JP2002503677A - Derivatized antibodies with exposed carbohydrate chains capable of binding to immobilized IgG - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗体の炭水化物鎖を露出して抗体がアガラクトシルIgGなどの固定化IgGに結合できるように該抗体を誘導体化する方法が開示される。誘導体化抗体は、慢性関節リウマチ(RA)などの固定化IgGに関連する病状の診断および治療に有用である。好ましい実施形態においては、この方法は、その場(in situ)で固定化IgGを検出することができる非侵襲性技術を提供し、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、クローン病、I型インスリン依存性糖尿病、II型糖尿病、サルコイドーシス、らい性結節性紅斑、および結核を含む自己免疫疾患などに関連する病状の診断および治療、ならびに、特にびらん性関節病の診断を援助する。   (57) [Summary] Methods are disclosed for derivatizing an antibody so that the carbohydrate chain of the antibody is exposed such that the antibody can bind to immobilized IgG, such as agalactosyl IgG. Derivatized antibodies are useful for diagnosing and treating conditions associated with immobilized IgG, such as rheumatoid arthritis (RA). In a preferred embodiment, the method provides a non-invasive technique capable of detecting immobilized IgG in situ, including rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, Crohn's disease, type I insulin dependent It assists in the diagnosis and treatment of conditions related to diabetes, type II diabetes, sarcoidosis, erythema nodosum, and autoimmune diseases including tuberculosis, and particularly in the diagnosis of erosive joint disease.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】発明の分野 本発明は、誘導体化された抗体に関し、また、固定化IgG、特に自己抗体に関 連する病状、ならびに特に慢性関節リウマチ(RA)などの固定化IgGレベルの上昇 に関連する病状の診断および治療におけるその使用に関する。本発明はまた、誘
導体化された抗体の製造方法も提供する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to derivatized antibodies, and also to pathologies associated with immobilized IgG, particularly autoantibodies, and particularly with elevated levels of immobilized IgG, such as rheumatoid arthritis (RA). And its use in the diagnosis and treatment of medical conditions. The present invention also provides a method for producing a derivatized antibody.

【０００２】発明の背景 臨床リウマチ病学における中心的な問題は、非侵襲性技術を用いて、びらん性
関節病を発病するようになる患者を提示して特定する必要があるということであ
る。そのような患者を同定することができれば、彼らを積極的な治療の目標とす
ることができ、また、びらん性関節病を発病しない残りのRA患者に対してはより
保存的な治療を約束することができる。このことは両群の治療に改善をもたらす
であろう。何故なら、びらん性群の初期治療は疾患の進行を妨げることができ、
また、良性群における初期治療はよくある重篤な薬物反応および毒性が少ないこ
とにより死亡率を低減するからである。[0002] central problem in the background clinical arthritis Disease of the invention, using non-invasive techniques, is that there is a need to identify and provide the patient comes to the pathogenesis of erosive joint disease. If such patients can be identified, they can be targeted for aggressive treatment and promise more conservative treatment for the remaining RA patients who do not develop erosive joint disease be able to. This will improve treatment in both groups. Because the initial treatment of the erosive group can prevent the progression of the disease,
Also, initial treatment in the benign group reduces mortality due to less common severe drug reactions and toxicity.

【０００３】 びらん性関節病の予後を予測する能力について、多くの臨床パラメーターが評
価されてきた。これらの臨床パラメーターには、年齢、性別、RFステータス、遺
伝的背景(HLA)、および血清アガラクトシルIgGレベル(例えば、JP-A-5087814を 参照されたい)が含まれる。しかし、従来の研究により、単一のパラメーターは 予測因子として有用ではないことがわかってきた。しかし、アガラクトシルIgG レベル、発病年齢、性別、機能評価およびRF力価の組合わせにより、94％の患者
においてRAの経過を正確に予測することができる。[0003] Many clinical parameters have been evaluated for their ability to predict the prognosis of erosive joint disease. These clinical parameters include age, gender, RF status, genetic background (HLA), and serum agalactosyl IgG levels (see, eg, JP-A-5087814). However, previous studies have shown that a single parameter is not useful as a predictor. However, a combination of agalactosyl IgG levels, age of onset, gender, functional assessment and RF titer can accurately predict the course of RA in 94% of patients.

【０００４】 アガラクトシルIgGは、慢性関節リウマチ、結核、クローン病、若年性関節炎 、サルコイドーシス、I型インスリン依存性糖尿病、II型糖尿病、およびらい性 結節性紅斑と呼ばれるらい病の形態の患者において増加するIgGの糖形態である 。アガラクトシルIgGは、以下のような様々な機構により、それぞれの標的組織 における病状を引き起こすと考えられる。[0004] Agalactosyl IgG is increased in patients with the form of rheumatoid arthritis, tuberculosis, Crohn's disease, juvenile arthritis, sarcoidosis, type I insulin-dependent diabetes, type II diabetes, and a leprosy form called lepromatous erythema nodosum This is the glycoform of IgG. Agalactosyl IgG is thought to cause a disease state in each target tissue by various mechanisms as follows.

【０００５】 (a)in situ（その場）で固定化されたアガラクトシルIgGおよびレクチンマンノ ース結合タンパク質(MBP)と、腫瘍壊死因子(TNFα)およびトランスフォーミング
増殖因子(TGFβ)との相互作用を介した組織損傷。組織に固定化された自己抗体 は、これらの炎症メディエーターに結合することができ、該組織においてそれら
を捕捉し、組織損傷を導く。[0005] (a) The interaction of agaractosyl IgG and lectin mannose binding protein (MBP) immobilized in situ with tumor necrosis factor (TNFα) and transforming growth factor (TGFβ) Tissue damage. Autoantibodies immobilized on tissue can bind to these inflammatory mediators, trap them in the tissue and lead to tissue damage.

【０００６】 (b)アガラクトシルIgGは、自己結合性免疫複合体を形成することにより、全身性
病状を引き起こすと考えられる。(B) Agalactosyl IgG is thought to cause a systemic condition by forming a self-binding immune complex.

【０００７】 アガラクトシルIgG作用の標的器官または組織は、自己抗体の特異性に依存す る。慢性関節リウマチの場合、II型コラーゲンに対する自己抗体は関節を標的と
すると考えられる。慢性関節リウマチ患者のクロスセクショナル研究により、患
者が疾患の後期にII型コラーゲンに対する検出可能な抗体を有する頻度はたった
の30％であることが示された。初期のRAにおいては、その頻度は70％に達する。
びらん性関節病を発病しそうな患者を同定する際の問題は複雑である。何故なら
、抗コラーゲン自己抗体血清力価により３群の慢性関節リウマチ患者が分類され
得るからである。[0007] The target organ or tissue for agalactosyl IgG action depends on the specificity of the autoantibody. In the case of rheumatoid arthritis, autoantibodies to type II collagen are thought to target the joints. Cross-sectional studies of patients with rheumatoid arthritis have shown that patients have only 30% of detectable antibodies to type II collagen late in the disease. In early RA, the frequency reaches 70%.
The problem of identifying patients likely to develop erosive joint disease is complicated. This is because three groups of rheumatoid arthritis patients can be classified according to anti-collagen autoantibody serum titers.

【０００８】 第1群：抗II型コラーゲン抗体の力価は正常である。Group 1: Anti-type II collagen antibody titers are normal.

【０００９】 第2群：定常状態を維持する抗II型コラーゲン抗体の力価が上昇する。Group 2: Increased titers of anti-type II collagen antibodies that maintain a steady state.

【００１０】 第3群：疾患の初期に抗II型コラーゲン抗体の力価が上昇し、疾患の後期には 正常レベルまで減少する。この場合、コラーゲンに対する血清抗体のレベルの減
少は、 (a)コラーゲンに対する抗体の関節滑液嚢内合成（全身性産生とは対照的）、 (b)免疫複合体形成に従属するコラーゲンに対する抗体の除去、および／または (c)損傷した軟骨表面に対する抗体の固定化による血清のスキミング(skimming) 、 を含んでもよい。Group 3: Anti-type II collagen antibody titers increase early in the disease and decrease to normal levels late in the disease. In this case, a decrease in the level of serum antibodies to collagen is due to (a) synovial sac synthesis of antibodies to collagen (as opposed to systemic production), and (b) removal of antibodies to collagen subordinate to immune complex formation. And / or (c) skimming serum by immobilizing antibodies to the damaged cartilage surface.

【００１１】 上記の3群のうち、第3群は重篤なびらん性疾患に、および第1群は軽度のびら ん性疾患に罹るであろう。従って、第3群の抗体レベルがひとたび正常に戻れば 、第1群と第3群との間の血清抗体レベルを識別することができなくなる。[0011] Of the above three groups, the third group will suffer from severe erosive disease and the first group will suffer from mild erosive disease. Therefore, once the antibody level of the third group returns to normal, it becomes impossible to distinguish the serum antibody level between the first and third groups.

【００１２】 一方、第3群の患者（第1群の患者とは対照的）の冒された滑液関節はアガラク
トシルIgGの糖形態の抗II型コラーゲン抗体で被覆されるので、関節生検はこれ らの抗体を検出するのに日常的な方法でもなければ望ましい方法でもない。On the other hand, the affected synovial joints of group 3 patients (as opposed to group 1 patients) are coated with an anti-type II collagen antibody in the glycoform of agalactosyl IgG, so joint biopsy Is not a routine or desirable method for detecting these antibodies.

【００１３】発明の概要 大まかに言うと、本発明は誘導体化された抗体を提供し、該抗体は、その炭水
化物鎖を露出して抗体がアガラクトシルIgGなどの固定化IgGに結合できるように
誘導体化される。従って、慢性関節リウマチ(RA)(上記の第3群対第1群)などの固
定化IgGに関連する病状の診断および治療に前記誘導体化抗体を用いることがで きる。特に、本発明は、in situで固定化IgGを検出することができる非侵襲性技
術を提供する。それにより固定化IgGに関連する病状の診断および治療を援助す る。本発明は、RAの辿りそうな経過を決定するのに現在用いられている臨床パラ
メーターの範囲の測定を回避するのに役立つことができる。[0013] SUMMARY Broadly speaking the invention, the invention provides an antibody derivatized, the antibody derivative as antibodies to expose the carbohydrate chains can bind to the immobilized IgG such agalactosyl IgG Be transformed into Thus, the derivatized antibodies can be used for the diagnosis and treatment of pathologies associated with immobilized IgG, such as rheumatoid arthritis (RA) (Group 3 vs. Group 1 above). In particular, the present invention provides non-invasive techniques that can detect immobilized IgG in situ. It assists in the diagnosis and treatment of conditions associated with immobilized IgG. The present invention can help to avoid measuring a range of clinical parameters currently used to determine the likely course of RA.

【００１４】 従って、第１の態様においては、本発明は誘導体化抗体を提供し、該抗体は、
抗体がアガラクトシルIgGなどの固定化IgGに結合できるようにその炭水化物鎖を
露出してアガラクトシルIgGなどの固定化IgGに結合できるように誘導体化される
。好ましくは、前記誘導体化抗体は、固定化IgGの部位において自己結合または 「スタッキング」して、固定化IgGの部位へ送達され得る誘導体化抗体の濃度を 増幅することにより患者の診断または治療を援助することができる。本発明はさ
らに、医学的治療方法において使用するための上記抗体を提供する。Thus, in a first aspect, the invention provides a derivatized antibody, wherein the antibody comprises:
The antibody is derivatized to expose its carbohydrate chains so that it can bind to immobilized IgG, such as agalactosyl IgG, and to bind to immobilized IgG, such as agalactosyl IgG. Preferably, the derivatized antibody self-associates or "stacks" at the site of the immobilized IgG to assist in diagnosing or treating a patient by amplifying the concentration of derivatized antibody that can be delivered to the site of the immobilized IgG. can do. The present invention further provides the above antibody for use in a method of medical treatment.

【００１５】 本発明は、固定化IgGに関連する病状、特に、慢性関節リウマチ、若年性関節 炎、クローン病、I型インスリン依存性糖尿病、II型糖尿病、サルコイドーシス 、らい性結節性紅斑、および結核を含む自己免疫疾患などのアガラクトシルIgG に関連する病状の診断または治療に適用できる。好ましい実施形態においては、
本発明は、びらん性関節病に罹りやすい慢性関節リウマチ患者（第3群）におい て産生される組織固定化抗II型コラーゲン抗体の存在を検出することによって、
びらん性関節病の診断において使用することができる。The present invention relates to pathologies associated with immobilized IgG, particularly rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, Crohn's disease, type I insulin-dependent diabetes, type II diabetes, sarcoidosis, erythema nodosum and tuberculosis. The present invention can be applied to diagnosis or treatment of medical conditions related to agalactosyl IgG such as autoimmune diseases including In a preferred embodiment,
The present invention provides a method for detecting the presence of a tissue-immobilized anti-type II collagen antibody produced in rheumatoid arthritis patients (group 3) susceptible to erosive joint disease.
It can be used in the diagnosis of erosive joint disease.

【００１６】 さらなる態様においては、本発明は、誘導体化抗体の製造方法を提供し、該方
法は、前駆体抗体を処理して抗体が固定化IgGに結合可能なように炭水化物鎖を 露出させることを含む。好ましくは、前記方法は、炭酸アンモニウムまたは炭酸
ナトリウムなどの炭酸塩の存在下で前記抗体をチオール化することを含む。本発
明のある実施形態においては、全誘導体化抗体の１画分のみが自己結合またはス
タッキングすることができ、これを下記では「イメージング画分」と呼ぶ。この
場合、好ましくは前記方法は、例えば、Con Aクロマトグラフィーを用いて、ま たはプロテインAアフィニティーカラムからの誘導体化抗体のpH溶出により、誘 導体化抗体のこの画分を分離する工程をさらに含む。好ましい実施形態において
は、前記前駆体抗体は、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基で終わるFc炭水化
物鎖を有する。前駆体抗体上のそのような鎖の比率は、β−ガラクトシダーゼを
使用して末端ガラクトース残基を除去することにより天然レベルから増大させる
ことができる。誘導体化抗体のイメージング画分は、炭水化物鎖に結合するFab をも含むべきである。In a further aspect, the invention provides a method of producing a derivatized antibody, comprising treating a precursor antibody to expose carbohydrate chains such that the antibody can bind to immobilized IgG. including. Preferably, the method comprises thiolating the antibody in the presence of a carbonate, such as ammonium carbonate or sodium carbonate. In certain embodiments of the invention, only one fraction of the whole derivatized antibody is capable of self-binding or stacking, which is referred to below as the "imaging fraction". In this case, preferably, the method further comprises the step of separating this fraction of the derivatized antibody using, for example, Con A chromatography or by pH elution of the derivatized antibody from a protein A affinity column. Including. In a preferred embodiment, the precursor antibody has an Fc carbohydrate chain ending with an N-acetylglucosamine (GlcNAc) residue. The proportion of such chains on the precursor antibody can be increased from natural levels by removing terminal galactose residues using β-galactosidase. The imaging fraction of the derivatized antibody should also contain Fab binding to carbohydrate chains.

【００１７】 前記方法は、内部の炭水化物鎖、例えばFc炭水化物鎖を、隙間のあるタンパク
質表面上のそれらの結合部位から弾き出す。次いで、IgGは、該炭水化物鎖がそ れらの隙間位置に戻るのを妨げる方法で化学的に誘導体化される。The method flips internal carbohydrate chains, eg, Fc carbohydrate chains, from their binding sites on interstitial protein surfaces. The IgG is then chemically derivatized in a way that prevents the carbohydrate chains from returning to their interstitial locations.

【００１８】 固定化IgGと誘導体化抗体との間の結合は、Fc結合部位もしくは固定化IgGの表
面に結合する誘導体化抗体のFab炭水化物鎖および／またはFc結合部位もしくは 誘導体化反応により誘導体化抗体上に露出した表面に結合する固定化抗体の露出
したFab炭水化物鎖を介するものであり得る。従って、どちらの場合も、結合反 応は、炭水化物鎖と、抗体上の炭水化物結合部位との間のものであり、抗体の免
疫学的な結合ドメインには関係しない。アガラクトシルIgGの場合、これらの抗 体はガラクトシルおよびシアル酸残基を欠いているので、これにより誘導体化抗
体の利用可能なFab炭水化物鎖を受容できる結合部位が提供される。好ましい実 施形態においては、誘導体化抗体は、それ自身に結合することができるし、また
固定化IgGに結合することができる。もし、炭水化物鎖の弾き出しが、他の抗体 上の炭水化物鎖に結合可能な結合部位（Fab、Fcなど）を開くとすれば、このこ とは起こり得る。この抗体のスタッキングは、固定化IgGが凝縮する患者の場所 に機能的部分を送達する方法を提供することができ、また、これらの場所に誘導
体化抗体を凝縮させる方法をも提供することができる。[0018] The binding between the immobilized IgG and the derivatized antibody can be accomplished by binding the Fab carbohydrate chain of the derivatized antibody to the Fc binding site or the surface of the immobilized IgG and / or by derivatizing the Fc binding site or derivatization reaction. It may be through the exposed Fab carbohydrate chains of the immobilized antibody binding to the upper exposed surface. Thus, in both cases, the binding reaction is between the carbohydrate chains and the carbohydrate binding site on the antibody and is not related to the immunological binding domain of the antibody. In the case of agalactosyl IgG, these antibodies lack galactosyl and sialic acid residues, thus providing a binding site that can accept the available Fab carbohydrate chains of the derivatized antibody. In a preferred embodiment, the derivatized antibody is capable of binding to itself and to immobilized IgG. This can happen if carbohydrate flipping opens a binding site (Fab, Fc, etc.) on another antibody that can bind to the carbohydrate chain. This stacking of antibodies can provide a way to deliver functional moieties to locations in the patient where the immobilized IgG condenses, and can also provide a way to condense derivatized antibodies at those locations. .

【００１９】 前駆体抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよいし、また
、IgE、IgA、IgM（モノマー）、IgDまたはIgGであってもよい。抗体の製造およ び精製は、下記に詳細に説明されている。下記の実施例において、使用した前駆
体抗体は、サンドグロブリン(Sandoglobulin)またはCLB、ポリクローナルIgG混 合物である。The precursor antibody may be polyclonal or monoclonal, and may be IgE, IgA, IgM (monomer), IgD or IgG. The production and purification of the antibody is described in detail below. In the following examples, the precursor antibody used was Sandoglobulin or CLB, a polyclonal IgG mixture.

【００２０】 さらなる態様においては、本発明は、固定化IgGに関連する病状の治療または 診断のための医薬の製造のための誘導体化抗体の使用を提供する。前記抗体は、
該抗体がその炭水化物鎖を露出して固定化IgGに結合可能なように誘導体化され る。In a further aspect, the invention provides the use of a derivatized antibody for the manufacture of a medicament for the treatment or diagnosis of a condition associated with immobilized IgG. The antibody is
The antibody is derivatized to expose its carbohydrate chains and bind to immobilized IgG.

【００２１】 ある実施形態においては、誘導体化抗体は、標識、トキシン、薬剤、プロドラ
ッグ、エフェクター、または他の部分などの機能的部分にコンジュゲートさせる
ことができる。標識により抗体をin vivoまたはin vitroで視覚化することが可 能となり、これはアガラクトシルIgGの存在および／または位置を示す。好まし い実施形態においては、標識は^99mTcなどの放射性標識である。機能的部分が薬 剤、プロドラッグまたはエフェクターである場合、誘導体化抗体は、固定化IgG が見出され、該薬剤、プロドラッグまたはエフェクターの作用を必要とする患者
の体内の場所に機能的部分を送達することができる。[0021] In certain embodiments, the derivatized antibody can be conjugated to a functional moiety such as a label, toxin, drug, prodrug, effector, or other moiety. Labeling allows the antibody to be visualized in vivo or in vitro, indicating the presence and / or location of agalactosyl IgG. In a preferred embodiment, the label is a radioactive label, such as ^99m Tc. If the functional moiety is a drug, prodrug, or effector, the derivatized antibody will have a functional moiety at a location in the patient's body where the immobilized IgG is found and where the action of the drug, prodrug, or effector is required. Can be delivered.

【００２２】 あるいは、または、さらに、前駆体抗体は、固定化IgGが蓄積している場所に 送達されたとき、それ自体で治療作用を有する。実施例により、TNF-αなどの炎
症メディエーターに対して特異性を有する誘導体化抗体を用いて、固定化IgGレ ベルが上昇した患者の場所でのこれらの物質の効果を改善することができた。さ
らなる態様においては、本発明は、固定化IgGに関連する病状をin vivoで診断す
る方法を提供する。前記方法は、(a)患者を誘導体化抗体に曝露すること（前記 抗体は、その炭水化物鎖を露出して抗体が固定化IgGに結合できるように誘導体 化され、標識される。）、および(b)該標識を用いて、固定化IgGの存在を検出す
ること、を含む。便利なことに、前記誘導体化抗体は、注入により患者に投与す
ることが可能である。Alternatively, or additionally, the precursor antibody has a therapeutic effect by itself when delivered to a location where immobilized IgG is accumulated. The examples showed that the use of derivatized antibodies with specificity for inflammatory mediators such as TNF-α could improve the effect of these substances in patients with elevated levels of immobilized IgG . In a further aspect, the present invention provides a method of diagnosing a condition associated with immobilized IgG in vivo. The method comprises the steps of (a) exposing a patient to a derivatized antibody (the antibody is derivatized and labeled so that its carbohydrate chains are exposed and the antibody can bind to immobilized IgG). b) detecting the presence of immobilized IgG using the label. Conveniently, the derivatized antibody can be administered to the patient by injection.

【００２３】 さらなる態様においては、本発明は、１つ以上の上記の抗体と、製薬上許容さ
れる担体とを組合わせて含む医薬組成物を提供する。In a further aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising one or more of the above antibodies in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

【００２４】 本発明を、添付の図面を参照しながら実施例により説明するが、それは限定で
はない。The present invention will now be described by way of example and not by way of limitation with reference to the accompanying drawings.

【００２５】詳細な説明 抗体の産生 前駆体抗体は、市販のものを使用するか、当分野で標準的な技法を用いて調製
することができる。ヒト前駆体抗体は、サンドグロブリンまたはCLB等の市販さ れている抗体のポリクローナル混合物として、あるいは大きな万能ファージ展示
ライブラリーから得られる。サンドグロブリンは、Sandozから製造および市販さ
れているポリクローナルIgG/グルコース調製物である。CLBは、オランダ赤十字 輸血サービス中央研究所（オランダ国アムステルダム）から入手可能なポリクロ
ーナルIgG調製物である。[0025] DETAILED DESCRIPTION production precursor antibody of an antibody, a commercially available one may be used, it can be prepared using standard techniques in the art. Human precursor antibodies can be obtained as polyclonal mixtures of commercially available antibodies such as sandglobulin or CLB, or from large universal phage display libraries. Sandglobulin is a polyclonal IgG / glucose preparation manufactured and sold by Sandoz. CLB is a polyclonal IgG preparation available from the Dutch Red Cross Blood Transfusion Services Central Laboratory (Amsterdam, The Netherlands).

【００２６】 ヒト前駆体抗体から作成された誘導体化抗体は、ヒト抗マウス抗体（human an
ti-mouse antibody:HAMA）応答が無いため、反復治療の使用を可能にするという
利点を有する（Schroffら、Cancer Research, 45：879-885, 1985; DeJagerら、
Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 29: 377, 1988）。HAMA応答は、投与した抗体の
中和による治療用量の減少から、アレルギー反応、血清病および腎臓障害に至る
まで、ある範囲の作用を有する。A derivatized antibody generated from a human precursor antibody is a human anti-mouse antibody (human an
The absence of a ti-mouse antibody: HAMA) response has the advantage of allowing the use of repeated treatments (Schroff et al., Cancer Research, 45: 879-885, 1985; DeJager et al.
Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 29: 377, 1988). The HAMA response has a range of effects, from reducing therapeutic doses by neutralizing administered antibodies to allergic reactions, serum sickness and kidney damage.

【００２７】 幾つかの例において、他の種の抗体は、好適な前駆体抗体でありうる。このよ
うな抗体の産生方法は、当分野では非常に良く知られており、哺乳動物（例えば
マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル等）を該タンパク質ま
たはその断片で免疫すること等が挙げられる。抗体は、当分野で知られる様々な
技術のうち任意のものを用いて免疫した動物から得ることができ、好ましくは目
的の抗原に抗体を結合させる方法を用いてスクリーニングすることができる。例
えば、ウェスタンブロッティング法または免疫沈降法を用いることができる（Ar
mitageら、Nature 357: 80-82, 1992）。動物からの抗体および/または抗体産生
細胞の単離は、動物を犠牲にする工程を伴う場合もある。[0027] In some examples, other species of antibodies may be suitable precursor antibodies. Methods for producing such antibodies are very well known in the art, and include immunizing a mammal (eg, mouse, rat, rabbit, horse, goat, sheep, or monkey) with the protein or a fragment thereof. Is mentioned. Antibodies can be obtained from animals immunized using any of a variety of techniques known in the art, and can be preferably screened using methods for binding the antibody to the antigen of interest. For example, Western blotting or immunoprecipitation can be used (Ar
mitage et al., Nature 357: 80-82, 1992). Isolation of antibodies and / or antibody-producing cells from an animal may involve sacrificing the animal.

【００２８】 幾つかの実施形態において、前駆体抗体はモノクローナルである。モノクロー
ナル抗体は、Kohlerら（Nature 256:495,1975）により最初に記載されたハイブ リドーマ法を用いて作成することもできるし、または組換え法を用いて作成する
こともできる。このように、タンパク質に特異的な抗体は、例えば機能的免疫グ
ロブリン結合ドメインを表面に展示するλバクテリオファージまたは繊維状バク
テリオファージを用いて、発現した免疫グロブリンの可変ドメインの組換えによ
り作成したライブラリーから得られる（例えばWO92/01047を参照されたい）。該
ライブラリーは、天然のもの（つまり任意のタンパク質（または断片）で免疫し
ていない生物から得た配列より構築されたもの）であっても、または目的の抗原
に曝露した生物から得た配列を用いて構築されたものであってもよい。[0028] In some embodiments, the precursor antibodies are monoclonal. Monoclonal antibodies can be made using the hybridoma method first described by Kohler et al. (Nature 256: 495, 1975), or can be made using recombinant methods. Thus, an antibody specific for a protein can be produced by recombinant recombination of the expressed immunoglobulin variable domains, for example, using lambda or filamentous bacteriophages displaying a functional immunoglobulin binding domain on the surface. Rally (see for example WO92 / 01047). The library may be native (ie, constructed from sequences obtained from an organism that has not been immunized with any protein (or fragment)) or may be derived from an organism that has been exposed to the antigen of interest. May be constructed using

【００２９】 モノクローナル抗体を遺伝子組換え技術の技法にかけて、もとの抗体の特異性
を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生することができる。このような技法
は、ある抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（CDRs）をコード
するDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域+フレームワーク領
域に導入する工程を含む。例えばEP 0184187A、GB-A-2188638またはEP 0239400A
を参照されたい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、産生された
抗体の結合特異性を変化させるかまたは変化させないような遺伝子の突然変異も
しくは他の変化にかけることができる。The monoclonal antibody can be subjected to the techniques of genetic engineering techniques to produce other antibodies or chimeric molecules that retain the specificity of the original antibody. Such techniques include the step of introducing DNA encoding the immunoglobulin variable or complementarity-determining regions (CDRs) of one antibody into the constant or constant regions plus framework regions of a different immunoglobulin. For example EP 0184187A, GB-A-2188638 or EP 0239400A
Please refer to. Hybridomas producing monoclonal antibodies can be subjected to mutations or other changes in the gene that alter or do not alter the binding specificity of the antibodies produced.

【００３０】医薬 本発明の抗体は、治療または診断で使用するための組成物として製剤化するこ
とができる。これらの組成物は、上記物質のうちのいずれか１つに加え、製薬上
許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤または当業者に周知の他の物質を含
むことができる。このような物質は非毒性でなければならず、且つ活性成分の効
力を阻害しないものでなければならない。担体または他の物質の正確な特性は、
投与経路（例えば経口、静脈内、皮膚もしくは皮下内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内
経路など）に依り、当業者により容易に選択されることができる。 Pharmaceuticals The antibodies of the present invention can be formulated as compositions for use in therapy or diagnosis. These compositions may contain, in addition to any one of the above substances, pharmaceutically acceptable excipients, carriers, buffers, stabilizers or other substances well known to those skilled in the art. Such materials must be non-toxic and must not interfere with the efficacy of the active ingredient. The exact properties of the carrier or other substance
Depending on the route of administration (eg, oral, intravenous, cutaneous or subcutaneous, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, etc.), it can be readily selected by those skilled in the art.

【００３１】 静脈内、皮膚もしくは皮下内注射、または患部への注射の場合、該活性成分は
、発熱物質を含まず適度なpH、等張性および安定性を有する、非経口投与可能な
水性溶液の形で存在する。当業者であれば、例えば等張賦形剤（塩化ナトリウム
注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液など）を用いて適切な溶液を簡単に調製
することができる。必要により、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および/ または他の添加剤を含ませることもできる。In the case of intravenous, cutaneous or subcutaneous injection or injection into an affected area, the active ingredient is a parenterally administrable aqueous solution having a moderate pH, isotonicity and stability without pyrogens. Exists in the form of Those skilled in the art can easily prepare an appropriate solution using, for example, an isotonic excipient (such as sodium chloride injection solution, Ringer's solution, or lactated Ringer's solution). If necessary, preservatives, stabilizers, buffers, antioxidants and / or other additives can be included.

【００３２】 治療的実施形態において、誘導体化抗体は、典型的には「予防上有効な量」ま
たは「治療上有効な量」で個体に投与される（場合によりどちらかであるが、予
防は治療とみなすこともできる）。これは、個体に利益をもたらすのに十分な量
である。実際に投与される量、および投与速度と経時変化は、治療すべきものの
性質および重症度によって異なる。治療の処方、例えば投与量の決定等について
は、一般の開業医および他の医師の責任の範疇内であり、典型的には治療すべき
疾患、個々の患者の病状、送達部位、投与方法および医師が知る他の要因を考慮
する。上記の技術およびプロトコールの例は、Remington’s Pharmaceutical Sc
iences（レミントンの医薬科学）第16版, Oslo,A.編, 1980に記載されている。In therapeutic embodiments, the derivatized antibody is typically administered to the individual in a “prophylactically effective amount” or a “therapeutically effective amount” (optionally either, Can also be considered treatment). This is an amount sufficient to benefit the individual. The actual amount administered, and rate and time-course of administration, will depend on the nature and severity of what is being treated. Prescription of treatment, e.g., determination of dosage, is within the responsibilities of general practitioners and other physicians, and typically involves the disease being treated, the condition of the individual patient, the site of delivery, the mode of administration, and the physician. Consider other factors that you know. Examples of the above techniques and protocols are described in Remington's Pharmaceutical Sc
iences (Remington's Pharmaceutical Sciences), 16th edition, Oslo, A. ed., 1980.

【００３３】 あるいは、抗体のターゲッティング特性を使用して、患者の体内における固定
化IgG（例えばアガラクトシルIgG）が蓄積する部位に、前記活性剤をより特異的
に送達することができる。Alternatively, the targeting properties of antibodies can be used to more specifically deliver the active agent to sites where immobilized IgG (eg, agalactosyl IgG) accumulates in the patient.

【００３４】 先に記載したように、本発明の抗体を用いて、１つ以上の機能的成分を固定化
IgGに関連する部位に送達することができる。この機能的成分は該抗体自体から 、またはその抗体と他の分子とのコンジュゲーションにより、提供される。前者
の例としては、炎症媒介物質（例えば腫瘍壊死因子（TNFα）など）に特異的な 抗体の使用が挙げられる。後者の例としては、薬剤の前駆体に該抗体をコンジュ
ゲートし、治療すべき細胞中で産生されたもしくは該細胞にターゲッティングさ
れた活性化剤により、活性形態に変換することが挙げられる。このタイプの方法
はしばしば、細胞特異的抗体へのコンジュゲーションによる活性化剤の細胞への
ターゲッティングを伴うADEPTとして知られている（例えばEP 0415731Aを参照さ
れたい）。As described above, one or more functional components may be immobilized using the antibodies of the invention.
It can be delivered to sites associated with IgG. This functional component is provided by the antibody itself or by conjugation of the antibody with other molecules. An example of the former includes the use of antibodies specific for inflammatory mediators such as tumor necrosis factor (TNFα). An example of the latter is conjugating the antibody to a precursor of the drug and converting it to an active form by an activating agent produced in or targeted to the cell to be treated. This type of method is often known as ADEPT, which involves targeting an activator to cells by conjugation to a cell-specific antibody (see, for example, EP 0415731A).

【００３５】材料および方法 １．モノクローナル抗体3C4の産生 末端N−アセチルグルコサミン（GlcNAc）に対して特異的なIgMモノクローナル
（3C4）を、UCLモノクローナル抗体ユニットのin vitro培養により産生した。ク
ローンの最初のスクリーニングでは、末端N−アセチルグルコサミンに富むオボ アルブミン、次にアガラクトシルIgG（agalactosyl IgG）を使用した。GlcNAcセ
ファロースを用いて培養上清から3C4モノクローナルを精製し、0.5M GlcNAcで溶
出した。次にこれを透析し、ビオチニル化した。この抗体を、以下に記載する実
験においてGlcNAc残基のためのプローブとして使用した。 Materials and Methods Production of Monoclonal Antibody 3C4 An IgM monoclonal (3C4) specific for terminal N-acetylglucosamine (GlcNAc) was produced by in vitro culture of the UCL monoclonal antibody unit. Initial screening of clones used ovalbumin, rich in terminal N-acetylglucosamine, followed by agalactosyl IgG. The 3C4 monoclonal was purified from the culture supernatant using GlcNAc Sepharose and eluted with 0.5M GlcNAc. This was then dialyzed and biotinylated. This antibody was used as a probe for GlcNAc residues in the experiments described below.

【００３６】 ２．3C4スタッキング・アッセイ （i）Nunc maxi-sorpプレートを、50μlのプロテインA（PBS中2.5mg/ml）で4℃ にて一晩被覆した。プレートをPBS/0.05％Tween20（PT）で洗浄し、PT中1% BSA （100μl）（PBT）で37℃にて1時間ブロッキングした。これらのプレートを次に
PTで洗浄し、100mMグリシン/150mM NaCl pH8.2緩衝液中に連続5倍希釈として三 重に、50μl中20μg/ウエル（400μg/ml）から開始して6回希釈し、最低量が約6
ng/ウエルとなるように、試験するヒトIgGを加えた。次にこれらのプレートを37
℃にて2時間インキュベートしたあと、PTで５回洗浄した。100μlのPBSを各ウエ
ルに加えたあと、これらのプレートを85℃の水浴に15分間浮かべ、IgGを変性さ せてFcN結合オリゴ糖類を露出させた。PBSを振り切ったあと、PBT中の１ウエル 当たり125ngのビオチニル化3C4モノクローナルを加え、4℃にて一晩インキュベ ートした。さらに5回洗浄したあと、50μlの0.1Mリン酸クエン酸（citrate phos
phate）中の0.1mgの2,2’-アジノ-ビス[3-エチルベンズ-チアゾリン-6-スルホン
酸]（0.005％過酸化水素を含む、pH4.1）を加え、室温にて10分間暗所でインキ ュベートすることにより、結合した3C4の可視化を行った。0.2％フッ化ナトリウ
ム（50μl）を加えて反応を停止し、650nm〜490nmで吸光度を測定した。2.3 C4 Stacking Assay (i) Nunc maxi-sorp plates were coated overnight at 4 ° C. with 50 μl of protein A (2.5 mg / ml in PBS). Plates were washed with PBS / 0.05% Tween20 (PT) and blocked with 1% BSA in PT (100 μl) (PBT) at 37 ° C. for 1 hour. These plates next
Wash with PT and dilute six times starting from 20 μg / well (400 μg / ml) in 50 μl in triplicate as a five-fold serial dilution in 100 mM glycine / 150 mM NaCl pH8.2 buffer, with a minimum volume of approximately 6
Human IgG to be tested was added to give ng / well. Then add these plates to 37
After 2 hours of incubation at ° C., the plate was washed 5 times with PT. After adding 100 μl of PBS to each well, the plates were floated in a water bath at 85 ° C. for 15 minutes to denature the IgG and expose the FcN-linked oligosaccharides. After shaking off PBS, 125 ng of biotinylated 3C4 monoclonal was added per well in PBT and incubated at 4 ° C overnight. After 5 more washes, 50 μl of 0.1 M citrate phos
0.1 mg of 2,2′-azino-bis [3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid] (containing 0.005% hydrogen peroxide, pH 4.1) in a phate) and a dark place at room temperature for 10 minutes. The 3C4 bound was visualized by incubating with. The reaction was stopped by adding 0.2% sodium fluoride (50 μl), and the absorbance was measured at 650 nm to 490 nm.

【００３７】 （ii）上記アッセイの変法として、ヒトIgGもまた50μl PBS中でNunc Maxi-sor
pプレートに上記と同じ連続希釈20μg/ウエル〜6ng/ウエルで直接被覆した。37 ℃にて2時間後、効率的なコーティングが得られた。この時点から、このアッセ イは加熱ステップから上記と同じにした。すなわち、PBS（100μl）を各ウエル に加えたあと、プレートを85℃の水浴に15分間浮かべた。このアッセイにより、
より高レベルの結合ヒトIgGが得られ、最初のIgG単層の配向（orientation）に 関して先述のアッセイとは異なる。(Ii) As a variant of the above assay, human IgG was also added to Nunc Maxi-sor in 50 μl PBS.
The p-plates were coated directly with the same serial dilutions from 20 μg / well to 6 ng / well as above. After 2 hours at 37 ° C., an efficient coating was obtained. From this point, the assay was identical to the above from the heating step. That is, after PBS (100 μl) was added to each well, the plate was floated in a water bath at 85 ° C. for 15 minutes. With this assay,
Higher levels of bound human IgG are obtained and differ from the previous assays in the orientation of the initial IgG monolayer.

【００３８】 ３．ヒトIgGのチオール化 ヒトIgG（30mg）を15mM重炭酸アンモニウム（0.5ml）中に溶解したが、全ての
溶液は調製後に脱気溶媒を用いて窒素下に保持することにより無酸素状態に保っ
た。15mM重炭酸アンモニウム（1ml）中の2-イミノチオラン-HCl（0.63mg）を加 え、ローラー装置で20分間緩やかに混合した。つぎに、0.9％NaCl中の1％ヒト血
清アルブミンでブロッキングし、15mM重炭酸アンモニウム中で平衡化した使い捨
てのSephadex G-25(PD10)カラムを用いて誘導体化IgGを過剰な2-イミノチオラン
から分離した。15mM重炭酸アンモニウムで誘導体化ヒトIgGの溶出を行い、280nm
の吸光度をモニターした。スズ/酒石酸塩溶液を以下のように作成した。酒石酸 二ナトリウム（4mg/mg IgG）を、酸素を含まない滅菌水（10ml）中に溶解した。
IgG１mg当たり塩化スズ（II）4μgを該溶液に加えた（原液1％ HCl中750μg Sn^{2 +} /mol）。[0038] 3. Thiolation of human IgG Human IgG (30 mg) was dissolved in 15 mM ammonium bicarbonate (0.5 ml), but all solutions were kept anoxic after preparation by keeping them under nitrogen with degassed solvent . 2-Iminothiolane-HCl (0.63 mg) in 15 mM ammonium bicarbonate (1 ml) was added and mixed gently on a roller device for 20 minutes. The derivatized IgG was then separated from excess 2-iminothiolane using a disposable Sephadex G-25 (PD10) column, blocked with 1% human serum albumin in 0.9% NaCl and equilibrated in 15 mM ammonium bicarbonate. did. Elution of derivatized human IgG with 15 mM ammonium bicarbonate was performed at 280 nm.
Was monitored for absorbance. A tin / tartrate solution was made as follows. Disodium tartrate (4 mg / mg IgG) was dissolved in sterile, oxygen-free water (10 ml).
4 μg of tin (II) chloride per mg of IgG was added to the solution (750 μg Sn ^{2 +} / mol in stock 1% HCl).

【００３９】 IgGカラム溶出液を酒石酸塩およびスズの10ml溶液に加え、誘導体化緩衝液を 用いて最終濃度を1mg IgG/mlとした。The IgG column eluate was added to a 10 ml solution of tartrate and tin and the final concentration was 1 mg IgG / ml using derivatization buffer.

【００４０】 ４．コンカナバリンA陽性ヒトIgGの調製 Con Aセファロース（Sigma社）の2mlベット体積のカラムを、200mM塩化ナトリ
ウムおよび2mM MnCl₂、CaCl₂でpH7.2とした50mM Trisで平衡化した。前もって透
析して凍結乾燥したヒト免疫グロブリン（10mg）を、上記緩衝液（1ml）中に溶 解し、該カラムに載せて室温に10分間放置した。つぎにカラムをカラム体積の数
倍量の上記緩衝液で洗浄し、Con A未結合IgG画分を溶出し、280nmの吸光度によ りモニターした。次にCon A陽性画分を5カラム体積の100mM HClで溶出すること により回収したあと、最小体積の1M Tris溶液でpHをできるだけ速やかに中性に 戻した。結合した画分の吸光度を280nmで測定したところ、通常はIgGの約25％が
Con A陽性であることが分かった。両方の画分を水に対して透析し、さらに分析 する前に凍結乾燥した。[0040] 4. Preparation of Concanavalin A Positive Human IgG A 2 ml bed volume column of Con A Sepharose (Sigma) was equilibrated with 50 mM Tris, pH 7.2 with 200 mM sodium chloride and 2 mM MnCl ₂ , CaCl ₂ . Human immunoglobulin (10 mg), previously dialyzed and lyophilized, was dissolved in the above buffer (1 ml), placed on the column and left at room temperature for 10 minutes. Next, the column was washed with several times the buffer volume of the above buffer, and the IgG fraction not bound to Con A was eluted and monitored by absorbance at 280 nm. The Con A positive fraction was then recovered by eluting with 5 column volumes of 100 mM HCl, and the pH was returned to neutral as soon as possible with a minimum volume of 1 M Tris solution. When the absorbance of the bound fraction was measured at 280 nm, usually about 25% of the IgG was
It was found to be Con A positive. Both fractions were dialyzed against water and lyophilized before further analysis.

【００４１】結果および考察 図１の上の図は、方法（３）で記載したように誘導体化IgG(HIG)の抗GlcNAc反
応性が、どの固定濃度でも出発材料（サンドグロブリン）よりも大きいことを示
している。サンドグロブリンおよびHIGはどちらも、それぞれIgG分子に結合した
炭水化物鎖上に同じ化学的含有量の末端N−アセチルグルコサミン残基を有する ので、反応性の増大は、3C4抗GlcNAcモノクローナルプローブに対する炭水化物 残基のアクセス可能性の増大により生じるものに違いない。 Results and Discussion The upper diagram in FIG. 1 shows that the anti-GlcNAc reactivity of the derivatized IgG (HIG) is greater than the starting material (sandglobulin) at any fixed concentration as described in method (3). Is shown. Since both sand globulin and HIG each have the same chemical content of terminal N-acetylglucosamine residues on the carbohydrate chains attached to the IgG molecule, the increased reactivity is due to the carbohydrate residues on the 3C4 anti-GlcNAc monoclonal probe. Must be caused by the increase in accessibility.

【００４２】 FcフラグメントIgG上の炭水化物残基は、タンパク質の内側に埋め込まれてい るために通常はアクセス不可能である（図７を参照されたい）。85℃に加熱する
ことにより、炭水化物鎖の幾つかはアクセス可能になり、3C4により検出可能と なる。サンドグロブリンと比べた場合、HIGにアクセス可能な炭水化物鎖の増加 は、85℃でHIGがより容易に熱変性され、より多くの鎖を露出することを示して いる。これは図９に示されており、図９は、HIGのGlcNAc残基のアクセス可能性 およびサンドグロブリン出発材料が温度と共にどのように変化するかを示すグラ
フである。これは、誘導体化反応により、炭水化物鎖が利用可能になる温度が生
理学的温度に向かって低下することを示す（図１の下の図を参照されたい）。こ
のシフトは、抗体を誘導体化しつつ熱変性により引き起こされる抗体結合活性の
損失を回避するための方法を提供するため、特に有利である。例えば抗体結合反
応に関連する有用な活性（例えば炎症媒介物質に対する結合特異性など）を保持
する誘導体化抗体を作成することができるようにする。糖を「フリップアウトす
る（はじき出す）」ための熱変性の使用は、（1）生理学的温度に戻ると糖がフ リップバックするため、および（2）熱変性により抗体の抗原結合部位が破壊さ れ得るため、有用な方法ではない。したがって、この実施形態に記載される誘導
体化抗体を産生するための２ステップ方法は、（1）生理学的温度で糖鎖を「フ リップアウトする」ための化学変性剤を提供し、続いて（2）これらをフリップ バックするのを防ぐための化学的誘導体化を行う。[0042] Carbohydrate residues on Fc fragment IgG are usually inaccessible because they are embedded inside the protein (see Figure 7). Heating to 85 ° C makes some of the carbohydrate chains accessible and detectable by 3C4. An increase in the carbohydrate chains accessible to HIG when compared to sand globulin indicates that HIG is more easily heat denatured at 85 ° C, exposing more chains. This is shown in FIG. 9, which is a graph showing the accessibility of GlcNAc residues in HIG and how the sand globulin starting material changes with temperature. This indicates that the temperature at which the carbohydrate chains become available decreases toward physiological temperatures due to the derivatization reaction (see the lower diagram of FIG. 1). This shift is particularly advantageous because it provides a method for derivatizing the antibody while avoiding the loss of antibody binding activity caused by thermal denaturation. For example, it allows the generation of derivatized antibodies that retain useful activities associated with antibody binding reactions (eg, binding specificity for inflammatory mediators, etc.). The use of heat denaturation to “flip out” sugars has two consequences: (1) the sugars flip back when they return to physiological temperature, and (2) heat denaturation destroys the antigen-binding site of the antibody. This is not a useful method. Thus, the two-step method for producing derivatized antibodies described in this embodiment provides (1) a chemical denaturant to "flip out" sugar chains at physiological temperature, followed by ( 2) Perform chemical derivatization to prevent them from flipping back.

【００４３】 マイクロタイターウエルに加えるIgGの量を増加させたとき、飽和が予測され る。図２は、サンドグロブリンが飽和するにもかかわらず、マイクロタイタープ
レートに加えるHIGの濃度を増大させたときにHIGの抗GlcNAc反応性が引き続き増
大することを示す。これは、一番上の新しい表面の単層が、抗GlcNAc反応性IgG をより多くの割合で含むHIGの場合に形成されていることを示す。最初のプロテ インA固定化単層およびその次の単層への抗GlcNAc反応性IgGのこの「スタッキン
グ（Stacking）」はHIGに独特な特性であり、サンドグロブリンには見られない 。この現象は、図８に記載されており、図８は、このスタックの連続的な層にお
いて固定化IgG（白丸で示す）と比べて誘導体化抗体（黒丸で示す）の割合がど のように増加するかを示している。When increasing the amount of IgG added to the microtiter wells, saturation is expected. FIG. 2 shows that the anti-GlcNAc reactivity of HIG continues to increase when the concentration of HIG added to the microtiter plate is increased, despite the saturation of sand globulin. This indicates that a top new surface monolayer is formed in the case of HIG, which contains a higher proportion of anti-GlcNAc-reactive IgG. This “stacking” of anti-GlcNAc-reactive IgG to the first protein A-immobilized monolayer and the next monolayer is a unique property of HIG and not found in sand globulin. This phenomenon is described in FIG. 8, which shows how the percentage of derivatized antibody (indicated by a closed circle) is compared to immobilized IgG (indicated by an open circle) in successive layers of this stack. Indicates that it will increase.

【００４４】 図２は、最初の単層がプレートのコーティング（すなわちプロテインA）によ り配向されていない場合にも、抗GlcNAc反応性IgGのスタッキングが生じること を示している。また図２は、加熱を行わない場合でも、HIG調製物の中に十分な 量の抗GlcNAc反応性IgGがあること、ならびにサンドグロブリン中には実質的に 何も存在しないことも示している。FIG. 2 shows that anti-GlcNAc-reactive IgG stacking also occurs when the first monolayer is not oriented by the coating of the plate (ie, protein A). FIG. 2 also shows that there is a sufficient amount of anti-GlcNAc-reactive IgG in the HIG preparation, even without heating, and that there is virtually nothing in the sand globulin.

【００４５】 またIgGは、その分子のFab領域の中に炭水化物残基を含むことも知られている
。Fab炭水化物は，レクチン結合にアクセス可能であるため、Fab会合炭水化物を
含むIgG分子をアフィニティークロマトグラフィにより分離することができる。 図３（下の図）は、Con A結合（Fab炭水化物を含むIgG）およびConA未結合（Fab
炭水化物を含まないIgG）のパーセンテージが、サンドグロブリンおよびHIGでは
同じであることを示している。しかし、図３（上の図）は、「スタッキング」Ig
Gの全てがHIGのConA結合画分中に見られることを示す。これらの種は図７に図示
されている。また図３は、誘導体化抗体の全てがスタッキング可能であるわけで
はない場合に、分離ステップを用いてスタッキング抗体を分離しなければならな
いことも示している。It is also known that IgG contains a carbohydrate residue in the Fab region of the molecule. Since Fab carbohydrates are accessible for lectin binding, IgG molecules containing Fab-associated carbohydrates can be separated by affinity chromatography. FIG. 3 (bottom) shows Con A binding (Fab carbohydrate-containing IgG) and ConA unbinding (Fab
The percentage of IgG without carbohydrates) is the same for sand globulin and HIG. However, Figure 3 (top) shows the "stacking" Ig
G shows that all of the G is found in the ConA binding fraction of HIG. These species are illustrated in FIG. FIG. 3 also shows that if not all of the derivatized antibodies are stackable, a stacking antibody must be separated using a separation step.

【００４６】 これらの結果は、「スタッキング」IgGが３つの具体的な特徴を有することを 示唆している。These results suggest that “stacking” IgG has three specific characteristics.

【００４７】 （a）第１に、「スタッキング」HIGは、Fcフラグメント上の炭水化物をプローブ
する抗GlcNAcモノクローナル抗体に反応性である。(A) First, “stacking” HIG is reactive with anti-GlcNAc monoclonal antibodies that probe carbohydrates on Fc fragments.

【００４８】 （b）第２に、スタッキングするのはFab会合炭水化物も有するこれらのHIG分子 のみである。(B) Second, only those HIG molecules that also have Fab associated carbohydrates stack.

【００４９】 （c）第３に、HIG濃度が増大したときに見られる抗GlcNAc反応物質の割合の増加
は、「スタッキング」IgGが自身をスタッキングすること（すなわち自己会合す ること）を好むことを示す。(C) Third, the increase in the proportion of anti-GlcNAc reactants seen when the concentration of HIG is increased indicates that “stacking” IgGs prefer to stack themselves (ie, self-associate). Is shown.

【００５０】 慢性関節リウマチ(rheumatoid arthritis:RA)に罹患した患者では、アガラク トシルIgGの糖形態（glycoform）の血清含量が増大している。この糖形態は、病
気に関係し、ガラクトースまたはシアル酸ではなくN-アセチルグルコサミンを末
端に有するFc会合炭水化物鎖の割合が増加していることを特徴する（図６(b)を 参照されたい）。したがってIgGのこの形態は、in vitroで産生されたHIGに似た
3C4モノクローナルと共に抗GlcNAc反応性が増大している。したがって固定化ア ガラクトシルIgGは、in vivoにおいてHIGの「スタッキング」のための優先的な 表面として働く。このようにHIGは、高濃度の内因性IgGの存在下において自己免
疫疾患の患者の組織表面（例えば滑膜性の連結）に選択的に結合することができ
る。In patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), the serum content of the agalactosyl IgG glycoform is increased. This glycoform is associated with disease and is characterized by an increased proportion of Fc-associated carbohydrate chains terminating in N-acetylglucosamine rather than galactose or sialic acid (see FIG. 6 (b)). . Thus, this form of IgG resembled HIG produced in vitro.
Anti-GlcNAc reactivity is increased with 3C4 monoclonal. Thus, immobilized agalactosyl IgG serves as a preferential surface for HIG "stacking" in vivo. Thus, HIG can selectively bind to the tissue surface (eg, synovial junction) of a patient with an autoimmune disease in the presence of high concentrations of endogenous IgG.

【００５１】 図４および図５は、イミノチオラン誘導体化反応自体はスタッキング可能なHI
Gを生成するのに十分ではないことを示す。この結果は予測できないものであり 、新規なものである。最も可能性の高いメカニズムは、ある種の緩衝液（例えば
重炭酸アンモニウム）が簡単に炭水化物残基を「フリップアウト」させることが
でき、隠れたアミノ酸残基を露出して次に該アミノ酸残基をイミノチオランで誘
導体化し得ることである。誘導体化されると、イミノチオラン基の存在は立体構
造的に炭水化物鎖がタンパク質の中にフリップバックするのを妨げる（図７(b) を参照）。他のメカニズムは、炭水化物鎖が「フリップアウト」するときに、炭
水化物結合部位から離れたところにあるアミノ酸残基のイミノチオラン誘導体化
により、タンパク質の立体配置が安定化する（この場合、炭水化物鎖は37℃にて
より長い時間「フリップアウト」する）ことである（図１(b)を参照されたい） 。つまり動的平衡化は、体温で糖鎖がより移動性になり、その結果タンパク質表
面が露出されて、隣の分子からの炭水化物鎖とより長い時間相互作用するように
、シフトする。FIGS. 4 and 5 show that the iminothiolane derivatization reaction itself is stackable HI.
Show that it is not enough to generate G. This result is unpredictable and new. The most likely mechanism is that certain buffers (eg, ammonium bicarbonate) can easily “flip out” carbohydrate residues, exposing hidden amino acid residues and then exposing them Can be derivatized with iminothiolane. When derivatized, the presence of the iminothiolane group sterically prevents the carbohydrate chains from flipping back into the protein (see FIG. 7 (b)). Another mechanism is that when the carbohydrate chain “flips out,” the iminothiolane derivatization of amino acid residues remote from the carbohydrate binding site stabilizes the protein configuration (in this case, the carbohydrate chain is 37 ("Flip out" for a longer period of time at 0 ° C) (see Figure 1 (b)). Thus, dynamic equilibration shifts the sugar chains at body temperature to become more mobile, thereby exposing the protein surface and interacting with carbohydrate chains from neighboring molecules for a longer time.

【００５２】 図６(a)は、本発明の誘導体化抗体が、RA患者の関節に固定化されることが分 かっている抗II型コラーゲンIgG抗体にどのように結合するかを示す。この誘導 体化抗体は、抗II型コラーゲンIgG抗体に結合することが可能であり、固定化IgG
のアガラクトシル炭水化物鎖による結合のために開く結合部位を有する炭水化物
残基をフリップアウトした。これは、誘導体化抗体が、固定化抗体が位置する部
位に結合することができ、スタッキングして診断用標識または治療目的のための
他の種類のエフェクター成分のための標識を増幅することができることを示す。FIG. 6 (a) shows how the derivatized antibody of the present invention binds to an anti-type II collagen IgG antibody known to be immobilized on the joints of RA patients. This derivatized antibody is capable of binding to anti-type II collagen IgG antibody,
Carbohydrate residues having a binding site that opens for binding by the agalactosyl carbohydrate chain of. This means that the derivatized antibody can bind to the site where the immobilized antibody is located and stack and amplify the label for a diagnostic label or other type of effector component for therapeutic purposes. Is shown.

【００５３】 図６(b)は、アガラクトシル抗体および通常の抗体における炭水化物鎖の構造 の違いを示し、アガラクトシルIgGではその炭水化物鎖の末端からガラクトシル およびシアル酸残基が失われている。FIG. 6 (b) shows the difference in carbohydrate chain structure between the agalactosyl antibody and the normal antibody. In agalactosyl IgG, galactosyl and sialic acid residues are missing from the end of the carbohydrate chain.

【００５４】 図７は，上記のHIG誘導体化抗体のスタッキング特性を調査する実験において 使用した種の模式図を表わす。このように、誘導体化反応は、内部タンパク質表
面に結合したFc炭水化物をフリップアウトする（図７のCon A結合および図７(HI
G)を比較）。この表面（結合部位）は、ここでは空であり、隣接するIgG分子上 の他の炭水化物鎖と相互作用することができる。図３のデータは、この炭水化物
鎖が隣接するIgG分子のFab（図7 Con A結合を参照）に結合したものであること を示す。血清アガラクトシルIgG（図６(b)）は、炭水化物鎖がフリップアウトす
るときに誘導体化IgGで生じる同じタンパク質表面を露出する炭水化物残基を失 うため、誘導体化抗体のように振舞う。FIG. 7 shows a schematic diagram of the species used in the experiments investigating the stacking properties of the above-described HIG-derivatized antibodies. Thus, the derivatization reaction flips out Fc carbohydrates bound to the internal protein surface (Con A binding in FIG. 7 and FIG. 7 (HI
G)). This surface (binding site) is now empty and can interact with other carbohydrate chains on adjacent IgG molecules. The data in FIG. 3 shows that this carbohydrate chain was bound to the Fab of an adjacent IgG molecule (see FIG. 7 Con A binding). Serum agalactosyl IgG (FIG. 6 (b)) behaves like a derivatized antibody because it loses the carbohydrate residues exposing the same protein surface that occurs with derivatized IgG when the carbohydrate chains flip out.

【００５５】 本明細書中に記載した参考文献は、参考として全て組み込まれるものとする。The references mentioned herein are all incorporated by reference.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、固定化サンドグロブリンまたは誘導体化サンドグロブリン(HIG)の抗G
lcNAc反応性を示す。種々の濃度のHIGのサンドグロブリンを含む溶液を、プロテ
インAで被覆したマイクロタイターウェルに加えた。上図は、プレートを85℃で1
0分間加熱し、タンパク質を穏やかに変性させ、炭水化物残基を露出させた後の 固定化IgGまたはHIGの抗GlcNAc反応性を示す。下図は、加熱工程を行わない場合
の抗GlcNAc反応性を示す。FIG. 1. Anti-G of immobilized or derivatized sand globulin (HIG).
Shows lcNAc reactivity. Solutions containing various concentrations of HIG sand globulin were added to protein A-coated microtiter wells. The above figure shows the plate at 85 ° C for 1
Shows anti-GlcNAc reactivity of immobilized IgG or HIG after heating for 0 min to gently denature the protein and expose carbohydrate residues. The lower figure shows the anti-GlcNAc reactivity without the heating step.

【図２】 図２は、固定化サンドグロブリン(上図)またはHIG(下図)の抗GlcNAc反応性を 示す。種々の濃度のHIGのサンドグロブリンを含む溶液を、直接マイクロタイタ ープレートに加えるか、またはプロテインAで被覆したプレートに加えた。抗Glc
NAcモノクローナル抗体を添加する前に、プロテインAで被覆したプレートを、85
℃で10分間加熱するか、または室温で同様の時間インキュベートした。FIG. 2 shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized sand globulin (upper figure) or HIG (lower figure). Solutions containing various concentrations of HIG in sand globulin were added directly to microtiter plates or to plates coated with protein A. Anti-Glc
Prior to addition of the NAc monoclonal antibody, plates coated with Protein A were
Heated at 10 ° C. for 10 minutes or incubated at room temperature for a similar time.

【図３】 図３は、固定化コンカナバリンAを含むアフィニティーカラムにサンドグロブ リンまたはHIG(4852)を添加した結果を示す。３つの画分が得られた。すなわち 、未結合、弱く結合（100 mMのα−メチルマンノシドで溶出）、強く結合（100
mMのHClで溶出）した画分である。種々の濃度の前記の３つの画分のそれぞれを 、プロテインAで被覆したマイクロタイターウェル中でインキュベートした。HIG
画分の固定化サンドグロブリンの抗GlcNAc反応性を測定した。下図は、3種の異 なるHIG調製物および未誘導体化サンドグロブリンに対する、未結合物質および 結合した物質の百分率を示す。FIG. 3 shows the results of adding sandglobulin or HIG (4852) to an affinity column containing immobilized concanavalin A. Three fractions were obtained. That is, unbound, weakly bound (eluted with 100 mM α-methyl mannoside), and strongly bound (100
eluting with mM HCl). Each of the three fractions at various concentrations was incubated in protein A coated microtiter wells. HIG
The anti-GlcNAc reactivity of the immobilized sand globulin of the fraction was measured. The figure below shows the percentage of unbound and bound material for three different HIG preparations and underivatized sandroglobulin.

【図４】 図４は、固定化CLB、誘導体化CLB(HIG-62759)、サンドグロブリンおよび誘導 体化サンドグロブリン(HIG 4855)の抗GlcNAc反応性を示す。種々の濃度の異なる
調製物を含む溶液を、プロテインAで被覆したマイクロタイタープレートに加え た。次いで、プレートを85℃で10分間加熱した。FIG. 4 shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized CLB, derivatized CLB (HIG-62759), sand globulin and derivatized sand globulin (HIG 4855). Solutions containing different concentrations of the different preparations were added to protein A-coated microtiter plates. The plate was then heated at 85 ° C. for 10 minutes.

【図５】 図５は、異なるバッファーを用いてイミノチオランで誘導体化された固定化サ
ンドグロブリンの抗GlcNAc反応性を示す。種々の濃度の誘導体化IgGを含む溶液 を、プロテインAで被覆したマイクロタイタープレートに加え、次いで、85℃で1
0分間加熱した。FIG. 5 shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized sand globulin derivatized with iminothiolane using different buffers. Solutions containing various concentrations of derivatized IgG were added to protein A-coated microtiter plates and then incubated at 85 ° C for 1 hour.
Heated for 0 minutes.

【図６】 図６(a)は、本発明の誘導体抗体が、RA患者の関節において固定化されること がわかっている抗II型コラーゲンIgG抗体にどのように結合するかを示す。 図６(b)は、アガラクトシル抗体および正常抗体における炭水化物鎖の構造の 差異を示す。FIG. 6 (a) shows how the derivative antibody of the present invention binds to an anti-type II collagen IgG antibody known to be immobilized in joints of RA patients. FIG. 6 (b) shows the difference in carbohydrate chain structure between the agalactosyl antibody and the normal antibody.

【図７】 図７は、図３において示した実験に関連する種の模式図を示す。FIG. 7 shows a schematic diagram of the species associated with the experiment shown in FIG.

【図８】 図８は、図２のスタッキングアッセイから得られる結果がどのように生じるの
かを説明する模式図である。FIG. 8 is a schematic diagram illustrating how the results obtained from the stacking assay of FIG. 2 occur.

【図９】 図９は、HIGおよびサンドグロブリンの温度に対してプロットされた変性度の グラフを示し、誘導体化が所定の温度でいかにして変性度の増大に導くかを実証
する。FIG. 9 shows a graph of denaturation plotted against the temperature of HIG and sand globulin, demonstrating how derivatization leads to an increase in denaturation at a given temperature.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成１２年９月５日（２０００．９．５）[Submission date] September 5, 2000 (2009.5)

【手続補正１】[Procedure amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【特許請求の範囲】[Claims]

【手続補正２】[Procedure amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００３５[Correction target item name] 0035

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００３５】材料および方法 １．モノクローナル抗体3C4の産生 末端N−アセチルグルコサミン（GlcNAc）に対して特異的なIgMモノクローナル
（3C4）を、UCLモノクローナル抗体ユニットのin vitro培養により産生した。ク
ローンの最初のスクリーニングでは、末端N−アセチルグルコサミに富むオボア ルブミン、次にアガラクトシルIgG（agalactosyl IgG）を使用した。GlcNAcセフ
ァロース(登録商標)を用いて培養上清から3C4モノクローナルを精製し、0.5M Gl
cNAcで溶出した。次にこれを透析し、ビオチニル化した。この抗体を、以下に記
載する実験においてGlcNAc残基のためのプローブとして使用した。 Materials and Methods Production of Monoclonal Antibody 3C4 An IgM monoclonal (3C4) specific for terminal N-acetylglucosamine (GlcNAc) was produced by in vitro culture of the UCL monoclonal antibody unit. Initial screening of clones used ovalbumin, rich in terminal N-acetylglucosami, followed by agalactosyl IgG. GlcNAc ceph <br/> Arosu purified from the culture supernatant 3C4 monoclonal using (R), 0.5M Gl
Eluted with cNAc. This was then dialyzed and biotinylated. This antibody was used as a probe for GlcNAc residues in the experiments described below.

【手続補正３】[Procedure amendment 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００３６[Correction target item name] 0036

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００３６】 ２．3C4スタッキング・アッセイ （i）Nunc(登録商標) maxi-sorpプレートを、50μlのプロテインA（PBS中2.5mg/
ml）で4℃にて一晩被覆した。プレートをPBS/0.05％Tween (登録商標) 20（PT）
で洗浄し、PT中1% BSA（100μl）（PBT）で37℃にて1時間ブロッキングした。こ
れらのプレートを次にPTで洗浄し、100mMグリシン/150mM NaCl pH8.2緩衝液中に
連続5倍希釈として三重に、50μl中20μg/ウエル（400μg/ml）から開始して6回
希釈し、最低量が約6ng/ウエルとなるように、試験するヒトIgGを加えた。次に これらのプレートを37℃にて2時間インキュベートしたあと、PTで５回洗浄した 。100μlのPBSを各ウエルに加えたあと、これらのプレートを85℃水浴に15分間 浮かべ、IgGを変性させてFcN結合オリゴ糖類を露出させた。PBSを振り切ったあ と、PBT中の１ウエル当たり125ngのビオチニル化3C4モノクローナルを加え、4℃
にて一晩インキュベートした。さらに5回洗浄したあと、50μlの0.1Mリン酸クエ
ン酸（citrate phosphate）中の0.1mgの2,2’-アジノ-ビス[3-エチルベンズ-チ アゾリン-6-スルホン酸]（0.005％過酸化水素を含む、pH4.1）を加え、室温にて
10分間暗所でインキュベートすることにより、結合した3C4の可視化を行った。0
.2％フッ化ナトリウム（50μl）を加えて反応を停止し、650nm〜490nmで吸光度 を測定した。[0036] 2.3C4 stacking Assay (i) Nunc (TM) the maxi-sorp plate, 50 [mu] l of Protein A (PBS in 2.5 mg /
ml) at 4 ° C overnight. Plates PBS / 0.05% Tween (R) 20 (PT)
And blocked with 1% BSA in PT (100 μl) (PBT) at 37 ° C. for 1 hour. The plates were then washed with PT and diluted six times starting at 20 μg / well in 50 μl (400 μg / ml) in triplicate in 100 mM glycine / 150 mM NaCl pH8.2 buffer as a five-fold dilution, The human IgG to be tested was added to a minimum of about 6 ng / well. The plates were then incubated at 37 ° C. for 2 hours and then washed 5 times with PT. After adding 100 μl of PBS to each well, the plates were floated in a 85 ° C. water bath for 15 minutes to denature the IgG and expose the FcN-linked oligosaccharides. After shaking off PBS, add 125 ng of biotinylated 3C4 monoclonal per well in PBT.
For overnight. After 5 additional washes, 0.1 mg of 2,2'-azino-bis [3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid] in 50 μl of 0.1 M citrate phosphate (0.005% peroxide Containing hydrogen, pH 4.1) and at room temperature
The bound 3C4 was visualized by incubation in the dark for 10 minutes. 0
The reaction was stopped by adding 0.2% sodium fluoride (50 μl), and the absorbance was measured at 650 nm to 490 nm.

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００３７[Correction target item name] 0037

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００３７】 （ii）上記アッセイの変法として、ヒトIgGもまた50μl PBS中でNunc(登録商標 ) Maxi-sorpプレートに上記と同じ連続希釈20μg/ウエル〜6ng/ウエルで直接被 覆した。37℃にて2時間後、効率的なコーティングが得られた。この時点から、 このアッセイは加熱ステップから上記と同じにした。すなわち、PBS（100μl） を各ウエルに加えたあと、プレートを85℃の水浴に15分間浮かべた。このアッセ
イにより、より高レベルの結合ヒトIgGが得られ、最初のIgG単層の配向（orient
ation）に関して先述のアッセイとは異なる。[0037] As a variant of (ii) above assay, human IgG was also reversed the direct in the same serial dilution 20 [mu] g / well ～6Ng / well as above the Nunc (TM) Maxi-sorp plates in 50 [mu] l PBS. After 2 hours at 37 ° C., an efficient coating was obtained. From this point, the assay was identical to the above from the heating step. That is, PBS (100 μl) was added to each well, and the plate was floated in a water bath at 85 ° C. for 15 minutes. This assay resulted in higher levels of bound human IgG and the orientation of the initial IgG monolayer (orient
ation) is different from the above-mentioned assay.

【手続補正５】[Procedure amendment 5]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００３８[Correction target item name] 0038

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００３８】 ３．ヒトIgGのチオール化 ヒトIgG（30mg）を15mM重炭酸アンモニウム（0.5ml）中に溶解したが、全ての
溶液は調製後に脱気溶媒を用いて窒素下に保持することにより無酸素状態に保っ
た。15mM重炭酸アンモニウム（1ml）中の2-イミノチオラン-HCl（0.63mg）を加 え、ローラー装置で20分間緩やかに混合した。つぎに、0.9％NaCl中の1％ヒト血
清アルブミンでブロッキングし、15mM重炭酸アンモニウム中で平衡化した使い捨
てのSephadex(登録商標) G-25(PD10)カラムを用いて誘導体化IgGを過剰な2-イミ
ノチオランから分離した。15mM重炭酸アンモニウムで誘導体化ヒトIgGの溶出を 行い、280nmの吸光度をモニターした。スズ/酒石酸塩溶液を以下のように作成し
た。酒石酸二ナトリウム（4mg/mg IgG）を、酸素を含まない滅菌水（10ml）中に
溶解した。IgG１mg当たり塩化スズ（II）4μgを該溶液に加えた（原液1％ HCl中
750μg Sn²⁺/mol）。[0038] 3. Thiolation of human IgG Human IgG (30 mg) was dissolved in 15 mM ammonium bicarbonate (0.5 ml), but all solutions were kept anoxic after preparation by keeping them under nitrogen with degassed solvent . 2-Iminothiolane-HCl (0.63 mg) in 15 mM ammonium bicarbonate (1 ml) was added and mixed gently on a roller device for 20 minutes. The derivatized IgG was then added to excess 2% using a disposable Sephadex® G-25 (PD10) column blocked with 1% human serum albumin in 0.9% NaCl and equilibrated in 15 mM ammonium bicarbonate. -Separated from iminothiolane. The derivatized human IgG was eluted with 15 mM ammonium bicarbonate, and the absorbance at 280 nm was monitored. A tin / tartrate solution was made as follows. Disodium tartrate (4 mg / mg IgG) was dissolved in sterile oxygen-free water (10 ml). 4 μg of tin (II) chloride per mg of IgG was added to the solution (in stock solution 1% HCl)
750 μg Sn ²⁺ / mol).

【手続補正６】[Procedure amendment 6]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００４０[Correction target item name] 0040

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００４０】 ４．コンカナバリンA陽性ヒトIgGの調製 Con Aセファロース(登録商標)（Sigma社）の2mlベット体積のカラムを、200mM
塩化ナトリウムおよび2mM MnCl₂、CaCl₂でpH7.2とした50mM Trisで平衡化した。
前もって透析して凍結乾燥したヒト免疫グロブリン（10mg）を、上記緩衝液（1m
l）中に溶解し、該カラムに載せて室温に10分間放置した。つぎにカラムをカラ ム体積の数倍量の上記緩衝液で洗浄し、Con A未結合IgG画分を溶出し、280nmの 吸光度によりモニターした。次にCon A陽性画分を5カラム体積の100mM HClで溶 出することにより回収したあと、最小体積の1M Tris溶液でpHをできるだけ速や かに中性に戻した。結合した画分の吸光度を280nmで測定したところ、通常はIgG
の約25％がCon A陽性であることが分かった。両方の画分を水に対して透析し、 さらに分析する前に凍結乾燥した。[0040] 4. Preparation of Concanavalin A Positive Human IgG A column of Con A Sepharose (registered trademark) (Sigma) having a bed volume of 2 ml
Equilibrated with 50 mM Tris, pH 7.2 with sodium chloride and 2 mM MnCl ₂ , CaCl ₂ .
Human immunoglobulin (10 mg), previously dialyzed and freeze-dried, was added to the above buffer (1 ml).
l) and left on the column for 10 minutes at room temperature. Next, the column was washed with several times the volume of the above buffer solution, and the IgG fraction not bound to Con A was eluted and monitored by absorbance at 280 nm. The Con A positive fraction was then recovered by elution with 5 column volumes of 100 mM HCl, and the pH was returned to neutral as soon as possible with a minimum volume of 1 M Tris solution. When the absorbance of the bound fraction was measured at 280 nm, it was
About 25% were found to be Con A positive. Both fractions were dialyzed against water and lyophilized before further analysis.

【手続補正７】[Procedure amendment 7]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００５５[Correction target item name] 0055

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction contents]

【００５５】 本明細書中に記載した参考文献は、参考として全て組み込まれるものとする。The references mentioned herein are all incorporated by reference.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 図１は、固定化サンドグロブリンまたは誘導体化サンドグロブリン(HIG)の抗G
lcNAc反応性を示す。種々の濃度のサンドグロブリンまたはHIGを含む溶液を、プ
ロテインAで被覆したマイクロタイターウェルに加えた。上図は、プレートを85 ℃で10分間加熱し、タンパク質を穏やかに変性させ、炭水化物残基を露出させた
後の固定化IgGまたはHIGの抗GlcNAc反応性を示す。下図は、加熱工程を行わない
場合の抗GlcNAc反応性を示す。FIG. 1. Anti-G of immobilized or derivatized sand globulin (HIG).
Shows lcNAc reactivity. Solutions containing various concentrations of sand globulin or HIG were added to protein A-coated microtiter wells. The upper panel shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized IgG or HIG after heating the plate at 85 ° C. for 10 minutes, gently denaturing the protein and exposing carbohydrate residues. The lower figure shows the anti-GlcNAc reactivity without the heating step.

【図２】 図２は、固定化サンドグロブリン(上図)またはHIG(下図)の抗GlcNAc反応性を 示す。種々の濃度のサンドグロブリンまたはHIGを含む溶液を、直接マイクロタ イタープレートに加えるか、またはプロテインAで被覆したプレートに加えた。 抗GlcNAcモノクローナル抗体を添加する前に、プロテインAで被覆したプレート を、85℃で10分間加熱するか、または室温で同様の時間インキュベートした。FIG. 2 shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized sand globulin (upper figure) or HIG (lower figure). Solutions containing various concentrations of sand globulin or HIG were added directly to microtiter plates or to plates coated with protein A. Prior to the addition of the anti-GlcNAc monoclonal antibody, the protein A-coated plates were heated at 85 ° C. for 10 minutes or incubated at room temperature for a similar time.

【図３】 図３は、固定化コンカナバリンAを含むアフィニティーカラムにサンドグロブ リンまたはHIG(4852)を添加した結果を示す。３つの画分が得られた。すなわち 、未結合、弱く結合（100 mMのα−メチルマンノシドで溶出）、強く結合（100
mMのHClで溶出）した画分である。種々の濃度の前記の３つの画分のそれぞれを 、プロテインAで被覆したマイクロタイターウェル中でインキュベートした。HIG
画分の固定化サンドグロブリンの抗GlcNAc反応性を測定した。下図は、3種の異 なるHIG調製物および未誘導体化サンドグロブリンに対する、未結合物質および 結合した物質の百分率を示す。FIG. 3 shows the results of adding sandglobulin or HIG (4852) to an affinity column containing immobilized concanavalin A. Three fractions were obtained. That is, unbound, weakly bound (eluted with 100 mM α-methyl mannoside), and strongly bound (100
eluting with mM HCl). Each of the three fractions at various concentrations was incubated in protein A coated microtiter wells. HIG
The anti-GlcNAc reactivity of the immobilized sand globulin of the fraction was measured. The figure below shows the percentage of unbound and bound material for three different HIG preparations and underivatized sandroglobulin.

【図４】 図４は、固定化CLB、誘導体化CLB(HIG-62759)、サンドグロブリンおよび誘導 体化サンドグロブリン(HIG 4855)の抗GlcNAc反応性を示す。種々の濃度の異なる
調製物を含む溶液を、プロテインAで被覆したマイクロタイタープレートに加え た。次いで、プレートを85℃で10分間加熱した。FIG. 4 shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized CLB, derivatized CLB (HIG-62759), sand globulin and derivatized sand globulin (HIG 4855). Solutions containing different concentrations of the different preparations were added to protein A-coated microtiter plates. The plate was then heated at 85 ° C. for 10 minutes.

【図５】 図５は、異なるバッファーを用いてイミノチオランで誘導体化された固定化サ
ンドグロブリンの抗GlcNAc反応性を示す。種々の濃度の誘導体化IgGを含む溶液 を、プロテインAで被覆したマイクロタイタープレートに加え、次いで、85℃で1
0分間加熱した。FIG. 5 shows the anti-GlcNAc reactivity of immobilized sand globulin derivatized with iminothiolane using different buffers. Solutions containing various concentrations of derivatized IgG were added to protein A-coated microtiter plates and then incubated at 85 ° C for 1 hour.
Heated for 0 minutes.

【図６】 図６(a)は、本発明の誘導体抗体が、RA患者の関節において固定化されること がわかっている抗II型コラーゲンIgG抗体にどのように結合するかを示す。 図６(b)は、アガラクトシル抗体および正常抗体における炭水化物鎖の構造の 差異を示す。FIG. 6 (a) shows how the derivative antibody of the present invention binds to an anti-type II collagen IgG antibody known to be immobilized in joints of RA patients. FIG. 6 (b) shows the difference in carbohydrate chain structure between the agalactosyl antibody and the normal antibody.

【図７】 図７は、図３において示した実験に関連する種の模式図を示す。FIG. 7 shows a schematic diagram of the species associated with the experiment shown in FIG.

【図８】 図８は、図２のスタッキングアッセイから得られる結果がどのように生じるの
かを説明する模式図である。FIG. 8 is a schematic diagram illustrating how the results obtained from the stacking assay of FIG. 2 occur.

【図９】 図９は、HIGおよびサンドグロブリンの温度に対してプロットされた変性度の グラフを示し、誘導体化が所定の温度でいかにして変性度の増大に導くかを実証
する。FIG. 9 shows a graph of denaturation plotted against the temperature of HIG and sand globulin, demonstrating how derivatization leads to an increase in denaturation at a given temperature.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 31/06 31/06 31/08 31/08 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C085 AA08 AA13 AA21 AA23 BB36 DD33 EE01 GG01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA53 BA61 DA75 DA76 EA22 EA50 GA26──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 29/00 101 A61P 29/00 101 31/06 31/06 31/08 31/08 37/00 37 / 00 C07K 16/00 C07K 16/00 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT , SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZWF terms (reference) 4C085 AA08 AA13 AA21 AA23 BB36 DD33 EE01 GG01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA53 BA61 DA75 DA76 EA22 EA50 GA26

Claims (24)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 抗体の炭水化物鎖を露出して抗体が固定化IgGに結合できる ように誘導体化された抗体。1. An antibody derivatized to expose the carbohydrate chains of the antibody so that the antibody can bind to immobilized IgG. 【請求項２】 前記炭水化物鎖がFc炭水化物鎖である、請求項１に記載の抗
体。2. The antibody of claim 1, wherein said carbohydrate chain is an Fc carbohydrate chain. 【請求項３】 前記炭水化物鎖がN-アセチルグルコサミン残基を末端に有す
る、請求項１または２に記載の抗体。3. The antibody according to claim 1, wherein the carbohydrate chain has an N-acetylglucosamine residue at a terminal. 【請求項４】 前記の誘導体化された抗体の炭水化物鎖が、固定化抗体上の
結合部位に特異的に結合することができる、請求項１〜３のいずれか一つに記載
の抗体。4. The antibody according to claim 1, wherein the carbohydrate chain of the derivatized antibody is capable of binding specifically to a binding site on the immobilized antibody. 【請求項５】 前記固定化IgGがアガラクトシルIgGである、請求項１〜４の
いずれか一つに記載の抗体。5. The antibody according to claim 1, wherein said immobilized IgG is agalactosyl IgG. 【請求項６】 標識、トキシン、薬剤、プロドラッグ、またはエフェクター
にコンジュゲートされる、請求項１〜５のいずれか一つに記載の抗体。6. The antibody according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody is conjugated to a label, toxin, drug, prodrug, or effector. 【請求項７】 炎症メディエーターに対して特異的である、請求項１〜６の
いずれか一つに記載の抗体。7. The antibody according to claim 1, which is specific for an inflammatory mediator. 【請求項８】 固定化IgGに関連する病状の医学的治療方法または診断方法 における使用のための、請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗体。8. The antibody according to any one of claims 1 to 7, for use in a method for medical treatment or diagnosis of a condition associated with immobilized IgG. 【請求項９】 自己免疫疾患の診断または治療における使用のための、請求
項８に記載の抗体。9. The antibody of claim 8, for use in diagnosing or treating an autoimmune disease. 【請求項１０】 前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、
クローン病、I型インスリン依存性糖尿病、II型糖尿病、サルコイドーシス、ら い性結節性紅斑、および結核より選択される、請求項９に記載の抗体。10. The autoimmune disease includes rheumatoid arthritis, juvenile arthritis,
The antibody according to claim 9, which is selected from Crohn's disease, type I insulin-dependent diabetes, type II diabetes, sarcoidosis, erythema nodosum leprosum, and tuberculosis. 【請求項１１】 前記抗体がびらん性関節病の診断または治療において使用
するためのものであり、かつ前記固定化IgGが抗II型コラーゲンIgGである、請求
項９に記載の抗体。11. The antibody according to claim 9, wherein the antibody is for use in diagnosis or treatment of erosive joint disease, and the immobilized IgG is an anti-type II collagen IgG. 【請求項１２】 固定化IgGに関連する病状の治療または診断のための医薬 の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の抗体の使用。12. Use of the antibody according to any one of claims 1 to 11 for the manufacture of a medicament for treating or diagnosing a condition associated with immobilized IgG. 【請求項１３】 固定化IgGに関連する病状が自己免疫疾患である、請求項 １２に記載の使用。13. The use according to claim 12, wherein the condition associated with immobilized IgG is an autoimmune disease. 【請求項１４】 前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、
クローン病、I型インスリン依存性糖尿病、II型糖尿病、サルコイドーシス、ら い性結節性紅斑、および結核より選択される、請求項１３に記載の使用。14. The autoimmune disease may be rheumatoid arthritis, juvenile arthritis,
14. The use according to claim 13, wherein the use is selected from Crohn's disease, type I insulin-dependent diabetes, type II diabetes, sarcoidosis, erythema nodosum and tuberculosis. 【請求項１５】 前記抗体がびらん性関節病の診断または治療において使用
するためのものであり、かつ前記固定化IgGが抗II型コラーゲンIgGである、請求
項１４に記載の使用。15. The use according to claim 14, wherein said antibody is for use in the diagnosis or treatment of erosive joint disease, and said immobilized IgG is an anti-type II collagen IgG. 【請求項１６】 固定化IgGに関連する病状のin vivo診断における使用であ
って、 (a) 標識された前記抗体に患者を曝露すること、および (b) 固定化IgGの存在を検出するための標識を使用すること、 を含む、請求項１２〜１５のいずれか一つに記載の使用。16. Use in in vivo diagnosis of a pathology associated with immobilized IgG, comprising: (a) exposing the patient to a labeled said antibody; and (b) detecting the presence of immobilized IgG. 16. The use according to any one of claims 12 to 15, comprising using a label of 【請求項１７】 前駆体抗体を処理して抗体が固定化IgGに結合できるよう にその炭水化物鎖を露出させることを含む、誘導体化された抗体の製造方法。17. A method for producing a derivatized antibody, comprising treating a precursor antibody to expose its carbohydrate chains so that the antibody can bind to immobilized IgG. 【請求項１８】 前記処理がタンパク質表面上の隙間にある部位から炭水化
物鎖を露出させ、かつ前記誘導体化が前記炭水化物鎖の前記部位への回復を妨げ
る、請求項１７に記載の方法。18. The method of claim 17, wherein the treatment exposes carbohydrate chains from interstitial sites on the protein surface, and wherein the derivatization prevents the carbohydrate chains from returning to the sites. 【請求項１９】 前記前駆体抗体が、N-アセチルグルコサミン残基を末端に
有するFc結合炭水化物鎖を有する、請求項１７または１８に記載の方法。19. The method according to claim 17, wherein the precursor antibody has an Fc-linked carbohydrate chain terminated with an N-acetylglucosamine residue. 【請求項２０】 β-ガラクトシダーゼを用いて、前記前駆体抗体から末端 のガラクトース残基を除去する工程を含む、請求項１７〜１９のいずれか一つに
記載の方法。20. The method according to any one of claims 17 to 19, comprising a step of removing a terminal galactose residue from the precursor antibody using β-galactosidase. 【請求項２１】 前記誘導体化反応が、炭酸塩の存在下で前記抗体をチオー
ル化する工程を含む、請求項１７〜２０のいずれか一つに記載の方法。21. The method according to any one of claims 17 to 20, wherein the derivatization reaction comprises a step of thiolating the antibody in the presence of a carbonate. 【請求項２２】 固定化IgGの部位で互いに結合することができる誘導体化 された抗体を、そのように結合できない誘導体化された抗体から分離する工程を
含む、請求項１７〜２１のいずれか一つに記載の方法。22. The method according to claim 17, further comprising the step of separating derivatized antibodies capable of binding to each other at the site of the immobilized IgG from derivatized antibodies which cannot so bind. The method described in one. 【請求項２３】 誘導体化された抗体を分離する前記の工程が、Con Aクロ マトグラフィーの使用、またはプロテインAアフィニティーカラムからのpH溶出 によるものである、請求項２２に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein said step of separating derivatized antibodies is by use of Con A chromatography or by pH elution from a Protein A affinity column. 【請求項２４】 請求項１〜７のいずれか一つに記載の抗体と、担体とを組
み合わせて含む医薬組成物。24. A pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of claims 1 to 7 in combination with a carrier.