JP2002504333A - Apoptosis-inducing molecule II and method of use - Google Patents
Apoptosis-inducing molecule II and method of useInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、TNF−リガンドスーパーファミリーのメンバーに関する。より詳細には、ヒトアポトーシス誘導分子II(AIM II)をコードする、単離された核酸分子が提供される。AIM IIポリペプチドもまた提供され、AIMIIを産生するための、ベクター、宿主細胞および組換え方法も同様に提供される。さらに本発明は、AIM II活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。リンパ節症、異常な骨発達、自己免疫疾患および他の免疫系疾患、移殖片対宿主疾患、慢性関節リウマチ、変形性関節症を処置するための治療方法、ならびに腫瘍細胞増殖のような新形成を阻害すための治療方法もまた提供される。 (57) [Summary] The present invention relates to members of the TNF-ligand superfamily. More particularly, provided is an isolated nucleic acid molecule encoding human apoptosis-inducing molecule II (AIM II). AIM II polypeptides are also provided, as are vectors, host cells and recombinant methods for producing AIMII. Further, the present invention relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of AIM II activity. New treatments such as lymphadenopathy, abnormal bone development, autoimmune and other immune system disorders, transplanted versus host disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and new treatments such as tumor cell proliferation Also provided are therapeutic methods for inhibiting formation.
Description
【0001】 (発明の背景) (発明の技術分野) 本発明は、TNFリガンドスーパーファミリーの新規なメンバーに関する。よ
り詳細には、ヒトアポトーシス誘導分子II(AIM II)をコードする単離
された核酸分子が提供される。AIM IIポリペプチドもまた提供され、同様
に、AIM IIポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞および組換
え方法が提供される。本発明はさらに、AIM II活性のアゴニストおよびア
ンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。リンパ節症、異常
な骨発達、自己免疫疾患、他の免疫系疾患、対宿主性移植片病、慢性関節リウマ
チ、変形性関節症を処置するため、そして新形成(例えば、腫瘍細胞増殖)を阻
害するための治療方法もまた、提供される。BACKGROUND OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to novel members of the TNF ligand superfamily. More particularly, provided is an isolated nucleic acid molecule encoding human apoptosis-inducing molecule II (AIM II). AIM II polypeptides are also provided, as well as vectors, host cells and recombinant methods for producing AIM II polypeptides. The invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of AIM II activity. To treat lymphadenopathy, abnormal bone development, autoimmune diseases, other immune system disorders, graft-versus-host disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and neoplasia (eg, tumor cell growth) A method of treatment for inhibiting is also provided.
【0002】 (関連分野) ヒト腫瘍壊死因子α(TNF−α)およびヒト腫瘍壊死因子β(TNF−β、
またはリンホトキシン)は、インターフェロン、インターロイキン、および増殖
因子(集団的にサイトカインと呼ばれる)を含む広範なクラスのポリペプチドメ
ディエーターに関連するメンバーである(Beutler,B.およびCera
mi,A.、Annu.Ret,.Immunol.、7:625〜655(1
989))。Related Art [0002] Human tumor necrosis factor α (TNF-α) and human tumor necrosis factor β (TNF-β,
Or lymphotoxins) are members related to a broad class of polypeptide mediators, including interferons, interleukins, and growth factors (collectively referred to as cytokines) (Beutler, B. and Cera).
mi, A .; , Annu. Ret,. Immunol. , 7: 625-655 (1
989)).
【0003】 腫瘍壊死因子(TNF−αおよびTNF−β)は本来、その抗腫瘍活性の結果
として発見されたが、現在、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活
性化および細胞増殖の媒介を含む多数の生物学的活性を有し得る多面的なサイト
カインとして、そしてまた免疫調節および炎症において重要な役割も果たすと認
識される。[0003] Tumor necrosis factors (TNF-α and TNF-β) were originally discovered as a result of their antitumor activity, but are now mediating apoptosis, cell activation and cell proliferation of several transformed cell lines. It is recognized as a pleiotropic cytokine that may have a number of biological activities, including, and also plays an important role in immune regulation and inflammation.
【0004】 現在までに、TNFリガンドスーパーファミリーの公知のメンバーは、TNF
−α、TNF−β(リンホトキシン−α)、LT−β、OX40L、Fasリガ
ンド、CD30L、CD27L、CD40Lおよび4−IBBLを含む。TNF
リガンドスーパーファミリーのリガンドは、細胞外ドメインにおいて約20%(
範囲、12%〜36%)の配列相同性を有する、酸性のTNF様分子であり、そ
して生物学的活性型が三量体/多量体の複合体である膜結合型として主に存在す
る。TNFリガンドスーパーファミリーの可溶型は、現在までに、TNF、LT
α、およびFasリガンドについてのみ同定されている(一般の総説については
、Gruss,H.およびDower,S.K.、Blood、85(12):
3378〜3404(1995)を参照のこと)(その全体において、本明細書
中で参考として援用される)。[0004] To date, known members of the TNF ligand superfamily are TNF
-Α, TNF-β (Lymphotoxin-α), LT-β, OX40L, Fas ligand, CD30L, CD27L, CD40L and 4-IBBL. TNF
Ligands of the ligand superfamily account for about 20% (
(Range, 12% -36%), are acidic TNF-like molecules, and exist primarily as membrane-bound forms, where the biologically active form is a trimeric / multimeric complex. Soluble forms of the TNF ligand superfamily have, to date, been TNF, LT
Only α and Fas ligands have been identified (for a general review, see Gruss, H. and Dower, SK, Blood, 85 (12):
3378-3404 (1995)), which is hereby incorporated by reference in its entirety.
【0005】 これらのタンパク質は、アポトーシスまたは細胞傷害性による細胞の生存また
は死の制御を含む、細胞増殖、細胞活性化、および細胞分化の調節に関与する(
Armitage,R.J.、Curr.Opin.Immunol.6;40
7(1994)およびSmith,C.A.、Cell 75:959(199
4))。[0005] These proteins are involved in regulating cell proliferation, cell activation, and cell differentiation, including controlling cell survival or death through apoptosis or cytotoxicity (
Armitage, R.A. J. Curr. Opin. Immunol. 6; 40
7 (1994) and Smith, C.I. A. Cell 75: 959 (199).
4)).
【0006】 哺乳動物の発達は、細胞の増殖および分化の両方ならびにプログラムされた細
胞死(アポトーシスを介して生じる)に依存する(Walkerら、Metho
ds Achiev.Exp.Pathol.13:18(1988))。アポ
トーシスは、自己抗原を認識する免疫胸腺細胞の破壊に重要な役割を果たす。こ
の正常な除去プロセス不全は、自己免疫疾患において役割を果たし得る(Gam
monら、Immunology Today 12:193(1991))。[0006] Mammalian development depends on both cell proliferation and differentiation as well as programmed cell death, which occurs via apoptosis (Walker et al., Metho).
ds Achiev. Exp. Pathol. 13:18 (1988)). Apoptosis plays an important role in the destruction of immune thymocytes that recognize self antigens. This failure of the normal removal process may play a role in autoimmune diseases (Gam
Mon et al., Immunology Today 12: 193 (1991)).
【0007】 Itohら(Cell 66:233(1991))は、アポトーシスを媒介
し、そしてT細胞のクローン除去に関与する細胞表面抗原であるFas/CD9
5を記載した。Fasは、活性化T細胞、B細胞、好中球、ならびに胸腺、肝臓
、心臓および肺、ならびに成体マウスにおいては、活性化T細胞、B細胞、好中
球に加えて卵巣(Watanabe−Fukunagaら、J.Immunol
o.148:1274(1992))において発現される。Fasに対するモノ
クローナル抗体がFasに架橋される実験において、アポトーシスが誘導される
(Yoneharaら、J.Exp.Med.169:1747(1989);
Trauthら、Science 245:301(1989))。さらに、F
asに対するモノクローナル抗体の結合が、特定の条件下でT細胞を刺激し得る
例が存在する(Aldersonら、J.Exp.Med.178:2231(
1993))。[0007] Itoh et al. (Cell 66: 233 (1991)) describe Fas / CD9, a cell surface antigen that mediates apoptosis and is involved in clonal depletion of T cells.
5 is described. Fas is activated T cells, B cells, neutrophils and, in thymus, liver, heart and lung, and in adult mice, activated T cells, B cells, neutrophils plus ovaries (Watanabe-Fukunaga et al.). , J. Immunol
o. 148: 1274 (1992)). Apoptosis is induced in experiments in which a monoclonal antibody to Fas is cross-linked to Fas (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169: 1747 (1989);
Trath et al., Science 245: 301 (1989)). Further, F
There are examples where binding of a monoclonal antibody to as can stimulate T cells under certain conditions (Alderson et al., J. Exp. Med. 178: 2231 (
1993)).
【0008】 Fas抗原は、45Kdの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Fasに
ついてのヒト遺伝子およびマウス遺伝子の両方は、Watanabe−Fuku
nagaら(J.Immunol.148:1274(1992))およびIt
ohら(Cell 66:233(1991))によってクローニングされてい
る。これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、両方とも、神経発育因子
/腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーに構造相同性を有する膜貫通タン
パク質であり、このスーパーファミリーは、2つのTNFレセプター、低親和性
神経発育因子レセプターおよびLTβレセプターCD40、CD27、CD30
、およびOX40を含む。[0008] The Fas antigen is a cell surface protein with a relative molecular weight of 45 Kd. Both human and mouse genes for Fas are available from Watanabe-Fuku.
Naga et al. (J. Immunol. 148: 1274 (1992)) and It.
(Cell 66: 233 (1991)). Both proteins encoded by these genes are transmembrane proteins with structural homology to the nerve growth factor / tumor necrosis factor receptor superfamily, a family of two TNF receptors, low affinity neuronal development. Factor receptor and LTβ receptor CD40, CD27, CD30
, And OX40.
【0009】 最近、Fasリガンドが、記述されている(Sudaら、Cell 75:1
169(1993))。このアミノ酸配列は、FasリガンドがTNFファミリ
ーに属するII型膜貫通タンパク質であることを示す。Fasリガンドは、脾臓
細胞および胸腺細胞において発現される。この精製したFasリガンドは、40
kdの分子量を有する。Recently, Fas ligands have been described (Suda et al., Cell 75: 1).
169 (1993)). This amino acid sequence indicates that the Fas ligand is a type II transmembrane protein belonging to the TNF family. Fas ligand is expressed on spleen cells and thymocytes. This purified Fas ligand contains 40
It has a molecular weight of kd.
【0010】 最近、Fas/Fasリガンド相互作用がT細胞の活性化に続くアポトーシス
に必要とされることが実証されている(Juら、Nature 373:444
(1995):Brunnerら、Nature 373:441(1995)
)。T細胞の活性化は、細胞表面上の両方のタンパク質を誘導する。引き続くリ
ガンドとレセプターとの間の相互作用は、細胞のアポトーシスを生じる。これは
、正常な免疫応答の間、Fas/Fasリガンド相互作用により誘導されるアポ
トーシスについて可能性のある調節役割を支持する。[0010] Recently, it has been demonstrated that Fas / Fas ligand interaction is required for apoptosis following T cell activation (Ju et al., Nature 373: 444).
(1995): Brunner et al., Nature 373: 441 (1995).
). Activation of T cells induces both proteins on the cell surface. Subsequent interaction between the ligand and the receptor results in cell apoptosis. This supports a possible regulatory role for apoptosis induced by the Fas / Fas ligand interaction during a normal immune response.
【0011】 本発明のポリペプチドは、構造的類似性および生物学的類似性に基づいて、T
NFリガンドスーパーファミリーの新規なメンバーとして同定された。[0011] The polypeptides of the present invention are based on structural and biological similarities.
It has been identified as a new member of the NF ligand superfamily.
【0012】 明らかに、正常細胞および異常細胞の活性化、および分化を調節する因子が必
要である。従って、正常細胞および疾患状態細胞の両方の活性化、および分化を
調節するこのような因子の同定および特徴付けが必要である。特に、自己免疫疾
患、対宿主性移植片病、慢性関節リウマチおよびリンパ節症の処置のためにアポ
トーシスを制御するさらなるFasリガンドを単離し、そして特徴付けることが
必要である。Clearly, there is a need for factors that regulate the activation and differentiation of normal and abnormal cells. Thus, there is a need for the identification and characterization of such factors that regulate the activation and differentiation of both normal and diseased cells. In particular, there is a need to isolate and characterize additional Fas ligands that control apoptosis for the treatment of autoimmune diseases, graft versus host disease, rheumatoid arthritis and lymphadenopathy.
【0013】 (発明の要旨) 本発明は、図1Aおよび図1B(配列番号2)に示されるアミノ酸配列、また
は1996年8月22日にATCC寄託番号97689として細菌宿主中に寄託
されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するAIM II
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供す
る。本発明はまた、図1Cおよび図1D(配列番号39)に示されるアミノ酸配
列、または1996年3月15日にATCC寄託番号97483として細菌宿主
中に寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するAI
M IIポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1A and FIG. 1B (SEQ ID NO: 2), or a cDNA clone deposited in a bacterial host on August 22, 1996 as ATCC Accession No. 97689. AIM II having the amino acid sequence encoded by
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding the polypeptide. The present invention also relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1C and FIG. 1D (SEQ ID NO: 39), or the amino acid sequence encoded by the cDNA clone deposited in a bacterial host as ATCC Deposit No. 97483 on Mar. 15, 1996. AI having
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a MII polypeptide.
【0014】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法、および組換え技術によりこれらをAIM IIポリペプチドま
たはペプチドの産生に使用するための方法に関する。The present invention also relates to recombinant vectors containing the isolated nucleic acid molecules of the present invention, and host cells containing the recombinant vectors, methods of making such vectors and host cells, and recombinant techniques. And methods for using them for the production of AIM II polypeptides or peptides.
【0015】 本発明はさらに、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する単離されたAIM IIポリペプチドを提供する。[0015] The invention further provides an isolated AIM II polypeptide having an amino acid sequence encoded by a polynucleotide described herein.
【0016】 本明細書中で使用される用語「AIM II」ポリペプチドは、膜結合タンパ
ク質(細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む)ならび
にAIM IIポリペプチド活性を保持する短縮型タンパク質を含む。1つの実
施態様において、可溶性AIM IIポリペプチドは、AIM IIタンパク質
の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むが、細胞膜上のポリペプチドの保持を
生じる膜貫通領域を欠損する。可溶性AIM IIはまた、可溶性AIM II
タンパク質が分泌され得る場合、膜貫通領域の部分または細胞質ドメインの部分
あるいは他の配列を含み得る。異種シグナルペプチドは、発現された際に、可溶
性AIM IIポリペプチドが分泌されるように、可溶性AIM IIポリペプ
チドのN末端に融合され得る。As used herein, the term “AIM II” polypeptide refers to membrane-associated proteins (including cytoplasmic, transmembrane, and extracellular domains) and truncated proteins that retain AIM II polypeptide activity including. In one embodiment, the soluble AIM II polypeptide comprises all or part of the extracellular domain of the AIM II protein, but lacks the transmembrane region that results in retention of the polypeptide on the cell membrane. Soluble AIM II is also soluble AIM II
If the protein can be secreted, it may include part of the transmembrane region or part of the cytoplasmic domain or other sequences. The heterologous signal peptide can be fused to the N-terminus of the soluble AIM II polypeptide such that when expressed, the soluble AIM II polypeptide is secreted.
【0017】 本発明はまた、リンパ節症、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、対宿主性移植
片病、IgE媒介アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸促進症候群、ク
ローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキン
リンパ腫(NHL)、およびグレーヴズ病のような病気を処置するために用いら
れ得る、AIM IIポリペプチド、特にヒトAIM IIポリペプチドを提供
する。本発明のこれらのポリペプチドはまた、末梢の寛容を刺激し、いくつかの
形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および細胞増殖を媒介するために使用され
得、そして免疫調節および炎症応答の最初のメディエーターとして機能的に関連
する。The invention also relates to lymphadenopathy, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, graft-versus-host disease, IgE-mediated allergic reactions, anaphylaxis, adult respiratory distress syndrome, Crohn's disease, allergic asthma, acute lymphoblasts Provided are AIM II polypeptides, particularly human AIM II polypeptides, that can be used to treat diseases such as leukemia (ALL), non-Hodgkin's lymphoma (NHL), and Graves' disease. These polypeptides of the present invention can also be used to stimulate peripheral tolerance, destroy some transformed cell lines, mediate cell activation and cell proliferation, and regulate immunomodulatory and inflammatory responses. Functionally relevant as the first mediator.
【0018】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボ
で細胞に、または多細胞生物に投与するためのAIM IIポリヌクレオチドま
たはAIM IIポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特
定の好ましい実施態様において、この組成物は、疾患の処置のために、宿主生物
中でAIM IIポリペプチドを発現させるためのAIM IIポリヌクレオチ
ドを含む。このことに関して特に好ましいのは、AIM IIの異常な内因性活
性と関連した機能不全の処置のためのヒト患者での発現である。The invention further provides a composition comprising an AIM II polynucleotide or AIM II polypeptide for administration to a cell in vitro, to a cell ex vivo, and to a cell in vivo, or to a multicellular organism. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the composition comprises an AIM II polynucleotide for expressing an AIM II polypeptide in a host organism for treatment of a disease. Particularly preferred in this regard is the expression in human patients for the treatment of dysfunction associated with abnormal endogenous activity of AIM II.
【0019】 本発明はまた、AIM IIにより誘導される細胞応答を増強し得るかまたは
阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は
、AIM IIを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞応答をアッ
セイする工程、そして標準的な細胞応答に対してこの細胞応答を比較する工程を
含む(標準は、候補化合物の非存在下で接触がなされた場合にアッセイされる)
。それによって、標準に対して上昇した細胞応答は、この化合物がアゴニストで
あることを示し、そしてこの標準に対して減少した細胞応答は、この化合物がア
ンタゴニストであることを示す。The present invention also provides a screening method for identifying a compound capable of enhancing or inhibiting the cellular response induced by AIM II. The method comprises the steps of contacting a cell expressing AIM II with a candidate compound, assaying the cellular response, and comparing the cellular response to a standard cell response. Assayed when contact is made in the absence)
. Thereby, an elevated cellular response to the standard indicates that the compound is an agonist, and a decreased cellular response to the standard indicates that the compound is an antagonist.
【0020】 別の局面において、AIM IIのアゴニストおよびアンタゴニストについて
のスクリーニングアッセイが提供される。このアンタゴニストを使用し、敗血症
性ショック、炎症、大脳マラリア、HIVウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶
反応、骨吸収、および悪液質(るいそうまたは栄養失調)を予防し得る。In another aspect, screening assays for AIM II agonists and antagonists are provided. This antagonist can be used to prevent septic shock, inflammation, cerebral malaria, activation of HIV virus, graft-host rejection, bone resorption, and cachexia (wasting or malnutrition).
【0021】 本発明のさらなる局面において、AIM IIは、慢性関節リウマチ(RA)
において頻繁に観察されるような骨および軟骨における侵襲性(invadin
g)パンヌスを維持することが必要とされる新脈管形成における増加または内皮
細胞増殖における増加を阻害することによってRAを処置するために使用され得
る。In a further aspect of the invention, AIM II comprises rheumatoid arthritis (RA)
Invasion in bone and cartilage as frequently observed in
g) Can be used to treat RA by inhibiting an increase in angiogenesis or an increase in endothelial cell proliferation required to maintain pannus.
【0022】 本発明のさらなる局面において、AIM IIは、リガンドのレセプターへの
結合を阻害することによって、またはレセプターに結合し、そしてレセプター媒
介細胞応答を活性化することによってのいずれかで、細胞性レセプター(例えば
、LT−β−R、TR2、CD27、およびTRANK)によって媒介される細
胞応答を阻害または活性化するために使用され得る。[0022] In a further aspect of the invention, AIM II inhibits cellular binding, either by inhibiting the binding of a ligand to a receptor, or by binding to a receptor and activating a receptor-mediated cellular response. It can be used to inhibit or activate cellular responses mediated by receptors (eg, LT-β-R, TR2, CD27, and TRANK).
【0023】 本発明のさらなる局面は、身体中において上昇したレベルのAIM II活性
を必要とする個体を処置するための方法であって、治療的に有効量の本発明の単
離されたAIM IIポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物をこのよ
うな個体に投与する工程を包含する方法に関する。A further aspect of the invention is a method for treating an individual in need of elevated levels of AIM II activity in the body, comprising a therapeutically effective amount of an isolated AIM II of the invention. A method comprising administering to such an individual a composition comprising the polypeptide or agonist thereof.
【0024】 本発明のなおさらなる局面は、身体中において減少したレベルのAIM II
活性を必要とする個体を処置するための方法であって、治療的に有効量のAIM
IIアンタゴニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程を包含する
方法に関する。[0024] Still a further aspect of the invention is directed to reduced levels of AIM II in the body.
A method for treating an individual in need of an activity, comprising a therapeutically effective amount of AIM
A method comprising administering to such an individual a composition comprising a II antagonist.
【0025】 (詳細な説明) 本発明は、クローン化cDNAの配列決定によって決定した図1AおよびBに
示されるアミノ酸配列(配列番号2)を有するAIM IIポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のAIM
IIタンパク質は、ヒトTNF−α(配列番号3)、ヒトTNF−β(配列番
号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、およびヒトFasリガンド(配列
番号6)との配列相同性を共有する(図2A〜C)。図1AおよびBに示される
ヌクレオチド配列(配列番号1)は、cDNAクローンを配列決定することによ
って得られ、これは、1996年8月22日に、アメリカンタイプカルチャーコ
レクション、10801、University Blvd.Manassas
,VA 20110−2209、USAに寄託され、そして受託番号97689
を与えられた。寄託されたクローンは、pBluescript SK(−)プ
ラスミド(Stratagene、La Jolla、CA)に含まれている。
図1CおよびDに示されるヌクレオチド配列を、cDNAクローンを配列決定す
ることによって得た。これは、1996年3月15日に、アメリカンタイプカル
チャーコレクション、10801、University Blvd.Mana
ssas,VA 20110−2209、USAに寄託され、そして受託番号9
7483を与えられた。DETAILED DESCRIPTION The present invention provides an isolation comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) as determined by sequencing of the cloned cDNA. Provided nucleic acid molecules. AIM of the present invention
The II protein shares sequence homology with human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and human Fas ligand (SEQ ID NO: 6). (FIGS. 2A-C). The nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was obtained by sequencing a cDNA clone, which was published on August 22, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Manassas
, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 97689.
Was given. The deposited clone is contained in the pBluescript SK (-) plasmid (Stratagene, La Jolla, CA).
The nucleotide sequences shown in FIGS. 1C and D were obtained by sequencing cDNA clones. This is on March 15, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Mana
sass, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 9
7483 was given.
【0026】 (核酸分子) 特に示されない限り、本明細書中のDNA分子を配列決定することによって決
定された全てのヌクレオチド配列は、自動化DNAシークエンサー(例えば、A
pplied Biosystems,Inc.からのModel 373)を
使用して決定され、そして本明細書中で決定されたDNA分子によってコードさ
れるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されたDNA配列
の翻訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された
任意のDNA配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定され
た任意のヌクレオチド配列は、いくらかの誤差を含み得る。自動化によって決定
されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたDNA分子の実際のヌ
クレオチド配列に対して、少なくとも約90%同一であり、より代表的には、少
なくとも約95%〜少なくとも約99.9%同一である。実際の配列は、当該分
野で周知の手動DNA配列決定法を含む他のアプローチによってより正確に決定
され得る。同様に当該分野で公知であるように、実際の配列に比較しての決定さ
れたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻
訳において、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予想されたアミ
ノ酸配列が、配列決定されたDNA分子によって実際にそのような挿入または欠
失の位置で始まってコードされたアミノ酸配列とは全く異なるように、フレーム
シフトを生じる。Nucleic Acid Molecules Unless otherwise indicated, all nucleotide sequences determined by sequencing DNA molecules herein are based on automated DNA sequencers (eg, A
Applied Biosystems, Inc. The entire amino acid sequence of a polypeptide determined by the DNA molecule determined using Model 373) and determined herein is predicted by translation of the DNA sequence determined as described above. Was. Thus, as is known in the art for any DNA sequence determined by this automated approach, any nucleotide sequence determined herein may contain some errors. The nucleotide sequence determined by automation is typically at least about 90% identical to the actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule, and more typically at least about 95% to at least about 99.9% identical. The actual sequence may be more accurately determined by other approaches, including manual DNA sequencing methods well known in the art. As is also known in the art, a single insertion or deletion in the determined nucleotide sequence relative to the actual sequence will result in the translation of the nucleotide sequence into the predicted sequence encoded by the determined nucleotide sequence. The resulting amino acid sequence causes a frameshift such that the sequenced DNA molecule is completely different from the encoded amino acid sequence actually starting at the position of such an insertion or deletion.
【0027】 本明細書中に提供される情報を(例えば、図1AおよびBのヌクレオチド配列
)使用して、AIM IIポリぺプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準
的なクローニング手順およびスクリーニング手順(例えば、開始材料としてmR
NAを使用するcDNAクローニング手順)を使用して得られ得る。本発明の例
証として、図1AおよびB(配列番号1)に記載される核酸分子は、ヒトマクロ
ファージox LDL(HMCCB64)に由来するcDNAライブラリーにお
いて発見された。この遺伝子はまた、活性化されたT細胞(HT4CC72)に
由来するcDNAライブラリーおいても同定された。図1AおよびBのAIM
II cDNAの決定されたヌクレオチド配列(配列番号1)は、240アミノ
酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタ
ンパク質は、図1AおよびBのヌクレオチド配列の49〜51位の開始コドン(
配列番号1)、図1AおよびBの約60〜約240のアミノ酸残基を含む細胞外
ドメイン(配列番号2)、図1AおよびBの約37〜約59のアミノ酸残基を含
む膜貫通ドメイン(配列番号2)、図1AおよびBの約1〜約36のアミノ酸残
基を含む細胞内ドメイン(配列番号2)を有し、そして推定分子質量は約26.
4kDaである。図1AおよびBに示されるAIM IIタンパク質(配列番号
2)は、ヒトFasリガンドのアミノ酸配列に約27%同一および51%類似で
あり(図2A)、そしてヒトTNF−αのアミノ酸配列に約26%同一および約
47%類似である(図2B)。AIM IIが、TNFリガンド様分子に相同で
あるならば、TNFリガンド様分子は、二量体として機能する。この分子は、ホ
モ二量体としても機能するようである。Using the information provided herein (eg, the nucleotide sequences of FIGS. 1A and B), a nucleic acid molecule of the invention encoding an AIM II polypeptide can be constructed using standard cloning procedures and screening. Procedure (eg, mR as starting material)
CDNA cloning procedure using NA). As an illustration of the present invention, the nucleic acid molecule set forth in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was found in a cDNA library derived from human macrophage ox LDL (HMCCB64). This gene was also identified in a cDNA library derived from activated T cells (HT4CC72). AIM of FIGS. 1A and B
The determined nucleotide sequence of the II cDNA (SEQ ID NO: 1) contains an open reading frame encoding a protein of 240 amino acid residues. This protein has the start codon at positions 49-51 of the nucleotide sequence of FIGS.
SEQ ID NO: 1), an extracellular domain comprising about 60 to about 240 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), a transmembrane domain comprising about 37 to about 59 amino acid residues in FIGS. SEQ ID NO: 2), having an intracellular domain comprising about 1 to about 36 amino acid residues of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), and a predicted molecular mass of about
4 kDa. The AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) is approximately 27% identical and 51% similar to the amino acid sequence of human Fas ligand (FIG. 2A), and approximately 26% to the amino acid sequence of human TNF-α. % Identity and about 47% similar (FIG. 2B). If AIM II is homologous to a TNF ligand-like molecule, the TNF ligand-like molecule functions as a dimer. This molecule also appears to function as a homodimer.
【0028】 当業者は、上記で議論された配列決定のエラーの可能性に起因して、寄託され
たcDNAによってコードされる推定AIM IIポリぺプチドが、約240ア
ミノ酸を含むように、該して230〜250アミノ酸の範囲の間であり得ること
を理解する。使用される基準に依存して、AIM IIポリぺプチドの細胞外ド
メイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な「位置(addres
s)」に関してはわずかに異なることが、さらに理解される。例えば、図1Aお
よびBのAIM IIの細胞外ドメイン(配列番号2)の正確な位置は、このド
メインを定義するために使用される基準に依存して、わずかに変化し得る(例え
ば、位置は、約1〜5残基「ずれ(shift)」得る)。The skilled artisan will appreciate that, due to the possibility of sequencing errors discussed above, the putative AIM II polypeptide encoded by the deposited cDNA will contain about 240 amino acids. It can range between 230 and 250 amino acids. Depending on the criteria used, the exact “location” of the extracellular, intracellular, and transmembrane domains of AIM II polypeptides (addres
s) "is slightly different. For example, the exact location of the extracellular domain of AIM II (SEQ ID NO: 2) in FIGS. 1A and B may vary slightly depending on the criteria used to define this domain (eg, , About 1-5 residues "shift").
【0029】 示したように、本発明の核酸分子は、RNAの形態(例えば、mRNA)であ
り得、またはDNAの形態(例えば、クローニングにより得られたか、または合
成的に産生された、cDNAおよびゲノムDNAを含む)であり得る。このDN
Aは、二重鎖または一重鎖であり得る。一重鎖のDNAもしくはRNAは、コー
ディング鎖(センス鎖としても公知)であり得、あるいは非コーディング鎖(抗
アンチセンス鎖とも呼ばれる)であり得る。As indicated, the nucleic acid molecules of the invention can be in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, obtained by cloning or produced synthetically). Genomic DNA). This DN
A can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or can be the non-coding strand (also called the anti-antisense strand).
【0030】 「単離した」核酸分子とは、その天然の環境から取り出された核酸分子、DN
AもしくはRNAをいう。例えば、ベクターに含まれる組換えDNA分子は、本
発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたDNA分子のさらなる
例としては、異種の宿主細胞で維持される組換えDNA分子、または溶液中の(
部分的にもしくは実質的に)精製したDNA分子が挙げられる。単離されたRN
A分子は、本発明のDNA分子のインビボもしくはインビトロのRNA転写物を
含む。本発明に従う単離された核酸分子は、さらに、合成的に産生されたこのよ
うな分子を含む。An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been removed from its natural environment, DN
A or RNA. For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector will be isolated for the purposes of the present invention. Further examples of isolated DNA molecules include recombinant DNA molecules maintained in heterologous host cells, or (in solution).
DNA molecules that are (partially or substantially) purified. Isolated RN
A molecule comprises an in vivo or in vitro RNA transcript of a DNA molecule of the present invention. Isolated nucleic acid molecules according to the present invention further include such molecules produced synthetically.
【0031】 本発明の単離された核酸分子としては、以下が挙げられる:図1AおよびBに
示されるオープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号1)または図1C
およびDに示されるオープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号38)
を含むDNA分子;図1AおよびBに示されるAIM IIタンパク質のコード
配列(配列番号2)または図1CおよびDに示されるAIM IIタンパク質の
コード配列(配列番号39)を含むDNA分子;ならびに上記に記載したDNA
と実質的に異なる配列を含むが(遺伝暗号の縮重に起因して)、AIM IIタ
ンパク質をまだコードするDNA分子。当然、遺伝子暗号は当該分野において周
知である。従って、当業者にとって、このような変性改変体を産生することは慣
用的なものである。[0031] Isolated nucleic acid molecules of the invention include the following: an open reading frame (ORF) (SEQ ID NO: 1) shown in FIGS. 1A and B or FIG. 1C.
Open reading frame (ORF) shown in SEQ ID NOS: and D (SEQ ID NO: 38)
A DNA molecule comprising the coding sequence of the AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) or the coding sequence of the AIM II protein shown in FIGS. 1C and D (SEQ ID NO: 39); DNA described
A DNA molecule comprising a sequence substantially different from that of the AIM II protein (due to the degeneracy of the genetic code) but still encodes the AIM II protein. Of course, the genetic code is well known in the art. Thus, it is conventional for those skilled in the art to produce such modified variants.
【0032】 さらに、本発明は、以下の関連したcDNAクローン:HT4CC72R(配
列番号20)から決定された、配列番号1の一部分に関連するヌクレオチド配列
を有する核酸分子を提供する。Further, the present invention provides a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence related to a portion of SEQ ID NO: 1, as determined from the following related cDNA clone: HT4CC72R (SEQ ID NO: 20).
【0033】 別の局面において、本発明は、1996年8月22日にATCC受諾番号第9
7689号として寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによって
か、または1996年3月15日にATCC受諾番号第97483号として寄託
されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸
配列を有するAIM IIポリぺプチドをコードする、単離された核酸分子を提
供する。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによ
ってコードされるポリぺプチドをコードする。本発明はさらに、図1AおよびB
に示されるヌクレオチド配列(配列番号1)を有する単離された核酸分子、もし
くは図1CおよびDに示されるヌクレオチド配列(配列番号38)を有する単離
された核酸分子、または上記の寄託されたクローンに含まれるAIM II c
DNAのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記の配列の
1つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された核酸分
子(特にDNA分子)は、(染色体のインサイチュハイブリダイゼーションによ
る)遺伝子マッピング、および(例えば、ノーザンブロット分析により)ヒト組
織においてAIM II遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用であ
る。In another aspect, the present invention relates to ATCC Accession No. 9 on August 22, 1996.
AIM having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in the plasmid deposited as No. 7689, or by the cDNA clone contained in the plasmid deposited as ATCC Accession No. 97483 on Mar. 15, 1996. Provided is an isolated nucleic acid molecule that encodes a II polypeptide. Preferably, the nucleic acid molecule encodes a polypeptide encoded by the deposited cDNA clone described above. The present invention further relates to FIGS.
An isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1), or having the nucleotide sequence shown in FIGS. 1C and D (SEQ ID NO: 38), or a deposited clone as described above AIM IIc included in
An isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of DNA or a nucleic acid molecule having a sequence complementary to one of the above sequences is provided. Such isolated nucleic acid molecules (especially DNA molecules) can be used for gene mapping (by in situ hybridization of chromosomes) and probes for detecting the expression of the AIM II gene in human tissues (eg, by Northern blot analysis). Useful as
【0034】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または図1AおよびBに示
されるヌクレオチド配列(配列番号1)を有する単離されたヌクレオチド分子の
フラグメントとは、本明細書中で議論されるように、診断的なプローブおよびプ
ライマーとして有用である、少なくとも約15nt、およびより好ましくは、少
なくとも約20nt、さらにより好ましくは、少なくとも30nt、そしてなお
さらにより好ましくは少なくとも40ntの長さのフラグメントをいう。当然、
50、75、100、125、150、175、200、225、250、27
5、300、325、350、375、400、425、450、475、50
0、525、550、575、600、625、650、675、700、72
5、750、775、800、825、850、875、900、925、95
0、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、
または1150ntの長さのより長いフラグメントもまた、寄託されたcDNA
のヌクレオチド配列、または図1AおよびBに示されるヌクレオチド配列(配列
番号1)のほとんどに(全てではなくとも)対応するフラグメントとして本発明
に従って有用である。少なくとも20ntの長さのフラグメントとは、例えば、
寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または図1AおよびBに示されるヌク
レオチド配列(配列番号1)からの20以上連続した塩基を含むフラグメントを
いう。[0034] The present invention further relates to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein. The nucleotide sequence of the deposited cDNA, or a fragment of the isolated nucleotide molecule having the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1), as discussed herein, is diagnostic. Refers to fragments of at least about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least 30 nt, and even more preferably at least 40 nt, which are useful as probes and primers. Of course,
50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 27
5, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 50
0, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 72
5, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 95
0, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125,
Alternatively, a longer fragment of 1150 nt in length was also obtained from the deposited cDNA.
Or fragments corresponding to most, if not all, of the nucleotide sequences shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1). A fragment having a length of at least 20 nt is, for example,
Refers to the nucleotide sequence of the deposited cDNA, or a fragment comprising at least 20 contiguous bases from the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1).
【0035】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、AIM IIタンパク質のエピトープ
保有部分をコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような核酸分子フラ
グメントは、以下をコードする核酸分子を含む:図1AおよびBの約13〜約2
0のアミノ酸残基(配列番号2)を含むポリぺプチド;図1の約23〜36アミ
ノ酸残基(配列番号2)を含むポリぺプチド;図1AおよびBの約69〜約79
のアミノ酸残基(配列番号2)を含むポリぺプチド;図1AおよびBの約85〜
約94のアミノ酸残基(配列番号2)を含むポリぺプチド;図1AおよびBの約
167〜約178のアミノ酸残基(配列番号2)を含むポリぺプチド;図1Aお
よびBの約184〜約196のアミノ酸残基(配列番号2)を含むポリぺプチド
;ならびに、図1AおよびBの約221〜約233のアミノ酸残基(配列番号2
)を含むポリぺプチド。本発明者らは、上記のポリぺプチドフラグメントは、A
IM IIタンパク質の抗原性領域であると決定した。AIM IIタンパク質
のこのような他のエピトープ保有領域を決定するための方法は、以下に詳細に記
載される。[0035] Preferred nucleic acid fragments of the invention include nucleic acid molecules encoding the epitope-bearing portion of the AIM II protein. In particular, such nucleic acid molecule fragments of the invention include nucleic acid molecules that encode: from about 13 to about 2 in FIGS.
A polypeptide comprising 0 amino acid residues (SEQ ID NO: 2); a polypeptide comprising about 23-36 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) of FIG. 1;
A polypeptide comprising the amino acid residues of SEQ ID NO: 2;
A polypeptide comprising about 94 amino acid residues (SEQ ID NO: 2); a polypeptide comprising about 167 to about 178 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) of FIGS. 1A and B; A polypeptide comprising about 196 amino acid residues (SEQ ID NO: 2); and about 221 to about 233 amino acid residues of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
A). We have determined that the above polypeptide fragment is
It was determined to be the antigenic region of the IM II protein. Methods for determining such other epitope-bearing regions of the AIM II protein are described in detail below.
【0036】 AIM IIポリヌクレオチドは、種々の用途、特に、AIM IIの化学的
特性および生物学的特性を利用する用途のために、本発明に従って使用され得る
。自己免疫疾患および異常な細胞増殖が、これらの用途のうちである。さらなる
用途は、細胞、組織、および器官の障害の診断および処置に関連する。AIM II polynucleotides can be used in accordance with the present invention for a variety of applications, particularly those that make use of the chemical and biological properties of AIM II. Autoimmune diseases and abnormal cell proliferation are among these uses. Further uses relate to the diagnosis and treatment of cell, tissue, and organ disorders.
【0037】 本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するための、例えば、診断試
薬としてのAIM IIポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害に関連する
AIM IIの変異した形態の検出は、AIM IIの過少発現、過剰発現、ま
たは変質した発現から生じる疾患(例えば、自己免疫疾患)の診断、あるいはそ
の疾患への感受性を補足または定義し得る診断上の手段を提供する。AIM I
Iをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明のポリぺプチドの発現のための
診断マーカーとして利用され得る。The present invention also relates to the use of AIM II polynucleotides for detecting complementary polynucleotides, for example, as a diagnostic reagent. Detection of a mutated form of AIM II associated with dysfunction can be used to diagnose, or supplement, susceptibility to a disease (eg, an autoimmune disease) resulting from under-, over-, or altered expression of AIM II. Provides a diagnostic tool that can be defined. AIM I
Polynucleotides encoding I can also be used as diagnostic markers for expression of the polypeptides of the invention.
【0038】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記に記載の本発明の核酸分子(例えば、ATCC受諾番号第9768
9号に含まれるcDNAクローン)におけるポリヌクレオチドの一部分にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下を含む溶液中で、42℃
で終夜インキュベートし、次いで、約65℃で0.1×SSC中でフィルターを
洗浄することを意図する:50%ホルムアミド、5×SSC(750mM Na
Cl、75mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH
7.6)、5×デンハート液、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml
変性、剪断サケ***DNA。In another aspect, the present invention provides a nucleic acid molecule of the invention described above (eg, ATCC Accession No. 9768) under stringent hybridization conditions.
(CDNA clone included in No. 9), comprising an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide that hybridizes to a portion of the polynucleotide. "Stringent hybridization conditions" refers to a solution containing
And wash the filters in 0.1 × SSC at about 65 ° C .: 50% formamide, 5 × SSC (750 mM Na
Cl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH
7.6) 5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml
Denatured, sheared salmon sperm DNA.
【0039】 ポリヌクレオチドの「一部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、
参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、およびより好
ましくは、少なくとも約20nt、さらにより好ましくは、少なくとも30nt
、そして、なおさらにより好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポ
リヌクレオチド(DNAまたはRNAのいずれか)を意図する。これらは、上記
で議論し、そしてさらに以下で詳細に議論されるように、診断上のプローブおよ
び診断上のプライマーとして有用である。A polynucleotide that hybridizes to a “portion” of a polynucleotide is:
At least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably, at least about 20 nt, even more preferably, at least 30 nt
And, even more preferably, polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to about 30-70 nt are contemplated. These are useful as diagnostic probes and diagnostic primers, as discussed above and in more detail below.
【0040】 「少なくとも20nt(ヌクレオチド)の長さ」のポリヌクレオチドの一部分
とは、例えば、参照ポリヌクレオチド(例えば、図1AおよびBに示されるよう
な寄託されたcDNAまたはヌクレオチド配列(配列番号1))のヌクレオチド
配列からの20以上連続したヌクレオチドを意図する。A portion of a polynucleotide that is “at least 20 nt (nucleotides in length)” includes, for example, a reference polynucleotide (eg, a deposited cDNA or nucleotide sequence as shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) ) Is intended for 20 or more contiguous nucleotides from the nucleotide sequence.
【0041】 当然、ポリA配列のみにハイブリダイズするポリヌクレオチド(例えば、図1
AおよびBに示されるAIM II cDNAの3’末端ポリ(A)領域(配列
番号1))、またはT(もしくはU)残基の相補的なストレッチにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズするために
使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリ
ヌクレオチドは、ポリ(A)ストレッチを含む任意の核酸分子、またはその相補
体にハイブリダイズするからである(例えば、特に、任意の二重鎖cDNAクロ
ーン)。Naturally, a polynucleotide that hybridizes only to the polyA sequence (eg, FIG. 1)
Polynucleotides that hybridize to the 3 ′ terminal poly (A) region of AIM II cDNA (A and B) (SEQ ID NO: 1), or a complementary stretch of T (or U) residues, are nucleic acids of the invention. Is not included in the polynucleotide of the present invention used to hybridize to a portion of the polynucleotide. This is because such a polynucleotide will hybridize to any nucleic acid molecule comprising a poly (A) stretch, or its complement (eg, in particular, any double-stranded cDNA clone).
【0042】 示されるように、AIM IIポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は
、以下を含み得るが、これらに限定されない:単独でポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする核酸分子;このポリペプチドのコード配列およびさらなる配列(
例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク
質配列のような、リーダー配列もしくは分泌配列をコードする配列);さらなる
非コード配列を伴う、上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まない、この
ポリペプチドのコード配列(さらなる非コード配列は、例えば、イントロンおよ
び非コード5’配列および3’配列(例えば、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナルを含む、転写、mRNAプロセシングにおいて役割(例えば、リボ
ソーム結合およびmRNAの安定性)を担う、転写される非翻訳配列)を含むが
、これらに限定されない);さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸
をコードするさらなるコード配列。従って、このポリペプチドをコードする配列
は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のよ
うな、マーカー配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態
様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、pQEベクター(Qiage
n,Inc.)中に提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドである
。これらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 86:821−824(1989)において記載
されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。
「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対
応する、精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、C
ell 37:767(1984)によって記載されている。以下で考察される
ように、他のそのような融合タンパク質は、N末端またはC末端にてFcに融合
されたAIM IIを含む。As indicated, a nucleic acid molecule of the invention encoding an AIM II polypeptide may include, but is not limited to: a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of a polypeptide alone; Coding sequence and additional sequences (
A polypeptide encoding a leader or secretory sequence, such as a pre-protein sequence or a pro-protein sequence or a pre-pro-protein sequence); with or without additional coding sequences as described above, with additional non-coding sequences Coding sequences (eg, additional non-coding sequences include, for example, introns and non-coding 5 ′ and 3 ′ sequences (eg, including splicing and polyadenylation signals, roles in transcription, mRNA processing (eg, ribosome binding and mRNA stability)). ) Transcribed non-translated sequences); additional coding sequences that encode additional amino acids to provide additional functionality. Thus, the sequence encoding the polypeptide can be fused to a marker sequence, such as a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fused polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker amino acid sequence is, inter alia, a pQE vector (Qiage).
n, Inc. ) Is a hexahistidine peptide, such as the tag provided in). Many of these are commercially available. See, for example, Gentz et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), hexahistidine provides for convenient purification of the fusion protein.
The “HA” tag is another peptide useful for purification, corresponding to an epitope from the influenza hemagglutinin protein, which is described in Wilson et al.
ell 37: 767 (1984). As discussed below, other such fusion proteins include AIM II fused to Fc at the N-terminus or C-terminus.
【0043】 本発明による核酸分子はさらに、N末端メチオニンを欠く全長AIM−IIポ
リペプチドをコードする核酸分子を含む。A nucleic acid molecule according to the present invention further includes a nucleic acid molecule encoding a full-length AIM-II polypeptide lacking an N-terminal methionine.
【0044】 本発明は、さらに、AIM IIのタンパク質の部分、アナログ、または誘導
体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。天然の対立遺伝子改変体
のような改変体は、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」とは、生物の染色体
上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態のうちの1つを意
図する。Genes II,Lewin,B.編、John Wiley&So
ns,New York(1985)。天然に存在しない改変体は、当該分野で
公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。The invention further relates to variants of the nucleic acid molecules of the invention that encode a portion, analog or derivative of a protein of AIM II. Variants such as natural allelic variants can occur naturally. By "allelic variant" is intended one of several alternative forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. Genes II, Lewin, B .; Hen, John Wiley & So
ns, New York (1985). Non-naturally occurring variants can be generated using mutagenesis techniques known in the art.
【0045】 このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生さ
れる改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には1つ以上のヌクレオチ
ドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変
更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸の置換
、欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな
置換、付加、および欠失であり、これらはAIM IIタンパク質、またはそれ
らの部分の特性および活性を変化させない。このことについてまた特に好ましい
のは、保存的置換である。Such variants include those produced by nucleotide substitutions, deletions or additions. The substitutions, deletions, or additions can include one or more nucleotides. Variants can be altered in the coding region, non-coding region, or both. Changes in the coding region can result in conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Especially preferred among these are silent substitutions, additions and deletions, which do not alter the properties and activities of the AIM II protein, or a portion thereof. Also particularly preferred in this regard are conservative substitutions.
【0046】 本発明のさらなる実施態様には、以下のポリヌクレオチドに、少なくとも90
%同一、そしてより好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、ま
たは99%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離さ
れた核酸分子が含まれる:(a)図1AおよびB(配列番号2)中の完全アミノ
酸配列を有するAIM IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(b
)図1AおよびB(配列番号2)中のアミノ酸配列を有するがN末端のメチオニ
ンが欠けているAIM IIポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(c
)ATCC受託番号97689に含まれるcDNAクローンによってコードされ
る完全アミノ酸配列を有するAIM IIポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列;(d)AIM IIポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオ
チド配列;(e)AIM IIポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレ
オチド配列;(f)AIM IIポリペプチド細胞内ドメインをコードするヌク
レオチド配列;(g)細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが膜貫通ド
メインが欠けている可溶性AIM IIポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列;ならびに(h)上記の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)
、または(g)は中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
。In a further embodiment of the present invention, the following polynucleotide comprises at least 90
An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is 100% identical, and more preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical is included: (a) FIGS. A nucleotide sequence encoding an AIM II polypeptide having the complete amino acid sequence in B (SEQ ID NO: 2); (b
) A nucleotide sequence encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) but lacking the N-terminal methionine; (c)
A) a nucleotide sequence encoding the AIM II polypeptide having the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97689; (d) a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the AIM II polypeptide; A nucleotide sequence encoding a polypeptide transmembrane domain; (f) a nucleotide sequence encoding an AIM II polypeptide intracellular domain; (g) a soluble AIM II having extracellular and intracellular domains but lacking the transmembrane domain. A nucleotide sequence encoding a polypeptide; and (h) (a), (b), (c), (d), (e), (f) as described above.
Or (g) is a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences therein.
【0047】 AIM IIポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも、
例えば、95%「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そ
のポリヌクレオチド配列が、AIM IIポリペプチドをコードする参照ヌクレ
オチド配列の各100ヌクレオチド毎に5つまでの点変異を含み得ることを除い
て、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを意
図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一の
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列において5
%までのヌクレオチドが、欠失されるかもしくは別のヌクレオチドで置換され得
、または参照配列における総ヌクレオチドの5%までの多数のヌクレオチドが参
照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5
’末端位置もしくは3’末端位置で、または参照配列のヌクレオチド間で個々に
、もしくは参照配列内で1つ以上の隣接した基においてのいずれかで散在して、
これらの末端位置の間のどこかで起こり得る。The reference nucleotide sequence encoding the AIM II polypeptide may have at least
For example, a polynucleotide having a 95% "identical" nucleotide sequence means that the polynucleotide sequence can contain up to 5 point mutations for every 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence encoding the AIM II polypeptide. Except, the nucleotide sequence of the polynucleotide is intended to be identical to the reference sequence. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to the reference nucleotide sequence, 5
Up to% of the nucleotides can be deleted or replaced with another nucleotide, or as many as 5% of the total nucleotides in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These mutations in the reference sequence correspond to 5
At the 'terminal or 3' terminal positions, or interspersed either individually between nucleotides of the reference sequence or at one or more adjacent groups within the reference sequence,
It can occur anywhere between these terminal positions.
【0048】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図1AおよびBに示され
るヌクレオチド配列、または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に
対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%同
一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Seq
uence Analysis Package,Unix用バージョン8、G
enetics Computer Group,University Re
search Park,575 Science Drive,Madiso
n,WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを使用して従
来通りに決定され得る。Bestfitは、SmithおよびWaterman
(Advances in Applied Mathematics 2:4
82−489(1981))の局所的相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列
間の相同性が最も良いセグメントを見出す。特定の配列が、本発明による参照配
列に、例えば、95%同一であるかどうかを決定するために、Bestfitま
たは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のことなが
ら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され
、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の5%までの相同性におけるギャップ
が許容されるようにパラメーターが設定される。As a practical matter, any particular nucleic acid molecule may be at least 90%, 95%, 96%, at least 90%, relative to the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B, or the nucleotide sequence of a deposited cDNA clone. Whether 97%, 98%, or 99% identical is determined by the Bestfit program (Wisconsin Seq
uence Analysis Package, Version 8 for Unix, G
Enetics Computer Group, University Re
search Park, 575 Science Drive, Madiso
n, WI 53711) can be determined conventionally using known computer programs. Bestfit is Smith and Waterman
(Advances in Applied Materials 2: 4
82-489 (1981)) to find the segment with the best homology between the two sequences. When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence according to the present invention, the percentage of identity will, of course, be determined. Is calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence, and parameters are set to allow for gaps in homology up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence.
【0049】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも95%「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列は、ポリヌクレオチド配列がAIM IIポリぺプチドをコードす
る参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異を含み
得ることを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、
参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの5%までが、別の
ヌクレオチドで欠失または置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチド
の5%までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合わせ(q
uery)配列は、表1Aおよび表1Bに示される配列全体、ORF(オープン
リーディングフレーム)、または本明細書中で記載されるように特定される任意
のフラグメントであり得る。By a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence of the present invention, the nucleotide sequence of the polynucleotide is a reference nucleotide whose polynucleotide sequence encodes an AIM II polypeptide. It is intended to be identical to a reference sequence except that it can contain up to 5 point mutations for each 100 nucleotides of the sequence. In other words,
To obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to a reference nucleotide sequence, up to 5% of the nucleotides of the reference sequence can be deleted or substituted with another nucleotide, or As many as 5% of the nucleotides can be inserted into the reference sequence. Inquiry (q
The uery) sequence can be the entire sequence shown in Table 1A and Table 1B, the ORF (open reading frame), or any fragment identified as described herein.
【0050】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、ま
たは99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来通りに決定され得る。問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列との間の最
も良好な全体的な適合性(全体的な配列整列としてもまた言及される)を決定す
るための好ましい方法は、Brutlagら(Comp.App.Biosci
.6:237−245(1990))のアルゴリズムに基づくFASTDBコン
ピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ
配列および対象配列は、両方ともにDNA配列である。RNA配列は、UからT
に変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性
パーセントで示される。同一性パーセントを算定するためにDNA配列のFAS
TDB整列において使用される好ましいパラメーターは:Matrix=Uni
tary、k−tuple=4、Mismatch Penalty=1、Jo
ining Penalty=30、Randomization Group
Length=0、Cutoff Score=1、Gap Penalty
=5、Gap Size Penalty 0.05、Window Size
=500または対象ヌクレオチド配列の長さ(どちらかより短い方)である。In practice, is any particular nucleic acid molecule or polypeptide at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to a nucleotide sequence of the present invention? No can be determined conventionally using known computer programs. A preferred method for determining the best overall match (also referred to as an overall sequence alignment) between a query sequence (a sequence of the invention) and a subject sequence is described in Brutlag et al. (Comp. App.Biosci
. 6: 237-245 (1990)). In sequence alignment, the query and subject sequences are both DNA sequences. RNA sequence from U to T
Can be compared. The result of this global sequence alignment is expressed as percent identity. FAS of DNA sequence to calculate percent identity
The preferred parameters used in the TDB alignment are: Matrix = Uni
tarry, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1, Jo
ining Penalty = 30, Randomization Group
Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty
= 5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size
= 500 or the length of the nucleotide sequence of interest (whichever is shorter).
【0051】 対象配列が、5’または3’欠失のために(内部欠失のためではなく)問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、FASTDBプログラムが対象配列
の5’および3’切断を考慮しないからである。5’末端または3’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致/整列されない対象配列の5’およ
び3’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致/整列されるか否かは、FASTDB配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上記のF
ASTDBプログラムによって算定される同一性パーセントから差し引かれ、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。FASTDB整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致/整列していない、対象配列の5’および3’塩基の外側の
塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。If the subject sequence is shorter than the query sequence due to a 5 ′ or 3 ′ deletion (rather than due to an internal deletion), a manual correction must be made to the result. This is because the FASTDB program does not take into account 5 'and 3' truncations of the subject sequence when calculating percent identity. For a subject sequence truncated at the 5 'end or 3' end, the percent identity to the query sequence is the query sequence, which is 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned as a percentage of the total bases of the query sequence. Is corrected by calculating the number of bases Whether nucleotides are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then calculated using the above parameters using the specified parameters.
Subtracted from the percent identity calculated by the ASTDB program to arrive at the final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of the present invention. Only those bases outside of the 5 'and 3' bases of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence, as indicated by FASTDB alignment, are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score.
【0052】 例えば、90塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために100塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失が対象配列の5’末端で生じ、従って、
FASTDB整列は、5’末端で最初の10塩基の一致/整列を示さない。10
個の不対合塩基は、配列の10%(一致していない5’末端および3’末端での
塩基の数/問い合わせ配列の塩基の総数)を表し、そのため10%が、FAST
DBプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる
。残りの90塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは90%
である。別の例では、90塩基の対象配列は、100塩基の問い合わせ配列と比
較される。今度は、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致/整
列しない塩基は、対象配列の5’側または3’側に存在しない。この場合、FA
STDBによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問
い合わせ配列と一致/整列しない対象配列の5’側または3’側の塩基のみが手
動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的ではなされない。For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, thus
FASTDB alignment shows no match / alignment of the first 10 bases at the 5 'end. 10
Unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at the unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the query sequence), so that 10%
It is subtracted from the percent identity score calculated by the DB program. If the remaining 90 bases match exactly, the final percent identity is 90%
It is. In another example, a 90 base subject sequence is compared to a 100 base query sequence. This time, the deletion is an internal deletion, so that no bases that do not match / align with the query are 5 'or 3' to the subject sequence. In this case, FA
The percent identity calculated by the STDB is not manually corrected. Again, only the 5 'or 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are manually corrected. Other manual corrections are not made for the purposes of the present invention.
【0053】 本出願は、AIM II活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係
なく、図1Aおよび1B(配列番号1)に示される核酸配列、または寄託された
cDNAの核酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、ま
たは99%同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がAIM I
I活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を
どのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用するかをなお知っているからであ
る。AIM II活性を有するポリペプチドをコードしない、本発明の核酸分子
の使用には、とりわけ、(1)cDNAライブラリーにおけるAIM II遺伝
子またはその対立遺伝子改変体を単離すること;(2)Vermaら,Huma
n Chromosomes:A Manual of Basic Tech
niques,Pergamon Press,New York(1988)
に記載のような、AIM II遺伝子の正確な染色***置を提供するための***
中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション(例えば、「F
ISH」);および(3)特定の組織におけるAIM II mRNAの発現を
検出するためのノーザンブロット分析、が含まれる。The present application relates to at least 90% of the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1), or the deposited cDNA, whether or not it encodes a polypeptide having AIM II activity. %, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. This is because a specific nucleic acid molecule is AIM I
Even if they do not encode a polypeptide having I activity, the person skilled in the art still knows how to use the nucleic acid molecule, for example, as a hybridization probe, or as a primer in the polymerase chain reaction (PCR). It is. Uses of the nucleic acid molecules of the invention that do not encode a polypeptide having AIM II activity include, among others, (1) isolating the AIM II gene or allelic variant thereof in a cDNA library; (2) Verma et al. , Huma
n Chromosomes: A Manual of Basic Tech
niques, Pergamon Press, New York (1988)
In situ hybridization to metaphase chromosomal spreads to provide the precise chromosomal location of the AIM II gene, as described in
ISH "); and (3) Northern blot analysis to detect expression of AIM II mRNA in specific tissues.
【0054】 しかし、図1AおよびB(配列番号1)に示される核酸配列、または実際にA
IM IIタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする寄託されたcDN
Aの核酸配列に、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または
99%同一な配列を有する核酸分子が好ましい。「AIM II活性を有するポ
リペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、本発
明のAIM IIタンパク質の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない、活
性を示すポリペプチドが意図される。例えば、AIM IIタンパク質の細胞傷
害性活性は、Zarresら,Cell 70:31−46(1992)により
記載されるようなアポトーシスを示すためのプロピジウムヨーダイド(prop
idium iodide)染色を用いて測定され得る。あるいは、AIM I
I誘導性アポトーシスはまた、Gavierliら,J.Cell.Biol.
119:493−501(1992)により記載されるようなTUNEL染色を
用いて測定され得る。However, the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1), or
Deposited cDN encoding a polypeptide having IM II protein activity
A nucleic acid molecule having a sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the nucleic acid sequence of A is preferred. By "polypeptide having AIM II activity" is intended a polypeptide that exhibits an activity that is similar, but not necessarily identical, to the activity of an AIM II protein of the invention as measured in a particular biological assay. You. For example, the cytotoxic activity of the AIM II protein can be measured by propidium iodide (prop) to show apoptosis as described by Zarres et al., Cell 70: 31-46 (1992).
(iodium iodide) staining. Alternatively, AIM I
I-induced apoptosis is also described in Gavierli et al. Cell. Biol.
119: 493-501 (1992) can be measured using TUNEL staining.
【0055】 手短には、プロピジウムヨーダイド染色を以下の通りに実施する。組織または
培養物のいずれかに由来の細胞を、ホルムアルデヒド中で固定し、凍結切片に切
断し、そしてプロピジウムヨーダイドで染色する。細胞核は、共焦点蛍光顕微鏡
法を用いてプロピジウムヨーダイドにより可視化される。細胞死は、核濃縮核(
染色体凝集、収縮および/または核の断片化)により示される。Briefly, propidium iodide staining is performed as follows. Cells from either tissue or culture are fixed in formaldehyde, cut into frozen sections and stained with propidium iodide. Cell nuclei are visualized with propidium iodide using confocal fluorescence microscopy. Cell death is caused by pyknotic nuclei (
Chromosome aggregation, shrinkage and / or nuclear fragmentation).
【0056】 もちろん、遺伝コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸
配列、または図1Aおよび1B(配列番号1)に示される核酸配列に少なくとも
90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を有す
る多数の核酸分子が「AIM IIタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコ
ードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変
体の全てが同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記の比較アッセ
イを行うことすらなく、当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核
酸分子について、妥当な数がまたAIM IIタンパク質活性を有するポリペプ
チドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、当業者が、タ
ンパク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、またはその可能性がないかの
いずれかのアミノ酸置換(例えば、1つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ
酸での置換)を十分に知っているからである。Of course, due to the degeneracy of the genetic code, those skilled in the art will recognize that the nucleic acid sequence of the deposited cDNA, or the nucleic acid sequence shown in FIGS. It is immediately recognized that a number of nucleic acid molecules having sequences that are%, 97%, 98%, or 99% identical encode polypeptides that "have AIM II protein activity." Indeed, this is apparent to the skilled artisan, since even all of the degenerate variants of these nucleotide sequences encode the same polypeptide, even without performing the above-described comparative assays. For such nucleic acid molecules that are not degenerate variants, it is further recognized in the art that a reasonable number also encodes a polypeptide having AIM II protein activity. This is because one of skill in the art will recognize that either amino acid substitutions that are unlikely or unlikely to significantly affect the function of the protein (eg, one aliphatic amino acid with a second aliphatic amino acid) Replacement).
【0057】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をいかにして行うかに関するガ
イダンスが、Bowie,J.U.ら、「Deciphering the M
essage in Protein Sequences:Toleranc
e to Amino Acid Substitutions」,Scien
ce 247:1306−1310(1990)において提供され、ここで筆者
らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを示している
。For example, guidance on how to make phenotypically silent amino acid substitutions can be found in Bowie, J. et al. U. Et al., "Deciphering the M
message in Protein Sequences: Toleranc
e to Amino Acid Substitutions ", Science
ce 247: 1306-1310 (1990), where we show that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions.
【0058】 (AIM II「ノックアウト」および相同組換え) 内因性遺伝子発現はまた、その遺伝子および/またはそのプロモーターを、標
的化された相同組換えを用いて不活化または「ノックアウト」することにより低
減され得る(例えば、Smithiesら,Nature 317:230−2
34(1985);ThomasおよびCapecchi,Cell 51:5
03−512(1987);Thompsonら,Cell 5:313−32
1(1989)を参照のこと;これらの各々は、本明細書中にその全体が参考と
して援用される)。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列(その遺伝子のコード
領域または調節領域のいずれか)に相同なDNAと隣接した、本発明の変異体の
非機能的なポリヌクレオチド(または完全に無関係なDNA配列)を用いて、選
択マーカーおよび/または陰性の選択マーカーを伴って、または伴わずに、本発
明のポリペプチドをインビボで発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実
施態様では、当該分野で公知の技術を用いて、目的の遺伝子を含むがこの遺伝子
を発現しない細胞においてノックアウトを生じる。標的化された相同組換えを介
する、このDNA構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活化を生じる。この
ようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変を用いて、不活性な標的化された
遺伝子を有する動物の子孫を作製し得る調査および農業分野において特に好適で
ある(例えば、ThomasおよびCapecchi 1987ならびにTho
mpson 1989,前出を参照のこと)。しかし、このアプローチは、ヒト
における使用のために慣用的に適合させ得る。ただし、組換えDNA構築物は、
当業者に明らかである適切なウイルスベクターを用いて、必要とされる部位へイ
ンビボで直接投与されるかまたは標的化される。この段落において引用した文献
の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。AIM II “knockout” and homologous recombination Endogenous gene expression is also reduced by inactivating or “knocking out” the gene and / or its promoter using targeted homologous recombination. (Eg, Smithies et al., Nature 317: 230-2).
34 (1985); Thomas and Capecchi, Cell 51: 5.
03-512 (1987); Thompson et al., Cell 5: 313-32.
1 (1989); each of which is incorporated herein by reference in its entirety). For example, a variant non-functional polynucleotide of the invention (or a completely unrelated DNA sequence) flanked by DNA homologous to an endogenous polynucleotide sequence (either the coding or regulatory region of the gene). Can be used to transfect cells expressing a polypeptide of the invention in vivo, with or without a selectable marker and / or a negative selectable marker. In another embodiment, knockout occurs in cells containing the gene of interest but not expressing the gene using techniques known in the art. Insertion of this DNA construct via targeted homologous recombination results in inactivation of the targeted gene. Such an approach is particularly suitable in the research and agricultural fields where modifications to embryonic stem cells can be used to produce the offspring of animals with inactive targeted genes (eg, Thomas and Capecchi 1987 and Thoma).
mpson 1989, supra). However, this approach can be routinely adapted for use in humans. However, the recombinant DNA construct is
It is directly administered or targeted in vivo to the required site in vivo using an appropriate viral vector which will be apparent to the skilled person. The contents of each of the references cited in this paragraph are incorporated herein by reference in their entirety.
【0059】 本発明のさらなる実施態様では、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝
子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように(例えば
、ノックアウトするために)遺伝子操作される細胞は、患者にインビボで投与さ
れる。このような細胞は、患者(すなわち、ヒトを含む動物)またはMHCが適
合性のドナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球(例えば、リ
ンパ球)、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るがこれらに限定されない
。この細胞は、例えば、(ウイルスベクター、そして好ましくは導入遺伝子を細
胞ゲノムに組み込むベクターを用いる)形質導入またはトランスフェクション手
順(プラスミド、コスミド、YAC、裸のDNA、エレクトロポレーション、リ
ポソームなどの使用を含むがこれらに限定されない)によって、組換えDNA技
術を用いてインビトロで遺伝子操作されて、本発明のポリペプチドのコード配列
を細胞に導入するか、あるいは本発明のポリペプチドと結合したコード配列およ
び/または内因性調節配列を破壊する。本発明のポリペプチドのコード配列は、
強力な構成性または誘導性のプロモーターまたはプロモーター/エンハンサーの
制御下に置かれて、発現、そして好ましくは本発明のポリペプチドの分泌を達成
し得る。本発明のポリペプチドを発現する、そして好ましくは分泌する、操作さ
れた細胞は、例えば、循環中に全身的に、または腹腔内に患者に導入され得る。
あるいは、細胞は、マトリックス中に取り込まれ、そして体内に移植され得る。
例えば、遺伝子操作された線維芽細胞は、皮膚移植片の一部として移植され得る
;遺伝子操作された内皮細胞は、リンパまたは血管の移植片の一部として移植さ
れ得る(例えば、Andersonら、米国特許第5,399,349号;なら
びにMulliganおよびWilson、米国特許第5,460,959号を
参照のこと(これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される)
)。In a further embodiment of the present invention, a cell is engineered to express a polypeptide of the invention, or is genetically engineered to not express (eg, knock out) a polypeptide of the invention. The cells are administered to the patient in vivo. Such cells can be obtained from patients (ie, animals including humans) or MHC-compatible donors, and contain fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg, lymphocytes), adipocytes, muscle cells, endothelium It may include, but is not limited to, cells. The cells can be transformed, for example, using a transduction or transfection procedure (using a viral vector, and preferably a vector that integrates the transgene into the cell genome) (plasmids, cosmids, YACs, naked DNA, electroporation, liposomes, etc.). Including, but not limited to, introducing a coding sequence for a polypeptide of the present invention into cells by genetic manipulation in vitro using recombinant DNA techniques, or a coding sequence linked to a polypeptide of the present invention. And / or destroy endogenous regulatory sequences. The coding sequence of the polypeptide of the invention is:
It may be under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression and, preferably, secretion of a polypeptide of the invention. Engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the present invention can be introduced into a patient, for example, systemically in the circulation or intraperitoneally.
Alternatively, cells can be taken up in a matrix and implanted into the body.
For example, engineered fibroblasts can be implanted as part of a skin graft; engineered endothelial cells can be implanted as part of a lymphatic or vascular graft (eg, Anderson et al., US And U.S. Patent No. 5,460,959; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
).
【0060】 投与されるべき細胞が非自己細胞またはMHC不適合細胞である場合、これら
は、導入された細胞に対する宿主の免疫応答の発生を防止する周知の技術を用い
て投与され得る。例えば、細胞は、隣接した細胞外環境との成分の交換は可能に
するが、導入された細胞が宿主の免疫系により認識されることは可能にしないカ
プセル化された形態で導入され得る。If the cells to be administered are non-autologous or MHC-incompatible cells, they can be administered using well-known techniques that prevent the development of a host immune response against the introduced cells. For example, cells can be introduced in an encapsulated form that allows for the exchange of components with the adjacent extracellular environment, but does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system.
【0061】 (ベクターおよび宿主細胞) 本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるAIM IIポリペプ
チドまたはそのフラグメントの産生に関する。Vectors and Host Cells The present invention also relates to vectors containing the isolated DNA molecules of the present invention, host cells genetically engineered with recombinant vectors, and recombinantly produced AIM II polypeptides or fragments thereof. For the production of
【0062】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに連結され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電した脂質との複合体中で導入される。ベクター
がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。The polynucleotide may be ligated to a vector containing a selectable marker for propagation in a host. Generally, a plasmid vector is introduced in a precipitate, such as a calcium phosphate precipitate, or in a complex with a charged lipid. If the vector is a virus, the vector can be packaged in vitro using a suitable packaging cell line and then transduced into host cells.
【0063】 DNAインサートは、適切なプロモーター(少数の例を挙げれば、例えば、λ
ファージのPLプロモーター、E.coliのlac、trp、およびtacプ
ロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスL
TRのプロモーター)に、作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモ
ーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写の開始、終結に関する部位
、および転写された領域中に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。
この構築物により発現された成熟転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳さ
れるポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを、そして翻訳されるポリペプチドの
末端に適切に配置された終止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。The DNA insert may comprise a suitable promoter (eg, λ
Phage PL promoter, E. coli. E. coli lac, trp, and tac promoters, SV40 early and late promoters, and retrovirus L
TR promoter). Other suitable promoters are known to those skilled in the art. The expression constructs further include sites for transcription initiation, termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation.
The coding portion of the mature transcript expressed by this construct preferably has a translation initiation codon at the beginning of the translated polypeptide and a stop codon (UAA, UGA) appropriately positioned at the end of the translated polypeptide. , Or UAG).
【0064】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元
酵素またはネオマイシン耐性ならびにE.coliおよび他の細菌中で培養する
ためのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切
な宿主の代表的な例としては、細菌細胞(例えば、E.coli、Strept
omycesおよびSalmonella typhimurium細胞);真
菌細胞(例えば、酵母細胞);昆虫細胞(例えば、Drosophila S2
およびSpodoptera Sf9細胞);動物細胞(例えば、CHO、CO
S、およびBowes黒色腫細胞);および植物細胞が挙げられるが、これらに
限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野
で公知である。As indicated, the expression vectors preferably include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and E. coli. Includes a tetracycline resistance gene or an ampicillin resistance gene for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli, Strept).
omyces and Salmonella typhimurium cells); fungal cells (eg, yeast cells); insect cells (eg, Drosophila S2)
And Spodoptera Sf9 cells); animal cells (eg, CHO, CO
S, and Bowes melanoma cells); and plant cells. Suitable culture media and conditions for the above-described host cells are known in the art.
【0065】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加え、本発明は、目的のタンパク
質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーターエレメン
トおよびプロモーターエレメントを含む、新規な発現ベクターをさらに含む。こ
のようなベクターの1つの例は、以下に詳細に記載されるpHE4−5である。In addition to using expression vectors in the practice of the present invention, the present invention further includes novel expression vectors that include an operator element and a promoter element operably linked to a nucleotide sequence encoding a protein of interest. One example of such a vector is pHE4-5, described in detail below.
【0066】 図10および図11に要約されるように、pHE4−5ベクター(配列番号5
0)の構成要素は、以下を含む:1)選択マーカーとしてネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子、2)E.coli複製起点、3)T5ファージプロモ
ーター配列、4)2つのlacオペレーター配列、5)シャイン−ダルガーノ配
列、6)ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子(lacIq)。複製起点(o
riC)は、pUC19(LTI、Gaithersburg、MD)由来であ
る。このプロモーター配列およびオペレーター配列は、合成により作製された。
核酸配列の合成調製は、当該分野で周知である。CLONTECH 95/96
Catalog、215〜216頁、CLONTECH、1020 East
Meadow Circle、Palo Alto、CA、94303。AI
MIIをコードするヌクレオチド配列(配列番号1)は、pHE4−5ベクター
のNdeI部位とAsp718部位との間にこのヌクレオチド配列を挿入するこ
とにより、これらのプロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結される。As summarized in FIGS. 10 and 11, the pHE4-5 vector (SEQ ID NO: 5)
The components of 0) include: 1) the neomycin phosphotransferase gene as a selectable marker, 2) E. coli. E. coli origin of replication, 3) T5 phage promoter sequence, 4) two lac operator sequences, 5) Shine-Dalgarno sequence, 6) lactose operon repressor gene (lacIq). Replication origin (o
riC) is derived from pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD). The promoter sequence and the operator sequence were produced synthetically.
Synthetic preparation of nucleic acid sequences is well known in the art. CLONTECH 95/96
Catalog, 215-216, CLONTECH, 1020 East
Meadow Circle, Palo Alto, CA, 94303. AI
The nucleotide sequence encoding MII (SEQ ID NO: 1) is operably linked to these promoters and operators by inserting this nucleotide sequence between the NdeI and Asp718 sites of the pHE4-5 vector.
【0067】 上述のように、pHE4−5ベクターは、lacIq遺伝子を含む。lacI
qは、lacI遺伝子の対立遺伝子であり、lacオペレーターの強固な調節を
付与する。Amann,E.ら、Gene 69:301〜315(1988)
;Stark,M.、Gene 51:255〜267(1987)。lacI
q遺伝子は、lacオペレーター配列に結合し、そして下流(すなわち、3’側
の)配列の転写を阻止する、リプレッサータンパク質をコードする。しかし、l
acIq遺伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトースアナログ(例えば、
イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG))のいずれかの存在
下で、lacオペレーターから解離する。従って、AIM IIは、pHE4−
5ベクターを含む非誘導宿主細胞において、感知可能な量で産生されない。しか
し、IPTGのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、AIM I
Iコード配列の発現を生じる。As mentioned above, the pHE4-5 vector contains the lacIq gene. lacI
q is an allele of the lacI gene and confers tight regulation of the lac operator. Amann, E .; Et al., Gene 69: 301-315 (1988).
Stark, M .; Gene 51: 255-267 (1987). lacI
The q gene encodes a repressor protein that binds to the lac operator sequence and blocks transcription of downstream (ie, 3 ′) sequences. However, l
The acIq gene product can be lactose or a specific lactose analog (eg,
Dissociates from the lac operator in the presence of any of isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Thus, AIM II has pHE4-
Not produced in appreciable amounts in non-induced host cells containing the 5 vector. However, the induction of these host cells by the addition of agents such as IPTG,
This results in expression of the I coding sequence.
【0068】 pHE4−5ベクターのプロモーター/オペレーター配列(配列番号51)は
、1つのT5ファージプロモーターおよび2つのlacオペレーター配列を含む
。一方のオペレーターは、転写開始部位の5’側に位置し、そして他方は、同部
位の3’側に位置する。これらのオペレーターは、lacIq遺伝子産物と組合
せて存在する場合、lacオペロンインデューサー(例えば、IPTG)の非存
在下での、下流配列の強固な抑制を与える。このlacオペレーターから下流に
位置する作動可能に連結された配列の発現は、lacオペロンインデューサー(
例えば、IPTG)の添加により誘導され得る。lacIqタンパク質へのla
cインデューサーの結合は、lacオペレーター配列からのそれらの解放、およ
び作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のlacオペロ
ン調節は、Devlin,T.、TEXTBOOK OF BIOCHEMIS
TRY WITH CLINICAL CORRELATIONS、第4版(1
997)、802〜807頁に概説される。The promoter / operator sequence of the pHE4-5 vector (SEQ ID NO: 51) contains one T5 phage promoter and two lac operator sequences. One operator is located 5 'to the transcription start site, and the other is located 3' to the same site. These operators, when present in combination with the lacIq gene product, provide robust repression of downstream sequences in the absence of a lac operon inducer (eg, IPTG). Expression of the operably linked sequence located downstream from the lac operator is determined by the lac operon inducer (
For example, it can be induced by the addition of IPTG). la to lacIq protein
Binding of the c inducers results in their release from the lac operator sequence and the initiation of transcription of the operably linked sequence. The lac operon regulation of gene expression is described in Devlin, T .; , TEXTBOOK OF BIOCHEMIS
TRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 4th edition (1
997), pp. 802-807.
【0069】 pHE4シリーズのベクターは、AIM IIコード配列を除くpHE4−5
ベクターの全ての構成要素を含む。pHE4ベクターの特徴は、最適化された合
成T5ファージプロモーター、lacオペレーター、およびシャイン−ダルガー
ノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられ、その結果
、挿入された遺伝子の発現は強固に調節され得、そして高レベルの発現が誘導に
際して生じる。The pHE4 series of vectors is pHE4-5 excluding the AIM II coding sequence.
Includes all components of the vector. Features of the pHE4 vector include an optimized synthetic T5 phage promoter, a lac operator, and a Shine-Dalgarno sequence. In addition, these sequences are also optimally spaced so that expression of the inserted gene can be tightly regulated and high levels of expression occur upon induction.
【0070】 本発明のタンパク質の生成における使用に適切な公知の細菌性プロモーターの
中には、E.coliのlacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7
プロモーター、gptプロモーター、λ PRおよびPLプロモーター、ならび
にtrpプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターとしては、CMV前
初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV
40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロモーター(例えば、ラウス肉腫
ウイルス(RSV)のLTRのプロモーター)、ならびにメタロチオネインプロ
モーター(例えば、マウスメタロチオネイン−Iプロモーター)が挙げられる。Among the known bacterial promoters suitable for use in producing the proteins of the present invention are E. coli. E. coli lacI and lacZ promoters, T3 and T7
Includes promoters, gpt promoters, λ PR and PL promoters, and trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include CMV immediate early promoter, HSV thymidine kinase promoter, early and late SV
40 promoter, the promoter of the retroviral LTR (eg, the promoter of the Rous sarcoma virus (RSV) LTR), and the metallothionein promoter (eg, the mouse metallothionein-I promoter).
【0071】 pHE4−5ベクターはまた、AUG開始コドンの5’側にシャイン−ダルガ
ーノ配列を含む。シャイン−ダルガーノ配列は、一般に、AUG開始コドンから
約10ヌクレオチド上流(すなわち、5’側)に位置する短い配列である。これ
らの配列は、本質的には、原核生物リボソームを、AUG開始コドンに導く。The pHE4-5 vector also contains a Shine-Dalgarno sequence 5 ′ to the AUG start codon. A Shine-Dalgarno sequence is generally a short sequence located about 10 nucleotides upstream (ie, 5 ') from the AUG start codon. These sequences essentially direct the prokaryotic ribosome to the AUG start codon.
【0072】 従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクターに関
する。本発明のこの局面は、pHE4−5ベクター(配列番号50)に例示され
る。Accordingly, the present invention also relates to an expression vector useful for producing the protein of the present invention. This aspect of the invention is exemplified by the pHE4-5 vector (SEQ ID NO: 50).
【0073】 細菌における使用に好ましいベクター中には、pQE70、pQE60および
pQE−9(Qiagenから入手可能);pBSベクター、Phagescr
iptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、
pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手可能);ならびに
ptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRI
T5(Pharmaciaから入手可能)が挙げられる。好ましい真核生物ベク
ターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびp
SG(Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、
pMSGおよびpSVL(Pharmaciaから入手可能)がある。他の適切
なベクターは、当業者には容易に明白である。Among the preferred vectors for use in bacteria are pQE70, pQE60 and pQE-9 (available from Qiagen); pBS vector, Phagecr
ipt vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16a,
pNH18A, pNH46A (available from Stratagene); and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRI
T5 (available from Pharmacia). Among preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and p
SG (available from Stratagene); and pSVK3, pBPV,
There are pMSG and pSVL (available from Pharmacia). Other suitable vectors will be readily apparent to one skilled in the art.
【0074】 宿主細胞へのこの構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によ
り、もたらされ得る。このような方法は、多くの標準実験室マニュアル(例えば
、Davisら、Basic Methods In Molecular B
iology(1986))に記載される。The introduction of this construct into a host cell can include calcium phosphate transfection,
It can be provided by DEAE-dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals (eg, Davis et al., Basic Methods In Molecular B.
ology (1986)).
【0075】 ポリペプチドは、改変形態(例えば、融合タンパク質)で発現され得、そして
分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域も含み得る。例えば、さらな
るアミノ酸(特に荷電アミノ酸)の領域が、ポリペプチドのN末端に付加されて
、精製の間の、または続く操作および貯蔵の間の、宿主細胞での安定性および持
続性を改良し得る。また、ペプチド部分がこのポリペプチドに付加されて、精製
を容易にし得る。このような領域は、このポリペプチドの最終的調製の前に除去
され得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こすため、安定性を改良するため
、そして精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当
該分野でよく知られており、かつ日常的技術である。好ましい融合タンパク質は
、タンパク質を可溶化するために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。
例えば、EP−A−O第464533号(カナダの対応特許番号第204586
9号)は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を、別のヒトタンパク質
またはその部分と共に含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融
合タンパク質のFc部分は、治療および診断での使用に徹底的に有利であり、従
って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じる(EP−A第02322
62号)。一方、いくつかの使用のために、記載された有利な様式で、融合タン
パク質が発現され、検出され、そして精製された後、Fc部分を欠失し得ること
が、望ましい。これは、例えば、融合タンパク質が、免疫化のための抗原として
使用される時に、Fc部分が、治療および診断における使用に対する障害である
ことを示す場合である。薬物送達において、例えば、ヒトタンパク質(例えば、
hIL5−レセプター)が、hIL−5のアンタゴニストを同定するための高処
理能スクリーニングアッセイの目的のために、Fc部分と融合されてきた。D.
Bennettら、Journal of Molecular Recogn
ition、第8巻:52〜58(1995)およびK.Johansonら、
The Journal of Biological Chemistry、
第270巻、第16号:9459〜9471(1995)を参照のこと。The polypeptide may be expressed in a modified form (eg, a fusion protein) and may include not only secretion signals but also additional heterologous functional regions. For example, regions of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell during purification or during subsequent manipulation and storage. . Also, a peptide moiety may be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides, among other things, to cause secretion or elimination, to improve stability, and to facilitate purification, is a well known and routine technique in the art. . Preferred fusion proteins contain heterologous regions from immunoglobulins useful for solubilizing the protein.
For example, EP-A-O 465 533 (Canadian corresponding patent no. 204586)
No. 9) discloses fusion proteins comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule together with another human protein or portion thereof. In many cases, the Fc portion of the fusion protein is drastically advantageous for use in therapy and diagnostics, thus resulting in, for example, improved pharmacokinetic properties (EP-A-02322).
No. 62). On the other hand, for some uses it is desirable to be able to delete the Fc part after the fusion protein has been expressed, detected and purified in the advantageous manner described. This is the case, for example, when the fusion protein is used as an antigen for immunization, indicating that the Fc portion is an obstacle to its use in therapy and diagnosis. In drug delivery, for example, human proteins (eg,
hIL5-receptor) has been fused to the Fc portion for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. D.
Bennett et al., Journal of Molecular Recognition.
ition, 8: 52-58 (1995) and K.I. Johanson et al.
The Journal of Biological Chemistry,
270, 16: 9459-9471 (1995).
【0076】 AIM IIタンパク質は、組換え細胞培養物から、周知の方法(硫酸アンモ
ニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーま
たはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
む)により、回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラ
フィー(「HPLC」)が、精製のために使用される。本発明のポリペプチドは
、天然に精製された産物、化学的合成手順の産物、および組換え技術により原核
生物宿主または真核生物宿主(例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺
乳動物細胞を含む)から産生された産物を含む。組換え産生手順で使用された宿
主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリ
コシル化され得ない。さらに、本発明のポリペプチドはまた、最初の改変メチオ
ニン残基を、いくつかの場合に、宿主に媒介されたプロセスの結果として含む。The AIM II protein can be obtained from recombinant cell culture by known methods (ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography,
(Including hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography). Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC") is used for purification. The polypeptides of the present invention can be obtained from naturally purified products, products of chemical synthetic procedures, and recombinant or prokaryotic or eukaryotic hosts, such as bacteria, yeast, higher plants, insects, and mammalian cells. ). Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides of the invention may or may not be glycosylated. In addition, the polypeptides of the present invention also include an initial modified methionine residue, in some cases as a result of a host-mediated process.
【0077】 本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含するのに加えて
、本発明はまた、内因性遺伝物質(例えば、AIM IIコード配列)を欠失ま
たは置換するように操作された脊椎動物起源(特に哺乳動物起源)の1次、2次
、および不死化宿主細胞、ならびに/あるいは本発明のAIM IIポリヌクレ
オチドと作動可能に結合され、かつ内因性AIM IIポリヌクレオチドを活性
化、変化、および/または増幅する遺伝物質(例えば、異種ポリヌクレオチド配
列)を含むように操作された脊椎動物起源(特に哺乳動物起源)の1次、2次、
および不死化宿主細胞を包含する。例えば、当該分野で公知の技術を使用して、
異種制御領域(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)と内因性A
IM IIポリヌクレオチド配列を相同組換えを介して作動可能に結合するため
に使用し得る(例えば、1997年6月24日発行の米国特許第5,641,6
70号;1996年9月26日公開の国際公開WO 96/29411号;19
94年8月4日公開の国際公開WO 94/12650号;Kollerら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932〜8935(1
989);およびZijlstraら、Nature 342:435〜438
(1989)を参照のこと。これらの各々の開示は、全体が参考として援用され
る)。In addition to including host cells containing the vector constructs discussed herein, the present invention also provides for deleting or replacing endogenous genetic material (eg, AIM II coding sequence). Primary, secondary, and immortalized host cells of engineered vertebrate origin, particularly mammalian origin, and / or endogenous AIM II polynucleotides operably linked to AIM II polynucleotides of the invention. Primary, secondary, of vertebrate origin (particularly mammalian origin) engineered to contain genetic material that activates, alters, and / or amplifies (eg, heterologous polynucleotide sequences).
And immortalized host cells. For example, using techniques known in the art,
Heterologous control regions (eg, promoters and / or enhancers) and endogenous A
IM II polynucleotide sequences can be used to operably link via homologous recombination (eg, US Pat. No. 5,641,6, issued June 24, 1997).
No. 70; International Publication WO 96/29411 published on September 26, 1996; 19
International Publication WO 94/12650 published August 4, 1994; Koller et al., P.
rc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1
989); and Zijlstra et al., Nature 342: 435-438.
(1989). The disclosure of each of these is incorporated by reference in its entirety).
【0078】 (トランスジェニック非ヒト動物) 本発明のポリペプチドは、トランスジェニック動物においてもまた、発現され
得る。任意の種の動物(マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブ
タ、マイクロピッグ(micro―pig)、ヤギ、ヒツジ、ウシおよび非ヒト
霊長類(例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー)を含むが、これらに限定さ
れない)を使用して、トランスジェニック動物を作製し得る。特定の実施態様に
おいて、本明細書中に記載される技術またはさもなければ当該分野で公知の技術
を使用して、ヒトにおいて、遺伝子療法プロトコルの一部として、本発明のポリ
ペプチドを発現する。Transgenic non-human animals The polypeptides of the present invention can also be expressed in transgenic animals. Including animals of any species (mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, micro-pig, goat, sheep, cow and non-human primates (eg, baboon, monkey, and chimpanzee) Without limitation, transgenic animals can be produced. In certain embodiments, the polypeptides of the invention are expressed in humans as part of a gene therapy protocol using the techniques described herein or otherwise known in the art.
【0079】 当該分野で公知の任意の技術を使用して、動物中に導入遺伝子(すなわち、本
発明のポリヌクレオチド)を導入して、トランスジェニック動物の創始系統(f
ounder−line)を作製し得る。このような技術には、前核マイクロイ
ンジェクション(Patersonら、Appl.Microbiol.Bio
technol.40:691〜698(1994);Carverら、Bio
technology(NY) 11:1263〜1270(1993);Wr
ightら、Biotechnology(NY)9:830〜834(199
1);およびHoppeら、米国特許第4,873,191号(1989));
生殖細胞系へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入(Van der Putte
nら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:6148〜6
152(1985));胚盤胞または胚:胚性幹細胞における遺伝子ターゲッテ
ィング(Thompsonら、Cell 56:313〜321(1989))
;細胞または胚のエレクトロポレーション(Lo、Mol Cell.Biol
.3:1803〜1814(1983));遺伝子銃を使用しての本発明のポリ
ヌクレオチドの導入(例えば、Ulmerら、Science 259:174
5(1993)を参照のこと);胚性多様性(pleuripotent)幹細
胞への核酸構築物の導入、および胚盤胞へのこの幹細胞の戻し移入;ならびに精
子媒介性遺伝子移入(Lavitranoら、Cell 57:717〜723
(1989)などが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の総
説として、Gordon「Transgenic Animals」Intl.
Rev.Cytol.115:171〜229(1989)(本明細書中でその
全体が参考として援用される)を参照のこと。さらに、この段落中で引用される
文書各々の内容は、その全体が、参考として援用される。The transgene (ie, the polynucleotide of the present invention) can be introduced into an animal using any technique known in the art to produce a transgenic animal founder line (f
under-line). Such techniques include pronuclear microinjection (Paterson et al., Appl. Microbiol. Bio.
technology. 40: 691-698 (1994); Carver et al., Bio.
technology (NY) 11: 1263-1270 (1993); Wr
Night et al., Biotechnology (NY) 9: 830-834 (199).
1); and Hoppe et al., US Pat. No. 4,873,191 (1989));
Germline retrovirus-mediated gene transfer (Van der Putte)
n et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 82: 6148-6.
152 (1985)); Blastocysts or embryos: Gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)).
Electroporation of cells or embryos (Lo, Mol Cell. Biol;
. 3: 1803-1814 (1983)); Introduction of a polynucleotide of the present invention using a gene gun (eg, Ulmer et al., Science 259: 174).
5 (1993)); introduction of the nucleic acid construct into pluripotent stem cells, and transfer of this stem cell back into blastocysts; and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57: 717-723
(1989), but are not limited thereto. For a review of such techniques, see Gordon "Transgenic Animals" Intl.
Rev .. Cytol. 115: 171-229 (1989), which is incorporated herein by reference in its entirety. Further, the contents of each of the documents cited in this paragraph are incorporated by reference in their entirety.
【0080】 当該分野で公知の任意の技術(例えば、静止に誘導された培養胚性細胞、胎児
細胞、または成体細胞から摘出された核の卵母細胞への核移入(Campell
ら、Nature 380:64〜66(1996);Wilmutら、Nat
ure 385:810〜813(1997)(その各々が本明細書中で全体と
して参考として援用される))を使用して、本発明のポリヌクレオチドを含むト
ランスジェニッククローンを作製し得る。Any technique known in the art (eg, nuclear transfer to oocytes of nuclei isolated from quiescently-derived cultured embryonic cells, fetal cells, or adult cells (Campell)
Et al., Nature 380: 64-66 (1996); Wilmut et al., Nat.
ure 385: 810-813 (1997), each of which is incorporated herein by reference in its entirety, can be used to generate transgenic clones comprising a polynucleotide of the present invention.
【0081】 本発明は、その全ての細胞中に導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物
、およびその細胞の全てではないが、いくつかの細胞中に導入遺伝子を保有する
動物(すなわち、モザイク動物またはキメラ動物)を提供する。導入遺伝子は、
単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー、例えば、頭−頭縦列(head
−to−head tandem)または頭−尾縦列(head−to−tai
l tandem)のような複数のコピーとして組み込まれ得る。導入遺伝子は
また、例えば、Laskoら(Laskoら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 89:6232〜6236(1992))の教示に従って、特
定の細胞型に選択的に導入され、そしてその特定の細胞型において活性化され得
る。このような細胞型特異的活性に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞
型に依存し、そして当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が内因
性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望まれる場合、遺伝子ターゲッティ
ングが好ましい。手短には、このような技術が利用される場合、内因性遺伝子と
相同的ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同組
換えを介して、その内因性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込み、そしてその機
能を破壊する目的のために設計される。導入遺伝子はまた、例えば、Guら(G
uら、Science 265:103〜106(1994))の教示に従って
、特定の細胞型に選択的に導入され、それによりその細胞型のみにおいてその内
因性遺伝子を不活性化し得る。このような細胞型特異的不活性化に必要とされる
調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。この
段落中で引用される文書の各々の内容は、その全体が参考として本明細書中で援
用される。The present invention relates to transgenic animals that carry the transgene in all of their cells, and animals that carry the transgene in some, but not all, of the cells (ie, mosaic animals or chimeras). Animals). The transgene is
As a single transgene or as a concatamer, eg, head-to-head tandem (head
-To-head tandem or head-to-tail.
l tandem). The transgene is also described, for example, in Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 6232-6236 (1992)) and can be selectively introduced into and activated in a particular cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific activity will depend on the particular cell type of interest, and will be apparent to those skilled in the art. If it is desired that the polynucleotide transgene be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene, gene targeting is preferred. Briefly, when such a technique is used, a vector containing several nucleotide sequences homologous to an endogenous gene is converted to the nucleotide sequence of the endogenous gene through homologous recombination with a chromosomal sequence. Designed for the purpose of embedding and destroying its functionality. The transgene may also be, for example, Gu et al.
u et al., Science 265: 103-106 (1994)), may be selectively introduced into a particular cell type, thereby inactivating the endogenous gene only in that cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation will depend on the particular cell type of interest, and will be apparent to those skilled in the art. The contents of each of the documents cited in this paragraph are incorporated herein by reference in their entirety.
【0082】 一旦、トランスジェニック動物が作製されると、組換え遺伝子の発現が、標準
技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロット解
析またはPCR技術により達成され、動物組織を分析し、その導入遺伝子の組み
込みが起こったことを確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけるこの
導入遺伝子のmRNA発現レベルもまた、その動物から得られた組織サンプルの
ノーザンブロット解析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転
写酵素PCR(rt−PCR)を含むが、これらに限定されない技術を使用して
評価され得る。トランスジェニック遺伝子を発現する組織のサンプルはまた、そ
の導入遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的または免疫組織化
学的に評価され得る。[0082] Once the transgenic animal is created, the expression of the recombinant gene can be assayed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques and animal tissues can be analyzed to confirm that integration of the transgene has occurred. The level of mRNA expression of this transgene in the tissue of the transgenic animal also includes, but is not limited to, Northern blot analysis, in situ hybridization analysis, and reverse transcriptase PCR (rt-PCR) of tissue samples obtained from that animal. It can be evaluated using non-limiting techniques. A sample of tissue expressing the transgenic gene can also be assessed immunocytochemically or immunohistochemically, using antibodies specific for the transgene product.
【0083】 一旦、創始動物が作製されると、それらは、交配、同系交配、もしくは異種交
配または雑種形成されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。このような交配
ストラテジーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:分離
系統を確立するために1より多い組み込み部位での創始動物の異系交配;各導入
遺伝子の付加的発現の効果に起因してより高いレベルでその導入遺伝子を発現す
る、複合トランスジェニックを作製するための、分離系統の同系交配;発現を増
加するため、およびDNA分析による動物のスクリーニングについての必要性を
評価するための両方のために、ヘテロ接合型のトランスジェニック動物の交雑に
より、所定の組み込み部位についてホモ接合型の動物を作製すること;分離した
ホモ接合型系の交雑により、複合へテロ接合型系または複合ホモ接合型系を作製
すること;ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入
遺伝子を配置するように交配すること。Once founders have been created, they can be crossed, inbred, or crossed or hybridized to produce specific animal colonies. Examples of such crossing strategies include, but are not limited to: outcrossing of founders at more than one integration site to establish an isolated lineage; additional expression of each transgene Evaluate the need for inbreeding of isolates to produce complex transgenics that express higher levels of the transgene due to effects; to increase expression and to screen animals by DNA analysis To produce a homozygous animal for a given integration site by crossing a heterozygous transgenic animal for both; Or to create a compound homozygous system; and transgenes on different backgrounds appropriate to the experimental model of interest Mating to it to place.
【0084】 本発明のトランスジェニック動物および「ノックアウト」動物は、以下を含む
が、これらに限定されない用途を有する:AIM IIポリペプチドの生物学的
機能を生成する際、異常なAIM II発現に関連する状態および/または障害
を研究する際、そしてこのような状態および/または障害を緩和するのに有効な
化合物についてのスクリーニングの際に有用な動物モデル系。The transgenic and “knock-out” animals of the present invention have uses, including but not limited to: aberrant AIM II expression in producing a biological function of an AIM II polypeptide Animal model systems useful in studying conditions and / or disorders that occur, and in screening for compounds that are effective in alleviating such conditions and / or disorders.
【0085】 (AIM IIポリペプチドおよびフラグメント) 本発明はさらに、寄託されたcDNAにコードされるアミノ酸配列、または図
1AおよびBのアミノ酸配列(配列番号2)、あるいは上記ポリペプチドの一部
を含むペプチドまたはポリペプチドを有する、単離されたAIM IIポリペプ
チドを提供する。AIM II Polypeptides and Fragments The present invention further includes the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, or the amino acid sequence of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), or a portion of the above polypeptide. Provided is an isolated AIM II polypeptide having a peptide or polypeptide.
【0086】 AIM IIポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列を、タンパク質の構造ま
たは機能の有意な効果を伴わずに変え得ることが、当該分野で認識される。配列
においてこのような差異を意図する場合、活性を決定するタンパク質上に重要な
領域が存在することを、考えるべきである。It is recognized in the art that some amino acid sequences of an AIM II polypeptide can be changed without significant effect on the structure or function of the protein. If such differences in sequence are contemplated, it should be considered that there are important regions on the protein that determine activity.
【0087】 従って、本発明はさらに、実質的なAIM IIポリペプチド活性を示すか、
または以下に議論されるタンパク質部分のようなAIM IIタンパク質の領域
を含む、AIM IIポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体
は、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換を含む。上記のように、どのアミノ
酸変化が表現型的にサイレントである可能性があるかに関する指針は、Bowi
e,J.U.ら、「Deciphering the Message in
Protein Sequences:Tolerance to Amino
Acid Substitutions」、Science 247:130
6〜1310(1990)に見出され得る。Accordingly, the present invention further provides a method for demonstrating substantial AIM II polypeptide activity,
Or a variation of the AIM II polypeptide that includes a region of the AIM II protein such as the protein portion discussed below. Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions. As noted above, guidance on which amino acid changes may be phenotypically silent can be found in Bowwi
e. U. Et al., "Deciphering the Message in
Protein Sequences: Tolerance to Amino
Acid Substitutions ", Science 247: 130.
6-1310 (1990).
【0088】 従って、図1AおよびB(配列番号2)のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログ、あるいは寄託されたcDNAによってコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下のものであり得る:(i)
1つ以上(例えば、3、5、8、10、15、または20)のアミノ酸残基が保
存的アミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基(好ましくは、保存的アミノ酸
残基)で置換されるものであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによ
ってコードされるものであってもなくてもよい、あるいは(ii)1つ以上(例
えば、3、5、8、10、15、または20)のアミノ酸残基が置換基を含むも
の、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加する
化合物のような別の化合物(例えば、ポリエチレングリコール)と融合されてい
るもの、あるいは(iv)さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるも
の(例えば、IgG Fc融合領域ペプチドもしくはリーダー配列もしくは分泌
配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用
される配列)。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。Thus, a fragment, derivative or analog of the polypeptide of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), or a polypeptide encoded by the deposited cDNA, may be: (I)
One or more (eg, 3, 5, 8, 10, 15, or 20) amino acid residues are replaced with conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues). Wherein such replacement amino acid residues may or may not be those encoded by the genetic code, or (ii) one or more (eg, 3, 5, 8, 10, 15, or 20). A) the amino acid residue comprises a substituent, or (iii) the mature polypeptide is fused to another compound such as a compound that increases the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol); or (Iv) those in which additional amino acids are fused to the mature polypeptide (eg, an IgG Fc fusion region peptide or leader or secretory sequence, or mature polypeptide). Sequences used for the purification of peptide or proprotein sequences). Such fragments, derivatives and analogs are deemed to be within the scope of those skilled in the art from the teachings herein.
【0089】 別の荷電アミノ酸、および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸との荷電
アミノ酸の置換が、特定の目的である。後者は、減少した正の電荷を有するタン
パク質を生じて、AIM IIタンパク質の特徴を改善する。凝集の防止は、非
常に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の減少を生じるだけでなく、薬学的処
方物を調製する場合に問題となり得る。なぜなら、その薬学的処方物が、免疫原
性であり得るからである。(Pinckardら、Clin Exp.Immu
nol.2:331−340(1967);Robbinsら、Diabete
s 36:838−845(1987);Clelandら、Crit.Rev
.Therapeutic Drug Carrier Systems 10
:307−377(1993))。The replacement of a charged amino acid with another charged amino acid and a neutral or negatively charged amino acid is of particular interest. The latter results in a protein with a reduced positive charge and improves the characteristics of the AIM II protein. Prevention of agglomeration is highly desirable. Aggregation of proteins not only results in reduced activity, but can be problematic when preparing pharmaceutical formulations. Because the pharmaceutical formulation can be immunogenic. (Pinkard et al., Clin Exp. Immu.
nol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabete.
s 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev
. Therapeutic Drug Carrier Systems 10
: 307-377 (1993)).
【0090】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変更し得る。
Ostadeら、Nature 361:266−268(1993)は、2つ
の公知の型のTNFレセプターの1つのみへのTNF−αの選択的結合を生じる
特定の変異を記載する。従って、本発明のAIM IIレセプターは、天然の変
異または人為的操作のいずれか由来の、1つ以上(例えば、3、5、8、10、
15、または20)のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。[0090] Amino acid substitutions can also alter the selectivity of binding to cell surface receptors.
Ostade et al., Nature 361: 266-268 (1993) describe certain mutations that result in the selective binding of TNF-α to only one of the two known types of TNF receptors. Thus, the AIM II receptor of the present invention may comprise one or more (eg, 3, 5, 8, 10,
15 or 20) amino acid substitutions, deletions or additions.
【0091】 示されるように、変更は、好ましくは、タンパク質の折りたたみまたは活性に
有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、あまり重要でない性質の変更で
ある(表1を参照のこと)。As indicated, the alteration is preferably an alteration of a less important property, such as a conservative amino acid substitution that does not significantly affect the folding or activity of the protein (see Table 1).
【0092】[0092]
【表1】 もちろん、アミノ酸置換の数は、当業者が多くの要因(上記のものを含む)に
依存して作製する。一般的に言うと、任意の所定のAIM−IIポリペプチドに
ついての置換の数は、50、40、30、25、20、15、10、5または3
を超えない。[Table 1] Of course, the number of amino acid substitutions will be made by those skilled in the art depending on many factors, including those described above. Generally speaking, the number of substitutions for any given AIM-II polypeptide is 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, or 3
Does not exceed.
【0093】 本発明のAIM IIタンパク質中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特
異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の
方法によって同定され得る(CunninghamおよびWells、Scie
nce 244:1081−1085(1989))。後者の手順は、分子中の
全ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、
レセプター結合のような生物学的活性、またはインビトロもしくはインビトロで
の増殖活性について試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部位
もまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造解析によって決
定され得る(Smithら、J.Mol.Biol.224:899−904(
1992)およびde Vosら、Science 255:306−312(
1992))。[0093] Amino acids that are essential for function in the AIM II protein of the present invention can be identified by methods known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Scie).
nce 244: 1081-1085 (1989)). The latter procedure introduces a single alanine mutation at every residue in the molecule. The resulting mutant molecule is then
Tested for biological activity, such as receptor binding, or in vitro or in vitro proliferative activity. Sites important for ligand-receptor binding can also be determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (
1992) and de Vos et al., Science 255: 306-312 (
1992)).
【0094】 (アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失) 本発明中に、アミノ末端欠失変異体もまた含まれる。このような変異体として
は、配列番号2の少なくともN−末端の初めのアミノ酸(しかしN−末端の初め
の114アミノ酸残基を超えない)の欠失を有する、配列番号2に示されるアミ
ノ酸配列を含むものが挙げられる。あるいは、この欠失は、配列番号2の少なく
ともN−末端の初めの35アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの114アミノ
酸残基を超えない)を含む。あるいは、この欠失は、配列番号2の少なくともN
−末端の初めの59アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの114アミノ酸残基
を超えない)を含む。あるいは、この欠失は、配列番号2の少なくともN−末端
の初めの67アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの114アミノ酸残基を超え
ない)を含む。あるいは、この欠失は、配列番号2の少なくともN−末端の初め
の68アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの114アミノ酸残基を超えない)
を含む。あるいは、この欠失は、配列番号2の少なくともN−末端の初めの73
アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの114アミノ酸残基を超えない)を含む
。あるいは、この欠失は、配列番号2の少なくともN−末端の初めの82アミノ
酸残基(しかしN−末端の初めの114アミノ酸残基を超えない)を含む。ある
いは、この欠失は、配列番号2の少なくともN−末端の初めの100アミノ酸残
基(しかしN−末端の初めの114アミノ酸残基を超えない)を含む。Amino- and Carboxy-Terminal Deletions Amino-terminal deletion mutants are also included in the present invention. Such variants include the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 having a deletion of at least the first N-terminal amino acid (but not more than the first 114 N-terminal amino acid residues) of SEQ ID NO: 2. And the like. Alternatively, the deletion comprises at least the first 35 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminal). Alternatively, the deletion comprises at least N
-Contains the first 59 amino acid residues at the terminus (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminus). Alternatively, the deletion comprises at least the first 67 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminal). Alternatively, the deletion is at least the first 68 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminal).
including. Alternatively, the deletion comprises at least the first 73 residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2.
Includes amino acid residues (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminus). Alternatively, the deletion comprises at least the first N-terminal 82 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 (but not more than the N-terminal first 114 amino acid residues). Alternatively, the deletion comprises at least the first 100 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminus).
【0095】 上記のN−末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記の範囲の全て
の組み合わせに関する。例えば、配列番号2の少なくともN−末端の初めの59
アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの67アミノ酸残基を超えない)の欠失;
配列番号2の少なくともN−末端の初めの59アミノ酸残基(しかしN−末端の
初めの68アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端
の初めの59アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの73アミノ酸残基を超えな
い)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初めの59アミノ酸残基(しか
しN−末端の初めの82アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列番号2の少なく
ともN−末端の初めの59アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの100アミノ
酸残基を超えない)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初めの67アミ
ノ酸残基(しかしN−末端の初めの73アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列
番号2の少なくともN−末端の初めの67アミノ酸残基(しかしN−末端の初め
の82アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初
めの67アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの100アミノ酸残基を超えない
)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初めの68アミノ酸残基(しかし
N−末端の初めの73アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列番号2の少なくと
もN−末端の初めの68アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの82アミノ酸残
基を超えない)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初めの68アミノ酸
残基(しかしN−末端の初めの100アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列番
号2の少なくともN−末端の初めの73アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの
82アミノ酸残基を超えない)の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初め
の73アミノ酸残基(しかしN−末端の初めの100アミノ酸残基を超えない)
の欠失;配列番号2の少なくともN−末端の初めの82アミノ酸残基(しかしN
−末端の初めの100アミノ酸残基を超えない)の欠失;など。In addition to the above range of N-terminal deletion mutants, the present invention also relates to all combinations of the above ranges. For example, at least the first 59 at the N-terminus of SEQ ID NO: 2
Deletion of amino acid residues (but not more than the first 67 amino acid residues at the N-terminus);
Deletion of at least the first N-terminal 59 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first N-terminal 68 amino acid residues); A deletion (but not more than the first 73 amino acid residues at the N-terminus); at least the first 59 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 82 amino acid residues at the N-terminus) ); Deletion of at least the first N-terminal 59 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 100 N-terminal amino acid residues); Deletion of 67 amino acid residues (but not more than the first 73 amino acid residues at the N-terminus); residue At least the first 67 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 100 amino acid residues at the N-terminus); at least the N-terminal of SEQ ID NO: 2 Deletion of the first 68 amino acid residues (but not more than the first 73 amino acid residues at the N-terminus) of SEQ ID NO: 2; Deletion of at least the first 68 amino acid residues at the N-terminus (but not more than the first 100 amino acid residues at the N-terminus) of SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2 A deletion of at least the first 73 amino acid residues at the N-terminus (but not more than the first 82 amino acid residues at the N-terminus); -Terminal It does not exceed the 100 amino acid residues of the eye)
Deletion; at least the first 82 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but N
-No more than the first 100 amino acid residues at the terminus);
【0096】 好ましいAIM IIポリペプチドを以下に示す(番号付けは、そのタンパク
質における最初のアミノ酸(Met)から開始する):Preferred AIM II polypeptides are shown below (numbering starts with the first amino acid (Met) in the protein):
【0097】[0097]
【化5】 特に、好ましい実施態様としては、AIM II N末端欠失である、Embedded image In particular, a preferred embodiment is an AIM II N-terminal deletion.
【0098】[0098]
【化6】 が挙げられる。Embedded image Is mentioned.
【0099】 1つのタンパク質のN末端からの1以上のアミノ酸の欠失がそのタンパク質の
1以上の生物学的機能の改変または欠失をもたらす場合でさえ、他の生物学的活
性はなお、保持され得る。従って、短縮されたAIM IIムテインがそのポリ
ペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および/または結合
する能力は、一般的にその完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の
大部分未満がN末端から除去される場合には、保持される。完全なポリペプチド
のN末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持するか
否かは、本明細書において記載され、そして当該分野で他の形で公知である慣用
方法によって容易に決定され得る。N末端アミノ酸残基が大多数の欠失されたA
IM IIムテインがいくらかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る
ことはあり得なくない。実際、6つのAIM IIアミノ酸残基ほどから構成さ
れるペプチドがしばしば、免疫応答を誘発し得る。Even if deletion of one or more amino acids from the N-terminus of one protein results in alteration or deletion of one or more biological functions of the protein, other biological activities still retain Can be done. Thus, the ability of a truncated AIM II mutein to induce and / or bind an antibody that recognizes the intact or mature form of the polypeptide generally depends on the size of the residues of the intact or mature polypeptide. If less than a portion is removed from the N-terminus, it is retained. Whether a particular polypeptide lacking the N-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunological activity is described herein and commonly used in the art. It can be easily determined by the method. A with the majority of the N-terminal amino acid residues deleted
It is not possible that IM II muteins can retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides composed of as many as six AIM II amino acid residues can often elicit an immune response.
【0100】 従って、本発明はさらに、図1AおよびB(すなわち、配列番号2)に示すA
IM IIアミノ酸配列のアミノ末端から位置番号235のフェニルアラニン残
基までのうち1以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびそのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図1Aおよ
びB(配列番号2)の残基n〜314のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供
する。ここで、nは、2〜235の範囲内の整数であり、そして236は、AI
M IIポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要とされると考えら
れる完全AIM IIポリペプチドのN末端からの最初の残基の位置である。[0100] Thus, the present invention further relates to A as shown in FIGS. 1A and B (ie, SEQ ID NO: 2).
Provided are polypeptides having one or more residues deleted from the amino terminus of the IM II amino acid sequence to the phenylalanine residue at position 235, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues n-314 of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2). Where n is an integer in the range of 2-235 and 236 is AI
This is the position of the first residue from the N-terminus of the complete AIM II polypeptide that would be required for at least the immunogenic activity of the M II polypeptide.
【0101】 より詳細には、本発明は、配列番号2に示すAIM II配列(これは、図1
A−Bに示す配列と、配列番号2におけるアミノ酸残基がN末端からC末端まで
の1〜240へと連続的に番号付けられている点を除いて同一である)の以下:More specifically, the present invention relates to the AIM II sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(Except that the amino acid residues in SEQ ID NO: 2 are consecutively numbered from 1 to 240 from the N-terminus to the C-terminus):
【0102】[0102]
【化7】 の残基のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、本発明に包含される。Embedded image A polynucleotide comprising or consisting of the amino acid sequence of the following residues: Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.
【0103】 上記において言及したように、1つのタンパク質のC末端から1以上のアミノ
酸の欠失がそのタンパク質の1以上の生物学的機能の改変または欠失をもたらす
場合でさえ、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮されたAIM
IIムテインがそのポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体
を誘導および/または結合する能力は、一般的にその完全なポリペプチドまたは
成熟ポリペプチドの残基の大部分未満がC末端から除去される場合には、保持さ
れる。完全なポリペプチドのC末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような
免疫学的活性を保持するか否かは本明細書において記載され、そして当該分野で
他の形で公知である慣用方法によって容易に決定され得る。C末端アミノ酸残基
が大多数の欠失されたAIM IIムテインがいくらかの生物学的活性または免
疫原性活性を保持し得ることはあり得なくない。実際、6つのAIM IIアミ
ノ酸残基ほどから構成されるペプチドがしばしば、免疫応答を誘発し得る。As mentioned above, even if deletion of one or more amino acids from the C-terminus of one protein results in modification or deletion of one or more biological functions of that protein, Activity can still be retained. Therefore, the shortened AIM
The ability of a II mutein to induce and / or bind an antibody that recognizes the intact or mature form of the polypeptide is generally less than most of the residues of the intact or mature polypeptide from the C-terminus. If removed, it is retained. Whether a particular polypeptide lacking the C-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunological activity is described herein, and conventional methods are otherwise known in the art. Can be easily determined by It is not possible that AIM II muteins with the majority of the C-terminal amino acid residues deleted may retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides composed of as many as six AIM II amino acid residues can often elicit an immune response.
【0104】 従って、本発明はさらに、図1AおよびB(配列番号2)に示すAIM II
ポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から位置番号6のバリン残基まで
のうち1以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびそのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図1AおよびB(
すなわち、配列番号2)の残基1〜mのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供
する。ここで、mは、6〜239の範囲内の整数であり、そして6は、AIM
IIポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要とされると考えられる
完全AIM IIポリペプチドのC末端からの最初の残基の位置である。Thus, the present invention further provides AIM II as shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
Provided are polypeptides having one or more residues deleted from the carboxy terminus of the amino acid sequence of the polypeptide to the valine residue at position No. 6, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention relates to FIGS. 1A and 1B (
That is, the present invention provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues 1 to m of SEQ ID NO: 2). Where m is an integer in the range of 6 to 239, and 6 is the AIM
The position of the first residue from the C-terminus of the complete AIM II polypeptide which is considered required for at least the immunogenic activity of the II polypeptide.
【0105】 より詳細には、本発明は、図1AおよびBに示すAIM II配列の配列(こ
れは、配列番号2に示す配列と、配列番号2におけるアミノ酸残基がN末端から
C末端までの1〜240へと連続的に番号付けられている点を除いて同一である
)の以下:More specifically, the present invention relates to the sequence of the AIM II sequence shown in FIGS. 1A and 1B (the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid residues in SEQ ID NO: 2 from N-terminal to C-terminal). (Except that they are numbered consecutively from 1 to 240):
【0106】[0106]
【化8】 の残基のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、提供される。Embedded image A polynucleotide comprising or consisting of the amino acid sequence of the following residues: Polynucleotides encoding these polypeptides are also provided.
【0107】 本発明はまた、1以上のアミノ酸がAIM IIポリペプチドのアミノ末端お
よびカルボキシ末端の両方が欠失したポリペプチドを提供する。これは、一般的
に図1AおよびB(すなわち配列番号2)の残基n−mを有するとして記載され
得る。ここで、nおよびmは、上記に記載したような整数である。The present invention also provides polypeptides in which one or more amino acids have been deleted at both the amino and carboxy termini of an AIM II polypeptide. This can be generally described as having residues nm of FIGS. 1A and B (ie, SEQ ID NO: 2). Here, n and m are integers as described above.
【0108】 全長AIM II cDNAで形質転換したMCA−38細胞の馴化培地から
LT−βレセプターカラム上でアフィニティー精製した、AIM IIの天然の
プロセシングを受けた形態は、配列番号2においてLeu−83〜Val−24
0である(実施例10を参照のこと)。しかし、AIM IIはCOS細胞にお
いては異なってプロセシングを受け、配列番号2においてGlu−67とMet
−68との間で切断されてアミノ酸68〜240を有するポリペプチドを産生す
るAIM IIを生産するようである。さらに、COS細胞はまた、Met−6
8とVal−69との間でAIM IIを切断し、配列番号2においてアミノ酸
69〜240を有するポリペプチドをもたらす。The native processed form of AIM II, affinity-purified on a LT-β receptor column from conditioned medium of MCA-38 cells transformed with full-length AIM II cDNA, is identical to Leu-83 to SEQ ID NO: 2. Val-24
0 (see Example 10). However, AIM II is processed differently in COS cells, and Glu-67 and Met in SEQ ID NO: 2.
It appears to produce AIM II which is cleaved between -68 to produce a polypeptide having amino acids 68-240. In addition, COS cells also contain Met-6
Cleavage of AIM II between 8 and Val-69, resulting in a polypeptide having amino acids 69-240 in SEQ ID NO: 2.
【0109】 本発明のポリペプチドは好ましくは、単離された形態で提供される。「単離さ
れたポリペプチド」とは、そのネイティブ環境から取り出されたポリペプチドを
いう。従って、組換え宿主細胞において産生されそして/または含有されるポリ
ペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。また、「単離され
たポリペプチド」で意図されるのは、組換え宿主から、部分的または実質的に精
製されたポリペプチドである。例えば、AIM IIポリペプチドの組換え産生
された形態は、SmithおよびJohnson,Gene 67:31−40
(1988)に記載された1工程方法によって実質的に精製され得る。The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form. “Isolated polypeptide” refers to a polypeptide that has been removed from its native environment. Thus, a polypeptide produced and / or contained in a recombinant host cell is considered isolated for the purposes of the present invention. Also, contemplated by "isolated polypeptide" are polypeptides that have been partially or substantially purified from a recombinant host. For example, recombinantly produced forms of AIM II polypeptides are described in Smith and Johnson, Gene 67: 31-40.
(1988).
【0110】 本発明のポリペプチドには、寄託されたcDNAによってコードされるポリペ
プチド、図1AおよびB(配列番号2)のポリペプチド、N末端メチオニン、細
胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを欠く図1AおよびB(配列番
号2)のポリペプチド、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインの全てまたは部分
を含むが膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチド、ならびに寄託されたcDN
Aによってコードされるポリペプチド、図1AおよびB(配列番号2)のポリペ
プチドと、少なくとも80%同一である、より好ましくは少なくとも90%また
は95%同一である、なおより好ましくは少なくとも96%、97%、98%ま
たは99%同一である、ポリペプチドが含まれ、そしてまた、少なくとも30ア
ミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するそのようなポリペ
プチドの部分が含まれる。The polypeptides of the present invention include the polypeptide encoded by the deposited cDNA, the polypeptide of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), the N-terminal methionine, the extracellular domain, the transmembrane domain, the intracellular domain. 1A and B (SEQ ID NO: 2) lacking a soluble polypeptide comprising all or part of the extracellular and intracellular domains but lacking the transmembrane domain, and the deposited cDN
A, at least 80%, more preferably at least 90% or 95%, even more preferably at least 96%, the polypeptide encoded by A, the polypeptide of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2); Polypeptides that are 97%, 98% or 99% identical are included, and also include portions of such polypeptides having at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids.
【0111】 AIM IIポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも例えば95%「
同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が
そのAIM IIポリペプチドの参照アミノ酸の各100アミノ酸あたり、5つ
までのアミノ酸改変を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列
がその参照配列と同一であることをいう。換言すれば、1つの参照アミノ酸配列
に少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために
は、参照配列におけるアミノ酸残基の5%までが欠失され得るか、もしくは別の
アミノ酸に置換され得るか、またはその参照配列におけるアミノ酸残基の総計の
5%までのいくつかのアミノ酸がその参照配列に挿入され得る。その参照配列の
これらの改変は、その参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末
端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで生じ得、その参照配列における
残基の間に個々に分散され得るか、その参照配列内の1以上の連続する群内に分
散され得るかのいずれかであり得る。The reference amino acid sequence of an AIM II polypeptide may be at least 95% "
A polypeptide having an amino acid sequence that is "identical" refers to a polypeptide having the same amino acid sequence, except that the polypeptide sequence may contain up to 5 amino acid modifications per 100 amino acids of the reference amino acid of the AIM II polypeptide. It means that the amino acid sequence is identical to its reference sequence. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to one reference amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence can be deleted, or Some amino acids may be substituted or may be inserted into the reference sequence up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence. These modifications of the reference sequence may occur at the amino or carboxy terminal positions of the reference amino acid sequence, or anywhere between these terminal positions, and may be individually distributed among the residues in the reference sequence. Or can be distributed within one or more contiguous groups within the reference sequence.
【0112】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図1AおよびB(配
列番号2)に示すアミノ酸配列または寄託されたcDNAクローンによってコー
ドされるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%ま
たは99%同一であるか否かは、Bestfitプログラム(Wisconsi
n Sequence Analysis Package、Version
8 for Unix、Genetics Computer Group、U
niversity Research Park,575 Science
Drive,Madison,WI 53711)のような公知のコンピュータ
プログラムを用いて簡便に決定され得る。特定の配列が本発明に従う参照配列と
、例えば、95%同一であるか否かを決定するためのBestfitまたは任意
の他の配列整列プログラムを用いる場合、そのパラメータは、当然、同一性のパ
ーセンテージがその参照アミノ酸配列の全長に対して計算され、そしてその参照
配列におけるアミノ酸残基の総数の5%までの相同性におけるギャップが許容さ
れるように設定される。As a practical matter, any particular polypeptide may be at least 90%, 95%, for example, the amino acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) or the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA clone. Whether they are 96%, 97%, 98% or 99% identical is determined by the Bestfit program (Wisconsi
n Sequence Analysis Package, Version
8 for Unix, Genetics Computer Group, U
diversity Research Park, 575 Science
Drive, Madison, WI 53711) and may be conveniently determined using known computer programs. When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is 95% identical to a reference sequence according to the present invention, the parameters will, of course, be those having a percentage identity. Calculated for the full length of the reference amino acid sequence, and set to allow for gaps in homology of up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence.
【0113】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば95%「同一
である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、その対象ポリペプチドのアミ
ノ酸配列が、その対象ポリペプチド配列がその問い合わせアミノ酸配列の各10
0アミノ酸あたり5アミノ酸までの改変を含み得ることを除いて、その問い合わ
せ配列と同一であることをいう。換言すれば、1つの問い合わせアミノ酸配列に
少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには
、対象配列におけるアミノ酸残基の5%までが、挿入され得るか、欠失され得る
か、(indels)もしくは別のアミノ酸に置換され得る。その参照配列のこ
れらの改変は、その参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、ま
たはこれらの末端位置の間のどこかで生じ得、その参照配列における残基の間に
個々に分散され得るか、その参照配列内の1以上の連続する群内に分散され得る
かのいずれかであり得る。A polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% “identical” to the query amino acid sequence of the present invention is defined as follows: the amino acid sequence of the subject polypeptide differs from the query amino acid Each 10 in the array
Refers to being identical to the query sequence except that it may contain up to 5 amino acid modifications per 0 amino acids. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to one query amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the subject sequence can be inserted or deleted. , (Indels) or another amino acid. These modifications of the reference sequence may occur at the amino or carboxy terminus of the reference amino acid sequence, or anywhere between these terminal positions, and may be individually dispersed among the residues in the reference sequence, It can either be distributed within one or more contiguous groups within the reference sequence.
【0114】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、表1に示すアミノ酸
配列または寄託されたDNAクローンによってコードされたアミノ酸配列と少な
くとも90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるか否か
は、公知のコンピュータプログラムを用いて簡便に決定され得る。問い合わせ配
列(本発明の配列)と対象配列との間の最良の全体的一致(これはまた、全体的
配列整列ともいう)を決定するための好ましい方法は、Brutlagら(Co
mp.App.Biosci.6:237−245(1990))のアルゴリズ
ムに基づいたFASTDBコンピュータプログラムを用いて決定され得る。配列
整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方がヌクレオチド配列であ
るか、両方がアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の
結果は、%同一性で示される。FASTDBアミノ酸整列において用いられる好
ましいパラメータは、以下のとおりである:Matrix=PAM 0、k−t
uple=2、Mismatch Penalty=1、Joining Pe
nalty=20、Randomization Group Length=
0、Cutoff Score=1、Window Size=配列長、Gap
Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Win
dow Size=500または対象アミノ酸配列の長さのうちより短いもの。As a practical matter, any particular polypeptide may be at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, for example, with the amino acid sequence shown in Table 1 or the amino acid sequence encoded by the deposited DNA clone. % Or 99% can be easily determined using a known computer program. A preferred method for determining the best overall match between the query sequence (sequence of the invention) and the subject sequence, which is also referred to as an overall sequence alignment, is described in Brutlag et al.
mp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). In sequence alignments, the query and subject sequences are either both nucleotide sequences or both amino acid sequences. The results of the overall sequence alignment above are given in% identity. Preferred parameters used in the FASTDB amino acid alignment are as follows: Matrix = PAM 0, kt
up = 2, Mismatch Penalty = 1, Joining Pe
nalty = 20, Randomization Group Length =
0, Cutoff Score = 1, Window Size = array length, Gap
Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0.05, Win
dow Size = 500 or the shorter of the length of the amino acid sequence of interest.
【0115】 対象配列が、内部欠失のためではなくN末端欠失またはC末端欠失のために問
い合わせ配列より短い場合は、手動の補正がその結果になされなければならない
。これは、FASTDBプログラムが、全体的%同一性を算出するときに対象配
列のN末端短縮またはC末端短縮を考慮しないからである。N末端またはC末端
において短縮された対象配列について、問い合わせ配列に対し、%同一性は、対
応する対象残基と適合/整列しない対象配列のN末端またはC末端である、その
問い合わせ配列の残基数を、その問い合わせ配列の塩基総数の%として計算する
ことにより補正する。1つの残基が適合/整列されているか否かは、FASTD
B配列整列の結果により決定される。次いで、このパーセンテージを%同一性か
ら減じ、特定のパラメータを用いて上記のFASTDBプログラムによって計算
して、最終の%同一性値に達する。この最終の%同一性値は、本発明の目的のた
めに使用されるものである。対象配列のN末端またはC末端を越えて延びる問い
合わせ(参照)配列の残基のみが、%同一性値を手動で調整する目的のために考
慮される。すなわち、問い合わせ配列のN末端またはC末端が適合/整列しない
配列のみが、%同一性値を手動で調整する場合に考慮される。If the subject sequence is shorter than the query sequence due to N-terminal or C-terminal deletions, not due to internal deletions, manual correction must be made. This is because the FASTDB program does not consider N-terminal or C-terminal truncations of the subject sequence when calculating overall% identity. For a subject sequence truncated at the N-terminus or C-terminus, the% identity to the query sequence is the residue of the query sequence that is the N-terminus or C-terminus of the subject sequence that does not match / align with the corresponding subject residue The number is corrected by calculating as a percentage of the total number of bases in the query sequence. Whether one residue is matched / aligned is FASTD
Determined by the result of the B sequence alignment. This percentage is then subtracted from the% identity and calculated by the FASTDB program above using the specified parameters to reach the final% identity value. This final% identity value is what is used for the purposes of the present invention. Only those residues of the query (reference) sequence that extend beyond the N-terminus or C-terminus of the subject sequence are considered for the purpose of manually adjusting the% identity values. That is, only those sequences where the N- or C-termini of the query sequence do not match / align are considered when manually adjusting the% identity values.
【0116】 例えば、90アミノ酸残基の対象配列は、100残基の問い合わせ配列と整列
して、%同一性が決定される。欠失はその対象配列のN末端に生じ、それゆえ、
FASTDB整列は、N末端の最初の10残基の適合/整列を示さない。10の
対合しない残基は、その配列の10%(適合しないN末端およびC末端の残基数
/その問い合わせ配列における残基の総数)を示し、そこで、10%は、FAS
TDBプログラムによって算出された%同一性値から減ぜられる。残りの90残
基が完全に適合する場合、最終的な%同一性は90%である。別の例では、90
残基の対象配列が、100残基の問い合わせ配列と比較される。今回は、欠失が
内部欠失であるので、問い合わせ(配列)と適合/整列しない対象配列のN末端 またはC末端における残基は存在しない。この場合、FASTDBによって算出
された%同一性は、手動で補正されない。ここで再び、FASTDB整列におい
て示されるときの、その問い合わせ配列と適合/整列しないその対象配列のN末
端およびC末端の外側の残基位置のみが、手動で補正される。本発明の目的のた
めには、他の手動補正はなされない。For example, a 90 amino acid residue subject sequence is aligned with a 100 residue query sequence to determine% identity. The deletion occurs at the N-terminus of the subject sequence and therefore
FASTDB alignment does not show a match / alignment of the first 10 residues at the N-terminus. Ten unpaired residues represent 10% of the sequence (number of unmatched N- and C-terminal residues / total number of residues in the query sequence), where 10% is FAS
It is subtracted from the% identity value calculated by the TDB program. If the remaining 90 residues match perfectly, the final% identity is 90%. In another example, 90
The residue's subject sequence is compared to the 100 residue query sequence. This time, since the deletion is an internal deletion, there are no residues at the N- or C-terminus of the subject sequence that do not match / align with the query (sequence). In this case, the% identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Here again, only those residue positions outside the N- and C-termini of the subject sequence that do not match / align with the query sequence as indicated in the FASTDB alignment are manually corrected. No other manual corrections are made for the purposes of the present invention.
【0117】 本明細書において使用される場合、用語「AIM II」ポリペプチドには、
膜結合型タンパク質(細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメイン
を含む)、ならびにAIM IIポリペプチド活性を保持する短縮タンパク質が
含まれる。1つの実施態様において、可溶性AIM IIポリペプチドは、AI
M IIタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むが、膜貫通領域を
欠き、これは、細胞膜上でのポリペプチドの保持を生じる。可溶性AIM II
はまた、その可溶性AIM IIタンパク質が分泌され得る限り、膜貫通領域の
部分または細胞質ドメインもしくは他の配列の部分を含み得る。異種シグナルペ
プチドがその可溶性AIM IIポリペプチドのN末端に融合され得て、その結
果その可溶性AIM IIポリペプチドが発現の際に分泌される。[0117] As used herein, the term "AIM II" polypeptide includes:
Includes membrane-bound proteins, including cytoplasmic, transmembrane, and extracellular domains, as well as truncated proteins that retain AIM II polypeptide activity. In one embodiment, the soluble AIM II polypeptide is AI
It contains all or part of the extracellular domain of the MII protein, but lacks the transmembrane region, resulting in retention of the polypeptide on the cell membrane. Soluble AIM II
May also include portions of the transmembrane region or portions of the cytoplasmic domain or other sequences, as long as the soluble AIM II protein can be secreted. A heterologous signal peptide can be fused to the N-terminus of the soluble AIM II polypeptide such that the soluble AIM II polypeptide is secreted upon expression.
【0118】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、SDS−PAGEゲ
ル上または分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして、使用され得る
。The polypeptides of the present invention can be used as molecular weight markers on SDS-PAGE gels or on molecular sieve gel filtration columns using methods well known to those skilled in the art.
【0119】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドおよびポリペプチドを提供する。これらのエピトープは、本発明の
ポリペプチドの免疫原性または抗原性のエピトープである。「免疫原性エピトー
プ」とは、本発明のポリペプチド全体、またはそのフラグメントが免疫原である
場合、インビボでの抗体応答を惹起するタンパク質の一部と定義される。他方、
抗体が結合し得るポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「抗原性エピト
ープ」と定義される。タンパク質のインビボ免疫原性エピトープの数は、一般に
、抗原性エピトープの数未満である。例えば、Geysenら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 81:3998−4002(1983)を参
照のこと。しかし、抗体は、ファージ提示のような方法を用いることにより、そ
れが免疫原性エピトープであるか否かに拘らず、任意の抗原性エピトープに対し
て作製され得る。例えば、Petersen G.ら、Mol.Gen.Gen
et.249:425−431(1995)を参照のこと。従って、本発明には
、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が包含される。In another aspect, the present invention provides peptides and polypeptides comprising an epitope-bearing portion of a polypeptide of the present invention. These epitopes are immunogenic or antigenic epitopes of the polypeptide of the invention. An "immunogenic epitope" is defined as a portion of a protein that elicits an in vivo antibody response when the entire polypeptide of the invention, or a fragment thereof, is an immunogen. On the other hand,
The region of the polypeptide to which an antibody can bind is defined as an "antigenic determinant" or "antigenic epitope." The number of in vivo immunogenic epitopes of a protein is generally less than the number of antigenic epitopes. See, for example, Geysen et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983). However, antibodies can be raised against any antigenic epitope by using methods such as phage display, whether or not it is an immunogenic epitope. For example, Petersen G. et al. Et al., Mol. Gen. Gen
et. 249: 425-431 (1995). Thus, the present invention includes both immunogenic and antigenic epitopes.
【0120】 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド(すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む)の選択について、タンパク質配列の一
部に模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Su
tcliffe,J.G.、Shinnick,T.M.、Green,N.お
よびLearner,R.A.(1983)Antibodies that
react with predetermined sites on pr
oteins.Science 219:660〜666を参照のこと。タンパ
ク質反応性の血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列においてしば
しば示され、一組の単純な化学法則によって特徴付けられ得、そしてインタクト
なタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原性エピトープ)またはアミノ末
端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。For the selection of peptides or polypeptides bearing an antigenic epitope (ie, including regions of the protein molecule to which antibodies can bind), relatively short synthetic peptides that mimic a portion of the protein sequence may be partially It is well known in the art that antisera reactive with mimicked proteins can be routinely induced. For example, Su
tcliffe, J.M. G. FIG. Shinnick, T .; M. Green, N .; And Learner, R .; A. (1983) Antibodies that
react with predetermined sites on pr
oteins. Science 219: 660-666. Peptides that can elicit protein-reactive sera are often shown in the primary sequence of proteins, can be characterized by a set of simple chemical rules, and are immunodominant regions of intact proteins (ie, immunogenic epitopes). Or it is not limited to either the amino or carboxy terminus.
【0121】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有
ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体(モノク
ローナル抗体を含む)を惹起するために有用である。例えば、Wilsonら、
Cell 37:767〜778(1984)の777を参照のこと。Accordingly, the antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are useful for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to the polypeptides of the present invention. . For example, Wilson et al.
See 377 in Cell 37: 767-778 (1984).
【0122】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプ
チドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる好ましくは少なくと
も7の、より好ましくは少なくとも9の、および最も好ましくはおよそ少なくと
も約15と約30との間のアミノ酸の配列を含む。The antigenic epitope-bearing peptide and the antigenic epitope-bearing polypeptide of the present invention preferably comprise at least 7, more preferably at least 9, and most preferably about at least 7 amino acids contained in the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention. It includes a sequence of at least between about 15 and about 30 amino acids.
【0123】 AIM II特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチド
または抗原性ペプチドの限定されない例は、以下を含む:図1AおよびB(配列
番号2)におけるアミノ酸残基約13〜約20を含むポリペプチド;図1(配列
番号2)におけるアミノ酸残基約23〜約36を含むポリペプチド;図1Aおよ
びB(配列番号2)におけるアミノ酸残基約69〜約79を含むポリペプチド;
図1AおよびB(配列番号2)におけるアミノ酸残基約85〜約94を含むポリ
ペプチド;図1AおよびB(配列番号2)におけるアミノ酸残基約167〜約1
78を含むポリペプチド;図1AおよびB(配列番号2)におけるアミノ酸残基
約184〜約196を含むポリペプチド;ならびに図1AおよびB(配列番号2
)におけるアミノ酸残基約221〜約233を含むポリペプチド。上記のように
、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがAIM IIタンパク質の
抗原性領域であることを決定した。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to raise AIM II-specific antibodies include: about 13 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising amino acid residues from about 23 to about 36 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); a polypeptide comprising amino acid residues from about 69 to about 79 in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) peptide;
A polypeptide comprising about 85 to about 94 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2); about 167 to about 1 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
Polypeptides comprising amino acid residues from about 184 to about 196 in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2); and FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
A) a polypeptide comprising about 221 to about 233 amino acid residues in As noted above, we have determined that the above polypeptide fragment is an antigenic region of the AIM II protein.
【0124】 本発明のAIM IIポリペプチドは、単量体または多量体(すなわち、二量
体、三量体、四量体、およびより高い多量体)中にあり得る。従って、本発明は
、本発明のAIM IIポリペプチドの単量体および多量体、これらの調製物、
およびこれらを含む組成物(好ましくは、薬学的組成物)に関する。特定の実施
態様において、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体、または四量
体である。さらなる実施態様において、本発明の多量体は、少なくとも二量体、
少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。The AIM II polypeptides of the present invention can be in monomers or multimers (ie, dimers, trimers, tetramers, and higher multimers). Accordingly, the present invention relates to monomers and multimers of the AIM II polypeptides of the present invention, their preparation,
And compositions containing them (preferably, pharmaceutical compositions). In certain embodiments, a polypeptide of the invention is a monomer, dimer, trimer, or tetramer. In a further embodiment, the multimer of the invention has at least a dimer,
It is at least a trimer, or at least a tetramer.
【0125】 本発明によって含まれる多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本
明細書中で使用される場合、用語、ホモマーは、本発明のAIM IIポリペプ
チドのみを含む多量体をいう(本明細書中に記載される場合、AIM IIフラ
グメント、改変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質を含む)。こ
れらのホモマーは、同一の、または異なるアミノ酸配列を有するAIM IIポ
リペプチドを含み得る。特定の実施態様において、本発明のホモマーは、同一の
アミノ酸配列を有するAIM IIポリペプチドのみを含む多量体である。別の
特定の実施態様において、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するA
IM IIポリペプチドを含む多量体である。特定の実施態様において、本発明
の多量体は、ホモ二量体(例えば、同一の、または異なるアミノ酸配列を有する
AIM IIポリペプチドを含む)、またはホモ三量体(例えば、同一の、およ
び/または異なるアミノ酸配列を有するAIM IIポリペプチドを含む)であ
る。さらなる実施態様において、本発明のホモマーの多量体は、少なくともホモ
二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。The multimers included by the present invention can be homomeric or heteromeric. As used herein, the term homomer refers to a multimer comprising only an AIM II polypeptide of the invention (as described herein, an AIM II fragment, variant, splicing variant). , And fusion proteins). These homomers can include AIM II polypeptides having the same or different amino acid sequence. In certain embodiments, a homomer of the invention is a multimer comprising only AIM II polypeptides having the same amino acid sequence. In another particular embodiment, the homomers of the present invention have A
Multimers containing IM II polypeptides. In certain embodiments, the multimers of the invention are homodimers (eg, including AIM II polypeptides having the same or different amino acid sequences) or homotrimers (eg, the same and / or Or AIM II polypeptides having different amino acid sequences). In a further embodiment, the homomer multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer, or at least a homotetramer.
【0126】 本明細書中で使用される場合、用語、ヘテロマーは、本発明のAIM IIお
よびAIM IIポリペプチドに加えて、1つ以上の異種ポリペプチド(すなわ
ち、異なるタンパク質のポリペプチド)を含む多量体をいう。特定の実施態様に
おいて、本発明の多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体
である。さらなる実施態様において、本発明のホモマーの多量体は、少なくとも
ホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。As used herein, the term heteromer includes one or more heterologous polypeptides (ie, polypeptides of different proteins) in addition to the AIM II and AIM II polypeptides of the invention. Refers to multimers. In certain embodiments, a multimer of the invention is a heterodimer, heterotrimer, or heterotetramer. In a further embodiment, the homomer multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer, or at least a homotetramer.
【0127】 本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性、および/もしくは共有結合性
の会合の結果であり得、かつ/または、例えば、リポソーム形成によって間接的
に結合され得る。従って、1つの実施態様において、例えばホモ二量体またはホ
モ三量体のような本発明の多量体は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接
触する場合に形成される。別の実施態様において、例えばヘテロ二量体またはヘ
テロ三量体のような本発明の多量体は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発
明のポリペプチドに対する抗体(本発明の融合タンパク質における異種ポリペプ
チド配列に対する抗体を含む)と接触する場合に形成される。他の実施態様にお
いて、本発明の多量体は、本発明のAIM IIポリペプチドとの共有結合的会
合、および/またはAIM IIポリペプチド間の共有結合的会合によって形成
される。このような共有結合的会合は、ポリペプチド配列に含まれる1つ以上の
アミノ酸残基を含み得る(例えば、配列番号2もしくは配列番号39に示される
、またはATCC受託番号97689および同97483として示されるクロー
ンによってコードされるポリペプチドに含まれる)。1つの例において、この共
有結合的な会合は、ネイティブ(すなわち、天然に存在する)ポリペプチド中で
相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。別
の例において、この共有結合的な会合は、化学的、または組換え的操作の結果で
ある。あるいは、このような共有結合的な会合は、AIM II融合タンパク質
中の異種ポリペプチド配列に含まれる1つ以上のアミノ酸残基を含み得る。1つ
の例において、共有結合的な会合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配
列間にある(例えば、米国特許第5,478,925号を参照のこと)。特定の
実施態様において、この共有結合的な会合は、本発明のAIM II−Fc融合
タンパク質に含まれる異種配列間にある(本明細書中に記載されるように)。別
の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合的な会合は、共有結合
的に会合する多量体を形成し得る別のTNFファミリーリガンド/レセプターメ
ンバー(例えば、オセテオプロテゲリン(oseteoprotegerin)
(例えば、国際特許公開番号WO98/49305を参照のこと。この内容は、
その全体が、本明細書中に参考として援用される))からの異種ポリペプチド配
列間にある。The multimers of the present invention may be the result of hydrophobic, hydrophilic, ionic, and / or covalent association and / or may be indirectly bound, for example, by liposome formation. Thus, in one embodiment, multimers of the invention, such as, for example, homodimers or homotrimers, are formed when the polypeptides of the invention contact one another in solution. In another embodiment, a multimer of the invention, such as a heterodimer or heterotrimer, is an antibody against a polypeptide of the invention in solution (in a fusion protein of the invention). (Including antibodies to heterologous polypeptide sequences). In other embodiments, the multimers of the invention are formed by covalent association with AIM II polypeptides of the invention and / or covalent associations between AIM II polypeptides. Such a covalent association may involve one or more amino acid residues contained in the polypeptide sequence (eg, as set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 39, or as set forth in ATCC Accession Numbers 97689 and 97483). Contained in the polypeptide encoded by the clone). In one example, the covalent association is a bridge between cysteine residues located within the interacting polypeptide sequence in the native (ie, naturally occurring) polypeptide. In another example, the covalent association is a result of chemical or recombinant manipulation. Alternatively, such a covalent association may involve one or more amino acid residues contained in a heterologous polypeptide sequence in the AIM II fusion protein. In one example, the covalent association is between heterologous sequences contained in a fusion protein of the invention (see, eg, US Pat. No. 5,478,925). In certain embodiments, the covalent association is between heterologous sequences contained in an AIM II-Fc fusion protein of the invention (as described herein). In another specific example, the covalent association of a fusion protein of the invention is such that another TNF family ligand / receptor member (eg, oseteoprotegerin) that can form covalently associated multimers.
(See, for example, International Patent Publication No. WO 98/49305.
In its entirety, is between the heterologous polypeptide sequences from))), which is incorporated herein by reference.
【0128】 本発明の多量体は、当該分野で公知の化学的技術を使用して生成され得る。例
えば、本発明の多量体に含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で
公知のリンカー分子およびリンカー分子長の最適化技術を使用して、化学的に架
橋され得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これは、その全体が、
本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。さらに、本発明の多量体
は、この多量体に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシ
ステイン残基間での1つ以上の分子間架橋を形成するために、当該分野で公知の
技術を使用して生成され得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これ
は、その全体が、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。さらに
、本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのC末端またはN末端に対して、
システインまたはビオチンを付加することによって慣用的に改変され得、そして
当該分野で公知の技術を適用して、1つ以上のこれらの改変されたポリペプチド
を含む多量体を生成し得る(例えば、米国特許第5,478,925号(これは
、その全体が、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。さらに、
当該分野で公知の技術を適用して、本発明の多量体に含まれることが所望される
ポリペプチド成分を含むリポソームを生成し得る(例えば、米国特許第5,47
8,925号(これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される)を参
照のこと)。The multimers of the present invention can be produced using chemical techniques known in the art. For example, a polypeptide that is desired to be included in a multimer of the invention can be chemically cross-linked using linker molecule and linker length optimization techniques known in the art (eg, US Pat. No. 5,478,925 (this is, in its entirety,
), Herein incorporated by reference)). Further, the multimers of the present invention may be used in the art to form one or more intermolecular bridges between cysteine residues located within the sequence of the polypeptide desired to be included in the multimer. It can be produced using known techniques (see, for example, US Pat. No. 5,478,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety). Further, the polypeptide of the present invention may have a C-terminal or N-terminal relative to the polypeptide.
It can be modified conventionally by adding cysteine or biotin, and techniques known in the art can be applied to produce multimers comprising one or more of these modified polypeptides (eg, US See US Patent No. 5,478,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety. further,
Techniques known in the art can be applied to generate liposomes containing the polypeptide components desired to be included in the multimers of the invention (see, for example, US Pat.
No. 8,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety).
【0129】 あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子操作技術を使用して生
成され得る。1つの実施態様において、本発明の多量体に含まれるポリペプチド
は、本明細書中に記載されるか、またはさもなくば当該分野で公知の融合タンパ
ク質技術を使用して、組換え的に生産される(例えば、米国特許第5,478,
925号(これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される)を参照の
こと)。特定の実施態様において、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレ
オチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカ
ーポリペプチドをコードする配列に、次いで、さらに本来のC末端からN末端(
リーダー配列を含まない)に逆方向にポリペプチドの翻訳産物をコードする合成
ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって生成される(例えば、米国
特許第5,478,925号(これは、その全体が、本明細書中に参考として援
用される)を参照のこと)。別の実施態様において、本明細書中に記載されるか
、またはさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメイン(
または疎水性もしくはシグナルペプチド)を含み、かつリポソームへの膜再構築
技術によって組み込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する(例えば
、米国特許第5,478,925号(これは、その全体が、本明細書中に参考と
して援用される)を参照のこと)。Alternatively, the multimers of the present invention can be produced using genetic engineering techniques known in the art. In one embodiment, the polypeptide comprised in the multimer of the invention is recombinantly produced using fusion protein technology described herein or otherwise known in the art. (Eg, US Pat. No. 5,478,
No. 925, which is hereby incorporated by reference in its entirety). In certain embodiments, the polynucleotide encoding a homodimer of the invention comprises a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention replaced by a sequence encoding a linker polypeptide, and then further from the native C-terminus. N-terminal (
It is produced by ligating the polypeptide in reverse direction to a synthetic polynucleotide encoding the translation product of the polypeptide (excluding the leader sequence) (see, eg, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein in its entirety). , Incorporated herein by reference). In another embodiment, applying the recombinant techniques described herein or otherwise known in the art, the transmembrane domain (
Or a hydrophobic or signal peptide) and produce a recombinant polypeptide of the invention that can be incorporated by membrane reconstitution techniques into liposomes (see, eg, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference). See (incorporated herein by reference in its entirety)).
【0130】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に差次的に改変(例えば、グリコシル化、ア
セチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タ
ンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによる)
されるAIM IIポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変が、公知の技
術によって実行され得る。これらの技術は、臭化シアン、トリプシン、キモトリ
プシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学切断;アセ チル化、ホルミル化、酸化、還元;ツニカマイシンの存在下での代謝合成;など
を含むがこれらに限定されない。The present invention provides for differentially altering during or after translation (eg, glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, antibodies) Such as by binding to molecules or other cellular ligands)
AIM II polypeptides. Any of a number of chemical modifications can be performed by known techniques. These techniques, cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, specific chemical cleavage by NaBH 4; acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin; including such It is not limited to these.
【0131】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後の改変としては、例えば、N結合化炭
水化物鎖またはO結合化炭水化物鎖、N末端またはC末端のプロセシング、アミ
ノ酸骨格に対する化学的部分の付着、N結合化炭水化物鎖またはO結合化炭水化
物鎖の化学的改変、および原核生物の宿主細胞発現の結果としてのN末端メチオ
ニン残基の付加が挙げられる。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単
離を可能にするために、検出可能な標識(例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体
標識、またはアフィニティー標識)を用いて改変され得る。Additional post-translational modifications encompassed by the present invention include, for example, N-linked or O-linked carbohydrate chains, N- or C-terminal processing, attachment of chemical moieties to the amino acid backbone, N-linked Chemical modification of carbohydrate or O-linked carbohydrate chains and addition of N-terminal methionine residues as a result of prokaryotic host cell expression. Polypeptides can also be modified with a detectable label, such as an enzymatic, fluorescent, isotopic, or affinity label, to allow detection and isolation of the protein.
【0132】 本発明はまた、ポリペプチドの可溶性、安定性、および循環時間の増加、また
は免疫原性の低下のようなさらなる利点を提供し得るAIM IIの化学的に改
変された誘導体を提供し得る(米国特許第4,179,337号を参照のこと)
。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコー
ル/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキス
トラン、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーから選択され得る。
ポリペプチドは、この分子内の無作為な位置で改変されても良いし、またはこの
分子内の予め決定された位置で改変されても良いし、そして1つ、2つ、3つ以
上の付着された化学的部分を含んでも良い。The present invention also provides chemically modified derivatives of AIM II that may provide additional benefits such as increased solubility, stability, and circulation time of the polypeptide, or reduced immunogenicity. Obtain (see US Patent No. 4,179,337).
. The chemical moiety for derivatization may be selected from water-soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like.
The polypeptide may be modified at a random position within the molecule, or may be modified at a predetermined position within the molecule, and may include one, two, three or more attachments. It may include a chemical moiety.
【0133】 このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分岐していても良いし、また
は分岐していなくても良い。ポリエチレングリコールに関して、操作および製造
の容易さのために、好ましい分子量は、約1kDaと約100kDaとの間であ
る(用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子
が規定された分子量よりも大きく、いくつかは小さいことを示す)。他のサイズ
は、所望の治療的プロフィール(例えば、所望される徐放性の持続、効果(生物
学的活性に対して、もしあるとすれば)、操作の容易性、抗原性の程度または欠
損、および治療的タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの
他の公知の効果)に依存して使用され得る。[0133] The polymer can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. For polyethylene glycol, for ease of operation and manufacture, the preferred molecular weight is between about 1 kDa and about 100 kDa (the term "about" refers to the definition of some molecules in a preparation of polyethylene glycol). Larger than the molecular weight, and some are smaller). Other sizes may include the desired therapeutic profile (eg, desired sustained release, effect (if any to biological activity), ease of manipulation, degree of antigenicity or deficiency). And other known effects of polyethylene glycol on therapeutic proteins or analogs).
【0134】 ポリエチレングリコール分子(または他の化学的部分)は、タンパク質の機能
性もしくは抗原性ドメインに対する効果を考慮して、このタンパク質に付着され
るべきである。当業者に利用可能な多くの付着方法が存在する(例えば、本明細
書中で参考として援用されるEP 0 401 384(PEGのG−CSFへ
の結合)、また、Malikら、Exp.Hematol.20:1028〜1
035(1992)(トレシルクロリド(tresyl chloride)を
使用するGM−CSFのペグ化(pegylation)を報告している)。例
えば、ポリエチレングリコールは、反応基(例えば、遊離のアミノ基またはカル
ボキシル基)を介して、アミノ酸残基を通じて共有結合的に結合され得る。反応
基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離
のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびN末端アミノ酸残
基が挙げられ得る:遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アス
パラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびC末端アミノ酸残基が挙げられ得る
。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子に付着するための反応
基として使用され得る。治療目的について好ましいのは、N末端またはリジン残
基での付着のような、アミノ基での付着である。A polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety) should be attached to a protein in view of its effect on the functional or antigenic domain of the protein. There are many attachment methods available to those skilled in the art (eg, EP 0 401 384 (attachment of PEG to G-CSF), which is hereby incorporated by reference), and also see Malik et al., Exp. 20: 1028-1
035 (1992) (reporting the pegylation of GM-CSF using tresyl chloride). For example, polyethylene glycol can be covalently attached through a reactive group, such as a free amino or carboxyl group, through an amino acid residue. A reactive group is a group to which an activated polyethylene glycol molecule can be bound. Amino acid residues having a free amino group may include lysine residues and the N-terminal amino acid residue: amino acid residues having a free carboxyl group include aspartic acid residues, glutamic acid residues, and C-terminal amino acid residues. Amino acid residues may be mentioned. Sulfhydryl groups can also be used as reactive groups for attaching to polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, such as attachment at the N-terminus or lysine residue.
【0135】 N末端で化学的に改変されるタンパク質を、特に所望し得る。本発明の組成物
の例示として使用するポリエチレングリコールを用いては、種々のポリエチレン
グリコール分子から(分子量、分岐などによる)、反応混合物中のタンパク質(
またはペプチド)分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実行される
べきペグ化反応の型、および選択されるN末端がペグ化されたタンパク質を得る
方法を選択し得る。N末端がペグ化された調製物を得る(すなわち、必要であれ
ば、他のモノペグ化(monopegylated)された部分からこの部分を
分離する)方法は、ペグ化されたタンパク質分子の集団からN末端がペグ化され
た物質を精製することにより得る。N末端の改変において化学的に改変される選
択的タンパク質は、特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な異なる型の主要な
アミノ基(リジン対N末端)の差次的な反応性を開発する、還元性のアルキル化
によって達成され得る。適切な反応条件下において、カルボニル基を含むポリマ
ーを用いるN末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が、達成される。A protein that is chemically modified at the N-terminus may be particularly desirable. Using polyethylene glycol, which is used as an example of the composition of the present invention, the protein (in terms of molecular weight, branching, etc.) in the reaction mixture (from various polyethylene glycol molecules)
The ratio of the polyethylene glycol molecules to the (or peptide) molecules, the type of PEGylation reaction to be performed, and the method of obtaining the selected N-terminally PEGylated protein can be selected. Methods for obtaining N-terminally pegylated preparations (ie, if necessary, separating this part from other monopegylated parts) involve the use of N-terminal from a population of pegylated protein molecules. Is obtained by purifying the pegylated material. Selective proteins that are chemically modified in the N-terminal modification develop differential reactivity of different types of major amino groups (lysine vs. N-terminal) available for derivatization of a particular protein, It can be achieved by reductive alkylation. Under appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with a polymer containing carbonyl groups is achieved.
【0136】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、任意
の従来の手段によって生成され得る。Houghten,R.A.(1985)
General method for the rapid solid−p
hase synthesis of large numbers of p
eptides:specificity of antigen−antib
ody interaction at the level of indi
vidual amino acids.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 82:5131〜5135。この「Simultaneous M
ultiple Peptide Synthesis(SMPS)」プロセス
は、Houghtenら(1986)に対する米国特許第4,631,211号
において、さらに記載される。[0136] The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means. Houghten, R .; A. (1985)
General method for the rapid solid-p
case synthesis of large numbers of p
eptides: specificity of antigen-antib
ody interaction at the level of indi
visual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 82: 5131-5135. This "Simultaneous M
The "multiple Peptide Synthesis (SMPS)" process is further described in U.S. Pat. No. 4,631,211 to Houghten et al. (1986).
【0137】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびT細胞
抗原レセプター(TCR)に関する。本発明の抗体としては、IgG(IgG1
、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む)、IgA(IgA1およびIg
A2を含む)、IgD、IgE、IgM、およびIgYが挙げられる。本明細書
中で使用される場合、用語「抗体」(Ab)は、単鎖抗体全体、およびこれらの
抗原結合フラグメントを含む、抗体全体を含むことを意味する。最も好ましくは
、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメント(Fab、Fab’およびF
(ab’)2、Fd、単鎖Fvs(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィド結合化
Fvs(sdFv)、ならびにVLドメインかまたはVHドメインのいずれかを
含むフラグメントを含むがこれらに限定されない)である。これらの抗体は、鳥
類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、これらの
抗体はヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワト
リである。The invention further relates to antibodies and T cell antigen receptors (TCRs) that specifically bind to a polypeptide of the invention. The antibodies of the present invention include IgG (IgG1
, IgG2, IgG3, and IgG4), IgA (IgA1 and IgA
A2), IgD, IgE, IgM, and IgY. As used herein, the term "antibody" (Ab) is meant to include whole single chain antibodies and whole antibodies, including antigen-binding fragments thereof. Most preferably, the antibody is a human antigen binding antibody fragment (Fab, Fab 'and F) of the present invention.
(Ab ′) 2, Fd, single-chain Fvs (scFv), single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv), and fragments containing either the VL domain or the VH domain). . These antibodies can be from any animal origin, including birds and mammals. Preferably, these antibodies are human, murine, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken.
【0138】 抗原結合抗体フラグメント(単鎖抗体を含む)は、可変領域単独、または以下
の全体もしくは一部との組合せを含み得る:ちょうつがい部位、CH1、CH2
、およびCH3ドメイン。本発明内には、可変領域とちょうつがい部位、CH1
、CH2、およびCH3ドメインとの任意の組合せもまた含まれる。本発明はさ
らに、本発明のポリペプチドを特異的に結合する、キメラ抗体、ヒト化抗体、な
らびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を含む。本発明は
さらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。Antigen binding antibody fragments (including single chain antibodies) may comprise the variable region alone or in combination with all or part of the following: hinge site, CH1, CH2
, And CH3 domain. Within the present invention, the variable region and the hinge site, CH1
, CH2, and CH3 domains are also included. The present invention further includes chimeric, humanized, and human monoclonal and polyclonal antibodies that specifically bind a polypeptide of the present invention. The present invention further includes antibodies that are anti-idiotypic to the antibodies of the present invention.
【0139】 本発明の抗体は、単一抗原特異的、二抗原特異的、三抗原特異的またはより多
くの多抗原特異的であり得る。多抗原特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの
異なるエピトープに特異的であっても良いし、または本発明のポリペプチドの両
方ならびに異種組成物(例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持材料)に特
異的であっても良い。例えば、WO93/17715;WO92/08802;
WO91/00360;WO92/05793;Tutt.Aら、J.Immu
nol.147:60〜69(1991);米国特許第5,573,920号、
同第4,474,893号、同第5,601,819号、同第4,714,68
1号、同第4,925,648号;Kostelny.S.A.ら、J.Imm
unol.148:1547〜1553(1992)を参照のこと。The antibodies of the present invention can be mono-antigen-specific, bi-antigen-specific, tri-antigen-specific or more multi-antigen-specific. Multiantigen-specific antibodies may be specific for different epitopes of a polypeptide of the invention, or may be specific for both polypeptides of the invention and heterologous compositions (eg, heterologous polypeptides or solid support materials). It may be specific. For example, WO93 / 17715; WO92 / 08802;
WO 91/05793; WO 92/05793; Tutt. A et al. Immu
nol. 147: 60-69 (1991); U.S. Patent No. 5,573,920;
Nos. 4,474,893, 5,601,819 and 4,714,68
No. 1, No. 4,925,648; Kostelny. S. A. J. et al. Imm
unol. 148: 1547-1553 (1992).
【0140】 本発明の抗体は、抗体によって認識されるかまたは特異的に結合される本発明
のポリペプチドのエピトープまたは部分について記載または特定され得る。この
エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば
、N末端位置およびC末端位置によって、連続するアミノ酸残基のサイズによっ
て、または表および図に列挙されるように特定され得る。本発明の任意のエピト
ープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた、除外され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、そして同一
物の除外を可能にする。An antibody of the invention can be described or specified for an epitope or portion of a polypeptide of the invention that is recognized or specifically bound by the antibody. The epitope or polypeptide portion may be identified as described herein, for example, by N-terminal and C-terminal positions, by the size of contiguous amino acid residues, or as listed in the tables and figures. Can be done. Antibodies that specifically bind any epitope or polypeptide of the present invention may also be excluded. Accordingly, the present invention includes antibodies that specifically bind a polypeptide of the present invention, and allows for the exclusion of the same.
【0141】 本発明の抗体はまた、これらの交差反応性について記載または特定され得る。
本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログ(ortholog)
、またはホモログを結合しない抗体は、含まれる。本発明のポリペプチドに対し
て、95%未満、90%未満、85%未満、80%未満、75%未満、70%未
満、65%未満、60%未満、55%未満、および50%未満の同一性(当該分
野で公知の方法、および本明細書中に記載される方法を使用して計算されるよう
に)を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。本発明
において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書中に記載
されるような)下において本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみを結合する抗体が、さらに
含まれる。本発明の抗体はまた、これらの結合親和性について記載または特定さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、5×10-6M、10-6M、5×10-7M
、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10 M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5× 10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、および1 0-15M未満の解離定数またはKdを有する結合親和性が挙げられる。The antibodies of the present invention may also be described or specified for their cross-reactivity.
Any other analog of the polypeptides of the invention, ortholog
Or antibodies that do not bind homologs are included. For polypeptides of the invention, less than 95%, less than 90%, less than 85%, less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, and less than 50% Antibodies that do not bind polypeptides that have identity (as calculated using methods known in the art and described herein) are also included in the invention. The present invention further includes an antibody that binds only a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of the present invention under stringent hybridization conditions (as described herein). It is. The antibodies of the present invention may also be described or specified for their binding affinity. Preferred binding affinity is 5 × 10 −6 M, 10 −6 M, 5 × 10 −7 M
, 10 -7 M, 5 x 10 -8 M, 10 -8 M, 5 x 10 -9 M, 10 -9 M, 5 x 10 -10 M, 10 -10 M, 5 x 10 -11 M, 10 −11 M, 5 × 10 −12 M, 10 −12 M, 5 × 10 −13 M, 10 −13 M, 5 × 10 −14 M, 10 −14 M, 5 × 10 −15 M, and 10 Binding affinities with a dissociation constant or Kd of less than -15 M are mentioned.
【0142】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的化する、当
該分野で公知の方法を含むがこれらに限定されない使用を有し、これは、インビ
トロおよびインビボの両方の診断方法ならびに治療方法を含む。例えば、これら
の抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的お
よび定量的に測定するための免疫アッセイにおける使用を有する。例えば、Ha
rlowら、ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL
(Cold Spring Harbor Laboratory Press
、第2版、1998)を参照のこと(これらの全体が参考として援用される)。The antibodies of the invention have uses, including but not limited to, methods known in the art, for purifying, detecting, and targeting polypeptides of the invention, including both in vitro and in vivo. And diagnostic methods. For example, these antibodies have use in immunoassays for qualitatively and quantitatively measuring levels of a polypeptide of the invention in biological samples. For example, Ha
rlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL
(Cold Spring Harbor Laboratory Press
, Second Edition, 1998), which are incorporated by reference in their entirety.
【0143】 本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用され得る。こ
れらの抗体はさらに、N末端もしくはC末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に対して化学的に結合体
化され得る(共有結合および非共有結合体化を含む)。例えば、本発明の抗体は
、異種ポリペプチド、薬物、または毒素のような、検出アッセイにおける標識お
よびエフェクター分子として有用である分子に組換え的に融合され得るか、また
は結合体化され得る。例えば、WO92/08495;WO91/14438;
WO89/12624;米国特許第5,314,995号;およびEP 0 3
96 387を参照のこと。The antibodies of the present invention can be used alone or in combination with other compositions. These antibodies can be further recombinantly fused at the N-terminus or C-terminus to a heterologous polypeptide, or chemically conjugated to a polypeptide or other composition (covalently and non-covalently). Conjugation). For example, the antibodies of the invention can be recombinantly fused or conjugated to molecules that are useful as labels and effector molecules in detection assays, such as heterologous polypeptides, drugs, or toxins. For example, WO 92/08495; WO 91/14438;
WO 89/12624; US Pat. No. 5,314,995; and EP 03
See 96 387.
【0144】 本発明の抗体を、当該分野において公知である任意の適切な方法により調製し
得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリク
ローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。モノクロ
ーナル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む、当該分野に
おいて公知である広範な技術を使用して調製され得る。例えば、Harlowら
、ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL、(Col
d Spring Harbor Laboratory Press.第2版
、1988):Hammerlingら、:MONOCLONAL ANTIB
ODIES AND T−CELL HYBRIDOMAS 563〜681(
Elsevier、N.Y.、1981)(上記の参考文献は、その全体が参考
として援用される)を参照のこと。[0144] Antibodies of the present invention may be prepared by any suitable method known in the art. For example, a polypeptide of the invention or an antigenic fragment thereof can be administered to an animal to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma and recombinant technology. See, for example, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Col.
d Spring Harbor Laboratory Press. 2nd edition, 1988): Hammerling et al., MONOCLONAL ANTIB.
ODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (
Elsevier, N .; Y. , 1981) (the above references are incorporated by reference in their entirety).
【0145】 FabおよびF(ab’)2フラグメントは、パパイン(Fabフラグメント
を産生するため)またはペプシン(F(ab’)2フラグメントを産生するため
)のような酵素を使用して、タンパク質分解性切断によって産生され得る。[0145] Fab and F (ab ') 2 fragments can be proteolytically purified using enzymes such as papain (to produce Fab fragments) or pepsin (to produce F (ab') 2 fragments). It can be produced by cleavage.
【0146】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知である方法を使用する、組換えD
NA技術の適用を通じてかまたは合成化学を通じて産生され得る。例えば、本発
明の抗体は、当該分野で公知である種々のファージディスプレイ法を使用して調
製され得る。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインは、それらを
コードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上に提示される。所
望の結合特性を有するファージは、抗原(代表的には固体表面またはビーズに結
合されたかまたは捕捉された抗原)を用いて直接的に選択することによって、レ
パートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウ
スから選択される。これらの方法で使用されるファージは、代表的には、Fab
を有するfdおよびM13を含む糸状ファージである。Fvまたはジスルフィド
で安定化されたFv抗体ドメインは、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VII
Iタンパク質のいずれかに組換え融合される。本発明の抗体を作製するために使
用され得るファージディスプレイ法の例は、Brinkman U.ら、J.I
mmunol.Methods 182:41〜50(1995):Ames,
R.S.ら、J.Immunol.Methods 184:177〜186(
1995):Kettleborough.C.A.ら、Eur.J.Immu
nol.24:952〜958(1994);Persic,L.ら、Gene
187:9〜18(1997);Burton,D.R.ら、Advance
s in Immunology 57:191〜280(1994);PCT
/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO
92/01047;WO92/18619;WO 93/11236;WO 9
5/15982;WO 95/20401;および米国特許第5,698,42
6号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580
,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,
821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同
第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727
号および同第5,733,743号(上記の参考文献は、それらの全体が参考と
して援用される)に開示されるものを含む。[0146] Alternatively, the antibodies of the present invention can be made using recombinant D, using methods known in the art.
It can be produced through the application of NA technology or through synthetic chemistry. For example, the antibodies of the present invention can be prepared using various phage display methods known in the art. In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles that carry the polynucleotide sequences that encode them. Phage with the desired binding properties are selected directly by using an antigen (typically an antigen bound or captured on a solid surface or a bead) to generate a repertoire or combinatorial antibody library (eg, a human antibody). Alternatively, the phage used in these methods is typically a Fab.
Is a filamentous phage containing fd and M13. Fv or Fv antibody domains stabilized with disulfide can be expressed by phage gene III or gene VII.
It is recombinantly fused to any of the I proteins. Examples of phage display methods that can be used to make the antibodies of the invention are described in Brinkman U.S. Pat. J. et al. I
mmunol. Methods 182: 41-50 (1995): Ames,
R. S. J. et al. Immunol. Methods 184: 177-186 (
1995): Kettleborough. C. A. Et al., Eur. J. Immu
nol. 24: 952-958 (1994); Persic, L .; Et al., Gene
187: 9-18 (1997); Burton, D .; R. Et al., Advance
s in Immunology 57: 191-280 (1994); PCT.
/ GB91 / 01134; WO90 / 02809; WO91 / 10737; WO
WO 92/18619; WO 93/11236; WO 9
WO 95/20401; and US Pat. No. 5,698,42.
No. 6, No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,580
No. 717, No. 5,427,908, No. 5,750,753, No. 5,
Nos. 821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, and 5,658,727.
And those disclosed in U.S. Pat. No. 5,733,743 (the above references are incorporated by reference in their entirety).
【0147】 上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択の後、ファージからの抗体
コード領域を単離し得、そして使用し、抗体全体(ヒト抗体を含む)、または任
意の他の所望される抗原結合フラグメントを生成し、そして任意の所望される宿
主(哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む)中で発現す
る。例えば、Fab、Fab’およびF(ab’)2フラグメントを組換え産生
するための技術もまた、当該分野で公知の方法(例えば、WO92/22324
;Mullinax.R.L.ら、BioTechniques 12:864
〜869(1992);およびSawai.H.ら、AJRI 34:26〜3
4(1995);ならびにBetter,M.ら、Science 240:1
041〜1043(1988)に開示される方法)(上記の参考文献は、それら
の全体が参考として援用される)を使用して用いられ得る。After phage selection, the antibody coding region from the phage can be isolated and used, as described in the above references, and used in whole antibodies (including human antibodies), or any other desired The resulting antigen binding fragment is produced and expressed in any desired host, including mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast, and bacteria. For example, techniques for recombinantly producing Fab, Fab ', and F (ab') 2 fragments are also known in the art (eg, WO 92/22324).
Mullinax. R. L. Et al., BioTechniques 12: 864.
-869 (1992); and Sawai. H. Et al., AJRI 34: 26-3
4 (1995); and Better, M .; Et al., Science 240: 1
041-1043 (1988)) (the above references are incorporated by reference in their entirety).
【0148】 単鎖Fvおよび抗体を産生するために使用され得る技術の例は、米国特許第4
,946,778号および同第5,258,498号;Hustonら(199
1)Methods in Enzymology 203:46〜88;Sh
u,L.ら(1993)PNAS 90;7995〜7999;およびSker
ra,A.ら、Science 240:1038〜1040(1988)に記
載されるものを含む。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロで
の検出アッセイを含む、いくつかの使用については、キメラ、ヒト化、またはヒ
ト抗体を使用することは、好ましくあり得る。キメラ抗体を産生するための方法
は、当該分野において公知である。例えば、Morrison、Science
229:1202(1985);Oiら、BioTechniques 4:
214(1986);Gillies,S.D.ら(1989)J.Immun
ol.Methods 125:191〜202;および米国特許第5,807
,715号を参照のこと。抗体は、CDR改変(grafting)(EP 0
239 400;WO 91/09967;米国特許第5,530,101号
;および同第5,585,089号)、被膜化(veneering)または再
表面化(resurfacing)(EP 0 592 106;EP 0 5
19 596;Padlan E.A.、(1991)Molecular I
mmunology 28(4/5):489〜498;Studnicka
G.M.ら(1994)Protein Engineering 7(6):
805〜814;Roguska M.A.ら(1994) PNAS 91:
969〜973)、ならびに鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332
号)を含む、種々の技術を使用してヒト化され得る。ヒト抗体は、上記のファー
ジディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得る。
米国特許第4,444,887号、同第4,716,111号、同第5,545
,806号、および同第5,814,318号;ならびにWO 98/4664
5(上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される)もまた参照のこ
と。Examples of techniques that can be used to produce single-chain Fvs and antibodies are described in US Pat.
Huston et al. (1992), 946,778 and 5,258,498;
1) Methods in Enzymology 203: 46-88; Sh
u, L. (1993) PNAS 90; 7995-7999; and Sker.
ra, A .; Science 240: 1038-1040 (1988). For some uses, including in vivo use of antibodies in humans and in vitro detection assays, it may be preferable to use chimeric, humanized, or human antibodies. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For example, Morrison, Science
229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:
214 (1986); Gillies, S .; D. (1989) J. Am. Immun
ol. Methods 125: 191-202; and US Pat. No. 5,807.
See, No. 715. Antibodies are used for CDR-grafting (EP 0
Nos. 239 400; WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,530,101; and 5,585,089), veneering or resurfacing (EP 0 592 106; EP 0 5).
19596; Padlan E. et al. A. , (1991) Molecular I
Munology 28 (4/5): 489-498; Studnicka
G. FIG. M. (1994) Protein Engineering 7 (6):
805-814; Roguska M .; A. (1994) PNAS 91:
969-973), as well as chain shuffling (U.S. Pat. No. 5,565,332).
) Can be humanized using various techniques. Human antibodies can be produced by various methods known in the art, including the phage display method described above.
U.S. Pat. Nos. 4,444,887, 4,716,111 and 5,545
, 806, and 5,814, 318; and WO 98/4664.
5 (the references above are incorporated by reference in their entirety).
【0149】 さらに、本発明において、本発明のポリペプチドに組換え融合されたかまたは
化学的に結合された(共有結合および非共有結合の両方を含む)抗体を含む。こ
の抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体
を使用し、本発明のポリペプチドを、インビトロまたはインビボのいずれかで、
本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させる
かまたは結合させることによって、特定の細胞型に標的化し得る。本発明のポリ
ペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を
使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され得る。例えば、
Harborら、前出およびWO 93/21232;EP 0 439 09
5;Naramura,M.ら、Immunol.Lett.39:91〜99
(1994);米国特許第5,474,981号:Gillies,S.O.ら
(1992)PNAS 89:1428〜1432;Fell,H.P.ら、(
1991)J.Immunol. 146:2446〜2452(上記の参考文
献は、それらの全体が参考として援用される)を参照のこと。Furthermore, the present invention includes antibodies recombinantly fused or chemically conjugated (including both covalent and non-covalent) to the polypeptides of the present invention. This antibody may be specific for an antigen other than the polypeptide of the invention. For example, using an antibody, a polypeptide of the present invention can be administered either in vitro or in vivo.
The polypeptides of the invention can be targeted to a particular cell type by fusing or binding to an antibody specific for a particular cell surface receptor. Antibodies fused or conjugated to a polypeptide of the invention can also be used in in vitro immunoassays and purification methods using methods known in the art. For example,
Harbor et al., Supra and WO 93/21232; EP 0 439 09.
5; Naramura, M .; Et al., Immunol. Lett. 39: 91-99
(1994); US Pat. No. 5,474,981: Gillies, S .; O. (1992) PNAS 89: 1428-1432; Fell, H .; P. (
1991). Immunol. 146: 2446-2452 (the references mentioned above are incorporated by reference in their entirety).
【0150】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
を、抗体のFc領域、またはその部分に融合または結合し得る。本発明のポリペ
プチドに融合された抗体部分は、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン
、およびCH3ドメイン、あるいはそのドメイン全体または部分の任意の組合せ
を含み得る。本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのインビボの半減期を
増加するためか、または当該分野で公知の方法を使用してイムノアッセイにおけ
る使用のために上記の抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチドは
また、マルチマーを形成するように上記の抗体部分に融合または結合され得る。
例えば、本発明のポリペプチドに融合されたFc部分は、Fc部分の間でジスル
フィド結合を通じて2量体を形成し得る。より高次なマルチマー型は、このポリ
ペプチドをIgAおよびIgMの部分に融合することにより作製され得る。本発
明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当該分野にお
いて公知である。例えば、米国特許第5,336、603号、同第5,622,
929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,4
47,851号、同第5,112,946号;EP 0 307 434、EP
0 367 166;WO 96/04388;WO 91/06570;A
shkenazi,A.ら(1991)PNAS 88:10535〜1053
9;Zheng,X.X.ら(1995)J.Immunol.154:559
0〜5600;およびVil,H.ら(1992)PNAS 89;11337
〜11341(上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される)を参
照のこと。The present invention further includes compositions comprising a polypeptide of the present invention fused or conjugated to a domain of the antibody other than the variable region. For example, a polypeptide of the invention can be fused or linked to the Fc region of an antibody, or a portion thereof. The antibody portion fused to the polypeptide of the present invention may comprise the hinge region, CH1 domain, CH2 domain, and CH3 domain, or any combination of the entire domain or portions thereof. A polypeptide of the present invention can be fused or conjugated to an antibody moiety described above for increasing the in vivo half-life of the polypeptide, or for use in immunoassays using methods known in the art. The polypeptide can also be fused or conjugated to the antibody portion described above to form a multimer.
For example, an Fc portion fused to a polypeptide of the invention may form a dimer through a disulfide bond between the Fc portions. Higher multimeric forms can be made by fusing the polypeptide to portions of IgA and IgM. Methods for fusing or attaching a polypeptide of the invention to an antibody moiety are known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,336,603 and 5,622.
No. 929, 5,359,046, 5,349,053, 5,4
No. 47,851, No. 5,112,946; EP 0 307 434, EP
0 367 166; WO 96/04388; WO 91/06570; A
shkenazi, A .; (1991) PNAS 88: 10535-1053.
9; Zheng, X .; X. (1995) J. Am. Immunol. 154: 559
0-5600; and Vil, H .; (1992) PNAS 89; 11337.
-11341 (the above references are incorporated by reference in their entirety).
【0151】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は部分的にかまたは完全にかのいず
れかで、本発明のポリペプチドとのレセプター/リガンド相互作用を妨害する抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗
体が含まれる。レセプター活性化(すなわち、シグナル伝達)は、本明細書中に
記載される技術または当該分野において公知の技術によって決定され得る。リガ
ンド結合およびレセプター活性化の両方を妨害するレセプター特異的抗体もまた
含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてこのレセプターに対するリガンド
の結合を妨害する中和抗体、ならびにこのリガンドに結合し、それによってレセ
プター活性化を妨害するが、このリガンドがこのレセプターに結合することを妨
害しない抗体が含まれる。さらに、このレセプターを活性化する抗体が含まれる
。これらの抗体は、リガンド媒介性レセプター活性化により影響される、全てか
または全てよりも小さい生物学的活性のいずれかに対するアゴニストとして作用
し得る。この抗体は、本明細書中に開示される比活性を含む生物学的活性に対し
てアゴニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体のアゴニス
トは、当該分野において公知である方法を使用して作製され得る。例えば、WO
96/40281;米国特許第5,811,097号;Deng,B.ら(1
998)Blood 92(6):1981〜1988;Chen,Z.ら(1
998)Cancer Res.58(16):3668〜3678;Harr
op,J.A.ら(1998)J.Immunol.161(4):1786〜
1794;Zhu,Z.ら(1998)Cancer Res.58(15):
3209〜3214;Yoon,D.Y.ら(1998)J.Immunol.
160(7):3170〜3179;Prat,M.ら(1998)J.Cel
l.Sci.111(Pt2):237〜247;Pitard,V.ら(19
97)J.Immunol.Methods 205(2):177〜190;
Liautard,J.ら(1997)Cytokinde 9(4):233
〜241;Carlson,N.G.ら(1997)J.Biol.Chem.
272(17):11295〜11301;Taryman,R.E.ら(19
95)Neuron 14(4):755〜762;Muller,Y.A.ら
(1998)Structure 6(9):1153〜1167;Bartu
nek,P.ら(1996)Cytokine 8(1):14〜20(上記の
参考文献は、それらの全体が参考として援用される)を参照のこと。The present invention further relates to antibodies that act as agonists or antagonists of the polypeptides of the present invention. For example, the present invention includes antibodies that either partially or completely block a receptor / ligand interaction with a polypeptide of the present invention. Both receptor-specific and ligand-specific antibodies are included.
Receptor-specific antibodies that do not interfere with ligand binding but do interfere with receptor activation are included. Receptor activation (ie, signal transduction) can be determined by the techniques described herein or known in the art. Receptor-specific antibodies that interfere with both ligand binding and receptor activation are also included. Similarly, neutralizing antibodies that bind to a ligand and prevent binding of the ligand to the receptor, as well as bind to the ligand and thereby prevent receptor activation, but prevent the ligand from binding to the receptor Not included antibodies. Furthermore, antibodies that activate this receptor are included. These antibodies can act as agonists for either all or less than all of the biological activity affected by ligand-mediated receptor activation. The antibodies can be identified as agonists or antagonists for biological activities, including the specific activities disclosed herein. Agonists of the above antibodies can be made using methods known in the art. For example, WO
96/40281; U.S. Patent No. 5,811,097; (1
998) Blood 92 (6): 1981-1988; Chen, Z. et al. (1
998) Cancer Res. 58 (16): 3668-3678; Harr
op, J.M. A. (1998) J. Am. Immunol. 161 (4): 1786-
1794; Zhu, Z .; (1998) Cancer Res. 58 (15):
3209-3214; Yoon, D .; Y. (1998) J. Am. Immunol.
160 (7): 3170-3179; Prat, M .; (1998) J. Am. Cel
l. Sci. 111 (Pt2): 237-247; (19
97) J. Immunol. Methods 205 (2): 177-190;
Liauard, J .; (1997) Cytokinde 9 (4): 233
241; Carlson, N .; G. FIG. (1997) J. Am. Biol. Chem.
272 (17): 11295-11301; Taryman, R .; E. FIG. (19
95) Neuron 14 (4): 755-762; Muller, Y .; A. (1998) Structure 6 (9): 1153-1167; Bartu.
nek, P .; (1996) Cytokine 8 (1): 14-20 (the above references are incorporated by reference in their entirety).
【0152】 さらなる実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、AIM IIの機
能的な性状をコードする。この点における本発明の好ましい実施態様は、AIM
IIの、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域(「α領域」)、βシート
およびβシート形成領域(「β領域」)、ターンおよびターン形成領域(「ター
ン領域」)、コイルおよびコイル形成領域(「コイル領域」)、親水性領域、疎
水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域ならび
に高抗原性指数領域を含むフラグメントを含む。In a further embodiment, a polynucleotide of the invention encodes a functional property of AIM II. A preferred embodiment of the invention in this regard is the AIM
II, α-helix and α-helix forming region (“α region”), β-sheet and β-sheet forming region (“β region”), turn and turn forming region (“turn region”), coil and coil forming region (“ Coil regions "), hydrophilic regions, hydrophobic regions, alpha amphipathic regions, beta amphipathic regions, flexible regions, surface forming regions, as well as fragments including high antigenic index regions.
【0153】 図3A〜Fおよび/または表2に示されるAIM IIの構造的または機能的
性状を示すデータは、デフォルトパラメータで設定されたDNA*STARの種 々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成された。好ましい実施態様に
おいて、表2のカラムVIII、IX、XIII、およびXIVに提示されるデ
ータを使用し、抗原性について高度の可能性を示すAIM IIの領域を決定し
得る。高抗原性の領域は、カラムVIII、IX、XIII、および/またはI
Vに提示されるデータから、抗原の認識が免疫応答の開始プロセスにおいて生じ
得る環境においてポリペプチドの表面に露出されるようであるポリペプチドの領
域を示す値を選択することによって決定される。The data indicating the structural or functional properties of AIM II shown in FIGS. 3A-F and / or Table 2 were generated using various modules and algorithms of DNA * STAR set with default parameters. Was done. In a preferred embodiment, the data presented in columns VIII, IX, XIII, and XIV of Table 2 can be used to determine regions of AIM II that exhibit a high potential for antigenicity. The region of high antigenicity can be found in columns VIII, IX, XIII and / or I
From the data presented in V, it is determined by choosing a value that indicates the region of the polypeptide that is likely to be exposed on the surface of the polypeptide in an environment where recognition of the antigen can occur in the process of initiating the immune response.
【0154】 これらの点における特定の好ましい領域は、図3A〜Fに示されるが、図3A
〜Fにおいて提示されるデータの表の表示を使用して、表2に示されるように表
され得るかまたは同定され得る。図3A〜Fを生成するために使用されるDNA * STARコンピューターアルゴリズム(最初のデフォルトパラメータで設定さ れる)を使用し、表の形式で図3A〜Fにデータを提示した(表2を参照のこと
)。図3A〜Fにおける表形式のデータを使用し、好ましい領域の特定の境界を
容易に決定し得る。Certain preferred areas at these points are shown in FIGS.
-F using the tabular representation of the data presented in Table 2 as shown in Table 2.
Or can be identified. DNA used to generate Figures 3A-F * The data were presented in the form of tables in FIGS. 3A-F using the STAR computer algorithm (set by the initial default parameters) (see Table 2).
). Using the tabular data in FIGS. 3A-F, the specific boundaries of the preferred area are identified.
It can be easily determined.
【0155】 図3A〜Fおよび表2に示される上述の好ましい領域は、図1Aおよび図Bに
示されたアミノ酸配列の分析により同定された上述の型の領域を含むがこれらに
限定されない。図3A〜Fおよび表2に示されるように、このような好ましい領
域は、ガルニエ−ロブソン(Garnier−Robson)α領域、β領域、
ターン領域、およびコイル領域、チョウ−ファスマン(Chou−Fasman
)α領域、ベータ領域、およびコイル領域、カイト−ドーリトル(Kyte−D
oolittle)親水性領域および疎水性領域、アイゼンベルグ(Eisen
berg)α両親媒性領域およびβ両親媒性領域、カープラス−シュルツ(Ka
rplus−Schulz)可撓性領域、エミニ(Emini)表面形成領域お
よび高抗原性指数のジェームソン−ヴォルフ(Jameson−Wolf)領域
を含む。The above-described preferred regions shown in FIGS. 3A-F and Table 2 include, but are not limited to, the above-described types of regions identified by analysis of the amino acid sequences shown in FIGS. 1A and 1B. As shown in FIGS. 3A-F and Table 2, such preferred regions include the Garnier-Robson α region, the β region,
Turn and coil regions, Chou-Fasman
) Alpha, beta, and coil regions, kite-daw little (Kyte-D
oolitol hydrophilic and hydrophobic regions, Eisenberg (Eisen)
berg) α- and β-amphiphilic regions, Carplus-Schulz (Ka
rplus-Schulz flexible region, Emini surface forming region and Jameson-Wolf region with high antigenic index.
【0156】[0156]
【表2】 この点に関して特に非常に好ましいフラグメントは、いくつかの構造的特性(
例えば、上記の表2に示すいくつかの特性)を組み合わせるAIM IIの領域
を含むフラグメントである。[Table 2] Particularly highly preferred fragments in this regard are those having several structural properties (eg,
For example, a fragment containing a region of AIM II that combines some of the properties shown in Table 2 above.
【0157】 本発明のAIM IIポリペプチドを用いて、リンパ節症を生じるリンパ増殖
(lymphoproliferative)疾患を処置し得る。AIM II
は、T細胞のクローン枯渇を刺激することによってアポトーシスを媒介し、従っ
て、自己免疫疾患を処置するため、末梢性寛容および細胞傷害性T細胞媒介アポ
トーシスを刺激するために用いられ得る。AIM IIはまた、全身性エリテマ
トーデス(SLE)、グレーヴズ病、免疫増殖性疾患、リンパ節症(IPL)、
血管免疫増殖性リンパ節症(AIL)、免疫芽球性リンパ節症(IBL)、慢性
関節リウマチ、糖尿病、および多発性硬化症、アレルギーを含む自己免疫障害の
生物学を解明する際に研究ツールとして用いられ得、そして対宿主性移植片病を
処置し得る。AIM II polypeptides of the present invention can be used to treat lymphoproliferative diseases that result in lymphadenopathy. AIM II
Mediates apoptosis by stimulating clonal depletion of T cells, and thus can be used to treat peripheral immune and cytotoxic T cell-mediated apoptosis to treat autoimmune diseases. AIM II also includes systemic lupus erythematosus (SLE), Graves' disease, immunoproliferative disease, lymphadenopathy (IPL),
Research tools in elucidating the biology of autoimmune disorders including vascular immunoproliferative lymphadenopathy (AIL), immunoblastic lymphadenopathy (IBL), rheumatoid arthritis, diabetes, and multiple sclerosis, allergy And can treat graft-versus-host disease.
【0158】 本発明のAIM IIポリペプチドはまた、新形成(例えば、腫瘍細胞増殖)
を阻害するために用いられ得る。AIM IIポリペプチドは、特定の細胞に対
するアポトーシスおよび細胞傷害性を通じる、腫瘍の破壊の原因であり得る。A
IM IIはまた、増殖促進活性(例えば、再狭窄)を必要とする疾患を処置す
るために用いられ得る。なぜなら、AIM IIは、内皮起源の細胞に増殖効果
を有するからである。従って、AIM IIはまた、内皮細胞の発達において造
血を調節するために用いられ得る。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used in neoplasia (eg, tumor cell growth)
Can be used to inhibit AIM II polypeptides may be responsible for tumor destruction through apoptosis and cytotoxicity to specific cells. A
IM II can also be used to treat diseases that require growth promoting activity (eg, restenosis). AIM II has a proliferative effect on cells of endothelial origin. Thus, AIM II can also be used to regulate hematopoiesis in endothelial cell development.
【0159】 本発明はまた、AIM IIに結合する分子(例えば、レセプター分子)の同
定のための方法を提供する。AIM IIを結合するタンパク質(例えば、レセ
プタータンパク質)をコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法(例えば
、リガンドパニングおよびFACS選別)によって同定され得る。このような方
法は、例えば、Coliganら、Current Protocols in
Immunology 1(2):第5章(1991)のような多数の実験マ
ニュアルに記載される。The invention also provides a method for the identification of a molecule (eg, a receptor molecule) that binds to AIM II. Genes encoding proteins (eg, receptor proteins) that bind AIM II can be identified by a number of methods known to those of skill in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Such methods are described, for example, in Coligan et al., Current Protocols in
Immunology 1 (2): described in a number of experimental manuals, such as Chapter 5 (1991).
【0160】 例えば、発現クローニングを、この目的のために用い得る。この目的のために
、ポリアデニル化されたRNAを、AIM IIに応答する細胞から調製する。
cDNAライブラリーをこのRNAから作製する。このライブラリーを、プール
に分割し、そしてこのプールを、AIM IIに応答しない細胞中に個々にトラ
ンスフェクトする。次いで、このトランスフェクトされた細胞を、標識されたA
IM IIに暴露する。(AIM IIは、放射ヨウ素化または部位特異的プロ
テインキナーゼに対する認識部位の封入の標準的な方法を含む種々の周知の技術
により標識され得る)。曝露に続いて、この細胞を固定し、そしてAIM II
の結合を決定する。これらの手順をガラススライド上で都合よく実行する。For example, expression cloning may be used for this purpose. To this end, polyadenylated RNA is prepared from cells that respond to AIM II.
A cDNA library is made from this RNA. The library is divided into pools and the pools are individually transfected into cells that do not respond to AIM II. The transfected cells are then labeled A
Exposure to IM II. (AIM II can be labeled by a variety of well-known techniques, including standard methods of radioiodination or encapsulation of recognition sites for site-specific protein kinases). Following exposure, the cells are fixed and AIM II
Is determined. These procedures are conveniently performed on glass slides.
【0161】 AIM II結合細胞を産生するcDNAのプールを同定する。サブプールを
これらの陽性物から調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、そして上記のよう
にスクリーニングする。サブプールおよび再スクリーニングプロセスの反復を使
用して、推定結合分子(例えば、レセプター分子)をコードする1つ以上の単一
クローンを単離し得る。A pool of cDNAs producing AIM II binding cells is identified. Subpools are prepared from these positives, transfected into host cells, and screened as described above. Using subpools and iterations of the rescreening process, one or more single clones encoding putative binding molecules (eg, receptor molecules) can be isolated.
【0162】 あるいは、標識されたリガンドは、例えば、レセプター分子に結合する分子を
発現する細胞から調製される細胞抽出物(例えば、膜または膜抽出物)に連結し
た光親和性であり得る。架橋物質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(「PA
GE」)により分離し、そしてX線フィルムに曝露する。リガンドレセプターを
含む標識された複合体を、切り出し、ペプチドフラグメントに分解し、そしてタ
ンパク質微量配列決定に供し得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使
用し、独特のオリゴヌクレオチドプローブまたは縮重オリゴヌクレオチドプロー
ブを設計し、cDNAライブラリーをスクリーニングして、推定レセプター分子
をコードする遺伝子を同定し得る。Alternatively, the labeled ligand can be photoaffinity linked, eg, to a cell extract (eg, a membrane or a membrane extract) prepared from cells expressing a molecule that binds to the receptor molecule. The cross-linked substance was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (“PA
GE ") and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the ligand receptor can be excised, broken down into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. Using the amino acid sequences obtained from microsequencing, unique or degenerate oligonucleotide probes can be designed and cDNA libraries can be screened to identify the gene encoding the putative receptor molecule.
【0163】 本発明のポリペプチドをまた使用して、細胞または無細胞抽出物において、A
IM II結合分子(例えば、レセプター分子)のAIM II結合能力を評価
し得る。The polypeptides of the present invention can also be used in cells or cell-free extracts to produce A
The ability of an IM II binding molecule (eg, a receptor molecule) to bind AIM II can be assessed.
【0164】 免疫原性エピトープを含む例示的なアミノ酸配列の一覧を、上記の表2に示す
。表2は、JamesonおよびWolf,Comp.Appl.Biosci
.4:181−186(1988)(この参考文献は、その全体において本明細
書中に参考として援用される)のアルゴリズムを使用して、最も高い程度の抗原
性を有すると推定されるエピトープを含むアミノ酸残基のみを列挙していること
に注意のこと。Jameson−Wolf抗原性分析を、デフォルトパラメータ
を使用する、コンピュータープログラムPROTEIN(Power Maci
ntosh対応バージョン3.11,DNASTAR,Inc.,1228 S
outh Park Street Madison,WI)を使用して行った
。表2のポリペプチドおよび表2に列挙されていないポリペプチドの部分は、非
免疫原性ではないと考えられる。表2の免疫原性エピトープは模範的な一覧であ
り、完全な一覧ではない。なぜなら、他の免疫原性エピトープは、例えば、使用
した特定のアルゴリズムによって、単に、認識されないだけであるからである。
他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基は、Jameson−Wolf分析
に類似するアルゴリズムか、または当該分に公知の方法を使用して抗原性応答に
ついてインビボで試験することによって慣用的に検出され得る。例えば、Gey
senら(前出);米国特許第4,708,781号;同第5,194,392
号;同第4,433,092号;ならびに同第5,480,971号を参照のこ
と(これらの参考文献は、その全体において参考として援用される)。A list of exemplary amino acid sequences containing immunogenic epitopes is provided in Table 2 above. Table 2 shows the results of Jameson and Wolf, Comp. Appl. Biosci
. 4: 181-186 (1988), which is incorporated by reference herein in its entirety, includes epitopes that are predicted to have the highest degree of antigenicity. Note that only amino acid residues are listed. James-Wolf antigenicity analysis was performed using the computer program PROTEIN (Power Maci) using default parameters.
ntosh version 3.11, DNASTAR, Inc. , 1228 S
out Park Street Madison, Wis.). Polypeptides in Table 2 and portions of the polypeptides not listed in Table 2 are not considered non-immunogenic. The immunogenic epitopes in Table 2 are an exemplary list, not a complete list. This is because other immunogenic epitopes are simply not recognized, for example, by the particular algorithm used.
Amino acid residues comprising other immunogenic epitopes can be routinely detected by testing for antigenic responses in vivo using algorithms similar to Jameson-Wolf analysis or methods known in the art. . For example, Gey
Sen et al., supra; U.S. Pat. Nos. 4,708,781; 5,194,392.
Nos. 4,433,092; and 5,480,971 (these references are incorporated by reference in their entirety).
【0165】 特に、表2のアミノ酸配列は、免疫原性を含むことに注意のこと。表2は、J
ameson−Wolf分析により決定された、免疫原性エピトープの重要な残
基のみを列挙する。従って、N末端、C末端、またはN末端およびC末端の両方
のいずれかのさらなる隣接残基は、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生成
するために表2の配列に加えられ得る。従って、表2の免疫原性エピトープは、
N末端またはC末端のさらなるアミノ酸残基を含む。さらなる隣接アミノ酸残基
は、本発明のポリペプチド、異種ポリペプチド配列に由来の連続して隣接するN
末端配列および/またはC末端配列であり得るか、または本発明のポリペプチド
および異種ポリペプチド配列に由来の連続して隣接する配列の両方を含み得る。In particular, note that the amino acid sequences in Table 2 include immunogenicity. Table 2 shows J
List only the critical residues of the immunogenic epitope as determined by ameson-Wolf analysis. Thus, additional contiguous residues at either the N-terminus, the C-terminus, or both the N-terminus and the C-terminus may be added to the sequences in Table 2 to generate an epitope-bearing polypeptide of the invention. Thus, the immunogenic epitopes in Table 2 are:
Includes additional N-terminal or C-terminal amino acid residues. Additional contiguous amino acid residues may be consecutive adjacent N from the polypeptide of the invention, a heterologous polypeptide sequence.
It may be a terminal sequence and / or a C-terminal sequence, or may include both consecutively adjacent sequences from a polypeptide of the invention and a heterologous polypeptide sequence.
【0166】 免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、
長さが少なくとも7アミノ酸残基である。「少なくとも」は、免疫原性エピトー
プまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、長さが7アミノ酸残
基であり得るか、または7アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残基
数との間の任意の整数であり得る。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープ
を含む好ましいポリペプチドは、長さが少なくとも、10、15、20、25、
30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、または100のアミノ酸残基である。しかし、7と全長のポリペプ
チドのアミノ酸残基数との間の各整数および全ての整数が、本発明に含まれるこ
とに注意のこと。A polypeptide of the invention comprising an immunogenic or antigenic epitope comprises
It is at least 7 amino acid residues in length. "At least" means that the polypeptide of the invention comprising an immunogenic or antigenic epitope may be 7 amino acid residues in length, or 7 amino acids and the number of amino acid residues in the full length polypeptide of the invention. Can be any integer between. Preferred polypeptides comprising an immunogenic or antigenic epitope are at least 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,
90, 95, or 100 amino acid residues. Note, however, that each and every integer between 7 and the number of amino acid residues in the full length polypeptide is included in the invention.
【0167】 免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープを保有するフラグメントは、上記
に記載される連続したアミノ酸残基数のいずれかによって指定され得るか、また
は配列番号2のアミノ酸配列上のこれらのフラグメントのN末端位置およびC末
端位置によってさらに指定され得る。例えば、配列番号2のアミノ酸配列を満た
し得る、長さが少なくとも7の連続アミノ酸残基または少なくとも15の連続ア
ミノ酸残基のフラグメントのN末端位置およびC末端位置のあらゆる組み合わせ
が、本発明に含まれる。さらに、「長さが少なくとも7の連続アミノ酸残基」は
、長さが7アミノ酸残基、または7アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミ
ノ酸残基数との間の任意の整数を意味する。特に、7と全長ポリペプチドのアミ
ノ酸残基数との間の各整数および全ての整数が、本発明に含まれる。The fragments carrying the immunogenic and antigenic epitopes can be specified by any of the number of contiguous amino acid residues described above, or of these fragments on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may be further specified by an N-terminal position and a C-terminal position. For example, any combination of N- and C-terminal positions of at least 7 contiguous amino acid residues or a fragment of at least 15 contiguous amino acid residues that can satisfy the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is included in the present invention. . Further, "at least 7 consecutive amino acid residues in length" means 7 amino acid residues in length, or any integer between 7 amino acids and the number of amino acid residues of the full length polypeptide of the invention. In particular, each and every integer between 7 and the number of amino acid residues of the full-length polypeptide is included in the invention.
【0168】 本発明の免役原性エピトープおよび抗原性エピトープを保有するポリペプチド
は、例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作成し、そしてイ
ムノアッセイにおいて本発明のポリペプチドを検出するために有用である。この
抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製において有用であ
る。この抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用して、特に、本発明のポリペ
プチドについて、種々の定性的なもしくは定量的なイムノアッセイにおいて日常
的に有用であり得る。例えば、Harlowら,ANTIBODIES:A L
aboratory Manual,(Cold Spring Harbor
Laboratory Press:第2版,1988)を参照のこと。Polypeptides carrying immunogenic and antigenic epitopes of the invention can, for example, generate antibodies that specifically bind to a polypeptide of the invention and detect the polypeptide of the invention in an immunoassay. Useful for. This antibody is useful, for example, in affinity purification of the polypeptide of the present invention. The antibodies may also be routinely useful in various qualitative or quantitative immunoassays using methods known in the art, particularly for polypeptides of the present invention. See, for example, Harlow et al., ANTIBODIES: AL
laboratory Manual, (Cold Spring Harbor)
Laboratory Press: Second Edition, 1988).
【0169】 本発明の抗原保有ポリペプチドを、ポリペプチドを作成するための従来の任意
の手段(当該分野に公知の合成方法および組み換え方法を含む)により生成し得
る。例えば、エピトープ保有ペプチドを、公知の化学合成方法を使用して合成し
得る。例えば、Houghtenは、多数のペプチドの合成のための簡便な方法
を記載している。例えば、HA 1ポリペプチドのセグメントの単一アミノ酸改
変体を提示する、10〜20mgの異なる13残基を有する248の各々ペプチ
ドの全てが、4週間に満たない間に調製され、そして(ELISA型の結合研究
によって)特徴付けられた(Houghtenら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 82:5131−5135(1985))。この「同時多
数ペプチド合成(SMPS:Simultaneous Multiple P
eptide Synthesis)」過程は、Houghtenおよび共同研
究者に対する米国特許第4,631,211号(1986)において、さらに記
載される。この過程において、種々のポリペプチドの固相合成のための個々のレ
ジンは、別々の溶媒透過性パケット(solvent−permeable p
acket)中に含まれ、これは、固相方法に関わる多数の同一の反復工程の最
適な使用を可能にする。完全な手動手順は、同時に処理される500〜1000
もしくはより多くの合成を可能にする(Houghtenら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 82:5131−5135(1985)の51
34頁にて)。The antigen-bearing polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means for making polypeptides, including synthetic and recombinant methods known in the art. For example, epitope-bearing peptides can be synthesized using known chemical synthesis methods. For example, Houghten describes a convenient method for the synthesis of a large number of peptides. For example, all 10 to 20 mg of each of the 248 peptides with 13 different residues, representing a single amino acid variant of a segment of the HA1 polypeptide, were prepared in less than 4 weeks and (ELISA-type (Houghten et al., Proc. Natl. Aca).
d. Sci. ScL USA 82: 5131-5135 (1985)). This “simultaneous multiple peptide synthesis (SMPS: Simultaneous Multiple P)
The "Eptide Synthesis" process is further described in U.S. Patent No. 4,631,211 to Houghten and co-workers (1986). In this process, the individual resins for solid phase synthesis of the various polypeptides are separated into separate solvent-permeable packets.
included in the same protocol, which allows optimal use of a number of identical iterative steps involved in the solid phase method. A complete manual procedure is performed simultaneously with 500-1000
Or allow for more synthesis (Houghten et al., Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985) 51
At page 34).
【0170】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドを使用して、当該分野で周知の方法(イ
ンビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ方法を含むが、これ
らに限定されない)に従い抗体を誘導する。例えば、Sutcliffeら、前
出;Wilsonら、前出;およびBittleら、J.Gen.Virol.
66:2347−2354(1985)を参照のこと。インビボ免疫を使用する
場合、動物を遊離ペプチドで免疫し得る;しかし、抗ペプチド抗体力価を、この
ペプチドの高分子キャリア(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KL
H)または破傷風毒素)への結合により追加免疫し得る。例えば、システイン残
基を含むペプチドは、リンカー(例えば、マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキ
シサクシニミドエステル(MBS))を使用してキャリアに結合し得るが、他の
ペプチドは、より一般的な結合試薬(例えば、グルタルアルデヒド)を使用して
キャリアに結合し得る。動物(例えば、ウサギ、ラットおよびマウス)を、遊離
のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて免疫し得る(例えば
、100μgのペプチドもしくはキャリアタンパク質およびフロイトアジュバン
トを含むエマルジョンの腹腔内注射および/または皮内注射により)。数回の追
加免疫が、例えば、固相表面に結合される遊離ペプチドを使用するELISAア
ッセイにより検出され得る抗ペプチドの抗体の有用な力価を提供するために、例
えば、2週間間隔で必要とされ得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗
体の力価を、抗ペプチド抗体の選択により増大し得る(例えば、当該分野で周知
の方法に従い、固相支持体上のペプチドへの吸着、そして選択した抗体の溶出に
より)。The epitope-bearing polypeptides of the invention are used to induce antibodies according to methods well known in the art, including but not limited to in vivo immunization, in vitro immunization, and phage display methods. See, for example, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; and Bittle et al. Gen. Virol.
66: 2347-2354 (1985). When in vivo immunization is used, animals can be immunized with the free peptide; however, anti-peptide antibody titers can be determined using a polymeric carrier for this peptide, such as keyhole limpet hemocyanin (KL
H) or tetanus toxin). For example, a peptide containing a cysteine residue can be attached to a carrier using a linker (eg, maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS)), while other peptides use more common coupling reagents. (Eg, glutaraldehyde) can be used to couple to the carrier. Animals (eg, rabbits, rats, and mice) can be immunized with either free peptide or carrier-bound peptide (eg, intraperitoneal injection of an emulsion containing 100 μg of peptide or carrier protein and Freud's adjuvant and / or By intradermal injection). Several boosts are required, for example, at two week intervals, to provide useful titers of anti-peptide antibodies that can be detected, for example, by ELISA assays using the free peptide bound to the solid surface. Can be done. The titer of the anti-peptide antibody in the serum from the immunized animal can be increased by selection of the anti-peptide antibody (eg, adsorption to the peptide on a solid support, and selection according to methods well known in the art). Elution of the antibody).
【0171】 当業者が理解し、そして上記を議論した場合、免疫原性エピトープまたは抗原
性エピトープを含む本発明のポリペプチドを、イムノグロブリン(IgA,Ig
E,IgG,IgM)またはそれらの部分(CH1,CH2,CH3,ドメイン
全体およびそれらの部分の両方を含むそれらの任意の組み合わせ)に融合し得、
キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合ポリペプチドは、精製を容易にし
、そしてインビボでの半減期の増大を示す。このことは、例えば、ヒトCD4−
ポリペプチドの第1の2つのドメイン、および哺乳動物のイムノグロブリンの重
鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について
示されている。例えば、EPA0,349,827;Trauneckerら,
Nature 331:84−86(1988)を参照のこと。IgG部分に起
因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質は、他の分子に結合
し、そして中和することにおいて、単量体ポリペプチド単独もしくはそれらのフ
ラグメント単独よりもより効率的であり得る。例えば、Fountoulaki
sら,J.Biochem.270:3958−3964(1995)を参照の
こと。上記のエピトープをコードする核酸を、発現されたポリペプチドの検出お
よび精製を助けるためのエピトープタグとして、目的の遺伝子を用いて組み換え
得る。As will be appreciated by those of skill in the art and discussed above, the polypeptides of the present invention, including immunogenic or antigenic epitopes, can be purified using immunoglobulins (IgA, IgA).
E, IgG, IgM) or portions thereof (CH1, CH2, CH3, any combination thereof including both the entire domain and those portions),
A chimeric polypeptide can result. These fusion polypeptides facilitate purification and exhibit an increased half-life in vivo. This means, for example, that human CD4-
A chimeric protein consisting of the first two domains of the polypeptide and various domains of the constant regions of the heavy or light chains of a mammalian immunoglobulin is shown. For example, EPA 0, 349, 827; Traunecker et al.,
Nature 331: 84-86 (1988). Fusion proteins having a disulfide-linked dimer structure due to an IgG moiety may be more efficient at binding and neutralizing other molecules than monomeric polypeptides alone or fragments thereof alone . For example, Fontoulaki
s et al. Biochem. 270: 3958-3964 (1995). Nucleic acids encoding the above-described epitopes can be recombined with the gene of interest as an epitope tag to aid in the detection and purification of the expressed polypeptide.
【0172】 本発明者らは、AIM IIが、脾臓、胸腺および骨髄組織において発現され
ることを発見した。多くの障害(例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリ
ア、HIVウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶、骨吸収、慢性関節リウマチお
よび悪液質)について、「標準的な」AIM II遺伝子発現レベル(すなわち
、障害を有さない個体由来の組織または体液中のAIM II発現レベル)に対
して有意により高いまたはより低いレベルのAIM II遺伝子発現が、このよ
うな障害を有する個体から採取された特定の組織(例えば、脾臓組織、胸腺組織
および骨髄組織)または体液(例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液)にお
いて検出され得ることが考えられる。従って、本発明は、障害の診断の間に有用
な診断方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する:(a)個々の細胞
または体液におけるAIM II遺伝子発現レベルをアッセイする工程;(b)
このAIM II遺伝子発現レベルと標準的なAIM II遺伝子発現レベルと
を比較する工程であって、これにより、アッセイしたAIM II遺伝子発現レ
ベルの標準的な発現レベルとの比較における増大または減少が、障害の指標とな
る工程。The present inventors have discovered that AIM II is expressed in spleen, thymus and bone marrow tissues. For many disorders (eg, septic shock, inflammation, cerebral malaria, activation of HIV virus, graft-host rejection, bone resorption, rheumatoid arthritis and cachexia), "standard" AIM II gene expression levels (Ie, AIM II expression levels in tissues or fluids from individuals without the disorder) significantly higher or lower levels of AIM II gene expression are identified from individuals with such disorders. It is contemplated that it may be detected in tissues (eg, spleen, thymus and bone marrow) or body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid, or cerebrospinal fluid). Thus, the present invention provides a useful diagnostic method during the diagnosis of a disorder. The method includes the following steps: (a) assaying AIM II gene expression levels in individual cells or body fluids; (b)
Comparing the AIM II gene expression level to a standard AIM II gene expression level, whereby an increase or decrease in the assayed AIM II gene expression level relative to the standard expression level is impaired. Process that is an indicator of
【0173】 (セルソーティング) 本発明はまた、細胞が、本発明のAIM IIポリペプチドまたはAIM I
Iポリペプチドに対して特異性を有する抗体のいずれかに結合するか否かに基づ
いて、これらの細胞を亜集団に分離するための方法に関する。これらの分離方法
は、一般に、細胞がAIM IIポリペプチドに結合する表面レセプターを発現
するか、または細胞表面上にAIM IIポリペプチドを有するかのいずれかの
原理に基づく。次いで、このような細胞をこれらのポリペプチドもしくは抗体に
結合しない集団中の他の細胞から分離し得る。「セルソーティング」として一般
に公知の細胞を分離するための方法は、当該分野で公知であり、そしてCran
e、米国特許第5,489,506号において議論される。(Cell Sorting) The present invention also provides that the cell comprises the AIM II polypeptide or AIM I of the present invention.
A method for separating these cells into subpopulations based on whether they bind to any of the antibodies that have specificity for the I polypeptide. These separation methods are generally based on the principle that either the cells express a surface receptor that binds to the AIM II polypeptide or have the AIM II polypeptide on the cell surface. Such cells can then be separated from other cells in the population that do not bind these polypeptides or antibodies. Methods for separating cells, commonly known as "cell sorting," are known in the art and
e, discussed in US Pat. No. 5,489,506.
【0174】 従って、1つの局面において、本発明は、AIM IIポリペプチドまたはA
IM IIポリペプチドに対して特異性を有する抗体のいずれかに結合する細胞
を分離するための方法を提供する。この方法は、細胞の集団を、AIM IIポ
リペプチドまたはAIM IIポリペプチドに対して特異性を有する抗体のいず
れかに接触させる工程であって、ここでAIM IIポリペプチドまたは抗体が
、検出可能な標識で標識されている工程、ならびにAIM IIポリペプチドま
たは抗AIM IIポリペプチド抗体のいずれかに結合する細胞をこれらの分子
に結合しない細胞から分離する工程を包含する。AIM IIポリペプチドに結
合する細胞は、リンホトキシンβレセプター(LT−β−R)、TR2、CD2
7、およびTRANKを発現する細胞を含むと考えられる。Thus, in one aspect, the invention relates to AIM II polypeptides or AIM II polypeptides.
Methods are provided for isolating cells that bind to any of the antibodies having specificity for an IM II polypeptide. The method comprises contacting a population of cells with either an AIM II polypeptide or an antibody having specificity for the AIM II polypeptide, wherein the AIM II polypeptide or antibody is detectable. Labeling, and separating cells that bind to either the AIM II polypeptide or the anti-AIM II polypeptide antibody from cells that do not bind to these molecules. Cells that bind to AIM II polypeptide include lymphotoxin β receptor (LT-β-R), TR2, CD2
7, and cells expressing TRANK.
【0175】 (AIM IIアゴニストおよびアンタゴニスト) 本発明はまた、細胞に対するAIM IIの作用(例えば、レセプター分子の
ようなAIM II結合分子との相互作用)を増強またはブロックする化合物を
同定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、A
IM IIの本来の生物学的機能を増加させる化合物であるか、またはAIM
IIと類似の様式において機能する化合物である。一方、アンタゴニストはその
ような機能を減少または排除する。AIM II Agonists and Antagonists The present invention also provides compounds for identifying compounds that enhance or block the action of AIM II on cells (eg, interaction with AIM II binding molecules such as receptor molecules). To provide a method for screening. The agonist is A
A compound that increases the intrinsic biological function of IM II, or AIM
Compounds that function in a manner similar to II. Antagonists, on the other hand, reduce or eliminate such functions.
【0176】 例えば、細胞区画(例えば、膜の調製物)は、AIM IIに結合する分子(
例えば、AIM IIによって調節されるシグナル経路または調節経路の分子)
を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、AIM IIアゴニストもし
くはAIM IIアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下で
、標識されたAIM IIと共に培養される。候補分子の、結合分子またはAI
M II自身に結合する能力は、標識されたリガンド結合の減少に反映される。
無償で(gratuitously)結合する分子、すなわち、AIM II結
合分子に結合する場合にAIM IIの効果を誘導することを伴わない分子は、
優良なアンタゴニストである可能性が最も高い。うまく結合し、そしてAIM
IIと同じようなまたは密接に関連した効果を誘発する分子は、優良なアゴニス
トである。For example, a cell compartment (eg, a membrane preparation) may contain a molecule that binds to AIM II (eg,
For example, signaling or regulatory pathway molecules regulated by AIM II)
Can be prepared from cells expressing The preparation is cultured with labeled AIM II in the absence or presence of a candidate molecule, which can be an AIM II agonist or an AIM II antagonist. Binding molecule or AI of the candidate molecule
The ability to bind to MII itself is reflected in reduced labeled ligand binding.
A molecule that binds gratuitously, that is, a molecule that does not induce the effect of AIM II when bound to an AIM II binding molecule,
Most likely to be a good antagonist. Well combined, and AIM
Molecules that elicit effects similar or closely related to II are good agonists.
【0177】 潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのAIM II様の効果は、例えば、
細胞または適切な細胞調製物との候補分子の相互作用に続くセカンドメッセンジ
ャー系の活性を決定することにより、およびその効果をAIM IIの効果もし
くはAIM IIと同じような効果を誘発する分子の効果と比較することにより
測定され得る。これに関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系としては
、AMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分
解セカンドメッセンジャー系が挙げられるがこれらに限定されない。The AIM II-like effects of potential agonists and antagonists include, for example,
By determining the activity of a second messenger system following the interaction of a candidate molecule with a cell or appropriate cell preparation, and by comparing the effect of AIM II or a molecule that elicits an effect similar to AIM II with the effect of AIM II It can be measured by comparing. Second messenger systems that may be useful in this regard include, but are not limited to, AMP guanylate cyclase, ion channel or phosphoinositide hydrolyzing second messenger systems.
【0178】 AIM IIアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合アッセイで
ある。このアッセイは、競合的阻害アッセイのための適切な条件下で、AIM
IIおよび潜在的アンタゴニストを、膜結合AIM IIレセプター分子または
組換えAIM IIレセプター分子と組み合わせる。AIM IIは、例えば、
放射性標識によって標識され得、その結果、レセプター分子に結合したAIM
II分子の数が、潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために正確に決定さ
れ得る。[0178] Another example of an assay for AIM II antagonists is a competition assay. This assay, under the appropriate conditions for a competitive inhibition assay,
II and a potential antagonist are combined with a membrane-bound AIM II receptor molecule or a recombinant AIM II receptor molecule. AIM II, for example,
AIM that can be labeled by a radioactive label so that it binds to the receptor molecule
The number of II molecules can be accurately determined to assess the efficacy of a potential antagonist.
【0179】 潜在的アンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれ
によってその活性を阻害または無効にする有機低分子、ペプチド、ポリペプチド
および抗体が挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた、AIM II誘導性活
性を誘導することなく、結合分子(例えば、レセプター分子)上の同じ部位に結
合し、それによって結合からAIM IIを除外することによりAIM IIの
作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のような有機低分子、ペプ
チド、ポリペプチドであり得る。本発明のアンタゴニストは、配列番号2に示さ
れるアミノ酸配列を有するAIM IIポリペプチドのフラグメントを含む。[0179] Potential antagonists include small organic molecules, peptides, polypeptides and antibodies that bind to a polypeptide of the invention and thereby inhibit or abolish its activity. Potential antagonists also prevent the action of AIM II by binding to the same site on the binding molecule (eg, a receptor molecule) without inducing AIM II-induced activity, thereby excluding AIM II from binding. Can be small organic molecules, peptides, polypeptides, such as closely related proteins or antibodies. Antagonists of the present invention include fragments of the AIM II polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
【0180】 他の潜在的アンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチ
センス技術は、アンチセンスDNAもしくはRNAを通して、または三重鎖ヘリ
ックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技
術は、例えば、Okano、J.Neurochem.56:560(1991
);Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression、CRC P
ress、Boca Rotan、FL(1988)において議論される。三重
鎖ヘリックス形成は、例えば、Leeら、Nucleic Acids Res
earch 6:3073(1979);Cooneyら、Science 2
41:456(1988);およびDervanら、Science 251:
1360(1991)において議論される。この方法は、相補的DNAまたはR
NAへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドの5’コード部分は、長さが約10〜40塩基対
のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。DN
Aオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設
計され、それによってAIM IIの転写および産生を妨げる。アンチセンスR
NAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてm
RNA分子のAIM IIポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記されるオ
リゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスRNAまた
はDNAは、AIM IIの産生を阻害するようにインビボで発現され得る。[0180] Other potential antagonists include antisense molecules. Antisense technology can be used to control gene expression through antisense DNA or RNA or through triple helix formation. Antisense technology is described, for example, in Okano, J. et al. Neurochem. 56: 560 (1991)
); Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRCP
res, Boca Rotan, FL (1988). Triple helix formation is described, for example, by Lee et al., Nucleic Acids Res.
earch 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 2.
41: 456 (1988); and Dervan et al., Science 251:
1360 (1991). This method uses complementary DNA or R
Based on binding of polynucleotide to NA. For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the present invention can be used to design antisense RNA oligonucleotides of about 10-40 base pairs in length. DN
The A oligonucleotide is designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription, thereby preventing AIM II transcription and production. Antisense R
The NA oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and
Blocks translation of the RNA molecule into AIM II polypeptide. The oligonucleotides described above can also be delivered to cells so that the antisense RNA or DNA can be expressed in vivo to inhibit the production of AIM II.
【0181】 このアンタゴニストは、例えば、本明細書中で後記されるように、薬学的に受
容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。The antagonist may be used, for example, in a composition with a pharmaceutically acceptable carrier, as described later herein.
【0182】 このアンタゴニストは、例えば、悪液質(これは、リポプロテインリパーゼの
全身性欠損から生じる脂質清澄化欠損であり、これはAIM IIにより抑制さ
れると考えられている)を処置するために使用され得る。AIM IIアンタゴ
ニストはまた、AIM IIが病原性の役割を担い得る大脳マラリアを処置する
ために使用され得る。This antagonist may be used, for example, to treat cachexia, which is a lipid clarification deficiency resulting from a systemic deficiency of lipoprotein lipase, which is believed to be suppressed by AIM II. Can be used for AIM II antagonists can also be used to treat cerebral malaria where AIM II may play a pathogenic role.
【0183】 AIM IIアンタゴニストはまた、移植片の存在下での免疫系の刺激を妨げ
ることによって、移植片−宿主拒絶を予防するために使用され得る。AIM II antagonists can also be used to prevent graft-host rejection by preventing stimulation of the immune system in the presence of the graft.
【0184】 AIM IIアンタゴニストはまた、骨吸収を阻害するために使用され得、そ
れによって、骨粗しょう症を処置および/または予防するために使用され得る。AIM II antagonists can also be used to inhibit bone resorption, and thereby to treat and / or prevent osteoporosis.
【0185】 このアンタゴニストはまた、抗炎症剤として使用され得、そして内毒素ショッ
クを処置するために使用され得る。この危険状態は、細菌および他の感染のタイ
プに対する過剰応答から生じる。[0185] The antagonists can also be used as anti-inflammatory agents and can be used to treat endotoxin shock. This risk situation results from an over-response to bacteria and other types of infection.
【0186】 上記したように、本発明のアンタゴニストおよびアゴニストは、AIM II
ペプチドを含む。これらのポリペプチドは、例えば、細胞タンパク質(例えば、
レセプター)に結合することによりそれらの効果を調節し得る。特定のタンパク
質と相互作用するペプチドを同定するための方法は、当該分野で公知である。例
えば、PhizickyおよびFields「Protein−Protein
interactions:methods for detection
and analysis」Microbiol.Rev.59:94−123
(1995)は、第2のタンパク質に対して結合親和性を有するペプチドを同定
するために、このペプチドをスクリーニングするための方法を記載する。Phi
zickyおよびFieldsは、タンパク質のアフィニティークロマトグラフ
ィー、アフィニティーブロッティング、同時免疫沈降、および交差結合のような
方法を議論する。本発明での使用に適した、分子生物学的なさらなる方法として
は、発現ライブラリーのタンパク質プロービング、ツーハイブリッド系、細胞パ
ニング、およびファージディスプレイが挙げられる。As mentioned above, the antagonists and agonists of the present invention may comprise AIM II
Including peptides. These polypeptides include, for example, cellular proteins (eg,
Receptor) to modulate their effects. Methods for identifying peptides that interact with a particular protein are known in the art. See, for example, Physicky and Fields "Protein-Protein.
interactions: methods for detection
and analysis "Microbiol. Rev .. 59: 94-123
(1995) describe a method for screening a peptide to identify a peptide having binding affinity for a second protein. Phi
Zicky and Fields discuss methods such as affinity chromatography, affinity blotting, co-immunoprecipitation, and cross-linking of proteins. Additional molecular biology methods suitable for use in the present invention include protein probing of expression libraries, two-hybrid systems, cell panning, and phage display.
【0187】 細胞表面レセプターに結合する、本発明のAIM IIポリペプチドを同定す
るための別の方法は、真核生物細胞を、このレセプターをコードするDNAを用
いてトランスフェクトする工程であって、その結果、この細胞はその細胞表面上
にレセプターを発現する工程、次いで、この細胞を標識(例えば、放射性標識、
ビオチンなど)されたAIM IIポリペプチドと接触する工程を包含する。細
胞に結合した標識されたAIM IIポリペプチドの量を測定して、コントロー
ル細胞に結合した標識されたAIM IIポリペプチドの量と比較する。このコ
ントロール細胞は、一般的に、この表面レセプターを発現しない細胞である。コ
ントロール細胞と比較して、このレセプターを発現する細胞に結合した標識の量
の増大は、このレセプターを発現する細胞が標識されたAIM IIポリペプチ
ドに結合することを示す。Another method for identifying an AIM II polypeptide of the invention that binds to a cell surface receptor is the step of transfecting a eukaryotic cell with DNA encoding the receptor. As a result, the cells express the receptor on their cell surface, and then label the cells (eg, radioactive labels,
Contacting AIM II polypeptide (e.g., biotin). The amount of labeled AIM II polypeptide bound to the cells is measured and compared to the amount of labeled AIM II polypeptide bound to control cells. The control cells are generally cells that do not express the surface receptor. An increase in the amount of label bound to cells expressing the receptor as compared to control cells indicates that cells expressing the receptor bind to the labeled AIM II polypeptide.
【0188】 さらに、当業者が認識するように、AIMIIポリペプチドを発現かつ保持す
る細胞を使用して、AIM IIリガンドを同定し得る。1つのこのような実施
態様において、AIM IIを発現する細胞は、検出可能に標識された潜在的な
リガンドと接触される。さらに、このようなリガンドは、ファージの表面上の配
列のライブラリーの一部として発現される(例えば、ファージディスプレイライ
ブラリー)ポリペプチドであり得る。In addition, as one of skill in the art would recognize, cells expressing and retaining AIMII polypeptides can be used to identify AIM II ligands. In one such embodiment, a cell expressing AIM II is contacted with a detectably labeled potential ligand. Further, such a ligand can be a polypeptide expressed as part of a library of sequences on the surface of a phage (eg, a phage display library).
【0189】 一旦、目的の細胞表面レセプターに結合するAIM IIポリペプチドが同定
されると、アッセイを行って、AIM IIポリペプチドが、通常は、特定のレ
セプターによって惹起されるレセプター媒介細胞応答を誘導するか、または阻害
するかが決定され得る。AIM IIポリペプチドがレセプター媒介細胞応答を
活性化するか否かは、AIM IIポリペプチドもしくは別のリガンドの存在下
でレセプターにより惹起されることが公知の細胞応答を測定することによって決
定され得る。さらに、AIM IIポリペプチドが、レセプター媒介細胞応答を
阻害するか否かは、細胞応答およびAIM IIポリペプチドを誘導することが
公知である両方の分子の存在下でレセプターにより惹起されることが公知の細胞
応答を測定することによって決定され得る。[0189] Once an AIM II polypeptide that binds to a cell surface receptor of interest has been identified, an assay is performed to allow the AIM II polypeptide to induce a receptor-mediated cellular response, usually elicited by a particular receptor. To do or inhibit. Whether an AIM II polypeptide activates a receptor-mediated cellular response can be determined by measuring a cellular response known to be elicited by the receptor in the presence of the AIM II polypeptide or another ligand. Furthermore, whether an AIM II polypeptide inhibits a receptor-mediated cellular response is known to be triggered by the receptor in the presence of both molecules that are known to induce a cellular response and the AIM II polypeptide. Can be determined by measuring the cellular response of
【0190】 例えば、本発明のポリペプチドの可溶性形態(例えば、配列番号2のアミノ酸
83〜240を含むAIMポリペプチド)は、上記のリガンド結合アッセイおよ
びレセプター活性化/阻害アッセイにおいて利用され得る。For example, soluble forms of the polypeptides of the invention (eg, an AIM polypeptide comprising amino acids 83-240 of SEQ ID NO: 2) can be utilized in the ligand binding assays and receptor activation / inhibition assays described above.
【0191】 (癌の予後) 癌を有する哺乳動物の特定の組織は、対応する「標準的」哺乳動物(すなわち
癌を有さない同じ種の哺乳動物)と比較される場合に、AIM IIタンパク質
およびAIM IIタンパク質をコードするmRNAの有意に低減されたレベル
を発現することが考えられている。さらに、AIM IIタンパク質の低減され
たレベルは、癌を有さない同じ種の哺乳動物由来の血清と比較される場合に、癌
を有する哺乳動物由来の特定の体液(例えば、血清、血漿、尿、および髄液)に
おいて検出され得る。従って、本発明は、腫瘍診断の間に有用な診断方法を提供
する。この方法は、哺乳動物細胞または体液におけるAIM IIタンパク質を
コードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工程、および標準のAIM II
遺伝子発現レベルとその遺伝子の発現レベルを比較する工程を包含し、それによ
って標準を超えた遺伝子発現レベルにおける減少が、特定の腫瘍の指標である。Cancer Prognosis Certain tissues of mammals with cancer have the AIM II protein when compared to the corresponding “standard” mammal (ie, a mammal of the same species without cancer). And expressing significantly reduced levels of mRNA encoding the AIM II protein. In addition, reduced levels of AIM II protein may be indicative of a specific body fluid (eg, serum, plasma, urine) from a mammal with cancer when compared to serum from a mammal of the same species without cancer. , And cerebrospinal fluid). Thus, the present invention provides a useful diagnostic method during tumor diagnosis. The method comprises assaying the expression level of a gene encoding an AIM II protein in a mammalian cell or body fluid, and a standard AIM II
Comparing the level of gene expression to the level of expression of the gene, whereby a decrease in gene expression levels above the norm is indicative of a particular tumor.
【0192】 従来の方法に従ってすでに腫瘍診断がなされている場合、本発明は予後指示薬
として有用であり、それによって、増強されたAIM II遺伝子発現を示す患
者は、低レベルでこの遺伝子を発現する患者と比較してより良い臨床結果を経験
し得る。The present invention is useful as a prognostic indicator if the tumor has already been diagnosed according to conventional methods, whereby patients exhibiting enhanced AIM II gene expression will be expressed in patients expressing low levels of this gene You may experience better clinical results as compared to.
【0193】 「AIM IIタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイするこ
と」によって、第1の生物学的サンプルにおいて、直接的(例えば、絶対的なタ
ンパク質レベルもしくはmRNAレベルを決定または推定することにより)また
は相対的(例えば、第2の生物学的サンプルにおけるAIM IIタンパク質レ
ベルまたはmRNAレベルと比較することにより)のいずれかで、AIM II
タンパク質のレベルもしくはAIM IIタンパク質をコードするmRNAのレ
ベルを定性的または定量的に測定あるいは推定することが意図される。[0193] By "assaying the expression level of the gene encoding the AIM II protein", the first biological sample can be directly (eg, by determining or estimating absolute protein or mRNA levels). ) Or relative (eg, by comparing to AIM II protein or mRNA levels in a second biological sample).
It is intended to measure or estimate qualitatively or quantitatively the level of the protein or the level of the mRNA encoding the AIM II protein.
【0194】 好ましくは、第1の生物学的サンプルにおけるAIM IIタンパク質レベル
またはmRNAレベルが測定または推定され、そして標準のAIM IIタンパ
ク質レベルもしくはmRNAレベル(癌を有さない個体から得られた第2の生物
学的サンプルから取得される標準)と比較される。当該分野において理解される
ように、いったん標準のAIM IIタンパク質レベルまたはmRNAレベルが
既知になると、それは比較のための標準として繰り返し使用され得る。Preferably, the level of AIM II protein or mRNA in the first biological sample is measured or estimated, and the level of standard AIM II protein or mRNA (secondary level obtained from an individual without cancer) is determined. Standards obtained from biological samples of As will be appreciated in the art, once the standard AIM II protein or mRNA level is known, it can be used repeatedly as a standard for comparison.
【0195】 「生物学的サンプル」によって、AIM IIタンパク質もしくはmRNAを
含む個体、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られる任意の生物学的
サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、分泌成熟AIM IIタン
パク質を含む哺乳動物の体液(例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液)、な
らびに卵巣組織、前立腺組織、心臓組織、胎盤組織、膵臓組織、肝臓組織、脾臓
組織、肺組織、***組織、および臍帯組織が挙げられる。By "biological sample" is intended any biological sample obtained from an individual, cell line, tissue culture, or other source that contains AIM II protein or mRNA. Biological samples include mammalian body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid and cerebrospinal fluid) containing secreted mature AIM II protein, as well as ovarian, prostate, heart, placental, pancreatic, Includes liver tissue, spleen tissue, lung tissue, breast tissue, and umbilical cord tissue.
【0196】 本発明は、哺乳動物における癌を検出するために有用である。特に、本発明は
、哺乳動物における以下のタイプの癌の診断の間に有用である:***、卵巣、前
立腺、骨、肝臓、肺、膵臓、および脾臓の癌。好ましい哺乳動物としては、サル
(monkey)、類人猿(ape)、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ
、およびヒトが挙げられる。特に好ましいのはヒトである。The present invention is useful for detecting cancer in a mammal. In particular, the present invention is useful during the diagnosis of the following types of cancer in mammals: breast, ovary, prostate, bone, liver, lung, pancreas, and spleen. Preferred mammals include monkeys, apes, cats, dogs, cows, pigs, horses, rabbits, and humans. Particularly preferred are humans.
【0197】 総細胞RNAは、ChomezynskiおよびSacchi、Anal.B
iochem.162:156−159(1987)に記載される一段階のグア
ニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法を使用して、生物学的
サンプルから単離され得る。次いで、AIM IIタンパク質をコードするmR
NAのレベルを、任意の適切な方法を使用してアッセイする。この適切なアッセ
イとしては、ノーザンブロット分析(Haradaら、Cell 63:303
−312(1990))、S1ヌクレアーゼマッピング(Fujitaら、Ce
ll 49:357−367(1987))、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
、ポリメラーゼ連鎖反応との組み合わせにおける逆転写(RT−PCR)(Ma
kinoら、Technique 2:295−301(1990)、およびリ
ガーゼ連鎖反応との組み合わせにおける逆転写(RT−LCR)が挙げられる。[0197] Total cellular RNA was obtained from Homezynski and Sacchi, Anal. B
iochem. 162: 156-159 (1987) can be isolated from biological samples using the one-step guanidine-thiocyanate-phenol-chloroform method. The mR encoding the AIM II protein is then
The level of NA is assayed using any suitable method. Suitable assays include Northern blot analysis (Harada et al., Cell 63: 303).
-312 (1990)), S1 nuclease mapping (Fujita et al., Ce)
11 49: 357-367 (1987)), polymerase chain reaction (PCR).
, Reverse transcription (RT-PCR) in combination with the polymerase chain reaction (Ma
Kino et al., Technique 2: 295-301 (1990), and reverse transcription (RT-LCR) in combination with a ligase chain reaction.
【0198】 生物学的サンプルにおいてAIM IIタンパク質レベルをアッセイすること
は、抗体に基づく技術の使用を生じ得る。例えば、組織におけるAIM IIタ
ンパク質発現は、伝統的な免疫組織学的な方法(Jalkanen,M.ら、J
.Cell.Biol.101:976−985(1985);Jalkane
n,M.ら、J.Cell.Biol.105:3087−3096(1987
))を用いて研究され得る。Assaying AIM II protein levels in a biological sample can result in the use of antibody-based techniques. For example, AIM II protein expression in tissues has been described by traditional immunohistological methods (Jalkanen, M. et al., J. Am.
. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkane.
n, M. J. et al. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987).
)).
【0199】 AIM IIタンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体に基づ
く方法としては、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)および放射免
疫アッセイ(RIA)のような免疫アッセイが挙げられる。Other antibody-based methods useful for detecting AIM II protein gene expression include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and radioimmunoassays (RIAs).
【0200】 適切な標識は当該分野において公知であり、そしてグルコースオキシダーゼの
ような酵素標識、そしてヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)
、トリチウム(3H)、インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc) のような放射性同位体、そしてフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標
識、そしてビオチンを含む。Suitable labels are known in the art, and enzyme labels such as glucose oxidase, and iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S)
, Including tritium (3 H), indium (112 an In), and radioactive isotopes such as technetium (99m Tc), and fluorescent labels such as fluorescein and rhodamine, and biotin.
【0201】 (治療剤) AIM IIポリペプチド、特にヒトAIM IIポリペプチドの使用は、ウ
イルス性肝炎、ヘルペスウイルス感染、アレルギー性反応、成人呼吸促進症候群
、新形成、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎(alle
rgen rhinitis)、薬物アレルギー(例えば、ペニシリン、セファ
ロスポリンに対して)、原発性中枢神経系リンパ腫(PCNSL)、慢性リンパ
性白血病(CLL)、リンパ節症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、慢性関節
リウマチ、変形性関節症、グレーヴズ病、急性リンパ性白血病(ALL)、非ホ
ジキンリンパ腫(NHL)、眼障害、尿素性網膜炎(uveoretiniti
s)、自己免疫相のI型糖尿病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝臓障
害(autoimmune hepatological disorder)
、自己免疫炎症性腸疾患、およびクローン病の処置が挙げられるが、これらに限
定されない。さらに、本発明のAIM IIポリペプチドは、腫瘍細胞増殖のよ
うな新形成を阻害するために使用され得る。AIM IIタンパク質の、IL−
2またはIL−12のような免疫治療剤との組み合わせは、確立した癌の処置の
ために非常に有用である、相乗効果または付加的効果を生じ得る。AIM II
ポリペプチドはまた、腫瘍治療に有効であり得るAIM IIはまた、増殖促進
活性を必要とする疾患(例えば、再狭窄)を処置するために使用され得る。なぜ
なら、AIM IIは、内皮由来の細胞に対する増殖効果を有するからである。
従って、AIM IIはまた、内皮細胞発達における造血を調節するために使用
され得る。Therapeutic Agents The use of AIM II polypeptides, especially human AIM II polypeptides, may be associated with viral hepatitis, herpes virus infection, allergic reactions, adult respiratory distress syndrome, neoplasia, anaphylaxis, allergic asthma, allergic Rhinitis (alle
rgen rhinitis), drug allergy (eg, to penicillin, cephalosporin), primary central nervous system lymphoma (PCNSL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), lymphadenopathy, autoimmune disease, graft versus host Disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, Graves' disease, acute lymphocytic leukemia (ALL), non-Hodgkin's lymphoma (NHL), ocular disorders, urea retinitis
s), autoimmune phase I diabetes, myasthenia gravis, glomerulonephritis, autoimmune hepatologic disorder
, Autoimmune inflammatory bowel disease, and treatment of Crohn's disease. In addition, AIM II polypeptides of the present invention can be used to inhibit neoplasia, such as tumor cell growth. AIM II protein, IL-
Combination with immunotherapeutic agents such as 2 or IL-12 can produce synergistic or additive effects that are very useful for the treatment of established cancers. AIM II
The polypeptide may also be effective in treating tumors. AIM II may also be used to treat diseases that require growth promoting activity, such as restenosis. This is because AIM II has a proliferative effect on endothelium-derived cells.
Thus, AIM II can also be used to regulate hematopoiesis in endothelial cell development.
【0202】 本発明のAIM IIポリペプチドはまた、T細胞およびB細胞の分化および
増殖を阻害するために使用され得る。T細胞およびB細胞の活性化、分化および
/または増殖のAIM IIによって誘導された阻害は、多くの免疫に基づく疾
患を治療するために使用され得る。それらのうちのいくつかは、上記に参照され
ている。さらに、使用される特定のAIM IIポリペプチドに依存して、本発
明のAIM IIポリペプチドはまた、T細胞およびB細胞の活性化、分化およ
び/または増殖を刺激するために使用され得る。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used to inhibit T cell and B cell differentiation and proliferation. AIM II-induced inhibition of T cell and B cell activation, differentiation and / or proliferation can be used to treat many immune-based diseases. Some of them have been referenced above. Further, depending on the particular AIM II polypeptide used, the AIM II polypeptides of the present invention can also be used to stimulate T cell and B cell activation, differentiation and / or proliferation.
【0203】 AIM IIは、サイトカインアジュバントまたは同時刺激性分子として作用
し得る。以下の実験を行って、宿主免疫系に対するインビボでのAIM IIタ
ンパク質を評価する。AIM II can act as a cytokine adjuvant or costimulatory molecule. The following experiment is performed to evaluate AIM II protein in vivo against the host immune system.
【0204】 腫瘍抗原またはスーパー抗原で免疫する前または後に、腫瘍保有マウスまたは
腫瘍を保有していないマウスを、3つの異なる用量(0.1mg/kg、1mg
/kg、および10mg/kg、腹腔内、QD、10〜14日、1群あたりN=
5)のAIM IIタンパク質で処置し、処置後毎週、血液採取の後にマウスを
屠殺する。脾臓またはリンパ節を、当業者に周知の、以下のインビトロ分析のた
めに使用する: FACS分析:T細胞、B細胞、NK細胞、単球、樹状細胞、同時刺激性分子、
および接着分子についての表面マーカーの発現。 サイトカイン産生アッセイ。 T細胞増殖または細胞傷害性アッセイ。Before or after immunization with tumor or superantigen, tumor-bearing or non-tumor-bearing mice are treated at three different doses (0.1 mg / kg, 1 mg
/ Kg, and 10 mg / kg, intraperitoneal, QD, 10-14 days, N =
5) Treat with AIM II protein and kill mice after blood collection weekly after treatment. The spleen or lymph nodes are used for the following in vitro assays, well known to those skilled in the art: FACS analysis: T cells, B cells, NK cells, monocytes, dendritic cells, costimulatory molecules,
And expression of surface markers for adhesion molecules. Cytokine production assay. T cell proliferation or cytotoxicity assay.
【0205】 AIM IIタンパク質および腫瘍抗原は、防御免疫の誘導を生じ得、これは
、その後の腫瘍チャレンジからマウスを防御することを導き得る。可能性を試験
するために、同系C57BL/6マウスを用いて以下の実験を行い、腫瘍または
Ag特異的防御免疫の誘導に対するAIM IIの効果を試験し得る。AIM II protein and tumor antigens can result in the induction of protective immunity, which can lead to protecting mice from subsequent tumor challenge. To test the potential, the following experiment can be performed using syngeneic C57BL / 6 mice to test the effect of AIM II on the induction of tumor or Ag-specific protective immunity.
【0206】 AIM IIタンパク質で処理したMC−38無腫瘍マウスを、当業者に周知
の技術を使用して、MC−38または無関係のマウス肉腫MCA−102でチャ
レンジする。3つの可能性のある結果が、観察され得る:MC-38 tumor-free mice treated with AIM II protein are challenged with MC-38 or an irrelevant mouse sarcoma MCA-102 using techniques well known to those skilled in the art. Three possible outcomes can be observed:
【0207】[0207]
【化9】 AIM II処置の際の腫瘍特異的な防御免疫の発生が実証される場合、以下
の枯渇実験を行い、どの白血球部分集団が、腫瘍拒絶を担うかを同定する。当業
者に周知の技術を用いて、マウスを、CD4+T細胞もしくはCD8+T細胞、
またはNK細胞もしくは顆粒球(Grl+)、またはIFNγのような特定のサ
イトカインのいずれかを認識する種々のmAbで処置する。これらの抗体処置マ
ウスにおける腫瘍増殖を測定する。Embedded image If the development of tumor-specific protective immunity upon AIM II treatment is demonstrated, the following depletion experiments will be performed to identify which leukocyte subpopulation is responsible for tumor rejection. Using techniques well known to those skilled in the art, mice can be transformed into CD4 + or CD8 + T cells,
Or treated with various mAbs that recognize either NK cells or granulocytes (Grl +), or specific cytokines such as IFNγ. The tumor growth in these antibody-treated mice is measured.
【0208】 AIM IIはまた、慢性関節リウマチ(RA)においてしばしば観察される
ように、新脈管形成の増加または骨および軟骨おける侵襲性のパンヌスを維持す
るために必要な内皮細胞増殖の増加を阻害することによってRAを処置するため
に使用され得る。内皮細胞増殖は、変形性関節症(OA)の患者または非罹患患
者と比較した場合、RA患者の滑液で増加する。新脈管形成は、骨および軟骨へ
の侵襲性のパンヌスの質量増加を維持するために必要とされる。新脈管形成の阻
害は、動物モデルにおける初期および慢性関節リウマチの両方の重篤度が有意に
低下することと関連する。AIM II also increases the angiogenesis or endothelial cell proliferation required to maintain invasive pannus in bone and cartilage, as often observed in rheumatoid arthritis (RA). Can be used to treat RA by inhibiting. Endothelial cell proliferation is increased in synovial fluid of RA patients when compared to osteoarthritis (OA) patients or unaffected patients. Angiogenesis is required to maintain invasive pannus mass gains on bone and cartilage. Inhibition of angiogenesis is associated with a significantly reduced severity of both early and rheumatoid arthritis in animal models.
【0209】 AIM IIポリペプチドは、多くのタンパク質(いくつかのヒト細胞レセプ
ターを含む)についての結合活性を有すると考えられている。これらのレセプタ
ーとしては、リンホトキシン−β−レセプター(LT−β−R)、TR2(ヘル
ペスウイルス初期メディエータ(HVEM)およびATARともいわれる)、C
D27、およびTRANK(核因子κBのレセプター活性化因子(RANK)と
もいわれる)が挙げられる。AIM II polypeptides are believed to have binding activity for a number of proteins, including some human cell receptors. These receptors include lymphotoxin-β-receptor (LT-β-R), TR2 (also called herpesvirus early mediator (HVEM) and ATAR), C
D27, and TRANK (also called receptor activator of nuclear factor κB (RANK)).
【0210】 直前に挙げられたレセプターの各々は、本発明のAIM IIポリペプチドに
よって調節され得る種々の生理学的プロセスに関与する。より詳細には、本発明
のポリペプチドを使用して、AIM II結合活性を有する細胞レセプター(例
えば、LT−βR、TR2、CD27、およびTRANK)に結合するリガンド
の作用を刺激またはブロックし得る。[0210] Each of the receptors just listed is involved in a variety of physiological processes that can be modulated by the AIM II polypeptides of the present invention. More specifically, the polypeptides of the invention can be used to stimulate or block the effects of ligands that bind to cellular receptors with AIM II binding activity (eg, LT-βR, TR2, CD27, and TRANK).
【0211】 LT−β−Rに結合するLT−βは、2次リンパ組織の発生および成体におけ
る組織化されたリンパ組織の維持に関連づけられる。LT−β−Rは、いくつか
の例において、TR2とともに機能して、細胞応答を媒介し得、そしてTリンパ
球の亜集団を含む、肺における多くの組織において発現されることが示された。
LT−β−Rはまた、胚中心の形成に関連づけられているので、体液性免疫応答
に関与するようである。Rennertら、Int.Immunol.9:16
27−1639(1997)。LT-β binding to LT-β-R has been implicated in the development of secondary lymphoid tissue and the maintenance of organized lymphoid tissue in adults. LT-β-R, in some cases, can function with TR2 to mediate cellular responses and has been shown to be expressed in many tissues in the lung, including a subpopulation of T lymphocytes. .
LT-β-R also appears to be involved in the humoral immune response since it has been implicated in germinal center formation. Rennert et al., Int. Immunol. 9:16
27-1639 (1997).
【0212】 本発明のAIM IIポリペプチドを使用して、LT−β−Rに対する細胞リ
ガンドの接近をブロックすることによる胚中心の形成およびLT−β−R媒介体
液性応答を阻害し得る。さらに、本発明のポリペプチドは、胚中心の形成および
LT−β−Rを活性化することによるLT−β−R媒介体液性応答を刺激し得る
。The AIM II polypeptides of the invention can be used to inhibit germinal center formation and block the LT-β-R mediated humoral response by blocking the access of cellular ligands to LT-β-R. In addition, the polypeptides of the invention may stimulate LT-β-R mediated humoral responses by activating germinal centers and LT-β-R.
【0213】 当業者は、AIM IIポリペプチドの異なる部分が、LT−β−Rに対する
異なる効果を有し得ることを認識する。当業者はまた、本発明のAIM IIポ
リペプチドが、LT−β−Rに対して有する効果が、個々のペプチドおよびLT
−β−Rに結合した場合のLT−β−Rが有する効果とともに変化することを認
識する。細胞レセプターのアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を有する分
子をスクリーニングする方法は、上記に記載される。[0213] One of skill in the art will recognize that different portions of the AIM II polypeptide may have different effects on LT-β-R. One of skill in the art will also appreciate that the effects of the AIM II polypeptides of the present invention on LT-β-R are dependent on individual peptides and LT-β-R.
It recognizes that it changes with the effect of LT-β-R when bound to -β-R. Methods for screening for molecules having cell receptor agonist and antagonist activity are described above.
【0214】 C型肝炎ウイルス(HCV)のコアタンパク質はまた、LT−β−Rと関連し
、そしてこのレセプターによって媒介されるシグナル伝達を増強することが示さ
れた。Chenら、J.Virol.71:9417−9426(1997)。
さらに、このタンパク質とLT−β−Rとの相互作用は、慢性的に活性化され、
持続状態のHCV感染細胞に寄与し得る。本発明のAIM IIポリペプチドを
使用して、LT−β−RのHCV刺激およびこのウイルスに関連する病状をブロ
ックし得る。The hepatitis C virus (HCV) core protein has also been shown to be associated with LT-β-R and to enhance signaling mediated by this receptor. Chen et al. Virol. 71: 9417-9426 (1997).
Furthermore, the interaction of this protein with LT-β-R is chronically activated,
May contribute to persistently infected HCV-infected cells. AIM II polypeptides of the invention can be used to block HCV stimulation of LT-β-R and pathologies associated with this virus.
【0215】 TR2は、腫瘍壊死因子(TNF)レセプターファミリーのメンバーである。
このファミリーは、多くのヒト組織および細胞株で発現される。このタンパク質
は、構成的に発現され、そして比較的高レベルで末梢血T細胞、B細胞、および
単球において発現される。Kwonら、J.Biol.Chem.272:14
272−14276(1997)。TR2は、インビボで多くの機能を提供する
、これらの機能としては、感染期間中の細胞へのヘルペスウイルス侵入の媒介が
挙げられる。さらにTR2−Fc融合タンパク質は、混合リンパ球反応媒介増殖
を阻害することが示された。これらのデータは、TR2およびそのリガンドがT
細胞刺激においてある役割を果たすことを示唆する。これは、これらの株の中で
TR2の過剰発現がNF−κBおよびAP−1を活性化することを示した。この
活性化は、TNFレセプター関連因子(TRAF)媒介機構によって生じるよう
である。[0215] TR2 is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family.
This family is expressed in many human tissues and cell lines. This protein is constitutively expressed and is expressed at relatively high levels in peripheral blood T cells, B cells, and monocytes. Kwon et al. Biol. Chem. 272: 14
272-14276 (1997). TR2 provides a number of functions in vivo, including the mediation of herpes virus entry into cells during infection. In addition, TR2-Fc fusion proteins have been shown to inhibit mixed lymphocyte response-mediated proliferation. These data indicate that TR2 and its ligand
Suggests a role in cell stimulation. This indicated that overexpression of TR2 activated NF-κB and AP-1 in these strains. This activation appears to occur by a TNF receptor-related factor (TRAF) -mediated mechanism.
【0216】 本発明のAIM IIポリペプチドを使用して、このレセプターを活性化する
細胞リガンドによるTR2への接近をブロックすることによって、T細胞活性化
、すなわちT細胞媒介免疫応答を阻害し得る。同様に、本発明のポリペプチドは
、TR2を活性化することによってT細胞活性化を刺激し得る。LT−β−Rに
ついて上記に記載されるように、当業者は、AIM IIポリペプチドの異なる
部分がTR2媒介細胞応答を阻害または刺激のいずれかを行い得ることを認識す
る。The AIM II polypeptides of the present invention can be used to block T cell activation, ie, a T cell mediated immune response, by blocking access to TR2 by cellular ligands that activate this receptor. Similarly, a polypeptide of the invention may stimulate T cell activation by activating TR2. As described above for LT-β-R, one of skill in the art will recognize that different portions of the AIM II polypeptide can either inhibit or stimulate TR2-mediated cellular responses.
【0217】 本発明のAIM IIポリペプチドはまた、ヘルペスウイルス感染を予防また
は処置するために使用され得る。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used to prevent or treat a herpes virus infection.
【0218】 CD27、ならびにそのリガンドCD70の発現は、リンパ球に対して優性に
限定される。さらにCD27は、CD70と相互作用し、かつB細胞におけるI
gE合成の誘導に関与することが示された。Nagumoら、J.Immuno
l.161:6496−6502(1998)。さらに、CD27の活性化は、
IgE合成を増強し得る。従って、CD27とCD70との間の相互作用の阻害
は、IgE産生およびアレルギー性応答を阻害し得る。The expression of CD27, as well as its ligand CD70, is dominantly restricted to lymphocytes. In addition, CD27 interacts with CD70 and acts on I in B cells.
It has been shown to be involved in the induction of gE synthesis. Nagamo et al. Immuno
l. 161: 6496-6502 (1998). Furthermore, activation of CD27
IgE synthesis may be enhanced. Thus, inhibition of the interaction between CD27 and CD70 can inhibit IgE production and allergic responses.
【0219】 本発明のAIM IIポリペプチドを、免疫応答を調節するために使用し得る
。例えば、AIM IIポリペプチドを使用して、CD27とCD70との間の
相互作用を阻害することによってB細胞の機能を調節し得る。従って、AIM
IIポリペプチドは、CD27に結合し得、そしてB細胞の分化および増殖、な
らびにこれらの細胞によるタンパク質(例えば、IgE)の分泌を阻害し得る。
従って、AIM IIポリペプチドを使用して、例えば、アレルギー性鼻炎(枯
草熱ともいわれる)、気管支喘息、アレルギー性喘息、アナフィラキシー、アト
ピー性皮膚炎、および胃腸の食物アレルギーのようなIgE誘導性即時型過敏反
応の処置におけるIgE抗体形成を抑制し得る。The AIM II polypeptides of the present invention can be used to modulate an immune response. For example, AIM II polypeptides can be used to modulate B cell function by inhibiting the interaction between CD27 and CD70. Therefore, AIM
II polypeptides can bind to CD27 and inhibit B cell differentiation and proliferation, and secretion of proteins (eg, IgE) by these cells.
Thus, using AIM II polypeptides, for example, IgE-induced immediate forms such as allergic rhinitis (also called hay fever), bronchial asthma, allergic asthma, anaphylaxis, atopic dermatitis, and gastrointestinal food allergy. IgE antibody formation in the treatment of hypersensitivity reactions can be suppressed.
【0220】 CD27はまた、一般的にSivaとして公知であるプロアポトーシスタンパ
ク質に対するレセプターであると考えられている。Pandanilamら、K
idney Int.54:1967−1975(1998)。本発明のAIM
IIポリペプチドを使用して、SivaとCD27との間の相互作用を阻害し
得るために、Siva/CD27媒介性のアポトーシス誘導を予防し得る。減少
した細胞生存性または増加したアポトーシスと関連する疾患としては、AIDS
:神経変性障害(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性外側硬
化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、色素
性網膜炎、小脳変性):脊髄形成異常症候群(例えば、再生不良性貧血)、虚血
性傷害(例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流傷害により引き起こされるもの
)、毒素誘導性肝臓疾患(例えば、アルコールにより引き起こされるもの)、敗
血性ショック、悪液質、および食欲不振が挙げられる。[0220] CD27 is also considered to be a receptor for the pro-apoptotic protein commonly known as Siva. Pandanilam et al., K
idney Int. 54: 1967-1975 (1998). AIM of the present invention
The II polypeptide can be used to inhibit the interaction between Siva and CD27 and thus prevent Siva / CD27-mediated induction of apoptosis. Diseases associated with decreased cell viability or increased apoptosis include AIDS
: Neurodegenerative disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration): myelodysplastic syndrome (eg, aplastic anemia), ischemic injury (Eg, caused by myocardial infarction, stroke, and reperfusion injury), toxin-induced liver disease (eg, caused by alcohol), septic shock, cachexia, and anorexia.
【0221】 本発明のAIM IIポリペプチドをまた、Siva/CD27アポトーシス
経路の活性化を増強するために利用し得、そしてそれゆえアポトーシスの誘導を
促進する。細胞の生存またはアポトーシスの阻害の増強に関連する疾患としては
、癌(例えば、濾胞性リンパ腫、p53変異を有する癌、およびホルモン依存性
腫瘍)、自己免疫障害(例えば、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎
、および慢性関節リウマチ)およびウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルス、
ポックスウイルス、およびアデノウイルス)、対宿主性移植片情報病、急性移植
拒絶、ならびに慢性移植片拒絶が挙げられる。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used to enhance the activation of the Siva / CD27 apoptotic pathway, and thus promote the induction of apoptosis. Diseases associated with enhanced inhibition of cell survival or apoptosis include cancer (eg, follicular lymphoma, cancer with a p53 mutation, and hormone-dependent tumors), autoimmune disorders (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related threads). Spherical nephritis, and rheumatoid arthritis) and viral infections (eg, herpes virus,
Poxviruses, and adenoviruses), graft-versus-host disease, acute transplant rejection, and chronic graft rejection.
【0222】 CD27は、膜結合し得るが、CD27の可溶性形態は、免疫応答中に産生さ
れる。可溶性CD27(sCD27)は、多くの体液中で見出され、そして局所
性および全身性免疫活性化をモニターするために測定され得る。さらに、CD2
7は、ヒト悪性B細胞において発現され、そして高レベルのsCD27が、種々
のB細胞悪性疾患を有する患者の血清に存在する。Kerstenら、Bloo
d 87:1985−1989(1996)。これらのsCD27の上昇したレ
ベルは、腫瘍による負担と強く相関することが示されている。Although CD27 can be membrane-bound, a soluble form of CD27 is produced during the immune response. Soluble CD27 (sCD27) is found in many body fluids and can be measured to monitor local and systemic immune activation. In addition, CD2
7 is expressed on human malignant B cells and high levels of sCD27 are present in the sera of patients with various B cell malignancies. Kersten et al., Bloo
d 87: 1985-1989 (1996). These elevated levels of sCD27 have been shown to correlate strongly with tumor burden.
【0223】 sCD27はまた、種々のリンパ系悪性疾患および中枢神経系の固体腫瘍を有
する患者での上昇が見られている。これらの苦痛には、原発性中枢神経系リンパ
腫(PCNSL)および髄膜に位置するリンパ系悪性疾患(例えば、急性リンパ
芽球性白血病(ALL)および非ホジキンリンパ腫(NHL))が挙げられる。SCD27 has also been elevated in patients with various lymphoid malignancies and solid tumors of the central nervous system. These distresses include primary central nervous system lymphoma (PCNSL) and lymphoid malignancies located in the meninges, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin's lymphoma (NHL).
【0224】 可溶性CD27はまた、多数の非過増殖性疾患を有する患者での上昇が見い出
されている。例えば、sCD27は、未処置のグレーブス甲状腺機能亢進症を有
する患者における上昇が見られている。Kallioら、J.Lab.Clin
.Med.132:478−482(1998)。さらに、sCD27血清レベ
ルの上昇が、全身性エリテマトーデス(SLE)を有する患者において見られ、
そしてこの上昇は、疾患の活性に関連していることが示されている。Fontら
、Clin.Immunol.Immunopathol.81:239−24
3(1996):Swaakら、Clin.Rheumatol.14:293
−300(1995)。また、慢性リンパ球性白血病(CLL)を有するほとん
どの患者由来のB細胞は、膜結合および可溶性CD27の両方ならびにCD70
が同時発現することを示した。Ranheimら、Blood85:3556−
3565(1995)。[0224] Soluble CD27 has also been found to be elevated in patients with a number of non-hyperproliferative diseases. For example, sCD27 has been elevated in patients with untreated Graves' hyperthyroidism. Kallio et al. Lab. Clin
. Med. 132: 478-482 (1998). In addition, elevated sCD27 serum levels are seen in patients with systemic lupus erythematosus (SLE),
This increase has been shown to be related to disease activity. Font et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 81: 239-24
3 (1996): Swak et al., Clin. Rheumatol. 14: 293
-300 (1995). Also, B cells from most patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) have both membrane-bound and soluble CD27 and CD70
Was co-expressed. Ranheim et al., Blood 85: 3556-.
3565 (1995).
【0225】 sCD27は、CD70を介した刺激T細胞由来の白血病B細胞を予防し得、
従って、B細胞が抗原提示細胞として機能する能力を損ない得ると考えられてい
る。Ranheimら、Blood 85:3556−3565(1995)。SCD27 can prevent CD70-mediated stimulated T cell-derived leukemia B cells,
Therefore, it is believed that B cells can impair the ability to function as antigen presenting cells. Ranheim et al., Blood 85: 3556-3565 (1995).
【0226】 本発明のポリペプチドを利用して、sCD27とCD70との間の相互作用を
阻害し得、それゆえ、抗原提示細胞として作用するB細胞の能力を増強し得る。
本発明のAIM IIをまた利用して、sCD27のレベルの増加に関する疾患
および苦痛を処置し得る。機械論に束縛されることは望まれないが、AIM I
Iポリペプチドは、これらの状態の処置療法に有用であり得る。なぜなら、AI
M IIは、sCD27に結合し、そして細胞性リガンドとの相互作用を阻害す
るからである。The polypeptides of the present invention can be used to inhibit the interaction between sCD27 and CD70, and thus enhance the ability of B cells to act as antigen presenting cells.
AIM II of the present invention may also be used to treat diseases and afflictions associated with increased levels of sCD27. While not wanting to be bound by mechanics, AIM I
I polypeptides may be useful in the treatment of these conditions. Because AI
MII binds to sCD27 and inhibits its interaction with cellular ligands.
【0227】 AIM IIポリペプチドはまた、RANKに結合すると考えられている(A
ndersonら、Nature 390:175−179(1997)を参照
のこと)。RANKは、破骨細胞の分化およびT細胞と樹状細胞との間の相互作
用の調節に関連するタンパク質である。RANKは、明らかに、RANKL(オ
ステオプロテゲリン(osteoprotegerin)リガンド(OPGL)
、TRANCEおよびODFともいわれる)との相互作用を介してその細胞効果
を媒介する。AIM II polypeptides are also thought to bind to RANK (A
nderson et al., Nature 390: 175-179 (1997)). RANK is a protein involved in the regulation of osteoclast differentiation and the interaction between T cells and dendritic cells. RANK is clearly RANKL (osteoprotegerin ligand (OPGL)
, Also known as TRANCE and ODF) mediate its cellular effects.
【0228】 破壊したRANKL遺伝子を有するマウスは、欠損歯の出現および破骨細胞の
欠如を示す深刻な骨粗鬆症を示す。これらのマウスはまた、Tリンパ球分化およ
びBリンパ球分化の欠損を示す。さらに、RANKL欠乏マウスは、リンパ節を
欠くが、正常な脾臓構造およびパイアー斑を示す。これらのデータは、RANK
L媒介経路がリンパ節器官形成、リンパ球発生、ならびに破骨細胞分化および増
殖を調節することを示す。[0228] Mice with the disrupted RANKL gene exhibit severe osteoporosis indicating the appearance of missing teeth and lack of osteoclasts. These mice also show a defect in T and B lymphocyte differentiation. In addition, RANKL-deficient mice lack lymph nodes but show normal spleen structure and Peyer's patches. These data are
Figure 4 shows that the L-mediated pathway regulates lymph node organogenesis, lymphocyte development, and osteoclast differentiation and proliferation.
【0229】 骨細胞には2つの主なクラスが存在する:骨、破骨細胞を形成する細胞および
骨、破骨細胞を吸収する細胞。これらの細胞は、それぞれ厳密な機能を有し、そ
してそれらの活性間のバランスは、骨格系の維持に重大な意味を持つ。例えば、
ヒト成人において、10〜15%の間の海綿質表面は、類骨(骨芽細胞より作製
される新しい非石灰化骨)で覆われているが、約4%は、活性な吸収性表面を有
する。骨細胞活性の継続フラックスの力学的な性質は、総骨格カルシウムの約1
8%が、しばしば除去され、そして1年の期間にわたって堆積するという事実に
より例証される。There are two main classes of bone cells: bone, cells that form osteoclasts, and cells that resorb bone, osteoclasts. Each of these cells has a strict function, and the balance between their activities is critical for maintaining the skeletal system. For example,
In human adults, between 10-15% of spongy surfaces are covered with osteoid (new non-calcified bone made from osteoblasts), but about 4% have active resorbable surfaces. Have. The dynamic nature of the continuous flux of bone cell activity is approximately 1% of total skeletal calcium.
Eight percent are often removed and exemplified by the fact that they accumulate over a period of one year.
【0230】 本発明のAIMポリペプチドを利用して、破骨細胞の分化および増殖ならびに
骨の発生および分解を調節し得る。本発明のポリペプチドを利用して、例えば破
骨細胞の分化および増殖を阻害し得、従ってこれを利用して、骨の分解比を低下
させ得る。破骨細胞の分化および増殖ならびに骨の分解の阻害は、骨粗鬆症、骨
格および歯の異常、骨の癌、変形性関節症、骨形成不全症、ならびにフルラー症
候群およびマルファン症候群のような状態の処置に有用であり得る。本発明のポ
リペプチドはまた、欠失した骨の置換または骨の増強が必要とされる骨および歯
の再形成ならびに歯周の再形成のプロセスに利用され得る。(例えば、歯の欠失
を遅延または阻害するために、顎の骨および歯周部の疾患に起因する補充歯槽骨
において)(例えば、Sigurdssonら、J.Periodentol.
66:511−21(1995)を参照のこと)。The AIM polypeptides of the present invention can be used to regulate osteoclast differentiation and proliferation and bone development and degradation. The polypeptides of the invention can be used, for example, to inhibit osteoclast differentiation and proliferation, and thus can be used to reduce the rate of bone degradation. Inhibition of osteoclast differentiation and proliferation and bone degradation can be used to treat osteoporosis, skeletal and dental abnormalities, bone cancer, osteoarthritis, osteogenesis imperfecta, and conditions such as Huller's syndrome and Marfan's syndrome May be useful for The polypeptides of the present invention may also be utilized in the process of bone and tooth remodeling and periodontal remodeling where replacement or replacement of missing bone is required. (Eg, in replacement alveolar bone due to jaw bone and periodontal disease to delay or inhibit tooth loss) (see, eg, Sigurdsson et al., J. Periodentol.
66: 511-21 (1995)).
【0231】 本発明のAIM IIポリペプチドを、さらに使用してTリンパ球およびBリ
ンパ球の分化および増殖を調節し得る。従って、AIM IIポリペプチドはま
た、RANKに結合し得、そしてTリンパ球およびBリンパ球の分化および増殖
ならびにこれらの細胞からのタンパク質(例えば、免疫グロブリン)の分泌を阻
害し得る。それゆえ、AIM IIポリペプチドを利用して、リンパ球媒介免疫
応答を抑制し(例えば、移植拒絶に対して予防する)得る。AIM IIポリペ
プチドをまた用いて、歯骨細胞の分化および増殖を阻害し得る。従って、AIM
IIポリペプチドを利用して、骨癌のような疾患を処置し得る。AIM II polypeptides of the present invention can further be used to modulate the differentiation and proliferation of T and B lymphocytes. Thus, AIM II polypeptides can also bind to RANK and inhibit the differentiation and proliferation of T and B lymphocytes and secretion of proteins (eg, immunoglobulins) from these cells. Thus, AIM II polypeptides can be utilized to suppress (eg, prevent against transplant rejection) lymphocyte-mediated immune responses. AIM II polypeptides can also be used to inhibit osteoclast differentiation and proliferation. Therefore, AIM
The II polypeptide can be used to treat diseases such as bone cancer.
【0232】 本発明はまた、RANKの1つ以上の天然のリガンドを模倣し、そしてRAN
K媒介細胞応答を刺激するAIM IIポリペプチドを提供する。これらの細胞
性応答は、Tリンパ球およびBリンパ球の分化および増殖の活性化ならびに破骨
細胞の分化の誘導を含む。従って、AIM IIポリペプチドを利用して、感染
(例えば、細菌感染、ウイルス感染および原生動物の感染)のような疾患を処置
し得る。AIM IIポリペプチドをまた利用して、免疫応答(例えば、AID
SおよびAIDS関連複合体の処置において)を増強し得、かつ骨の分解速度を
増加し得る。The present invention also mimics one or more natural ligands of RANK, and
AIM II polypeptides that stimulate K-mediated cellular responses are provided. These cellular responses include the activation of T and B lymphocyte differentiation and proliferation and the induction of osteoclast differentiation. Thus, AIM II polypeptides can be used to treat diseases such as infections (eg, bacterial, viral, and protozoal). AIM II polypeptides can also be used to generate an immune response (eg, AID
In the treatment of S and AIDS-related complexes) and may increase the rate of bone degradation.
【0233】 AIM IIポリペプチドは分子の可溶性形態を形成するためにインビボで切
断され得る。実施例10に記載したように、切断部位は、配列番号2に示される
配列のアミノ酸残基82と83との間に位置するようである。この位置でのAI
M IIポリペプチドの切断は、配列番号2のアミノ酸83〜240を含む分子
の可溶性形態の産生を生じると考えられている。AIM IIの可溶性形態は、
これらのペプチドの全身投与が好ましい疾患の処置において特に有用である。さ
らに、AIM IIの可溶性形態はまた、局所投与に有用である。本発明の完全
かつ成熟したAIM IIポリペプチドならびにこれらのポリペプチドのサブフ
ラグメントを利用して、これらの分子が結合するレセプターおよび他のリガンド
に関連する苦痛を処置し得る。AIM II polypeptides can be cleaved in vivo to form soluble forms of the molecule. As described in Example 10, the cleavage site appears to be located between amino acid residues 82 and 83 of the sequence shown in SEQ ID NO: 2. AI at this position
Cleavage of the MII polypeptide is believed to result in the production of a soluble form of the molecule comprising amino acids 83-240 of SEQ ID NO: 2. The soluble form of AIM II is
Systemic administration of these peptides is particularly useful in treating preferred diseases. In addition, soluble forms of AIM II are also useful for topical administration. The complete and mature AIM II polypeptides of the present invention, as well as subfragments of these polypeptides, can be used to treat the pain associated with the receptors and other ligands to which these molecules bind.
【0234】 (投与形態) 上記で議論される状態のような状態が、AIM IIタンパク質の投与によっ
て処置され得ることが理解される。従って、本発明はさらに、AIM II活性
のレベルの増加を必要とする個体を処置する方法を提供し、この方法は、そのよ
うな個体に、そのような個体におけるAIM II活性レベルを増加させるのに
有効な、有効量の本発明の単離されたAIM IIポリペプチドを含む薬学的組
成物を投与する工程を包含する。Dosage Forms It is understood that conditions such as those discussed above can be treated by administration of the AIM II protein. Accordingly, the invention further provides a method of treating an individual in need of an increased level of AIM II activity, the method comprising providing such an individual with an increased level of AIM II activity in such an individual. Administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an isolated AIM II polypeptide of the present invention.
【0235】 一般的な提案として、非経口投与されるAIM IIポリペプチドの薬学的に
有効な1用量あたりの総量は、患者の体重あたり約1μg/kg/日〜10mg
/kg/日の範囲であるが、上述のように、これは、治療の裁量を必要とする。
より好ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日であり、そし
て最も好ましくは、ヒトの場合、ホルモンについて、約0.01mg/kg/日
〜1mg/kg/日の間である。連続的に投与される場合、AIM IIポリペ
プチドは、代表的には、1日あたり1〜4注射によって、または例えばミニポン
プを使用する連続的皮下注入によってのいずれかで、約1μg/kg/時間〜約
50μg/kg/時間の用量速度で投与される。静脈注射バッグ溶液もまた、使
用され得る。As a general suggestion, the total pharmaceutically effective dose of parenterally administered AIM II polypeptide is about 1 μg / kg / day to 10 mg / body weight of the patient.
/ Kg / day, but as noted above, this requires discretion in treatment.
More preferably, the dose is at least 0.01 mg / kg / day, and most preferably, for humans, between about 0.01 mg / kg / day to 1 mg / kg / day for the hormone. When administered continuously, AIM II polypeptides are typically administered at about 1 μg / kg / hr, either by 1-4 injections per day or by continuous subcutaneous infusion using, for example, a minipump. It is administered at a dose rate of 約 50 μg / kg / hour. Intravenous bag solutions may also be used.
【0236】 本発明のAIM IIを含む薬学的組成物は、経口投与、直腸投与、非経口投
与、槽内投与、膣内投与、腹腔内投与、局部投与(例えば、粉末、軟膏、ドロッ
プ、または経皮パッチによって)、口内投与されるか、または経口スプレーもし
くは経鼻スプレーによって投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」によ
って、非毒性の、固体、半固体、または液体の、任意の型の賦形剤、希釈剤、カ
プセル化物質、または処方補助剤が意図される。本明細書中で使用される用語「
非経口」は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨下、皮下、ならびに関節内での注射お
よび注入を含む投与のモードをいう。A pharmaceutical composition comprising AIM II of the invention may be administered orally, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (eg, as a powder, ointment, drop, or (By transdermal patches), buccally, or by oral or nasal spray. By "pharmaceutically acceptable carrier" is intended any non-toxic, solid, semi-solid, or liquid excipient, diluent, encapsulating material, or formulation aid. As used herein, the term "
"Parenteral" refers to modes of administration including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, substernal, subcutaneous, and intraarticular injection and infusion.
【0237】 慢性関節リウマチの処置において、本発明のAIM IIポリペプチドの投与
の特に好ましいモードは、皮内、皮下、および関節内への注射ならびに注入を含
む。好ましくは、AIM IIポリペプチドは、用量当たり、約0.1〜約1.
0mg/患者の体重kgの範囲で関節内にまたは皮内に投与した。特に好ましい
賦形剤としては、を含む 可溶性のAIM IIポリペプチド(すなわち、膜貫通ドメインの全てまたは
一部を欠いているAIM IIポリペプチド)に加えて、膜貫通領域を含むAI
M IIポリペプチドもまた、界面活性剤(例えば、トリトンX−100)を含
ませることによって緩衝液に適切に溶解される場合、使用され得る。In the treatment of rheumatoid arthritis, particularly preferred modes of administration of the AIM II polypeptides of the present invention include intradermal, subcutaneous, and intraarticular injection and infusion. Preferably, the AIM II polypeptide comprises from about 0.1 to about 1.
It was administered intra-articularly or intradermally in the range of 0 mg / kg of patient weight. Particularly preferred excipients include, in addition to a soluble AIM II polypeptide (ie, an AIM II polypeptide lacking all or part of the transmembrane domain), an AI comprising a transmembrane region
MII polypeptides can also be used if properly dissolved in buffer by including a detergent (eg, Triton X-100).
【0238】 (染色体アッセイ) 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。その配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得
る。本発明による、DNAの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子と
それらの配列とを相関付ける際の重要な第1の工程である。Chromosome Assays The nucleic acid molecules of the present invention are also useful for chromosome identification. The sequence can be specifically targeted to and hybridized to a particular location on an individual human chromosome. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating genes associated with disease with their sequences.
【0239】 この点について特定の好ましい実施態様において、本明細書中において開示さ
れるcDNAを使用して、AIM IIタンパク質遺伝子のゲノムDNAをクロ
ーニングする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およびライ
ブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、インサイチュ染色
体マッピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用される。In certain preferred embodiments in this regard, the cDNA disclosed herein is used to clone the genomic DNA of the AIM II protein gene. This can be accomplished using a variety of well-known techniques and libraries that are generally commercially available. The genomic DNA is then used for in situ chromosome mapping, using well-known techniques for this purpose.
【0240】 さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNA由来のPCRプライマー
(好ましくは、15〜25bp)を調製することによって、染色体にマッピング
され得る。遺伝子の3’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムDN
Aにおける1より多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、そ
れによって増幅プロセスは複雑にされる。次いで、これらのプライマーを、個々
のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために使用す
る。Further, in some cases, sequences can be mapped to chromosomes by preparing cDNA-derived PCR primers, preferably 15-25 bp. Using computer analysis of the 3 'untranslated region of the gene, the genomic DN
Quickly select primers that do not span more than one exon in A, thereby complicating the amplification process. These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes.
【0241】 中期染色体スプレッドへのcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション(「FISH」)を使用して、1つの工程で、正確な染色***置を提
供し得る。この技術は、50または60bpほどの短いcDNA由来のプローブ
とともに使用され得る。この技術の概説について、Vermaら、Human
Chromosomes:A Manual Of Basic Techni
ques、Pergamon Press,New York(1988)を参
照のこと。[0241] Fluorescence in situ hybridization ("FISH") of a cDNA clone to a metaphase chromosomal spread can be used to provide the exact chromosomal location in one step. This technique can be used with probes from cDNA as short as 50 or 60 bp. For a review of this technology, see Verma et al., Human.
Chromosomes: A Manual Of Basic Techni
ques, Pergamon Press, New York (1988).
【0242】 一旦、配列が正確な染色***置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例え
ば、V.McKusick,Mendelian Inheritance I
n Man(Johns Hopkins University,Welch
Medical Libraryからオンラインで利用可能)において見られ
る。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、
連鎖解析(物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝)を介して同定する。[0242] Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of that sequence on the chromosome can be correlated to genetic map data. Such data is described, for example, in V.A. McKusick, Mendelian Inheritance I
n Man (Johns Hopkins University, Welch)
(Available online from Medical Library). Then, the relationship between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease,
Identify via linkage analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).
【0243】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、cDNAまたはゲ
ノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体の
いくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察され
ない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。It is then necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in normal individuals, then the mutation may be a causative agent of the disease.
【0244】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照してより容
易に理解される。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定を意図さ
れない。Having generally described the invention, the invention will be more readily understood with reference to the following examples. The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to be limiting.
【0245】 (実施例) (実施例1:E.coliにおけるAIM IIの発現および精製) (A.N末端6−Hisタグを有するAIM IIの発現) 寄託されたcDNAクローン中のAIM IIタンパク質をコードするDNA
配列を、AIM IIタンパク質のアミノ末端配列、およびその遺伝子の3’側
のベクター配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅
する。クローニングを促進するための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、
それぞれ5’および3’配列に付加する。Examples Example 1: Expression and purification of AIM II in E. coli A. Expression of AIM II with N-terminal 6-His tag AIM II protein in the deposited cDNA clone was DNA encoding
The sequence is amplified using PCR oligonucleotide primers specific for the amino terminal sequence of the AIM II protein and the vector sequence 3 'to the gene. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning,
Append to the 5 'and 3' sequences respectively.
【0246】 22kDaのAIM IIタンパク質フラグメント(N末端領域および膜貫通
領域を欠く)を、以下のプライマーを使用して発現させる: 5’オリゴヌクレオチドプライマーは、図1A(配列番号1)のAIM II
タンパク質コード配列のヌクレオチド244〜258を含む、下線を付したBa
mHI制限部位を含む配列5’GCGGGATCCGGAGAGATGGTCA
CC3’(配列番号7)を有する。A 22 kDa AIM II protein fragment (lacking the N-terminal and transmembrane regions) is expressed using the following primers: The 5 ′ oligonucleotide primer is the AIM II of FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
Underlined Ba containing nucleotides 244-258 of the protein coding sequence
Sequence 5 'GCG GGATCC GGAGAGATGGTCA containing mHI restriction site
It has CC3 '(SEQ ID NO: 7).
【0247】 3’プライマーは、下線を付したHindIII制限部位、続いて図1B(配
列番号1)に示されるヌクレオチド757〜774に相補的なヌクレオチドを含
む、配列5’CGCAAGCTTCCTTCACACCATGAAAGC3’(
配列番号8)を有する。The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ CGC AAGCTT CCCTTCACACCATGAAAGC 3 ′ (SEQ ID NO: 1) comprising an underlined HindIII restriction site followed by nucleotides complementary to nucleotides 757-774 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 8).
【0248】 全AIM IIタンパク質は、以下のプライマーを用いて発現され得る: 5’オリゴヌクレオチドプライマーは、図1A(配列番号1)のAIM II
タンパク質コード配列のヌクレオチド49〜70を含む、下線を付したBamH
I制限部位を含む配列5’GACC GGATCC ATG GAG GAG
AGT GTC GTA CGG C3’(配列番号9)を有する。The entire AIM II protein can be expressed using the following primers: The 5 ′ oligonucleotide primer is the AIM II of FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
Underlined BamH comprising nucleotides 49-70 of the protein coding sequence
Sequence containing restriction site 5 'GACC GGATCC ATG GAG GAG
It has AGT GTC GTA CGG C3 '(SEQ ID NO: 9).
【0249】 3’プライマーは、下線を付したHindIII制限部位、続いて図1B(配
列番号1)に示されるヌクレオチド756〜783に相補的なヌクレオチドを含
む、配列5’CGC AAGCTT CCT TCA CAC CAT GAA
AGC3’(配列番号10)を有する。The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ CGC AAGCTT CCT TCA CAC CAT GAA, comprising an underlined HindIII restriction site, followed by nucleotides complementary to nucleotides 756-783 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
It has AGC 3 '(SEQ ID NO: 10).
【0250】 これらの制限部位は、これらの実施例における細菌発現のために使用される細
菌発現ベクターpQE9における制限酵素部位にとって都合がいい。(Qiag
en,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth、C
A,91311)。pQE9は、アンピシリン抗生物質耐性(「Ampr」)を コードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG誘導性プロモーター
、リボソーム結合部位(「RBS」)、6−Hisタグ、および制限酵素部位を
含む。These restriction sites are convenient for restriction enzyme sites in the bacterial expression vector pQE9 used for bacterial expression in these examples. (Qiag
en, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, C
A, 91311). pQE9 encodes ampicillin antibiotic resistance ("Amp r ") and has a bacterial origin of replication ("ori"), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site ("RBS"), a 6-His tag, and a restriction enzyme. Including the site.
【0251】 増幅されたAIM II DNAおよびベクターpQE9の両方を、BamH
IおよびHindIIIで消化し、次いで消化したDNAをともに連結する。制
限されたpQE9ベクターへのAIM IIタンパク質DNAの挿入によって、
AIM IIタンパク質コード領域を、ベクターのIPTG誘導性プロモーター
の下流に、それに対して作動可能に連結されるように、そしてAIM IIタン
パク質の翻訳のために適切に位置付けされた開始AUGに関してインフレームに
配置する。[0251] Both the amplified AIM II DNA and the vector pQE9 were isolated from BamH
Digest with I and HindIII and then ligate the digested DNA together. By inserting the AIM II protein DNA into the restricted pQE9 vector,
Placing the AIM II protein coding region downstream of the vector's IPTG-inducible promoter, operably linked thereto, and in-frame with respect to the appropriately positioned starting AUG for translation of the AIM II protein. I do.
【0252】 (B.C末端6−Hisタグを有するAIM IIの発現) 細菌発現ベクターpQE60が、本実施例において細菌発現のために使用され
る。(QIAGEN,Inc.、9259 Eton Avenue,Chat
sworth,CA,91311)。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性
(「Ampr」)をコードし、そして細菌複製起点(「ori」)、IPTG誘 導性プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、QIAGEN,Inc
.(上述)により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸(「Ni−NTA」
)親和性樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコー
ドする6コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらのエレ
メントは、ポリペプチドをコードする挿入DNAフラグメントが、そのポリペプ
チドのカルボキシル末端に共有結合で連結された6つのHis残基(すなわち、
「6×Hisタグ」)を有するポリペプチドを発現するように配置される。B. Expression of AIM II with C-terminal 6-His Tag The bacterial expression vector pQE60 is used in this example for bacterial expression. (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chat.
swth, CA, 91311). pQE60 encodes ampicillin antibiotic resistance ("Amp r ") and has a bacterial origin of replication ("ori"), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site ("RBS"), QIAGEN, Inc.
. Nickel-nitrilotriacetic acid ("Ni-NTA") sold by
3.) Contains 6 codons encoding histidine residues allowing for affinity purification using an affinity resin, and an appropriate single restriction enzyme cleavage site. These elements are composed of six His residues in which the inserted DNA fragment encoding the polypeptide is covalently linked to the carboxyl terminus of the polypeptide (ie,
“6 × His tag”).
【0253】 AIM IIタンパク質の所望の部分をコードするDNA配列を、PCRオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたcDNAクローンから増幅す
る。このプライマーは、AIM IIタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列
およびcDNAコード配列の3’側の寄託された構築物中の配列にアニールする
。pQE60ベクターにおけるクローニングを容易にするための制限部位を含む
さらなるヌクレオチドを、5’配列および3’配列にそれぞれ付加する。The DNA sequence encoding the desired portion of the AIM II protein is amplified from the deposited cDNA clone using PCR oligonucleotide primers. This primer anneals to the amino terminal sequence of the desired portion of the AIM II protein and sequences in the deposited construct 3 'to the cDNA coding sequence. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning in the pQE60 vector are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.
【0254】 タンパク質のクローニングのために、5’プライマーは、配列5’GACGC CCATGG AG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C
3’(配列番号17)を有する。これは、下線を付したNcoI制限部位、続い
て、図1A中のAIM II配列のアミノ末端コード配列に相補的なヌクレオチ
ドを含有する。当然、当業者は、タンパク質コード配列中における、5’プライ
マーが開始する地点が、完全タンパク質の任意の所望の部分をコードするDNA
セグメント(より短いまたはより長い)を増幅するために変動され得ることを理
解する。3’プライマーは、配列5’GACC GGATCC CAC CAT
GAA AGC CCC GAA GTA AG 3’(配列番号18)を有
する。これは、下線を付したBamHI制限部位、続いて、図1B中のAIM
II DNA配列中の停止コドンの直前のコード配列の3’末端に相補的なヌク
レオチドを含有し、コード配列は、pQE60ベクター中の6つのHisコドン
の読み枠と共にその読み枠を維持するように制限部位と整列される。For cloning of the protein, the 5 'primer had the sequence 5' GACGC CCATGG AG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C
3 '(SEQ ID NO: 17). This is the underlined NcoI restriction site, followed by
And a nucleotide complementary to the amino-terminal coding sequence of the AIM II sequence in FIG. 1A.
Contains Of course, those skilled in the art will recognize that the 5 'ply
The point where the mer starts is DNA encoding any desired part of the complete protein
Understand that it can be varied to amplify segments (shorter or longer)
Understand. The 3 'primer has the sequence 5' GACCGGATCC CAC CAT
GAA AGC CCC GAA GTA AG 3 '(SEQ ID NO: 18)
I do. This is the underlined BamHI restriction site, followed by the AIM in FIG. 1B.
II A nucleotide complementary to the 3 'end of the coding sequence immediately before the stop codon in the DNA sequence.
Containing the reotide, the coding sequence consists of six His codons in the pQE60 vector.
Together with the restriction site to maintain that reading frame.
【0255】 増幅されたAIM II DNAフラグメントおよびベクターpQE60を、
BamHIおよびNcoIで消化し、そして次いで、消化されたDNAを共に連
結する。AIM II DNAの制限されたpQE60ベクターへの挿入は、I
PTG誘導性プロモーターから下流に、かつ開始AUGおよび6つのヒスチジン
コドンとインフレームに、AIM IIタンパク質コード領域を配置する。The amplified AIM II DNA fragment and the vector pQE60 were
Digest with BamHI and NcoI and then ligate the digested DNA together. Insertion of AIM II DNA into the restricted pQE60 vector
The AIM II protein coding region is located downstream from the PTG inducible promoter and in frame with the initiation AUG and the six histidine codons.
【0256】 (C.N末端6Hisタグを有するAIM II欠失変異体の発現) 寄託されたcDNAクローン中のAIM IIタンパク質をコードするDNA
配列を、AIM IIタンパク質の配列およびこの遺伝子の3’側のベクター配
列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。クロー
ニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、5’配列お
よび3’配列にそれぞれ付加した。C. Expression of AIM II Deletion Mutant with N-Terminal 6His Tag DNA encoding AIM II protein in the deposited cDNA clone
The sequence was amplified using PCR oligonucleotide primers specific for the sequence of the AIM II protein and the vector sequence 3 'to this gene. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning were added to the 5 'and 3' sequences, respectively.
【0257】 特に、N末端欠失AIM II変異体(配列番号2中のMet(68)からV
al(240))を、以下のプライマーを使用して構築した: 5’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’−GGG GGA TCC
ATG GTC ACC CGC CTG CC−3’(配列番号21)を有す
る。これは、下線を付したBamHI制限部位を含み、そして図1A(配列番号
1)中のAIM IIタンパク質コード配列の17ヌクレオチドを含有する。In particular, the N-terminal deletion AIM II mutant (Met (68) to V
al (240)) was constructed using the following primers: The 5 'oligonucleotide primer had the sequence 5'-GGG GGA TCC
It has ATG GTC ACC CGC CTG CC-3 '(SEQ ID NO: 21). It contains an underlined BamHI restriction site and contains 17 nucleotides of the AIM II protein coding sequence in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
【0258】 3’プライマーは、配列5’−GGG AAG CTT CAC CAT G
AA AGC CCC G−3’(配列番号22)を有する。これは、下線を付
したHindIII制限部位、続いて、図1B(配列番号1)中に示されるよう
なヌクレオチド753〜768に相補的なヌクレオチドを含有する。The 3 ′ primer had the sequence 5′-GGG AAG CTT CAC CAT G
It has AA AGC CCC G-3 '(SEQ ID NO: 22). It contains an underlined HindIII restriction site, followed by nucleotides complementary to nucleotides 753-768 as shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
【0259】 これらの制限部位は、細菌発現ベクターpQE9における制限酵素部位に対し
て好都合である。これらは、本実施例において細菌発現のために使用される。(
Qiagen,Inc.9259 Eton Avenue,Chatswor
th,CA,91311)。pQE9は、アンピシリン抗生物質耐性(「Amp r 」)をコードし、そして細菌複製起点(「ori」)、IPTG誘導性プロモ ーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、6−Hisタグ、および制限酵素
部位を含有する。These restriction sites correspond to the restriction enzyme sites in the bacterial expression vector pQE9.
It is convenient. These are used for bacterial expression in this example. (
Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth
th, CA, 91311). pQE9 is resistant to ampicillin antibiotics (“Amp r ") And encodes a bacterial origin of replication (" ori "), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site (" RBS "), a 6-His tag, and a restriction enzyme.
Contains a site.
【0260】 増幅されたAIM II(アミノ酸68−240)DNAおよびベクターpQ
E9の両方をBamHIおよびHindIIIで消化し、そして次いで、消化さ
れたDNAを共に連結した。AIM II(アミノ酸68−240)タンパク質
DNAの、制限処理されたpQE9ベクターへの挿入は、ベクターのIPTG誘
導性プロモーターから下流に、かつこれに作動可能に連結され、かつAIM I
I欠失タンパク質の翻訳のために適切に位置された開始AUGとインフレームに
、AIM IIタンパク質コード領域を配置する。Amplified AIM II (amino acids 68-240) DNA and vector pQ
Both E9 were digested with BamHI and HindIII, and then the digested DNA was ligated together. Insertion of the AIM II (amino acids 68-240) protein DNA into the restricted pQE9 vector is operably linked to and downstream from the vector's IPTG-inducible promoter.
The AIM II protein coding region is placed in frame with the starting AUG properly positioned for translation of the I deleted protein.
【0261】 (細菌の形質転換:) 上記のA、B、またはCにおいて作製された6−Hisタグ化発現構築物由来
の連結混合物は、標準的な手順を使用して、コンピテントなE.coli細胞に
形質転換される。このような手順は、Sambrookら、Molecular
Cloning:a Laboratory Manual、第2版;Col
d Spring Harbor Laboratory Press、Col
d Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載されている。E
.coli M15/rep4株(多コピーのプラスミドpREP4を含有する
。これは、lacリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性(「Kanr 」)を与える)が、本明細書中に記載の例示的な実施例を実施することにおいて
使用される。この株は、AIM IIタンパク質の発現に適した多くのうちの唯
一の1つであり、Qiagenから市販されている。Bacterial Transformation: The ligation mixture from the 6-His-tagged expression constructs made in A, B, or C above was used to construct competent E. coli cells using standard procedures. E. coli cells. Such a procedure is described in Sambrook et al., Molecular.
Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition; Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Spring Harbor, N.D. Y. (1989). E
. E. coli strain M15 / rep4, which contains multiple copies of plasmid pREP4, which expresses the lac repressor and confers kanamycin resistance ("Kan r "), has been described in the exemplary implementations described herein. Used in practicing the examples. This strain is one of many suitable for the expression of AIM II protein and is commercially available from Qiagen.
【0262】 形質転換体は、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下におけるLBプレー
ト上で増殖するそれらの能力によって同定される。プラスミドDNAは耐性コロ
ニーから単離され、そしてクローン化DNAの正体は制限分析によって確認され
る。Transformants are identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA is confirmed by restriction analysis.
【0263】 所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン(100μg/ml)およ
びカナマイシン(25μg/ml)の両方を添加したLB培地中での液体培養に
おいて、一晩(「O/N」)増殖させる。Clones containing the desired construct are grown overnight (“O / N”) in liquid culture in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). .
【0264】 このO/N培養物を、約1:100〜1:250の希釈で大きな培養物を接種
するために使用する。細胞を、600nmでの光学密度(「OD600」)が0
.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−D−チ
オガラクトピラノシド(「IPTG」)を最終濃度1mMに添加し、lacIリ
プレッサーを不活性化することによりlacリプレッサー感受性プロモーターか
らの転写を誘導する。細胞を、続けてさらに3〜4時間インキュベートする。次
いで、細胞を、標準的な方法を使用して、遠心分離により採取し、そして破壊す
る。封入体を破壊細胞から慣用的な採集技術を使用して精製し、そしてタンパク
質を封入体から8M尿素に可溶化する。可溶化タンパク質を含有する8M尿素溶
液を、2×リン酸緩衝化生理食塩水(「PBS」)中でPD−10カラムに通し
、それにより尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再フォールデ
ィングする。このタンパク質をクロマトグラフィーのさらなる段階によって精製
し、エンドトキシンを除去する。次いで、これを滅菌濾過する。滅菌濾過された
タンパク質調製物を、95μg/mlの濃度で2×PBS中に保存する。This O / N culture is used to inoculate a large culture at a dilution of about 1: 100 to 1: 250. Cells were treated with an optical density at 600 nm ("OD600") of 0.
. Grow to between 4 and 0.6. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (“IPTG”) is added to a final concentration of 1 mM to induce transcription from the lac repressor sensitive promoter by inactivating the lacI repressor. The cells are subsequently incubated for a further 3-4 hours. The cells are then harvested by centrifugation and disrupted using standard methods. The inclusion bodies are purified from the disrupted cells using conventional harvesting techniques, and the protein is solubilized from the inclusion bodies in 8M urea. The 8M urea solution containing the solubilized protein is passed over a PD-10 column in 2x phosphate buffered saline ("PBS"), thereby removing the urea, replacing the buffer, and removing the protein. Refold. The protein is purified by a further step of chromatography to remove endotoxin. It is then sterile filtered. The sterile filtered protein preparation is stored in 2 × PBS at a concentration of 95 μg / ml.
【0265】 (D.6−Hisタグを有さない全長AIM IIの発現および精製) 細菌発現ベクターpQE60が、本実施例において細菌発現のために使用され
る(QIAGEN,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsw
orth,CA,91311)。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性(「
Ampr」)をコードし、そして細菌複製起点(「ori」)、IPTG誘導性 プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、QIAGEN,Inc.(
前出)により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸(「Ni−NTA」)ア
フィニティー樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基を
コードする6コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらの
エレメントは、ポリペプチドをコードするDNAフラグメントが、そのポリペプ
チドのカルボキシル末端に共有結合で連結された6つのHis残基(すなわち、
「6×Hisタグ」)を有するポリペプチドを生成するように挿入され得るよう
に配置される。しかし、本実施例では、ポリペプチドコード配列は、6Hisコ
ドンの翻訳が妨害されるように挿入され、従って、このポリペプチドは、6×H
isタグを有さずに生成される。D. Expression and Purification of Full Length AIM II without 6-His Tag The bacterial expression vector pQE60 is used for bacterial expression in this example (QIAGEN, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsw).
orth, CA, 91311). pQE60 is resistant to ampicillin antibiotics ("
Amp r ") and encodes a bacterial origin of replication (" ori "), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site (" RBS "), QIAGEN, Inc. (
The 6 codons encoding histidine residues that allow for affinity purification using the nickel-nitrilotriacetic acid ("Ni-NTA") affinity resin sold by J. Am. contains. These elements comprise six His residues in which a DNA fragment encoding a polypeptide is covalently linked to the carboxyl terminus of the polypeptide (ie,
It is arranged so that it can be inserted to produce a polypeptide with a “6 × His tag”). However, in this example, the polypeptide coding sequence was inserted such that translation of the 6His codon was prevented, so that the polypeptide had a 6 × H
Generated without an is tag.
【0266】 AIM IIタンパク質の所望の部分をコードするDNA配列を、PCRオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたcDNAクローンから増幅す
る。このプライマーは、AIM IIタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列
およびcDNAコード配列の3’側の寄託された構築物中の配列にアニールする
。pQE60ベクターにおけるクローン化を容易にするための制限部位を含むさ
らなるヌクレオチドを、5’配列および3’配列にそれぞれ付加する。The DNA sequence encoding the desired portion of the AIM II protein is amplified from the deposited cDNA clone using PCR oligonucleotide primers. This primer anneals to the amino terminal sequence of the desired portion of the AIM II protein and sequences in the deposited construct 3 'to the cDNA coding sequence. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning in the pQE60 vector are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.
【0267】 タンパク質のクローン化のために、5’プライマーは、配列5’GACGCC CATGG AG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3
’(配列番号17)を有する。これは、下線を付したNcoI制限部位を含有し
、図1A中のAIM II配列のアミノ末端コード領域のヌクレオチドを含む。
当然、当業者は、タンパク質コード配列中における、5’プライマーが開始する
位置が、完全タンパク質の所望の部分(すなわち、より短いまたはより長い)を
増幅するために変動され得ることを理解する。3’プライマーは、配列5’CG
C AAGCTT CCTT CAC ACC ATG AAA GC 3’(
配列番号19)を有する。これは、下線を付したHindIII制限部位、続い
て、図1B(配列番号1)中のAIM II DNA配列中の非コード配列の3
’末端に相補的なヌクレオチドを含有する。For protein cloning, the 5 ′ primer was prepared using the sequence 5 ′ GACGC C CATGG AG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3
'(SEQ ID NO: 17). It contains an underlined NcoI restriction site and includes the nucleotides of the amino-terminal coding region of the AIM II sequence in FIG. 1A.
Of course, those skilled in the art will appreciate that the position in the protein coding sequence where the 5 'primer starts can be varied to amplify the desired portion of the complete protein (ie, shorter or longer). The 3 'primer has the sequence 5'CG
C AAGCTT CCTT CAC ACC ATG AAA GC 3 '(
SEQ ID NO: 19). This is an underlined HindIII restriction site, followed by three of the non-coding sequences in the AIM II DNA sequence in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
'Contains a complementary nucleotide at the terminus.
【0268】 増幅されたAIM II DNAフラグメントおよびベクターpQE60を、
NcoIおよびHindIIIで消化し、そして次いで、消化されたDNAを共
に連結する。AIM II DNAの制限されたpQE60ベクターへの挿入は
、IPTG誘導性プロモーターから下流に、かつ開始AUGとインフレームに、
その関連停止コドンを含むAIM IIタンパク質コード領域を配置する。関連
停止コドンは、挿入点の下流の6ヒスチジンコドンの翻訳を妨害する。The amplified AIM II DNA fragment and the vector pQE60 were
Digest with NcoI and HindIII, and then ligate the digested DNA together. Insertion of AIM II DNA into the restricted pQE60 vector was performed downstream from the IPTG-inducible promoter and in frame with the starting AUG.
Place the AIM II protein coding region including its associated stop codon. The relevant stop codon prevents translation of the six histidine codons downstream of the insertion point.
【0269】 (E.N末端AIM II欠失変異体の構築) AIM II欠失変異体(配列番号2におけるMet(68)〜Val(24
0))をクローニングするために、5’プライマーは、配列5’−GGG CC A TGG ATG GTC ACC CGC CTG CC−3’(配列番号
23)(下線部のNcoI制限酵素認識部位を含む)を有し、そして続いて図1
A中のAIM IIタンパク質コード配列の17ヌクレオチドを含む。3’プラ
イマーは、配列5’−GGG AAG CTT CAC CAT GAA AG
C CCC G−3’(配列番号22)(下線部のHind III制限部位、
続いて図1B(配列番号1)中のヌクレオチド753〜768に相補的なヌクレ
オチドを含む)を有する。E. Construction of N-terminal AIM II deletion mutant AIM II deletion mutant (Met (68) -Val (24 in SEQ ID NO: 2)
For cloning 0)), the 5 'primer has the sequence 5'-GGG CC ATG G ATG GTC ACC CGC CTG CC-3' (SEQ ID NO: 23) (including the underlined NcoI restriction enzyme recognition site). And then Figure 1
A contains 17 nucleotides of the AIM II protein coding sequence in A. The 3 'primer has the sequence 5'-GGG AAG CTT CAC CAT GAA AG
C CCC G-3 ′ (SEQ ID NO: 22) (underlined Hind III restriction site,
Followed by nucleotides complementary to nucleotides 753-768 in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
【0270】 増幅したAIM II(アミノ酸68〜240)DNAフラグメントおよびベ
クターpQE60をNcoIおよびHind IIIで消化し、次いで、消化し
たDNAをともに連結した。AIM II(アミノ酸68〜240)DNAの、
制限酵素で切断されたpQE60ベクターへの挿入は、IPTG誘導プロモータ
ーから下流に、およびインフレームに開始AUGを有するように、AIM II
(アミノ酸68〜240)タンパク質コード領域を配置する。HindIII消
化は、この挿入場所の下流の6つのヒスチジンコドンを除去する。The amplified AIM II (amino acids 68-240) DNA fragment and the vector pQE60 were digested with NcoI and HindIII, and the digested DNAs were ligated together. Of AIM II (amino acids 68-240) DNA,
Insertion into the pQE60 vector cleaved with the restriction enzyme was performed with AIM II downstream from the IPTG-inducible promoter and with the initiating AUG in frame.
(Amino acids 68-240) Position the protein coding region. HindIII digestion removes the six histidine codons downstream of this insertion site.
【0271】 (F.N末端AIM II欠失変異体の構築) AIM II欠失変異体(配列番号2中のAla(101)〜Val(240
))をクローニングするために、5’プライマーは、配列5’−GGG CCA TGG GCC AAC TCC AGC TTG ACC−3’(配列番号
24)(下線部のNcoI制限酵素認識部位を含み、図1A中のAIM IIタ
ンパク質コード配列におけるヌクレオチド349〜366を含む)を有する。も
ちろん、当業者は、タンパク質コード配列における5’プライマーの始点が完全
なタンパク質の所望の部分を増幅する(すなわち、より短くまたはより長く)た
めに変化し得ることを理解する。3’プライマーは、配列5’−GGG AAG CTT CAC CAT GAA AGC CCC G−3’(配列番号22
)(下線部のHind III制限部位、続いて図1BのAIM II DNA
配列のヌクレオチド755〜768に相補的なヌクレオチドを含む)を有する。F. Construction of N-terminal AIM II deletion mutant AIM II deletion mutant (Ala (101) -Val (240 in SEQ ID NO: 2)
)), The 5 ′ primer contains the sequence 5′-GGG CCA TGG GCC AAC TCC AGC TTG ACC-3 ′ (SEQ ID NO: 24) (including the underlined NcoI restriction enzyme recognition site and FIG. (Comprising nucleotides 349-366 in the AIM II protein coding sequence). Of course, those skilled in the art will understand that the starting point of the 5 'primer in the protein coding sequence may vary to amplify (ie, shorter or longer) the desired portion of the complete protein. The 3 ′ primer has the sequence 5′-GGG AAG CTT CAC CAT GAA AGC CCC G-3 ′ (SEQ ID NO: 22).
) (Underlined Hind III restriction site followed by AIM II DNA of FIG. 1B)
(Comprising nucleotides complementary to nucleotides 755 to 768 of the sequence).
【0272】 増幅されたAIM II(アミノ酸101〜240)DNAフラグメントおよ
びベクターpQE60をNcoIおよびHind IIIで消化し、次いで、消
化したDNAをともに連結した。AIM II(アミノ酸101〜240)DN
Aの、制限酵素で切断されたpQE60ベクターへの挿入は、IPTG誘導プロ
モーターから下流に、およびインフレームに開始AUGを有するように、AIM
II(アミノ酸101〜240)タンパク質コード領域を配置する。Hind
III消化は、挿入場所の下流の6つのヒスチジンコドンを除去する。The amplified AIM II (amino acids 101-240) DNA fragment and the vector pQE60 were digested with NcoI and HindIII, and the digested DNAs were ligated together. AIM II (amino acids 101-240) DN
Insertion of A into the pQE60 vector cut with the restriction enzyme was performed with the AIM
The II (amino acids 101-240) protein coding region is located. Hind
III digestion removes the six histidine codons downstream of the insertion site.
【0273】 (G.E.coli由来のAIM IIの精製) AIM IIの可溶性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列(配列
番号2のアミノ酸残基、L83−V240に対応する)をHGS E.coli
発現ベクター、pHE4にクローン化した。生じたプラスミドDNA(pHE4
:AIM II.L83−V240)は、SG13009 E.coli宿主細
胞を形質転換するために使用した。この細菌性形質転換体をカナマイシンを含む
LB培地中で増殖させた。IPTG誘導に際して、組換えAIM IIを封入体
中で蓄積される不溶性タンパク質として、E.coli中で発現させた。(Purification of AIM II from GE coli) The polynucleotide sequence encoding the soluble fragment of AIM II (amino acid residue of SEQ ID NO: 2, corresponding to L83-V240) was prepared by HGS E. coli. coli
It was cloned into an expression vector, pHE4. The resulting plasmid DNA (pHE4
: AIM II. L83-V240) is SG13009E. E. coli host cells. This bacterial transformant was grown in LB medium containing kanamycin. Upon IPTG induction, recombinant AIM II as E. coli as an insoluble protein that accumulates in inclusion bodies. E. coli.
【0274】 E.coli細胞ペーストを0.1M Tris−HCl(pH7.4)、2
mM CaCl2を含む緩衝液中で再懸濁し、そしてマイクロフルイダイザー( microfluidizer)(Microfluidics.Newton
.MA)を通して、6000〜8000psiで2回通過することにより溶解し
た。この溶解サンプルを0.5Mの最終濃度までNaClと混合し、次いで70
00×gで20分間遠心分離した。得られたペレットを0.5M NaClを含
む同じ緩衝液で再度洗浄し、次いで7000×gで20分間、再度、遠心分離し
た。E. coli cell paste in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 2
Resuspend in a buffer containing mM CaCl 2 and use a microfluidizer (Microfluidics. Newton).
. MA) through two passes at 6000-8000 psi. The lysed sample was mixed with NaCl to a final concentration of 0.5M, then
Centrifuged at 00 × g for 20 minutes. The resulting pellet was washed again with the same buffer containing 0.5 M NaCl and then centrifuged again at 7000 × g for 20 minutes.
【0275】 次いで、部分精製された封入体を100mM Tris(pH7.4)、2m
M CaCl2、5mM システインを含む2.0M グアニジン塩酸塩中で2 0−25μCで2〜4時間再懸濁し、そして遠心分離した。次いで、得られたペ
レットを5mMシステインを有するか、または有さない100mM Tris(
pH7.4)、2mM CaCl2を含む3.0〜3.5M グアニジン塩酸塩 中で4μCで48〜72時間再懸濁した。この時点で、AIM IIの一部が可
溶化し、そして7000×gの遠心分離後に可溶性相に残存した。Next, the partially purified inclusion body was added to 100 mM Tris (pH 7.4), 2m
Resuspended in M CaCl 2 , 2.0 M guanidine hydrochloride containing 5 mM cysteine at 20-25 μC for 2-4 hours and centrifuged. The resulting pellet was then combined with 100 mM Tris (with or without 5 mM cysteine).
pH 7.4) and resuspended in 3.0-3.5 M guanidine hydrochloride containing 2 mM CaCl 2 at 4 μC for 48-72 hours. At this point, a portion of AIM II was solubilized and remained in the soluble phase after centrifugation at 7000 × g.
【0276】 3Mグアニジン塩酸塩抽出物を50mM Tris−HCl(pH8)、15
0mM 塩化ナトリウムを含む20〜30容量の緩衝液で迅速に希釈した。界面
活性剤(例えば、Tween−20、CHAPS)を添加し、再折りたたみ効力
を増加させ得る。その後、この混合物を、以下に述べるクロマトグラフィー精製
工程前、2〜7日間混合することなく4μCに置く。The 3M guanidine hydrochloride extract was added to 50 mM Tris-HCl (pH 8), 15 mM
Dilute quickly with 20-30 volumes of buffer containing 0 mM sodium chloride. Surfactants (eg, Tween-20, CHAPS) can be added to increase refolding efficacy. This mixture is then placed at 4 μC without mixing for 2-7 days before the chromatographic purification step described below.
【0277】 (AIM IIの液体クロマトグラフィー精製) この希釈したAIM IIサンプルを0.45μmの滅菌フィルターを使用し
て清澄化した。次いで、AIM IIタンパク質を0.5M MESでpH6〜
6.8に調整し、そして強陽イオン交換(POROS HS−50)カラム上で
クロマトグラフを行った。このHSカラムを最初に、50mM MES−NaO
H(pH6.6)および150mM 塩化ナトリウムを含む6〜10カラム容量
の緩衝液で洗浄した。結合タンパク質を50mM MES(pH6.6)中の3
00mM、700mM、1500mM 塩化ナトリウムの段階的勾配の3〜5カ
ラム容量を使用して溶出した。Liquid Chromatographic Purification of AIM II The diluted AIM II sample was clarified using a 0.45 μm sterile filter. The AIM II protein was then purified with 0.5 M MES to pH 6-
Adjusted to 6.8 and chromatographed on a strong cation exchange (POROS HS-50) column. The HS column is first loaded with 50 mM MES-NaO
Washed with 6-10 column volumes of buffer containing H (pH 6.6) and 150 mM sodium chloride. The bound protein was added to 3 mM in 50 mM MES, pH 6.6.
Elution was performed using 3-5 column volumes of a step gradient of 00 mM, 700 mM, 1500 mM sodium chloride.
【0278】 0.7M塩化ナトリウムで溶出したHS画分を水で3倍に希釈した。The HS fraction eluted with 0.7M sodium chloride was diluted three times with water.
【0279】 (細菌の形質転換:) 上記D、EまたはFにおいて生成された発現構築物由来の連結混合物を、Sa
mbrookら、Molecular Cloning:a Laborato
ry Manual,第2版;Cold Spring Harbor Lab
oratory Press、Cold Spring Harbor、NY(
1989)に記載のような標準的手順を用いて、コンピテントE.coli細胞
へ形質転換した。lacリプレッサーを発現し、かつカナマイシン耐性(「Ka
nr」)を与える、プラスミドpREP4の複数のコピーを含むE.coli株 MI5/rep4を、本明細書中に記載の例証的な実施例を実行する際に使用し
た。この株は、AIM IIタンパク質を発現するのに適切な多くの株のうちの
たった1つであり、QIAGEN、Inc.(前出)より市販されていた。形質
転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下においてLBプレート上で
増殖するそれらの能力によって同定した。プラスミドDNAを耐性コロニーから
単離し、そしてクローン化されたDNAの正体を、制限酵素分析、PCRおよび
DNA配列決定によって確認した。Bacterial Transformation: The ligation mixture from the expression constructs generated in D, E or F above was
mbrook et al., Molecular Cloning: a Laborato.
ry Manual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Lab
office Press, Cold Spring Harbor, NY (
1989) using standard procedures as described in E. coli cells were transformed. lac repressor and kanamycin resistance ("Ka
nr ") containing multiple copies of plasmid pREP4. E. coli strain MI5 / rep4 was used in performing the illustrative examples described herein. This strain is only one of many suitable for expressing AIM II protein and is available from QIAGEN, Inc. (See above). Transformants were identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA was isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA was confirmed by restriction analysis, PCR and DNA sequencing.
【0280】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン(100μg/ml)およびカ
ナマイシン(25μg/ml)の両方で補充されたLB培地における液体培養で
一晩(「O/N」)増殖する。O/N培養物は、約1:25〜約1:250の希
釈で大きな培養物を接種するために使用した。この細胞を、600nm(「OD
600」)での光学密度が0.4と0.6との間のになるように増殖させた。次
いで、lacIリプレッサーを不活性化することにより、lacリプレッサー感
受性プロモーターから転写を誘導するために、イソプロピル−β−D−チオガラ
クトピラノシド(「IPTG」)を、最終濃度が1mMになるように添加した。
続いて細胞をさらに3〜4時間インキュベートした。次いで、遠心分離により細
胞を収集した。A clone containing the desired construct is grown overnight ("O / N") in liquid culture in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). The O / N culture was used to inoculate a large culture at a dilution of about 1:25 to about 1: 250. The cells were grown at 600 nm ("OD
Grow at 600 ") between 0.4 and 0.6. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (“IPTG”) is brought to a final concentration of 1 mM to induce transcription from the lac repressor-sensitive promoter by inactivating the lacI repressor. Was added as follows.
The cells were subsequently incubated for a further 3-4 hours. The cells were then collected by centrifugation.
【0281】 次いで、この細胞を6MグアニジンHCl、pH8中で、4℃で3〜4時間、
攪拌した。この細胞細片を遠心分離によって除去し、そしてAIM IIを含む
上清を、200mM NaClを補充した50mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH
6に対して透析した。あるいは、このタンパク質は、プロテアーゼインヒビター
を含む500mM NaCl、20%グリセロール、25mM Tris/HC
l pH7.4に対して透析することによって首尾よく再折り畳みされ得る。再
生後、このタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロ
マトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。あ
るいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程が、純粋な
AIM IIタンパク質を得るために使用され得る。精製されたタンパク質を4
℃で保存するかまたは−80℃で凍結した。The cells were then incubated in 6 M guanidine HCl, pH 8, at 4 ° C. for 3-4 hours.
Stirred. The cell debris was removed by centrifugation and the supernatant containing AIM II was washed with 50 mM sodium acetate buffer pH 200 supplemented with 200 mM NaCl.
Dialyzed against 6. Alternatively, the protein is 500 mM NaCl with protease inhibitors, 20% glycerol, 25 mM Tris / HC
1 Can be successfully refolded by dialysis against pH 7.4. After regeneration, the protein can be purified by ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and size exclusion chromatography. Alternatively, an affinity chromatography step, such as an antibody column, can be used to obtain pure AIM II protein. 4 purified proteins
C. or frozen at -80.degree.
【0282】 (実施例2:バキュロウイルス発現系におけるAIM IIタンパク質のクロ
ーニングおよび発現) (A.全長AIM IIタンパク質の構築:) 寄託されたクローンにおける全長AIM IIタンパク質をコードするcDN
A配列は、その遺伝子の5’および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用して増幅される: この5’プライマーは、配列5’GCT CCA GGA TCC GCC
ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C3’(
配列番号11)(下線部のBam HI制限酵素部位、続いて図1A中のAIM
IIタンパク質に対するコード領域の22塩基(すなわち、ヌクレオチド49
〜70)を含む)を有する。以下のように発現ベクターに挿入され、AIM I
Iをコードする増幅されたフラグメントの5’末端は、有効なシグナルペプチド
を提供する。Kozak,M.,J.Mol.Biol.196:947−95
0(1987)によって記載される、真核生物細胞における翻訳開始のための有
効なシグナルは、構築物のベクター部分に適切に位置する。Example 2 Cloning and Expression of AIM II Protein in Baculovirus Expression System A. Construction of Full Length AIM II Protein: cDN encoding full length AIM II protein in the deposited clone
The A sequence is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene: The 5 'primer has the sequence 5' GCT CCA GGA TCC GCC
ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C3 '(
SEQ ID NO: 11) (underlined Bam HI restriction enzyme site followed by AIM in FIG. 1A)
22 bases of the coding region for the II protein (ie, nucleotide 49
To 70). The AIM I was inserted into the expression vector as follows.
The 5 'end of the amplified fragment encoding I provides an effective signal peptide. Kozak, M .; , J. et al. Mol. Biol. 196: 947-95
The effective signal for translation initiation in eukaryotic cells, described by J. O. (1987), is appropriately located in the vector portion of the construct.
【0283】 3’プライマーは、配列5’GA CGC GGT ACC GTC CAA
TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC3’(配列番号12
)(下線部のAsp718制限酵素認識部位、続いて図1A中に示すAIM I
Iのヌクレオチド770〜795に対して相補的なヌクレオチドを含む)を有す
る。The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ GA CGC GGT ACC GTC CAA
TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC3 '(SEQ ID NO: 12
) (Underlined Asp718 restriction enzyme recognition site followed by AIM I shown in FIG. 1A)
I (comprising nucleotides complementary to nucleotides 770-795).
【0284】 増幅されたフラグメントを、市販のキット(「Geneclean」、BIO
101 Inc.、La Jolla、Ca.)を使用して1%アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、BamHIおよびAsp718
を用いて消化し、そして再び1%アガロースゲル上で精製する。このフラグメン
トは、本明細書においてF2と命名する。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean”, BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Using a 1% agarose gel. This fragment was then converted to BamHI and Asp718.
And purified again on a 1% agarose gel. This fragment is designated herein as F2.
【0285】 ベクターpA2−GPを、Summersら、A Manual of Me
thods for Baculovirus Vectors and In
sect Cell Culture Procedures,Texas A
gricultural Experimental Station Bul
letin No.1555(1987)に記載されるように、標準的手法を使
用して、バキュロウイルス発現系においてAIM IIタンパク質を発現するた
めに使用する。この発現ベクターは、Autographa californ
ica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリへドリン(polyh
edrin)プロモーター、続いて都合の良い制限酵素部位を含む。AcMNP
V gp67のシグナルペプチド(N末端メチオニンを含む)は、ちょうどBa
mHI部位の上流に位置する。シミアンウイルス40(「SV40」)のポリア
デニル化部位は、効率的なポリアデニル化のために使用される。組換えウイルス
の容易な選択のために、E.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が、ポ
リヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入され、そしてポリヘドリン遺伝子のポ
リアデニル化シグナルが続く。クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生
存可能なウイルスを産生するために、このポリヘドリン配列は、両側で、野生型
ウイルスDNAとの細胞媒介相同的組換えのためのウイルス配列に隣接される。The vector pA2-GP was constructed as described in Summers et al., A Manual of Me.
foods for Baculovirus Vectors and In
sec Cell Culture Procedures, Texas A
gricultural Experimental Station Bull
Letin No. 1555 (1987), and used to express the AIM II protein in a baculovirus expression system using standard techniques. This expression vector is Autographa californ.
ica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), a potent polyhedrin (polyh
edrin) promoter, followed by convenient restriction sites. AcMNP
The signal peptide of V gp67 (including the N-terminal methionine) is just Ba
Located upstream of the mHI site. The simian virus 40 ("SV40") polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses, E. coli The β-galactosidase gene from E. coli is inserted in the same direction as the polyhedrin promoter, and is followed by a polyadenylation signal of the polyhedrin gene. The polyhedrin sequence is flanked on both sides by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA to produce a viable virus expressing the cloned polynucleotide.
【0286】 他の多くのバキュロウイルスベクター(例えば、pAc373、pVL941
およびpAcIM1)は、pA2−GPの代わりに使用され得る。これらは、当
業者が、構築物を必要に応じて、転写、翻訳、輸送などのために適切に配置され
たシグナル(例えば、インフレームAUGおよびシグナルペプチド)を提供する
ことを理解するように提供される。このようなベクターは、とりわけ、Luck
owら、Virology 170:31−39に記載される。[0286] Many other baculovirus vectors (eg, pAc373, pVL941
And pAcIM1) can be used instead of pA2-GP. These are provided so that one of skill in the art would understand that the constructs provide signals (eg, in-frame AUGs and signal peptides) appropriately arranged for transcription, translation, transport, etc., as needed. You. Such vectors are, inter alia, Luck
ow et al., Virology 170: 31-39.
【0287】 プラスミドを、制限酵素Bam HIおよびAsp 718を用いて消化し、
次いで、当該分野において公知の慣用的手順を使用して、仔ウシ腸ホスファター
ゼを用いて脱リン酸化する。次いで、このDNAを市販のキット(「Genec
lean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して
1%アガロースゲルから単離する。このベクターDNAを、本明細書中において
「V」と命名する。The plasmid was digested with the restriction enzymes Bam HI and Asp 718,
It is then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase using conventional procedures known in the art. This DNA was then transferred to a commercially available kit ("Genec
lean "BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Using a 1% agarose gel. This vector DNA is designated herein as "V".
【0288】 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼ
を用いてともに連結する。E.coli HB101細胞をライゲーション混合
物を用いて形質転換し、そして培養プレート上に広げた。ヒトAIM II遺伝
子を有するプラスミドを含む細菌を、XbaIを使用して個々のコロニー由来の
DNAを消化し、次いでゲル電気泳動により消化産物を分析することによって、
同定する。クローン化されたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって確
認する。このプラスミドを、本明細書中でpBacAIM IIと命名する。Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 are ligated together using T4 DNA ligase. E. FIG. E. coli HB101 cells were transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Bacteria containing the plasmid with the human AIM II gene are digested with DNA from individual colonies using XbaI, and then analyzed by gel electrophoresis for digestion products.
Identify. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing. This plasmid is designated herein as pBacAIM II.
【0289】 (B.N末端AIM II欠失変異体の構築:) この例示的な例において、AIM IIタンパク質のN末端欠失をコードする
クローン化DNAをバキュロウイルスに挿入するために、プラスミドシャトルベ
クターpA2 GPを使用し、そして、バキュロウイルスリーダーおよびSum
mersら、A Manual of Methods for Baculo
virus Vectors and Insect Cell Cultur
e Procedures,Texas Agricultural Expe
rimental Station Bulletin No.1555(19
87)に記載される標準的方法を使用して、配列番号2におけるAIM II変
異体(Gln(60)〜Val(240))およびAIM II変異体(Ser
(79)〜Val(240))を発現させた。この発現ベクターは、Autog
rapha californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強
力なポリへドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスgp67タンパク質の
分泌シグナルペプチド(リーダー)および都合の良い制限部位(例えば、Bam
HI、Xba IおよびAsp718)を含む。シミアンウイルス40(「SV
40」)のポリアデニル化部位は、効率的なポリアデニル化のために使用される
。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同じ方向の弱いD
rosophilaプロモーターの制御下で、E.coli由来のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含み、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを
含む。この挿入された遺伝子は、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する
生存可能なウイルスを産生するために、両側で、野生型ウイルスDNAとの細胞
媒介相同的組換えのためのウイルス配列に隣接される。B. Construction of N-Terminal AIM II Deletion Mutants: In this illustrative example, the plasmid shuttle was used to insert the cloned DNA encoding the N-terminal deletion of AIM II protein into a baculovirus. The vector pA2 GP was used and a baculovirus leader and Sum
mers et al., A Manual of Methods for Baculo.
virus Vectors and Insect Cell Cultur
e Procedures, Texas Acrocultural Expe
rimental Station Bulletin No. 1555 (19
87) and the AIM II variants (Gln (60) -Val (240)) and AIM II variants (Ser
(79) to Val (240)) were expressed. This expression vector is Autog
rapa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) strong polyhedrin promoter, followed by the secretion signal peptide (leader) of the baculovirus gp67 protein and convenient restriction sites (eg, Bam).
HI, Xba I and Asp718). Simian virus 40 ("SV
The 40 ') polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. For easy selection of the recombinant virus, this plasmid contains a weak D
under the control of the E. rosophila promoter. E. coli containing the β-galactosidase gene, followed by the polyhedrin gene polyadenylation signal. This inserted gene is flanked on both sides by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA to produce a viable virus expressing the cloned polynucleotide. .
【0290】 構築物が、転写、翻訳、分泌などのために適切に位置されたシグナル(必要に
応じて、シグナルペプチドおよびインフレームAUGを含む)を提供する限り、
当業者が容易に理解するような、他の多くのバキュロウイルスベクターは、上記
ベクター(例えば、pAc373、pVL941およびpAcIM1)の代わり
に使用され得る。このようなベクターは、例えばLuckowら、Virolo
gy 170:31−39に記載される。As long as the construct provides appropriately positioned signals for transcription, translation, secretion, etc., including, where appropriate, signal peptides and in-frame AUGs.
Many other baculovirus vectors can be used in place of the above vectors (eg, pAc373, pVL941 and pAcIM1), as will be readily appreciated by those skilled in the art. Such vectors are described, for example, in Luckow et al., Virolo.
gy 170: 31-39.
【0291】 AIM II(Gln(60)〜Val(240))(図1A(配列番号2)
)をコードするcDNA配列を、この遺伝子の5’および3’配列に対応するP
CRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。AIM II (Gln (60) to Val (240)) (FIG. 1A (SEQ ID NO: 2)
) Is inserted into the P's corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene.
Amplification was performed using CR oligonucleotide primers.
【0292】 この5’プライマーは、配列5’−GGG GGA TCC CGCA GC
T GCA CTG GCG TCT AGG−3’(配列番号25)(下線部
のBamHI制限酵素部位、続いて図1AおよびBに示されるAIM IIタン
パク質をコードする、このタンパク質のアミノ酸60で始まる20ヌクレオチド
(すなわち、ヌクレオチド225〜245)を含む)を有する。3’プライマー
は、配列5’−GGG TCT AGA CAC CAT GAA AGC C
CC G−3’(配列番号26)(下線部のXbaI制限部位、続いて図1B(
配列番号1)中のヌクレオチド753−768に対して相補的なヌクレオチドを
含む)を有する。The 5 ′ primer has the sequence 5′-GGG GGA TCC CGCA GC
TGCA CTG GCG TCT AGG-3 '(SEQ ID NO: 25) (20 nucleotides starting at amino acid 60 of this protein, encoding the BamHI restriction enzyme site underlined, followed by the AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (ie, , Nucleotides 225-245). The 3 'primer has the sequence 5'-GGG TCT AGA CAC CAT GAA AGC C
CC G-3 ′ (SEQ ID NO: 26) (underlined XbaI restriction site followed by FIG. 1B (
(Comprising nucleotides complementary to nucleotides 753-768 in SEQ ID NO: 1).
【0293】 増幅されたフラグメントを、市販のキット(「Geneclean」、BIO
101 Inc.,La Jolla、Ca.)を使用して1%アガロースゲ
ルより単離した。次いで、このフラグメントをBamHIおよびXbaIを用い
て消化し、そして再び1%アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、
本明細書中で「F1」と称した。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean”, BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Was used to isolate from a 1% agarose gel. This fragment was then digested with BamHI and XbaI and again purified on a 1% agarose gel. This fragment
It was designated "F1" in this specification.
【0294】 このプラスミドを制限酵素BamHIおよびXbaIで消化した。そして必要
に応じて、当該分野において公知の慣用的な手順を用いて、このプラスミドをウ
シ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化し得る。次に、このDNAを市販のキ
ット(「Geneclean」BIO 101 Inc.、La Jolla、
Ca.)を使用して、1%アガロースゲルから単離した。このベクターDNAを
、本明細書において「V1」と称した。This plasmid was digested with restriction enzymes BamHI and XbaI. And, if desired, the plasmid can be dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase using conventional procedures known in the art. This DNA was then converted to a commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla,
Ca. ) Was isolated from a 1% agarose gel. This vector DNA was designated herein as "V1".
【0295】 フラグメントF1および脱リン酸化プラスミドV1をともに、T4 DNAリ
ガーゼを用いて連結した。E.coli HB101または他の適切なE.co
li宿主(例えば、XL−1 Blue(Stratagene Clonin
g Systems、La Jolla、CA))細胞を、連結混合液を用いて
形質転換し、そして培養プレート上に広げた。PCR法を使用して、ヒトAIM
II遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定した。PCR法において、使
用されたプライマーの1つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第2のプ
ライマーは十分にベクターの内部からであり、その結果AIM II遺伝子フラ
グメントを含有する細菌コロニーのみがDNAの増幅を示す。クローン化された
フラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認した。このプラスミドを、
本明細書においてpBacAIM II(aa60〜240)と称した。[0295] Fragment F1 and the dephosphorylated plasmid V1 were both ligated using T4 DNA ligase. E. FIG. coli HB101 or other suitable E. coli. co
li host (eg, XL-1 Blue (Stratagene Clonin)
g Systems, La Jolla, Calif.) Cells were transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Using the PCR method, human AIM
Bacteria containing the plasmid with the II gene were identified. In the PCR method, one of the primers used was to amplify this gene and the second primer was sufficiently from inside the vector so that only bacterial colonies containing the AIM II gene fragment 2 shows the amplification of. The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing. This plasmid is
It was designated pBacAIM II (aa 60-240) herein.
【0296】 AIM IIをコードするcDNA配列(Ser(79)〜Val(240)
、図1A,配列番号2)を、遺伝子の5’配列および3’配列に対応するPCR
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。The cDNA sequence encoding AIM II (Ser (79) to Val (240)
, FIG. 1A, SEQ ID NO: 2) was used to determine the PCR corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the gene.
Amplification was performed using oligonucleotide primers.
【0297】 5’プライマーは、下線のBamHI制限酵素部位、それに続く、タンパク質
のアミノ酸79で始まる、図1AおよびBに示されるAIM IIタンパク質を
コードするヌクレオチド283〜301を含む、配列: 5’cgc GGATCC C TCCTGGGAGCAGCTGATAC 3
’(配列番号27)を有する。3’プライマーは、下線のBamHI制限酵素部
位、それに続く、図1B(配列番号1)におけるヌクレオチド757〜771に
相補的なヌクレオチドを含む、配列: 5’−cgc GGATCC TCA CACCATGAAAGC−3’(配列
番号29)を有する。The 5 ′ primer contains the underlined BamHI restriction enzyme site, followed by nucleotides 283-301 encoding the AIM II protein shown in FIGS. 1A and B, beginning at amino acid 79 of the protein. GGATCC C TCCTGGGAGCAGCTGATAC 3
'(SEQ ID NO: 27). 3 'primer, underlined BamHI restriction enzyme site, followed, including nucleotides complementary to nucleotides 757-771 in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1), the sequence: 5'-cgc GGATCC TCA CACCATGAAAGC- 3' ( SEQ ID NO: 29).
【0298】 増幅したフラグメントを、市販のキット(「Geneclean」BIO 1
01 Inc.、La Jolla、Ca.)を使用して、1%アガロースゲル
から単離した。次に、このフラグメントを、BamHIを用いて消化し、そして
再度1%アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、本明細書において
「F1」と称した。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean” BIO 1
01 Inc. , La Jolla, Ca. ) Was isolated from a 1% agarose gel. The fragment was then digested with BamHI and purified again on a 1% agarose gel. This fragment was designated herein as "F1".
【0299】 このプラスミドを制限酵素BamHIで消化した。そして必要に応じて、当該
分野において公知の慣用的な手順を用いて、このプラスミドをウシ腸ホスファタ
ーゼを使用して脱リン酸化し得る。次に、このDNAを市販のキット(「Gen
eclean」BIO 101 Inc.、La Jolla、Ca.)を使用
して、1%アガロースゲルから単離した。このベクターDNAを、本明細書にお
いて「V1」と称した。This plasmid was digested with the restriction enzyme BamHI. And, if desired, the plasmid can be dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase using conventional procedures known in the art. Next, this DNA was converted into a commercially available kit (“Gen
eclean "BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Was isolated from a 1% agarose gel. This vector DNA was designated herein as "V1".
【0300】 フラグメントF1および脱リン酸化プラスミドV1をともに、T4 DNAリ
ガーゼを用いて連結した。E.coli HB101または他の適切なE.co
li宿主(例えば、XL−1 Blue(Stratagene Clonin
g Systems、La Jolla、CA))細胞を、連結混合液を用いて
形質転換し、そして培養プレート上に広げた。PCR法を使用して、変異AIM
II遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定した。PCR法において、使
用されたプライマーの1つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第2のプ
ライマーは十分にベクターの内部からであり、その結果AIM II遺伝子フラ
グメントを含有する細菌コロニーのみがDNAの増幅を示す。クローン化された
フラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認した。このプラスミドを、
本明細書においてpBacAIM II(aa79〜240)と称した。Fragment F1 and dephosphorylated plasmid V1 were both ligated using T4 DNA ligase. E. FIG. coli HB101 or other suitable E. coli. co
li host (eg, XL-1 Blue (Stratagene Clonin)
g Systems, La Jolla, Calif.) Cells were transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Mutation AIM using PCR method
Bacteria containing the plasmid with the II gene were identified. In the PCR method, one of the primers used was to amplify this gene and the second primer was sufficiently from inside the vector so that only bacterial colonies containing the AIM II gene fragment 2 shows the amplification of. The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing. This plasmid is
It was designated pBacAIM II (aa 79-240) herein.
【0301】 (C.AIM II配列を含むバキュロウイルスベクターのトランスフェクシ
ョン) pBacAIM IIまたはpBacAIM II(aa60〜240)のい
ずれかのプラスミド5μgを、市販の直線状バキュロウイルスDNA(「Bac
uloGoldTMバキュロウイルスDNA」、Pharmingen、San
Diego、CA)1.0μgと共に、Felgnerら、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA、 84:7413〜7417(1987)に記載
されるリポフェクション法を使用して、同時トランスフェクションした。1μg
のBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラスミドpBacA
IM IIまたはpBacAIM II(aa60〜240)を、50μlの無
血清グレース培地(Grace’s medium)(Life Techno
logies Inc.、Gaithersburg、MD)を含有する、滅菌
したマイクロタイタープレートのウェル中で混合した。その後、10μlのLi
pofectinおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温
で15分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を、1ml
の無血清グレース培地を有する35mm組織培養プレート中に播種したSf9昆
虫細胞(ATCC CRL 1711)に、滴下した。このプレートを前後に揺
らし、新たに添加した溶液を混合した。次にこのプレートを27℃で5時間イン
キュベートした。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして10%ウシ胎仔血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加した。こ
のプレートを培養器に戻し、そして27℃での培養を4日間続けた。C. Transfection of Baculovirus Vectors Containing AIM II Sequences 5 μg of either pBacAIM II or pBacAIM II (aa 60-240) plasmids were prepared using commercially available linear baculovirus DNA (“BacAIM II”).
uloGold ™ Baculovirus DNA ”, Pharmingen, San
(Diego, CA) with 1.0 μg together with Felgner et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987). 1 μg
BaculoGold ™ viral DNA and 5 μg of plasmid pBacA
IM II or pBacAIM II (aa 60-240) was added to 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Techno).
logs Inc. , Gaithersburg, Md.) In sterile microtiter plate wells. Then, 10 μl of Li
Pofectin and 90 μl of Grace's medium were added, mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. Next, 1 ml of the transfection mixture
Were dropped into Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) seeded in 35 mm tissue culture plates with serum-free Grace's medium. The plate was rocked back and forth to mix the newly added solution. The plate was then incubated at 27 ° C for 5 hours. After 5 hours, the transfection solution was removed from the plate,
Then, 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal calf serum was added. The plate was returned to the incubator and incubation at 27 ° C. continued for 4 days.
【0302】 4日後、上清を回収し、そしてプラークアッセイを、SummersおよびS
mith(上記に引用)によって記載されるように行った。「Blue Gal
」(Life Technologies Inc.、Gaithersbur
g)を有するアガロースゲルを使用して、青く染まるプラークを産生するgal
発現クローンの容易な同定および単離を可能とした。(このタイプの「プラーク
アッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc
.、Gaithersburgによって頒布された昆虫細胞培養とバキュロウイ
ルス学のための使用者のガイド(9〜10頁)において見出され得る)。After 4 days, supernatants were collected and plaque assays were performed with Summers and S
performed as described by mit (cited above). "Blue Gal
(Life Technologies Inc., Gaithersburg)
using agarose gel with g) to produce plaques that stain blue
It allows easy identification and isolation of expression clones. (A detailed description of this type of "plaque assay" is also available at Life Technologies Inc.
. (Guide to insect cell culture and baculovirology distributed by Gaithersburg, pp. 9-10).
【0303】 段階希釈の4日後、このウイルスをこの細胞に添加した。適切なインキュベー
ションの後に、青く染まるプラークをエッペンドルフピペットのチップを用いて
拾った。次に、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含有
するエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。寒天を短時間の遠心分離によって
除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュ中に
播種された昆虫Sf9細胞に対して使用した。4日後、これらの培養ディッシュ
の上清を回収し、次に上清を4℃で保存した。適切に挿入されたhESSB I
、IIおよびIIIを含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むD
NA分析によって同定した。このクローンを、本明細書においてV−AIM I
IまたはV−AIM II(aa60〜240)と称した。After 4 days of serial dilution, the virus was added to the cells. After appropriate incubation, plaques that stained blue were picked up using the tips of an Eppendorf pipette. Next, the agar containing the recombinant virus was resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. The agar was removed by brief centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus was used on insect Sf9 cells seeded in 35 mm dishes. Four days later, the supernatants of these culture dishes were collected, and then the supernatant was stored at 4 ° C. HESSB I properly inserted
, II and III were cloned into D, including restriction mapping and sequencing.
Identified by NA analysis. This clone was designated herein as V-AIMI
I or V-AIM II (aa 60-240).
【0304】 Sf9細胞に10%の熱非働化FBSを補充したグレース培地中で増殖した。
この細胞を、約2(約1〜約3)の感染多重度(「MOI」)で、組換えバキュ
ロウイルスV−AIM IIまたはV−AIM II(aa60〜240)に感
染させた。6時間後、この培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを
含まないSF900II培地(Life Technologies Inc.
、Gaithersburgより入手可能)で置き換えた。42時間後、5μC
iの35Sメチオニンおよび5μCiの35Sシステイン(Amershamより入
手可能)を、添加した。この細胞をさらに16時間インキュベートし、次に遠心
分離によって回収し、溶解し、そして標識したタンパク質をSDS−PAGEお
よびオートラジオグラフィーによって可視化した。[0304] Sf9 cells were grown in Grace's medium supplemented with 10% heat inactivated FBS.
The cells were infected with the recombinant baculovirus V-AIM II or V-AIM II (aa 60-240) at a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 (about 1 to about 3). After 6 hours, the medium was removed and methionine and cysteine free SF900II medium (Life Technologies Inc.).
, Available from Gaithersburg). After 42 hours, 5 μC
i 35 S methionine and 5 μCi 35 S cysteine (available from Amersham) were added. The cells were incubated for an additional 16 hours, then harvested by centrifugation, lysed, and labeled proteins visualized by SDS-PAGE and autoradiography.
【0305】 (実施例3:哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現) 哺乳動物細胞中で、AIM IIタンパク質遺伝子配列の一過性の発現のため
に使用されるほとんどのベクターは、SV40の複製起点を含むべきである。こ
のことは、ウイルスDNA合成の開始に必要とされるT抗原を発現する細胞(例
えば、COS細胞)中での、高コピー数までのベクターの複製を可能とする。任
意の他の哺乳動物細胞株はまた、この目的に利用され得る。Example 3 Cloning and Expression in Mammalian Cells Most vectors used for the transient expression of AIM II protein gene sequences in mammalian cells contain the SV40 origin of replication. Should. This allows for replication of the vector up to high copy numbers in cells (eg, COS cells) that express the T antigen required for initiation of viral DNA synthesis. Any other mammalian cell lines can also be utilized for this purpose.
【0306】 代表的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、転写の終結および転写物のポリアデニ
ル化に必要とされるシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサ
ー、Kozak配列、およびRNAスプライシングのドナーおよびアクセプター
部位に隣接する介在配列が挙げられる。高効率の転写は、SV40の初期および
後期プロモーター、レトロウイルス(例えば、RSV、HTLVI、HIVI)
の長末端反復配列(LTR)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期
プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞性のシグナル(例えば、ヒト
アクチンプロモーター)もまた使用され得る。本発明の実施における使用のため
の適切な発現ベクターとしては、例えば、pSVLおよびpMSG(Pharm
acia、Uppsala、Sweden)、pRSVcat(ATCC 37
152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)およびpBC12MI(
ATCC 67109)のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物
宿主細胞としては、ヒトHeLa、283、H9およびジャーカット細胞、マウ
スNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、アフリ
カミドリザル細胞、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞が挙げられる。A typical mammalian expression vector contains a promoter element that mediates the initiation of mRNA transcription, a protein coding sequence, signals required for termination of transcription and polyadenylation of the transcript. Additional elements include enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanking donor and acceptor sites for RNA splicing. Highly efficient transcription is due to the early and late promoters of SV40, retroviruses (eg, RSV, HTLVI, HIVI)
Long terminal repeat (LTR), as well as the cytomegalovirus (CMV) early promoter. However, cellular signals such as the human actin promoter can also be used. Suitable expression vectors for use in the practice of the present invention include, for example, pSVL and pMSG (Pharm
acia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37)
152), pSV2dhfr (ATCC 37146) and pBC12MI (
ATCC 67109). Mammalian host cells that can be used include human HeLa, 283, H9 and Jurkat cells, mouse NIH3T3 and C127 cells, Cos1, Cos7 and CV1, African green monkey cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells and Chinese hamster ovary Cells.
【0307】 あるいは、この遺伝子は、染色体中に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細
胞株中で発現され得る。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンの
ような選択マーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクションさ
れた細胞の同定および単離を可能にする。Alternatively, the gene can be expressed in a stable cell line that contains the gene integrated into a chromosome. Co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin allows identification and isolation of the transfected cells.
【0308】 トランスフェクションされた遺伝子はまた増幅され、コードされるタンパク質
を大量に発現し得る。DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)は、目的の遺伝子の数
百コピーまたは数千コピーさえも保有する細胞株を発生させるための有用なマー
カーである。別の有用な選択マーカーは、グルタミンシンターゼ酵素(GS)で
ある(Murphyら、Biochem J.227:277〜279(199
1);Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169
〜175(1992))。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を、選択
培地中で増殖し、そして最も高度な耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞
株は、染色体中に組み込まれた増殖した遺伝子を含有する。チャイニーズハムス
ター卵巣(CHO)細胞は、しばしばタンパク質の産生に使用される。The transfected gene may also be amplified and express the encoded protein in large quantities. DHFR (dihydrofolate reductase) is a useful marker for generating cell lines that carry hundreds or even thousands of copies of the gene of interest. Another useful selectable marker is the glutamine synthase enzyme (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (199).
1); Bebbington et al., Bio / Technology 10: 169.
175 (1992)). Using these markers, mammalian cells are grown in selective media and cells with the highest resistance are selected. These cell lines contain the propagated gene integrated into the chromosome. Chinese hamster ovary (CHO) cells are often used for protein production.
【0309】 発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー(LTR)(Cullenら、Molecular and Cellula
r Biology、438〜447(March、1985))、およびCM
Vエンハンサーのフラグメント(Boshartら、Cell 41:521〜
530(1985))を含む。多重クローニング部位(例えば、BamHI、X
baIおよびAsp718の制限酵素切断部位を有する)は、目的の遺伝子のク
ローニングを促進する。このベクターは、3’イントロンに加えて、ラットプレ
プロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナルを含む。The expression vectors pC1 and pC4 contain the Rous sarcoma virus strong promoter (LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellula).
r Biology, 438-447 (March, 1985)), and CM
V enhancer fragment (Boshart et al., Cell 41: 521-
530 (1985)). Multiple cloning sites (eg, BamHI, X
baI and Asp718 restriction sites) facilitate cloning of the gene of interest. This vector contains, in addition to the 3 'intron, polyadenylation and termination signals of the rat preproinsulin gene.
【0310】 (実施例3(a):COS細胞におけるクローニングおよび発現) 発現プラスミドpAIM II HAを、AIM IIをコードするcDNA
を発現ベクターpcDNAI/Amp(Invitrogen,Inc.より入
手され得る)内にクローニングすることにより作製する。Example 3 (a): Cloning and Expression in COS Cells The expression plasmid pAIM II HA was replaced with cDNA encoding AIM II
Is cloned into the expression vector pcDNAI / Amp (available from Invitrogen, Inc.).
【0311】 発現ベクターpcDNAI/ampは、以下を含む:(1)E.coliおよ
び他の原核生物細胞において増殖に効果的なE.coliの複製起点;(2)プ
ラスミドを保持する原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子;(3
)真核生物細胞において増殖のためのSV40複製起点;(4)配列されたCM
Vプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン、およびポリアデニル化シ
グナル(その結果、cDNAは、ポリリンカー中の制限部位により都合よく、C
MVプロモーターの発現制御下に配置され得、そしてSV40イントロンおよび
ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る)。The expression vector pcDNAI / amp contains: (1) E. coli. E. coli effective for growth in E. coli and other prokaryotic cells. E. coli origin of replication; (2) ampicillin resistance gene for selection of prokaryotic cells carrying the plasmid; (3
) SV40 origin of replication for growth in eukaryotic cells; (4) sequenced CM
V promoter, polylinker, SV40 intron, and polyadenylation signal (so that the cDNA is more convenient due to the restriction sites in the polylinker,
Can be placed under the control of the expression of the MV promoter, and can be operably linked to the SV40 intron and polyadenylation signal).
【0312】 AIM IIタンパク質をコードするDNAフラグメントおよびその3’末端
にインフレームで融合されたHAタグを、組換えタンパク質の発現がCMVプロ
モーターにより指向されるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化す
る。HAタグは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)に記載
される、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応す
る。HAタグの標的タンパク質への融合は、そのHAエピトープを認識する抗体
を用いる組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。The DNA fragment encoding the AIM II protein and the HA tag fused in frame to its 3 ′ end were cloned into the polylinker region of the vector such that expression of the recombinant protein was driven by the CMV promoter. I do. The HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein described in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Fusion of an HA tag to a target protein allows for easy detection of the recombinant protein using an antibody that recognizes the HA epitope.
【0313】 プラスミド構築戦略は、以下の通りである。寄託されたクローンのAIM I
I cDNAを、E.coliにおけるAIM II発現のための発現ベクター
の構築に関する上記とほぼ同様に、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用
して増幅する。発現されたAIM IIの検出、精製および特徴づけを容易にす
るために、プライマーの1つは、上記の赤血球凝集素タグ(「HAタグ」)を含
む。[0313] The plasmid construction strategy is as follows. AIM I of the deposited clone
The I cDNA was converted to E. coli. Amplification is performed using primers containing convenient restriction sites, much as described above for the construction of expression vectors for AIM II expression in E. coli. One of the primers includes a hemagglutinin tag ("HA tag") as described above to facilitate detection, purification and characterization of the expressed AIM II.
【0314】 適切なプライマーとしては、以下のものが挙げられ、これを本実施例において
使用する。5’プライマー(下線部のBamHI部位、およびAUG開始コドン
を含む)は、以下の配列を有する: 5’GAG CTC GGA TCC GCC ATC ATG GAG G
AG AGT GTC GTA CGGC 3’(配列番号13)。[0314] Suitable primers include the following, which are used in this example. The 5 'primer (including the underlined BamHI site and the AUG start codon) has the following sequence: 5'GAG CTC GGA TCC GCC ATC ATG GAG G
AG AGT GTC GTA CGGC 3 '(SEQ ID NO: 13).
【0315】 3’プライマー(下線部のXbaI部位、終止コドン、後に赤血球凝集素HA
タグを形成する9コドン、および3’コード配列(3’末端での)の33bpを
含む)は、以下の配列を有する: 5’GAT GTT CTA GAA AGC GTA GTC TGG G
AC GTC GTA TGG GTA CAC CAT GAA AGC C
CC GAA GTA AGA CCG GGT AC 3’(配列番号14)
。The 3 ′ primer (underlined XbaI site, stop codon, followed by hemagglutinin HA
The 9 codons that form the tag, and the 3 'coding sequence (at the 3' end, including 33 bp) have the following sequence: 5 'GAT GT T CTA GA A AGC GTA GTC TGG G
AC GTC GTA TGG GTA CAC CAT GAA AGC C
CC GAA GTA AGA CCG GGT AC 3 '(SEQ ID NO: 14)
.
【0316】 PCR増幅されたDNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを
、HindIIIおよびXhoIで消化し、次いで連結した。連結混合物を、E
.coli SURE株(Stratagene Cloning Syste
ms,11099 North Torrey Pines Road,La
Jolla,CA 92037より入手可能)内に形質転換し、そして形質転換
した培養物を、アンピシリン培地プレート上にプレートし、次いで、プレートを
インキュベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させ得る。プラスミドD
NAを、耐性コロニーより単離し、そしてAIM IIコードフラグメントの存
在について、制限分析およびゲル泳動により試験した。The PCR amplified DNA fragment and the vector pcDNAI / Amp were digested with HindIII and XhoI and then ligated. The linked mixture is
. coli SURE strain (Stratagene Cloning System)
ms, 11099 North Torrey Pines Road, La
(Available from Jolla, CA 92037), and the transformed culture is plated on ampicillin media plates, and the plates can then be incubated to grow ampicillin-resistant colonies. Plasmid D
NA was isolated from resistant colonies and tested by restriction analysis and gel electrophoresis for the presence of the AIM II coding fragment.
【0317】 組換えAIM IIの発現のために、COS細胞を、DEAE−DEXTRA
N(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:a
Laboratory Manual,Cold Spring Labora
tory Press,Cold Spring Harbor,New Yo
rk(1989)に記載されるような)を使用して、上記の発現ベクターでトラ
ンスフェクトした。細胞を、ベクターによるAIM IIの発現のための条件下
でインキュベートした。For expression of recombinant AIM II, COS cells were transformed with DEAE-DEXTRA
N (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, Cold Spring Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, New Yo
rk (as described in 1989)). Cells were incubated under conditions for expression of AIM II by the vector.
【0318】 AIM II HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら、An
tibodies:A Laboratory Manual,第2版;Col
d Spring Harbor Laboratory Press,Col
d Spring Harbor,New York(1988)に記載される
方法を使用して、放射標識および免疫沈澱により検出する。この目的ために、ト
ランスフェクション2日後に、細胞を、35Sシステインを含む培地中での、8時
間のインキュベーションにより標識した。細胞および培地を収集して、そして細
胞を洗浄し、そして界面活性剤含有RIPA緩衝液:150mM NaCl、1
%NP−40、0.1%SDS、1%NP−40、0.5%DOC、50mM
TRIS、pH7.5(上記に引用されたWilsonらにより記載される)で
溶解した。タンパク質を細胞溶解物から沈殿させ、そしてHA特異的モノクロー
ナル抗体を使用して培養培地から沈殿させた。次いで、沈殿させたタンパク質を
、SDS−PAGEゲルおよびオートラジオグラフィーにより分析した。予期さ
れる大きさの発現産物を、細胞溶解物中に見出し、それはネガティブコントロー
ルには見られなかった。[0318] Expression of the AIM II HA fusion protein is determined, for example, by the method of Harlow et al., An.
tibodies: A Laboratory Manual, 2nd edition; Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Detection by radiolabeling and immunoprecipitation using the method described in Spring Harbor, New York (1988). To this end, two days after transfection, the cells were labeled by incubation for 8 hours in medium containing 35 S cysteine. Cells and media are collected and cells are washed and detergent-containing RIPA buffer: 150 mM NaCl, 1
% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM
Dissolved in TRIS, pH 7.5 (described by Wilson et al., Cited above). Protein was precipitated from cell lysate and precipitated from the culture medium using an HA-specific monoclonal antibody. The precipitated proteins were then analyzed by SDS-PAGE gel and autoradiography. An expression product of the expected size was found in the cell lysate, which was not found in the negative control.
【0319】 (実施例3(b):CHO細胞におけるクローニングおよび発現) ベクターpC4をAIM IIタンパク質の発現に使用する。プラスミドpC
1は、プラスミドpSV2−dhfr(ATCC受託番号37146)の誘導体
である。両プラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下にマウスDHFR
遺伝子を含む。これらのプラスミドをトランスフェクトさせる、ジヒドロ葉酸活
性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療法剤メ
トトレキセートを補充した選択培地(αマイナスMEM、Life Techn
ologies)において細胞を増殖することにより選択され得る。メトトレキ
セート(MTX)に耐性な細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は、詳細に実証さ
れている(例えば、Alt,F.W.、Kellems,R.M.、Berti
no,J.R.、およびSchimke,R.T.、1978、J.Biol.
Chem.253:1357−1370、Hamlin,J.L.およびMa,
C.1990、Biochem.et Biophys.Acta、1097:
107−143、Page,M.J.およびSydenham,M.A.199
1、Biotechnology 第9巻:64−68を参照のこと)。増加す
るMTXの濃度において増殖される細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として
、標的酵素DHFRを過剰生成することにより薬物に対する耐性を発生する。第
2の遺伝子がDHFR遺伝子に連結される場合、それは通常、同時増幅され、そ
して過剰発現される。それは、1000コピーを超える遺伝子を保持する細胞株
を発生するための当該技術の常識である。引き続き、メトトレキセートが回収さ
れる場合、細胞株は、染色体内に組込まれた増幅された遺伝子を保持する。Example 3 (b): Cloning and Expression in CHO Cells The vector pC4 is used for the expression of AIM II protein. Plasmid pC
1 is a derivative of plasmid pSV2-dhfr (ATCC Accession No. 37146). Both plasmids contain the mouse DHFR under the control of the SV40 early promoter.
Including genes. Chinese hamster ovary cells or other cells deficient in dihydrofolate activity, transfected with these plasmids, are selected from selective media (α minus MEM, Life Techn) supplemented with the chemotherapeutic agent methotrexate.
in the cultures). Amplification of the DHFR gene in cells resistant to methotrexate (MTX) has been well documented (eg, Alt, FW, Kellems, RM, Berti).
no. R. And Schimke, R .; T. 1978; Biol.
Chem. 253: 1357-1370; Hamlin, J. M .; L. And Ma,
C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:
107-143, Page, M .; J. And Sydenham, M .; A. 199
1, Biotechnology 9: 64-68). Cells grown at increasing concentrations of MTX develop resistance to the drug by overproducing the target enzyme DHFR as a result of amplification of the DHFR gene. When a second gene is linked to a DHFR gene, it is usually co-amplified and overexpressed. It is common knowledge in the art to generate cell lines that carry more than 1000 copies of a gene. Subsequently, if methotrexate is recovered, the cell line will carry the amplified gene integrated into the chromosome.
【0320】 プラスミドpC4は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの
長末端反復配列(LTR)の強力なプロモーター(Cullenら、Molec
ular and Cellular Biology、March 1985
:438−447)およびヒトサイトメガロウイルス(CMV)の前初期遺伝子
のエンハンサーから単離されたフラグメント(Boshartら、Cell 4
1:521−530(1985))を含む。プロモーターの下流には、遺伝子の
組み込みを可能にするBamHI、XbaI、およびAsp718制限酵素切断
部位が存在する。このプラスミドは、これらのクローニング部位の後に、ラット
プレプロインスリン遺伝子の3’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。
他の高い効率のプロモーターもまた、発現のために使用され得る(例えば、ヒト
βアクチンプロモーター、SV40初期または後期プロモーター、あるいは他の
レトロウイルス(例えば、HIVおよびHTLVI)由来の長末端反復配列)。
Clontech’s Tet−OffおよびTet−On遺伝子発現系ならび
に同様の系は、哺乳動物細胞の調節方法においてAIM IIを発現するために
使用され得る(Gossen,M.およびBujard,H.1992,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551)。mR
NAのポリアデニル化のために、他のシグナル(例えば、ヒト成長ホルモンまた
はグロビン遺伝子由来の)もまた、同様に使用され得る。染色体に組込まれた目
的の遺伝子を保持する安定な細胞株もまた、選択可能なマーカー(例えば、gp
t、G418またはハイグロマイシン)での同時トランスフェクションで選択さ
れ得る。最初に1より多い選択可能なマーカー(例えば、G418およびメトト
レキセート)を使用することは有利である。Plasmid pC4 is a strong promoter for the Rous sarcoma virus long terminal repeat (LTR) (Cullen et al., Molec) in order to express the gene of interest.
ullar and Cellular Biology, March 1985
: 438-447) and fragments isolated from enhancers of the immediate early gene of human cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 4).
1: 521-530 (1985)). Downstream of the promoter are BamHI, XbaI, and Asp718 restriction enzyme cleavage sites that allow for gene integration. This plasmid contains, after these cloning sites, the 3 'intron and polyadenylation site of the rat preproinsulin gene.
Other high efficiency promoters can also be used for expression (eg, the human β-actin promoter, the SV40 early or late promoter, or long terminal repeats from other retroviruses (eg, HIV and HTLVI)).
Clontech's Tet-Off and Tet-On gene expression systems and similar systems can be used to express AIM II in mammalian cell regulation methods (Gossen, M. and Bujard, H. 1992, Pro).
c. Natl. Acad. Sci. ScL USA 89: 5547-5551). mR
For polyadenylation of NA, other signals, such as from the human growth hormone or globin genes, can be used as well. Stable cell lines that carry the gene of interest integrated into the chromosome can also be obtained by selecting a selectable marker (eg, gp
t, G418 or hygromycin). It is advantageous to use more than one selectable marker initially (eg, G418 and methotrexate).
【0321】 プラスミドpC4を、制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、次い
で、当該分野で公知の手順により、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸
化する。次いで、ベクターを1%アガロースゲルから単離する。The plasmid pC4 is digested with the restriction enzymes BamHI and Asp718 and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. The vector is then isolated from a 1% agarose gel.
【0322】 完全AIM IIタンパク質をコードするDNA配列を、この遺伝子の5’お
よび3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅
する。5’プライマーは、配列5’GCT CCA GGA TCC GCC
ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3’
(配列番号15)を有し、この配列は、下線部のBamHI制限酵素部位、それ
に続く、真核生物における翻訳開始のための効率的なシグナル(Kozak,M
.、J.Mol.Biol.196:947−950(1987)に記載される
ような)、および図1A(配列番号1)に示されるAIM IIタンパク質のコ
ード領域の22塩基(すなわち、ヌクレオチド49〜70)を含む。3’プライ
マーは、配列5’GA CGC GGT ACC GTC CAA TGC A
CC ACG CTC CTT CCT TC 3’(配列番号16)を有し、
この配列は、下線部のAsp718制限部位、それに続く、図1B(配列番号1
)に示されるAIM II遺伝子のヌクレオチド770〜795に相補的なヌク
レオチドを含む。The DNA sequence encoding the complete AIM II protein is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. The 5 'primer has the sequence 5' GCT CCA GGA TCC GCC
ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3 '
(SEQ ID NO: 15), which contains an underlined BamHI restriction enzyme site followed by an efficient signal for initiation of translation in eukaryotes (Kozak, M.
. J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)), and 22 bases (ie, nucleotides 49-70) of the coding region of the AIM II protein shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). The 3 'primer has the sequence 5' GA CGC GGT ACC GTC CAA TGC A
CC ACG CTC CTT CCT TC 3 '(SEQ ID NO: 16)
This sequence is shown in underlined Asp718 restriction site followed by FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
) Contains nucleotides complementary to nucleotides 770 to 795 of the AIM II gene shown in FIG.
【0323】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp71
8で消化し、次いで、1%アガロースゲル上で、再度、精製した。次いで、単離
されたフラグメントおよび脱リン酸化されたベクターを、T4 DNAリガーゼ
で連結した。次いで、E.coli HB101 またはXL−1 Blue細
胞を形質転換し、そしてプラスミドpC4内に挿入されたフラグメントを含む細
菌を、例えば、制限酵素分析により同定する。[0324] The amplified fragment was digested with the endonucleases BamHI and Asp71.
8 and then purified again on a 1% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated with T4 DNA ligase. Then, E. E. coli HB101 or XL-1 Blue cells are transformed and bacteria containing the fragment inserted in plasmid pC4 are identified, for example, by restriction enzyme analysis.
【0324】 (実施例3(c):CHO細胞における、AIM IIN末端欠失物のクロー
ニングおよび発現) ベクターpC4を、AIM II変異体(配列番号2中のMet(68)〜V
al(240))タンパク質の発現のために使用した。プラスミドpC4を、制
限酵素BamHIで消化し、次いで、当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホス
ファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、このベクターを、1%アガロー
スゲルから単離した。Example 3 (c): Cloning and Expression of AIM IIN-Terminal Deletion in CHO Cells The vector pC4 was transformed with an AIM II mutant
al (240)) protein was used for expression. Plasmid pC4 was digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. This vector was then isolated from a 1% agarose gel.
【0325】 AIM II(アミノ酸68〜240)タンパク質をコードするDNA配列を
、この遺伝子の5’ 配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチド プライマーを使用して、増幅した。以下の5’プライマーを使用した:5’GA
C AGT GGA TCC GCC ACC ATG GTC ACC CG
C CTG CCT GAC GGA C 3’(配列番号40)。これは、下
線部のBamHI制限酵素部位、それに続く、真核生物における翻訳開始のため
の効率的なシグナル(Kozak,M.、J.Mol.Biol.196:94
7−950(1987)に記載される通り)、および図1A(配列番号1)に示
されるAIM IIポリペプチドのコード領域中のヌクレオチド202〜226
を含む。以下の3’プライマーを使用した:(BamHIおよび終止コドン(斜
体))The DNA sequence encoding the AIM II (amino acids 68-240) protein was amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. The following 5 'primer was used: 5' GA
C AGT GGA TCC GCC ACC ATG GTC ACC CG
CCTG CCT GAC GGA C 3 '(SEQ ID NO: 40). This is due to the underlined BamHI restriction enzyme site followed by an efficient signal for translation initiation in eukaryotes (Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 94).
7-950 (1987)), and nucleotides 202-226 in the coding region of the AIM II polypeptide shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
including. The following 3 'primers were used: (BamHI and stop codon (italics))
【0326】[0326]
【化10】 これは、下線部のBamHI制限部位、それに続く、図1B(配列番号1)に示
されるnt753〜768に相補的なヌクレオチドを含む。Embedded image It contains an underlined BamHI restriction site followed by nucleotides complementary to nts 753-768 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
【0327】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼでBamHIで消化し、次い
で、1%アガロースゲルで、再度精製した。次いで、単離されたフラグメントお
よび脱リン酸化されたベクターを、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次
いで、E.coli HB101 またはXL−1 Blue細胞を形質転換し
、そしてプラスミドpC4内に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、
制限酵素分析を使用して同定した。The amplified fragment was digested with BamHI with endonuclease and then purified again on a 1% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated using T4 DNA ligase. Then, E. E. coli HB101 or XL-1 Blue cells and bacteria containing the fragment inserted into plasmid pC4, for example,
Identified using restriction enzyme analysis.
【0328】 ベクターpC4/Ckβ8(最初にCkβ8シグナルペプチドを、Ckβ8シ
グナル配列の3’末端におけるBamHI部位で、pC4ベクター内にクローン
化したpC4構築物)を、AIM II変異体(配列番号2のTrp(80)〜
Val(240))タンパク質の発現のために使用した。プラスミドpC4/C
kβ8を、制限酵素BamHIで消化し、次いで、当該分野で公知の手順により
仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、このベクターを、
1%アガロースゲルから単離した。The vector pC4 / Ckβ8 (the pC4 construct cloned first into the pC4 vector with the Ckβ8 signal peptide at the BamHI site at the 3 ′ end of the Ckβ8 signal sequence) was transformed with the AIM II variant (Trp of SEQ ID NO: 2). 80)-
Val (240)) protein was used for expression. Plasmid pC4 / C
kβ8 was digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. This vector is then
Isolated from a 1% agarose gel.
【0329】 AIM II(アミノ酸80〜240)タンパク質をコードするDNA配列を
、この遺伝子の5’配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して、増幅した。以下の5’プライマーを使用した:5’cgc
GGATCCTGGGAGCAGCTGATAC 3’(配列番号41)。こ
れは、下線部のBamHI制限酵素部位、それに続く、図1A(配列番号1)に
示されるAIM IIポリペプチドのコード領域中のヌクレオチド286〜30
1を含む。以下の3’プライマーを使用した:5’cgc GGATCC TC
A CACCATGAAAGC 3’(配列番号29)。これは、下線部のBa
mHI制限部位、それに続く、図1B(配列番号1)に示されるnt757〜7
71に相補的なヌクレオチドを含む。The DNA sequence encoding the AIM II (amino acids 80-240) protein was amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. The following 5 'primer was used: 5'cgc
GGATCC TGGGAGCAGCTGATAC 3 '(SEQ ID NO: 41). This is the underlined BamHI restriction enzyme site followed by nucleotides 286-30 in the coding region of the AIM II polypeptide shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
Including 1. The following 3 'primer was used: 5' cgc GGATCC TC
A ACCCATGAAAGC 3 '(SEQ ID NO: 29). This is the underlined Ba
mHI restriction site followed by nts 757-7 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1)
It contains the nucleotide complementary to 71.
【0330】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIで消化し、次いで1
%アガロースゲルで再度精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン
酸化したベクターを、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次いで、E.c
oli HB101またはXL−1 Blue細胞を形質転換し、そして、例え
ば制限酵素分析を用いて、プラスミドpC4/Ckβ8に挿入されたフラグメン
トを含む細菌を同定した。The amplified fragment was digested with the endonuclease BamHI and
Purified again on a% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated using T4 DNA ligase. Then, E. c
oli HB101 or XL-1 Blue cells were transformed and bacteria containing the inserted fragment in plasmid pC4 / Ckβ8 were identified using, for example, restriction enzyme analysis.
【0331】 (CHO細胞トランスフェクション:) 活性なDHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェ
クションのために使用する。5μgの上記のpC4発現ベクターを、リポフェク
チンを用いて0.5μgのプラスミドpSV2−neoで同時トランスフェクシ
ョンする(Felgnerら、前出)。プラスミドpSV2neoは、優性な選
択マーカーであるTn5由来のneo遺伝子を含み、これはG418を含む一群
の抗生物質に対して耐性を与える酵素をコードする。その細胞を、1mg/ml
のG418で補充したαマイナスMEM中に播種する。2日後、細胞をトリプシ
ン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび
1mg/ml G418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクロー
ニングプレート(Greiner,Germany)に播種する。約10〜14
日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで、異なる濃度(50nM、1
00nM、200nM、400nM、800nM)のメトトレキサートを使用し
て、6ウェルのペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最も高い
濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度(1μM、2μ
M、5μM、10μM、20μM)のメトトレキサートを含む新しい6ウェルプ
レートに移す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得
られるまで反復する。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS−PAGEお
よびウェスタンブロッティング、または逆相HPLC分析によって分析する。CHO cell transfection: Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR gene are used for transfection. 5 μg of the above pC4 expression vector is co-transfected with 0.5 μg of the plasmid pSV2-neo using Lipofectin (Felgner et al., Supra). Plasmid pSV2neo contains the neo gene from Tn5, a dominant selectable marker, which encodes an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including G418. 1 mg / ml of the cells
Seed in α minus MEM supplemented with G418. Two days later, cells are trypsinized and seeded on hybridoma cloning plates (Greiner, Germany) in α-min MEM supplemented with 10, 25, or 50 ng / ml methotrexate and 1 mg / ml G418. About 10-14
One day later, single clones were trypsinized and then different concentrations (50 nM, 1
(00 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) are seeded into 6-well petri dishes or 10 ml flasks. The clones growing at the highest concentration of methotrexate were then cloned to higher concentrations (1 μM, 2 μM).
M, 5 μM, 10 μM, 20 μM) in a new 6-well plate containing methotrexate. The same procedure is repeated until a clone is obtained that grows at a concentration of 100-200 μM. The expression of the desired gene product is analyzed, for example, by SDS-PAGE and Western blotting, or by reverse phase HPLC analysis.
【0332】 (実施例3(d):CHO細胞におけるAIM II N末端欠失物のクロー
ニングおよび発現) C−末端Fc免疫グロブリン領域を含むAIM II変異体(配列番号2にお
けるMet(68)−Val(240))タンパク質の発現のために、ベクター
pC4を使用した。この構築物において、Ckβ8シグナルペプチドを、Ckβ
8の3’末端のBamHI部位を用いて最初にpC4にクローニングした。Ba
mHIおよびXbaI部位に隣接するFcフラグメントを、そのベクターにクロ
ーニングして、pC4/Ckβ8/Fcを生じた。次いで、AIM IIフラグ
メントを、BamHI部位で、CK−β8リーダーとFcフラグメントとの間に
クローニングした。Example 3 (d): Cloning and Expression of AIM II N-Terminal Deletion in CHO Cells An AIM II mutant containing the C-terminal Fc immunoglobulin region (Met (68) -Val (SEQ ID NO: 2) 240)) The vector pC4 was used for protein expression. In this construct, the Ckβ8 signal peptide was replaced with Ckβ
It was first cloned into pC4 using a BamHI site at the 3 'end of 8. Ba
The Fc fragment flanking the mHI and XbaI sites was cloned into the vector, resulting in pC4 / Ckβ8 / Fc. The AIM II fragment was then cloned at the BamHI site between the CK-β8 leader and the Fc fragment.
【0333】 プラスミドpC4を、制限酵素BamHIで消化し、次いで、当該分野で公知
の手順によって仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、この
ベクターを、1%アガロースゲルから単離した。The plasmid pC4 was digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated with calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. This vector was then isolated from a 1% agarose gel.
【0334】 完全AIM II(アミノ酸68〜240)タンパク質をコードするDNA配
列を、この遺伝子の5’ 配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオ チドプライマーを用いて増幅した。以下の5’プライマーを使用した:5’GA
C AGT GGA TCC GCC ACC ATG GTC ACC CG
C CTG CCT GAC GGA C3’(配列番号40)。このプライマ
ーは、下線を付したBamHI制限酵素部位、続いて、Kozak,M.、J.
Mol.Biol.196:947〜950(1987)によって記載される通
りの真核生物における翻訳の開始のために効率的なシグナル、および図1A(配
列番号1)に示されるAIM IIポリペプチドについてのコード領域における
ヌクレオチド202〜226を含む。以下の3’プライマーを使用した:(Ba
mHI)5’−GGG GGA TCC CAC CAT GAA AGC C
CC G−3’(配列番号30)。このプライマーは、下線を付したBamHI
制限部位、続いて図1AおよびB(配列番号1)に示されるヌクレオチド753
〜768に相補的なヌクレオチド、続いて以下の配列を有するFc免疫グロブリ
ンフラグメントを含む:The DNA sequence encoding the complete AIM II (amino acids 68-240) protein was amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene. The following 5 'primer was used: 5' GA
C AGT GGA TCC GCC ACC ATG GTC ACC CG
CCTG CCT GAC GGA C3 '(SEQ ID NO: 40). This primer was underlined with a BamHI restriction enzyme site, followed by Kozak, M .; J.
Mol. Biol. 196: 947-950 (1987), an efficient signal for initiation of translation in eukaryotes, and nucleotides in the coding region for the AIM II polypeptide shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). 202-226. The following 3 'primer was used: (Ba
mHI) 5'-GGG GGA TCC CAC CAT GAA AGC C
CC G-3 '(SEQ ID NO: 30). This primer is underlined with BamHI
A restriction site followed by nucleotides 753 shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1)
Nucleotide complementary to 7768, followed by an Fc immunoglobulin fragment having the following sequence:
【0335】[0335]
【化11】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIで消化し、次いで1
%アガロースゲルで再度精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン
酸化したベクターを、T4 DNAリガーゼで連結した。次いで、E.coli
HB101またはXL−1 Blue細胞を形質転換した。そして、例えば制
限酵素分析を用いて、プラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を
同定する。Embedded image The amplified fragment is digested with the endonuclease BamHI and
Purified again on a% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated with T4 DNA ligase. Then, E. coli
HB101 or XL-1 Blue cells were transformed. Then, bacteria containing the fragment inserted into the plasmid pC4 are identified using, for example, restriction enzyme analysis.
【0336】 (CHO細胞トランスフェクション:) チャイニーズハムスター卵巣(CHO/dhfr−DG44)細胞を、リポフ
ェクチンを使用して、発現ベクター(pC4/spCKβ8/Fc/AIM I
I)を用いてトランスフェクトした。組換えクローンを、5% 透析ウシ胎仔血
清(DiFBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)、1mg/
mL ジェネティシン(G418)および10nM メトトレキサート(MTX
)を有するMEMα選択培地中で細胞を増殖させることによって単離した。次い
で、BIAcore法を使用して組換えクローンをスクリーニングすること(よ
り詳細には、以下を参照のこと)によって確認された高発現クローンを、MTX
の濃度を100μMの最終濃度まで段階的に増加させることによって個々に増幅
した。この高発現クローンを、マイクロキャリアCHO灌流バイオリアクター中
のAIM II−IgG1融合タンパク質の産生のために使用した。(CHO cell transfection: Chinese hamster ovary (CHO / dhfr-DG44) cells were transfected with lipofectin using an expression vector (pC4 / spCKβ8 / Fc / AIM I).
Transfected using I). Recombinant clones were digested with 5% dialyzed fetal calf serum (DiFBS), 1% penicillin / streptomycin (PS), 1 mg /
mL Geneticin (G418) and 10 nM Methotrexate (MTX)
) Was isolated by growing the cells in MEMα selective medium with The highly expressing clones identified by screening the recombinant clones using the BIAcore method (see below in more detail) were then replaced with MTX.
Were amplified individually by stepwise increasing the concentration to 100 μM final concentration. This high expressing clone was used for the production of AIM II-IgG1 fusion protein in a microcarrier CHO perfusion bioreactor.
【0337】 CHO.AIM II−IgG1細胞を、1%超低IgG FBSを含むHG
S−CHO−3培地中で、Cytodex 1マイクロキャリア(Pharma
cia Biotech,Upsala,Sweden)上で増殖させた。マル
チプルマイクロキャリアスピナー中で増殖させた細胞を、10Lのマイクロキャ
リア灌流バイオリアクターにスケールアップした。灌流バイオリアクターを27
日間連続して操作して、そしてその時間の間、AIM II−IgG1融合タン
パク質を含み、マイクロキャリアを含まない90リットルの上清を収集した。こ
の上清を、0.2μmの滅菌フィルターを使用する濾過プロセスを通して清澄化
し、そして5mM EDTAを添加することによって安定化した。清澄化した上
清をアフィニティーカラムにロードして、AIMII−IgG1融合タンパク質
を捕捉した。CHO. AIM II-IgG1 cells were converted to HG with 1% ultra-low IgG FBS
Cytodex 1 microcarriers (Pharma) in S-CHO-3 medium
(Cia Biotech, Upsala, Sweden). Cells grown in the multiple microcarrier spinner were scaled up to a 10 L microcarrier perfusion bioreactor. 27 perfusion bioreactors
Operating continuously for days, during which time 90 liters of supernatant containing AIM II-IgG1 fusion protein and no microcarriers was collected. The supernatant was clarified through a filtration process using a 0.2 μm sterile filter and stabilized by adding 5 mM EDTA. The clarified supernatant was loaded on an affinity column to capture the AIMII-IgG1 fusion protein.
【0338】 (AIM II−IgG1融合タンパク質の精製) AIM II−IgG1融合タンパク質を、15LのCHO馴化培地から精製
した。この馴化培地を、30mL/分の流速で、BioCad60(PerSe
ptives Biosystems)上で10℃で、プロテインA Hype
rD(54mLベット容積、BioSepra)アフィニティーカラムにロード
した。このカラムを、25mM 酢酸ナトリウム、pH8および0.1M Na
Clで前もって平衡化した。ロード後、このカラムをそれぞれ3カラム容量の0
.1M クエン酸ナトリウム、pH5および0.1M NaCl、ならびに0.
1M クエン酸ナトリウム、pH 2.8および0.1M NaClで洗浄した
。AIM II−IgG融合タンパク質を含むピーク画分を、SDS−PAGE
分析によって決定し、そしてプールした。この精製タンパク質の正体を、N末端
配列分析によって確認した。最終的なタンパク質収率は、馴化培地1リットルあ
たり約9mgであった。Purification of AIM II-IgG1 fusion protein AIM II-IgG1 fusion protein was purified from 15 L of CHO conditioned medium. The conditioned medium was added to BioCad60 (PerSe) at a flow rate of 30 mL / min.
protein A Hype at 10 ° C. on an active biosystems.
Loaded on rD (54 mL bed volume, BioSepra) affinity column. The column was loaded with 25 mM sodium acetate, pH 8 and 0.1 M Na.
Equilibrated previously with Cl. After loading, the columns are each filled with 3 column volumes of 0
. 1 M sodium citrate, pH 5 and 0.1 M NaCl, and 0.1 M NaCl.
Washed with 1 M sodium citrate, pH 2.8 and 0.1 M NaCl. The peak fraction containing the AIM II-IgG fusion protein was analyzed by SDS-PAGE.
Determined by analysis and pooled. The identity of this purified protein was confirmed by N-terminal sequence analysis. The final protein yield was about 9 mg per liter of conditioned medium.
【0339】 (実施例4:AIM II発現構築物) (全長構築物) (a)pCMVsport:真核生物発現ベクターpCMVsportは、M
et(1)〜Val(240)のAIM−II ORFをコードするヌクレオチ
ドを含む。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託されたクロー
ンのAIM II cDNAを、便利な制限部位を含むプライマーを使用して増
幅する。適切なプライマーは、この実施例で使用される以下のものを含む。5’
プライマーは、下線を付したSalI部位、AUG開始コドン、AIM IIポ
リペプチド(配列番号1)のコード領域のヌクレオチド51〜69を含み、そし
て以下の配列を有する: 5’−GGG GTC GAC GCC ATC ATG GAG GAG A
GT GTC GTA CGG−3’(配列番号32)。Example 4 AIM II Expression Constructs (Full Length Constructs) (a) pCMVsport: The eukaryotic expression vector pCMVsport is M
It contains nucleotides encoding the AIM-II ORF of et (1) to Val (240). The plasmid construction strategy is as follows. The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following used in this example. 5 '
The primers include an underlined SalI site, an AUG start codon, nucleotides 51-69 of the coding region of the AIM II polypeptide (SEQ ID NO: 1), and have the following sequence: 5′-GGG GTC GAC GCC ATC ATG GAG GAG A
GT GTC GTA CGG-3 '(SEQ ID NO: 32).
【0340】 3’プライマーは、下線を付したNotI部位を含み、配列番号1のヌクレオ
チド753〜767に相補的なヌクレオチド、および終止コドンを含み、そして
以下の配列を有する: 5’−GGG GCG GCC GCG CCT TCA CAC CAT G
AA AGC CCCG−3’(配列番号33)。The 3 ′ primer contains an underlined NotI site, contains a nucleotide complementary to nucleotides 753-767 of SEQ ID NO: 1, and a stop codon, and has the following sequence: 5′-GGG GCG GCC GC G CCT TCA CAC CAT G
AA AGC CCCG-3 '(SEQ ID NO: 33).
【0341】 PCR増幅DNAフラグメントを、SalIおよびNotIで消化し、次いで
ゲル精製する。次いで、単離したフラグメントをSalIおよびNotI消化し
たベクターpCMVsportに連結した。連結混合物でE.coliを形質転
換し、そして形質転換した培養物を、抗生物質培地プレート上にプレーティング
し、次いでそのプレートをインキュベートして、抗生物質耐性コロニーの増殖を
可能にする。プラスミドDNAを、耐性コロニーから単離し、そしてAIM I
Iコードフラグメントの存在について、制限分析およびゲル上のサイジングによ
って試験する。The PCR amplified DNA fragment is digested with SalI and NotI and then gel purified. The isolated fragment was then ligated into the SalI and NotI digested vector pCMVsport. E. ligation mixture The E. coli is transformed, and the transformed culture is plated on an antibiotic medium plate, and the plate is then incubated to allow growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA was isolated from the resistant colonies and AIM I
Test for the presence of the I-code fragment by restriction analysis and sizing on a gel.
【0342】 組換えAIM IIの発現のために、真核生物細胞(例えば、COS細胞また
はCHO細胞)を、上記の実施例3に示すようにDEAE−DEXTRANを使
用して、上記に示すように発現ベクターでトランスフェクトする。AIM II
組換えタンパク質の発現を、実施例3中の上記の方法によって検出する。For expression of recombinant AIM II, eukaryotic cells (eg, COS cells or CHO cells) were prepared as described above using DEAE-DEXTRAN as described in Example 3 above. Transfect with expression vector. AIM II
Expression of the recombinant protein is detected by the method described above in Example 3.
【0343】 (b)pG1SamEN:レトロウイルス発現ベクターpG1SamENは、
Met(1)〜Val(240)のAIM−II ORFをコードする。pG1
ベクターは、Morgan,R.A.ら、Nucl.Acids.Res.20
(6):1293〜1299(1992)において記載され、そしてLNベクタ
ー(Miller,A.D.およびRosman,G.J.Biotechni
ques 7:980〜990(1989))に類似するが、さらなるクローニ
ング部位を有する。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託され
たクローンのAIM II cDNAを、便利な制限部位を含むプライマーを使
用して増幅する。適切なプライマーは、本実施例中で使用される以下のものを含
む。5’プライマーは、下線を付したNotI部位、および AUG開始コドン 、 AIM IIポリペプチド(配列番号1)のコード領域のヌクレオチド51 〜69を含み、以下の配列を有する: 5’−GGG GCG GCC GCG CCA TCA TGG AGG A
GA GTG TCG TAC GG−3’(配列番号34)。(B) pG1SamEN: The retroviral expression vector pG1SamEN is
Encodes the AIM-II ORF from Met (1) to Val (240). pG1
The vector is described in Morgan, R .; A. Et al., Nucl. Acids. Res. 20
(6): 1293-1299 (1992) and described in the LN vector (Miller, AD and Rosman, GJ Biotechni).
ques 7: 980-990 (1989)), but with additional cloning sites. The plasmid construction strategy is as follows. The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following used in this example. The 5 'primer contains an underlined NotI site, and the AUG start codon, nucleotides 51-69 of the coding region of the AIM II polypeptide (SEQ ID NO: 1), and has the following sequence: 5'-GGG GCG GCC GC G CCA TCA TGG AGG A
GA GTG TCG TAC GG-3 '(SEQ ID NO: 34).
【0344】 3’プライマーは、下線を付したSalI部位、配列番号1のヌクレオチド7
53〜768に相補的なヌクレオチド、および終止コドンを含み、以下の配列を
有する: 5’−GGG GTC GAC GCC TTCA CAC CAT GAA
AGC CCC G−3’(配列番号35)。The 3 ′ primer has an underlined SalI site, nucleotide 7 of SEQ ID NO: 1.
Including nucleotides complementary to 53-768, and a stop codon, has the following sequence: 5'-GGG GTC GAC GCC TTCA CAC CAT GAA
AGC CCC G-3 '(SEQ ID NO: 35).
【0345】 PCR増幅したDNAフラグメントをSalIおよびNotIで消化し、次い
でゲル精製する。次いで、単離したフラグメントをSalIおよびNotI消化
したベクターに連結した。連結混合物でE.coliを形質転換し、そして形質
転換した培養物を抗生物質培地プレート上にプレーティングし、次いでこのプレ
ートをインキュベートして抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にする。プラスミ
ドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてAIM IIコードフラグメントの
存在について、制限分析およびゲル上のサイジングによって試験する。The PCR amplified DNA fragment is digested with SalI and NotI and then gel purified. The isolated fragment was then ligated into the SalI and NotI digested vector. E. ligation mixture E. coli is transformed, and the transformed culture is plated on an antibiotic medium plate, and the plate is then incubated to allow growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and tested for the presence of the AIM II coding fragment by restriction analysis and sizing on a gel.
【0346】 組換えAIM IIの発現のために、真核生物細胞(例えば、COS細胞また
はCHO細胞)を、上記の実施例3に示すようにDEAE−DEXTRANを使
用して、上記に示すように発現ベクターでトランスフェクトする。AIM II
組換えタンパク質の発現を、実施例3中の上記の方法によって検出する。For expression of recombinant AIM II, eukaryotic cells (eg, COS cells or CHO cells) were prepared as described above using DEAE-DEXTRAN as described in Example 3 above. Transfect with expression vector. AIM II
Expression of the recombinant protein is detected by the method described above in Example 3.
【0347】 (2.N末端欠失構築物) (a)pG1/ckβ8:この真核生物の発現ベクターは、AIM−II変異
体(配列番号2におけるGln(60)〜Val(240))(AIM−2(ア
ミノ酸60〜240)をコードする。そしてヒトCk−β8シグナルペプチドの
指揮下で分泌された。このpG1ベクターは、Morgan,R.A.ら、Nu
cl.Acids Res.20(6):1293−1299(1992)に記
載され、そしてLNベクター(Miller,A.D.およびRosman,G
.J.Biotechniques 7:980−990(1989))に類似
しているが、付加的なクローニング部位を有する。このプラスミド構築ストラテ
ジーは、以下のとおりである。寄託されたクローンのAIM II cDNAを
、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用して増幅する。適切なプライマー
としては、本実施例に用いられる以下のプライマーが挙げられる。下線を付した
NotI部位、AIM IIポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチ
ド(配列番号1)、およびAUG開始コドンを含む5’プライマーは、以下の配
列を有する:(2. N-terminal deletion construct) (a) pG1 / ckβ8: This eukaryotic expression vector is an AIM-II mutant (Gln (60) to Val (240) in SEQ ID NO: 2) (AIM -2 (amino acids 60-240) and was secreted under the direction of the human Ck-β8 signal peptide.This pG1 vector is described in Morgan, RA et al., Nu.
cl. Acids Res. 20 (6): 1293-1299 (1992) and described in the LN vector (Miller, AD and Rosman, G.
. J. Biotechniques 7: 980-990 (1989)), but with additional cloning sites. This plasmid construction strategy is as follows. The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following primers used in this example. The 5 'primer, including the underlined NotI site, nucleotides in the coding region for the AIM II polypeptide (SEQ ID NO: 1), and the AUG start codon has the following sequence:
【0348】[0348]
【化12】 下線を付したSalI部位、配列番号1におけるヌクレオチド753〜768
に対して相補的なヌクレオチドおよび終止コドンを含む3’プライマーは、以下
の配列を有する: 5’−GGG GTC GAC TCA CAC CAT GAA AGC C
CC G−3’(配列番号37)。Embedded image Underlined SalI site, nucleotides 753-768 in SEQ ID NO: 1
The 3 'primer containing a nucleotide complementary to and a stop codon has the following sequence: 5'-GGG GTC GAC TCA CAC CAT GAA AGC C
CC G-3 '(SEQ ID NO: 37).
【0349】 PCRで増幅したDNAフラグメントを、SalIおよびNotIで消化し、
次いでゲルで精製する。次いで、単離したフラグメントを、SalIおよびNo
tIで消化したベクターpG1中へ連結した。連結混合物で、E.coliで形
質転換し、そしてこの形質転換された培養物を、抗生物質培地プレート上にプレ
ーティングし、次いで、このプレートを抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にす
るためにインキュベートする。プラスミドDNAを、耐性コロニーから単離し、
AIM IIをコードするフラグメントの存在について、制限分析およびゲルサ
イジングによって試験する。The DNA fragment amplified by PCR was digested with SalI and NotI,
It is then purified on a gel. The isolated fragment was then converted to SalI and No.
Ligation into the vector pG1 digested with tI. In the ligation mixture, E. coli and the transformed culture is plated on antibiotic media plates, and the plates are then incubated to allow growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from the resistant colonies,
The presence of the fragment encoding AIM II is tested by restriction analysis and gel sizing.
【0350】 組換えAIM IIの発現のために、COSまたはCHOのような真核生物細
胞を、上記実施例3に記載したようにDEAE−DEXTRANを用いて、上記
の発現ベクターでトランスフェクトする。AIM II組換えタンパク質の発現
を、上記の実施例3に記載した方法によって検出する。For expression of recombinant AIM II, eukaryotic cells such as COS or CHO are transfected with the above expression vectors using DEAE-DEXTRAN as described in Example 3 above. Expression of the AIM II recombinant protein is detected by the method described in Example 3 above.
【0351】 (b)pHE4:プラスミドpHE4は、2つのlacオペレーターを有する
強力な合成プロモーターを含む細菌性の発現ベクターである。このプロモーター
からの発現を、lacリプレッサーの存在によって調節し、そしてIPTGまた
はラクトースを用いて誘導する。このプラスミドはまた、効率的なリボソーム結
合部位、およびAIM II変異体遺伝子の下流に合成転写ターミネーターを含
む。このベクターはまた、pUCプラスミドの複製領域およびカナマイシン耐性
遺伝子を含む。(B) pHE4: Plasmid pHE4 is a bacterial expression vector containing a strong synthetic promoter with two lac operators. Expression from this promoter is regulated by the presence of the lac repressor and induced with IPTG or lactose. This plasmid also contains an efficient ribosome binding site, and a synthetic transcription terminator downstream of the AIM II mutant gene. This vector also contains the replication region of the pUC plasmid and the kanamycin resistance gene.
【0352】 このAIM II N末端欠失変異体を、以下のスキームに従って構築した。
寄託されたクローンのAIM II cDNAを、都合のよい制限部位を含むプ
ライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、本実施例において用いられる
以下のものを含む。This AIM II N-terminal deletion mutant was constructed according to the following scheme.
The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following used in this example.
【0353】 配列番号2におけるAIM II(Thr(70)〜Val(240))ポリ
ペプチドについて、下線を付したNdeI部位およびAUG開始コドン、AIM
IIポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチド256〜271(配
列番号1)を含む5’プライマーは、以下の配列を有する: 5’−cgc CATATG A CCCGCCTGCCTGACG−3’(配
列番号42)。For the AIM II (Thr (70) -Val (240)) polypeptide in SEQ ID NO: 2, the underlined NdeI site and the AUG start codon, AIM
II 5 comprising nucleotides 256-271 (SEQ ID NO: 1) in the coding region for polypeptides 'primer has the following sequence: 5'-cgc CATATG A CCCGCCTGCCTGACG- 3' ( SEQ ID NO: 42).
【0354】 配列番号2におけるAIM II(Ser(79)〜Val(240))ポリ
ペプチドについて、下線を付したNdeI部位およびAUG開始コドン、AIM
IIポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチド283〜310(配
列番号1)を含む5’プライマーは、以下の配列を有する: 5’−cgc CATATG A GC TGGGAGCAGCTGATAC−
3’(配列番号43)。For the AIM II (Ser (79) -Val (240)) polypeptide in SEQ ID NO: 2, the underlined NdeI site and the AUG start codon, AIM
The 5 'primer comprising nucleotides 283-310 (SEQ ID NO: 1) in the coding region for the II polypeptide has the following sequence: 5'-cgcCATATAG AGC TGGGAGCAGCTGATAC-
3 '(SEQ ID NO: 43).
【0355】 配列番号2におけるAIM II(Ser(103)〜Val(240))ポ
リペプチドについて、下線を付したNdeI部位およびAUG開始コドン、AI
M IIポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチド355〜373(
配列番号1)を含む5’プライマーは、以下の配列を有する: 5’−cgc CATATG A GC AGCTTGACCGGCAGCG−
3’(配列番号44)。For the AIM II (Ser (103) -Val (240)) polypeptide in SEQ ID NO: 2, the underlined NdeI site and the AUG start codon, AI
Nucleotides 355 to 373 in the coding region for the MII polypeptide (
5 'primer comprising SEQ ID NO: 1) has the following sequence: 5'-cgc CATATG A GC AGCTTGACCGGCAGCG-
3 '(SEQ ID NO: 44).
【0356】 以下の3’プライマーを、上述のN末端欠失物を構築するために使用し得る: 下線を付したAsp718部位、配列番号1におけるヌクレオチド753〜7
68に相補的なヌクレオチドおよび終止コドンを含む3’プライマーは、以下の
配列を有する: 5’−cgc GGTACC TTA CACCATGAAAGCCCCG−3
’(配列番号45)。The following 3 ′ primers can be used to construct the N-terminal deletion described above: Underlined Asp718 site, nucleotides 753-7 in SEQ ID NO: 1
The 3 'primer containing a nucleotide complementary to 68 and a stop codon has the following sequence: 5'-cgc GGTAC TTA ACCCATGAAAGCCCCG-3
'(SEQ ID NO: 45).
【0357】 このPCR増幅したDNAフラグメントを、NdeIおよびAsp718で消
化し、次いでゲルで精製する。次に、この単離したフラグメントを、適切に消化
したpHE4ベクター中へ連結した。この連結混合物でE.coliを形質転換
し、そして形質転換した培養物を、抗生物質培地プレート上にプレーティングし
、次いでこのプレートをインキュベートし、抗生物質耐性コロニーの増殖を可能
にする。プラスミドDNAを、耐性コロニーから単離し、そしてAIM IIを
コードするフラグメントの存在について、制限分析およびゲルサイジングにより
試験する。The PCR amplified DNA fragment is digested with NdeI and Asp718 and then gel purified. This isolated fragment was then ligated into the appropriately digested pHE4 vector. In this ligation mixture, E. The E. coli is transformed, and the transformed culture is plated on an antibiotic medium plate, which is then incubated, allowing the growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and tested by restriction analysis and gel sizing for the presence of the fragment encoding AIM II.
【0358】 組換えAIM II N末端欠失物の発現のために、細菌細胞を、実施例1に
おいて上記に記載したように発現ベクターでトランスフェクトする。AIM I
I組換えタンパク質の発現を、実施例1において上記に記載したような方法で検
出する。For expression of a recombinant AIM II N-terminal deletion, bacterial cells are transfected with an expression vector as described above in Example 1. AIM I
Expression of the I recombinant protein is detected by the method as described above in Example 1.
【0359】 (実施例5:AIM IIポリペプチドの生物学的特徴付け) 以下の実験のセットは、AIM IIタンパク質の生物学的特徴付けを提供し
、そしてAIM IIが、インビボおよびインビトロにおいて強力な抗腫瘍活性
を有することを実証する。Example 5: Biological characterization of AIM II polypeptides The following set of experiments provides for the biological characterization of AIM II protein and that AIM II is potent in vivo and in vitro. It demonstrates that it has antitumor activity.
【0360】 (A.AIM IIは、活性化リンパ球において多く発現されるが、癌細胞に
おいては高度に発現されない。) ノーザンブロット分析は、AIM II mRNAが、約1.9kbの長さで
あり、そして主に脾臓、脳、および末梢血細胞において発現されることを示した
。AIM IIはまた、前立腺、精巣、卵巣、小腸、胎盤、肝臓、骨格筋、およ
び肺において、ある程度検出可能である。AIM IIメッセージは、胎児性組
織、多くの内分泌腺、ならびに非造血および骨髄由来の腫瘍株において検出され
なかった。(A. AIM II is highly expressed in activated lymphocytes but not highly expressed in cancer cells.) Northern blot analysis showed that AIM II mRNA was approximately 1.9 kb long. And predominantly expressed in spleen, brain, and peripheral blood cells. AIM II is also partially detectable in prostate, testis, ovary, small intestine, placenta, liver, skeletal muscle, and lung. AIM II messages were not detected in fetal tissues, many endocrine glands, and non-hematopoietic and bone marrow derived tumor lines.
【0361】 RT−PCRアッセイを、活性化PBMC対静止期PBMCにおいてAIM
IIの発現を調査するために行った。T細胞、Bリンパ球、NK細胞、単球、お
よび顆粒球の混合物を含む新鮮なPBMCは、ノーザンブロット分析と一致する
AIM II mRNAを発現する。発現は、T細胞、B細胞、およびNK細胞
の混合物としての静止期PBL、ジャーカット細胞(静止期または活性化)また
はK562細胞において見出されなかった。AIM IIの増加した発現が、活
性化PBL、CD3+、CD4+T細胞、CD8+腫瘍浸潤性リンパ球(TIL
)、顆粒球、および単球において見出された。さらなるRT−PCR分析は、L
PS活性化好中球およびPMA刺激したU937細胞においてAIM II m
RNAの存在を示した。興味深いことに、AIM IIの発現は、***、前立腺
または卵巣由来の種々の癌細胞株(ヒト***上皮性由来の非腫瘍形成性細胞株M
CA−1OA細胞を除く)においては検出可能ではなかった。さらに、AIM
IIの発現は、試験された3つの乳癌サンプルからは見出されなかった。The RT-PCR assay was performed on activated versus stationary PBMC using AIM
Performed to investigate the expression of II. Fresh PBMC, including a mixture of T cells, B lymphocytes, NK cells, monocytes, and granulocytes, express AIM II mRNA consistent with Northern blot analysis. No expression was found in quiescent PBL, Jurkat (quiescent or activated) or K562 cells as a mixture of T, B and NK cells. Increased expression of AIM II is associated with activated PBL, CD3 +, CD4 + T cells, CD8 + tumor infiltrating lymphocytes (TIL
), Granulocytes, and monocytes. Further RT-PCR analysis was performed using L
AIM II m in PS-activated neutrophils and PMA-stimulated U937 cells
Indicates the presence of RNA. Interestingly, the expression of AIM II was detected in various cancer cell lines derived from breast, prostate or ovary (non-tumorigenic cell line M derived from human mammary epithelium).
(Except for CA-1OA cells). In addition, AIM
II expression was not found in the three breast cancer samples tested.
【0362】 (B.AIM IIの構成的発現は、血清飢餓またはIFNγ処理下で増殖阻
害を生じた) AIM IIの生物学的機能を調査するため、AIM II遺伝子を、ヒト乳
房癌腫細胞株MDA−MB−231にレトロウィルスベクターを用いて安定に形
質導入した。これらの細胞におけるAIM II遺伝子の発現を、ノーザンブロ
ット分析によって確認した。さらに、薬物耐性遺伝子Neoを発現するMDA−
MB−231細胞を、本研究においてコントロールとして使用した。これらの細
胞を、10%FBSを含む培地において培養した場合、その親細胞またはベクタ
ーコントロールトランスフェクト細胞(MDA−MB−231/Neo)と比較
して、AIM IIトランスフェクト体(MDA−MB−231/AIM II
)中で、インビトロにおける増殖率における差異は観察されなかった。しかし、
血清濃度が、1%にまで低下した場合、MDA−MB−231/AIM II細
胞に関して80%の増殖阻害(図4A)があったが、親細胞またはベクターコン
トロールMDA−MB−231細胞では存在しなかった。異なる量の血清に関す
る用量依存性増殖阻害もまた、観察された。(B. Constitutive expression of AIM II resulted in growth inhibition under serum starvation or IFNγ treatment) To investigate the biological function of AIM II, the AIM II gene was replaced with the human breast carcinoma cell line MDA -MB-231 was stably transduced with a retroviral vector. The expression of the AIM II gene in these cells was confirmed by Northern blot analysis. Furthermore, MDA- expressing the drug resistance gene Neo
MB-231 cells were used as controls in this study. When these cells were cultured in a medium containing 10% FBS, the AIM II transfectants (MDA-MB-231) were compared with their parental cells or vector control transfected cells (MDA-MB-231 / Neo). / AIM II
), No difference in the growth rate in vitro was observed. But,
When serum concentration was reduced to 1%, there was 80% growth inhibition (FIG. 4A) for MDA-MB-231 / AIM II cells, but was present in parental cells or vector control MDA-MB-231 cells. Did not. Dose-dependent growth inhibition for different amounts of serum was also observed.
【0363】 野生型MDA−MB−231細胞は、10%または1%のいずれかの血清にお
いて、代表的なパイルアップ(pile−up)特性を伴って非常に高い密度ま
で増殖した(図4A)。MDA−MB−231/AIM II細胞において、ほ
とんどの細胞が培地中に浮遊し、そして培養物の全体にわたって単層の増殖パタ
ーンを維持することを伴う、形態学的な変化が注目された。形態学の変化は、ベ
クターコントロールMDA−MB−231細胞において見出されなかった。MD
A−MB−231細胞を発現するAIM IIの増殖阻害を、ソフトアガーコロ
ニーアッセイでさらに試験した。図4Bに示されるように、コロニー形成の80
%の減少が、MDA−MB−231/AIM II細胞において、それらの親細
胞またはベクターコントロール細胞と比較して見られた。IFNγの25μ/m
lでの処理もまた、AIM II発現MDA−MB−231細胞の80%の増殖
阻害を引き起こし得るのに対し、親細胞またはベクターコントロール細胞におい
ては、わずか20〜30%にすぎない阻害が存在した。従って、AIM IIを
発現する細胞は、サイトカインIFNγにより媒介された細胞傷害性に対する増
強された感受性を示した。Wild-type MDA-MB-231 cells grew to very high density with typical pile-up characteristics in either 10% or 1% serum (FIG. 4A). . In MDA-MB-231 / AIM II cells, morphological changes were noted, with most cells floating in the medium and maintaining a monolayer growth pattern throughout the culture. No morphological changes were found in the vector control MDA-MB-231 cells. MD
Growth inhibition of AIM II expressing A-MB-231 cells was further tested in a soft agar colony assay. As shown in FIG.
A% reduction was seen in MDA-MB-231 / AIM II cells compared to their parental or vector control cells. 25 μ / m of IFNγ
l can also cause 80% growth inhibition of AIM II expressing MDA-MB-231 cells, whereas in parental cells or vector control cells there was only 20-30% inhibition. . Thus, cells expressing AIM II exhibited enhanced sensitivity to cytotoxicity mediated by the cytokine IFNγ.
【0364】 (C.AIM II発現細胞における増強されたアポトーシス) アネキシン−V FACS分析を、AIM II発現細胞の増殖阻害の潜在的
な機構を調査するために行った。10%血清の存在下では、3つの細胞株全てに
おいて、2%未満のアポトーシス細胞が存在する。減少した血清(0.5%FB
S)における48時間のインキュベーション後、MDA−MB−231細胞のア
ポトーシス集団は、3倍(8%まで)の増加を示した。親細胞またはベクターコ
ントロールMDA−MB−231細胞においては、アポトーシスのわずかな増加
があるか、または増加がない(図5A)。アポトーシスの誘導は、図5Bに示さ
れるDNAフラグメント化によって、さらに確認された。フラグメント化したD
NAは、AIM II発現MDA−MB−231細胞において、特に1%血清に
おいてのみ見られた。AIM II発現細胞を、Paclitaxel(tax
ol)で処理した場合、親細胞またはベクターコントロール細胞において見られ
たよりも、ずっとより多くのフラグメント化DNAが観察された。従って、この
データは、AIM II発現が、血清飢餓下、あるいはIFNγまたはタキソー
ルの添加で、MDA−MB−231細胞のアポトーシスの引き金となり得ること
を示唆する。C. Enhanced Apoptosis in AIM II Expressing Cells Annexin-V FACS analysis was performed to investigate the potential mechanism of growth inhibition of AIM II expressing cells. In the presence of 10% serum, less than 2% apoptotic cells are present in all three cell lines. Reduced serum (0.5% FB
After 48 hours incubation in S), the apoptotic population of MDA-MB-231 cells showed a 3-fold (up to 8%) increase. There is little or no increase in apoptosis in parental cells or vector control MDA-MB-231 cells (FIG. 5A). The induction of apoptosis was further confirmed by the DNA fragmentation shown in FIG. 5B. Fragmented D
NA was found only in AIM II expressing MDA-MB-231 cells, especially in 1% serum. AIM II-expressing cells were transferred to Paclitaxel (tax
ol), much more fragmented DNA was observed than was seen in parental cells or vector control cells. Thus, this data suggests that AIM II expression can trigger apoptosis of MDA-MB-231 cells under serum starvation or with the addition of IFNγ or taxol.
【0365】 (D.AIM IIの強力なインビボ抗腫瘍活性) 本発明者らは、インビボにおける腫瘍増殖に対するAIM II形質導入の効
果を評価した。MDA−MB−231細胞を、***脂肪パッド中へ接種した場合
、AIM II発現は、ヌードマウスにおけるMDA−MB−231の腫瘍形成
を有意に阻害したが、ベクターコントロールMDA−MB−231/Neo細胞
は、それらの親MDA−MB−231細胞と比較して腫瘍増殖において何ら変化
も示さなかった(図6A)。MDA−MB−231/AIM II細胞における
同様の腫瘍抑制はまた、SCIDマウスにおいても示された。AIM II発現
MDA−MB−231細胞由来か、あるいはそれらの親細胞またはベクターコン
トロール細胞由来の腫瘍の組織学的な試験を行った。親細胞またはベクターコン
トロールMDA−MB−231細胞は、わずかな細胞浸潤を伴うかまたは細胞浸
潤を伴わずに、優位に腫瘍細胞で満たされた大きな固形腫瘍塊を形成した。対照
的に、ヌードマウスにおいてMDA−MB−231/AIM II細胞によって
形成された小さな残留腫瘍においてでさえ、大規模な壊死が観察された。さらに
、AIM II発現腫瘍において、好中球細胞の浸潤の数に有意な増加がある。
Gr−1 mAb(PharMingen,San Diego,CA)を用い
る免疫組織学的染色に基づき、野生型、Neoコントロール、およびAIM I
I形質導入MDA−MB−231腫瘍におけるmm2腫瘍サイズあたりの好中球 の平均数(平均±S.D.)は、それぞれ101±26、77±16および22
6±38であった。D. Potent In Vivo Anti-Tumor Activity of AIM II We evaluated the effect of AIM II transduction on tumor growth in vivo. When MDA-MB-231 cells were inoculated into the mammary fat pad, AIM II expression significantly inhibited MDA-MB-231 tumorigenesis in nude mice, whereas the vector control MDA-MB-231 / Neo cells Showed no change in tumor growth compared to their parental MDA-MB-231 cells (FIG. 6A). Similar tumor suppression in MDA-MB-231 / AIM II cells was also demonstrated in SCID mice. Histological examination of tumors from AIM II expressing MDA-MB-231 cells or from their parental cells or vector control cells was performed. Parental cells or vector control MDA-MB-231 cells formed large solid tumor masses predominantly filled with tumor cells with little or no cell invasion. In contrast, extensive necrosis was observed even in small residual tumors formed by MDA-MB-231 / AIM II cells in nude mice. Furthermore, there is a significant increase in the number of neutrophil cell infiltrates in AIM II expressing tumors.
Based on immunohistological staining with Gr-1 mAb (PharMingen, San Diego, Calif.), Wild type, Neo control, and AIM I
The average number of neutrophils per mm 2 tumor size (mean ± SD) in I-transduced MDA-MB-231 tumors was 101 ± 26, 77 ± 16 and 22 respectively.
6 ± 38.
【0366】 AIM IIの腫瘍抑制に対する阻害効果を、同系のマウス腫瘍モデルでさら
に確認した。MC−38マウス結腸ガン細胞におけるAIM IIの局所的発現
は、10匹のC57BL/6マウスのうち8匹で腫瘍形成の完全な抑制を生じた
(図6B)。AIM IIの局所的生成によってもまた、MC−38腫瘍を有す
るマウスの生存が劇的に延長された。全ての動物実験を3回繰り返し、そして同
様の結果が得られた。The inhibitory effect of AIM II on tumor suppression was further confirmed in a syngeneic mouse tumor model. Local expression of AIM II in MC-38 mouse colon cancer cells resulted in complete suppression of tumor formation in 8 out of 10 C57BL / 6 mice (FIG. 6B). Local production of AIM II also dramatically prolonged the survival of mice bearing MC-38 tumors. All animal experiments were repeated three times with similar results.
【0367】 AIM II発現腫瘍細胞の注射によって、実験期間中、ヌードマウス、SC
IDマウスまたはC57BL/6マウスにおいて著しい異常(例えば、体重減少
または肝臓損傷)は引き起こされなかった。これは、局所的に生成されたAIM
IIが全身毒性を誘導することなく強力な抗腫瘍効果を発揮することを示す。Injection of AIM II-expressing tumor cells allowed nude mice, SC
No significant abnormalities (eg, weight loss or liver damage) were caused in ID or C57BL / 6 mice. This is the locally generated AIM
11 shows that II exerts potent antitumor effects without inducing systemic toxicity.
【0368】 (E.可溶性AIM IIタンパク質の発現および細胞傷害性) AIM IIタンパク質の活性を研究するために、AIM IIタンパク質の
組換え可溶性形態(sAIM II)を構築物pFlag−AIM IIで29
3T細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。この構築物は
、AIM IIの細胞外ドメインをコードするが、AIM IIの膜貫通部分を
欠失している(図7A)。単一の20kDaポリペプチド(sAIM II)を
pFlag−AIM IIを形質導入した293T細胞の馴化培地から抗Fla
gモノクローナル抗体で精製し得る(図7A)。乳癌MDA−MB−231細胞
の増殖は、用量依存性様式でこの可溶性AIM IIタンパク質の処理に応答し
て阻害された(図7B)。INFγの添加(10μ/mlまたは50μ/ml)
は、可溶性AIM IIタンパク質の細胞傷害性を劇的に高めた。IFNγ単独
では、MDA−MB−231細胞に対してほとんど活性を示さなかった(図7B
)。これは、MDA−MB−231細胞がTNFまたはIFNγ処理のような単
一のサイトカインに耐性であるという先の報告と一致する。E. Expression and Cytotoxicity of Soluble AIM II Protein To study the activity of AIM II protein, a recombinant soluble form of AIM II protein (sAIM II) was prepared using construct pFlag-AIM II with 29
3T cells were generated by transient transfection. This construct encodes the extracellular domain of AIM II, but lacks the transmembrane portion of AIM II (FIG. 7A). A single 20 kDa polypeptide (sAIM II) was isolated from conditioned medium of 293T cells transduced with pFlag-AIM II by anti-Fla.
g monoclonal antibody (FIG. 7A). The growth of breast cancer MDA-MB-231 cells was inhibited in response to treatment with this soluble AIM II protein in a dose-dependent manner (FIG. 7B). Addition of INFγ (10μ / ml or 50μ / ml)
Dramatically increased the cytotoxicity of the soluble AIM II protein. IFNγ alone showed little activity on MDA-MB-231 cells (FIG. 7B
). This is consistent with previous reports that MDA-MB-231 cells are resistant to a single cytokine, such as TNF or IFNγ treatment.
【0369】 一連の正常細胞株および癌細胞株を、10μ/mlのINFγの存在下で最適
濃度未満の濃度(50ng/ml)で可溶性AIM IIタンパク質の細胞傷害
性効果に対するそれらの感受性について試験した。図8Cに示されるように、M
DA−130、MCF−7,HT−29由来の細胞は、AIM IIの細胞傷害
性に対して感受性であるのに対し、U93T、MC3−1、SW480、MCF
−10A由来の細胞は、AIM II媒介細胞殺傷に対して耐性である。試験し
た全ての細胞株の中で、結腸腺癌細胞株HT−29が最も感受性であり、IC50 は、1ng/ml未満である。HT−29は、IFNγの存在下で、TNF、F
asまたはリンホトキシンβレセプター媒介殺傷に対して非常に感受性であるこ
とを示した。A series of normal and cancer cell lines were tested for their sensitivity to the cytotoxic effects of soluble AIM II protein at suboptimal concentrations (50 ng / ml) in the presence of 10 μ / ml INFγ. . As shown in FIG. 8C, M
Cells derived from DA-130, MCF-7, HT-29 are susceptible to AIM II cytotoxicity, whereas U93T, MC3-1, SW480, MCF
Cells from -10A are resistant to AIM II-mediated cell killing. Of all the cell lines tested, colon adenocarcinoma cell line HT-29 is the most sensitive, IC 50 is the less than 1 ng / ml. HT-29 reacts with TNF, F in the presence of IFNγ.
It was shown to be very susceptible to as or lymphotoxin β receptor mediated killing.
【0370】 (F.LTβRおよびTR2の両方が、癌細胞のAIM II誘導性増殖阻害
を必要とする) AIM IIは、本来、活性化T細胞cDNAライブラリーから同定されたが
、リンパ球細胞株においてアポトーシスを誘導しない。RT−PCR分析を使用
して、試験した全てのリンパ球細胞がLTβRの発現を示さないことを示したが
、TR2発現がこれらの全ての細胞、特に活性化ジャーカット細胞またはPBL
で見出された。これは、末梢リンパ球がLTβRを発現しないという先の報告と
一致するが、TR2発現は、T細胞活性化と関連する。F. Both LTβR and TR2 Require AIM II-Induced Growth Inhibition of Cancer Cells AIM II was originally identified from an activated T-cell cDNA library Does not induce apoptosis in RT-PCR analysis was used to show that all lymphocyte cells tested did not show LTβR expression, but TR2 expression showed that all these cells, especially activated Jurkat cells or PBL
Found in. This is consistent with previous reports that peripheral lymphocytes do not express LTβR, but TR2 expression is associated with T cell activation.
【0371】 LTβRおよびTR2の一連のヒト癌細胞における細胞表面発現を、LTβR
またはTR2に対するモノクローナル抗体を使用して、FACS分析によって調
べた。図8Aに示されるように、両方のレセプターが高レベルであることがMD
A−MB−231およびHT−29細胞で見いだされたが、その一方でMC3−
1細胞はTR2を発現せず、そしてジャーカット細胞は、LTβRを発現しない
。図8Cに、試験した全ての細胞株における両方のレセプターの表面発現をまと
める。レセプターの一方のみを発現する細胞株(例えば、ジャーカットまたはM
C3−1)は、AIM IIの細胞傷害性に対して耐性である。まとめると、こ
れらのデータは、腫瘍細胞におけるAIM II媒介増殖阻害がLTβRおよび
TR2レセプターの両方を必要とし得るが、その一方で、レセプターのうちの一
方のみを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを示唆
する。The cell surface expression of LTβR and TR2 on a series of human cancer cells was
Or by FACS analysis using a monoclonal antibody against TR2. As shown in FIG. 8A, high levels of both receptors indicated that MD
It was found in A-MB-231 and HT-29 cells, while MC3-
One cell does not express TR2 and Jurkat cells do not express LTβR. FIG. 8C summarizes the surface expression of both receptors in all cell lines tested. Cell lines expressing only one of the receptors (eg, Jurkat or M
C3-1) is resistant to AIM II cytotoxicity. Taken together, these data indicate that AIM II-mediated growth inhibition in tumor cells may require both LTβR and TR2 receptors, while cells expressing only one of the receptors mediate cell killing Suggest that it is not enough.
【0372】 AIM IIがLTβRおよびTR2レセプター両方についての適切なリガン
ドであり、ならびにAIM II媒介腫瘍細胞増殖阻害における両方のレセプタ
ーに重要であることをさらに実証するために、Flagタグ化AIM IIタン
パク質を、MDA−MB−231またはHT−29細胞とともにインキュベート
し、次いで、FACS分析を、抗FlagmAbを用いて行った。図8Bに示さ
れるように、MDA−MB−231またはHT−29細胞の、Flagタグ化可
溶性AIM IIタンパク質との結合は正にシフトする。結合の特異性を、同じ
細胞中で可溶性AIM II−flagタンパク質とのLTβR−Fc融合タン
パク質またはTR2−Fc融合タンパク質(これは、両方のレセプターの結合を
効果的にブロックした)のプレインキュベーションによってさらに確認した(図
8B)。To further demonstrate that AIM II is a suitable ligand for both the LTβR and TR2 receptors, and that it is important for both receptors in AIM II-mediated tumor cell growth inhibition, Flag-tagged AIM II protein was , MDA-MB-231 or HT-29 cells, and then FACS analysis was performed with anti-FlagmAb. As shown in FIG. 8B, binding of MDA-MB-231 or HT-29 cells to Flag-tagged soluble AIM II protein is positively shifted. The specificity of the binding was further enhanced by preincubation of the LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion protein with the soluble AIM II-flag protein in the same cells, which effectively blocked the binding of both receptors. Confirmed (FIG. 8B).
【0373】 腫瘍細胞に対するAIM II媒介細胞傷害性におけるLTβRおよびTR2
の両方の改善の重要性は、インビトロ増殖アッセイから得られたデータによって
さらに支持された:HT−29のsAIM II媒介細胞傷害性は、用量依存性
様式でLTβR−Fc融合タンパク質またはTR2−Fc融合タンパク質の添加
によって無効にされたが、一方で、LTβR−Fc融合タンパク質またはTR2
−Fc融合タンパク質それ自体は、細胞増殖に対して全く効果を示さなかった(
図8D)。さらに、同様のアッセイにおいて、sAIM IIはTNFRの他の
メンバー(例えば、TNFRI、Fas、DR3またはDR14)に結合し得な
かった。LTβR and TR2 in AIM II-mediated cytotoxicity against tumor cells
The importance of both improvements was further supported by the data obtained from the in vitro proliferation assay: sAIM II-mediated cytotoxicity of HT-29 was demonstrated in a dose-dependent manner by LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion. The LTβR-Fc fusion protein or TR2
The -Fc fusion protein itself had no effect on cell proliferation (
(FIG. 8D). Furthermore, in a similar assay, sAIM II failed to bind to other members of TNFR (eg, TNFRI, Fas, DR3 or DR14).
【0374】 さらに、MDA−MB−231/WtまたはHT−29細胞とMDA−MB−
231/AIM II細胞との共培養は、MDA−MB−231/Wtまたは野
生型HT−29細胞の殺傷を生じた。しかし、共培養したMDA−MB−231
/AIM IIまたはMC−38/AIM II細胞から回収された馴化培地は
、HT−29細胞の増殖のインビトロに対する阻害効果を全く示さなかった。こ
の結果は、天然のAIM IIタンパク質が切断され得ず、そして培地中に分泌
され得ないことを示した。従って、膜結合AIM IIは、MDA−MB−23
1またはHT−29のような適切な表面レセプターを発現する細胞で機能的であ
る。まとめると、このデータは、腫瘍細胞のAIM II媒介増殖阻害がLTβ
RおよびTR2レセプターの両方を必要とし得るが、レセプターのうちの一方の
みを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを示唆する
。In addition, MDA-MB-231 / Wt or HT-29 cells and MDA-MB-
Co-culture with 231 / AIM II cells resulted in killing of MDA-MB-231 / Wt or wild type HT-29 cells. However, co-cultured MDA-MB-231
Conditioned media recovered from / AIM II or MC-38 / AIM II cells showed no inhibitory effect on the proliferation of HT-29 cells in vitro. This result indicated that the native AIM II protein could not be cleaved and secreted into the medium. Therefore, the membrane-bound AIM II is based on MDA-MB-23.
It is functional in cells that express appropriate surface receptors such as 1 or HT-29. Taken together, this data indicates that inhibition of AIM II-mediated growth of tumor cells was LTβ
Cells that may require both the R and TR2 receptors, but that express only one of the receptors, are not sufficient to mediate cell killing.
【0375】 (G.リンパ球に対するAIM IIの効果) AIM IIは、本来、活性化T細胞cDNAライブラリーから同定されたが
、リンパ球細胞株においてアポトーシスを誘導しない。RT−PCR分析を使用
して、試験した全てのリンパ球産生細胞がLTβRを発現しないことを示したが
、TR2は、これらの全ての細胞、特に活性化ジャーカット細胞またはPBLで
陽性であった。これは、末梢リンパ球がLTβRを発現しないという先の報告と
一致するが、TR2発現は、T細胞活性化と関連した。G. Effect of AIM II on Lymphocytes AIM II was originally identified from an activated T cell cDNA library, but does not induce apoptosis in lymphocyte cell lines. RT-PCR analysis was used to show that all lymphocyte producing cells tested did not express LTβR, but TR2 was positive in all these cells, especially activated Jurkat cells or PBL . This is consistent with previous reports that peripheral lymphocytes do not express LTβR, but TR2 expression was associated with T cell activation.
【0376】 膜結合AIM IIがリンパ球に対して異なる活性を発揮するか否かを調べる
ために、TIL1200細胞のMDA−MB−231/AIM II細胞との共
培養実験を行った。TIL1200は、高レベルのFasを発現するCD8+( 995)腫瘍浸潤リンパ球株である。膜結合AIM IIは、TIL1200の
アポトーシスを誘導しなかったが、Fas抗体の添加によって、90%のTIL
1200が誘発されて、アポトーシスを受けた。同様の結果が、新鮮なTIL細
胞またはジャーカット細胞で得られた。To determine whether membrane-bound AIM II exerts different activities on lymphocytes, co-culture experiments of TIL1200 cells with MDA-MB-231 / AIM II cells were performed. TIL1200 is a CD8 + (995) tumor infiltrating lymphocyte line that expresses high levels of Fas. Membrane-bound AIM II did not induce TIL1200 apoptosis, but with the addition of Fas antibody, 90% TIL
1200 were induced to undergo apoptosis. Similar results were obtained with fresh TIL or Jurkat cells.
【0377】 さらに、いくつかのリンパ系細胞株およびPBLを可溶性AIM IIタンパ
ク質に対するこれらの応答性についてスクリーニングした。AIM IIの細胞
傷害性は、ジャーカット細胞(静止またはCD3 mAb活性化のいずれか)、
K562細胞、またはTIL1200(腫瘍浸潤リンパ球)、PBMC(新鮮ま
たはIL−2/CD3 mAb活性化)においてみられなかった(図8C)。対
照的に、PBLのsAIM IIでの処理は、IFNγの放出によって実証され
るように、TR2発現T細胞の活性化を生じる(図9)。Additionally, several lymphoid cell lines and PBLs were screened for their responsiveness to soluble AIM II protein. The cytotoxicity of AIM II is determined by Jurkat cells (either resting or CD3 mAb activation),
It was not found in K562 cells, or TIL1200 (tumor infiltrating lymphocytes), PBMC (fresh or IL-2 / CD3 mAb activation) (FIG. 8C). In contrast, treatment of PBL with sAIM II results in activation of TR2-expressing T cells, as demonstrated by the release of IFNγ (FIG. 9).
【0378】 (考察) 前述の実験で、AIM IIの生物学的機能およびLTβRおよびTR2の新
規なリガンドとしての作用の、そのあり得る機構が特徴づけられた。この結果は
、AIM IIタンパク質がインビトロおよびインビボの両方で形質転換された
腫瘍細胞において主に強力な細胞傷害性を示すが同時に、リンパ球を活性化する
ことを実証する。インビトロおよびインビボでのAIM IIの生物学的活性は
、2つの異なるシグナル伝達経路:LTβRおよびTR2への結合を含むいくつ
かの方法においてTNF/FasLファミリーの他の公知のメンバーと、AIM
IIとを明らかに区別する。AIM II発現が腫瘍増殖を阻害する能力が異
系(xenographic)(免疫不全)モデルおよび同系(免疫コンピテン
ト)モデルの両方で実証されたので、この結果は、T細胞媒介腫瘍特異的応答が
、この研究における原発性腫瘍拒絶についての本質的な因子ではないかもしれな
いことを示唆する。Discussion The experiments described above characterized the biological function of AIM II and its possible mechanism of action as a novel ligand for LTβR and TR2. The results demonstrate that the AIM II protein shows mainly potent cytotoxicity in tumor cells transformed both in vitro and in vivo, but at the same time activates lymphocytes. The biological activity of AIM II in vitro and in vivo has been demonstrated by AIM in several ways, including binding to two different signaling pathways: LTβR and TR2, with other known members of the TNF / FasL family.
It is clearly distinguished from II. This result indicates that the T cell-mediated tumor-specific response was Suggests that this study may not be an essential factor for primary tumor rejection.
【0379】 TNFレセプターファミリーの活性化は、細胞増殖、あるいは細胞分化または
細胞死を直接誘導し得る。前述の実験は、AIM II発現が、血清飢餓または
IFNγの添加と関連して、ヒト乳癌腫細胞株MDA−MB−231における増
殖阻害およびアポトーシスを生じたことを示す。アポトーシスの誘導は、アネキ
シン−V FACS分析およびDNA断片化で示されるように、インビトロでの
増殖阻害についての主な原因であるようである。MDA−MB−231/LT−
γ細胞の形態および増殖パターンは、細胞接着のいくらかの損失の関与を示唆す
る。Browningらは、Fas活性化が急激な細胞死(12〜24時間)を
導き、TNFの効果には24時間を必要とし、そしてLTcX120ヘテロトリ
マーは、HT−29細胞についてのアポトーシスの誘導が最も遅かった(2〜3
日)ことを示した。可溶性AIM IIタンパク質での処理に応答して、LTγ
RおよびTR2を発現するMDA−MB−231細胞およびHT−29細胞の溶
解は、同様の緩慢な結果を示した(すなわち、少なくとも3〜5日)。実質的な
細胞溶解は、いくつかの細胞株については、3〜4日後ですら起こらない。AI
M IIの作用の動態は、LTαIβ2ヘテロトリマーに、より類似している。Activation of the TNF receptor family can directly induce cell proliferation, or cell differentiation or death. The foregoing experiments show that AIM II expression resulted in growth inhibition and apoptosis in the human breast carcinoma cell line MDA-MB-231 in association with serum starvation or addition of IFNγ. Induction of apoptosis appears to be a major cause for growth inhibition in vitro, as shown by Annexin-V FACS analysis and DNA fragmentation. MDA-MB-231 / LT-
The morphology and proliferation pattern of gamma cells suggests that some loss of cell adhesion is involved. Browning et al. Found that Fas activation led to rapid cell death (12-24 hours), the effect of TNF required 24 hours, and that the LTcX120 heterotrimer was the slowest at inducing apoptosis on HT-29 cells. (2-3
Day). In response to treatment with soluble AIM II protein, LTγ
Lysis of MDA-MB-231 and HT-29 cells expressing R and TR2 showed similar slow results (ie, at least 3-5 days). Substantial cell lysis does not occur even after 3-4 days for some cell lines. AI
The kinetics of action of MII is more similar to the LTαIβ2 heterotrimer.
【0380】 AIM IIは、本来、TNF/Fasリガンドおよびレセプタースーパーフ
ァミリーのシステインリッチモチーフとの配列相同性のスクリーニングによって
ヒト活性化T細胞ライブラリーから同定された。他のTNF関連リガンドと同様
に、AIM IIは、外側の細胞表面上にC末端を有し、単一の膜貫通ドメイン
、および短い細胞質テイルを有するII型膜貫通タンパク質である。予測される
ように、AIM II遺伝子の全長cDNAの形質導入によって、タンパク質の
細胞表面発現を生じ、そしてこのタンパク質は、FACS分析で実証されるよう
に、2つのレセプターに結合する。可溶性AIM IIタンパク質は、両方のレ
セプターに結合し、そして標的細胞に対する細胞傷害性効果を誘発するためには
十分である。しかしトランスウェル(transwell)共培養実験(ここで
は、2つの型の細胞が培養培地を共有するが物理的には分離している)において
、野生型MDA−MB−231またはHT−29細胞に対する、AIM II発
現MDA−MB−231細胞に由来する細胞傷害性は観察されなかった。直接共
培養アッセイにおいて、膜結合AIM IIは、近接の接触に由来する殺傷を効
果的に媒介した。従って、天然のAIM IIタンパク質は、分泌されたタンパ
ク質ではないかもしれないことが考えられる。蛍光インサイチュハイブリダイゼ
ーション(FISH)によって、AIM II遺伝子は、ヒト第16染色体、バ
ンドp11.2に位置した。AIM IIの位置は、コア結合タンパク質、スル
ホトランスフェラーゼ、シンタキシン1B、網膜芽細胞腫結合タンパク質6、ジ
ンクフィンガータンパク質44、細胞接着調節遺伝子およびウィルムス腫瘍−3
遺伝子と非常に近い。他の公知のTNFリガンド(例えば、TNF、LTα、お
よびLTβ)をコードする遺伝子は、クラスIIIとHLA−B遺伝子座との間
に挟まれた主要組織適合遺伝子複合体(MHC)内のヒト第6染色体上で密接に
関連している。AIM II was originally identified from a human activated T cell library by screening for sequence homology with the TNF / Fas ligand and cysteine-rich motifs of the receptor superfamily. Like other TNF-related ligands, AIM II is a type II transmembrane protein with a C-terminus on the outer cell surface, a single transmembrane domain, and a short cytoplasmic tail. As expected, transduction of the full-length cDNA of the AIM II gene results in cell surface expression of the protein, which binds to two receptors, as demonstrated by FACS analysis. Soluble AIM II protein is sufficient to bind to both receptors and elicit a cytotoxic effect on target cells. However, in a transwell co-culture experiment (where the two types of cells share the culture medium but are physically separated), wild-type MDA-MB-231 or HT-29 cells No cytotoxicity from AIM II expressing MDA-MB-231 cells was observed. In a direct co-culture assay, membrane-bound AIM II effectively mediated killing from close contact. Thus, it is believed that the native AIM II protein may not be a secreted protein. By fluorescence in situ hybridization (FISH), the AIM II gene was located on human chromosome 16, band p11.2. The location of AIM II is determined by core binding protein, sulfotransferase, syntaxin 1B, retinoblastoma binding protein 6, zinc finger protein 44, cell adhesion regulatory gene and Wilms tumor-3.
Very close to the gene. Genes encoding other known TNF ligands (e.g., TNF, LTa, and LTp) are human homologs of the major histocompatibility complex (MHC) sandwiched between the class III and HLA-B loci. Closely related on 6 chromosomes.
【0381】 LTβRおよびTR2の両方は、デスドメインを欠如している。従って、LT
βRおよびTR2の両方に対するAIM II結合の実証は、興味深い。LTβ
RおよびTR2は、TNFRに対する会合因子(TRAF)との会合を介して一
般的なシグナル伝達経路を活性化し得るが、AIM II−LTβRおよびAI
M II−TR2の相互作用が、異なる生物学的事象の引き金となり得る。本実
施例に示したように、AIM IIの発現は、TR2レセプターのみを発現して
いるリンパ球を活性化するが、LTβRおよびTR2の両方を発現している細胞
を死へと誘導する。LTβRを介したシグナル伝達は、TRAF3依存経路を活
性化する。対照的に、AIM II−TR2相互作用は、おそらくTRAF(T
RAF1、TRAF2、TRAF3およびTRAF5)を介した宿主免疫系の刺
激性応答を励起する。このAIM II二重シグナル伝達仮説は、LTβRおよ
びTR2の異なる組織発現パターンおよび細胞発現パターンによりさらに支持さ
れる。LTβRは、腫瘍および他の上皮細胞において顕著であるが、TおよびB
細胞には存在しない。対照的に、TR2は、静止期のT細胞および活性化された
T細胞、B細胞および単球および顆粒球において匹敵するレベルで大量に発現さ
れる。それゆえ、AIM IIはおそらく、アポトーシスおよび免疫活性化の誘
導のような重大な役割を果たしており、そしてそれゆえ、癌についての治療的適
用を有し得る。[0381] Both LTβR and TR2 lack a death domain. Therefore, LT
The demonstration of AIM II binding to both βR and TR2 is interesting. LTβ
R and TR2 can activate general signaling pathways through association with the association factor for TNFR (TRAF), but AIM II-LTβR and AI
The MII-TR2 interaction can trigger different biological events. As shown in this example, expression of AIM II activates lymphocytes that express only the TR2 receptor, but induces cells that express both LTβR and TR2 to death. Signaling through LTβR activates a TRAF3-dependent pathway. In contrast, the AIM II-TR2 interaction is probably due to TRAF (T
(RAF1, TRAF2, TRAF3 and TRAF5) to excite the stimulatory response of the host immune system. This AIM II dual signaling hypothesis is further supported by the different tissue and cell expression patterns of LTβR and TR2. LTβR is prominent in tumors and other epithelial cells, while T and B
Not present in cells. In contrast, TR2 is abundantly expressed at comparable levels in quiescent and activated T cells, B cells and monocytes and granulocytes. Therefore, AIM II probably plays a critical role such as inducing apoptosis and immune activation, and may therefore have therapeutic applications for cancer.
【0382】 LTβRは、元々、TNFRスーパーファミリーのメンバーであるヒト第12
p染色体上にコードされる転写配列として記載されていた。LTβRは、リンパ
節の発達および細胞性免疫反応を調節するのに重要なエレメントとして関係して
いる。LTβRが、腫瘍株を含む種々の組織および細胞株で発現されていること
が示されている。TNFRファミリーの他のメンバーとは異なり、LTβRは、
Tリンパ球およびBリンパ球によって発現されない。組換えLTα1β2ヘテロ
トリマーを用いることによる、または固定化された抗体との架橋によるLTβR
の活性化は、LTβRが、自身の細胞質領域内にデスドメインを含まないにもか
かわらず、腺癌細胞株の死ならびにケモカインIL−8およびRANTESの産
生を誘導する。The LTβR is originally a human twelfth member that is a member of the TNFR superfamily.
It was described as a transcribed sequence encoded on the p chromosome. LTβR has been implicated as an important element in regulating lymph node development and the cellular immune response. LTβR has been shown to be expressed in various tissues and cell lines, including tumor lines. Unlike other members of the TNFR family, LTβR
Not expressed by T and B lymphocytes. LTβR by using recombinant LTα1β2 heterotrimer or by cross-linking with immobilized antibody
Activation induces the death of adenocarcinoma cell lines and the production of chemokines IL-8 and RANTES, despite that the LTβR does not contain a death domain in its cytoplasmic region.
【0383】 TR2が、複数のヒト組織において発現され、そして休止期および活性化され
たCD4+およびCD8+T細胞、B細胞、単球および好中球を含む造血性系統
細胞における構成的および相対的に高い発現を示す。TR2細胞質テイルは、F
asおよびTNFR−I細胞内ドメインに見られるデスドメインを含まず、そし
てCD40および4−1BBのドメインにより関連しているようである。4−1 BBおよびCD40を介したシグナルが、それぞれT細胞およびB細胞に対して
共刺激性であることが示されている。TR2−Fc融合タンパク質は、アポトー
シスの引き金となるFasLおよびTNFとは対照的に混合リンパ球反応媒介増
殖を阻害した。試験した全ての造血性由来細胞は、TR2レセプターを発現して
いるが、腫瘍細胞で観察されたAIM II媒介殺傷に対して耐性である。これ
は、TR2単独では、デスシグナルを媒介しないことを示す。しかし、試験した
全ての癌細胞が、LTβRおよびTR2の両方を発現したが、AIM II−L
TβRシグナル伝達およびAIM II−TR2シグナル伝達の両方が、腫瘍細
胞において、等しくAIM II媒介細胞傷害性に貢献しているか否かを、解明
することが残されている。本発明者らはまた、可溶性AIM IIは、DR3、
DR4およびDR5にインビトロ結合アッセイにおいては結合しないが、AIM
IIがDR3、DR4およびDR5のような他の公知または未知のデスレセプ
ターと相互作用する可能性を排除し得ない。TR2 is expressed in multiple human tissues and is constitutive and relatively high in hematopoietic lineage cells, including quiescent and activated CD4 + and CD8 + T cells, B cells, monocytes and neutrophils Shows expression. TR2 cytoplasmic tail is F
It does not contain the death domain found in the as and TNFR-I intracellular domains and appears to be more related to the CD40 and 4-1BB domains. 4-1 Signals through BB and CD40 have been shown to be costimulatory for T cells and B cells, respectively. The TR2-Fc fusion protein inhibited mixed lymphocyte response-mediated proliferation in contrast to FasL and TNF, which trigger apoptosis. All hematopoietic-derived cells tested express the TR2 receptor, but are resistant to AIM II-mediated killing observed in tumor cells. This indicates that TR2 alone does not mediate death signals. However, all cancer cells tested expressed both LTβR and TR2, but AIM II-L
It remains to be determined whether both TβR signaling and AIM II-TR2 signaling contribute equally to AIM II-mediated cytotoxicity in tumor cells. We also show that soluble AIM II comprises DR3,
Does not bind to DR4 and DR5 in an in vitro binding assay,
It cannot exclude the possibility that II interacts with other known or unknown death receptors such as DR3, DR4 and DR5.
【0384】 T細胞に対する、TNFの用量制限毒性およびFasLの細胞傷害性が、それ
らの臨床的適用を制限する。AIM IIでの処置は、AIM IIが、TR2
を発現するがLTβRを欠いている宿主免疫細胞に対してデスシグナルではなく
刺激性シグナルの引き金となるので、代替的な魅力的なアプローチとなり得る。
AIM IIは、おそらくLTβRおよびTR2を介して腫瘍細胞の死を選択的
に誘導する能力を有し、そして同時に、見かけ上TR2シグナル伝達経路を介し
てリンパ球からのIFNγの分泌の引き金となり得る。従って、このモデルは、
AIM IIが、抗癌薬剤としてのさらなる開発のための魅力的な候補であるだ
けでなく、より重要なことに、TNFリガンド−レセプター相互作用のメンバー
のシグナル伝達経路をさらに理解するために、以前に定義されたTNFまたはF
asシステムとは異なる新規なシステムを提供することを示す。The dose limiting toxicity of TNF and the cytotoxicity of FasL on T cells limit their clinical application. Treatment with AIM II indicates that AIM II
An alternative attractive approach may be to trigger a stimulatory signal rather than a death signal for host immune cells that express but lack LTβR.
AIM II has the ability to selectively induce tumor cell death, probably via LTβR and TR2, and may at the same time trigger the secretion of IFNγ from lymphocytes, apparently via the TR2 signaling pathway. Therefore, this model
AIM II is not only an attractive candidate for further development as an anticancer drug, but more importantly, to further understand the signaling pathways of members of the TNF ligand-receptor interaction, TNF or F as defined in
It shows that a new system different from the as system is provided.
【0385】 (方法) (AIM II全長遺伝子の分子クローニング) 500を超える異なるcDNAライブラリーから得た1,000,000より
多くのEST(発現配列タグ)を含むデータベースが、ランダムに選択されたヒ
トcDNAクローンの高処理能力を有する自動DNA配列分析を用いて、Hum
an Genome Science Inc.およびThe Institu
te for Genomic Researchの合わさった努力を通じて生
成されている。各ESTの配列相同性比較を、blastnおよびblastn
アルゴリズムを用いて、GenBankデータベースに対して行った。以前に同
定された配列に対する相同性を有するEST(およそ0.01未満)に、相同で
ある配列の名称に基づいて一時的な名称を与えた。このヒトESTデータベース
に対するTNF/Fasリガンドファミリーの保存されたアミノ酸配列(GLY
LIYSQVLF(配列番号46))を用いる特定の相同性およびモチーフ検索
が、>50%の相同性を有するいくつかのESTを明らかにした。ヒト活性化T
細胞ライブラリー由来のGYYYIYSKVQL(配列番号47)を含む1つの
クローンを、選択した。このESTを、3’末端に対する両方の鎖において配列
決定した。その相同性を確認した。最初のクローンは、TNFファミリーの他の
メンバーと比較して遺伝子の5’部分を欠いている。全長配列を得るために、ネ
スティッド(nested)PCR反応を、2つの遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チドおよび2つのベクター特異的プライマーを用いて行なった。5’末端のさら
なる72ヌクレオチドを得た。次いで、全長配列を、ベクターpCMVspor
t2.0(Life Technologies Inc.、Rockvill
e、MD)にクローニングした。Methods Molecular Cloning of AIM II Full Length Genes A database containing more than 1,000,000 ESTs (expressed sequence tags) obtained from over 500 different cDNA libraries was selected from randomly selected humans. Using automated DNA sequence analysis with high throughput of cDNA clones, Hum
an Genome Science Inc. And The Institute
Generated through the combined efforts of te for Genomic Research. Sequence homology comparisons for each EST were performed using blastn and blastn
The algorithm was performed against the GenBank database. ESTs with homology to previously identified sequences (approximately less than 0.01) were given a temporary name based on the name of the sequence being homologous. The conserved amino acid sequence of the TNF / Fas ligand family (GLY
Specific homology and motif searches using LIYSQVLF (SEQ ID NO: 46) revealed several ESTs with> 50% homology. Human activated T
One clone containing GYYYIYSKVQL (SEQ ID NO: 47) from a cell library was selected. This EST was sequenced on both strands to the 3 'end. Its homology was confirmed. The first clone lacks the 5 'portion of the gene as compared to other members of the TNF family. To obtain the full length sequence, a nested PCR reaction was performed using two gene-specific oligonucleotides and two vector-specific primers. An additional 72 nucleotides at the 5 'end were obtained. Next, the full-length sequence was converted into the vector pCMVspor.
t2.0 (Life Technologies Inc., Rockville)
e, MD).
【0386】 (ノーザンブロット分析) ヒト多重組織ノーザンブロット(Clontech、MTNblots、#7
759−1および#7760−1)を、製造者の説明書に従って、32P標識され
たAIM II全長cDNAを用いてプローブした。ブロットを、使用前に42
℃で予熱したハイブリゾル溶液(Oncor)中で、一晩ハイブリダイズし、そ
の後、引き続いて42℃で、2×SSC/0.1%SDSおよび0.2×SSC
/0.1%SDS中で2回洗浄し、PhospholmagerTM(Molec
ular Dynamics Co.)を用いて可視化した。(Northern Blot Analysis) Human Multiple Tissue Northern Blot (Clontech, MTNblots, # 7
759-1 and # 7760-1) were probed with 32 P-labeled AIM II full-length cDNA according to the manufacturer's instructions. Blots were prepared before use.
Hybridization overnight in a hybridsol solution (Oncor) preheated at <RTIgt; 0 C, </ RTI> followed by <RTIgt;
/ 2% in 0.1% SDS, and Phosphormager ™ (Molec
ullar Dynamics Co. ).
【0387】 (インサイチュハイブリダイゼーションおよびFISH検出) AIM II遺伝子の正確な染色体上の位置を決定するために、正常なヒト分
裂中期染色体の広がりに対する単一コピー遺伝子の蛍光インサイチュハイブリダ
イゼーション(FISH)を、試みた(Lawrenceら、1988)。2K
bのcDNAを、ジゴキシゲニン−11−dUTP(Boehringer M
annheim)を用いてニックトランスレーションし、FISHを、John
sonら、1991bに詳述のように行なった。個々の染色体は、DAPIおよ
びカラーデジタルイメージで対比染色し、DAPIおよびローダミンで検出され
た遺伝子シグナルの両方を含んだ物を、トリプル−バンドパスフィルターセット
(Chroma Technology、Inc.、Brattleburo、
VT)を冷却電荷結合素子カメラ(Photometrics、Inc.、Tu
cson、AZ)および可変励起波長フィルター(variable exci
tation wave length filters)(Johnsonら
、1991a)と組み合わせて用いて記録した。画像を、ISEEソフトウェア
パッケージ(Inovision Corp.、Durham、NC)を用いて
分析した。In Situ Hybridization and FISH Detection To determine the exact chromosomal location of the AIM II gene, fluorescent in situ hybridization (FISH) of a single copy gene to the normal human metaphase chromosome spread was performed. Attempted (Lawrence et al., 1988). 2K
b. cDNA was converted to digoxigenin-11-dUTP (Boehringer M
nick translation using FISH and John
Son et al., 1991b. Individual chromosomes were counterstained with DAPI and color digital images and those containing both DAPI and rhodamine detected gene signals were filtered using a triple-bandpass filter set (Chroma Technology, Inc., Brattlebur,
VT) using a cooled charge-coupled device camera (Photometrics, Inc., Tu)
cson, AZ) and a variable excitation wavelength filter (variable exci)
Tissue wave length filters) (Johnson et al., 1991a). Images were analyzed using the ISEE software package (Invision Corp., Durham, NC).
【0388】 (細胞および試薬) ヒト乳癌MDA−MB−231、サブクローン2LMPを、胸腺欠損ヌードマ
ウスのMDA−MB−231細胞のインビボ継代より得、全ての実験に用いた。
MC−38は、H−2b起源の1,2−ジメチルヒドラジン誘導マウス結腸腺癌
である。ヒトTリンパ球株JurkatおよびCHO株を、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション(ATCC、Rockville、MD)より得た。ヒト
黒色腫抗原gp100反応性CD8+T細胞株TIL 1200は、Dr.Yu
taka Kawakami(National Cancer Instit
ute、Bethesda、MD)により快く提供された。MDA−MB−23
1を除く全ての腫瘍細胞株を、10%FCSを含むRPMI1640培地で増殖
および維持した。MDA−MB−231には、ダルベッコ改変されたEagle
’s培地を基本培地として用いた。HLA−A−2制限TIL 1200を、1
0%ヒト血清および1000UのIL−2を含むAim−V培地において増殖さ
せた。アポトーシス誘導性抗Fas Mab CH−11を、Upstate
Biotechnologyより得た。インターフェロンを、Biosourc
e International(CA)より得た。Cells and Reagents Human breast cancer MDA-MB-231, subclone 2LMP, was obtained from in vivo passage of MDA-MB-231 cells of athymic nude mice and used in all experiments.
MC-38 is a 1,2-dimethylhydrazine-induced mouse colon adenocarcinoma of H-2b origin. Human T lymphocyte strains Jurkat and CHO strains were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). The human melanoma antigen gp100 reactive CD8 + T cell line TIL 1200 was obtained from Dr. Yu
Taka Kawami (National Cancer Institute)
, Bethesda, MD). MDA-MB-23
All but one tumor cell line was grown and maintained in RPMI 1640 medium with 10% FCS. MDA-MB-231 contains Dulbecco's modified Eagle
's medium was used as the basal medium. HLA-A-2 restricted TIL 1200
Grow in Aim-V medium containing 0% human serum and 1000 U IL-2. Apoptosis-inducing anti-Fas Mab CH-11 was purified by Upstate
Obtained from Biotechnology. Interferon, Biosource
e Obtained from International (CA).
【0389】 (可溶性AIM IIの生成) AIM IIのアミノ酸74−240(すなわち、推定細胞外ドメイン)をコ
ードする配列を、プレプロトリプシンシグナルペプチドおよびFLAGペプチド
タグをコードする配列とインフレームにベクターpFLAG.CMV−1にサブ
クローニングした。得られた構築物、pFLAG−sAIM IIを、組換えs
AIM IIを生成するために293T細胞にトランスフェクトした。pFLA
G.CMV−1またはpFLAG−sAIM IIをトランスフェクトした細胞
由来の培養培地を、抗FLAG mAb(Eastman Kodak Co.
)アフィニティーカラムに通した。カラム溶出液を、SDS−PAGEにより分
画し、そして、sAIM IIを、抗FLAG mAbおよびECL検出試薬(
Amersham International)を用いてウェスタンブロット
分析により検出した。Generation of Soluble AIM II The sequence encoding amino acids 74-240 of AIM II (ie, the putative extracellular domain) was placed in frame with the sequence encoding the preprotrypsin signal peptide and the FLAG peptide tag in the vector pFLAG. It was subcloned into CMV-1. The resulting construct, pFLAG-sAIM II, was
293T cells were transfected to produce AIM II. pFLA
G. FIG. Culture medium derived from cells transfected with CMV-1 or pFLAG-sAIM II was purified from anti-FLAG mAb (Eastman Kodak Co., Ltd.).
) Passed through an affinity column. The column eluate was fractionated by SDS-PAGE, and sAIM II was replaced with anti-FLAG mAb and ECL detection reagent (
Detection was performed by Western blot analysis using Amersham International).
【0390】 (組換えレセプター−Fc融合タンパク質の生成) ヒトLTβRの細胞外ドメインをコードするcDNAを、RT−PCR技術に
よりHepG2細胞から増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、以
下であり:正方向5’CGGGATCCATGCTCCTGCCTTGGGCC
AC3’(配列番号48);および逆方向5’GCGGATCCTGGGGGC
AGTGGCTCTAATGG3’(配列番号49)、そしてpSK+ベクター
(Stratagene)へのPCR産物のクローニングが促進されるように各
末端にBamHI制限酵素部位を含んだ。増幅された配列を、BamHI消化に
供し、そして配列決定のためにBamHI切断pSK+ベクターに連結した。増
幅したcDNAフラグメントの忠実度をジデオキシDNA配列決定により確認し
た。ヒトLTβR−Fc融合タンパク質を得るために、LTβRの細胞外ドメイ
ンを、BamHI制限エンドヌクレアーゼを用いてpSK+ベクターから切り出
し、そしてインフレーム連結するようにBglII切断pUC19−IgGl−
Fcベクターに連結した。組換えバキュロウイルスを生成するために、融合遺伝
子をまず、pUC19−IgG−FcベクターからHpal/HindIIIで
切り出し、続いてSmaI切断pBacPAK9ベクター(Clontech
Co.)との連結で塞いだ後、次いで、Sf9細胞内に線状化したBacPAK
6 DNA(Clontech Co.)と共トランスフェクトした。組換え可
溶性LTβR融合タンパク質を得るために、組換えウイルスを感染させた昆虫S
f21細胞からの5日間培養した上清を、濾過し、プロテインAセファロースビ
ーズ上に捕捉し、次いで、結合sLTβRタンパク質を、グリシン緩衝液(pH
3.0)で溶出し、続いてPBS中で透析した。TR2−Fc融合タンパク質の
産生は、記載されている。(Generation of Recombinant Receptor-Fc Fusion Protein) cDNA encoding the extracellular domain of human LTβR was amplified from HepG2 cells by the RT-PCR technique. The sequence of the oligonucleotide primers is as follows: forward 5 'CGGGATCCATGCCTCCTGCCTTGGGGCC
AC3 '(SEQ ID NO: 48); and reverse 5' GCGGATCCTGGGGGGC
A BTGHI restriction enzyme site was included at each end to facilitate the cloning of the PCR product into AGTGGCTCTAATGG3 '(SEQ ID NO: 49) and the pSK + vector (Stratagene). The amplified sequence was subjected to BamHI digestion and ligated into a BamHI cut pSK + vector for sequencing. The fidelity of the amplified cDNA fragment was confirmed by dideoxy DNA sequencing. To obtain a human LTβR-Fc fusion protein, the extracellular domain of LTβR is excised from the pSK + vector using BamHI restriction endonuclease and BglII cut pUC19-IgGl- so as to ligate in frame.
It was ligated to the Fc vector. To generate a recombinant baculovirus, the fusion gene was first excised from the pUC19-IgG-Fc vector with Hpal / HindIII followed by a SmaI cut pBacPAK9 vector (Clontech).
Co. ), And then BacPAK linearized in Sf9 cells
Co-transfected with 6 DNA (Clontech Co.). In order to obtain a recombinant soluble LTβR fusion protein, insects infected with the recombinant virus S
Supernatants cultured for 5 days from f21 cells were filtered and captured on protein A Sepharose beads, and then bound sLTβR protein was removed from glycine buffer (pH
3.0) followed by dialysis in PBS. The production of a TR2-Fc fusion protein has been described.
【0391】 (LTβR抗体およびTR2抗体の生成) Balb/cJマウス(The Jackson Laboratory、B
ar Harbor、ME)を、フロイントアジュバント中のLTβR−Fc融
合タンパク質で免疫した。マウスを、3回追加免疫し、次いで、脾臓細胞を、H
EPES中50%のポリエチレングリコール存在下(PEG 1500、Boe
hringer Mannheim)でマウスミエローマNS−1細胞と融合し
、続いて、RPMI1640/HATおよびRPMI1640/HT選択培地(
Boehringer Co.)中で培養した。ポジティブウェルからの上清を
、LTβR−Fc融合タンパク質に結合するがヒトIgGには結合しない能力に
ついてELISAにより試験した。LTβR−Fc融合タンパク質に対する抗体
を産生するハイブリドーマを、3回の制限希釈によりクローニングした。大量の
mAbを産生するために、107ハイブリドーマ細胞をBalb/cマウスのプ リスタン処理した腹腔内に注入し、続いてmAbを、アフィニティークロマトグ
ラフィーにより腹水から精製した。同様に、TR2−GST融合タンパク質を用
いて、TR2に対するモノクローナル抗体を産生させ、ELISAアッセイによ
りスクリーニングした。(Generation of LTβR and TR2 Antibodies) Balb / cJ mice (The Jackson Laboratory, B
ar Harbor, ME) was immunized with the LTβR-Fc fusion protein in Freund's adjuvant. Mice were boosted three times and then spleen cells were
In the presence of 50% polyethylene glycol in EPES (PEG 1500, Boe
fusion with mouse myeloma NS-1 cells, followed by RPMI 1640 / HAT and RPMI 1640 / HT selective media (
Boehringer Co. ). Supernatants from positive wells were tested by ELISA for their ability to bind to the LTβR-Fc fusion protein but not to human IgG. Hybridomas producing antibodies against the LTβR-Fc fusion protein were cloned by three limiting dilutions. To produce large amounts of mAb, was injected into 10 7 hybridoma cells Balb / c mice flop Risutan treated intraperitoneally, followed by mAb, it was purified from ascites by affinity chromatography. Similarly, a monoclonal antibody against TR2 was produced using the TR2-GST fusion protein and screened by an ELISA assay.
【0392】 (インビトロ増殖アッセイ) 細胞(5,000細胞/ウェル)を、10%FBSまたは1%FBSのいずれ
かの存在下のIMEMと共に、24−マルチウェル組織培養プレート中に3連で
プレートした。3日、5日または7日目の生存細胞の数を、トリパンブルー排除
法により決定した。細胞を、この時間経過の間2日ごとに新鮮な培地と交換した
。In Vitro Proliferation Assay Cells (5,000 cells / well) were plated in triplicate in 24-multiwell tissue culture plates with IMEM in the presence of either 10% FBS or 1% FBS. . The number of surviving cells at 3, 5 or 7 days was determined by trypan blue exclusion. Cells were replaced with fresh medium every two days during this time course.
【0393】 96ウェルプレート中で細胞増殖のための可溶性テトラゾリウム/ホルマザン
(XTT)アッセイを実施した。細胞(2,000〜4,000細胞/ウェル)
を10%FBSまたは1%FBSを有するIMEM培地中で増殖させた。4〜5
日の培養後、XTT(1.0mg/mlおよび1.53mg/mlのPMS)を
各ウェルに添加し、そして37℃で4時間インキュベートした。450nmでの
吸光度をDynatech Model MR700で測定した。[0393] Soluble tetrazolium / formazan (XTT) assays for cell growth were performed in 96-well plates. Cells (2,000-4,000 cells / well)
Was grown in IMEM medium with 10% FBS or 1% FBS. 4-5
After day culture, XTT (1.0 mg / ml and 1.53 mg / ml PMS) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Absorbance at 450 nm was measured with a Dynatech Model MR700.
【0394】 (FACS分析) 細胞をトリプシン処理または吸引で集め、そして1500〜2000rpmで
5分間、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、そして5mlの氷冷PBSで
2回洗浄した。次いで、細胞を結合緩衝液(10% BSA、20mM HEP
ES(pH7.2)、0.02% NaN3および25μg/ml正常ラットI gを含むHBSS)中で、30分間、4℃において、10μg/mlのFlag
−タグ化AIM IIタンパク質またはAbsと共にインキュベートした。次い
で、細胞を洗浄し、そして記載のようにヤギ抗マウスIgGに結合体化させたフ
ィコエリスリン(PE)20μg/mlを用いて染色した。細胞表面結合に対し
て競合させるために、可溶性LTRβR−Fc融合タンパク質、TR2−Fcを
10μg/mlで細胞に添加前に、30分間、AIM IIとプレインキュベー
トした。蛍光をFACスキャンフローサイトメーター(Becton Dick
inson、Mountain View、CA)によって分析した。FACS Analysis Cells were harvested by trypsinization or aspiration and centrifuged at 1500-2000 rpm for 5 minutes. The cell pellet was resuspended and washed twice with 5 ml of ice-cold PBS. The cells were then combined with binding buffer (10% BSA, 20 mM HEP).
10 μg / ml Flag for 30 minutes at 4 ° C. in ES (pH 7.2), HBSS containing 0.02% NaN 3 and 25 μg / ml normal rat Ig.
-Incubated with tagged AIM II protein or Abs. Cells were then washed and stained with 20 μg / ml phycoerythrin (PE) conjugated to goat anti-mouse IgG as described. To compete for cell surface binding, the soluble LTRβR-Fc fusion protein, TR2-Fc, was pre-incubated with AIM II for 30 minutes before adding 10 μg / ml to the cells. Fluorescence is measured by FAC scan flow cytometer (Becton Dick)
inson, Mountain View, CA).
【0395】 アポトーシスアッセイのために、細胞ペレットを1:100希釈のAnnex
in V−FITC(Trevigen、Gaithersburg,MD)お
よび50μg/mlのヨウ化プロピジウムを含む1×結合緩衝液(10mM H
EPES(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM KCl、1mM M
gCl2、1.8mM CaCl2)中で再懸濁し、4℃で15分間インキュベー
トした。各細胞のAnnexin V−FITCおよびヨウ化プロピジウムの蛍
光をフローサイトメトリー(Coulter)で分析した。For the apoptosis assay, the cell pellet was diluted 1: 100 with Annex.
1 × binding buffer (10 mM H2F) containing in V-FITC (Trevigen, Gaithersburg, MD) and 50 μg / ml propidium iodide.
EPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 1 mM M
gCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 ) and incubated at 4 ° C. for 15 minutes. The fluorescence of Annexin V-FITC and propidium iodide of each cell was analyzed by flow cytometry (Coulter).
【0396】 (腫瘍細胞のレトロウイルス形質導入) レトロウイルスベクターをAIM II遺伝子で腫瘍細胞を安定に形質導入す
ために使用した。AIM IIをコードするプラスミドを構築するために、AI
M II cDNAを含む1.9kd Not I/Sal Iフラグメントを
親プラスミドpG1SamENに挿入した。このレトロウイルス骨格は、モロニ
ーマウス白血病ウイルスに由来し、そしてAIM II遺伝子は、モロニー(M
oline)マウス白血病ウイルス由来の長末端反復の転写制御下であった。レ
トロウイルスパッケージング株の生成は、以前に記載された(Markowit
zら)。簡潔には、30μgのpG1SamEN−AIM II DNAを2×
105のPA317両栄養性パッケージング株および3×105GP+E86エコ
トロピックパッケージング株の混合物をトランスフェクトするために使用した。
2週間の選択後、次いで、高力価G418耐性PA317クローンを、パッケー
ジング株PA−AIM IIを再生成するために選択し、そして腫瘍細胞中への
遺伝子導入のために使用した。コントロールレトロウイルス産生株、PA−ne
oもまた使用した。これらのパッケージング株を20時間、増殖させ、レトロウ
イルスの上清を収穫し、野生型、MDA−MB−231またはMC−38の75
%コンフルエントなフラスコにそれぞれ添加した。ヒトAIM IIをコードす
る組換えレトロウイルスを用いた形質導入後、AIM II発現MDA−MB−
231またはMC−38細胞をネオマイシンアナログ、G418で選択し、それ
ぞれMDA−MB−231/AIM IIまたはMC−38/AIM IIと命
名した。これらの腫瘍細胞中でのAIM II発現をノーザンブロット分析で確
認した。MDA−MB−231/AIM II、ベクターコントロール株、MD
A−MB−231/neo、MC−38/AIM IIおよびベクターコントロ
ール株、MC−38/neoを含む全ての安定なトランスフェクト体を増殖させ
、そして、それぞれ1.5mg/mlおよび0.375mg/mlのG418の
存在下で維持した。Retroviral transduction of tumor cells A retroviral vector was used to stably transduce tumor cells with the AIM II gene. To construct a plasmid encoding AIM II, the AI
The 1.9 kd Not I / Sal I fragment containing the MII cDNA was inserted into the parent plasmid pG1SamEN. This retroviral backbone is derived from the Moloney murine leukemia virus, and the AIM II gene contains the Moloney (M
olein) was under transcriptional control of the long terminal repeat from mouse leukemia virus. The generation of retroviral packaging strains has been described previously (Markowit
z et al.). Briefly, 30 μg of pG1SamEN-AIM II DNA was added to 2 ×
A mixture of 10 5 PA317 amphotropic packaging strains and 3 × 10 5 GP + E86 ecotropic packaging strains was used to transfect.
After two weeks of selection, high titer G418 resistant PA317 clones were then selected to regenerate the packaging strain PA-AIM II and used for gene transfer into tumor cells. Control retrovirus producing strain, PA-ne
o was also used. These packaging strains were grown for 20 hours and the retroviral supernatant was harvested and 75% wild-type, MDA-MB-231 or MC-38.
% Confluent flasks. After transduction with a recombinant retrovirus encoding human AIM II, AIM II expressing MDA-MB-
231 or MC-38 cells were selected with the neomycin analog, G418, and named MDA-MB-231 / AIM II or MC-38 / AIM II, respectively. AIM II expression in these tumor cells was confirmed by Northern blot analysis. MDA-MB-231 / AIM II, vector control strain, MD
All stable transfectants, including A-MB-231 / neo, MC-38 / AIM II and the vector control strain, MC-38 / neo, were grown and 1.5 mg / ml and 0.375 mg / ml, respectively. Maintained in the presence of ml G418.
【0397】 (ジャーカット(Jurkat)細胞の同時培養アッセイ) MDA−MB−231細胞を6ウェル組織培養プレートにプレートし、そして
コンフルエントまで増殖させた。培地の除去および1×PBSでの単層の洗浄の
後、1×106ジャーカット細胞(非付着性)を単層または空のウェル上の1m lのRPMI培地中にプレートした。MDA−MB−231細胞単独を有するウ
ェル(ジャーカット細胞を重層することなしに)をさらなるコントロールとして
維持した。24または48時間の培養後、混合培養物の非付着性相を、プレート
の穏やかな揺動後、プレートされた6ウェルから収集し、そしてトリパンブルー
排除を使用して生存度をアッセイした。アポトーシスの検出については、Ann
exin V−FITC FACScanフローサイトメーターを使用して、サ
ンプル当たり20,000細胞を測定した。Jurkat Cell Co-Culture Assay MDA-MB-231 cells were plated in 6-well tissue culture plates and grown to confluence. After removal of the medium and washing of the monolayer with 1 × PBS, 1 × 10 6 Jurkat cells (non-adherent) were plated in 1 ml of RPMI medium on a monolayer or empty well. Wells with MDA-MB-231 cells alone (without overlaying Jurkat cells) were maintained as additional controls. After 24 or 48 hours of culture, the non-adherent phase of the mixed culture was collected from 6 plated wells after gentle rocking of the plate and assayed for viability using trypan blue exclusion. For detection of apoptosis, Ann
20,000 cells per sample were measured using an exin V-FITC FACScan flow cytometer.
【0398】 (リンホカイン放出アッセイ) リンホカイン放出アッセイを以前記載のように(Zhaiら)、AIM II
でヒトPBL反応性を検出するために実施した。簡潔には、ヒトPBL細胞を抗
CD3mAb(0.1μg/ml)およびrlL−2 20U/mlならびに種 々の濃度のAIM IIタンパク質の存在下で5日間インキュべートし、上清を
収集し、そしてIFNγの分泌をR&D Systems(Minneapol
is、MN)から購入したELISAキットを使用して決定した。Lymphokine Release Assay Lymphokine release assays were performed as previously described (Zhai et al.), AIM II.
Performed to detect human PBL reactivity. Briefly, human PBL cells were incubated for 5 days in the presence of anti-CD3 mAb (0.1 μg / ml) and rlL-2 20 U / ml and various concentrations of AIM II protein, and the supernatant was collected. And the secretion of IFNγ was determined by R & D Systems (Minneapol
is, MN) using an ELISA kit purchased from
【0399】 (腫瘍形成能研究) メス胸腺欠損Ncr−nuヌードマウス(6週齢)をFrederick C
ancer Reseach and Development Center
、National Institute of Health(Freder
ich、MD)およびCharles River Laboratories
(Raleigh、NC)から得た。メスC57BL/6マウス(6−7週齢)
をHarlan Sprague Dawley(Indianapolis、
IN)から購入した。MDA−MB−231細胞(1×106)をメス胸腺欠損 のヌードマウスの***脂肪パッドに0日目に注射し、同様に、MC−38細胞を
C58BL/6マウスの隣接領域に皮下(s.c)注射した。次いで、マウスに
耳標し、そして無作為化した。腫瘍サイズを盲目的な様式で週に2回カリパーを
用いて垂直直径を測定することによって評価した。各処理群は、10匹の動物か
らなり、実験を3回繰り返した。腫瘍の組織学的検査をH/E染色を使用して実
施した。(Tumorogenicity study) Female athymic Ncr-nu nude mice (6 weeks old) were cultured on Frederick C
ancer Research and Development Center
, National Institute of Health (Freder
ich, MD) and Charles River Laboratories
(Raleigh, NC). Female C57BL / 6 mouse (6-7 weeks old)
To Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Indianapolis,
IN). MDA-MB-231 cells (1 × 10 6 ) were injected at day 0 into the mammary fat pad of female athymic nude mice, and MC-38 cells were similarly injected subcutaneously (s) into adjacent areas of C58BL / 6 mice. C) injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor size was assessed in a blind fashion by measuring vertical diameter twice a week using calipers. Each treatment group consisted of 10 animals and the experiment was repeated three times. Histological examination of the tumor was performed using H / E staining.
【0400】 (実施例6:BIAcore分析によるAIM II発現の検出) CHO細胞をAIM II−Flag タグ発現ベクターまたはBAP−Fl
ag(ネガティブコントロール)のいずれかでトランスフェクトした。トランス
フェクトの3日後、AIM II発現をBIAcore装置(BIAcore、
Inc.)を用いて測定し、これは、固定化AIM IIレセプター、リンホト
キシン−βレセプターに対する、タンパク質結合現象のリアルタイム測定を可能
とする(BIAcoreセンサーグラムは、フローセルの表面で屈折率の変化に
よって結合を検出する)。リンホトキシン−βレセプター−Fc融合タンパク質
をN−エチル−N’−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド/N−ヒドロ
キシスクシンイミド化学を使用して、アミン基を介してBIAcoreフローセ
ルに共有結合的に固定化した。AIM II−Fragおよびネガティブコント
ロール(BAP−Flag)馴化無血清培地の種々の希釈をリンホトキシン−β
−レセプター−誘導体化フローセルに、50μlの総用量について5μl/分で
供した。結合タンパク質の量をHBS緩衝液(10mM HEPES(pH7.
4)、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005% Surf
actant P20)でのフローセル洗浄後、決定した。このフローセル表面
を20μlの10mM HClでの洗浄による結合タンパク質の置換によって再
生した。Example 6 Detection of AIM II Expression by BIAcore Analysis CHO cells were transformed with AIM II-Flag tag expression vector or BAP-Fl
ag (negative control). Three days after transfection, AIM II expression was measured using a BIAcore device (BIAcore,
Inc. ), Which allows real-time measurement of the protein binding phenomenon for the immobilized AIM II receptor, lymphotoxin-β receptor (BIAcore sensorgrams detect binding by changes in refractive index at the surface of the flow cell). Do). Lymphotoxin-β receptor-Fc fusion protein was covalently immobilized via an amine group to a BIAcore flow cell using N-ethyl-N ′-(dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide chemistry. Various dilutions of AIM II-Frag and negative control (BAP-Flag) conditioned serum-free media were tested with lymphotoxin-β
-Receptor-derivatized flow cells were applied at 5 μl / min for a total volume of 50 μl. The amount of bound protein was determined using HBS buffer (10 mM HEPES (pH 7.
4), 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Surf
determined after washing the flow cell with actant P20). The flow cell surface was regenerated by displacement of the bound protein by washing with 20 μl of 10 mM HCl.
【0401】 リンホトキシン−β−レセプターに対する特異的結合をAIM II−Fla
g培養物からの10倍までの馴化培地の希釈で検出したが、ネガティブコントロ
ール(BAP−Flag)馴化培地について有意な結合を全く観察しなかった。
このことは、AIM II−Flag結合がリンホトキシン−β−レセプターに
特異的であり、そしてこの融合タンパク質のFc部分に対しては特異的でないこ
とを実証する。さらに、AIM II−Flagタンパク質による特異的レセプ
ター結合は、この結合がこの細胞によって分泌されるようなネイティブな構造物
を表すことを示す。従って、このBIAcoreに基づいたアッセイを馴化培地
および他の生物学的液体からのAIM IIの発現を検出するために使用し得る
。さらに、純粋なAIM IIタンパク質の既知量を使用することによって、こ
のアッセイをAIM II濃度を決定するための定量的アッセイに開発し得る。The specific binding to lymphotoxin-β-receptor was determined by AIM II-Fla
No significant binding was observed for the negative control (BAP-Flag) conditioned medium, detected at up to 10-fold dilution of conditioned medium from g culture.
This demonstrates that AIM II-Flag binding is specific for the lymphotoxin-β-receptor and not for the Fc portion of the fusion protein. Furthermore, specific receptor binding by the AIM II-Flag protein indicates that this binding represents a native construct as secreted by the cell. Thus, this BIAcore-based assay can be used to detect the expression of AIM II from conditioned media and other biological fluids. In addition, by using known amounts of pure AIM II protein, this assay can be developed into a quantitative assay to determine AIM II concentration.
【0402】 (実施例7:活性化誘導されたアポトーシスアッセイ) 活性化誘導されたアポトーシスを、SupT−13 白血病細胞を使用してア
ッセイし、そして細胞周期分析により測定した。アッセイを以下のように実施す
る。SupT−13細胞を、対数増殖(約1×106)中に10%FCSを含有 するRPMIにおいて維持する。Sup−T13細胞を、0.5×106/ml 、1ml/ウェルで24ウェルプレートのウェル中に播種する。AIM IIタ
ンパク質(0.01、0.1、1、10、100、1000ng/ml)または
緩衝液コントロールをウェルに添加し、そして細胞を37℃で、24時間インキ
ュベートする。滅菌濾過した0.05M炭酸水素緩衝液、pH9.5中、10μ
g/ml濃度の精製BC3 mAb、または、緩衝液単独を、ウェル中に0.5
ml/ウェルで、インキュベートすることによって、抗CD3抗体を併ってまた
は併わず、別の24ウェルプレートのウェルを調製した。プレートを4℃で一晩
インキュベートする。抗体でコーティングされたプレートのウェルを、4℃で、
滅菌PBSで3回洗浄する。AIM II処理したSup−T13細胞を、抗体
でコーティングしたウェルに移し、そして37℃で、18時間インキュベートす
る。アポトーシスを、ヨウ化プロピジウムおよびフローサイトメトリーを使用す
る細胞周期分析により測定する。各処理したウェルの全300μlを採取し、そ
して96ウェルプレートの3連のウェル内に送達することにより(100μl/
ウェル)、処理した細胞の増殖を測定する。各ウェルに対して、20μl/ウェ
ルの3H−チミジン(0.5μCi/20μl、2Ci/mM)を添加し、37 ℃で、18時間インキュベートする。収集し、そして細胞による3H−チミジン の取り込みを計数する。この測定を使用して、他の方法により観察される場合の
アポトーシスに対する効果を確認する。このアッセイについてのポジティブコン
トロールは、抗CD3架橋単独である。さらに、抗fasモノクローナル抗体(
可溶化形態IgM mAb中、500ng/ml)を使用して、この株における
顕著でかつ再現性のアポトーシスが実証された。このアッセイについてのネガテ
ィブコントロールは、培地または緩衝液単独である。また、別の抗CD3 mA
B(OKT3)での架橋は、効果を有さないことが示された。Example 7 Activation-Induced Apoptosis Assay Activation-induced apoptosis was assayed using SupT-13 leukemia cells and measured by cell cycle analysis. The assay is performed as follows. SupT-13 cells are maintained in RPMI containing 10% FCS in logarithmic growth (about 1 × 10 6 ). Sup-T13 cells are seeded at 0.5 × 10 6 / ml, 1 ml / well in wells of a 24-well plate. AIM II protein (0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) or buffer control is added to the wells and the cells are incubated at 37 ° C. for 24 hours. 10 μl in sterile filtered 0.05M bicarbonate buffer, pH 9.5
g / ml concentration of purified BC3 mAb or buffer alone was added to wells at 0.5 g / ml.
The wells of another 24-well plate were prepared by incubation with ml / well, with or without anti-CD3 antibody. Incubate the plate at 4 ° C. overnight. The wells of the plate coated with the antibody were placed at 4 ° C.
Wash three times with sterile PBS. AIM II-treated Sup-T13 cells are transferred to antibody-coated wells and incubated at 37 ° C. for 18 hours. Apoptosis is measured by cell cycle analysis using propidium iodide and flow cytometry. By taking a total of 300 μl of each treated well and delivering into triplicate wells of a 96-well plate (100 μl /
Wells), measure the proliferation of the treated cells. To each well, add 20 μl / well of 3 H-thymidine (0.5 μCi / 20 μl, 2 Ci / mM) and incubate at 37 ° C. for 18 hours. Harvest and count uptake of 3 H-thymidine by the cells. This measurement is used to confirm the effect on apoptosis as observed by other methods. The positive control for this assay is anti-CD3 cross-linking alone. Furthermore, an anti-fas monoclonal antibody (
A prominent and reproducible apoptosis in this strain was demonstrated using a solubilized form of IgM mAb (500 ng / ml). Negative controls for this assay are medium or buffer alone. Another anti-CD3 mA
Crosslinking with B (OKT3) was shown to have no effect.
【0403】 細胞周期分析により効果が観察される場合、その細胞をさらに、フローサイト
メトリーのためのTUNELアッセイのために染色するか、または当業者に周知
のアネキシンV技術により染色する。If effects are observed by cell cycle analysis, the cells are further stained for a TUNEL assay for flow cytometry or by Annexin V technology well known to those skilled in the art.
【0404】 (実施例8:CD3に誘導される増殖アッセイ) CD3に誘導される増殖アッセイを、PBMCに対して実施し、そして3H− チミジンの取り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実施する。9
6ウェルプレートを、100μl/ウェルのCD3に対するmAb(HIT3a
、Pharmingen)またはアイソタイプ適合コントロールmAb(BB3
3.1)を用いて、4℃で、一晩コーティングし(0.05M炭酸水素緩衝液、
pH9.5中、1μg/ml)、次いで、PBSで3回洗浄する。PBMCは、
F/H勾配遠心分離により、ヒト末梢血から単離し、そして変動する濃度のAI
M IIタンパク質の存在下で(総容量200μl)、10%FCSおよびP/
S含有RPMI中の、mAbでコーティングしたプレートの4連のウェル(5×
104/ウェル)に添加する。関連タンパク質の緩衝液単独および培地単独は、 コントロールである。37℃で、48時間培養後、プレートを2分間、1000
rpmでスピンし、そして増殖に対する効果が観察される場合、100μlの上
清を取りだし、IL−2(または他のサイトカイン)の測定のために−20℃で
保存する。ウェルを、0.5μCiの3H−チミジンを含有する100μlの培 地で補充し、そして37℃で、18〜24時間培養する。ウェルを収集し、そし
て3H−チミジンの取り込みを増殖の測定値として使用する。抗CD3単独は、 増殖についてのポジティブコントロールである。IL−2(100U/ml)は
また、増殖を増強するコントロールとして使用される。T細胞の増殖を誘導しな
いコントロール抗体を、CD3に誘導される増殖に対するネガティブコントロー
ルとして使用し、培地または緩衝液を、AIM IIタンパク質の効果について
のネガティブコントロールとして使用する。Example 8: CD3-Induced Proliferation Assay A CD3-induced proliferation assay is performed on PBMC and measured by 3 H-thymidine incorporation. This assay is performed as follows. 9
A 6-well plate was prepared with 100 μl / well of mAb against CD3 (HIT3a
Pharmingen) or isotype matched control mAb (BB3
3.1) with 4 ° C. overnight (0.05M bicarbonate buffer,
Wash at pH 9.5, 1 μg / ml), then 3 times with PBS. PBMC is
Isolated from human peripheral blood by F / H gradient centrifugation and varying concentrations of AI
In the presence of MII protein (200 μl total volume), 10% FCS and P /
Quadruplicate wells (5 ×) of mAb-coated plates in S-containing RPMI
10 4 / well). Buffer alone of the relevant protein and medium alone are controls. After culturing at 37 ° C. for 48 hours, the plate was incubated at 1000 ° C. for 2 minutes.
Spin at rpm and if an effect on growth is observed, remove 100 μl of supernatant and store at −20 ° C. for IL-2 (or other cytokine) measurement. The wells are supplemented with 100 μl of medium containing 0.5 μCi of 3 H-thymidine and incubated at 37 ° C. for 18-24 hours. Wells are collected and 3 H-thymidine incorporation is used as a measure of proliferation. Anti-CD3 alone is a positive control for proliferation. IL-2 (100 U / ml) is also used as a control to enhance proliferation. A control antibody that does not induce T cell proliferation is used as a negative control for CD3-induced proliferation, and media or buffer is used as a negative control for the effect of AIM II protein.
【0405】 (実施例9:MHCクラスIIの発現に対するAIM IIの効果、単球由来
ヒト樹状細胞の同時刺激性分子および接着分子ならびに細胞分化) 樹状細胞を、末梢血中に見出される増殖前駆体の増大により生成する:接着P
BMCまたは溶出した単球画分を、GM−CSF(50ng/ml)およびIL
−4(20ng/ml)を併って、7〜10日間培養する。これらの樹状細胞は
、未成熟細胞の特有の表現型(CD1、CD80、CD86、CD40およびM
HCクラスII抗原の発現)を有する。活性因子(例えば、TNF−α)の処理
は、表面の表現型に急速な変化(MHCクラスIおよびII、同時刺激性分子お
よび接着分子の発現の増加、FcγRIIの下方調節、CD83の上方調節)を
生じる。これらの変化は、抗原提示能力の増加および樹状細胞の機能的成熟と相
関する。Example 9: Effect of AIM II on MHC class II expression, costimulatory and adhesion molecules of monocyte-derived human dendritic cells and cell differentiation Dendritic cells are found in peripheral blood Produced by increasing precursor: Adhesion P
BMC or eluted monocyte fractions were purified using GM-CSF (50 ng / ml) and IL
-4 (20 ng / ml) for 7 to 10 days. These dendritic cells have the unique phenotype of immature cells (CD1, CD80, CD86, CD40 and M
HC class II antigen expression). Treatment of activators (eg, TNF-α) causes rapid changes in surface phenotype (MHC class I and II, increased expression of costimulatory and adhesion molecules, downregulation of FcγRII, upregulation of CD83) Is generated. These changes correlate with increased antigen presenting capacity and functional maturation of dendritic cells.
【0406】 表面抗原のFACS分析を以下のように実施する。細胞を、種々の濃度のAI
M−II(0.1、1、10、100、1000ng/ml)またはポジティブ
コントロールとしてLPSで、1〜3日処理し、1%BSAおよび0.02mM
アジ化ナトリウムを含有するPBSで洗浄し、次いで、1:20希釈の適切なF
ITCまたはPE標識したモノクローナル抗体と共に、4℃で30分間インキュ
ベートする。さらなる洗浄後、標識細胞を、FACScan(Becton D
ickinson)上のフローサイトメトリーにより分析する。FACS analysis of surface antigens is performed as follows. Cells can be treated with various concentrations of AI
Treatment with M-II (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) or LPS as a positive control for 1-3 days, 1% BSA and 0.02 mM
Wash with PBS containing sodium azide, then dilute 1:20 with the appropriate F
Incubate with ITC or PE labeled monoclonal antibody for 30 minutes at 4 ° C. After further washing, the labeled cells were washed with FACScan (Becton D).
(Ickinson).
【0407】 (サイトカイン産生に対する効果) 樹状細胞により生成されたサイトカイン、特にIL−12は、T細胞依存性免
疫応答の惹起に重要である。IL−12は、Th1ヘルパーT細胞免疫応答の発
生に強く影響し、そして細胞傷害性T細胞およびNK細胞機能を誘導する。EL
ISAを使用して、以下のようにIL−12放出を測定する。樹状細胞(106 /ml)を、AIM−II(0.1、1、10、100、1000ng/ml)
で、24時間処理する。LPS(100ng/ml)をポジティブコントロール
として細胞培養物に添加する。次いで、細胞培養物からの上清を収集し、そして
市販のELISAキットを使用してIL−12含量について分析する。キットと
共に提供される標準的なプロトコールを使用する。(Effects on Cytokine Production) Cytokines generated by dendritic cells, particularly IL-12, are important in eliciting a T cell-dependent immune response. IL-12 strongly influences the development of a Th1 helper T cell immune response and induces cytotoxic T cells and NK cell function. EL
ISA is used to measure IL-12 release as follows. Dendritic cells (10 6 / ml) were converted to AIM-II (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml).
For 24 hours. LPS (100 ng / ml) is added to the cell culture as a positive control. The supernatant from the cell culture is then collected and analyzed for IL-12 content using a commercially available ELISA kit. Use the standard protocol provided with the kit.
【0408】 (MHCクラスII同時刺激性分子および接着分子の発現の効果) 細胞表面抗原の3つの主要なファミリーが、単球上で同定され得る:接着分子
、抗原提示に関与する分子、およびFcレセプター。MHCクラスII抗原およ
び他の同時刺激性分子(例えば、B7およびICAM−1)の発現の調節は、単
球の抗原提示能力およびT細胞活性化を誘導する能力における変化を生じ得る。
Fcレセプターの発現増加は、単球の細胞傷害活性、サイトカインの放出、およ
び食作用の改善に相関し得る。Effects of MHC Class II Co-Stimulatory and Adhesion Molecule Expression Three major families of cell surface antigens can be identified on monocytes: adhesion molecules, molecules involved in antigen presentation, and Fc Receptor. Modulation of the expression of MHC class II antigens and other costimulatory molecules (eg, B7 and ICAM-1) can result in changes in the ability of monocytes to present antigen and induce T cell activation.
Increased Fc receptor expression may correlate with improved monocyte cytotoxic activity, cytokine release, and phagocytosis.
【0409】 FACS分析を使用して、以下のように表面抗原を試験する。単球を、種々の
濃度のAIM−II(0.1、1、10、100、1000ng/ml)または
LPS(ポジティブコントロール)で1〜5日間処理し、1%BSAおよび0.
02mMアジ化ナトリウムを含有するPBSで洗浄し、次いで、1:20希釈の
適切なFITCまたはPE標識したモノクローナル抗体と共に、4℃で30分間
インキュベートする。さらなる洗浄後、標識細胞を、FACScan(Bect
on Dickinson)上のフローサイトメトリーにより分析する。Use FACS analysis to test for surface antigens as follows. Monocytes were treated with various concentrations of AIM-II (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) or LPS (positive control) for 1-5 days, with 1% BSA and 0.
Wash with PBS containing 02 mM sodium azide, then incubate with the appropriate FITC or PE labeled monoclonal antibody at a 1:20 dilution for 30 minutes at 4 ° C. After a further wash, the labeled cells were washed with FACScan (Bect
on Dickinson).
【0410】 (単球生存に対する効果) ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激物の非存在下で培養させた場合、次第
に生存率を減少する。これらの死は、内部的に調節されたプロセス(アポトーシ
ス)から生じる。活性化因子(例えば、TNF−α)の培養物への添加は、細胞
生存を劇的に改善し、そしてDNA断片化を防止する。ヨウ化プロピジウム染色
を使用して、以下のようにアポトーシスを測定する。単球(107/ml)を、 TNF−α(100ng/ml、ポジティブコントロール)またはAIM−II
(0.1、1、10、100、1000ng/ml)の存在下または非存在下で
2日間、DMEMにおけるポリプロピレンチューブ中の懸濁液で培養する。細胞
の生存率を、ヨウ化プロピジウム(PI)染色により評価する。細胞を、最終濃
度5μg/mlでPIを含有するPBS中で、2×106/mlの濃度に懸濁し 、次いで、FACScan分析前に5分間室温でインキュベートする。PIの取
り込みは、DNA断片化と相関することが、この実験系列において実証された。Effect on Monocyte Survival Human peripheral blood monocytes gradually decrease viability when cultured in the absence of serum or other stimuli. These deaths result from internally regulated processes (apoptosis). Addition of an activator (eg, TNF-α) to the culture dramatically improves cell survival and prevents DNA fragmentation. Apoptosis is measured using propidium iodide staining as follows. Monocytes (10 7 / ml) were transferred to TNF-α (100 ng / ml, positive control) or AIM-II.
(0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) for 2 days in suspension in polypropylene tubes in DMEM. Cell viability is assessed by propidium iodide (PI) staining. Cells are suspended at a concentration of 2 × 10 6 / ml in PBS containing PI at a final concentration of 5 μg / ml and then incubated for 5 minutes at room temperature before FACScan analysis. PI uptake was demonstrated in this series of experiments to correlate with DNA fragmentation.
【0411】 (サイトカイン放出に対する効果) 単球/マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を介する
、免疫系の他の細胞集団に対する、これらの調節活性である。IL−1β放出を
測定するためのELISAを、以下のように実施する。ヒト単球を、48ウェル
プレートに106/mlで添加し、そして100ng/mlのLPSの存在下ま たは非存在下で、種々の濃度のAIM−IIを添加する(0.1、1、10、1
00、1000ng/ml)。24時間のインキュベーション後、上清を収集し
、そしてELISAキットによりサイトカインの存在をアッセイする。キットと
共に提供される標準的なプロトコルを使用する。Effect on Cytokine Release An important function of monocytes / macrophages is their regulatory activity on other cell populations of the immune system through the release of cytokines after stimulation. An ELISA for measuring IL-1β release is performed as follows. Human monocytes are added to a 48-well plate at 10 6 / ml, and various concentrations of AIM-II in the presence or absence of 100 ng / ml LPS (0.1, 1). , 10, 1
00, 1000 ng / ml). After a 24-hour incubation, the supernatant is collected and assayed for the presence of cytokines by an ELISA kit. Use the standard protocol provided with the kit.
【0412】 (実施例10:N末端配列分析のための可溶性AIM IIのアフィニティー
精製) 先のデータにより、リンホトキシンβレセプター(LTβR)−Fc融合タン
パク質で誘導されたBIAcoreチップは、AIM II(アミノ酸74〜2
40)−Flag融合タンパク質に特異的に結合し得ることが示された(実施例
5、第E節および図7Aを参照のこと)。次いで、いずれの細胞株をN−末端配
列分析のためのさらなる精製に使用するべきかを決定するために、LTβR B
IAcoreチップを使用して、非Flagタグ化AIM IIの安定なトラン
スフェクト体の馴化培地から可溶性のAIM IIタンパク質の発現を検出した
。Example 10 Affinity Purification of Soluble AIM II for N-Terminal Sequence Analysis According to the previous data, the BIAcore chip induced with the lymphotoxin β receptor (LTβR) -Fc fusion protein shows that AIM II (amino acids 74 ~ 2
40) -Flag fusion protein was shown to be able to specifically bind (see Example 5, Section E and FIG. 7A). Then, to determine which cell lines should be used for further purification for N-terminal sequence analysis, LTβRB
Using an IAcore chip, the expression of soluble AIM II protein was detected from conditioned media of non-Flag-tagged AIM II stable transfectants.
【0413】 CHO細胞を、ck−β8シグナルペプチドに融合させたAIM IIの細胞
外領域(アミノ酸60〜240)からなる発現構築物(pC4ベクター)でトラ
ンスフェクトした。クローンを、メトトレキサートを含有する培地中での増殖に
よる高い発現について選択した。LTβR BIAcoreチップに最も多く結
合するクローンをさらに、増幅した。CHO11(高レベルのAIM IIを産
生するクローン)由来の馴化培地(20mL)を得た。完全長のcDNAをコー
ドする第二のAIM II構築物を、マウスMCA−38癌細胞内にトランスフ
ェクトし、そしてG418での選択に供した。馴化培地を、これらのトランスフ
ェクトさせたMCA−38細胞から得た。[0413] CHO cells were transfected with an expression construct (pC4 vector) consisting of the extracellular region of AIM II (amino acids 60-240) fused to the ck-β8 signal peptide. Clones were selected for high expression by growth in media containing methotrexate. Clones that bound the most to the LTβR BIAcore chip were further amplified. Conditioned medium (20 mL) from CHO11 (clone producing high levels of AIM II) was obtained. A second AIM II construct encoding full-length cDNA was transfected into mouse MCA-38 cancer cells and subjected to selection on G418. Conditioned media was obtained from these transfected MCA-38 cells.
【0414】 安定なトランスフェクト体である、CHO11細胞またはMCA−38細胞由
来の馴化培地を、濾過し、10,000×gで遠心分離し、次いで、MCIF−
Fcアフィニティーカラム(コントロールカラム)通過させ、続いてLTβR−
Fcアフィニティーカラム(0.2ml床容量)を通過させた。カラムを数床カ
ラム容量の0.005%界面活性剤P−20含有HEPES緩衝化生理食塩水で
洗浄した。結合したタンパク質を10mM HClで溶出し(3×0.5mL画
分)、そして直ちにTRIS緩衝液で中和した。LTβRカラムから溶出された
画分は、LTβR BIAcoreチップに結合したままであったが、コントロ
ールのMCIF−Fcカラムから溶出された画分は、結合に対して陰性であった
。溶出された画分を、Spedvac中で乾燥し、次いで20μLの水に再懸濁
した。溶出されたタンパク質のアリコートを、還元性SDS−PAGEゲルによ
り分析し、そして銀染色により検出した。CHO−11細胞株およびMCA−3
8細胞株由来のLTβRカラムに特異的に結合した、約25kDaおよび約21
kDaのバンドを検出した。N末端配列分析のために、残存する溶出物質を、S
DS−PAGEに供し、そしてPVDF膜上にブロットした。[0414] Conditioned medium from stable transfectants, CHO11 cells or MCA-38 cells, was filtered, centrifuged at 10,000 xg, and then MCIF-
After passing through an Fc affinity column (control column), the LTβR-
Passed through an Fc affinity column (0.2 ml bed volume). The column was washed with several column volumes of HEPES-buffered saline containing 0.005% surfactant P-20. Bound proteins were eluted with 10 mM HCl (3 × 0.5 mL fractions) and immediately neutralized with TRIS buffer. The fraction eluted from the LTβR column remained bound to the LTβR BIAcore chip, while the fraction eluted from the control MCIF-Fc column was negative for binding. The eluted fraction was dried in a Speedvac and then resuspended in 20 μL of water. Aliquots of the eluted protein were analyzed by reducing SDS-PAGE gels and detected by silver staining. CHO-11 cell line and MCA-3
About 25 kDa and about 21 kDa specifically bound to LTβR columns from 8 cell lines.
A kDa band was detected. For N-terminal sequence analysis, the remaining eluted material was
It was subjected to DS-PAGE and blotted on a PVDF membrane.
【0415】 MCA−38細胞から精製されたAIM II分子のN末端は、この分子の推
定細胞外領域内の残基83で開始する(表3)。CHO−11由来のAIM I
Iの結果により、このタンパク質がAIM IIタンパク質と対応することもま
た確認された;このN末端は、3残基離れて開始する2つの配列を含み、これら
は残基60で開始するAIM IIの細胞外領域が続くck−β8シグナルペプ
チド内で開始する(表3)。従って、AIM IIの天然のプロセシング形態は
、残基83〜240に対応し、そして17.284ダルトンの分子量を有するは
ずである。約21kDaの見かけの電気泳動移動度は、糖化と一致し、これは、
いくつかの電気泳動種の存在により明らかである。同様に、CHO−11で発現
されたck−β8/AIM II融合タンパク質の約25kDaの見かけの分子
量は、その配列から推定される分子量(20,361)より大きい。再度、この
ことはまた、タンパク質の糖化に起因し得る(全長AIM IIの残基104に
1つのN−グリコシル化部位が存在する)。The N-terminus of the AIM II molecule purified from MCA-38 cells starts at residue 83 in the putative extracellular region of the molecule (Table 3). AIM I from CHO-11
The results of I also confirmed that this protein corresponded to the AIM II protein; its N-terminus contained two sequences that started 3 residues apart, which are those of AIM II starting at residue 60. The extracellular region starts in the ck-β8 signal peptide followed by (Table 3). Thus, the native processed form of AIM II corresponds to residues 83-240 and should have a molecular weight of 17.284 daltons. The apparent electrophoretic mobility of about 21 kDa is consistent with saccharification,
This is evident by the presence of some electrophoretic species. Similarly, the apparent molecular weight of about 25 kDa of the ck-β8 / AIM II fusion protein expressed in CHO-11 is greater than the molecular weight deduced from its sequence (20,361). Again, this may also be due to glycation of the protein (there is one N-glycosylation site at residue 104 of full length AIM II).
【0416】[0416]
【表3】 MCA−38 AIM II馴化培地の、BIAcoreチップ上で固定化さ
れたLTβR−Fcに対する結合特異性対MCIF−Fcに対する結合特異性の
Sensorgramを、図12に示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプ
ターFc融合タンパク質で誘導された、BIAcore装置フローセル上で分析
した。馴化培地(100μl)を、5μL/分でチップ全体に流動し、そしてH
BS緩衝液でまた5μL/分で洗浄した。その示されるデータは、固定化された
レセプターに対するAIM IIの結合後のプロットの正味の結合(オフレイト
(off−rate))領域を示し、そして、相対的質量単位(RU)対時間で
測定した。結合条件は、拡散限界条件下で高レセプターチップ密度で実施した。
リガンド:LTβR−FcおよびMCIF−Fcとは、それぞれ、LTβR−F
cまたはMCIF−Fcで固定化されたBIAcoreチップ表面からの結合デ
ータをいう。[Table 3] The Sensorgram of the binding specificity of MCA-38 AIM II conditioned medium for LTβR-Fc immobilized on a BIAcore chip versus the binding specificity for MCIF-Fc is shown in FIG. Conditioned media was analyzed on a BIAcore instrument flow cell, induced with a lymphotoxin β receptor Fc fusion protein. Conditioned medium (100 μl) was flowed through the chip at 5 μL / min and H
Washed again with BS buffer at 5 μL / min. The data shown shows the net binding (off-rate) area of the plot following binding of AIM II to the immobilized receptor and was measured in relative mass units (RU) versus time. Binding conditions were performed at high receptor chip density under diffusion-limited conditions.
Ligand: LTβR-Fc and MCIF-Fc are respectively LTβR-F
c or binding data from the surface of the BIAcore chip immobilized with MCIF-Fc.
【0417】 LTβR−Fcカラムから溶出されたAIM IIによるLTβR結合の決定
を図13に示す。LTβRおよびMCIFは、それぞれ、LTβR−Fcまたは
MCIF−Fcを固定化したBIAcoreチップ表面からの結合データをいう
。MCA38細胞由来の未希釈の馴化培地を、MCIF−Fc(MCIF後)お
よびLTβR−Fc(LTβR後)アフィニティーカラムを通過させる、前(プ
レ)および後で分析した。LTβR(E4〜6)およびMCIF−Fc(E1〜
3)アフィニティーカラムから溶出された画分(1mL)を、3倍希釈し、そし
てLTβR BIAcoreチップに対する結合について試験した。The determination of LTβR binding by AIM II eluted from the LTβR-Fc column is shown in FIG. LTβR and MCIF refer to binding data from the surface of a BIAcore chip on which LTβR-Fc or MCIF-Fc is immobilized, respectively. Undiluted conditioned media from MCA38 cells was analyzed before, after (pre) and after passing through MCIF-Fc (after MCIF) and LTβR-Fc (after LTβR) affinity columns. LTβR (E4-6) and MCIF-Fc (E1-
3) Fractions (1 mL) eluted from the affinity column were diluted 3-fold and tested for binding to LTβR BIAcore chips.
【0418】 (実施例11:ラットにおけるアジュバント誘導された関節炎の処置における
AIMIIの効果) 慢性関節リウマチ(RA)を処置するためのAIM IIの使用の分析を、ラ
ットにおけるアジュバント誘導された関節炎(AIA)モデルの使用を通して実
施する。AIAは、十分に特徴付けられ、そして再現性のある慢性関節リウマチ
の動物モデルであり、これは、当業者に周知である(Pearson、Ann.
Rheum.Dis.15:379(1956);Pearsonら、Arth
ritis Rheum.2:440(1959))。AIM IIは、このR
Aの動物モデルにおいて観察される骨および軟骨のパンヌスの浸潤を維持するた
めに必要とされる、脈管形成の増加または内皮細胞増殖の増加を阻害することが
予期される。LewisラットおよびBBラット(Charles River
Lab,Raleigh.N.C.およびthe University o
f Massachusetts Medical Center.Worce
ster,MAから入手可能)を、これらの実験において、アジュバント誘導関
節炎についての一般株および応答性の株として使用する。Example 11: Effect of AIMII in the treatment of adjuvant-induced arthritis in rats Analysis of the use of AIM II to treat rheumatoid arthritis (RA) was performed using adjuvant-induced arthritis (AIA) in rats. ) Through the use of the model. AIA is a well-characterized and reproducible animal model of rheumatoid arthritis, which is well known to those skilled in the art (Pearson, Ann.
Rheum. Dis. 15: 379 (1956); Pearson et al., Arth.
ritis Rheum. 2: 440 (1959)). AIM II uses this R
It is expected to inhibit the increased angiogenesis or increased endothelial cell proliferation required to maintain bone and cartilage pannus invasion observed in animal models of A. Lewis and BB rats (Charles River
Lab, Raleigh. N. C. And the University o
f Massachusetts Medical Center. Worce
(available from S.T., MA) is used in these experiments as a general and responsive strain for adjuvant-induced arthritis.
【0419】 関節炎状態の惹起を、尾の基部内へ0.1mlのアジュバント(5mg/ml
)の皮内注射により誘導する。5〜6のラットの群に、0.1〜1.0mg/k
gのAIM IIまたはビヒクルのいずれかを、アジュバント注射の20日後に
関節内接種する。この時点で、急性の炎症が最大レベルに達し、そして慢性のパ
ンヌス形成が開始する。パンヌス形成に対するAIM IIの効果を、基本的に
Taurogおよび共同研究者(J.Exp.Med.162:962(198
5))に記載のように、以下のアジュバントチャレンジの15日後、各週1度放
射線学的に分析する。要するに、ラットをエーテルまたは抱水クローラルで麻酔
し、そして両方の後肢を共にX線放射するように位置した。X線フィルムを、骨
膜反応、骨侵食、関節空間の狭小化および破壊についての0〜3のスコアリング
系を使用して、盲目的に試験する。ビヒクルで処理したラットにおいて有意な量
の関節の損傷が存在する場合、この動物を屠殺する。この時点で、組織損傷の相
対度およびこれらの関節に対して誘発されたAIM IIの治療効果について、
その足を組織学的に評価した。The induction of the arthritic state was achieved by injecting 0.1 ml of adjuvant (5 mg / ml) into the base of the tail.
) Is induced by intradermal injection. In groups of 5-6 rats, 0.1-1.0 mg / k
g of either AIM II or vehicle is intra-articularly inoculated 20 days after adjuvant injection. At this point, acute inflammation has reached a maximum level and chronic pannus formation begins. The effect of AIM II on pannus formation was essentially determined by Taurog and coworkers (J. Exp. Med. 162: 962 (198).
As described in 5)), radiological analysis is performed once a week, 15 days after the following adjuvant challenge. Briefly, rats were anesthetized with ether or chloral hydrate and both hind limbs were positioned to emit X-rays together. X-ray films are blindly tested using a 0-3 scoring system for periosteal response, bone erosion, joint space narrowing and destruction. If there is a significant amount of joint damage in rats treated with vehicle, the animals are sacrificed. At this point, regarding the relative degree of tissue damage and the therapeutic effect of AIM II induced on these joints,
The paws were evaluated histologically.
【0420】 最終的に、AIM IIおよびビヒクルで処理した動物を、1週間に2度臨床
的評価に供し、プレチスモメーター系および体重を使用して、後足の容量を評価
する。Finally, animals treated with AIM II and vehicle are subjected to clinical evaluation twice weekly to assess hindpaw volume using a plethysmometer system and body weight.
【0421】 (実施例12:マウスにおけるコラーゲン誘導された関節炎の処置におけるA
IM IIの効果) 慢性関節リウマチ(RA)を処置するためのAIM IIの使用の分析を、マ
ウスにおけるコラーゲン誘導された自己免疫性関節炎(CIA)モデルの使用を
通して実施し得る。CIAは、十分に特徴付けられ、そして再現性のある別の慢
性関節リウマチの動物モデルであり、これは、当業者に周知である(Court
enayら、Nature 283:666(1980);Wooleyら、J
.Exp.Med.154:688(1981);Holmdahlら、Imm
unol.Reviews 118:193(1990))。AIM IIは、
アポトーシスを誘導し、そして慢性関節リウマチおよびこのRAの自己免疫性動
物モデルの両方おいて観察される骨および軟骨のパンヌスの浸潤を形成するため
に必要とされる、滑膜の細胞増殖を阻害することが予期される。Example 12: A in the treatment of collagen-induced arthritis in mice
Effect of IM II) Analysis of the use of AIM II to treat rheumatoid arthritis (RA) can be performed through the use of a collagen-induced autoimmune arthritis (CIA) model in mice. CIA is another well-characterized and reproducible animal model of rheumatoid arthritis, which is well known to those skilled in the art (Court
Enay et al., Nature 283: 666 (1980); Wooley et al., J.
. Exp. Med. 154: 688 (1981); Holmdahl et al., Imm.
unol. Reviews 118: 193 (1990)). AIM II
Induces apoptosis and inhibits synovial cell proliferation required to form bone and cartilage pannus infiltrates observed in both rheumatoid arthritis and this autoimmune animal model of RA Is expected.
【0422】 DBA/1 LacJマウス(Jackson Lab(Bar Harbo
r,ME)から入手可能)を、これらの実験において、コラーゲン誘導関節炎に
ついての最も一般的な感受性株として使用する。DBA / 1 LacJ mice (Jackson Lab (Bar Harbo
r, ME) is used as the most common susceptible strain for collagen-induced arthritis in these experiments.
【0423】 関節炎状態の惹起を、尾の基部内へフロイント完全アジュバント中の1mg/
mlのウシII型コラーゲン0.1mlの皮内注射により誘導する。3週後、そ
の動物に40μgのLPSを注射して、関節炎の発生を促進する。10のマウス
の群に、0.1〜1.0mg/kgのAIM IIまたはビヒクルのいずれかを
、LPSの注射の7〜15日後に、皮内または関節内接種する。この時点で、急
性の炎症が最大レベルに達すると予期され、そして慢性のパンヌス形成が開始す
る。AIM IIの関節炎に対する効果をモニターして、そして以下のスコアを
使用して臨床的に分析した:0=正常、0.5=指の腫大、1=足全体の腫大、
2=変形および3=強直。ビヒクルで処理したラットの足において有意な量の強
直が生じると決定される場合、この動物を屠殺し、そしてパンヌス形成、軟骨お
よび骨破壊の相対度について、ならびにどのような効果をAIM IIが、これ
らの関節に対して誘発したかについて、その足を組織学的に評価した。The induction of the arthritic condition was determined by adding 1 mg / in Freund's complete adjuvant into the base of the tail.
Induced by intradermal injection of 0.1 ml of bovine type II collagen in 0.1 ml. Three weeks later, the animals are injected with 40 μg of LPS to promote the development of arthritis. Groups of 10 mice are inoculated intradermally or intra-articularly 7-15 days after LPS injection with either 0.1-1.0 mg / kg of AIM II or vehicle. At this point, acute inflammation is expected to reach maximal levels and chronic pannus formation begins. The effect of AIM II on arthritis was monitored and analyzed clinically using the following scores: 0 = normal, 0.5 = swelling of the finger, 1 = swelling of the entire paw,
2 = deformed and 3 = tonic. If it is determined that a significant amount of tonicity occurs in the paws of rats treated with vehicle, the animals are sacrificed and AIM II determines the relative degree of pannus formation, cartilage and bone destruction, and what effect The paws were evaluated histologically for induction on these joints.
【0424】 本発明は、先の説明および実施例において特定に記載される以外にも実施され
得ることが明らかである。It is clear that the present invention can be practiced other than as specifically described in the foregoing description and examples.
【0425】 本発明の多くの改変および変更は,上記の教示に照らして可能であり、従って
これらは、添付の特許請求の範囲内である。Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings and, therefore, are within the scope of the appended claims.
【0426】 本明細書中で引用される全ての刊行物(特許、特許出願、学術雑誌、実験マニ
ュアル、書籍、または他の文書を含む)の全体の開示は、本明細書に参考として
援用される。The entire disclosure of all publications (including patents, patent applications, journals, experimental manuals, books, or other documents) cited herein is hereby incorporated by reference. You.
【表4】 [Table 4]
【表5】 [Table 5]
【配列表】 [Sequence list]
【図1A】 図1AおよびBは、AIM IIのヌクレオチド(配列番号1)および推定ア
ミノ酸(配列番号2)の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約26.4
kDaを有する。AIM IIタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.
【図1B】 図1AおよびBは、AIM IIのヌクレオチド(配列番号1)および推定ア
ミノ酸(配列番号2)の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約26.4
kDaを有する。AIM IIタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and 1B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.
【図1C】 図1CおよびDは、同様に得られた部分AIM II cDNAのヌクレオチ
ド(配列番号38)および推定アミノ酸(配列番号39)の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequence of a partially obtained AIM II cDNA, respectively.
【図1D】 図1CおよびDは、同様に得られた部分AIM II cDNAのヌクレオチ
ド(配列番号38)および推定アミノ酸(配列番号39)の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequences of a similarly obtained partial AIM II cDNA.
【図2A】 図2A、BおよびCは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列
番号3)、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)
、ならびにヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を
示す。FIGS. 2A, B and C show the AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5).
And similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2B】 図2A、BおよびCは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列
番号3)、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)
、ならびにヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を
示す。FIGS. 2A, B and C show the AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5).
And similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2C】 図2A、BおよびCは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列
番号3)、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)
、ならびにヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を
示す。FIGS. 2A, B and C show the AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5).
And similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図3A】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。FIGS. 3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3B】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3C】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3D】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3E】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3F】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図4A】 図4AおよびBは、MDA−MB−231ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するAIM IIの効果を示す。5,000 MDA−MB−231/WT(丸
)、MDA−MB−231/Neo(三角)またはMDA−MB−231/AI
MII(四角)細胞を、24ウェルプレートにIMEMとともに10%FBS(
黒丸、黒四角、または黒三角)または1%FBS(白丸、白四角、または白三角
)のいずれかの存在下で、3連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、3日目、5日目、または7日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を2日おきに補給した。図4Bは、0.33%アガロースにお
けるMDA−MB−231/WT細胞、MDA−MB−231/Neo細胞、お
よびMDA−MB−231/AIM II細胞のコロニー形成を示す。4A and 4B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.
【図4B】 図4AおよびBは、MDA−MB−231ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するAIM IIの効果を示す。5,000 MDA−MB−231/WT(丸
)、MDA−MB−231/Neo(三角)またはMDA−MB−231/AI
MII(四角)細胞を、24ウェルプレートにIMEMとともに10%FBS(
黒丸、黒四角、または黒三角)または1%FBS(白丸、白四角、または白三角
)のいずれかの存在下で、3連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、3日目、5日目、または7日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を2日おきに補給した。図4Bは、0.33%アガロースにお
けるMDA−MB−231/WT細胞、MDA−MB−231/Neo細胞、お
よびMDA−MB−231/AIM II細胞のコロニー形成を示す。FIGS. 4A and B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.
【図5A】 図5(A)は、実施例5の材料および方法に記載されるAnnexin−V
FACS分析での、MDA−MB−231/WT(パネルa)細胞またはMDA
−MB−231/Neo(パネルb)細胞のアポトーシス細胞と比較した、0.
5%血清におけるMDA−MB−231/AIM II(パネルc)におけるア
ポトーシス細胞の増加を示す。FIG. 5 (A) shows the Annexin-V described in the materials and methods of Example 5.
MDA-MB-231 / WT (panel a) cells or MDA by FACS analysis
-0.2-MB-231 / Neo (panel b) cells compared to apoptotic cells.
Figure 4 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (panel c) in 5% serum.
【図5B】 図5(B)は、実施例5の材料および方法に記載されるように、Paclit
axel(タキソール)を含むかまたは含まない、10%および0.5%の血清
における、MDA−MB−231/WT細胞、MDA−MB−231/Neo細
胞およびMDA−MB−231/AIM II細胞のDNAフラグメント化アッ
セイを示す。FIG. 5B shows Paclit as described in the materials and methods of Example 5.
of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo and MDA-MB-231 / AIM II cells in 10% and 0.5% serum with or without axel (Taxol) 3 shows a DNA fragmentation assay.
【図6A】 図6(A)は、ヌードマウスにおける異種移植片ヒト乳癌MDA−231の増
殖に対するAIM IIの効果の評価を示す。雌胸腺欠損ヌードマウスに、皮下
注射で、親MDA−23 1(MDA−23 1−WT)またはAIM IIで
安定にトランスフェクトしたMDA−23 1あるいはベクターコントロールn
eo(n=10)の106細胞を注入した。次いで、マウスに耳標を付け、そし て無作為化した。腫瘍増殖を、盲検様式でカリパーで週に2回評価した。このパ
ネルは、1グループあたり各々10匹のマウスを有する3つの実験を示す。FIG. 6 (A) shows the evaluation of the effect of AIM II on the growth of xenograft human breast cancer MDA-231 in nude mice. Female athymic nude mice were injected subcutaneously by injection with parental MDA-231 (MDA-231-WT) or AIM II stably transfected MDA-231 or vector control n.
10 6 cells of eo (n = 10) were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice weekly with calipers in a blinded fashion. This panel shows three experiments, each with 10 mice per group.
【図6B】 図6(B)は、同系のC57BL/6マウスにおけるMC−38マウス結腸癌
の増殖の阻害に対するAIM II形質導入の効果を示す。雌C57BL/6マ
ウスに、皮下注射により親MC−38(MC−38−WT)またはAIM II
で安定にトランスフェクトしたMC−38、あるいはベクターコントロールne
o(n=10)の106細胞を注射した。次いで、マウスに耳標を付けそして無 作為化した。腫瘍増殖を、コード化した盲検様式でカリパーで週に2回評価した
。このパネルは、1グループあたり各々10匹のマウスを有する4つの実験を表
す。FIG. 6 (B) shows the effect of AIM II transduction on inhibiting the growth of MC-38 mouse colon cancer in syngeneic C57BL / 6 mice. Female C57BL / 6 mice were injected subcutaneously with parental MC-38 (MC-38-WT) or AIM II.
MC-38 stably transfected with
o (n = 10) of 10 6 cells were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice a week with calipers in an encoded blinded fashion. This panel represents four experiments, each with 10 mice per group.
【図7A】 図7(A)は、pFlag−AIM IIプラスミド構築物およびpFlag
−AIM II形質導入された293T細胞の馴化培地から精製されたポリペプ
チドを示す。FIG. 7 (A) shows the pFlag-AIM II plasmid construct and pFlag.
-Polypeptide purified from conditioned medium of AIM II transduced 293T cells.
【図7B】 図7(B)。IFNγの存在下または非存在下での(パネルa)またはIFN
γ単独での(パネルb)、MDA−MB−231細胞における組換え可溶性形態
のAIM II(sAIMII)の細胞傷害性。実験は、実施例5の材料および
方法に記載されるように行われた。FIG. 7 (B). (Panel a) or IFN in the presence or absence of IFNγ
Cytotoxicity of recombinant soluble form of AIM II (sAIMII) in MDA-MB-231 cells with gamma alone (panel b). The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.
【図8A】 図8(A)。LTβR(A〜D)またはTR2(E〜H)mAbを使用したF
ACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB−231
(AおよびE)、HT−29(BおよびF)、MC−3(CおよびG)、U93
T(DおよびH)。FIG. 8 (A). F using LTβR (AD) or TR2 (EH) mAb
Cell surface expression of LTβR or TR2 by ACS analysis. MDA-MB-231
(A and E), HT-29 (B and F), MC-3 (C and G), U93
T (D and H).
【図8B】 図8(B)。MDA−MB−231細胞における、可溶性AIM IIタンパ
ク質単独のFACS結合分析(A)、および可溶性AIM IIタンパク質結合
のLTβR−Fc融合タンパク質(B)またはTR2−Fc融合タンパク質(C
)でのプレインキュベーションによるブロッキング。FIG. 8B. FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (A) and LTβR-Fc fusion protein (B) or TR2-Fc fusion protein (C
Blocking by pre-incubation at).
【図8C】 図8(C)。種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面発現を要約す
る。FIG. 8 (C). Summary of LTβR and TR2 surface expression in various cell lines.
【図8D】 図8(D)。LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質の、HT−2
9細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする効果。細胞を
96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10ng/ml)を
5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白丸はLTβR
−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR2−Fc融合
タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−FcとsLTγおよ
びIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、そして細胞の
生存度をXTTアッセイによって決定した。FIG. 8D. HT-2 of an LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein
Effect of blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in 9 cells. Cells are plated in 96-well plates and sAIM II (10 ng / ml) is treated with various amounts of sLTβR-Fc (open circles LTLTR) in the presence of 5 U / ml IFNγ.
-Fc alone, closed circles are LTβR-Fc and IFNγ), or TR2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Cells were incubated for 5 days and cell viability was determined by XTT assay.
【図9】 図9は、sAIM II処理ヒトPBL細胞によるIFN−γの分泌を示す。
ヒトPBL(96ウェルプレートにおいてウェルあたり5×105細胞)を、抗 CD3 mAbおよびIL−2(20U/ml)ありまたはなしでsAIM I
Iの存在下または非存在下で5日間処理した。次いで、上清を以下の細胞の群か
ら収集した:sAIMIIの存在下(黒丸)または非存在下(白丸)のPBL、
あるいはsAIMIIあり(黒三角)またはなし(白三角)での休止PBL。ヒ
トIFNγ濃度を、ELISAによって決定した。FIG. 9 shows secretion of IFN-γ by sAIM II-treated human PBL cells.
Human PBLs (5 × 10 5 cells per well in a 96-well plate) were treated with sAIM I with or without anti-CD3 mAb and IL-2 (20 U / ml).
Treated in the presence or absence of I for 5 days. Supernatants were then collected from the following groups of cells: PBL in the presence (closed circle) or absence (open circle) of sAIMII,
Or resting PBL with sAIMII (black triangle) or without (open triangle). Human IFNγ concentration was determined by ELISA.
【図10】 図10は、pHE4〜5発現ベクター(配列番号50)およびサブクローン化
AIMII cDNAコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺
伝子の位置、AIMIIコード配列、oriC配列、およびlacIqコード配
列が示されている。FIG. 10 shows a schematic diagram of the pHE4-5 expression vector (SEQ ID NO: 50) and the subcloned AIMII cDNA coding sequence. The location of the kanamycin resistance marker gene, AIMII coding sequence, oriC sequence, and lacIq coding sequence are indicated.
【図11】 図11は、pHEプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列(配列番
号51)を示す。2つのlacオペレーター配列、Shine−Delgarn
o配列(S/D)、ならびに末端HindIIIおよびNdeI制限部位(イタ
リック)を示す。FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the regulatory element of the pHE promoter (SEQ ID NO: 51). Two lac operator sequences, Shine-Delgarn
o Sequence (S / D) and terminal HindIII and NdeI restriction sites (italics).
【図12】 図12は、MCA−38 AIM II馴化培地の、BIAcoreチップ上
に固定化したLTβR−Fc対MCIF−FCへの結合の特異性のセンサーグラ ムを示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプターFc融合タンパク質で誘導
体化したBIAcore装置フローセル上で分析した。馴化培地(100μL)
を、5μL/分でチップ上に流し、そして同様に5μL/分でHBS緩衝液で洗
浄した。示されたデータは、AIMIIの固定化レセプターへの結合後のプロッ
トの正味の結合した(オフレート)領域を表し、そして相対質量単位(RU)対
時間で測定されている。結合条件を、拡散限定条件下で高レセプターチップ密度
で行った。説明:LTβR−FcおよびMCIF−Fcは、それぞれ、LTβR
−FcまたはMCIF−Fc固定化BIAcoreチップ表面からの結合データ
を参照する。Figure 12 shows the MCA-38 of AIM II conditioned medium, the sensor gram-binding specificity to LTßR-Fc vs. MCIF-F C immobilized on the BIAcore chip. Conditioned media was analyzed on a BIAcore instrument flow cell derivatized with a lymphotoxin β receptor Fc fusion protein. Conditioned medium (100 μL)
Was run over the chip at 5 μL / min and was also washed with HBS buffer at 5 μL / min. The data shown represent the net bound (off-rate) area of the plot following binding of AIMII to the immobilized receptor and is measured in relative mass units (RU) versus time. Binding conditions were performed at high receptor chip density under diffusion limited conditions. Description: LTβR-Fc and MCIF-Fc, respectively, are LTβR
-Reference binding data from Fc or MCIF-Fc immobilized BIAcore chip surface.
【図13】 図13は、LTβR−Fcカラムから溶出されたAIM IIによるLTβR
結合の決定を示す。結合条件は、図11に記載するとおりであった。説明:LT
βRおよびMCIFは、それぞれLTβR−FcまたはMCIF−Fc固定化B
IAcoreチップ表面からの結合データを参照する。MCA38細胞由来の希
釈していない馴化培地を、MCIF−Fc(MCIF後)およびLTβR−Fc
(LTβR後)アフィニティーカラムを通過する前(プレ)および後に分析した
。LTβR(E4〜6)およびMCIF−Fc(E1〜3)アフィニティーカラ
ムから溶出した画分(1mL)を、3倍に希釈し、そしてLTβR BIAco
reチップへの結合を試験した。FIG. 13 shows LTβR by AIM II eluted from LTβR-Fc column.
4 shows the determination of binding. The binding conditions were as described in FIG. Description: LT
βR and MCIF were LTβR-Fc or MCIF-Fc immobilized B, respectively.
Reference the binding data from the IAcore chip surface. Undiluted conditioned medium from MCA38 cells was purified using MCIF-Fc (after MCIF) and LTβR-Fc.
Analyzed before (pre) and after passing through the affinity column (after LTβR). The fraction (1 mL) eluted from the LTβR (E4-6) and MCIF-Fc (E1-3) affinity columns was diluted 3-fold, and LTβR BIAco
The binding to the rechip was tested.
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成11年9月17日(1999.9.17)[Submission date] September 17, 1999 (September 17, 1999)
【手続補正1】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0013[Correction target item name] 0013
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0013】 (発明の要旨) 本発明は、図1Aおよび図1B(配列番号2)に示されるアミノ酸配列、また
は1996年8月22日にATCC寄託番号97689として寄託されたcDN
Aクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するAIM IIポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明は
また、図1Cおよび図1D(配列番号39)に示されるアミノ酸配列、または1
996年3月15日にATCC寄託番号97483として寄託されたcDNAク
ローンによりコードされるアミノ酸配列を有するAIM IIポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1A and FIG. 1B (SEQ ID NO: 2), or the cDN deposited on August 22, 1996 as ATCC accession number 97689.
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence encoded by the A clone. The present invention also relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1C and FIG.
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having an amino acid sequence encoded by a cDNA clone deposited on March 15, 996, ATCC Deposit No. 97483.
【手続補正2】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0025[Correction target item name] 0025
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0025】 (詳細な説明) 本発明は、クローン化cDNAの配列決定によって決定した図1AおよびBに
示されるアミノ酸配列(配列番号2)を有するAIM IIポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のAIM
IIタンパク質は、ヒトTNF−α(配列番号3)、ヒトTNF−β(配列番
号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、およびヒトFasリガンド(配列
番号6)との配列相同性を共有する(図2A〜F)。図1AおよびBに示される
ヌクレオチド配列(配列番号1)は、cDNAクローンを配列決定することによ
って得られ、これは、1996年8月22日に、アメリカンタイプカルチャーコ
レクション、10801、University Blvd.Manassas
,VA 20110−2209、USAに寄託され、そして受託番号97689
を与えられた。寄託されたクローンは、pBluescript SK(−)プ
ラスミド(Stratagene、La Jolla、CA)に含まれている。
図1CおよびDに示されるヌクレオチド配列を、cDNAクローンを配列決定す
ることによって得た。これは、1996年3月15日に、アメリカンタイプカル
チャーコレクション、10801、University Blvd.Mana
ssas,VA 20110−2209、USAに寄託され、そして受託番号9
7483を与えられた。DETAILED DESCRIPTION The present invention provides an isolation comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) as determined by sequencing of the cloned cDNA. Provided nucleic acid molecules. AIM of the present invention
The II protein shares sequence homology with human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and human Fas ligand (SEQ ID NO: 6). (FIGS. 2A-F). The nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was obtained by sequencing a cDNA clone, which was published on August 22, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Manassas
, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 97689.
Was given. The deposited clone is contained in the pBluescript SK (-) plasmid (Stratagene, La Jolla, CA).
The nucleotide sequences shown in FIGS. 1C and D were obtained by sequencing cDNA clones. This is on March 15, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Mana
sass, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 9
7483 was given.
【手続補正3】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0027[Correction target item name] 0027
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0027】 本明細書中に提供される情報を(例えば、図1AおよびBのヌクレオチド配
列)使用して、AIM IIポリぺプチドをコードする本発明の核酸分子は、標
準的なクローニング手順およびスクリーニング手順(例えば、開始材料としてm
RNAを使用するcDNAクローニング手順)を使用して得られ得る。本発明の
例証として、図1AおよびB(配列番号1)に記載される核酸分子は、ヒトマク
ロファージox LDL(HMCCB64)に由来するcDNAライブラリーに
おいて発見された。この遺伝子はまた、活性化されたT細胞(HT4CC72)
に由来するcDNAライブラリーおいても同定された。図1AおよびBのAIM
II cDNAの決定されたヌクレオチド配列(配列番号1)は、240アミ
ノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。この
タンパク質は、図1AおよびBのヌクレオチド配列の49〜51位の開始コドン
(配列番号1)、図1AおよびBの約60〜約240のアミノ酸残基を含む細胞
外ドメイン(配列番号2)、図1AおよびBの約37〜約59のアミノ酸残基を
含む膜貫通ドメイン(配列番号2)、図1AおよびBの約1〜約36のアミノ酸
残基を含む細胞内ドメイン(配列番号2)を有し、そして推定分子質量は約26
.4kDaである。図1AおよびBに示されるAIM IIタンパク質(配列番
号2)は、ヒトFasリガンドのアミノ酸配列に約27%同一および51%類似
であり(図2A〜F)、そしてヒトTNF−αのアミノ酸配列に約26%同一お
よび約47%類似である(図2A〜F)。AIM IIが、TNFリガンド様分
子に相同であるならば、TNFリガンド様分子は、二量体として機能する。この
分子は、ホモ二量体としても機能するようである。Using the information provided herein (eg, the nucleotide sequences of FIGS. 1A and B), a nucleic acid molecule of the invention encoding an AIM II polypeptide can be constructed using standard cloning procedures and screening. Procedure (eg, m as starting material)
CDNA cloning procedure using RNA). As an illustration of the present invention, the nucleic acid molecule set forth in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was found in a cDNA library derived from human macrophage ox LDL (HMCCB64). This gene also contains activated T cells (HT4CC72)
Was also identified in a cDNA library derived from E. coli. AIM of FIGS. 1A and B
The determined nucleotide sequence of the II cDNA (SEQ ID NO: 1) contains an open reading frame encoding a protein of 240 amino acid residues. This protein comprises an initiation codon at positions 49-51 of the nucleotide sequence of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1), an extracellular domain comprising from about 60 to about 240 amino acid residues of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), The transmembrane domain containing about 37 to about 59 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) and the intracellular domain containing about 1 to about 36 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) And has an estimated molecular mass of about 26
. 4 kDa. The AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) is approximately 27% identical and 51% similar to the amino acid sequence of human Fas ligand (FIGS. 2A-F), and is similar to the amino acid sequence of human TNF-α. About 26% identical and about 47% similar (FIGS. 2A-F). If AIM II is homologous to a TNF ligand-like molecule, the TNF ligand-like molecule functions as a dimer. This molecule also appears to function as a homodimer.
【手続補正4】[Procedure amendment 4]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0364[Correction target item name] 0364
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0364】 (C.AIM II発現細胞における増強されたアポトーシス) アネキシン−V FACS分析を、AIM II発現細胞の増殖阻害の潜在的
な機構を調査するために行った。10%血清の存在下では、3つの細胞株全てに
おいて、2%未満のアポトーシス細胞が存在する。減少した血清(0.5%FB
S)における48時間のインキュベーション後、MDA−MB−231細胞のア
ポトーシス集団は、3倍(8%まで)の増加を示した。親細胞またはベクターコ
ントロールMDA−MB−231細胞においては、アポトーシスのわずかな増加
があるか、または増加がない(図5A〜C)。アポトーシスの誘導は、Pacl
itaxel(taxol)を用いるかまたは用いない、10%および0.5%
血清中のMDA−MB231/WT細胞、MDA−MB231/Neo細胞、お
よびMDA−MB231/AIMII細胞のDNAフラグメント化アッセイによ
って、さらに確認された。フラグメント化したDNAは、AIM II発現MD
A−MB−231細胞において、特に1%血清においてのみ見られた。AIM
II発現細胞を、Paclitaxel(taxol)で処理した場合、親細胞
またはベクターコントロール細胞において見られたよりも、ずっとより多くのフ
ラグメント化DNAが観察された。従って、このデータは、AIM II発現が
、血清飢餓下、あるいはIFNγまたはタキソールの添加で、MDA−MB−2
31細胞のアポトーシスの引き金となり得ることを示唆する。C. Enhanced Apoptosis in AIM II Expressing Cells Annexin-V FACS analysis was performed to investigate the potential mechanism of growth inhibition of AIM II expressing cells. In the presence of 10% serum, less than 2% apoptotic cells are present in all three cell lines. Reduced serum (0.5% FB
After 48 hours incubation in S), the apoptotic population of MDA-MB-231 cells showed a 3-fold (up to 8%) increase. There is a slight or no increase in apoptosis in parental cells or vector control MDA-MB-231 cells (FIGS. 5A-C). Apoptosis is induced by Pacl
10% and 0.5% with or without itaxel (taxol)
This was further confirmed by DNA fragmentation assays of MDA-MB231 / WT, MDA-MB231 / Neo, and MDA-MB231 / AIMII cells in serum. The fragmented DNA was used for AIM II-expressed MD.
It was found only in A-MB-231 cells, especially in 1% serum. AIM
When II expressing cells were treated with Paclitaxel (taxol), much more fragmented DNA was observed than was seen in parental or vector control cells. Thus, this data shows that AIM II expression was not elevated under serum starvation, or with the addition of IFNγ or taxol, to MDA-MB-2.
This suggests that it may trigger apoptosis of 31 cells.
【手続補正5】[Procedure amendment 5]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0368[Correction target item name] 0368
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0368】 (E.可溶性AIM IIタンパク質の発現および細胞傷害性) AIM IIタンパク質の活性を研究するために、AIM IIタンパク質の
組換え可溶性形態(sAIM II)を構築物pFlag−AIM IIで29
3T細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。この構築物は
、AIM IIの細胞外ドメインをコードするが、AIM IIの膜貫通部分を
欠失している(図7A)。単一の20kDaポリペプチド(sAIM II)を
pFlag−AIM IIを形質導入した293T細胞の馴化培地から抗Fla
gモノクローナル抗体で精製し得る。乳癌MDA−MB−231細胞の増殖は、
用量依存性様式でこの可溶性AIM IIタンパク質の処理に応答して阻害され
た(図7B〜C)。INFγの添加(10μ/mlまたは50μ/ml)は、可
溶性AIM IIタンパク質の細胞傷害性を劇的に高めた。IFNγ単独では、
MDA−MB−231細胞に対してほとんど活性を示さなかった(図7B〜C)
。これは、MDA−MB−231細胞がTNFまたはIFNγ処理のような単一
のサイトカインに耐性であるという先の報告と一致する。E. Expression and Cytotoxicity of Soluble AIM II Protein To study the activity of AIM II protein, a recombinant soluble form of AIM II protein (sAIM II) was prepared using construct pFlag-AIM II with 29
3T cells were generated by transient transfection. This construct encodes the extracellular domain of AIM II, but lacks the transmembrane portion of AIM II (FIG. 7A). A single 20 kDa polypeptide (sAIM II) was isolated from conditioned medium of 293T cells transduced with pFlag-AIM II by anti-Fla.
g monoclonal antibody. The growth of breast cancer MDA-MB-231 cells is
It was inhibited in response to treatment of this soluble AIM II protein in a dose-dependent manner (FIGS. 7B-C). Addition of INFγ (10 μ / ml or 50 μ / ml) dramatically increased the cytotoxicity of soluble AIM II protein. IFNγ alone,
Little activity on MDA-MB-231 cells (FIGS. 7B-C)
. This is consistent with previous reports that MDA-MB-231 cells are resistant to a single cytokine, such as TNF or IFNγ treatment.
【手続補正6】[Procedure amendment 6]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0371[Correction target item name] 0371
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0371】 LTβRおよびTR2の一連のヒト癌細胞における細胞表面発現を、LTβR
またはTR2に対するモノクローナル抗体を使用して、FACS分析によって調
べた。図8A〜Hに示されるように、両方のレセプターが高レベルであることが
MDA−MB−231およびHT−29細胞で見いだされたが、その一方でMC
3−1細胞はTR2を発現せず、そしてジャーカット細胞は、LTβRを発現し
ない。図8Lに、試験した全ての細胞株における両方のレセプターの表面発現を
まとめる。レセプターの一方のみを発現する細胞株(例えば、ジャーカットまた
はMC3−1)は、AIM IIの細胞傷害性に対して耐性である。まとめると
、これらのデータは、腫瘍細胞におけるAIM II媒介増殖阻害がLTβRお
よびTR2レセプターの両方を必要とし得るが、その一方で、レセプターのうち
の一方のみを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを
示唆する。The cell surface expression of LTβR and TR2 on a series of human cancer cells was
Or by FACS analysis using a monoclonal antibody against TR2. As shown in FIGS. 8A-H, high levels of both receptors were found in MDA-MB-231 and HT-29 cells, while MC
3-1 cells do not express TR2, and Jurkat cells do not express LTβR. FIG. 8L summarizes the surface expression of both receptors in all cell lines tested. Cell lines expressing only one of the receptors (eg, Jurkat or MC3-1) are resistant to AIM II cytotoxicity. Taken together, these data indicate that AIM II-mediated growth inhibition in tumor cells may require both LTβR and TR2 receptors, while cells expressing only one of the receptors mediate cell killing Suggest that it is not enough.
【手続補正7】[Procedure amendment 7]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0372[Correction target item name] 0372
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0372】 AIM IIがLTβRおよびTR2レセプター両方についての適切なリガン
ドであり、ならびにAIM II媒介腫瘍細胞増殖阻害における両方のレセプタ
ーに重要であることをさらに実証するために、Flagタグ化AIM IIタン
パク質を、MDA−MB−231またはHT−29細胞とともにインキュベート
し、次いで、FACS分析を、抗FlagmAbを用いて行った。図8I〜Kに
示されるように、MDA−MB−231またはHT−29細胞の、Flagタグ
化可溶性AIM IIタンパク質との結合は正にシフトする。結合の特異性を、
同じ細胞中で可溶性AIM II−flagタンパク質とのLTβR−Fc融合
タンパク質またはTR2−Fc融合タンパク質(これは、両方のレセプターの結
合を効果的にブロックした)のプレインキュベーションによってさらに確認した
(図8I〜K)。To further demonstrate that AIM II is a suitable ligand for both the LTβR and TR2 receptors, and that it is important for both receptors in AIM II-mediated tumor cell growth inhibition, Flag-tagged AIM II protein was , MDA-MB-231 or HT-29 cells, and then FACS analysis was performed with anti-FlagmAb. As shown in FIGS. 81-K, binding of MDA-MB-231 or HT-29 cells to Flag-tagged soluble AIM II protein is positively shifted. The specificity of the binding
Further confirmation was obtained by preincubation of the LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion protein with the soluble AIM II-flag protein in the same cells, which effectively blocked the binding of both receptors (FIG. 8I-). K).
【手続補正8】[Procedure amendment 8]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0373[Correction target item name] 0373
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0373】 腫瘍細胞に対するAIM II媒介細胞傷害性におけるLTβRおよびTR2
の両方の改善の重要性は、インビトロ増殖アッセイから得られたデータによって
さらに支持された:HT−29のsAIM II媒介細胞傷害性は、用量依存性
様式でLTβR−Fc融合タンパク質またはTR2−Fc融合タンパク質の添加
によって無効にされたが、一方で、LTβR−Fc融合タンパク質またはTR2
−Fc融合タンパク質それ自体は、細胞増殖に対して全く効果を示さなかった(
図8M)。さらに、同様のアッセイにおいて、sAIM IIはTNFRの他の
メンバー(例えば、TNFRI、Fas、DR3またはDR14)に結合し得な
かった。LTβR and TR2 in AIM II-mediated cytotoxicity against tumor cells
The importance of both improvements was further supported by the data obtained from the in vitro proliferation assay: sAIM II-mediated cytotoxicity of HT-29 was demonstrated in a dose-dependent manner by LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion. The LTβR-Fc fusion protein or TR2
The -Fc fusion protein itself had no effect on cell proliferation (
(FIG. 8M). Furthermore, in a similar assay, sAIM II failed to bind to other members of TNFR (eg, TNFRI, Fas, DR3 or DR14).
【手続補正9】[Procedure amendment 9]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】0374[Correction target item name] 0374
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【0374】 さらに、いくつかのリンパ系細胞株およびPBLを可溶性AIM IIタンパ
ク質に対するこれらの応答性についてスクリーニングした。AIM IIの細胞
傷害性は、ジャーカット(Jurkat)細胞(静止またはCD3 mAb活性
化のいずれか)、K562細胞、またはTIL1200(腫瘍浸潤リンパ球)、
PBMC(新鮮またはIL−2/CD3 mAb活性化)においてみられなかっ
た(図8L)。対照的に、PBLのsAIM IIでの処理は、IFNγの放出
によって実証されるように、TR2発現T細胞の活性化を生じる(図9)。In addition, several lymphoid cell lines and PBLs were screened for their responsiveness to soluble AIM II protein. The cytotoxicity of AIM II can be measured in Jurkat cells (either resting or CD3 mAb activated), K562 cells, or TIL1200 (tumor infiltrating lymphocytes),
It was not found in PBMC (fresh or IL-2 / CD3 mAb activation) (FIG. 8L). In contrast, treatment of PBL with sAIM II results in activation of TR2-expressing T cells, as demonstrated by the release of IFNγ (FIG. 9).
【手続補正10】[Procedure amendment 10]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図面の簡単な説明[Correction target item name] Brief description of drawings
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図1A】 図1AおよびBは、AIM IIのヌクレオチド(配列番号1)および推定ア
ミノ酸(配列番号2)の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約26.4
kDaを有する。AIM IIタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.
【図1B】 図1AおよびBは、AIM IIのヌクレオチド(配列番号1)および推定ア
ミノ酸(配列番号2)の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約26.4
kDaを有する。AIM IIタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and 1B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.
【図1C】 図1CおよびDは、同様に得られた部分AIM II cDNAのヌクレオチ
ド(配列番号38)および推定アミノ酸(配列番号39)の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequence of a partially obtained AIM II cDNA, respectively.
【図1D】 図1CおよびDは、同様に得られた部分AIM II cDNAのヌクレオチ
ド(配列番号38)および推定アミノ酸(配列番号39)の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequences of a similarly obtained partial AIM II cDNA.
【図2A】 図2A〜Fは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列番号3)
、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、ならび
にヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2B】 図2A〜Fは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列番号3)
、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、ならび
にヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2C】 図2A〜Fは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列番号3)
、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、ならび
にヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2D】 図2A〜Fは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列番号3)
、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、ならび
にヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2E】 図2A〜Fは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列番号3)
、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、ならび
にヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図2F】 図2A〜Fは、AIM IIタンパク質およびヒトTNF−α(配列番号3)
、ヒトTNF−β(配列番号4)、ヒトリンホトキシン(配列番号5)、ならび
にヒトFasリガンド(配列番号6)のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).
【図3A】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。FIGS. 3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3B】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3C】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3D】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3E】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図3F】 図3A〜Fは、AIM IIアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Jameson−Wolf」グ
ラフにおいて、図1AおよびB(配列番号2)の約アミノ酸残基13〜20、2
3〜36、69〜79、85〜94、167〜178、184〜196、221
〜233は、AIM IIタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.
【図4A】 図4AおよびBは、MDA−MB−231ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するAIM IIの効果を示す。5,000 MDA−MB−231/WT(丸
)、MDA−MB−231/Neo(三角)またはMDA−MB−231/AI
MII(四角)細胞を、24ウェルプレートにIMEMとともに10%FBS(
黒丸、黒四角、または黒三角)または1%FBS(白丸、白四角、または白三角
)のいずれかの存在下で、3連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、3日目、5日目、または7日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を2日おきに補給した。図4Bは、0.33%アガロースにお
けるMDA−MB−231/WT細胞、MDA−MB−231/Neo細胞、お
よびMDA−MB−231/AIM II細胞のコロニー形成を示す。4A and 4B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.
【図4B】 図4AおよびBは、MDA−MB−231ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するAIM IIの効果を示す。5,000 MDA−MB−231/WT(丸
)、MDA−MB−231/Neo(三角)またはMDA−MB−231/AI
MII(四角)細胞を、24ウェルプレートにIMEMとともに10%FBS(
黒丸、黒四角、または黒三角)または1%FBS(白丸、白四角、または白三角
)のいずれかの存在下で、3連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、3日目、5日目、または7日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を2日おきに補給した。図4Bは、0.33%アガロースにお
けるMDA−MB−231/WT細胞、MDA−MB−231/Neo細胞、お
よびMDA−MB−231/AIM II細胞のコロニー形成を示す。FIGS. 4A and B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.
【図5A】 図5A〜Cは、実施例5の材料および方法に記載されるAnnexin−V
FACS分析での、MDA−MB−231/WT(図5A)細胞またはMDA−
MB−231/Neo(図5B)細胞のアポトーシス細胞と比較した、0.5%
血清におけるMDA−MB−231/AIM II(図5C)におけるアポトー
シス細胞の増加を示す。5A-C show Annexin-V described in the materials and methods of Example 5. FIG.
MDA-MB-231 / WT (FIG. 5A) cells or MDA-
0.5% of MB-231 / Neo (FIG. 5B) cells compared to apoptotic cells
Figure 5 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (Figure 5C) in serum.
【図5B】 図5A〜Cは、実施例5の材料および方法に記載されるAnnexin−V
FACS分析での、MDA−MB−231/WT(図5A)細胞またはMDA−
MB−231/Neo(図5B)細胞のアポトーシス細胞と比較した、0.5%
血清におけるMDA−MB−231/AIM II(図5C)におけるアポトー
シス細胞の増加を示す。5A-C show Annexin-V described in Example 5 Materials and Methods.
MDA-MB-231 / WT (FIG. 5A) cells or MDA-
0.5% of MB-231 / Neo (FIG. 5B) cells compared to apoptotic cells
Figure 5 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (Figure 5C) in serum.
【図5C】 図5A〜Cは、実施例5の材料および方法に記載されるAnnexin−V
FACS分析での、MDA−MB−231/WT(図5A)細胞またはMDA−
MB−231/Neo(図5B)細胞のアポトーシス細胞と比較した、0.5%
血清におけるMDA−MB−231/AIM II(図5C)におけるアポトー
シス細胞の増加を示す。5A-C show Annexin-V described in Example 5 Materials and Methods.
MDA-MB-231 / WT (FIG. 5A) cells or MDA-
0.5% of MB-231 / Neo (FIG. 5B) cells compared to apoptotic cells
Figure 5 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (Figure 5C) in serum.
【図6A】 図6(A)は、ヌードマウスにおける異種移植片ヒト乳癌MDA−231の増
殖に対するAIM IIの効果の評価を示す。雌胸腺欠損ヌードマウスに、皮下
注射で、親MDA−23 1(MDA−23 1−WT)またはAIM IIで
安定にトランスフェクトしたMDA−23 1あるいはベクターコントロールn
eo(n=10)の106細胞を注入した。次いで、マウスに耳標を付け、そし て無作為化した。腫瘍増殖を、盲検様式でカリパーで週に2回評価した。このパ
ネルは、1グループあたり各々10匹のマウスを有する3つの実験を示す。FIG. 6 (A) shows the evaluation of the effect of AIM II on the growth of xenograft human breast cancer MDA-231 in nude mice. Female athymic nude mice were injected subcutaneously by injection with parental MDA-231 (MDA-231-WT) or AIM II stably transfected MDA-231 or vector control n.
10 6 cells of eo (n = 10) were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice weekly with calipers in a blinded fashion. This panel shows three experiments, each with 10 mice per group.
【図6B】 図6(B)は、同系のC57BL/6マウスにおけるMC−38マウス結腸癌
の増殖の阻害に対するAIM II形質導入の効果を示す。雌C57BL/6マ
ウスに、皮下注射により親MC−38(MC−38−WT)またはAIM II
で安定にトランスフェクトしたMC−38、あるいはベクターコントロールne
o(n=10)の106細胞を注射した。次いで、マウスに耳標を付けそして無 作為化した。腫瘍増殖を、コード化した盲検様式でカリパーで週に2回評価した
。このパネルは、1グループあたり各々10匹のマウスを有する4つの実験を表
す。FIG. 6 (B) shows the effect of AIM II transduction on inhibiting the growth of MC-38 mouse colon cancer in syngeneic C57BL / 6 mice. Female C57BL / 6 mice were injected subcutaneously with parental MC-38 (MC-38-WT) or AIM II.
MC-38 stably transfected with
o (n = 10) of 10 6 cells were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice a week with calipers in an encoded blinded fashion. This panel represents four experiments, each with 10 mice per group.
【図7A】 図7は、pFlag−AIM IIプラスミド構築物を示す(図7A)。IF
Nγの存在下または非存在下での(図7B)またはIFNγ単独での(図7C)
、MDA−MB−231細胞における組換え可溶性形態のAIM II(sAI
MII)の細胞傷害性。実験は、実施例5の材料および方法に記載されるように
行われた。FIG. 7 shows the pFlag-AIM II plasmid construct (FIG. 7A). IF
With or without Nγ (FIG. 7B) or with IFNγ alone (FIG. 7C).
AIM II (sAI) in recombinant soluble form in MDA-MB-231 cells
MII) cytotoxicity. The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.
【図7B】 図7は、pFlag−AIM IIプラスミド構築物を示す(図7A)。IF
Nγの存在下または非存在下での(図7B)またはIFNγ単独での(図7C)
、MDA−MB−231細胞における組換え可溶性形態のAIM II(sAI
MII)の細胞傷害性。実験は、実施例5の材料および方法に記載されるように
行われた。FIG. 7 shows the pFlag-AIM II plasmid construct (FIG. 7A). IF
With or without Nγ (FIG. 7B) or with IFNγ alone (FIG. 7C).
AIM II (sAI) in recombinant soluble form in MDA-MB-231 cells
MII) cytotoxicity. The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.
【図7C】 図7は、pFlag−AIM IIプラスミド構築物を示す(図7A)。IF
Nγの存在下または非存在下での(図7B)またはIFNγ単独での(図7C)
、MDA−MB−231細胞における組換え可溶性形態のAIM II(sAI
MII)の細胞傷害性。実験は、実施例5の材料および方法に記載されるように
行われた。FIG. 7 shows the pFlag-AIM II plasmid construct (FIG. 7A). IF
With or without Nγ (FIG. 7B) or with IFNγ alone (FIG. 7C).
AIM II (sAI) in recombinant soluble form in MDA-MB-231 cells
MII) cytotoxicity. The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.
【図8A】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8B】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8C】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A-8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8D】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8E】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8F】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A to 8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8G】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A-8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8H】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A-M. FIG. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8I】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8J】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A to 8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8K】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A-8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8L】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A to 8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図8M】 図8A〜M。LTβR(図8A〜D)またはTR2(図8E〜H)mAbを使
用したFACS分析によるLTβRまたはTR2の細胞表面発現。MDA−MB
−231(図8AおよびE)、HT−29(図8BおよびF)、MC−3(図8
CおよびG)、U93T(図8DおよびH)。MDA−MB−231細胞におけ
る、可溶性AIM IIタンパク質単独のFACS結合分析(図8I)、および
可溶性AIM IIタンパク質結合のLTβR−Fc融合タンパク質(図8J)
またはTR2−Fc融合タンパク質(図8K)でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図8Lは、種々の細胞株におけるLTβRおよびTR2の表面
発現を要約する。(図8M)LTβR−FcまたはTR2−Fc融合タンパク質
の、HT−29細胞におけるsAIM II媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を96ウェルプレートにプレートし、そしてsAIM II(10n
g/ml)を5U/mlのIFNγの存在下で様々な量のsLTβR−Fc(白
丸はLTβR−Fc単独、黒丸はLTβR−FcおよびIFNγ)、またはTR
2−Fc融合タンパク質(白三角はTR−2Fc単独、黒三角はTR2−Fcと
sLTγおよびIFNγ)とともに添加した。細胞を5日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をXTTアッセイによって決定した。8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.
【図9】 図9は、sAIM II処理ヒトPBL細胞によるIFN−γの分泌を示す。
ヒトPBL(96ウェルプレートにおいてウェルあたり5×105細胞)を、抗 CD3 mAbおよびIL−2(20U/ml)ありまたはなしでsAIM I
Iの存在下または非存在下で5日間処理した。次いで、上清を以下の細胞の群か
ら収集した:sAIMIIの存在下(黒丸)または非存在下(白丸)のPBL、
あるいはsAIMIIあり(黒三角)またはなし(白三角)での休止PBL。ヒ
トIFNγ濃度を、ELISAによって決定した。FIG. 9 shows secretion of IFN-γ by sAIM II-treated human PBL cells.
Human PBLs (5 × 10 5 cells per well in a 96-well plate) were treated with sAIM I with or without anti-CD3 mAb and IL-2 (20 U / ml).
Treated in the presence or absence of I for 5 days. Supernatants were then collected from the following groups of cells: PBL in the presence (closed circle) or absence (open circle) of sAIMII,
Or resting PBL with sAIMII (black triangle) or without (open triangle). Human IFNγ concentration was determined by ELISA.
【図10】 図10は、pHE4〜5発現ベクター(配列番号50)およびサブクローン化
AIMII cDNAコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺
伝子の位置、AIMIIコード配列、oriC配列、およびlacIqコード配
列が示されている。FIG. 10 shows a schematic diagram of the pHE4-5 expression vector (SEQ ID NO: 50) and the subcloned AIMII cDNA coding sequence. The location of the kanamycin resistance marker gene, AIMII coding sequence, oriC sequence, and lacIq coding sequence are indicated.
【図11】 図11は、pHEプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列(配列番
号51)を示す。2つのlacオペレーター配列、Shine−Delgarn
o配列(S/D)、ならびに末端HindIIIおよびNdeI制限部位(イタ
リック)を示す。FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the regulatory element of the pHE promoter (SEQ ID NO: 51). Two lac operator sequences, Shine-Delgarn
o Sequence (S / D) and terminal HindIII and NdeI restriction sites (italics).
【図12】 図12は、MCA−38 AIM II馴化培地の、BIAcoreチップ上
に固定化したLTβR−Fc対MCIF−FCへの結合の特異性のセンサーグラ ムを示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプターFc融合タンパク質で誘導
体化したBIAcore装置フローセル上で分析した。馴化培地(100μL)
を、5μL/分でチップ上に流し、そして同様に5μL/分でHBS緩衝液で洗
浄した。示されたデータは、AIMIIの固定化レセプターへの結合後のプロッ
トの正味の結合した(オフレート)領域を表し、そして相対質量単位(RU)対
時間で測定されている。結合条件を、拡散限定条件下で高レセプターチップ密度
で行った。説明:LTβR−FcおよびMCIF−Fcは、それぞれ、LTβR
−FcまたはMCIF−Fc固定化BIAcoreチップ表面からの結合データ
を参照する。Figure 12 shows the MCA-38 of AIM II conditioned medium, the sensor gram-binding specificity to LTßR-Fc vs. MCIF-F C immobilized on the BIAcore chip. Conditioned media was analyzed on a BIAcore instrument flow cell derivatized with a lymphotoxin β receptor Fc fusion protein. Conditioned medium (100 μL)
Was run over the chip at 5 μL / min and was also washed with HBS buffer at 5 μL / min. The data shown represent the net bound (off-rate) area of the plot following binding of AIMII to the immobilized receptor and is measured in relative mass units (RU) versus time. Binding conditions were performed at high receptor chip density under diffusion limited conditions. Description: LTβR-Fc and MCIF-Fc, respectively, are LTβR
-Reference binding data from Fc or MCIF-Fc immobilized BIAcore chip surface.
【図13】 図13は、LTβR−Fcカラムから溶出されたAIM IIによるLTβR
結合の決定を示す。結合条件は、図11に記載するとおりであった。説明:LT
βRおよびMCIFは、それぞれLTβR−FcまたはMCIF−Fc固定化B
IAcoreチップ表面からの結合データを参照する。MCA38細胞由来の希
釈していない馴化培地を、MCIF−Fc(MCIF後)およびLTβR−Fc
(LTβR後)アフィニティーカラムを通過する前(プレ)および後に分析した
。LTβR(E4〜6)およびMCIF−Fc(E1〜3)アフィニティーカラ
ムから溶出した画分(1mL)を、3倍に希釈し、そしてLTβR BIAco
reチップへの結合を試験した。FIG. 13 shows LTβR by AIM II eluted from LTβR-Fc column.
4 shows the determination of binding. The binding conditions were as described in FIG. Description: LT
βR and MCIF were LTβR-Fc or MCIF-Fc immobilized B, respectively.
Reference the binding data from the IAcore chip surface. Undiluted conditioned medium from MCA38 cells was purified using MCIF-Fc (after MCIF) and LTβR-Fc.
Analyzed before (pre) and after passing through the affinity column (after LTβR). The fraction (1 mL) eluted from the LTβR (E4-6) and MCIF-Fc (E1-3) affinity columns was diluted 3-fold, and LTβR BIAco
The binding to the rechip was tested.
【手続補正11】[Procedure amendment 11]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All figures
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図1A】 FIG. 1A
【図1B】 FIG. 1B
【図1C】 FIG. 1C
【図1D】 FIG. 1D
【図2A】 FIG. 2A
【図2B】 FIG. 2B
【図2C】 FIG. 2C
【図2D】 FIG. 2D
【図2E】 FIG. 2E
【図2F】 FIG. 2F
【図3A】 FIG. 3A
【図3B】 FIG. 3B
【図3C】 FIG. 3C
【図3D】 FIG. 3D
【図3E】 FIG. 3E
【図3F】 FIG. 3F
【図4A】 FIG. 4A
【図4B】 FIG. 4B
【図5A】 FIG. 5A
【図5B】 FIG. 5B
【図5C】 FIG. 5C
【図6A】 FIG. 6A
【図6B】 FIG. 6B
【図7A】 FIG. 7A
【図7B】 FIG. 7B
【図7C】 FIG. 7C
【図8A】 FIG. 8A
【図8B】 FIG. 8B
【図8C】 FIG. 8C
【図8D】 FIG. 8D
【図8E】 FIG. 8E
【図8F】 FIG. 8F
【図8G】 FIG. 8G
【図8H】 FIG. 8H
【図8I】 FIG. 8I
【図8J】 FIG. 8J
【図8K】 FIG. 8K
【図8L】 FIG. 8L
【図8M】 FIG. 8M
【図9】 FIG. 9
【図10】 FIG. 10
【図11】 FIG. 11
【図12】 FIG.
【図13】 FIG. 13
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 37/00 C07K 16/28 C07K 14/705 C12Q 1/68 A 16/28 G01N 33/50 P C12Q 1/68 33/68 G01N 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/68 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM ,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE, KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,L T,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX ,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE, SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,U A,UG,US,UZ,VN,YU,ZW (71)出願人 9410 Key West Avenue, Rockville, Marylan d 20850, United State s of America (72)発明者 ユ, ガオ−リャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705, バークレー, グラバット ドライブ 242 (72)発明者 ルーベン, スティーブン エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20832, オルニー, ヘリテッジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ザン, ジュン アメリカ合衆国 メリーランド 20817, ベセスダ, クレストベリー プレイス 10100 (72)発明者 ウールリッチ, スティーブン アメリカ合衆国 メリーランド 20853, ロックビル, ラムズ ヘッド コート 4713 (72)発明者 ザイ, イーファン アメリカ合衆国 メリーランド 20879, ゲイサーズバーグ, ロイヤル ウッズ コート 10330──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 37/00 C07K 16/28 C07K 14/705 C12Q 1/68 A 16/28 G01N 33/50 PC12 / 68 33/68 G01N 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/68 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, A , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (71) Applicant 9410 Key West Avenue, Rockville, Maryland 20850, United States of America (72) Inventor Yu, Gao-Liang United States of America 94705, Berkeley, Gravatt Drive 242 (72) Inventor -Ben, Stephen M. United States Maryland 20832, Olney, Heritage Hills Drive 18528 (72) Inventor Zan, Jun United States Maryland 20817, Bethesda, Crestbury Place 10100 (72) Inventor Ulrich, Steven United States Maryland 20853, Rockville, Rams Head Court 4713 (72) Inventor Zai, Efan United States Maryland 20879, Gaithersburg, Royal Woods Court 10330
Claims (31)
チド配列、 (b)以下: 配列番号2における、 【化2】 からなる群から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列; (c)(a)または(b)のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオ
チド配列; からなる群から選択されるヌクレオチド配列に、少なくとも95%同一性である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子。1. An isolated nucleic acid molecule comprising: (a) the following: in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid selected from the group consisting of: (b) the following: in SEQ ID NO: 2, A nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid selected from the group consisting of: (c) a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences of (a) or (b); a nucleotide sequence selected from the group consisting of: An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical.
された核酸分子。5. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, fused to a heterologous polynucleotide.
る、請求項5に記載の単離された核酸分子。6. The isolated nucleic acid molecule of claim 5, wherein said heterologous polynucleotide encodes a heterologous polypeptide.
分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の単離
された核酸分子。7. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of the AIM II polypeptide of SEQ ID NO: 2.
る工程を包含する、ベクターを作製するための方法。8. A method for producing a vector, comprising a step of inserting the isolated nucleic acid molecule according to claim 1 into the vector.
含する、宿主細胞を作製する方法。10. A method for producing a host cell, comprising a step of introducing the vector according to claim 9 into the host cell.
、該方法が、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項9に記載の宿主
細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。12. A method for producing an AIM II polypeptide, said method comprising culturing the host cell of claim 9 under conditions such that said polypeptide is expressed. A method comprising recovering the polypeptide.
C末端欠失変異体であって、以下: (a)以下: 配列番号2における、 【化3】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド; (b)以下: 配列番号2における、 【化4】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド; (c)該N末端に(a)およびメチオニン残基のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド; (d)該N末端に(b)およびメチオニン残基のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド; (e)1つ以上のアミノ酸置換を除いて、(a)のアミノ酸配列を有する置換
変異体であって;ここで該変異体のアミノ酸配列が(a)の該アミノ酸配列に対
して少なくとも95%同一である、置換変異体;および (f)1つ以上のアミノ酸置換を除いて、(b)のアミノ酸配列を有する置換
変異体であって、;ここで該変異体のアミノ酸配列が(b)の該アミノ酸配列に
対して少なくとも95%同一である、置換変異体、 からなる群から選択されるポリペプチドからなる、欠失変異体。13. An isolated N-terminal or C-terminal deletion mutant of an AIM polypeptide, comprising: (a) the following: in SEQ ID NO: 2, A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: (b) the following: in SEQ ID NO: 2, A polypeptide having an amino acid sequence of (a) and a methionine residue at the N-terminus; and (d) a polypeptide having an amino acid sequence of a methionine residue at the N-terminus. (E) a substitution variant having the amino acid sequence of (a), except for one or more amino acid substitutions, wherein the amino acid sequence of the variant is the amino acid sequence of (a). A substitution variant that is at least 95% identical to the amino acid sequence; and (f) a substitution variant having the amino acid sequence of (b), except for one or more amino acid substitutions, wherein the variant A substitution variant, wherein the amino acid sequence of the derivative is at least 95% identical to the amino acid sequence of (b).
C末端欠失変異体が、Fc免疫グロブリンポリペプチドに融合される、請求項1
3に記載の単離されたポリペプチド。20. The N-terminal or C-terminal deletion mutant of the AIM-II polypeptide is fused to an Fc immunoglobulin polypeptide.
4. The isolated polypeptide of claim 3.
合される、請求項20に記載の単離されたポリペプチド。21. The isolated polypeptide of claim 20, wherein said Fc immunoglobulin is fused at the C-terminus of said deletion mutant.
る、請求項13に記載の単離されたポリペプチド。22. The isolated polypeptide of claim 13, which is produced in or contained in a host cell.
求項13に記載の単離されたポリペプチド。23. The isolated polypeptide of claim 13, wherein said host cell is an insect, mammal, or bacterium.
13に記載の単離されたポリペプチド。24. The isolated polypeptide of claim 13, with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
下の工程: (a)該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主
細胞に挿入する工程; (b)該宿主細胞を培養する工程;および (c)該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する方法によって生成される、単離されたポリペプチド。25. The isolated polypeptide according to claim 13, comprising: (a) inserting a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide into a host cell; (b) C) culturing the host cell; and (c) recovering the polypeptide.
: (a)前記ベクターが発現される条件下で、請求項25に記載の宿主細胞を培
養する工程;および (b)該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。26. A method for producing a polypeptide, comprising: (a) culturing the host cell according to claim 25 under conditions in which the vector is expressed; and (b) A) recovering the polypeptide.
結合する、単離された抗体。27. An isolated antibody that specifically binds to the AIM II polypeptide of claim 13.
: (a)慢性関節リウマチ; (b)変形性関節症; (c)アレルギー反応; (d)ウイルス感染; (e)グレーヴズ病; (f)自己免疫疾患;および (g)癌; からなる群から選択される方法であって、ここで、該方法が、以下: (a)配列番号2の約1〜約240のアミノ酸; (b)配列番号2の約2〜約240のアミノ酸; (c)ATCC受託番号97689中に含まれるcDNAクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列; (d)ATCC受託番号97483中に含まれるcDNAクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列; (e)前記AIM IIポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列; (f)前記AIM IIポリペプチドの膜貫通ドメインのアミノ酸配列; (g)前記AIM IIポリペプチドの細胞内ドメインのアミノ酸配列; (h)該細胞外ドメインおよび該細胞内ドメインの全てまたは一部分を有する
が、該膜貫通ドメインを欠く、可溶性AIM IIポリペプチドのアミノ酸配列
; (i)配列番号2のアミノ酸83〜240を含む、ポリペプチド;および (j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、
または(i)のいずれか1つのポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配
列、 からなる群から選択される治療的有効量のアポトーシス誘導分子II(AIM
II)ポリペプチドを該患者に投与する工程を包含する、方法。28. A method for the treatment of a disease state in a patient, comprising: (a) rheumatoid arthritis; (b) osteoarthritis; (c) allergic reaction; (d) viral infection; C) Graves'disease; (f) an autoimmune disease; and (g) cancer, wherein the method comprises: (a) about 1 to about 240 of SEQ ID NO: 2. (B) amino acids of about 2 to about 240 of SEQ ID NO: 2; (c) amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97689; (d) cDNA contained in ATCC Accession No. 97483 (E) amino acid sequence of the extracellular domain of the AIM II polypeptide; (f) transmembrane domain of the AIM II polypeptide (G) amino acid sequence of the intracellular domain of the AIM II polypeptide; (h) soluble AIM having all or a portion of the extracellular domain and the intracellular domain, but lacking the transmembrane domain (I) a polypeptide comprising amino acids 83-240 of SEQ ID NO: 2; and (j) (a), (b), (c), (d), (e), (f) ), (G), (h),
Or (i) an amino acid sequence of an epitope-bearing portion of any one of the polypeptides, or a therapeutically effective amount of an apoptosis-inducing molecule II (AIM) selected from the group consisting of:
II) A method comprising administering a polypeptide to the patient.
賦形剤を伴って投与される、請求項28に記載の方法。29. The method of claim 28, wherein said polypeptide is administered with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
I)ポリペプチドを結合する真核生物細胞を、該AIM IIポリペプチドを結
合しない真核生物細胞から分離するための方法であって、以下の工程: (a)該AIM IIポリペプチドを結合する細胞および該AIM IIポリ
ペプチドを結合しない細胞を含む真核生物細胞の混合集団を、該AIM IIポ
リペプチドと接触させる工程; (b)該AIM IIポリペプチドを結合する細胞を同定する工程;および (c)該AIM IIポリペプチドを結合する細胞を、該AIM IIポリペ
プチドを結合しない細胞から分離する工程、 を包含する、方法。30. The apoptosis-inducing molecule II (AIM I) according to claim 1.
I) A method for separating eukaryotic cells that bind a polypeptide from eukaryotic cells that do not bind the AIM II polypeptide, comprising the following steps: (a) binding the AIM II polypeptide Contacting a mixed population of eukaryotic cells, including cells and cells that do not bind the AIM II polypeptide, with the AIM II polypeptide; (b) identifying cells that bind the AIM II polypeptide; and (C) separating cells that bind the AIM II polypeptide from cells that do not bind the AIM II polypeptide.
AIM II遺伝子の過剰発現または過小発現に関連し、該方法は、以下の工程
: (a)該個体の生物学的サンプルにおけるAIM II遺伝子発現レベルを測
定する工程;および (b)該個体のAIM II遺伝子発現レベルを、標準のAIM II遺伝子
発現レベルと比較する工程; を包含する、方法であって、ここで、該標準を超えるAIM II遺伝子発現レ
ベルにおける増加または減少が、AIM II関連障害の指標である、方法。31. A method for the diagnosis of a disorder in an individual, wherein the disorder is associated with overexpression or underexpression of the AIM II gene, the method comprising: (a) biology of the individual Measuring the level of AIM II gene expression in the target sample; and (b) comparing the AIM II gene expression level of the individual to a standard AIM II gene expression level, wherein A method wherein an increase or decrease in AIM II gene expression levels above said standard is indicative of an AIM II-related disorder.
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