JP2002500512A

JP2002500512A - 天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用

Info

Publication number: JP2002500512A
Application number: JP50004299A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，グレゴリー・ジー
Original assignee: マクギル・ユニヴァーシティ
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2002-01-08
Also published as: US20020100078A1; US6365798B1; EP0983371A1; LT99137A; CA2290883A1; HUP0002501A3; PL337058A1; HUP0002501A2; WO1998054340A1; US6951970B2; CN1265151A; AU7517798A; LT4667B; AU744121B2; CA2290883C

Abstract

(57)【要約】本発明は、天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用に関する。以下の工程：ａ）異常なＣＭＳ関連ミトコンドリア遺伝子を同時トランスフェクトされた正常ミトコンドリア遺伝子の未編集形態の上流およびフレーム中に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物を植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）の遺伝子構築物を獲得した植物細胞を選択し；そしてｃ）選択された植物細胞の再生を誘導することにより成熟植物を生産することからなる細胞質性雄性不稔性植物に雄性稔性を回復する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用発明の背景（ａ）発明の分野本発明は、天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用に関する。（ｂ）従来技術の記載２つまたはそれ以上の異なる株により形成される作物、ハイブリッドは、親株自身よりも高い収量を提供する。例えば、カナダのもっとも重要な作物であるカノラ（canola）(Brassica napus，campestris)において、操作することにより生産されたハイブリッドは親の系よりも50％高いまでの収量になりうる。この現象は、ハイブリッドビガー（hybrid vigor）と呼ばれ、トウモロコシ（Zea mays）においてもっとも成功して適用されてきた。ハイブリッドトウモロコシは北アメリカの作物の約90％を構成する。商業上のスケールでハイブリッドの種子を生産するためには、ハイブリッド作物の原種の自家受粉を妨害する必要がある。これはトウモロコシにおいては相対的に単純な件であるが、なぜならば雄または花粉生産器官（おしべ）は雌あるいは種子生産器官（めしべ）とは植物の異なる位置に存在し、そして雄穂と呼ばれる構造を集約的に形成するおしべが、種子生産オペレーションにおいて用いられる多数の植物から、操作により容易に除去できるからである。対照的に、ほとんどの作物種、例えばカノラにおいては、おしべと心皮が同じ花の構造中に存在し、そして多数の植物の、操作による除雄が不可能である。よって、種子生産者は、それらの作物においてハイブリッドを製造するための別の受粉制御法を必要とする。この目的のために開発された技術の総説は、Arnison P.のＰＢＩ会報の論文に見いだすことができる(Arnison P．et al.，The PBI Bulletin，1997年１月、１-11)。別の方法は、花粉を特異的に殺傷する、生殖体撲滅薬（gametocides）と呼ぶ薬品を使用することである。これらの薬品は一般に高価であり、しばしば部分的に有効でしかない。ほとんどの作物、特に長期間にわたり花が咲くカノラのような作物に関しては、この種の受粉制御は費用の点から有効でない。ほとんど全てのハイブリッド種子生産系は、よって、受粉の遺伝子制御に依存する。遺伝子受粉制御機構は３つのカテゴリー：自己不適合、「分子ハイブリダイゼーション」法、および細胞質性雄性不稔性に入る。自己不適合（ＳＩ）は、いくつかの植物がそれら自身の花粉を拒絶する能力をもたらす。ＳＩを発現する植物はハイブリッド生産において雌系として使用できるが、これらの植物は通常それら自身の花粉を拒絶するから、そのような系を繁殖するかまたは保持することは通常難しく、そしてコスト上有効ではない。さらに、自己不適合は殆どの植物種において見いだされない。分子ハイブリダイゼーション法はもっとも最近に開発された。それらは、花粉形成細胞において毒性蛋白質の特定の発現により引き起こされる遺伝子工学処理された雄性不稔性に依存する。そのような導入された毒性遺伝子は優性の雄性不稔性遺伝子として作用して、ハイブリッド種子生産のための雌系を生成するのに使用することができる。ＳＩのように、そのような雌系の増殖は簡単ではなく、植物材料の損失を含む。これらの方法のこれら不便性は未だ明らかではなく、現在、それらが僅かなハイブリッドバラエティの生産において用いられて、それらは大きく生育しない。細胞質性雄性不稔性（ＣＭＳ）は、普及した古典的な非メンデル形質である。ＣＭＳ植物は自己受粉できず、よって、ＣＭＳ系を雄性稔性系側に植えた場合、不稔性植物上に形成される全ての種子は２つの親のハイブリッドとなる。ほとんどの形質とは違って、ＣＭＳは母系伝達性、即ち、原種を通してのみ子孫に伝えられる。この特性は、ＣＭＳを決定する一つまたは複数の遺伝子がミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）上に存在する事実によりもたらされる；核ＤＮＡに存在するほとんどの遺伝子とは違って、ｍｔＤＮＡ中の遺伝子は殆どの植物種において雌を通してのみ伝達される。母系伝達のこの特性の結果として、その核遺伝子に関してＣＭＳ系と同一であるが、ＣＭＳの原因となるｍｔＤＮＡを欠くために雄性稔性である雄の稔性系「保持因子(maintainer)」系と受粉することにより、容易に雌ＣＭＳ系を繁殖させることができる。しかしながら、その上に、ＣＭＳの母系伝達の結果として、雌ＣＭＳ系を用いて生産したハイブリッド植物は、雄性不稔性を授けるｍｔＤＮＡを有するから、雄性不稔性でもある。これは、収穫された産物である形成種子のために花粉の生産を必要とする種子作物、例えばトウモロコシおよびカノラに関して問題となる。運よく、稔性の回復因子（restor er of fertility）(Ｒｆ)と呼ばれる、多くの作物種特異的優性核遺伝子は、雄性不稔性表現型を抑圧してＦ１ハイブリッドに稔性を「回復する」ことが可能なものとして同定されてきた。ＣＭＳ系の成分は、よって、ＣＭＳ系からなり、雄性不稔性（Ｓ）細胞質（またはｍｔＤＮＡ）を含み、そして回復遺伝子の劣性または保持因子の対立遺伝子に関して同型接合性であるが、保持因子系は、稔性または正常のｍｔＤＮＡ（Ｆ）を有するが核遺伝子座においてＣＭＳ系と同質遺伝子型であり、そして回復因子系は雄性不稔性ｍｔＤＮＡを通常は含むが優性核Ｒｆ遺伝子に関して同型接合性である。ハイブリッド種子生産の計画におけるこれらの成分の使用を図１に示す。ＣＭＳを用いたハイブリッドの逆のセットを生産するためには、Ｒｆ遺伝子を含む十分な数の回復因子系並びにＣＭＳのｍｔＤＮＡにより不稔性化された「保持因子」系を利用可能とせねばならない。慣用の遺伝学を通したこれらの系の開発は、数年の努力を最低必要とする遅いプロセスである。例えば、新しい回復因子系を開発するためには、最初に、存在する回復因子系とレシピエント系を交配させ、Ｒｆ対立遺伝子を導入することが必要である。レシピエント系の遺伝子型を回復するために、次に、一連の戻し交雑が必要である。多世代の戻し交雑後でさえ、Ｒｆ遺伝子に連鎖したいくつかのドナーＤＮＡが残ったままとなり、この現象を連鎖ドラッグと呼ぶ；このドナーＤＮＡは有害な形質を含むかもしれず、レシピエント株の質を危険にさらす。２つのＣＭＳ系が、ハイブリッドカノラ種子の生産においていくつかの限定された用途を有することが証明される。ポリマ（Polima）またはｐｏｌ細胞形質は、多くのカノラ品種に雄性不稔性を授けることができ、そして単一の核回復系の座において優性対立遺伝子を有する有効な回復因予系が同定された。この系を用いる、ハイブリッド生産のコストにおける有効性は、特に雌系が暖かい生育培地に暴露される場合に、ｐｏｌ誘導雄性不稔性が不完全または「漏出性」になる傾向があるとの事実により制限される。結果として、ｐｏｌハイブリッド種子は雌系の自己受粉によりもたらされるＣＭＳ種子により汚染するかもしれない。これらのＣＭＳ植物が雄性不稔性であって自発的に種子を発育させないので、それらの存在は「ハイブリッド」混合物の全収量を顕著に低下させうる。第２のＣＭＳ系は、雄性不稔性決定因子がオグラ（Ogura）またはｏｇｕと呼ばれるダイコンの細胞形質に由来する、ハイブリッド細胞質の使用に基づく。ｏｇｕ細胞形質により授けられた雄性不稔性は完全である。単一のダイコン回復遺伝子（本明細書ではＲｆｏと命名する）をBrassica napusに遺伝子移入することにより開発された、この系のための回復遺伝子系は最近利用可能になったが、回復遺伝子系の開発は回復遺伝子と種子の質に対する負の作用を有する遺伝子の間の「連鎖ドラッグ」により妨害される。天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用を提供することは強く望まれている。発明の概要本発明の目的は、天然に生じる雄性不稔性の増強および雄性不稔性の回復のための方法並びにハイブリッド作物の生産におけるその使用を提供することである。本発明によれば、植物の天然に生じる雄性不稔性の増強方法が提供され、以下の工程：ａ）Brassica napusミトコンドリアのａｔｐ６遺伝子およびｏｒｆ２２４遺伝子の未編集形態の少なくとも一つの上流およびフレーム中に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物を植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）の遺伝子構築物を獲得した植物細胞を選択し；そしてｃ）選択された植物細胞の再生を誘導することにより成熟植物を生産することからなる。本発明によれば、細胞質性雄性不稔性植物に雄性稔性を回復する方法も提供され、以下の工程：ａ）異常なＣＭＳ関連ミトコンドリア遺伝子を同時トランスフェクトされた正常ミトコンドリア遺伝子の未編集形態の上流およびフレーム中に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物を植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）の遺伝子構築物を獲得した植物細胞を選択し；そしてｃ）選択された植物細胞の再生を誘導することにより成熟植物を生産することからなる。好ましい植物は、Brassica napusである。好ましくは、工程ｂ）は植物形質転換ベクター、例えばｐＲＤ４００を用いて作用させる。本発明によれば、ポリマの細胞質性雄性不稔性のB．napusに雄性稔性を回復させる方法も提供され、以下の工程：ａ）B．napusミトコンドリアのａｔｐ６遺伝子の未編集形態の上流およびフレーム中に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物をB．napus植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）の遺伝子構築物を獲得した植物細胞を選択し；そしてｃ）選択された植物細胞の再生を誘導することにより成熟植物を生産することからなる。我々の結果は、ハイブリッドカノラおよび他のアブラナ属（Brassica）作物の生産のためのｐｏｌＣＭＳの実用的道具に関する含蓄を有する。ミトコンドリアに対してBrassica ａｔｐ６遺伝子の編集形態の生成物の標的化を可能にする遺伝子構築物の、ｐｏｌＣＭＳ植物への導入は、雄の稔性が回復した植物が回収されうる新規な型のプロセスを代表する；これは植物形質転換を通して単一の工程において新規なｐｏｌＣＭＳ回復因子系の生産を可能にするべきである。これは、現在これらの系を生じさせることが可能な唯一の方法である、そのような系を生じさせるための慣用の植物育種法を超える、時間および費用の点での顕著な軽減を示すはずである。さらに、増強した雄性不稔性を有する植物を生産するための、ミトコンドリアへのａｔｐ６遺伝子またはｏｒｆ２２４遺伝子の未編集形態の生成物の標的化を可能にする構築物の導入は、雄性不稔性の増強された維持を伴う新規なｐｏｌＣＭＳ系が潜在的に生産可能なプロセスを代表する；上記のとおり、ｐｏｌの雄性不稔の漏出性（leakiness）はハイブリッドカノラ生産におけるそのより広範囲な使用に対する主要な障害であり、そしてこれに立ち向かう有効な手段はない。これらのプロセスが変更物の生産のためのより一般的な戦略の例を代表し、他のＣＭＳ系中および他の植物種と共にＣＭＳを保持または回復させることも可能である。図面の簡単な説明図＋１は、ハイブリッド種子生産における細胞質性雄性不稔性（ＣＭＳ）の使用を例示し；図２Ａ−２Ｊは、稔性、ｐｏｌＣＭＳおよびトランスジェニックB．napus cv ．ウエスター植物の花を例示し；図２Ａは、ｐｏｌＣＭＳウエスター（左）およびｍａｓ２'／Ａ９−Ａ６ｅ構築物で形質転換されたｐｏｌＣＭＳウエスターを例示し(トランスジェニック植物における大きさの増加に注目されたい)；図２Ｂは、ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｕをウエスター（ｎａｐ）(左)および雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）に導入することにより得られた一部雄性不稔性のトランスジェニック植物の花全体を示し(トランスジェニックの花の花弁の色素沈着の低下に注目されたい)；図２Ｃは、花弁およびがく片を除いた、ｐｏｌＣＭＳウエスター（左）およびｍａｓ２'／Ａ９−Ａ６ｅ構築物で形質転換されたｐｏｌＣＭＳウエスターの花を示し；トランスジェニック植物中のおしべの大きさの増加とより高度に発達したやくに注目されたい；図２Ｄは、花弁およびがく片を除いた、ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｕをウエスター（ｎａｐ）(左)および雄稔性ウエスター（ｎａｐ）に導入することにより得られた一部雄性不稔性のトランスジェニック植物の花を示し(トランスジェニック植物のやくの大きさの低下に注目されたい)；図２Ｅは、ＡＰ３／Ａ９−ＯＲＦ構築物を雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）に導入することにより得られたｐｏｌＣＭＳウエスター、雄性不稔性のトランスジェニック植物４０−８、および雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）の（左から右）花全体を示し；図２Ｆは、花弁とがく片を除去されたトランスジェニック植物４０−８の花を示し；４つの内部のおしべが心皮中に形質転換されたことに注目されたい；図２Ｇは、ＡＰ３／Ｃ４−ＯＲＦ構築物を雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）に導入することにより得られた一部稔性トランスジェニック種子４０−１０の花全体を示し(左)；レシピエント株のウエスター（ｎａｐ）の花を右側に示す(トランスジェニック植物の花弁の大きさの低下に注目されたい)；図２Ｈは、トランスジェニック植物４０−１０および雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）から花弁とがく片が除去された花を示し；図２１は、ｐｏｌＣＭＳウエスター（左）およびＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｅ構築物をｐｏｌＣＭＳウエスターに導入することにより得られた一部稔性トランスジェニック植物の花を示し(トランスジェニック植物における花弁の大きさの増加に注目されたい)；図２Ｊは、花弁およびがく片を除去された、ｐｏｌＣＭＳウエスター（左）およびＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｅ構築物をｐｏｌＣＭＳウエスターに導入することにより得られた一部稔性トランスジェニック植物の花を示し(トランスジェニック植物におけるおしべとやくの大きさの増加に注目されたい)；図３Ａ−３Ｄは、ｐｏｌＣＭＳウエスターにおけるＡ９−Ａ６ｅのｍａｓ２ ’−推進発現を伴う表現型の変化を例示し；Ａ：トランスジェニック植物の花序；Ｂ：ｐｏｌＣＭＳウエスターの花序；Ｃ：完全トランスジェニック植物；Ｄ：ｐｏｌＣＭＳウエスター植物(トランスジェニック植物における花序および休止期の節間（vegetative internodes）の大きさの増加に注目されたい)；図４は、ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｅ構築物のB．napusにおける優性の稔性回復遺伝子としての使用を例示し；そして図５は、B．napusにおいてｐｏｌ細胞質性雄性不稔性を増強するためのＡＰ３／Ｃ４−ＯＲＦの使用を例示する。発明の詳細な説明この発明は、遺伝子工学を通した保持因子および回復因子系の開発法を提供する。本発明は、特に、カノラ（Brassica napus，campestris）のｐｏｌＣＭＳ系に関する。しかしながら、原則として、該方法は、カノラの他のＣＭＳ系および多数の他の作物のＣＭＳ系に関して、そのような系の花粉生産能力を修飾するために使用することができる。この発明は、私の実験室において1987年から1993年の間に実施されてきたカノラ（Brassica napus，L.）中の細胞質性雄性不稔性（ＣＭＳ）の分子上の基礎における研究に基づく。アブラナ属（Brassica）のミトコンドリアゲノムの編成および発現の分析は、B．napusのＣＭＳのポリマまたはｐｏｌ形態が、正常なミトコンドリア遺伝子ａｔｐ６を同時トランスフェクトしたキメラ遺伝子ｏｒｆ２２４を含むミトコンドリア遺伝子領域の発現に相関することを示した(Singh，M．P ．and Brown，G．G．(1991)．The Plant Cell 3，1349-1362；Bonen，L．and Br own，G．G．(1993)．Can．J．Bot．71，645-660)。我々は、ｐｏｌＣＭＳが、（ｉ）ミトコンドリア膜内のＯＲＦ２２４蛋白質の存在、または（ii）ａｔｐ６翻訳におけるｏｒｆ２２４の干渉により引き起こされるかもしれないＡＴＰ６蛋白質中の可能性のある欠損の何れかによりもたらされるミトコンドリアの機能不全によることを仮定した。ミトコンドリアの蛋白質は２つの遺伝上の起源を有し：これらの蛋白質のいくつか、ＣＭＳを特定するものを含むおそらく１０％程度がｍｔＤＮＡによりコードされ；その他は核ＤＮＡによりコードされる。ｍｔＤＮＡ中にコードされる蛋白質はミトコンドリア中に残る。核によりコードされるミトコンドリア蛋白質は通過ペプチドあるいはプレ配列と呼ばれるＮ末端における追加の延長アミノ酸を通常は含む前駆体として合成される。この通過ペプチドはミトコンドリアへ蛋白質を導くために機能する；蛋白質がミトコンドリア内部に入れば、それはプロテアーゼにより除去される。ｍｔＤＮＡ中に通常はコードされる蛋白質のＤＮＡ配列を導くために通過ペプチドのＤＮＡ配列に融合し、そしてその結果の構築物を核中に導入して発現させると、その結果の前駆体蛋白質がミトコンドリアに輸送されて、最終産物がミトコンドリアで作成された形態と同じ様式で機能できる。我々は、仮定（ｉ）が正しければ、我々は、核によりコードされて細胞質で翻訳されたＯＲＦ２２４がミトコンドリアを標的化することを可能にするＤＮＡ構築物を発現させることにより、雄性稔性植物上に雄性不稔を授けることができるかもしれないと推論した。同様に、我々は、仮定（ii）が正しければ、我々は、ＡＴＰ６蛋白質の核によりコードされて細胞質で翻訳された形態がミトコンドリアを標的化させうるはずであるＤＮＡ構築物を発現させることにより、雄性稔性をｐｏｌＣＭＳ植物に回復させることができるかもしれないと推論した。上記構築物が雄の稔性／不稔性を変えたなら、ｏｒｆ２２４トランス遺伝子は雄性不稔性の合成された保持因子とみなすことができ、一方、ａｔｐ６トランス遺伝子は雄性稔性の合成された回復因子とみなすことができた。これらの仮定に対するさらなる複雑性は、ｏｒｆ２２４およびａｔｐ６転写物の両者がほとんどの植物のミトコンドリア転写物のように編集されるとの観察に由来した(Stahl R．et a l．（1994）Nucleic Acids Res 22，2109-2113)。植物のミトコンドリア転写物の編集は、コードされた蛋白質のアミノ酸配列を変更する、ｍＲＮＡ分子中の特定のＣ残基からＵ残基への変換を含む(編集されたｍＲＮＡは該蛋白質の機能性形態をコードする)。ａｔｐ６およびｏｒｆ２２４転写物の両者が単一の部位において編集され、各場合に、アミノ酸配列の単一の変化をもたらす。未編集のコムギＡＴＰ９蛋白質のミトコンドリアへの標的化を可能にしたＤＮＡ構築物の核内における発現がトランスフェクトタバコ植物上に雄性不稔を授けた（Hernould ，M．et al．(1993)．Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90，2370-2374）ので、未編集のアブラナ属（Brassica）のＡＴＰ６蛋白質の発現／標的化も雄性不稔性を引き起こして合成による保持遺伝子として機能できる可能性があるらしかった。この種の合成回復因子は原則として遺伝子形質転換により新規な回復因子系を創製できる。これは、これらの系が現在開発された長期間のコスト要求性の植物育種の課題を回避するはずである。合成保持遺伝子の利用可能性は、ｐｏｌの不稔性を完全に保持することができる植物形質転換を通して系の生成を可能にするかもしれない。そのような系は現在存在せず、そしてこの技術は、従って、ｐｏｌに基づくカノラハイブリッドにより増強を生じさせるための最終バリアーを有効に取り除くはずである。最終的には、類似の戦略を用いることにより合成回復因子および保持因子系をカノラ以外の作物のために生成して、よってＣＭＳの遺伝子工学による品質管理および回復のグローバルな戦略が開発できることが可能であり、有望でさえある。ＡＴＰ６およびＯＲＦ２２４蛋白質の核コードミトコンドリア標的化形態がそれぞれ合成による回復遺伝子および保持遺伝子として機能できる証拠これらの可能性に立ち向かうために、我々は、編集された（Ａ６ｅ）および未編集の（Ａ６ｕ）形態のａｔｐ６コーディング配列に相当するＤＮＡを２つのミトコンドリア標的化ブレ配列、酵母ＣＯＸ４（Ｃ４）またはニューロスポラＡＴＰ９（Ａ９）の何れかをコードするＤＮＡに融台させた。同じブレ配列を未編集形態のｏｒｆ２２４（ＯＲＦｕ）に融合させることにより、同様な構築物を調製した。これらの配列を、それらの５’末端においてｍａｓ２’プロモーターに連結し(van der Leegt-Plegt，L．M．et al．(1992)．Plant Cell Reports 11，20 -24)、そして３’末端においてカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡのポリアデニル化シグナルに連結した。結果として得た構築物をアグロバクテリウム媒介形質転換によりB．napusの子葉へ導入した(Moloney，M．et al．(1989)． Plant Cell Rep．8，238-242)。我々は、該ＯＲＦｕ構築物が導入された植物を再生することができなかった。Ａ９／Ａ６ｕ構築物を稔性のB．napus cvウエスターに導入した後に我々が回収したトランスジェニック植物３つは一部雄性不稔性であったが、しかしながら、Ａ９／Ａ６ｅ構築物を不稔性ｐｏｌＣＭＳのB． napusに導入後に我々が回収した単一の植物は一部雄稔性であった。これは、未編集形態のａｔｐ６を発現する構築物が不稔性誘導、または保持遺伝子として作用し、一方編集された形態がｐｏｌ稔性回復因子として作用したことを示唆した。不幸なことに、我々は何れかの構築物を発現する植物の何れかから種子を回収できなかったし、そのため、稔性／不稔性における変化が次の植物世代に遺伝上受け継がれ得たことを示すこと、あるいは表現型がトランス遺伝子発現によりもたらされたことを確証できなかった。 Arabidopsis thalianaのＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）遺伝子由来の発生学上制御されたプロモーター（Jack，T．et al．（1994）Cell 76，703-716）を用いてａｔｐ６およびｏｒｆ２２４構築物の発現を推進する構築物のアッセンブリーに、より最近の研究は集中した。Ａｐ３が組織特異性プロモーターとして選択されたが、なぜならば、それがおしべ（並びに花弁）の極めて初期に発現されるからである。以前のデータは、ｐｏｌＣＭＳに関連した花粉の発生における妨害が減数***前であり、よって、花粉発生の初期に生じることを示した；我々は、よって、ｐｏｌＣＭＳを埋合せるかまたは模倣するためには、花粉の発生の初期において上記構築物を発現させる必要があるはずであると感じた。完成したかまたは現在アッセンブルされつつある次の構築物は、「構成的」ｍａｓ２’プロモーターを、発現に用いるものを含む。全ての構築物を二元性形質転換ベクターｐＲＤ４００に挿入して、アブラナ属（Brassica）における効率よい形質転換のために最適化し、そして子葉形質転換手法を通して植物に導入した。我々がアッセンブルした構築物の要約、および我々が回収したトランスジェニック植物の表現型を以下の表１に示す。表１遺伝子構築物およびトランスジェニック植物の対応する表現型 ¹構築物要素を順に提示する：プロモーター／プレ配列−コーディング配列；AP3 ， Aranidopsis ARETELA3プロモータ一；C4、酵母COX4プレ配列；A9、ニューロスポラATP9プレ配列；ORF，編集されたorf224コーディング配列；A6e、編集されたat p6コーディング配列；A6u、未編集のatp6コーディング配列。² NPTII遺伝子由来のプローブを用いてサザンブロット分析により確証された。³ A9プレ配列に融合されたエピトープタグ付加編集atp6コーディング配列。⁴ 編集されたatp6コーディング配列。非標的プレ配列。表２のデータは、トランスジェニック植物における雄の不稔性または稔性の変化を様々な構築物が誘導した頻度を示す。雄稔性／不稔性およびトランスジェニック植物中の花構造において観察されたいくつかの変化を図２に示す。図２Ａの左側および図２Ｂの右側に示した花は、それぞれ、ｐｏｌＣＭＳウエスターおよび稔性ウエスター（ｎａｐ）植物由来である。これら各々の下の図（それぞれ、２Ｃおよび２Ｄ）は、花弁とがく片を除去された同じ植物由来の花である。これらの図面から明らかなとおり、ｐｏｌＣＭＳ植物のおしべと花弁はウエスター（ｎａｐ）の花のそれらよりも顕著に小さい。我々が用いた制御された成長条件下では（２０°、１６時間日中、１５°８時間夜）、若いｐｏｌＣＭＳ植物上に形成したおしべはめしべの高さより顕著に低く、完全に形成されたやくを発生せず、そしてほんの僅かな量の花粉を落とした。表２修飾された雄稔性／不稔性を有するトランスジェニック植物の数 ¹ウエスター(nap)と識別不可能² ウエスター(nap)に比して低下した花弁放出；自家受粉時に得た完全種子莢³ 最少花粉放出；自家受粉時の乏しい種子セット⁴ 自家受粉時に得た僅かかまたは無い種子；いくつかのmas2'/A9-A6e植物は顕著な花粉を生成したが種子を付けず、よって雌および雄の不稔性であるらしい。表１および２に示すとおり、我々が収穫した約半分のトランスジェニック植物において、何れかの標的化配列に融合した、編集されたｏｒｆ２２４コーディング配列のＡＰ３−推進発現が、雄稔性を低下でき、そしてウエスター（ｎａｐ）植物において花の形態の変化を誘導できることを証明した。新たに開花した花のやくの上に観察される花粉の量により評価されたとおり、不稔性の程度並びに他の花の異常性の性質は、異なるトランスジェニック植物間でいくらか変化し、そして場合によって、個々の植物の異なる花序のブランチ間ではより小さい程度で変化した。授けられた表現型または雄の不稔性が誘導された頻度の何れかにおいて、ＣＯＸ４（Ｃ４）とＡＴＰ９（Ａ９）プレ配列構築物間で明らかな違いはなかった。得られた表現型のいくつかの示唆は図２Ｅ−Ｈにおいて見ることができ、花粉生産における変化が観察されたトランスジェニック植物の花を示す。これらの植物において、花弁とおしべの大きさ並びに生産された花粉の量はウエスター（ｎａｐ）に比して低下したが、ｐｏｌＣＭＳ植物において低下した程度ほどではなかった。もっとも極端な表現型はトランスジェニック植物４０−８、Ａ９−ＯＲＦ形質転換体にて観察された(図２Ｅおよび２Ｆ)；これらの花においては、４つの内部のおしべが心皮様構造に変換された；２つの外部のおしべ上に形成されたやくは淡黄色のままであり、ほんの極めて少量の花粉を落とした。我々は、個々の植物がそれらの雄／雌性稔性の事実上の測定として自家受精に際して種子を付ける能力を評価した。植物を自家受粉するために、我々は花序にわたってクロッシングバッグを通常はかぶせて、受粉を促進するようにそれを緩やかに軽くたたく。通常の雄性稔性植物の場合、バッグ内の全ての種子莢が完全に満たされることになる；これらの条件下ではｐｏｌＣＭＳ植物は全くかあるいはほとんど種子を生産しない。我々がこの様式においてＡＰ３／Ａ９−ＯＲＦまたはＡＰ３／Ｃ４−ＯＲＦを発現するトランスジェニック植物を自家受粉しようと試みたとき、我々は、一つのケースにおいて種子が得られず(トランスジェニック植物４０−８、図２)、そして他のいくつかのケースにおいてはほんの僅かな種子しか得られなかった。種子付けにおいて顕著な低下を示したがいくつかの花粉を生産する能力を保持したそれらの植物は、「半不稔性(semi-sterile)」と命名した。２２の確認されたトランスジェニックＯＲＦ植物のうち全部で３つが、この試験により半不稔性であった。ＡＴＰ９プレ配列に融合したａｔｐ６遺伝子（Ａ６ｕ）の未編集形態の発現は、ＡＰ３プロモーターにより推進された場合にも、ウエスター（ｎａｐ）植物の稔性を低下させることが証明された(表１)。この構築物を発現する回収されたトランスジェニック植物の半数弱が、雄性稔性の低下を示した(表２)。通常は、しかしながら、種子を付ける能力による雄性不稔性の低下はＯＲＦ構築物よりもっと著しかった；表現型を示した全てのトランスジェニック植物は半不稔性であると分類された。低下した稔性を示した植物のほとんども小さい淡黄色の花弁を所有した。ＡＰ３／Ａ９−６ｕ植物の一つにより示された半不稔性表現型を図２ＢおよびＤに示す。我々は、この種の構築物、並びに上記ＯＲＦ構築物および第３の種類のＡＰ３／Ａ９−Ａ６構築物、ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｅｐが、ＡＴＰ６コーディング配列を小さなペプチドをコードする配列により遮断することにおいて、ｐｏｌＣＭＳ植物の不稔性を増強できることも見いだした。ｐｏｌＣＭＳ植物は通常少量の花粉を生産する；ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｕを発現するｐｏｌＣＭＳ植物は花粉を落とさない。図２１およびＪに示すとおり、ｐｏｌＣＭＳ植物中の編集されたａｔｐ６構築物のＡＰ３−推進発現は、それが合成回復遺伝子として作用するとの予言に一致して表現型の変化を引き起こした。これらのトランスジェニック植物上の花は、ｐｏｌＣＭＳと稔性ウエスター（ｎａｐ）植物の間の大きさの、花弁とおしべを有した。これらの花のやくは顕著な量の花粉を生産する小さな淡黄色のやくを生産したが、雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）植物ほどではなかった(表１)。全てのトランスジェニック植物は変化した表現型を示したが(表２)、生産される花粉の量は植物によりわずかに異なった。これらの植物は全て花序の袋掛けに際して種子を生産することができ；２つの植物がほんの僅かな量の種子を生産し、一方５つの残りの植物は袋掛けあるいは他の介入なしに充満した莢を生産した。これらの後者の５つの植物は、よって、用語の完全な機能上の意味において、稔性が回復したと言うことができる。我々は、「構成的」プロモーターｍａｓ２'を用いて発現させた場合にｐｏｌＣＭＳ植物中で雄性稔性を誘導する、Ａ９−Ａ６ｅ構築物の能力も評価した。我々が収穫した６つのトランスジェニック植物は、ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｅ植物により生産されるのと事実上同一の花を所有した(図１Ａおよび１Ｃ)。残りの植物は、少量しか、あるいは事実上全く花粉を生産しなかった。ただ一つの花粉生産植物が、操作による受粉無しに顕著な数の種子を形成できたことから、ｍａｓ２'／Ａ９−Ａ６ｅ植物の雌性稔性が通常は低下することが示唆される。これは、我々が種子を落とすことができない稔性の花を有する植物を収穫した際の、この種の構築物の以前の結果と一致する。我々が収穫した植物の第２の特徴も、我々の予備の結果；ｍａｓ２'プロモーターからＡ９−Ａ６ｅを発現する全ての植物が休止期の成長における変化を示したことと一致する。特に、休止期および花序節間の両方がウエスター（ｎａｐ）またはｐｏｌＣＭＳウエスター植物のそれらよりも長かった(図３)；いくつかのトランスジェニック植物においては葉の形態も影響された。同様な変化は、ＡＰ３プロモーターを発現のために用いたどの植物においても観察されなかった。即ち、雌性稔性およびたの異常性の両方は、ｍａｓ２'プロモーターからの融合蛋白質の一般化発現によりもたらされる。複数の個別の形質転換植物における同種の不稔性修飾の観察は、我々の初期の仮説の極めて強い支持を提供する、即ち：（ｉ）ＯＲＦ２２４または未編集ＡＴＰ６のポリペプチドのミトコンドリアに対する標的化を可能にする構築物が雄性稔性植物に不稔性を授け、よって、合成保持者遺伝子として作用できるとの仮説；および（ii）編集されたＡＴＰ６ポリペプチドのミトコンドリアに対する標的化を可能にする構築物が合成回復遺伝子として作用できるとの仮説である。データは、休止期成長および雌稔性に対する有害作用を避けることも示唆し、組織特異性または誘導可能プロモーターを用いてこれらの構築物を発現することが必要である。ＲＯ植物（形質転換−再生プロトコルにより回収された植物）Ｃ４−ＯＲＦ発現植物４０−８（上記）のＲ１子孫の分析は、観察された表現型が遺伝性でありそしてトランス遺伝子によるとの強制的な証拠を提供した。我々は、これら植物２０を成熟にさせた。ある範囲の花の表現型が明らかであり、たった２つの極めて不稔性のやくが形成された残りの４つのやくがめしべ様器官に変換される、親植物の究極の異常性から、この構築物を発現するＲＯ植物の多くにおいて観察された一部雄性稔性にわたる。全部のＲ１子孫植物がトランス遺伝子を含んだことから、オリジナルの４０−８ＲＯ植物が１コピーより多い遺伝子を有するかもしれないことが示唆される。これは、さらに、発現された稔性の程度が遺伝子投薬量に依存することを示すはずである。この遺伝子投薬量効果は、トランスジェニック植物により発現された不稔性の程度を修飾する追加の手段を提供する。要約すると、我々の実験は、雄不稔性が同一の宿主植物におけるミトコンドリアＯＲＦ産物（ｏｒｆ２２４および未編集のａｔｐ６）の標的化を通して誘導された最初のケース、そしてアブラナ属（Brassica）の遺伝子がこの目的のために使用された最初であることを示す。我々の結果は、Ａ９−Ａ６ｅ構築物のＡＰ３推進発現がｐｏｌＣＭＳの稔性回復遺伝子として作用できることも強く示唆する。これは、我々が、ＣＭＳの天然形態が合成遺伝子構築物により抑圧されることに気づく最初のケースである。我々の結果は、インゲンマメ（bean）ＣＭＳ関連ORF(He，S．et al．(1996)． Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．93，11763-11768）または未編集のコムギＡＴＰ９遺伝子（Hernould，M．et al．(1993)．Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90 ，2370-2374）の蛋白質産物の発現／標的化が、異種レシピエント植物、タバコにおいて雄不稔性を誘導できることを発見した、他の研究者により実施された実験と一致する。おもしろいことに、トウモロコシおよびピチュニア（petunia）からのＣＭＳ関連ＯＲＦを用いた同種の実験は、雄性不稔性植物の収穫に失敗した(Chaumont，F．et al．(1995)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92，1167-1171 ；Wintz H．et al．(1995)．Plant Mol Biol 28，83-92)。我々が回収した頻度はインゲンマメＯＲＦに関して観察されたよりも高く、そして未編集コムギＡＴＰ９遺伝子を用いて結果を比較するのは難しかった。本発明は、本発明の範囲を制限するよりは本発明を例示する以下の実施例を参照することによりより容易に理解されることになる。実施例Ｉ B．napusにおける優性稔性回復遺伝子としてのAP3/A9-A6e構築物の使用図４において概説されたこの実施例においては、Ａ９／Ａ６ｅ構築物を、（ｐｏｌ）細胞質により正常に不稔化されたウエスター等の様々なゲノムへの遺伝子形質転換により導入した。該遺伝子はｐｏｌ細胞質系に導入されるはずであり、そして収穫されるその結果のトランスジェニック植物は一部雄性稔性となることが期待される。この系は、次に、自家受粉することにより、Ａ９／Ａ６ｅトランス遺伝子に関して同型接合である一部雄性稔性回復遺伝子系を生成する。この系は、次に、別のｐｏｌＣＭＳ系と交雑することにより、稔性回復Ｆ１ハイブリッドを生成することができた。実施例II B．napus中でpol細胞質性雄性不稔性を増強するためのAP3/C4-ORF構築物の使用ほとんどのB．napus遺伝子型上のｐｏｌ細胞形質により誘導された不稔性は、特に高温において不完全である。この残余の花粉生産は、ハイブリッド種子生産の実施においてＣＭＳ系における自家受粉の可変の程度をもたらす。これらの種子からの植物はハイブリッドではなく、種子を付けることに関しては低下した能力をそれら自身が有することになる。これらの因子は共に、顕著な範囲で、「ハイブリッド」種子バッチの収量を減じることができる。図５に概説されたこの実施例においては、Ｃ４−ＯＲＦの優性不稔性授与特性を用いることにより、ＣＭＳ系において残余の花粉生産を低下させるかまたは排除し、そしてそれにより、回収されるハイブリッド種子のパーセンテージを、そしてひいてはハイブリッド種子のバッチの収量を増強する。Ｃ４−ＯＲＦ構築物は、完全雄性稔性ウエスター（ｎａｐ）系への遺伝子形質転換により導入されて、Ｃ４−ＯＲＦトランス遺伝子を含む一部雄性稔性系を生じさせる。この系を、次に、自家受粉することにより、一部雄性稔性保持因子系を生じさせ、そして同じ核遺伝子型であるがｐｏｌ細胞質を有する非形質転換系と交雑することにより、Ｃ４−ＯＲＦに関して同型接台である完全な不稔性ｐｏｌＣＭＳ系を生じさせる。これをＣ４−ＯＲＦ―部雄稔性保持因子系に戻し交配することにより、Ｃ４− ＯＲＦに関して同型接合の完全雄不稔性ｐｏｌＣＭＳ系を生じさせる。このＣＭＳ系を、ｐｏｌ回復系と交雑させた場合、稔性Ｆ１ハイブリッドを生じることになる。完全に不稔性のｐｏｌＣＭＳ系は、それを雌として、ｎａｐ細胞質性一部雄性稔性トランスジェニックＣ４−ＯＲＦ保持因子系を交配することにより増やす。我々はＡＰ３／Ｃ４−ＯＲＦ構築物を用いてｐｏｌＣＭＳの不稔性を増強する方法を記載してきたが、ＡＰ３／Ａ９−Ａ６ａおよびＡＰ３／Ａ９−Ａ６ｅｐ構築物もこの目的に使用でき、これら全ての構築物の発現は完全に雄性不稔性のｐｏｌＣＭＳトランスジェニック植物をもたらす。本発明は本発明の特定の態様に関連して記載されたが、さらなる修飾が可能であり、そして本出願は、本発明の原理に従うあらゆる変更、使用または適合を包含することを意図し、本開示からのそのような逸脱を包含し、本発明の属する技術分野内の公知または通常の実施の範囲内と解釈しそして上記何れかの本質的な特徴に適合してよく、そして請求の範囲の範囲に従うものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程：ａ）Brassica napusのミトコンドリアのａｔｐ６遺伝子およびｏｒｆ２２４遺伝子の未編集形態少なくとも一つの上流およびフレーム内に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物を、植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）において遺伝子構築物を獲得した植物細胞に関して選択し；そしてｃ）選択された植物の再生を誘導することにより、成熟植物を生じさせることからなる、植物において、天然に生じた細胞質雄性不稔性を増強するための方法。２．植物がBrassica napusである、請求項１記載の方法。３．植物形質転換ベクターを用いて工程ｂ）を作用させる、請求項１記載の方法。４．以下の工程：ａ）異常なＣＭＳ関連ミトコンドリア遺伝子を同時トランスフェクトされた正常ミトコンドリア遺伝子の未編集形態の上流およびフレーム中に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物を植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）の遺伝子構築物を獲得した植物細胞を選択し；そしてｃ）選択された植物細胞の再生を誘導することにより成熟植物を生産することからなる細胞質性雄性不稔性植物に雄性稔性を回復する方法。５．植物がBrassica napusである、請求項４記載の方法。６．植物形質転換ベクターを用いて工程ｂ）を作用させる、請求項４記載の方法。７．以下の工程：ａ）B．napusミトコンドリアのａｔｐ６遺伝子の未編集形態の上流およびフレーム中に融合したミトコンドリア通過ペプチドをコードする配列から本質的になる遺伝子構築物をB．napus植物細胞の核に導入し；ｂ）工程ａ）の遺伝子構築物を獲得した植物細胞を選択し；そしてｃ）選択された植物細胞の再生を誘導することにより成熟植物を生産することからなるポリマの細胞質性雄性不稔性のB．napusに雄性稔性を回復させる方法。