシAdh1
遺伝子からのイントロン６（〜550bp ）およびpSOG10からの18bpのGUS 非翻訳リ
ーダー配列を増幅するために用いられる。大腸菌ジヒドロフォレートレダクター
ゼII型遺伝子をコードする250bp 断片もＰＣＲにより増幅され、これら２つのＰ
ＣＲ断片は、pUC19 ベクター主鎖およびノパリンシンターゼターミネーターを包
含するpB1221（Clontech）からのSacI-PstI 断片とともに集合される。これらの
断片のアッセンブリーは、イントロン６配列、GUS リーダー、DHFR遺伝子および
ノパリンシンターゼターミネーターと融合して35S プロモーターを含有するpSOG
19を生成する。トウモロコシ萎黄病斑点ウイルス（MCMV）からのリーダー配列に
よるpSOG19中のGUS リーダーの置換は、ベクターpSOG35を生じる。pSOG19および
pSOG35は、アンピシリン耐性に関するpUC 遺伝子を保有し、外来物質のクローニ
ングに利用可能なHindIII 、SphI、PstIおよびEcoRI 部位を有する。B. pSOG19 and pSOG35: pSOG35 is a transformation vector that utilizes the E. coli gene dihydrophore reductase (DFR) as a selectable marker that confers resistance to methotrexate. PCR was performed using 35S promoter (~ 800 bp), corn Adh1
Used to amplify intron 6 (６550 bp) from the gene and 18 bp GUS untranslated leader sequence from pSOG10. A 250 bp fragment encoding the E. coli dihydrofolate reductase type II gene was also amplified by PCR and these two P
The CR fragment is assembled with the SacI-PstI fragment from pB1221 (Clontech), which includes the pUC19 vector backbone and the nopaline synthase terminator. The assembly of these fragments is a pSOG containing the 35S promoter fused to the intron 6 sequence, GUS leader, DHFR gene and nopaline synthase terminator.
Generate 19. Replacement of the GUS leader in pSOG19 with a leader sequence from maize yellow spot virus (MCMV) yields the vector pSOG35. pSOG19 and
pSOG35 carries the pUC gene for ampicillin resistance and has HindIII, SphI, PstI and EcoRI sites available for cloning foreign material.

【０１６４】 実施例２５：形質転換 本発明の核酸配列が発現系中にクローン化されると、それは植物細胞中に形質
転換される。植物の形質転換および再生のための方法は、当業界で周知である。
例えば、Tiプラスミドベクターは、外来ＤＮＡの送達、ならびに直接ＤＮＡ取込
み、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクションおよびマイクロプロジェ
クションに利用されている。さらに、アグロバクテリウム属からの細菌は、植物
細胞を形質転換するために利用され得る。以下は、双子葉類および単子葉類植物
の両方を形質転換するための代表的技術の説明である。Example 25: Transformation Once a nucleic acid sequence of the invention has been cloned into an expression system, it is transformed into plant cells. Methods for plant transformation and regeneration are well known in the art.
For example, Ti plasmid vectors have been used for delivery of foreign DNA, as well as for direct DNA uptake, liposomes, electroporation, microinjection and microprojection. In addition, bacteria from the genus Agrobacterium can be used to transform plant cells. The following is a description of representative techniques for transforming both dicotyledonous and monocotyledonous plants.

【０１６５】 １．双子葉類の形質転換 双子葉類のための形質転換技術は当業界で周知であり、その例としては、アグ
ロバクテリウムベースの技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術が挙
げられる。非アグロバクテリウム技術は、プロトプラストまたは細胞による直接
的な外生的遺伝物質の取込みを包含する。これは、ＰＥＧまたは電気穿孔媒介性
取込み、粒子衝撃媒介性送達、またはマイクロインジェクションにより達成され
得る。これらの技法の例は、以下の文献に記載されている：Paszkowski et al.,
EMBO J. 3:2717-2722（1984）; Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-
177 （1985）; Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 （1986）およびKlei
n et al., Nature 327:70-73（1987）。各々の場合、形質転換細胞は、当業界で
既知の標準技法を用いて、全植物体に再生される。[0165] 1. Transformation of dicots Transformation techniques for dicots are well known in the art, and include Agrobacterium-based techniques and techniques that do not require Agrobacterium. Non-Agrobacterium technology involves the direct uptake of exogenous genetic material by protoplasts or cells. This can be achieved by PEG or electroporation mediated uptake, particle impact mediated delivery, or microinjection. Examples of these techniques are described in the following literature: Paszkowski et al.,
EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-
177 (1985); Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986) and Klei.
n et al., Nature 327: 70-73 (1987). In each case, the transformed cells are regenerated into whole plants using standard techniques known in the art.

【０１６６】 アグロバクテリウム媒介性形質転換は、その形質転換効力および多数の異なる
種を用いたその広範な効用のために、双子葉類の形質転換に好ましい技術である
。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、同時在住Tiプラスミド上にまた
は染色体上に、宿主アグロバクテリウム株により保有されるvir 遺伝子の補体に
よっている適切なアグロバクテリウム株（例えばpCIB200 またはpCIB2001に関し
てはCIB542株）への、当該外来ＤＮＡを保有するバイナリーベクター（例えば、
pCIB200 またはpCIB2001）の移入を包含する。組換えバイナリーベクターを保有
する大腸菌、pRK2013 のようなプラスミドを保有し、組換えバイナリーベクター
を標的アグロバクテリウム株に可動化し得るヘルパー大腸菌株を用いる三親交配
法により、アグロバクテリウムへの組換えバイナリーベクターの移入は成し遂げ
られる。あるいは、組換えバイナリーベクターは、ＤＮＡ形質転換によりアグロ
バクテリウムに移入され得る（Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:987
7 （1988））。Agrobacterium-mediated transformation is a preferred technique for dicot transformation due to its transformation efficacy and its widespread utility with a number of different species. Agrobacterium transformation is typically carried out on a co-resident Ti plasmid or on the chromosome by the appropriate Agrobacterium strain (eg, pCIB200 or pCIB2001) which is complemented by the vir gene carried by the host Agrobacterium strain. For the CIB542 strain, a binary vector carrying the foreign DNA (for example,
pCIB200 or pCIB2001). Escherichia coli harboring a recombinant binary vector, a three-parenter mating method using a helper Escherichia coli strain that harbors a plasmid such as pRK2013 and can mobilize the recombinant binary vector into a target Agrobacterium strain, The transfer of the binary vector is accomplished. Alternatively, the recombinant binary vector can be transferred to Agrobacterium by DNA transformation (Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 987).
7 (1988)).

【０１６７】 組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常は、植物から
の外植片とのアグロバクテリウムの同時培養を包含し、当業界で周知のプロトコ
ールに従う。形質転換組織は、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡボーダー間に存
在する抗生物質または除草剤耐性マーカーを保有する選択可能培地上で再生され
る。Transformation of a target plant species with a recombinant Agrobacterium usually involves co-culture of Agrobacterium with explants from the plant and follows protocols well known in the art. Transformed tissues are regenerated on a selectable medium that carries an antibiotic or herbicide resistance marker present between the binary plasmid T-DNA borders.

【０１６８】 遺伝子を用いて植物細胞を形質転換する別のアプローチは、植物組織および細
胞に、不活性または生物学的活性粒子を推進させることを包含する。この技法は
、米国特許第4,945,050 号、第5,036,006 号および第5,100,792 号（すべてSanf
ord 等）に開示されている。一般に、この手法は、細胞の外表面を貫通し、その
内部に組み入れをもたらすのに有効な条件下で、細胞に不活性または生物学的活
性粒子を推進させることを包含する。不活性粒子を用いる場合、ベクターは、所
望の遺伝子を含有するベクターで粒子を被覆することにより細胞中に導入され得
る。あるいは、標的細胞は、粒子の航跡により細胞中にベクターが運ばれるよう
に、ベクターに取り囲まれ得る。生物学的活性粒子（例えば、各々導入されると
思われるＤＮＡを含有する乾燥酵母菌細胞、乾燥細菌またはバクテリオファージ
）も、植物細胞組織中に推進され得る。Another approach to transforming plant cells with genes involves driving plant tissues and cells with inert or biologically active particles. This technique is disclosed in U.S. Pat. Nos. 4,945,050, 5,036,006 and 5,100,792 (all Sanf.
ord etc.). In general, this approach involves forcing the cell to pass inert or biologically active particles under conditions effective to penetrate the outer surface of the cell and effect internalization therein. When using inert particles, the vector can be introduced into cells by coating the particles with a vector containing the desired gene. Alternatively, the target cells may be surrounded by a vector such that the wake of the particles carries the vector into the cell. Biologically active particles, such as dried yeast cells, dried bacteria or bacteriophages, each containing the DNA to be introduced, can also be propelled into the plant cell tissue.

【０１６９】 ２．単子葉類の形質転換 ほとんどの単子葉類の形質転換も、目下、ルーチンになってきた。好ましい技
法としては、ＰＥＧまたは電気穿孔技法を用いたプロトプラストへの直接遺伝子
移入、ならびにカルス組織への粒子衝撃が挙げられる。形質転換は、単一ＤＮＡ
種または多ＤＮＡ種（即ち同時形質転換）を用いて成され得るが、これらの技法
はともに、本発明に関する使用に適している。同時形質転換は、完全ベクター構
築を回避し、そして当該遺伝子に関する非連鎖遺伝子座および選択可能マーカー
を有し、望ましいとみなされるべきその後の世代における選択可能マーカーの除
去を可能にするトランスジェニック植物を再生するという利点を有し得る。しか
しながら、同時形質転換の使用の欠点は、別個のＤＮＡ種がゲノムに統合される
頻度が100 ％未満であることである（Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1
096 （1986））。[0169] 2. Transformation of monocotyledons Transformation of most monocotyledons is now becoming routine. Preferred techniques include direct gene transfer into protoplasts using PEG or electroporation techniques, as well as particle bombardment of callus tissue. Transformation is single DNA
Species or multi-DNA species (ie, co-transformation), but both of these techniques are suitable for use with the present invention. Co-transformation avoids complete vector construction and transgenic plants that have unlinked loci for the gene of interest and a selectable marker, allowing removal of the selectable marker in subsequent generations to be considered desirable. It may have the advantage of regeneration. However, a disadvantage of using co-transformation is that the frequency of distinct DNA species being integrated into the genome is less than 100% (Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1).
096 (1986)).

【０１７０】 特許出願EP0292435 、EP0392225 およびWO93/07278は、トウモロコシの近親交
配系統からのカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧまたは電気穿孔を用い
るプロ等プラストの形質転換、ならびに形質転換プロトプラストからのトウモロ
コシ植物体の再生のための技術を記載する。Gordon-Kamm 等（Plant Cell 2:603
-618（1990））ならびにFromm 等（Biotechnology 8:833-839 （1990））は、粒
子衝撃を用いたA188由来トウモロコシ系統の形質転換のための技法を発表した。
さらに、WO93/07278およびKoziel等（Biotechnology 11:194-200（1993））は、
粒子衝撃によるトウモロコシの精選近親交配系統の形質転換のための技法を記載
する。この技法は、受粉後14〜15日目のトウモロコシの穂から切り出した長さ1.
5 〜2.5mm の未熟トウモロコシ胚と、衝撃のためのPDS-1000He Biolistics 装置
を利用する。Patent applications EP0292435, EP0392225 and WO93 / 07278 disclose the preparation of callus and protoplasts from inbred lines of maize, the transformation of pro-isoplasts using PEG or electroporation, and the transformation of maize plants from transformed protoplasts. Describe the technology for regeneration. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603
-618 (1990)) and Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) have described techniques for transformation of A188-derived corn lines using particle bombardment.
Further, WO93 / 07278 and Koziel et al. (Biotechnology 11: 194-200 (1993))
Techniques for the transformation of selected maize inbred lines by particle bombardment are described. This technique is cut from corn ears 14 to 15 days after pollination and has a length of 1.
Utilize 5-2.5 mm immature corn embryos and the PDS-1000He Biolistics instrument for impact.

【０１７１】 イネの形質転換も、プロトプラストを利用する直接遺伝子移入技法または粒子
衝撃によりなされ得る。プロトプラスト媒介性形質転換は、ジャポニカ型および
インディカ型に関して記載されている（Zhang et al., Plant Cell Rep. 7:379-
384 （1988）; Shimamoto et al., Nature 338:274-277（1989）; Datta et al.
, Biotechnology 8:736-740 （1990））。両型とも、粒子衝撃を用いてルーチン
に形質転換可能である（Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 （1991）
）。さらに、WO93/21335は、電気穿孔によるイネの形質転換のための技法を記載
する。Transformation of rice can also be done by direct gene transfer techniques utilizing protoplasts or particle bombardment. Protoplast-mediated transformation has been described for the Japonica and Indica types (Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379-
384 (1988); Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al.
Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Both types can be routinely transformed using particle bombardment (Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)).
). Furthermore, WO 93/21335 describes a technique for the transformation of rice by electroporation.

【０１７２】 特許出願EP0332581 は、Pooideaeプロトプラストの生成、形質転換および再生
のための技法を記載する。これらの技法は、Dactylisおよびコムギの形質転換を
可能にする。さらに、コムギ形質転換は、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞への粒
子衝撃を用いて、Vasil 等（Biotechnology 10:667-674（1992））により、そし
て未熟胚および未熟胚由来カルスを用いて、 Vasil等（Biotechnology 11:1553-
1558（1993））およびWeeks 等（Plant Physiol. 102:1077-1084（1993））によ
り記載されている。しかしながら、コムギ形質転換のための好ましい技法は、未
熟胚の粒子衝撃によるコムギの形質転換を包含し、遺伝子送達前の高スクロース
または高マルトース工程を含む。衝撃前に、任意数の胚（長さ0.75〜1mm ）を、
体性胚の誘導のために3 ％スクロース（Murashiga & Skoog, Physiologia Plant
arum 15:473-497 （1962））および3mg/l の２，４−Ｄを含有するＭＳ培地上で
プレート化し、これは暗所で進行される。衝撃の選定日に、胚を誘導培地から取
り出し、オスモチクム（即ち所望の濃度で、典型的には15％で付加されるスクロ
ースまたはマルト巣を含有する導入培地）上でプレート化する。胚を2 〜3 時間
原形質分離させた後、衝撃処理する。標的プレート当たり20個の胚が典型的であ
るが、しかしこれは重要ではない。適切な遺伝子保有プラスミド（例えばpCIB30
64またはpSG35 ）を、標準手法を用いてμm サイズの金粒子上に沈澱させる。標
準80メッシュスクリーンを用いて、〜1000 psi の破裂圧を用いて、胚の各プレ
ートをDuPont BiolisticsRヘリウム装置で撃つ。衝撃後、胚を暗所に戻して、約
24時間回復させる（依然としてオスモチクム上で）。24時間後、胚をオスモチク
ムから取り出して、誘導培地に戻し、そこにそれらは約１ヶ月間留まった後、再
生する。約１ヶ月後、発生中の胚形成性カルスとともに、胚外植片を、再生培地
（MS+1mg/l NAA, 5mg/l GA）に移し、さらに適切な選択作用物質（pCIB3064の場
合は10mg/lベスタ、pSOG35の場合は2mg/l メトキシレート）を含入する。約１ヶ
月後、半強度MS, 2 ％スクロースならびに同一濃度の選択作用物質を含入する「
GA7s」として知られている大型滅菌容器に発生した根を移す。Patent application EP0332581 describes techniques for the production, transformation and regeneration of Pooideae protoplasts. These techniques allow for the transformation of Dactylis and wheat. In addition, wheat transformation has been performed by Vasil et al. (Biotechnology 10: 667-674 (1992)) using particle bombardment of cells of type C long-term renewable callus, and by using calli derived from immature and immature embryos. Vasil et al. (Biotechnology 11: 1553-
1558 (1993)) and Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)). However, a preferred technique for wheat transformation involves the transformation of wheat by particle bombardment of immature embryos, including a high sucrose or high maltose step prior to gene delivery. Before impact, any number of embryos (0.75-1 mm in length)
3% sucrose (Murashiga & Skoog, Physiologia Plant
arum 15: 473-497 (1962)) and 3 mg / l 2,4-D on MS medium, which proceeds in the dark. On the day of bombardment, embryos are removed from the induction medium and plated on osmochicum (ie, transfer medium containing sucrose or malt nests added at the desired concentration, typically 15%). Embryos are subjected to protoplasmic separation for 2-3 hours and then subjected to shock treatment. Twenty embryos per target plate are typical, but this is not critical. Appropriate gene-bearing plasmids (eg, pCIB30
64 or pSG35) are precipitated on μm sized gold particles using standard techniques. Each plate of embryos is shot with a DuPont Biolistics® helium device using a standard 80 mesh screen and a burst pressure of 10001000 psi. After impact, return the embryo to the dark place and
Allow to recover for 24 hours (still on Osmochikum). After 24 hours, the embryos are removed from the osmoticum and returned to the induction medium, where they stay for about a month before regenerating. After about one month, the embryo explants, along with the developing embryogenic callus, are transferred to regeneration medium (MS + 1 mg / l NAA, 5 mg / l GA) and an appropriate selection agent (10 mg for pCIB3064) / l Vesta, 2 mg / l methoxylate for pSOG35). After about one month, containing "half strength MS, 2% sucrose and the same concentration of selective agent"
Transfer the roots to a large sterile container known as GA7s.

【０１７３】 アグロバクテリウムを用いた単子葉類の形質転換も記載されている（WO94/009
77および米国特許第5,591,616 号参照）（これらの記載内容はともに、参照によ
り本明細書中に含まれる）。 Ｅ．交配および種子産生 実施例２６：交配 本発明の核酸配列を用いた形質転換により得られた植物は、広範な植物種、例
えば単子葉類および双子葉類のいずれかであり得るが、しかしながら、本発明の
方法に用いられる植物は、好ましくは、前記の農業経営学的に重要な標的作物の
一覧から選択される。本発明生産および品質に関して重要なその他の特徴と組合
せた本発明の遺伝子の発現は、交配により植物系統に組み入れられる。交配アプ
ローチおよび技法は、当業界で知られている（例えば、Welsh J.R., Fundamenta
ls of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY（1981）; Crop B
reeding, Wood D.R.（Ed. ）American Society of Agronomy Madison, Wisconsi
n （1983）; Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clare
ndon Press, Oxford（1987）; Singh, D.P., Breeding for Resistance to Dise
ases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY（1986）; およびWricke and Web
er, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyte
r and Co., Berlin （1986）参照）。Transformation of monocots using Agrobacterium has also been described (WO94 / 009).
77 and US Pat. No. 5,591,616) (both of which are incorporated herein by reference). E. FIG. Mating and Seed Production Example 26: Mating Plants obtained by transformation with the nucleic acid sequences of the present invention can be any of a wide variety of plant species, for example, monocotyledons and dicotyledons. The plants used in the method of the invention are preferably selected from the list of agriculturally important target crops mentioned above. The expression of the gene of the present invention in combination with other features important for the production and quality of the present invention is incorporated into the plant line by crossing. Hybridization approaches and techniques are known in the art (eg, Welsh JR, Fundamenta
ls of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981); Crop B
reeding, Wood DR (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wisconsi
n (1983); Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clare
ndon Press, Oxford (1987); Singh, DP, Breeding for Resistance to Dise
ases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); and Wricke and Web
er, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyte
r and Co., Berlin (1986)).

【０１７４】 前記のトランスジェニック種子および植物中で工学処理された遺伝特性は、生
殖または植物性成長により移行され、したがって、子孫植物中に保持され、増殖
され得る。一般に、前記の保持および増殖は、工作、播種または収穫といった特
定の目的に合わせて開発された既知の農業的方法を用いる。水耕法または温室法
といった特殊方法も適用され得る。成長中の作物は昆虫または感染により引き起
こされる襲撃または損害に対してならびに雑草植物による競合に対して傷つきや
すいので、収量を改良するために雑草、植物病、昆虫、線虫およびその他の悪影
響を及ぼす条件の制御がなされる。これらは、機械的測定、例えば土壌の耕作、
または雑草および感染植物の除去、ならびに農業化学物質、例えば除草剤、殺真
菌剤、殺配偶子剤、殺線虫剤、成長調節剤、成熟剤、および殺昆虫剤の適用を含
む。The genetic characteristics engineered in the transgenic seeds and plants described above are transferred by reproduction or plant growth, and thus can be retained and propagated in progeny plants. In general, said holding and propagation use known agricultural methods that have been developed for a particular purpose, such as crafting, sowing or harvesting. Special methods such as hydroponics or greenhouse methods may also be applied. Growing crops are vulnerable to assault or damage caused by insects or infections and to competition by weed plants, so weeds, plant diseases, insects, nematodes and other adverse effects to improve yield Conditions are controlled. These include mechanical measurements, such as soil cultivation,
Or the removal of weeds and infected plants, and the application of agricultural chemicals such as herbicides, fungicides, gameticides, nematicides, growth regulators, ripening agents, and insecticides.

【０１７５】 本発明のトランスジェニック植物および種子の有益な遺伝特性の使用はさらに
、害虫、除草剤またはストレスの耐容性といった促成の改良、栄養値の改良、収
量増大または寄宿または粉砕による呈損失を生じる構造の改良を示す植物の開発
を目指す植物交配において成され得る。種々の交配工程は、十分限定されたヒト
の介入、例えば交雑される系統の選択、親系統の受粉の指図、または適切な子孫
植物の選択により特性化される。所望の特性によって、異なる交配測定が採用さ
れる。関連技術は当業界で周知であり、その例としては、ハイブリダイゼーショ
ン、近親交配、戻し交配、多系統交配、変種融合、種間ハイブリダイゼーション
、異数体法等が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション
技法はさらに、機械的、化学的または生化学的手段により雌または雄の不稔性植
物を産生するための植物の不稔化を含む。異なる系統の花粉を用いた雄不稔性植
物交差受粉は、雄不稔性で、しかし雌稔性の植物のゲノムが両方の親の系統の特
性を均質に得るのを保証する。したがって、本発明のトランスジェニック種子お
よび植物は、例えば、除草剤または殺虫剤処理といった慣用的方法の有効性を増
大し、またはそれらの修飾遺伝子特性のために前記の方法を用いて分配させる改
良植物系統の交配のために用いられ得る。あるいは、その最適化遺伝的「装置」
のために、ストレス耐性の改良を示す新規の作物が得られ、それらは、匹敵する
悪発生条件を耐容し得ない生成物よりも良好な品質の収穫生成物を産生する。The use of the beneficial genetic properties of the transgenic plants and seeds of the present invention may further improve improved forcing such as pest, herbicide or stress tolerance, improved nutritional value, increased yield or loss due to boarding or grinding. This can be done in plant crosses aiming to develop plants that show the resulting structural improvement. The various mating steps are characterized by well-defined human intervention, such as selection of the line to be crossed, instructions for pollination of the parent line, or selection of appropriate progeny plants. Depending on the properties desired, different mating measurements are employed. Related techniques are well-known in the art, and include, but are not limited to, hybridization, inbreeding, backcrossing, multiline breeding, variant fusion, interspecies hybridization, aneuploidy, and the like. . Hybridization techniques further include sterilization of the plants to produce female or male sterile plants by mechanical, chemical or biochemical means. Cross-pollination of male-sterile plants with pollen from different lines ensures that the genomes of the male-sterile, but female-fertile plants obtain the homogeneity of the characteristics of both parental lines. Thus, the transgenic seeds and plants of the present invention may be modified plants that increase the effectiveness of conventional methods, such as, for example, herbicide or pesticide treatment, or that are distributed using the methods described above due to their modified genetic properties. It can be used for crossing of lines. Or its optimized genetic "device"
New crops are obtained that exhibit improved stress tolerance, which produce better quality harvest products than products that cannot tolerate comparable adverse development conditions.

【０１７６】 実施例２７：種子産生 種子産生において、種子の発芽の質および均一性は不可欠な生成物特性である
が、一方、農業経営者が収穫し、販売する種子の発芽の質および均一性は、重要
ではない。他の作物および雑草の種子が混じらないよう作物を保持するのは困難
であるので、種子保有疾患を制御し、そして良好な発芽を示す種子を産生するた
めに、純正種子の成長、条件調節および販売の業界で経験を積んだ種子産生者に
より、かなり広範な、且つ十分限定された種子産生手段が開発されてきた。した
がって、彼自身の作物からの種子を用いる代わりに、特定の品質基準を満たす保
証付種子を農業経営者が購入することは一般的におこなわれることである。種子
として用いられる繁殖用物質は、通常は、除草剤、殺昆虫剤、殺真菌剤、殺細菌
剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはそれらの混合物を包含する予防保護剤コーテ
ィングにより処理される。常習的に用いられる予防保護剤コーティングは、カプ
タン、カルボキシン、チラム（TMTD（商標））、メタラキシル（アプロン（商標
））およびピリミフォス−メチル（アクテリック（商標））といった化合物を包
含する。所望により、これらの化合物は、さらに処方業界で常用される担体、界
面活性剤または適用促進アジュバントと一緒に処方されて、細菌、真菌または動
物害虫により引き起こされる損害に対する防御を提供する。予防保護剤コーティ
ングは、液体処方物を繁殖物質に含浸させることにより、または併合湿潤または
乾燥処方物で被覆することにより、適用され得る。蕾または果実に向けられる処
理といったその他の適用方法も可能である。Example 27: Seed production In seed production, seed germination quality and uniformity are essential product characteristics, while seed germination quality and uniformity are harvested and sold by farmers. Is not important. Because it is difficult to keep the crop from mixing with other crops and weed seeds, the growth, conditioning and control of genuine seeds to control seed-bearing diseases and produce seeds that show good germination A fairly extensive and well-defined means of producing seeds has been developed by seed producers with experience in the marketing industry. Thus, instead of using seeds from his own crop, it is common for farmers to purchase guaranteed seeds that meet certain quality standards. Reproductive substances used as seeds are usually treated with a prophylactic protectant coating, including herbicides, insecticides, fungicides, bactericides, nematicides, molluscics or mixtures thereof. You. Conventionally used prophylactic protective coatings include compounds such as captan, carboxin, thiram (TMTD ™), metalaxyl (Apron ™), and pirimiphos-methyl (Acteric ™). If desired, these compounds may be further formulated with carriers, surfactants, or application-enhancing adjuvants, which are commonly used in the formulation arts, to provide protection against damage caused by bacteria, fungi or animal pests. The prophylactic protectant coating may be applied by impregnating the liquid formulation with the propagation material, or by coating with a combined wet or dry formulation. Other methods of application, such as treatment directed at buds or fruits, are also possible.

【０１７７】 前記で例示したような、本発明のトランスジェニック植物、トランスジェニッ
ク植物物質またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする、新規の農法を提
供することは、本発明のさらに別の局面である。 種子は、適切なパッケージ物質から成る袋、入れ物または容器中で提供され、
袋または入れ物は、種子を含有するために密閉され得る。袋、入れ物または容器
は、種子の短期または長期保存のために、あるいはその両方のために設計され得
る。適切なパッケージ物質の例としては、紙、例えばクラフト紙、剛性または可
撓性プラスチックまたはその他の高分子物質、ガラスあるいは金属が挙げられる
。望ましくは、袋、入れ物または容器は、同一または異なる型の、パッケージ物
質の複数の層から成る。一実施態様では、袋、入れ物または容器は、水または湿
気が種子と接触するのを排除するかまたは制限するように提供される。一実施例
では、袋、入れ物または容器は密封され、例えば溶封されて、水または湿気が侵
入するのを防止する。別の実施態様では、水吸収物質がパッケージ物質層の間に
、または隣接して配置される。さらに別の実施態様では、袋、入れ物または容器
、あるいは含有されるパッケージ物質は、疾患、汚染または種子の保存または運
搬のその他の悪影響を制限し、抑制し、または防止するよう処理される。このよ
うな処理の一例は、例えば、化学的手段による、または放射線への曝露による滅
菌である。野生型植物より高レベルで前記の形質転換植物中で発現される本発明
の遺伝子を包含するトランスジェニック植物の種子を、適切な担体と一緒に、植
物に広範囲の疾患耐性を付与するためのそれらの使用に関する説明を記したラベ
ルと一緒に含有する市販の袋は、本発明に含まれる。It is yet another aspect of the present invention to provide a novel agricultural method, characterized by the use of the transgenic plant, transgenic plant material or transgenic seed of the present invention as exemplified above. . Seeds are provided in bags, containers or containers made of suitable packaging material,
The bag or container may be sealed to contain the seed. Bags, containers or containers may be designed for short or long term storage of seeds, or both. Examples of suitable packaging materials include paper, such as kraft paper, rigid or flexible plastic or other polymeric material, glass or metal. Desirably, the bag, container or container consists of multiple layers of the same or different types of packaging material. In one embodiment, a bag, container or container is provided to eliminate or limit water or moisture from contacting the seed. In one embodiment, the bag, container or container is sealed, for example, sealed, to prevent water or moisture from entering. In another embodiment, the water-absorbing material is located between or adjacent to the package material layers. In yet another embodiment, the bag, container or container, or the contained packaging material, is treated to limit, suppress, or prevent disease, contamination, or other adverse effects of seed storage or transport. One example of such a treatment is sterilization, for example, by chemical means or by exposure to radiation. Transgenic plant seeds comprising the genes of the present invention expressed in said transformed plants at higher levels than wild-type plants, together with suitable carriers, are used to confer a wide range of disease resistance to the plants. Commercially available pouches containing labels with instructions for the use of are included in the present invention.

【配列表】 [Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アンダーソン，アーン ロバート アメリカ合衆国，ノース カロライナ 27597，ゼブロン，グリーン−ペース ロ ード 1005 (72)発明者 ハート，ホープ プリム アメリカ合衆国，ノース カロライナ 27526，ファキー−バリナ，プランターズ グレン コート 4106 (72)発明者 ウォーレン，グレゴリー ウェイン アメリカ合衆国，ノース カロライナ 27513，キャリー，ボンド レイク ドラ イブ 324 (72)発明者 ダン，マーサ マリー アメリカ合衆国，ノース カロライナ 27278，ヒルスボロー，オークビュー コ ート 6201 (72)発明者 チェン，ジェン ション アメリカ合衆国，ノース カロライナ 27514，チャペル ヒル，オーチャード レーン 302 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD12 CD13 CD14 CD17 CG01 4B024 AA08 BA38 CA01 DA01 EA04 4B064 AG30 CA11 CA19 CC24 DA12 4B065 AA01Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA48 CA53 4H011 AC01 4H045 AA10 AA30 BA10 CA11 DA83 EA06 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/19 C12N 1/21 4H045 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12P 21 / 02 5/00 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ) , UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, B , CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Anderson, Arn Robert United States of America, North Carolina 27597, Zebulon, Green-Pacero 1005 (72) Inventor Hart, Hope Prim, United States, North Carolina 27526, Fakey Ballina, Planters Glen Court 4106 (72) Inventor Warren, Gregory Wayne America Country, North Carolina 27513, Carrie, Bond Lake Drive 324 (72) Inventor Dan, Martha Marie United States of America, North Carolina 27278, Hillsborough, Oak View Coat 6201 (72) Inventor of Chen, Gen. United States of America, North Carolina 27514 , Chapel Hill, Orchard Lane 302 F Term (Reference) 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD12 CD13 CD14 CD17 CG01 4B024 AA08 BA38 CA01 DA01 EA04 4B064 AG30 CA11 CA19 CC24 DA12 4B065 AA01Y AB01 AC20 BA02 4A30 CA48 BA10 CA11 DA83 EA06 FA74

Claims (36)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の： （ａ）配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１のヌクレオチド1686-2
447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１のヌクレオチド3342-4
118 、配列番号１のヌクレオチド4515-9269 、配列番号１１のヌクレオチド15,1
71-18,035 、および配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 から成る群から
選択されるヌクレオチド配列と実質的に同様のヌクレオチド配列、 （ｂ）配列番号１１のヌクレオチド23,768-31,336 を包含するヌクレオチド配
列、あるいは （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と等コード化するヌクレオチド
配列、 を包含する単離核酸分子であって、その発現が昆虫（insects)に対して活性な少
なくとも１つの毒素を生じる核酸分子。1. The following: (a) nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2 of SEQ ID NO: 1
447, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4 of SEQ ID NO: 1
118, nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 15,1 of SEQ ID NO: 11
71-18,035, and a nucleotide sequence substantially similar to a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11, (b) a nucleotide sequence comprising nucleotides 23,768-31,336 of SEQ ID NO: 11, or c) a nucleotide sequence which encodes the nucleotide sequence of (a) or (b), wherein the expression results in at least one toxin active against insects. molecule. 【請求項２】 配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１のヌクレオ
チド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１のヌクレオ
チド3342-4118 、配列番号１のヌクレオチド4515-9269 、配列番号１１のヌクレ
オチド15,171-18,035 、および配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 から
成る群から選択されるヌクレオチド配列の連続する２０塩基対ヌクレオチド部分
と配列が同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を包含する単離核酸分子であって、
前記核酸分子の発現が昆虫に対して活性である少なくとも１つの毒素を生じる核
酸分子。2. nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1, An isolation comprising a 20 base pair nucleotide portion identical in sequence to a continuous 20 base pair nucleotide portion of a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11 and nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11. A nucleic acid molecule,
A nucleic acid molecule wherein expression of said nucleic acid molecule results in at least one toxin that is active against insects. 【請求項３】 配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１のヌクレオ
チド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１のヌクレオ
チド3342-4118 、配列番号１のヌクレオチド4515-9269 、配列番号１１のヌクレ
オチド66-1898 、配列番号１１のヌクレオチド2416-9909 、配列番号１１のヌク
レオチド2817-3395 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド9966-14,633 、配列
番号１１のヌクレオチド14,699-15,007 、配列番号１１のヌクレオチド15,171-1
8,035 、配列番号１１のヌクレオチド17,072-17,398 の相補体、配列番号１１の
ヌクレオチド18,235-19,167 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド19.385-20,
116 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド20217-20,963の相補体、配列番号１
１のヌクレオチド22,172-23,086 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド23,768
-31,336 、配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 、配列番号１１のヌクレ
オチド35,383-35,709 の相補体、配列番号１１のヌクレオチド36,032-36,661 の
相補体、および配列番号１１のヌクレオチド36,654-37,781 の相補体から成る群
から選択されるフォトラブドゥス・ルミネッセンス（Photorhabdus luminescens
）からのヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子。3. nucleotides 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1, Nucleotides 66-1898 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 2416-9909 of SEQ ID NO: 11, complement of nucleotides 2817-3395 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 9966-14,633 of SEQ ID NO: 11, nucleotides 14,699-15,007 of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11 nucleotides 15,171-1
8,035, the complement of nucleotides 17,072-17,398 of SEQ ID NO: 11, the complement of nucleotides 18,235-19,167 of SEQ ID NO: 11, the nucleotides 19.385-20,
116, the complement of nucleotides 20217-20,963 of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1
The complement of one nucleotide 22,172-23,086, the nucleotide 23,768 of SEQ ID NO: 11
-31,336, consisting of nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11, complements of nucleotides 35,383-35,709 of SEQ ID NO: 11, complements of nucleotides 36,032-36,661 of SEQ ID NO: 11, and complements of nucleotides 36,654-37,781 of SEQ ID NO: 11 Photorhabdus luminescens selected from a group
An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence from 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド412-16
65、配列番号１のヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-331
8 、配列番号１のヌクレオチド3342-4118 、または配列番号１のヌクレオチド45
15-9269 と実質的に類似する、請求項１に記載の単離核酸分子。4. The method according to claim 1, wherein the nucleotide sequence is nucleotides 412-16 of SEQ ID NO: 1.
65, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-331 of SEQ ID NO: 1
8, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1 or nucleotide 45 of SEQ ID NO: 1
2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, which is substantially similar to 15-9269. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が配列番号２〜６から成る群から選択
されるアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。5. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein said nucleotide sequence encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-6. 【請求項６】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド412-16
65、配列番号１のヌクレオチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-331
8 、配列番号１のヌクレオチド3342-4118 、または配列番号１のヌクレオチド45
15-9269 を包含する、請求項１に記載の単離核酸分子。6. The nucleotide sequence of claim 1 wherein the nucleotide sequence is nucleotides 412-16 of SEQ ID NO: 1.
65, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-331 of SEQ ID NO: 1
8, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1 or nucleotide 45 of SEQ ID NO: 1
2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising 15-9269. 【請求項７】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１１のヌクレオチド15,171
-18,035 、または配列番号１１のヌクレオチド31,393-35,838 と実質的に類似す
る、請求項１に記載の単離核酸分子。7. The method according to claim 6, wherein said nucleotide sequence is nucleotide 15,171 of SEQ ID NO: 11.
The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the isolated nucleic acid molecule is substantially similar to nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11. 【請求項８】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１２〜１４のいずれかに記
載されるアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。8. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein said nucleotide sequence encodes an amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 12-14. 【請求項９】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１１のヌクレオチド15,171
-18,035 、23,768-31,336 または31,393-35,838 を包含する、請求項１に記載の
単離核酸分子。9. The method according to claim 9, wherein said nucleotide sequence is nucleotide 15,171 of SEQ ID NO: 11.
2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising -18,035, 23,768-31,336 or 31,393-35,838. 【請求項１０】 配列番号１のヌクレオチド412-1665、配列番号１のヌクレ
オチド1686-2447 、配列番号１のヌクレオチド2758-3318 、配列番号１のヌクレ
オチド3342-4118 、または配列番号１のヌクレオチド4515-9269 の連続する２０
塩基対ヌクレオチド部分と配列が同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を包含する
、請求項２に記載の単離核酸分子。10. Nucleotide 412-1665 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 1686-2447 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 2758-3318 of SEQ ID NO: 1, nucleotides 3342-4118 of SEQ ID NO: 1 or nucleotides 4515-9269 of SEQ ID NO: 1. 20 consecutive
3. The isolated nucleic acid molecule of claim 2, comprising a 20 base pair nucleotide portion that is identical in sequence to the base pair nucleotide portion. 【請求項１１】 配列番号１１のヌクレオチド15,171-18,035 または配列番
号１１のヌクレオチド31,393-35,838 の連続する２０塩基対ヌクレオチド部分と
配列が同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を包含する、請求項２に記載の単離核
酸分子。11. The method of claim 2, comprising a 20 base pair nucleotide portion identical in sequence to the contiguous 20 base pair nucleotide portion of nucleotides 15,171-18,035 of SEQ ID NO: 11 or nucleotides 31,393-35,838 of SEQ ID NO: 11. An isolated nucleic acid molecule. 【請求項１２】 請求項１または請求項２の核酸分子と操作可能的に連結さ
れる異種プロモーター配列を包含するキメラ遺伝子。12. A chimeric gene comprising a heterologous promoter sequence operably linked to the nucleic acid molecule of claim 1 or 2. 【請求項１３】 請求項１２のキメラ遺伝子を包含する組換えベクター。13. A recombinant vector comprising the chimeric gene according to claim 12. 【請求項１４】 請求項１２のキメラ遺伝子を包含する宿主細胞。14. A host cell comprising the chimeric gene of claim 12. 【請求項１５】 細菌細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。15. The host cell according to claim 14, which is a bacterial cell. 【請求項１６】 酵母菌細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。16. The host cell according to claim 14, which is a yeast cell. 【請求項１７】 植物細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。17. The host cell according to claim 14, which is a plant cell. 【請求項１８】 請求項１７の植物細胞を包含する植物。18. A plant comprising the plant cell of claim 17. 【請求項１９】 トウモロコシ（maite)である請求項１８に記載の植物。19. The plant according to claim 18, which is corn (maite). 【請求項２０】 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡ分子の発現により
生成される毒素。20. A toxin produced by expression of the DNA molecule according to claim 1 or 2. 【請求項２１】 鱗翅目昆虫に対する活性を有する、請求項２０に記載の毒
素。21. The toxin according to claim 20, which has activity against lepidopteran insects. 【請求項２２】 Plutella xylostella（コナガ）、Trichoplusia ni （イ
ラクサキンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis viresc
ens （タバコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exigua （
シロイチモンジヨトウ）、およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ）に対
する活性を有する、請求項２１に記載の毒素。22. Plutella xylostella (conaga), Trichoplusia ni (nettle), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga), Heliothis viresc
ens (Helicoverpa), Helicoverpa zea (Helicoverpa), Spodoptera exigua (
22. The toxin according to claim 21, which has activity against Syringa armyworm and Spodoptera frugiperda. 【請求項２３】 鱗翅目および鞘翅目昆虫に対する活性を有する、請求項２
０に記載の毒素。23. The composition according to claim 2, which has activity against Lepidoptera and Coleoptera insects.
The toxin according to 0. 【請求項２４】 Plutella xylostella（コナガ）、Ostrinia nubilalis（
アワノメイガ）、およびManduca sexta （スズメガ）、ならびにDiabrotica vir
gifera virgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata howardi
（ウリハムシの一種）、およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハムシ）
に対する殺昆虫活性を有する、請求項２３に記載の毒素。24. Plutella xylostella (conaga), Ostrinia nubilalis (
Awanomeiga), and Manduca sexta (Sphingida), and Diabrotica vir
gifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata howardi
(A kind of beetle) and Leptinotarsa decimlineata (color beetle)
24. The toxin of claim 23 having insecticidal activity against 【請求項２５】 配列番号２〜６から成る群から選択されるアミノ酸配列を
包含する、請求項２０に記載の毒素。25. The toxin of claim 20, which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-6. 【請求項２６】 配列番号１２〜１４から成る群から選択されるアミノ酸配
列を包含する、請求項２０に記載の毒素。26. The toxin of claim 20, which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12-14. 【請求項２７】 殺昆虫的有効量の請求項２０の毒素を包含する組成物。27. A composition comprising an insecticidal effective amount of the toxin of claim 20. 【請求項２８】 昆虫に対して活性である毒素の製造方法であって、以下の
： （ａ）請求項１４の宿主細胞を得て、そして （ｂ）前記細胞中で、昆虫に対して活性である少なくとも１つの毒素を生じる
核酸分子を発現させる、 工程を包含する方法。28. A method for producing a toxin which is active against insects, comprising: (a) obtaining the host cell of claim 14, and (b) wherein said cell is active against insects. Expressing a nucleic acid molecule that produces at least one toxin that is: 【請求項２９】 前記植物中に請求項１に記載の核酸分子を導入することを
包含する昆虫耐性植物の産生方法であって、前記核酸分子が昆虫を防除するのに
有効な量で前記植物中で発現可能である方法。29. A method for producing an insect-tolerant plant, comprising introducing the nucleic acid molecule according to claim 1 into the plant, wherein the nucleic acid molecule is used in an amount effective for controlling insects. A method that can be expressed in. 【請求項３０】 有効量の請求項４４の毒素を昆虫に届けることを包含する
昆虫の防除方法。30. A method for controlling insects comprising delivering an effective amount of the toxin of claim 44 to the insects. 【請求項３１】 前記昆虫が鱗翅目（Lepidopteran) 昆虫である、請求項２
９または請求項３０に記載の方法。31. The insect of claim 2, wherein the insect is a Lepidopteran insect.
A method according to claim 9 or claim 30. 【請求項３２】 昆虫がPlutella xylostella （コナガ）、Trichoplusia n
i （イラクサキンウワバ）、Ostrinia nubilalis（アワノメイガ）、Heliothis
virescens （タバコガ）、Helicoverpa zea （オオタバコガ）、Spodoptera exi
gua （シロイチモンジヨトウ）、およびSpodoptera frugiperda （シロナヨトウ
）から成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。32. The insects are Plutella xylostella (Prylla), Trichoplusia n
i (Europea americana), Ostrinia nubilalis (Awanomeiga), Heliothis
virescens, Helicoverpa zea, Spodoptera exi
32. The method of claim 31, wherein the method is selected from the group consisting of gua (Syringa armyworm) and Spodoptera frugiperda (Sycamore armyworm). 【請求項３３】 前記昆虫が鱗翅目および鞘翅目（Coleopteran)昆虫である
、請求項２９または３０に記載の方法。33. The method of claim 29 or 30, wherein said insects are Lepidoptera and Coleopteran insects. 【請求項３４】 昆虫がPlutella xylostella （コナガ）、Ostrinia nubil
alis（アワノメイガ）、およびManduca sexta （スズメガ）、ならびにDiabroti
ca virgifera virgifera（ウリハムシの一種）、Diabrotica undecimpunctata h
owardi（ウリハムシの一種）、およびLeptinotarsa decimlineata （コロラドハ
ムシ）から成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。34. Insects comprising Plutella xylostella (Pryllid), Ostrinia nubil
alis (Awanomeiga), Manduca sexta (Sphingidae), and Diabroti
ca virgifera virgifera (a kind of beetle), Diabrotica undecimpunctata h
34. The method of claim 33, wherein the method is selected from the group consisting of owardi (a kind of beetle) and Leptinotarsa decimlineata (color beetle). 【請求項３５】 前記毒素が経口的に昆虫に届けられる、請求項３０に記載
の方法。35. The method of claim 30, wherein said toxin is delivered to an insect orally. 【請求項３６】 前記核酸分子が所望のサイズの二本鎖無作為断片の集団に
開裂された、請求項１に記載の核酸分子の突然変異誘発方法であって、以下の： （ａ）二本鎖無作為断片の集団に、各々が二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対し
て同一構造の領域と異種構造の領域を包含する１つ又はそれ以上の一本または二
本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、 （ｂ）その結果生じる二本鎖無作為断片およびオリゴヌクレオチドの混合物を
一本鎖断片に変性し、 （ｃ）その結果生じる一本鎖断片の集団を、対の一方の成員に関して他方の複
製をプライムするのに十分な同一構造の領域で前記一本鎖断片のアニーリングを
生じてアニール化断片の対を生成し、それにより突然変異誘発二本鎖ポリヌクレ
オチドを生成する条件下で、ポリメラーゼとともにインキュベートし、そして （ｄ）上記第二および第三工程を少なくともさらに２回繰り返す、ここで、第
二工程をさらに１回実施した結果生じる混合物が前回の第三工程からの突然変異
誘発二本鎖ポリヌクレオチドを含有し、そしてさらにもう１回実行すると突然変
異誘発二本鎖ポリヌクレオチドがさらに生じる、 工程を包含する方法。36. The method of mutagenizing nucleic acid molecules according to claim 1, wherein the nucleic acid molecules have been cleaved into a population of double-stranded random fragments of a desired size, comprising: Adding to the population of single-stranded random fragments one or more single- or double-stranded oligonucleotides, each containing a region of identical structure and a region of heterogeneous structure relative to the double-stranded template polynucleotide; (B) denaturing the resulting mixture of double-stranded random fragments and oligonucleotides into single-stranded fragments; and (c) replicating the resulting population of single-stranded fragments with respect to one member of the pair to the other. Annealing of the single-stranded fragment in a region of the same structure sufficient to prime to produce a pair of annealed fragments, thereby producing a mutagenized double-stranded polynucleotide together with the polymerase. And (d) repeating the second and third steps at least two more times, wherein the mixture resulting from one more execution of the second step is the mutagenized duplex from the previous third step A polynucleotide comprising the polynucleotide and, when performed one more time, further yields a mutagenized double-stranded polynucleotide.
JP2000532529A 1998-02-20 1999-02-18 Insecticidal toxins from Photolabdus Pending JP2002504336A (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2708098A 1998-02-20 1998-02-20
US09/027,080 1998-02-20
US11643999P 1999-01-20 1999-01-20
US60/116,439 1999-01-20
PCT/EP1999/001015 WO1999042589A2 (en) 1998-02-20 1999-02-18 Insecticidal toxins from photorhabdus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002504336A true JP2002504336A (en) 2002-02-12

Family

ID=26702017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000532529A Pending JP2002504336A (en) 1998-02-20 1999-02-18 Insecticidal toxins from Photolabdus

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1054972A2 (en)
JP (1) JP2002504336A (en)
CA (1) CA2320801A1 (en)
WO (1) WO1999042589A2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8552256B2 (en) 2008-04-11 2013-10-08 National Institute Of Agrobiological Sciences Gene capable of being expressed specifically in endosperm of plant, promoter for the gene, and use of the gene and the promoter

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9901499D0 (en) * 1999-01-22 1999-03-17 Horticulture Res Int Biological control
WO2001016305A2 (en) * 1999-09-02 2001-03-08 Agresearch Limited Nucleotide sequences encoding an insectidal protein complex from serratia
KR20030085528A (en) * 2001-02-07 2003-11-05 앵스띠뛰 파스퇴르 Sequence of the Photorhabdus Luminescens strain TT01 Genome and Uses
WO2003057593A1 (en) 2001-12-21 2003-07-17 Nektar Therapeutics Capsule package with moisture barrier
FR2838750A1 (en) * 2002-04-17 2003-10-24 Pasteur Institut New nucleic acid from Photorhabdus luminescens, useful for producing insecticidal polypeptides and insect resistant transgenic plants
AU2003247650A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 Dow Agrosciences Llc Pesticidally active proteins and polynucleotides obtainable from paenibacillus species
BRPI0406856A (en) 2003-01-21 2005-12-27 Dow Agrosciences Llc Mixture and compatibility of tc proteins for pest control
AR042717A1 (en) 2003-01-21 2005-06-29 Dow Agrosciences Llc XENORHABDUS CT PROTEINS AND GENES FOR PEST CONTROL
CN1918296A (en) 2004-01-07 2007-02-21 美国陶氏益农公司 Toxin complex proteins and genes from xenorhabus bovienii
AR052064A1 (en) * 2004-12-22 2007-02-28 Dow Agrosciences Llc XENORHABDUS TOXINE COMPLEX
KR101314263B1 (en) * 2011-06-09 2013-10-02 경북대학교 산학협력단 Novel Pesticidal proteins, compound and method for controlling harmful insects using novel Pesticidal proteins
KR101380111B1 (en) 2013-05-22 2014-03-31 경북대학교 산학협력단 Novel Pesticidal proteins, compound and method for controlling harmful insects using novel Pesticidal proteins

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA48104C2 (en) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Dna fragment including sequence that codes an insecticide protein with optimization for corn, dna fragment providing directed preferable for the stem core expression of the structural gene of the plant related to it, dna fragment providing specific for the pollen expression of related to it structural gene in the plant, recombinant dna molecule, method for obtaining a coding sequence of the insecticide protein optimized for corn, method of corn plants protection at least against one pest insect
CA2162485A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Adam Joseph Smigielski Toxin gene from xenorhabdus nematophilus
CA2209659C (en) * 1995-11-06 2008-01-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Insecticidal protein toxins from photorhabdus
GB9618083D0 (en) * 1996-08-29 1996-10-09 Mini Agriculture & Fisheries Pesticidal agents
TR199901126T2 (en) * 1996-08-29 1999-07-21 Dow Agrosciences Llc Insecticidal protein toxins from Photarhabdus.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8552256B2 (en) 2008-04-11 2013-10-08 National Institute Of Agrobiological Sciences Gene capable of being expressed specifically in endosperm of plant, promoter for the gene, and use of the gene and the promoter

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999042589A2 (en) 1999-08-26
WO1999042589A3 (en) 1999-12-23
CA2320801A1 (en) 1999-08-26
EP1054972A2 (en) 2000-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1311162B1 (en) Bacillus thurigiensis crystal protein hybrids
JP4038778B2 (en) A novel Bacillus thuringiensis gene encoding a toxin active against lepidopteran pests
KR101841295B1 (en) COMBINED USE OF CRY1Ca AND CRY1Fa PROTEINS FOR INSECT RESISTANCE MANAGEMENT
KR100371904B1 (en) Genes for Synthesizing Antipathogenic Substances
US5716849A (en) Genes for the biosynthesis of soraphen
AU2001285900A1 (en) Novel insecticidal toxins derived from Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins
MX2012007138A (en) Combined use of cry1da and cry1fa proteins for insect resistance management.
US6174860B1 (en) Insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor
WO2016138819A1 (en) Uses of insecticidal protein
JP2002504336A (en) Insecticidal toxins from Photolabdus
US6281413B1 (en) Insecticidal toxins from Photorhabdus luminescens and nucleic acid sequences coding therefor
KR20160135768A (en) Cry1d for controlling corn earworm
JP2001505774A (en) Use of NIM1 gene for imparting disease resistance to plants
KR100649909B1 (en) Novel insecticidal toxins from Xenorhabdus nematophilus, nucleic acid sequences coding therefor and a method of producing the same
CN1954075B (en) Inducible promoters
RU2241749C2 (en) New plant genes and their applying
JP2002509710A (en) Chimeric insecticidal protein and gene encoding the same
JP5054267B2 (en) New toxin
US6204057B1 (en) Polynucleotides and the proteins encoded thereby, suitable for controlling lamellicorn beetles
US20030154510A1 (en) Novel delta-endotoxin gene isolated from Bacillus thuringiensis var. finitimus
RU2240003C2 (en) Isolated nucleic acid molecule, chimeric gene, recombinant vector, microorganism strain, toxin, insecticide composition, method for preparing toxin, method for preparing toxin-resistant plant and method for control of insects
AU3028699A (en) Insecticidal toxins from photorhabdus
MXPA00010308A (en) Novel insecticidal toxins from xenorhabdus nematophilus