JP2002504333A - Apoptosis-inducing molecule II and method of use - Google Patents

Apoptosis-inducing molecule II and method of use

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦ−リガンドスーパーファミリーのメンバーに関する。より詳細には、ヒトアポトーシス誘導分子ＩＩ（ＡＩＭ ＩＩ）をコードする、単離された核酸分子が提供される。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドもまた提供され、ＡＩＭＩＩを産生するための、ベクター、宿主細胞および組換え方法も同様に提供される。さらに本発明は、ＡＩＭ ＩＩ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。リンパ節症、異常な骨発達、自己免疫疾患および他の免疫系疾患、移殖片対宿主疾患、慢性関節リウマチ、変形性関節症を処置するための治療方法、ならびに腫瘍細胞増殖のような新形成を阻害すための治療方法もまた提供される。   (57) [Summary] The present invention relates to members of the TNF-ligand superfamily. More particularly, provided is an isolated nucleic acid molecule encoding human apoptosis-inducing molecule II (AIM II). AIM II polypeptides are also provided, as are vectors, host cells and recombinant methods for producing AIMII. Further, the present invention relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of AIM II activity. New treatments such as lymphadenopathy, abnormal bone development, autoimmune and other immune system disorders, transplanted versus host disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and new treatments such as tumor cell proliferation Also provided are therapeutic methods for inhibiting formation.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 （発明の背景） （発明の技術分野） 本発明は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの新規なメンバーに関する。よ
り詳細には、ヒトアポトーシス誘導分子ＩＩ（ＡＩＭ ＩＩ）をコードする単離
された核酸分子が提供される。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドもまた提供され、同様
に、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞および組換
え方法が提供される。本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩ活性のアゴニストおよびア
ンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。リンパ節症、異常
な骨発達、自己免疫疾患、他の免疫系疾患、対宿主性移植片病、慢性関節リウマ
チ、変形性関節症を処置するため、そして新形成（例えば、腫瘍細胞増殖）を阻
害するための治療方法もまた、提供される。BACKGROUND OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to novel members of the TNF ligand superfamily. More particularly, provided is an isolated nucleic acid molecule encoding human apoptosis-inducing molecule II (AIM II). AIM II polypeptides are also provided, as well as vectors, host cells and recombinant methods for producing AIM II polypeptides. The invention further relates to screening methods for identifying agonists and antagonists of AIM II activity. To treat lymphadenopathy, abnormal bone development, autoimmune diseases, other immune system disorders, graft-versus-host disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and neoplasia (eg, tumor cell growth) A method of treatment for inhibiting is also provided.

【０００２】 （関連分野） ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびヒト腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β、
またはリンホトキシン）は、インターフェロン、インターロイキン、および増殖
因子（集団的にサイトカインと呼ばれる）を含む広範なクラスのポリペプチドメ
ディエーターに関連するメンバーである（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒａ
ｍｉ，Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｔ，．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：６２５〜６５５（１
９８９））。Related Art [0002] Human tumor necrosis factor α (TNF-α) and human tumor necrosis factor β (TNF-β,
Or lymphotoxins) are members related to a broad class of polypeptide mediators, including interferons, interleukins, and growth factors (collectively referred to as cytokines) (Beutler, B. and Cera).
mi, A .; , Annu. Ret,. Immunol. , 7: 625-655 (1
989)).

【０００３】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）は本来、その抗腫瘍活性の結果
として発見されたが、現在、いくつかの形質転換細胞株のアポトーシス、細胞活
性化および細胞増殖の媒介を含む多数の生物学的活性を有し得る多面的なサイト
カインとして、そしてまた免疫調節および炎症において重要な役割も果たすと認
識される。[0003] Tumor necrosis factors (TNF-α and TNF-β) were originally discovered as a result of their antitumor activity, but are now mediating apoptosis, cell activation and cell proliferation of several transformed cell lines. It is recognized as a pleiotropic cytokine that may have a number of biological activities, including, and also plays an important role in immune regulation and inflammation.

【０００４】 現在までに、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの公知のメンバーは、ＴＮＦ
−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、Ｆａｓリガ
ンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌおよび４−ＩＢＢＬを含む。ＴＮＦ
リガンドスーパーファミリーのリガンドは、細胞外ドメインにおいて約２０％（
範囲、１２％〜３６％）の配列相同性を有する、酸性のＴＮＦ様分子であり、そ
して生物学的活性型が三量体／多量体の複合体である膜結合型として主に存在す
る。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの可溶型は、現在までに、ＴＮＦ、ＬＴ
α、およびＦａｓリガンドについてのみ同定されている（一般の総説については
、Ｇｒｕｓｓ，Ｈ．およびＤｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｂｌｏｏｄ、８５（１２）：
３３７８〜３４０４（１９９５）を参照のこと）（その全体において、本明細書
中で参考として援用される）。[0004] To date, known members of the TNF ligand superfamily are TNF
-Α, TNF-β (Lymphotoxin-α), LT-β, OX40L, Fas ligand, CD30L, CD27L, CD40L and 4-IBBL. TNF
Ligands of the ligand superfamily account for about 20% (
(Range, 12% -36%), are acidic TNF-like molecules, and exist primarily as membrane-bound forms, where the biologically active form is a trimeric / multimeric complex. Soluble forms of the TNF ligand superfamily have, to date, been TNF, LT
Only α and Fas ligands have been identified (for a general review, see Gruss, H. and Dower, SK, Blood, 85 (12):
3378-3404 (1995)), which is hereby incorporated by reference in its entirety.

【０００５】 これらのタンパク質は、アポトーシスまたは細胞傷害性による細胞の生存また
は死の制御を含む、細胞増殖、細胞活性化、および細胞分化の調節に関与する（
Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６；４０
７（１９９４）およびＳｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．、Ｃｅｌｌ ７５：９５９（１９９
４））。[0005] These proteins are involved in regulating cell proliferation, cell activation, and cell differentiation, including controlling cell survival or death through apoptosis or cytotoxicity (
Armitage, R.A. J. Curr. Opin. Immunol. 6; 40
7 (1994) and Smith, C.I. A. Cell 75: 959 (199).
4)).

【０００６】 哺乳動物の発達は、細胞の増殖および分化の両方ならびにプログラムされた細
胞死（アポトーシスを介して生じる）に依存する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ａｃｈｉｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１８（１９８８））。アポ
トーシスは、自己抗原を認識する免疫胸腺細胞の破壊に重要な役割を果たす。こ
の正常な除去プロセス不全は、自己免疫疾患において役割を果たし得る（Ｇａｍ
ｍｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：１９３（１９９１））。[0006] Mammalian development depends on both cell proliferation and differentiation as well as programmed cell death, which occurs via apoptosis (Walker et al., Metho).
ds Achiev. Exp. Pathol. 13:18 (1988)). Apoptosis plays an important role in the destruction of immune thymocytes that recognize self antigens. This failure of the normal removal process may play a role in autoimmune diseases (Gam
Mon et al., Immunology Today 12: 193 (1991)).

【０００７】 Ｉｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））は、アポトーシスを媒介
し、そしてＴ細胞のクローン除去に関与する細胞表面抗原であるＦａｓ／ＣＤ９
５を記載した。Ｆａｓは、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、ならびに胸腺、肝臓
、心臓および肺、ならびに成体マウスにおいては、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中
球に加えて卵巣（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏ．１４８：１２７４（１９９２））において発現される。Ｆａｓに対するモノ
クローナル抗体がＦａｓに架橋される実験において、アポトーシスが誘導される
（Ｙｏｎｅｈａｒａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７（１９８９）；
Ｔｒａｕｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３０１（１９８９））。さらに、Ｆ
ａｓに対するモノクローナル抗体の結合が、特定の条件下でＴ細胞を刺激し得る
例が存在する（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２２３１（
１９９３））。[0007] Itoh et al. (Cell 66: 233 (1991)) describe Fas / CD9, a cell surface antigen that mediates apoptosis and is involved in clonal depletion of T cells.
5 is described. Fas is activated T cells, B cells, neutrophils and, in thymus, liver, heart and lung, and in adult mice, activated T cells, B cells, neutrophils plus ovaries (Watanabe-Fukunaga et al.). , J. Immunol
o. 148: 1274 (1992)). Apoptosis is induced in experiments in which a monoclonal antibody to Fas is cross-linked to Fas (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169: 1747 (1989);
Trath et al., Science 245: 301 (1989)). Further, F
There are examples where binding of a monoclonal antibody to as can stimulate T cells under certain conditions (Alderson et al., J. Exp. Med. 178: 2231 (
1993)).

【０００８】 Ｆａｓ抗原は、４５Ｋｄの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Ｆａｓに
ついてのヒト遺伝子およびマウス遺伝子の両方は、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕ
ｎａｇａら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４（１９９２））およびＩｔ
ｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））によってクローニングされてい
る。これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、両方とも、神経発育因子
／腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーに構造相同性を有する膜貫通タン
パク質であり、このスーパーファミリーは、２つのＴＮＦレセプター、低親和性
神経発育因子レセプターおよびＬＴβレセプターＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０
、およびＯＸ４０を含む。[0008] The Fas antigen is a cell surface protein with a relative molecular weight of 45 Kd. Both human and mouse genes for Fas are available from Watanabe-Fuku.
Naga et al. (J. Immunol. 148: 1274 (1992)) and It.
(Cell 66: 233 (1991)). Both proteins encoded by these genes are transmembrane proteins with structural homology to the nerve growth factor / tumor necrosis factor receptor superfamily, a family of two TNF receptors, low affinity neuronal development. Factor receptor and LTβ receptor CD40, CD27, CD30
, And OX40.

【０００９】 最近、Ｆａｓリガンドが、記述されている（Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ７５：１
１６９（１９９３））。このアミノ酸配列は、ＦａｓリガンドがＴＮＦファミリ
ーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示す。Ｆａｓリガンドは、脾臓
細胞および胸腺細胞において発現される。この精製したＦａｓリガンドは、４０
ｋｄの分子量を有する。Recently, Fas ligands have been described (Suda et al., Cell 75: 1).
169 (1993)). This amino acid sequence indicates that the Fas ligand is a type II transmembrane protein belonging to the TNF family. Fas ligand is expressed on spleen cells and thymocytes. This purified Fas ligand contains 40
It has a molecular weight of kd.

【００１０】 最近、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用がＴ細胞の活性化に続くアポトーシス
に必要とされることが実証されている（Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４４
（１９９５）：Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１（１９９５）
）。Ｔ細胞の活性化は、細胞表面上の両方のタンパク質を誘導する。引き続くリ
ガンドとレセプターとの間の相互作用は、細胞のアポトーシスを生じる。これは
、正常な免疫応答の間、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用により誘導されるアポ
トーシスについて可能性のある調節役割を支持する。[0010] Recently, it has been demonstrated that Fas / Fas ligand interaction is required for apoptosis following T cell activation (Ju et al., Nature 373: 444).
(1995): Brunner et al., Nature 373: 441 (1995).
). Activation of T cells induces both proteins on the cell surface. Subsequent interaction between the ligand and the receptor results in cell apoptosis. This supports a possible regulatory role for apoptosis induced by the Fas / Fas ligand interaction during a normal immune response.

【００１１】 本発明のポリペプチドは、構造的類似性および生物学的類似性に基づいて、Ｔ
ＮＦリガンドスーパーファミリーの新規なメンバーとして同定された。[0011] The polypeptides of the present invention are based on structural and biological similarities.
It has been identified as a new member of the NF ligand superfamily.

【００１２】 明らかに、正常細胞および異常細胞の活性化、および分化を調節する因子が必
要である。従って、正常細胞および疾患状態細胞の両方の活性化、および分化を
調節するこのような因子の同定および特徴付けが必要である。特に、自己免疫疾
患、対宿主性移植片病、慢性関節リウマチおよびリンパ節症の処置のためにアポ
トーシスを制御するさらなるＦａｓリガンドを単離し、そして特徴付けることが
必要である。Clearly, there is a need for factors that regulate the activation and differentiation of normal and abnormal cells. Thus, there is a need for the identification and characterization of such factors that regulate the activation and differentiation of both normal and diseased cells. In particular, there is a need to isolate and characterize additional Fas ligands that control apoptosis for the treatment of autoimmune diseases, graft versus host disease, rheumatoid arthritis and lymphadenopathy.

【００１３】 （発明の要旨） 本発明は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、また
は１９９６年８月２２日にＡＴＣＣ寄託番号９７６８９として細菌宿主中に寄託
されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供す
る。本発明はまた、図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号３９）に示されるアミノ酸配
列、または１９９６年３月１５日にＡＴＣＣ寄託番号９７４８３として細菌宿主
中に寄託されたｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子
を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1A and FIG. 1B (SEQ ID NO: 2), or a cDNA clone deposited in a bacterial host on August 22, 1996 as ATCC Accession No. 97689. AIM II having the amino acid sequence encoded by
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding the polypeptide. The present invention also relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1C and FIG. 1D (SEQ ID NO: 39), or the amino acid sequence encoded by the cDNA clone deposited in a bacterial host as ATCC Deposit No. 97483 on Mar. 15, 1996. AI having
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a MII polypeptide.

【００１４】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法、および組換え技術によりこれらをＡＩＭ ＩＩポリペプチドま
たはペプチドの産生に使用するための方法に関する。The present invention also relates to recombinant vectors containing the isolated nucleic acid molecules of the present invention, and host cells containing the recombinant vectors, methods of making such vectors and host cells, and recombinant techniques. And methods for using them for the production of AIM II polypeptides or peptides.

【００１５】 本発明はさらに、本明細書中で記載されるポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する単離されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドを提供する。[0015] The invention further provides an isolated AIM II polypeptide having an amino acid sequence encoded by a polynucleotide described herein.

【００１６】 本明細書中で使用される用語「ＡＩＭ ＩＩ」ポリペプチドは、膜結合タンパ
ク質（細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む）ならび
にＡＩＭ ＩＩポリペプチド活性を保持する短縮型タンパク質を含む。１つの実
施態様において、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質
の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むが、細胞膜上のポリペプチドの保持を
生じる膜貫通領域を欠損する。可溶性ＡＩＭ ＩＩはまた、可溶性ＡＩＭ ＩＩ
タンパク質が分泌され得る場合、膜貫通領域の部分または細胞質ドメインの部分
あるいは他の配列を含み得る。異種シグナルペプチドは、発現された際に、可溶
性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドが分泌されるように、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドのＮ末端に融合され得る。As used herein, the term “AIM II” polypeptide refers to membrane-associated proteins (including cytoplasmic, transmembrane, and extracellular domains) and truncated proteins that retain AIM II polypeptide activity including. In one embodiment, the soluble AIM II polypeptide comprises all or part of the extracellular domain of the AIM II protein, but lacks the transmembrane region that results in retention of the polypeptide on the cell membrane. Soluble AIM II is also soluble AIM II
If the protein can be secreted, it may include part of the transmembrane region or part of the cytoplasmic domain or other sequences. The heterologous signal peptide can be fused to the N-terminus of the soluble AIM II polypeptide such that when expressed, the soluble AIM II polypeptide is secreted.

【００１７】 本発明はまた、リンパ節症、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、対宿主性移植
片病、ＩｇＥ媒介アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸促進症候群、ク
ローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン
リンパ腫（ＮＨＬ）、およびグレーヴズ病のような病気を処置するために用いら
れ得る、ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、特にヒトＡＩＭ ＩＩポリペプチドを提供
する。本発明のこれらのポリペプチドはまた、末梢の寛容を刺激し、いくつかの
形質転換細胞株を破壊し、細胞活性化および細胞増殖を媒介するために使用され
得、そして免疫調節および炎症応答の最初のメディエーターとして機能的に関連
する。The invention also relates to lymphadenopathy, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, graft-versus-host disease, IgE-mediated allergic reactions, anaphylaxis, adult respiratory distress syndrome, Crohn's disease, allergic asthma, acute lymphoblasts Provided are AIM II polypeptides, particularly human AIM II polypeptides, that can be used to treat diseases such as leukemia (ALL), non-Hodgkin's lymphoma (NHL), and Graves' disease. These polypeptides of the present invention can also be used to stimulate peripheral tolerance, destroy some transformed cell lines, mediate cell activation and cell proliferation, and regulate immunomodulatory and inflammatory responses. Functionally relevant as the first mediator.

【００１８】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボ
で細胞に、または多細胞生物に投与するためのＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドま
たはＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特
定の好ましい実施態様において、この組成物は、疾患の処置のために、宿主生物
中でＡＩＭ ＩＩポリペプチドを発現させるためのＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチ
ドを含む。このことに関して特に好ましいのは、ＡＩＭ ＩＩの異常な内因性活
性と関連した機能不全の処置のためのヒト患者での発現である。The invention further provides a composition comprising an AIM II polynucleotide or AIM II polypeptide for administration to a cell in vitro, to a cell ex vivo, and to a cell in vivo, or to a multicellular organism. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the composition comprises an AIM II polynucleotide for expressing an AIM II polypeptide in a host organism for treatment of a disease. Particularly preferred in this regard is the expression in human patients for the treatment of dysfunction associated with abnormal endogenous activity of AIM II.

【００１９】 本発明はまた、ＡＩＭ ＩＩにより誘導される細胞応答を増強し得るかまたは
阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は
、ＡＩＭ ＩＩを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞応答をアッ
セイする工程、そして標準的な細胞応答に対してこの細胞応答を比較する工程を
含む（標準は、候補化合物の非存在下で接触がなされた場合にアッセイされる）
。それによって、標準に対して上昇した細胞応答は、この化合物がアゴニストで
あることを示し、そしてこの標準に対して減少した細胞応答は、この化合物がア
ンタゴニストであることを示す。The present invention also provides a screening method for identifying a compound capable of enhancing or inhibiting the cellular response induced by AIM II. The method comprises the steps of contacting a cell expressing AIM II with a candidate compound, assaying the cellular response, and comparing the cellular response to a standard cell response. Assayed when contact is made in the absence)
. Thereby, an elevated cellular response to the standard indicates that the compound is an agonist, and a decreased cellular response to the standard indicates that the compound is an antagonist.

【００２０】 別の局面において、ＡＩＭ ＩＩのアゴニストおよびアンタゴニストについて
のスクリーニングアッセイが提供される。このアンタゴニストを使用し、敗血症
性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶
反応、骨吸収、および悪液質（るいそうまたは栄養失調）を予防し得る。In another aspect, screening assays for AIM II agonists and antagonists are provided. This antagonist can be used to prevent septic shock, inflammation, cerebral malaria, activation of HIV virus, graft-host rejection, bone resorption, and cachexia (wasting or malnutrition).

【００２１】 本発明のさらなる局面において、ＡＩＭ ＩＩは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）
において頻繁に観察されるような骨および軟骨における侵襲性（ｉｎｖａｄｉｎ
ｇ）パンヌスを維持することが必要とされる新脈管形成における増加または内皮
細胞増殖における増加を阻害することによってＲＡを処置するために使用され得
る。In a further aspect of the invention, AIM II comprises rheumatoid arthritis (RA)
Invasion in bone and cartilage as frequently observed in
g) Can be used to treat RA by inhibiting an increase in angiogenesis or an increase in endothelial cell proliferation required to maintain pannus.

【００２２】 本発明のさらなる局面において、ＡＩＭ ＩＩは、リガンドのレセプターへの
結合を阻害することによって、またはレセプターに結合し、そしてレセプター媒
介細胞応答を活性化することによってのいずれかで、細胞性レセプター（例えば
、ＬＴ−β−Ｒ、ＴＲ２、ＣＤ２７、およびＴＲＡＮＫ）によって媒介される細
胞応答を阻害または活性化するために使用され得る。[0022] In a further aspect of the invention, AIM II inhibits cellular binding, either by inhibiting the binding of a ligand to a receptor, or by binding to a receptor and activating a receptor-mediated cellular response. It can be used to inhibit or activate cellular responses mediated by receptors (eg, LT-β-R, TR2, CD27, and TRANK).

【００２３】 本発明のさらなる局面は、身体中において上昇したレベルのＡＩＭ ＩＩ活性
を必要とする個体を処置するための方法であって、治療的に有効量の本発明の単
離されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物をこのよ
うな個体に投与する工程を包含する方法に関する。A further aspect of the invention is a method for treating an individual in need of elevated levels of AIM II activity in the body, comprising a therapeutically effective amount of an isolated AIM II of the invention. A method comprising administering to such an individual a composition comprising the polypeptide or agonist thereof.

【００２４】 本発明のなおさらなる局面は、身体中において減少したレベルのＡＩＭ ＩＩ
活性を必要とする個体を処置するための方法であって、治療的に有効量のＡＩＭ
ＩＩアンタゴニストを含む組成物をこのような個体に投与する工程を包含する
方法に関する。[0024] Still a further aspect of the invention is directed to reduced levels of AIM II in the body.
A method for treating an individual in need of an activity, comprising a therapeutically effective amount of AIM
A method comprising administering to such an individual a composition comprising a II antagonist.

【００２５】 （詳細な説明） 本発明は、クローン化ｃＤＮＡの配列決定によって決定した図１ＡおよびＢに
示されるアミノ酸配列（配列番号２）を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のＡＩＭ
ＩＩタンパク質は、ヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒトＴＮＦ−β（配列番
号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、およびヒトＦａｓリガンド（配列
番号６）との配列相同性を共有する（図２Ａ〜Ｃ）。図１ＡおよびＢに示される
ヌクレオチド配列（配列番号１）は、ｃＤＮＡクローンを配列決定することによ
って得られ、これは、１９９６年８月２２日に、アメリカンタイプカルチャーコ
レクション、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ
，ＶＡ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託され、そして受託番号９７６８９
を与えられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プ
ラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれている。
図１ＣおよびＤに示されるヌクレオチド配列を、ｃＤＮＡクローンを配列決定す
ることによって得た。これは、１９９６年３月１５日に、アメリカンタイプカル
チャーコレクション、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａ
ｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託され、そして受託番号９
７４８３を与えられた。DETAILED DESCRIPTION The present invention provides an isolation comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) as determined by sequencing of the cloned cDNA. Provided nucleic acid molecules. AIM of the present invention
The II protein shares sequence homology with human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and human Fas ligand (SEQ ID NO: 6). (FIGS. 2A-C). The nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was obtained by sequencing a cDNA clone, which was published on August 22, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Manassas
, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 97689.
Was given. The deposited clone is contained in the pBluescript SK (-) plasmid (Stratagene, La Jolla, CA).
The nucleotide sequences shown in FIGS. 1C and D were obtained by sequencing cDNA clones. This is on March 15, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Mana
sass, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 9
7483 was given.

【００２６】 （核酸分子） 特に示されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＭｏｄｅｌ ３７３）を
使用して決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によってコードさ
れるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されたＤＮＡ配列
の翻訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された
任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定され
た任意のヌクレオチド配列は、いくらかの誤差を含み得る。自動化によって決定
されたヌクレオチド配列は、代表的には、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌ
クレオチド配列に対して、少なくとも約９０％同一であり、より代表的には、少
なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分
野で周知の手動ＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによってより正確に決定
され得る。同様に当該分野で公知であるように、実際の配列に比較しての決定さ
れたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻
訳において、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予想されたアミ
ノ酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にそのような挿入または欠
失の位置で始まってコードされたアミノ酸配列とは全く異なるように、フレーム
シフトを生じる。Nucleic Acid Molecules Unless otherwise indicated, all nucleotide sequences determined by sequencing DNA molecules herein are based on automated DNA sequencers (eg, A
Applied Biosystems, Inc. The entire amino acid sequence of a polypeptide determined by the DNA molecule determined using Model 373) and determined herein is predicted by translation of the DNA sequence determined as described above. Was. Thus, as is known in the art for any DNA sequence determined by this automated approach, any nucleotide sequence determined herein may contain some errors. The nucleotide sequence determined by automation is typically at least about 90% identical to the actual nucleotide sequence of the sequenced DNA molecule, and more typically at least about 95% to at least about 99.9% identical. The actual sequence may be more accurately determined by other approaches, including manual DNA sequencing methods well known in the art. As is also known in the art, a single insertion or deletion in the determined nucleotide sequence relative to the actual sequence will result in the translation of the nucleotide sequence into the predicted sequence encoded by the determined nucleotide sequence. The resulting amino acid sequence causes a frameshift such that the sequenced DNA molecule is completely different from the encoded amino acid sequence actually starting at the position of such an insertion or deletion.

【００２７】 本明細書中に提供される情報を（例えば、図１ＡおよびＢのヌクレオチド配列
）使用して、ＡＩＭ ＩＩポリぺプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準
的なクローニング手順およびスクリーニング手順（例えば、開始材料としてｍＲ
ＮＡを使用するｃＤＮＡクローニング手順）を使用して得られ得る。本発明の例
証として、図１ＡおよびＢ（配列番号１）に記載される核酸分子は、ヒトマクロ
ファージｏｘ ＬＤＬ（ＨＭＣＣＢ６４）に由来するｃＤＮＡライブラリーにお
いて発見された。この遺伝子はまた、活性化されたＴ細胞（ＨＴ４ＣＣ７２）に
由来するｃＤＮＡライブラリーおいても同定された。図１ＡおよびＢのＡＩＭ
ＩＩ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列（配列番号１）は、２４０アミノ
酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタ
ンパク質は、図１ＡおよびＢのヌクレオチド配列の４９〜５１位の開始コドン（
配列番号１）、図１ＡおよびＢの約６０〜約２４０のアミノ酸残基を含む細胞外
ドメイン（配列番号２）、図１ＡおよびＢの約３７〜約５９のアミノ酸残基を含
む膜貫通ドメイン（配列番号２）、図１ＡおよびＢの約１〜約３６のアミノ酸残
基を含む細胞内ドメイン（配列番号２）を有し、そして推定分子質量は約２６．
４ｋＤａである。図１ＡおよびＢに示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質（配列番号
２）は、ヒトＦａｓリガンドのアミノ酸配列に約２７％同一および５１％類似で
あり（図２Ａ）、そしてヒトＴＮＦ−αのアミノ酸配列に約２６％同一および約
４７％類似である（図２Ｂ）。ＡＩＭ ＩＩが、ＴＮＦリガンド様分子に相同で
あるならば、ＴＮＦリガンド様分子は、二量体として機能する。この分子は、ホ
モ二量体としても機能するようである。Using the information provided herein (eg, the nucleotide sequences of FIGS. 1A and B), a nucleic acid molecule of the invention encoding an AIM II polypeptide can be constructed using standard cloning procedures and screening. Procedure (eg, mR as starting material)
CDNA cloning procedure using NA). As an illustration of the present invention, the nucleic acid molecule set forth in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was found in a cDNA library derived from human macrophage ox LDL (HMCCB64). This gene was also identified in a cDNA library derived from activated T cells (HT4CC72). AIM of FIGS. 1A and B
The determined nucleotide sequence of the II cDNA (SEQ ID NO: 1) contains an open reading frame encoding a protein of 240 amino acid residues. This protein has the start codon at positions 49-51 of the nucleotide sequence of FIGS.
SEQ ID NO: 1), an extracellular domain comprising about 60 to about 240 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), a transmembrane domain comprising about 37 to about 59 amino acid residues in FIGS. SEQ ID NO: 2), having an intracellular domain comprising about 1 to about 36 amino acid residues of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), and a predicted molecular mass of about
4 kDa. The AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) is approximately 27% identical and 51% similar to the amino acid sequence of human Fas ligand (FIG. 2A), and approximately 26% to the amino acid sequence of human TNF-α. % Identity and about 47% similar (FIG. 2B). If AIM II is homologous to a TNF ligand-like molecule, the TNF ligand-like molecule functions as a dimer. This molecule also appears to function as a homodimer.

【００２８】 当業者は、上記で議論された配列決定のエラーの可能性に起因して、寄託され
たｃＤＮＡによってコードされる推定ＡＩＭ ＩＩポリぺプチドが、約２４０ア
ミノ酸を含むように、該して２３０〜２５０アミノ酸の範囲の間であり得ること
を理解する。使用される基準に依存して、ＡＩＭ ＩＩポリぺプチドの細胞外ド
メイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な「位置（ａｄｄｒｅｓ
ｓ）」に関してはわずかに異なることが、さらに理解される。例えば、図１Ａお
よびＢのＡＩＭ ＩＩの細胞外ドメイン（配列番号２）の正確な位置は、このド
メインを定義するために使用される基準に依存して、わずかに変化し得る（例え
ば、位置は、約１〜５残基「ずれ（ｓｈｉｆｔ）」得る）。The skilled artisan will appreciate that, due to the possibility of sequencing errors discussed above, the putative AIM II polypeptide encoded by the deposited cDNA will contain about 240 amino acids. It can range between 230 and 250 amino acids. Depending on the criteria used, the exact “location” of the extracellular, intracellular, and transmembrane domains of AIM II polypeptides (addres
s) "is slightly different. For example, the exact location of the extracellular domain of AIM II (SEQ ID NO: 2) in FIGS. 1A and B may vary slightly depending on the criteria used to define this domain (eg, , About 1-5 residues "shift").

【００２９】 示したように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）であ
り得、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより得られたか、または合
成的に産生された、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮ
Ａは、二重鎖または一重鎖であり得る。一重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡは、コー
ディング鎖（センス鎖としても公知）であり得、あるいは非コーディング鎖（抗
アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る。As indicated, the nucleic acid molecules of the invention can be in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, obtained by cloning or produced synthetically). Genomic DNA). This DN
A can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or can be the non-coding strand (also called the anti-antisense strand).

【００３０】 「単離した」核酸分子とは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮ
ＡもしくはＲＮＡをいう。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本
発明の目的のために単離されると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる
例としては、異種の宿主細胞で維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（
部分的にもしくは実質的に）精製したＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮ
Ａ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボもしくはインビトロのＲＮＡ転写物を
含む。本発明に従う単離された核酸分子は、さらに、合成的に産生されたこのよ
うな分子を含む。An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that has been removed from its natural environment, DN
A or RNA. For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector will be isolated for the purposes of the present invention. Further examples of isolated DNA molecules include recombinant DNA molecules maintained in heterologous host cells, or (in solution).
DNA molecules that are (partially or substantially) purified. Isolated RN
A molecule comprises an in vivo or in vitro RNA transcript of a DNA molecule of the present invention. Isolated nucleic acid molecules according to the present invention further include such molecules produced synthetically.

【００３１】 本発明の単離された核酸分子としては、以下が挙げられる：図１ＡおよびＢに
示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）または図１Ｃ
およびＤに示されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号３８）
を含むＤＮＡ分子；図１ＡおよびＢに示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質のコード
配列（配列番号２）または図１ＣおよびＤに示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質の
コード配列（配列番号３９）を含むＤＮＡ分子；ならびに上記に記載したＤＮＡ
と実質的に異なる配列を含むが（遺伝暗号の縮重に起因して）、ＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質をまだコードするＤＮＡ分子。当然、遺伝子暗号は当該分野において周
知である。従って、当業者にとって、このような変性改変体を産生することは慣
用的なものである。[0031] Isolated nucleic acid molecules of the invention include the following: an open reading frame (ORF) (SEQ ID NO: 1) shown in FIGS. 1A and B or FIG. 1C.
Open reading frame (ORF) shown in SEQ ID NOS: and D (SEQ ID NO: 38)
A DNA molecule comprising the coding sequence of the AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) or the coding sequence of the AIM II protein shown in FIGS. 1C and D (SEQ ID NO: 39); DNA described
A DNA molecule comprising a sequence substantially different from that of the AIM II protein (due to the degeneracy of the genetic code) but still encodes the AIM II protein. Of course, the genetic code is well known in the art. Thus, it is conventional for those skilled in the art to produce such modified variants.

【００３２】 さらに、本発明は、以下の関連したｃＤＮＡクローン：ＨＴ４ＣＣ７２Ｒ（配
列番号２０）から決定された、配列番号１の一部分に関連するヌクレオチド配列
を有する核酸分子を提供する。Further, the present invention provides a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence related to a portion of SEQ ID NO: 1, as determined from the following related cDNA clone: HT4CC72R (SEQ ID NO: 20).

【００３３】 別の局面において、本発明は、１９９６年８月２２日にＡＴＣＣ受諾番号第９
７６８９号として寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡクローンによって
か、または１９９６年３月１５日にＡＴＣＣ受諾番号第９７４８３号として寄託
されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸
配列を有するＡＩＭ ＩＩポリぺプチドをコードする、単離された核酸分子を提
供する。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるポリぺプチドをコードする。本発明はさらに、図１ＡおよびＢ
に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する単離された核酸分子、もし
くは図１ＣおよびＤに示されるヌクレオチド配列（配列番号３８）を有する単離
された核酸分子、または上記の寄託されたクローンに含まれるＡＩＭ ＩＩ ｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記の配列の
１つに相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された核酸分
子（特にＤＮＡ分子）は、（染色体のインサイチュハイブリダイゼーションによ
る）遺伝子マッピング、および（例えば、ノーザンブロット分析により）ヒト組
織においてＡＩＭ ＩＩ遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用であ
る。In another aspect, the present invention relates to ATCC Accession No. 9 on August 22, 1996.
AIM having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in the plasmid deposited as No. 7689, or by the cDNA clone contained in the plasmid deposited as ATCC Accession No. 97483 on Mar. 15, 1996. Provided is an isolated nucleic acid molecule that encodes a II polypeptide. Preferably, the nucleic acid molecule encodes a polypeptide encoded by the deposited cDNA clone described above. The present invention further relates to FIGS.
An isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1), or having the nucleotide sequence shown in FIGS. 1C and D (SEQ ID NO: 38), or a deposited clone as described above AIM IIc included in
An isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of DNA or a nucleic acid molecule having a sequence complementary to one of the above sequences is provided. Such isolated nucleic acid molecules (especially DNA molecules) can be used for gene mapping (by in situ hybridization of chromosomes) and probes for detecting the expression of the AIM II gene in human tissues (eg, by Northern blot analysis). Useful as

【００３４】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１ＡおよびＢに示
されるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する単離されたヌクレオチド分子の
フラグメントとは、本明細書中で議論されるように、診断的なプローブおよびプ
ライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは、少
なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは、少なくとも３０ｎｔ、そしてなお
さらにより好ましくは少なくとも４０ｎｔの長さのフラグメントをいう。当然、
５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７
５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５０
０、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２
５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５
０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、
または１１５０ｎｔの長さのより長いフラグメントもまた、寄託されたｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列、または図１ＡおよびＢに示されるヌクレオチド配列（配列
番号１）のほとんどに（全てではなくとも）対応するフラグメントとして本発明
に従って有用である。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントとは、例えば、
寄託されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または図１ＡおよびＢに示されるヌク
レオチド配列（配列番号１）からの２０以上連続した塩基を含むフラグメントを
いう。[0034] The present invention further relates to fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein. The nucleotide sequence of the deposited cDNA, or a fragment of the isolated nucleotide molecule having the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1), as discussed herein, is diagnostic. Refers to fragments of at least about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least 30 nt, and even more preferably at least 40 nt, which are useful as probes and primers. Of course,
50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 27
5, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 50
0, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 72
5, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 95
0, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125,
Alternatively, a longer fragment of 1150 nt in length was also obtained from the deposited cDNA.
Or fragments corresponding to most, if not all, of the nucleotide sequences shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1). A fragment having a length of at least 20 nt is, for example,
Refers to the nucleotide sequence of the deposited cDNA, or a fragment comprising at least 20 contiguous bases from the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1).

【００３５】 本発明の好ましい核酸フラグメントは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のエピトープ
保有部分をコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような核酸分子フラ
グメントは、以下をコードする核酸分子を含む：図１ＡおよびＢの約１３〜約２
０のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリぺプチド；図１の約２３〜３６アミ
ノ酸残基（配列番号２）を含むポリぺプチド；図１ＡおよびＢの約６９〜約７９
のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリぺプチド；図１ＡおよびＢの約８５〜
約９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリぺプチド；図１ＡおよびＢの約
１６７〜約１７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリぺプチド；図１Ａお
よびＢの約１８４〜約１９６のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリぺプチド
；ならびに、図１ＡおよびＢの約２２１〜約２３３のアミノ酸残基（配列番号２
）を含むポリぺプチド。本発明者らは、上記のポリぺプチドフラグメントは、Ａ
ＩＭ ＩＩタンパク質の抗原性領域であると決定した。ＡＩＭ ＩＩタンパク質
のこのような他のエピトープ保有領域を決定するための方法は、以下に詳細に記
載される。[0035] Preferred nucleic acid fragments of the invention include nucleic acid molecules encoding the epitope-bearing portion of the AIM II protein. In particular, such nucleic acid molecule fragments of the invention include nucleic acid molecules that encode: from about 13 to about 2 in FIGS.
A polypeptide comprising 0 amino acid residues (SEQ ID NO: 2); a polypeptide comprising about 23-36 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) of FIG. 1;
A polypeptide comprising the amino acid residues of SEQ ID NO: 2;
A polypeptide comprising about 94 amino acid residues (SEQ ID NO: 2); a polypeptide comprising about 167 to about 178 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) of FIGS. 1A and B; A polypeptide comprising about 196 amino acid residues (SEQ ID NO: 2); and about 221 to about 233 amino acid residues of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
A). We have determined that the above polypeptide fragment is
It was determined to be the antigenic region of the IM II protein. Methods for determining such other epitope-bearing regions of the AIM II protein are described in detail below.

【００３６】 ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドは、種々の用途、特に、ＡＩＭ ＩＩの化学的
特性および生物学的特性を利用する用途のために、本発明に従って使用され得る
。自己免疫疾患および異常な細胞増殖が、これらの用途のうちである。さらなる
用途は、細胞、組織、および器官の障害の診断および処置に関連する。AIM II polynucleotides can be used in accordance with the present invention for a variety of applications, particularly those that make use of the chemical and biological properties of AIM II. Autoimmune diseases and abnormal cell proliferation are among these uses. Further uses relate to the diagnosis and treatment of cell, tissue, and organ disorders.

【００３７】 本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するための、例えば、診断試
薬としてのＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害に関連する
ＡＩＭ ＩＩの変異した形態の検出は、ＡＩＭ ＩＩの過少発現、過剰発現、ま
たは変質した発現から生じる疾患（例えば、自己免疫疾患）の診断、あるいはそ
の疾患への感受性を補足または定義し得る診断上の手段を提供する。ＡＩＭ Ｉ
Ｉをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明のポリぺプチドの発現のための
診断マーカーとして利用され得る。The present invention also relates to the use of AIM II polynucleotides for detecting complementary polynucleotides, for example, as a diagnostic reagent. Detection of a mutated form of AIM II associated with dysfunction can be used to diagnose, or supplement, susceptibility to a disease (eg, an autoimmune disease) resulting from under-, over-, or altered expression of AIM II. Provides a diagnostic tool that can be defined. AIM I
Polynucleotides encoding I can also be used as diagnostic markers for expression of the polypeptides of the invention.

【００３８】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記に記載の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受諾番号第９７６８
９号に含まれるｃＤＮＡクローン）におけるポリヌクレオチドの一部分にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下を含む溶液中で、４２℃
で終夜インキュベートし、次いで、約６５℃で０．１×ＳＳＣ中でフィルターを
洗浄することを意図する：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ
７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ
変性、剪断サケ***ＤＮＡ。In another aspect, the present invention provides a nucleic acid molecule of the invention described above (eg, ATCC Accession No. 9768) under stringent hybridization conditions.
(CDNA clone included in No. 9), comprising an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide that hybridizes to a portion of the polynucleotide. "Stringent hybridization conditions" refers to a solution containing
And wash the filters in 0.1 × SSC at about 65 ° C .: 50% formamide, 5 × SSC (750 mM Na
Cl, 75 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH
7.6) 5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml
Denatured, sheared salmon sperm DNA.

【００３９】 ポリヌクレオチドの「一部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、
参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好
ましくは、少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは、少なくとも３０ｎｔ
、そして、なおさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポ
リヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらは、上記
で議論し、そしてさらに以下で詳細に議論されるように、診断上のプローブおよ
び診断上のプライマーとして有用である。A polynucleotide that hybridizes to a “portion” of a polynucleotide is:
At least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably, at least about 20 nt, even more preferably, at least 30 nt
And, even more preferably, polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to about 30-70 nt are contemplated. These are useful as diagnostic probes and diagnostic primers, as discussed above and in more detail below.

【００４０】 「少なくとも２０ｎｔ（ヌクレオチド）の長さ」のポリヌクレオチドの一部分
とは、例えば、参照ポリヌクレオチド（例えば、図１ＡおよびＢに示されるよう
な寄託されたｃＤＮＡまたはヌクレオチド配列（配列番号１））のヌクレオチド
配列からの２０以上連続したヌクレオチドを意図する。A portion of a polynucleotide that is “at least 20 nt (nucleotides in length)” includes, for example, a reference polynucleotide (eg, a deposited cDNA or nucleotide sequence as shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) ) Is intended for 20 or more contiguous nucleotides from the nucleotide sequence.

【００４１】 当然、ポリＡ配列のみにハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、図１
ＡおよびＢに示されるＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域（配列
番号１））、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズするために
使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリ
ヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分子、またはその相補
体にハイブリダイズするからである（例えば、特に、任意の二重鎖ｃＤＮＡクロ
ーン）。Naturally, a polynucleotide that hybridizes only to the polyA sequence (eg, FIG. 1)
Polynucleotides that hybridize to the 3 ′ terminal poly (A) region of AIM II cDNA (A and B) (SEQ ID NO: 1), or a complementary stretch of T (or U) residues, are nucleic acids of the invention. Is not included in the polynucleotide of the present invention used to hybridize to a portion of the polynucleotide. This is because such a polynucleotide will hybridize to any nucleic acid molecule comprising a poly (A) stretch, or its complement (eg, in particular, any double-stranded cDNA clone).

【００４２】 示されるように、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は
、以下を含み得るが、これらに限定されない：単独でポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする核酸分子；このポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（
例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク
質配列のような、リーダー配列もしくは分泌配列をコードする配列）；さらなる
非コード配列を伴う、上記のさらなるコード配列を含むかまたは含まない、この
ポリペプチドのコード配列（さらなる非コード配列は、例えば、イントロンおよ
び非コード５’配列および３’配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナルを含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えば、リボ
ソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）を担う、転写される非翻訳配列）を含むが
、これらに限定されない）；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸
をコードするさらなるコード配列。従って、このポリペプチドをコードする配列
は、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のよ
うな、マーカー配列と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態
様において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．）中に提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドである
。これらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載
されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。
「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対
応する、精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃ
ｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によって記載されている。以下で考察される
ように、他のそのような融合タンパク質は、Ｎ末端またはＣ末端にてＦｃに融合
されたＡＩＭ ＩＩを含む。As indicated, a nucleic acid molecule of the invention encoding an AIM II polypeptide may include, but is not limited to: a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of a polypeptide alone; Coding sequence and additional sequences (
A polypeptide encoding a leader or secretory sequence, such as a pre-protein sequence or a pro-protein sequence or a pre-pro-protein sequence); with or without additional coding sequences as described above, with additional non-coding sequences Coding sequences (eg, additional non-coding sequences include, for example, introns and non-coding 5 ′ and 3 ′ sequences (eg, including splicing and polyadenylation signals, roles in transcription, mRNA processing (eg, ribosome binding and mRNA stability)). ) Transcribed non-translated sequences); additional coding sequences that encode additional amino acids to provide additional functionality. Thus, the sequence encoding the polypeptide can be fused to a marker sequence, such as a sequence encoding a peptide that facilitates purification of the fused polypeptide. In certain preferred embodiments of this aspect of the invention, the marker amino acid sequence is, inter alia, a pQE vector (Qiage).
n, Inc. ) Is a hexahistidine peptide, such as the tag provided in). Many of these are commercially available. See, for example, Gentz et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989), hexahistidine provides for convenient purification of the fusion protein.
The “HA” tag is another peptide useful for purification, corresponding to an epitope from the influenza hemagglutinin protein, which is described in Wilson et al.
ell 37: 767 (1984). As discussed below, other such fusion proteins include AIM II fused to Fc at the N-terminus or C-terminus.

【００４３】 本発明による核酸分子はさらに、Ｎ末端メチオニンを欠く全長ＡＩＭ−ＩＩポ
リペプチドをコードする核酸分子を含む。A nucleic acid molecule according to the present invention further includes a nucleic acid molecule encoding a full-length AIM-II polypeptide lacking an N-terminal methionine.

【００４４】 本発明は、さらに、ＡＩＭ ＩＩのタンパク質の部分、アナログ、または誘導
体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。天然の対立遺伝子改変体
のような改変体は、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」とは、生物の染色体
上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態のうちの１つを意
図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で
公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。The invention further relates to variants of the nucleic acid molecules of the invention that encode a portion, analog or derivative of a protein of AIM II. Variants such as natural allelic variants can occur naturally. By "allelic variant" is intended one of several alternative forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism. Genes II, Lewin, B .; Hen, John Wiley & So
ns, New York (1985). Non-naturally occurring variants can be generated using mutagenesis techniques known in the art.

【００４５】 このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生さ
れる改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には１つ以上のヌクレオチ
ドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変
更され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸の置換
、欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな
置換、付加、および欠失であり、これらはＡＩＭ ＩＩタンパク質、またはそれ
らの部分の特性および活性を変化させない。このことについてまた特に好ましい
のは、保存的置換である。Such variants include those produced by nucleotide substitutions, deletions or additions. The substitutions, deletions, or additions can include one or more nucleotides. Variants can be altered in the coding region, non-coding region, or both. Changes in the coding region can result in conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions or additions. Especially preferred among these are silent substitutions, additions and deletions, which do not alter the properties and activities of the AIM II protein, or a portion thereof. Also particularly preferred in this regard are conservative substitutions.

【００４６】 本発明のさらなる実施態様には、以下のポリヌクレオチドに、少なくとも９０
％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離さ
れた核酸分子が含まれる：（ａ）図１ＡおよびＢ（配列番号２）中の完全アミノ
酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ
）図１ＡおよびＢ（配列番号２）中のアミノ酸配列を有するがＮ末端のメチオニ
ンが欠けているＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ
）ＡＴＣＣ受託番号９７６８９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされ
る完全アミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｄ）ＡＩＭ ＩＩポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオ
チド配列；（ｅ）ＡＩＭ ＩＩポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレ
オチド配列；（ｆ）ＡＩＭ ＩＩポリペプチド細胞内ドメインをコードするヌク
レオチド配列；（ｇ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが膜貫通ド
メインが欠けている可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；ならびに（ｈ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）
、または（ｇ）は中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
。In a further embodiment of the present invention, the following polynucleotide comprises at least 90
An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is 100% identical, and more preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical is included: (a) FIGS. A nucleotide sequence encoding an AIM II polypeptide having the complete amino acid sequence in B (SEQ ID NO: 2); (b
) A nucleotide sequence encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) but lacking the N-terminal methionine; (c)
A) a nucleotide sequence encoding the AIM II polypeptide having the complete amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97689; (d) a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the AIM II polypeptide; A nucleotide sequence encoding a polypeptide transmembrane domain; (f) a nucleotide sequence encoding an AIM II polypeptide intracellular domain; (g) a soluble AIM II having extracellular and intracellular domains but lacking the transmembrane domain. A nucleotide sequence encoding a polypeptide; and (h) (a), (b), (c), (d), (e), (f) as described above.
Or (g) is a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences therein.

【００４７】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも、
例えば、９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そ
のポリヌクレオチド配列が、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコードする参照ヌクレ
オチド配列の各１００ヌクレオチド毎に５つまでの点変異を含み得ることを除い
て、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを意
図する。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一の
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列において５
％までのヌクレオチドが、欠失されるかもしくは別のヌクレオチドで置換され得
、または参照配列における総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参
照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５
’末端位置もしくは３’末端位置で、または参照配列のヌクレオチド間で個々に
、もしくは参照配列内で１つ以上の隣接した基においてのいずれかで散在して、
これらの末端位置の間のどこかで起こり得る。The reference nucleotide sequence encoding the AIM II polypeptide may have at least
For example, a polynucleotide having a 95% "identical" nucleotide sequence means that the polynucleotide sequence can contain up to 5 point mutations for every 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence encoding the AIM II polypeptide. Except, the nucleotide sequence of the polynucleotide is intended to be identical to the reference sequence. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to the reference nucleotide sequence, 5
Up to% of the nucleotides can be deleted or replaced with another nucleotide, or as many as 5% of the total nucleotides in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These mutations in the reference sequence correspond to 5
At the 'terminal or 3' terminal positions, or interspersed either individually between nucleotides of the reference sequence or at one or more adjacent groups within the reference sequence,
It can occur anywhere between these terminal positions.

【００４８】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１ＡおよびＢに示され
るヌクレオチド配列、または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に
対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従
来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ
（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４
８２−４８９（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列
間の相同性が最も良いセグメントを見出す。特定の配列が、本発明による参照配
列に、例えば、９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔま
たは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のことなが
ら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され
、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップ
が許容されるようにパラメーターが設定される。As a practical matter, any particular nucleic acid molecule may be at least 90%, 95%, 96%, at least 90%, relative to the nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B, or the nucleotide sequence of a deposited cDNA clone. Whether 97%, 98%, or 99% identical is determined by the Bestfit program (Wisconsin Seq
uence Analysis Package, Version 8 for Unix, G
Enetics Computer Group, University Re
search Park, 575 Science Drive, Madiso
n, WI 53711) can be determined conventionally using known computer programs. Bestfit is Smith and Waterman
(Advances in Applied Materials 2: 4
82-489 (1981)) to find the segment with the best homology between the two sequences. When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence according to the present invention, the percentage of identity will, of course, be determined. Is calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence, and parameters are set to allow for gaps in homology up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence.

【００４９】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列は、ポリヌクレオチド配列がＡＩＭ ＩＩポリぺプチドをコードす
る参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み
得ることを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、
参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが、別の
ヌクレオチドで欠失または置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチド
の５％までの多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合わせ（ｑ
ｕｅｒｙ）配列は、表１Ａおよび表１Ｂに示される配列全体、ＯＲＦ（オープン
リーディングフレーム）、または本明細書中で記載されるように特定される任意
のフラグメントであり得る。By a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% “identical” to a reference nucleotide sequence of the present invention, the nucleotide sequence of the polynucleotide is a reference nucleotide whose polynucleotide sequence encodes an AIM II polypeptide. It is intended to be identical to a reference sequence except that it can contain up to 5 point mutations for each 100 nucleotides of the sequence. In other words,
To obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to a reference nucleotide sequence, up to 5% of the nucleotides of the reference sequence can be deleted or substituted with another nucleotide, or As many as 5% of the nucleotides can be inserted into the reference sequence. Inquiry (q
The uery) sequence can be the entire sequence shown in Table 1A and Table 1B, the ORF (open reading frame), or any fragment identified as described herein.

【００５０】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来通りに決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最
も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた言及される）を決定す
るための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ
．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコン
ピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ
配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵからＴ
に変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性
パーセントで示される。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳ
ＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉ
ｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ
＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。In practice, is any particular nucleic acid molecule or polypeptide at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to a nucleotide sequence of the present invention? No can be determined conventionally using known computer programs. A preferred method for determining the best overall match (also referred to as an overall sequence alignment) between a query sequence (a sequence of the invention) and a subject sequence is described in Brutlag et al. (Comp. App.Biosci
. 6: 237-245 (1990)). In sequence alignment, the query and subject sequences are both DNA sequences. RNA sequence from U to T
Can be compared. The result of this global sequence alignment is expressed as percent identity. FAS of DNA sequence to calculate percent identity
The preferred parameters used in the TDB alignment are: Matrix = Uni
tarry, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1, Jo
ining Penalty = 30, Randomization Group
Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty
= 5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size
= 500 or the length of the nucleotide sequence of interest (whichever is shorter).

【００５１】 対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上記のＦ
ＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントから差し引かれ、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列していない、対象配列の５’および３’塩基の外側の
塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。If the subject sequence is shorter than the query sequence due to a 5 ′ or 3 ′ deletion (rather than due to an internal deletion), a manual correction must be made to the result. This is because the FASTDB program does not take into account 5 'and 3' truncations of the subject sequence when calculating percent identity. For a subject sequence truncated at the 5 'end or 3' end, the percent identity to the query sequence is the query sequence, which is 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned as a percentage of the total bases of the query sequence. Is corrected by calculating the number of bases Whether nucleotides are matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then calculated using the above parameters using the specified parameters.
Subtracted from the percent identity calculated by the ASTDB program to arrive at the final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of the present invention. Only those bases outside of the 5 'and 3' bases of the subject sequence that are not matched / aligned with the query sequence, as indicated by FASTDB alignment, are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score.

【００５２】 例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失が対象配列の５’末端で生じ、従って、
ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端で最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０
個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’末端および３’末端での
塩基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる
。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％
である。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わせ配列と比
較される。今度は、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない塩基は、対象配列の５’側または３’側に存在しない。この場合、ＦＡ
ＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問
い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’側または３’側の塩基のみが手
動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的ではなされない。For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base query sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, thus
FASTDB alignment shows no match / alignment of the first 10 bases at the 5 'end. 10
Unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at the unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the query sequence), so that 10%
It is subtracted from the percent identity score calculated by the DB program. If the remaining 90 bases match exactly, the final percent identity is 90%
It is. In another example, a 90 base subject sequence is compared to a 100 base query sequence. This time, the deletion is an internal deletion, so that no bases that do not match / align with the query are 5 'or 3' to the subject sequence. In this case, FA
The percent identity calculated by the STDB is not manually corrected. Again, only the 5 'or 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the query sequence are manually corrected. Other manual corrections are not made for the purposes of the present invention.

【００５３】 本出願は、ＡＩＭ ＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係
なく、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示される核酸配列、または寄託された
ｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一である核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がＡＩＭ Ｉ
Ｉ活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を
どのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使用するかをなお知っているからであ
る。ＡＩＭ ＩＩ活性を有するポリペプチドをコードしない、本発明の核酸分子
の使用には、とりわけ、（１）ｃＤＮＡライブラリーにおけるＡＩＭ ＩＩ遺伝
子またはその対立遺伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）
に記載のような、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の正確な染色***置を提供するための***
中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「Ｆ
ＩＳＨ」）；および（３）特定の組織におけるＡＩＭ ＩＩ ｍＲＮＡの発現を
検出するためのノーザンブロット分析、が含まれる。The present application relates to at least 90% of the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1), or the deposited cDNA, whether or not it encodes a polypeptide having AIM II activity. %, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. This is because a specific nucleic acid molecule is AIM I
Even if they do not encode a polypeptide having I activity, the person skilled in the art still knows how to use the nucleic acid molecule, for example, as a hybridization probe, or as a primer in the polymerase chain reaction (PCR). It is. Uses of the nucleic acid molecules of the invention that do not encode a polypeptide having AIM II activity include, among others, (1) isolating the AIM II gene or allelic variant thereof in a cDNA library; (2) Verma et al. , Huma
n Chromosomes: A Manual of Basic Tech
niques, Pergamon Press, New York (1988)
In situ hybridization to metaphase chromosomal spreads to provide the precise chromosomal location of the AIM II gene, as described in
ISH "); and (3) Northern blot analysis to detect expression of AIM II mRNA in specific tissues.

【００５４】 しかし、図１ＡおよびＢ（配列番号１）に示される核酸配列、または実際にＡ
ＩＭ ＩＩタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする寄託されたｃＤＮ
Ａの核酸配列に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または
９９％同一な配列を有する核酸分子が好ましい。「ＡＩＭ ＩＩ活性を有するポ
リペプチド」によって、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、本発
明のＡＩＭ ＩＩタンパク質の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない、活
性を示すポリペプチドが意図される。例えば、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の細胞傷
害性活性は、Ｚａｒｒｅｓら，Ｃｅｌｌ ７０：３１−４６（１９９２）により
記載されるようなアポトーシスを示すためのプロピジウムヨーダイド（ｐｒｏｐ
ｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）染色を用いて測定され得る。あるいは、ＡＩＭ Ｉ
Ｉ誘導性アポトーシスはまた、Ｇａｖｉｅｒｌｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１１９：４９３−５０１（１９９２）により記載されるようなＴＵＮＥＬ染色を
用いて測定され得る。However, the nucleic acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1), or
Deposited cDN encoding a polypeptide having IM II protein activity
A nucleic acid molecule having a sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the nucleic acid sequence of A is preferred. By "polypeptide having AIM II activity" is intended a polypeptide that exhibits an activity that is similar, but not necessarily identical, to the activity of an AIM II protein of the invention as measured in a particular biological assay. You. For example, the cytotoxic activity of the AIM II protein can be measured by propidium iodide (prop) to show apoptosis as described by Zarres et al., Cell 70: 31-46 (1992).
(iodium iodide) staining. Alternatively, AIM I
I-induced apoptosis is also described in Gavierli et al. Cell. Biol.
119: 493-501 (1992) can be measured using TUNEL staining.

【００５５】 手短には、プロピジウムヨーダイド染色を以下の通りに実施する。組織または
培養物のいずれかに由来の細胞を、ホルムアルデヒド中で固定し、凍結切片に切
断し、そしてプロピジウムヨーダイドで染色する。細胞核は、共焦点蛍光顕微鏡
法を用いてプロピジウムヨーダイドにより可視化される。細胞死は、核濃縮核（
染色体凝集、収縮および／または核の断片化）により示される。Briefly, propidium iodide staining is performed as follows. Cells from either tissue or culture are fixed in formaldehyde, cut into frozen sections and stained with propidium iodide. Cell nuclei are visualized with propidium iodide using confocal fluorescence microscopy. Cell death is caused by pyknotic nuclei (
Chromosome aggregation, shrinkage and / or nuclear fragmentation).

【００５６】 もちろん、遺伝コードの縮重のために、当業者は、寄託されたｃＤＮＡの核酸
配列、または図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示される核酸配列に少なくとも
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有す
る多数の核酸分子が「ＡＩＭ ＩＩタンパク質活性を有する」ポリペプチドをコ
ードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改変
体の全てが同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記の比較アッセ
イを行うことすらなく、当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核
酸分子について、妥当な数がまたＡＩＭ ＩＩタンパク質活性を有するポリペプ
チドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、当業者が、タ
ンパク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、またはその可能性がないかの
いずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の第二の脂肪族アミノ
酸での置換）を十分に知っているからである。Of course, due to the degeneracy of the genetic code, those skilled in the art will recognize that the nucleic acid sequence of the deposited cDNA, or the nucleic acid sequence shown in FIGS. It is immediately recognized that a number of nucleic acid molecules having sequences that are%, 97%, 98%, or 99% identical encode polypeptides that "have AIM II protein activity." Indeed, this is apparent to the skilled artisan, since even all of the degenerate variants of these nucleotide sequences encode the same polypeptide, even without performing the above-described comparative assays. For such nucleic acid molecules that are not degenerate variants, it is further recognized in the art that a reasonable number also encodes a polypeptide having AIM II protein activity. This is because one of skill in the art will recognize that either amino acid substitutions that are unlikely or unlikely to significantly affect the function of the protein (eg, one aliphatic amino acid with a second aliphatic amino acid) Replacement).

【００５７】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をいかにして行うかに関するガ
イダンスが、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍ
ｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃ
ｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで筆者
らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを示している
。For example, guidance on how to make phenotypically silent amino acid substitutions can be found in Bowie, J. et al. U. Et al., "Deciphering the M
message in Protein Sequences: Toleranc
e to Amino Acid Substitutions ", Science
ce 247: 1306-1310 (1990), where we show that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions.

【００５８】 （ＡＩＭ ＩＩ「ノックアウト」および相同組換え） 内因性遺伝子発現はまた、その遺伝子および／またはそのプロモーターを、標
的化された相同組換えを用いて不活化または「ノックアウト」することにより低
減され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２
３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５
０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２
１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中にその全体が参考と
して援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（その遺伝子のコード
領域または調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡと隣接した、本発明の変異体の
非機能的なポリヌクレオチド（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を用いて、選
択マーカーおよび／または陰性の選択マーカーを伴って、または伴わずに、本発
明のポリペプチドをインビボで発現する細胞をトランスフェクトし得る。別の実
施態様では、当該分野で公知の技術を用いて、目的の遺伝子を含むがこの遺伝子
を発現しない細胞においてノックアウトを生じる。標的化された相同組換えを介
する、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活化を生じる。この
ようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変を用いて、不活性な標的化された
遺伝子を有する動物の子孫を作製し得る調査および農業分野において特に好適で
ある（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７ならびにＴｈｏ
ｍｐｓｏｎ １９８９，前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは、ヒト
における使用のために慣用的に適合させ得る。ただし、組換えＤＮＡ構築物は、
当業者に明らかである適切なウイルスベクターを用いて、必要とされる部位へイ
ンビボで直接投与されるかまたは標的化される。この段落において引用した文献
の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。AIM II “knockout” and homologous recombination Endogenous gene expression is also reduced by inactivating or “knocking out” the gene and / or its promoter using targeted homologous recombination. (Eg, Smithies et al., Nature 317: 230-2).
34 (1985); Thomas and Capecchi, Cell 51: 5.
03-512 (1987); Thompson et al., Cell 5: 313-32.
1 (1989); each of which is incorporated herein by reference in its entirety). For example, a variant non-functional polynucleotide of the invention (or a completely unrelated DNA sequence) flanked by DNA homologous to an endogenous polynucleotide sequence (either the coding or regulatory region of the gene). Can be used to transfect cells expressing a polypeptide of the invention in vivo, with or without a selectable marker and / or a negative selectable marker. In another embodiment, knockout occurs in cells containing the gene of interest but not expressing the gene using techniques known in the art. Insertion of this DNA construct via targeted homologous recombination results in inactivation of the targeted gene. Such an approach is particularly suitable in the research and agricultural fields where modifications to embryonic stem cells can be used to produce the offspring of animals with inactive targeted genes (eg, Thomas and Capecchi 1987 and Thoma).
mpson 1989, supra). However, this approach can be routinely adapted for use in humans. However, the recombinant DNA construct is
It is directly administered or targeted in vivo to the required site in vivo using an appropriate viral vector which will be apparent to the skilled person. The contents of each of the references cited in this paragraph are incorporated herein by reference in their entirety.

【００５９】 本発明のさらなる実施態様では、本発明のポリペプチドを発現するように遺伝
子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように（例えば
、ノックアウトするために）遺伝子操作される細胞は、患者にインビボで投与さ
れる。このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣが適
合性のドナーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リ
ンパ球）、脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るがこれらに限定されない
。この細胞は、例えば、（ウイルスベクター、そして好ましくは導入遺伝子を細
胞ゲノムに組み込むベクターを用いる）形質導入またはトランスフェクション手
順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リ
ポソームなどの使用を含むがこれらに限定されない）によって、組換えＤＮＡ技
術を用いてインビトロで遺伝子操作されて、本発明のポリペプチドのコード配列
を細胞に導入するか、あるいは本発明のポリペプチドと結合したコード配列およ
び／または内因性調節配列を破壊する。本発明のポリペプチドのコード配列は、
強力な構成性または誘導性のプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの
制御下に置かれて、発現、そして好ましくは本発明のポリペプチドの分泌を達成
し得る。本発明のポリペプチドを発現する、そして好ましくは分泌する、操作さ
れた細胞は、例えば、循環中に全身的に、または腹腔内に患者に導入され得る。
あるいは、細胞は、マトリックス中に取り込まれ、そして体内に移植され得る。
例えば、遺伝子操作された線維芽細胞は、皮膚移植片の一部として移植され得る
；遺伝子操作された内皮細胞は、リンパまたは血管の移植片の一部として移植さ
れ得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；なら
びにＭｕｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を
参照のこと（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）
）。In a further embodiment of the present invention, a cell is engineered to express a polypeptide of the invention, or is genetically engineered to not express (eg, knock out) a polypeptide of the invention. The cells are administered to the patient in vivo. Such cells can be obtained from patients (ie, animals including humans) or MHC-compatible donors, and contain fibroblasts, bone marrow cells, blood cells (eg, lymphocytes), adipocytes, muscle cells, endothelium It may include, but is not limited to, cells. The cells can be transformed, for example, using a transduction or transfection procedure (using a viral vector, and preferably a vector that integrates the transgene into the cell genome) (plasmids, cosmids, YACs, naked DNA, electroporation, liposomes, etc.). Including, but not limited to, introducing a coding sequence for a polypeptide of the present invention into cells by genetic manipulation in vitro using recombinant DNA techniques, or a coding sequence linked to a polypeptide of the present invention. And / or destroy endogenous regulatory sequences. The coding sequence of the polypeptide of the invention is:
It may be under the control of a strong constitutive or inducible promoter or promoter / enhancer to achieve expression and, preferably, secretion of a polypeptide of the invention. Engineered cells that express and preferably secrete a polypeptide of the present invention can be introduced into a patient, for example, systemically in the circulation or intraperitoneally.
Alternatively, cells can be taken up in a matrix and implanted into the body.
For example, engineered fibroblasts can be implanted as part of a skin graft; engineered endothelial cells can be implanted as part of a lymphatic or vascular graft (eg, Anderson et al., US And U.S. Patent No. 5,460,959; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
).

【００６０】 投与されるべき細胞が非自己細胞またはＭＨＣ不適合細胞である場合、これら
は、導入された細胞に対する宿主の免疫応答の発生を防止する周知の技術を用い
て投与され得る。例えば、細胞は、隣接した細胞外環境との成分の交換は可能に
するが、導入された細胞が宿主の免疫系により認識されることは可能にしないカ
プセル化された形態で導入され得る。If the cells to be administered are non-autologous or MHC-incompatible cells, they can be administered using well-known techniques that prevent the development of a host immune response against the introduced cells. For example, cells can be introduced in an encapsulated form that allows for the exchange of components with the adjacent extracellular environment, but does not allow the introduced cells to be recognized by the host immune system.

【００６１】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、組換えベクタ
ーで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドまたはそのフラグメントの産生に関する。Vectors and Host Cells The present invention also relates to vectors containing the isolated DNA molecules of the present invention, host cells genetically engineered with recombinant vectors, and recombinantly produced AIM II polypeptides or fragments thereof. For the production of

【００６２】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに連結され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電した脂質との複合体中で導入される。ベクター
がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。The polynucleotide may be ligated to a vector containing a selectable marker for propagation in a host. Generally, a plasmid vector is introduced in a precipitate, such as a calcium phosphate precipitate, or in a complex with a charged lipid. If the vector is a virus, the vector can be packaged in vitro using a suitable packaging cell line and then transduced into host cells.

【００６３】 ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（少数の例を挙げれば、例えば、λ
ファージのＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプ
ロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬ
ＴＲのプロモーター）に、作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモ
ーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写の開始、終結に関する部位
、および転写された領域中に、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。
この構築物により発現された成熟転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳さ
れるポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを、そして翻訳されるポリペプチドの
末端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。The DNA insert may comprise a suitable promoter (eg, λ
Phage PL promoter, E. coli. E. coli lac, trp, and tac promoters, SV40 early and late promoters, and retrovirus L
TR promoter). Other suitable promoters are known to those skilled in the art. The expression constructs further include sites for transcription initiation, termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation.
The coding portion of the mature transcript expressed by this construct preferably has a translation initiation codon at the beginning of the translated polypeptide and a stop codon (UAA, UGA) appropriately positioned at the end of the translated polypeptide. , Or UAG).

【００６４】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーは、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元
酵素またはネオマイシン耐性ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中で培養する
ためのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切
な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真
菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２
およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯ
Ｓ、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；および植物細胞が挙げられるが、これらに
限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野
で公知である。As indicated, the expression vectors preferably include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and E. coli. Includes a tetracycline resistance gene or an ampicillin resistance gene for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli, Strept).
omyces and Salmonella typhimurium cells); fungal cells (eg, yeast cells); insect cells (eg, Drosophila S2)
And Spodoptera Sf9 cells); animal cells (eg, CHO, CO
S, and Bowes melanoma cells); and plant cells. Suitable culture media and conditions for the above-described host cells are known in the art.

【００６５】 本発明の実施における発現ベクターの使用に加え、本発明は、目的のタンパク
質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたオペレーターエレメン
トおよびプロモーターエレメントを含む、新規な発現ベクターをさらに含む。こ
のようなベクターの１つの例は、以下に詳細に記載されるｐＨＥ４−５である。In addition to using expression vectors in the practice of the present invention, the present invention further includes novel expression vectors that include an operator element and a promoter element operably linked to a nucleotide sequence encoding a protein of interest. One example of such a vector is pHE4-5, described in detail below.

【００６６】 図１０および図１１に要約されるように、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号５
０）の構成要素は、以下を含む：１）選択マーカーとしてネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモ
ーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配
列、６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製起点（ｏ
ｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）由来であ
る。このプロモーター配列およびオペレーター配列は、合成により作製された。
核酸配列の合成調製は、当該分野で周知である。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ９５／９６
Ｃａｔａｌｏｇ、２１５〜２１６頁、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、１０２０ Ｅａｓｔ
Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、９４３０３。ＡＩ
ＭＩＩをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、ｐＨＥ４−５ベクター
のＮｄｅＩ部位とＡｓｐ７１８部位との間にこのヌクレオチド配列を挿入するこ
とにより、これらのプロモーターおよびオペレーターに作動可能に連結される。As summarized in FIGS. 10 and 11, the pHE4-5 vector (SEQ ID NO: 5)
The components of 0) include: 1) the neomycin phosphotransferase gene as a selectable marker, 2) E. coli. E. coli origin of replication, 3) T5 phage promoter sequence, 4) two lac operator sequences, 5) Shine-Dalgarno sequence, 6) lactose operon repressor gene (lacIq). Replication origin (o
riC) is derived from pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD). The promoter sequence and the operator sequence were produced synthetically.
Synthetic preparation of nucleic acid sequences is well known in the art. CLONTECH 95/96
Catalog, 215-216, CLONTECH, 1020 East
Meadow Circle, Palo Alto, CA, 94303. AI
The nucleotide sequence encoding MII (SEQ ID NO: 1) is operably linked to these promoters and operators by inserting this nucleotide sequence between the NdeI and Asp718 sites of the pHE4-5 vector.

【００６７】 上述のように、ｐＨＥ４−５ベクターは、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む。ｌａｃＩ
ｑは、ｌａｃＩ遺伝子の対立遺伝子であり、ｌａｃオペレーターの強固な調節を
付与する。Ａｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１〜３１５（１９８８）
；Ｓｔａｒｋ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ ５１：２５５〜２６７（１９８７）。ｌａｃＩ
ｑ遺伝子は、ｌａｃオペレーター配列に結合し、そして下流（すなわち、３’側
の）配列の転写を阻止する、リプレッサータンパク質をコードする。しかし、ｌ
ａｃＩｑ遺伝子産物は、ラクトースまたは特定のラクトースアナログ（例えば、
イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））のいずれかの存在
下で、ｌａｃオペレーターから解離する。従って、ＡＩＭ ＩＩは、ｐＨＥ４−
５ベクターを含む非誘導宿主細胞において、感知可能な量で産生されない。しか
し、ＩＰＴＧのような薬剤の添加によるこれらの宿主細胞の誘導は、ＡＩＭ Ｉ
Ｉコード配列の発現を生じる。As mentioned above, the pHE4-5 vector contains the lacIq gene. lacI
q is an allele of the lacI gene and confers tight regulation of the lac operator. Amann, E .; Et al., Gene 69: 301-315 (1988).
Stark, M .; Gene 51: 255-267 (1987). lacI
The q gene encodes a repressor protein that binds to the lac operator sequence and blocks transcription of downstream (ie, 3 ′) sequences. However, l
The acIq gene product can be lactose or a specific lactose analog (eg,
Dissociates from the lac operator in the presence of any of isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Thus, AIM II has pHE4-
Not produced in appreciable amounts in non-induced host cells containing the 5 vector. However, the induction of these host cells by the addition of agents such as IPTG,
This results in expression of the I coding sequence.

【００６８】 ｐＨＥ４−５ベクターのプロモーター／オペレーター配列（配列番号５１）は
、１つのＴ５ファージプロモーターおよび２つのｌａｃオペレーター配列を含む
。一方のオペレーターは、転写開始部位の５’側に位置し、そして他方は、同部
位の３’側に位置する。これらのオペレーターは、ｌａｃＩｑ遺伝子産物と組合
せて存在する場合、ｌａｃオペロンインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ）の非存
在下での、下流配列の強固な抑制を与える。このｌａｃオペレーターから下流に
位置する作動可能に連結された配列の発現は、ｌａｃオペロンインデューサー（
例えば、ＩＰＴＧ）の添加により誘導され得る。ｌａｃＩｑタンパク質へのｌａ
ｃインデューサーの結合は、ｌａｃオペレーター配列からのそれらの解放、およ
び作動可能に連結された配列の転写の開始を生じる。遺伝子発現のｌａｃオペロ
ン調節は、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｔ．、ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ ＷＩＴＨ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳ、第４版（１
９９７）、８０２〜８０７頁に概説される。The promoter / operator sequence of the pHE4-5 vector (SEQ ID NO: 51) contains one T5 phage promoter and two lac operator sequences. One operator is located 5 'to the transcription start site, and the other is located 3' to the same site. These operators, when present in combination with the lacIq gene product, provide robust repression of downstream sequences in the absence of a lac operon inducer (eg, IPTG). Expression of the operably linked sequence located downstream from the lac operator is determined by the lac operon inducer (
For example, it can be induced by the addition of IPTG). la to lacIq protein
Binding of the c inducers results in their release from the lac operator sequence and the initiation of transcription of the operably linked sequence. The lac operon regulation of gene expression is described in Devlin, T .; , TEXTBOOK OF BIOCHEMIS
TRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 4th edition (1
997), pp. 802-807.

【００６９】 ｐＨＥ４シリーズのベクターは、ＡＩＭ ＩＩコード配列を除くｐＨＥ４−５
ベクターの全ての構成要素を含む。ｐＨＥ４ベクターの特徴は、最適化された合
成Ｔ５ファージプロモーター、ｌａｃオペレーター、およびシャイン−ダルガー
ノ配列を含む。さらに、これらの配列はまた、最適に間隔を空けられ、その結果
、挿入された遺伝子の発現は強固に調節され得、そして高レベルの発現が誘導に
際して生じる。The pHE4 series of vectors is pHE4-5 excluding the AIM II coding sequence.
Includes all components of the vector. Features of the pHE4 vector include an optimized synthetic T5 phage promoter, a lac operator, and a Shine-Dalgarno sequence. In addition, these sequences are also optimally spaced so that expression of the inserted gene can be tightly regulated and high levels of expression occur upon induction.

【００７０】 本発明のタンパク質の生成における使用に適切な公知の細菌性プロモーターの
中には、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７
プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λ ＰＲおよびＰＬプロモーター、ならび
にｔｒｐプロモーターを含む。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前
初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ
４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫
ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲのプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロ
モーター（例えば、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター）が挙げられる。Among the known bacterial promoters suitable for use in producing the proteins of the present invention are E. coli. E. coli lacI and lacZ promoters, T3 and T7
Includes promoters, gpt promoters, λ PR and PL promoters, and trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include CMV immediate early promoter, HSV thymidine kinase promoter, early and late SV
40 promoter, the promoter of the retroviral LTR (eg, the promoter of the Rous sarcoma virus (RSV) LTR), and the metallothionein promoter (eg, the mouse metallothionein-I promoter).

【００７１】 ｐＨＥ４−５ベクターはまた、ＡＵＧ開始コドンの５’側にシャイン−ダルガ
ーノ配列を含む。シャイン−ダルガーノ配列は、一般に、ＡＵＧ開始コドンから
約１０ヌクレオチド上流（すなわち、５’側）に位置する短い配列である。これ
らの配列は、本質的には、原核生物リボソームを、ＡＵＧ開始コドンに導く。The pHE4-5 vector also contains a Shine-Dalgarno sequence 5 ′ to the AUG start codon. A Shine-Dalgarno sequence is generally a short sequence located about 10 nucleotides upstream (ie, 5 ') from the AUG start codon. These sequences essentially direct the prokaryotic ribosome to the AUG start codon.

【００７２】 従って、本発明はまた、本発明のタンパク質の産生に有用な発現ベクターに関
する。本発明のこの局面は、ｐＨＥ４−５ベクター（配列番号５０）に例示され
る。Accordingly, the present invention also relates to an expression vector useful for producing the protein of the present invention. This aspect of the invention is exemplified by the pHE4-5 vector (SEQ ID NO: 50).

【００７３】 細菌における使用に好ましいベクター中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０および
ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、
ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびに
ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩ
Ｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。好ましい真核生物ベク
ターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐ
ＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切
なベクターは、当業者には容易に明白である。Among the preferred vectors for use in bacteria are pQE70, pQE60 and pQE-9 (available from Qiagen); pBS vector, Phagecr
ipt vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16a,
pNH18A, pNH46A (available from Stratagene); and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRI
T5 (available from Pharmacia). Among preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and p
SG (available from Stratagene); and pSVK3, pBPV,
There are pMSG and pSVL (available from Pharmacia). Other suitable vectors will be readily apparent to one skilled in the art.

【００７４】 宿主細胞へのこの構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トラン
スフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によ
り、もたらされ得る。このような方法は、多くの標準実験室マニュアル（例えば
、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載される。The introduction of this construct into a host cell can include calcium phosphate transfection,
It can be provided by DEAE-dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals (eg, Davis et al., Basic Methods In Molecular B.
ology (1986)).

【００７５】 ポリペプチドは、改変形態（例えば、融合タンパク質）で発現され得、そして
分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域も含み得る。例えば、さらな
るアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加されて
、精製の間の、または続く操作および貯蔵の間の、宿主細胞での安定性および持
続性を改良し得る。また、ペプチド部分がこのポリペプチドに付加されて、精製
を容易にし得る。このような領域は、このポリペプチドの最終的調製の前に除去
され得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こすため、安定性を改良するため
、そして精製を容易にするための、ポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当
該分野でよく知られており、かつ日常的技術である。好ましい融合タンパク質は
、タンパク質を可溶化するために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。
例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ第４６４５３３号（カナダの対応特許番号第２０４５８６
９号）は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を、別のヒトタンパク質
またはその部分と共に含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融
合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断での使用に徹底的に有利であり、従
って、例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じる（ＥＰ−Ａ第０２３２２
６２号）。一方、いくつかの使用のために、記載された有利な様式で、融合タン
パク質が発現され、検出され、そして精製された後、Ｆｃ部分を欠失し得ること
が、望ましい。これは、例えば、融合タンパク質が、免疫化のための抗原として
使用される時に、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に対する障害である
ことを示す場合である。薬物送達において、例えば、ヒトタンパク質（例えば、
ｈＩＬ５−レセプター）が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処
理能スクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃ部分と融合されてきた。Ｄ．
Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎ
ｉｔｉｏｎ、第８巻：５２〜５８（１９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
第２７０巻、第１６号：９４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと。The polypeptide may be expressed in a modified form (eg, a fusion protein) and may include not only secretion signals but also additional heterologous functional regions. For example, regions of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell during purification or during subsequent manipulation and storage. . Also, a peptide moiety may be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides, among other things, to cause secretion or elimination, to improve stability, and to facilitate purification, is a well known and routine technique in the art. . Preferred fusion proteins contain heterologous regions from immunoglobulins useful for solubilizing the protein.
For example, EP-A-O 465 533 (Canadian corresponding patent no. 204586)
No. 9) discloses fusion proteins comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule together with another human protein or portion thereof. In many cases, the Fc portion of the fusion protein is drastically advantageous for use in therapy and diagnostics, thus resulting in, for example, improved pharmacokinetic properties (EP-A-02322).
No. 62). On the other hand, for some uses it is desirable to be able to delete the Fc part after the fusion protein has been expressed, detected and purified in the advantageous manner described. This is the case, for example, when the fusion protein is used as an antigen for immunization, indicating that the Fc portion is an obstacle to its use in therapy and diagnosis. In drug delivery, for example, human proteins (eg,
hIL5-receptor) has been fused to the Fc portion for the purpose of high-throughput screening assays to identify antagonists of hIL-5. D.
Bennett et al., Journal of Molecular Recognition.
ition, 8: 52-58 (1995) and K.I. Johanson et al.
The Journal of Biological Chemistry,
270, 16: 9459-9471 (1995).

【００７６】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質は、組換え細胞培養物から、周知の方法（硫酸アンモ
ニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーま
たはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
む）により、回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラ
フィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製のために使用される。本発明のポリペプチドは
、天然に精製された産物、化学的合成手順の産物、および組換え技術により原核
生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺
乳動物細胞を含む）から産生された産物を含む。組換え産生手順で使用された宿
主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリ
コシル化され得ない。さらに、本発明のポリペプチドはまた、最初の改変メチオ
ニン残基を、いくつかの場合に、宿主に媒介されたプロセスの結果として含む。The AIM II protein can be obtained from recombinant cell culture by known methods (ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography,
(Including hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography). Most preferably, high performance liquid chromatography ("HPLC") is used for purification. The polypeptides of the present invention can be obtained from naturally purified products, products of chemical synthetic procedures, and recombinant or prokaryotic or eukaryotic hosts, such as bacteria, yeast, higher plants, insects, and mammalian cells. ). Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides of the invention may or may not be glycosylated. In addition, the polypeptides of the present invention also include an initial modified methionine residue, in some cases as a result of a host-mediated process.

【００７７】 本明細書中で議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含するのに加えて
、本発明はまた、内因性遺伝物質（例えば、ＡＩＭ ＩＩコード配列）を欠失ま
たは置換するように操作された脊椎動物起源（特に哺乳動物起源）の１次、２次
、および不死化宿主細胞、ならびに／あるいは本発明のＡＩＭ ＩＩポリヌクレ
オチドと作動可能に結合され、かつ内因性ＡＩＭ ＩＩポリヌクレオチドを活性
化、変化、および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配
列）を含むように操作された脊椎動物起源（特に哺乳動物起源）の１次、２次、
および不死化宿主細胞を包含する。例えば、当該分野で公知の技術を使用して、
異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と内因性Ａ
ＩＭ ＩＩポリヌクレオチド配列を相同組換えを介して作動可能に結合するため
に使用し得る（例えば、１９９７年６月２４日発行の米国特許第５，６４１，６
７０号；１９９６年９月２６日公開の国際公開ＷＯ ９６／２９４１１号；１９
９４年８月４日公開の国際公開ＷＯ ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５〜４３８
（１９８９）を参照のこと。これらの各々の開示は、全体が参考として援用され
る）。In addition to including host cells containing the vector constructs discussed herein, the present invention also provides for deleting or replacing endogenous genetic material (eg, AIM II coding sequence). Primary, secondary, and immortalized host cells of engineered vertebrate origin, particularly mammalian origin, and / or endogenous AIM II polynucleotides operably linked to AIM II polynucleotides of the invention. Primary, secondary, of vertebrate origin (particularly mammalian origin) engineered to contain genetic material that activates, alters, and / or amplifies (eg, heterologous polynucleotide sequences).
And immortalized host cells. For example, using techniques known in the art,
Heterologous control regions (eg, promoters and / or enhancers) and endogenous A
IM II polynucleotide sequences can be used to operably link via homologous recombination (eg, US Pat. No. 5,641,6, issued June 24, 1997).
No. 70; International Publication WO 96/29411 published on September 26, 1996; 19
International Publication WO 94/12650 published August 4, 1994; Koller et al., P.
rc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1
989); and Zijlstra et al., Nature 342: 435-438.
(1989). The disclosure of each of these is incorporated by reference in its entirety).

【００７８】 （トランスジェニック非ヒト動物） 本発明のポリペプチドは、トランスジェニック動物においてもまた、発現され
得る。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブ
タ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ―ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシおよび非ヒト
霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むが、これらに限定さ
れない）を使用して、トランスジェニック動物を作製し得る。特定の実施態様に
おいて、本明細書中に記載される技術またはさもなければ当該分野で公知の技術
を使用して、ヒトにおいて、遺伝子療法プロトコルの一部として、本発明のポリ
ペプチドを発現する。Transgenic non-human animals The polypeptides of the present invention can also be expressed in transgenic animals. Including animals of any species (mouse, rat, rabbit, hamster, guinea pig, pig, micro-pig, goat, sheep, cow and non-human primates (eg, baboon, monkey, and chimpanzee) Without limitation, transgenic animals can be produced. In certain embodiments, the polypeptides of the invention are expressed in humans as part of a gene therapy protocol using the techniques described herein or otherwise known in the art.

【００７９】 当該分野で公知の任意の技術を使用して、動物中に導入遺伝子（すなわち、本
発明のポリヌクレオチド）を導入して、トランスジェニック動物の創始系統（ｆ
ｏｕｎｄｅｒ−ｌｉｎｅ）を作製し得る。このような技術には、前核マイクロイ
ンジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１〜６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ） １１：１２６３〜１２７０（１９９３）；Ｗｒ
ｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０〜８３４（１９９
１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；
生殖細胞系へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８２：６１４８〜６
１５２（１９８５））；胚盤胞または胚：胚性幹細胞における遺伝子ターゲッテ
ィング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３〜３２１（１９８９））
；細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．３：１８０３〜１８１４（１９８３））；遺伝子銃を使用しての本発明のポリ
ヌクレオチドの導入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４
５（１９９３）を参照のこと）；胚性多様性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細
胞への核酸構築物の導入、および胚盤胞へのこの幹細胞の戻し移入；ならびに精
子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７〜７２３
（１９８９）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の総
説として、Ｇｏｒｄｏｎ「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」Ｉｎｔｌ．
Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１〜２２９（１９８９）（本明細書中でその
全体が参考として援用される）を参照のこと。さらに、この段落中で引用される
文書各々の内容は、その全体が、参考として援用される。The transgene (ie, the polynucleotide of the present invention) can be introduced into an animal using any technique known in the art to produce a transgenic animal founder line (f
under-line). Such techniques include pronuclear microinjection (Paterson et al., Appl. Microbiol. Bio.
technology. 40: 691-698 (1994); Carver et al., Bio.
technology (NY) 11: 1263-1270 (1993); Wr
Night et al., Biotechnology (NY) 9: 830-834 (199).
1); and Hoppe et al., US Pat. No. 4,873,191 (1989));
Germline retrovirus-mediated gene transfer (Van der Putte)
n et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 82: 6148-6.
152 (1985)); Blastocysts or embryos: Gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., Cell 56: 313-321 (1989)).
Electroporation of cells or embryos (Lo, Mol Cell. Biol;
. 3: 1803-1814 (1983)); Introduction of a polynucleotide of the present invention using a gene gun (eg, Ulmer et al., Science 259: 174).
5 (1993)); introduction of the nucleic acid construct into pluripotent stem cells, and transfer of this stem cell back into blastocysts; and sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57: 717-723
(1989), but are not limited thereto. For a review of such techniques, see Gordon "Transgenic Animals" Intl.
Rev .. Cytol. 115: 171-229 (1989), which is incorporated herein by reference in its entirety. Further, the contents of each of the documents cited in this paragraph are incorporated by reference in their entirety.

【００８０】 当該分野で公知の任意の技術（例えば、静止に誘導された培養胚性細胞、胎児
細胞、または成体細胞から摘出された核の卵母細胞への核移入（Ｃａｍｐｅｌｌ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４〜６６（１９９６）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３（１９９７）（その各々が本明細書中で全体と
して参考として援用される））を使用して、本発明のポリヌクレオチドを含むト
ランスジェニッククローンを作製し得る。Any technique known in the art (eg, nuclear transfer to oocytes of nuclei isolated from quiescently-derived cultured embryonic cells, fetal cells, or adult cells (Campell)
Et al., Nature 380: 64-66 (1996); Wilmut et al., Nat.
ure 385: 810-813 (1997), each of which is incorporated herein by reference in its entirety, can be used to generate transgenic clones comprising a polynucleotide of the present invention.

【００８１】 本発明は、その全ての細胞中に導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物
、およびその細胞の全てではないが、いくつかの細胞中に導入遺伝子を保有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、
単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー、例えば、頭−頭縦列（ｈｅａｄ
−ｔｏ−ｈｅａｄ ｔａｎｄｅｍ）または頭−尾縦列（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉ
ｌ ｔａｎｄｅｍ）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２〜６２３６（１９９２））の教示に従って、特
定の細胞型に選択的に導入され、そしてその特定の細胞型において活性化され得
る。このような細胞型特異的活性に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞
型に依存し、そして当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が内因
性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが望まれる場合、遺伝子ターゲッティ
ングが好ましい。手短には、このような技術が利用される場合、内因性遺伝子と
相同的ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同組
換えを介して、その内因性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込み、そしてその機
能を破壊する目的のために設計される。導入遺伝子はまた、例えば、Ｇｕら（Ｇ
ｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３〜１０６（１９９４））の教示に従って
、特定の細胞型に選択的に導入され、それによりその細胞型のみにおいてその内
因性遺伝子を不活性化し得る。このような細胞型特異的不活性化に必要とされる
調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当業者に明らかである。この
段落中で引用される文書の各々の内容は、その全体が参考として本明細書中で援
用される。The present invention relates to transgenic animals that carry the transgene in all of their cells, and animals that carry the transgene in some, but not all, of the cells (ie, mosaic animals or chimeras). Animals). The transgene is
As a single transgene or as a concatamer, eg, head-to-head tandem (head
-To-head tandem or head-to-tail.
l tandem). The transgene is also described, for example, in Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 6232-6236 (1992)) and can be selectively introduced into and activated in a particular cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific activity will depend on the particular cell type of interest, and will be apparent to those skilled in the art. If it is desired that the polynucleotide transgene be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene, gene targeting is preferred. Briefly, when such a technique is used, a vector containing several nucleotide sequences homologous to an endogenous gene is converted to the nucleotide sequence of the endogenous gene through homologous recombination with a chromosomal sequence. Designed for the purpose of embedding and destroying its functionality. The transgene may also be, for example, Gu et al.
u et al., Science 265: 103-106 (1994)), may be selectively introduced into a particular cell type, thereby inactivating the endogenous gene only in that cell type. The regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation will depend on the particular cell type of interest, and will be apparent to those skilled in the art. The contents of each of the documents cited in this paragraph are incorporated herein by reference in their entirety.

【００８２】 一旦、トランスジェニック動物が作製されると、組換え遺伝子の発現が、標準
技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロット解
析またはＰＣＲ技術により達成され、動物組織を分析し、その導入遺伝子の組み
込みが起こったことを確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけるこの
導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルもまた、その動物から得られた組織サンプルの
ノーザンブロット解析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転
写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むが、これらに限定されない技術を使用して
評価され得る。トランスジェニック遺伝子を発現する組織のサンプルはまた、そ
の導入遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的または免疫組織化
学的に評価され得る。[0082] Once the transgenic animal is created, the expression of the recombinant gene can be assayed using standard techniques. Initial screening can be accomplished by Southern blot analysis or PCR techniques and animal tissues can be analyzed to confirm that integration of the transgene has occurred. The level of mRNA expression of this transgene in the tissue of the transgenic animal also includes, but is not limited to, Northern blot analysis, in situ hybridization analysis, and reverse transcriptase PCR (rt-PCR) of tissue samples obtained from that animal. It can be evaluated using non-limiting techniques. A sample of tissue expressing the transgenic gene can also be assessed immunocytochemically or immunohistochemically, using antibodies specific for the transgene product.

【００８３】 一旦、創始動物が作製されると、それらは、交配、同系交配、もしくは異種交
配または雑種形成されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。このような交配
ストラテジーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：分離
系統を確立するために１より多い組み込み部位での創始動物の異系交配；各導入
遺伝子の付加的発現の効果に起因してより高いレベルでその導入遺伝子を発現す
る、複合トランスジェニックを作製するための、分離系統の同系交配；発現を増
加するため、およびＤＮＡ分析による動物のスクリーニングについての必要性を
評価するための両方のために、ヘテロ接合型のトランスジェニック動物の交雑に
より、所定の組み込み部位についてホモ接合型の動物を作製すること；分離した
ホモ接合型系の交雑により、複合へテロ接合型系または複合ホモ接合型系を作製
すること；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入
遺伝子を配置するように交配すること。Once founders have been created, they can be crossed, inbred, or crossed or hybridized to produce specific animal colonies. Examples of such crossing strategies include, but are not limited to: outcrossing of founders at more than one integration site to establish an isolated lineage; additional expression of each transgene Evaluate the need for inbreeding of isolates to produce complex transgenics that express higher levels of the transgene due to effects; to increase expression and to screen animals by DNA analysis To produce a homozygous animal for a given integration site by crossing a heterozygous transgenic animal for both; Or to create a compound homozygous system; and transgenes on different backgrounds appropriate to the experimental model of interest Mating to it to place.

【００８４】 本発明のトランスジェニック動物および「ノックアウト」動物は、以下を含む
が、これらに限定されない用途を有する：ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの生物学的
機能を生成する際、異常なＡＩＭ ＩＩ発現に関連する状態および／または障害
を研究する際、そしてこのような状態および／または障害を緩和するのに有効な
化合物についてのスクリーニングの際に有用な動物モデル系。The transgenic and “knock-out” animals of the present invention have uses, including but not limited to: aberrant AIM II expression in producing a biological function of an AIM II polypeptide Animal model systems useful in studying conditions and / or disorders that occur, and in screening for compounds that are effective in alleviating such conditions and / or disorders.

【００８５】 （ＡＩＭ ＩＩポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列、または図
１ＡおよびＢのアミノ酸配列（配列番号２）、あるいは上記ポリペプチドの一部
を含むペプチドまたはポリペプチドを有する、単離されたＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドを提供する。AIM II Polypeptides and Fragments The present invention further includes the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, or the amino acid sequence of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), or a portion of the above polypeptide. Provided is an isolated AIM II polypeptide having a peptide or polypeptide.

【００８６】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列を、タンパク質の構造ま
たは機能の有意な効果を伴わずに変え得ることが、当該分野で認識される。配列
においてこのような差異を意図する場合、活性を決定するタンパク質上に重要な
領域が存在することを、考えるべきである。It is recognized in the art that some amino acid sequences of an AIM II polypeptide can be changed without significant effect on the structure or function of the protein. If such differences in sequence are contemplated, it should be considered that there are important regions on the protein that determine activity.

【００８７】 従って、本発明はさらに、実質的なＡＩＭ ＩＩポリペプチド活性を示すか、
または以下に議論されるタンパク質部分のようなＡＩＭ ＩＩタンパク質の領域
を含む、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体
は、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換を含む。上記のように、どのアミノ
酸変化が表現型的にサイレントである可能性があるかに関する指針は、Ｂｏｗｉ
ｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６〜１３１０（１９９０）に見出され得る。Accordingly, the present invention further provides a method for demonstrating substantial AIM II polypeptide activity,
Or a variation of the AIM II polypeptide that includes a region of the AIM II protein such as the protein portion discussed below. Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions. As noted above, guidance on which amino acid changes may be phenotypically silent can be found in Bowwi
e. U. Et al., "Deciphering the Message in
Protein Sequences: Tolerance to Amino
Acid Substitutions ", Science 247: 130.
6-1310 (1990).

【００８８】 従って、図１ＡおよびＢ（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下のものであり得る：（ｉ）
１つ以上（例えば、３、５、８、１０、１５、または２０）のアミノ酸残基が保
存的アミノ酸残基もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸
残基）で置換されるものであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによ
ってコードされるものであってもなくてもよい、あるいは（ｉｉ）１つ以上（例
えば、３、５、８、１０、１５、または２０）のアミノ酸残基が置換基を含むも
の、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加する
化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されてい
るもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるも
の（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドもしくはリーダー配列もしくは分泌
配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用
される配列）。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。Thus, a fragment, derivative or analog of the polypeptide of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), or a polypeptide encoded by the deposited cDNA, may be: (I)
One or more (eg, 3, 5, 8, 10, 15, or 20) amino acid residues are replaced with conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues). Wherein such replacement amino acid residues may or may not be those encoded by the genetic code, or (ii) one or more (eg, 3, 5, 8, 10, 15, or 20). A) the amino acid residue comprises a substituent, or (iii) the mature polypeptide is fused to another compound such as a compound that increases the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol); or (Iv) those in which additional amino acids are fused to the mature polypeptide (eg, an IgG Fc fusion region peptide or leader or secretory sequence, or mature polypeptide). Sequences used for the purification of peptide or proprotein sequences). Such fragments, derivatives and analogs are deemed to be within the scope of those skilled in the art from the teachings herein.

【００８９】 別の荷電アミノ酸、および中性アミノ酸または負に荷電したアミノ酸との荷電
アミノ酸の置換が、特定の目的である。後者は、減少した正の電荷を有するタン
パク質を生じて、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の特徴を改善する。凝集の防止は、非
常に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の減少を生じるだけでなく、薬学的処
方物を調製する場合に問題となり得る。なぜなら、その薬学的処方物が、免疫原
性であり得るからである。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅ
ｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ
．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０
：３０７−３７７（１９９３））。The replacement of a charged amino acid with another charged amino acid and a neutral or negatively charged amino acid is of particular interest. The latter results in a protein with a reduced positive charge and improves the characteristics of the AIM II protein. Prevention of agglomeration is highly desirable. Aggregation of proteins not only results in reduced activity, but can be problematic when preparing pharmaceutical formulations. Because the pharmaceutical formulation can be immunogenic. (Pinkard et al., Clin Exp. Immu.
nol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabete.
s 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev
. Therapeutic Drug Carrier Systems 10
: 307-377 (1993)).

【００９０】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変更し得る。
Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つ
の公知の型のＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的結合を生じる
特定の変異を記載する。従って、本発明のＡＩＭ ＩＩレセプターは、天然の変
異または人為的操作のいずれか由来の、１つ以上（例えば、３、５、８、１０、
１５、または２０）のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。[0090] Amino acid substitutions can also alter the selectivity of binding to cell surface receptors.
Ostade et al., Nature 361: 266-268 (1993) describe certain mutations that result in the selective binding of TNF-α to only one of the two known types of TNF receptors. Thus, the AIM II receptor of the present invention may comprise one or more (eg, 3, 5, 8, 10,
15 or 20) amino acid substitutions, deletions or additions.

【００９１】 示されるように、変更は、好ましくは、タンパク質の折りたたみまたは活性に
有意に影響しない保存的アミノ酸置換のような、あまり重要でない性質の変更で
ある（表１を参照のこと）。As indicated, the alteration is preferably an alteration of a less important property, such as a conservative amino acid substitution that does not significantly affect the folding or activity of the protein (see Table 1).

【００９２】[0092]

【表１】 もちろん、アミノ酸置換の数は、当業者が多くの要因（上記のものを含む）に
依存して作製する。一般的に言うと、任意の所定のＡＩＭ−ＩＩポリペプチドに
ついての置換の数は、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５または３
を超えない。[Table 1] Of course, the number of amino acid substitutions will be made by those skilled in the art depending on many factors, including those described above. Generally speaking, the number of substitutions for any given AIM-II polypeptide is 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, or 3
Does not exceed.

【００９３】 本発明のＡＩＭ ＩＩタンパク質中の、機能に必須であるアミノ酸は、部位特
異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発のような、当該分野で公知の
方法によって同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中の
全ての残基で単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、
レセプター結合のような生物学的活性、またはインビトロもしくはインビトロで
の増殖活性について試験される。リガンド−レセプター結合のために重要な部位
もまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造解析によって決
定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（
１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（
１９９２））。[0093] Amino acids that are essential for function in the AIM II protein of the present invention can be identified by methods known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Scie).
nce 244: 1081-1085 (1989)). The latter procedure introduces a single alanine mutation at every residue in the molecule. The resulting mutant molecule is then
Tested for biological activity, such as receptor binding, or in vitro or in vitro proliferative activity. Sites important for ligand-receptor binding can also be determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (
1992) and de Vos et al., Science 255: 306-312 (
1992)).

【００９４】 （アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失） 本発明中に、アミノ末端欠失変異体もまた含まれる。このような変異体として
は、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めのアミノ酸（しかしＮ−末端の初め
の１１４アミノ酸残基を超えない）の欠失を有する、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列を含むものが挙げられる。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なく
ともＮ−末端の初めの３５アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ
酸残基を超えない）を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ
−末端の初めの５９アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ酸残基
を超えない）を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ−末端
の初めの６７アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ酸残基を超え
ない）を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ−末端の初め
の６８アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ酸残基を超えない）
を含む。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの７３
アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ酸残基を超えない）を含む
。あるいは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの８２アミノ
酸残基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ酸残基を超えない）を含む。ある
いは、この欠失は、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの１００アミノ酸残
基（しかしＮ−末端の初めの１１４アミノ酸残基を超えない）を含む。Amino- and Carboxy-Terminal Deletions Amino-terminal deletion mutants are also included in the present invention. Such variants include the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 having a deletion of at least the first N-terminal amino acid (but not more than the first 114 N-terminal amino acid residues) of SEQ ID NO: 2. And the like. Alternatively, the deletion comprises at least the first 35 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminal). Alternatively, the deletion comprises at least N
-Contains the first 59 amino acid residues at the terminus (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminus). Alternatively, the deletion comprises at least the first 67 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminal). Alternatively, the deletion is at least the first 68 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminal).
including. Alternatively, the deletion comprises at least the first 73 residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2.
Includes amino acid residues (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminus). Alternatively, the deletion comprises at least the first N-terminal 82 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 (but not more than the N-terminal first 114 amino acid residues). Alternatively, the deletion comprises at least the first 100 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 114 amino acid residues at the N-terminus).

【００９５】 上記のＮ−末端欠失変異体の範囲に加えて、本発明はまた、上記の範囲の全て
の組み合わせに関する。例えば、配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９
アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの６７アミノ酸残基を超えない）の欠失；
配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９アミノ酸残基（しかしＮ−末端の
初めの６８アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端
の初めの５９アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基を超えな
い）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの５９アミノ酸残基（しか
しＮ−末端の初めの８２アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列番号２の少なく
ともＮ−末端の初めの５９アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１００アミノ
酸残基を超えない）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの６７アミ
ノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列
番号２の少なくともＮ−末端の初めの６７アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初め
の８２アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初
めの６７アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない
）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの６８アミノ酸残基（しかし
Ｎ−末端の初めの７３アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列番号２の少なくと
もＮ−末端の初めの６８アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの８２アミノ酸残
基を超えない）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの６８アミノ酸
残基（しかしＮ−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列番
号２の少なくともＮ−末端の初めの７３アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの
８２アミノ酸残基を超えない）の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初め
の７３アミノ酸残基（しかしＮ−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない）
の欠失；配列番号２の少なくともＮ−末端の初めの８２アミノ酸残基（しかしＮ
−末端の初めの１００アミノ酸残基を超えない）の欠失；など。In addition to the above range of N-terminal deletion mutants, the present invention also relates to all combinations of the above ranges. For example, at least the first 59 at the N-terminus of SEQ ID NO: 2
Deletion of amino acid residues (but not more than the first 67 amino acid residues at the N-terminus);
Deletion of at least the first N-terminal 59 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first N-terminal 68 amino acid residues); A deletion (but not more than the first 73 amino acid residues at the N-terminus); at least the first 59 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 82 amino acid residues at the N-terminus) ); Deletion of at least the first N-terminal 59 amino acid residues of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 100 N-terminal amino acid residues); Deletion of 67 amino acid residues (but not more than the first 73 amino acid residues at the N-terminus); residue At least the first 67 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but not more than the first 100 amino acid residues at the N-terminus); at least the N-terminal of SEQ ID NO: 2 Deletion of the first 68 amino acid residues (but not more than the first 73 amino acid residues at the N-terminus) of SEQ ID NO: 2; Deletion of at least the first 68 amino acid residues at the N-terminus (but not more than the first 100 amino acid residues at the N-terminus) of SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2 A deletion of at least the first 73 amino acid residues at the N-terminus (but not more than the first 82 amino acid residues at the N-terminus); -Terminal It does not exceed the 100 amino acid residues of the eye)
Deletion; at least the first 82 amino acid residues at the N-terminus of SEQ ID NO: 2 (but N
-No more than the first 100 amino acid residues at the terminus);

【００９６】 好ましいＡＩＭ ＩＩポリペプチドを以下に示す（番号付けは、そのタンパク
質における最初のアミノ酸（Ｍｅｔ）から開始する）：Preferred AIM II polypeptides are shown below (numbering starts with the first amino acid (Met) in the protein):

【００９７】[0097]

【化５】 特に、好ましい実施態様としては、ＡＩＭ ＩＩ Ｎ末端欠失である、Embedded image In particular, a preferred embodiment is an AIM II N-terminal deletion.

【００９８】[0098]

【化６】 が挙げられる。Embedded image Is mentioned.

【００９９】 １つのタンパク質のＮ末端からの１以上のアミノ酸の欠失がそのタンパク質の
１以上の生物学的機能の改変または欠失をもたらす場合でさえ、他の生物学的活
性はなお、保持され得る。従って、短縮されたＡＩＭ ＩＩムテインがそのポリ
ペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合
する能力は、一般的にその完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の
大部分未満がＮ末端から除去される場合には、保持される。完全なポリペプチド
のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫学的活性を保持するか
否かは、本明細書において記載され、そして当該分野で他の形で公知である慣用
方法によって容易に決定され得る。Ｎ末端アミノ酸残基が大多数の欠失されたＡ
ＩＭ ＩＩムテインがいくらかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る
ことはあり得なくない。実際、６つのＡＩＭ ＩＩアミノ酸残基ほどから構成さ
れるペプチドがしばしば、免疫応答を誘発し得る。Even if deletion of one or more amino acids from the N-terminus of one protein results in alteration or deletion of one or more biological functions of the protein, other biological activities still retain Can be done. Thus, the ability of a truncated AIM II mutein to induce and / or bind an antibody that recognizes the intact or mature form of the polypeptide generally depends on the size of the residues of the intact or mature polypeptide. If less than a portion is removed from the N-terminus, it is retained. Whether a particular polypeptide lacking the N-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunological activity is described herein and commonly used in the art. It can be easily determined by the method. A with the majority of the N-terminal amino acid residues deleted
It is not possible that IM II muteins can retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides composed of as many as six AIM II amino acid residues can often elicit an immune response.

【０１００】 従って、本発明はさらに、図１ＡおよびＢ（すなわち、配列番号２）に示すＡ
ＩＭ ＩＩアミノ酸配列のアミノ末端から位置番号２３５のフェニルアラニン残
基までのうち１以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびそのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１Ａおよ
びＢ（配列番号２）の残基ｎ〜３１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供
する。ここで、ｎは、２〜２３５の範囲内の整数であり、そして２３６は、ＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要とされると考えら
れる完全ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのＮ末端からの最初の残基の位置である。[0100] Thus, the present invention further relates to A as shown in FIGS. 1A and B (ie, SEQ ID NO: 2).
Provided are polypeptides having one or more residues deleted from the amino terminus of the IM II amino acid sequence to the phenylalanine residue at position 235, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues n-314 of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2). Where n is an integer in the range of 2-235 and 236 is AI
This is the position of the first residue from the N-terminus of the complete AIM II polypeptide that would be required for at least the immunogenic activity of the M II polypeptide.

【０１０１】 より詳細には、本発明は、配列番号２に示すＡＩＭ ＩＩ配列（これは、図１
Ａ−Ｂに示す配列と、配列番号２におけるアミノ酸残基がＮ末端からＣ末端まで
の１〜２４０へと連続的に番号付けられている点を除いて同一である）の以下：More specifically, the present invention relates to the AIM II sequence shown in SEQ ID NO: 2,
(Except that the amino acid residues in SEQ ID NO: 2 are consecutively numbered from 1 to 240 from the N-terminus to the C-terminus):

【０１０２】[0102]

【化７】 の残基のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、本発明に包含される。Embedded image A polynucleotide comprising or consisting of the amino acid sequence of the following residues: Polynucleotides encoding these polypeptides are also encompassed by the present invention.

【０１０３】 上記において言及したように、１つのタンパク質のＣ末端から１以上のアミノ
酸の欠失がそのタンパク質の１以上の生物学的機能の改変または欠失をもたらす
場合でさえ、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮されたＡＩＭ
ＩＩムテインがそのポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体
を誘導および／または結合する能力は、一般的にその完全なポリペプチドまたは
成熟ポリペプチドの残基の大部分未満がＣ末端から除去される場合には、保持さ
れる。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような
免疫学的活性を保持するか否かは本明細書において記載され、そして当該分野で
他の形で公知である慣用方法によって容易に決定され得る。Ｃ末端アミノ酸残基
が大多数の欠失されたＡＩＭ ＩＩムテインがいくらかの生物学的活性または免
疫原性活性を保持し得ることはあり得なくない。実際、６つのＡＩＭ ＩＩアミ
ノ酸残基ほどから構成されるペプチドがしばしば、免疫応答を誘発し得る。As mentioned above, even if deletion of one or more amino acids from the C-terminus of one protein results in modification or deletion of one or more biological functions of that protein, Activity can still be retained. Therefore, the shortened AIM
The ability of a II mutein to induce and / or bind an antibody that recognizes the intact or mature form of the polypeptide is generally less than most of the residues of the intact or mature polypeptide from the C-terminus. If removed, it is retained. Whether a particular polypeptide lacking the C-terminal residue of an intact polypeptide retains such immunological activity is described herein, and conventional methods are otherwise known in the art. Can be easily determined by It is not possible that AIM II muteins with the majority of the C-terminal amino acid residues deleted may retain some biological or immunogenic activity. In fact, peptides composed of as many as six AIM II amino acid residues can often elicit an immune response.

【０１０４】 従って、本発明はさらに、図１ＡおよびＢ（配列番号２）に示すＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から位置番号６のバリン残基まで
のうち１以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびそのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、図１ＡおよびＢ（
すなわち、配列番号２）の残基１〜ｍのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供
する。ここで、ｍは、６〜２３９の範囲内の整数であり、そして６は、ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドの少なくとも免疫原性活性のために必要とされると考えられる
完全ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのＣ末端からの最初の残基の位置である。Thus, the present invention further provides AIM II as shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
Provided are polypeptides having one or more residues deleted from the carboxy terminus of the amino acid sequence of the polypeptide to the valine residue at position No. 6, and polynucleotides encoding such polypeptides. In particular, the present invention relates to FIGS. 1A and 1B (
That is, the present invention provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of residues 1 to m of SEQ ID NO: 2). Where m is an integer in the range of 6 to 239, and 6 is the AIM
The position of the first residue from the C-terminus of the complete AIM II polypeptide which is considered required for at least the immunogenic activity of the II polypeptide.

【０１０５】 より詳細には、本発明は、図１ＡおよびＢに示すＡＩＭ ＩＩ配列の配列（こ
れは、配列番号２に示す配列と、配列番号２におけるアミノ酸残基がＮ末端から
Ｃ末端までの１〜２４０へと連続的に番号付けられている点を除いて同一である
）の以下：More specifically, the present invention relates to the sequence of the AIM II sequence shown in FIGS. 1A and 1B (the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid residues in SEQ ID NO: 2 from N-terminal to C-terminal). (Except that they are numbered consecutively from 1 to 240):

【０１０６】[0106]

【化８】 の残基のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、提供される。Embedded image A polynucleotide comprising or consisting of the amino acid sequence of the following residues: Polynucleotides encoding these polypeptides are also provided.

【０１０７】 本発明はまた、１以上のアミノ酸がＡＩＭ ＩＩポリペプチドのアミノ末端お
よびカルボキシ末端の両方が欠失したポリペプチドを提供する。これは、一般的
に図１ＡおよびＢ（すなわち配列番号２）の残基ｎ−ｍを有するとして記載され
得る。ここで、ｎおよびｍは、上記に記載したような整数である。The present invention also provides polypeptides in which one or more amino acids have been deleted at both the amino and carboxy termini of an AIM II polypeptide. This can be generally described as having residues nm of FIGS. 1A and B (ie, SEQ ID NO: 2). Here, n and m are integers as described above.

【０１０８】 全長ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡで形質転換したＭＣＡ−３８細胞の馴化培地から
ＬＴ−βレセプターカラム上でアフィニティー精製した、ＡＩＭ ＩＩの天然の
プロセシングを受けた形態は、配列番号２においてＬｅｕ−８３〜Ｖａｌ−２４
０である（実施例１０を参照のこと）。しかし、ＡＩＭ ＩＩはＣＯＳ細胞にお
いては異なってプロセシングを受け、配列番号２においてＧｌｕ−６７とＭｅｔ
−６８との間で切断されてアミノ酸６８〜２４０を有するポリペプチドを産生す
るＡＩＭ ＩＩを生産するようである。さらに、ＣＯＳ細胞はまた、Ｍｅｔ−６
８とＶａｌ−６９との間でＡＩＭ ＩＩを切断し、配列番号２においてアミノ酸
６９〜２４０を有するポリペプチドをもたらす。The native processed form of AIM II, affinity-purified on a LT-β receptor column from conditioned medium of MCA-38 cells transformed with full-length AIM II cDNA, is identical to Leu-83 to SEQ ID NO: 2. Val-24
0 (see Example 10). However, AIM II is processed differently in COS cells, and Glu-67 and Met in SEQ ID NO: 2.
It appears to produce AIM II which is cleaved between -68 to produce a polypeptide having amino acids 68-240. In addition, COS cells also contain Met-6
Cleavage of AIM II between 8 and Val-69, resulting in a polypeptide having amino acids 69-240 in SEQ ID NO: 2.

【０１０９】 本発明のポリペプチドは好ましくは、単離された形態で提供される。「単離さ
れたポリペプチド」とは、そのネイティブ環境から取り出されたポリペプチドを
いう。従って、組換え宿主細胞において産生されそして／または含有されるポリ
ペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。また、「単離され
たポリペプチド」で意図されるのは、組換え宿主から、部分的または実質的に精
製されたポリペプチドである。例えば、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの組換え産生
された形態は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０
（１９８８）に記載された１工程方法によって実質的に精製され得る。The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form. “Isolated polypeptide” refers to a polypeptide that has been removed from its native environment. Thus, a polypeptide produced and / or contained in a recombinant host cell is considered isolated for the purposes of the present invention. Also, contemplated by "isolated polypeptide" are polypeptides that have been partially or substantially purified from a recombinant host. For example, recombinantly produced forms of AIM II polypeptides are described in Smith and Johnson, Gene 67: 31-40.
(1988).

【０１１０】 本発明のポリペプチドには、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペ
プチド、図１ＡおよびＢ（配列番号２）のポリペプチド、Ｎ末端メチオニン、細
胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを欠く図１ＡおよびＢ（配列番
号２）のポリペプチド、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインの全てまたは部分
を含むが膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチド、ならびに寄託されたｃＤＮ
Ａによってコードされるポリペプチド、図１ＡおよびＢ（配列番号２）のポリペ
プチドと、少なくとも８０％同一である、より好ましくは少なくとも９０％また
は９５％同一である、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一である、ポリペプチドが含まれ、そしてまた、少なくとも３０ア
ミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するそのようなポリペ
プチドの部分が含まれる。The polypeptides of the present invention include the polypeptide encoded by the deposited cDNA, the polypeptide of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), the N-terminal methionine, the extracellular domain, the transmembrane domain, the intracellular domain. 1A and B (SEQ ID NO: 2) lacking a soluble polypeptide comprising all or part of the extracellular and intracellular domains but lacking the transmembrane domain, and the deposited cDN
A, at least 80%, more preferably at least 90% or 95%, even more preferably at least 96%, the polypeptide encoded by A, the polypeptide of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2); Polypeptides that are 97%, 98% or 99% identical are included, and also include portions of such polypeptides having at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids.

【０１１１】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも例えば９５％「
同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が
そのＡＩＭ ＩＩポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり、５つ
までのアミノ酸改変を含み得ることを除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列
がその参照配列と同一であることをいう。換言すれば、１つの参照アミノ酸配列
に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために
は、参照配列におけるアミノ酸残基の５％までが欠失され得るか、もしくは別の
アミノ酸に置換され得るか、またはその参照配列におけるアミノ酸残基の総計の
５％までのいくつかのアミノ酸がその参照配列に挿入され得る。その参照配列の
これらの改変は、その参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末
端位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで生じ得、その参照配列における
残基の間に個々に分散され得るか、その参照配列内の１以上の連続する群内に分
散され得るかのいずれかであり得る。The reference amino acid sequence of an AIM II polypeptide may be at least 95% "
A polypeptide having an amino acid sequence that is "identical" refers to a polypeptide having the same amino acid sequence, except that the polypeptide sequence may contain up to 5 amino acid modifications per 100 amino acids of the reference amino acid of the AIM II polypeptide. It means that the amino acid sequence is identical to its reference sequence. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to one reference amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence can be deleted, or Some amino acids may be substituted or may be inserted into the reference sequence up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence. These modifications of the reference sequence may occur at the amino or carboxy terminal positions of the reference amino acid sequence, or anywhere between these terminal positions, and may be individually distributed among the residues in the reference sequence. Or can be distributed within one or more contiguous groups within the reference sequence.

【０１１２】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１ＡおよびＢ（配
列番号２）に示すアミノ酸配列または寄託されたｃＤＮＡクローンによってコー
ドされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％ま
たは９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ
８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータ
プログラムを用いて簡便に決定され得る。特定の配列が本発明に従う参照配列と
、例えば、９５％同一であるか否かを決定するためのＢｅｓｔｆｉｔまたは任意
の他の配列整列プログラムを用いる場合、そのパラメータは、当然、同一性のパ
ーセンテージがその参照アミノ酸配列の全長に対して計算され、そしてその参照
配列におけるアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容さ
れるように設定される。As a practical matter, any particular polypeptide may be at least 90%, 95%, for example, the amino acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) or the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA clone. Whether they are 96%, 97%, 98% or 99% identical is determined by the Bestfit program (Wisconsi
n Sequence Analysis Package, Version
8 for Unix, Genetics Computer Group, U
diversity Research Park, 575 Science
Drive, Madison, WI 53711) and may be conveniently determined using known computer programs. When using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is 95% identical to a reference sequence according to the present invention, the parameters will, of course, be those having a percentage identity. Calculated for the full length of the reference amino acid sequence, and set to allow for gaps in homology of up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence.

【０１１３】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば９５％「同一
である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、その対象ポリペプチドのアミ
ノ酸配列が、その対象ポリペプチド配列がその問い合わせアミノ酸配列の各１０
０アミノ酸あたり５アミノ酸までの改変を含み得ることを除いて、その問い合わ
せ配列と同一であることをいう。換言すれば、１つの問い合わせアミノ酸配列に
少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには
、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入され得るか、欠失され得る
か、（ｉｎｄｅｌｓ）もしくは別のアミノ酸に置換され得る。その参照配列のこ
れらの改変は、その参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、ま
たはこれらの末端位置の間のどこかで生じ得、その参照配列における残基の間に
個々に分散され得るか、その参照配列内の１以上の連続する群内に分散され得る
かのいずれかであり得る。A polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% “identical” to the query amino acid sequence of the present invention is defined as follows: the amino acid sequence of the subject polypeptide differs from the query amino acid Each 10 in the array
Refers to being identical to the query sequence except that it may contain up to 5 amino acid modifications per 0 amino acids. In other words, to obtain a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 95% identical to one query amino acid sequence, up to 5% of the amino acid residues in the subject sequence can be inserted or deleted. , (Indels) or another amino acid. These modifications of the reference sequence may occur at the amino or carboxy terminus of the reference amino acid sequence, or anywhere between these terminal positions, and may be individually dispersed among the residues in the reference sequence, It can either be distributed within one or more contiguous groups within the reference sequence.

【０１１４】 実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、表１に示すアミノ酸
配列または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされたアミノ酸配列と少な
くとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否か
は、公知のコンピュータプログラムを用いて簡便に決定され得る。問い合わせ配
列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的一致（これはまた、全体的
配列整列ともいう）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏ
ｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズ
ムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定され得る。配列
整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方がヌクレオチド配列であ
るか、両方がアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の
結果は、％同一性で示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列において用いられる好
ましいパラメータは、以下のとおりである：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔ
ｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅ
ｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝
０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎ
ｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのうちより短いもの。As a practical matter, any particular polypeptide may be at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, for example, with the amino acid sequence shown in Table 1 or the amino acid sequence encoded by the deposited DNA clone. % Or 99% can be easily determined using a known computer program. A preferred method for determining the best overall match between the query sequence (sequence of the invention) and the subject sequence, which is also referred to as an overall sequence alignment, is described in Brutlag et al.
mp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)). In sequence alignments, the query and subject sequences are either both nucleotide sequences or both amino acid sequences. The results of the overall sequence alignment above are given in% identity. Preferred parameters used in the FASTDB amino acid alignment are as follows: Matrix = PAM 0, kt
up = 2, Mismatch Penalty = 1, Joining Pe
nalty = 20, Randomization Group Length =
0, Cutoff Score = 1, Window Size = array length, Gap
Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0.05, Win
dow Size = 500 or the shorter of the length of the amino acid sequence of interest.

【０１１５】 対象配列が、内部欠失のためではなくＮ末端欠失またはＣ末端欠失のために問
い合わせ配列より短い場合は、手動の補正がその結果になされなければならない
。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的％同一性を算出するときに対象配
列のＮ末端短縮またはＣ末端短縮を考慮しないからである。Ｎ末端またはＣ末端
において短縮された対象配列について、問い合わせ配列に対し、％同一性は、対
応する対象残基と適合／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端である、その
問い合わせ配列の残基数を、その問い合わせ配列の塩基総数の％として計算する
ことにより補正する。１つの残基が適合／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤ
Ｂ配列整列の結果により決定される。次いで、このパーセンテージを％同一性か
ら減じ、特定のパラメータを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算
して、最終の％同一性値に達する。この最終の％同一性値は、本発明の目的のた
めに使用されるものである。対象配列のＮ末端またはＣ末端を越えて延びる問い
合わせ（参照）配列の残基のみが、％同一性値を手動で調整する目的のために考
慮される。すなわち、問い合わせ配列のＮ末端またはＣ末端が適合／整列しない
配列のみが、％同一性値を手動で調整する場合に考慮される。If the subject sequence is shorter than the query sequence due to N-terminal or C-terminal deletions, not due to internal deletions, manual correction must be made. This is because the FASTDB program does not consider N-terminal or C-terminal truncations of the subject sequence when calculating overall% identity. For a subject sequence truncated at the N-terminus or C-terminus, the% identity to the query sequence is the residue of the query sequence that is the N-terminus or C-terminus of the subject sequence that does not match / align with the corresponding subject residue The number is corrected by calculating as a percentage of the total number of bases in the query sequence. Whether one residue is matched / aligned is FASTD
Determined by the result of the B sequence alignment. This percentage is then subtracted from the% identity and calculated by the FASTDB program above using the specified parameters to reach the final% identity value. This final% identity value is what is used for the purposes of the present invention. Only those residues of the query (reference) sequence that extend beyond the N-terminus or C-terminus of the subject sequence are considered for the purpose of manually adjusting the% identity values. That is, only those sequences where the N- or C-termini of the query sequence do not match / align are considered when manually adjusting the% identity values.

【０１１６】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、１００残基の問い合わせ配列と整列
して、％同一性が決定される。欠失はその対象配列のＮ末端に生じ、それゆえ、
ＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の適合／整列を示さない。１０の
対合しない残基は、その配列の１０％（適合しないＮ末端およびＣ末端の残基数
／その問い合わせ配列における残基の総数）を示し、そこで、１０％は、ＦＡＳ
ＴＤＢプログラムによって算出された％同一性値から減ぜられる。残りの９０残
基が完全に適合する場合、最終的な％同一性は９０％である。別の例では、９０
残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。今回は、欠失が
内部欠失であるので、問い合わせ(配列）と適合／整列しない対象配列のＮ末端 またはＣ末端における残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出
された％同一性は、手動で補正されない。ここで再び、ＦＡＳＴＤＢ整列におい
て示されるときの、その問い合わせ配列と適合／整列しないその対象配列のＮ末
端およびＣ末端の外側の残基位置のみが、手動で補正される。本発明の目的のた
めには、他の手動補正はなされない。For example, a 90 amino acid residue subject sequence is aligned with a 100 residue query sequence to determine% identity. The deletion occurs at the N-terminus of the subject sequence and therefore
FASTDB alignment does not show a match / alignment of the first 10 residues at the N-terminus. Ten unpaired residues represent 10% of the sequence (number of unmatched N- and C-terminal residues / total number of residues in the query sequence), where 10% is FAS
It is subtracted from the% identity value calculated by the TDB program. If the remaining 90 residues match perfectly, the final% identity is 90%. In another example, 90
The residue's subject sequence is compared to the 100 residue query sequence. This time, since the deletion is an internal deletion, there are no residues at the N- or C-terminus of the subject sequence that do not match / align with the query (sequence). In this case, the% identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Here again, only those residue positions outside the N- and C-termini of the subject sequence that do not match / align with the query sequence as indicated in the FASTDB alignment are manually corrected. No other manual corrections are made for the purposes of the present invention.

【０１１７】 本明細書において使用される場合、用語「ＡＩＭ ＩＩ」ポリペプチドには、
膜結合型タンパク質（細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメイン
を含む）、ならびにＡＩＭ ＩＩポリペプチド活性を保持する短縮タンパク質が
含まれる。１つの実施態様において、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、ＡＩ
Ｍ ＩＩタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは部分を含むが、膜貫通領域を
欠き、これは、細胞膜上でのポリペプチドの保持を生じる。可溶性ＡＩＭ ＩＩ
はまた、その可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質が分泌され得る限り、膜貫通領域の
部分または細胞質ドメインもしくは他の配列の部分を含み得る。異種シグナルペ
プチドがその可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのＮ末端に融合され得て、その結
果その可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドが発現の際に分泌される。[0117] As used herein, the term "AIM II" polypeptide includes:
Includes membrane-bound proteins, including cytoplasmic, transmembrane, and extracellular domains, as well as truncated proteins that retain AIM II polypeptide activity. In one embodiment, the soluble AIM II polypeptide is AI
It contains all or part of the extracellular domain of the MII protein, but lacks the transmembrane region, resulting in retention of the polypeptide on the cell membrane. Soluble AIM II
May also include portions of the transmembrane region or portions of the cytoplasmic domain or other sequences, as long as the soluble AIM II protein can be secreted. A heterologous signal peptide can be fused to the N-terminus of the soluble AIM II polypeptide such that the soluble AIM II polypeptide is secreted upon expression.

【０１１８】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ル上または分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして、使用され得る
。The polypeptides of the present invention can be used as molecular weight markers on SDS-PAGE gels or on molecular sieve gel filtration columns using methods well known to those skilled in the art.

【０１１９】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドおよびポリペプチドを提供する。これらのエピトープは、本発明の
ポリペプチドの免疫原性または抗原性のエピトープである。「免疫原性エピトー
プ」とは、本発明のポリペプチド全体、またはそのフラグメントが免疫原である
場合、インビボでの抗体応答を惹起するタンパク質の一部と定義される。他方、
抗体が結合し得るポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「抗原性エピト
ープ」と定義される。タンパク質のインビボ免疫原性エピトープの数は、一般に
、抗原性エピトープの数未満である。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参
照のこと。しかし、抗体は、ファージ提示のような方法を用いることにより、そ
れが免疫原性エピトープであるか否かに拘らず、任意の抗原性エピトープに対し
て作製され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．２４９：４２５−４３１（１９９５）を参照のこと。従って、本発明には
、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が包含される。In another aspect, the present invention provides peptides and polypeptides comprising an epitope-bearing portion of a polypeptide of the present invention. These epitopes are immunogenic or antigenic epitopes of the polypeptide of the invention. An "immunogenic epitope" is defined as a portion of a protein that elicits an in vivo antibody response when the entire polypeptide of the invention, or a fragment thereof, is an immunogen. On the other hand,
The region of the polypeptide to which an antibody can bind is defined as an "antigenic determinant" or "antigenic epitope." The number of in vivo immunogenic epitopes of a protein is generally less than the number of antigenic epitopes. See, for example, Geysen et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983). However, antibodies can be raised against any antigenic epitope by using methods such as phage display, whether or not it is an immunogenic epitope. For example, Petersen G. et al. Et al., Mol. Gen. Gen
et. 249: 425-431 (1995). Thus, the present invention includes both immunogenic and antigenic epitopes.

【０１２０】 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択について、タンパク質配列の一
部に模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが、当該分野で周知である。例えば、Ｓｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．お
よびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ
ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０〜６６６を参照のこと。タンパ
ク質反応性の血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列においてしば
しば示され、一組の単純な化学法則によって特徴付けられ得、そしてインタクト
なタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）またはアミノ末
端もしくはカルボキシ末端のいずれにも制限されない。For the selection of peptides or polypeptides bearing an antigenic epitope (ie, including regions of the protein molecule to which antibodies can bind), relatively short synthetic peptides that mimic a portion of the protein sequence may be partially It is well known in the art that antisera reactive with mimicked proteins can be routinely induced. For example, Su
tcliffe, J.M. G. FIG. Shinnick, T .; M. Green, N .; And Learner, R .; A. (1983) Antibodies that
react with predetermined sites on pr
oteins. Science 219: 660-666. Peptides that can elicit protein-reactive sera are often shown in the primary sequence of proteins, can be characterized by a set of simple chemical rules, and are immunodominant regions of intact proteins (ie, immunogenic epitopes). Or it is not limited to either the amino or carboxy terminus.

【０１２１】 従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有
ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体（モノク
ローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、
Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８（１９８４）の７７７を参照のこと。Accordingly, the antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are useful for raising antibodies (including monoclonal antibodies) that specifically bind to the polypeptides of the present invention. . For example, Wilson et al.
See 377 in Cell 37: 767-778 (1984).

【０１２２】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポリペプ
チドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる好ましくは少なくと
も７の、より好ましくは少なくとも９の、および最も好ましくはおよそ少なくと
も約１５と約３０との間のアミノ酸の配列を含む。The antigenic epitope-bearing peptide and the antigenic epitope-bearing polypeptide of the present invention preferably comprise at least 7, more preferably at least 9, and most preferably about at least 7 amino acids contained in the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention. It includes a sequence of at least between about 15 and about 30 amino acids.

【０１２３】 ＡＩＭ ＩＩ特異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチド
または抗原性ペプチドの限定されない例は、以下を含む：図１ＡおよびＢ（配列
番号２）におけるアミノ酸残基約１３〜約２０を含むポリペプチド；図１（配列
番号２）におけるアミノ酸残基約２３〜約３６を含むポリペプチド；図１Ａおよ
びＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基約６９〜約７９を含むポリペプチド；
図１ＡおよびＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基約８５〜約９４を含むポリ
ペプチド；図１ＡおよびＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基約１６７〜約１
７８を含むポリペプチド；図１ＡおよびＢ（配列番号２）におけるアミノ酸残基
約１８４〜約１９６を含むポリペプチド；ならびに図１ＡおよびＢ（配列番号２
）におけるアミノ酸残基約２２１〜約２３３を含むポリペプチド。上記のように
、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがＡＩＭ ＩＩタンパク質の
抗原性領域であることを決定した。Non-limiting examples of antigenic polypeptides or peptides that can be used to raise AIM II-specific antibodies include: about 13 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising amino acid residues from about 23 to about 36 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); a polypeptide comprising amino acid residues from about 69 to about 79 in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) peptide;
A polypeptide comprising about 85 to about 94 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2); about 167 to about 1 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
Polypeptides comprising amino acid residues from about 184 to about 196 in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2); and FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2).
A) a polypeptide comprising about 221 to about 233 amino acid residues in As noted above, we have determined that the above polypeptide fragment is an antigenic region of the AIM II protein.

【０１２４】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、単量体または多量体（すなわち、二量
体、三量体、四量体、およびより高い多量体）中にあり得る。従って、本発明は
、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドの単量体および多量体、これらの調製物、
およびこれらを含む組成物（好ましくは、薬学的組成物）に関する。特定の実施
態様において、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体、または四量
体である。さらなる実施態様において、本発明の多量体は、少なくとも二量体、
少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。The AIM II polypeptides of the present invention can be in monomers or multimers (ie, dimers, trimers, tetramers, and higher multimers). Accordingly, the present invention relates to monomers and multimers of the AIM II polypeptides of the present invention, their preparation,
And compositions containing them (preferably, pharmaceutical compositions). In certain embodiments, a polypeptide of the invention is a monomer, dimer, trimer, or tetramer. In a further embodiment, the multimer of the invention has at least a dimer,
It is at least a trimer, or at least a tetramer.

【０１２５】 本発明によって含まれる多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本
明細書中で使用される場合、用語、ホモマーは、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプ
チドのみを含む多量体をいう（本明細書中に記載される場合、ＡＩＭ ＩＩフラ
グメント、改変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質を含む）。こ
れらのホモマーは、同一の、または異なるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドを含み得る。特定の実施態様において、本発明のホモマーは、同一の
アミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドのみを含む多量体である。別の
特定の実施態様において、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するＡ
ＩＭ ＩＩポリペプチドを含む多量体である。特定の実施態様において、本発明
の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一の、または異なるアミノ酸配列を有する
ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む）、またはホモ三量体（例えば、同一の、およ
び／または異なるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む）であ
る。さらなる実施態様において、本発明のホモマーの多量体は、少なくともホモ
二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。The multimers included by the present invention can be homomeric or heteromeric. As used herein, the term homomer refers to a multimer comprising only an AIM II polypeptide of the invention (as described herein, an AIM II fragment, variant, splicing variant). , And fusion proteins). These homomers can include AIM II polypeptides having the same or different amino acid sequence. In certain embodiments, a homomer of the invention is a multimer comprising only AIM II polypeptides having the same amino acid sequence. In another particular embodiment, the homomers of the present invention have A
Multimers containing IM II polypeptides. In certain embodiments, the multimers of the invention are homodimers (eg, including AIM II polypeptides having the same or different amino acid sequences) or homotrimers (eg, the same and / or Or AIM II polypeptides having different amino acid sequences). In a further embodiment, the homomer multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer, or at least a homotetramer.

【０１２６】 本明細書中で使用される場合、用語、ヘテロマーは、本発明のＡＩＭ ＩＩお
よびＡＩＭ ＩＩポリペプチドに加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわ
ち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含む多量体をいう。特定の実施態様に
おいて、本発明の多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体
である。さらなる実施態様において、本発明のホモマーの多量体は、少なくとも
ホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。As used herein, the term heteromer includes one or more heterologous polypeptides (ie, polypeptides of different proteins) in addition to the AIM II and AIM II polypeptides of the invention. Refers to multimers. In certain embodiments, a multimer of the invention is a heterodimer, heterotrimer, or heterotetramer. In a further embodiment, the homomer multimer of the invention is at least a homodimer, at least a homotrimer, or at least a homotetramer.

【０１２７】 本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性、および／もしくは共有結合性
の会合の結果であり得、かつ／または、例えば、リポソーム形成によって間接的
に結合され得る。従って、１つの実施態様において、例えばホモ二量体またはホ
モ三量体のような本発明の多量体は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接
触する場合に形成される。別の実施態様において、例えばヘテロ二量体またはヘ
テロ三量体のような本発明の多量体は、本発明のポリペプチドが、溶液中で本発
明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプ
チド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に形成される。他の実施態様にお
いて、本発明の多量体は、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドとの共有結合的会
合、および／またはＡＩＭ ＩＩポリペプチド間の共有結合的会合によって形成
される。このような共有結合的会合は、ポリペプチド配列に含まれる１つ以上の
アミノ酸残基を含み得る（例えば、配列番号２もしくは配列番号３９に示される
、またはＡＴＣＣ受託番号９７６８９および同９７４８３として示されるクロー
ンによってコードされるポリペプチドに含まれる）。１つの例において、この共
有結合的な会合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチド中で
相互作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。別
の例において、この共有結合的な会合は、化学的、または組換え的操作の結果で
ある。あるいは、このような共有結合的な会合は、ＡＩＭ ＩＩ融合タンパク質
中の異種ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。１つ
の例において、共有結合的な会合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配
列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の
実施態様において、この共有結合的な会合は、本発明のＡＩＭ ＩＩ−Ｆｃ融合
タンパク質に含まれる異種配列間にある（本明細書中に記載されるように）。別
の特定の例において、本発明の融合タンパク質の共有結合的な会合は、共有結合
的に会合する多量体を形成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメ
ンバー（例えば、オセテオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）
（例えば、国際特許公開番号ＷＯ９８／４９３０５を参照のこと。この内容は、
その全体が、本明細書中に参考として援用される））からの異種ポリペプチド配
列間にある。The multimers of the present invention may be the result of hydrophobic, hydrophilic, ionic, and / or covalent association and / or may be indirectly bound, for example, by liposome formation. Thus, in one embodiment, multimers of the invention, such as, for example, homodimers or homotrimers, are formed when the polypeptides of the invention contact one another in solution. In another embodiment, a multimer of the invention, such as a heterodimer or heterotrimer, is an antibody against a polypeptide of the invention in solution (in a fusion protein of the invention). (Including antibodies to heterologous polypeptide sequences). In other embodiments, the multimers of the invention are formed by covalent association with AIM II polypeptides of the invention and / or covalent associations between AIM II polypeptides. Such a covalent association may involve one or more amino acid residues contained in the polypeptide sequence (eg, as set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 39, or as set forth in ATCC Accession Numbers 97689 and 97483). Contained in the polypeptide encoded by the clone). In one example, the covalent association is a bridge between cysteine residues located within the interacting polypeptide sequence in the native (ie, naturally occurring) polypeptide. In another example, the covalent association is a result of chemical or recombinant manipulation. Alternatively, such a covalent association may involve one or more amino acid residues contained in a heterologous polypeptide sequence in the AIM II fusion protein. In one example, the covalent association is between heterologous sequences contained in a fusion protein of the invention (see, eg, US Pat. No. 5,478,925). In certain embodiments, the covalent association is between heterologous sequences contained in an AIM II-Fc fusion protein of the invention (as described herein). In another specific example, the covalent association of a fusion protein of the invention is such that another TNF family ligand / receptor member (eg, oseteoprotegerin) that can form covalently associated multimers.
(See, for example, International Patent Publication No. WO 98/49305.
In its entirety, is between the heterologous polypeptide sequences from))), which is incorporated herein by reference.

【０１２８】 本発明の多量体は、当該分野で公知の化学的技術を使用して生成され得る。例
えば、本発明の多量体に含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で
公知のリンカー分子およびリンカー分子長の最適化技術を使用して、化学的に架
橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、
本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明の多量体
は、この多量体に含まれることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシ
ステイン残基間での１つ以上の分子間架橋を形成するために、当該分野で公知の
技術を使用して生成され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これ
は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに
、本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に対して、
システインまたはビオチンを付加することによって慣用的に改変され得、そして
当該分野で公知の技術を適用して、１つ以上のこれらの改変されたポリペプチド
を含む多量体を生成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これは
、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、
当該分野で公知の技術を適用して、本発明の多量体に含まれることが所望される
ポリペプチド成分を含むリポソームを生成し得る（例えば、米国特許第５，４７
８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参
照のこと）。The multimers of the present invention can be produced using chemical techniques known in the art. For example, a polypeptide that is desired to be included in a multimer of the invention can be chemically cross-linked using linker molecule and linker length optimization techniques known in the art (eg, US Pat. No. 5,478,925 (this is, in its entirety,
), Herein incorporated by reference)). Further, the multimers of the present invention may be used in the art to form one or more intermolecular bridges between cysteine residues located within the sequence of the polypeptide desired to be included in the multimer. It can be produced using known techniques (see, for example, US Pat. No. 5,478,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety). Further, the polypeptide of the present invention may have a C-terminal or N-terminal relative to the polypeptide.
It can be modified conventionally by adding cysteine or biotin, and techniques known in the art can be applied to produce multimers comprising one or more of these modified polypeptides (eg, US See US Patent No. 5,478,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety. further,
Techniques known in the art can be applied to generate liposomes containing the polypeptide components desired to be included in the multimers of the invention (see, for example, US Pat.
No. 8,925, which is hereby incorporated by reference in its entirety).

【０１２９】 あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子操作技術を使用して生
成され得る。１つの実施態様において、本発明の多量体に含まれるポリペプチド
は、本明細書中に記載されるか、またはさもなくば当該分野で公知の融合タンパ
ク質技術を使用して、組換え的に生産される（例えば、米国特許第５，４７８，
９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照の
こと）。特定の実施態様において、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレ
オチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカ
ーポリペプチドをコードする配列に、次いで、さらに本来のＣ末端からＮ末端（
リーダー配列を含まない）に逆方向にポリペプチドの翻訳産物をコードする合成
ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって生成される（例えば、米国
特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援
用される）を参照のこと）。別の実施態様において、本明細書中に記載されるか
、またはさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して、膜貫通ドメイン（
または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、かつリポソームへの膜再構築
技術によって組み込まれ得る、本発明の組換えポリペプチドを生成する（例えば
、米国特許第５，４７８，９２５号（これは、その全体が、本明細書中に参考と
して援用される）を参照のこと）。Alternatively, the multimers of the present invention can be produced using genetic engineering techniques known in the art. In one embodiment, the polypeptide comprised in the multimer of the invention is recombinantly produced using fusion protein technology described herein or otherwise known in the art. (Eg, US Pat. No. 5,478,
No. 925, which is hereby incorporated by reference in its entirety). In certain embodiments, the polynucleotide encoding a homodimer of the invention comprises a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention replaced by a sequence encoding a linker polypeptide, and then further from the native C-terminus. N-terminal (
It is produced by ligating the polypeptide in reverse direction to a synthetic polynucleotide encoding the translation product of the polypeptide (excluding the leader sequence) (see, eg, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein in its entirety). , Incorporated herein by reference). In another embodiment, applying the recombinant techniques described herein or otherwise known in the art, the transmembrane domain (
Or a hydrophobic or signal peptide) and produce a recombinant polypeptide of the invention that can be incorporated by membrane reconstitution techniques into liposomes (see, eg, US Pat. No. 5,478,925, which is incorporated herein by reference). See (incorporated herein by reference in its entirety)).

【０１３０】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に差次的に改変（例えば、グリコシル化、ア
セチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タ
ンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによる）
されるＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変が、公知の技
術によって実行され得る。これらの技術は、臭化シアン、トリプシン、キモトリ
プシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学切断；アセ チル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など
を含むがこれらに限定されない。The present invention provides for differentially altering during or after translation (eg, glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, antibodies) Such as by binding to molecules or other cellular ligands)
AIM II polypeptides. Any of a number of chemical modifications can be performed by known techniques. These techniques, cyanogen bromide, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, specific chemical cleavage by NaBH 4; acetylation, formylation, oxidation, reduction; metabolic synthesis in the presence of tunicamycin; including such It is not limited to these.

【０１３１】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後の改変としては、例えば、Ｎ結合化炭
水化物鎖またはＯ結合化炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミ
ノ酸骨格に対する化学的部分の付着、Ｎ結合化炭水化物鎖またはＯ結合化炭水化
物鎖の化学的改変、および原核生物の宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオ
ニン残基の付加が挙げられる。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単
離を可能にするために、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体
標識、またはアフィニティー標識）を用いて改変され得る。Additional post-translational modifications encompassed by the present invention include, for example, N-linked or O-linked carbohydrate chains, N- or C-terminal processing, attachment of chemical moieties to the amino acid backbone, N-linked Chemical modification of carbohydrate or O-linked carbohydrate chains and addition of N-terminal methionine residues as a result of prokaryotic host cell expression. Polypeptides can also be modified with a detectable label, such as an enzymatic, fluorescent, isotopic, or affinity label, to allow detection and isolation of the protein.

【０１３２】 本発明はまた、ポリペプチドの可溶性、安定性、および循環時間の増加、また
は免疫原性の低下のようなさらなる利点を提供し得るＡＩＭ ＩＩの化学的に改
変された誘導体を提供し得る（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）
。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコー
ル／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキス
トラン、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーから選択され得る。
ポリペプチドは、この分子内の無作為な位置で改変されても良いし、またはこの
分子内の予め決定された位置で改変されても良いし、そして１つ、２つ、３つ以
上の付着された化学的部分を含んでも良い。The present invention also provides chemically modified derivatives of AIM II that may provide additional benefits such as increased solubility, stability, and circulation time of the polypeptide, or reduced immunogenicity. Obtain (see US Patent No. 4,179,337).
. The chemical moiety for derivatization may be selected from water-soluble polymers such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol, and the like.
The polypeptide may be modified at a random position within the molecule, or may be modified at a predetermined position within the molecule, and may include one, two, three or more attachments. It may include a chemical moiety.

【０１３３】 このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分岐していても良いし、また
は分岐していなくても良い。ポリエチレングリコールに関して、操作および製造
の容易さのために、好ましい分子量は、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間であ
る（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子
が規定された分子量よりも大きく、いくつかは小さいことを示す）。他のサイズ
は、所望の治療的プロフィール（例えば、所望される徐放性の持続、効果（生物
学的活性に対して、もしあるとすれば）、操作の容易性、抗原性の程度または欠
損、および治療的タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの
他の公知の効果）に依存して使用され得る。[0133] The polymer can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. For polyethylene glycol, for ease of operation and manufacture, the preferred molecular weight is between about 1 kDa and about 100 kDa (the term "about" refers to the definition of some molecules in a preparation of polyethylene glycol). Larger than the molecular weight, and some are smaller). Other sizes may include the desired therapeutic profile (eg, desired sustained release, effect (if any to biological activity), ease of manipulation, degree of antigenicity or deficiency). And other known effects of polyethylene glycol on therapeutic proteins or analogs).

【０１３４】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、タンパク質の機能
性もしくは抗原性ドメインに対する効果を考慮して、このタンパク質に付着され
るべきである。当業者に利用可能な多くの付着方法が存在する（例えば、本明細
書中で参考として援用されるＥＰ ０ ４０１ ３８４（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへ
の結合）、また、Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１
０３５（１９９２）（トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を
使用するＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告している）。例
えば、ポリエチレングリコールは、反応基（例えば、遊離のアミノ基またはカル
ボキシル基）を介して、アミノ酸残基を通じて共有結合的に結合され得る。反応
基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得る基である。遊離
のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残
基が挙げられ得る：遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アス
パラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る
。スルフヒドリル基はまた、ポリエチレングリコール分子に付着するための反応
基として使用され得る。治療目的について好ましいのは、Ｎ末端またはリジン残
基での付着のような、アミノ基での付着である。A polyethylene glycol molecule (or other chemical moiety) should be attached to a protein in view of its effect on the functional or antigenic domain of the protein. There are many attachment methods available to those skilled in the art (eg, EP 0 401 384 (attachment of PEG to G-CSF), which is hereby incorporated by reference), and also see Malik et al., Exp. 20: 1028-1
035 (1992) (reporting the pegylation of GM-CSF using tresyl chloride). For example, polyethylene glycol can be covalently attached through a reactive group, such as a free amino or carboxyl group, through an amino acid residue. A reactive group is a group to which an activated polyethylene glycol molecule can be bound. Amino acid residues having a free amino group may include lysine residues and the N-terminal amino acid residue: amino acid residues having a free carboxyl group include aspartic acid residues, glutamic acid residues, and C-terminal amino acid residues. Amino acid residues may be mentioned. Sulfhydryl groups can also be used as reactive groups for attaching to polyethylene glycol molecules. Preferred for therapeutic purposes is attachment at an amino group, such as attachment at the N-terminus or lysine residue.

【０１３５】 Ｎ末端で化学的に改変されるタンパク質を、特に所望し得る。本発明の組成物
の例示として使用するポリエチレングリコールを用いては、種々のポリエチレン
グリコール分子から（分子量、分岐などによる）、反応混合物中のタンパク質（
またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実行される
べきペグ化反応の型、および選択されるＮ末端がペグ化されたタンパク質を得る
方法を選択し得る。Ｎ末端がペグ化された調製物を得る（すなわち、必要であれ
ば、他のモノペグ化（ｍｏｎｏｐｅｇｙｌａｔｅｄ）された部分からこの部分を
分離する）方法は、ペグ化されたタンパク質分子の集団からＮ末端がペグ化され
た物質を精製することにより得る。Ｎ末端の改変において化学的に改変される選
択的タンパク質は、特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な異なる型の主要な
アミノ基（リジン対Ｎ末端）の差次的な反応性を開発する、還元性のアルキル化
によって達成され得る。適切な反応条件下において、カルボニル基を含むポリマ
ーを用いるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が、達成される。A protein that is chemically modified at the N-terminus may be particularly desirable. Using polyethylene glycol, which is used as an example of the composition of the present invention, the protein (in terms of molecular weight, branching, etc.) in the reaction mixture (from various polyethylene glycol molecules)
The ratio of the polyethylene glycol molecules to the (or peptide) molecules, the type of PEGylation reaction to be performed, and the method of obtaining the selected N-terminally PEGylated protein can be selected. Methods for obtaining N-terminally pegylated preparations (ie, if necessary, separating this part from other monopegylated parts) involve the use of N-terminal from a population of pegylated protein molecules. Is obtained by purifying the pegylated material. Selective proteins that are chemically modified in the N-terminal modification develop differential reactivity of different types of major amino groups (lysine vs. N-terminal) available for derivatization of a particular protein, It can be achieved by reductive alkylation. Under appropriate reaction conditions, substantially selective derivatization of the protein at the N-terminus with a polymer containing carbonyl groups is achieved.

【０１３６】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドは、任意
の従来の手段によって生成され得る。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）
Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐ
ｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉ
ｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１〜５１３５。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセス
は、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）に対する米国特許第４，６３１，２１１号
において、さらに記載される。[0136] The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means. Houghten, R .; A. (1985)
General method for the rapid solid-p
case synthesis of large numbers of p
eptides: specificity of antigen-antib
ody interaction at the level of indi
visual amino acids. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 82: 5131-5135. This "Simultaneous M
The "multiple Peptide Synthesis (SMPS)" process is further described in U.S. Pat. No. 4,631,211 to Houghten et al. (1986).

【０１３７】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１
、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇ
Ａ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＹが挙げられる。本明細書
中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖抗体全体、およびこれらの
抗原結合フラグメントを含む、抗体全体を含むことを意味する。最も好ましくは
、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ
（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合化
Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬドメインかまたはＶＨドメインのいずれかを
含むフラグメントを含むがこれらに限定されない）である。これらの抗体は、鳥
類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、これらの
抗体はヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワト
リである。The invention further relates to antibodies and T cell antigen receptors (TCRs) that specifically bind to a polypeptide of the invention. The antibodies of the present invention include IgG (IgG1
, IgG2, IgG3, and IgG4), IgA (IgA1 and IgA
A2), IgD, IgE, IgM, and IgY. As used herein, the term "antibody" (Ab) is meant to include whole single chain antibodies and whole antibodies, including antigen-binding fragments thereof. Most preferably, the antibody is a human antigen binding antibody fragment (Fab, Fab 'and F) of the present invention.
(Ab ′) 2, Fd, single-chain Fvs (scFv), single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv), and fragments containing either the VL domain or the VH domain). . These antibodies can be from any animal origin, including birds and mammals. Preferably, these antibodies are human, murine, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken.

【０１３８】 抗原結合抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域単独、または以下
の全体もしくは一部との組合せを含み得る：ちょうつがい部位、ＣＨ１、ＣＨ２
、およびＣＨ３ドメイン。本発明内には、可変領域とちょうつがい部位、ＣＨ１
、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組合せもまた含まれる。本発明はさ
らに、本発明のポリペプチドを特異的に結合する、キメラ抗体、ヒト化抗体、な
らびにヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を含む。本発明は
さらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。Antigen binding antibody fragments (including single chain antibodies) may comprise the variable region alone or in combination with all or part of the following: hinge site, CH1, CH2
, And CH3 domain. Within the present invention, the variable region and the hinge site, CH1
, CH2, and CH3 domains are also included. The present invention further includes chimeric, humanized, and human monoclonal and polyclonal antibodies that specifically bind a polypeptide of the present invention. The present invention further includes antibodies that are anti-idiotypic to the antibodies of the present invention.

【０１３９】 本発明の抗体は、単一抗原特異的、二抗原特異的、三抗原特異的またはより多
くの多抗原特異的であり得る。多抗原特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの
異なるエピトープに特異的であっても良いし、または本発明のポリペプチドの両
方ならびに異種組成物（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持材料）に特
異的であっても良い。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；
ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ．Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第５，５７３，９２０号、
同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８
１号、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ．Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。The antibodies of the present invention can be mono-antigen-specific, bi-antigen-specific, tri-antigen-specific or more multi-antigen-specific. Multiantigen-specific antibodies may be specific for different epitopes of a polypeptide of the invention, or may be specific for both polypeptides of the invention and heterologous compositions (eg, heterologous polypeptides or solid support materials). It may be specific. For example, WO93 / 17715; WO92 / 08802;
WO 91/05793; WO 92/05793; Tutt. A et al. Immu
nol. 147: 60-69 (1991); U.S. Patent No. 5,573,920;
Nos. 4,474,893, 5,601,819 and 4,714,68
No. 1, No. 4,925,648; Kostelny. S. A. J. et al. Imm
unol. 148: 1547-1553 (1992).

【０１４０】 本発明の抗体は、抗体によって認識されるかまたは特異的に結合される本発明
のポリペプチドのエピトープまたは部分について記載または特定され得る。この
エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば
、Ｎ末端位置およびＣ末端位置によって、連続するアミノ酸残基のサイズによっ
て、または表および図に列挙されるように特定され得る。本発明の任意のエピト
ープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた、除外され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、そして同一
物の除外を可能にする。An antibody of the invention can be described or specified for an epitope or portion of a polypeptide of the invention that is recognized or specifically bound by the antibody. The epitope or polypeptide portion may be identified as described herein, for example, by N-terminal and C-terminal positions, by the size of contiguous amino acid residues, or as listed in the tables and figures. Can be done. Antibodies that specifically bind any epitope or polypeptide of the present invention may also be excluded. Accordingly, the present invention includes antibodies that specifically bind a polypeptide of the present invention, and allows for the exclusion of the same.

【０１４１】 本発明の抗体はまた、これらの交差反応性について記載または特定され得る。
本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）
、またはホモログを結合しない抗体は、含まれる。本発明のポリペプチドに対し
て、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未
満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当該分
野で公知の方法、および本明細書中に記載される方法を使用して計算されるよう
に）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。本発明
において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書中に記載
されるような）下において本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみを結合する抗体が、さらに
含まれる。本発明の抗体はまた、これらの結合親和性について記載または特定さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ
、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10 Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５× １０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１ ０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する結合親和性が挙げられる。The antibodies of the present invention may also be described or specified for their cross-reactivity.
Any other analog of the polypeptides of the invention, ortholog
Or antibodies that do not bind homologs are included. For polypeptides of the invention, less than 95%, less than 90%, less than 85%, less than 80%, less than 75%, less than 70%, less than 65%, less than 60%, less than 55%, and less than 50% Antibodies that do not bind polypeptides that have identity (as calculated using methods known in the art and described herein) are also included in the invention. The present invention further includes an antibody that binds only a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide of the present invention under stringent hybridization conditions (as described herein). It is. The antibodies of the present invention may also be described or specified for their binding affinity. Preferred binding affinity is 5 × 10 −6 M, 10 −6 M, 5 × 10 −7 M
, 10 -7 M, 5 x 10 -8 M, 10 -8 M, 5 x 10 -9 M, 10 -9 M, 5 x 10 -10 M, 10 -10 M, 5 x 10 -11 M, 10 −11 M, 5 × 10 −12 M, 10 −12 M, 5 × 10 −13 M, 10 −13 M, 5 × 10 −14 M, 10 −14 M, 5 × 10 −15 M, and 10 Binding affinities with a dissociation constant or Kd of less than -15 M are mentioned.

【０１４２】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的化する、当
該分野で公知の方法を含むがこれらに限定されない使用を有し、これは、インビ
トロおよびインビボの両方の診断方法ならびに治療方法を含む。例えば、これら
の抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的お
よび定量的に測定するための免疫アッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａ
ｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
、第２版、１９９８）を参照のこと（これらの全体が参考として援用される）。The antibodies of the invention have uses, including but not limited to, methods known in the art, for purifying, detecting, and targeting polypeptides of the invention, including both in vitro and in vivo. And diagnostic methods. For example, these antibodies have use in immunoassays for qualitatively and quantitatively measuring levels of a polypeptide of the invention in biological samples. For example, Ha
rlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL
(Cold Spring Harbor Laboratory Press
, Second Edition, 1998), which are incorporated by reference in their entirety.

【０１４３】 本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用され得る。こ
れらの抗体はさらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に対して化学的に結合体
化され得る（共有結合および非共有結合体化を含む）。例えば、本発明の抗体は
、異種ポリペプチド、薬物、または毒素のような、検出アッセイにおける標識お
よびエフェクター分子として有用である分子に組換え的に融合され得るか、また
は結合体化され得る。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；
ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ０ ３
９６ ３８７を参照のこと。The antibodies of the present invention can be used alone or in combination with other compositions. These antibodies can be further recombinantly fused at the N-terminus or C-terminus to a heterologous polypeptide, or chemically conjugated to a polypeptide or other composition (covalently and non-covalently). Conjugation). For example, the antibodies of the invention can be recombinantly fused or conjugated to molecules that are useful as labels and effector molecules in detection assays, such as heterologous polypeptides, drugs, or toxins. For example, WO 92/08495; WO 91/14438;
WO 89/12624; US Pat. No. 5,314,995; and EP 03
See 96 387.

【０１４４】 本発明の抗体を、当該分野において公知である任意の適切な方法により調製し
得る。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリク
ローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。モノクロ
ーナル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む、当該分野に
おいて公知である広範な技術を使用して調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら
、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．第２版
、１９８８）：Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢ
ＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ５６３〜６８１（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考
として援用される）を参照のこと。[0144] Antibodies of the present invention may be prepared by any suitable method known in the art. For example, a polypeptide of the invention or an antigenic fragment thereof can be administered to an animal to induce the production of serum containing polyclonal antibodies. Monoclonal antibodies can be prepared using a wide variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma and recombinant technology. See, for example, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Col.
d Spring Harbor Laboratory Press. 2nd edition, 1988): Hammerling et al., MONOCLONAL ANTIB.
ODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (
Elsevier, N .; Y. , 1981) (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０１４５】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント
を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため
）のような酵素を使用して、タンパク質分解性切断によって産生され得る。[0145] Fab and F (ab ') 2 fragments can be proteolytically purified using enzymes such as papain (to produce Fab fragments) or pepsin (to produce F (ab') 2 fragments). It can be produced by cleavage.

【０１４６】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知である方法を使用する、組換えＤ
ＮＡ技術の適用を通じてかまたは合成化学を通じて産生され得る。例えば、本発
明の抗体は、当該分野で公知である種々のファージディスプレイ法を使用して調
製され得る。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインは、それらを
コードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上に提示される。所
望の結合特性を有するファージは、抗原（代表的には固体表面またはビーズに結
合されたかまたは捕捉された抗原）を用いて直接的に選択することによって、レ
パートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウ
スから選択される。これらの方法で使用されるファージは、代表的には、Ｆａｂ
を有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージである。Ｆｖまたはジスルフィド
で安定化されたＦｖ抗体ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩ
Ｉタンパク質のいずれかに組換え融合される。本発明の抗体を作製するために使
用され得るファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ．ら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０（１９９５）：Ａｍｅｓ，
Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６（
１９９５）：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ．Ｃ．Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．２４：９５２〜９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ
１８７：９〜１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１〜２８０（１９９４）；ＰＣＴ
／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ
９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９
５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２
６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０
，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，
８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同
第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７
号および同第５，７３３，７４３号（上記の参考文献は、それらの全体が参考と
して援用される）に開示されるものを含む。[0146] Alternatively, the antibodies of the present invention can be made using recombinant D, using methods known in the art.
It can be produced through the application of NA technology or through synthetic chemistry. For example, the antibodies of the present invention can be prepared using various phage display methods known in the art. In phage display methods, functional antibody domains are displayed on the surface of phage particles that carry the polynucleotide sequences that encode them. Phage with the desired binding properties are selected directly by using an antigen (typically an antigen bound or captured on a solid surface or a bead) to generate a repertoire or combinatorial antibody library (eg, a human antibody). Alternatively, the phage used in these methods is typically a Fab.
Is a filamentous phage containing fd and M13. Fv or Fv antibody domains stabilized with disulfide can be expressed by phage gene III or gene VII.
It is recombinantly fused to any of the I proteins. Examples of phage display methods that can be used to make the antibodies of the invention are described in Brinkman U.S. Pat. J. et al. I
mmunol. Methods 182: 41-50 (1995): Ames,
R. S. J. et al. Immunol. Methods 184: 177-186 (
1995): Kettleborough. C. A. Et al., Eur. J. Immu
nol. 24: 952-958 (1994); Persic, L .; Et al., Gene
187: 9-18 (1997); Burton, D .; R. Et al., Advance
s in Immunology 57: 191-280 (1994); PCT.
/ GB91 / 01134; WO90 / 02809; WO91 / 10737; WO
WO 92/18619; WO 93/11236; WO 9
WO 95/20401; and US Pat. No. 5,698,42.
No. 6, No. 5,223,409, No. 5,403,484, No. 5,580
No. 717, No. 5,427,908, No. 5,750,753, No. 5,
Nos. 821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, and 5,658,727.
And those disclosed in U.S. Pat. No. 5,733,743 (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０１４７】 上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択の後、ファージからの抗体
コード領域を単離し得、そして使用し、抗体全体（ヒト抗体を含む）、または任
意の他の所望される抗原結合フラグメントを生成し、そして任意の所望される宿
主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）中で発現す
る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え産生
するための技術もまた、当該分野で公知の方法（例えば、ＷＯ９２／２２３２４
；Ｍｕｌｌｉｎａｘ．Ｒ．Ｌ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：８６４
〜８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ．Ｈ．ら、ＡＪＲＩ ３４：２６〜３
４（１９９５）；ならびにＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１
０４１〜１０４３（１９８８）に開示される方法）（上記の参考文献は、それら
の全体が参考として援用される）を使用して用いられ得る。After phage selection, the antibody coding region from the phage can be isolated and used, as described in the above references, and used in whole antibodies (including human antibodies), or any other desired The resulting antigen binding fragment is produced and expressed in any desired host, including mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast, and bacteria. For example, techniques for recombinantly producing Fab, Fab ', and F (ab') 2 fragments are also known in the art (eg, WO 92/22324).
Mullinax. R. L. Et al., BioTechniques 12: 864.
-869 (1992); and Sawai. H. Et al., AJRI 34: 26-3
4 (1995); and Better, M .; Et al., Science 240: 1
041-1043 (1988)) (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０１４８】 単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用され得る技術の例は、米国特許第４
，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら（１９９
１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜８８；Ｓｈ
ｕ，Ｌ．ら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０；７９９５〜７９９９；およびＳｋｅｒ
ｒａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜１０４０（１９８８）に記
載されるものを含む。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロで
の検出アッセイを含む、いくつかの使用については、キメラ、ヒト化、またはヒ
ト抗体を使用することは、好ましくあり得る。キメラ抗体を産生するための方法
は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：
２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０７
，７１５号を参照のこと。抗体は、ＣＤＲ改変（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（ＥＰ ０
２３９ ４００；ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号
；および同第５，５８５，０８９号）、被膜化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再
表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ ０ ５
１９ ５９６；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９〜４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ
Ｇ．Ｍ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：
８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ら（１９９４） ＰＮＡＳ ９１：
９６９〜９７３）、ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２
号）を含む、種々の技術を使用してヒト化され得る。ヒト抗体は、上記のファー
ジディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法によって作製され得る。
米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５
，８０６号、および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４６６４
５（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）もまた参照のこ
と。Examples of techniques that can be used to produce single-chain Fvs and antibodies are described in US Pat.
Huston et al. (1992), 946,778 and 5,258,498;
1) Methods in Enzymology 203: 46-88; Sh
u, L. (1993) PNAS 90; 7995-7999; and Sker.
ra, A .; Science 240: 1038-1040 (1988). For some uses, including in vivo use of antibodies in humans and in vitro detection assays, it may be preferable to use chimeric, humanized, or human antibodies. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. For example, Morrison, Science
229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:
214 (1986); Gillies, S .; D. (1989) J. Am. Immun
ol. Methods 125: 191-202; and US Pat. No. 5,807.
See, No. 715. Antibodies are used for CDR-grafting (EP 0
Nos. 239 400; WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,530,101; and 5,585,089), veneering or resurfacing (EP 0 592 106; EP 0 5).
19596; Padlan E. et al. A. , (1991) Molecular I
Munology 28 (4/5): 489-498; Studnicka
G. FIG. M. (1994) Protein Engineering 7 (6):
805-814; Roguska M .; A. (1994) PNAS 91:
969-973), as well as chain shuffling (U.S. Pat. No. 5,565,332).
) Can be humanized using various techniques. Human antibodies can be produced by various methods known in the art, including the phage display method described above.
U.S. Pat. Nos. 4,444,887, 4,716,111 and 5,545
, 806, and 5,814, 318; and WO 98/4664.
5 (the references above are incorporated by reference in their entirety).

【０１４９】 さらに、本発明において、本発明のポリペプチドに組換え融合されたかまたは
化学的に結合された（共有結合および非共有結合の両方を含む）抗体を含む。こ
の抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体
を使用し、本発明のポリペプチドを、インビトロまたはインビボのいずれかで、
本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合させる
かまたは結合させることによって、特定の細胞型に標的化し得る。本発明のポリ
ペプチドに融合されたかまたは結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を
使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方法にて使用され得る。例えば、
Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＷＯ ９３／２１２３２；ＥＰ ０ ４３９ ０９
５；Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜９９
（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号：Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら
（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：１４２８〜１４３２；Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら、（
１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：２４４６〜２４５２（上記の参考文
献は、それらの全体が参考として援用される）を参照のこと。Furthermore, the present invention includes antibodies recombinantly fused or chemically conjugated (including both covalent and non-covalent) to the polypeptides of the present invention. This antibody may be specific for an antigen other than the polypeptide of the invention. For example, using an antibody, a polypeptide of the present invention can be administered either in vitro or in vivo.
The polypeptides of the invention can be targeted to a particular cell type by fusing or binding to an antibody specific for a particular cell surface receptor. Antibodies fused or conjugated to a polypeptide of the invention can also be used in in vitro immunoassays and purification methods using methods known in the art. For example,
Harbor et al., Supra and WO 93/21232; EP 0 439 09.
5; Naramura, M .; Et al., Immunol. Lett. 39: 91-99
(1994); US Pat. No. 5,474,981: Gillies, S .; O. (1992) PNAS 89: 1428-1432; Fell, H .; P. (
1991). Immunol. 146: 2446-2452 (the references mentioned above are incorporated by reference in their entirety).

【０１５０】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチド
を、抗体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合し得る。本発明のポリペ
プチドに融合された抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン
、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそのドメイン全体または部分の任意の組合せ
を含み得る。本発明のポリペプチドは、このポリペプチドのインビボの半減期を
増加するためか、または当該分野で公知の方法を使用してイムノアッセイにおけ
る使用のために上記の抗体部分に融合または結合され得る。このポリペプチドは
また、マルチマーを形成するように上記の抗体部分に融合または結合され得る。
例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分の間でジスル
フィド結合を通じて２量体を形成し得る。より高次なマルチマー型は、このポリ
ペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合することにより作製され得る。本発
明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、当該分野にお
いて公知である。例えば、米国特許第５，３３６、６０３号、同第５，６２２，
９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４
４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ
０ ３６７ １６６；ＷＯ ９６／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａ
ｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：１０５３５〜１０５３
９；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９
０〜５６００；およびＶｉｌ，Ｈ．ら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９；１１３３７
〜１１３４１（上記の参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参
照のこと。The present invention further includes compositions comprising a polypeptide of the present invention fused or conjugated to a domain of the antibody other than the variable region. For example, a polypeptide of the invention can be fused or linked to the Fc region of an antibody, or a portion thereof. The antibody portion fused to the polypeptide of the present invention may comprise the hinge region, CH1 domain, CH2 domain, and CH3 domain, or any combination of the entire domain or portions thereof. A polypeptide of the present invention can be fused or conjugated to an antibody moiety described above for increasing the in vivo half-life of the polypeptide, or for use in immunoassays using methods known in the art. The polypeptide can also be fused or conjugated to the antibody portion described above to form a multimer.
For example, an Fc portion fused to a polypeptide of the invention may form a dimer through a disulfide bond between the Fc portions. Higher multimeric forms can be made by fusing the polypeptide to portions of IgA and IgM. Methods for fusing or attaching a polypeptide of the invention to an antibody moiety are known in the art. For example, U.S. Patent Nos. 5,336,603 and 5,622.
No. 929, 5,359,046, 5,349,053, 5,4
No. 47,851, No. 5,112,946; EP 0 307 434, EP
0 367 166; WO 96/04388; WO 91/06570; A
shkenazi, A .; (1991) PNAS 88: 10535-1053.
9; Zheng, X .; X. (1995) J. Am. Immunol. 154: 559
0-5600; and Vil, H .; (1992) PNAS 89; 11337.
-11341 (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０１５１】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は部分的にかまたは完全にかのいず
れかで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を妨害する抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンド結合を妨害しないが、レセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗
体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に
記載される技術または当該分野において公知の技術によって決定され得る。リガ
ンド結合およびレセプター活性化の両方を妨害するレセプター特異的抗体もまた
含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてこのレセプターに対するリガンド
の結合を妨害する中和抗体、ならびにこのリガンドに結合し、それによってレセ
プター活性化を妨害するが、このリガンドがこのレセプターに結合することを妨
害しない抗体が含まれる。さらに、このレセプターを活性化する抗体が含まれる
。これらの抗体は、リガンド媒介性レセプター活性化により影響される、全てか
または全てよりも小さい生物学的活性のいずれかに対するアゴニストとして作用
し得る。この抗体は、本明細書中に開示される比活性を含む生物学的活性に対し
てアゴニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体のアゴニス
トは、当該分野において公知である方法を使用して作製され得る。例えば、ＷＯ
９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら（１
９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１〜１９８８；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら（１
９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８〜３６７８；Ｈａｒｒ
ｏｐ，Ｊ．Ａ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６〜
１７９４；Ｚｈｕ，Ｚ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）：
３２０９〜３２１４；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１６０（７）：３１７０〜３１７９；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７〜２４７；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら（１９
９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７〜１９０；
Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２３３
〜２４１；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２（１７）：１１２９５〜１１３０１；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら（１９
９５）Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５〜７６２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら
（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３〜１１６７；Ｂａｒｔｕ
ｎｅｋ，Ｐ．ら（１９９６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４〜２０（上記の
参考文献は、それらの全体が参考として援用される）を参照のこと。The present invention further relates to antibodies that act as agonists or antagonists of the polypeptides of the present invention. For example, the present invention includes antibodies that either partially or completely block a receptor / ligand interaction with a polypeptide of the present invention. Both receptor-specific and ligand-specific antibodies are included.
Receptor-specific antibodies that do not interfere with ligand binding but do interfere with receptor activation are included. Receptor activation (ie, signal transduction) can be determined by the techniques described herein or known in the art. Receptor-specific antibodies that interfere with both ligand binding and receptor activation are also included. Similarly, neutralizing antibodies that bind to a ligand and prevent binding of the ligand to the receptor, as well as bind to the ligand and thereby prevent receptor activation, but prevent the ligand from binding to the receptor Not included antibodies. Furthermore, antibodies that activate this receptor are included. These antibodies can act as agonists for either all or less than all of the biological activity affected by ligand-mediated receptor activation. The antibodies can be identified as agonists or antagonists for biological activities, including the specific activities disclosed herein. Agonists of the above antibodies can be made using methods known in the art. For example, WO
96/40281; U.S. Patent No. 5,811,097; (1
998) Blood 92 (6): 1981-1988; Chen, Z. et al. (1
998) Cancer Res. 58 (16): 3668-3678; Harr
op, J.M. A. (1998) J. Am. Immunol. 161 (4): 1786-
1794; Zhu, Z .; (1998) Cancer Res. 58 (15):
3209-3214; Yoon, D .; Y. (1998) J. Am. Immunol.
160 (7): 3170-3179; Prat, M .; (1998) J. Am. Cel
l. Sci. 111 (Pt2): 237-247; (19
97) J. Immunol. Methods 205 (2): 177-190;
Liauard, J .; (1997) Cytokinde 9 (4): 233
241; Carlson, N .; G. FIG. (1997) J. Am. Biol. Chem.
272 (17): 11295-11301; Taryman, R .; E. FIG. (19
95) Neuron 14 (4): 755-762; Muller, Y .; A. (1998) Structure 6 (9): 1153-1167; Bartu.
nek, P .; (1996) Cytokine 8 (1): 14-20 (the above references are incorporated by reference in their entirety).

【０１５２】 さらなる実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＩＭ ＩＩの機
能的な性状をコードする。この点における本発明の好ましい実施態様は、ＡＩＭ
ＩＩの、αヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシート
およびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ター
ン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎
水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域ならび
に高抗原性指数領域を含むフラグメントを含む。In a further embodiment, a polynucleotide of the invention encodes a functional property of AIM II. A preferred embodiment of the invention in this regard is the AIM
II, α-helix and α-helix forming region (“α region”), β-sheet and β-sheet forming region (“β region”), turn and turn forming region (“turn region”), coil and coil forming region (“ Coil regions "), hydrophilic regions, hydrophobic regions, alpha amphipathic regions, beta amphipathic regions, flexible regions, surface forming regions, as well as fragments including high antigenic index regions.

【０１５３】 図３Ａ〜Ｆおよび／または表２に示されるＡＩＭ ＩＩの構造的または機能的
性状を示すデータは、デフォルトパラメータで設定されたＤＮＡ*ＳＴＡＲの種 々のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成された。好ましい実施態様に
おいて、表２のカラムＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに提示されるデ
ータを使用し、抗原性について高度の可能性を示すＡＩＭ ＩＩの領域を決定し
得る。高抗原性の領域は、カラムＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＩ
Ｖに提示されるデータから、抗原の認識が免疫応答の開始プロセスにおいて生じ
得る環境においてポリペプチドの表面に露出されるようであるポリペプチドの領
域を示す値を選択することによって決定される。The data indicating the structural or functional properties of AIM II shown in FIGS. 3A-F and / or Table 2 were generated using various modules and algorithms of DNA * STAR set with default parameters. Was done. In a preferred embodiment, the data presented in columns VIII, IX, XIII, and XIV of Table 2 can be used to determine regions of AIM II that exhibit a high potential for antigenicity. The region of high antigenicity can be found in columns VIII, IX, XIII and / or I
From the data presented in V, it is determined by choosing a value that indicates the region of the polypeptide that is likely to be exposed on the surface of the polypeptide in an environment where recognition of the antigen can occur in the process of initiating the immune response.

【０１５４】 これらの点における特定の好ましい領域は、図３Ａ〜Ｆに示されるが、図３Ａ
〜Ｆにおいて提示されるデータの表の表示を使用して、表２に示されるように表
され得るかまたは同定され得る。図３Ａ〜Ｆを生成するために使用されるＤＮＡ * ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（最初のデフォルトパラメータで設定さ れる）を使用し、表の形式で図３Ａ〜Ｆにデータを提示した（表２を参照のこと
）。図３Ａ〜Ｆにおける表形式のデータを使用し、好ましい領域の特定の境界を
容易に決定し得る。Certain preferred areas at these points are shown in FIGS.
-F using the tabular representation of the data presented in Table 2 as shown in Table 2.
Or can be identified. DNA used to generate Figures 3A-F * The data were presented in the form of tables in FIGS. 3A-F using the STAR computer algorithm (set by the initial default parameters) (see Table 2).
). Using the tabular data in FIGS. 3A-F, the specific boundaries of the preferred area are identified.
It can be easily determined.

【０１５５】 図３Ａ〜Ｆおよび表２に示される上述の好ましい領域は、図１Ａおよび図Ｂに
示されたアミノ酸配列の分析により同定された上述の型の領域を含むがこれらに
限定されない。図３Ａ〜Ｆおよび表２に示されるように、このような好ましい領
域は、ガルニエ−ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）α領域、β領域、
ターン領域、およびコイル領域、チョウ−ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ
）α領域、ベータ領域、およびコイル領域、カイト−ドーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄ
ｏｏｌｉｔｔｌｅ）親水性領域および疎水性領域、アイゼンベルグ（Ｅｉｓｅｎ
ｂｅｒｇ）α両親媒性領域およびβ両親媒性領域、カープラス−シュルツ（Ｋａ
ｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ）可撓性領域、エミニ（Ｅｍｉｎｉ）表面形成領域お
よび高抗原性指数のジェームソン−ヴォルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）領域
を含む。The above-described preferred regions shown in FIGS. 3A-F and Table 2 include, but are not limited to, the above-described types of regions identified by analysis of the amino acid sequences shown in FIGS. 1A and 1B. As shown in FIGS. 3A-F and Table 2, such preferred regions include the Garnier-Robson α region, the β region,
Turn and coil regions, Chou-Fasman
) Alpha, beta, and coil regions, kite-daw little (Kyte-D
oolitol hydrophilic and hydrophobic regions, Eisenberg (Eisen)
berg) α- and β-amphiphilic regions, Carplus-Schulz (Ka
rplus-Schulz flexible region, Emini surface forming region and Jameson-Wolf region with high antigenic index.

【０１５６】[0156]

【表２】 この点に関して特に非常に好ましいフラグメントは、いくつかの構造的特性（
例えば、上記の表２に示すいくつかの特性）を組み合わせるＡＩＭ ＩＩの領域
を含むフラグメントである。[Table 2] Particularly highly preferred fragments in this regard are those having several structural properties (eg,
For example, a fragment containing a region of AIM II that combines some of the properties shown in Table 2 above.

【０１５７】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを用いて、リンパ節症を生じるリンパ増殖
（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）疾患を処置し得る。ＡＩＭ ＩＩ
は、Ｔ細胞のクローン枯渇を刺激することによってアポトーシスを媒介し、従っ
て、自己免疫疾患を処置するため、末梢性寛容および細胞傷害性Ｔ細胞媒介アポ
トーシスを刺激するために用いられ得る。ＡＩＭ ＩＩはまた、全身性エリテマ
トーデス（ＳＬＥ）、グレーヴズ病、免疫増殖性疾患、リンパ節症（ＩＰＬ）、
血管免疫増殖性リンパ節症（ＡＩＬ）、免疫芽球性リンパ節症（ＩＢＬ）、慢性
関節リウマチ、糖尿病、および多発性硬化症、アレルギーを含む自己免疫障害の
生物学を解明する際に研究ツールとして用いられ得、そして対宿主性移植片病を
処置し得る。AIM II polypeptides of the present invention can be used to treat lymphoproliferative diseases that result in lymphadenopathy. AIM II
Mediates apoptosis by stimulating clonal depletion of T cells, and thus can be used to treat peripheral immune and cytotoxic T cell-mediated apoptosis to treat autoimmune diseases. AIM II also includes systemic lupus erythematosus (SLE), Graves' disease, immunoproliferative disease, lymphadenopathy (IPL),
Research tools in elucidating the biology of autoimmune disorders including vascular immunoproliferative lymphadenopathy (AIL), immunoblastic lymphadenopathy (IBL), rheumatoid arthritis, diabetes, and multiple sclerosis, allergy And can treat graft-versus-host disease.

【０１５８】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、新形成（例えば、腫瘍細胞増殖）
を阻害するために用いられ得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、特定の細胞に対
するアポトーシスおよび細胞傷害性を通じる、腫瘍の破壊の原因であり得る。Ａ
ＩＭ ＩＩはまた、増殖促進活性（例えば、再狭窄）を必要とする疾患を処置す
るために用いられ得る。なぜなら、ＡＩＭ ＩＩは、内皮起源の細胞に増殖効果
を有するからである。従って、ＡＩＭ ＩＩはまた、内皮細胞の発達において造
血を調節するために用いられ得る。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used in neoplasia (eg, tumor cell growth)
Can be used to inhibit AIM II polypeptides may be responsible for tumor destruction through apoptosis and cytotoxicity to specific cells. A
IM II can also be used to treat diseases that require growth promoting activity (eg, restenosis). AIM II has a proliferative effect on cells of endothelial origin. Thus, AIM II can also be used to regulate hematopoiesis in endothelial cell development.

【０１５９】 本発明はまた、ＡＩＭ ＩＩに結合する分子（例えば、レセプター分子）の同
定のための方法を提供する。ＡＩＭ ＩＩを結合するタンパク質（例えば、レセ
プタータンパク質）をコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法（例えば
、リガンドパニングおよびＦＡＣＳ選別）によって同定され得る。このような方
法は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）のような多数の実験マ
ニュアルに記載される。The invention also provides a method for the identification of a molecule (eg, a receptor molecule) that binds to AIM II. Genes encoding proteins (eg, receptor proteins) that bind AIM II can be identified by a number of methods known to those of skill in the art, such as ligand panning and FACS sorting. Such methods are described, for example, in Coligan et al., Current Protocols in
Immunology 1 (2): described in a number of experimental manuals, such as Chapter 5 (1991).

【０１６０】 例えば、発現クローニングを、この目的のために用い得る。この目的のために
、ポリアデニル化されたＲＮＡを、ＡＩＭ ＩＩに応答する細胞から調製する。
ｃＤＮＡライブラリーをこのＲＮＡから作製する。このライブラリーを、プール
に分割し、そしてこのプールを、ＡＩＭ ＩＩに応答しない細胞中に個々にトラ
ンスフェクトする。次いで、このトランスフェクトされた細胞を、標識されたＡ
ＩＭ ＩＩに暴露する。（ＡＩＭ ＩＩは、放射ヨウ素化または部位特異的プロ
テインキナーゼに対する認識部位の封入の標準的な方法を含む種々の周知の技術
により標識され得る）。曝露に続いて、この細胞を固定し、そしてＡＩＭ ＩＩ
の結合を決定する。これらの手順をガラススライド上で都合よく実行する。For example, expression cloning may be used for this purpose. To this end, polyadenylated RNA is prepared from cells that respond to AIM II.
A cDNA library is made from this RNA. The library is divided into pools and the pools are individually transfected into cells that do not respond to AIM II. The transfected cells are then labeled A
Exposure to IM II. (AIM II can be labeled by a variety of well-known techniques, including standard methods of radioiodination or encapsulation of recognition sites for site-specific protein kinases). Following exposure, the cells are fixed and AIM II
Is determined. These procedures are conveniently performed on glass slides.

【０１６１】 ＡＩＭ ＩＩ結合細胞を産生するｃＤＮＡのプールを同定する。サブプールを
これらの陽性物から調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、そして上記のよう
にスクリーニングする。サブプールおよび再スクリーニングプロセスの反復を使
用して、推定結合分子（例えば、レセプター分子）をコードする１つ以上の単一
クローンを単離し得る。A pool of cDNAs producing AIM II binding cells is identified. Subpools are prepared from these positives, transfected into host cells, and screened as described above. Using subpools and iterations of the rescreening process, one or more single clones encoding putative binding molecules (eg, receptor molecules) can be isolated.

【０１６２】 あるいは、標識されたリガンドは、例えば、レセプター分子に結合する分子を
発現する細胞から調製される細胞抽出物（例えば、膜または膜抽出物）に連結し
た光親和性であり得る。架橋物質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡ
ＧＥ」）により分離し、そしてＸ線フィルムに曝露する。リガンドレセプターを
含む標識された複合体を、切り出し、ペプチドフラグメントに分解し、そしてタ
ンパク質微量配列決定に供し得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を使
用し、独特のオリゴヌクレオチドプローブまたは縮重オリゴヌクレオチドプロー
ブを設計し、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定レセプター分子
をコードする遺伝子を同定し得る。Alternatively, the labeled ligand can be photoaffinity linked, eg, to a cell extract (eg, a membrane or a membrane extract) prepared from cells expressing a molecule that binds to the receptor molecule. The cross-linked substance was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (“PA
GE ") and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the ligand receptor can be excised, broken down into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. Using the amino acid sequences obtained from microsequencing, unique or degenerate oligonucleotide probes can be designed and cDNA libraries can be screened to identify the gene encoding the putative receptor molecule.

【０１６３】 本発明のポリペプチドをまた使用して、細胞または無細胞抽出物において、Ａ
ＩＭ ＩＩ結合分子（例えば、レセプター分子）のＡＩＭ ＩＩ結合能力を評価
し得る。The polypeptides of the present invention can also be used in cells or cell-free extracts to produce A
The ability of an IM II binding molecule (eg, a receptor molecule) to bind AIM II can be assessed.

【０１６４】 免疫原性エピトープを含む例示的なアミノ酸配列の一覧を、上記の表２に示す
。表２は、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ
．４：１８１−１８６（１９８８）（この参考文献は、その全体において本明細
書中に参考として援用される）のアルゴリズムを使用して、最も高い程度の抗原
性を有すると推定されるエピトープを含むアミノ酸残基のみを列挙していること
に注意のこと。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析を、デフォルトパラメータ
を使用する、コンピュータープログラムＰＲＯＴＥＩＮ（Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉ
ｎｔｏｓｈ対応バージョン３．１１，ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８ Ｓ
ｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った
。表２のポリペプチドおよび表２に列挙されていないポリペプチドの部分は、非
免疫原性ではないと考えられる。表２の免疫原性エピトープは模範的な一覧であ
り、完全な一覧ではない。なぜなら、他の免疫原性エピトープは、例えば、使用
した特定のアルゴリズムによって、単に、認識されないだけであるからである。
他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析
に類似するアルゴリズムか、または当該分に公知の方法を使用して抗原性応答に
ついてインビボで試験することによって慣用的に検出され得る。例えば、Ｇｅｙ
ｓｅｎら（前出）；米国特許第４，７０８，７８１号；同第５，１９４，３９２
号；同第４，４３３，０９２号；ならびに同第５，４８０，９７１号を参照のこ
と（これらの参考文献は、その全体において参考として援用される）。A list of exemplary amino acid sequences containing immunogenic epitopes is provided in Table 2 above. Table 2 shows the results of Jameson and Wolf, Comp. Appl. Biosci
. 4: 181-186 (1988), which is incorporated by reference herein in its entirety, includes epitopes that are predicted to have the highest degree of antigenicity. Note that only amino acid residues are listed. James-Wolf antigenicity analysis was performed using the computer program PROTEIN (Power Maci) using default parameters.
ntosh version 3.11, DNASTAR, Inc. , 1228 S
out Park Street Madison, Wis.). Polypeptides in Table 2 and portions of the polypeptides not listed in Table 2 are not considered non-immunogenic. The immunogenic epitopes in Table 2 are an exemplary list, not a complete list. This is because other immunogenic epitopes are simply not recognized, for example, by the particular algorithm used.
Amino acid residues comprising other immunogenic epitopes can be routinely detected by testing for antigenic responses in vivo using algorithms similar to Jameson-Wolf analysis or methods known in the art. . For example, Gey
Sen et al., supra; U.S. Pat. Nos. 4,708,781; 5,194,392.
Nos. 4,433,092; and 5,480,971 (these references are incorporated by reference in their entirety).

【０１６５】 特に、表２のアミノ酸配列は、免疫原性を含むことに注意のこと。表２は、Ｊ
ａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析により決定された、免疫原性エピトープの重要な残
基のみを列挙する。従って、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方
のいずれかのさらなる隣接残基は、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生成
するために表２の配列に加えられ得る。従って、表２の免疫原性エピトープは、
Ｎ末端またはＣ末端のさらなるアミノ酸残基を含む。さらなる隣接アミノ酸残基
は、本発明のポリペプチド、異種ポリペプチド配列に由来の連続して隣接するＮ
末端配列および／またはＣ末端配列であり得るか、または本発明のポリペプチド
および異種ポリペプチド配列に由来の連続して隣接する配列の両方を含み得る。In particular, note that the amino acid sequences in Table 2 include immunogenicity. Table 2 shows J
List only the critical residues of the immunogenic epitope as determined by ameson-Wolf analysis. Thus, additional contiguous residues at either the N-terminus, the C-terminus, or both the N-terminus and the C-terminus may be added to the sequences in Table 2 to generate an epitope-bearing polypeptide of the invention. Thus, the immunogenic epitopes in Table 2 are:
Includes additional N-terminal or C-terminal amino acid residues. Additional contiguous amino acid residues may be consecutive adjacent N from the polypeptide of the invention, a heterologous polypeptide sequence.
It may be a terminal sequence and / or a C-terminal sequence, or may include both consecutively adjacent sequences from a polypeptide of the invention and a heterologous polypeptide sequence.

【０１６６】 免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、
長さが少なくとも７アミノ酸残基である。「少なくとも」は、免疫原性エピトー
プまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、長さが７アミノ酸残
基であり得るか、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残基
数との間の任意の整数であり得る。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープ
を含む好ましいポリペプチドは、長さが少なくとも、１０、１５、２０、２５、
３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、
９０、９５、または１００のアミノ酸残基である。しかし、７と全長のポリペプ
チドのアミノ酸残基数との間の各整数および全ての整数が、本発明に含まれるこ
とに注意のこと。A polypeptide of the invention comprising an immunogenic or antigenic epitope comprises
It is at least 7 amino acid residues in length. "At least" means that the polypeptide of the invention comprising an immunogenic or antigenic epitope may be 7 amino acid residues in length, or 7 amino acids and the number of amino acid residues in the full length polypeptide of the invention. Can be any integer between. Preferred polypeptides comprising an immunogenic or antigenic epitope are at least 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,
90, 95, or 100 amino acid residues. Note, however, that each and every integer between 7 and the number of amino acid residues in the full length polypeptide is included in the invention.

【０１６７】 免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープを保有するフラグメントは、上記
に記載される連続したアミノ酸残基数のいずれかによって指定され得るか、また
は配列番号２のアミノ酸配列上のこれらのフラグメントのＮ末端位置およびＣ末
端位置によってさらに指定され得る。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を満た
し得る、長さが少なくとも７の連続アミノ酸残基または少なくとも１５の連続ア
ミノ酸残基のフラグメントのＮ末端位置およびＣ末端位置のあらゆる組み合わせ
が、本発明に含まれる。さらに、「長さが少なくとも７の連続アミノ酸残基」は
、長さが７アミノ酸残基、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミ
ノ酸残基数との間の任意の整数を意味する。特に、７と全長ポリペプチドのアミ
ノ酸残基数との間の各整数および全ての整数が、本発明に含まれる。The fragments carrying the immunogenic and antigenic epitopes can be specified by any of the number of contiguous amino acid residues described above, or of these fragments on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may be further specified by an N-terminal position and a C-terminal position. For example, any combination of N- and C-terminal positions of at least 7 contiguous amino acid residues or a fragment of at least 15 contiguous amino acid residues that can satisfy the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is included in the present invention. . Further, "at least 7 consecutive amino acid residues in length" means 7 amino acid residues in length, or any integer between 7 amino acids and the number of amino acid residues of the full length polypeptide of the invention. In particular, each and every integer between 7 and the number of amino acid residues of the full-length polypeptide is included in the invention.

【０１６８】 本発明の免役原性エピトープおよび抗原性エピトープを保有するポリペプチド
は、例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作成し、そしてイ
ムノアッセイにおいて本発明のポリペプチドを検出するために有用である。この
抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製において有用であ
る。この抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用して、特に、本発明のポリペ
プチドについて、種々の定性的なもしくは定量的なイムノアッセイにおいて日常
的に有用であり得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：第２版，１９８８）を参照のこと。Polypeptides carrying immunogenic and antigenic epitopes of the invention can, for example, generate antibodies that specifically bind to a polypeptide of the invention and detect the polypeptide of the invention in an immunoassay. Useful for. This antibody is useful, for example, in affinity purification of the polypeptide of the present invention. The antibodies may also be routinely useful in various qualitative or quantitative immunoassays using methods known in the art, particularly for polypeptides of the present invention. See, for example, Harlow et al., ANTIBODIES: AL
laboratory Manual, (Cold Spring Harbor)
Laboratory Press: Second Edition, 1988).

【０１６９】 本発明の抗原保有ポリペプチドを、ポリペプチドを作成するための従来の任意
の手段（当該分野に公知の合成方法および組み換え方法を含む）により生成し得
る。例えば、エピトープ保有ペプチドを、公知の化学合成方法を使用して合成し
得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチドの合成のための簡便な方法
を記載している。例えば、ＨＡ １ポリペプチドのセグメントの単一アミノ酸改
変体を提示する、１０〜２０ｍｇの異なる１３残基を有する２４８の各々ペプチ
ドの全てが、４週間に満たない間に調製され、そして（ＥＬＩＳＡ型の結合研究
によって）特徴付けられた（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５））。この「同時多
数ペプチド合成（ＳＭＰＳ：Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」過程は、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研
究者に対する米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）において、さらに記
載される。この過程において、種々のポリペプチドの固相合成のための個々のレ
ジンは、別々の溶媒透過性パケット（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐ
ａｃｋｅｔ）中に含まれ、これは、固相方法に関わる多数の同一の反復工程の最
適な使用を可能にする。完全な手動手順は、同時に処理される５００〜１０００
もしくはより多くの合成を可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）の５１
３４頁にて）。The antigen-bearing polypeptides of the present invention can be produced by any conventional means for making polypeptides, including synthetic and recombinant methods known in the art. For example, epitope-bearing peptides can be synthesized using known chemical synthesis methods. For example, Houghten describes a convenient method for the synthesis of a large number of peptides. For example, all 10 to 20 mg of each of the 248 peptides with 13 different residues, representing a single amino acid variant of a segment of the HA1 polypeptide, were prepared in less than 4 weeks and (ELISA-type (Houghten et al., Proc. Natl. Aca).
d. Sci. ScL USA 82: 5131-5135 (1985)). This “simultaneous multiple peptide synthesis (SMPS: Simultaneous Multiple P)
The "Eptide Synthesis" process is further described in U.S. Patent No. 4,631,211 to Houghten and co-workers (1986). In this process, the individual resins for solid phase synthesis of the various polypeptides are separated into separate solvent-permeable packets.
included in the same protocol, which allows optimal use of a number of identical iterative steps involved in the solid phase method. A complete manual procedure is performed simultaneously with 500-1000
Or allow for more synthesis (Houghten et al., Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985) 51
At page 34).

【０１７０】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドを使用して、当該分野で周知の方法（イ
ンビボ免疫、インビトロ免疫、およびファージディスプレイ方法を含むが、これ
らに限定されない）に従い抗体を誘導する。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前
出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する
場合、動物を遊離ペプチドで免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価を、この
ペプチドの高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）または破傷風毒素）への結合により追加免疫し得る。例えば、システイン残
基を含むペプチドは、リンカー（例えば、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステル（ＭＢＳ））を使用してキャリアに結合し得るが、他の
ペプチドは、より一般的な結合試薬（例えば、グルタルアルデヒド）を使用して
キャリアに結合し得る。動物（例えば、ウサギ、ラットおよびマウス）を、遊離
のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて免疫し得る（例えば
、１００μｇのペプチドもしくはキャリアタンパク質およびフロイトアジュバン
トを含むエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射により）。数回の追
加免疫が、例えば、固相表面に結合される遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡア
ッセイにより検出され得る抗ペプチドの抗体の有用な力価を提供するために、例
えば、２週間間隔で必要とされ得る。免疫した動物由来の血清中の抗ペプチド抗
体の力価を、抗ペプチド抗体の選択により増大し得る（例えば、当該分野で周知
の方法に従い、固相支持体上のペプチドへの吸着、そして選択した抗体の溶出に
より）。The epitope-bearing polypeptides of the invention are used to induce antibodies according to methods well known in the art, including but not limited to in vivo immunization, in vitro immunization, and phage display methods. See, for example, Sutcliffe et al., Supra; Wilson et al., Supra; and Bittle et al. Gen. Virol.
66: 2347-2354 (1985). When in vivo immunization is used, animals can be immunized with the free peptide; however, anti-peptide antibody titers can be determined using a polymeric carrier for this peptide, such as keyhole limpet hemocyanin (KL
H) or tetanus toxin). For example, a peptide containing a cysteine residue can be attached to a carrier using a linker (eg, maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS)), while other peptides use more common coupling reagents. (Eg, glutaraldehyde) can be used to couple to the carrier. Animals (eg, rabbits, rats, and mice) can be immunized with either free peptide or carrier-bound peptide (eg, intraperitoneal injection of an emulsion containing 100 μg of peptide or carrier protein and Freud's adjuvant and / or By intradermal injection). Several boosts are required, for example, at two week intervals, to provide useful titers of anti-peptide antibodies that can be detected, for example, by ELISA assays using the free peptide bound to the solid surface. Can be done. The titer of the anti-peptide antibody in the serum from the immunized animal can be increased by selection of the anti-peptide antibody (eg, adsorption to the peptide on a solid support, and selection according to methods well known in the art). Elution of the antibody).

【０１７１】 当業者が理解し、そして上記を議論した場合、免疫原性エピトープまたは抗原
性エピトープを含む本発明のポリペプチドを、イムノグロブリン（ＩｇＡ，Ｉｇ
Ｅ，ＩｇＧ，ＩｇＭ）またはそれらの部分（ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３，ドメイン
全体およびそれらの部分の両方を含むそれらの任意の組み合わせ）に融合し得、
キメラポリペプチドを生じ得る。これらの融合ポリペプチドは、精製を容易にし
、そしてインビボでの半減期の増大を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ４−
ポリペプチドの第１の２つのドメイン、および哺乳動物のイムノグロブリンの重
鎖もしくは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について
示されている。例えば、ＥＰＡ０，３４９，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，
Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと。ＩｇＧ部分に起
因するジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質は、他の分子に結合
し、そして中和することにおいて、単量体ポリペプチド単独もしくはそれらのフ
ラグメント単独よりもより効率的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉ
ｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照の
こと。上記のエピトープをコードする核酸を、発現されたポリペプチドの検出お
よび精製を助けるためのエピトープタグとして、目的の遺伝子を用いて組み換え
得る。As will be appreciated by those of skill in the art and discussed above, the polypeptides of the present invention, including immunogenic or antigenic epitopes, can be purified using immunoglobulins (IgA, IgA).
E, IgG, IgM) or portions thereof (CH1, CH2, CH3, any combination thereof including both the entire domain and those portions),
A chimeric polypeptide can result. These fusion polypeptides facilitate purification and exhibit an increased half-life in vivo. This means, for example, that human CD4-
A chimeric protein consisting of the first two domains of the polypeptide and various domains of the constant regions of the heavy or light chains of a mammalian immunoglobulin is shown. For example, EPA 0, 349, 827; Traunecker et al.,
Nature 331: 84-86 (1988). Fusion proteins having a disulfide-linked dimer structure due to an IgG moiety may be more efficient at binding and neutralizing other molecules than monomeric polypeptides alone or fragments thereof alone . For example, Fontoulaki
s et al. Biochem. 270: 3958-3964 (1995). Nucleic acids encoding the above-described epitopes can be recombined with the gene of interest as an epitope tag to aid in the detection and purification of the expressed polypeptide.

【０１７２】 本発明者らは、ＡＩＭ ＩＩが、脾臓、胸腺および骨髄組織において発現され
ることを発見した。多くの障害（例えば、敗血症性ショック、炎症、大脳マラリ
ア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片−宿主拒絶、骨吸収、慢性関節リウマチお
よび悪液質）について、「標準的な」ＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベル（すなわち
、障害を有さない個体由来の組織または体液中のＡＩＭ ＩＩ発現レベル）に対
して有意により高いまたはより低いレベルのＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現が、このよ
うな障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、脾臓組織、胸腺組織
および骨髄組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）にお
いて検出され得ることが考えられる。従って、本発明は、障害の診断の間に有用
な診断方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）個々の細胞
または体液におけるＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）
このＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルと標準的なＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルと
を比較する工程であって、これにより、アッセイしたＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レ
ベルの標準的な発現レベルとの比較における増大または減少が、障害の指標とな
る工程。The present inventors have discovered that AIM II is expressed in spleen, thymus and bone marrow tissues. For many disorders (eg, septic shock, inflammation, cerebral malaria, activation of HIV virus, graft-host rejection, bone resorption, rheumatoid arthritis and cachexia), "standard" AIM II gene expression levels (Ie, AIM II expression levels in tissues or fluids from individuals without the disorder) significantly higher or lower levels of AIM II gene expression are identified from individuals with such disorders. It is contemplated that it may be detected in tissues (eg, spleen, thymus and bone marrow) or body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid, or cerebrospinal fluid). Thus, the present invention provides a useful diagnostic method during the diagnosis of a disorder. The method includes the following steps: (a) assaying AIM II gene expression levels in individual cells or body fluids; (b)
Comparing the AIM II gene expression level to a standard AIM II gene expression level, whereby an increase or decrease in the assayed AIM II gene expression level relative to the standard expression level is impaired. Process that is an indicator of

【０１７３】 （セルソーティング） 本発明はまた、細胞が、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチドに対して特異性を有する抗体のいずれかに結合するか否かに基づ
いて、これらの細胞を亜集団に分離するための方法に関する。これらの分離方法
は、一般に、細胞がＡＩＭ ＩＩポリペプチドに結合する表面レセプターを発現
するか、または細胞表面上にＡＩＭ ＩＩポリペプチドを有するかのいずれかの
原理に基づく。次いで、このような細胞をこれらのポリペプチドもしくは抗体に
結合しない集団中の他の細胞から分離し得る。「セルソーティング」として一般
に公知の細胞を分離するための方法は、当該分野で公知であり、そしてＣｒａｎ
ｅ、米国特許第５，４８９，５０６号において議論される。(Cell Sorting) The present invention also provides that the cell comprises the AIM II polypeptide or AIM I of the present invention.
A method for separating these cells into subpopulations based on whether they bind to any of the antibodies that have specificity for the I polypeptide. These separation methods are generally based on the principle that either the cells express a surface receptor that binds to the AIM II polypeptide or have the AIM II polypeptide on the cell surface. Such cells can then be separated from other cells in the population that do not bind these polypeptides or antibodies. Methods for separating cells, commonly known as "cell sorting," are known in the art and
e, discussed in US Pat. No. 5,489,506.

【０１７４】 従って、１つの局面において、本発明は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたはＡ
ＩＭ ＩＩポリペプチドに対して特異性を有する抗体のいずれかに結合する細胞
を分離するための方法を提供する。この方法は、細胞の集団を、ＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドまたはＡＩＭ ＩＩポリペプチドに対して特異性を有する抗体のいず
れかに接触させる工程であって、ここでＡＩＭ ＩＩポリペプチドまたは抗体が
、検出可能な標識で標識されている工程、ならびにＡＩＭ ＩＩポリペプチドま
たは抗ＡＩＭ ＩＩポリペプチド抗体のいずれかに結合する細胞をこれらの分子
に結合しない細胞から分離する工程を包含する。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドに結
合する細胞は、リンホトキシンβレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）、ＴＲ２、ＣＤ２
７、およびＴＲＡＮＫを発現する細胞を含むと考えられる。Thus, in one aspect, the invention relates to AIM II polypeptides or AIM II polypeptides.
Methods are provided for isolating cells that bind to any of the antibodies having specificity for an IM II polypeptide. The method comprises contacting a population of cells with either an AIM II polypeptide or an antibody having specificity for the AIM II polypeptide, wherein the AIM II polypeptide or antibody is detectable. Labeling, and separating cells that bind to either the AIM II polypeptide or the anti-AIM II polypeptide antibody from cells that do not bind to these molecules. Cells that bind to AIM II polypeptide include lymphotoxin β receptor (LT-β-R), TR2, CD2
7, and cells expressing TRANK.

【０１７５】 （ＡＩＭ ＩＩアゴニストおよびアンタゴニスト） 本発明はまた、細胞に対するＡＩＭ ＩＩの作用（例えば、レセプター分子の
ようなＡＩＭ ＩＩ結合分子との相互作用）を増強またはブロックする化合物を
同定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。アゴニストは、Ａ
ＩＭ ＩＩの本来の生物学的機能を増加させる化合物であるか、またはＡＩＭ
ＩＩと類似の様式において機能する化合物である。一方、アンタゴニストはその
ような機能を減少または排除する。AIM II Agonists and Antagonists The present invention also provides compounds for identifying compounds that enhance or block the action of AIM II on cells (eg, interaction with AIM II binding molecules such as receptor molecules). To provide a method for screening. The agonist is A
A compound that increases the intrinsic biological function of IM II, or AIM
Compounds that function in a manner similar to II. Antagonists, on the other hand, reduce or eliminate such functions.

【０１７６】 例えば、細胞区画（例えば、膜の調製物）は、ＡＩＭ ＩＩに結合する分子（
例えば、ＡＩＭ ＩＩによって調節されるシグナル経路または調節経路の分子）
を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、ＡＩＭ ＩＩアゴニストもし
くはＡＩＭ ＩＩアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下で
、標識されたＡＩＭ ＩＩと共に培養される。候補分子の、結合分子またはＡＩ
Ｍ ＩＩ自身に結合する能力は、標識されたリガンド結合の減少に反映される。
無償で（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓｌｙ）結合する分子、すなわち、ＡＩＭ ＩＩ結
合分子に結合する場合にＡＩＭ ＩＩの効果を誘導することを伴わない分子は、
優良なアンタゴニストである可能性が最も高い。うまく結合し、そしてＡＩＭ
ＩＩと同じようなまたは密接に関連した効果を誘発する分子は、優良なアゴニス
トである。For example, a cell compartment (eg, a membrane preparation) may contain a molecule that binds to AIM II (eg,
For example, signaling or regulatory pathway molecules regulated by AIM II)
Can be prepared from cells expressing The preparation is cultured with labeled AIM II in the absence or presence of a candidate molecule, which can be an AIM II agonist or an AIM II antagonist. Binding molecule or AI of the candidate molecule
The ability to bind to MII itself is reflected in reduced labeled ligand binding.
A molecule that binds gratuitously, that is, a molecule that does not induce the effect of AIM II when bound to an AIM II binding molecule,
Most likely to be a good antagonist. Well combined, and AIM
Molecules that elicit effects similar or closely related to II are good agonists.

【０１７７】 潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのＡＩＭ ＩＩ様の効果は、例えば、
細胞または適切な細胞調製物との候補分子の相互作用に続くセカンドメッセンジ
ャー系の活性を決定することにより、およびその効果をＡＩＭ ＩＩの効果もし
くはＡＩＭ ＩＩと同じような効果を誘発する分子の効果と比較することにより
測定され得る。これに関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系としては
、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分
解セカンドメッセンジャー系が挙げられるがこれらに限定されない。The AIM II-like effects of potential agonists and antagonists include, for example,
By determining the activity of a second messenger system following the interaction of a candidate molecule with a cell or appropriate cell preparation, and by comparing the effect of AIM II or a molecule that elicits an effect similar to AIM II with the effect of AIM II It can be measured by comparing. Second messenger systems that may be useful in this regard include, but are not limited to, AMP guanylate cyclase, ion channel or phosphoinositide hydrolyzing second messenger systems.

【０１７８】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合アッセイで
ある。このアッセイは、競合的阻害アッセイのための適切な条件下で、ＡＩＭ
ＩＩおよび潜在的アンタゴニストを、膜結合ＡＩＭ ＩＩレセプター分子または
組換えＡＩＭ ＩＩレセプター分子と組み合わせる。ＡＩＭ ＩＩは、例えば、
放射性標識によって標識され得、その結果、レセプター分子に結合したＡＩＭ
ＩＩ分子の数が、潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために正確に決定さ
れ得る。[0178] Another example of an assay for AIM II antagonists is a competition assay. This assay, under the appropriate conditions for a competitive inhibition assay,
II and a potential antagonist are combined with a membrane-bound AIM II receptor molecule or a recombinant AIM II receptor molecule. AIM II, for example,
AIM that can be labeled by a radioactive label so that it binds to the receptor molecule
The number of II molecules can be accurately determined to assess the efficacy of a potential antagonist.

【０１７９】 潜在的アンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれ
によってその活性を阻害または無効にする有機低分子、ペプチド、ポリペプチド
および抗体が挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた、ＡＩＭ ＩＩ誘導性活
性を誘導することなく、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位に結
合し、それによって結合からＡＩＭ ＩＩを除外することによりＡＩＭ ＩＩの
作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のような有機低分子、ペプ
チド、ポリペプチドであり得る。本発明のアンタゴニストは、配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドのフラグメントを含む。[0179] Potential antagonists include small organic molecules, peptides, polypeptides and antibodies that bind to a polypeptide of the invention and thereby inhibit or abolish its activity. Potential antagonists also prevent the action of AIM II by binding to the same site on the binding molecule (eg, a receptor molecule) without inducing AIM II-induced activity, thereby excluding AIM II from binding. Can be small organic molecules, peptides, polypeptides, such as closely related proteins or antibodies. Antagonists of the present invention include fragments of the AIM II polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

【０１８０】 他の潜在的アンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチ
センス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、または三重鎖ヘリ
ックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技
術は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１
）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８）において議論される。三重
鎖ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：
１３６０（１９９１）において議論される。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲ
ＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対
のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設
計され、それによってＡＩＭ ＩＩの転写および産生を妨げる。アンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍ
ＲＮＡ分子のＡＩＭ ＩＩポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記されるオ
リゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまた
はＤＮＡは、ＡＩＭ ＩＩの産生を阻害するようにインビボで発現され得る。[0180] Other potential antagonists include antisense molecules. Antisense technology can be used to control gene expression through antisense DNA or RNA or through triple helix formation. Antisense technology is described, for example, in Okano, J. et al. Neurochem. 56: 560 (1991)
); Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRCP
res, Boca Rotan, FL (1988). Triple helix formation is described, for example, by Lee et al., Nucleic Acids Res.
earch 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 2.
41: 456 (1988); and Dervan et al., Science 251:
1360 (1991). This method uses complementary DNA or R
Based on binding of polynucleotide to NA. For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide encoding a mature polypeptide of the present invention can be used to design antisense RNA oligonucleotides of about 10-40 base pairs in length. DN
The A oligonucleotide is designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription, thereby preventing AIM II transcription and production. Antisense R
The NA oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and
Blocks translation of the RNA molecule into AIM II polypeptide. The oligonucleotides described above can also be delivered to cells so that the antisense RNA or DNA can be expressed in vivo to inhibit the production of AIM II.

【０１８１】 このアンタゴニストは、例えば、本明細書中で後記されるように、薬学的に受
容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。The antagonist may be used, for example, in a composition with a pharmaceutically acceptable carrier, as described later herein.

【０１８２】 このアンタゴニストは、例えば、悪液質（これは、リポプロテインリパーゼの
全身性欠損から生じる脂質清澄化欠損であり、これはＡＩＭ ＩＩにより抑制さ
れると考えられている）を処置するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩアンタゴ
ニストはまた、ＡＩＭ ＩＩが病原性の役割を担い得る大脳マラリアを処置する
ために使用され得る。This antagonist may be used, for example, to treat cachexia, which is a lipid clarification deficiency resulting from a systemic deficiency of lipoprotein lipase, which is believed to be suppressed by AIM II. Can be used for AIM II antagonists can also be used to treat cerebral malaria where AIM II may play a pathogenic role.

【０１８３】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストはまた、移植片の存在下での免疫系の刺激を妨げ
ることによって、移植片−宿主拒絶を予防するために使用され得る。AIM II antagonists can also be used to prevent graft-host rejection by preventing stimulation of the immune system in the presence of the graft.

【０１８４】 ＡＩＭ ＩＩアンタゴニストはまた、骨吸収を阻害するために使用され得、そ
れによって、骨粗しょう症を処置および／または予防するために使用され得る。AIM II antagonists can also be used to inhibit bone resorption, and thereby to treat and / or prevent osteoporosis.

【０１８５】 このアンタゴニストはまた、抗炎症剤として使用され得、そして内毒素ショッ
クを処置するために使用され得る。この危険状態は、細菌および他の感染のタイ
プに対する過剰応答から生じる。[0185] The antagonists can also be used as anti-inflammatory agents and can be used to treat endotoxin shock. This risk situation results from an over-response to bacteria and other types of infection.

【０１８６】 上記したように、本発明のアンタゴニストおよびアゴニストは、ＡＩＭ ＩＩ
ペプチドを含む。これらのポリペプチドは、例えば、細胞タンパク質（例えば、
レセプター）に結合することによりそれらの効果を調節し得る。特定のタンパク
質と相互作用するペプチドを同定するための方法は、当該分野で公知である。例
えば、ＰｈｉｚｉｃｋｙおよびＦｉｅｌｄｓ「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３
（１９９５）は、第２のタンパク質に対して結合親和性を有するペプチドを同定
するために、このペプチドをスクリーニングするための方法を記載する。Ｐｈｉ
ｚｉｃｋｙおよびＦｉｅｌｄｓは、タンパク質のアフィニティークロマトグラフ
ィー、アフィニティーブロッティング、同時免疫沈降、および交差結合のような
方法を議論する。本発明での使用に適した、分子生物学的なさらなる方法として
は、発現ライブラリーのタンパク質プロービング、ツーハイブリッド系、細胞パ
ニング、およびファージディスプレイが挙げられる。As mentioned above, the antagonists and agonists of the present invention may comprise AIM II
Including peptides. These polypeptides include, for example, cellular proteins (eg,
Receptor) to modulate their effects. Methods for identifying peptides that interact with a particular protein are known in the art. See, for example, Physicky and Fields "Protein-Protein.
interactions: methods for detection
and analysis "Microbiol. Rev .. 59: 94-123
(1995) describe a method for screening a peptide to identify a peptide having binding affinity for a second protein. Phi
Zicky and Fields discuss methods such as affinity chromatography, affinity blotting, co-immunoprecipitation, and cross-linking of proteins. Additional molecular biology methods suitable for use in the present invention include protein probing of expression libraries, two-hybrid systems, cell panning, and phage display.

【０１８７】 細胞表面レセプターに結合する、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを同定す
るための別の方法は、真核生物細胞を、このレセプターをコードするＤＮＡを用
いてトランスフェクトする工程であって、その結果、この細胞はその細胞表面上
にレセプターを発現する工程、次いで、この細胞を標識（例えば、放射性標識、
ビオチンなど）されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドと接触する工程を包含する。細
胞に結合した標識されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドの量を測定して、コントロー
ル細胞に結合した標識されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドの量と比較する。このコ
ントロール細胞は、一般的に、この表面レセプターを発現しない細胞である。コ
ントロール細胞と比較して、このレセプターを発現する細胞に結合した標識の量
の増大は、このレセプターを発現する細胞が標識されたＡＩＭ ＩＩポリペプチ
ドに結合することを示す。Another method for identifying an AIM II polypeptide of the invention that binds to a cell surface receptor is the step of transfecting a eukaryotic cell with DNA encoding the receptor. As a result, the cells express the receptor on their cell surface, and then label the cells (eg, radioactive labels,
Contacting AIM II polypeptide (e.g., biotin). The amount of labeled AIM II polypeptide bound to the cells is measured and compared to the amount of labeled AIM II polypeptide bound to control cells. The control cells are generally cells that do not express the surface receptor. An increase in the amount of label bound to cells expressing the receptor as compared to control cells indicates that cells expressing the receptor bind to the labeled AIM II polypeptide.

【０１８８】 さらに、当業者が認識するように、ＡＩＭＩＩポリペプチドを発現かつ保持す
る細胞を使用して、ＡＩＭ ＩＩリガンドを同定し得る。１つのこのような実施
態様において、ＡＩＭ ＩＩを発現する細胞は、検出可能に標識された潜在的な
リガンドと接触される。さらに、このようなリガンドは、ファージの表面上の配
列のライブラリーの一部として発現される（例えば、ファージディスプレイライ
ブラリー）ポリペプチドであり得る。In addition, as one of skill in the art would recognize, cells expressing and retaining AIMII polypeptides can be used to identify AIM II ligands. In one such embodiment, a cell expressing AIM II is contacted with a detectably labeled potential ligand. Further, such a ligand can be a polypeptide expressed as part of a library of sequences on the surface of a phage (eg, a phage display library).

【０１８９】 一旦、目的の細胞表面レセプターに結合するＡＩＭ ＩＩポリペプチドが同定
されると、アッセイを行って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドが、通常は、特定のレ
セプターによって惹起されるレセプター媒介細胞応答を誘導するか、または阻害
するかが決定され得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドがレセプター媒介細胞応答を
活性化するか否かは、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドもしくは別のリガンドの存在下
でレセプターにより惹起されることが公知の細胞応答を測定することによって決
定され得る。さらに、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドが、レセプター媒介細胞応答を
阻害するか否かは、細胞応答およびＡＩＭ ＩＩポリペプチドを誘導することが
公知である両方の分子の存在下でレセプターにより惹起されることが公知の細胞
応答を測定することによって決定され得る。[0189] Once an AIM II polypeptide that binds to a cell surface receptor of interest has been identified, an assay is performed to allow the AIM II polypeptide to induce a receptor-mediated cellular response, usually elicited by a particular receptor. To do or inhibit. Whether an AIM II polypeptide activates a receptor-mediated cellular response can be determined by measuring a cellular response known to be elicited by the receptor in the presence of the AIM II polypeptide or another ligand. Furthermore, whether an AIM II polypeptide inhibits a receptor-mediated cellular response is known to be triggered by the receptor in the presence of both molecules that are known to induce a cellular response and the AIM II polypeptide. Can be determined by measuring the cellular response of

【０１９０】 例えば、本発明のポリペプチドの可溶性形態（例えば、配列番号２のアミノ酸
８３〜２４０を含むＡＩＭポリペプチド）は、上記のリガンド結合アッセイおよ
びレセプター活性化／阻害アッセイにおいて利用され得る。For example, soluble forms of the polypeptides of the invention (eg, an AIM polypeptide comprising amino acids 83-240 of SEQ ID NO: 2) can be utilized in the ligand binding assays and receptor activation / inhibition assays described above.

【０１９１】 （癌の予後） 癌を有する哺乳動物の特定の組織は、対応する「標準的」哺乳動物（すなわち
癌を有さない同じ種の哺乳動物）と比較される場合に、ＡＩＭ ＩＩタンパク質
およびＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡの有意に低減されたレベル
を発現することが考えられている。さらに、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の低減され
たレベルは、癌を有さない同じ種の哺乳動物由来の血清と比較される場合に、癌
を有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）に
おいて検出され得る。従って、本発明は、腫瘍診断の間に有用な診断方法を提供
する。この方法は、哺乳動物細胞または体液におけるＡＩＭ ＩＩタンパク質を
コードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工程、および標準のＡＩＭ ＩＩ
遺伝子発現レベルとその遺伝子の発現レベルを比較する工程を包含し、それによ
って標準を超えた遺伝子発現レベルにおける減少が、特定の腫瘍の指標である。Cancer Prognosis Certain tissues of mammals with cancer have the AIM II protein when compared to the corresponding “standard” mammal (ie, a mammal of the same species without cancer). And expressing significantly reduced levels of mRNA encoding the AIM II protein. In addition, reduced levels of AIM II protein may be indicative of a specific body fluid (eg, serum, plasma, urine) from a mammal with cancer when compared to serum from a mammal of the same species without cancer. , And cerebrospinal fluid). Thus, the present invention provides a useful diagnostic method during tumor diagnosis. The method comprises assaying the expression level of a gene encoding an AIM II protein in a mammalian cell or body fluid, and a standard AIM II
Comparing the level of gene expression to the level of expression of the gene, whereby a decrease in gene expression levels above the norm is indicative of a particular tumor.

【０１９２】 従来の方法に従ってすでに腫瘍診断がなされている場合、本発明は予後指示薬
として有用であり、それによって、増強されたＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現を示す患
者は、低レベルでこの遺伝子を発現する患者と比較してより良い臨床結果を経験
し得る。The present invention is useful as a prognostic indicator if the tumor has already been diagnosed according to conventional methods, whereby patients exhibiting enhanced AIM II gene expression will be expressed in patients expressing low levels of this gene You may experience better clinical results as compared to.

【０１９３】 「ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイするこ
と」によって、第１の生物学的サンプルにおいて、直接的（例えば、絶対的なタ
ンパク質レベルもしくはｍＲＮＡレベルを決定または推定することにより）また
は相対的（例えば、第２の生物学的サンプルにおけるＡＩＭ ＩＩタンパク質レ
ベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することにより）のいずれかで、ＡＩＭ ＩＩ
タンパク質のレベルもしくはＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｍＲＮＡのレ
ベルを定性的または定量的に測定あるいは推定することが意図される。[0193] By "assaying the expression level of the gene encoding the AIM II protein", the first biological sample can be directly (eg, by determining or estimating absolute protein or mRNA levels). ) Or relative (eg, by comparing to AIM II protein or mRNA levels in a second biological sample).
It is intended to measure or estimate qualitatively or quantitatively the level of the protein or the level of the mRNA encoding the AIM II protein.

【０１９４】 好ましくは、第１の生物学的サンプルにおけるＡＩＭ ＩＩタンパク質レベル
またはｍＲＮＡレベルが測定または推定され、そして標準のＡＩＭ ＩＩタンパ
ク質レベルもしくはｍＲＮＡレベル（癌を有さない個体から得られた第２の生物
学的サンプルから取得される標準）と比較される。当該分野において理解される
ように、いったん標準のＡＩＭ ＩＩタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが
既知になると、それは比較のための標準として繰り返し使用され得る。Preferably, the level of AIM II protein or mRNA in the first biological sample is measured or estimated, and the level of standard AIM II protein or mRNA (secondary level obtained from an individual without cancer) is determined. Standards obtained from biological samples of As will be appreciated in the art, once the standard AIM II protein or mRNA level is known, it can be used repeatedly as a standard for comparison.

【０１９５】 「生物学的サンプル」によって、ＡＩＭ ＩＩタンパク質もしくはｍＲＮＡを
含む個体、細胞株、組織培養物、または他の供給源から得られる任意の生物学的
サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、分泌成熟ＡＩＭ ＩＩタン
パク質を含む哺乳動物の体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、な
らびに卵巣組織、前立腺組織、心臓組織、胎盤組織、膵臓組織、肝臓組織、脾臓
組織、肺組織、***組織、および臍帯組織が挙げられる。By "biological sample" is intended any biological sample obtained from an individual, cell line, tissue culture, or other source that contains AIM II protein or mRNA. Biological samples include mammalian body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid and cerebrospinal fluid) containing secreted mature AIM II protein, as well as ovarian, prostate, heart, placental, pancreatic, Includes liver tissue, spleen tissue, lung tissue, breast tissue, and umbilical cord tissue.

【０１９６】 本発明は、哺乳動物における癌を検出するために有用である。特に、本発明は
、哺乳動物における以下のタイプの癌の診断の間に有用である：***、卵巣、前
立腺、骨、肝臓、肺、膵臓、および脾臓の癌。好ましい哺乳動物としては、サル
（ｍｏｎｋｅｙ）、類人猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ
、およびヒトが挙げられる。特に好ましいのはヒトである。The present invention is useful for detecting cancer in a mammal. In particular, the present invention is useful during the diagnosis of the following types of cancer in mammals: breast, ovary, prostate, bone, liver, lung, pancreas, and spleen. Preferred mammals include monkeys, apes, cats, dogs, cows, pigs, horses, rabbits, and humans. Particularly preferred are humans.

【０１９７】 総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載される一段階のグア
ニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法を使用して、生物学的
サンプルから単離され得る。次いで、ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｍＲ
ＮＡのレベルを、任意の適切な方法を使用してアッセイする。この適切なアッセ
イとしては、ノーザンブロット分析（Ｈａｒａｄａら、Ｃｅｌｌ ６３：３０３
−３１２（１９９０））、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング（Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅ
ｌｌ ４９：３５７−３６７（１９８７））、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
、ポリメラーゼ連鎖反応との組み合わせにおける逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｍａ
ｋｉｎｏら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ２：２９５−３０１（１９９０）、およびリ
ガーゼ連鎖反応との組み合わせにおける逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。[0197] Total cellular RNA was obtained from Homezynski and Sacchi, Anal. B
iochem. 162: 156-159 (1987) can be isolated from biological samples using the one-step guanidine-thiocyanate-phenol-chloroform method. The mR encoding the AIM II protein is then
The level of NA is assayed using any suitable method. Suitable assays include Northern blot analysis (Harada et al., Cell 63: 303).
-312 (1990)), S1 nuclease mapping (Fujita et al., Ce)
11 49: 357-367 (1987)), polymerase chain reaction (PCR).
, Reverse transcription (RT-PCR) in combination with the polymerase chain reaction (Ma
Kino et al., Technique 2: 295-301 (1990), and reverse transcription (RT-LCR) in combination with a ligase chain reaction.

【０１９８】 生物学的サンプルにおいてＡＩＭ ＩＩタンパク質レベルをアッセイすること
は、抗体に基づく技術の使用を生じ得る。例えば、組織におけるＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質発現は、伝統的な免疫組織学的な方法（Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅ
ｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７
））を用いて研究され得る。Assaying AIM II protein levels in a biological sample can result in the use of antibody-based techniques. For example, AIM II protein expression in tissues has been described by traditional immunohistological methods (Jalkanen, M. et al., J. Am.
. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkane.
n, M. J. et al. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987).
)).

【０１９９】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体に基づ
く方法としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免
疫アッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが挙げられる。Other antibody-based methods useful for detecting AIM II protein gene expression include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and radioimmunoassays (RIAs).

【０２００】 適切な標識は当該分野において公知であり、そしてグルコースオキシダーゼの
ような酵素標識、そしてヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）
、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）およびテクネチウム（99mＴｃ） のような放射性同位体、そしてフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標
識、そしてビオチンを含む。Suitable labels are known in the art, and enzyme labels such as glucose oxidase, and iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S)
, Including tritium (3 H), indium (112 an In), and radioactive isotopes such as technetium (99m Tc), and fluorescent labels such as fluorescein and rhodamine, and biotin.

【０２０１】 （治療剤） ＡＩＭ ＩＩポリペプチド、特にヒトＡＩＭ ＩＩポリペプチドの使用は、ウ
イルス性肝炎、ヘルペスウイルス感染、アレルギー性反応、成人呼吸促進症候群
、新形成、アナフィラキシー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅ
ｒｇｅｎ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン、セファ
ロスポリンに対して）、原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ）、慢性リンパ
性白血病（ＣＬＬ）、リンパ節症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、慢性関節
リウマチ、変形性関節症、グレーヴズ病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホ
ジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、眼障害、尿素性網膜炎（ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉ
ｓ）、自己免疫相のＩ型糖尿病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝臓障
害（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）
、自己免疫炎症性腸疾患、およびクローン病の処置が挙げられるが、これらに限
定されない。さらに、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、腫瘍細胞増殖のよ
うな新形成を阻害するために使用され得る。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の、ＩＬ−
２またはＩＬ−１２のような免疫治療剤との組み合わせは、確立した癌の処置の
ために非常に有用である、相乗効果または付加的効果を生じ得る。ＡＩＭ ＩＩ
ポリペプチドはまた、腫瘍治療に有効であり得るＡＩＭ ＩＩはまた、増殖促進
活性を必要とする疾患（例えば、再狭窄）を処置するために使用され得る。なぜ
なら、ＡＩＭ ＩＩは、内皮由来の細胞に対する増殖効果を有するからである。
従って、ＡＩＭ ＩＩはまた、内皮細胞発達における造血を調節するために使用
され得る。Therapeutic Agents The use of AIM II polypeptides, especially human AIM II polypeptides, may be associated with viral hepatitis, herpes virus infection, allergic reactions, adult respiratory distress syndrome, neoplasia, anaphylaxis, allergic asthma, allergic Rhinitis (alle
rgen rhinitis), drug allergy (eg, to penicillin, cephalosporin), primary central nervous system lymphoma (PCNSL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), lymphadenopathy, autoimmune disease, graft versus host Disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, Graves' disease, acute lymphocytic leukemia (ALL), non-Hodgkin's lymphoma (NHL), ocular disorders, urea retinitis
s), autoimmune phase I diabetes, myasthenia gravis, glomerulonephritis, autoimmune hepatologic disorder
, Autoimmune inflammatory bowel disease, and treatment of Crohn's disease. In addition, AIM II polypeptides of the present invention can be used to inhibit neoplasia, such as tumor cell growth. AIM II protein, IL-
Combination with immunotherapeutic agents such as 2 or IL-12 can produce synergistic or additive effects that are very useful for the treatment of established cancers. AIM II
The polypeptide may also be effective in treating tumors. AIM II may also be used to treat diseases that require growth promoting activity, such as restenosis. This is because AIM II has a proliferative effect on endothelium-derived cells.
Thus, AIM II can also be used to regulate hematopoiesis in endothelial cell development.

【０２０２】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、Ｔ細胞およびＢ細胞の分化および
増殖を阻害するために使用され得る。Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、分化および
／または増殖のＡＩＭ ＩＩによって誘導された阻害は、多くの免疫に基づく疾
患を治療するために使用され得る。それらのうちのいくつかは、上記に参照され
ている。さらに、使用される特定のＡＩＭ ＩＩポリペプチドに依存して、本発
明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、分化およ
び／または増殖を刺激するために使用され得る。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used to inhibit T cell and B cell differentiation and proliferation. AIM II-induced inhibition of T cell and B cell activation, differentiation and / or proliferation can be used to treat many immune-based diseases. Some of them have been referenced above. Further, depending on the particular AIM II polypeptide used, the AIM II polypeptides of the present invention can also be used to stimulate T cell and B cell activation, differentiation and / or proliferation.

【０２０３】 ＡＩＭ ＩＩは、サイトカインアジュバントまたは同時刺激性分子として作用
し得る。以下の実験を行って、宿主免疫系に対するインビボでのＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質を評価する。AIM II can act as a cytokine adjuvant or costimulatory molecule. The following experiment is performed to evaluate AIM II protein in vivo against the host immune system.

【０２０４】 腫瘍抗原またはスーパー抗原で免疫する前または後に、腫瘍保有マウスまたは
腫瘍を保有していないマウスを、３つの異なる用量（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ
／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、ＱＤ、１０〜１４日、１群あたりＮ＝
５）のＡＩＭ ＩＩタンパク質で処置し、処置後毎週、血液採取の後にマウスを
屠殺する。脾臓またはリンパ節を、当業者に周知の、以下のインビトロ分析のた
めに使用する： ＦＡＣＳ分析：Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、同時刺激性分子、
および接着分子についての表面マーカーの発現。 サイトカイン産生アッセイ。 Ｔ細胞増殖または細胞傷害性アッセイ。Before or after immunization with tumor or superantigen, tumor-bearing or non-tumor-bearing mice are treated at three different doses (0.1 mg / kg, 1 mg
/ Kg, and 10 mg / kg, intraperitoneal, QD, 10-14 days, N =
5) Treat with AIM II protein and kill mice after blood collection weekly after treatment. The spleen or lymph nodes are used for the following in vitro assays, well known to those skilled in the art: FACS analysis: T cells, B cells, NK cells, monocytes, dendritic cells, costimulatory molecules,
And expression of surface markers for adhesion molecules. Cytokine production assay. T cell proliferation or cytotoxicity assay.

【０２０５】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質および腫瘍抗原は、防御免疫の誘導を生じ得、これは
、その後の腫瘍チャレンジからマウスを防御することを導き得る。可能性を試験
するために、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて以下の実験を行い、腫瘍または
Ａｇ特異的防御免疫の誘導に対するＡＩＭ ＩＩの効果を試験し得る。AIM II protein and tumor antigens can result in the induction of protective immunity, which can lead to protecting mice from subsequent tumor challenge. To test the potential, the following experiment can be performed using syngeneic C57BL / 6 mice to test the effect of AIM II on the induction of tumor or Ag-specific protective immunity.

【０２０６】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質で処理したＭＣ−３８無腫瘍マウスを、当業者に周知
の技術を使用して、ＭＣ−３８または無関係のマウス肉腫ＭＣＡ−１０２でチャ
レンジする。３つの可能性のある結果が、観察され得る：MC-38 tumor-free mice treated with AIM II protein are challenged with MC-38 or an irrelevant mouse sarcoma MCA-102 using techniques well known to those skilled in the art. Three possible outcomes can be observed:

【０２０７】[0207]

【化９】 ＡＩＭ ＩＩ処置の際の腫瘍特異的な防御免疫の発生が実証される場合、以下
の枯渇実験を行い、どの白血球部分集団が、腫瘍拒絶を担うかを同定する。当業
者に周知の技術を用いて、マウスを、ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞、
またはＮＫ細胞もしくは顆粒球（Ｇｒｌ＋）、またはＩＦＮγのような特定のサ
イトカインのいずれかを認識する種々のｍＡｂで処置する。これらの抗体処置マ
ウスにおける腫瘍増殖を測定する。Embedded image If the development of tumor-specific protective immunity upon AIM II treatment is demonstrated, the following depletion experiments will be performed to identify which leukocyte subpopulation is responsible for tumor rejection. Using techniques well known to those skilled in the art, mice can be transformed into CD4 + or CD8 + T cells,
Or treated with various mAbs that recognize either NK cells or granulocytes (Grl +), or specific cytokines such as IFNγ. The tumor growth in these antibody-treated mice is measured.

【０２０８】 ＡＩＭ ＩＩはまた、慢性関節リウマチ（ＲＡ）においてしばしば観察される
ように、新脈管形成の増加または骨および軟骨おける侵襲性のパンヌスを維持す
るために必要な内皮細胞増殖の増加を阻害することによってＲＡを処置するため
に使用され得る。内皮細胞増殖は、変形性関節症（ＯＡ）の患者または非罹患患
者と比較した場合、ＲＡ患者の滑液で増加する。新脈管形成は、骨および軟骨へ
の侵襲性のパンヌスの質量増加を維持するために必要とされる。新脈管形成の阻
害は、動物モデルにおける初期および慢性関節リウマチの両方の重篤度が有意に
低下することと関連する。AIM II also increases the angiogenesis or endothelial cell proliferation required to maintain invasive pannus in bone and cartilage, as often observed in rheumatoid arthritis (RA). Can be used to treat RA by inhibiting. Endothelial cell proliferation is increased in synovial fluid of RA patients when compared to osteoarthritis (OA) patients or unaffected patients. Angiogenesis is required to maintain invasive pannus mass gains on bone and cartilage. Inhibition of angiogenesis is associated with a significantly reduced severity of both early and rheumatoid arthritis in animal models.

【０２０９】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、多くのタンパク質（いくつかのヒト細胞レセプ
ターを含む）についての結合活性を有すると考えられている。これらのレセプタ
ーとしては、リンホトキシン−β−レセプター（ＬＴ−β−Ｒ）、ＴＲ２（ヘル
ペスウイルス初期メディエータ（ＨＶＥＭ）およびＡＴＡＲともいわれる）、Ｃ
Ｄ２７、およびＴＲＡＮＫ（核因子κＢのレセプター活性化因子（ＲＡＮＫ）と
もいわれる）が挙げられる。AIM II polypeptides are believed to have binding activity for a number of proteins, including some human cell receptors. These receptors include lymphotoxin-β-receptor (LT-β-R), TR2 (also called herpesvirus early mediator (HVEM) and ATAR), C
D27, and TRANK (also called receptor activator of nuclear factor κB (RANK)).

【０２１０】 直前に挙げられたレセプターの各々は、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドに
よって調節され得る種々の生理学的プロセスに関与する。より詳細には、本発明
のポリペプチドを使用して、ＡＩＭ ＩＩ結合活性を有する細胞レセプター（例
えば、ＬＴ−βＲ、ＴＲ２、ＣＤ２７、およびＴＲＡＮＫ）に結合するリガンド
の作用を刺激またはブロックし得る。[0210] Each of the receptors just listed is involved in a variety of physiological processes that can be modulated by the AIM II polypeptides of the present invention. More specifically, the polypeptides of the invention can be used to stimulate or block the effects of ligands that bind to cellular receptors with AIM II binding activity (eg, LT-βR, TR2, CD27, and TRANK).

【０２１１】 ＬＴ−β−Ｒに結合するＬＴ−βは、２次リンパ組織の発生および成体におけ
る組織化されたリンパ組織の維持に関連づけられる。ＬＴ−β−Ｒは、いくつか
の例において、ＴＲ２とともに機能して、細胞応答を媒介し得、そしてＴリンパ
球の亜集団を含む、肺における多くの組織において発現されることが示された。
ＬＴ−β−Ｒはまた、胚中心の形成に関連づけられているので、体液性免疫応答
に関与するようである。Ｒｅｎｎｅｒｔら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１６
２７−１６３９（１９９７）。LT-β binding to LT-β-R has been implicated in the development of secondary lymphoid tissue and the maintenance of organized lymphoid tissue in adults. LT-β-R, in some cases, can function with TR2 to mediate cellular responses and has been shown to be expressed in many tissues in the lung, including a subpopulation of T lymphocytes. .
LT-β-R also appears to be involved in the humoral immune response since it has been implicated in germinal center formation. Rennert et al., Int. Immunol. 9:16
27-1639 (1997).

【０２１２】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを使用して、ＬＴ−β−Ｒに対する細胞リ
ガンドの接近をブロックすることによる胚中心の形成およびＬＴ−β−Ｒ媒介体
液性応答を阻害し得る。さらに、本発明のポリペプチドは、胚中心の形成および
ＬＴ−β−Ｒを活性化することによるＬＴ−β−Ｒ媒介体液性応答を刺激し得る
。The AIM II polypeptides of the invention can be used to inhibit germinal center formation and block the LT-β-R mediated humoral response by blocking the access of cellular ligands to LT-β-R. In addition, the polypeptides of the invention may stimulate LT-β-R mediated humoral responses by activating germinal centers and LT-β-R.

【０２１３】 当業者は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの異なる部分が、ＬＴ−β−Ｒに対する
異なる効果を有し得ることを認識する。当業者はまた、本発明のＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドが、ＬＴ−β−Ｒに対して有する効果が、個々のペプチドおよびＬＴ
−β−Ｒに結合した場合のＬＴ−β−Ｒが有する効果とともに変化することを認
識する。細胞レセプターのアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を有する分
子をスクリーニングする方法は、上記に記載される。[0213] One of skill in the art will recognize that different portions of the AIM II polypeptide may have different effects on LT-β-R. One of skill in the art will also appreciate that the effects of the AIM II polypeptides of the present invention on LT-β-R are dependent on individual peptides and LT-β-R.
It recognizes that it changes with the effect of LT-β-R when bound to -β-R. Methods for screening for molecules having cell receptor agonist and antagonist activity are described above.

【０２１４】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコアタンパク質はまた、ＬＴ−β−Ｒと関連し
、そしてこのレセプターによって媒介されるシグナル伝達を増強することが示さ
れた。Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９４１７−９４２６（１９９７）。
さらに、このタンパク質とＬＴ−β−Ｒとの相互作用は、慢性的に活性化され、
持続状態のＨＣＶ感染細胞に寄与し得る。本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを
使用して、ＬＴ−β−ＲのＨＣＶ刺激およびこのウイルスに関連する病状をブロ
ックし得る。The hepatitis C virus (HCV) core protein has also been shown to be associated with LT-β-R and to enhance signaling mediated by this receptor. Chen et al. Virol. 71: 9417-9426 (1997).
Furthermore, the interaction of this protein with LT-β-R is chronically activated,
May contribute to persistently infected HCV-infected cells. AIM II polypeptides of the invention can be used to block HCV stimulation of LT-β-R and pathologies associated with this virus.

【０２１５】 ＴＲ２は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターファミリーのメンバーである。
このファミリーは、多くのヒト組織および細胞株で発現される。このタンパク質
は、構成的に発現され、そして比較的高レベルで末梢血Ｔ細胞、Ｂ細胞、および
単球において発現される。Ｋｗｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４
２７２−１４２７６（１９９７）。ＴＲ２は、インビボで多くの機能を提供する
、これらの機能としては、感染期間中の細胞へのヘルペスウイルス侵入の媒介が
挙げられる。さらにＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、混合リンパ球反応媒介増殖
を阻害することが示された。これらのデータは、ＴＲ２およびそのリガンドがＴ
細胞刺激においてある役割を果たすことを示唆する。これは、これらの株の中で
ＴＲ２の過剰発現がＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を活性化することを示した。この
活性化は、ＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲＡＦ）媒介機構によって生じるよう
である。[0215] TR2 is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family.
This family is expressed in many human tissues and cell lines. This protein is constitutively expressed and is expressed at relatively high levels in peripheral blood T cells, B cells, and monocytes. Kwon et al. Biol. Chem. 272: 14
272-14276 (1997). TR2 provides a number of functions in vivo, including the mediation of herpes virus entry into cells during infection. In addition, TR2-Fc fusion proteins have been shown to inhibit mixed lymphocyte response-mediated proliferation. These data indicate that TR2 and its ligand
Suggests a role in cell stimulation. This indicated that overexpression of TR2 activated NF-κB and AP-1 in these strains. This activation appears to occur by a TNF receptor-related factor (TRAF) -mediated mechanism.

【０２１６】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを使用して、このレセプターを活性化する
細胞リガンドによるＴＲ２への接近をブロックすることによって、Ｔ細胞活性化
、すなわちＴ細胞媒介免疫応答を阻害し得る。同様に、本発明のポリペプチドは
、ＴＲ２を活性化することによってＴ細胞活性化を刺激し得る。ＬＴ−β−Ｒに
ついて上記に記載されるように、当業者は、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの異なる
部分がＴＲ２媒介細胞応答を阻害または刺激のいずれかを行い得ることを認識す
る。The AIM II polypeptides of the present invention can be used to block T cell activation, ie, a T cell mediated immune response, by blocking access to TR2 by cellular ligands that activate this receptor. Similarly, a polypeptide of the invention may stimulate T cell activation by activating TR2. As described above for LT-β-R, one of skill in the art will recognize that different portions of the AIM II polypeptide can either inhibit or stimulate TR2-mediated cellular responses.

【０２１７】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ヘルペスウイルス感染を予防また
は処置するために使用され得る。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used to prevent or treat a herpes virus infection.

【０２１８】 ＣＤ２７、ならびにそのリガンドＣＤ７０の発現は、リンパ球に対して優性に
限定される。さらにＣＤ２７は、ＣＤ７０と相互作用し、かつＢ細胞におけるＩ
ｇＥ合成の誘導に関与することが示された。Ｎａｇｕｍｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１６１：６４９６−６５０２（１９９８）。さらに、ＣＤ２７の活性化は、
ＩｇＥ合成を増強し得る。従って、ＣＤ２７とＣＤ７０との間の相互作用の阻害
は、ＩｇＥ産生およびアレルギー性応答を阻害し得る。The expression of CD27, as well as its ligand CD70, is dominantly restricted to lymphocytes. In addition, CD27 interacts with CD70 and acts on I in B cells.
It has been shown to be involved in the induction of gE synthesis. Nagamo et al. Immuno
l. 161: 6496-6502 (1998). Furthermore, activation of CD27
IgE synthesis may be enhanced. Thus, inhibition of the interaction between CD27 and CD70 can inhibit IgE production and allergic responses.

【０２１９】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを、免疫応答を調節するために使用し得る
。例えば、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを使用して、ＣＤ２７とＣＤ７０との間の
相互作用を阻害することによってＢ細胞の機能を調節し得る。従って、ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドは、ＣＤ２７に結合し得、そしてＢ細胞の分化および増殖、な
らびにこれらの細胞によるタンパク質（例えば、ＩｇＥ）の分泌を阻害し得る。
従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを使用して、例えば、アレルギー性鼻炎（枯
草熱ともいわれる）、気管支喘息、アレルギー性喘息、アナフィラキシー、アト
ピー性皮膚炎、および胃腸の食物アレルギーのようなＩｇＥ誘導性即時型過敏反
応の処置におけるＩｇＥ抗体形成を抑制し得る。The AIM II polypeptides of the present invention can be used to modulate an immune response. For example, AIM II polypeptides can be used to modulate B cell function by inhibiting the interaction between CD27 and CD70. Therefore, AIM
II polypeptides can bind to CD27 and inhibit B cell differentiation and proliferation, and secretion of proteins (eg, IgE) by these cells.
Thus, using AIM II polypeptides, for example, IgE-induced immediate forms such as allergic rhinitis (also called hay fever), bronchial asthma, allergic asthma, anaphylaxis, atopic dermatitis, and gastrointestinal food allergy. IgE antibody formation in the treatment of hypersensitivity reactions can be suppressed.

【０２２０】 ＣＤ２７はまた、一般的にＳｉｖａとして公知であるプロアポトーシスタンパ
ク質に対するレセプターであると考えられている。Ｐａｎｄａｎｉｌａｍら、Ｋ
ｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５４：１９６７−１９７５（１９９８）。本発明のＡＩＭ
ＩＩポリペプチドを使用して、ＳｉｖａとＣＤ２７との間の相互作用を阻害し
得るために、Ｓｉｖａ／ＣＤ２７媒介性のアポトーシス誘導を予防し得る。減少
した細胞生存性または増加したアポトーシスと関連する疾患としては、ＡＩＤＳ
：神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性外側硬
化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、色素
性網膜炎、小脳変性）：脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、虚血
性傷害（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流傷害により引き起こされるもの
）、毒素誘導性肝臓疾患（例えば、アルコールにより引き起こされるもの）、敗
血性ショック、悪液質、および食欲不振が挙げられる。[0220] CD27 is also considered to be a receptor for the pro-apoptotic protein commonly known as Siva. Pandanilam et al., K
idney Int. 54: 1967-1975 (1998). AIM of the present invention
The II polypeptide can be used to inhibit the interaction between Siva and CD27 and thus prevent Siva / CD27-mediated induction of apoptosis. Diseases associated with decreased cell viability or increased apoptosis include AIDS
: Neurodegenerative disorders (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration): myelodysplastic syndrome (eg, aplastic anemia), ischemic injury (Eg, caused by myocardial infarction, stroke, and reperfusion injury), toxin-induced liver disease (eg, caused by alcohol), septic shock, cachexia, and anorexia.

【０２２１】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドをまた、Ｓｉｖａ／ＣＤ２７アポトーシス
経路の活性化を増強するために利用し得、そしてそれゆえアポトーシスの誘導を
促進する。細胞の生存またはアポトーシスの阻害の増強に関連する疾患としては
、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌、およびホルモン依存性
腫瘍）、自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎
、および慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、
ポックスウイルス、およびアデノウイルス）、対宿主性移植片情報病、急性移植
拒絶、ならびに慢性移植片拒絶が挙げられる。The AIM II polypeptides of the present invention can also be used to enhance the activation of the Siva / CD27 apoptotic pathway, and thus promote the induction of apoptosis. Diseases associated with enhanced inhibition of cell survival or apoptosis include cancer (eg, follicular lymphoma, cancer with a p53 mutation, and hormone-dependent tumors), autoimmune disorders (eg, systemic lupus erythematosus, immune-related threads). Spherical nephritis, and rheumatoid arthritis) and viral infections (eg, herpes virus,
Poxviruses, and adenoviruses), graft-versus-host disease, acute transplant rejection, and chronic graft rejection.

【０２２２】 ＣＤ２７は、膜結合し得るが、ＣＤ２７の可溶性形態は、免疫応答中に産生さ
れる。可溶性ＣＤ２７（ｓＣＤ２７）は、多くの体液中で見出され、そして局所
性および全身性免疫活性化をモニターするために測定され得る。さらに、ＣＤ２
７は、ヒト悪性Ｂ細胞において発現され、そして高レベルのｓＣＤ２７が、種々
のＢ細胞悪性疾患を有する患者の血清に存在する。Ｋｅｒｓｔｅｎら、Ｂｌｏｏ
ｄ ８７：１９８５−１９８９（１９９６）。これらのｓＣＤ２７の上昇したレ
ベルは、腫瘍による負担と強く相関することが示されている。Although CD27 can be membrane-bound, a soluble form of CD27 is produced during the immune response. Soluble CD27 (sCD27) is found in many body fluids and can be measured to monitor local and systemic immune activation. In addition, CD2
7 is expressed on human malignant B cells and high levels of sCD27 are present in the sera of patients with various B cell malignancies. Kersten et al., Bloo
d 87: 1985-1989 (1996). These elevated levels of sCD27 have been shown to correlate strongly with tumor burden.

【０２２３】 ｓＣＤ２７はまた、種々のリンパ系悪性疾患および中枢神経系の固体腫瘍を有
する患者での上昇が見られている。これらの苦痛には、原発性中枢神経系リンパ
腫（ＰＣＮＳＬ）および髄膜に位置するリンパ系悪性疾患（例えば、急性リンパ
芽球性白血病（ＡＬＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））が挙げられる。SCD27 has also been elevated in patients with various lymphoid malignancies and solid tumors of the central nervous system. These distresses include primary central nervous system lymphoma (PCNSL) and lymphoid malignancies located in the meninges, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin's lymphoma (NHL).

【０２２４】 可溶性ＣＤ２７はまた、多数の非過増殖性疾患を有する患者での上昇が見い出
されている。例えば、ｓＣＤ２７は、未処置のグレーブス甲状腺機能亢進症を有
する患者における上昇が見られている。Ｋａｌｌｉｏら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ
．Ｍｅｄ．１３２：４７８−４８２（１９９８）。さらに、ｓＣＤ２７血清レベ
ルの上昇が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者において見られ、
そしてこの上昇は、疾患の活性に関連していることが示されている。Ｆｏｎｔら
、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８１：２３９−２４
３（１９９６）：Ｓｗａａｋら、Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４：２９３
−３００（１９９５）。また、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有するほとん
どの患者由来のＢ細胞は、膜結合および可溶性ＣＤ２７の両方ならびにＣＤ７０
が同時発現することを示した。Ｒａｎｈｅｉｍら、Ｂｌｏｏｄ８５：３５５６−
３５６５（１９９５）。[0224] Soluble CD27 has also been found to be elevated in patients with a number of non-hyperproliferative diseases. For example, sCD27 has been elevated in patients with untreated Graves' hyperthyroidism. Kallio et al. Lab. Clin
. Med. 132: 478-482 (1998). In addition, elevated sCD27 serum levels are seen in patients with systemic lupus erythematosus (SLE),
This increase has been shown to be related to disease activity. Font et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 81: 239-24
3 (1996): Swak et al., Clin. Rheumatol. 14: 293
-300 (1995). Also, B cells from most patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) have both membrane-bound and soluble CD27 and CD70
Was co-expressed. Ranheim et al., Blood 85: 3556-.
3565 (1995).

【０２２５】 ｓＣＤ２７は、ＣＤ７０を介した刺激Ｔ細胞由来の白血病Ｂ細胞を予防し得、
従って、Ｂ細胞が抗原提示細胞として機能する能力を損ない得ると考えられてい
る。Ｒａｎｈｅｉｍら、Ｂｌｏｏｄ ８５：３５５６−３５６５（１９９５）。SCD27 can prevent CD70-mediated stimulated T cell-derived leukemia B cells,
Therefore, it is believed that B cells can impair the ability to function as antigen presenting cells. Ranheim et al., Blood 85: 3556-3565 (1995).

【０２２６】 本発明のポリペプチドを利用して、ｓＣＤ２７とＣＤ７０との間の相互作用を
阻害し得、それゆえ、抗原提示細胞として作用するＢ細胞の能力を増強し得る。
本発明のＡＩＭ ＩＩをまた利用して、ｓＣＤ２７のレベルの増加に関する疾患
および苦痛を処置し得る。機械論に束縛されることは望まれないが、ＡＩＭ Ｉ
Ｉポリペプチドは、これらの状態の処置療法に有用であり得る。なぜなら、ＡＩ
Ｍ ＩＩは、ｓＣＤ２７に結合し、そして細胞性リガンドとの相互作用を阻害す
るからである。The polypeptides of the present invention can be used to inhibit the interaction between sCD27 and CD70, and thus enhance the ability of B cells to act as antigen presenting cells.
AIM II of the present invention may also be used to treat diseases and afflictions associated with increased levels of sCD27. While not wanting to be bound by mechanics, AIM I
I polypeptides may be useful in the treatment of these conditions. Because AI
MII binds to sCD27 and inhibits its interaction with cellular ligands.

【０２２７】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはまた、ＲＡＮＫに結合すると考えられている（Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：１７５−１７９（１９９７）を参照
のこと）。ＲＡＮＫは、破骨細胞の分化およびＴ細胞と樹状細胞との間の相互作
用の調節に関連するタンパク質である。ＲＡＮＫは、明らかに、ＲＡＮＫＬ（オ
ステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）リガンド（ＯＰＧＬ）
、ＴＲＡＮＣＥおよびＯＤＦともいわれる）との相互作用を介してその細胞効果
を媒介する。AIM II polypeptides are also thought to bind to RANK (A
nderson et al., Nature 390: 175-179 (1997)). RANK is a protein involved in the regulation of osteoclast differentiation and the interaction between T cells and dendritic cells. RANK is clearly RANKL (osteoprotegerin ligand (OPGL)
, Also known as TRANCE and ODF) mediate its cellular effects.

【０２２８】 破壊したＲＡＮＫＬ遺伝子を有するマウスは、欠損歯の出現および破骨細胞の
欠如を示す深刻な骨粗鬆症を示す。これらのマウスはまた、Ｔリンパ球分化およ
びＢリンパ球分化の欠損を示す。さらに、ＲＡＮＫＬ欠乏マウスは、リンパ節を
欠くが、正常な脾臓構造およびパイアー斑を示す。これらのデータは、ＲＡＮＫ
Ｌ媒介経路がリンパ節器官形成、リンパ球発生、ならびに破骨細胞分化および増
殖を調節することを示す。[0228] Mice with the disrupted RANKL gene exhibit severe osteoporosis indicating the appearance of missing teeth and lack of osteoclasts. These mice also show a defect in T and B lymphocyte differentiation. In addition, RANKL-deficient mice lack lymph nodes but show normal spleen structure and Peyer's patches. These data are
Figure 4 shows that the L-mediated pathway regulates lymph node organogenesis, lymphocyte development, and osteoclast differentiation and proliferation.

【０２２９】 骨細胞には２つの主なクラスが存在する：骨、破骨細胞を形成する細胞および
骨、破骨細胞を吸収する細胞。これらの細胞は、それぞれ厳密な機能を有し、そ
してそれらの活性間のバランスは、骨格系の維持に重大な意味を持つ。例えば、
ヒト成人において、１０〜１５％の間の海綿質表面は、類骨（骨芽細胞より作製
される新しい非石灰化骨）で覆われているが、約４％は、活性な吸収性表面を有
する。骨細胞活性の継続フラックスの力学的な性質は、総骨格カルシウムの約１
８％が、しばしば除去され、そして１年の期間にわたって堆積するという事実に
より例証される。There are two main classes of bone cells: bone, cells that form osteoclasts, and cells that resorb bone, osteoclasts. Each of these cells has a strict function, and the balance between their activities is critical for maintaining the skeletal system. For example,
In human adults, between 10-15% of spongy surfaces are covered with osteoid (new non-calcified bone made from osteoblasts), but about 4% have active resorbable surfaces. Have. The dynamic nature of the continuous flux of bone cell activity is approximately 1% of total skeletal calcium.
Eight percent are often removed and exemplified by the fact that they accumulate over a period of one year.

【０２３０】 本発明のＡＩＭポリペプチドを利用して、破骨細胞の分化および増殖ならびに
骨の発生および分解を調節し得る。本発明のポリペプチドを利用して、例えば破
骨細胞の分化および増殖を阻害し得、従ってこれを利用して、骨の分解比を低下
させ得る。破骨細胞の分化および増殖ならびに骨の分解の阻害は、骨粗鬆症、骨
格および歯の異常、骨の癌、変形性関節症、骨形成不全症、ならびにフルラー症
候群およびマルファン症候群のような状態の処置に有用であり得る。本発明のポ
リペプチドはまた、欠失した骨の置換または骨の増強が必要とされる骨および歯
の再形成ならびに歯周の再形成のプロセスに利用され得る。（例えば、歯の欠失
を遅延または阻害するために、顎の骨および歯周部の疾患に起因する補充歯槽骨
において）（例えば、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｅｎｔｏｌ．
６６：５１１−２１（１９９５）を参照のこと）。The AIM polypeptides of the present invention can be used to regulate osteoclast differentiation and proliferation and bone development and degradation. The polypeptides of the invention can be used, for example, to inhibit osteoclast differentiation and proliferation, and thus can be used to reduce the rate of bone degradation. Inhibition of osteoclast differentiation and proliferation and bone degradation can be used to treat osteoporosis, skeletal and dental abnormalities, bone cancer, osteoarthritis, osteogenesis imperfecta, and conditions such as Huller's syndrome and Marfan's syndrome May be useful for The polypeptides of the present invention may also be utilized in the process of bone and tooth remodeling and periodontal remodeling where replacement or replacement of missing bone is required. (Eg, in replacement alveolar bone due to jaw bone and periodontal disease to delay or inhibit tooth loss) (see, eg, Sigurdsson et al., J. Periodentol.
66: 511-21 (1995)).

【０２３１】 本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドを、さらに使用してＴリンパ球およびＢリ
ンパ球の分化および増殖を調節し得る。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドはま
た、ＲＡＮＫに結合し得、そしてＴリンパ球およびＢリンパ球の分化および増殖
ならびにこれらの細胞からのタンパク質（例えば、免疫グロブリン）の分泌を阻
害し得る。それゆえ、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを利用して、リンパ球媒介免疫
応答を抑制し（例えば、移植拒絶に対して予防する）得る。ＡＩＭ ＩＩポリペ
プチドをまた用いて、歯骨細胞の分化および増殖を阻害し得る。従って、ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドを利用して、骨癌のような疾患を処置し得る。AIM II polypeptides of the present invention can further be used to modulate the differentiation and proliferation of T and B lymphocytes. Thus, AIM II polypeptides can also bind to RANK and inhibit the differentiation and proliferation of T and B lymphocytes and secretion of proteins (eg, immunoglobulins) from these cells. Thus, AIM II polypeptides can be utilized to suppress (eg, prevent against transplant rejection) lymphocyte-mediated immune responses. AIM II polypeptides can also be used to inhibit osteoclast differentiation and proliferation. Therefore, AIM
The II polypeptide can be used to treat diseases such as bone cancer.

【０２３２】 本発明はまた、ＲＡＮＫの１つ以上の天然のリガンドを模倣し、そしてＲＡＮ
Ｋ媒介細胞応答を刺激するＡＩＭ ＩＩポリペプチドを提供する。これらの細胞
性応答は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の分化および増殖の活性化ならびに破骨
細胞の分化の誘導を含む。従って、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを利用して、感染
（例えば、細菌感染、ウイルス感染および原生動物の感染）のような疾患を処置
し得る。ＡＩＭ ＩＩポリペプチドをまた利用して、免疫応答（例えば、ＡＩＤ
ＳおよびＡＩＤＳ関連複合体の処置において）を増強し得、かつ骨の分解速度を
増加し得る。The present invention also mimics one or more natural ligands of RANK, and
AIM II polypeptides that stimulate K-mediated cellular responses are provided. These cellular responses include the activation of T and B lymphocyte differentiation and proliferation and the induction of osteoclast differentiation. Thus, AIM II polypeptides can be used to treat diseases such as infections (eg, bacterial, viral, and protozoal). AIM II polypeptides can also be used to generate an immune response (eg, AID
In the treatment of S and AIDS-related complexes) and may increase the rate of bone degradation.

【０２３３】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは分子の可溶性形態を形成するためにインビボで切
断され得る。実施例１０に記載したように、切断部位は、配列番号２に示される
配列のアミノ酸残基８２と８３との間に位置するようである。この位置でのＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドの切断は、配列番号２のアミノ酸８３〜２４０を含む分子
の可溶性形態の産生を生じると考えられている。ＡＩＭ ＩＩの可溶性形態は、
これらのペプチドの全身投与が好ましい疾患の処置において特に有用である。さ
らに、ＡＩＭ ＩＩの可溶性形態はまた、局所投与に有用である。本発明の完全
かつ成熟したＡＩＭ ＩＩポリペプチドならびにこれらのポリペプチドのサブフ
ラグメントを利用して、これらの分子が結合するレセプターおよび他のリガンド
に関連する苦痛を処置し得る。AIM II polypeptides can be cleaved in vivo to form soluble forms of the molecule. As described in Example 10, the cleavage site appears to be located between amino acid residues 82 and 83 of the sequence shown in SEQ ID NO: 2. AI at this position
Cleavage of the MII polypeptide is believed to result in the production of a soluble form of the molecule comprising amino acids 83-240 of SEQ ID NO: 2. The soluble form of AIM II is
Systemic administration of these peptides is particularly useful in treating preferred diseases. In addition, soluble forms of AIM II are also useful for topical administration. The complete and mature AIM II polypeptides of the present invention, as well as subfragments of these polypeptides, can be used to treat the pain associated with the receptors and other ligands to which these molecules bind.

【０２３４】 （投与形態） 上記で議論される状態のような状態が、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の投与によっ
て処置され得ることが理解される。従って、本発明はさらに、ＡＩＭ ＩＩ活性
のレベルの増加を必要とする個体を処置する方法を提供し、この方法は、そのよ
うな個体に、そのような個体におけるＡＩＭ ＩＩ活性レベルを増加させるのに
有効な、有効量の本発明の単離されたＡＩＭ ＩＩポリペプチドを含む薬学的組
成物を投与する工程を包含する。Dosage Forms It is understood that conditions such as those discussed above can be treated by administration of the AIM II protein. Accordingly, the invention further provides a method of treating an individual in need of an increased level of AIM II activity, the method comprising providing such an individual with an increased level of AIM II activity in such an individual. Administering an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an isolated AIM II polypeptide of the present invention.

【０２３５】 一般的な提案として、非経口投与されるＡＩＭ ＩＩポリペプチドの薬学的に
有効な１用量あたりの総量は、患者の体重あたり約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ
／ｋｇ／日の範囲であるが、上述のように、これは、治療の裁量を必要とする。
より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、そし
て最も好ましくは、ヒトの場合、ホルモンについて、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日
〜１ｍｇ／ｋｇ／日の間である。連続的に投与される場合、ＡＩＭ ＩＩポリペ
プチドは、代表的には、１日あたり１〜４注射によって、または例えばミニポン
プを使用する連続的皮下注入によってのいずれかで、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約
５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で投与される。静脈注射バッグ溶液もまた、使
用され得る。As a general suggestion, the total pharmaceutically effective dose of parenterally administered AIM II polypeptide is about 1 μg / kg / day to 10 mg / body weight of the patient.
/ Kg / day, but as noted above, this requires discretion in treatment.
More preferably, the dose is at least 0.01 mg / kg / day, and most preferably, for humans, between about 0.01 mg / kg / day to 1 mg / kg / day for the hormone. When administered continuously, AIM II polypeptides are typically administered at about 1 μg / kg / hr, either by 1-4 injections per day or by continuous subcutaneous infusion using, for example, a minipump. It is administered at a dose rate of 約 50 μg / kg / hour. Intravenous bag solutions may also be used.

【０２３６】 本発明のＡＩＭ ＩＩを含む薬学的組成物は、経口投与、直腸投与、非経口投
与、槽内投与、膣内投与、腹腔内投与、局部投与（例えば、粉末、軟膏、ドロッ
プ、または経皮パッチによって）、口内投与されるか、または経口スプレーもし
くは経鼻スプレーによって投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」によ
って、非毒性の、固体、半固体、または液体の、任意の型の賦形剤、希釈剤、カ
プセル化物質、または処方補助剤が意図される。本明細書中で使用される用語「
非経口」は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨下、皮下、ならびに関節内での注射お
よび注入を含む投与のモードをいう。A pharmaceutical composition comprising AIM II of the invention may be administered orally, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (eg, as a powder, ointment, drop, or (By transdermal patches), buccally, or by oral or nasal spray. By "pharmaceutically acceptable carrier" is intended any non-toxic, solid, semi-solid, or liquid excipient, diluent, encapsulating material, or formulation aid. As used herein, the term "
"Parenteral" refers to modes of administration including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, substernal, subcutaneous, and intraarticular injection and infusion.

【０２３７】 慢性関節リウマチの処置において、本発明のＡＩＭ ＩＩポリペプチドの投与
の特に好ましいモードは、皮内、皮下、および関節内への注射ならびに注入を含
む。好ましくは、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドは、用量当たり、約０．１〜約１．
０ｍｇ／患者の体重ｋｇの範囲で関節内にまたは皮内に投与した。特に好ましい
賦形剤としては、を含む 可溶性のＡＩＭ ＩＩポリペプチド（すなわち、膜貫通ドメインの全てまたは
一部を欠いているＡＩＭ ＩＩポリペプチド）に加えて、膜貫通領域を含むＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドもまた、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）を含
ませることによって緩衝液に適切に溶解される場合、使用され得る。In the treatment of rheumatoid arthritis, particularly preferred modes of administration of the AIM II polypeptides of the present invention include intradermal, subcutaneous, and intraarticular injection and infusion. Preferably, the AIM II polypeptide comprises from about 0.1 to about 1.
It was administered intra-articularly or intradermally in the range of 0 mg / kg of patient weight. Particularly preferred excipients include, in addition to a soluble AIM II polypeptide (ie, an AIM II polypeptide lacking all or part of the transmembrane domain), an AI comprising a transmembrane region
MII polypeptides can also be used if properly dissolved in buffer by including a detergent (eg, Triton X-100).

【０２３８】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。その配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得
る。本発明による、ＤＮＡの染色体へのマッピングは、疾患と関連する遺伝子と
それらの配列とを相関付ける際の重要な第１の工程である。Chromosome Assays The nucleic acid molecules of the present invention are also useful for chromosome identification. The sequence can be specifically targeted to and hybridized to a particular location on an individual human chromosome. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating genes associated with disease with their sequences.

【０２３９】 この点について特定の好ましい実施態様において、本明細書中において開示さ
れるｃＤＮＡを使用して、ＡＩＭ ＩＩタンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクロ
ーニングする。このことは、一般に市販されている種々の周知の技術およびライ
ブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、インサイチュ染色
体マッピングのために、この目的のための周知の技術を使用して使用される。In certain preferred embodiments in this regard, the cDNA disclosed herein is used to clone the genomic DNA of the AIM II protein gene. This can be accomplished using a variety of well-known techniques and libraries that are generally commercially available. The genomic DNA is then used for in situ chromosome mapping, using well-known techniques for this purpose.

【０２４０】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー
（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピング
され得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピュータ分析を使用して、ゲノムＤＮ
Ａにおける１より多くのエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、そ
れによって増幅プロセスは複雑にされる。次いで、これらのプライマーを、個々
のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用す
る。Further, in some cases, sequences can be mapped to chromosomes by preparing cDNA-derived PCR primers, preferably 15-25 bp. Using computer analysis of the 3 'untranslated region of the gene, the genomic DN
Quickly select primers that do not span more than one exon in A, thereby complicating the amplification process. These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes.

【０２４１】 中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用して、１つの工程で、正確な染色***置を提
供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐほどの短いｃＤＮＡ由来のプローブ
とともに使用され得る。この技術の概説について、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参
照のこと。[0241] Fluorescence in situ hybridization ("FISH") of a cDNA clone to a metaphase chromosomal spread can be used to provide the exact chromosomal location in one step. This technique can be used with probes from cDNA as short as 50 or 60 bp. For a review of this technology, see Verma et al., Human.
Chromosomes: A Manual Of Basic Techni
ques, Pergamon Press, New York (1988).

【０２４２】 一旦、配列が正確な染色***置にマッピングされると、染色体上のその配列の
物理的位置を、遺伝マップデータに相関付けし得る。そのようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉ
ｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで利用可能）において見られ
る。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係を、
連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。[0242] Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of that sequence on the chromosome can be correlated to genetic map data. Such data is described, for example, in V.A. McKusick, Mendelian Inheritance I
n Man (Johns Hopkins University, Welch)
(Available online from Medical Library). Then, the relationship between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease,
Identify via linkage analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).

【０２４３】 次いで、罹患している個体と罹患していない個体との間の、ｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列における差を決定することが必要である。変異が、罹患している個体の
いくらか、またはすべてにおいて観察されるが、正常な個体においては観察され
ない場合、変異は、その疾患の原因因子である可能性がある。It is then necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is observed in some or all of the affected individuals but not in normal individuals, then the mutation may be a causative agent of the disease.

【０２４４】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照してより容
易に理解される。以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定を意図さ
れない。Having generally described the invention, the invention will be more readily understood with reference to the following examples. The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to be limiting.

【０２４５】 （実施例） （実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡＩＭ ＩＩの発現および精製） （Ａ．Ｎ末端６−Ｈｉｓタグを有するＡＩＭ ＩＩの発現） 寄託されたｃＤＮＡクローン中のＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ
配列を、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のアミノ末端配列、およびその遺伝子の３’側
のベクター配列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅
する。クローニングを促進するための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、
それぞれ５’および３’配列に付加する。Examples Example 1: Expression and purification of AIM II in E. coli A. Expression of AIM II with N-terminal 6-His tag AIM II protein in the deposited cDNA clone was DNA encoding
The sequence is amplified using PCR oligonucleotide primers specific for the amino terminal sequence of the AIM II protein and the vector sequence 3 'to the gene. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning,
Append to the 5 'and 3' sequences respectively.

【０２４６】 ２２ｋＤａのＡＩＭ ＩＩタンパク質フラグメント（Ｎ末端領域および膜貫通
領域を欠く）を、以下のプライマーを使用して発現させる： ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、図１Ａ（配列番号１）のＡＩＭ ＩＩ
タンパク質コード配列のヌクレオチド２４４〜２５８を含む、下線を付したＢａ
ｍＨＩ制限部位を含む配列５’ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡ
ＣＣ３’（配列番号７）を有する。A 22 kDa AIM II protein fragment (lacking the N-terminal and transmembrane regions) is expressed using the following primers: The 5 ′ oligonucleotide primer is the AIM II of FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
Underlined Ba containing nucleotides 244-258 of the protein coding sequence
Sequence 5 'GCG GGATCC GGAGAGATGGTCA containing mHI restriction site
It has CC3 '(SEQ ID NO: 7).

【０２４７】 ３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配
列番号１）に示されるヌクレオチド７５７〜７７４に相補的なヌクレオチドを含
む、配列５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣ３’（
配列番号８）を有する。The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ CGC AAGCTT CCCTTCACACCATGAAAGC 3 ′ (SEQ ID NO: 1) comprising an underlined HindIII restriction site followed by nucleotides complementary to nucleotides 757-774 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
SEQ ID NO: 8).

【０２４８】 全ＡＩＭ ＩＩタンパク質は、以下のプライマーを用いて発現され得る： ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、図１Ａ（配列番号１）のＡＩＭ ＩＩ
タンパク質コード配列のヌクレオチド４９〜７０を含む、下線を付したＢａｍＨ
Ｉ制限部位を含む配列５’ＧＡＣＣ ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ
ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ Ｃ３’（配列番号９）を有する。The entire AIM II protein can be expressed using the following primers: The 5 ′ oligonucleotide primer is the AIM II of FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
Underlined BamH comprising nucleotides 49-70 of the protein coding sequence
Sequence containing restriction site 5 'GACC GGATCC ATG GAG GAG
It has AGT GTC GTA CGG C3 '(SEQ ID NO: 9).

【０２４９】 ３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて図１Ｂ（配
列番号１）に示されるヌクレオチド７５６〜７８３に相補的なヌクレオチドを含
む、配列５’ＣＧＣ ＡＡＧＣＴＴ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ
ＡＧＣ３’（配列番号１０）を有する。The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ CGC AAGCTT CCT TCA CAC CAT GAA, comprising an underlined HindIII restriction site, followed by nucleotides complementary to nucleotides 756-783 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
It has AGC 3 '(SEQ ID NO: 10).

【０２５０】 これらの制限部位は、これらの実施例における細菌発現のために使用される細
菌発現ベクターｐＱＥ９における制限酵素部位にとって都合がいい。（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃ
Ａ，９１３１１）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐr」）を コードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター
、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位を
含む。These restriction sites are convenient for restriction enzyme sites in the bacterial expression vector pQE9 used for bacterial expression in these examples. (Qiag
en, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, C
A, 91311). pQE9 encodes ampicillin antibiotic resistance ("Amp r ") and has a bacterial origin of replication ("ori"), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site ("RBS"), a 6-His tag, and a restriction enzyme. Including the site.

【０２５１】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡおよびベクターｐＱＥ９の両方を、ＢａｍＨ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化したＤＮＡをともに連結する。制
限されたｐＱＥ９ベクターへのＡＩＭ ＩＩタンパク質ＤＮＡの挿入によって、
ＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を、ベクターのＩＰＴＧ誘導性プロモーター
の下流に、それに対して作動可能に連結されるように、そしてＡＩＭ ＩＩタン
パク質の翻訳のために適切に位置付けされた開始ＡＵＧに関してインフレームに
配置する。[0251] Both the amplified AIM II DNA and the vector pQE9 were isolated from BamH
Digest with I and HindIII and then ligate the digested DNA together. By inserting the AIM II protein DNA into the restricted pQE9 vector,
Placing the AIM II protein coding region downstream of the vector's IPTG-inducible promoter, operably linked thereto, and in-frame with respect to the appropriately positioned starting AUG for translation of the AIM II protein. I do.

【０２５２】 （Ｂ．Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＡＩＭ ＩＩの発現） 細菌発現ベクターｐＱＥ６０が、本実施例において細菌発現のために使用され
る。（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔ
ｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性
（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘 導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ
．（上述）により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」
）親和性樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコー
ドする６コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらのエレ
メントは、ポリペプチドをコードする挿入ＤＮＡフラグメントが、そのポリペプ
チドのカルボキシル末端に共有結合で連結された６つのＨｉｓ残基（すなわち、
「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置される。B. Expression of AIM II with C-terminal 6-His Tag The bacterial expression vector pQE60 is used in this example for bacterial expression. (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chat.
swth, CA, 91311). pQE60 encodes ampicillin antibiotic resistance ("Amp r ") and has a bacterial origin of replication ("ori"), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site ("RBS"), QIAGEN, Inc.
. Nickel-nitrilotriacetic acid ("Ni-NTA") sold by
3.) Contains 6 codons encoding histidine residues allowing for affinity purification using an affinity resin, and an appropriate single restriction enzyme cleavage site. These elements are composed of six His residues in which the inserted DNA fragment encoding the polypeptide is covalently linked to the carboxyl terminus of the polypeptide (ie,
“6 × His tag”).

【０２５３】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅す
る。このプライマーは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列
およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニールする
。ｐＱＥ６０ベクターにおけるクローニングを容易にするための制限部位を含む
さらなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ付加する。The DNA sequence encoding the desired portion of the AIM II protein is amplified from the deposited cDNA clone using PCR oligonucleotide primers. This primer anneals to the amino terminal sequence of the desired portion of the AIM II protein and sequences in the deposited construct 3 'to the cDNA coding sequence. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning in the pQE60 vector are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.

【０２５４】 タンパク質のクローニングのために、５’プライマーは、配列５’ＧＡＣＧＣ ＣＣＡＴＧＧ ＡＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ Ｃ
３’（配列番号１７）を有する。これは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位、続い
て、図１Ａ中のＡＩＭ ＩＩ配列のアミノ末端コード配列に相補的なヌクレオチ
ドを含有する。当然、当業者は、タンパク質コード配列中における、５’プライ
マーが開始する地点が、完全タンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡ
セグメント（より短いまたはより長い）を増幅するために変動され得ることを理
解する。３’プライマーは、配列５’ＧＡＣＣ ＧＧＡＴＣＣ ＣＡＣ ＣＡＴ
ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＣＣ ＧＡＡ ＧＴＡ ＡＧ ３’（配列番号１８）を有
する。これは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位、続いて、図１Ｂ中のＡＩＭ
ＩＩ ＤＮＡ配列中の停止コドンの直前のコード配列の３’末端に相補的なヌク
レオチドを含有し、コード配列は、ｐＱＥ６０ベクター中の６つのＨｉｓコドン
の読み枠と共にその読み枠を維持するように制限部位と整列される。For cloning of the protein, the 5 'primer had the sequence 5' GACGC CCATGG AG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C
3 '(SEQ ID NO: 17). This is the underlined NcoI restriction site, followed by
And a nucleotide complementary to the amino-terminal coding sequence of the AIM II sequence in FIG. 1A.
Contains Of course, those skilled in the art will recognize that the 5 'ply
The point where the mer starts is DNA encoding any desired part of the complete protein
Understand that it can be varied to amplify segments (shorter or longer)
Understand. The 3 'primer has the sequence 5' GACCGGATCC CAC CAT
 GAA AGC CCC GAA GTA AG 3 '(SEQ ID NO: 18)
I do. This is the underlined BamHI restriction site, followed by the AIM in FIG. 1B.
II A nucleotide complementary to the 3 'end of the coding sequence immediately before the stop codon in the DNA sequence.
Containing the reotide, the coding sequence consists of six His codons in the pQE60 vector.
Together with the restriction site to maintain that reading frame.

【０２５５】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、
ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化し、そして次いで、消化されたＤＮＡを共に連
結する。ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、Ｉ
ＰＴＧ誘導性プロモーターから下流に、かつ開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジン
コドンとインフレームに、ＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を配置する。The amplified AIM II DNA fragment and the vector pQE60 were
Digest with BamHI and NcoI and then ligate the digested DNA together. Insertion of AIM II DNA into the restricted pQE60 vector
The AIM II protein coding region is located downstream from the PTG inducible promoter and in frame with the initiation AUG and the six histidine codons.

【０２５６】 （Ｃ．Ｎ末端６Ｈｉｓタグを有するＡＩＭ ＩＩ欠失変異体の発現） 寄託されたｃＤＮＡクローン中のＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ
配列を、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の配列およびこの遺伝子の３’側のベクター配
列に特異的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。クロー
ニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、５’配列お
よび３’配列にそれぞれ付加した。C. Expression of AIM II Deletion Mutant with N-Terminal 6His Tag DNA encoding AIM II protein in the deposited cDNA clone
The sequence was amplified using PCR oligonucleotide primers specific for the sequence of the AIM II protein and the vector sequence 3 'to this gene. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning were added to the 5 'and 3' sequences, respectively.

【０２５７】 特に、Ｎ末端欠失ＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２中のＭｅｔ（６８）からＶ
ａｌ（２４０））を、以下のプライマーを使用して構築した： ５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’−ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ
ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号２１）を有す
る。これは、下線を付したＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして図１Ａ（配列番号
１）中のＡＩＭ ＩＩタンパク質コード配列の１７ヌクレオチドを含有する。In particular, the N-terminal deletion AIM II mutant (Met (68) to V
al (240)) was constructed using the following primers: The 5 'oligonucleotide primer had the sequence 5'-GGG GGA TCC
It has ATG GTC ACC CGC CTG CC-3 '(SEQ ID NO: 21). It contains an underlined BamHI restriction site and contains 17 nucleotides of the AIM II protein coding sequence in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).

【０２５８】 ３’プライマーは、配列５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＴ Ｇ
ＡＡ ＡＧＣ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号２２）を有する。これは、下線を付
したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続いて、図１Ｂ（配列番号１）中に示されるよう
なヌクレオチド７５３〜７６８に相補的なヌクレオチドを含有する。The 3 ′ primer had the sequence 5′-GGG AAG CTT CAC CAT G
It has AA AGC CCC G-3 '(SEQ ID NO: 22). It contains an underlined HindIII restriction site, followed by nucleotides complementary to nucleotides 753-768 as shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).

【０２５９】 これらの制限部位は、細菌発現ベクターｐＱＥ９における制限酵素部位に対し
て好都合である。これらは、本実施例において細菌発現のために使用される。（
Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒ
ｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐ r 」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモ ーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素
部位を含有する。These restriction sites correspond to the restriction enzyme sites in the bacterial expression vector pQE9.
It is convenient. These are used for bacterial expression in this example. (
Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth
th, CA, 91311). pQE9 is resistant to ampicillin antibiotics (“Amp r ") And encodes a bacterial origin of replication (" ori "), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site (" RBS "), a 6-His tag, and a restriction enzyme.
Contains a site.

【０２６０】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８−２４０）ＤＮＡおよびベクターｐＱ
Ｅ９の両方をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして次いで、消化さ
れたＤＮＡを共に連結した。ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８−２４０）タンパク質
ＤＮＡの、制限処理されたｐＱＥ９ベクターへの挿入は、ベクターのＩＰＴＧ誘
導性プロモーターから下流に、かつこれに作動可能に連結され、かつＡＩＭ Ｉ
Ｉ欠失タンパク質の翻訳のために適切に位置された開始ＡＵＧとインフレームに
、ＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を配置する。Amplified AIM II (amino acids 68-240) DNA and vector pQ
Both E9 were digested with BamHI and HindIII, and then the digested DNA was ligated together. Insertion of the AIM II (amino acids 68-240) protein DNA into the restricted pQE9 vector is operably linked to and downstream from the vector's IPTG-inducible promoter.
The AIM II protein coding region is placed in frame with the starting AUG properly positioned for translation of the I deleted protein.

【０２６１】 （細菌の形質転換：） 上記のＡ、Ｂ、またはＣにおいて作製された６−Ｈｉｓタグ化発現構築物由来
の連結混合物は、標準的な手順を使用して、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に
形質転換される。このような手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。Ｅ
．ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株（多コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を含有する
。これは、ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr 」）を与える）が、本明細書中に記載の例示的な実施例を実施することにおいて
使用される。この株は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現に適した多くのうちの唯
一の１つであり、Ｑｉａｇｅｎから市販されている。Bacterial Transformation: The ligation mixture from the 6-His-tagged expression constructs made in A, B, or C above was used to construct competent E. coli cells using standard procedures. E. coli cells. Such a procedure is described in Sambrook et al., Molecular.
Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition; Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Spring Harbor, N.D. Y. (1989). E
. E. coli strain M15 / rep4, which contains multiple copies of plasmid pREP4, which expresses the lac repressor and confers kanamycin resistance ("Kan r "), has been described in the exemplary implementations described herein. Used in practicing the examples. This strain is one of many suitable for the expression of AIM II protein and is commercially available from Qiagen.

【０２６２】 形質転換体は、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下におけるＬＢプレー
ト上で増殖するそれらの能力によって同定される。プラスミドＤＮＡは耐性コロ
ニーから単離され、そしてクローン化ＤＮＡの正体は制限分析によって確認され
る。Transformants are identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA is confirmed by restriction analysis.

【０２６３】 所望の構築物を含有するクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およ
びカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を添加したＬＢ培地中での液体培養に
おいて、一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Clones containing the desired construct are grown overnight (“O / N”) in liquid culture in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). .

【０２６４】 このＯ／Ｎ培養物を、約１：１００〜１：２５０の希釈で大きな培養物を接種
するために使用する。細胞を、６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）が０
．４と０．６との間になるまで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を最終濃度１ｍＭに添加し、ｌａｃＩリ
プレッサーを不活性化することによりｌａｃリプレッサー感受性プロモーターか
らの転写を誘導する。細胞を、続けてさらに３〜４時間インキュベートする。次
いで、細胞を、標準的な方法を使用して、遠心分離により採取し、そして破壊す
る。封入体を破壊細胞から慣用的な採集技術を使用して精製し、そしてタンパク
質を封入体から８Ｍ尿素に可溶化する。可溶化タンパク質を含有する８Ｍ尿素溶
液を、２×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中でＰＤ−１０カラムに通し
、それにより尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再フォールデ
ィングする。このタンパク質をクロマトグラフィーのさらなる段階によって精製
し、エンドトキシンを除去する。次いで、これを滅菌濾過する。滅菌濾過された
タンパク質調製物を、９５μｇ／ｍｌの濃度で２×ＰＢＳ中に保存する。This O / N culture is used to inoculate a large culture at a dilution of about 1: 100 to 1: 250. Cells were treated with an optical density at 600 nm ("OD600") of 0.
. Grow to between 4 and 0.6. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (“IPTG”) is added to a final concentration of 1 mM to induce transcription from the lac repressor sensitive promoter by inactivating the lacI repressor. The cells are subsequently incubated for a further 3-4 hours. The cells are then harvested by centrifugation and disrupted using standard methods. The inclusion bodies are purified from the disrupted cells using conventional harvesting techniques, and the protein is solubilized from the inclusion bodies in 8M urea. The 8M urea solution containing the solubilized protein is passed over a PD-10 column in 2x phosphate buffered saline ("PBS"), thereby removing the urea, replacing the buffer, and removing the protein. Refold. The protein is purified by a further step of chromatography to remove endotoxin. It is then sterile filtered. The sterile filtered protein preparation is stored in 2 × PBS at a concentration of 95 μg / ml.

【０２６５】 （Ｄ．６−Ｈｉｓタグを有さない全長ＡＩＭ ＩＩの発現および精製） 細菌発現ベクターｐＱＥ６０が、本実施例において細菌発現のために使用され
る（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗ
ｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐性（「
Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性 プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（
前出）により販売されているニッケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）ア
フィニティー樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基を
コードする６コドン、および適切な単一制限酵素切断部位を含有する。これらの
エレメントは、ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントが、そのポリペプ
チドのカルボキシル末端に共有結合で連結された６つのＨｉｓ残基（すなわち、
「６×Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを生成するように挿入され得るよう
に配置される。しかし、本実施例では、ポリペプチドコード配列は、６Ｈｉｓコ
ドンの翻訳が妨害されるように挿入され、従って、このポリペプチドは、６×Ｈ
ｉｓタグを有さずに生成される。D. Expression and Purification of Full Length AIM II without 6-His Tag The bacterial expression vector pQE60 is used for bacterial expression in this example (QIAGEN, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsw).
orth, CA, 91311). pQE60 is resistant to ampicillin antibiotics ("
Amp r ") and encodes a bacterial origin of replication (" ori "), an IPTG-inducible promoter, a ribosome binding site (" RBS "), QIAGEN, Inc. (
The 6 codons encoding histidine residues that allow for affinity purification using the nickel-nitrilotriacetic acid ("Ni-NTA") affinity resin sold by J. Am. contains. These elements comprise six His residues in which a DNA fragment encoding a polypeptide is covalently linked to the carboxyl terminus of the polypeptide (ie,
It is arranged so that it can be inserted to produce a polypeptide with a “6 × His tag”). However, in this example, the polypeptide coding sequence was inserted such that translation of the 6His codon was prevented, so that the polypeptide had a 6 × H
Generated without an is tag.

【０２６６】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅す
る。このプライマーは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列
およびｃＤＮＡコード配列の３’側の寄託された構築物中の配列にアニールする
。ｐＱＥ６０ベクターにおけるクローン化を容易にするための制限部位を含むさ
らなるヌクレオチドを、５’配列および３’配列にそれぞれ付加する。The DNA sequence encoding the desired portion of the AIM II protein is amplified from the deposited cDNA clone using PCR oligonucleotide primers. This primer anneals to the amino terminal sequence of the desired portion of the AIM II protein and sequences in the deposited construct 3 'to the cDNA coding sequence. Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning in the pQE60 vector are added to the 5 'and 3' sequences, respectively.

【０２６７】 タンパク質のクローン化のために、５’プライマーは、配列５’ＧＡＣＧＣＣ ＣＡＴＧＧ ＡＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ Ｃ ３
’（配列番号１７）を有する。これは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位を含有し
、図１Ａ中のＡＩＭ ＩＩ配列のアミノ末端コード領域のヌクレオチドを含む。
当然、当業者は、タンパク質コード配列中における、５’プライマーが開始する
位置が、完全タンパク質の所望の部分（すなわち、より短いまたはより長い）を
増幅するために変動され得ることを理解する。３’プライマーは、配列５’ＣＧ
Ｃ ＡＡＧＣＴＴ ＣＣＴＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＣ ３’（
配列番号１９）を有する。これは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、続い
て、図１Ｂ（配列番号１）中のＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡ配列中の非コード配列の３
’末端に相補的なヌクレオチドを含有する。For protein cloning, the 5 ′ primer was prepared using the sequence 5 ′ GACGC C CATGG AG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3
'(SEQ ID NO: 17). It contains an underlined NcoI restriction site and includes the nucleotides of the amino-terminal coding region of the AIM II sequence in FIG. 1A.
Of course, those skilled in the art will appreciate that the position in the protein coding sequence where the 5 'primer starts can be varied to amplify the desired portion of the complete protein (ie, shorter or longer). The 3 'primer has the sequence 5'CG
C AAGCTT CCTT CAC ACC ATG AAA GC 3 '(
SEQ ID NO: 19). This is an underlined HindIII restriction site, followed by three of the non-coding sequences in the AIM II DNA sequence in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
'Contains a complementary nucleotide at the terminus.

【０２６８】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、
ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして次いで、消化されたＤＮＡを共
に連結する。ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は
、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流に、かつ開始ＡＵＧとインフレームに、
その関連停止コドンを含むＡＩＭ ＩＩタンパク質コード領域を配置する。関連
停止コドンは、挿入点の下流の６ヒスチジンコドンの翻訳を妨害する。The amplified AIM II DNA fragment and the vector pQE60 were
Digest with NcoI and HindIII, and then ligate the digested DNA together. Insertion of AIM II DNA into the restricted pQE60 vector was performed downstream from the IPTG-inducible promoter and in frame with the starting AUG.
Place the AIM II protein coding region including its associated stop codon. The relevant stop codon prevents translation of the six histidine codons downstream of the insertion point.

【０２６９】 （Ｅ．Ｎ末端ＡＩＭ II欠失変異体の構築） ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体（配列番号２におけるＭｅｔ（６８）〜Ｖａｌ（２４
０））をクローニングするために、５’プライマーは、配列５’−ＧＧＧ ＣＣ Ａ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号
２３）（下線部のＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含む）を有し、そして続いて図１
Ａ中のＡＩＭ ＩＩタンパク質コード配列の１７ヌクレオチドを含む。３’プラ
イマーは、配列５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧ
Ｃ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号２２）（下線部のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位、
続いて図１Ｂ（配列番号１）中のヌクレオチド７５３〜７６８に相補的なヌクレ
オチドを含む）を有する。E. Construction of N-terminal AIM II deletion mutant AIM II deletion mutant (Met (68) -Val (24 in SEQ ID NO: 2)
For cloning 0)), the 5 'primer has the sequence 5'-GGG CC ATG G ATG GTC ACC CGC CTG CC-3' (SEQ ID NO: 23) (including the underlined NcoI restriction enzyme recognition site). And then Figure 1
A contains 17 nucleotides of the AIM II protein coding sequence in A. The 3 'primer has the sequence 5'-GGG AAG CTT CAC CAT GAA AG
C CCC G-3 ′ (SEQ ID NO: 22) (underlined Hind III restriction site,
Followed by nucleotides complementary to nucleotides 753-768 in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).

【０２７０】 増幅したＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８〜２４０）ＤＮＡフラグメントおよびベ
クターｐＱＥ６０をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、次いで、消化し
たＤＮＡをともに連結した。ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８〜２４０）ＤＮＡの、
制限酵素で切断されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモータ
ーから下流に、およびインフレームに開始ＡＵＧを有するように、ＡＩＭ ＩＩ
（アミノ酸６８〜２４０）タンパク質コード領域を配置する。ＨｉｎｄＩＩＩ消
化は、この挿入場所の下流の６つのヒスチジンコドンを除去する。The amplified AIM II (amino acids 68-240) DNA fragment and the vector pQE60 were digested with NcoI and HindIII, and the digested DNAs were ligated together. Of AIM II (amino acids 68-240) DNA,
Insertion into the pQE60 vector cleaved with the restriction enzyme was performed with AIM II downstream from the IPTG-inducible promoter and with the initiating AUG in frame.
(Amino acids 68-240) Position the protein coding region. HindIII digestion removes the six histidine codons downstream of this insertion site.

【０２７１】 （Ｆ．Ｎ末端ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体の構築） ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体（配列番号２中のＡｌａ（１０１）〜Ｖａｌ（２４０
））をクローニングするために、５’プライマーは、配列５’−ＧＧＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＣＣ ＡＡＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＣＣ−３’（配列番号
２４）（下線部のＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含み、図１Ａ中のＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質コード配列におけるヌクレオチド３４９〜３６６を含む）を有する。も
ちろん、当業者は、タンパク質コード配列における５’プライマーの始点が完全
なタンパク質の所望の部分を増幅する（すなわち、より短くまたはより長く）た
めに変化し得ることを理解する。３’プライマーは、配列５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号２２
）（下線部のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位、続いて図１ＢのＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡ
配列のヌクレオチド７５５〜７６８に相補的なヌクレオチドを含む）を有する。F. Construction of N-terminal AIM II deletion mutant AIM II deletion mutant (Ala (101) -Val (240 in SEQ ID NO: 2)
)), The 5 ′ primer contains the sequence 5′-GGG CCA TGG GCC AAC TCC AGC TTG ACC-3 ′ (SEQ ID NO: 24) (including the underlined NcoI restriction enzyme recognition site and FIG. (Comprising nucleotides 349-366 in the AIM II protein coding sequence). Of course, those skilled in the art will understand that the starting point of the 5 'primer in the protein coding sequence may vary to amplify (ie, shorter or longer) the desired portion of the complete protein. The 3 ′ primer has the sequence 5′-GGG AAG CTT CAC CAT GAA AGC CCC G-3 ′ (SEQ ID NO: 22).
) (Underlined Hind III restriction site followed by AIM II DNA of FIG. 1B)
(Comprising nucleotides complementary to nucleotides 755 to 768 of the sequence).

【０２７２】 増幅されたＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸１０１〜２４０）ＤＮＡフラグメントおよ
びベクターｐＱＥ６０をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、次いで、消
化したＤＮＡをともに連結した。ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸１０１〜２４０）ＤＮ
Ａの、制限酵素で切断されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロ
モーターから下流に、およびインフレームに開始ＡＵＧを有するように、ＡＩＭ
ＩＩ（アミノ酸１０１〜２４０）タンパク質コード領域を配置する。Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ消化は、挿入場所の下流の６つのヒスチジンコドンを除去する。The amplified AIM II (amino acids 101-240) DNA fragment and the vector pQE60 were digested with NcoI and HindIII, and the digested DNAs were ligated together. AIM II (amino acids 101-240) DN
Insertion of A into the pQE60 vector cut with the restriction enzyme was performed with the AIM
The II (amino acids 101-240) protein coding region is located. Hind
III digestion removes the six histidine codons downstream of the insertion site.

【０２７３】 （Ｇ．Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＡＩＭ ＩＩの精製） ＡＩＭ ＩＩの可溶性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列（配列
番号２のアミノ酸残基、Ｌ８３−Ｖ２４０に対応する）をＨＧＳ Ｅ．ｃｏｌｉ
発現ベクター、ｐＨＥ４にクローン化した。生じたプラスミドＤＮＡ（ｐＨＥ４
：ＡＩＭ ＩＩ．Ｌ８３−Ｖ２４０）は、ＳＧ１３００９ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細
胞を形質転換するために使用した。この細菌性形質転換体をカナマイシンを含む
ＬＢ培地中で増殖させた。ＩＰＴＧ誘導に際して、組換えＡＩＭ ＩＩを封入体
中で蓄積される不溶性タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。(Purification of AIM II from GE coli) The polynucleotide sequence encoding the soluble fragment of AIM II (amino acid residue of SEQ ID NO: 2, corresponding to L83-V240) was prepared by HGS E. coli. coli
It was cloned into an expression vector, pHE4. The resulting plasmid DNA (pHE4
: AIM II. L83-V240) is SG13009E. E. coli host cells. This bacterial transformant was grown in LB medium containing kanamycin. Upon IPTG induction, recombinant AIM II as E. coli as an insoluble protein that accumulates in inclusion bodies. E. coli.

【０２７４】 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２
ｍＭ ＣａＣｌ2を含む緩衝液中で再懸濁し、そしてマイクロフルイダイザー（ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎｅｗｔｏｎ
．ＭＡ）を通して、６０００〜８０００ｐｓｉで２回通過することにより溶解し
た。この溶解サンプルを０．５Ｍの最終濃度までＮａＣｌと混合し、次いで７０
００×ｇで２０分間遠心分離した。得られたペレットを０．５Ｍ ＮａＣｌを含
む同じ緩衝液で再度洗浄し、次いで７０００×ｇで２０分間、再度、遠心分離し
た。E. coli cell paste in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 2
Resuspend in a buffer containing mM CaCl 2 and use a microfluidizer (Microfluidics. Newton).
. MA) through two passes at 6000-8000 psi. The lysed sample was mixed with NaCl to a final concentration of 0.5M, then
Centrifuged at 00 × g for 20 minutes. The resulting pellet was washed again with the same buffer containing 0.5 M NaCl and then centrifuged again at 7000 × g for 20 minutes.

【０２７５】 次いで、部分精製された封入体を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2、５ｍＭ システインを含む２．０Ｍ グアニジン塩酸塩中で２ ０−２５μＣで２〜４時間再懸濁し、そして遠心分離した。次いで、得られたペ
レットを５ｍＭシステインを有するか、または有さない１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（
ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＣａＣｌ2を含む３．０〜３．５Ｍ グアニジン塩酸塩 中で４μＣで４８〜７２時間再懸濁した。この時点で、ＡＩＭ ＩＩの一部が可
溶化し、そして７０００×ｇの遠心分離後に可溶性相に残存した。Next, the partially purified inclusion body was added to 100 mM Tris (pH 7.4), 2m
Resuspended in M CaCl 2 , 2.0 M guanidine hydrochloride containing 5 mM cysteine at 20-25 μC for 2-4 hours and centrifuged. The resulting pellet was then combined with 100 mM Tris (with or without 5 mM cysteine).
pH 7.4) and resuspended in 3.0-3.5 M guanidine hydrochloride containing 2 mM CaCl 2 at 4 μC for 48-72 hours. At this point, a portion of AIM II was solubilized and remained in the soluble phase after centrifugation at 7000 × g.

【０２７６】 ３Ｍグアニジン塩酸塩抽出物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５
０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む２０〜３０容量の緩衝液で迅速に希釈した。界面
活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＣＨＡＰＳ）を添加し、再折りたたみ効力
を増加させ得る。その後、この混合物を、以下に述べるクロマトグラフィー精製
工程前、２〜７日間混合することなく４μＣに置く。The 3M guanidine hydrochloride extract was added to 50 mM Tris-HCl (pH 8), 15 mM
Dilute quickly with 20-30 volumes of buffer containing 0 mM sodium chloride. Surfactants (eg, Tween-20, CHAPS) can be added to increase refolding efficacy. This mixture is then placed at 4 μC without mixing for 2-7 days before the chromatographic purification step described below.

【０２７７】 （ＡＩＭ ＩＩの液体クロマトグラフィー精製） この希釈したＡＩＭ ＩＩサンプルを０．４５μｍの滅菌フィルターを使用し
て清澄化した。次いで、ＡＩＭ ＩＩタンパク質を０．５Ｍ ＭＥＳでｐＨ６〜
６．８に調整し、そして強陽イオン交換（ＰＯＲＯＳ ＨＳ−５０）カラム上で
クロマトグラフを行った。このＨＳカラムを最初に、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯ
Ｈ（ｐＨ６．６）および１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む６〜１０カラム容量
の緩衝液で洗浄した。結合タンパク質を５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．６）中の３
００ｍＭ、７００ｍＭ、１５００ｍＭ 塩化ナトリウムの段階的勾配の３〜５カ
ラム容量を使用して溶出した。Liquid Chromatographic Purification of AIM II The diluted AIM II sample was clarified using a 0.45 μm sterile filter. The AIM II protein was then purified with 0.5 M MES to pH 6-
Adjusted to 6.8 and chromatographed on a strong cation exchange (POROS HS-50) column. The HS column is first loaded with 50 mM MES-NaO
Washed with 6-10 column volumes of buffer containing H (pH 6.6) and 150 mM sodium chloride. The bound protein was added to 3 mM in 50 mM MES, pH 6.6.
Elution was performed using 3-5 column volumes of a step gradient of 00 mM, 700 mM, 1500 mM sodium chloride.

【０２７８】 ０．７Ｍ塩化ナトリウムで溶出したＨＳ画分を水で３倍に希釈した。The HS fraction eluted with 0.7M sodium chloride was diluted three times with water.

【０２７９】 （細菌の形質転換：） 上記Ｄ、ＥまたはＦにおいて生成された発現構築物由来の連結混合物を、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（
１９８９）に記載のような標準的手順を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞
へ形質転換した。ｌａｃリプレッサーを発現し、かつカナマイシン耐性（「Ｋａ
ｎr」）を与える、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含むＥ．ｃｏｌｉ株 ＭＩ５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載の例証的な実施例を実行する際に使用し
た。この株は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質を発現するのに適切な多くの株のうちの
たった１つであり、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．（前出）より市販されていた。形質
転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下においてＬＢプレート上で
増殖するそれらの能力によって同定した。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから
単離し、そしてクローン化されたＤＮＡの正体を、制限酵素分析、ＰＣＲおよび
ＤＮＡ配列決定によって確認した。Bacterial Transformation: The ligation mixture from the expression constructs generated in D, E or F above was
mbrook et al., Molecular Cloning: a Laborato.
ry Manual, 2nd edition; Cold Spring Harbor Lab
office Press, Cold Spring Harbor, NY (
1989) using standard procedures as described in E. coli cells were transformed. lac repressor and kanamycin resistance ("Ka
nr ") containing multiple copies of plasmid pREP4. E. coli strain MI5 / rep4 was used in performing the illustrative examples described herein. This strain is only one of many suitable for expressing AIM II protein and is available from QIAGEN, Inc. (See above). Transformants were identified by their ability to grow on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin. Plasmid DNA was isolated from resistant colonies and the identity of the cloned DNA was confirmed by restriction analysis, PCR and DNA sequencing.

【０２８０】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補充されたＬＢ培地における液体培養で
一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物は、約１：２５〜約１：２５０の希
釈で大きな培養物を接種するために使用した。この細胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ
６００」）での光学密度が０．４と０．６との間のになるように増殖させた。次
いで、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッサー感
受性プロモーターから転写を誘導するために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、最終濃度が１ｍＭになるように添加した。
続いて細胞をさらに３〜４時間インキュベートした。次いで、遠心分離により細
胞を収集した。A clone containing the desired construct is grown overnight ("O / N") in liquid culture in LB medium supplemented with both ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin (25 μg / ml). The O / N culture was used to inoculate a large culture at a dilution of about 1:25 to about 1: 250. The cells were grown at 600 nm ("OD
Grow at 600 ") between 0.4 and 0.6. Then, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (“IPTG”) is brought to a final concentration of 1 mM to induce transcription from the lac repressor-sensitive promoter by inactivating the lacI repressor. Was added as follows.
The cells were subsequently incubated for a further 3-4 hours. The cells were then collected by centrifugation.

【０２８１】 次いで、この細胞を６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ８中で、４℃で３〜４時間、
攪拌した。この細胞細片を遠心分離によって除去し、そしてＡＩＭ ＩＩを含む
上清を、２００ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
６に対して透析した。あるいは、このタンパク質は、プロテアーゼインヒビター
を含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ ｐＨ７．４に対して透析することによって首尾よく再折り畳みされ得る。再
生後、このタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロ
マトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る。あ
るいは、抗体カラムのようなアフィニティークロマトグラフィー工程が、純粋な
ＡＩＭ ＩＩタンパク質を得るために使用され得る。精製されたタンパク質を４
℃で保存するかまたは−８０℃で凍結した。The cells were then incubated in 6 M guanidine HCl, pH 8, at 4 ° C. for 3-4 hours.
Stirred. The cell debris was removed by centrifugation and the supernatant containing AIM II was washed with 50 mM sodium acetate buffer pH 200 supplemented with 200 mM NaCl.
Dialyzed against 6. Alternatively, the protein is 500 mM NaCl with protease inhibitors, 20% glycerol, 25 mM Tris / HC
1 Can be successfully refolded by dialysis against pH 7.4. After regeneration, the protein can be purified by ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and size exclusion chromatography. Alternatively, an affinity chromatography step, such as an antibody column, can be used to obtain pure AIM II protein. 4 purified proteins
C. or frozen at -80.degree.

【０２８２】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＡＩＭ ＩＩタンパク質のクロ
ーニングおよび発現） （Ａ．全長ＡＩＭ ＩＩタンパク質の構築：） 寄託されたクローンにおける全長ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａ配列は、その遺伝子の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを使用して増幅される： この５’プライマーは、配列５’ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ Ｃ３’（
配列番号１１）（下線部のＢａｍ ＨＩ制限酵素部位、続いて図１Ａ中のＡＩＭ
ＩＩタンパク質に対するコード領域の２２塩基（すなわち、ヌクレオチド４９
〜７０）を含む）を有する。以下のように発現ベクターに挿入され、ＡＩＭ Ｉ
Ｉをコードする増幅されたフラグメントの５’末端は、有効なシグナルペプチド
を提供する。Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５
０（１９８７）によって記載される、真核生物細胞における翻訳開始のための有
効なシグナルは、構築物のベクター部分に適切に位置する。Example 2 Cloning and Expression of AIM II Protein in Baculovirus Expression System A. Construction of Full Length AIM II Protein: cDN encoding full length AIM II protein in the deposited clone
The A sequence is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene: The 5 'primer has the sequence 5' GCT CCA GGA TCC GCC
ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C3 '(
SEQ ID NO: 11) (underlined Bam HI restriction enzyme site followed by AIM in FIG. 1A)
22 bases of the coding region for the II protein (ie, nucleotide 49
To 70). The AIM I was inserted into the expression vector as follows.
The 5 'end of the amplified fragment encoding I provides an effective signal peptide. Kozak, M .; , J. et al. Mol. Biol. 196: 947-95
The effective signal for translation initiation in eukaryotic cells, described by J. O. (1987), is appropriately located in the vector portion of the construct.

【０２８３】 ３’プライマーは、配列５’ＧＡ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＣＡＡ
ＴＧＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＣ３’（配列番号１２
）（下線部のＡｓｐ７１８制限酵素認識部位、続いて図１Ａ中に示すＡＩＭ Ｉ
Ｉのヌクレオチド７７０〜７９５に対して相補的なヌクレオチドを含む）を有す
る。The 3 ′ primer has the sequence 5 ′ GA CGC GGT ACC GTC CAA
TGC ACC ACG CTC CTT CCT TC3 '(SEQ ID NO: 12
) (Underlined Asp718 restriction enzyme recognition site followed by AIM I shown in FIG. 1A)
I (comprising nucleotides complementary to nucleotides 770-795).

【０２８４】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８
を用いて消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメン
トは、本明細書においてＦ２と命名する。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean”, BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Using a 1% agarose gel. This fragment was then converted to BamHI and Asp718.
And purified again on a 1% agarose gel. This fragment is designated herein as F2.

【０２８５】 ベクターｐＡ２−ＧＰを、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎ
ｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌ
ｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されるように、標準的手法を使
用して、バキュロウイルス発現系においてＡＩＭ ＩＩタンパク質を発現するた
めに使用する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリへドリン（ｐｏｌｙｈ
ｅｄｒｉｎ）プロモーター、続いて都合の良い制限酵素部位を含む。ＡｃＭＮＰ
Ｖ ｇｐ６７のシグナルペプチド（Ｎ末端メチオニンを含む）は、ちょうどＢａ
ｍＨＩ部位の上流に位置する。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリア
デニル化部位は、効率的なポリアデニル化のために使用される。組換えウイルス
の容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が、ポ
リヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入され、そしてポリヘドリン遺伝子のポ
リアデニル化シグナルが続く。クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生
存可能なウイルスを産生するために、このポリヘドリン配列は、両側で、野生型
ウイルスＤＮＡとの細胞媒介相同的組換えのためのウイルス配列に隣接される。The vector pA2-GP was constructed as described in Summers et al., A Manual of Me.
foods for Baculovirus Vectors and In
sec Cell Culture Procedures, Texas A
gricultural Experimental Station Bull
Letin No. 1555 (1987), and used to express the AIM II protein in a baculovirus expression system using standard techniques. This expression vector is Autographa californ.
ica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), a potent polyhedrin (polyh
edrin) promoter, followed by convenient restriction sites. AcMNP
The signal peptide of V gp67 (including the N-terminal methionine) is just Ba
Located upstream of the mHI site. The simian virus 40 ("SV40") polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses, E. coli The β-galactosidase gene from E. coli is inserted in the same direction as the polyhedrin promoter, and is followed by a polyadenylation signal of the polyhedrin gene. The polyhedrin sequence is flanked on both sides by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA to produce a viable virus expressing the cloned polynucleotide.

【０２８６】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
およびｐＡｃＩＭ１）は、ｐＡ２−ＧＰの代わりに使用され得る。これらは、当
業者が、構築物を必要に応じて、転写、翻訳、輸送などのために適切に配置され
たシグナル（例えば、インフレームＡＵＧおよびシグナルペプチド）を提供する
ことを理解するように提供される。このようなベクターは、とりわけ、Ｌｕｃｋ
ｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９に記載される。[0286] Many other baculovirus vectors (eg, pAc373, pVL941
And pAcIM1) can be used instead of pA2-GP. These are provided so that one of skill in the art would understand that the constructs provide signals (eg, in-frame AUGs and signal peptides) appropriately arranged for transcription, translation, transport, etc., as needed. You. Such vectors are, inter alia, Luck
ow et al., Virology 170: 31-39.

【０２８７】 プラスミドを、制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＡｓｐ ７１８を用いて消化し、
次いで、当該分野において公知の慣用的手順を使用して、仔ウシ腸ホスファター
ゼを用いて脱リン酸化する。次いで、このＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎｅｃ
ｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して
１％アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中において
「Ｖ」と命名する。The plasmid was digested with the restriction enzymes Bam HI and Asp 718,
It is then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase using conventional procedures known in the art. This DNA was then transferred to a commercially available kit ("Genec
lean "BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Using a 1% agarose gel. This vector DNA is designated herein as "V".

【０２８８】 フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
を用いてともに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞をライゲーション混合
物を用いて形質転換し、そして培養プレート上に広げた。ヒトＡＩＭ ＩＩ遺伝
子を有するプラスミドを含む細菌を、ＸｂａＩを使用して個々のコロニー由来の
ＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動により消化産物を分析することによって、
同定する。クローン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確
認する。このプラスミドを、本明細書中でｐＢａｃＡＩＭ ＩＩと命名する。Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 are ligated together using T4 DNA ligase. E. FIG. E. coli HB101 cells were transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Bacteria containing the plasmid with the human AIM II gene are digested with DNA from individual colonies using XbaI, and then analyzed by gel electrophoresis for digestion products.
Identify. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing. This plasmid is designated herein as pBacAIM II.

【０２８９】 （Ｂ．Ｎ末端ＡＩＭ ＩＩ欠失変異体の構築：） この例示的な例において、ＡＩＭ ＩＩタンパク質のＮ末端欠失をコードする
クローン化ＤＮＡをバキュロウイルスに挿入するために、プラスミドシャトルベ
クターｐＡ２ ＧＰを使用し、そして、バキュロウイルスリーダーおよびＳｕｍ
ｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏ
ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９
８７）に記載される標準的方法を使用して、配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ変
異体（Ｇｌｎ（６０）〜Ｖａｌ（２４０））およびＡＩＭ ＩＩ変異体（Ｓｅｒ
（７９）〜Ｖａｌ（２４０））を発現させた。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇ
ｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強
力なポリへドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７タンパク質の
分泌シグナルペプチド（リーダー）および都合の良い制限部位（例えば、Ｂａｍ
ＨＩ、Ｘｂａ ＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ
４０」）のポリアデニル化部位は、効率的なポリアデニル化のために使用される
。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同じ方向の弱いＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含み、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを
含む。この挿入された遺伝子は、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する
生存可能なウイルスを産生するために、両側で、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞
媒介相同的組換えのためのウイルス配列に隣接される。B. Construction of N-Terminal AIM II Deletion Mutants: In this illustrative example, the plasmid shuttle was used to insert the cloned DNA encoding the N-terminal deletion of AIM II protein into a baculovirus. The vector pA2 GP was used and a baculovirus leader and Sum
mers et al., A Manual of Methods for Baculo.
virus Vectors and Insect Cell Cultur
e Procedures, Texas Acrocultural Expe
rimental Station Bulletin No. 1555 (19
87) and the AIM II variants (Gln (60) -Val (240)) and AIM II variants (Ser
(79) to Val (240)) were expressed. This expression vector is Autog
rapa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) strong polyhedrin promoter, followed by the secretion signal peptide (leader) of the baculovirus gp67 protein and convenient restriction sites (eg, Bam).
HI, Xba I and Asp718). Simian virus 40 ("SV
The 40 ') polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. For easy selection of the recombinant virus, this plasmid contains a weak D
under the control of the E. rosophila promoter. E. coli containing the β-galactosidase gene, followed by the polyhedrin gene polyadenylation signal. This inserted gene is flanked on both sides by viral sequences for cell-mediated homologous recombination with wild-type viral DNA to produce a viable virus expressing the cloned polynucleotide. .

【０２９０】 構築物が、転写、翻訳、分泌などのために適切に位置されたシグナル（必要に
応じて、シグナルペプチドおよびインフレームＡＵＧを含む）を提供する限り、
当業者が容易に理解するような、他の多くのバキュロウイルスベクターは、上記
ベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１）の代わり
に使用され得る。このようなベクターは、例えばＬｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ １７０：３１−３９に記載される。As long as the construct provides appropriately positioned signals for transcription, translation, secretion, etc., including, where appropriate, signal peptides and in-frame AUGs.
Many other baculovirus vectors can be used in place of the above vectors (eg, pAc373, pVL941 and pAcIM1), as will be readily appreciated by those skilled in the art. Such vectors are described, for example, in Luckow et al., Virolo.
gy 170: 31-39.

【０２９１】 ＡＩＭ ＩＩ（Ｇｌｎ（６０）〜Ｖａｌ（２４０））（図１Ａ（配列番号２）
）をコードするｃＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’および３’配列に対応するＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。AIM II (Gln (60) to Val (240)) (FIG. 1A (SEQ ID NO: 2)
) Is inserted into the P's corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene.
Amplification was performed using CR oligonucleotide primers.

【０２９２】 この５’プライマーは、配列５’−ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＧＣＡ ＧＣ
Ｔ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＣＧ ＴＣＴ ＡＧＧ−３’（配列番号２５）（下線部
のＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて図１ＡおよびＢに示されるＡＩＭ ＩＩタン
パク質をコードする、このタンパク質のアミノ酸６０で始まる２０ヌクレオチド
（すなわち、ヌクレオチド２２５〜２４５）を含む）を有する。３’プライマー
は、配列５’−ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ Ｃ
ＣＣ Ｇ−３’（配列番号２６）（下線部のＸｂａＩ制限部位、続いて図１Ｂ（
配列番号１）中のヌクレオチド７５３−７６８に対して相補的なヌクレオチドを
含む）を有する。The 5 ′ primer has the sequence 5′-GGG GGA TCC CGCA GC
TGCA CTG GCG TCT AGG-3 '(SEQ ID NO: 25) (20 nucleotides starting at amino acid 60 of this protein, encoding the BamHI restriction enzyme site underlined, followed by the AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (ie, , Nucleotides 225-245). The 3 'primer has the sequence 5'-GGG TCT AGA CAC CAT GAA AGC C
CC G-3 ′ (SEQ ID NO: 26) (underlined XbaI restriction site followed by FIG. 1B (
(Comprising nucleotides complementary to nucleotides 753-768 in SEQ ID NO: 1).

【０２９３】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲ
ルより単離した。次いで、このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用い
て消化し、そして再び１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、
本明細書中で「Ｆ１」と称した。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean”, BIO
101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Was used to isolate from a 1% agarose gel. This fragment was then digested with BamHI and XbaI and again purified on a 1% agarose gel. This fragment
It was designated "F1" in this specification.

【０２９４】 このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。そして必要
に応じて、当該分野において公知の慣用的な手順を用いて、このプラスミドをウ
シ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化し得る。次に、このＤＮＡを市販のキ
ット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、
Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを
、本明細書において「Ｖ１」と称した。This plasmid was digested with restriction enzymes BamHI and XbaI. And, if desired, the plasmid can be dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase using conventional procedures known in the art. This DNA was then converted to a commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla,
Ca. ) Was isolated from a 1% agarose gel. This vector DNA was designated herein as "V1".

【０２９５】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１をともに、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏ
ｌｉ宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））細胞を、連結混合液を用いて
形質転換し、そして培養プレート上に広げた。ＰＣＲ法を使用して、ヒトＡＩＭ
ＩＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定した。ＰＣＲ法において、使
用されたプライマーの１つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第２のプ
ライマーは十分にベクターの内部からであり、その結果ＡＩＭ ＩＩ遺伝子フラ
グメントを含有する細菌コロニーのみがＤＮＡの増幅を示す。クローン化された
フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドを、
本明細書においてｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）と称した。[0295] Fragment F1 and the dephosphorylated plasmid V1 were both ligated using T4 DNA ligase. E. FIG. coli HB101 or other suitable E. coli. co
li host (eg, XL-1 Blue (Stratagene Clonin)
g Systems, La Jolla, Calif.) Cells were transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Using the PCR method, human AIM
Bacteria containing the plasmid with the II gene were identified. In the PCR method, one of the primers used was to amplify this gene and the second primer was sufficiently from inside the vector so that only bacterial colonies containing the AIM II gene fragment 2 shows the amplification of. The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing. This plasmid is
It was designated pBacAIM II (aa 60-240) herein.

【０２９６】 ＡＩＭ ＩＩをコードするｃＤＮＡ配列（Ｓｅｒ（７９）〜Ｖａｌ（２４０）
、図１Ａ，配列番号２）を、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。The cDNA sequence encoding AIM II (Ser (79) to Val (240)
, FIG. 1A, SEQ ID NO: 2) was used to determine the PCR corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the gene.
Amplification was performed using oligonucleotide primers.

【０２９７】 ５’プライマーは、下線のＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く、タンパク質
のアミノ酸７９で始まる、図１ＡおよびＢに示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質を
コードするヌクレオチド２８３〜３０１を含む、配列： ５’ｃｇｃ ＧＧＡＴＣＣ Ｃ ＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣ ３
’（配列番号２７）を有する。３’プライマーは、下線のＢａｍＨＩ制限酵素部
位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１）におけるヌクレオチド７５７〜７７１に
相補的なヌクレオチドを含む、配列： ５’−ｃｇｃ ＧＧＡＴＣＣ ＴＣＡ ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列
番号２９）を有する。The 5 ′ primer contains the underlined BamHI restriction enzyme site, followed by nucleotides 283-301 encoding the AIM II protein shown in FIGS. 1A and B, beginning at amino acid 79 of the protein. GGATCC C TCCTGGGAGCAGCTGATAC 3
'(SEQ ID NO: 27). 3 'primer, underlined BamHI restriction enzyme site, followed, including nucleotides complementary to nucleotides 757-771 in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1), the sequence: 5'-cgc GGATCC TCA CACCATGAAAGC- 3' ( SEQ ID NO: 29).

【０２９８】 増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １
０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲル
から単離した。次に、このフラグメントを、ＢａｍＨＩを用いて消化し、そして
再度１％アガロースゲル上で精製した。このフラグメントを、本明細書において
「Ｆ１」と称した。The amplified fragment was prepared using a commercially available kit (“Geneclean” BIO 1
01 Inc. , La Jolla, Ca. ) Was isolated from a 1% agarose gel. The fragment was then digested with BamHI and purified again on a 1% agarose gel. This fragment was designated herein as "F1".

【０２９９】 このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。そして必要に応じて、当該
分野において公知の慣用的な手順を用いて、このプラスミドをウシ腸ホスファタ
ーゼを使用して脱リン酸化し得る。次に、このＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎ
ｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用
して、１％アガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを、本明細書にお
いて「Ｖ１」と称した。This plasmid was digested with the restriction enzyme BamHI. And, if desired, the plasmid can be dephosphorylated using bovine intestinal phosphatase using conventional procedures known in the art. Next, this DNA was converted into a commercially available kit (“Gen
eclean "BIO 101 Inc. , La Jolla, Ca. ) Was isolated from a 1% agarose gel. This vector DNA was designated herein as "V1".

【０３００】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１をともに、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏ
ｌｉ宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））細胞を、連結混合液を用いて
形質転換し、そして培養プレート上に広げた。ＰＣＲ法を使用して、変異ＡＩＭ
ＩＩ遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定した。ＰＣＲ法において、使
用されたプライマーの１つはこの遺伝子を増幅するためであり、そして第２のプ
ライマーは十分にベクターの内部からであり、その結果ＡＩＭ ＩＩ遺伝子フラ
グメントを含有する細菌コロニーのみがＤＮＡの増幅を示す。クローン化された
フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドを、
本明細書においてｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ７９〜２４０）と称した。Fragment F1 and dephosphorylated plasmid V1 were both ligated using T4 DNA ligase. E. FIG. coli HB101 or other suitable E. coli. co
li host (eg, XL-1 Blue (Stratagene Clonin)
g Systems, La Jolla, Calif.) Cells were transformed with the ligation mixture and spread on culture plates. Mutation AIM using PCR method
Bacteria containing the plasmid with the II gene were identified. In the PCR method, one of the primers used was to amplify this gene and the second primer was sufficiently from inside the vector so that only bacterial colonies containing the AIM II gene fragment 2 shows the amplification of. The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing. This plasmid is
It was designated pBacAIM II (aa 79-240) herein.

【０３０１】 （Ｃ．ＡＩＭ ＩＩ配列を含むバキュロウイルスベクターのトランスフェクシ
ョン） ｐＢａｃＡＩＭ ＩＩまたはｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）のい
ずれかのプラスミド５μｇを、市販の直線状バキュロウイルスＤＮＡ（「Ｂａｃ
ｕｌｏＧｏｌｄTMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１．０μｇと共に、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８４：７４１３〜７４１７（１９８７）に記載
されるリポフェクション法を使用して、同時トランスフェクションした。１μｇ
のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＡ
ＩＭ ＩＩまたはｐＢａｃＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）を、５０μｌの無
血清グレース培地（Ｇｒａｃｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含有する、滅菌
したマイクロタイタープレートのウェル中で混合した。その後、１０μｌのＬｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温
で１５分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を、１ｍｌ
の無血清グレース培地を有する３５ｍｍ組織培養プレート中に播種したＳｆ９昆
虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に、滴下した。このプレートを前後に揺
らし、新たに添加した溶液を混合した。次にこのプレートを２７℃で５時間イン
キュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。こ
のプレートを培養器に戻し、そして２７℃での培養を４日間続けた。C. Transfection of Baculovirus Vectors Containing AIM II Sequences 5 μg of either pBacAIM II or pBacAIM II (aa 60-240) plasmids were prepared using commercially available linear baculovirus DNA (“BacAIM II”).
uloGold ™ Baculovirus DNA ”, Pharmingen, San
(Diego, CA) with 1.0 μg together with Felgner et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987). 1 μg
BaculoGold ™ viral DNA and 5 μg of plasmid pBacA
IM II or pBacAIM II (aa 60-240) was added to 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Techno).
logs Inc. , Gaithersburg, Md.) In sterile microtiter plate wells. Then, 10 μl of Li
Pofectin and 90 μl of Grace's medium were added, mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. Next, 1 ml of the transfection mixture
Were dropped into Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) seeded in 35 mm tissue culture plates with serum-free Grace's medium. The plate was rocked back and forth to mix the newly added solution. The plate was then incubated at 27 ° C for 5 hours. After 5 hours, the transfection solution was removed from the plate,
Then, 1 ml of Grace's insect medium supplemented with 10% fetal calf serum was added. The plate was returned to the incubator and incubation at 27 ° C. continued for 4 days.

【０３０２】 ４日後、上清を回収し、そしてプラークアッセイを、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳ
ｍｉｔｈ（上記に引用）によって記載されるように行った。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ
」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）を有するアガロースゲルを使用して、青く染まるプラークを産生するｇａｌ
発現クローンの容易な同定および単離を可能とした。（このタイプの「プラーク
アッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ
．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇによって頒布された昆虫細胞培養とバキュロウイ
ルス学のための使用者のガイド（９〜１０頁）において見出され得る）。After 4 days, supernatants were collected and plaque assays were performed with Summers and S
performed as described by mit (cited above). "Blue Gal
(Life Technologies Inc., Gaithersburg)
using agarose gel with g) to produce plaques that stain blue
It allows easy identification and isolation of expression clones. (A detailed description of this type of "plaque assay" is also available at Life Technologies Inc.
. (Guide to insect cell culture and baculovirology distributed by Gaithersburg, pp. 9-10).

【０３０３】 段階希釈の４日後、このウイルスをこの細胞に添加した。適切なインキュベー
ションの後に、青く染まるプラークをエッペンドルフピペットのチップを用いて
拾った。次に、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含有
するエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。寒天を短時間の遠心分離によって
除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、３５ｍｍディッシュ中に
播種された昆虫Ｓｆ９細胞に対して使用した。４日後、これらの培養ディッシュ
の上清を回収し、次に上清を４℃で保存した。適切に挿入されたｈＥＳＳＢ Ｉ
、ＩＩおよびＩＩＩを含むクローンを、制限マッピングおよび配列決定を含むＤ
ＮＡ分析によって同定した。このクローンを、本明細書においてＶ−ＡＩＭ Ｉ
ＩまたはＶ−ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）と称した。After 4 days of serial dilution, the virus was added to the cells. After appropriate incubation, plaques that stained blue were picked up using the tips of an Eppendorf pipette. Next, the agar containing the recombinant virus was resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. The agar was removed by brief centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus was used on insect Sf9 cells seeded in 35 mm dishes. Four days later, the supernatants of these culture dishes were collected, and then the supernatant was stored at 4 ° C. HESSB I properly inserted
, II and III were cloned into D, including restriction mapping and sequencing.
Identified by NA analysis. This clone was designated herein as V-AIMI
I or V-AIM II (aa 60-240).

【０３０４】 Ｓｆ９細胞に１０％の熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖した。
この細胞を、約２（約１〜約３）の感染多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバキュ
ロウイルスＶ−ＡＩＭ ＩＩまたはＶ−ＡＩＭ ＩＩ（ａａ６０〜２４０）に感
染させた。６時間後、この培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを
含まないＳＦ９００ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇより入手可能）で置き換えた。４２時間後、５μＣ
ｉの35Ｓメチオニンおよび５μＣｉの35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍより入
手可能）を、添加した。この細胞をさらに１６時間インキュベートし、次に遠心
分離によって回収し、溶解し、そして標識したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィーによって可視化した。[0304] Sf9 cells were grown in Grace's medium supplemented with 10% heat inactivated FBS.
The cells were infected with the recombinant baculovirus V-AIM II or V-AIM II (aa 60-240) at a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 (about 1 to about 3). After 6 hours, the medium was removed and methionine and cysteine free SF900II medium (Life Technologies Inc.).
, Available from Gaithersburg). After 42 hours, 5 μC
i 35 S methionine and 5 μCi 35 S cysteine (available from Amersham) were added. The cells were incubated for an additional 16 hours, then harvested by centrifugation, lysed, and labeled proteins visualized by SDS-PAGE and autoradiography.

【０３０５】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現） 哺乳動物細胞中で、ＡＩＭ ＩＩタンパク質遺伝子配列の一過性の発現のため
に使用されるほとんどのベクターは、ＳＶ４０の複製起点を含むべきである。こ
のことは、ウイルスＤＮＡ合成の開始に必要とされるＴ抗原を発現する細胞（例
えば、ＣＯＳ細胞）中での、高コピー数までのベクターの複製を可能とする。任
意の他の哺乳動物細胞株はまた、この目的に利用され得る。Example 3 Cloning and Expression in Mammalian Cells Most vectors used for the transient expression of AIM II protein gene sequences in mammalian cells contain the SV40 origin of replication. Should. This allows for replication of the vector up to high copy numbers in cells (eg, COS cells) that express the T antigen required for initiation of viral DNA synthesis. Any other mammalian cell lines can also be utilized for this purpose.

【０３０６】 代表的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモー
ターエレメント、タンパク質コード配列、転写の終結および転写物のポリアデニ
ル化に必要とされるシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハンサ
ー、Ｋｏｚａｋ配列、およびＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター
部位に隣接する介在配列が挙げられる。高効率の転写は、ＳＶ４０の初期および
後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）
の長末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期
プロモーターを用いて達成され得る。しかし、細胞性のシグナル（例えば、ヒト
アクチンプロモーター）もまた使用され得る。本発明の実施における使用のため
の適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７
１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（
ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物
宿主細胞としては、ヒトＨｅＬａ、２８３、Ｈ９およびジャーカット細胞、マウ
スＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１、アフリ
カミドリザル細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞が挙げられる。A typical mammalian expression vector contains a promoter element that mediates the initiation of mRNA transcription, a protein coding sequence, signals required for termination of transcription and polyadenylation of the transcript. Additional elements include enhancers, Kozak sequences, and intervening sequences flanking donor and acceptor sites for RNA splicing. Highly efficient transcription is due to the early and late promoters of SV40, retroviruses (eg, RSV, HTLVI, HIVI)
Long terminal repeat (LTR), as well as the cytomegalovirus (CMV) early promoter. However, cellular signals such as the human actin promoter can also be used. Suitable expression vectors for use in the practice of the present invention include, for example, pSVL and pMSG (Pharm
acia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37)
152), pSV2dhfr (ATCC 37146) and pBC12MI (
ATCC 67109). Mammalian host cells that can be used include human HeLa, 283, H9 and Jurkat cells, mouse NIH3T3 and C127 cells, Cos1, Cos7 and CV1, African green monkey cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells and Chinese hamster ovary Cells.

【０３０７】 あるいは、この遺伝子は、染色体中に組み込まれた遺伝子を含有する安定な細
胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンの
ような選択マーカーとの同時トランスフェクションは、トランスフェクションさ
れた細胞の同定および単離を可能にする。Alternatively, the gene can be expressed in a stable cell line that contains the gene integrated into a chromosome. Co-transfection with a selectable marker such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin allows identification and isolation of the transfected cells.

【０３０８】 トランスフェクションされた遺伝子はまた増幅され、コードされるタンパク質
を大量に発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）は、目的の遺伝子の数
百コピーまたは数千コピーさえも保有する細胞株を発生させるための有用なマー
カーである。別の有用な選択マーカーは、グルタミンシンターゼ酵素（ＧＳ）で
ある（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７〜２７９（１９９
１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９
〜１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を、選択
培地中で増殖し、そして最も高度な耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞
株は、染色体中に組み込まれた増殖した遺伝子を含有する。チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、しばしばタンパク質の産生に使用される。The transfected gene may also be amplified and express the encoded protein in large quantities. DHFR (dihydrofolate reductase) is a useful marker for generating cell lines that carry hundreds or even thousands of copies of the gene of interest. Another useful selectable marker is the glutamine synthase enzyme (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (199).
1); Bebbington et al., Bio / Technology 10: 169.
175 (1992)). Using these markers, mammalian cells are grown in selective media and cells with the highest resistance are selected. These cell lines contain the propagated gene integrated into the chromosome. Chinese hamster ovary (CHO) cells are often used for protein production.

【０３０９】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８〜４４７（Ｍａｒｃｈ、１９８５））、およびＣＭ
Ｖエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１〜
５３０（１９８５））を含む。多重クローニング部位（例えば、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位を有する）は、目的の遺伝子のク
ローニングを促進する。このベクターは、３’イントロンに加えて、ラットプレ
プロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナルを含む。The expression vectors pC1 and pC4 contain the Rous sarcoma virus strong promoter (LTR) (Cullen et al., Molecular and Cellula).
r Biology, 438-447 (March, 1985)), and CM
V enhancer fragment (Boshart et al., Cell 41: 521-
530 (1985)). Multiple cloning sites (eg, BamHI, X
baI and Asp718 restriction sites) facilitate cloning of the gene of interest. This vector contains, in addition to the 3 'intron, polyadenylation and termination signals of the rat preproinsulin gene.

【０３１０】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドｐＡＩＭ ＩＩ ＨＡを、ＡＩＭ ＩＩをコードするｃＤＮＡ
を発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．より入
手され得る）内にクローニングすることにより作製する。Example 3 (a): Cloning and Expression in COS Cells The expression plasmid pAIM II HA was replaced with cDNA encoding AIM II
Is cloned into the expression vector pcDNAI / Amp (available from Invitrogen, Inc.).

【０３１１】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核生物細胞において増殖に効果的なＥ．ｃｏｌｉの複製起点；（２）プ
ラスミドを保持する原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３
）真核生物細胞において増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）配列されたＣＭ
Ｖプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化シ
グナル（その結果、ｃＤＮＡは、ポリリンカー中の制限部位により都合よく、Ｃ
ＭＶプロモーターの発現制御下に配置され得、そしてＳＶ４０イントロンおよび
ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る）。The expression vector pcDNAI / amp contains: (1) E. coli. E. coli effective for growth in E. coli and other prokaryotic cells. E. coli origin of replication; (2) ampicillin resistance gene for selection of prokaryotic cells carrying the plasmid; (3
) SV40 origin of replication for growth in eukaryotic cells; (4) sequenced CM
V promoter, polylinker, SV40 intron, and polyadenylation signal (so that the cDNA is more convenient due to the restriction sites in the polylinker,
Can be placed under the control of the expression of the MV promoter, and can be operably linked to the SV40 intron and polyadenylation signal).

【０３１２】 ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントおよびその３’末端
にインフレームで融合されたＨＡタグを、組換えタンパク質の発現がＣＭＶプロ
モーターにより指向されるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化す
る。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載
される、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応す
る。ＨＡタグの標的タンパク質への融合は、そのＨＡエピトープを認識する抗体
を用いる組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。The DNA fragment encoding the AIM II protein and the HA tag fused in frame to its 3 ′ end were cloned into the polylinker region of the vector such that expression of the recombinant protein was driven by the CMV promoter. I do. The HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein described in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Fusion of an HA tag to a target protein allows for easy detection of the recombinant protein using an antibody that recognizes the HA epitope.

【０３１３】 プラスミド構築戦略は、以下の通りである。寄託されたクローンのＡＩＭ Ｉ
Ｉ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡＩＭ ＩＩ発現のための発現ベクター
の構築に関する上記とほぼ同様に、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用
して増幅する。発現されたＡＩＭ ＩＩの検出、精製および特徴づけを容易にす
るために、プライマーの１つは、上記の赤血球凝集素タグ（「ＨＡタグ」）を含
む。[0313] The plasmid construction strategy is as follows. AIM I of the deposited clone
The I cDNA was converted to E. coli. Amplification is performed using primers containing convenient restriction sites, much as described above for the construction of expression vectors for AIM II expression in E. coli. One of the primers includes a hemagglutinin tag ("HA tag") as described above to facilitate detection, purification and characterization of the expressed AIM II.

【０３１４】 適切なプライマーとしては、以下のものが挙げられ、これを本実施例において
使用する。５’プライマー（下線部のＢａｍＨＩ部位、およびＡＵＧ開始コドン
を含む）は、以下の配列を有する： ５’ＧＡＧ ＣＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＡＧ Ｇ
ＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧＣ ３’（配列番号１３）。[0314] Suitable primers include the following, which are used in this example. The 5 'primer (including the underlined BamHI site and the AUG start codon) has the following sequence: 5'GAG CTC GGA TCC GCC ATC ATG GAG G
AG AGT GTC GTA CGGC 3 '(SEQ ID NO: 13).

【０３１５】 ３’プライマー（下線部のＸｂａＩ部位、終止コドン、後に赤血球凝集素ＨＡ
タグを形成する９コドン、および３’コード配列（３’末端での）の３３ｂｐを
含む）は、以下の配列を有する： ５’ＧＡＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＴＣ ＴＧＧ Ｇ
ＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＴＧＧ ＧＴＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ Ｃ
ＣＣ ＧＡＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＣ ３’（配列番号１４）
。The 3 ′ primer (underlined XbaI site, stop codon, followed by hemagglutinin HA
The 9 codons that form the tag, and the 3 'coding sequence (at the 3' end, including 33 bp) have the following sequence: 5 'GAT GT T CTA GA A AGC GTA GTC TGG G
AC GTC GTA TGG GTA CAC CAT GAA AGC C
CC GAA GTA AGA CCG GGT AC 3 '(SEQ ID NO: 14)
.

【０３１６】 ＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを
、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いで連結した。連結混合物を、Ｅ
．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，１１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７より入手可能）内に形質転換し、そして形質転換
した培養物を、アンピシリン培地プレート上にプレートし、次いで、プレートを
インキュベートして、アンピシリン耐性コロニーを増殖させ得る。プラスミドＤ
ＮＡを、耐性コロニーより単離し、そしてＡＩＭ ＩＩコードフラグメントの存
在について、制限分析およびゲル泳動により試験した。The PCR amplified DNA fragment and the vector pcDNAI / Amp were digested with HindIII and XhoI and then ligated. The linked mixture is
. coli SURE strain (Stratagene Cloning System)
ms, 11099 North Torrey Pines Road, La
(Available from Jolla, CA 92037), and the transformed culture is plated on ampicillin media plates, and the plates can then be incubated to grow ampicillin-resistant colonies. Plasmid D
NA was isolated from resistant colonies and tested by restriction analysis and gel electrophoresis for the presence of the AIM II coding fragment.

【０３１７】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡ
Ｎ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８９）に記載されるような）を使用して、上記の発現ベクターでトラ
ンスフェクトした。細胞を、ベクターによるＡＩＭ ＩＩの発現のための条件下
でインキュベートした。For expression of recombinant AIM II, COS cells were transformed with DEAE-DEXTRA
N (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: a
Laboratory Manual, Cold Spring Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, New Yo
rk (as described in 1989)). Cells were incubated under conditions for expression of AIM II by the vector.

【０３１８】 ＡＩＭ ＩＩ ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される
方法を使用して、放射標識および免疫沈澱により検出する。この目的ために、ト
ランスフェクション２日後に、細胞を、35Ｓシステインを含む培地中での、８時
間のインキュベーションにより標識した。細胞および培地を収集して、そして細
胞を洗浄し、そして界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５（上記に引用されたＷｉｌｓｏｎらにより記載される）で
溶解した。タンパク質を細胞溶解物から沈殿させ、そしてＨＡ特異的モノクロー
ナル抗体を使用して培養培地から沈殿させた。次いで、沈殿させたタンパク質を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーにより分析した。予期さ
れる大きさの発現産物を、細胞溶解物中に見出し、それはネガティブコントロー
ルには見られなかった。[0318] Expression of the AIM II HA fusion protein is determined, for example, by the method of Harlow et al., An.
tibodies: A Laboratory Manual, 2nd edition; Col
d Spring Harbor Laboratory Press, Col
d Detection by radiolabeling and immunoprecipitation using the method described in Spring Harbor, New York (1988). To this end, two days after transfection, the cells were labeled by incubation for 8 hours in medium containing 35 S cysteine. Cells and media are collected and cells are washed and detergent-containing RIPA buffer: 150 mM NaCl, 1
% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM
Dissolved in TRIS, pH 7.5 (described by Wilson et al., Cited above). Protein was precipitated from cell lysate and precipitated from the culture medium using an HA-specific monoclonal antibody. The precipitated proteins were then analyzed by SDS-PAGE gel and autoradiography. An expression product of the expected size was found in the cell lysate, which was not found in the negative control.

【０３１９】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４をＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現に使用する。プラスミドｐＣ
１は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体
である。両プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にマウスＤＨＦＲ
遺伝子を含む。これらのプラスミドをトランスフェクトさせる、ジヒドロ葉酸活
性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療法剤メ
トトレキセートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）において細胞を増殖することにより選択され得る。メトトレキ
セート（ＭＴＸ）に耐性な細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、詳細に実証さ
れている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉ
ｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，
Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：
１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９
１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻：６４−６８を参照のこと）。増加す
るＭＴＸの濃度において増殖される細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として
、標的酵素ＤＨＦＲを過剰生成することにより薬物に対する耐性を発生する。第
２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、それは通常、同時増幅され、そ
して過剰発現される。それは、１０００コピーを超える遺伝子を保持する細胞株
を発生するための当該技術の常識である。引き続き、メトトレキセートが回収さ
れる場合、細胞株は、染色体内に組込まれた増幅された遺伝子を保持する。Example 3 (b): Cloning and Expression in CHO Cells The vector pC4 is used for the expression of AIM II protein. Plasmid pC
1 is a derivative of plasmid pSV2-dhfr (ATCC Accession No. 37146). Both plasmids contain the mouse DHFR under the control of the SV40 early promoter.
Including genes. Chinese hamster ovary cells or other cells deficient in dihydrofolate activity, transfected with these plasmids, are selected from selective media (α minus MEM, Life Techn) supplemented with the chemotherapeutic agent methotrexate.
in the cultures). Amplification of the DHFR gene in cells resistant to methotrexate (MTX) has been well documented (eg, Alt, FW, Kellems, RM, Berti).
no. R. And Schimke, R .; T. 1978; Biol.
Chem. 253: 1357-1370; Hamlin, J. M .; L. And Ma,
C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:
107-143, Page, M .; J. And Sydenham, M .; A. 199
1, Biotechnology 9: 64-68). Cells grown at increasing concentrations of MTX develop resistance to the drug by overproducing the target enzyme DHFR as a result of amplification of the DHFR gene. When a second gene is linked to a DHFR gene, it is usually co-amplified and overexpressed. It is common knowledge in the art to generate cell lines that carry more than 1000 copies of a gene. Subsequently, if methotrexate is recovered, the cell line will carry the amplified gene integrated into the chromosome.

【０３２０】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの
長末端反復配列（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｒｃｈ １９８５
：４３８−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子
のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４
１：５２１−５３０（１９８５））を含む。プロモーターの下流には、遺伝子の
組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８制限酵素切断
部位が存在する。このプラスミドは、これらのクローニング部位の後に、ラット
プレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。
他の高い効率のプロモーターもまた、発現のために使用され得る（例えば、ヒト
βアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、あるいは他の
レトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復配列）。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ Ｔｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系ならび
に同様の系は、哺乳動物細胞の調節方法においてＡＩＭ ＩＩを発現するために
使用され得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．１９９２，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲ
ＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまた
はグロビン遺伝子由来の）もまた、同様に使用され得る。染色体に組込まれた目
的の遺伝子を保持する安定な細胞株もまた、選択可能なマーカー（例えば、ｇｐ
ｔ、Ｇ４１８またはハイグロマイシン）での同時トランスフェクションで選択さ
れ得る。最初に１より多い選択可能なマーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトト
レキセート）を使用することは有利である。Plasmid pC4 is a strong promoter for the Rous sarcoma virus long terminal repeat (LTR) (Cullen et al., Molec) in order to express the gene of interest.
ullar and Cellular Biology, March 1985
: 438-447) and fragments isolated from enhancers of the immediate early gene of human cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 4).
1: 521-530 (1985)). Downstream of the promoter are BamHI, XbaI, and Asp718 restriction enzyme cleavage sites that allow for gene integration. This plasmid contains, after these cloning sites, the 3 'intron and polyadenylation site of the rat preproinsulin gene.
Other high efficiency promoters can also be used for expression (eg, the human β-actin promoter, the SV40 early or late promoter, or long terminal repeats from other retroviruses (eg, HIV and HTLVI)).
Clontech's Tet-Off and Tet-On gene expression systems and similar systems can be used to express AIM II in mammalian cell regulation methods (Gossen, M. and Bujard, H. 1992, Pro).
c. Natl. Acad. Sci. ScL USA 89: 5547-5551). mR
For polyadenylation of NA, other signals, such as from the human growth hormone or globin genes, can be used as well. Stable cell lines that carry the gene of interest integrated into the chromosome can also be obtained by selecting a selectable marker (eg, gp
t, G418 or hygromycin). It is advantageous to use more than one selectable marker initially (eg, G418 and methotrexate).

【０３２１】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次い
で、当該分野で公知の手順により、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸
化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。The plasmid pC4 is digested with the restriction enzymes BamHI and Asp718 and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. The vector is then isolated from a 1% agarose gel.

【０３２２】 完全ＡＩＭ ＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、この遺伝子の５’お
よび３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅
する。５’プライマーは、配列５’ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ
ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ Ｃ ３’
（配列番号１５）を有し、この配列は、下線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、それ
に続く、真核生物における翻訳開始のための効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ
．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載される
ような）、および図１Ａ（配列番号１）に示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質のコ
ード領域の２２塩基（すなわち、ヌクレオチド４９〜７０）を含む。３’プライ
マーは、配列５’ＧＡ ＣＧＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＣＡＡ ＴＧＣ Ａ
ＣＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＣ ３’（配列番号１６）を有し、
この配列は、下線部のＡｓｐ７１８制限部位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１
）に示されるＡＩＭ ＩＩ遺伝子のヌクレオチド７７０〜７９５に相補的なヌク
レオチドを含む。The DNA sequence encoding the complete AIM II protein is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. The 5 'primer has the sequence 5' GCT CCA GGA TCC GCC
ATC ATG GAG GAG AGT GTC GTA CGG C 3 '
(SEQ ID NO: 15), which contains an underlined BamHI restriction enzyme site followed by an efficient signal for initiation of translation in eukaryotes (Kozak, M.
. J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987)), and 22 bases (ie, nucleotides 49-70) of the coding region of the AIM II protein shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). The 3 'primer has the sequence 5' GA CGC GGT ACC GTC CAA TGC A
CC ACG CTC CTT CCT TC 3 '(SEQ ID NO: 16)
This sequence is shown in underlined Asp718 restriction site followed by FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).
) Contains nucleotides complementary to nucleotides 770 to 795 of the AIM II gene shown in FIG.

【０３２３】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１
８で消化し、次いで、１％アガロースゲル上で、再度、精製した。次いで、単離
されたフラグメントおよび脱リン酸化されたベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細
胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ４内に挿入されたフラグメントを含む細
菌を、例えば、制限酵素分析により同定する。[0324] The amplified fragment was digested with the endonucleases BamHI and Asp71.
8 and then purified again on a 1% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated with T4 DNA ligase. Then, E. E. coli HB101 or XL-1 Blue cells are transformed and bacteria containing the fragment inserted in plasmid pC4 are identified, for example, by restriction enzyme analysis.

【０３２４】 （実施例３（ｃ）：ＣＨＯ細胞における、ＡＩＭ ＩＩＮ末端欠失物のクロー
ニングおよび発現） ベクターｐＣ４を、ＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２中のＭｅｔ（６８）〜Ｖ
ａｌ（２４０））タンパク質の発現のために使用した。プラスミドｐＣ４を、制
限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホス
ファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、このベクターを、１％アガロー
スゲルから単離した。Example 3 (c): Cloning and Expression of AIM IIN-Terminal Deletion in CHO Cells The vector pC4 was transformed with an AIM II mutant
al (240)) protein was used for expression. Plasmid pC4 was digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. This vector was then isolated from a 1% agarose gel.

【０３２５】 ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８〜２４０）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を
、この遺伝子の５’ 配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド プライマーを使用して、増幅した。以下の５’プライマーを使用した：５’ＧＡ
Ｃ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧ
Ｃ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＣ ＧＧＡ Ｃ ３’（配列番号４０）。これは、下
線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く、真核生物における翻訳開始のため
の効率的なシグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４
７−９５０（１９８７）に記載される通り）、および図１Ａ（配列番号１）に示
されるＡＩＭ ＩＩポリペプチドのコード領域中のヌクレオチド２０２〜２２６
を含む。以下の３’プライマーを使用した：（ＢａｍＨＩおよび終止コドン（斜
体））The DNA sequence encoding the AIM II (amino acids 68-240) protein was amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. The following 5 'primer was used: 5' GA
C AGT GGA TCC GCC ACC ATG GTC ACC CG
CCTG CCT GAC GGA C 3 '(SEQ ID NO: 40). This is due to the underlined BamHI restriction enzyme site followed by an efficient signal for translation initiation in eukaryotes (Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 94).
7-950 (1987)), and nucleotides 202-226 in the coding region of the AIM II polypeptide shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
including. The following 3 'primers were used: (BamHI and stop codon (italics))

【０３２６】[0326]

【化１０】 これは、下線部のＢａｍＨＩ制限部位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１）に示
されるｎｔ７５３〜７６８に相補的なヌクレオチドを含む。Embedded image It contains an underlined BamHI restriction site followed by nucleotides complementary to nts 753-768 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1).

【０３２７】 増幅されたフラグメントを、エンドヌクレアーゼでＢａｍＨＩで消化し、次い
で、１％アガロースゲルで、再度精製した。次いで、単離されたフラグメントお
よび脱リン酸化されたベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し
、そしてプラスミドｐＣ４内に挿入されたフラグメントを含む細菌を、例えば、
制限酵素分析を使用して同定した。The amplified fragment was digested with BamHI with endonuclease and then purified again on a 1% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated using T4 DNA ligase. Then, E. E. coli HB101 or XL-1 Blue cells and bacteria containing the fragment inserted into plasmid pC4, for example,
Identified using restriction enzyme analysis.

【０３２８】 ベクターｐＣ４／Ｃｋβ８（最初にＣｋβ８シグナルペプチドを、Ｃｋβ８シ
グナル配列の３’末端におけるＢａｍＨＩ部位で、ｐＣ４ベクター内にクローン
化したｐＣ４構築物）を、ＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２のＴｒｐ（８０）〜
Ｖａｌ（２４０））タンパク質の発現のために使用した。プラスミドｐＣ４／Ｃ
ｋβ８を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当該分野で公知の手順により
仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化した。次いで、このベクターを、
１％アガロースゲルから単離した。The vector pC4 / Ckβ8 (the pC4 construct cloned first into the pC4 vector with the Ckβ8 signal peptide at the BamHI site at the 3 ′ end of the Ckβ8 signal sequence) was transformed with the AIM II variant (Trp of SEQ ID NO: 2). 80)-
Val (240)) protein was used for expression. Plasmid pC4 / C
kβ8 was digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. This vector is then
Isolated from a 1% agarose gel.

【０３２９】 ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸８０〜２４０）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を
、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して、増幅した。以下の５’プライマーを使用した：５’ｃｇｃ
ＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣ ３’（配列番号４１）。こ
れは、下線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、それに続く、図１Ａ（配列番号１）に
示されるＡＩＭ ＩＩポリペプチドのコード領域中のヌクレオチド２８６〜３０
１を含む。以下の３’プライマーを使用した：５’ｃｇｃ ＧＧＡＴＣＣ ＴＣ
Ａ ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣ ３’（配列番号２９）。これは、下線部のＢａ
ｍＨＩ制限部位、それに続く、図１Ｂ（配列番号１）に示されるｎｔ７５７〜７
７１に相補的なヌクレオチドを含む。The DNA sequence encoding the AIM II (amino acids 80-240) protein was amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene. The following 5 'primer was used: 5'cgc
GGATCC TGGGAGCAGCTGATAC 3 '(SEQ ID NO: 41). This is the underlined BamHI restriction enzyme site followed by nucleotides 286-30 in the coding region of the AIM II polypeptide shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1).
Including 1. The following 3 'primer was used: 5' cgc GGATCC TC
A ACCCATGAAAGC 3 '(SEQ ID NO: 29). This is the underlined Ba
mHI restriction site followed by nts 757-7 shown in FIG. 1B (SEQ ID NO: 1)
It contains the nucleotide complementary to 71.

【０３３０】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１
％アガロースゲルで再度精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン
酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次いで、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして、例え
ば制限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ４／Ｃｋβ８に挿入されたフラグメン
トを含む細菌を同定した。The amplified fragment was digested with the endonuclease BamHI and
Purified again on a% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated using T4 DNA ligase. Then, E. c
oli HB101 or XL-1 Blue cells were transformed and bacteria containing the inserted fragment in plasmid pC4 / Ckβ8 were identified using, for example, restriction enzyme analysis.

【０３３１】 （ＣＨＯ細胞トランスフェクション：） 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェ
クションのために使用する。５μｇの上記のｐＣ４発現ベクターを、リポフェク
チンを用いて０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏで同時トランスフェクシ
ョンする（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは、優性な選
択マーカーであるＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含み、これはＧ４１８を含む一群
の抗生物質に対して耐性を与える酵素をコードする。その細胞を、１ｍｇ／ｍｌ
のＧ４１８で補充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。２日後、細胞をトリプシ
ン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび
１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクロー
ニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４
日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで、異なる濃度（５０ｎＭ、１
００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）のメトトレキサートを使用し
て、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最も高い
濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μ
Ｍ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のメトトレキサートを含む新しい６ウェルプ
レートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得
られるまで反復する。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびウェスタンブロッティング、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。CHO cell transfection: Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR gene are used for transfection. 5 μg of the above pC4 expression vector is co-transfected with 0.5 μg of the plasmid pSV2-neo using Lipofectin (Felgner et al., Supra). Plasmid pSV2neo contains the neo gene from Tn5, a dominant selectable marker, which encodes an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics, including G418. 1 mg / ml of the cells
Seed in α minus MEM supplemented with G418. Two days later, cells are trypsinized and seeded on hybridoma cloning plates (Greiner, Germany) in α-min MEM supplemented with 10, 25, or 50 ng / ml methotrexate and 1 mg / ml G418. About 10-14
One day later, single clones were trypsinized and then different concentrations (50 nM, 1
(00 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) are seeded into 6-well petri dishes or 10 ml flasks. The clones growing at the highest concentration of methotrexate were then cloned to higher concentrations (1 μM, 2 μM).
M, 5 μM, 10 μM, 20 μM) in a new 6-well plate containing methotrexate. The same procedure is repeated until a clone is obtained that grows at a concentration of 100-200 μM. The expression of the desired gene product is analyzed, for example, by SDS-PAGE and Western blotting, or by reverse phase HPLC analysis.

【０３３２】 （実施例３（ｄ）：ＣＨＯ細胞におけるＡＩＭ ＩＩ Ｎ末端欠失物のクロー
ニングおよび発現） Ｃ−末端Ｆｃ免疫グロブリン領域を含むＡＩＭ ＩＩ変異体（配列番号２にお
けるＭｅｔ（６８）−Ｖａｌ（２４０））タンパク質の発現のために、ベクター
ｐＣ４を使用した。この構築物において、Ｃｋβ８シグナルペプチドを、Ｃｋβ
８の３’末端のＢａｍＨＩ部位を用いて最初にｐＣ４にクローニングした。Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａＩ部位に隣接するＦｃフラグメントを、そのベクターにクロ
ーニングして、ｐＣ４／Ｃｋβ８／Ｆｃを生じた。次いで、ＡＩＭ ＩＩフラグ
メントを、ＢａｍＨＩ部位で、ＣＫ−β８リーダーとＦｃフラグメントとの間に
クローニングした。Example 3 (d): Cloning and Expression of AIM II N-Terminal Deletion in CHO Cells An AIM II mutant containing the C-terminal Fc immunoglobulin region (Met (68) -Val (SEQ ID NO: 2) 240)) The vector pC4 was used for protein expression. In this construct, the Ckβ8 signal peptide was replaced with Ckβ
It was first cloned into pC4 using a BamHI site at the 3 'end of 8. Ba
The Fc fragment flanking the mHI and XbaI sites was cloned into the vector, resulting in pC4 / Ckβ8 / Fc. The AIM II fragment was then cloned at the BamHI site between the CK-β8 leader and the Fc fragment.

【０３３３】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで、当該分野で公知
の手順によって仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、この
ベクターを、１％アガロースゲルから単離した。The plasmid pC4 was digested with the restriction enzyme BamHI and then dephosphorylated with calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. This vector was then isolated from a 1% agarose gel.

【０３３４】 完全ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸６８〜２４０）タンパク質をコードするＤＮＡ配
列を、この遺伝子の５’ 配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ チドプライマーを用いて増幅した。以下の５’プライマーを使用した：５’ＧＡ
Ｃ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＧ
Ｃ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＣ ＧＧＡ Ｃ３’（配列番号４０）。このプライマ
ーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７〜９５０（１９８７）によって記載される通
りの真核生物における翻訳の開始のために効率的なシグナル、および図１Ａ（配
列番号１）に示されるＡＩＭ ＩＩポリペプチドについてのコード領域における
ヌクレオチド２０２〜２２６を含む。以下の３’プライマーを使用した：（Ｂａ
ｍＨＩ）５’−ＧＧＧ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ Ｃ
ＣＣ Ｇ−３’（配列番号３０）。このプライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ
制限部位、続いて図１ＡおよびＢ（配列番号１）に示されるヌクレオチド７５３
〜７６８に相補的なヌクレオチド、続いて以下の配列を有するＦｃ免疫グロブリ
ンフラグメントを含む：The DNA sequence encoding the complete AIM II (amino acids 68-240) protein was amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of this gene. The following 5 'primer was used: 5' GA
C AGT GGA TCC GCC ACC ATG GTC ACC CG
CCTG CCT GAC GGA C3 '(SEQ ID NO: 40). This primer was underlined with a BamHI restriction enzyme site, followed by Kozak, M .; J.
Mol. Biol. 196: 947-950 (1987), an efficient signal for initiation of translation in eukaryotes, and nucleotides in the coding region for the AIM II polypeptide shown in FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). 202-226. The following 3 'primer was used: (Ba
mHI) 5'-GGG GGA TCC CAC CAT GAA AGC C
CC G-3 '(SEQ ID NO: 30). This primer is underlined with BamHI
A restriction site followed by nucleotides 753 shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1)
Nucleotide complementary to ７768, followed by an Fc immunoglobulin fragment having the following sequence:

【０３３５】[0335]

【化１１】 増幅したフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで１
％アガロースゲルで再度精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン
酸化したベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。そして、例えば制
限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を
同定する。Embedded image The amplified fragment is digested with the endonuclease BamHI and
Purified again on a% agarose gel. The isolated fragment and the dephosphorylated vector were then ligated with T4 DNA ligase. Then, E. coli
HB101 or XL-1 Blue cells were transformed. Then, bacteria containing the fragment inserted into the plasmid pC4 are identified using, for example, restriction enzyme analysis.

【０３３６】 （ＣＨＯ細胞トランスフェクション：） チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−ＤＧ４４）細胞を、リポフ
ェクチンを使用して、発現ベクター（ｐＣ４／ｓｐＣＫβ８／Ｆｃ／ＡＩＭ Ｉ
Ｉ）を用いてトランスフェクトした。組換えクローンを、５％ 透析ウシ胎仔血
清（ＤｉＦＢＳ）、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）、１ｍｇ／
ｍＬ ジェネティシン（Ｇ４１８）および１０ｎＭ メトトレキサート（ＭＴＸ
）を有するＭＥＭα選択培地中で細胞を増殖させることによって単離した。次い
で、ＢＩＡｃｏｒｅ法を使用して組換えクローンをスクリーニングすること（よ
り詳細には、以下を参照のこと）によって確認された高発現クローンを、ＭＴＸ
の濃度を１００μＭの最終濃度まで段階的に増加させることによって個々に増幅
した。この高発現クローンを、マイクロキャリアＣＨＯ灌流バイオリアクター中
のＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質の産生のために使用した。(CHO cell transfection: Chinese hamster ovary (CHO / dhfr-DG44) cells were transfected with lipofectin using an expression vector (pC4 / spCKβ8 / Fc / AIM I).
Transfected using I). Recombinant clones were digested with 5% dialyzed fetal calf serum (DiFBS), 1% penicillin / streptomycin (PS), 1 mg /
mL Geneticin (G418) and 10 nM Methotrexate (MTX)
) Was isolated by growing the cells in MEMα selective medium with The highly expressing clones identified by screening the recombinant clones using the BIAcore method (see below in more detail) were then replaced with MTX.
Were amplified individually by stepwise increasing the concentration to 100 μM final concentration. This high expressing clone was used for the production of AIM II-IgG1 fusion protein in a microcarrier CHO perfusion bioreactor.

【０３３７】 ＣＨＯ．ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１細胞を、１％超低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＨＧ
Ｓ−ＣＨＯ−３培地中で、Ｃｙｔｏｄｅｘ １マイクロキャリア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で増殖させた。マル
チプルマイクロキャリアスピナー中で増殖させた細胞を、１０Ｌのマイクロキャ
リア灌流バイオリアクターにスケールアップした。灌流バイオリアクターを２７
日間連続して操作して、そしてその時間の間、ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タン
パク質を含み、マイクロキャリアを含まない９０リットルの上清を収集した。こ
の上清を、０．２μｍの滅菌フィルターを使用する濾過プロセスを通して清澄化
し、そして５ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって安定化した。清澄化した上
清をアフィニティーカラムにロードして、ＡＩＭＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質
を捕捉した。CHO. AIM II-IgG1 cells were converted to HG with 1% ultra-low IgG FBS
Cytodex 1 microcarriers (Pharma) in S-CHO-3 medium
(Cia Biotech, Upsala, Sweden). Cells grown in the multiple microcarrier spinner were scaled up to a 10 L microcarrier perfusion bioreactor. 27 perfusion bioreactors
Operating continuously for days, during which time 90 liters of supernatant containing AIM II-IgG1 fusion protein and no microcarriers was collected. The supernatant was clarified through a filtration process using a 0.2 μm sterile filter and stabilized by adding 5 mM EDTA. The clarified supernatant was loaded on an affinity column to capture the AIMII-IgG1 fusion protein.

【０３３８】 （ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質の精製） ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ１融合タンパク質を、１５ＬのＣＨＯ馴化培地から精製
した。この馴化培地を、３０ｍＬ／分の流速で、ＢｉｏＣａｄ６０（ＰｅｒＳｅ
ｐｔｉｖｅｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で１０℃で、プロテインＡ Ｈｙｐｅ
ｒＤ（５４ｍＬベット容積、ＢｉｏＳｅｐｒａ）アフィニティーカラムにロード
した。このカラムを、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ８および０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌで前もって平衡化した。ロード後、このカラムをそれぞれ３カラム容量の０
．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ５および０．１Ｍ ＮａＣｌ、ならびに０．
１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ２．８および０．１Ｍ ＮａＣｌで洗浄した
。ＡＩＭ ＩＩ−ＩｇＧ融合タンパク質を含むピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析によって決定し、そしてプールした。この精製タンパク質の正体を、Ｎ末端
配列分析によって確認した。最終的なタンパク質収率は、馴化培地１リットルあ
たり約９ｍｇであった。Purification of AIM II-IgG1 fusion protein AIM II-IgG1 fusion protein was purified from 15 L of CHO conditioned medium. The conditioned medium was added to BioCad60 (PerSe) at a flow rate of 30 mL / min.
protein A Hype at 10 ° C. on an active biosystems.
Loaded on rD (54 mL bed volume, BioSepra) affinity column. The column was loaded with 25 mM sodium acetate, pH 8 and 0.1 M Na.
Equilibrated previously with Cl. After loading, the columns are each filled with 3 column volumes of 0
. 1 M sodium citrate, pH 5 and 0.1 M NaCl, and 0.1 M NaCl.
Washed with 1 M sodium citrate, pH 2.8 and 0.1 M NaCl. The peak fraction containing the AIM II-IgG fusion protein was analyzed by SDS-PAGE.
Determined by analysis and pooled. The identity of this purified protein was confirmed by N-terminal sequence analysis. The final protein yield was about 9 mg per liter of conditioned medium.

【０３３９】 （実施例４：ＡＩＭ ＩＩ発現構築物） （全長構築物） （ａ）ｐＣＭＶｓｐｏｒｔ：真核生物発現ベクターｐＣＭＶｓｐｏｒｔは、Ｍ
ｅｔ（１）〜Ｖａｌ（２４０）のＡＩＭ−ＩＩ ＯＲＦをコードするヌクレオチ
ドを含む。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託されたクロー
ンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、便利な制限部位を含むプライマーを使用して増
幅する。適切なプライマーは、この実施例で使用される以下のものを含む。５’
プライマーは、下線を付したＳａｌＩ部位、ＡＵＧ開始コドン、ＡＩＭ ＩＩポ
リペプチド（配列番号１）のコード領域のヌクレオチド５１〜６９を含み、そし
て以下の配列を有する： ５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ Ａ
ＧＴ ＧＴＣ ＧＴＡ ＣＧＧ−３’（配列番号３２）。Example 4 AIM II Expression Constructs (Full Length Constructs) (a) pCMVsport: The eukaryotic expression vector pCMVsport is M
It contains nucleotides encoding the AIM-II ORF of et (1) to Val (240). The plasmid construction strategy is as follows. The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following used in this example. 5 '
The primers include an underlined SalI site, an AUG start codon, nucleotides 51-69 of the coding region of the AIM II polypeptide (SEQ ID NO: 1), and have the following sequence: 5′-GGG GTC GAC GCC ATC ATG GAG GAG A
GT GTC GTA CGG-3 '(SEQ ID NO: 32).

【０３４０】 ３’プライマーは、下線を付したＮｏｔＩ部位を含み、配列番号１のヌクレオ
チド７５３〜７６７に相補的なヌクレオチド、および終止コドンを含み、そして
以下の配列を有する： ５’−ＧＧＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ Ｇ
ＡＡ ＡＧＣ ＣＣＣＧ−３’（配列番号３３）。The 3 ′ primer contains an underlined NotI site, contains a nucleotide complementary to nucleotides 753-767 of SEQ ID NO: 1, and a stop codon, and has the following sequence: 5′-GGG GCG GCC GC G CCT TCA CAC CAT G
AA AGC CCCG-3 '(SEQ ID NO: 33).

【０３４１】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、次いで
ゲル精製する。次いで、単離したフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩ消化し
たベクターｐＣＭＶｓｐｏｒｔに連結した。連結混合物でＥ．ｃｏｌｉを形質転
換し、そして形質転換した培養物を、抗生物質培地プレート上にプレーティング
し、次いでそのプレートをインキュベートして、抗生物質耐性コロニーの増殖を
可能にする。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてＡＩＭ Ｉ
Ｉコードフラグメントの存在について、制限分析およびゲル上のサイジングによ
って試験する。The PCR amplified DNA fragment is digested with SalI and NotI and then gel purified. The isolated fragment was then ligated into the SalI and NotI digested vector pCMVsport. E. ligation mixture The E. coli is transformed, and the transformed culture is plated on an antibiotic medium plate, and the plate is then incubated to allow growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA was isolated from the resistant colonies and AIM I
Test for the presence of the I-code fragment by restriction analysis and sizing on a gel.

【０３４２】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞また
はＣＨＯ細胞）を、上記の実施例３に示すようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使
用して、上記に示すように発現ベクターでトランスフェクトする。ＡＩＭ ＩＩ
組換えタンパク質の発現を、実施例３中の上記の方法によって検出する。For expression of recombinant AIM II, eukaryotic cells (eg, COS cells or CHO cells) were prepared as described above using DEAE-DEXTRAN as described in Example 3 above. Transfect with expression vector. AIM II
Expression of the recombinant protein is detected by the method described above in Example 3.

【０３４３】 （ｂ）ｐＧ１ＳａｍＥＮ：レトロウイルス発現ベクターｐＧ１ＳａｍＥＮは、
Ｍｅｔ（１）〜Ｖａｌ（２４０）のＡＩＭ−ＩＩ ＯＲＦをコードする。ｐＧ１
ベクターは、Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０
（６）：１２９３〜１２９９（１９９２）において記載され、そしてＬＮベクタ
ー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．およびＲｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ７：９８０〜９９０（１９８９））に類似するが、さらなるクローニ
ング部位を有する。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託され
たクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、便利な制限部位を含むプライマーを使
用して増幅する。適切なプライマーは、本実施例中で使用される以下のものを含
む。５’プライマーは、下線を付したＮｏｔＩ部位、および ＡＵＧ開始コドン 、 ＡＩＭ ＩＩポリペプチド（配列番号１）のコード領域のヌクレオチド５１ 〜６９を含み、以下の配列を有する： ５’−ＧＧＧ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＧＧ ＡＧＧ Ａ
ＧＡ ＧＴＧ ＴＣＧ ＴＡＣ ＧＧ−３’（配列番号３４）。(B) pG1SamEN: The retroviral expression vector pG1SamEN is
Encodes the AIM-II ORF from Met (1) to Val (240). pG1
The vector is described in Morgan, R .; A. Et al., Nucl. Acids. Res. 20
(6): 1293-1299 (1992) and described in the LN vector (Miller, AD and Rosman, GJ Biotechni).
ques 7: 980-990 (1989)), but with additional cloning sites. The plasmid construction strategy is as follows. The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following used in this example. The 5 'primer contains an underlined NotI site, and the AUG start codon, nucleotides 51-69 of the coding region of the AIM II polypeptide (SEQ ID NO: 1), and has the following sequence: 5'-GGG GCG GCC GC G CCA TCA TGG AGG A
GA GTG TCG TAC GG-3 '(SEQ ID NO: 34).

【０３４４】 ３’プライマーは、下線を付したＳａｌＩ部位、配列番号１のヌクレオチド７
５３〜７６８に相補的なヌクレオチド、および終止コドンを含み、以下の配列を
有する： ５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＴＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ
ＡＧＣ ＣＣＣ Ｇ−３’（配列番号３５）。The 3 ′ primer has an underlined SalI site, nucleotide 7 of SEQ ID NO: 1.
Including nucleotides complementary to 53-768, and a stop codon, has the following sequence: 5'-GGG GTC GAC GCC TTCA CAC CAT GAA
AGC CCC G-3 '(SEQ ID NO: 35).

【０３４５】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、次い
でゲル精製する。次いで、単離したフラグメントをＳａｌＩおよびＮｏｔＩ消化
したベクターに連結した。連結混合物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、そして形質
転換した培養物を抗生物質培地プレート上にプレーティングし、次いでこのプレ
ートをインキュベートして抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にする。プラスミ
ドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてＡＩＭ ＩＩコードフラグメントの
存在について、制限分析およびゲル上のサイジングによって試験する。The PCR amplified DNA fragment is digested with SalI and NotI and then gel purified. The isolated fragment was then ligated into the SalI and NotI digested vector. E. ligation mixture E. coli is transformed, and the transformed culture is plated on an antibiotic medium plate, and the plate is then incubated to allow growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and tested for the presence of the AIM II coding fragment by restriction analysis and sizing on a gel.

【０３４６】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞また
はＣＨＯ細胞）を、上記の実施例３に示すようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使
用して、上記に示すように発現ベクターでトランスフェクトする。ＡＩＭ ＩＩ
組換えタンパク質の発現を、実施例３中の上記の方法によって検出する。For expression of recombinant AIM II, eukaryotic cells (eg, COS cells or CHO cells) were prepared as described above using DEAE-DEXTRAN as described in Example 3 above. Transfect with expression vector. AIM II
Expression of the recombinant protein is detected by the method described above in Example 3.

【０３４７】 （２．Ｎ末端欠失構築物） （ａ）ｐＧ１／ｃｋβ８：この真核生物の発現ベクターは、ＡＩＭ−ＩＩ変異
体（配列番号２におけるＧｌｎ（６０）〜Ｖａｌ（２４０））（ＡＩＭ−２（ア
ミノ酸６０〜２４０）をコードする。そしてヒトＣｋ−β８シグナルペプチドの
指揮下で分泌された。このｐＧ１ベクターは、Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（６）：１２９３−１２９９（１９９２）に記
載され、そしてＬＮベクター（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．およびＲｏｓｍａｎ，Ｇ
．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１９８９））に類似
しているが、付加的なクローニング部位を有する。このプラスミド構築ストラテ
ジーは、以下のとおりである。寄託されたクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを
、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用して増幅する。適切なプライマー
としては、本実施例に用いられる以下のプライマーが挙げられる。下線を付した
ＮｏｔＩ部位、ＡＩＭ ＩＩポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチ
ド（配列番号１）、およびＡＵＧ開始コドンを含む５’プライマーは、以下の配
列を有する：(2. N-terminal deletion construct) (a) pG1 / ckβ8: This eukaryotic expression vector is an AIM-II mutant (Gln (60) to Val (240) in SEQ ID NO: 2) (AIM -2 (amino acids 60-240) and was secreted under the direction of the human Ck-β8 signal peptide.This pG1 vector is described in Morgan, RA et al., Nu.
cl. Acids Res. 20 (6): 1293-1299 (1992) and described in the LN vector (Miller, AD and Rosman, G.
. J. Biotechniques 7: 980-990 (1989)), but with additional cloning sites. This plasmid construction strategy is as follows. The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following primers used in this example. The 5 'primer, including the underlined NotI site, nucleotides in the coding region for the AIM II polypeptide (SEQ ID NO: 1), and the AUG start codon has the following sequence:

【０３４８】[0348]

【化１２】 下線を付したＳａｌＩ部位、配列番号１におけるヌクレオチド７５３〜７６８
に対して相補的なヌクレオチドおよび終止コドンを含む３’プライマーは、以下
の配列を有する： ５’−ＧＧＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣ Ｃ
ＣＣ Ｇ−３’（配列番号３７）。Embedded image Underlined SalI site, nucleotides 753-768 in SEQ ID NO: 1
The 3 'primer containing a nucleotide complementary to and a stop codon has the following sequence: 5'-GGG GTC GAC TCA CAC CAT GAA AGC C
CC G-3 '(SEQ ID NO: 37).

【０３４９】 ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、
次いでゲルで精製する。次いで、単離したフラグメントを、ＳａｌＩおよびＮｏ
ｔＩで消化したベクターｐＧ１中へ連結した。連結混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉで形
質転換し、そしてこの形質転換された培養物を、抗生物質培地プレート上にプレ
ーティングし、次いで、このプレートを抗生物質耐性コロニーの増殖を可能にす
るためにインキュベートする。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、
ＡＩＭ ＩＩをコードするフラグメントの存在について、制限分析およびゲルサ
イジングによって試験する。The DNA fragment amplified by PCR was digested with SalI and NotI,
It is then purified on a gel. The isolated fragment was then converted to SalI and No.
Ligation into the vector pG1 digested with tI. In the ligation mixture, E. coli and the transformed culture is plated on antibiotic media plates, and the plates are then incubated to allow growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from the resistant colonies,
The presence of the fragment encoding AIM II is tested by restriction analysis and gel sizing.

【０３５０】 組換えＡＩＭ ＩＩの発現のために、ＣＯＳまたはＣＨＯのような真核生物細
胞を、上記実施例３に記載したようにＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いて、上記
の発現ベクターでトランスフェクトする。ＡＩＭ ＩＩ組換えタンパク質の発現
を、上記の実施例３に記載した方法によって検出する。For expression of recombinant AIM II, eukaryotic cells such as COS or CHO are transfected with the above expression vectors using DEAE-DEXTRAN as described in Example 3 above. Expression of the AIM II recombinant protein is detected by the method described in Example 3 above.

【０３５１】 （ｂ）ｐＨＥ４：プラスミドｐＨＥ４は、２つのｌａｃオペレーターを有する
強力な合成プロモーターを含む細菌性の発現ベクターである。このプロモーター
からの発現を、ｌａｃリプレッサーの存在によって調節し、そしてＩＰＴＧまた
はラクトースを用いて誘導する。このプラスミドはまた、効率的なリボソーム結
合部位、およびＡＩＭ ＩＩ変異体遺伝子の下流に合成転写ターミネーターを含
む。このベクターはまた、ｐＵＣプラスミドの複製領域およびカナマイシン耐性
遺伝子を含む。(B) pHE4: Plasmid pHE4 is a bacterial expression vector containing a strong synthetic promoter with two lac operators. Expression from this promoter is regulated by the presence of the lac repressor and induced with IPTG or lactose. This plasmid also contains an efficient ribosome binding site, and a synthetic transcription terminator downstream of the AIM II mutant gene. This vector also contains the replication region of the pUC plasmid and the kanamycin resistance gene.

【０３５２】 このＡＩＭ ＩＩ Ｎ末端欠失変異体を、以下のスキームに従って構築した。
寄託されたクローンのＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡを、都合のよい制限部位を含むプ
ライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、本実施例において用いられる
以下のものを含む。This AIM II N-terminal deletion mutant was constructed according to the following scheme.
The AIM II cDNA of the deposited clone is amplified using primers containing convenient restriction sites. Suitable primers include the following used in this example.

【０３５３】 配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ（Ｔｈｒ（７０）〜Ｖａｌ（２４０））ポリ
ペプチドについて、下線を付したＮｄｅＩ部位およびＡＵＧ開始コドン、ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチド２５６〜２７１（配
列番号１）を含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＣＡＴＡＴＧ Ａ ＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧ−３’（配
列番号４２）。For the AIM II (Thr (70) -Val (240)) polypeptide in SEQ ID NO: 2, the underlined NdeI site and the AUG start codon, AIM
II 5 comprising nucleotides 256-271 (SEQ ID NO: 1) in the coding region for polypeptides 'primer has the following sequence: 5'-cgc CATATG A CCCGCCTGCCTGACG- 3' ( SEQ ID NO: 42).

【０３５４】 配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ（Ｓｅｒ（７９）〜Ｖａｌ（２４０））ポリ
ペプチドについて、下線を付したＮｄｅＩ部位およびＡＵＧ開始コドン、ＡＩＭ
ＩＩポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチド２８３〜３１０（配
列番号１）を含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＣＡＴＡＴＧ Ａ ＧＣ ＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣ−
３’（配列番号４３）。For the AIM II (Ser (79) -Val (240)) polypeptide in SEQ ID NO: 2, the underlined NdeI site and the AUG start codon, AIM
The 5 'primer comprising nucleotides 283-310 (SEQ ID NO: 1) in the coding region for the II polypeptide has the following sequence: 5'-cgcCATATAG AGC TGGGAGCAGCTGATAC-
3 '(SEQ ID NO: 43).

【０３５５】 配列番号２におけるＡＩＭ ＩＩ（Ｓｅｒ（１０３）〜Ｖａｌ（２４０））ポ
リペプチドについて、下線を付したＮｄｅＩ部位およびＡＵＧ開始コドン、ＡＩ
Ｍ ＩＩポリペプチドについてのコード領域中のヌクレオチド３５５〜３７３（
配列番号１）を含む５’プライマーは、以下の配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＣＡＴＡＴＧ Ａ ＧＣ ＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧ−
３’（配列番号４４）。For the AIM II (Ser (103) -Val (240)) polypeptide in SEQ ID NO: 2, the underlined NdeI site and the AUG start codon, AI
Nucleotides 355 to 373 in the coding region for the MII polypeptide (
5 'primer comprising SEQ ID NO: 1) has the following sequence: 5'-cgc CATATG A GC AGCTTGACCGGCAGCG-
3 '(SEQ ID NO: 44).

【０３５６】 以下の３’プライマーを、上述のＮ末端欠失物を構築するために使用し得る： 下線を付したＡｓｐ７１８部位、配列番号１におけるヌクレオチド７５３〜７
６８に相補的なヌクレオチドおよび終止コドンを含む３’プライマーは、以下の
配列を有する： ５’−ｃｇｃ ＧＧＴＡＣＣ ＴＴＡ ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＧ−３
’（配列番号４５）。The following 3 ′ primers can be used to construct the N-terminal deletion described above: Underlined Asp718 site, nucleotides 753-7 in SEQ ID NO: 1
The 3 'primer containing a nucleotide complementary to 68 and a stop codon has the following sequence: 5'-cgc GGTAC TTA ACCCATGAAAGCCCCG-3
'(SEQ ID NO: 45).

【０３５７】 このＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で消
化し、次いでゲルで精製する。次に、この単離したフラグメントを、適切に消化
したｐＨＥ４ベクター中へ連結した。この連結混合物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換
し、そして形質転換した培養物を、抗生物質培地プレート上にプレーティングし
、次いでこのプレートをインキュベートし、抗生物質耐性コロニーの増殖を可能
にする。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてＡＩＭ ＩＩを
コードするフラグメントの存在について、制限分析およびゲルサイジングにより
試験する。The PCR amplified DNA fragment is digested with NdeI and Asp718 and then gel purified. This isolated fragment was then ligated into the appropriately digested pHE4 vector. In this ligation mixture, E. The E. coli is transformed, and the transformed culture is plated on an antibiotic medium plate, which is then incubated, allowing the growth of antibiotic resistant colonies. Plasmid DNA is isolated from resistant colonies and tested by restriction analysis and gel sizing for the presence of the fragment encoding AIM II.

【０３５８】 組換えＡＩＭ ＩＩ Ｎ末端欠失物の発現のために、細菌細胞を、実施例１に
おいて上記に記載したように発現ベクターでトランスフェクトする。ＡＩＭ Ｉ
Ｉ組換えタンパク質の発現を、実施例１において上記に記載したような方法で検
出する。For expression of a recombinant AIM II N-terminal deletion, bacterial cells are transfected with an expression vector as described above in Example 1. AIM I
Expression of the I recombinant protein is detected by the method as described above in Example 1.

【０３５９】 （実施例５：ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの生物学的特徴付け） 以下の実験のセットは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の生物学的特徴付けを提供し
、そしてＡＩＭ ＩＩが、インビボおよびインビトロにおいて強力な抗腫瘍活性
を有することを実証する。Example 5: Biological characterization of AIM II polypeptides The following set of experiments provides for the biological characterization of AIM II protein and that AIM II is potent in vivo and in vitro. It demonstrates that it has antitumor activity.

【０３６０】 （Ａ．ＡＩＭ ＩＩは、活性化リンパ球において多く発現されるが、癌細胞に
おいては高度に発現されない。） ノーザンブロット分析は、ＡＩＭ ＩＩ ｍＲＮＡが、約１．９ｋｂの長さで
あり、そして主に脾臓、脳、および末梢血細胞において発現されることを示した
。ＡＩＭ ＩＩはまた、前立腺、精巣、卵巣、小腸、胎盤、肝臓、骨格筋、およ
び肺において、ある程度検出可能である。ＡＩＭ ＩＩメッセージは、胎児性組
織、多くの内分泌腺、ならびに非造血および骨髄由来の腫瘍株において検出され
なかった。(A. AIM II is highly expressed in activated lymphocytes but not highly expressed in cancer cells.) Northern blot analysis showed that AIM II mRNA was approximately 1.9 kb long. And predominantly expressed in spleen, brain, and peripheral blood cells. AIM II is also partially detectable in prostate, testis, ovary, small intestine, placenta, liver, skeletal muscle, and lung. AIM II messages were not detected in fetal tissues, many endocrine glands, and non-hematopoietic and bone marrow derived tumor lines.

【０３６１】 ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、活性化ＰＢＭＣ対静止期ＰＢＭＣにおいてＡＩＭ
ＩＩの発現を調査するために行った。Ｔ細胞、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球、お
よび顆粒球の混合物を含む新鮮なＰＢＭＣは、ノーザンブロット分析と一致する
ＡＩＭ ＩＩ ｍＲＮＡを発現する。発現は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞
の混合物としての静止期ＰＢＬ、ジャーカット細胞（静止期または活性化）また
はＫ５６２細胞において見出されなかった。ＡＩＭ ＩＩの増加した発現が、活
性化ＰＢＬ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ
）、顆粒球、および単球において見出された。さらなるＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｌ
ＰＳ活性化好中球およびＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞においてＡＩＭ ＩＩ ｍ
ＲＮＡの存在を示した。興味深いことに、ＡＩＭ ＩＩの発現は、***、前立腺
または卵巣由来の種々の癌細胞株（ヒト***上皮性由来の非腫瘍形成性細胞株Ｍ
ＣＡ−１ＯＡ細胞を除く）においては検出可能ではなかった。さらに、ＡＩＭ
ＩＩの発現は、試験された３つの乳癌サンプルからは見出されなかった。The RT-PCR assay was performed on activated versus stationary PBMC using AIM
Performed to investigate the expression of II. Fresh PBMC, including a mixture of T cells, B lymphocytes, NK cells, monocytes, and granulocytes, express AIM II mRNA consistent with Northern blot analysis. No expression was found in quiescent PBL, Jurkat (quiescent or activated) or K562 cells as a mixture of T, B and NK cells. Increased expression of AIM II is associated with activated PBL, CD3 +, CD4 + T cells, CD8 + tumor infiltrating lymphocytes (TIL
), Granulocytes, and monocytes. Further RT-PCR analysis was performed using L
AIM II m in PS-activated neutrophils and PMA-stimulated U937 cells
Indicates the presence of RNA. Interestingly, the expression of AIM II was detected in various cancer cell lines derived from breast, prostate or ovary (non-tumorigenic cell line M derived from human mammary epithelium).
(Except for CA-1OA cells). In addition, AIM
II expression was not found in the three breast cancer samples tested.

【０３６２】 （Ｂ．ＡＩＭ ＩＩの構成的発現は、血清飢餓またはＩＦＮγ処理下で増殖阻
害を生じた） ＡＩＭ ＩＩの生物学的機能を調査するため、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子を、ヒト乳
房癌腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１にレトロウィルスベクターを用いて安定に形
質導入した。これらの細胞におけるＡＩＭ ＩＩ遺伝子の発現を、ノーザンブロ
ット分析によって確認した。さらに、薬物耐性遺伝子Ｎｅｏを発現するＭＤＡ−
ＭＢ−２３１細胞を、本研究においてコントロールとして使用した。これらの細
胞を、１０％ＦＢＳを含む培地において培養した場合、その親細胞またはベクタ
ーコントロールトランスフェクト細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ）と比較
して、ＡＩＭ ＩＩトランスフェクト体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ
）中で、インビトロにおける増殖率における差異は観察されなかった。しかし、
血清濃度が、１％にまで低下した場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細
胞に関して８０％の増殖阻害（図４Ａ）があったが、親細胞またはベクターコン
トロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では存在しなかった。異なる量の血清に関す
る用量依存性増殖阻害もまた、観察された。(B. Constitutive expression of AIM II resulted in growth inhibition under serum starvation or IFNγ treatment) To investigate the biological function of AIM II, the AIM II gene was replaced with the human breast carcinoma cell line MDA -MB-231 was stably transduced with a retroviral vector. The expression of the AIM II gene in these cells was confirmed by Northern blot analysis. Furthermore, MDA- expressing the drug resistance gene Neo
MB-231 cells were used as controls in this study. When these cells were cultured in a medium containing 10% FBS, the AIM II transfectants (MDA-MB-231) were compared with their parental cells or vector control transfected cells (MDA-MB-231 / Neo). / AIM II
), No difference in the growth rate in vitro was observed. But,
When serum concentration was reduced to 1%, there was 80% growth inhibition (FIG. 4A) for MDA-MB-231 / AIM II cells, but was present in parental cells or vector control MDA-MB-231 cells. Did not. Dose-dependent growth inhibition for different amounts of serum was also observed.

【０３６３】 野生型ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％または１％のいずれかの血清にお
いて、代表的なパイルアップ（ｐｉｌｅ−ｕｐ）特性を伴って非常に高い密度ま
で増殖した（図４Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞において、ほ
とんどの細胞が培地中に浮遊し、そして培養物の全体にわたって単層の増殖パタ
ーンを維持することを伴う、形態学的な変化が注目された。形態学の変化は、ベ
クターコントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において見出されなかった。ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞を発現するＡＩＭ ＩＩの増殖阻害を、ソフトアガーコロ
ニーアッセイでさらに試験した。図４Ｂに示されるように、コロニー形成の８０
％の減少が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞において、それらの親細
胞またはベクターコントロール細胞と比較して見られた。ＩＦＮγの２５μ／ｍ
ｌでの処理もまた、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の８０％の増殖
阻害を引き起こし得るのに対し、親細胞またはベクターコントロール細胞におい
ては、わずか２０〜３０％にすぎない阻害が存在した。従って、ＡＩＭ ＩＩを
発現する細胞は、サイトカインＩＦＮγにより媒介された細胞傷害性に対する増
強された感受性を示した。Wild-type MDA-MB-231 cells grew to very high density with typical pile-up characteristics in either 10% or 1% serum (FIG. 4A). . In MDA-MB-231 / AIM II cells, morphological changes were noted, with most cells floating in the medium and maintaining a monolayer growth pattern throughout the culture. No morphological changes were found in the vector control MDA-MB-231 cells. MD
Growth inhibition of AIM II expressing A-MB-231 cells was further tested in a soft agar colony assay. As shown in FIG.
A% reduction was seen in MDA-MB-231 / AIM II cells compared to their parental or vector control cells. 25 μ / m of IFNγ
l can also cause 80% growth inhibition of AIM II expressing MDA-MB-231 cells, whereas in parental cells or vector control cells there was only 20-30% inhibition. . Thus, cells expressing AIM II exhibited enhanced sensitivity to cytotoxicity mediated by the cytokine IFNγ.

【０３６４】 （Ｃ．ＡＩＭ ＩＩ発現細胞における増強されたアポトーシス） アネキシン−Ｖ ＦＡＣＳ分析を、ＡＩＭ ＩＩ発現細胞の増殖阻害の潜在的
な機構を調査するために行った。１０％血清の存在下では、３つの細胞株全てに
おいて、２％未満のアポトーシス細胞が存在する。減少した血清（０．５％ＦＢ
Ｓ）における４８時間のインキュベーション後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のア
ポトーシス集団は、３倍（８％まで）の増加を示した。親細胞またはベクターコ
ントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においては、アポトーシスのわずかな増加
があるか、または増加がない（図５Ａ）。アポトーシスの誘導は、図５Ｂに示さ
れるＤＮＡフラグメント化によって、さらに確認された。フラグメント化したＤ
ＮＡは、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、特に１％血清に
おいてのみ見られた。ＡＩＭ ＩＩ発現細胞を、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ｔａｘ
ｏｌ）で処理した場合、親細胞またはベクターコントロール細胞において見られ
たよりも、ずっとより多くのフラグメント化ＤＮＡが観察された。従って、この
データは、ＡＩＭ ＩＩ発現が、血清飢餓下、あるいはＩＦＮγまたはタキソー
ルの添加で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスの引き金となり得ること
を示唆する。C. Enhanced Apoptosis in AIM II Expressing Cells Annexin-V FACS analysis was performed to investigate the potential mechanism of growth inhibition of AIM II expressing cells. In the presence of 10% serum, less than 2% apoptotic cells are present in all three cell lines. Reduced serum (0.5% FB
After 48 hours incubation in S), the apoptotic population of MDA-MB-231 cells showed a 3-fold (up to 8%) increase. There is little or no increase in apoptosis in parental cells or vector control MDA-MB-231 cells (FIG. 5A). The induction of apoptosis was further confirmed by the DNA fragmentation shown in FIG. 5B. Fragmented D
NA was found only in AIM II expressing MDA-MB-231 cells, especially in 1% serum. AIM II-expressing cells were transferred to Paclitaxel (tax
ol), much more fragmented DNA was observed than was seen in parental cells or vector control cells. Thus, this data suggests that AIM II expression can trigger apoptosis of MDA-MB-231 cells under serum starvation or with the addition of IFNγ or taxol.

【０３６５】 （Ｄ．ＡＩＭ ＩＩの強力なインビボ抗腫瘍活性） 本発明者らは、インビボにおける腫瘍増殖に対するＡＩＭ ＩＩ形質導入の効
果を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、***脂肪パッド中へ接種した場合
、ＡＩＭ ＩＩ発現は、ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の腫瘍形成
を有意に阻害したが、ベクターコントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細胞
は、それらの親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と比較して腫瘍増殖において何ら変化
も示さなかった（図６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞における
同様の腫瘍抑制はまた、ＳＣＩＤマウスにおいても示された。ＡＩＭ ＩＩ発現
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来か、あるいはそれらの親細胞またはベクターコン
トロール細胞由来の腫瘍の組織学的な試験を行った。親細胞またはベクターコン
トロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、わずかな細胞浸潤を伴うかまたは細胞浸
潤を伴わずに、優位に腫瘍細胞で満たされた大きな固形腫瘍塊を形成した。対照
的に、ヌードマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞によって
形成された小さな残留腫瘍においてでさえ、大規模な壊死が観察された。さらに
、ＡＩＭ ＩＩ発現腫瘍において、好中球細胞の浸潤の数に有意な増加がある。
Ｇｒ−１ ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い
る免疫組織学的染色に基づき、野生型、Ｎｅｏコントロール、およびＡＩＭ Ｉ
Ｉ形質導入ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるｍｍ2腫瘍サイズあたりの好中球 の平均数（平均±Ｓ．Ｄ．）は、それぞれ１０１±２６、７７±１６および２２
６±３８であった。D. Potent In Vivo Anti-Tumor Activity of AIM II We evaluated the effect of AIM II transduction on tumor growth in vivo. When MDA-MB-231 cells were inoculated into the mammary fat pad, AIM II expression significantly inhibited MDA-MB-231 tumorigenesis in nude mice, whereas the vector control MDA-MB-231 / Neo cells Showed no change in tumor growth compared to their parental MDA-MB-231 cells (FIG. 6A). Similar tumor suppression in MDA-MB-231 / AIM II cells was also demonstrated in SCID mice. Histological examination of tumors from AIM II expressing MDA-MB-231 cells or from their parental cells or vector control cells was performed. Parental cells or vector control MDA-MB-231 cells formed large solid tumor masses predominantly filled with tumor cells with little or no cell invasion. In contrast, extensive necrosis was observed even in small residual tumors formed by MDA-MB-231 / AIM II cells in nude mice. Furthermore, there is a significant increase in the number of neutrophil cell infiltrates in AIM II expressing tumors.
Based on immunohistological staining with Gr-1 mAb (PharMingen, San Diego, Calif.), Wild type, Neo control, and AIM I
The average number of neutrophils per mm 2 tumor size (mean ± SD) in I-transduced MDA-MB-231 tumors was 101 ± 26, 77 ± 16 and 22 respectively.
6 ± 38.

【０３６６】 ＡＩＭ ＩＩの腫瘍抑制に対する阻害効果を、同系のマウス腫瘍モデルでさら
に確認した。ＭＣ−３８マウス結腸ガン細胞におけるＡＩＭ ＩＩの局所的発現
は、１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのうち８匹で腫瘍形成の完全な抑制を生じた
（図６Ｂ）。ＡＩＭ ＩＩの局所的生成によってもまた、ＭＣ−３８腫瘍を有す
るマウスの生存が劇的に延長された。全ての動物実験を３回繰り返し、そして同
様の結果が得られた。The inhibitory effect of AIM II on tumor suppression was further confirmed in a syngeneic mouse tumor model. Local expression of AIM II in MC-38 mouse colon cancer cells resulted in complete suppression of tumor formation in 8 out of 10 C57BL / 6 mice (FIG. 6B). Local production of AIM II also dramatically prolonged the survival of mice bearing MC-38 tumors. All animal experiments were repeated three times with similar results.

【０３６７】 ＡＩＭ ＩＩ発現腫瘍細胞の注射によって、実験期間中、ヌードマウス、ＳＣ
ＩＤマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて著しい異常（例えば、体重減少
または肝臓損傷）は引き起こされなかった。これは、局所的に生成されたＡＩＭ
ＩＩが全身毒性を誘導することなく強力な抗腫瘍効果を発揮することを示す。Injection of AIM II-expressing tumor cells allowed nude mice, SC
No significant abnormalities (eg, weight loss or liver damage) were caused in ID or C57BL / 6 mice. This is the locally generated AIM
11 shows that II exerts potent antitumor effects without inducing systemic toxicity.

【０３６８】 （Ｅ．可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現および細胞傷害性） ＡＩＭ ＩＩタンパク質の活性を研究するために、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の
組換え可溶性形態（ｓＡＩＭ ＩＩ）を構築物ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩで２９
３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。この構築物は
、ＡＩＭ ＩＩの細胞外ドメインをコードするが、ＡＩＭ ＩＩの膜貫通部分を
欠失している（図７Ａ）。単一の２０ｋＤａポリペプチド（ｓＡＩＭ ＩＩ）を
ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩを形質導入した２９３Ｔ細胞の馴化培地から抗Ｆｌａ
ｇモノクローナル抗体で精製し得る（図７Ａ）。乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞
の増殖は、用量依存性様式でこの可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の処理に応答し
て阻害された（図７Ｂ）。ＩＮＦγの添加（１０μ／ｍｌまたは５０μ／ｍｌ）
は、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の細胞傷害性を劇的に高めた。ＩＦＮγ単独
では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してほとんど活性を示さなかった（図７Ｂ
）。これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＴＮＦまたはＩＦＮγ処理のような単
一のサイトカインに耐性であるという先の報告と一致する。E. Expression and Cytotoxicity of Soluble AIM II Protein To study the activity of AIM II protein, a recombinant soluble form of AIM II protein (sAIM II) was prepared using construct pFlag-AIM II with 29
3T cells were generated by transient transfection. This construct encodes the extracellular domain of AIM II, but lacks the transmembrane portion of AIM II (FIG. 7A). A single 20 kDa polypeptide (sAIM II) was isolated from conditioned medium of 293T cells transduced with pFlag-AIM II by anti-Fla.
g monoclonal antibody (FIG. 7A). The growth of breast cancer MDA-MB-231 cells was inhibited in response to treatment with this soluble AIM II protein in a dose-dependent manner (FIG. 7B). Addition of INFγ (10μ / ml or 50μ / ml)
Dramatically increased the cytotoxicity of the soluble AIM II protein. IFNγ alone showed little activity on MDA-MB-231 cells (FIG. 7B
). This is consistent with previous reports that MDA-MB-231 cells are resistant to a single cytokine, such as TNF or IFNγ treatment.

【０３６９】 一連の正常細胞株および癌細胞株を、１０μ／ｍｌのＩＮＦγの存在下で最適
濃度未満の濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）で可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の細胞傷害
性効果に対するそれらの感受性について試験した。図８Ｃに示されるように、Ｍ
ＤＡ−１３０、ＭＣＦ−７，ＨＴ−２９由来の細胞は、ＡＩＭ ＩＩの細胞傷害
性に対して感受性であるのに対し、Ｕ９３Ｔ、ＭＣ３−１、ＳＷ４８０、ＭＣＦ
−１０Ａ由来の細胞は、ＡＩＭ ＩＩ媒介細胞殺傷に対して耐性である。試験し
た全ての細胞株の中で、結腸腺癌細胞株ＨＴ−２９が最も感受性であり、ＩＣ50 は、１ｎｇ／ｍｌ未満である。ＨＴ−２９は、ＩＦＮγの存在下で、ＴＮＦ、Ｆ
ａｓまたはリンホトキシンβレセプター媒介殺傷に対して非常に感受性であるこ
とを示した。A series of normal and cancer cell lines were tested for their sensitivity to the cytotoxic effects of soluble AIM II protein at suboptimal concentrations (50 ng / ml) in the presence of 10 μ / ml INFγ. . As shown in FIG. 8C, M
Cells derived from DA-130, MCF-7, HT-29 are susceptible to AIM II cytotoxicity, whereas U93T, MC3-1, SW480, MCF
Cells from -10A are resistant to AIM II-mediated cell killing. Of all the cell lines tested, colon adenocarcinoma cell line HT-29 is the most sensitive, IC 50 is the less than 1 ng / ml. HT-29 reacts with TNF, F in the presence of IFNγ.
It was shown to be very susceptible to as or lymphotoxin β receptor mediated killing.

【０３７０】 （Ｆ．ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方が、癌細胞のＡＩＭ ＩＩ誘導性増殖阻害
を必要とする） ＡＩＭ ＩＩは、本来、活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから同定されたが
、リンパ球細胞株においてアポトーシスを誘導しない。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用
して、試験した全てのリンパ球細胞がＬＴβＲの発現を示さないことを示したが
、ＴＲ２発現がこれらの全ての細胞、特に活性化ジャーカット細胞またはＰＢＬ
で見出された。これは、末梢リンパ球がＬＴβＲを発現しないという先の報告と
一致するが、ＴＲ２発現は、Ｔ細胞活性化と関連する。F. Both LTβR and TR2 Require AIM II-Induced Growth Inhibition of Cancer Cells AIM II was originally identified from an activated T-cell cDNA library Does not induce apoptosis in RT-PCR analysis was used to show that all lymphocyte cells tested did not show LTβR expression, but TR2 expression showed that all these cells, especially activated Jurkat cells or PBL
Found in. This is consistent with previous reports that peripheral lymphocytes do not express LTβR, but TR2 expression is associated with T cell activation.

【０３７１】 ＬＴβＲおよびＴＲ２の一連のヒト癌細胞における細胞表面発現を、ＬＴβＲ
またはＴＲ２に対するモノクローナル抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によって調
べた。図８Ａに示されるように、両方のレセプターが高レベルであることがＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１およびＨＴ−２９細胞で見いだされたが、その一方でＭＣ３−
１細胞はＴＲ２を発現せず、そしてジャーカット細胞は、ＬＴβＲを発現しない
。図８Ｃに、試験した全ての細胞株における両方のレセプターの表面発現をまと
める。レセプターの一方のみを発現する細胞株（例えば、ジャーカットまたはＭ
Ｃ３−１）は、ＡＩＭ ＩＩの細胞傷害性に対して耐性である。まとめると、こ
れらのデータは、腫瘍細胞におけるＡＩＭ ＩＩ媒介増殖阻害がＬＴβＲおよび
ＴＲ２レセプターの両方を必要とし得るが、その一方で、レセプターのうちの一
方のみを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを示唆
する。The cell surface expression of LTβR and TR2 on a series of human cancer cells was
Or by FACS analysis using a monoclonal antibody against TR2. As shown in FIG. 8A, high levels of both receptors indicated that MD
It was found in A-MB-231 and HT-29 cells, while MC3-
One cell does not express TR2 and Jurkat cells do not express LTβR. FIG. 8C summarizes the surface expression of both receptors in all cell lines tested. Cell lines expressing only one of the receptors (eg, Jurkat or M
C3-1) is resistant to AIM II cytotoxicity. Taken together, these data indicate that AIM II-mediated growth inhibition in tumor cells may require both LTβR and TR2 receptors, while cells expressing only one of the receptors mediate cell killing Suggest that it is not enough.

【０３７２】 ＡＩＭ ＩＩがＬＴβＲおよびＴＲ２レセプター両方についての適切なリガン
ドであり、ならびにＡＩＭ ＩＩ媒介腫瘍細胞増殖阻害における両方のレセプタ
ーに重要であることをさらに実証するために、Ｆｌａｇタグ化ＡＩＭ ＩＩタン
パク質を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞とともにインキュベート
し、次いで、ＦＡＣＳ分析を、抗ＦｌａｇｍＡｂを用いて行った。図８Ｂに示さ
れるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞の、Ｆｌａｇタグ化可
溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質との結合は正にシフトする。結合の特異性を、同じ
細胞中で可溶性ＡＩＭ ＩＩ−ｆｌａｇタンパク質とのＬＴβＲ−Ｆｃ融合タン
パク質またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（これは、両方のレセプターの結合を
効果的にブロックした）のプレインキュベーションによってさらに確認した（図
８Ｂ）。To further demonstrate that AIM II is a suitable ligand for both the LTβR and TR2 receptors, and that it is important for both receptors in AIM II-mediated tumor cell growth inhibition, Flag-tagged AIM II protein was , MDA-MB-231 or HT-29 cells, and then FACS analysis was performed with anti-FlagmAb. As shown in FIG. 8B, binding of MDA-MB-231 or HT-29 cells to Flag-tagged soluble AIM II protein is positively shifted. The specificity of the binding was further enhanced by preincubation of the LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion protein with the soluble AIM II-flag protein in the same cells, which effectively blocked the binding of both receptors. Confirmed (FIG. 8B).

【０３７３】 腫瘍細胞に対するＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性におけるＬＴβＲおよびＴＲ２
の両方の改善の重要性は、インビトロ増殖アッセイから得られたデータによって
さらに支持された：ＨＴ−２９のｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性は、用量依存性
様式でＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の添加
によって無効にされたが、一方で、ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＴＲ２
−Ｆｃ融合タンパク質それ自体は、細胞増殖に対して全く効果を示さなかった（
図８Ｄ）。さらに、同様のアッセイにおいて、ｓＡＩＭ ＩＩはＴＮＦＲの他の
メンバー（例えば、ＴＮＦＲＩ、Ｆａｓ、ＤＲ３またはＤＲ１４）に結合し得な
かった。LTβR and TR2 in AIM II-mediated cytotoxicity against tumor cells
The importance of both improvements was further supported by the data obtained from the in vitro proliferation assay: sAIM II-mediated cytotoxicity of HT-29 was demonstrated in a dose-dependent manner by LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion. The LTβR-Fc fusion protein or TR2
The -Fc fusion protein itself had no effect on cell proliferation (
(FIG. 8D). Furthermore, in a similar assay, sAIM II failed to bind to other members of TNFR (eg, TNFRI, Fas, DR3 or DR14).

【０３７４】 さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷｔまたはＨＴ−２９細胞とＭＤＡ−ＭＢ−
２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞との共培養は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｗｔまたは野
生型ＨＴ−２９細胞の殺傷を生じた。しかし、共培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１
／ＡＩＭ ＩＩまたはＭＣ−３８／ＡＩＭ ＩＩ細胞から回収された馴化培地は
、ＨＴ−２９細胞の増殖のインビトロに対する阻害効果を全く示さなかった。こ
の結果は、天然のＡＩＭ ＩＩタンパク質が切断され得ず、そして培地中に分泌
され得ないことを示した。従って、膜結合ＡＩＭ ＩＩは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３
１またはＨＴ−２９のような適切な表面レセプターを発現する細胞で機能的であ
る。まとめると、このデータは、腫瘍細胞のＡＩＭ ＩＩ媒介増殖阻害がＬＴβ
ＲおよびＴＲ２レセプターの両方を必要とし得るが、レセプターのうちの一方の
みを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを示唆する
。In addition, MDA-MB-231 / Wt or HT-29 cells and MDA-MB-
Co-culture with 231 / AIM II cells resulted in killing of MDA-MB-231 / Wt or wild type HT-29 cells. However, co-cultured MDA-MB-231
Conditioned media recovered from / AIM II or MC-38 / AIM II cells showed no inhibitory effect on the proliferation of HT-29 cells in vitro. This result indicated that the native AIM II protein could not be cleaved and secreted into the medium. Therefore, the membrane-bound AIM II is based on MDA-MB-23.
It is functional in cells that express appropriate surface receptors such as 1 or HT-29. Taken together, this data indicates that inhibition of AIM II-mediated growth of tumor cells was LTβ
Cells that may require both the R and TR2 receptors, but that express only one of the receptors, are not sufficient to mediate cell killing.

【０３７５】 （Ｇ．リンパ球に対するＡＩＭ ＩＩの効果） ＡＩＭ ＩＩは、本来、活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから同定されたが
、リンパ球細胞株においてアポトーシスを誘導しない。ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用
して、試験した全てのリンパ球産生細胞がＬＴβＲを発現しないことを示したが
、ＴＲ２は、これらの全ての細胞、特に活性化ジャーカット細胞またはＰＢＬで
陽性であった。これは、末梢リンパ球がＬＴβＲを発現しないという先の報告と
一致するが、ＴＲ２発現は、Ｔ細胞活性化と関連した。G. Effect of AIM II on Lymphocytes AIM II was originally identified from an activated T cell cDNA library, but does not induce apoptosis in lymphocyte cell lines. RT-PCR analysis was used to show that all lymphocyte producing cells tested did not express LTβR, but TR2 was positive in all these cells, especially activated Jurkat cells or PBL . This is consistent with previous reports that peripheral lymphocytes do not express LTβR, but TR2 expression was associated with T cell activation.

【０３７６】 膜結合ＡＩＭ ＩＩがリンパ球に対して異なる活性を発揮するか否かを調べる
ために、ＴＩＬ１２００細胞のＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞との共
培養実験を行った。ＴＩＬ１２００は、高レベルのＦａｓを発現するＣＤ８+（ ９９５）腫瘍浸潤リンパ球株である。膜結合ＡＩＭ ＩＩは、ＴＩＬ１２００の
アポトーシスを誘導しなかったが、Ｆａｓ抗体の添加によって、９０％のＴＩＬ
１２００が誘発されて、アポトーシスを受けた。同様の結果が、新鮮なＴＩＬ細
胞またはジャーカット細胞で得られた。To determine whether membrane-bound AIM II exerts different activities on lymphocytes, co-culture experiments of TIL1200 cells with MDA-MB-231 / AIM II cells were performed. TIL1200 is a CD8 + (995) tumor infiltrating lymphocyte line that expresses high levels of Fas. Membrane-bound AIM II did not induce TIL1200 apoptosis, but with the addition of Fas antibody, 90% TIL
1200 were induced to undergo apoptosis. Similar results were obtained with fresh TIL or Jurkat cells.

【０３７７】 さらに、いくつかのリンパ系細胞株およびＰＢＬを可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパ
ク質に対するこれらの応答性についてスクリーニングした。ＡＩＭ ＩＩの細胞
傷害性は、ジャーカット細胞（静止またはＣＤ３ ｍＡｂ活性化のいずれか）、
Ｋ５６２細胞、またはＴＩＬ１２００（腫瘍浸潤リンパ球）、ＰＢＭＣ（新鮮ま
たはＩＬ−２／ＣＤ３ ｍＡｂ活性化）においてみられなかった（図８Ｃ）。対
照的に、ＰＢＬのｓＡＩＭ ＩＩでの処理は、ＩＦＮγの放出によって実証され
るように、ＴＲ２発現Ｔ細胞の活性化を生じる（図９）。Additionally, several lymphoid cell lines and PBLs were screened for their responsiveness to soluble AIM II protein. The cytotoxicity of AIM II is determined by Jurkat cells (either resting or CD3 mAb activation),
It was not found in K562 cells, or TIL1200 (tumor infiltrating lymphocytes), PBMC (fresh or IL-2 / CD3 mAb activation) (FIG. 8C). In contrast, treatment of PBL with sAIM II results in activation of TR2-expressing T cells, as demonstrated by the release of IFNγ (FIG. 9).

【０３７８】 （考察） 前述の実験で、ＡＩＭ ＩＩの生物学的機能およびＬＴβＲおよびＴＲ２の新
規なリガンドとしての作用の、そのあり得る機構が特徴づけられた。この結果は
、ＡＩＭ ＩＩタンパク質がインビトロおよびインビボの両方で形質転換された
腫瘍細胞において主に強力な細胞傷害性を示すが同時に、リンパ球を活性化する
ことを実証する。インビトロおよびインビボでのＡＩＭ ＩＩの生物学的活性は
、２つの異なるシグナル伝達経路：ＬＴβＲおよびＴＲ２への結合を含むいくつ
かの方法においてＴＮＦ／ＦａｓＬファミリーの他の公知のメンバーと、ＡＩＭ
ＩＩとを明らかに区別する。ＡＩＭ ＩＩ発現が腫瘍増殖を阻害する能力が異
系（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ）（免疫不全）モデルおよび同系（免疫コンピテン
ト）モデルの両方で実証されたので、この結果は、Ｔ細胞媒介腫瘍特異的応答が
、この研究における原発性腫瘍拒絶についての本質的な因子ではないかもしれな
いことを示唆する。Discussion The experiments described above characterized the biological function of AIM II and its possible mechanism of action as a novel ligand for LTβR and TR2. The results demonstrate that the AIM II protein shows mainly potent cytotoxicity in tumor cells transformed both in vitro and in vivo, but at the same time activates lymphocytes. The biological activity of AIM II in vitro and in vivo has been demonstrated by AIM in several ways, including binding to two different signaling pathways: LTβR and TR2, with other known members of the TNF / FasL family.
It is clearly distinguished from II. This result indicates that the T cell-mediated tumor-specific response was Suggests that this study may not be an essential factor for primary tumor rejection.

【０３７９】 ＴＮＦレセプターファミリーの活性化は、細胞増殖、あるいは細胞分化または
細胞死を直接誘導し得る。前述の実験は、ＡＩＭ ＩＩ発現が、血清飢餓または
ＩＦＮγの添加と関連して、ヒト乳癌腫細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における増
殖阻害およびアポトーシスを生じたことを示す。アポトーシスの誘導は、アネキ
シン−Ｖ ＦＡＣＳ分析およびＤＮＡ断片化で示されるように、インビトロでの
増殖阻害についての主な原因であるようである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＬＴ−
γ細胞の形態および増殖パターンは、細胞接着のいくらかの損失の関与を示唆す
る。Ｂｒｏｗｎｉｎｇらは、Ｆａｓ活性化が急激な細胞死（１２〜２４時間）を
導き、ＴＮＦの効果には２４時間を必要とし、そしてＬＴｃＸ１２０ヘテロトリ
マーは、ＨＴ−２９細胞についてのアポトーシスの誘導が最も遅かった（２〜３
日）ことを示した。可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質での処理に応答して、ＬＴγ
ＲおよびＴＲ２を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＨＴ−２９細胞の溶
解は、同様の緩慢な結果を示した（すなわち、少なくとも３〜５日）。実質的な
細胞溶解は、いくつかの細胞株については、３〜４日後ですら起こらない。ＡＩ
Ｍ ＩＩの作用の動態は、ＬＴαＩβ２ヘテロトリマーに、より類似している。Activation of the TNF receptor family can directly induce cell proliferation, or cell differentiation or death. The foregoing experiments show that AIM II expression resulted in growth inhibition and apoptosis in the human breast carcinoma cell line MDA-MB-231 in association with serum starvation or addition of IFNγ. Induction of apoptosis appears to be a major cause for growth inhibition in vitro, as shown by Annexin-V FACS analysis and DNA fragmentation. MDA-MB-231 / LT-
The morphology and proliferation pattern of gamma cells suggests that some loss of cell adhesion is involved. Browning et al. Found that Fas activation led to rapid cell death (12-24 hours), the effect of TNF required 24 hours, and that the LTcX120 heterotrimer was the slowest at inducing apoptosis on HT-29 cells. (2-3
Day). In response to treatment with soluble AIM II protein, LTγ
Lysis of MDA-MB-231 and HT-29 cells expressing R and TR2 showed similar slow results (ie, at least 3-5 days). Substantial cell lysis does not occur even after 3-4 days for some cell lines. AI
The kinetics of action of MII is more similar to the LTαIβ2 heterotrimer.

【０３８０】 ＡＩＭ ＩＩは、本来、ＴＮＦ／Ｆａｓリガンドおよびレセプタースーパーフ
ァミリーのシステインリッチモチーフとの配列相同性のスクリーニングによって
ヒト活性化Ｔ細胞ライブラリーから同定された。他のＴＮＦ関連リガンドと同様
に、ＡＩＭ ＩＩは、外側の細胞表面上にＣ末端を有し、単一の膜貫通ドメイン
、および短い細胞質テイルを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。予測される
ように、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の全長ｃＤＮＡの形質導入によって、タンパク質の
細胞表面発現を生じ、そしてこのタンパク質は、ＦＡＣＳ分析で実証されるよう
に、２つのレセプターに結合する。可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質は、両方のレ
セプターに結合し、そして標的細胞に対する細胞傷害性効果を誘発するためには
十分である。しかしトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）共培養実験（ここで
は、２つの型の細胞が培養培地を共有するが物理的には分離している）において
、野生型ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞に対する、ＡＩＭ ＩＩ発
現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に由来する細胞傷害性は観察されなかった。直接共
培養アッセイにおいて、膜結合ＡＩＭ ＩＩは、近接の接触に由来する殺傷を効
果的に媒介した。従って、天然のＡＩＭ ＩＩタンパク質は、分泌されたタンパ
ク質ではないかもしれないことが考えられる。蛍光インサイチュハイブリダイゼ
ーション（ＦＩＳＨ）によって、ＡＩＭ ＩＩ遺伝子は、ヒト第１６染色体、バ
ンドｐ１１．２に位置した。ＡＩＭ ＩＩの位置は、コア結合タンパク質、スル
ホトランスフェラーゼ、シンタキシン１Ｂ、網膜芽細胞腫結合タンパク質６、ジ
ンクフィンガータンパク質４４、細胞接着調節遺伝子およびウィルムス腫瘍−３
遺伝子と非常に近い。他の公知のＴＮＦリガンド（例えば、ＴＮＦ、ＬＴα、お
よびＬＴβ）をコードする遺伝子は、クラスＩＩＩとＨＬＡ−Ｂ遺伝子座との間
に挟まれた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）内のヒト第６染色体上で密接に
関連している。AIM II was originally identified from a human activated T cell library by screening for sequence homology with the TNF / Fas ligand and cysteine-rich motifs of the receptor superfamily. Like other TNF-related ligands, AIM II is a type II transmembrane protein with a C-terminus on the outer cell surface, a single transmembrane domain, and a short cytoplasmic tail. As expected, transduction of the full-length cDNA of the AIM II gene results in cell surface expression of the protein, which binds to two receptors, as demonstrated by FACS analysis. Soluble AIM II protein is sufficient to bind to both receptors and elicit a cytotoxic effect on target cells. However, in a transwell co-culture experiment (where the two types of cells share the culture medium but are physically separated), wild-type MDA-MB-231 or HT-29 cells No cytotoxicity from AIM II expressing MDA-MB-231 cells was observed. In a direct co-culture assay, membrane-bound AIM II effectively mediated killing from close contact. Thus, it is believed that the native AIM II protein may not be a secreted protein. By fluorescence in situ hybridization (FISH), the AIM II gene was located on human chromosome 16, band p11.2. The location of AIM II is determined by core binding protein, sulfotransferase, syntaxin 1B, retinoblastoma binding protein 6, zinc finger protein 44, cell adhesion regulatory gene and Wilms tumor-3.
Very close to the gene. Genes encoding other known TNF ligands (e.g., TNF, LTa, and LTp) are human homologs of the major histocompatibility complex (MHC) sandwiched between the class III and HLA-B loci. Closely related on 6 chromosomes.

【０３８１】 ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方は、デスドメインを欠如している。従って、ＬＴ
βＲおよびＴＲ２の両方に対するＡＩＭ ＩＩ結合の実証は、興味深い。ＬＴβ
ＲおよびＴＲ２は、ＴＮＦＲに対する会合因子（ＴＲＡＦ）との会合を介して一
般的なシグナル伝達経路を活性化し得るが、ＡＩＭ ＩＩ−ＬＴβＲおよびＡＩ
Ｍ ＩＩ−ＴＲ２の相互作用が、異なる生物学的事象の引き金となり得る。本実
施例に示したように、ＡＩＭ ＩＩの発現は、ＴＲ２レセプターのみを発現して
いるリンパ球を活性化するが、ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方を発現している細胞
を死へと誘導する。ＬＴβＲを介したシグナル伝達は、ＴＲＡＦ３依存経路を活
性化する。対照的に、ＡＩＭ ＩＩ−ＴＲ２相互作用は、おそらくＴＲＡＦ（Ｔ
ＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３およびＴＲＡＦ５）を介した宿主免疫系の刺
激性応答を励起する。このＡＩＭ ＩＩ二重シグナル伝達仮説は、ＬＴβＲおよ
びＴＲ２の異なる組織発現パターンおよび細胞発現パターンによりさらに支持さ
れる。ＬＴβＲは、腫瘍および他の上皮細胞において顕著であるが、ＴおよびＢ
細胞には存在しない。対照的に、ＴＲ２は、静止期のＴ細胞および活性化された
Ｔ細胞、Ｂ細胞および単球および顆粒球において匹敵するレベルで大量に発現さ
れる。それゆえ、ＡＩＭ ＩＩはおそらく、アポトーシスおよび免疫活性化の誘
導のような重大な役割を果たしており、そしてそれゆえ、癌についての治療的適
用を有し得る。[0381] Both LTβR and TR2 lack a death domain. Therefore, LT
The demonstration of AIM II binding to both βR and TR2 is interesting. LTβ
R and TR2 can activate general signaling pathways through association with the association factor for TNFR (TRAF), but AIM II-LTβR and AI
The MII-TR2 interaction can trigger different biological events. As shown in this example, expression of AIM II activates lymphocytes that express only the TR2 receptor, but induces cells that express both LTβR and TR2 to death. Signaling through LTβR activates a TRAF3-dependent pathway. In contrast, the AIM II-TR2 interaction is probably due to TRAF (T
(RAF1, TRAF2, TRAF3 and TRAF5) to excite the stimulatory response of the host immune system. This AIM II dual signaling hypothesis is further supported by the different tissue and cell expression patterns of LTβR and TR2. LTβR is prominent in tumors and other epithelial cells, while T and B
Not present in cells. In contrast, TR2 is abundantly expressed at comparable levels in quiescent and activated T cells, B cells and monocytes and granulocytes. Therefore, AIM II probably plays a critical role such as inducing apoptosis and immune activation, and may therefore have therapeutic applications for cancer.

【０３８２】 ＬＴβＲは、元々、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであるヒト第１２
ｐ染色体上にコードされる転写配列として記載されていた。ＬＴβＲは、リンパ
節の発達および細胞性免疫反応を調節するのに重要なエレメントとして関係して
いる。ＬＴβＲが、腫瘍株を含む種々の組織および細胞株で発現されていること
が示されている。ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーとは異なり、ＬＴβＲは、
Ｔリンパ球およびＢリンパ球によって発現されない。組換えＬＴα１β２ヘテロ
トリマーを用いることによる、または固定化された抗体との架橋によるＬＴβＲ
の活性化は、ＬＴβＲが、自身の細胞質領域内にデスドメインを含まないにもか
かわらず、腺癌細胞株の死ならびにケモカインＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳの産
生を誘導する。The LTβR is originally a human twelfth member that is a member of the TNFR superfamily.
It was described as a transcribed sequence encoded on the p chromosome. LTβR has been implicated as an important element in regulating lymph node development and the cellular immune response. LTβR has been shown to be expressed in various tissues and cell lines, including tumor lines. Unlike other members of the TNFR family, LTβR
Not expressed by T and B lymphocytes. LTβR by using recombinant LTα1β2 heterotrimer or by cross-linking with immobilized antibody
Activation induces the death of adenocarcinoma cell lines and the production of chemokines IL-8 and RANTES, despite that the LTβR does not contain a death domain in its cytoplasmic region.

【０３８３】 ＴＲ２が、複数のヒト組織において発現され、そして休止期および活性化され
たＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および好中球を含む造血性系統
細胞における構成的および相対的に高い発現を示す。ＴＲ２細胞質テイルは、Ｆ
ａｓおよびＴＮＦＲ−Ｉ細胞内ドメインに見られるデスドメインを含まず、そし
てＣＤ４０および４−１ＢＢのドメインにより関連しているようである。４−1 ＢＢおよびＣＤ４０を介したシグナルが、それぞれＴ細胞およびＢ細胞に対して
共刺激性であることが示されている。ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、アポトー
シスの引き金となるＦａｓＬおよびＴＮＦとは対照的に混合リンパ球反応媒介増
殖を阻害した。試験した全ての造血性由来細胞は、ＴＲ２レセプターを発現して
いるが、腫瘍細胞で観察されたＡＩＭ ＩＩ媒介殺傷に対して耐性である。これ
は、ＴＲ２単独では、デスシグナルを媒介しないことを示す。しかし、試験した
全ての癌細胞が、ＬＴβＲおよびＴＲ２の両方を発現したが、ＡＩＭ ＩＩ−Ｌ
ＴβＲシグナル伝達およびＡＩＭ ＩＩ−ＴＲ２シグナル伝達の両方が、腫瘍細
胞において、等しくＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性に貢献しているか否かを、解明
することが残されている。本発明者らはまた、可溶性ＡＩＭ ＩＩは、ＤＲ３、
ＤＲ４およびＤＲ５にインビトロ結合アッセイにおいては結合しないが、ＡＩＭ
ＩＩがＤＲ３、ＤＲ４およびＤＲ５のような他の公知または未知のデスレセプ
ターと相互作用する可能性を排除し得ない。TR2 is expressed in multiple human tissues and is constitutive and relatively high in hematopoietic lineage cells, including quiescent and activated CD4 + and CD8 + T cells, B cells, monocytes and neutrophils Shows expression. TR2 cytoplasmic tail is F
It does not contain the death domain found in the as and TNFR-I intracellular domains and appears to be more related to the CD40 and 4-1BB domains. 4-1 Signals through BB and CD40 have been shown to be costimulatory for T cells and B cells, respectively. The TR2-Fc fusion protein inhibited mixed lymphocyte response-mediated proliferation in contrast to FasL and TNF, which trigger apoptosis. All hematopoietic-derived cells tested express the TR2 receptor, but are resistant to AIM II-mediated killing observed in tumor cells. This indicates that TR2 alone does not mediate death signals. However, all cancer cells tested expressed both LTβR and TR2, but AIM II-L
It remains to be determined whether both TβR signaling and AIM II-TR2 signaling contribute equally to AIM II-mediated cytotoxicity in tumor cells. We also show that soluble AIM II comprises DR3,
Does not bind to DR4 and DR5 in an in vitro binding assay,
It cannot exclude the possibility that II interacts with other known or unknown death receptors such as DR3, DR4 and DR5.

【０３８４】 Ｔ細胞に対する、ＴＮＦの用量制限毒性およびＦａｓＬの細胞傷害性が、それ
らの臨床的適用を制限する。ＡＩＭ ＩＩでの処置は、ＡＩＭ ＩＩが、ＴＲ２
を発現するがＬＴβＲを欠いている宿主免疫細胞に対してデスシグナルではなく
刺激性シグナルの引き金となるので、代替的な魅力的なアプローチとなり得る。
ＡＩＭ ＩＩは、おそらくＬＴβＲおよびＴＲ２を介して腫瘍細胞の死を選択的
に誘導する能力を有し、そして同時に、見かけ上ＴＲ２シグナル伝達経路を介し
てリンパ球からのＩＦＮγの分泌の引き金となり得る。従って、このモデルは、
ＡＩＭ ＩＩが、抗癌薬剤としてのさらなる開発のための魅力的な候補であるだ
けでなく、より重要なことに、ＴＮＦリガンド−レセプター相互作用のメンバー
のシグナル伝達経路をさらに理解するために、以前に定義されたＴＮＦまたはＦ
ａｓシステムとは異なる新規なシステムを提供することを示す。The dose limiting toxicity of TNF and the cytotoxicity of FasL on T cells limit their clinical application. Treatment with AIM II indicates that AIM II
An alternative attractive approach may be to trigger a stimulatory signal rather than a death signal for host immune cells that express but lack LTβR.
AIM II has the ability to selectively induce tumor cell death, probably via LTβR and TR2, and may at the same time trigger the secretion of IFNγ from lymphocytes, apparently via the TR2 signaling pathway. Therefore, this model
AIM II is not only an attractive candidate for further development as an anticancer drug, but more importantly, to further understand the signaling pathways of members of the TNF ligand-receptor interaction, TNF or F as defined in
It shows that a new system different from the as system is provided.

【０３８５】 （方法） （ＡＩＭ ＩＩ全長遺伝子の分子クローニング） ５００を超える異なるｃＤＮＡライブラリーから得た１，０００，０００より
多くのＥＳＴ（発現配列タグ）を含むデータベースが、ランダムに選択されたヒ
トｃＤＮＡクローンの高処理能力を有する自動ＤＮＡ配列分析を用いて、Ｈｕｍ
ａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．およびＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈの合わさった努力を通じて生
成されている。各ＥＳＴの配列相同性比較を、ｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｎ
アルゴリズムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して行った。以前に同
定された配列に対する相同性を有するＥＳＴ（およそ０．０１未満）に、相同で
ある配列の名称に基づいて一時的な名称を与えた。このヒトＥＳＴデータベース
に対するＴＮＦ／Ｆａｓリガンドファミリーの保存されたアミノ酸配列（ＧＬＹ
ＬＩＹＳＱＶＬＦ（配列番号４６））を用いる特定の相同性およびモチーフ検索
が、＞５０％の相同性を有するいくつかのＥＳＴを明らかにした。ヒト活性化Ｔ
細胞ライブラリー由来のＧＹＹＹＩＹＳＫＶＱＬ（配列番号４７）を含む１つの
クローンを、選択した。このＥＳＴを、３’末端に対する両方の鎖において配列
決定した。その相同性を確認した。最初のクローンは、ＴＮＦファミリーの他の
メンバーと比較して遺伝子の５’部分を欠いている。全長配列を得るために、ネ
スティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ反応を、２つの遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チドおよび２つのベクター特異的プライマーを用いて行なった。５’末端のさら
なる７２ヌクレオチドを得た。次いで、全長配列を、ベクターｐＣＭＶｓｐｏｒ
ｔ２．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、ＭＤ）にクローニングした。Methods Molecular Cloning of AIM II Full Length Genes A database containing more than 1,000,000 ESTs (expressed sequence tags) obtained from over 500 different cDNA libraries was selected from randomly selected humans. Using automated DNA sequence analysis with high throughput of cDNA clones, Hum
an Genome Science Inc. And The Institute
Generated through the combined efforts of te for Genomic Research. Sequence homology comparisons for each EST were performed using blastn and blastn
The algorithm was performed against the GenBank database. ESTs with homology to previously identified sequences (approximately less than 0.01) were given a temporary name based on the name of the sequence being homologous. The conserved amino acid sequence of the TNF / Fas ligand family (GLY
Specific homology and motif searches using LIYSQVLF (SEQ ID NO: 46) revealed several ESTs with> 50% homology. Human activated T
One clone containing GYYYIYSKVQL (SEQ ID NO: 47) from a cell library was selected. This EST was sequenced on both strands to the 3 'end. Its homology was confirmed. The first clone lacks the 5 'portion of the gene as compared to other members of the TNF family. To obtain the full length sequence, a nested PCR reaction was performed using two gene-specific oligonucleotides and two vector-specific primers. An additional 72 nucleotides at the 5 'end were obtained. Next, the full-length sequence was converted into the vector pCMVspor.
t2.0 (Life Technologies Inc., Rockville)
e, MD).

【０３８６】 （ノーザンブロット分析） ヒト多重組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭＴＮｂｌｏｔｓ、＃７
７５９−１および＃７７６０−１）を、製造者の説明書に従って、32Ｐ標識され
たＡＩＭ ＩＩ全長ｃＤＮＡを用いてプローブした。ブロットを、使用前に４２
℃で予熱したハイブリゾル溶液（Ｏｎｃｏｒ）中で、一晩ハイブリダイズし、そ
の後、引き続いて４２℃で、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳおよび０．２×ＳＳＣ
／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒTM（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｃｏ．）を用いて可視化した。(Northern Blot Analysis) Human Multiple Tissue Northern Blot (Clontech, MTNblots, # 7
759-1 and # 7760-1) were probed with 32 P-labeled AIM II full-length cDNA according to the manufacturer's instructions. Blots were prepared before use.
Hybridization overnight in a hybridsol solution (Oncor) preheated at <RTIgt; 0 C, </ RTI> followed by <RTIgt;
/ 2% in 0.1% SDS, and Phosphormager ™ (Molec
ullar Dynamics Co. ).

【０３８７】 （インサイチュハイブリダイゼーションおよびＦＩＳＨ検出） ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の正確な染色体上の位置を決定するために、正常なヒト分
裂中期染色体の広がりに対する単一コピー遺伝子の蛍光インサイチュハイブリダ
イゼーション（ＦＩＳＨ）を、試みた（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９８８）。２Ｋ
ｂのｃＤＮＡを、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、ＦＩＳＨを、Ｊｏｈｎ
ｓｏｎら、１９９１ｂに詳述のように行なった。個々の染色体は、ＤＡＰＩおよ
びカラーデジタルイメージで対比染色し、ＤＡＰＩおよびローダミンで検出され
た遺伝子シグナルの両方を含んだ物を、トリプル−バンドパスフィルターセット
（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｂｒａｔｔｌｅｂｕｒｏ、
ＶＴ）を冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｔｕ
ｃｓｏｎ、ＡＺ）および可変励起波長フィルター（ｖａｒｉａｂｌｅ ｅｘｃｉ
ｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ｆｉｌｔｅｒｓ）（Ｊｏｈｎｓｏｎら
、１９９１ａ）と組み合わせて用いて記録した。画像を、ＩＳＥＥソフトウェア
パッケージ（Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて
分析した。In Situ Hybridization and FISH Detection To determine the exact chromosomal location of the AIM II gene, fluorescent in situ hybridization (FISH) of a single copy gene to the normal human metaphase chromosome spread was performed. Attempted (Lawrence et al., 1988). 2K
b. cDNA was converted to digoxigenin-11-dUTP (Boehringer M
nick translation using FISH and John
Son et al., 1991b. Individual chromosomes were counterstained with DAPI and color digital images and those containing both DAPI and rhodamine detected gene signals were filtered using a triple-bandpass filter set (Chroma Technology, Inc., Brattlebur,
VT) using a cooled charge-coupled device camera (Photometrics, Inc., Tu)
cson, AZ) and a variable excitation wavelength filter (variable exci)
Tissue wave length filters) (Johnson et al., 1991a). Images were analyzed using the ISEE software package (Invision Corp., Durham, NC).

【０３８８】 （細胞および試薬） ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、サブクローン２ＬＭＰを、胸腺欠損ヌードマ
ウスのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のインビボ継代より得、全ての実験に用いた。
ＭＣ−３８は、Ｈ−２ｂ起源の１，２−ジメチルヒドラジン誘導マウス結腸腺癌
である。ヒトＴリンパ球株ＪｕｒｋａｔおよびＣＨＯ株を、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）より得た。ヒト
黒色腫抗原ｇｐ１００反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞株ＴＩＬ １２００は、Ｄｒ．Ｙｕ
ｔａｋａ Ｋａｗａｋａｍｉ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）により快く提供された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３
１を除く全ての腫瘍細胞株を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で増殖
および維持した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１には、ダルベッコ改変されたＥａｇｌｅ
’ｓ培地を基本培地として用いた。ＨＬＡ−Ａ−２制限ＴＩＬ １２００を、１
０％ヒト血清および１０００ＵのＩＬ−２を含むＡｉｍ−Ｖ培地において増殖さ
せた。アポトーシス誘導性抗Ｆａｓ Ｍａｂ ＣＨ−１１を、Ｕｐｓｔａｔｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより得た。インターフェロンを、Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＡ）より得た。Cells and Reagents Human breast cancer MDA-MB-231, subclone 2LMP, was obtained from in vivo passage of MDA-MB-231 cells of athymic nude mice and used in all experiments.
MC-38 is a 1,2-dimethylhydrazine-induced mouse colon adenocarcinoma of H-2b origin. Human T lymphocyte strains Jurkat and CHO strains were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). The human melanoma antigen gp100 reactive CD8 + T cell line TIL 1200 was obtained from Dr. Yu
Taka Kawami (National Cancer Institute)
, Bethesda, MD). MDA-MB-23
All but one tumor cell line was grown and maintained in RPMI 1640 medium with 10% FCS. MDA-MB-231 contains Dulbecco's modified Eagle
's medium was used as the basal medium. HLA-A-2 restricted TIL 1200
Grow in Aim-V medium containing 0% human serum and 1000 U IL-2. Apoptosis-inducing anti-Fas Mab CH-11 was purified by Upstate
Obtained from Biotechnology. Interferon, Biosource
e Obtained from International (CA).

【０３８９】 （可溶性ＡＩＭ ＩＩの生成） ＡＩＭ ＩＩのアミノ酸７４−２４０（すなわち、推定細胞外ドメイン）をコ
ードする配列を、プレプロトリプシンシグナルペプチドおよびＦＬＡＧペプチド
タグをコードする配列とインフレームにベクターｐＦＬＡＧ．ＣＭＶ−１にサブ
クローニングした。得られた構築物、ｐＦＬＡＧ−ｓＡＩＭ ＩＩを、組換えｓ
ＡＩＭ ＩＩを生成するために２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ｐＦＬＡ
Ｇ．ＣＭＶ−１またはｐＦＬＡＧ−ｓＡＩＭ ＩＩをトランスフェクトした細胞
由来の培養培地を、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．
）アフィニティーカラムに通した。カラム溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
画し、そして、ｓＡＩＭ ＩＩを、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂおよびＥＣＬ検出試薬（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてウェスタンブロット
分析により検出した。Generation of Soluble AIM II The sequence encoding amino acids 74-240 of AIM II (ie, the putative extracellular domain) was placed in frame with the sequence encoding the preprotrypsin signal peptide and the FLAG peptide tag in the vector pFLAG. It was subcloned into CMV-1. The resulting construct, pFLAG-sAIM II, was
293T cells were transfected to produce AIM II. pFLA
G. FIG. Culture medium derived from cells transfected with CMV-1 or pFLAG-sAIM II was purified from anti-FLAG mAb (Eastman Kodak Co., Ltd.).
) Passed through an affinity column. The column eluate was fractionated by SDS-PAGE, and sAIM II was replaced with anti-FLAG mAb and ECL detection reagent (
Detection was performed by Western blot analysis using Amersham International).

【０３９０】 （組換えレセプター−Ｆｃ融合タンパク質の生成） ヒトＬＴβＲの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ技術に
よりＨｅｐＧ２細胞から増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、以
下であり：正方向５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣ
ＡＣ３’（配列番号４８）；および逆方向５’ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣ
ＡＧＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧ３’（配列番号４９）、そしてｐＳＫ＋ベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へのＰＣＲ産物のクローニングが促進されるように各
末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んだ。増幅された配列を、ＢａｍＨＩ消化に
供し、そして配列決定のためにＢａｍＨＩ切断ｐＳＫ＋ベクターに連結した。増
幅したｃＤＮＡフラグメントの忠実度をジデオキシＤＮＡ配列決定により確認し
た。ヒトＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質を得るために、ＬＴβＲの細胞外ドメイ
ンを、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＳＫ＋ベクターから切り出
し、そしてインフレーム連結するようにＢｇｌＩＩ切断ｐＵＣ１９−ＩｇＧｌ−
Ｆｃベクターに連結した。組換えバキュロウイルスを生成するために、融合遺伝
子をまず、ｐＵＣ１９−ＩｇＧ−ＦｃベクターからＨｐａｌ／ＨｉｎｄＩＩＩで
切り出し、続いてＳｍａＩ切断ｐＢａｃＰＡＫ９ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｃｏ．）との連結で塞いだ後、次いで、Ｓｆ９細胞内に線状化したＢａｃＰＡＫ
６ ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏ．）と共トランスフェクトした。組換え可
溶性ＬＴβＲ融合タンパク質を得るために、組換えウイルスを感染させた昆虫Ｓ
ｆ２１細胞からの５日間培養した上清を、濾過し、プロテインＡセファロースビ
ーズ上に捕捉し、次いで、結合ｓＬＴβＲタンパク質を、グリシン緩衝液（ｐＨ
３．０）で溶出し、続いてＰＢＳ中で透析した。ＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の
産生は、記載されている。(Generation of Recombinant Receptor-Fc Fusion Protein) cDNA encoding the extracellular domain of human LTβR was amplified from HepG2 cells by the RT-PCR technique. The sequence of the oligonucleotide primers is as follows: forward 5 'CGGGATCCATGCCTCCTGCCTTGGGGCC
AC3 '(SEQ ID NO: 48); and reverse 5' GCGGATCCTGGGGGGC
A BTGHI restriction enzyme site was included at each end to facilitate the cloning of the PCR product into AGTGGCTCTAATGG3 '(SEQ ID NO: 49) and the pSK + vector (Stratagene). The amplified sequence was subjected to BamHI digestion and ligated into a BamHI cut pSK + vector for sequencing. The fidelity of the amplified cDNA fragment was confirmed by dideoxy DNA sequencing. To obtain a human LTβR-Fc fusion protein, the extracellular domain of LTβR is excised from the pSK + vector using BamHI restriction endonuclease and BglII cut pUC19-IgGl- so as to ligate in frame.
It was ligated to the Fc vector. To generate a recombinant baculovirus, the fusion gene was first excised from the pUC19-IgG-Fc vector with Hpal / HindIII followed by a SmaI cut pBacPAK9 vector (Clontech).
Co. ), And then BacPAK linearized in Sf9 cells
Co-transfected with 6 DNA (Clontech Co.). In order to obtain a recombinant soluble LTβR fusion protein, insects infected with the recombinant virus S
Supernatants cultured for 5 days from f21 cells were filtered and captured on protein A Sepharose beads, and then bound sLTβR protein was removed from glycine buffer (pH
3.0) followed by dialysis in PBS. The production of a TR2-Fc fusion protein has been described.

【０３９１】 （ＬＴβＲ抗体およびＴＲ２抗体の生成） Ｂａｌｂ／ｃＪマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂ
ａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、フロイントアジュバント中のＬＴβＲ−Ｆｃ融
合タンパク質で免疫した。マウスを、３回追加免疫し、次いで、脾臓細胞を、Ｈ
ＥＰＥＳ中５０％のポリエチレングリコール存在下（ＰＥＧ １５００、Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でマウスミエローマＮＳ−１細胞と融合し
、続いて、ＲＰＭＩ１６４０／ＨＡＴおよびＲＰＭＩ１６４０／ＨＴ選択培地（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｃｏ．）中で培養した。ポジティブウェルからの上清を
、ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質に結合するがヒトＩｇＧには結合しない能力に
ついてＥＬＩＳＡにより試験した。ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質に対する抗体
を産生するハイブリドーマを、３回の制限希釈によりクローニングした。大量の
ｍＡｂを産生するために、１０7ハイブリドーマ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスのプ リスタン処理した腹腔内に注入し、続いてｍＡｂを、アフィニティークロマトグ
ラフィーにより腹水から精製した。同様に、ＴＲ２−ＧＳＴ融合タンパク質を用
いて、ＴＲ２に対するモノクローナル抗体を産生させ、ＥＬＩＳＡアッセイによ
りスクリーニングした。(Generation of LTβR and TR2 Antibodies) Balb / cJ mice (The Jackson Laboratory, B
ar Harbor, ME) was immunized with the LTβR-Fc fusion protein in Freund's adjuvant. Mice were boosted three times and then spleen cells were
In the presence of 50% polyethylene glycol in EPES (PEG 1500, Boe
fusion with mouse myeloma NS-1 cells, followed by RPMI 1640 / HAT and RPMI 1640 / HT selective media (
Boehringer Co. ). Supernatants from positive wells were tested by ELISA for their ability to bind to the LTβR-Fc fusion protein but not to human IgG. Hybridomas producing antibodies against the LTβR-Fc fusion protein were cloned by three limiting dilutions. To produce large amounts of mAb, was injected into 10 7 hybridoma cells Balb / c mice flop Risutan treated intraperitoneally, followed by mAb, it was purified from ascites by affinity chromatography. Similarly, a monoclonal antibody against TR2 was produced using the TR2-GST fusion protein and screened by an ELISA assay.

【０３９２】 （インビトロ増殖アッセイ） 細胞（５，０００細胞／ウェル）を、１０％ＦＢＳまたは１％ＦＢＳのいずれ
かの存在下のＩＭＥＭと共に、２４−マルチウェル組織培養プレート中に３連で
プレートした。３日、５日または７日目の生存細胞の数を、トリパンブルー排除
法により決定した。細胞を、この時間経過の間２日ごとに新鮮な培地と交換した
。In Vitro Proliferation Assay Cells (5,000 cells / well) were plated in triplicate in 24-multiwell tissue culture plates with IMEM in the presence of either 10% FBS or 1% FBS. . The number of surviving cells at 3, 5 or 7 days was determined by trypan blue exclusion. Cells were replaced with fresh medium every two days during this time course.

【０３９３】 ９６ウェルプレート中で細胞増殖のための可溶性テトラゾリウム／ホルマザン
（ＸＴＴ）アッセイを実施した。細胞（２，０００〜４，０００細胞／ウェル）
を１０％ＦＢＳまたは１％ＦＢＳを有するＩＭＥＭ培地中で増殖させた。４〜５
日の培養後、ＸＴＴ（１．０ｍｇ／ｍｌおよび１．５３ｍｇ／ｍｌのＰＭＳ）を
各ウェルに添加し、そして３７℃で４時間インキュベートした。４５０ｎｍでの
吸光度をＤｙｎａｔｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ＭＲ７００で測定した。[0393] Soluble tetrazolium / formazan (XTT) assays for cell growth were performed in 96-well plates. Cells (2,000-4,000 cells / well)
Was grown in IMEM medium with 10% FBS or 1% FBS. 4-5
After day culture, XTT (1.0 mg / ml and 1.53 mg / ml PMS) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Absorbance at 450 nm was measured with a Dynatech Model MR700.

【０３９４】 （ＦＡＣＳ分析） 細胞をトリプシン処理または吸引で集め、そして１５００〜２０００ｒｐｍで
５分間、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、そして５ｍｌの氷冷ＰＢＳで
２回洗浄した。次いで、細胞を結合緩衝液（１０％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．２）、０．０２％ ＮａＮ3および２５μｇ／ｍｌ正常ラットＩ ｇを含むＨＢＳＳ）中で、３０分間、４℃において、１０μｇ／ｍｌのＦｌａｇ
−タグ化ＡＩＭ ＩＩタンパク質またはＡｂｓと共にインキュベートした。次い
で、細胞を洗浄し、そして記載のようにヤギ抗マウスＩｇＧに結合体化させたフ
ィコエリスリン（ＰＥ）２０μｇ／ｍｌを用いて染色した。細胞表面結合に対し
て競合させるために、可溶性ＬＴＲβＲ−Ｆｃ融合タンパク質、ＴＲ２−Ｆｃを
１０μｇ／ｍｌで細胞に添加前に、３０分間、ＡＩＭ ＩＩとプレインキュベー
トした。蛍光をＦＡＣスキャンフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって分析した。FACS Analysis Cells were harvested by trypsinization or aspiration and centrifuged at 1500-2000 rpm for 5 minutes. The cell pellet was resuspended and washed twice with 5 ml of ice-cold PBS. The cells were then combined with binding buffer (10% BSA, 20 mM HEP).
10 μg / ml Flag for 30 minutes at 4 ° C. in ES (pH 7.2), HBSS containing 0.02% NaN 3 and 25 μg / ml normal rat Ig.
-Incubated with tagged AIM II protein or Abs. Cells were then washed and stained with 20 μg / ml phycoerythrin (PE) conjugated to goat anti-mouse IgG as described. To compete for cell surface binding, the soluble LTRβR-Fc fusion protein, TR2-Fc, was pre-incubated with AIM II for 30 minutes before adding 10 μg / ml to the cells. Fluorescence is measured by FAC scan flow cytometer (Becton Dick)
inson, Mountain View, CA).

【０３９５】 アポトーシスアッセイのために、細胞ペレットを１：１００希釈のＡｎｎｅｘ
ｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）お
よび５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む１×結合緩衝液（１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2）中で再懸濁し、４℃で１５分間インキュベー
トした。各細胞のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムの蛍
光をフローサイトメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。For the apoptosis assay, the cell pellet was diluted 1: 100 with Annex.
1 × binding buffer (10 mM H2F) containing in V-FITC (Trevigen, Gaithersburg, MD) and 50 μg / ml propidium iodide.
EPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 1 mM M
gCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 ) and incubated at 4 ° C. for 15 minutes. The fluorescence of Annexin V-FITC and propidium iodide of each cell was analyzed by flow cytometry (Coulter).

【０３９６】 （腫瘍細胞のレトロウイルス形質導入） レトロウイルスベクターをＡＩＭ ＩＩ遺伝子で腫瘍細胞を安定に形質導入す
ために使用した。ＡＩＭ ＩＩをコードするプラスミドを構築するために、ＡＩ
Ｍ ＩＩ ｃＤＮＡを含む１．９ｋｄ Ｎｏｔ Ｉ／Ｓａｌ Ｉフラグメントを
親プラスミドｐＧ１ＳａｍＥＮに挿入した。このレトロウイルス骨格は、モロニ
ーマウス白血病ウイルスに由来し、そしてＡＩＭ ＩＩ遺伝子は、モロニー（Ｍ
ｏｌｉｎｅ）マウス白血病ウイルス由来の長末端反復の転写制御下であった。レ
トロウイルスパッケージング株の生成は、以前に記載された（Ｍａｒｋｏｗｉｔ
ｚら）。簡潔には、３０μｇのｐＧ１ＳａｍＥＮ−ＡＩＭ ＩＩ ＤＮＡを２×
１０5のＰＡ３１７両栄養性パッケージング株および３×１０5ＧＰ＋Ｅ８６エコ
トロピックパッケージング株の混合物をトランスフェクトするために使用した。
２週間の選択後、次いで、高力価Ｇ４１８耐性ＰＡ３１７クローンを、パッケー
ジング株ＰＡ−ＡＩＭ ＩＩを再生成するために選択し、そして腫瘍細胞中への
遺伝子導入のために使用した。コントロールレトロウイルス産生株、ＰＡ−ｎｅ
ｏもまた使用した。これらのパッケージング株を２０時間、増殖させ、レトロウ
イルスの上清を収穫し、野生型、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＣ−３８の７５
％コンフルエントなフラスコにそれぞれ添加した。ヒトＡＩＭ ＩＩをコードす
る組換えレトロウイルスを用いた形質導入後、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤＡ−ＭＢ−
２３１またはＭＣ−３８細胞をネオマイシンアナログ、Ｇ４１８で選択し、それ
ぞれＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩまたはＭＣ−３８／ＡＩＭ ＩＩと命
名した。これらの腫瘍細胞中でのＡＩＭ ＩＩ発現をノーザンブロット分析で確
認した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ、ベクターコントロール株、ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１／ｎｅｏ、ＭＣ−３８／ＡＩＭ ＩＩおよびベクターコントロ
ール株、ＭＣ−３８／ｎｅｏを含む全ての安定なトランスフェクト体を増殖させ
、そして、それぞれ１．５ｍｇ／ｍｌおよび０．３７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の
存在下で維持した。Retroviral transduction of tumor cells A retroviral vector was used to stably transduce tumor cells with the AIM II gene. To construct a plasmid encoding AIM II, the AI
The 1.9 kd Not I / Sal I fragment containing the MII cDNA was inserted into the parent plasmid pG1SamEN. This retroviral backbone is derived from the Moloney murine leukemia virus, and the AIM II gene contains the Moloney (M
olein) was under transcriptional control of the long terminal repeat from mouse leukemia virus. The generation of retroviral packaging strains has been described previously (Markowit
z et al.). Briefly, 30 μg of pG1SamEN-AIM II DNA was added to 2 ×
A mixture of 10 5 PA317 amphotropic packaging strains and 3 × 10 5 GP + E86 ecotropic packaging strains was used to transfect.
After two weeks of selection, high titer G418 resistant PA317 clones were then selected to regenerate the packaging strain PA-AIM II and used for gene transfer into tumor cells. Control retrovirus producing strain, PA-ne
o was also used. These packaging strains were grown for 20 hours and the retroviral supernatant was harvested and 75% wild-type, MDA-MB-231 or MC-38.
% Confluent flasks. After transduction with a recombinant retrovirus encoding human AIM II, AIM II expressing MDA-MB-
231 or MC-38 cells were selected with the neomycin analog, G418, and named MDA-MB-231 / AIM II or MC-38 / AIM II, respectively. AIM II expression in these tumor cells was confirmed by Northern blot analysis. MDA-MB-231 / AIM II, vector control strain, MD
All stable transfectants, including A-MB-231 / neo, MC-38 / AIM II and the vector control strain, MC-38 / neo, were grown and 1.5 mg / ml and 0.375 mg / ml, respectively. Maintained in the presence of ml G418.

【０３９７】 （ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の同時培養アッセイ） ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェル組織培養プレートにプレートし、そして
コンフルエントまで増殖させた。培地の除去および１×ＰＢＳでの単層の洗浄の
後、１×１０6ジャーカット細胞（非付着性）を単層または空のウェル上の１ｍ ｌのＲＰＭＩ培地中にプレートした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞単独を有するウ
ェル（ジャーカット細胞を重層することなしに）をさらなるコントロールとして
維持した。２４または４８時間の培養後、混合培養物の非付着性相を、プレート
の穏やかな揺動後、プレートされた６ウェルから収集し、そしてトリパンブルー
排除を使用して生存度をアッセイした。アポトーシスの検出については、Ａｎｎ
ｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、サ
ンプル当たり２０，０００細胞を測定した。Jurkat Cell Co-Culture Assay MDA-MB-231 cells were plated in 6-well tissue culture plates and grown to confluence. After removal of the medium and washing of the monolayer with 1 × PBS, 1 × 10 6 Jurkat cells (non-adherent) were plated in 1 ml of RPMI medium on a monolayer or empty well. Wells with MDA-MB-231 cells alone (without overlaying Jurkat cells) were maintained as additional controls. After 24 or 48 hours of culture, the non-adherent phase of the mixed culture was collected from 6 plated wells after gentle rocking of the plate and assayed for viability using trypan blue exclusion. For detection of apoptosis, Ann
20,000 cells per sample were measured using an exin V-FITC FACScan flow cytometer.

【０３９８】 （リンホカイン放出アッセイ） リンホカイン放出アッセイを以前記載のように（Ｚｈａｉら）、ＡＩＭ ＩＩ
でヒトＰＢＬ反応性を検出するために実施した。簡潔には、ヒトＰＢＬ細胞を抗
ＣＤ３ｍＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ）およびｒｌＬ−２ ２０Ｕ/ｍｌならびに種 々の濃度のＡＩＭ ＩＩタンパク質の存在下で５日間インキュべートし、上清を
収集し、そしてＩＦＮγの分泌をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ、ＭＮ）から購入したＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。Lymphokine Release Assay Lymphokine release assays were performed as previously described (Zhai et al.), AIM II.
Performed to detect human PBL reactivity. Briefly, human PBL cells were incubated for 5 days in the presence of anti-CD3 mAb (0.1 μg / ml) and rlL-2 20 U / ml and various concentrations of AIM II protein, and the supernatant was collected. And the secretion of IFNγ was determined by R & D Systems (Minneapol
is, MN) using an ELISA kit purchased from

【０３９９】 （腫瘍形成能研究） メス胸腺欠損Ｎｃｒ−ｎｕヌードマウス（６週齢）をＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（Ｆｒｅｄｅｒ
ｉｃｈ、ＭＤ）およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）から得た。メスＣ５７ＢＬ／６マウス（６−７週齢）
をＨａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、
ＩＮ）から購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０6）をメス胸腺欠損 のヌードマウスの***脂肪パッドに０日目に注射し、同様に、ＭＣ−３８細胞を
Ｃ５８ＢＬ／６マウスの隣接領域に皮下（ｓ．ｃ）注射した。次いで、マウスに
耳標し、そして無作為化した。腫瘍サイズを盲目的な様式で週に２回カリパーを
用いて垂直直径を測定することによって評価した。各処理群は、１０匹の動物か
らなり、実験を３回繰り返した。腫瘍の組織学的検査をＨ／Ｅ染色を使用して実
施した。(Tumorogenicity study) Female athymic Ncr-nu nude mice (6 weeks old) were cultured on Frederick C
ancer Research and Development Center
, National Institute of Health (Freder
ich, MD) and Charles River Laboratories
(Raleigh, NC). Female C57BL / 6 mouse (6-7 weeks old)
To Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Indianapolis,
IN). MDA-MB-231 cells (1 × 10 6 ) were injected at day 0 into the mammary fat pad of female athymic nude mice, and MC-38 cells were similarly injected subcutaneously (s) into adjacent areas of C58BL / 6 mice. C) injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor size was assessed in a blind fashion by measuring vertical diameter twice a week using calipers. Each treatment group consisted of 10 animals and the experiment was repeated three times. Histological examination of the tumor was performed using H / E staining.

【０４００】 （実施例６：ＢＩＡｃｏｒｅ分析によるＡＩＭ ＩＩ発現の検出） ＣＨＯ細胞をＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａｇ タグ発現ベクターまたはＢＡＰ−Ｆｌ
ａｇ（ネガティブコントロール）のいずれかでトランスフェクトした。トランス
フェクトの３日後、ＡＩＭ ＩＩ発現をＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅ、
Ｉｎｃ．）を用いて測定し、これは、固定化ＡＩＭ ＩＩレセプター、リンホト
キシン−βレセプターに対する、タンパク質結合現象のリアルタイム測定を可能
とする（ＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムは、フローセルの表面で屈折率の変化に
よって結合を検出する）。リンホトキシン−βレセプター−Ｆｃ融合タンパク質
をＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド化学を使用して、アミン基を介してＢＩＡｃｏｒｅフローセ
ルに共有結合的に固定化した。ＡＩＭ ＩＩ−Ｆｒａｇおよびネガティブコント
ロール（ＢＡＰ−Ｆｌａｇ）馴化無血清培地の種々の希釈をリンホトキシン−β
−レセプター−誘導体化フローセルに、５０μｌの総用量について５μｌ／分で
供した。結合タンパク質の量をＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．
４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆ
ａｃｔａｎｔ Ｐ２０）でのフローセル洗浄後、決定した。このフローセル表面
を２０μｌの１０ｍＭ ＨＣｌでの洗浄による結合タンパク質の置換によって再
生した。Example 6 Detection of AIM II Expression by BIAcore Analysis CHO cells were transformed with AIM II-Flag tag expression vector or BAP-Fl
ag (negative control). Three days after transfection, AIM II expression was measured using a BIAcore device (BIAcore,
Inc. ), Which allows real-time measurement of the protein binding phenomenon for the immobilized AIM II receptor, lymphotoxin-β receptor (BIAcore sensorgrams detect binding by changes in refractive index at the surface of the flow cell). Do). Lymphotoxin-β receptor-Fc fusion protein was covalently immobilized via an amine group to a BIAcore flow cell using N-ethyl-N ′-(dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide chemistry. Various dilutions of AIM II-Frag and negative control (BAP-Flag) conditioned serum-free media were tested with lymphotoxin-β
-Receptor-derivatized flow cells were applied at 5 μl / min for a total volume of 50 μl. The amount of bound protein was determined using HBS buffer (10 mM HEPES (pH 7.
4), 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Surf
determined after washing the flow cell with actant P20). The flow cell surface was regenerated by displacement of the bound protein by washing with 20 μl of 10 mM HCl.

【０４０１】 リンホトキシン−β−レセプターに対する特異的結合をＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａ
ｇ培養物からの１０倍までの馴化培地の希釈で検出したが、ネガティブコントロ
ール（ＢＡＰ−Ｆｌａｇ）馴化培地について有意な結合を全く観察しなかった。
このことは、ＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａｇ結合がリンホトキシン−β−レセプターに
特異的であり、そしてこの融合タンパク質のＦｃ部分に対しては特異的でないこ
とを実証する。さらに、ＡＩＭ ＩＩ−Ｆｌａｇタンパク質による特異的レセプ
ター結合は、この結合がこの細胞によって分泌されるようなネイティブな構造物
を表すことを示す。従って、このＢＩＡｃｏｒｅに基づいたアッセイを馴化培地
および他の生物学的液体からのＡＩＭ ＩＩの発現を検出するために使用し得る
。さらに、純粋なＡＩＭ ＩＩタンパク質の既知量を使用することによって、こ
のアッセイをＡＩＭ ＩＩ濃度を決定するための定量的アッセイに開発し得る。The specific binding to lymphotoxin-β-receptor was determined by AIM II-Fla
No significant binding was observed for the negative control (BAP-Flag) conditioned medium, detected at up to 10-fold dilution of conditioned medium from g culture.
This demonstrates that AIM II-Flag binding is specific for the lymphotoxin-β-receptor and not for the Fc portion of the fusion protein. Furthermore, specific receptor binding by the AIM II-Flag protein indicates that this binding represents a native construct as secreted by the cell. Thus, this BIAcore-based assay can be used to detect the expression of AIM II from conditioned media and other biological fluids. In addition, by using known amounts of pure AIM II protein, this assay can be developed into a quantitative assay to determine AIM II concentration.

【０４０２】 （実施例７：活性化誘導されたアポトーシスアッセイ） 活性化誘導されたアポトーシスを、ＳｕｐＴ−１３ 白血病細胞を使用してア
ッセイし、そして細胞周期分析により測定した。アッセイを以下のように実施す
る。ＳｕｐＴ−１３細胞を、対数増殖（約１×１０6）中に１０％ＦＣＳを含有 するＲＰＭＩにおいて維持する。Ｓｕｐ−Ｔ１３細胞を、０．５×１０6／ｍｌ 、１ｍｌ／ウェルで２４ウェルプレートのウェル中に播種する。ＡＩＭ ＩＩタ
ンパク質（０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）または
緩衝液コントロールをウェルに添加し、そして細胞を３７℃で、２４時間インキ
ュベートする。滅菌濾過した０．０５Ｍ炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．５中、１０μ
ｇ／ｍｌ濃度の精製ＢＣ３ ｍＡｂ、または、緩衝液単独を、ウェル中に０．５
ｍｌ／ウェルで、インキュベートすることによって、抗ＣＤ３抗体を併ってまた
は併わず、別の２４ウェルプレートのウェルを調製した。プレートを４℃で一晩
インキュベートする。抗体でコーティングされたプレートのウェルを、４℃で、
滅菌ＰＢＳで３回洗浄する。ＡＩＭ ＩＩ処理したＳｕｐ−Ｔ１３細胞を、抗体
でコーティングしたウェルに移し、そして３７℃で、１８時間インキュベートす
る。アポトーシスを、ヨウ化プロピジウムおよびフローサイトメトリーを使用す
る細胞周期分析により測定する。各処理したウェルの全３００μｌを採取し、そ
して９６ウェルプレートの３連のウェル内に送達することにより（１００μｌ／
ウェル）、処理した細胞の増殖を測定する。各ウェルに対して、２０μｌ／ウェ
ルの3Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／２０μｌ、２Ｃｉ／ｍＭ）を添加し、３７ ℃で、１８時間インキュベートする。収集し、そして細胞による3Ｈ−チミジン の取り込みを計数する。この測定を使用して、他の方法により観察される場合の
アポトーシスに対する効果を確認する。このアッセイについてのポジティブコン
トロールは、抗ＣＤ３架橋単独である。さらに、抗ｆａｓモノクローナル抗体（
可溶化形態ＩｇＭ ｍＡｂ中、５００ｎｇ／ｍｌ）を使用して、この株における
顕著でかつ再現性のアポトーシスが実証された。このアッセイについてのネガテ
ィブコントロールは、培地または緩衝液単独である。また、別の抗ＣＤ３ ｍＡ
Ｂ（ＯＫＴ３）での架橋は、効果を有さないことが示された。Example 7 Activation-Induced Apoptosis Assay Activation-induced apoptosis was assayed using SupT-13 leukemia cells and measured by cell cycle analysis. The assay is performed as follows. SupT-13 cells are maintained in RPMI containing 10% FCS in logarithmic growth (about 1 × 10 6 ). Sup-T13 cells are seeded at 0.5 × 10 6 / ml, 1 ml / well in wells of a 24-well plate. AIM II protein (0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) or buffer control is added to the wells and the cells are incubated at 37 ° C. for 24 hours. 10 μl in sterile filtered 0.05M bicarbonate buffer, pH 9.5
g / ml concentration of purified BC3 mAb or buffer alone was added to wells at 0.5 g / ml.
The wells of another 24-well plate were prepared by incubation with ml / well, with or without anti-CD3 antibody. Incubate the plate at 4 ° C. overnight. The wells of the plate coated with the antibody were placed at 4 ° C.
Wash three times with sterile PBS. AIM II-treated Sup-T13 cells are transferred to antibody-coated wells and incubated at 37 ° C. for 18 hours. Apoptosis is measured by cell cycle analysis using propidium iodide and flow cytometry. By taking a total of 300 μl of each treated well and delivering into triplicate wells of a 96-well plate (100 μl /
Wells), measure the proliferation of the treated cells. To each well, add 20 μl / well of 3 H-thymidine (0.5 μCi / 20 μl, 2 Ci / mM) and incubate at 37 ° C. for 18 hours. Harvest and count uptake of 3 H-thymidine by the cells. This measurement is used to confirm the effect on apoptosis as observed by other methods. The positive control for this assay is anti-CD3 cross-linking alone. Furthermore, an anti-fas monoclonal antibody (
A prominent and reproducible apoptosis in this strain was demonstrated using a solubilized form of IgM mAb (500 ng / ml). Negative controls for this assay are medium or buffer alone. Another anti-CD3 mA
Crosslinking with B (OKT3) was shown to have no effect.

【０４０３】 細胞周期分析により効果が観察される場合、その細胞をさらに、フローサイト
メトリーのためのＴＵＮＥＬアッセイのために染色するか、または当業者に周知
のアネキシンＶ技術により染色する。If effects are observed by cell cycle analysis, the cells are further stained for a TUNEL assay for flow cytometry or by Annexin V technology well known to those skilled in the art.

【０４０４】 （実施例８：ＣＤ３に誘導される増殖アッセイ） ＣＤ３に誘導される増殖アッセイを、ＰＢＭＣに対して実施し、そして3Ｈ− チミジンの取り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実施する。９
６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルのＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ
、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはアイソタイプ適合コントロールｍＡｂ（ＢＢ３
３．１）を用いて、４℃で、一晩コーティングし（０．０５Ｍ炭酸水素緩衝液、
ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）、次いで、ＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣは、
Ｆ／Ｈ勾配遠心分離により、ヒト末梢血から単離し、そして変動する濃度のＡＩ
Ｍ ＩＩタンパク質の存在下で（総容量２００μｌ）、１０％ＦＣＳおよびＰ／
Ｓ含有ＲＰＭＩ中の、ｍＡｂでコーティングしたプレートの４連のウェル（５×
１０4／ウェル）に添加する。関連タンパク質の緩衝液単独および培地単独は、 コントロールである。３７℃で、４８時間培養後、プレートを２分間、１０００
ｒｐｍでスピンし、そして増殖に対する効果が観察される場合、１００μｌの上
清を取りだし、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で
保存する。ウェルを、０．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培 地で補充し、そして３７℃で、１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そし
て3Ｈ−チミジンの取り込みを増殖の測定値として使用する。抗ＣＤ３単独は、 増殖についてのポジティブコントロールである。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）は
また、増殖を増強するコントロールとして使用される。Ｔ細胞の増殖を誘導しな
いコントロール抗体を、ＣＤ３に誘導される増殖に対するネガティブコントロー
ルとして使用し、培地または緩衝液を、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の効果について
のネガティブコントロールとして使用する。Example 8: CD3-Induced Proliferation Assay A CD3-induced proliferation assay is performed on PBMC and measured by 3 H-thymidine incorporation. This assay is performed as follows. 9
A 6-well plate was prepared with 100 μl / well of mAb against CD3 (HIT3a
Pharmingen) or isotype matched control mAb (BB3
3.1) with 4 ° C. overnight (0.05M bicarbonate buffer,
Wash at pH 9.5, 1 μg / ml), then 3 times with PBS. PBMC is
Isolated from human peripheral blood by F / H gradient centrifugation and varying concentrations of AI
In the presence of MII protein (200 μl total volume), 10% FCS and P /
Quadruplicate wells (5 ×) of mAb-coated plates in S-containing RPMI
10 4 / well). Buffer alone of the relevant protein and medium alone are controls. After culturing at 37 ° C. for 48 hours, the plate was incubated at 1000 ° C. for 2 minutes.
Spin at rpm and if an effect on growth is observed, remove 100 μl of supernatant and store at −20 ° C. for IL-2 (or other cytokine) measurement. The wells are supplemented with 100 μl of medium containing 0.5 μCi of 3 H-thymidine and incubated at 37 ° C. for 18-24 hours. Wells are collected and 3 H-thymidine incorporation is used as a measure of proliferation. Anti-CD3 alone is a positive control for proliferation. IL-2 (100 U / ml) is also used as a control to enhance proliferation. A control antibody that does not induce T cell proliferation is used as a negative control for CD3-induced proliferation, and media or buffer is used as a negative control for the effect of AIM II protein.

【０４０５】 （実施例９：ＭＨＣクラスＩＩの発現に対するＡＩＭ ＩＩの効果、単球由来
ヒト樹状細胞の同時刺激性分子および接着分子ならびに細胞分化） 樹状細胞を、末梢血中に見出される増殖前駆体の増大により生成する：接着Ｐ
ＢＭＣまたは溶出した単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ
−４（２０ｎｇ／ｍｌ）を併って、７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、未成熟細胞の特有の表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。活性因子（例えば、ＴＮＦ−α）の処理
は、表面の表現型に急速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激性分子お
よび接着分子の発現の増加、ＦｃγＲＩＩの下方調節、ＣＤ８３の上方調節）を
生じる。これらの変化は、抗原提示能力の増加および樹状細胞の機能的成熟と相
関する。Example 9: Effect of AIM II on MHC class II expression, costimulatory and adhesion molecules of monocyte-derived human dendritic cells and cell differentiation Dendritic cells are found in peripheral blood Produced by increasing precursor: Adhesion P
BMC or eluted monocyte fractions were purified using GM-CSF (50 ng / ml) and IL
-4 (20 ng / ml) for 7 to 10 days. These dendritic cells have the unique phenotype of immature cells (CD1, CD80, CD86, CD40 and M
HC class II antigen expression). Treatment of activators (eg, TNF-α) causes rapid changes in surface phenotype (MHC class I and II, increased expression of costimulatory and adhesion molecules, downregulation of FcγRII, upregulation of CD83) Is generated. These changes correlate with increased antigen presenting capacity and functional maturation of dendritic cells.

【０４０６】 表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下のように実施する。細胞を、種々の濃度のＡＩ
Ｍ−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）またはポジティブ
コントロールとしてＬＰＳで、１〜３日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭ
アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、１：２０希釈の適切なＦ
ＩＴＣまたはＰＥ標識したモノクローナル抗体と共に、４℃で３０分間インキュ
ベートする。さらなる洗浄後、標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のフローサイトメトリーにより分析する。FACS analysis of surface antigens is performed as follows. Cells can be treated with various concentrations of AI
Treatment with M-II (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) or LPS as a positive control for 1-3 days, 1% BSA and 0.02 mM
Wash with PBS containing sodium azide, then dilute 1:20 with the appropriate F
Incubate with ITC or PE labeled monoclonal antibody for 30 minutes at 4 ° C. After further washing, the labeled cells were washed with FACScan (Becton D).
(Ickinson).

【０４０７】 （サイトカイン産生に対する効果） 樹状細胞により生成されたサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免
疫応答の惹起に重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発
生に強く影響し、そして細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬ
ＩＳＡを使用して、以下のようにＩＬ−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6 ／ｍｌ）を、ＡＩＭ−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）
で、２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）をポジティブコントロール
として細胞培養物に添加する。次いで、細胞培養物からの上清を収集し、そして
市販のＥＬＩＳＡキットを使用してＩＬ−１２含量について分析する。キットと
共に提供される標準的なプロトコールを使用する。(Effects on Cytokine Production) Cytokines generated by dendritic cells, particularly IL-12, are important in eliciting a T cell-dependent immune response. IL-12 strongly influences the development of a Th1 helper T cell immune response and induces cytotoxic T cells and NK cell function. EL
ISA is used to measure IL-12 release as follows. Dendritic cells (10 6 / ml) were converted to AIM-II (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml).
For 24 hours. LPS (100 ng / ml) is added to the cell culture as a positive control. The supernatant from the cell culture is then collected and analyzed for IL-12 content using a commercially available ELISA kit. Use the standard protocol provided with the kit.

【０４０８】 （ＭＨＣクラスＩＩ同時刺激性分子および接着分子の発現の効果） 細胞表面抗原の３つの主要なファミリーが、単球上で同定され得る：接着分子
、抗原提示に関与する分子、およびＦｃレセプター。ＭＨＣクラスＩＩ抗原およ
び他の同時刺激性分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単
球の抗原提示能力およびＴ細胞活性化を誘導する能力における変化を生じ得る。
Ｆｃレセプターの発現増加は、単球の細胞傷害活性、サイトカインの放出、およ
び食作用の改善に相関し得る。Effects of MHC Class II Co-Stimulatory and Adhesion Molecule Expression Three major families of cell surface antigens can be identified on monocytes: adhesion molecules, molecules involved in antigen presentation, and Fc Receptor. Modulation of the expression of MHC class II antigens and other costimulatory molecules (eg, B7 and ICAM-1) can result in changes in the ability of monocytes to present antigen and induce T cell activation.
Increased Fc receptor expression may correlate with improved monocyte cytotoxic activity, cytokine release, and phagocytosis.

【０４０９】 ＦＡＣＳ分析を使用して、以下のように表面抗原を試験する。単球を、種々の
濃度のＡＩＭ−ＩＩ（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）または
ＬＰＳ（ポジティブコントロール）で１〜５日間処理し、１％ＢＳＡおよび０．
０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、１：２０希釈の
適切なＦＩＴＣまたはＰＥ標識したモノクローナル抗体と共に、４℃で３０分間
インキュベートする。さらなる洗浄後、標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のフローサイトメトリーにより分析する。Use FACS analysis to test for surface antigens as follows. Monocytes were treated with various concentrations of AIM-II (0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) or LPS (positive control) for 1-5 days, with 1% BSA and 0.
Wash with PBS containing 02 mM sodium azide, then incubate with the appropriate FITC or PE labeled monoclonal antibody at a 1:20 dilution for 30 minutes at 4 ° C. After a further wash, the labeled cells were washed with FACScan (Bect
on Dickinson).

【０４１０】 （単球生存に対する効果） ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激物の非存在下で培養させた場合、次第
に生存率を減少する。これらの死は、内部的に調節されたプロセス（アポトーシ
ス）から生じる。活性化因子（例えば、ＴＮＦ−α）の培養物への添加は、細胞
生存を劇的に改善し、そしてＤＮＡ断片化を防止する。ヨウ化プロピジウム染色
を使用して、以下のようにアポトーシスを測定する。単球（１０7／ｍｌ）を、 ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ、ポジティブコントロール）またはＡＩＭ−ＩＩ
（０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で
２日間、ＤＭＥＭにおけるポリプロピレンチューブ中の懸濁液で培養する。細胞
の生存率を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により評価する。細胞を、最終濃
度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有するＰＢＳ中で、２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し 、次いで、ＦＡＣＳｃａｎ分析前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩの取
り込みは、ＤＮＡ断片化と相関することが、この実験系列において実証された。Effect on Monocyte Survival Human peripheral blood monocytes gradually decrease viability when cultured in the absence of serum or other stimuli. These deaths result from internally regulated processes (apoptosis). Addition of an activator (eg, TNF-α) to the culture dramatically improves cell survival and prevents DNA fragmentation. Apoptosis is measured using propidium iodide staining as follows. Monocytes (10 7 / ml) were transferred to TNF-α (100 ng / ml, positive control) or AIM-II.
(0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / ml) for 2 days in suspension in polypropylene tubes in DMEM. Cell viability is assessed by propidium iodide (PI) staining. Cells are suspended at a concentration of 2 × 10 6 / ml in PBS containing PI at a final concentration of 5 μg / ml and then incubated for 5 minutes at room temperature before FACScan analysis. PI uptake was demonstrated in this series of experiments to correlate with DNA fragmentation.

【０４１１】 （サイトカイン放出に対する効果） 単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を介する
、免疫系の他の細胞集団に対する、これらの調節活性である。ＩＬ−１β放出を
測定するためのＥＬＩＳＡを、以下のように実施する。ヒト単球を、４８ウェル
プレートに１０6／ｍｌで添加し、そして１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下ま たは非存在下で、種々の濃度のＡＩＭ−ＩＩを添加する（０．１、１、１０、１
００、１０００ｎｇ／ｍｌ）。２４時間のインキュベーション後、上清を収集し
、そしてＥＬＩＳＡキットによりサイトカインの存在をアッセイする。キットと
共に提供される標準的なプロトコルを使用する。Effect on Cytokine Release An important function of monocytes / macrophages is their regulatory activity on other cell populations of the immune system through the release of cytokines after stimulation. An ELISA for measuring IL-1β release is performed as follows. Human monocytes are added to a 48-well plate at 10 6 / ml, and various concentrations of AIM-II in the presence or absence of 100 ng / ml LPS (0.1, 1). , 10, 1
00, 1000 ng / ml). After a 24-hour incubation, the supernatant is collected and assayed for the presence of cytokines by an ELISA kit. Use the standard protocol provided with the kit.

【０４１２】 （実施例１０：Ｎ末端配列分析のための可溶性ＡＩＭ ＩＩのアフィニティー
精製） 先のデータにより、リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）−Ｆｃ融合タン
パク質で誘導されたＢＩＡｃｏｒｅチップは、ＡＩＭ ＩＩ（アミノ酸７４〜２
４０）−Ｆｌａｇ融合タンパク質に特異的に結合し得ることが示された（実施例
５、第Ｅ節および図７Ａを参照のこと）。次いで、いずれの細胞株をＮ−末端配
列分析のためのさらなる精製に使用するべきかを決定するために、ＬＴβＲ Ｂ
ＩＡｃｏｒｅチップを使用して、非Ｆｌａｇタグ化ＡＩＭ ＩＩの安定なトラン
スフェクト体の馴化培地から可溶性のＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現を検出した
。Example 10 Affinity Purification of Soluble AIM II for N-Terminal Sequence Analysis According to the previous data, the BIAcore chip induced with the lymphotoxin β receptor (LTβR) -Fc fusion protein shows that AIM II (amino acids 74 ~ 2
40) -Flag fusion protein was shown to be able to specifically bind (see Example 5, Section E and FIG. 7A). Then, to determine which cell lines should be used for further purification for N-terminal sequence analysis, LTβRB
Using an IAcore chip, the expression of soluble AIM II protein was detected from conditioned media of non-Flag-tagged AIM II stable transfectants.

【０４１３】 ＣＨＯ細胞を、ｃｋ−β８シグナルペプチドに融合させたＡＩＭ ＩＩの細胞
外領域（アミノ酸６０〜２４０）からなる発現構築物（ｐＣ４ベクター）でトラ
ンスフェクトした。クローンを、メトトレキサートを含有する培地中での増殖に
よる高い発現について選択した。ＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅチップに最も多く結
合するクローンをさらに、増幅した。ＣＨＯ１１（高レベルのＡＩＭ ＩＩを産
生するクローン）由来の馴化培地（２０ｍＬ）を得た。完全長のｃＤＮＡをコー
ドする第二のＡＩＭ ＩＩ構築物を、マウスＭＣＡ−３８癌細胞内にトランスフ
ェクトし、そしてＧ４１８での選択に供した。馴化培地を、これらのトランスフ
ェクトさせたＭＣＡ−３８細胞から得た。[0413] CHO cells were transfected with an expression construct (pC4 vector) consisting of the extracellular region of AIM II (amino acids 60-240) fused to the ck-β8 signal peptide. Clones were selected for high expression by growth in media containing methotrexate. Clones that bound the most to the LTβR BIAcore chip were further amplified. Conditioned medium (20 mL) from CHO11 (clone producing high levels of AIM II) was obtained. A second AIM II construct encoding full-length cDNA was transfected into mouse MCA-38 cancer cells and subjected to selection on G418. Conditioned media was obtained from these transfected MCA-38 cells.

【０４１４】 安定なトランスフェクト体である、ＣＨＯ１１細胞またはＭＣＡ−３８細胞由
来の馴化培地を、濾過し、１０，０００×ｇで遠心分離し、次いで、ＭＣＩＦ−
Ｆｃアフィニティーカラム（コントロールカラム）通過させ、続いてＬＴβＲ−
Ｆｃアフィニティーカラム（０．２ｍｌ床容量）を通過させた。カラムを数床カ
ラム容量の０．００５％界面活性剤Ｐ−２０含有ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で
洗浄した。結合したタンパク質を１０ｍＭ ＨＣｌで溶出し（３×０．５ｍＬ画
分）、そして直ちにＴＲＩＳ緩衝液で中和した。ＬＴβＲカラムから溶出された
画分は、ＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅチップに結合したままであったが、コントロ
ールのＭＣＩＦ−Ｆｃカラムから溶出された画分は、結合に対して陰性であった
。溶出された画分を、Ｓｐｅｄｖａｃ中で乾燥し、次いで２０μＬの水に再懸濁
した。溶出されたタンパク質のアリコートを、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによ
り分析し、そして銀染色により検出した。ＣＨＯ−１１細胞株およびＭＣＡ−３
８細胞株由来のＬＴβＲカラムに特異的に結合した、約２５ｋＤａおよび約２１
ｋＤａのバンドを検出した。Ｎ末端配列分析のために、残存する溶出物質を、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＰＶＤＦ膜上にブロットした。[0414] Conditioned medium from stable transfectants, CHO11 cells or MCA-38 cells, was filtered, centrifuged at 10,000 xg, and then MCIF-
After passing through an Fc affinity column (control column), the LTβR-
Passed through an Fc affinity column (0.2 ml bed volume). The column was washed with several column volumes of HEPES-buffered saline containing 0.005% surfactant P-20. Bound proteins were eluted with 10 mM HCl (3 × 0.5 mL fractions) and immediately neutralized with TRIS buffer. The fraction eluted from the LTβR column remained bound to the LTβR BIAcore chip, while the fraction eluted from the control MCIF-Fc column was negative for binding. The eluted fraction was dried in a Speedvac and then resuspended in 20 μL of water. Aliquots of the eluted protein were analyzed by reducing SDS-PAGE gels and detected by silver staining. CHO-11 cell line and MCA-3
About 25 kDa and about 21 kDa specifically bound to LTβR columns from 8 cell lines.
A kDa band was detected. For N-terminal sequence analysis, the remaining eluted material was
It was subjected to DS-PAGE and blotted on a PVDF membrane.

【０４１５】 ＭＣＡ−３８細胞から精製されたＡＩＭ ＩＩ分子のＮ末端は、この分子の推
定細胞外領域内の残基８３で開始する（表３）。ＣＨＯ−１１由来のＡＩＭ Ｉ
Ｉの結果により、このタンパク質がＡＩＭ ＩＩタンパク質と対応することもま
た確認された；このＮ末端は、３残基離れて開始する２つの配列を含み、これら
は残基６０で開始するＡＩＭ ＩＩの細胞外領域が続くｃｋ−β８シグナルペプ
チド内で開始する（表３）。従って、ＡＩＭ ＩＩの天然のプロセシング形態は
、残基８３〜２４０に対応し、そして１７．２８４ダルトンの分子量を有するは
ずである。約２１ｋＤａの見かけの電気泳動移動度は、糖化と一致し、これは、
いくつかの電気泳動種の存在により明らかである。同様に、ＣＨＯ−１１で発現
されたｃｋ−β８／ＡＩＭ ＩＩ融合タンパク質の約２５ｋＤａの見かけの分子
量は、その配列から推定される分子量（２０，３６１）より大きい。再度、この
ことはまた、タンパク質の糖化に起因し得る（全長ＡＩＭ ＩＩの残基１０４に
１つのＮ−グリコシル化部位が存在する）。The N-terminus of the AIM II molecule purified from MCA-38 cells starts at residue 83 in the putative extracellular region of the molecule (Table 3). AIM I from CHO-11
The results of I also confirmed that this protein corresponded to the AIM II protein; its N-terminus contained two sequences that started 3 residues apart, which are those of AIM II starting at residue 60. The extracellular region starts in the ck-β8 signal peptide followed by (Table 3). Thus, the native processed form of AIM II corresponds to residues 83-240 and should have a molecular weight of 17.284 daltons. The apparent electrophoretic mobility of about 21 kDa is consistent with saccharification,
This is evident by the presence of some electrophoretic species. Similarly, the apparent molecular weight of about 25 kDa of the ck-β8 / AIM II fusion protein expressed in CHO-11 is greater than the molecular weight deduced from its sequence (20,361). Again, this may also be due to glycation of the protein (there is one N-glycosylation site at residue 104 of full length AIM II).

【０４１６】[0416]

【表３】 ＭＣＡ−３８ ＡＩＭ ＩＩ馴化培地の、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上で固定化さ
れたＬＴβＲ−Ｆｃに対する結合特異性対ＭＣＩＦ−Ｆｃに対する結合特異性の
Ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍを、図１２に示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプ
ターＦｃ融合タンパク質で誘導された、ＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセル上で分析
した。馴化培地（１００μｌ）を、５μＬ／分でチップ全体に流動し、そしてＨ
ＢＳ緩衝液でまた５μＬ／分で洗浄した。その示されるデータは、固定化された
レセプターに対するＡＩＭ ＩＩの結合後のプロットの正味の結合（オフレイト
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））領域を示し、そして、相対的質量単位（ＲＵ）対時間で
測定した。結合条件は、拡散限界条件下で高レセプターチップ密度で実施した。
リガンド：ＬＴβＲ−ＦｃおよびＭＣＩＦ−Ｆｃとは、それぞれ、ＬＴβＲ−Ｆ
ｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃで固定化されたＢＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合デ
ータをいう。[Table 3] The Sensorgram of the binding specificity of MCA-38 AIM II conditioned medium for LTβR-Fc immobilized on a BIAcore chip versus the binding specificity for MCIF-Fc is shown in FIG. Conditioned media was analyzed on a BIAcore instrument flow cell, induced with a lymphotoxin β receptor Fc fusion protein. Conditioned medium (100 μl) was flowed through the chip at 5 μL / min and H
Washed again with BS buffer at 5 μL / min. The data shown shows the net binding (off-rate) area of the plot following binding of AIM II to the immobilized receptor and was measured in relative mass units (RU) versus time. Binding conditions were performed at high receptor chip density under diffusion-limited conditions.
Ligand: LTβR-Fc and MCIF-Fc are respectively LTβR-F
c or binding data from the surface of the BIAcore chip immobilized with MCIF-Fc.

【０４１７】 ＬＴβＲ−Ｆｃカラムから溶出されたＡＩＭ ＩＩによるＬＴβＲ結合の決定
を図１３に示す。ＬＴβＲおよびＭＣＩＦは、それぞれ、ＬＴβＲ−Ｆｃまたは
ＭＣＩＦ−Ｆｃを固定化したＢＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合データをいう
。ＭＣＡ３８細胞由来の未希釈の馴化培地を、ＭＣＩＦ−Ｆｃ（ＭＣＩＦ後）お
よびＬＴβＲ−Ｆｃ（ＬＴβＲ後）アフィニティーカラムを通過させる、前（プ
レ）および後で分析した。ＬＴβＲ（Ｅ４〜６）およびＭＣＩＦ−Ｆｃ（Ｅ１〜
３）アフィニティーカラムから溶出された画分（１ｍＬ）を、３倍希釈し、そし
てＬＴβＲ ＢＩＡｃｏｒｅチップに対する結合について試験した。The determination of LTβR binding by AIM II eluted from the LTβR-Fc column is shown in FIG. LTβR and MCIF refer to binding data from the surface of a BIAcore chip on which LTβR-Fc or MCIF-Fc is immobilized, respectively. Undiluted conditioned media from MCA38 cells was analyzed before, after (pre) and after passing through MCIF-Fc (after MCIF) and LTβR-Fc (after LTβR) affinity columns. LTβR (E4-6) and MCIF-Fc (E1-
3) Fractions (1 mL) eluted from the affinity column were diluted 3-fold and tested for binding to LTβR BIAcore chips.

【０４１８】 （実施例１１：ラットにおけるアジュバント誘導された関節炎の処置における
ＡＩＭＩＩの効果） 慢性関節リウマチ（ＲＡ）を処置するためのＡＩＭ ＩＩの使用の分析を、ラ
ットにおけるアジュバント誘導された関節炎（ＡＩＡ）モデルの使用を通して実
施する。ＡＩＡは、十分に特徴付けられ、そして再現性のある慢性関節リウマチ
の動物モデルであり、これは、当業者に周知である（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ａｎｎ．
Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．１５：３７９（１９５６）；Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｒｔｈ
ｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２：４４０（１９５９））。ＡＩＭ ＩＩは、このＲ
Ａの動物モデルにおいて観察される骨および軟骨のパンヌスの浸潤を維持するた
めに必要とされる、脈管形成の増加または内皮細胞増殖の増加を阻害することが
予期される。ＬｅｗｉｓラットおよびＢＢラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ
Ｌａｂ，Ｒａｌｅｉｇｈ．Ｎ．Ｃ．およびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ
ｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ．Ｗｏｒｃｅ
ｓｔｅｒ，ＭＡから入手可能）を、これらの実験において、アジュバント誘導関
節炎についての一般株および応答性の株として使用する。Example 11: Effect of AIMII in the treatment of adjuvant-induced arthritis in rats Analysis of the use of AIM II to treat rheumatoid arthritis (RA) was performed using adjuvant-induced arthritis (AIA) in rats. ) Through the use of the model. AIA is a well-characterized and reproducible animal model of rheumatoid arthritis, which is well known to those skilled in the art (Pearson, Ann.
Rheum. Dis. 15: 379 (1956); Pearson et al., Arth.
ritis Rheum. 2: 440 (1959)). AIM II uses this R
It is expected to inhibit the increased angiogenesis or increased endothelial cell proliferation required to maintain bone and cartilage pannus invasion observed in animal models of A. Lewis and BB rats (Charles River
Lab, Raleigh. N. C. And the University o
f Massachusetts Medical Center. Worce
(available from S.T., MA) is used in these experiments as a general and responsive strain for adjuvant-induced arthritis.

【０４１９】 関節炎状態の惹起を、尾の基部内へ０．１ｍｌのアジュバント（５ｍｇ／ｍｌ
）の皮内注射により誘導する。５〜６のラットの群に、０．１〜１．０ｍｇ／ｋ
ｇのＡＩＭ ＩＩまたはビヒクルのいずれかを、アジュバント注射の２０日後に
関節内接種する。この時点で、急性の炎症が最大レベルに達し、そして慢性のパ
ンヌス形成が開始する。パンヌス形成に対するＡＩＭ ＩＩの効果を、基本的に
Ｔａｕｒｏｇおよび共同研究者（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：９６２（１９８
５））に記載のように、以下のアジュバントチャレンジの１５日後、各週１度放
射線学的に分析する。要するに、ラットをエーテルまたは抱水クローラルで麻酔
し、そして両方の後肢を共にＸ線放射するように位置した。Ｘ線フィルムを、骨
膜反応、骨侵食、関節空間の狭小化および破壊についての０〜３のスコアリング
系を使用して、盲目的に試験する。ビヒクルで処理したラットにおいて有意な量
の関節の損傷が存在する場合、この動物を屠殺する。この時点で、組織損傷の相
対度およびこれらの関節に対して誘発されたＡＩＭ ＩＩの治療効果について、
その足を組織学的に評価した。The induction of the arthritic state was achieved by injecting 0.1 ml of adjuvant (5 mg / ml) into the base of the tail.
) Is induced by intradermal injection. In groups of 5-6 rats, 0.1-1.0 mg / k
g of either AIM II or vehicle is intra-articularly inoculated 20 days after adjuvant injection. At this point, acute inflammation has reached a maximum level and chronic pannus formation begins. The effect of AIM II on pannus formation was essentially determined by Taurog and coworkers (J. Exp. Med. 162: 962 (198).
As described in 5)), radiological analysis is performed once a week, 15 days after the following adjuvant challenge. Briefly, rats were anesthetized with ether or chloral hydrate and both hind limbs were positioned to emit X-rays together. X-ray films are blindly tested using a 0-3 scoring system for periosteal response, bone erosion, joint space narrowing and destruction. If there is a significant amount of joint damage in rats treated with vehicle, the animals are sacrificed. At this point, regarding the relative degree of tissue damage and the therapeutic effect of AIM II induced on these joints,
The paws were evaluated histologically.

【０４２０】 最終的に、ＡＩＭ ＩＩおよびビヒクルで処理した動物を、１週間に２度臨床
的評価に供し、プレチスモメーター系および体重を使用して、後足の容量を評価
する。Finally, animals treated with AIM II and vehicle are subjected to clinical evaluation twice weekly to assess hindpaw volume using a plethysmometer system and body weight.

【０４２１】 （実施例１２：マウスにおけるコラーゲン誘導された関節炎の処置におけるＡ
ＩＭ ＩＩの効果） 慢性関節リウマチ（ＲＡ）を処置するためのＡＩＭ ＩＩの使用の分析を、マ
ウスにおけるコラーゲン誘導された自己免疫性関節炎（ＣＩＡ）モデルの使用を
通して実施し得る。ＣＩＡは、十分に特徴付けられ、そして再現性のある別の慢
性関節リウマチの動物モデルであり、これは、当業者に周知である（Ｃｏｕｒｔ
ｅｎａｙら、Ｎａｔｕｒｅ ２８３：６６６（１９８０）；Ｗｏｏｌｅｙら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４：６８８（１９８１）；Ｈｏｌｍｄａｈｌら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １１８：１９３（１９９０））。ＡＩＭ ＩＩは、
アポトーシスを誘導し、そして慢性関節リウマチおよびこのＲＡの自己免疫性動
物モデルの両方おいて観察される骨および軟骨のパンヌスの浸潤を形成するため
に必要とされる、滑膜の細胞増殖を阻害することが予期される。Example 12: A in the treatment of collagen-induced arthritis in mice
Effect of IM II) Analysis of the use of AIM II to treat rheumatoid arthritis (RA) can be performed through the use of a collagen-induced autoimmune arthritis (CIA) model in mice. CIA is another well-characterized and reproducible animal model of rheumatoid arthritis, which is well known to those skilled in the art (Court
Enay et al., Nature 283: 666 (1980); Wooley et al., J.
. Exp. Med. 154: 688 (1981); Holmdahl et al., Imm.
unol. Reviews 118: 193 (1990)). AIM II
Induces apoptosis and inhibits synovial cell proliferation required to form bone and cartilage pannus infiltrates observed in both rheumatoid arthritis and this autoimmune animal model of RA Is expected.

【０４２２】 ＤＢＡ／１ ＬａｃＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏ
ｒ，ＭＥ）から入手可能）を、これらの実験において、コラーゲン誘導関節炎に
ついての最も一般的な感受性株として使用する。DBA / 1 LacJ mice (Jackson Lab (Bar Harbo
r, ME) is used as the most common susceptible strain for collagen-induced arthritis in these experiments.

【０４２３】 関節炎状態の惹起を、尾の基部内へフロイント完全アジュバント中の１ｍｇ／
ｍｌのウシＩＩ型コラーゲン０．１ｍｌの皮内注射により誘導する。３週後、そ
の動物に４０μｇのＬＰＳを注射して、関節炎の発生を促進する。１０のマウス
の群に、０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇのＡＩＭ ＩＩまたはビヒクルのいずれかを
、ＬＰＳの注射の７〜１５日後に、皮内または関節内接種する。この時点で、急
性の炎症が最大レベルに達すると予期され、そして慢性のパンヌス形成が開始す
る。ＡＩＭ ＩＩの関節炎に対する効果をモニターして、そして以下のスコアを
使用して臨床的に分析した：０＝正常、０．５＝指の腫大、１＝足全体の腫大、
２＝変形および３＝強直。ビヒクルで処理したラットの足において有意な量の強
直が生じると決定される場合、この動物を屠殺し、そしてパンヌス形成、軟骨お
よび骨破壊の相対度について、ならびにどのような効果をＡＩＭ ＩＩが、これ
らの関節に対して誘発したかについて、その足を組織学的に評価した。The induction of the arthritic condition was determined by adding 1 mg / in Freund's complete adjuvant into the base of the tail.
Induced by intradermal injection of 0.1 ml of bovine type II collagen in 0.1 ml. Three weeks later, the animals are injected with 40 μg of LPS to promote the development of arthritis. Groups of 10 mice are inoculated intradermally or intra-articularly 7-15 days after LPS injection with either 0.1-1.0 mg / kg of AIM II or vehicle. At this point, acute inflammation is expected to reach maximal levels and chronic pannus formation begins. The effect of AIM II on arthritis was monitored and analyzed clinically using the following scores: 0 = normal, 0.5 = swelling of the finger, 1 = swelling of the entire paw,
2 = deformed and 3 = tonic. If it is determined that a significant amount of tonicity occurs in the paws of rats treated with vehicle, the animals are sacrificed and AIM II determines the relative degree of pannus formation, cartilage and bone destruction, and what effect The paws were evaluated histologically for induction on these joints.

【０４２４】 本発明は、先の説明および実施例において特定に記載される以外にも実施され
得ることが明らかである。It is clear that the present invention can be practiced other than as specifically described in the foregoing description and examples.

【０４２５】 本発明の多くの改変および変更は，上記の教示に照らして可能であり、従って
これらは、添付の特許請求の範囲内である。Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings and, therefore, are within the scope of the appended claims.

【０４２６】 本明細書中で引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術雑誌、実験マニ
ュアル、書籍、または他の文書を含む）の全体の開示は、本明細書に参考として
援用される。The entire disclosure of all publications (including patents, patent applications, journals, experimental manuals, books, or other documents) cited herein is hereby incorporated by reference. You.

【表４】 [Table 4]

【表５】 [Table 5]

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】 図１ＡおよびＢは、ＡＩＭ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１）および推定ア
ミノ酸（配列番号２）の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約２６．４
ｋＤａを有する。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.

【図１Ｂ】 図１ＡおよびＢは、ＡＩＭ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１）および推定ア
ミノ酸（配列番号２）の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約２６．４
ｋＤａを有する。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and 1B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.

【図１Ｃ】 図１ＣおよびＤは、同様に得られた部分ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド（配列番号３８）および推定アミノ酸（配列番号３９）の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequence of a partially obtained AIM II cDNA, respectively.

【図１Ｄ】 図１ＣおよびＤは、同様に得られた部分ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド（配列番号３８）および推定アミノ酸（配列番号３９）の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequences of a similarly obtained partial AIM II cDNA.

【図２Ａ】 図２Ａ、ＢおよびＣは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列
番号３）、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）
、ならびにヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を
示す。FIGS. 2A, B and C show the AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5).
And similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｂ】 図２Ａ、ＢおよびＣは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列
番号３）、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）
、ならびにヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を
示す。FIGS. 2A, B and C show the AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5).
And similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｃ】 図２Ａ、ＢおよびＣは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列
番号３）、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）
、ならびにヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を
示す。FIGS. 2A, B and C show the AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5).
And similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図３Ａ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。FIGS. 3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｂ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｃ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｄ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｅ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｆ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図４Ａ】 図４ＡおよびＢは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するＡＩＭ ＩＩの効果を示す。５，０００ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（丸
）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩ
ＭＩＩ（四角）細胞を、２４ウェルプレートにＩＭＥＭとともに１０％ＦＢＳ（
黒丸、黒四角、または黒三角）または１％ＦＢＳ（白丸、白四角、または白三角
）のいずれかの存在下で、３連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、３日目、５日目、または７日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を２日おきに補給した。図４Ｂは、０．３３％アガロースにお
けるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細胞、お
よびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞のコロニー形成を示す。4A and 4B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.

【図４Ｂ】 図４ＡおよびＢは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するＡＩＭ ＩＩの効果を示す。５，０００ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（丸
）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩ
ＭＩＩ（四角）細胞を、２４ウェルプレートにＩＭＥＭとともに１０％ＦＢＳ（
黒丸、黒四角、または黒三角）または１％ＦＢＳ（白丸、白四角、または白三角
）のいずれかの存在下で、３連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、３日目、５日目、または７日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を２日おきに補給した。図４Ｂは、０．３３％アガロースにお
けるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細胞、お
よびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞のコロニー形成を示す。FIGS. 4A and B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.

【図５Ａ】 図５（Ａ）は、実施例５の材料および方法に記載されるＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ
ＦＡＣＳ分析での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（パネルａ）細胞またはＭＤＡ
−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（パネルｂ）細胞のアポトーシス細胞と比較した、０．
５％血清におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ（パネルｃ）におけるア
ポトーシス細胞の増加を示す。FIG. 5 (A) shows the Annexin-V described in the materials and methods of Example 5.
MDA-MB-231 / WT (panel a) cells or MDA by FACS analysis
-0.2-MB-231 / Neo (panel b) cells compared to apoptotic cells.
Figure 4 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (panel c) in 5% serum.

【図５Ｂ】 図５（Ｂ）は、実施例５の材料および方法に記載されるように、Ｐａｃｌｉｔ
ａｘｅｌ（タキソール）を含むかまたは含まない、１０％および０．５％の血清
における、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細
胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞のＤＮＡフラグメント化アッ
セイを示す。FIG. 5B shows Paclit as described in the materials and methods of Example 5.
of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo and MDA-MB-231 / AIM II cells in 10% and 0.5% serum with or without axel (Taxol) 3 shows a DNA fragmentation assay.

【図６Ａ】 図６（Ａ）は、ヌードマウスにおける異種移植片ヒト乳癌ＭＤＡ−２３１の増
殖に対するＡＩＭ ＩＩの効果の評価を示す。雌胸腺欠損ヌードマウスに、皮下
注射で、親ＭＤＡ−２３ １（ＭＤＡ−２３ １−ＷＴ）またはＡＩＭ ＩＩで
安定にトランスフェクトしたＭＤＡ−２３ １あるいはベクターコントロールｎ
ｅｏ（ｎ＝１０）の１０6細胞を注入した。次いで、マウスに耳標を付け、そし て無作為化した。腫瘍増殖を、盲検様式でカリパーで週に２回評価した。このパ
ネルは、１グループあたり各々１０匹のマウスを有する３つの実験を示す。FIG. 6 (A) shows the evaluation of the effect of AIM II on the growth of xenograft human breast cancer MDA-231 in nude mice. Female athymic nude mice were injected subcutaneously by injection with parental MDA-231 (MDA-231-WT) or AIM II stably transfected MDA-231 or vector control n.
10 6 cells of eo (n = 10) were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice weekly with calipers in a blinded fashion. This panel shows three experiments, each with 10 mice per group.

【図６Ｂ】 図６（Ｂ）は、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ−３８マウス結腸癌
の増殖の阻害に対するＡＩＭ ＩＩ形質導入の効果を示す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスに、皮下注射により親ＭＣ−３８（ＭＣ−３８−ＷＴ）またはＡＩＭ ＩＩ
で安定にトランスフェクトしたＭＣ−３８、あるいはベクターコントロールｎｅ
ｏ（ｎ＝１０）の１０6細胞を注射した。次いで、マウスに耳標を付けそして無 作為化した。腫瘍増殖を、コード化した盲検様式でカリパーで週に２回評価した
。このパネルは、１グループあたり各々１０匹のマウスを有する４つの実験を表
す。FIG. 6 (B) shows the effect of AIM II transduction on inhibiting the growth of MC-38 mouse colon cancer in syngeneic C57BL / 6 mice. Female C57BL / 6 mice were injected subcutaneously with parental MC-38 (MC-38-WT) or AIM II.
MC-38 stably transfected with
o (n = 10) of 10 6 cells were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice a week with calipers in an encoded blinded fashion. This panel represents four experiments, each with 10 mice per group.

【図７Ａ】 図７（Ａ）は、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩプラスミド構築物およびｐＦｌａｇ
−ＡＩＭ ＩＩ形質導入された２９３Ｔ細胞の馴化培地から精製されたポリペプ
チドを示す。FIG. 7 (A) shows the pFlag-AIM II plasmid construct and pFlag.
-Polypeptide purified from conditioned medium of AIM II transduced 293T cells.

【図７Ｂ】 図７（Ｂ）。ＩＦＮγの存在下または非存在下での（パネルａ）またはＩＦＮ
γ単独での（パネルｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態
のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩＭＩＩ）の細胞傷害性。実験は、実施例５の材料および
方法に記載されるように行われた。FIG. 7 (B). (Panel a) or IFN in the presence or absence of IFNγ
Cytotoxicity of recombinant soluble form of AIM II (sAIMII) in MDA-MB-231 cells with gamma alone (panel b). The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.

【図８Ａ】 図８（Ａ）。ＬＴβＲ（Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使用したＦ
ＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
（ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（ＣおよびＧ）、Ｕ９３
Ｔ（ＤおよびＨ）。FIG. 8 (A). F using LTβR (AD) or TR2 (EH) mAb
Cell surface expression of LTβR or TR2 by ACS analysis. MDA-MB-231
(A and E), HT-29 (B and F), MC-3 (C and G), U93
T (D and H).

【図８Ｂ】 図８（Ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパ
ク質単独のＦＡＣＳ結合分析（Ａ）、および可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合
のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｂ）またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｃ
）でのプレインキュベーションによるブロッキング。FIG. 8B. FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (A) and LTβR-Fc fusion protein (B) or TR2-Fc fusion protein (C
Blocking by pre-incubation at).

【図８Ｃ】 図８（Ｃ）。種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面発現を要約す
る。FIG. 8 (C). Summary of LTβR and TR2 surface expression in various cell lines.

【図８Ｄ】 図８（Ｄ）。ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の、ＨＴ−２
９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする効果。細胞を
９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎｇ／ｍｌ）を
５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白丸はＬＴβＲ
−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ２−Ｆｃ融合
タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−ＦｃとｓＬＴγおよ
びＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、そして細胞の
生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。FIG. 8D. HT-2 of an LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein
Effect of blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in 9 cells. Cells are plated in 96-well plates and sAIM II (10 ng / ml) is treated with various amounts of sLTβR-Fc (open circles LTLTR) in the presence of 5 U / ml IFNγ.
-Fc alone, closed circles are LTβR-Fc and IFNγ), or TR2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Cells were incubated for 5 days and cell viability was determined by XTT assay.

【図９】 図９は、ｓＡＩＭ ＩＩ処理ヒトＰＢＬ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を示す。
ヒトＰＢＬ（９６ウェルプレートにおいてウェルあたり５×１０5細胞）を、抗 ＣＤ３ ｍＡｂおよびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）ありまたはなしでｓＡＩＭ Ｉ
Ｉの存在下または非存在下で５日間処理した。次いで、上清を以下の細胞の群か
ら収集した：ｓＡＩＭＩＩの存在下（黒丸）または非存在下（白丸）のＰＢＬ、
あるいはｓＡＩＭＩＩあり（黒三角）またはなし（白三角）での休止ＰＢＬ。ヒ
トＩＦＮγ濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。FIG. 9 shows secretion of IFN-γ by sAIM II-treated human PBL cells.
Human PBLs (5 × 10 5 cells per well in a 96-well plate) were treated with sAIM I with or without anti-CD3 mAb and IL-2 (20 U / ml).
Treated in the presence or absence of I for 5 days. Supernatants were then collected from the following groups of cells: PBL in the presence (closed circle) or absence (open circle) of sAIMII,
Or resting PBL with sAIMII (black triangle) or without (open triangle). Human IFNγ concentration was determined by ELISA.

【図１０】 図１０は、ｐＨＥ４〜５発現ベクター（配列番号５０）およびサブクローン化
ＡＩＭＩＩ ｃＤＮＡコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺
伝子の位置、ＡＩＭＩＩコード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード配
列が示されている。FIG. 10 shows a schematic diagram of the pHE4-5 expression vector (SEQ ID NO: 50) and the subcloned AIMII cDNA coding sequence. The location of the kanamycin resistance marker gene, AIMII coding sequence, oriC sequence, and lacIq coding sequence are indicated.

【図１１】 図１１は、ｐＨＥプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列（配列番
号５１）を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎ
ｏ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびに末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタ
リック）を示す。FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the regulatory element of the pHE promoter (SEQ ID NO: 51). Two lac operator sequences, Shine-Delgarn
o Sequence (S / D) and terminal HindIII and NdeI restriction sites (italics).

【図１２】 図１２は、ＭＣＡ−３８ ＡＩＭ ＩＩ馴化培地の、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上
に固定化したＬＴβＲ−Ｆｃ対ＭＣＩＦ−ＦCへの結合の特異性のセンサーグラ ムを示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプターＦｃ融合タンパク質で誘導
体化したＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセル上で分析した。馴化培地（１００μＬ）
を、５μＬ／分でチップ上に流し、そして同様に５μＬ／分でＨＢＳ緩衝液で洗
浄した。示されたデータは、ＡＩＭＩＩの固定化レセプターへの結合後のプロッ
トの正味の結合した（オフレート）領域を表し、そして相対質量単位（ＲＵ）対
時間で測定されている。結合条件を、拡散限定条件下で高レセプターチップ密度
で行った。説明：ＬＴβＲ−ＦｃおよびＭＣＩＦ−Ｆｃは、それぞれ、ＬＴβＲ
−ＦｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃ固定化ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合データ
を参照する。Figure 12 shows the MCA-38 of AIM II conditioned medium, the sensor gram-binding specificity to LTßR-Fc vs. MCIF-F C immobilized on the BIAcore chip. Conditioned media was analyzed on a BIAcore instrument flow cell derivatized with a lymphotoxin β receptor Fc fusion protein. Conditioned medium (100 μL)
Was run over the chip at 5 μL / min and was also washed with HBS buffer at 5 μL / min. The data shown represent the net bound (off-rate) area of the plot following binding of AIMII to the immobilized receptor and is measured in relative mass units (RU) versus time. Binding conditions were performed at high receptor chip density under diffusion limited conditions. Description: LTβR-Fc and MCIF-Fc, respectively, are LTβR
-Reference binding data from Fc or MCIF-Fc immobilized BIAcore chip surface.

【図１３】 図１３は、ＬＴβＲ−Ｆｃカラムから溶出されたＡＩＭ ＩＩによるＬＴβＲ
結合の決定を示す。結合条件は、図１１に記載するとおりであった。説明：ＬＴ
βＲおよびＭＣＩＦは、それぞれＬＴβＲ−ＦｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃ固定化Ｂ
ＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合データを参照する。ＭＣＡ３８細胞由来の希
釈していない馴化培地を、ＭＣＩＦ−Ｆｃ（ＭＣＩＦ後）およびＬＴβＲ−Ｆｃ
（ＬＴβＲ後）アフィニティーカラムを通過する前（プレ）および後に分析した
。ＬＴβＲ（Ｅ４〜６）およびＭＣＩＦ−Ｆｃ（Ｅ１〜３）アフィニティーカラ
ムから溶出した画分（１ｍＬ）を、３倍に希釈し、そしてＬＴβＲ ＢＩＡｃｏ
ｒｅチップへの結合を試験した。FIG. 13 shows LTβR by AIM II eluted from LTβR-Fc column.
4 shows the determination of binding. The binding conditions were as described in FIG. Description: LT
βR and MCIF were LTβR-Fc or MCIF-Fc immobilized B, respectively.
Reference the binding data from the IAcore chip surface. Undiluted conditioned medium from MCA38 cells was purified using MCIF-Fc (after MCIF) and LTβR-Fc.
Analyzed before (pre) and after passing through the affinity column (after LTβR). The fraction (1 mL) eluted from the LTβR (E4-6) and MCIF-Fc (E1-3) affinity columns was diluted 3-fold, and LTβR BIAco
The binding to the rechip was tested.

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty

【提出日】平成１１年９月１７日（１９９９．９．１７）[Submission date] September 17, 1999 (September 17, 1999)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１３[Correction target item name] 0013

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００１３】 （発明の要旨） 本発明は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列、また
は１９９６年８月２２日にＡＴＣＣ寄託番号９７６８９として寄託されたｃＤＮ
Ａクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明は
また、図１Ｃおよび図１Ｄ（配列番号３９）に示されるアミノ酸配列、または１
９９６年３月１５日にＡＴＣＣ寄託番号９７４８３として寄託されたｃＤＮＡク
ローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1A and FIG. 1B (SEQ ID NO: 2), or the cDN deposited on August 22, 1996 as ATCC accession number 97689.
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence encoded by the A clone. The present invention also relates to the amino acid sequence shown in FIG. 1C and FIG.
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having an amino acid sequence encoded by a cDNA clone deposited on March 15, 996, ATCC Deposit No. 97483.

【手続補正２】[Procedure amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００２５[Correction target item name] 0025

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００２５】 （詳細な説明） 本発明は、クローン化ｃＤＮＡの配列決定によって決定した図１ＡおよびＢに
示されるアミノ酸配列（配列番号２）を有するＡＩＭ ＩＩポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のＡＩＭ
ＩＩタンパク質は、ヒトＴＮＦ−α（配列番号３）、ヒトＴＮＦ−β（配列番
号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、およびヒトＦａｓリガンド（配列
番号６）との配列相同性を共有する（図２Ａ〜Ｆ）。図１ＡおよびＢに示される
ヌクレオチド配列（配列番号１）は、ｃＤＮＡクローンを配列決定することによ
って得られ、これは、１９９６年８月２２日に、アメリカンタイプカルチャーコ
レクション、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ
，ＶＡ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託され、そして受託番号９７６８９
を与えられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プ
ラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれている。
図１ＣおよびＤに示されるヌクレオチド配列を、ｃＤＮＡクローンを配列決定す
ることによって得た。これは、１９９６年３月１５日に、アメリカンタイプカル
チャーコレクション、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａ
ｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託され、そして受託番号９
７４８３を与えられた。DETAILED DESCRIPTION The present invention provides an isolation comprising a polynucleotide encoding an AIM II polypeptide having the amino acid sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) as determined by sequencing of the cloned cDNA. Provided nucleic acid molecules. AIM of the present invention
The II protein shares sequence homology with human TNF-α (SEQ ID NO: 3), human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and human Fas ligand (SEQ ID NO: 6). (FIGS. 2A-F). The nucleotide sequence shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was obtained by sequencing a cDNA clone, which was published on August 22, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Manassas
, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 97689.
Was given. The deposited clone is contained in the pBluescript SK (-) plasmid (Stratagene, La Jolla, CA).
The nucleotide sequences shown in FIGS. 1C and D were obtained by sequencing cDNA clones. This is on March 15, 1996, American Type Culture Collection, 10801, University Blvd. Mana
sass, VA 20110-2209, deposited with the USA and accession number 9
7483 was given.

【手続補正３】[Procedure amendment 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００２７[Correction target item name] 0027

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００２７】 本明細書中に提供される情報を（例えば、図１ＡおよびＢのヌクレオチド配
列）使用して、ＡＩＭ ＩＩポリぺプチドをコードする本発明の核酸分子は、標
準的なクローニング手順およびスクリーニング手順（例えば、開始材料としてｍ
ＲＮＡを使用するｃＤＮＡクローニング手順）を使用して得られ得る。本発明の
例証として、図１ＡおよびＢ（配列番号１）に記載される核酸分子は、ヒトマク
ロファージｏｘ ＬＤＬ（ＨＭＣＣＢ６４）に由来するｃＤＮＡライブラリーに
おいて発見された。この遺伝子はまた、活性化されたＴ細胞（ＨＴ４ＣＣ７２）
に由来するｃＤＮＡライブラリーおいても同定された。図１ＡおよびＢのＡＩＭ
ＩＩ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列（配列番号１）は、２４０アミ
ノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。この
タンパク質は、図１ＡおよびＢのヌクレオチド配列の４９〜５１位の開始コドン
（配列番号１）、図１ＡおよびＢの約６０〜約２４０のアミノ酸残基を含む細胞
外ドメイン（配列番号２）、図１ＡおよびＢの約３７〜約５９のアミノ酸残基を
含む膜貫通ドメイン（配列番号２）、図１ＡおよびＢの約１〜約３６のアミノ酸
残基を含む細胞内ドメイン（配列番号２）を有し、そして推定分子質量は約２６
．４ｋＤａである。図１ＡおよびＢに示されるＡＩＭ ＩＩタンパク質（配列番
号２）は、ヒトＦａｓリガンドのアミノ酸配列に約２７％同一および５１％類似
であり（図２Ａ〜Ｆ）、そしてヒトＴＮＦ−αのアミノ酸配列に約２６％同一お
よび約４７％類似である（図２Ａ〜Ｆ）。ＡＩＭ ＩＩが、ＴＮＦリガンド様分
子に相同であるならば、ＴＮＦリガンド様分子は、二量体として機能する。この
分子は、ホモ二量体としても機能するようである。Using the information provided herein (eg, the nucleotide sequences of FIGS. 1A and B), a nucleic acid molecule of the invention encoding an AIM II polypeptide can be constructed using standard cloning procedures and screening. Procedure (eg, m as starting material)
CDNA cloning procedure using RNA). As an illustration of the present invention, the nucleic acid molecule set forth in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1) was found in a cDNA library derived from human macrophage ox LDL (HMCCB64). This gene also contains activated T cells (HT4CC72)
Was also identified in a cDNA library derived from E. coli. AIM of FIGS. 1A and B
The determined nucleotide sequence of the II cDNA (SEQ ID NO: 1) contains an open reading frame encoding a protein of 240 amino acid residues. This protein comprises an initiation codon at positions 49-51 of the nucleotide sequence of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 1), an extracellular domain comprising from about 60 to about 240 amino acid residues of FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2), The transmembrane domain containing about 37 to about 59 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) and the intracellular domain containing about 1 to about 36 amino acid residues in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) And has an estimated molecular mass of about 26
. 4 kDa. The AIM II protein shown in FIGS. 1A and B (SEQ ID NO: 2) is approximately 27% identical and 51% similar to the amino acid sequence of human Fas ligand (FIGS. 2A-F), and is similar to the amino acid sequence of human TNF-α. About 26% identical and about 47% similar (FIGS. 2A-F). If AIM II is homologous to a TNF ligand-like molecule, the TNF ligand-like molecule functions as a dimer. This molecule also appears to function as a homodimer.

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３６４[Correction target item name] 0364

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０３６４】 （Ｃ．ＡＩＭ ＩＩ発現細胞における増強されたアポトーシス） アネキシン−Ｖ ＦＡＣＳ分析を、ＡＩＭ ＩＩ発現細胞の増殖阻害の潜在的
な機構を調査するために行った。１０％血清の存在下では、３つの細胞株全てに
おいて、２％未満のアポトーシス細胞が存在する。減少した血清（０．５％ＦＢ
Ｓ）における４８時間のインキュベーション後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のア
ポトーシス集団は、３倍（８％まで）の増加を示した。親細胞またはベクターコ
ントロールＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においては、アポトーシスのわずかな増加
があるか、または増加がない（図５Ａ〜Ｃ）。アポトーシスの誘導は、Ｐａｃｌ
ｉｔａｘｅｌ（ｔａｘｏｌ）を用いるかまたは用いない、１０％および０．５％
血清中のＭＤＡ−ＭＢ２３１／ＷＴ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１／Ｎｅｏ細胞、お
よびＭＤＡ−ＭＢ２３１／ＡＩＭＩＩ細胞のＤＮＡフラグメント化アッセイによ
って、さらに確認された。フラグメント化したＤＮＡは、ＡＩＭ ＩＩ発現ＭＤ
Ａ−ＭＢ−２３１細胞において、特に１％血清においてのみ見られた。ＡＩＭ
ＩＩ発現細胞を、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ｔａｘｏｌ）で処理した場合、親細胞
またはベクターコントロール細胞において見られたよりも、ずっとより多くのフ
ラグメント化ＤＮＡが観察された。従って、このデータは、ＡＩＭ ＩＩ発現が
、血清飢餓下、あるいはＩＦＮγまたはタキソールの添加で、ＭＤＡ−ＭＢ−２
３１細胞のアポトーシスの引き金となり得ることを示唆する。C. Enhanced Apoptosis in AIM II Expressing Cells Annexin-V FACS analysis was performed to investigate the potential mechanism of growth inhibition of AIM II expressing cells. In the presence of 10% serum, less than 2% apoptotic cells are present in all three cell lines. Reduced serum (0.5% FB
After 48 hours incubation in S), the apoptotic population of MDA-MB-231 cells showed a 3-fold (up to 8%) increase. There is a slight or no increase in apoptosis in parental cells or vector control MDA-MB-231 cells (FIGS. 5A-C). Apoptosis is induced by Pacl
10% and 0.5% with or without itaxel (taxol)
This was further confirmed by DNA fragmentation assays of MDA-MB231 / WT, MDA-MB231 / Neo, and MDA-MB231 / AIMII cells in serum. The fragmented DNA was used for AIM II-expressed MD.
It was found only in A-MB-231 cells, especially in 1% serum. AIM
When II expressing cells were treated with Paclitaxel (taxol), much more fragmented DNA was observed than was seen in parental or vector control cells. Thus, this data shows that AIM II expression was not elevated under serum starvation, or with the addition of IFNγ or taxol, to MDA-MB-2.
This suggests that it may trigger apoptosis of 31 cells.

【手続補正５】[Procedure amendment 5]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３６８[Correction target item name] 0368

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０３６８】 （Ｅ．可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の発現および細胞傷害性） ＡＩＭ ＩＩタンパク質の活性を研究するために、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の
組換え可溶性形態（ｓＡＩＭ ＩＩ）を構築物ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩで２９
３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。この構築物は
、ＡＩＭ ＩＩの細胞外ドメインをコードするが、ＡＩＭ ＩＩの膜貫通部分を
欠失している（図７Ａ）。単一の２０ｋＤａポリペプチド（ｓＡＩＭ ＩＩ）を
ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩを形質導入した２９３Ｔ細胞の馴化培地から抗Ｆｌａ
ｇモノクローナル抗体で精製し得る。乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖は、
用量依存性様式でこの可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の処理に応答して阻害され
た（図７Ｂ〜Ｃ）。ＩＮＦγの添加（１０μ／ｍｌまたは５０μ／ｍｌ）は、可
溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質の細胞傷害性を劇的に高めた。ＩＦＮγ単独では、
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してほとんど活性を示さなかった（図７Ｂ〜Ｃ）
。これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＴＮＦまたはＩＦＮγ処理のような単一
のサイトカインに耐性であるという先の報告と一致する。E. Expression and Cytotoxicity of Soluble AIM II Protein To study the activity of AIM II protein, a recombinant soluble form of AIM II protein (sAIM II) was prepared using construct pFlag-AIM II with 29
3T cells were generated by transient transfection. This construct encodes the extracellular domain of AIM II, but lacks the transmembrane portion of AIM II (FIG. 7A). A single 20 kDa polypeptide (sAIM II) was isolated from conditioned medium of 293T cells transduced with pFlag-AIM II by anti-Fla.
g monoclonal antibody. The growth of breast cancer MDA-MB-231 cells is
It was inhibited in response to treatment of this soluble AIM II protein in a dose-dependent manner (FIGS. 7B-C). Addition of INFγ (10 μ / ml or 50 μ / ml) dramatically increased the cytotoxicity of soluble AIM II protein. IFNγ alone,
Little activity on MDA-MB-231 cells (FIGS. 7B-C)
. This is consistent with previous reports that MDA-MB-231 cells are resistant to a single cytokine, such as TNF or IFNγ treatment.

【手続補正６】[Procedure amendment 6]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３７１[Correction target item name] 0371

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０３７１】 ＬＴβＲおよびＴＲ２の一連のヒト癌細胞における細胞表面発現を、ＬＴβＲ
またはＴＲ２に対するモノクローナル抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によって調
べた。図８Ａ〜Ｈに示されるように、両方のレセプターが高レベルであることが
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＴ−２９細胞で見いだされたが、その一方でＭＣ
３−１細胞はＴＲ２を発現せず、そしてジャーカット細胞は、ＬＴβＲを発現し
ない。図８Ｌに、試験した全ての細胞株における両方のレセプターの表面発現を
まとめる。レセプターの一方のみを発現する細胞株（例えば、ジャーカットまた
はＭＣ３−１）は、ＡＩＭ ＩＩの細胞傷害性に対して耐性である。まとめると
、これらのデータは、腫瘍細胞におけるＡＩＭ ＩＩ媒介増殖阻害がＬＴβＲお
よびＴＲ２レセプターの両方を必要とし得るが、その一方で、レセプターのうち
の一方のみを発現する細胞は、細胞殺傷を媒介するためには十分ではないことを
示唆する。The cell surface expression of LTβR and TR2 on a series of human cancer cells was
Or by FACS analysis using a monoclonal antibody against TR2. As shown in FIGS. 8A-H, high levels of both receptors were found in MDA-MB-231 and HT-29 cells, while MC
3-1 cells do not express TR2, and Jurkat cells do not express LTβR. FIG. 8L summarizes the surface expression of both receptors in all cell lines tested. Cell lines expressing only one of the receptors (eg, Jurkat or MC3-1) are resistant to AIM II cytotoxicity. Taken together, these data indicate that AIM II-mediated growth inhibition in tumor cells may require both LTβR and TR2 receptors, while cells expressing only one of the receptors mediate cell killing Suggest that it is not enough.

【手続補正７】[Procedure amendment 7]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３７２[Correction target item name] 0372

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０３７２】 ＡＩＭ ＩＩがＬＴβＲおよびＴＲ２レセプター両方についての適切なリガン
ドであり、ならびにＡＩＭ ＩＩ媒介腫瘍細胞増殖阻害における両方のレセプタ
ーに重要であることをさらに実証するために、Ｆｌａｇタグ化ＡＩＭ ＩＩタン
パク質を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞とともにインキュベート
し、次いで、ＦＡＣＳ分析を、抗ＦｌａｇｍＡｂを用いて行った。図８Ｉ〜Ｋに
示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨＴ−２９細胞の、Ｆｌａｇタグ
化可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質との結合は正にシフトする。結合の特異性を、
同じ細胞中で可溶性ＡＩＭ ＩＩ−ｆｌａｇタンパク質とのＬＴβＲ−Ｆｃ融合
タンパク質またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（これは、両方のレセプターの結
合を効果的にブロックした）のプレインキュベーションによってさらに確認した
（図８Ｉ〜Ｋ）。To further demonstrate that AIM II is a suitable ligand for both the LTβR and TR2 receptors, and that it is important for both receptors in AIM II-mediated tumor cell growth inhibition, Flag-tagged AIM II protein was , MDA-MB-231 or HT-29 cells, and then FACS analysis was performed with anti-FlagmAb. As shown in FIGS. 81-K, binding of MDA-MB-231 or HT-29 cells to Flag-tagged soluble AIM II protein is positively shifted. The specificity of the binding
Further confirmation was obtained by preincubation of the LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion protein with the soluble AIM II-flag protein in the same cells, which effectively blocked the binding of both receptors (FIG. 8I-). K).

【手続補正８】[Procedure amendment 8]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３７３[Correction target item name] 0373

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０３７３】 腫瘍細胞に対するＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性におけるＬＴβＲおよびＴＲ２
の両方の改善の重要性は、インビトロ増殖アッセイから得られたデータによって
さらに支持された：ＨＴ−２９のｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性は、用量依存性
様式でＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質の添加
によって無効にされたが、一方で、ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＴＲ２
−Ｆｃ融合タンパク質それ自体は、細胞増殖に対して全く効果を示さなかった（
図８Ｍ）。さらに、同様のアッセイにおいて、ｓＡＩＭ ＩＩはＴＮＦＲの他の
メンバー（例えば、ＴＮＦＲＩ、Ｆａｓ、ＤＲ３またはＤＲ１４）に結合し得な
かった。LTβR and TR2 in AIM II-mediated cytotoxicity against tumor cells
The importance of both improvements was further supported by the data obtained from the in vitro proliferation assay: sAIM II-mediated cytotoxicity of HT-29 was demonstrated in a dose-dependent manner by LTβR-Fc fusion protein or TR2-Fc fusion. The LTβR-Fc fusion protein or TR2
The -Fc fusion protein itself had no effect on cell proliferation (
(FIG. 8M). Furthermore, in a similar assay, sAIM II failed to bind to other members of TNFR (eg, TNFRI, Fas, DR3 or DR14).

【手続補正９】[Procedure amendment 9]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０３７４[Correction target item name] 0374

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【０３７４】 さらに、いくつかのリンパ系細胞株およびＰＢＬを可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパ
ク質に対するこれらの応答性についてスクリーニングした。ＡＩＭ ＩＩの細胞
傷害性は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞（静止またはＣＤ３ ｍＡｂ活性
化のいずれか）、Ｋ５６２細胞、またはＴＩＬ１２００（腫瘍浸潤リンパ球）、
ＰＢＭＣ（新鮮またはＩＬ−２／ＣＤ３ ｍＡｂ活性化）においてみられなかっ
た（図８Ｌ）。対照的に、ＰＢＬのｓＡＩＭ ＩＩでの処理は、ＩＦＮγの放出
によって実証されるように、ＴＲ２発現Ｔ細胞の活性化を生じる（図９）。In addition, several lymphoid cell lines and PBLs were screened for their responsiveness to soluble AIM II protein. The cytotoxicity of AIM II can be measured in Jurkat cells (either resting or CD3 mAb activated), K562 cells, or TIL1200 (tumor infiltrating lymphocytes),
It was not found in PBMC (fresh or IL-2 / CD3 mAb activation) (FIG. 8L). In contrast, treatment of PBL with sAIM II results in activation of TR2-expressing T cells, as demonstrated by the release of IFNγ (FIG. 9).

【手続補正１０】[Procedure amendment 10]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】図面の簡単な説明[Correction target item name] Brief description of drawings

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１Ａ】 図１ＡおよびＢは、ＡＩＭ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１）および推定ア
ミノ酸（配列番号２）の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約２６．４
ｋＤａを有する。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.

【図１Ｂ】 図１ＡおよびＢは、ＡＩＭ ＩＩのヌクレオチド（配列番号１）および推定ア
ミノ酸（配列番号２）の配列を示す。このタンパク質は、推定分子量約２６．４
ｋＤａを有する。ＡＩＭ ＩＩタンパク質の推定膜貫通ドメインに下線を付して
ある。1A and 1B show the nucleotide (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 2) sequences of AIM II. This protein has an estimated molecular weight of about 26.4.
has a kDa. The putative transmembrane domain of the AIM II protein is underlined.

【図１Ｃ】 図１ＣおよびＤは、同様に得られた部分ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド（配列番号３８）および推定アミノ酸（配列番号３９）の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequence of a partially obtained AIM II cDNA, respectively.

【図１Ｄ】 図１ＣおよびＤは、同様に得られた部分ＡＩＭ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチ
ド（配列番号３８）および推定アミノ酸（配列番号３９）の配列を示す。1C and 1D show the nucleotide (SEQ ID NO: 38) and deduced amino acid (SEQ ID NO: 39) sequences of a similarly obtained partial AIM II cDNA.

【図２Ａ】 図２Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）
、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならび
にヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｂ】 図２Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）
、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならび
にヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｃ】 図２Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）
、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならび
にヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｄ】 図２Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）
、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならび
にヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｅ】 図２Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）
、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならび
にヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図２Ｆ】 図２Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩタンパク質およびヒトＴＮＦ−α（配列番号３）
、ヒトＴＮＦ−β（配列番号４）、ヒトリンホトキシン（配列番号５）、ならび
にヒトＦａｓリガンド（配列番号６）のアミノ酸配列間の類似の領域を示す。FIGS. 2A-F show AIM II protein and human TNF-α (SEQ ID NO: 3).
, Human TNF-β (SEQ ID NO: 4), human lymphotoxin (SEQ ID NO: 5), and similar regions between the amino acid sequences of human Fas ligand (SEQ ID NO: 6).

【図３Ａ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。FIGS. 3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｂ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｃ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｄ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｅ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図３Ｆ】 図３Ａ〜Ｆは、ＡＩＭ ＩＩアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、お
よびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数
および表面確率が示されている。「抗原性指数−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グ
ラフにおいて、図１ＡおよびＢ（配列番号２）の約アミノ酸残基１３〜２０、２
３〜３６、６９〜７９、８５〜９４、１６７〜１７８、１８４〜１９６、２２１
〜２３３は、ＡＩＭ ＩＩタンパク質の示された高い抗原性の領域に対応する。3A-F show analysis of AIM II amino acid sequence. α, β, turn, and coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions; antigenic index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph, about amino acid residues 13-20, 2 of FIGS.
3-36, 69-79, 85-94, 167-178, 184-196, 221
233 corresponds to the indicated highly antigenic region of the AIM II protein.

【図４Ａ】 図４ＡおよびＢは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するＡＩＭ ＩＩの効果を示す。５，０００ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（丸
）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩ
ＭＩＩ（四角）細胞を、２４ウェルプレートにＩＭＥＭとともに１０％ＦＢＳ（
黒丸、黒四角、または黒三角）または１％ＦＢＳ（白丸、白四角、または白三角
）のいずれかの存在下で、３連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、３日目、５日目、または７日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を２日おきに補給した。図４Ｂは、０．３３％アガロースにお
けるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細胞、お
よびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞のコロニー形成を示す。4A and 4B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.

【図４Ｂ】 図４ＡおよびＢは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のインビトロ増殖に対
するＡＩＭ ＩＩの効果を示す。５，０００ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（丸
）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩ
ＭＩＩ（四角）細胞を、２４ウェルプレートにＩＭＥＭとともに１０％ＦＢＳ（
黒丸、黒四角、または黒三角）または１％ＦＢＳ（白丸、白四角、または白三角
）のいずれかの存在下で、３連でプレートした。生細胞の数を、トリパンブルー
排除法により、３日目、５日目、または７日目に決定した。この時間経過の間、
細胞に新鮮な培地を２日おきに補給した。図４Ｂは、０．３３％アガロースにお
けるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ細胞、お
よびＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ細胞のコロニー形成を示す。FIGS. 4A and B show the effect of AIM II on the in vitro growth of MDA-MB-231 human breast cancer cells. 5,000 MDA-MB-231 / WT (circle), MDA-MB-231 / Neo (triangle) or MDA-MB-231 / AI
MII (square) cells were placed in a 24-well plate with 10% FBS (IMEM).
Triplicates were plated in the presence of either solid circles, solid squares, or solid triangles or 1% FBS (open circles, open squares, or open triangles). The number of viable cells was determined on day 3, 5, or 7 by trypan blue exclusion. During this time,
Cells were supplemented with fresh medium every other day. FIG. 4B shows colony formation of MDA-MB-231 / WT, MDA-MB-231 / Neo, and MDA-MB-231 / AIM II cells on 0.33% agarose.

【図５Ａ】 図５Ａ〜Ｃは、実施例５の材料および方法に記載されるＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ
ＦＡＣＳ分析での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（図５Ａ）細胞またはＭＤＡ−
ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（図５Ｂ）細胞のアポトーシス細胞と比較した、０．５％
血清におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ（図５Ｃ）におけるアポトー
シス細胞の増加を示す。5A-C show Annexin-V described in the materials and methods of Example 5. FIG.
MDA-MB-231 / WT (FIG. 5A) cells or MDA-
0.5% of MB-231 / Neo (FIG. 5B) cells compared to apoptotic cells
Figure 5 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (Figure 5C) in serum.

【図５Ｂ】 図５Ａ〜Ｃは、実施例５の材料および方法に記載されるＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ
ＦＡＣＳ分析での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（図５Ａ）細胞またはＭＤＡ−
ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（図５Ｂ）細胞のアポトーシス細胞と比較した、０．５％
血清におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ（図５Ｃ）におけるアポトー
シス細胞の増加を示す。5A-C show Annexin-V described in Example 5 Materials and Methods.
MDA-MB-231 / WT (FIG. 5A) cells or MDA-
0.5% of MB-231 / Neo (FIG. 5B) cells compared to apoptotic cells
Figure 5 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (Figure 5C) in serum.

【図５Ｃ】 図５Ａ〜Ｃは、実施例５の材料および方法に記載されるＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ
ＦＡＣＳ分析での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＷＴ（図５Ａ）細胞またはＭＤＡ−
ＭＢ−２３１／Ｎｅｏ（図５Ｂ）細胞のアポトーシス細胞と比較した、０．５％
血清におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＩＭ ＩＩ（図５Ｃ）におけるアポトー
シス細胞の増加を示す。5A-C show Annexin-V described in Example 5 Materials and Methods.
MDA-MB-231 / WT (FIG. 5A) cells or MDA-
0.5% of MB-231 / Neo (FIG. 5B) cells compared to apoptotic cells
Figure 5 shows the increase of apoptotic cells in MDA-MB-231 / AIM II (Figure 5C) in serum.

【図６Ａ】 図６（Ａ）は、ヌードマウスにおける異種移植片ヒト乳癌ＭＤＡ−２３１の増
殖に対するＡＩＭ ＩＩの効果の評価を示す。雌胸腺欠損ヌードマウスに、皮下
注射で、親ＭＤＡ−２３ １（ＭＤＡ−２３ １−ＷＴ）またはＡＩＭ ＩＩで
安定にトランスフェクトしたＭＤＡ−２３ １あるいはベクターコントロールｎ
ｅｏ（ｎ＝１０）の１０6細胞を注入した。次いで、マウスに耳標を付け、そし て無作為化した。腫瘍増殖を、盲検様式でカリパーで週に２回評価した。このパ
ネルは、１グループあたり各々１０匹のマウスを有する３つの実験を示す。FIG. 6 (A) shows the evaluation of the effect of AIM II on the growth of xenograft human breast cancer MDA-231 in nude mice. Female athymic nude mice were injected subcutaneously by injection with parental MDA-231 (MDA-231-WT) or AIM II stably transfected MDA-231 or vector control n.
10 6 cells of eo (n = 10) were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice weekly with calipers in a blinded fashion. This panel shows three experiments, each with 10 mice per group.

【図６Ｂ】 図６（Ｂ）は、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ−３８マウス結腸癌
の増殖の阻害に対するＡＩＭ ＩＩ形質導入の効果を示す。雌Ｃ５７ＢＬ／６マ
ウスに、皮下注射により親ＭＣ−３８（ＭＣ−３８−ＷＴ）またはＡＩＭ ＩＩ
で安定にトランスフェクトしたＭＣ−３８、あるいはベクターコントロールｎｅ
ｏ（ｎ＝１０）の１０6細胞を注射した。次いで、マウスに耳標を付けそして無 作為化した。腫瘍増殖を、コード化した盲検様式でカリパーで週に２回評価した
。このパネルは、１グループあたり各々１０匹のマウスを有する４つの実験を表
す。FIG. 6 (B) shows the effect of AIM II transduction on inhibiting the growth of MC-38 mouse colon cancer in syngeneic C57BL / 6 mice. Female C57BL / 6 mice were injected subcutaneously with parental MC-38 (MC-38-WT) or AIM II.
MC-38 stably transfected with
o (n = 10) of 10 6 cells were injected. The mice were then earmarked and randomized. Tumor growth was assessed twice a week with calipers in an encoded blinded fashion. This panel represents four experiments, each with 10 mice per group.

【図７Ａ】 図７は、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩプラスミド構築物を示す（図７Ａ）。ＩＦ
Ｎγの存在下または非存在下での（図７Ｂ）またはＩＦＮγ単独での（図７Ｃ）
、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩ
ＭＩＩ）の細胞傷害性。実験は、実施例５の材料および方法に記載されるように
行われた。FIG. 7 shows the pFlag-AIM II plasmid construct (FIG. 7A). IF
With or without Nγ (FIG. 7B) or with IFNγ alone (FIG. 7C).
AIM II (sAI) in recombinant soluble form in MDA-MB-231 cells
MII) cytotoxicity. The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.

【図７Ｂ】 図７は、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩプラスミド構築物を示す（図７Ａ）。ＩＦ
Ｎγの存在下または非存在下での（図７Ｂ）またはＩＦＮγ単独での（図７Ｃ）
、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩ
ＭＩＩ）の細胞傷害性。実験は、実施例５の材料および方法に記載されるように
行われた。FIG. 7 shows the pFlag-AIM II plasmid construct (FIG. 7A). IF
With or without Nγ (FIG. 7B) or with IFNγ alone (FIG. 7C).
AIM II (sAI) in recombinant soluble form in MDA-MB-231 cells
MII) cytotoxicity. The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.

【図７Ｃ】 図７は、ｐＦｌａｇ−ＡＩＭ ＩＩプラスミド構築物を示す（図７Ａ）。ＩＦ
Ｎγの存在下または非存在下での（図７Ｂ）またはＩＦＮγ単独での（図７Ｃ）
、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における組換え可溶性形態のＡＩＭ ＩＩ（ｓＡＩ
ＭＩＩ）の細胞傷害性。実験は、実施例５の材料および方法に記載されるように
行われた。FIG. 7 shows the pFlag-AIM II plasmid construct (FIG. 7A). IF
With or without Nγ (FIG. 7B) or with IFNγ alone (FIG. 7C).
AIM II (sAI) in recombinant soluble form in MDA-MB-231 cells
MII) cytotoxicity. The experiments were performed as described in the materials and methods of Example 5.

【図８Ａ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｂ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｃ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A-8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｄ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｅ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｆ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A to 8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｇ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A-8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｈ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A-M. FIG. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｉ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。FIGS. 8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｊ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A to 8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｋ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A-8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｌ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A to 8M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図８Ｍ】 図８Ａ〜Ｍ。ＬＴβＲ（図８Ａ〜Ｄ）またはＴＲ２（図８Ｅ〜Ｈ）ｍＡｂを使
用したＦＡＣＳ分析によるＬＴβＲまたはＴＲ２の細胞表面発現。ＭＤＡ−ＭＢ
−２３１（図８ＡおよびＥ）、ＨＴ−２９（図８ＢおよびＦ）、ＭＣ−３（図８
ＣおよびＧ）、Ｕ９３Ｔ（図８ＤおよびＨ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけ
る、可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質単独のＦＡＣＳ結合分析（図８Ｉ）、および
可溶性ＡＩＭ ＩＩタンパク質結合のＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｊ）
またはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（図８Ｋ）でのプレインキュベーションによ
るブロッキング。図８Ｌは、種々の細胞株におけるＬＴβＲおよびＴＲ２の表面
発現を要約する。（図８Ｍ）ＬＴβＲ−ＦｃまたはＴＲ２−Ｆｃ融合タンパク質
の、ＨＴ−２９細胞におけるｓＡＩＭ ＩＩ媒介細胞傷害性をブロッキングする
効果。細胞を９６ウェルプレートにプレートし、そしてｓＡＩＭ ＩＩ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を５Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの存在下で様々な量のｓＬＴβＲ−Ｆｃ（白
丸はＬＴβＲ−Ｆｃ単独、黒丸はＬＴβＲ−ＦｃおよびＩＦＮγ）、またはＴＲ
２−Ｆｃ融合タンパク質（白三角はＴＲ−２Ｆｃ単独、黒三角はＴＲ２−Ｆｃと
ｓＬＴγおよびＩＦＮγ）とともに添加した。細胞を５日間インキュベートし、
そして細胞の生存度をＸＴＴアッセイによって決定した。8A-M. Cell surface expression of LTβR or TR2 by FACS analysis using LTβR (FIGS. 8A-D) or TR2 (FIGS. 8E-H) mAbs. MDA-MB
-231 (Figs. 8A and 8E), HT-29 (Figs. 8B and F), MC-3 (Fig.
C and G), U93T (FIGS. 8D and H). FACS binding analysis of soluble AIM II protein alone in MDA-MB-231 cells (FIG. 8I) and LTβR-Fc fusion protein of soluble AIM II protein binding (FIG. 8J).
Or blocking by preincubation with TR2-Fc fusion protein (FIG. 8K). FIG. 8L summarizes the surface expression of LTβR and TR2 in various cell lines. (FIG. 8M) Effect of LTβR-Fc or TR2-Fc fusion protein blocking sAIM II-mediated cytotoxicity in HT-29 cells. Cells are plated in 96 well plates and sAIM II (10n
g / ml) and various amounts of sLTβR-Fc (open circles are LTβR-Fc alone, solid circles are LTβR-Fc and IFNγ) in the presence of 5 U / ml IFNγ, or TR
It was added together with a 2-Fc fusion protein (open triangles are TR-2Fc alone, closed triangles are TR2-Fc and sLTγ and IFNγ). Incubate the cells for 5 days,
The cell viability was then determined by the XTT assay.

【図９】 図９は、ｓＡＩＭ ＩＩ処理ヒトＰＢＬ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を示す。
ヒトＰＢＬ（９６ウェルプレートにおいてウェルあたり５×１０5細胞）を、抗 ＣＤ３ ｍＡｂおよびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）ありまたはなしでｓＡＩＭ Ｉ
Ｉの存在下または非存在下で５日間処理した。次いで、上清を以下の細胞の群か
ら収集した：ｓＡＩＭＩＩの存在下（黒丸）または非存在下（白丸）のＰＢＬ、
あるいはｓＡＩＭＩＩあり（黒三角）またはなし（白三角）での休止ＰＢＬ。ヒ
トＩＦＮγ濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。FIG. 9 shows secretion of IFN-γ by sAIM II-treated human PBL cells.
Human PBLs (5 × 10 5 cells per well in a 96-well plate) were treated with sAIM I with or without anti-CD3 mAb and IL-2 (20 U / ml).
Treated in the presence or absence of I for 5 days. Supernatants were then collected from the following groups of cells: PBL in the presence (closed circle) or absence (open circle) of sAIMII,
Or resting PBL with sAIMII (black triangle) or without (open triangle). Human IFNγ concentration was determined by ELISA.

【図１０】 図１０は、ｐＨＥ４〜５発現ベクター（配列番号５０）およびサブクローン化
ＡＩＭＩＩ ｃＤＮＡコード配列の模式図を示す。カナマイシン耐性マーカー遺
伝子の位置、ＡＩＭＩＩコード配列、ｏｒｉＣ配列、およびｌａｃＩｑコード配
列が示されている。FIG. 10 shows a schematic diagram of the pHE4-5 expression vector (SEQ ID NO: 50) and the subcloned AIMII cDNA coding sequence. The location of the kanamycin resistance marker gene, AIMII coding sequence, oriC sequence, and lacIq coding sequence are indicated.

【図１１】 図１１は、ｐＨＥプロモーターの調節エレメントのヌクレオチド配列（配列番
号５１）を示す。２つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎ
ｏ配列（Ｓ／Ｄ）、ならびに末端ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位（イタ
リック）を示す。FIG. 11 shows the nucleotide sequence of the regulatory element of the pHE promoter (SEQ ID NO: 51). Two lac operator sequences, Shine-Delgarn
o Sequence (S / D) and terminal HindIII and NdeI restriction sites (italics).

【図１２】 図１２は、ＭＣＡ−３８ ＡＩＭ ＩＩ馴化培地の、ＢＩＡｃｏｒｅチップ上
に固定化したＬＴβＲ−Ｆｃ対ＭＣＩＦ−ＦCへの結合の特異性のセンサーグラ ムを示す。馴化培地を、リンホトキシンβレセプターＦｃ融合タンパク質で誘導
体化したＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセル上で分析した。馴化培地（１００μＬ）
を、５μＬ／分でチップ上に流し、そして同様に５μＬ／分でＨＢＳ緩衝液で洗
浄した。示されたデータは、ＡＩＭＩＩの固定化レセプターへの結合後のプロッ
トの正味の結合した（オフレート）領域を表し、そして相対質量単位（ＲＵ）対
時間で測定されている。結合条件を、拡散限定条件下で高レセプターチップ密度
で行った。説明：ＬＴβＲ−ＦｃおよびＭＣＩＦ−Ｆｃは、それぞれ、ＬＴβＲ
−ＦｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃ固定化ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合データ
を参照する。Figure 12 shows the MCA-38 of AIM II conditioned medium, the sensor gram-binding specificity to LTßR-Fc vs. MCIF-F C immobilized on the BIAcore chip. Conditioned media was analyzed on a BIAcore instrument flow cell derivatized with a lymphotoxin β receptor Fc fusion protein. Conditioned medium (100 μL)
Was run over the chip at 5 μL / min and was also washed with HBS buffer at 5 μL / min. The data shown represent the net bound (off-rate) area of the plot following binding of AIMII to the immobilized receptor and is measured in relative mass units (RU) versus time. Binding conditions were performed at high receptor chip density under diffusion limited conditions. Description: LTβR-Fc and MCIF-Fc, respectively, are LTβR
-Reference binding data from Fc or MCIF-Fc immobilized BIAcore chip surface.

【図１３】 図１３は、ＬＴβＲ−Ｆｃカラムから溶出されたＡＩＭ ＩＩによるＬＴβＲ
結合の決定を示す。結合条件は、図１１に記載するとおりであった。説明：ＬＴ
βＲおよびＭＣＩＦは、それぞれＬＴβＲ−ＦｃまたはＭＣＩＦ−Ｆｃ固定化Ｂ
ＩＡｃｏｒｅチップ表面からの結合データを参照する。ＭＣＡ３８細胞由来の希
釈していない馴化培地を、ＭＣＩＦ−Ｆｃ（ＭＣＩＦ後）およびＬＴβＲ−Ｆｃ
（ＬＴβＲ後）アフィニティーカラムを通過する前（プレ）および後に分析した
。ＬＴβＲ（Ｅ４〜６）およびＭＣＩＦ−Ｆｃ（Ｅ１〜３）アフィニティーカラ
ムから溶出した画分（１ｍＬ）を、３倍に希釈し、そしてＬＴβＲ ＢＩＡｃｏ
ｒｅチップへの結合を試験した。FIG. 13 shows LTβR by AIM II eluted from LTβR-Fc column.
4 shows the determination of binding. The binding conditions were as described in FIG. Description: LT
βR and MCIF were LTβR-Fc or MCIF-Fc immobilized B, respectively.
Reference the binding data from the IAcore chip surface. Undiluted conditioned medium from MCA38 cells was purified using MCIF-Fc (after MCIF) and LTβR-Fc.
Analyzed before (pre) and after passing through the affinity column (after LTβR). The fraction (1 mL) eluted from the LTβR (E4-6) and MCIF-Fc (E1-3) affinity columns was diluted 3-fold, and LTβR BIAco
The binding to the rechip was tested.

【手続補正１１】[Procedure amendment 11]

【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing

【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All figures

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【図１Ａ】 FIG. 1A

【図１Ｂ】 FIG. 1B

【図１Ｃ】 FIG. 1C

【図１Ｄ】 FIG. 1D

【図２Ａ】 FIG. 2A

【図２Ｂ】 FIG. 2B

【図２Ｃ】 FIG. 2C

【図２Ｄ】 FIG. 2D

【図２Ｅ】 FIG. 2E

【図２Ｆ】 FIG. 2F

【図３Ａ】 FIG. 3A

【図３Ｂ】 FIG. 3B

【図３Ｃ】 FIG. 3C

【図３Ｄ】 FIG. 3D

【図３Ｅ】 FIG. 3E

【図３Ｆ】 FIG. 3F

【図４Ａ】 FIG. 4A

【図４Ｂ】 FIG. 4B

【図５Ａ】 FIG. 5A

【図５Ｂ】 FIG. 5B

【図５Ｃ】 FIG. 5C

【図６Ａ】 FIG. 6A

【図６Ｂ】 FIG. 6B

【図７Ａ】 FIG. 7A

【図７Ｂ】 FIG. 7B

【図７Ｃ】 FIG. 7C

【図８Ａ】 FIG. 8A

【図８Ｂ】 FIG. 8B

【図８Ｃ】 FIG. 8C

【図８Ｄ】 FIG. 8D

【図８Ｅ】 FIG. 8E

【図８Ｆ】 FIG. 8F

【図８Ｇ】 FIG. 8G

【図８Ｈ】 FIG. 8H

【図８Ｉ】 FIG. 8I

【図８Ｊ】 FIG. 8J

【図８Ｋ】 FIG. 8K

【図８Ｌ】 FIG. 8L

【図８Ｍ】 FIG. 8M

【図９】 FIG. 9

【図１０】 FIG. 10

【図１１】 FIG. 11

【図１２】 FIG.

【図１３】 FIG. 13

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 16/28 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ユ， ガオ−リャン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレー， グラバット ドライブ 242 (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルニー， ヘリテッジ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ザン， ジュン アメリカ合衆国 メリーランド 20817， ベセスダ， クレストベリー プレイス 10100 (72)発明者 ウールリッチ， スティーブン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， ラムズ ヘッド コート 4713 (72)発明者 ザイ， イーファン アメリカ合衆国 メリーランド 20879， ゲイサーズバーグ， ロイヤル ウッズ コート 10330──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 37/00 C07K 16/28 C07K 14/705 C12Q 1/68 A 16/28 G01N 33/50 PC12 / 68 33/68 G01N 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/68 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, A , AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (71) Applicant 9410 Key West Avenue, Rockville, Maryland 20850, United States of America (72) Inventor Yu, Gao-Liang United States of America 94705, Berkeley, Gravatt Drive 242 (72) Inventor -Ben, Stephen M. United States Maryland 20832, Olney, Heritage Hills Drive 18528 (72) Inventor Zan, Jun United States Maryland 20817, Bethesda, Crestbury Place 10100 (72) Inventor Ulrich, Steven United States Maryland 20853, Rockville, Rams Head Court 4713 (72) Inventor Zai, Efan United States Maryland 20879, Gaithersburg, Royal Woods Court 10330

Claims (31)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）以下： 配列番号２における、 【化１】 からなる群から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列、 （ｂ）以下： 配列番号２における、 【化２】 からなる群から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオ
チド配列； からなる群から選択されるヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一性である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子。1. An isolated nucleic acid molecule comprising: (a) the following: in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid selected from the group consisting of: (b) the following: in SEQ ID NO: 2, A nucleotide sequence encoding a polypeptide having an amino acid selected from the group consisting of: (c) a nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences of (a) or (b); a nucleotide sequence selected from the group consisting of: An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence that is at least 95% identical. 【請求項２】 （ａ）である、請求項１に記載の単離された核酸分子。2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, which is (a). 【請求項３】 （ｂ）である、請求項１に記載の単離された核酸分子。3. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, which is (b). 【請求項４】 ＤＮＡである、請求項１に記載の単離された核酸分子。4. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, which is a DNA. 【請求項５】 異種ポリヌクレオチドに融合された、請求項１に記載の単離
された核酸分子。5. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, fused to a heterologous polynucleotide. 【請求項６】 前記異種ポリヌクレオチドが、異種ポリペプチドをコードす
る、請求項５に記載の単離された核酸分子。6. The isolated nucleic acid molecule of claim 5, wherein said heterologous polynucleotide encodes a heterologous polypeptide. 【請求項７】 配列番号２のＡＩＭ ＩＩポリペプチドのエピトープ保有部
分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離
された核酸分子。7. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of the AIM II polypeptide of SEQ ID NO: 2. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を、ベクターに挿入す
る工程を包含する、ベクターを作製するための方法。8. A method for producing a vector, comprising a step of inserting the isolated nucleic acid molecule according to claim 1 into the vector. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって生成される、ベクター。9. A vector produced by the method of claim 8. 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を包
含する、宿主細胞を作製する方法。10. A method for producing a host cell, comprising a step of introducing the vector according to claim 9 into the host cell. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法によって生成された、宿主細胞。11. A host cell produced by the method of claim 10. 【請求項１２】 ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを生成するための方法であって
、該方法が、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項９に記載の宿主
細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。12. A method for producing an AIM II polypeptide, said method comprising culturing the host cell of claim 9 under conditions such that said polypeptide is expressed. A method comprising recovering the polypeptide. 【請求項１３】 単離されたＡＩＭポリペプチドのＮ末端欠失変異体または
Ｃ末端欠失変異体であって、以下： （ａ）以下： 配列番号２における、 【化３】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｂ）以下： 配列番号２における、 【化４】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド； （ｃ）該Ｎ末端に（ａ）およびメチオニン残基のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド； （ｄ）該Ｎ末端に（ｂ）およびメチオニン残基のアミノ酸配列を有するポリペ
プチド； （ｅ）１つ以上のアミノ酸置換を除いて、（ａ）のアミノ酸配列を有する置換
変異体であって；ここで該変異体のアミノ酸配列が（ａ）の該アミノ酸配列に対
して少なくとも９５％同一である、置換変異体；および （ｆ）１つ以上のアミノ酸置換を除いて、（ｂ）のアミノ酸配列を有する置換
変異体であって、；ここで該変異体のアミノ酸配列が（ｂ）の該アミノ酸配列に
対して少なくとも９５％同一である、置換変異体、 からなる群から選択されるポリペプチドからなる、欠失変異体。13. An isolated N-terminal or C-terminal deletion mutant of an AIM polypeptide, comprising: (a) the following: in SEQ ID NO: 2, A polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: (b) the following: in SEQ ID NO: 2, A polypeptide having an amino acid sequence of (a) and a methionine residue at the N-terminus; and (d) a polypeptide having an amino acid sequence of a methionine residue at the N-terminus. (E) a substitution variant having the amino acid sequence of (a), except for one or more amino acid substitutions, wherein the amino acid sequence of the variant is the amino acid sequence of (a). A substitution variant that is at least 95% identical to the amino acid sequence; and (f) a substitution variant having the amino acid sequence of (b), except for one or more amino acid substitutions, wherein the variant A substitution variant, wherein the amino acid sequence of the derivative is at least 95% identical to the amino acid sequence of (b). 【請求項１４】 （ａ）である、請求項１３に記載の欠失変異体。14. The deletion mutant according to claim 13, which is (a). 【請求項１５】 （ｂ）である、請求項１３に記載の欠失変異体。15. The deletion mutant according to claim 13, which is (b). 【請求項１６】 （ｃ）である、請求項１３に記載の欠失変異体。16. The deletion mutant according to claim 13, which is (c). 【請求項１７】 （ｄ）である、請求項１３に記載の欠失変異体。17. The deletion mutant according to claim 13, which is (d). 【請求項１８】 （ｅ）である、請求項１３に記載の欠失変異体。18. The deletion mutant according to claim 13, which is (e). 【請求項１９】 （ｆ）である、請求項１３に記載の欠失変異体。19. The deletion mutant according to claim 13, which is (f). 【請求項２０】 前記ＡＩＭ−ＩＩポリペプチドのＮ末端欠失変異体または
Ｃ末端欠失変異体が、Ｆｃ免疫グロブリンポリペプチドに融合される、請求項１
３に記載の単離されたポリペプチド。20. The N-terminal or C-terminal deletion mutant of the AIM-II polypeptide is fused to an Fc immunoglobulin polypeptide.
4. The isolated polypeptide of claim 3. 【請求項２１】 前記Ｆｃ免疫グロブリンが、前記欠失変異体のＣ末端で融
合される、請求項２０に記載の単離されたポリペプチド。21. The isolated polypeptide of claim 20, wherein said Fc immunoglobulin is fused at the C-terminus of said deletion mutant. 【請求項２２】 宿主細胞中で生成されるか、または宿主細胞中に含有され
る、請求項１３に記載の単離されたポリペプチド。22. The isolated polypeptide of claim 13, which is produced in or contained in a host cell. 【請求項２３】 前記宿主細胞が、昆虫、哺乳動物、または細菌である、請
求項１３に記載の単離されたポリペプチド。23. The isolated polypeptide of claim 13, wherein said host cell is an insect, mammal, or bacterium. 【請求項２４】 薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を伴う、請求項
１３に記載の単離されたポリペプチド。24. The isolated polypeptide of claim 13, with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. 【請求項２５】 請求項１３に記載の単離されたポリペプチドであって、以
下の工程： （ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、宿主
細胞に挿入する工程； （ｂ）該宿主細胞を培養する工程；および （ｃ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する方法によって生成される、単離されたポリペプチド。25. The isolated polypeptide according to claim 13, comprising: (a) inserting a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide into a host cell; (b) C) culturing the host cell; and (c) recovering the polypeptide. 【請求項２６】 ポリペプチドを生成するための方法であって、以下の工程
： （ａ）前記ベクターが発現される条件下で、請求項２５に記載の宿主細胞を培
養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。26. A method for producing a polypeptide, comprising: (a) culturing the host cell according to claim 25 under conditions in which the vector is expressed; and (b) A) recovering the polypeptide. 【請求項２７】 請求項１３に記載のＡＩＭ ＩＩポリペプチドに特異的に
結合する、単離された抗体。27. An isolated antibody that specifically binds to the AIM II polypeptide of claim 13. 【請求項２８】 患者における疾患状態の処置のための方法であって、以下
： （ａ）慢性関節リウマチ； （ｂ）変形性関節症； （ｃ）アレルギー反応； （ｄ）ウイルス感染； （ｅ）グレーヴズ病； （ｆ）自己免疫疾患；および （ｇ）癌； からなる群から選択される方法であって、ここで、該方法が、以下： （ａ）配列番号２の約１〜約２４０のアミノ酸； （ｂ）配列番号２の約２〜約２４０のアミノ酸； （ｃ）ＡＴＣＣ受託番号９７６８９中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号９７４８３中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるアミノ酸配列； （ｅ）前記ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｆ）前記ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの膜貫通ドメインのアミノ酸配列； （ｇ）前記ＡＩＭ ＩＩポリペプチドの細胞内ドメインのアミノ酸配列； （ｈ）該細胞外ドメインおよび該細胞内ドメインの全てまたは一部分を有する
が、該膜貫通ドメインを欠く、可溶性ＡＩＭ ＩＩポリペプチドのアミノ酸配列
； （ｉ）配列番号２のアミノ酸８３〜２４０を含む、ポリペプチド；および （ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
または（ｉ）のいずれか１つのポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配
列、 からなる群から選択される治療的有効量のアポトーシス誘導分子ＩＩ（ＡＩＭ
ＩＩ）ポリペプチドを該患者に投与する工程を包含する、方法。28. A method for the treatment of a disease state in a patient, comprising: (a) rheumatoid arthritis; (b) osteoarthritis; (c) allergic reaction; (d) viral infection; C) Graves'disease; (f) an autoimmune disease; and (g) cancer, wherein the method comprises: (a) about 1 to about 240 of SEQ ID NO: 2. (B) amino acids of about 2 to about 240 of SEQ ID NO: 2; (c) amino acid sequence encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 97689; (d) cDNA contained in ATCC Accession No. 97483 (E) amino acid sequence of the extracellular domain of the AIM II polypeptide; (f) transmembrane domain of the AIM II polypeptide (G) amino acid sequence of the intracellular domain of the AIM II polypeptide; (h) soluble AIM having all or a portion of the extracellular domain and the intracellular domain, but lacking the transmembrane domain (I) a polypeptide comprising amino acids 83-240 of SEQ ID NO: 2; and (j) (a), (b), (c), (d), (e), (f) ), (G), (h),
Or (i) an amino acid sequence of an epitope-bearing portion of any one of the polypeptides, or a therapeutically effective amount of an apoptosis-inducing molecule II (AIM) selected from the group consisting of:
II) A method comprising administering a polypeptide to the patient. 【請求項２９】 前記ポリペプチドが、薬学的に受容可能なキャリアまたは
賦形剤を伴って投与される、請求項２８に記載の方法。29. The method of claim 28, wherein said polypeptide is administered with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. 【請求項３０】 請求項１に記載のアポトーシス誘導分子ＩＩ（ＡＩＭ Ｉ
Ｉ）ポリペプチドを結合する真核生物細胞を、該ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを結
合しない真核生物細胞から分離するための方法であって、以下の工程： （ａ）該ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを結合する細胞および該ＡＩＭ ＩＩポリ
ペプチドを結合しない細胞を含む真核生物細胞の混合集団を、該ＡＩＭ ＩＩポ
リペプチドと接触させる工程； （ｂ）該ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを結合する細胞を同定する工程；および （ｃ）該ＡＩＭ ＩＩポリペプチドを結合する細胞を、該ＡＩＭ ＩＩポリペ
プチドを結合しない細胞から分離する工程、 を包含する、方法。30. The apoptosis-inducing molecule II (AIM I) according to claim 1.
I) A method for separating eukaryotic cells that bind a polypeptide from eukaryotic cells that do not bind the AIM II polypeptide, comprising the following steps: (a) binding the AIM II polypeptide Contacting a mixed population of eukaryotic cells, including cells and cells that do not bind the AIM II polypeptide, with the AIM II polypeptide; (b) identifying cells that bind the AIM II polypeptide; and (C) separating cells that bind the AIM II polypeptide from cells that do not bind the AIM II polypeptide. 【請求項３１】 個体における障害の診断のための方法であって、該障害は
ＡＩＭ ＩＩ遺伝子の過剰発現または過小発現に関連し、該方法は、以下の工程
： （ａ）該個体の生物学的サンプルにおけるＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルを測
定する工程；および （ｂ）該個体のＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レベルを、標準のＡＩＭ ＩＩ遺伝子
発現レベルと比較する工程； を包含する、方法であって、ここで、該標準を超えるＡＩＭ ＩＩ遺伝子発現レ
ベルにおける増加または減少が、ＡＩＭ ＩＩ関連障害の指標である、方法。31. A method for the diagnosis of a disorder in an individual, wherein the disorder is associated with overexpression or underexpression of the AIM II gene, the method comprising: (a) biology of the individual Measuring the level of AIM II gene expression in the target sample; and (b) comparing the AIM II gene expression level of the individual to a standard AIM II gene expression level, wherein A method wherein an increase or decrease in AIM II gene expression levels above said standard is indicative of an AIM II-related disorder.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635743B1 (en) 1996-03-22 2003-10-21 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule II and methods of use
US7964190B2 (en) 1996-03-22 2011-06-21 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for decreasing T-cell activity
US6495520B2 (en) 1996-03-22 2002-12-17 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis Inducing Molecule II and methods of use
US6479254B2 (en) 1996-03-22 2002-11-12 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule II
US6998108B1 (en) 1997-07-07 2006-02-14 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antibodies to p30 polypeptides and methods making and using same
US6140467A (en) * 1997-07-07 2000-10-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
US7118742B2 (en) 1997-07-07 2006-10-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
AU3623700A (en) * 1999-03-11 2000-09-28 Reinhard Ebner Apoptosis inducing molecule ii and methods of use
WO2001079496A2 (en) * 2000-03-13 2001-10-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
ATE365214T1 (en) * 2000-04-12 2007-07-15 Jolla Inst Allergy Immunolog HERPES SIMPLEX CELL ENTRY-MEDIATING PROTEIN LIGAND AND METHODS OF USES THEREOF
WO2002066049A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Agents for plasmic change
EP1364653A4 (en) * 2001-02-23 2005-01-26 Takeda Pharmaceutical Casoase 3 inhibitors
EP2292663B1 (en) 2006-08-28 2013-10-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0904278A4 (en) * 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc Apoptosis inducing molecule ii
EP0922099B1 (en) * 1996-07-19 2004-09-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Fas ligand-like protein, its production and use
US6346388B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-12 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying agonist and antagonists for tumor necrosis related receptors TR1 and TR2
AU9222698A (en) * 1997-09-05 1999-03-22 Millennium Biotherapeutics, Inc. Novel molecules of the tnfr-ligand-related protein family and uses thereof

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