JP2002503678A - Method for processing and storing collagen-based tissue - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コラーゲンベース組織を保存する方法は、コラーゲンベース組織を調達すること、洗浄液でその組織を処理すること、酵素溶液でその組織を処理すること、メイラード反応およびその後の後生的なグリコシル化最終生成物の形成による処理組織の分子架橋を防止または抑制するためにその組織を処理すること、反応的酸化力を有する種の分子による処理組織の分子架橋を防止または抑制するためにその組織を処理すること、分子のフリーラジカルの形成および成長による処理組織の分子架橋を防止または抑制するためにその組織を処理すること、凍結保存溶液中でその組織を処理すること、および、その組織を凍結保存すること、を含んでなる。本方法は、心臓弁、静脈および動脈を含む血管移植、臍帯、神経および神経系組織、硬膜、真皮および他の類似のコラーゲンベース組織を含む異なる数種類のコラーゲンベース組織を保存するのに利用することができる。   (57) [Summary] Methods for preserving collagen-based tissue include procuring collagen-based tissue, treating the tissue with a wash solution, treating the tissue with an enzyme solution, Maillard reaction and subsequent generation of endogenous glycosylation end products. Treating the tissue to prevent or inhibit molecular cross-linking of the tissue due to formation, treating the tissue to prevent or inhibit molecular cross-linking of the treated tissue by species of molecules having reactive oxidative power, Treating the tissue to prevent or inhibit molecular crosslinking of the treated tissue due to the formation and growth of free radicals of the molecule, treating the tissue in a cryopreservation solution, and cryopreserving the tissue, Comprising. The method is used to preserve several different types of collagen-based tissues, including vascular grafts, including heart valves, veins and arteries, umbilical cord, nerve and nervous system tissues, dura, dermis and other similar collagen-based tissues. be able to.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】 本出願は、１９９８年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／０７５
，４７２の優先権を主張する。[0001] This application is related to US Provisional Patent Application No. 60/075, filed on Feb. 20, 1998.
, 472 claim priority.

【０００２】 （発明の背景） 組織移植および臓器移植は、外科的治療における進歩、免疫抑制剤の改良、お
よび人工血管／被移植体の相互作用に関する知識増加によって、急速に発展して
いる治療分野である。この分野の大きな進歩にもかかわらず、現代の組織移植は
、炎症、壊変、瘢痕、痙縮、石灰化（硬化）、閉塞および拒絶反応を含む合併症
を伴なったままである。改良された移植可能な組織移植片の工学的技術に関する
多数の研究が進行中であるが、理想的な移植組織がなおも産生されなければなら
ないと業界では一般に考えられている。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Tissue transplantation and organ transplantation are a rapidly evolving therapeutic field due to advances in surgical therapy, improvements in immunosuppressive drugs, and increasing knowledge of vascular / graft interaction. It is. Despite significant advances in this field, modern tissue transplants remain associated with complications including inflammation, decay, scarring, spasticity, calcification (sclerosis), obstruction and rejection. Although a number of studies are underway on the engineering of improved implantable tissue grafts, it is generally accepted in the industry that ideal transplants must still be produced.

【０００３】 移植法には、自家の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または自己由来の（ｓｅｌｆ−
ｄｅｒｉｖｅｄ）ヒト組織を使用することが多い。これらの方法には、冠状およ
び抹消血管バイパス手術があり、この場合、血管、通常、静脈が身体の他の一部
の領域から採取され、閉塞血流を治療するため１つ以上の発症動脈に移植される
。[0003] Transplantation methods include autologous or autologous (self-
Derived human tissue is often used. These methods include coronary and peripheral vascular bypass surgery, in which blood vessels, usually veins, are removed from some other area of the body and passed to one or more affected arteries to treat occluded blood flow. Be transplanted.

【０００４】 移植に自己由来の組織を使用する動機は、免疫拒絶反応の合併症を防ぎ、移植
片生着に対する条件を向上させるという概念に基づいている。しかし残念ながら
、自己由来の移植片に伴なって他の合併症が発症する可能性がある。例えば、か
なりの障害が、採取時または移植前に、移植静脈の複数の組織成分に発生し得る
。この障害には、静脈壁中の平滑筋細胞における機械的攣縮があり、内皮の損失
および平滑筋細胞低酸素症および死亡に結びつく。低酸素症の障害は、細胞リソ
ソームから細胞外基質に重い障害をもたらす可能性がある酵素を放出させる。体
内移植後、そのような障害は、血小板付着、白血球およびマクロファージの侵入
を増し、引き続き、さらに血管壁に対する障害を引き起こす。そのような障害の
最終結果は、移植後の初期段階における血栓症および閉塞である。そのような障
害がないにしても、自己由来の移植静脈は一般的に血管壁を肥厚化し、アテロー
ム硬化症を進行させ、後に閉塞を生じる。これらの現象の正確な原因は多因子性
であるが、完全には解明されていない。しかしながら、移植前低酸素症、組織の
採取および取扱中に生じた機械的損傷、および高血圧および流速の動脈部位にお
ける静脈のコンプライアンスミスマッチが要因として考えられてきた。移植静脈
の閉塞では、後で再採取した新たな自己由来静脈、あるいは、合成血管または非
自己由来の血管を用いた置換による複雑な反復バイパス法が必要となる。その結
果、患者は、厳しい術後状態や死亡という大きな危険に遭遇することになる。[0004] The motivation to use autologous tissue for transplantation is based on the concept of preventing the complications of immune rejection and improving the conditions for graft survival. Unfortunately, however, other complications can develop with autologous grafts. For example, significant impairment can occur in multiple tissue components of the graft vein at the time of harvest or prior to transplant. The disorder includes mechanical spasm in smooth muscle cells in the vein wall, leading to endothelial loss and smooth muscle cell hypoxia and death. Hypoxic disorders release enzymes from cellular lysosomes that can cause severe damage to the extracellular matrix. After transplantation, such disorders increase platelet adhesion, infiltration of leukocytes and macrophages, and subsequently cause further damage to the vessel wall. The end result of such a disorder is thrombosis and occlusion in the early stages after transplantation. Even in the absence of such disorders, autologous vein grafts generally thicken the vessel wall, develop atherosclerosis, and later result in obstruction. The exact cause of these phenomena is multifactorial, but has not been fully elucidated. However, pre-transplant hypoxia, mechanical damage caused during tissue harvesting and handling, and venous compliance mismatches at arterial sites of hypertension and flow have been considered as factors. Occlusion of a graft vein requires a complex iterative bypass procedure with replacement using a new autologous vein that is later re-collected, or a synthetic or non-autologous vessel. As a result, patients are at great risk of severe postoperative conditions and death.

【０００５】 移植可能な自己由来の組織の供給が枯渇した場合、または、移植片（例えば、
心臓弁置換）に利用可能な好適な自己由来組織がない場合、人工合成物質、動物
由来の組織および組織生成物、または他の個体から提供された（通常、死体から
取り出された）個体同種異系のヒト組織を含む代替物を用いることができる。人
工の移植組織材料には、管状形状に成形され、ある末梢動脈バイパス法において
血流導管として用いられることが多い合成ポリマー（例えば、ポリテトラフルオ
ロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＤＡＣＲＯＮ^ＴＭおよびＧＯＲＥＴＥＸ^ＴＭ）がある
。人工心臓弁を成形する場合、プラスチックおよび炭化金属などの人工材料を大
動脈の心臓弁置換法用として用いることができる。合成物質は低免疫原性で製造
することができるが、他の制限を受けやすい。人工心臓弁の場合には、それらの
血行力学特性によって、一生の抗凝固療法が余儀なくされる。上述の膝末梢血管
バイパス法で頻繁に使用される合成血管移植片は、自己由来移植片に比べると閉
塞の出現率がさらに高くなっている。確かに、パンフレットには、小さな直径（
直径６ｍｍ未満）へ適用するにあたっての合成導管使用に対する禁忌が記載され
ている。多くの場合、処理された動物組織、または同種異系のヒト組織である生
体移植組織が優先される。When the supply of transplantable autologous tissue is depleted, or the graft (eg,
If there is no suitable autologous tissue available for heart valve replacement), an artificial allogeneic, animal-derived tissue and tissue product, or an individual allogeneic (usually removed from the cadaver) provided by another individual Alternatives involving the human tissue of the system can be used. Artificial implant materials include synthetic polymers (eg, polytetrafluoroethylene (PTFE), DACRON ^™ and GORETEX ^™ ) that are formed into a tubular shape and are often used as blood flow conduits in certain peripheral arterial bypass procedures. . When molding prosthetic heart valves, prosthetic materials such as plastics and metal carbides can be used for aortic heart valve replacement. Synthetic materials can be manufactured with low immunogenicity, but are subject to other limitations. In the case of prosthetic heart valves, their hemodynamic properties necessitate lifetime anticoagulant therapy. Synthetic vascular grafts frequently used in the above-described knee peripheral vascular bypass method have an even higher incidence of occlusion than autologous grafts. Indeed, the pamphlet has a small diameter (
Contraindications to the use of synthetic conduits for application to diameters <6 mm) are described. In many cases, preference is given to treated animal tissue, or allogeneic human tissue, a living transplant.

【０００６】 化学薬品により処理された動物組織（ウシまたはブタ）は、欠陥ヒト心臓弁お
よび血管移植片の代替品として使用することができる。化学処理における概念は
、グルタルアルデヒドまたは類似架橋剤を用いた架橋結合によって、構造タンパ
ク質およびコラーゲン基質を安定させることである。さらに、薬品処理は、組織
適合性抗原および他の抗原決定基を遮断する。したがって、ヒト被移植者はその
移植組織を外来のものとして認識せず、特異的な免疫拒絶反応応答が低下するか
、なくなるはずである。しかしながら、薬品処理したにもかかわらず、免疫系は
その移植組織を異物としてなお認識し、その結果、その移植組織のカプセル化ま
たは過成長を起こすかもしれない。さらに、グルタルアルデヒド処理の組織は、
生化学的、生体力学的ホメオスタシスに必要な被移植者細胞を内部移入させるこ
とがほとんどない。次第に、グルタルアルデヒド処理された組織は石灰化の結果
としての硬化が生じ、５〜７年で機能的欠陥が見受けられることが報告された。
過去、血管バイパス法にグルタルアルデヒド処理ヒトおよびウシ臍帯静脈が使用
されたが、容認し難い６ｆ動脈瘤形成および閉塞の発生率により、それらの使用
は中止された。[0006] Animal tissue (bovine or porcine) treated with chemicals can be used as a replacement for defective human heart valves and vascular grafts. The concept in chemical processing is to stabilize structural proteins and collagen substrates by cross-linking using glutaraldehyde or similar cross-linking agents. In addition, drug treatment blocks histocompatibility antigens and other antigenic determinants. Thus, the human recipient does not recognize the transplant as foreign and should have a reduced or no specific immune rejection response. However, despite drug treatment, the immune system may still recognize the implant as foreign and may result in encapsulation or overgrowth of the implant. In addition, the glutaraldehyde-treated tissue
Very little internal transfer of recipient cells required for biochemical and biomechanical homeostasis. Gradually, glutaraldehyde-treated tissues were reported to undergo hardening as a result of calcification, with functional defects seen in 5-7 years.
In the past, glutaraldehyde-treated human and bovine umbilical veins have been used for vascular bypass, but their use has been discontinued due to the unacceptable incidence of 6f aneurysm formation and occlusion.

【０００７】 同種異系の移植組織の使用は、心臓弁置換法、動脈バイパス法、硬骨、軟骨お
よび靭帯置換法、並びに、一時的処理としての全厚創傷処置に適用されている。
同種異系組織は新しいものを使用するか、あるいは細胞成分の生存能力を維持す
るために凍結保存することができる。その細胞成分は、組織適合性抗原を含み、
被移植者からの免疫応答を誘発し得ると考えられる。多くの場合、同種異系移植
片を受けている患者は、免疫抑制療法を受ける。免疫抑制療法にもかかわらず、
多くの同種異系心臓弁は炎症反応が生じ、５〜１０年以内に機能しなくなること
が報告されている。凍結保存された同種異系の伏在静脈については、移植後１年
での不成功率が７２％に達することが文献に報告されている。The use of allogeneic transplants has been applied to heart valve replacement, arterial bypass, bone, cartilage and ligament replacement, and to full thickness wound treatment as a temporary treatment.
Allogeneic tissue can be used fresh or cryopreserved to maintain the viability of the cellular components. The cellular component contains a histocompatible antigen,
It is believed that an immune response from the recipient can be elicited. Often, patients receiving allografts receive immunosuppressive therapy. Despite immunosuppressive therapy
Many allogeneic heart valves have been reported to develop an inflammatory response and fail within 5-10 years. It has been reported in the literature that cryopreserved allogeneic saphenous veins have a 72% failure rate one year after transplantation.

【０００８】 同種異系移植組織および動物由来移植組織の限界に取り組むことを目的とした
他者によって、代替処理方法が開発されている。移植用の同種異系硬骨の処理で
は、凍結乾燥が慣例的に使用されている。凍結乾燥処理により、新しい同種異系
硬骨、または凍結保存された同種異系硬骨と比べて有意な拒絶反応を誘発するこ
とのない移植片が得られることがわかった。移植後の凍結乾燥硬骨は鋳型として
作用し、その後、被移植者によって引き続き再構築されると考えられる。心臓弁
などのより複雑な組織に凍結乾燥処理を適用した場合は、結果が不十分であった
と報告されている。１５例の同種異系心臓弁を移植前に凍結乾燥により処理する
研究が行われた。ほとんどの凍結乾燥弁は、移植後の早期の時期に機械的な原因
がもとで失敗した。しかしながら、失敗しなかったそれらの凍結乾燥弁について
は、長期の機能性が証明された（１５年以内）。[0008] Alternative processing methods have been developed by others aimed at addressing the limitations of allogeneic and animal-derived transplants. Freeze-drying is routinely used in the treatment of allogeneic bone for transplantation. The lyophilization treatment was found to result in grafts that did not induce significant rejection compared to new allogeneic bone or cryopreserved allogeneic bone. It is believed that the post-implant lyophilized bone acts as a template and is subsequently reconstructed by the recipient. Poor results have been reported when lyophilization is applied to more complex tissues such as heart valves. A study was conducted in which 15 allogeneic heart valves were treated by lyophilization prior to implantation. Most freeze-dried valves failed early in the post-transplant period due to mechanical causes. However, for those freeze-dried valves that did not fail, long-term functionality was demonstrated (within 15 years).

【０００９】 さらに、コラーゲンベースの移植可能な組織から抗原細胞を除去するために、
酵素および洗浄剤が組織の処理で使用されてきた。有機溶媒および洗浄剤による
処理は、再建的外科的処置で使用される硬膜物質などの相対的な単組織で首尾よ
く用いられてきた。しかしながら、心臓弁、血管移植片および皮膚などのより複
雑な構造の化学処理は、臨床的利用において不十分な成果しか得られなかった。Further, to remove antigen cells from collagen-based implantable tissue,
Enzymes and detergents have been used in tissue processing. Treatment with organic solvents and detergents has been used successfully with relative single tissues such as dura matter used in reconstructive surgical procedures. However, the chemical treatment of more complex structures, such as heart valves, vascular grafts and skin, has had poor results in clinical use.

【００１０】 （発明の概要） 本発明は、移植可能な組織として使用するコラーゲンベース組織を処理し保存
する方法を教示するものである。さらに、本発明は、その処理方法による生成物
を教示するものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention teaches a method of processing and storing collagen-based tissue for use as an implantable tissue. Further, the present invention teaches a product obtained by the processing method.

【００１１】 一般に、本発明のコラーゲンベース組織を保存する方法は、コラーゲンベース
組織を調達すること、 第１洗浄液でその組織を処理すること、 酵素溶液でその
組織を処理すること、 凍結保存溶液でその組織を処理すること、および、 その
組織を凍結保存すること、を含んでなる。また、本方法は、メイラード反応およ
びその後の後生的なグリコシル化最終生成物の形成による処理組織の分子架橋を
防止または抑制するために、その組織を処理すること、 反応的酸化力を有する 種の分子による処理組織の分子架橋を防止または抑制するために、その組織を処
理すること、 分子のフリーラジカルの形成および成長による処理組織の分子架 橋を防止または抑制するために、その組織を処理すること、を含んでなる。本方
法は、心臓弁、静脈および動脈などの血管導管、神経および神経系組織、臍帯、
硬膜、真皮等であるコラーゲンベース組織に適用することができる。第１洗浄液
は、生理学的緩衝溶液に、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ト
リトンＸ−１００）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デオキシコー
ル酸塩、オクタン酸（カプリル酸塩）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチ
ルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ）、エチレンジアミ
ンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム、および広域スペクトルの抗
菌物質からの１種または複数種を含むように調製することができる。その方法に
は、代わりに第２洗浄液が含まれていてもよく、そのような第２洗浄液は、第１
洗浄液と同じ原料から調製することができる。酵素溶液は、広域抗菌スペクトル
抗菌物質を含む生理的緩衝溶液に、ＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ Ｔ
ｙｐｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ、ホスホリパーゼＡ、ホスホリパーゼＣ、および広範
囲抗生物質の１種または複数種を含み得る。[0011] In general, the method of preserving collagen-based tissue of the present invention comprises: procuring a collagen-based tissue; treating the tissue with a first wash solution; treating the tissue with an enzyme solution; Processing the tissue and cryopreserving the tissue. The method also includes treating the tissue to prevent or inhibit molecular crosslinking of the Maillard reaction and subsequent formation of an endogenous glycosylation end product; treating the tissue with a reactive oxidizing species. Treating the tissue to prevent or inhibit molecular cross-linking of the treated tissue by the molecule; treating the tissue to prevent or inhibit molecular bridging of the treated tissue by the formation and growth of free radicals of the molecule That comprises. The method comprises the steps of: heart valves, vascular conduits such as veins and arteries, nerve and nervous system tissue, umbilical cord,
It can be applied to collagen-based tissues such as dura and dermis. The first washing solution was prepared by adding t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), n-octyl-β-D-glucopyranoside, deoxycholate, octanoic acid (caprylate) to physiological buffer solution. Prepared to contain one or more of [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propane-sulfonate (CHAPS), ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium chloride, and a broad spectrum antimicrobial can do. The method may alternatively include a second cleaning solution, such a second cleaning solution comprising the first cleaning solution.
It can be prepared from the same raw materials as the washing liquid. The enzyme solution is prepared by adding DNase Type I and DNase T to a physiological buffer solution containing a broad-spectrum antibacterial spectrum antibacterial substance.
It may include one or more of ype II, RNase, phospholipase A, phospholipase C, and a wide range of antibiotics.

【００１２】 メイラード反応およびその後の後生的なグリコシル化最終生成物の形成による
処理組織の分子架橋を防止または抑制するためのその組織を処理する過程におい
て、利用する技術および溶液を、降下温度； グルコースおよび関連化合物内の カルボニル基の分子還元から生じるような非反応性または非還元性炭水化物、お
よびアミノグアニジンの使用； およびそれらの併用、から選択することができ る。反応的酸化力を有する種の分子による処理組織の分子架橋を防止または抑制
するためのその組織を処理する過程において、利用する技術は、降下温度；不活
性雰囲気；デフェロキサミンメシレート、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、
カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−トコフェロール、還元型グル
タチオン、および６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２
−カルボン酸の１種または複数種；およびそれらの併用、を含み得る。分子のフ
リーラジカルの成長を防止または抑制するためのその組織を処理するステップに
は、降下温度を使用すること；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、α−トコフ
ェロール、アスコルベート、還元型グルタチオン、フラボノイド、およびイノシ
トールヘキサリン酸（フィチン酸）の１種または複数種を使用することが含まれ
る。凍結保存中に利用される凍結保存溶液には、非還元型マルトデキストリンお
よびエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、並びに生理的緩衝溶液を
含み得る。In the process of treating a tissue to prevent or inhibit molecular crosslinking of the Maillard reaction and subsequent formation of an endogenous glycosylation end product to treat or inhibit the tissue, the techniques and solutions employed are reduced temperature; And the use of non-reactive or non-reducing carbohydrates, such as those resulting from the molecular reduction of carbonyl groups in related compounds, and aminoguanidine; and combinations thereof. In the process of treating the tissue to prevent or inhibit molecular cross-linking of the tissue by reactive oxidizing species molecules, the techniques utilized are: temperature drop; inert atmosphere; deferoxamine mesylate, dimethyl sulfoxide (DMSO ),
Catalase, superoxide dismutase, α-tocopherol, reduced glutathione, and 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2
-One or more carboxylic acids; and combinations thereof. Treating the tissue to prevent or inhibit the growth of free radicals in the molecule, using reduced temperature; dimethyl sulfoxide (DMSO), α-tocopherol, ascorbate, reduced glutathione, flavonoids, and inositol The use of one or more of hexaphosphoric acid (phytic acid) is included. Cryopreservation solutions utilized during cryopreservation may include non-reduced maltodextrin and ethylenediaminetetraacetate (EDTA), and physiological buffer solutions.

【００１３】 本発明のこれらの態様、および他の態様は、以下の本発明の実例となる実施形
態の記載においてさらに詳細に述べる。[0013] These and other aspects of the invention are described in further detail in the following description of illustrative embodiments of the invention.

【００１４】 （実例となる実施形態の説明） 本発明は、一般に、移植可能な組織として使用するために、コラーゲンベース
組織、特に心臓血管組織および神経組織を処理し保存する方法を教示する。心臓
血管組織には心臓弁、動脈、静脈および臍帯があるが、これに制限されるもので
はない。神経組織には、硬膜などの中枢神経組織、並びに中枢および末梢神経系
の神経および他のコラーゲンベース組織がある。また、本発明は、その処理方法
による生成物を教示するものである。DESCRIPTION OF ILLUSTRATIVE EMBODIMENTS The present invention generally teaches a method of processing and storing collagen-based tissue, particularly cardiovascular and neural tissue, for use as implantable tissue. Cardiovascular tissue includes, but is not limited to, heart valves, arteries, veins and umbilical cord. Neural tissue includes central nervous tissue such as the dura mater, as well as nerves and other collagen-based tissues of the central and peripheral nervous system. The present invention also teaches a product obtained by the processing method.

【００１５】 本明細書では、本発明の方法には、一般に、ドナー源からドナー組織を入手す
ることを含んでいる。洗浄液でドナー組織を処理し、酵素溶液で処理することに
よって、有害な要素が除かれると同時に、非細胞のコラーゲン基質が得られる。
本方法は、いくつかの異なる洗浄剤または酵素溶液の使用を含んでいてもよく、
また、代わりに、洗浄剤および酵素溶液を併用してもよい。さらに、本方法は、
メイラード反応またはその後の最終生成物に基づく非酵素的架橋、反応的酸化力
を有する分子種、または分子のフリーラジカルからその基質を保護することを含
んでいる。これは、非関係物および／または阻害剤をこれらの反応に添加するこ
とによって達成することができる。得られた非細胞のコラーゲン基質の保存は、
凍結保存、好ましくは分子蒸留乾燥によって行い、乾燥され、従って保存された
非細胞のコラーゲン基質が得られた。得られた保存非細胞コラーゲン基質は再水
和することができ、従来の自己由来組織、同種異系の組織、または人工合成移植
片の入用を軽減する移植片として使用することができる。[0015] As used herein, the methods of the invention generally involve obtaining donor tissue from a donor source. Treatment of the donor tissue with a wash solution and treatment with an enzyme solution removes harmful elements while providing a non-cellular collagen matrix.
The method may include the use of several different detergents or enzyme solutions,
Alternatively, a detergent and an enzyme solution may be used in combination. Further, the method comprises:
Non-enzymatic crosslinking based on the Maillard reaction or subsequent end products, protecting the substrate from reactive radically oxidizing species, or free radicals of the molecule. This can be achieved by adding extraneous substances and / or inhibitors to these reactions. Preservation of the resulting non-cellular collagen matrix
Performed by cryopreservation, preferably by molecular distillation drying, yielded a dried, and thus preserved, non-cellular collagen matrix. The resulting preserved non-cellular collagen matrix can be rehydrated and used as a graft to reduce the need for conventional autologous, allogeneic, or artificial synthetic grafts.

【００１６】 ドナー組織の調達： 本明細書に含まれる記載を検討するにあたっては、広い範囲のコラーゲンベー
ス組織とは、本発明の原理を用いて処理され得るものであると当業者は理解すべ
きである。すなわち、腱、じん帯、血脈洞組織等の軟骨組織、中枢神経系、脊髄
、末梢神経および他の類似した神経系組織の硬膜物質、真皮および他の皮膚組織
、静脈および動脈心臓弁等のような維管束組織、臍帯、角膜組織および眼球系の
他のコラーゲン含有組織、歯肉およびコラーゲン基質を含む他のそのような軟繊
維などの歯周組織、などのコラーゲンベース組織を処理し保存することは、本発
明の範囲内であると考えられる。採取時のコラーゲンベース組織の大きさ、形状
、細胞組織および条件によって、ドナー組織試料を得るためには様々な外科的技
術が必要とされ得ることを当業者は理解するべきである。そのような技術は熟練
の外科医は知っているはずであるが、さらに、通常の当業者によっても理解され
るはずである。Procurement of Donor Tissue: In reviewing the description contained herein, one of ordinary skill in the art should understand that a wide range of collagen-based tissues can be processed using the principles of the present invention. It is. Such as cartilage tissue such as tendons, ligaments, sinus tissue, dura matter of the central nervous system, spinal cord, peripheral nerves and other similar nervous systems, dermis and other skin tissues, venous and arterial heart valves It is possible to process and preserve collagen-based tissue such as vascular tissue, umbilical cord, corneal tissue and other collagen-containing tissues of the eye system, gingiva and other periodontal tissues such as soft fibers, including collagen matrix. , Are considered to be within the scope of the present invention. One of skill in the art should appreciate that various surgical techniques may be required to obtain a donor tissue sample, depending on the size, shape, cellular organization, and conditions of the collagen-based tissue at the time of collection. Such techniques should be known to the skilled surgeon, but should also be understood by one of ordinary skill in the art.

【００１７】 好適なドナー源は、ドナー組織を入手するために探し出さなければならない。
本ドナー源は、ヒトの死体または適当に分類された動物のいずれかであってよい
。一般に、その組織に関係するものが不可逆的、反生化学的または機械的変化を
受けたことがないという条件に合致しているべきである。ある好ましい実施形態
では、ドナーは、湯はぎを受けたことがない死後間もないブタである。他の好ま
しい実施形態では、ドナーは、死亡時に組織ドナーとなることを希望し示したヒ
トドナーである。ドナー組織は解剖され、ドナーから取り出される。その組織の
他に、低温切片および試験用の周囲組織試料を得ておくべきである。一般的に、
周囲組織の試料は入手直後に冷凍する。ドナー組織は、移植にあたって十分な幾
何学的形状であるように入手すべきである。[0017] Suitable donor sources must be sought to obtain donor tissue.
The donor source may be either a human cadaver or an appropriately classified animal. In general, the conditions associated with the tissue should have met the condition that they have not undergone irreversible, antibiochemical or mechanical changes. In a preferred embodiment, the donor is a freshly killed pig that has not been dewaxed. In another preferred embodiment, the donor is a human donor who has expressed and desires to be a tissue donor at the time of death. The donor tissue is dissected and removed from the donor. In addition to the tissue, cryosections and surrounding tissue samples for testing should be obtained. Typically,
Samples of surrounding tissue are frozen immediately after acquisition. Donor tissue should be obtained in a geometry sufficient for transplantation.

【００１８】 入手後すぐに本発明の方法を行なわない場合には、そのドナー組織は安定化溶
液中に入れておくことができる。安定化溶液には、抗生物質が添加された、冷却
（すなわち、４℃）ロズウェルパークメモリアル研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａ
ｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）溶液、またはウィ
スコンシン大学（ＵＷ）溶液がある。好適な抗菌物質にはセフォキシチン、リン
コマイシン、ポリミキシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンがある。冷
却（すなわち、４℃）安定化溶液中の組織は、本明細書に記述されているような
処理を行うためにできるだけ早く送る。受取りに際して、さらなる処理に対する
その適性を確認するためにその組織の別の試料も受け取る。If the method of the present invention is not performed immediately after obtaining, the donor tissue can be placed in a stabilizing solution. The stabilized solution was supplemented with antibiotics and cooled (ie, 4 ° C.) at the Roswell Park Memorial Laboratory (Roswell Pa.).
rk Medical Institute (RPMI) solution, or University of Wisconsin (UW) solution. Suitable antimicrobial agents include cefoxitin, lincomycin, polymyxin, vancomycin and amphotericin. The tissue in the cooled (ie, 4 ° C.) stabilizing solution is sent as soon as possible to perform the processing as described herein. Upon receipt, another sample of the tissue is also received to confirm its suitability for further processing.

【００１９】 非細胞化（Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）： 処置前のドナー組織は生理食塩液ですすぎ、存在し得る過度の血液および組織
粒子を除去する。その後、ドナー組織を第１洗浄液に浸す。この第１洗浄液の一
般的な目的は、組織を損傷する可能性がある酸化化合物または酵素化合物をもた
らす、すべての残留血液成分をできるだけ完全に除去することである。第１洗浄
液は、緩衝された水または培地に、脂質膜およびタンパク質を可溶化するための
洗浄剤および塩化ナトリウム、並びにプロテアーゼ活性を阻害する二価の陽イオ
ンキレート剤を含有させて調製する。ある実施形態では、第１洗浄液は、２０ｍ
ＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥ
ＰＥＳ）緩衝液に溶解された、０．２４ｍＭのｔ−オクチルフェノキシポリエト
キシエタノール（トリトンＸ−１００）、２５ｍＭのエチレンジアミンテトラア
セテート（ＥＤＴＡ）および１Ｍの塩化ナトリウムからなる。あるいは、第１洗
浄液は、ロズウェルパークメモリアル研究所（ＲＰＭＩ）溶液にＴＸ−１００、
塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡを含有させて調製してもよい。十分な第１洗浄溶
液は、ドナー組織を溶液に完全に浸漬するように使用するべきである。混合およ
び組織周囲の流体の流れを促進するには、撹拌が行われなければならない。浸漬
ステップの終了時に、廃棄される溶液と共に、ドナー組織から第１洗浄液を除液
する。Decellularization: Prior to treatment, donor tissue is rinsed with saline to remove any excess blood and tissue particles that may be present. Thereafter, the donor tissue is immersed in the first washing solution. The general purpose of this first lavage fluid is to remove as completely as possible all residual blood components that result in oxidizing or enzymatic compounds that can damage tissue. The first washing solution is prepared by buffering water or a medium containing a detergent for solubilizing lipid membranes and proteins, sodium chloride, and a divalent cation chelating agent that inhibits protease activity. In one embodiment, the first cleaning liquid is 20 m
M of N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HE
Consist of 0.24 mM t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), 25 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA) and 1 M sodium chloride dissolved in (PES) buffer. Alternatively, the first cleaning solution is prepared by adding TX-100 to Roswell Park Memorial Laboratory (RPMI) solution.
It may be prepared by containing sodium chloride and EDTA. Sufficient first wash solution should be used to completely immerse the donor tissue in the solution. Agitation must be provided to promote mixing and fluid flow around the tissue. At the end of the immersion step, the first cleaning solution is removed from the donor tissue along with the solution to be discarded.

【００２０】 残留血液要素のすべてを除去するのに十分な時間が経過した後、その組織を冷
凍保存（ritrification）溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）に移す。この場 合、ＶＳＭＤは、浸透変化を介して組織へ洗浄剤が入っていくことを増大させ、
かつ、特異的な細胞タンパク質の溶解度を直接的に増強する炭水化物を提供する
ことにより、細胞タンパク質の可溶化を促進する溶液である。ＶＳＭＤ溶液の成
分には、低褐変（メイラード反応）ポテンシャルのものであってもよいポリヒド
ロキシ化合物のポリマー、タンパク質分解活性を阻害する二価の陽イオンのキレ
ート剤、水、および所望のｐＨを維持するのに好適な緩衝液が含有されているべ
きである。メイラード反応でのその関与を防止するために、マルトデキストリン
をデキストロース当量（ＤＥ）１未満まで化学的に変更してもよい。この反応は
、抑制されていない場合、基質の非酵素的架橋を生じる。好ましい実施形態では
、ＶＳＭＤは、変更された７５％マルトデキストリン、約１０ｍＭのエチレンジ
アミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、水、およびＮ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含んでいる。ＶＳＭＤ
溶液のｐＨ値は、約ｐＨ７．４から約７．５に調節するのが好ましい。十分なＶ
ＳＭＤは、ドナー組織をその溶液に完全に浸漬するように使用すべきである。混
合を促進し、組織周囲の流体の流れを促進するには、撹拌が行われなければなら
ない。 浸漬ステップの終了時に、廃棄される溶液と共に、ドナー組織からＶＳ ＭＤを除液する。After a period of time sufficient to remove any residual blood components, the tissue is transferred to a cryopreservation solution maltodextrin (VSMD). In this case, the VSMD will increase the entry of the detergent into the tissue via osmotic changes,
The solution promotes the solubilization of cellular proteins by providing a carbohydrate that directly enhances the solubility of specific cellular proteins. The components of the VSMD solution include a polymer of a polyhydroxy compound, which may have a low browning (Maillard reaction) potential, a chelating agent of a divalent cation that inhibits proteolytic activity, water, and maintaining a desired pH. A suitable buffer should be included. Maltodextrin may be chemically modified to a dextrose equivalent (DE) less than 1 to prevent its participation in the Maillard reaction. This reaction, if not inhibited, results in non-enzymatic crosslinking of the substrate. In a preferred embodiment, the VSMD comprises a modified 75% maltodextrin, about 10 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), water, and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES). In. VSMD
Preferably, the pH value of the solution is adjusted from about pH 7.4 to about 7.5. Enough V
SMD should be used to completely immerse the donor tissue in the solution. Agitation must be provided to promote mixing and promote fluid flow around the tissue. At the end of the immersion step, the VSSMD is drained from the donor tissue along with the solution to be discarded.

【００２１】 脱水の終了後に、ドナー組織を第２洗浄液に入れ、緩やかに撹拌する。第２洗
浄液は、細胞膜および潜在的抗原成分を破壊し可溶化する溶液であるので、それ
らは組織の洗浄による遊離物となり得る。第２洗浄液の成分は、緩衝液を使用し
た水または細胞培地に溶解した洗浄剤および二価の陽イオンキレート剤、および
広域抗菌物質、抗真菌剤、酸化防止剤およびフリーラジカル捕捉剤を含んでいる
。ある特定の実施形態では、第２洗浄液は、脱気したロズウェルパークメモリア
ル研究所（ＲＰＭＩ）溶液中に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、エ
チレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、デフェロキサミン、フィチン酸
、およびアミノグアニジンを含んでいる。ロズウェルパークメモリアル研究所（
ＲＰＭＩ）溶液は、市販の細胞培地である。別の実施形態では、第２洗浄液は、
ｐＨ値が約７．４から７．５の脱気されたロズウェルパークメモリアル研究所（
ＲＰＭＩ）溶液中に、約４０ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、
約２５ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、約１０ｍＭのデ
フェロキサミン、約１０ｍＭのフィチン酸、および約１００ｍＭのアミノグアニ
ジンを含んでいる。上記の成分に加えて、第２洗浄液には、細菌または真菌感染
の伝染を防止する抗菌物質を含んでいてもよい。好適な抗菌物質には、ペニシリ
ン、アミノグリコシド、セファロスポリン、エリスロマイシン、テトラサイクリ
ン、ポリミキシン、抗真菌剤、または組織調達セッティングにおいて予期される
微生物に対して好適な活性を有する他の物質の１種または組合せが含まれる。あ
る特定の実施例において、抗菌物質には、リンコマイシン、ポリミキシンＢ硫酸
塩、セフォキシチン、バンコマイシン、およびアンホテリシンＢが含まれる。別
の実施例では、第２洗浄液には、２５０ｍＭのリンコマイシン、１０００活性ユ
ニット／ｍｌのポリミキシンＢ硫酸塩、０．５Ｍのセフォキシチン、２０ｍＭの
バンコマイシン、および２５ｍＭのアンホテリシンＢが含まれる。混合を促進し
、組織周囲の流体の流れを促進するには、撹拌が行われなければならない。 第 ２洗浄液を用いた最適処理の持続期間および温度は、異なる組織の種類に応じて
変わり得るが、当業者は最適条件を得るための各パラメーターを系統的に変更す
る方法を知っているはずである。After the completion of the dehydration, the donor tissue is put into the second washing solution and gently stirred. Since the second lavage fluid is a solution that destroys and solubilizes cell membranes and potential antigen components, they can be freed from washing the tissue. The components of the second washing solution include a detergent and a divalent cation chelating agent dissolved in water or a cell medium using a buffer solution, and a broad-spectrum antibacterial agent, an antifungal agent, an antioxidant and a free radical scavenger. I have. In certain embodiments, the second wash solution is n-octyl-β-D-glucopyranoside, ethylenediaminetetraacetate (EDTA), deferoxamine, phytic acid, and degassed Roswell Park Memorial Laboratory (RPMI) solution. Contains aminoguanidine. Roswell Park Memorial Laboratory (
RPMI) solution is a commercially available cell culture medium. In another embodiment, the second cleaning liquid is
Degassed Roswell Park Memorial Laboratory with a pH value of about 7.4 to 7.5 (
RPMI) solution, about 40 mM n-octyl-β-D-glucopyranoside,
It contains about 25 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), about 10 mM deferoxamine, about 10 mM phytic acid, and about 100 mM aminoguanidine. In addition to the above components, the second wash may include an antimicrobial substance that prevents transmission of bacterial or fungal infections. Suitable antimicrobial agents include one or a combination of penicillins, aminoglycosides, cephalosporins, erythromycin, tetracyclines, polymyxins, antimycotics, or other agents having suitable activity against the microorganisms expected in the tissue procurement setting. Is included. In certain embodiments, antimicrobial agents include lincomycin, polymyxin B sulfate, cefoxitin, vancomycin, and amphotericin B. In another example, the second wash contains 250 mM lincomycin, 1000 activity units / ml polymyxin B sulfate, 0.5 M cefoxitin, 20 mM vancomycin, and 25 mM amphotericin B. Agitation must be provided to promote mixing and promote fluid flow around the tissue. While the duration and temperature of the optimal treatment with the second wash may vary for different tissue types, those skilled in the art will know how to systematically modify each parameter to achieve optimal conditions. is there.

【００２２】 第２洗浄剤処理の完了時に、その組織を最終仕様まで切取り形を整えることが
できる。得られた処理済み組織は、好ましくは洗浄剤と同じｐＨの、さらに好ま
しくは約ｐＨ７．４から７．５の滅菌生理的食塩水で洗浄すべきである。Upon completion of the second cleaning agent treatment, the tissue can be trimmed to final specifications. The resulting treated tissue should be washed with sterile saline, preferably at the same pH as the detergent, more preferably at about pH 7.4 to 7.5.

【００２３】 洗浄された処理済み組織は酵素溶液に入れられ、適温および適当な時間でイン
キュベートする。酵素溶液の目的は、細胞核および細胞リン脂質などの特定の細
胞の成分を破壊し可溶化することである。本発明の酵素溶液は、２０ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ緩衝水中にＤＮａｓｅ Ｉ、デフェロキサミン、フィチン酸、およびアミ
ノグアニジンを含んでいる。また、本酵素溶液は、リン脂質の除去を促進するホ
スホリパーゼＣを含んでいてもよい。また、組織の非酵素的架橋に対する活性を
有する他の試薬には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、カタラーゼ、スーパ
ーオキシドジスムターゼ、α−トコフェロール、還元型グルタチオン、６−ヒド
ロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルベ
ート、フラボノイド、およびイノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）などをそ
の酵素溶液に含有することができる。さらに、ペニシリン、アミノグリコシド、
セファロスポリン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシン、抗真
菌剤、または組織調達セッティングにおいて予期される微生物に対して好適な活
性を有する他の物質のうちの１種、または組合せの抗菌物質を本酵素溶液に添加
することができる。ある好ましい実施形態では、本酵素溶液には、１５０活性ユ
ニット／ｍｇのＤＮａｓｅ Ｉ、１０ｍＭのデフェロキサミン、１００ｍＭのフ
ィチン酸、および１００ｍＭのアミノグアニジンが含まれている。さらに好まし
い実施形態においては、本酵素溶液は、２５０ｍＭのリンコマイシン、１０００
活性ユニット／ｍｌのポリミキシンＢ硫酸塩、０．５Ｍのセフォキシチン、２０
ｍＭのバンコマイシン、および２５ｍＭのアンホテリシンＢを抗菌物質として含
んでいる。混合を促進し、組織周囲の流体の流れを促進するには、撹拌が行われ
なければならない。 ドナー組織は、３７℃の酵素溶液中でインキュベートする のが好ましい。しかしながら、組織内の非酵素的架橋に関する反応速度を低下さ
せるために、なお、降下温度を用いてもよい。酵素含有溶液を用いた処理が完了
した後、酵素溶液は除去し廃棄する。その組織は、脱気した滅菌生理的食塩水で
、各洗浄毎に新しい溶液を用いて３回洗浄する。The washed treated tissue is placed in an enzyme solution and incubated at an appropriate temperature and for an appropriate time. The purpose of the enzyme solution is to destroy and solubilize certain cellular components such as cell nuclei and cell phospholipids. The enzyme solution of the present invention contains 20 mM HE.
Contains DNase I, deferoxamine, phytic acid, and aminoguanidine in PES buffered water. Further, the present enzyme solution may contain phospholipase C which promotes removal of phospholipid. Other reagents having activity against non-enzymatic crosslinking of tissues include dimethyl sulfoxide (DMSO), catalase, superoxide dismutase, α-tocopherol, reduced glutathione, 6-hydroxy-2,5,7,8- Tetramethylchroman-2-carboxylic acid, ascorbate, flavonoids, inositol hexaphosphate (phytic acid) and the like can be included in the enzyme solution. In addition, penicillins, aminoglycosides,
One or a combination of cephalosporins, erythromycins, tetracyclines, polymyxins, antifungals, or other substances having suitable activity against microorganisms expected in a tissue procurement setting, or a combination of antimicrobial substances, may be added to the enzyme solution. Can be added. In one preferred embodiment, the enzyme solution contains 150 activity units / mg DNase I, 10 mM deferoxamine, 100 mM phytic acid, and 100 mM aminoguanidine. In a more preferred embodiment, the enzyme solution comprises 250 mM lincomycin, 1000 mM
Active units / ml polymyxin B sulfate, 0.5 M cefoxitin, 20
mM vancomycin and 25 mM amphotericin B as antimicrobial substances. Agitation must be provided to promote mixing and promote fluid flow around the tissue. The donor tissue is preferably incubated in an enzyme solution at 37 ° C. However, a reduced temperature may still be used to reduce the rate of reaction for non-enzymatic cross-linking in the tissue. After the treatment using the enzyme-containing solution is completed, the enzyme solution is removed and discarded. The tissue is washed three times with degassed sterile saline with fresh solution for each wash.

【００２４】 凍結保存： 細胞生存能力または組織超微細構造を冷却後に保存することになっている場合
、一般に２つの方法が利用可能である。第１の方法は、超高速で試料を冷却する
ことであり、その結果、その組織液はガラス状、すなわち、氷晶がない状態で冷
凍される。第２の方法は、低温保護の段階を付与する化学添加剤を添加し、緩慢
な冷却速度で冷凍保存させることである。その化学薬品は、グリセロール、プロ
リン、糖類およびアルコールのような天然に存在する凍結保護物質から、ジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
、デキストリン、マルトデキストリンおよびヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）な
どの高分子量ポリマーまで及ぶ。Cryopreservation: If cell viability or tissue ultrastructure is to be preserved after cooling, two methods are generally available. The first method is to cool the sample at a very high rate, so that the tissue fluid is frozen in a glassy, ie, free of ice crystals. A second method is to add a chemical additive that provides a stage of cryoprotection and store frozen at a slow cooling rate. The chemicals include naturally occurring cryoprotectants such as glycerol, proline, sugars and alcohols, organic solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO), polyvinylpyrrolidone (PVP)
, Dextrins, maltodextrins and high molecular weight polymers such as hydroxyethyl starch (HES).

【００２５】 細胞および組織の冷凍保存は、試料の冷却され得る速度、および組織それ自身
の絶縁特性によって制限される。物理的限界のため、最先端技術を使用すること
によって、組織の薄層の冷凍保存を唯一達成することができる。したがって、低
温保護および冷却速度を操作するための化合物質は、構造的かつ機能的損傷を引
き起こすことなく、生物試料を冷却し保存するのに利用される。[0025] Cryopreservation of cells and tissues is limited by the rate at which samples can be cooled and the insulating properties of the tissues themselves. Due to physical limitations, cryopreservation of thin layers of tissue can only be achieved by using state-of-the-art technology. Thus, compounds for manipulating cryoprotection and cooling rates are utilized to cool and store biological samples without causing structural and functional damage.

【００２６】 凍結防止剤の存在下での冷却速度は、凍害における重要な要因である。通常、
細胞においては、後者は細胞内の氷形成を促進するので、徐冷は高速冷却速度よ
りも優れている。これは、含有されている細胞水の凍結前に、その水が細胞から
放出される時間が不十分であることから生じる。緩慢な速度冷却では、まず細胞
外の氷が形成され、凍結保護物質の存在が加わることによって、細胞内の氷形成
を防ぐ細胞の脱水が生じる。組織基質試料については、全氷晶形成度に関する全
体的減少とさらに直接的な関係がある。The cooling rate in the presence of a deicing agent is an important factor in frost damage. Normal,
In cells, slow cooling outperforms fast cooling rates, since the latter promotes ice formation within the cell. This results from insufficient time for the contained cell water to be released from the cells before freezing. With slow rate cooling, extracellular ice is first formed, and the addition of cryoprotectant causes dehydration of the cell, which prevents ice formation within the cell. For tissue matrix samples, there is a more direct relationship to the overall reduction in total ice crystal formation.

【００２７】 凍結組織の損傷の原因は、それ自体が凍結していること以外に、多くの凍結保
護剤の浸透作用および中毒作用である。凍結保護物質の物理化学的作用には、（
ａ）総括的基底における基質および細胞質の平衡凝固点の低下、（ｂ）均質氷核
形成温度の降下、（ｃ）溶液の粘性および熱拡散率の変化による氷晶成長速度の
低下、（ｄ）浸透作用による細胞に対する脱水作用、がある。混合物中で使用し
た場合、一部の凍結防止剤は、他の凍結保護物質の毒性を抑制するかもしれない
。凍結防止特性の化合物に影響する要因は、（ａ）化学的特性、（ｂ）毒性の相
対的欠如、（ｃ）分子の大きさおよび浸透能力、（ｄ）混合物中での他の化合物
との相互作用、である。[0027] Frozen tissue damage is due to the osmotic and toxic effects of many cryoprotectants, besides being frozen themselves. The physical and chemical effects of cryoprotectants include (
a) lowering the equilibrium freezing point of the substrate and cytoplasm at the global basis; (b) lowering the homogeneous ice nucleation temperature; (c) lowering the ice crystal growth rate due to changes in solution viscosity and thermal diffusivity; There is a dehydration effect on cells by the action. When used in a mixture, some cryoprotectants may reduce the toxicity of other cryoprotectants. Factors affecting compounds with antifreeze properties include (a) chemical properties, (b) relative lack of toxicity, (c) molecular size and penetration capacity, (d) Interaction.

【００２８】 調達および非細胞化のステップの完了時に、組織は直ちに第２冷凍保存溶液マ
ルトデキストリン（ＶＳＭＤ）中でインキュベートする。第２ＶＳＭＤは、すで
に上述したのと同じ配合であってよい。ある好ましい実施形態では、第２ＶＳＭ
Ｄは、７５％マルトデキストリンおよび他のすでに記載した成分を含有するよう
に調製する。しかしながら、氷晶が一部形成され得るのであれば、第２ＶＳＭＤ
には、より少量のマルトデキストリン、好ましくは約３５％のマルトデキストリ
ンを使用してもよい。混合を促進し、組織周囲の流体の流れを促進するには、撹
拌が行われなければならない。 第２ＶＳＭＤ中で十分なインキュベーション時 間が経過した後、好ましくは４時間またはそれ以上が経過した後、溶液からドナ
ー組織を取り出し、さらに最低４時間の間、新しい第２ＶＳＭＤ中でインキュベ
ートする。第２ＶＳＭＤ中への浸漬が完了した後、組織は除液し、冷却および乾
燥を行うためにＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチに入れる。At the completion of the procurement and decellularization steps, the tissue is immediately incubated in a second cryopreservation solution maltodextrin (VSMD). The second VSMD may be of the same formulation as already described above. In one preferred embodiment, the second VSM
D is prepared to contain 75% maltodextrin and other components already described. However, if ice crystals can partially form, the second VSMD
May use a smaller amount of maltodextrin, preferably about 35% maltodextrin. Agitation must be provided to promote mixing and promote fluid flow around the tissue. After a sufficient incubation time in the second VSMD, preferably after 4 hours or more, the donor tissue is removed from the solution and incubated in a fresh second VSMD for a minimum of 4 hours. After immersion in the second VSMD is complete, the tissue is drained and placed in a TYVEK® pouch for cooling and drying.

【００２９】 冷却パラメーター： ＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチ内に密閉された組織は、乾燥方法の過程にわた
って形成される氷晶の量を防止または制限する方法を用いて凍結する。Cooling Parameters: Tissue sealed in a TYVEK® pouch is frozen using a method that prevents or limits the amount of ice crystals formed over the course of the drying process.

【００３０】 本発明による生体懸濁液の凍結調製の目的において、様々な冷却方法が使用で
きるということに留意することが重要である。本発明の好ましい実施形態では、
急速冷却が、好適な氷晶混合物を得るのに不可欠であると考えられる。本発明の
最も好ましい実施形態では、冷凍保存法が用いられ、生体試料中に実質的な割合
の非晶形水が形成される。使用する冷却方式にかかわらず、非晶相水、立方氷晶
および六方氷晶が最終産物中に存在すると考えられている。冷却方法は、冷却凍
結溶液中で確認される氷晶タイプの分布との間にはっきりとした関係がある。好
ましい実施形態では、氷晶形成が試料に損傷をもたらす程度以下であるような適
当な方法によって試料を冷却する。凍結したならば、その後、最も不安定な氷形
状の転移温度以下にその試料を保存する。非晶形氷については、この温度は−１
６０℃より低い温度である。It is important to note that various cooling methods can be used for the purpose of freezing the biological suspension according to the invention. In a preferred embodiment of the present invention,
Rapid cooling is believed to be essential to obtaining a suitable ice crystal mixture. In a most preferred embodiment of the present invention, a cryopreservation method is used to form a substantial proportion of amorphous water in a biological sample. Regardless of the cooling method used, it is believed that amorphous water, cubic ice crystals and hexagonal ice crystals are present in the final product. The cooling method has a clear relationship with the ice crystal type distribution found in the cooled frozen solution. In a preferred embodiment, the sample is cooled by any suitable method such that ice crystal formation is no more than damaging to the sample. Once frozen, the sample is then stored below the transition temperature of the most unstable ice shape. For amorphous ice, this temperature is -1.
The temperature is lower than 60 ° C.

【００３１】 乾燥パラメーター： 分子蒸留乾燥による凍結生体試料の制御式乾燥の目的は、乾燥工程中に生じる
さらなる機械的または化学的損傷なく、試料から水分を除去することである。こ
れには、適切な乾燥条件を使用することにより、２つの基本的な障害現象を回避
することが含まれる。第１には、大きくより安定し、より破壊的な結晶への転移
なしに、氷結晶相から水を除去することである。第２には、固体ではあるが非結
晶性の水、または水−溶質混合物から、これらの固相を融解または結晶化するこ
となく水を除去することである。この第２の要素は、非晶形状態にある水、共晶
の溶質とともにある水、または水と結合し構造を保っている化合物とともにある
水を意味し、従って、凍結工程時のその結晶化を妨げる。よって、超急速冷却純
水における場合、ガラス質水は低エネルギーで安定的であり、中間の冷却速度で
凍結保護剤を用いた場合、高エネルギーで安定的である。Drying Parameters: The purpose of controlled drying of frozen biological samples by molecular distillation drying is to remove water from the sample without the additional mechanical or chemical damage that occurs during the drying process. This involves avoiding two basic obstacle phenomena by using appropriate drying conditions. The first is to remove water from the ice crystal phase without a large, more stable, more destructive crystal transition. Second, the removal of water from solid but amorphous water or water-solute mixtures without melting or crystallizing these solid phases. This second element refers to water in the amorphous state, water with eutectic solutes, or water with compounds that bind and retain structure with water, thus inhibiting its crystallization during the freezing process. Hinder. Thus, in ultra-rapid cooling pure water, vitreous water is low energy and stable, and when a cryoprotectant is used at an intermediate cooling rate, it is high energy and stable.

【００３２】 これらの現象の発生を回避する、制御式乾燥に要求される特徴の多くは重複し
ている。この理由は、各形態の水が、結晶であろうと凍結防止剤に結合した状態
であろうと、特別のエネルギー状態を持つということであり、乾燥を行うための
必要な条件が、その形状よりもむしろこのエネルギー状態によって決定されるか
らである。制御式乾燥の目標は、その六角相への転移時に、かつ、六角氷相への
いずれの重要な転移が生じるのに必要とされるよりも短時間内に立方氷相から水
を除去することである。Many of the features required for controlled drying that avoid the occurrence of these phenomena overlap. The reason for this is that each form of water, whether crystalline or bound to a cryoprotectant, has a special energy state, and the conditions required for drying are less than its shape. Rather, it is determined by this energy state. The goal of controlled drying is to remove water from the cubic ice phase during its transition to the hexagonal phase and within a shorter time than is required for any significant transition to the hexagonal ice phase to occur It is.

【００３３】 この趣旨は、水が立方体または六角形の形状の結晶、または非晶形としての非
結晶、または凍結保護物質、タンパク質、炭水化物または脂質である任意の分子
への結合であろうとなかろうと、水のすべての形態に反復して適用することがで
きる。この概念をわかりやすくするために、凍結生体試料中の水は比エネルギー
準位Ｅを有していると記述することができる。凍結生体試料では、次のような水
形態の複数の定義可能なエネルギー準位がある。The intent is whether water is a crystal in the shape of cubes or hexagons, or amorphous as an amorphous form, or whether it is bound to any molecule that is a cryoprotectant, protein, carbohydrate or lipid, It can be applied repeatedly to all forms of water. To make this concept easier to understand, it can be stated that water in a frozen biological sample has a specific energy level E. In a frozen biological sample, there are several definable energy levels in the form of water as follows.

【００３４】 Ｅ_１ Ｅ_２ Ｅ_３ ・・・・ Ｅ_ｎ 調製方法、試料の特性、凍結保護物質または他の添加剤の使用、および使用さ
れる冷却速度は、これらの異なる水形態の相対速度を決定する。各エネルギー準
位は、その転移または融解の開始温度、および転移または溶解の速度の温度依存
性を決定する。[0034] _{E 1 E 2 E 3 ···· E} n preparation, properties of the sample, the use of cryoprotectants or other additives, and the cooling rate used is the relative speed of these different water forms decide. Each energy level determines its onset of transition or melting, and the temperature dependence of the rate of transition or dissolution.

【００３５】 制御式乾燥法は、ある相から別の第２の相への転移時に、また、転移が完了す
るのに必要とされるよりも少ない時間内に、水のこれらの異なる各々の状態を移
動させなければならない。したがって、この乾燥方法は、いくつかの条件を満た
すことを必要とする。The controlled drying method is used to control each of these different states of water during the transition from one phase to another, and within less time than required to complete the transition. Must be moved. Therefore, this drying method needs to satisfy several conditions.

【００３６】 第１として、その最低転移温度より高い温度上昇がない乾燥機に試料を装填す
べきである。温度の上昇が生じる場合には、これは明らかな転移が生じないよう
に短時間でなければならない。理想的には、装填は純粋な超急速冷却非晶形水に
関して、最低と認識しうる−１６０℃の転移よりもかなり低い−１９０℃で液体
窒素下において行う。しかしながら、試料が主として−１００℃から−１３０℃
程度でガラス転移する立方晶氷、又は水及び凍結保護物質の混合物である場合、
閉回路冷凍システムが転移開始以下の試料温度を維持し得るのに十分であろう。First, the sample should be loaded into a dryer that has no temperature rise above its minimum transition temperature. If a rise in temperature occurs, this must be brief so that no apparent transition occurs. Ideally, the loading is carried out under pure nitrogen at -190 ° C, which is much lower than the lowest discernible -160 ° C transition for pure ultra-cooled amorphous water. However, the sample is mainly at -100 ° C to -130 ° C.
Cubic ice, or a mixture of water and cryoprotectants,
It will be sufficient for the closed circuit refrigeration system to be able to maintain the sample temperature below the onset of the transition.

【００３７】 第２として、装填した後は、その試料は真空にさらし、コンデンサー表面に面
して直列とすべきである。これらに対する基準は、試料中に存在する水相の性質
によって再度決定する。Second, after loading, the sample should be subjected to a vacuum and in series with the surface of the condenser. The criteria for these are again determined by the nature of the aqueous phase present in the sample.

【００３８】 第３として、特定の相の乾燥時におけるチャンバー内の真空は、除去されるべ
き相中の水の飽和蒸気圧に少くとも相当するか、またはそれよりも低い水の分圧
を形成しなければならない。この飽和蒸気圧は、水相の特性及びその温度に左右
される。したがって、−１６０℃から−１３０℃の転移範囲内の純粋な非晶形水
に関するおよその飽和蒸気圧は、それぞれ６×１０^−１２ｍｂａｒ（６×１０^{− １０} Ｐａ）（−１６０℃）、および５×１０^-７ｍｂａｒ（５×１０^−５Ｐａ） （−１３０℃）である。この同一温度範囲、−１６０℃から−１３０℃における
非晶質から立方晶氷への転移時間は５×１０^５分から５分間であるので、乾燥は
−１５０℃から−１４０℃程度の温度になるまでは非常に遅く、５×１０^−１０ ｍｂａｒ（５×１０^−８Ｐａ）から２×１０^−８ｍｂａｒ（２×１０^−６Ｐａ）
の真空が必要とされる。立方晶氷の場合は、その飽和蒸気圧は非晶形水の場合よ
りも１ｌｏｇ低い程度であるので、その転移開始よりも低い−１３０℃では、も
しあるにしても乾燥はほとんど生じない。転移範囲−１３０℃から−１００℃の
場合、立方晶氷の飽和蒸気圧は約５×１０^−８ｍｂａｒ（５×１０^−６Ｐａ）か
ら９×１０^−５ｍｂａｒ（９×１０^−３Ｐａ）である。立方晶から六方晶への転
移時間は、それぞれ７００分および１０９分である。Third, the vacuum in the chamber during drying of a particular phase creates a partial pressure of water that is at least equal to or lower than the saturated vapor pressure of the water in the phase to be removed. Must. This saturated vapor pressure depends on the characteristics of the aqueous phase and its temperature. Therefore, the approximate saturation vapor pressures regarding pure amorphous water in the transition range of -130 ° C. from -160 ° C., respectively ^{6 × 10 -12 mbar (6 ×} 10 - 10 Pa) (- 160 ℃), and 5 × 10 ⁻⁷ mbar (5 × 10 ⁻⁵ Pa) (−130 ° C.). In this same temperature range, the transition time from amorphous to cubic ice in the temperature range of -160 ° C to -130 ° C is 5 × 10 ⁵ minutes to 5 minutes, so that the drying temperature is about −150 ° C. to −140 ° C. Very slow until 5 × 10 ⁻¹⁰ mbar (5 × 10 ⁻⁸ Pa) to 2 × 10 ⁻⁸ mbar (2 × 10 ⁻⁶ Pa)
Of vacuum is required. In the case of cubic ice, its saturation vapor pressure is on the order of 1 log lower than in the case of amorphous water, so that at -130 ° C., lower than its onset of transformation, little if any drying occurs. For the transition range of -130 ° C to -100 ° C, the saturated vapor pressure of cubic ice is about 5 × 10 ⁻⁸ mbar (5 × 10 ⁻⁶ Pa) to 9 × 10 ⁻⁵ mbar (9 × 10 ⁻³ Pa). It is. The transition time from cubic to hexagonal is 700 minutes and 109 minutes, respectively.

【００３９】 したがって、飽和蒸気圧は、乾燥するための真空要求条件を決定し、存在する
すべての水相に適用することができる。同様の真空基準はすべての相に適用可能
ではなく、むしろ相依存性であることに注意することが重要である。Thus, the saturated vapor pressure determines the vacuum requirements for drying and can be applied to any water phase present. It is important to note that similar vacuum criteria are not applicable to all phases, but rather are phase dependent.

【００４０】 真空の別の基準は、形成される平均自由路が試料とコンデンサー表面との距離
を超えていることである。理想的には、これは１０倍超過であるべきである。コ
ンデンサー表面は試料から除去される水相の開始転移温度よりも低い温度でなけ
ればならず、それによって、乾燥時にこの表面上で凝縮される水の飽和蒸気圧は
試料内における水相の場合よりも著しく低くなる。理想的には、これは３オーダ
ー低くあるべきである。多数の水相を含む試料の場合、コンデンサー表面の温度
は、除去されるべき最も安定性の小さい残留氷相の転移開始よりも低く保たれて
いるべきである。理想的には、コンデンサーも試料に面して整列されているべき
である。Another criterion for vacuum is that the mean free path formed exceeds the distance between the sample and the capacitor surface. Ideally, this should be over 10 times. The condenser surface must be at a temperature below the onset transition temperature of the aqueous phase removed from the sample, so that the saturated vapor pressure of water condensed on this surface during drying is lower than for the aqueous phase in the sample. Will also be significantly lower. Ideally, this should be three orders of magnitude lower. For samples containing multiple aqueous phases, the temperature at the condenser surface should be kept below the onset of the transition of the least stable residual ice phase to be removed. Ideally, the condenser should also be aligned facing the sample.

【００４１】 試料が装填され、真空およびコンデンサー表面にさらされたならば、試料およ
び試料ホルダーは、水分子の移動性を増し、その結果それらの逃避が生じるよう
に加熱されなければならない。これは、複数の相を含有する資料の乾燥、または
水のエネルギーレベルにおいて重要な要素である。試料の温度は正確に知るべき
であり、試料加熱の温度および速度のコントロールは正確に制御されねばならな
い。これは、試料中における水の各相の乾燥が連続的であることを保証するため
に必要である。Once the sample has been loaded and exposed to the vacuum and condenser surfaces, the sample and sample holder must be heated to increase the mobility of the water molecules, resulting in their escape. This is an important factor in the drying of materials containing multiple phases, or the energy level of water. The temperature of the sample must be accurately known, and the control of the temperature and rate of sample heating must be precisely controlled. This is necessary to ensure that the drying of each phase of the water in the sample is continuous.

【００４２】 したがって、エネルギーレベルＥ_１、およびＥ_２----Ｅ_ｎ、ただしＥ_１が最も
安定性が小さい、の水の複数相を含む試料については、Ｅ_１がＥ_２へのその転移
前に、Ｅ_２がＥ_３へのその転移前等々に除去されるような速度で加熱が行われね
ばならない。このことは、下記式によって決定されるように昇華が生じるように
、非平衡乾燥条件、および連続速度における加熱または一定温度レベルに保つこ
とによる加熱を要する。Thus, for a sample containing multiple phases of water at energy levels E ₁ and E ₂ --- E _n , where E ₁ is the least stable, E ₁ has its transition to E ₂ before, E ₂ must be performed is heated at such a rate that is removed so before its transition to E _3. This requires non-equilibrium drying conditions and heating at a continuous rate or by maintaining a constant temperature level so that sublimation occurs as determined by the following equation:

【００４３】[0043]

【数１】 式中、Ｊｓ＝昇華速度ｇｃｍ^−１ｓｅｃ^−１、Ｎ ＝蒸発係数、Ｐｓ＝飽和蒸気 圧、Ｍ ＝水の分子量、Ｑ ＝普遍気体定数、Ｔ ＝試料の絶対温度。(Equation 1) Where Js = sublimation rate gcm ^-1 sec ^-1 , N = evaporation coefficient, Ps = saturated vapor pressure, M = molecular weight of water, Q = universal gas constant, T = absolute temperature of sample.

【００４４】 これは、特定相が除去されるための転移速度と一致する。例えば、非晶質から
立方晶への転移速度は次の式で表される。This is consistent with the transition rate for the removal of a particular phase. For example, the transition rate from amorphous to cubic is represented by the following equation.

【００４５】 Ｅ＝２．０４×１０^２８×ｅｘｐ（−０．４６５Ｔ） 一方、転移ウィンドウがＴ_１からＴ_２である場合は、昇華速度および転移速度
はこの区間の温度に応じて変動する。このウィンドウＴ_１からＴ_２への加熱速度
は、任意の特定温度における転移が完了する前に、昇華が試料の全寸にわたって
生じるような速度でなければならない。E = 2.04 × 10 ²⁸ × exp (−0.465T) On the other hand, when the transition window is from T ₁ to T ₂ , the sublimation rate and the transition rate vary according to the temperature in this section. Heating rate from this window T ₁ to T ₂ are, prior to transfer at any particular temperature is completed, sublimation must be such a rate that occur over the entire dimension of the sample.

【００４６】 このようにして、制御式分子蒸留乾燥の目的、すなわち、特定相の氷晶成長、
形成または融解なしに、各相の特性に適した条件下で水の各相の連続除去が達成
される。In this way, the purpose of controlled molecular distillation drying, namely, the growth of ice crystals of a specific phase,
Without formation or melting, continuous removal of each phase of water is achieved under conditions appropriate for the properties of each phase.

【００４７】 好ましい実施形態においては、試料は、氷晶形成が試料に損傷を起こす程度以
下であるような適当な方法によって冷却される。これは、液体窒素への浸漬、液
体窒素蒸気への露出、または他の類似の急速凍結工程によるものであってよい。
凍結された後、試料は最も不安定な氷形の転移温度以下で貯蔵される。非晶質氷
の場合、これは−１６０℃以下であることが好ましい。次いで、試料を試料ホル
ダーに装填し、−１９６℃まで事前冷却し、分子蒸留乾燥機へ移す。その後、乾
燥機チャンバーを閉じ、完全真空に密封する。再結晶化を回避するため、水和試
料は、すべての操作にわたって最も不安定な氷形の転移温度以下のままでなけれ
ばならない。In a preferred embodiment, the sample is cooled by any suitable method such that ice crystal formation is no more than damaging to the sample. This may be by immersion in liquid nitrogen, exposure to liquid nitrogen vapor, or other similar quick freezing process.
After freezing, the samples are stored below the most unstable ice-shaped transition temperature. In the case of amorphous ice, this is preferably below -160 ° C. The sample is then loaded into the sample holder, pre-cooled to -196 ° C and transferred to a molecular distillation dryer. Thereafter, the dryer chamber is closed and sealed to full vacuum. To avoid recrystallization, the hydrated sample must remain below the most unstable ice-shaped transition temperature over all operations.

【００４８】 試料が装填されると、高真空（１０^−８ｍｂａｒ（１０^−６Ｐａ）から１０^{− ６} ｍｂａｒ（１０^−４Ｐａ））がチャンバー内に形成される。試料は、チャンバ
ー内の平均自由路よりもコンデンサー表面（液体窒素冷却チャンバー壁）のかな
り近くに置く。コンデンサーの温度は、試料の温度よりも常に下でなければなら
ない。非晶質試料の場合、コンデンサーは−１９６℃であることが好ましい。[0048] When the sample is loaded, ⁽¹⁰ from ^{10 -8 mbar (10 -6 Pa)} - 6 mbar (10 -4 Pa)) high vacuum is formed in the chamber. The sample is placed much closer to the condenser surface (liquid nitrogen cooled chamber wall) than the mean free path in the chamber. The temperature of the condenser must always be below the temperature of the sample. In the case of an amorphous sample, the condenser is preferably at -196 ° C.

【００４９】 次いで、試料ホルダーがプログラム制御ヒーターマイクロプロセッサー熱電対
ループで加熱される。加熱プログラムは、試料の特性に従って決定する。非晶質
、立方晶及び六方晶氷を含む試料に対する典型的プログラムは、−１８０℃から
−１５０℃まで１０℃/ｈｒ、−１５０℃から−７０℃まで１℃/ｈｒ、および−
７０℃から＋２０℃まで１０℃/ｈｒである。The sample holder is then heated in a program controlled heater microprocessor thermocouple loop. The heating program is determined according to the characteristics of the sample. Typical programs for samples containing amorphous, cubic and hexagonal ice are 10 ° C / hr from -180 ° C to -150 ° C, 1 ° C / hr from -150 ° C to -70 ° C, and-
10 ° C / hr from 70 ° C to + 20 ° C.

【００５０】 乾燥後、コンデンサー表面または任意の他の源の水から試料を物理的又は機械
的に単離し、真空または乾燥不活性ガス下で密閉容器中に貯蔵しなければならな
い。試料は、真空度チャンバー内の適当な容器内に密閉し、その後の保管および
包装用に取出しが可能である。ある形態では、試料はガラスバイアル内に入れら
れ、サイクルの最後にブチルゴム凍結乾燥ストッパーで密封される。分子蒸留乾
燥機の操作に関する更に具体的な詳細は、米国特許第４，８６５，８７１号、５
，３３６，６１６号に記載されており、それらの全内容はこれによって引用によ
り本明細書に援用する。After drying, the sample must be physically or mechanically isolated from the condenser surface or any other source of water and stored in a closed container under vacuum or dry inert gas. The sample can be sealed in a suitable container in a vacuum chamber and removed for subsequent storage and packaging. In one form, the sample is placed in a glass vial and sealed with a butyl rubber lyophilization stopper at the end of the cycle. For more specific details regarding the operation of a molecular distillation dryer, see US Pat.
, 336, 616, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

【００５１】 本明細書に含まれる開示の検討に関し、当業者は、本発明の原理を使用して、
広範囲のコラーゲンベース組織を処理することができると理解すべきである。す
なわち、腱、靭帯、静脈洞組織等などの軟骨組織、脳、脊髄、末梢神経および他
の類似した神経組織の硬膜、真皮および他の皮膚組織、静脈および動脈などの維
管束組織、心臓弁等、角膜の組織および視覚系の組織を含む他のコラーゲン、歯
肉などの歯根膜組織、および、コラーゲン基質を含んでいる他の軟繊維、などの
コラーゲンベース組織を処理および保存することが本発明の範囲内であると考え
られる。収集時のコラーゲンベース組織の大きさ、形状、細胞組織および条件に
よって、濃度、時間、温度等などの特定条件が必要とされ得ることを当業者は理
解するべきである。そのような調整は、本明細書で開示したパラメーターのルー
チン変更によって決定することもでき、したがって、本発明の結果を実質的に達
成するために使用することができる。Regarding the discussion of the disclosure contained herein, one of ordinary skill in the art, using the principles of the present invention,
It should be understood that a wide range of collagen-based tissues can be processed. Cartilage tissue such as tendons, ligaments, sinus tissue, etc., dura of brain, spinal cord, peripheral nerves and other similar nerve tissues, dermis and other skin tissues, vascular tissues such as veins and arteries, heart valves The present invention provides for processing and preserving collagen-based tissues, such as other collagens, including corneal and visual tissues, periodontal tissues, such as gingiva, and other soft fibers, including a collagen matrix. Is considered to be within the range. One of skill in the art should understand that certain conditions such as concentration, time, temperature, etc. may be required depending on the size, shape, cell structure and conditions of the collagen-based tissue at the time of collection. Such adjustments can also be determined by routine alteration of the parameters disclosed herein, and can therefore be used to substantially achieve the results of the present invention.

【００５２】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために記載されている。以
下の実施例に記載された技術は、発明者らによって発見された技術が本発明の実
施において十分作用するよう説明したものであり、したがって、その実施につい
ての好ましい方法を構成するものと考えることができることを当業者は十分に理
解すべきである。しかしながら、当業者は本明細書に鑑みて、開示されている特
定の実施形態において多くの変更が可能であり、さらに、本発明の範囲から逸脱
することなく、同様な結果または類似の結果を得ることができることを認識すべ
きである。The following examples are provided to illustrate preferred embodiments of the present invention. The techniques described in the following examples are intended to illustrate that the techniques discovered by the inventors work satisfactorily in the practice of the present invention, and therefore should be considered as constituting a preferred method of practicing the same. One of ordinary skill in the art should appreciate that However, one of ordinary skill in the art, in light of the present specification, will be able to make many variations in the specific embodiments disclosed and still obtain similar or similar results without departing from the scope of the invention. It should be recognized that it is possible.

【００５３】 （実施例１） 調達： 湯はぎを受けていない新鮮な屠殺後のブタをドナー組織として得る。心臓弁は
、後の外科的体内移植を容易にするのに十分な冠状および筋肉縁丈（ｓｋｉｒｔ
ｌｅｎｇｔｈｓ）がある形でドナーから切除しなければならない。所望の場合
、輸送用の安定化溶液にドナー組織を入れることもできる。しかしながら、本ケ
ースではこれは必要ではなかった。Example 1 Procurement: Freshly slaughtered pigs that have not been blanched are obtained as donor tissue. The heart valve should have sufficient coronal and muscle margin (skirt) to facilitate subsequent surgical implantation.
lengths must be excised from the donor in some way. If desired, the donor tissue can be included in a stabilizing solution for transport. However, this was not necessary in this case.

【００５４】 非細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）： 過剰の血液および組織粒子を除去するため、生理食塩水でその切除組織をすす
ぐ。その後、約４℃で約１時間、第１洗浄液中に置く。第１洗浄液は、約２０ｍ
ＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥ
ＰＥＳ）緩衝溶液に溶解した、約０．２４ｍＭのｔ−オクチルフェノキシポリエ
トキシエタノール（トリトンＸ−１００）、約２５ｍＭのエチレンジアミンテト
ラアセテート（ＥＤＴＡ）、および約１Ｍの塩化ナトリウムからなる。あるいは
、ロズウェルパークメモリアル研究所（ＲＰＭＩ）溶液に溶解したＴＸ−１００
、塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡの溶液を第１洗浄液として使用してもよい。そ
の溶液中に完全にドナー組織を浸漬できるように、十分量の第１洗浄液を使用す
べきである。全表面が十分に洗浄できるよう撹拌を行うべきである。浸漬ステッ
プの完了時に、第１洗浄液を廃棄すると同時に、ドナー組織から第１洗浄液を除
液する。Decellularization: Rinse the excised tissue with saline to remove excess blood and tissue particles. Then, it is placed in the first cleaning solution at about 4 ° C. for about 1 hour. The first cleaning liquid is about 20m
M of N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HE
Consists of about 0.24 mM t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), about 25 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), and about 1 M sodium chloride dissolved in a (PES) buffer solution. Alternatively, TX-100 dissolved in Roswell Park Memorial Laboratory (RPMI) solution
, Sodium chloride and EDTA may be used as the first cleaning solution. A sufficient amount of the first washing solution should be used so that the donor tissue can be completely immersed in the solution. Agitation should be provided to ensure that all surfaces are sufficiently cleaned. At the completion of the immersion step, the first washing solution is discarded, and at the same time, the first washing solution is removed from the donor tissue.

【００５５】 約１時間の後に、冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）にその組織を
移し、約１時間から４時間までＶＳＭＤ中で組織をインキュベートする。ＶＳＭ
Ｄには、改質７５％マルトデキストリン、約１０ｍＭエチレンジアミンテトラア
セテート（ＥＤＴＡ）、水、およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれている。ＶＳＭＤ溶液のｐＨ値
は、約ｐＨ７．４から７．５に調整するのが好ましい。その溶液にドナー組織が
完全に浸漬するように十分量のＶＳＭＤを使用すべきである。混合と組織周囲の
流体の流れを促進するよう撹拌を行うべきである。浸漬ステップの完了時に、そ
の溶液を廃棄するとともに、ドナー組織からＶＳＭＤを除液する。After about 1 hour, transfer the tissue to the cryopreservation solution maltodextrin (VSMD) and incubate the tissue in the VSMD for about 1 to 4 hours. VSM
D includes modified 75% maltodextrin, about 10 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), water, and N-2-hydroxyethylpiperazine-N ′
-2-ethanesulfonic acid (HEPES). Preferably, the pH value of the VSMD solution is adjusted from about pH 7.4 to 7.5. Sufficient VSMD should be used to completely immerse the donor tissue in the solution. Agitation should be provided to promote mixing and fluid flow around the tissue. Upon completion of the immersion step, the solution is discarded and the VSMD is removed from the donor tissue.

【００５６】 脱水完了後、ドナー組織を第２洗浄液に入れ、穏やかに撹拌する。現在の実施
例では、心臓弁を約２４時間、室温にて第２洗浄液中で撹拌した。第２洗浄液に
は、ｐＨ約７．４から７．５の脱気ロズウェルパークメモリアル研究所（ＲＰＭ
Ｉ）溶液中に、約４０ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、約２５
ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、約１０ｍＭのデフェロ
キサミン、約１０ｍＭのフィチン酸、および約１００ｍＭのアミノグアニジンが
含まれている。第２洗浄液は、約２５０ｍＭのリンコマイシン、約１０００活性
単位／ｍｌのポリミキシンＢ硫酸塩、約０．５Ｍのセフォキシチン、約２０ｍＭ
のバンコマイシン、および約２５ｍＭのアンフォテリシンＢを任意に含むことが
できる。得られた処理組織は、好ましくは、その洗浄剤と同じｐＨ、さらに好ま
しくは、約７．４から約７．５のｐＨ値の滅菌生理的食塩水で洗浄する。After the completion of the dehydration, the donor tissue is placed in the second washing solution and gently stirred. In the current example, the heart valve was agitated in the second lavage at room temperature for about 24 hours. The second cleaning solution includes a degassed Roswell Park Memorial Laboratory (RPM) having a pH of about 7.4 to 7.5.
I) About 40 mM n-octyl-β-D-glucopyranoside, about 25 mM
It contains about mM mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), about 10 mM deferoxamine, about 10 mM phytic acid, and about 100 mM aminoguanidine. The second wash was about 250 mM lincomycin, about 1000 activity units / ml polymyxin B sulfate, about 0.5 M cefoxitin, about 20 mM
Vancomycin, and about 25 mM amphotericin B. The resulting treated tissue is preferably washed with sterile saline at the same pH as the detergent, more preferably at a pH value of about 7.4 to about 7.5.

【００５７】 その洗浄処理組織は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝水に約１５０活性単位／ｍｇ
のＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ、約１０ｍＭのデフェロキサミン、約１００ｍＭの
フィチン酸、および約１００ｍＭのアミノグアニジンを含む酵素溶液中に置いた
。さらに好ましい実施形態では、そのＤＮａｓｅ溶液は、抗菌物質として、約２
５０ｍＭのリンコマイシン、約１０００活性単位／ｍｌのポリミキシンＢ硫酸塩
、０．５Ｍのセフォキシチン、約２０ｍＭのバンコマイシン、および２５ｍＭの
アンホテリシンＢをさらに含んでいる。心臓弁は約３７℃で約２４時間、その酵
素溶液中でインキュベートする。その溶液にドナー組織が完全に浸漬するように
十分量の酵素溶液を使用すべきである。混合と組織周囲の流体の流れを促進する
よう撹拌を行うべきである。酵素含有溶液による処理が完了した後、酵素溶液を
取り除き廃棄する。滅菌脱気生理的食塩水で、各洗浄毎に新しい溶液を使用して
、組織を３回洗浄する。The washed tissue was treated with about 150 activity units / mg in 20 mM HEPES buffer water.
Of DNase Type I, about 10 mM deferoxamine, about 100 mM phytic acid, and about 100 mM aminoguanidine. In a further preferred embodiment, the DNase solution comprises about 2
It further comprises 50 mM lincomycin, about 1000 activity units / ml polymyxin B sulfate, 0.5 M cefoxitin, about 20 mM vancomycin, and 25 mM amphotericin B. The heart valve is incubated in the enzyme solution at about 37 ° C. for about 24 hours. Enough enzyme solution should be used so that the donor tissue is completely immersed in the solution. Agitation should be provided to promote mixing and fluid flow around the tissue. After the treatment with the enzyme-containing solution is completed, the enzyme solution is removed and discarded. Wash the tissue three times with sterile degassed saline, using fresh solution for each wash.

【００５８】 凍結保存： 上記のステップの完了時に、少なくとも４時間、第２ＶＳＭＤ中でその組織を
インキュベートする。第２ＶＳＭＤは、同一組成および第１ＶＳＭＤを有するよ
うに調製する。その溶液にドナー組織が完全に浸漬するように十分量のＶＳＭＤ
を使用すべきである。混合と、組織周囲の流体の流れを促進するよう撹拌を行う
べきである。インキュベーション後、その溶液から組織を取り出し、さらに最低
４時間、新しいＶＳＭＤ溶液中でインキュベーションする。この第２ＶＳＭＤ浸
潤の完了後、組織の除液を行い、ＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチ中に置く。Cryopreservation: At the completion of the above steps, incubate the tissue in a second VSMD for at least 4 hours. The second VSMD is prepared to have the same composition and the first VSMD. A sufficient amount of VSMD so that the donor tissue is completely immersed in the solution
Should be used. Mixing and agitation should be performed to promote fluid flow around the tissue. After incubation, the tissue is removed from the solution and incubated in a fresh VSMD solution for a minimum of 4 hours. After completion of this second VSMD infiltration, the tissue is drained and placed in a TYVEK® pouch.

【００５９】 組織をＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチ中に密閉し、上述のような氷晶形成量を
防止または制限する方法でそれを凍結および凍結乾燥する。その乾燥方法の全体
は、連続約３日間にわたって行われる。一般的に、この方法は、約−１６０℃未
満で試料を冷却し、真空下にその冷却試料を置き、上述のように加温することを
含んでいる。コンシステンシーと精度を保つため、この方法では、プログラム制
御温度調節計を使用することができる。室温に達する際、周囲水分との接触を防
ぎながら、また、無菌条件下で、その乾燥組織試料を移し包装する。The tissue is sealed in a TYVEK® pouch and it is frozen and lyophilized in a manner to prevent or limit ice crystal formation as described above. The entire drying process is performed for about three consecutive days. Generally, the method involves cooling the sample below about -160 <0> C, placing the cooled sample under vacuum, and warming as described above. To maintain consistency and accuracy, the method can use a program-controlled temperature controller. Upon reaching room temperature, the dried tissue sample is transferred and packaged while preventing contact with ambient moisture and under aseptic conditions.

【００６０】 （実施例２） 調達： ドナー組織を人間ドナーから得る。撓側動脈、伏在静脈、または臍帯は、後の
外科的体内移植を容易に行うのに十分な組織である形でドナーから切除すべきで
ある。輸送用の安定化溶液にドナー組織を入れる。安定化溶液は、冷却ロズウェ
ルパークメモリアル研究所（ＲＰＭＩ）溶液またはウィスコンシン大学（ＵＷ）
溶液を追加の抗生物質とともに含み得る。好適な抗菌物質には、セフォキシチン
、リンコマイシン、ポリミキシン、バンコマイシンおよびアンフォテリシンがあ
る。冷却安定化溶液中の組織は、処理のためにできるだけ早く送る。処理設備で
の受取にあたって、その適性を決定するために、さらなる処理用組織の試料を受
け取る。Example 2 Procurement: Donor tissue is obtained from a human donor. The contralateral artery, saphenous vein, or umbilical cord should be excised from the donor in sufficient tissue to facilitate subsequent surgical implantation. Place donor tissue in stabilizing solution for transport. The stabilizing solution may be a cooled Roswell Park Memorial Laboratory (RPMI) solution or the University of Wisconsin (UW)
The solution may include additional antibiotics. Suitable antibacterials include cefoxitin, lincomycin, polymyxin, vancomycin and amphotericin. The tissue in the cold stabilized solution is sent for processing as soon as possible. Upon receipt at the processing facility, a sample of further tissue for processing is received to determine its suitability.

【００６１】 非細胞化： 過剰の血液および組織粒子を除去するため、生理食塩水でその切除組織をすす
ぐ。 その後、約４℃で約１時間、第１洗浄液中に置く。第１洗浄液は、約２０ ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｈ
ＥＰＥＳ）緩衝溶液に溶解した、約０．２４ｍＭのｔ−オクチルフェノキシポリ
エトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、約２５ｍＭのエチレンジアミンテ
トラアセテート（ＥＤＴＡ）、および約１Ｍの塩化ナトリウムからなる。あるい
は、ロズウェルパークメモリアル研究所（ＲＰＭＩ）溶液に溶解したトリトンＸ
−１００、塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡの溶液を第１洗浄液としてを使用して
もよい。その溶液中にドナー組織を完全に浸漬できるように、十分量の第１洗浄
液を使用すべきである。全表面が十分に洗浄できるよう撹拌を行うべきである。
浸漬ステップの完了時に、第１洗浄液を廃棄すると同時に、ドナー組織から第１
洗浄液を除液する。Decellularization: Rinse the excised tissue with saline to remove excess blood and tissue particles. Then, it is placed in the first cleaning solution at about 4 ° C. for about 1 hour. The first washing solution contains about 20 mM of N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (H
It consists of about 0.24 mM t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), about 25 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), and about 1 M sodium chloride dissolved in a buffer solution (EPES). Alternatively, Triton X dissolved in Roswell Park Memorial Laboratory (RPMI) solution
A solution of -100, sodium chloride and EDTA may be used as the first cleaning solution. A sufficient amount of the first washing solution should be used so that the donor tissue can be completely immersed in the solution. Agitation should be provided to ensure that all surfaces are sufficiently cleaned.
Upon completion of the immersion step, the first wash solution is discarded while the first
Remove the cleaning solution.

【００６２】 約１時間の後に、冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）にその組織を
移し、約１時間から４時間までＶＳＭＤ中で組織をインキュベートする。ＶＳＭ
Ｄには、改質７５％マルトデキストリン、約１０ｍＭエチレンジアミンテトラア
セテート（ＥＤＴＡ）、水、およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれている。ＶＳＭＤ溶液のｐＨ値
は、約ｐＨ７．４から７．５に調整するのが好ましい。その溶液にドナー組織が
完全に浸漬するように十分量のＶＳＭＤを使用すべきである。混合と組織周囲の
流体の流れを促進するよう撹拌を行うべきである。浸漬ステップの完了時に、そ
の溶液を廃棄するとともに、ドナー組織からＶＳＭＤを除液する。 脱水完了後、ドナー組織を第２洗浄液に入れ、穏やかに撹拌する。現在の実施
例では、心臓弁を約２４時間、室温にて第２洗浄液中で撹拌した。第２洗浄液に
は、ｐＨ約７．４から７．５の脱気ロズウェルパークメモリアル研究所（ＲＰＭ
Ｉ）溶液中に、約４０ｍＭのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、約２５
ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、約１０ｍＭのデフェロ
キサミン、約１０ｍＭのフィチン酸、および約１００ｍＭのアミノグアニジンが
含まれている。第２洗浄液は、約２５０ｍＭのリンコマイシン、約１０００活性
単位／ｍｌのポリミキシンＢ硫酸塩、約０．５Ｍのセフォキシチン、約２０ｍＭ
のバンコマイシン、および約２５ｍＭのアンフォテリシンＢを任意に含むことが
できる。After about 1 hour, transfer the tissue to the cryopreservation solution maltodextrin (VSMD) and incubate the tissue in the VSMD for about 1 to 4 hours. VSM
D includes modified 75% maltodextrin, about 10 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), water, and N-2-hydroxyethylpiperazine-N ′
-2-ethanesulfonic acid (HEPES). Preferably, the pH value of the VSMD solution is adjusted from about pH 7.4 to 7.5. Sufficient VSMD should be used to completely immerse the donor tissue in the solution. Agitation should be provided to promote mixing and fluid flow around the tissue. Upon completion of the immersion step, the solution is discarded and the VSMD is removed from the donor tissue. After dehydration is complete, the donor tissue is placed in a second wash and gently agitated. In the current example, the heart valve was agitated in the second lavage at room temperature for about 24 hours. The second cleaning solution includes a degassed Roswell Park Memorial Laboratory (RPM) having a pH of about 7.4 to 7.5.
I) About 40 mM n-octyl-β-D-glucopyranoside, about 25 mM
It contains about mM mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA), about 10 mM deferoxamine, about 10 mM phytic acid, and about 100 mM aminoguanidine. The second wash was about 250 mM lincomycin, about 1000 activity units / ml polymyxin B sulfate, about 0.5 M cefoxitin, about 20 mM
Vancomycin, and about 25 mM amphotericin B.

【００６３】 得られた処理組織は、好ましくは、その洗浄剤と同じｐＨ、さらに好ましくは
、約７．４から約７．５のｐＨ値の滅菌生理的食塩水で洗浄する。The resulting treated tissue is preferably washed with sterile saline at the same pH as the detergent, more preferably at a pH of about 7.4 to about 7.5.

【００６４】 その洗浄処理組織は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に約１５０活性単位／ｍｇ
のＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ、約１０ｍＭのデフェロキサミン、約１００ｍＭの
フィチン酸、および約１００ｍＭのアミノグアニジンを含む酵素溶液中に置いた
。さらに好ましい実施形態では、そのＤＮａｓｅ溶液は、抗菌物質として、約２
５０ｍＭのリンコマイシン、約１０００活性単位／ｍｌのポリミキシンＢ硫酸塩
、０．５Ｍのセフォキシチン、約２０ｍＭのバンコマイシン、および２５ｍＭの
アンホテリシンＢをさらに含んでいる。 心臓弁は約３７℃で約２４時間、その 酵素溶液中でインキュベートする。 その溶液にドナー組織が完全に浸漬するよ うに十分量の酵素溶液を使用すべきである。混合と組織周囲の流体の流れを促進
するよう撹拌を行うべきである。酵素含有溶液による処理が完了した後、酵素溶
液を取り除き廃棄する。滅菌脱気生理的食塩水で、各洗浄毎に新しい溶液を使用
して、組織を３回洗浄する。The washed tissue was treated with about 150 activity units / mg in 20 mM HEPES buffer.
Of DNase Type I, about 10 mM deferoxamine, about 100 mM phytic acid, and about 100 mM aminoguanidine. In a further preferred embodiment, the DNase solution comprises about 2
It further comprises 50 mM lincomycin, about 1000 activity units / ml polymyxin B sulfate, 0.5 M cefoxitin, about 20 mM vancomycin, and 25 mM amphotericin B. The heart valve is incubated in the enzyme solution at about 37 ° C. for about 24 hours. Enough enzyme solution should be used to completely immerse the donor tissue in the solution. Agitation should be provided to promote mixing and fluid flow around the tissue. After the treatment with the enzyme-containing solution is completed, the enzyme solution is removed and discarded. Wash the tissue three times with sterile degassed saline, using fresh solution for each wash.

【００６５】 凍結保存： 上記のステップの完了時に、少なくとも４時間、第２ＶＳＭＤ中でその組織を
インキュベートする。 第２ＶＳＭＤは、同一組成および第１ＶＳＭＤを有する ように調製する。その溶液にドナー組織が完全に浸漬するように十分量のＶＳＭ
Ｄを使用すべきである。混合と組織周囲の流体の流れを促進するよう撹拌を行う
べきである。インキュベーション後、その溶液から組織を取り出し、さらに最低
４時間、新しいＶＳＭＤ溶液中でインキュベーションする。 この第２ＶＳＭＤ 浸潤の完了後、組織の除液を行い、ＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチ中に置く。Cryopreservation: At the completion of the above steps, incubate the tissue in a second VSMD for at least 4 hours. The second VSMD is prepared to have the same composition and the first VSMD. A sufficient amount of VSM to completely immerse the donor tissue in the solution
D should be used. Agitation should be provided to promote mixing and fluid flow around the tissue. After incubation, the tissue is removed from the solution and incubated in a fresh VSMD solution for a minimum of 4 hours. After completion of this second VSMD infiltration, the tissue is drained and placed in a TYVEK® pouch.

【００６６】 組織をＴＹＶＥＫ（登録商標）パウチ中に密閉し、上述のような氷晶形成量を
防止または制限する方法でそれを凍結および凍結乾燥する。その乾燥方法の全体
は、連続約３日間にわたって行われる。一般的に、この方法は、約−１６０℃未
満で試料を冷却し、真空下にその冷却試料を置き、上述のように加温することを
含んでいる。コンシステンシーと精度を保つため、この方法では、プログラム制
御温度調節計を使用することができる。室温に達する際、周囲の水分との接触を
防ぎながら、また、無菌条件下で、その乾燥組織試料を移し包装する。The tissue is sealed in a TYVEK® pouch and frozen and lyophilized in a manner to prevent or limit the amount of ice crystals as described above. The entire drying process is performed for about three consecutive days. Generally, the method involves cooling the sample below about -160 <0> C, placing the cooled sample under vacuum, and warming as described above. To maintain consistency and accuracy, the method can use a program-controlled temperature controller. Upon reaching room temperature, the dried tissue sample is transferred and packaged while preventing contact with ambient moisture and under aseptic conditions.

【００６７】 （実施例３）（神経） 調達： 神経組織を入手し、２４０ｍｇ／ｌのセフォキシチン、１２０ｍｇ／ｌのリン
コマイシン、１００ｍｇ／ｌのポリミキシンＢ、３０ｍｇ／ｌのバンコマイシン
、および２５ｍｇ／ｌのアンフォテリシンを含む抗菌物質含有の、または非含有
の滅菌ロズウェルパークメモリアル研究所（ＲＰＭＩ）溶液へ直ちに入れた。も
しほぼ４８時間ごとにこの溶液を新しい滅菌溶液と交換すれば、その組織を約７
日間この溶液中に保つことができる。理想的には、この組織の処理は、調達から
約２４時間以内に開始する。Example 3 (Nerve) Procurement: Neural tissue was obtained and 240 mg / l cefoxitin, 120 mg / l lincomycin, 100 mg / l polymyxin B, 30 mg / l vancomycin and 25 mg / l Immediately placed in sterile Roswell Park Memorial Laboratory (RPMI) solution with or without antimicrobial containing amphotericin. If the solution is replaced with a fresh sterile solution approximately every 48 hours, the tissue will
It can be kept in this solution for days. Ideally, the processing of this organization will begin within about 24 hours of procurement.

【００６８】 非細胞化： 輸送溶液（ＲＰＭＩ）を除去し、燐酸ナトリウム緩衝液（約０．６３９％Ｎａ _２ ＨＰＯ_４および約０．０６９％ＮａＨ_２ＰＯ_４）、および約０．５％のトリト
ンＸ−１００（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）、約１Ｍの塩化ナト
リウム、約１０ｍＭのＥＤＴＡからなる第１非細胞化溶液と交換する。この溶液
には、セフォキシチン、リンコマイシン、ポリミキシン、バンコマイシン、ａｎ
ｓアンフォテリシンなどの抗菌物質を任意に含むことができる。室温で約５〜３
０分間、穏やかに撹拌しながら、組織をこの溶液中ですすぐ。溶液を新しい溶液
と交換し、さらに約１５〜２４時間撹拌する。Decellularization: The transport solution (RPMI) is removed and sodium phosphate buffer (about 0.639% Na ₂ HPO₄And about 0.069% NaH₂PO₄), And about 0.5% trito
X-100 (n-octyl-β-D-glucopyranoside), about 1 M sodium chloride
Exchange with a first decellularization solution consisting of lium, about 10 mM EDTA. This solution
Include cefoxitin, lincomycin, polymyxin, vancomycin, an
An antimicrobial substance, such as s amphotericin, can optionally be included. About 5-3 at room temperature
The tissue is rinsed in this solution for 0 minutes with gentle agitation. Solution to new solution
And stir for about another 15-24 hours.

【００６９】 この溶液から組織を除去し、約１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン燐緩衝食塩水中
で２回、それぞれ約１５分間洗浄した。その後、この組織を約５〜３０分間すす
ぎ、次いで、抗生物質含有または非含有の、約０．６３９％Ｎａ_２ＨＰＯ_４およ
び約０．０６９％ＮａＨ_２ＰＯ_４からなる燐酸ナトリウム緩衝液に溶解した約５
．０６％ｎ−オクタン酸（カプリル酸）からなる第２非細胞化溶液中、３７℃で
ほぼ１５〜２４時間インキュベーションした。あるいは、この第２非細胞化溶液
は、抗生物質含有または非含有の、約１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した約
２％デオキシコレートからなっていてもよい。The tissue was removed from the solution and washed twice in phosphate-phosphorus buffered saline containing about 10 mM EDTA for about 15 minutes each. Then rinsed the tissue about 5-30 minutes, then antibiotic-containing or non-containing, dissolved in sodium phosphate buffer consisting of about _0.639% Na 2 HPO ₄ and about 0.069% _NaH 2 PO ₄ About 5
. Incubation for approximately 15-24 hours at 37 ° C. in a second non-cellularized solution consisting of 06% n-octanoic acid (caprylic acid). Alternatively, the second decellularized solution may consist of about 2% deoxycholate in about 10 mM HEPES buffer, with or without antibiotic.

【００７０】 この溶液から組織を除去し、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン燐緩衝食塩水中で
２回、それぞれ約１５分間洗浄した。その後、ｐＨ約７．４の、約０．９％Ｎａ
Ｃｌおよび約１０ｍＭのＭｇＣｌ_２に溶解した約５０μｇ／ｍｌのＤｎａｓｅ−
Ｉからなる溶液において撹拌を行いながら室温で約１５〜２４時間この組織をイ
ンキュベートした。この溶液から組織を除去し、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン
燐緩衝食塩液中で３回、各約１５分間洗浄した。The tissue was removed from the solution, and the cells were washed twice in phosphate-phosphorus buffered saline containing 10 mM EDTA for about 15 minutes each. Thereafter, about 0.9% Na, pH about 7.4.
Cl and about 50 μg / ml Dnase- dissolved in about 10 mM MgCl _2.
The tissue was incubated for about 15-24 hours at room temperature with stirring in the solution consisting of I. Tissue was removed from this solution and washed three times in phosphate-phosphorus buffered saline containing 10 mM EDTA for approximately 15 minutes each.

【００７１】 凍結保存： その後、約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した約３５％マルトデキストリ
ンおよび約１０ｍＭのＥＤＴＡからなる溶液において、撹拌しながら室温で約１
〜６時間この組織をインキュベートした。次いで、この組織をＴＹＶＥＫパウチ
中に密閉し、氷晶形成量を防止または制限する方法で凍結および凍結乾燥する。
その乾燥方法の全体は、連続約３日間にわたって行われる。一般的に、この方法
は、約−１６０℃未満で試料を冷却し、真空下にその冷却試料を置き、上述のよ
うに加温することを含んでいる。コンシステンシーと精度を保つため、この方法
では、プログラム制御温度調節計を使用することができる。室温に達する際、周
囲の水分との接触を防ぎながら、また、無菌条件下で、その乾燥組織試料を移し
包装する。Cryopreservation: Then, in a solution consisting of about 35% maltodextrin and about 10 mM EDTA dissolved in about 10 mM HEPES buffer, at room temperature for about 1 hour with stirring.
The tissue was incubated for ６6 hours. The tissue is then sealed in a TYVEK pouch and frozen and lyophilized in a manner to prevent or limit ice crystal formation.
The entire drying process is performed for about three consecutive days. Generally, the method involves cooling the sample below about -160 <0> C, placing the cooled sample under vacuum, and warming as described above. To maintain consistency and accuracy, the method can use a program-controlled temperature controller. Upon reaching room temperature, the dried tissue sample is transferred and packaged while preventing contact with ambient moisture and under aseptic conditions.

【００７２】 上記を考慮して、当業者は、本発明が多くの可能な実施形態を含んでいること
を認識すべきである。そのような一つの実施形態には、コラーゲンベース組織を
保存する方法であって、コラーゲンベース組織を調達すること；洗浄液でその組
織を処理すること；酵素溶液でその組織を処理すること；メイラード反応および
その後の後生的なグリコシル化最終生成物の形成による処理組織の分子架橋を防
止または抑制する技術および／または添加物によってその組織を処理すること；
反応的酸化力を有する種の分子による処理組織の分子架橋を防止または抑制する
技術および／または添加物によってその組織を処理すること；分子のフリーラジ
カルの形成および成長による処理組織の分子架橋を防止または抑制する技術およ
び／または添加物によってその組織を処理すること；凍結保存溶液中でその組織
を処理すること； および、その組織を凍結保存すること；を含んでなる方法が ある。好ましい１つの実施形態では、コラーゲンベース組織が心臓弁である。In view of the above, those skilled in the art should recognize that the present invention includes many possible embodiments. One such embodiment is a method of preserving collagen-based tissue, comprising: procuring a collagen-based tissue; treating the tissue with a wash solution; treating the tissue with an enzyme solution; And treating the tissue with techniques and / or additives that prevent or inhibit molecular crosslinking of the treated tissue by subsequent formation of epigenetic glycosylation end products;
Treating the treated tissue with techniques and / or additives to prevent or suppress molecular crosslinking of the treated tissue by reactive oxidizing species molecules; Prevent molecular crosslinking of the treated tissue by the formation and growth of free radicals of the molecule Or treating the tissue with techniques and / or additives that inhibit it; treating the tissue in a cryopreservation solution; and cryopreserving the tissue. In one preferred embodiment, the collagen-based tissue is a heart valve.

【００７３】 さらなる別の実施形態では、洗浄液は、生理学的緩衝溶液に、ｔ−オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、ｎ−オクチル−β−
Ｄ−グルコピラノシド、デオキシコール酸塩、オクタン酸（カプリル酸塩）、３
−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネ
ート（ＣＨＡＰＳ）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、塩化ナ
トリウム、および広域スペクトルの抗菌物質の１種以上を含んでいる。ある好ま
しい実施形態では、酵素溶液は、広域抗菌スペクトル抗菌物質を含む生理的緩衝
溶液に、ＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ
、ホスホリパーゼＡ、ホスホリパーゼＣ、および広範囲抗生物質の１種以上を含
んでいる。本発明の方法の１つの実施形態では、メイラード反応および後生的な
グリコシル化最終生成物の形成による分子架橋に対する技術または阻害剤には、
降下温度、グルコースおよび関連化合物のカルボニル基の分子還元から生じるよ
うな非反応性または非還元性炭水化物、およびアミノグアニジンの使用がある。
別の実施形態には、降下温度、不活性雰囲気、および、デフェロキサミンメシレ
ート、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、カタラーゼ、スーパーオキシドジス
ムターゼ、α−トコフェロール、還元型グルタチオン、６−ヒドロキシ−２，５
，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の１種以上を含む、反応的酸
化力を有する種による分子架橋に対する技術または阻害剤がある。別の実施形態
において、分子のフリーラジカルによる分子架橋に対する技術または阻害剤には
、降下温度、および、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、α−トコフェロール
、アスコルベート、還元型グルタチオン、フラボノイド、およびイノシトールヘ
キサリン酸（フィチン酸）の１種以上が含まれている。凍結保存溶液は、生理的
緩衝液に非還元型マルトデキストリンおよびエチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）を含んでいるものが好ましい。[0073] In yet another embodiment, the washing solution is a solution of t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), n-octyl-β- in a physiological buffer solution.
D-glucopyranoside, deoxycholate, octanoic acid (caprylate), 3
-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propane-sulfonate (CHAPS), ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium chloride, and one or more of the broad spectrum antimicrobial substances. In certain preferred embodiments, the enzyme solution is added to a physiological buffer solution containing a broad spectrum antimicrobial antimicrobial substance, in a DNase Type I, DNase Type II, RNase Type.
, Phospholipase A, phospholipase C, and one or more of a wide range of antibiotics. In one embodiment of the method of the present invention, techniques or inhibitors for molecular crosslinking by Maillard reaction and formation of advanced glycosylation end products include:
There is the use of non-reactive or non-reducing carbohydrates, such as those resulting from the temperature reduction, molecular reduction of the carbonyl group of glucose and related compounds, and aminoguanidine.
Other embodiments include reduced temperature, an inert atmosphere, and deferoxamine mesylate, dimethyl sulfoxide (DMSO), catalase, superoxide dismutase, α-tocopherol, reduced glutathione, 6-hydroxy-2,5
There are techniques or inhibitors against molecular crosslinking by reactive oxidizing species, including one or more of 7,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid. In another embodiment, techniques or inhibitors for molecular crosslinking by free radicals of the molecule include temperature drop and dimethyl sulfoxide (DMSO), α-tocopherol, ascorbate, reduced glutathione, flavonoids, and inositol hexaphosphate (Phytic acid). The cryopreservation solution is preferably a solution containing non-reduced maltodextrin and ethylenediaminetetraacetate (EDTA) in a physiological buffer.

【００７４】 さらに、出願人は、本明細書に記載した方法の生成物を本発明の一部をなすも
のとみなしている。したがって、そのような１つの実施形態では、その方法の生
成物とは、再水和後、移植に好適な保存コラーゲンベース組織である。別のその
ような実施形態では、生成物は、再水和された場合、移植に好適な保存心臓弁で
ある。さらなる別の実施形態は、再水和後、移植に好適な伏在静脈または他の血
管移植片である。また、本発明の別の実施形態は、再水和後、移植に好適な保存
コラーゲン基底組織である神経または神経組織である。Further, Applicants regard the products of the methods described herein as part of the present invention. Thus, in one such embodiment, the product of the method, after rehydration, is a preserved collagen-based tissue suitable for implantation. In another such embodiment, the product, when rehydrated, is a stored heart valve suitable for implantation. Yet another embodiment is a saphenous vein or other vascular graft suitable for transplantation after rehydration. Yet another embodiment of the present invention is a nerve or nerve tissue that is a preserved collagen basal tissue suitable for transplantation after rehydration.

【００７５】 本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の
概念および範囲から逸脱するこなく、本明細書に記載された方法に変更が適用で
きることは当業者において明らかであろう。当業者に明らかであるそのようなす
べての代替物および変更は、特許請求の範囲に記載されているような本発明の範
囲および概念であるとみなす。Although the compositions and methods of the present invention have been described with reference to preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that modifications can be made to the methods described herein without departing from the spirit and scope of the invention. There will be. All such alternatives and modifications apparent to those skilled in the art are deemed to be within the scope and concept of the invention as set forth in the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ボーアブーム，ローレンス イー アメリカ合衆国 テキサス州 77381 ザ ウッドランズ ホリー クリーク コー ト ナンバー1605 333 (72)発明者 グリフェイ，エドワード エス アメリカ合衆国 テキサス州 77381 ザ ウッドランズ ガネット ハロー プレ イス ５ Ｆターム(参考） 4C081 AB12 AB13 AB17 AB18 AB19 BA12 CD121 4H011 BB03 BB06 BB07 BB19 BB21 CA01 CB04 CB05 CD02 CD06──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE , KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Boa Boom, Lawrence E USA 77381 The Woodlands Holly Creek Coat No. 1605 333 (72) Inventor Grifey, Edward S. Texas, United States 77381 The Woodlands Gannet Hello Place 5F Term (Reference) 4C081 AB12 AB13 AB17 AB18 AB19 BA12 CD121 4H011 BB03 BB06 BB07 BB19 BB21 CA01 CB04 CB05 CD02 CD02 CD02

Claims (18)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 コラーゲンベース組織を保存する方法であって、 コラーゲンベース組織を調達すること； 洗浄液でその組織を処理すること； 酵素溶液でその組織を処理すること； メイラード反応およびその後の後生的なグリコシル化最終生成物の形成による
処理組織の分子架橋を防止または抑制するようにその組織を処理すること； 反応的酸化力を有する種の分子による処理組織の分子架橋を防止または抑制す
るようにその組織を処理すること； 分子のフリーラジカルの形成および成長による処理組織の分子架橋を防止また
は抑制するようにその組織を処理すること； 凍結保存溶液中でその組織を処理すること； および、 その組織を凍結保存すること； を含んでなる方法。1. A method of preserving collagen-based tissue, comprising: obtaining a collagen-based tissue; treating the tissue with a wash solution; treating the tissue with an enzyme solution; a Maillard reaction and subsequent epigenesis Treating the tissue to prevent or inhibit molecular cross-linking of the treated tissue due to the formation of a novel glycosylation end product; to prevent or inhibit molecular cross-linking of the treated tissue by molecules of reactive oxidizing species. Treating the tissue; preventing or inhibiting molecular crosslinking of the treated tissue by the formation and growth of free radicals of the molecule; treating the tissue in a cryopreservation solution; and Cryopreserving the tissue. 【請求項２】 前記コラーゲンベース組織が心臓弁、静脈、動脈、臍帯管、
硬膜、神経組織および真皮から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法
。2. The method of claim 2, wherein the collagen-based tissue is a heart valve, a vein, an artery, an umbilical cord,
The method according to claim 1, wherein the method is selected from dura, neural tissue and dermis. 【請求項３】 前記洗浄液が、生理学的緩衝溶液に、ｔ−オクチルフェノキ
シポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド、デオキシコール酸塩、オクタン酸（カプリル酸塩）、３−［（
３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（
ＣＨＡＰＳ）、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウ
ム、および広域スペクトルの抗菌物質の１種以上を含んでいることを特徴とする
請求項２記載の方法。3. The washing solution is prepared by adding t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), n-octyl-β-D-glucopyranoside, deoxycholate, octanoic acid (caprylate) to a physiological buffer solution. ), 3-[(
3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propane-sulfonate (
3. The method of claim 2, comprising one or more of CHAPS), ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium chloride, and a broad spectrum antimicrobial. 【請求項４】 前記酵素溶液が、広域抗菌スペクトル抗菌物質を含む生理的
緩衝溶液に、ＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ、ＲＮａ
ｓｅ、ホスホリパーゼＡ、ホスホリパーゼＣ、および広範囲抗生物質の１種以上
を含んでいることを特徴とする請求項３記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein said enzyme solution is prepared in a physiological buffer solution containing a broad spectrum antibacterial antibacterial substance, by adding DNase Type I, DNase Type II, RNa
4. The method of claim 3, comprising one or more of SE, phospholipase A, phospholipase C, and a broad spectrum antibiotic. 【請求項５】 メイラード反応およびその後の後生的なグリコシル化最終生
成物の形成による処理組織の分子架橋を防止または抑制するように前記組織を処
理することが、降下させた温度；グルコースおよび関連化合物内のカルボニル基
の分子還元から生じるような非反応性または非還元性炭水化物、およびアミノグ
アニジンの使用；およびそれらの併用；から選択されることを特徴とする請求項
４記載の方法。5. Treating the treated tissue to prevent or inhibit molecular crosslinking of the Maillard reaction and subsequent formation of an endogenous glycosylation end product at reduced temperature; glucose and related compounds. 5. A process according to claim 4, characterized in that it is selected from the use of non-reactive or non-reducing carbohydrates, such as resulting from the molecular reduction of carbonyl groups within, and aminoguanidine; and combinations thereof. 【請求項６】 反応的酸化力を有する種の分子による処理組織の分子架橋を
防止または抑制するように前記組織を処理することが、降下させた温度；不活性
雰囲気；デフェロキサミンメシレート、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、カ
タラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−トコフェロール、還元型グルタ
チオン、および６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−
カルボン酸の１種以上；およびそれらの併用；を含んでいることを特徴とする請
求項５記載の方法。6. Treating the treated tissue to prevent or inhibit molecular cross-linking of the treated tissue by molecules of a species having a reactive oxidizing power, the reduced temperature; an inert atmosphere; deferoxamine mesylate, dimethyl sulfoxide. (DMSO), catalase, superoxide dismutase, α-tocopherol, reduced glutathione, and 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-
The method of claim 5, comprising one or more carboxylic acids; and combinations thereof. 【請求項７】 分子のフリーラジカルの成長を防止または抑制するように前
記組織を処理することが、降下させた温度を使用すること；ジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ）、α−トコフェロール、アスコルベート、還元型グルタチオン、
フラボノイド、およびイノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）の１種以上を使
用すること；を含んでいることを特徴とする請求項６記載の方法。7. Treating said tissue to prevent or inhibit the growth of free radicals of molecules using reduced temperatures; dimethyl sulfoxide (DMSO), α-tocopherol, ascorbate, reduced form Glutathione,
7. The method of claim 6, comprising using one or more of flavonoids and inositol hexaphosphate (phytic acid). 【請求項８】 前記凍結保存溶液が、非還元型マルトデキストリンおよびエ
チレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）および生理的緩衝液を含んでいる
ことを特徴とする請求項７記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the cryopreservation solution contains non-reduced maltodextrin, ethylenediaminetetraacetate (EDTA) and a physiological buffer. 【請求項９】 請求項８記載の方法の生成物。9. The product of the method of claim 8. 【請求項１０】 移植用のコラーゲンベース組織の保存方法であって、 ドナーからコラーゲンベース組織を調達すること； 脂質膜およびタンパク質を可溶化する洗浄剤および塩化物イオン、プロテアー
ゼ活性を阻害する二価の陽イオンキレート剤を含む第１洗浄液に前記組織を浸漬
すること； 低メイラード反応電位を有するポリヒドロキシ化合物のポリマー、二価の陽イ
オンキレート剤および緩衝剤を含む第１冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳ
ＭＤ）に前記組織を浸漬すること； 洗浄剤、二価の陽イオンキレート剤、抗菌物質、抗真菌剤、酸化防止剤および
フリーラジカル捕捉剤を含む第２洗浄液に直ちに前記組織を浸漬すること； ＤＮａｓｅＩ、デフェロキサミン、フィチン酸およびアミノグアニジンを含む
酵素溶液に前記組織を浸漬すること； 第２冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）に直ちに前記組織を浸漬す
ること、ただし、第１ＶＳＭＤは低メイラード反応電位を有するポリヒドロキシ
化合物のポリマー、二価の陽イオンキレート剤を含んでおり； 実質的に氷晶の形成を妨げるような速度で、またその温度まで前記組織を冷却
すること； 分子蒸留乾燥によって前記冷却組織を乾燥すること； を含んでなる方法。10. A method for preserving collagen-based tissue for transplantation, comprising: procuring a collagen-based tissue from a donor; a detergent for solubilizing lipid membranes and proteins, and chloride ions, and divalent for inhibiting protease activity. Immersing the tissue in a first washing solution containing a cationic chelating agent; a first cryopreservation solution maltodextrin containing a polymer of a polyhydroxy compound having a low Maillard reaction potential, a divalent cationic chelating agent and a buffer ( VS
Immersing the tissue in MD); immediately immersing the tissue in a second lavage fluid containing a detergent, a divalent cation chelator, an antibacterial, an antifungal, an antioxidant and a free radical scavenger; Immersing the tissue in an enzyme solution containing DNase I, deferoxamine, phytic acid and aminoguanidine; immediately immersing the tissue in a second cryopreservation solution maltodextrin (VSMD), where the first VSMD reduces the low Maillard reaction potential. Comprising a polymer of a polyhydroxy compound having a divalent cation chelating agent; cooling the tissue to a temperature that substantially prevents ice crystal formation and to that temperature; cooling by molecular distillation drying Drying the tissue. 【請求項１１】 前記コラーゲンベース組織が心臓弁、静脈、動脈、臍帯管
、硬膜、神経組織および真皮から選択されることを特徴とする請求項１０記載の
方法。11. The method of claim 10, wherein said collagen-based tissue is selected from heart valves, veins, arteries, umbilical cord, dura, nervous tissue, and dermis. 【請求項１２】 請求項１１の方法の生成物。12. The product of the method of claim 11. 【請求項１３】 移植用のコラーゲンベース組織の保存方法であって、 ドナーからコラーゲンベース組織を調達すること； 成分が脂質膜およびタンパク質を可溶化し、プロテアーゼ活性を阻害する第１
洗浄液に前記組織を浸漬すること； 成分が、浸透変化を介して組織へ洗浄剤が入るのを増大することによって細胞
タンパク質の可溶化を促進し、細胞タンパク質の溶解度を高める炭水化物を供給
し、タンパク質分解活性を阻害する第１冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳ
ＭＤ）に前記組織を浸漬すること； 成分が細胞膜および抗原性成分を破壊し可溶化する第２洗浄液に直ちに前記組
織を浸漬すること； 成分が細胞核および細胞リン脂質を破壊、可溶化し、組織の非酵素的架橋を低
減する酵素溶液に前記組織を浸漬すること； 成分が、浸透変化を介して組織へ洗浄剤が入るのを増大することによって細胞
タンパク質の可溶化を促進し、細胞タンパク質の溶解度を高める炭水化物を供給
し、タンパク質分解活性を阻害する第２冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳ
ＭＤ）に前記組織を浸漬すること； 凍結水の異なる相が形成され、実質的に氷晶の形成を妨げるような速度で、ま
たその温度まで前記組織を冷却すること； 明らかな氷晶成長、氷晶形成または融解なく、試料から水が除去されるような
条件下で凍結水の各相を継続的に除去することによって前記冷却組織を乾燥する
こと； を含んでなる方法。13. A method of preserving collagen-based tissue for transplantation, comprising: procuring collagen-based tissue from a donor; wherein the component solubilizes lipid membranes and proteins and inhibits protease activity.
Immersing the tissue in a lavage fluid; providing a carbohydrate component that promotes the solubilization of cellular proteins by increasing detergent entry into the tissue via osmotic changes and increases the solubility of cellular proteins; First cryopreservation solution maltodextrin (VS
Immersing the tissue in an MD); immediately immersing the tissue in a second wash where the components destroy and solubilize cell membranes and antigenic components; the components destroy and solubilize cell nuclei and cell phospholipids; Immersing the tissue in an enzyme solution that reduces non-enzymatic cross-linking of the components; the components promote solubilization of cellular proteins by increasing detergent entry into the tissue via osmotic changes; Maltodextrin (VS), a second cryopreservation solution that supplies carbohydrates to increase solubility and inhibits proteolytic activity
Immersing the tissue in MD); cooling the tissue to a temperature and at such a rate that a different phase of frozen water is formed and substantially prevents the formation of ice crystals; Drying said cooled tissue by continuously removing each phase of frozen water under conditions such that water is removed from the sample without ice formation or thawing. 【請求項１４】 前記コラーゲンベース組織が心臓弁、静脈、動脈、臍帯管
、硬膜、神経組織および真皮から選択されることを特徴とする請求項１３記載の
方法。14. The method of claim 13, wherein said collagen-based tissue is selected from heart valves, veins, arteries, umbilical cord, dura, nervous tissue and dermis. 【請求項１５】 請求項１４記載の方法の生成物。15. The product of the method according to claim 14. 【請求項１６】 移植用の心臓弁を保存する方法であって、 ドナーから心臓弁を調達すること； 脂質膜およびタンパク質を可溶化するｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエ
タノールおよび塩化ナトリウム、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ
）および緩衝剤を含む第１洗浄液に心臓弁を浸漬すること； 低メイラード反応電位を有するマルトデキストリン、ＥＤＴＡおよび緩衝剤を
含む第１冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）に心臓弁を浸漬すること
； 脱気した細胞培地にｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＥＤＴＡ、デ
フェロキサミン、フィチン酸およびアミノグアニジンを含む第２洗浄液に直ちに
心臓弁を浸漬すること； ＤＮａｓｅＩ、デフェロキサミン、フィチン酸およびアミノグアニジンを含む
酵素溶液に心臓弁を浸漬すること； 第２冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）に心臓弁を浸漬すること、
ただし、第１ＶＳＭＤは低メイラード反応電位を有するマルトデキストリン、Ｅ
ＤＴＡおよび緩衝剤を含んでおり； 実質的に氷晶の形成を妨げるような速度で、またその温度まで心臓弁を冷却す
ること； 分子蒸留乾燥によって凍結心臓弁を乾燥すること； を含んでなる方法。16. A method of preserving a heart valve for transplantation, comprising: obtaining a heart valve from a donor; t-octylphenoxypolyethoxyethanol and sodium chloride, ethylenediaminetetraacetate (t-octylphenoxypolyethoxyethanol) for solubilizing lipid membranes and proteins. EDTA
Dipping the heart valve in maltodextrin having a low Maillard reaction potential, EDTA and a buffer, and a first cryopreservation solution maltodextrin (VSMD) containing buffer; Immediately immersing the heart valve in a second lavage fluid containing n-octyl-β-D-glucopyranoside, EDTA, deferoxamine, phytic acid and aminoguanidine in degassed cell culture media; Dipping the heart valve in an enzyme solution; dipping the heart valve in a second cryopreservation solution maltodextrin (VSMD);
However, the first VSMD is maltodextrin having a low Maillard reaction potential, E
DTA and a buffer; cooling the heart valve at a rate substantially to prevent ice crystal formation and to that temperature; drying the frozen heart valve by molecular distillation drying. Method. 【請求項１７】 移植用の維管束組織を保存する方法であって、 ドナーから心臓弁を調達すること； 抗生物質および組織培地を含む安定化溶液に維管束組織を浸漬すること； 脂質膜およびタンパク質を可溶化するｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエ
タノールおよび塩化ナトリウム、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ
）および緩衝剤を含む第１洗浄液に維管束組織を浸漬すること； 低メイラード反応電位を有するマルトデキストリン、ＥＤＴＡおよび緩衝剤を
含む第１冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）に維管束組織を浸漬する
こと； 脱気した細胞培地にｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＥＤＴＡ、デ
フェロキサミン、フィチン酸およびアミノグアニジンを含む第２洗浄液に直ちに
維管束組織を浸漬すること； ＤＮａｓｅＩ、デフェロキサミン、フィチン酸およびアミノグアニジンを含む
酵素溶液に維管束組織を浸漬すること； 第２冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）で維管束組織をインキュベ
ートすること、ただし、第１ＶＳＭＤは低メイラード反応電位を有するマルトデ
キストリン、ＥＤＴＡおよび緩衝剤を含んでおり； 凍結維管束組織が得られる実質的に氷晶の形成を妨げるような速度で、またそ
の温度まで維管束組織を冷却すること； 分子蒸留乾燥によって凍結維管束組織を乾燥すること； を含んでなる方法。17. A method of preserving vascular tissue for transplantation, comprising: obtaining a heart valve from a donor; immersing the vascular tissue in a stabilizing solution comprising an antibiotic and a tissue culture medium; T-octylphenoxypolyethoxyethanol for solubilizing proteins and sodium chloride, ethylenediaminetetraacetate (EDTA
Immersion of the vascular tissue in a first washing solution containing a maltodextrin having a low Maillard reaction potential, EDTA and a buffer; maltodextrin (VSMD) containing a low Maillard reaction potential. Immediately immersing the vascular tissue in a second wash containing n-octyl-β-D-glucopyranoside, EDTA, deferoxamine, phytic acid and aminoguanidine in the degassed cell medium; DNaseI, deferoxamine, phytic acid and amino Immersing the vascular tissue in an enzyme solution containing guanidine; incubating the vascular tissue with a second cryopreservation solution maltodextrin (VSMD), where the first VSMD is maltodextrin with low Maillard reaction potential, EDTA and buffer Including the agent Cooling the vascular tissue at a rate and to a temperature that substantially prevents the formation of ice crystals from which the frozen vascular tissue is obtained; drying the frozen vascular tissue by molecular distillation drying; How to be. 【請求項１８】 移植用のコラーゲンベース神経組織を保存する方法であっ
て、 ドナーからコラーゲンベース神経組織を調達すること； 安定化溶液に神経組織を浸漬すること； 脂質膜およびタンパク質を可溶化するｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドおよび塩化ナトリウム、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）およ
び緩衝剤を含む第１洗浄液に神経組織を浸漬すること； ＥＤＴＡおよび緩衝剤を含む洗浄液で神経組織を洗浄すること； オクタン酸、リン酸ナトリウム緩衝液、および任意の抗生物質を含む第２洗浄
液に直ちに神経組織を浸漬すること； ＤＮａｓｅＩ、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび緩衝液を含む酵素溶
液に神経組織を浸漬すること； 第２冷凍保存溶液マルトデキストリン（ＶＳＭＤ）に神経組織を浸漬すること
、ただし、第１ＶＳＭＤは低メイラード反応電位を有するマルトデキストリン、
ＥＤＴＡおよび緩衝液を含んでおり； 凍結神経組織が得られる、実質的に氷晶の形成を妨げるような速度で、またそ
の温度まで神経組織を冷却すること； 分子蒸留乾燥によって凍結神経組織を乾燥すること； を含んでなる方法。18. A method of preserving collagen-based nerve tissue for transplantation, comprising: obtaining collagen-based nerve tissue from a donor; immersing the nerve tissue in a stabilizing solution; and solubilizing lipid membranes and proteins. immersing the nervous tissue in a first lavage solution comprising n-octyl-β-D-glucopyranoside and sodium chloride, ethylenediaminetetraacetate (EDTA) and a buffer; rinsing the nervous tissue with a lavage solution containing EDTA and a buffer; Immediately immersing the nerve tissue in a second wash containing octanoic acid, sodium phosphate buffer, and any antibiotics; Immersing the nerve tissue in an enzyme solution containing DNase I, sodium chloride, magnesium chloride and buffer; The second cryopreservation solution Maltodextrin (VSMD) with nervous system Soaking the weave, wherein the first VSMD is maltodextrin having a low Maillard reaction potential,
Containing EDTA and buffer; cooling frozen nerve tissue to a temperature and at a rate that substantially prevents the formation of ice crystals, resulting in frozen nerve tissue; drying frozen nerve tissue by molecular distillation drying Doing. A method comprising: