JP2002372489A - Particle-measuring method and apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、粒子の性状を測定
する粒子測定方法及びその装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and an apparatus for measuring the properties of particles.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来より、化学的操作の１つとして、液
中に粒子を分散させる処理があり、食品、薬剤の製造な
どの各種分野において利用されている。2. Description of the Related Art Heretofore, as one of chemical operations, there has been a treatment of dispersing particles in a liquid, which has been used in various fields such as production of food and medicine.
【０００３】このような処理において、粒子径など粒子
の性状を調べることは非常に重要であり、液体中に分散
している液体・固体粒子のサイズを測定する方法として
各種の方法が知られている。例えば、粒子の光散乱を利
用した動的光散乱法、電極間を通過する粒子を計数する
コールターカウンタ（測定可能な粒子径は数μｍ程
度）、超音波の緩和を利用したアコーストサイザー（測
定可能な粒子径は数μｍ程度）等がある。In such a treatment, it is very important to examine the properties of the particles such as the particle diameter, and various methods are known as methods for measuring the size of liquid / solid particles dispersed in a liquid. I have. For example, a dynamic light scattering method using light scattering of particles, a Coulter counter for counting particles passing between electrodes (measurable particle diameter is about several μm), an acoustic sizer using relaxation of ultrasonic waves (measurement Possible particle diameter is about several μm).
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】この中で、最も汎用的
に用いられているのが動的光散乱法である。しかし、動
的光散乱法は、分散粒子の種類、粒子径、濃度、分散溶
液の色が限定されるなど制約が多い。また、動的光散乱
法は、散乱体をすべて剛体球と見なして粒子径を見積も
っている。従って、界面活性剤ミセルや液体微粒子のよ
うな強固な界面を持たない粒子には適さない。また、粒
子径の測定下限は直径約５ｎｍであるとされているが、
この程度の粒子径をもつ界面活性剤ミセルや液体微粒子
の測定はきわめて困難である。Among them, the most widely used is the dynamic light scattering method. However, the dynamic light scattering method has many restrictions, such as limitations on the type of dispersed particles, particle size, concentration, and color of the dispersion solution. In the dynamic light scattering method, all the scatterers are regarded as hard spheres and the particle diameter is estimated. Therefore, it is not suitable for particles having no strong interface, such as surfactant micelles and liquid fine particles. Although the lower limit of the measurement of the particle diameter is said to be about 5 nm in diameter,
It is extremely difficult to measure surfactant micelles and liquid fine particles having such a particle size.
【０００５】本発明は、上記課題に鑑みなされたもので
あり、微細な界面活性剤ミセルや液体微粒子等の性状を
確実に測定することができる粒子測定方法及びその装置
を提供することを目的とする。The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a particle measuring method and apparatus capable of reliably measuring the properties of fine surfactant micelles and liquid fine particles. I do.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明に係る粒子測定方
法は、測定対象の粒子に溶解可能かつ励起光により励起
可能な物質を溶解させる工程と、前記物質を溶解した粒
子に励起光を照射し励起強度を測定する工程と、測定さ
れた励起強度から測定対象の粒子の性状を求める工程
と、を含むことを特徴とする。According to the present invention, there is provided a particle measuring method comprising the steps of: dissolving a substance dissolvable in particles to be measured and excitable by excitation light; and irradiating the particles in which the substance is dissolved with excitation light. And measuring the excitation intensity, and determining the properties of the particles to be measured from the measured excitation intensity.
【０００７】このように、粒子内に溶解した物質の励起
強度を測定するため、液滴などに溶解された色素の量を
容易に測定できる。物質の濃度が一定であれば、粒子径
を測定することが可能になる。また、励起光の照射領域
を調整することで、単粒子測定も可能である。As described above, since the excitation intensity of a substance dissolved in a particle is measured, the amount of a dye dissolved in a droplet or the like can be easily measured. If the concentration of the substance is constant, the particle size can be measured. Further, by adjusting the irradiation area of the excitation light, single particle measurement is also possible.
【０００８】また、前記励起光により励起可能な物質
は、蛍光剤であることが好適である。蛍光剤を用いるこ
とにより、励起光の照射に応じ、蛍光剤の分子数に応じ
た蛍光強度が得られ、粒子径などを容易に測定すること
が可能となる。It is preferable that the substance which can be excited by the excitation light is a fluorescent agent. By using the fluorescent agent, a fluorescence intensity corresponding to the number of molecules of the fluorescent agent can be obtained according to the irradiation of the excitation light, and the particle diameter and the like can be easily measured.
【０００９】また、前記粒子の性状は、粒子径であるこ
とが好適である。Preferably, the properties of the particles are a particle diameter.
【００１０】また、前記測定対象の粒子を分散媒中に分
散した状態で前記励起強度の測定を行うことが好適であ
る。It is preferable that the excitation intensity is measured in a state where the particles to be measured are dispersed in a dispersion medium.
【００１１】また、前記測定対象の粒子を分散媒中に分
散した状態で、励起光照射領域に流通して、励起強度の
頻度分布を測定し、この頻度分布から粒子の性状を測定
することが好適である。このような手法により、粒子性
状の時間変化などを測定することが可能である。It is also possible that the particles to be measured are dispersed in a dispersion medium and flow through an excitation light irradiation area to measure the frequency distribution of excitation intensity, and to measure the properties of the particles from the frequency distribution. It is suitable. By such a method, it is possible to measure the time change of the particle properties and the like.
【００１２】また、前記測定した励起強度について、励
起光の強度分布を考慮して、頻度分布から粒径分布を算
出することが好適である。It is preferable to calculate the particle size distribution from the frequency distribution of the measured excitation intensity in consideration of the intensity distribution of the excitation light.
【００１３】また、前記励起光により励起可能な物質
は、粒子に溶解するが分散媒には溶解しない物質である
ことが好適である。これによって、励起光強度が粒子の
みに応じたものになり、粒子の性状を容易、かつ高精度
に測定することができる。Further, it is preferable that the substance excitable by the excitation light is a substance that dissolves in the particles but does not dissolve in the dispersion medium. As a result, the excitation light intensity depends on only the particles, and the properties of the particles can be measured easily and with high accuracy.
【００１４】また、本発明に係る粒子測定装置は、励起
光により励起可能な物質を溶解した粒子を分散媒中に分
散した流体を保持する容器と、前記容器内の流体に対し
励起光を照射する照射手段と、物質の励起強度を測定す
る励起強度測定手段と、測定された励起強度から測定対
象の粒子の性状を求める性状検出手段と、を含むことを
特徴とする。Further, the particle measuring apparatus according to the present invention comprises a container for holding a fluid in which particles in which a substance excitable by excitation light is dissolved are dispersed in a dispersion medium, and irradiating the fluid in the container with excitation light. Irradiating means, an excitation intensity measuring means for measuring an excitation intensity of a substance, and a property detecting means for obtaining properties of particles to be measured from the measured excitation intensity.
【００１５】また、前記容器は、その内部に流体を流す
パイプで構成されることが好適である。Preferably, the container is constituted by a pipe through which a fluid flows.
【００１６】[0016]
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施形態につい
て、図面に基づいて説明する。Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
【００１７】図１は、一実施形態に係る粒子径測定シス
テムの構成を示す図である。ガラスなどの透明部材から
構成されたキャピラリー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）１０の
内部に測定対象である粒子が分散された液体のサンプル
が所定の流速で流通される。ここで、このキャピラリー
１０の内部の様子が図１の左上に記載されている。この
ように、粒子（エマルション滴）の内部には色素が溶解
しており、粒子が分散されている液体中には色素は存在
しない。また、色素はその粒子内においてもその濃度が
均一であり、粒子内に存在する色素の個数はその粒子の
大きさに比例している。また、粒子の観測領域は、キャ
ピラリー１０内の一部であり、例えば１μｍ程度に設定
される。FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a particle diameter measuring system according to one embodiment. A liquid sample in which particles to be measured are dispersed in a capillary 10 made of a transparent material such as glass flows at a predetermined flow rate. Here, the inside of the capillary 10 is described in the upper left of FIG. As described above, the pigment is dissolved inside the particles (emulsion droplets), and the pigment is not present in the liquid in which the particles are dispersed. Further, the concentration of the pigment is uniform even in the particle, and the number of pigments present in the particle is proportional to the size of the particle. The particle observation area is a part of the capillary 10 and is set to, for example, about 1 μm.
【００１８】そして、粒子内に存在する色素は、蛍光色
素であり、所定の光の照射により蛍光を発する。本シス
テムでは、この蛍光の強度を計測する。The dye present in the particles is a fluorescent dye, and emits fluorescence when irradiated with predetermined light. In this system, the intensity of this fluorescence is measured.
【００１９】このために、レーザ光源１２が設けられて
おり、ここから所定のレーザ光が射出される。この例で
は、レーザ光源１２は、アルゴンイオンレーザ光源であ
り、４７６．５ｎｍの光を放出する。レーザ光源１２か
らのレーザ光は、ダイクロイックミラー１４に入射し、
ここでキャピラリー１０の方向に反射される。ダイクロ
イックミラー１４による反射光は、対物レンズ（Ｏｂｊ
ｅｃｔｉｖｅ Ｌｅｎｓ）１６により集光されてキャピ
ラリー１０の所定位置に照射される。この照射された光
の範囲が上述の観測範囲である。For this purpose, a laser light source 12 is provided, from which predetermined laser light is emitted. In this example, the laser light source 12 is an argon ion laser light source and emits light of 476.5 nm. Laser light from the laser light source 12 enters the dichroic mirror 14,
Here, the light is reflected in the direction of the capillary 10. The light reflected by the dichroic mirror 14 is reflected by an objective lens (Obj
Then, the light is condensed by an active lens 16 and is irradiated to a predetermined position of the capillary 10. The range of the irradiated light is the above-mentioned observation range.
【００２０】対物レンズ１６により集光されたレーザ光
は、キャピラリー１０及びキャピラリー１０内の観測領
域を通過して反対側に抜ける。The laser light condensed by the objective lens 16 passes through the capillary 10 and an observation area in the capillary 10 and passes through the opposite side.
【００２１】ここで、このレーザ光は、蛍光色素の励起
光として作用する。すなわち、粒子内の蛍光色素はこの
励起光によって励起され、蛍光を発する。この蛍光は、
例えば５２０ｎｍの光である。このようにして発せられ
た蛍光は、対物レンズ１６を介しダイクロイックミラー
１４に至る。そして、この蛍光は、ダイクロイックミラ
ー１４をそのまま通過して、フィルタ１８を介し、プリ
ズム２０に至る。フィルタ１８は、波長５２０ｎｍの光
を選択するものである。Here, this laser light acts as excitation light for the fluorescent dye. That is, the fluorescent dye in the particles is excited by the excitation light and emits fluorescence. This fluorescence
For example, light of 520 nm is used. The fluorescent light thus emitted reaches the dichroic mirror 14 via the objective lens 16. Then, this fluorescence passes through the dichroic mirror 14 as it is, and reaches the prism 20 via the filter 18. The filter 18 selects light having a wavelength of 520 nm.
【００２２】プリズム２０は、入射してくる蛍光を９０
°方向を変更する。プリズム２０からの光は、凸レンズ
２２、ピンホール２４、凸レンズ２６により、適切な大
きさの光にされて、アバランシェフォトダイオード２８
に入射される。このアバランシェフォトダイオード（Ａ
ｖａｌａｎｓｈｅ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）２８は、入
射してくる光の強度（フォトン数）に対応した信号を出
力する。The prism 20 converts the incoming fluorescent light into 90
° Change direction. The light from the prism 20 is converted into light of an appropriate size by the convex lens 22, the pinhole 24, and the convex lens 26, and the avalanche photodiode 28
Is incident on. This avalanche photodiode (A
The valance photo diode 28 outputs a signal corresponding to the intensity (number of photons) of the incident light.
【００２３】アバランシェフォトダイオード２８の出力
は、マルチチャンネルカウンタ（Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎ
ｎｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）３０を介し、コンピュータ３
２に入力される。そこで、このコンピュータ３２におい
て、アバランシェフォトダイオード２８に入射するフォ
トン数、すなわち観測領域の粒子内に存在する色素から
発せられた蛍光の強度が計測される。そして、このコン
ピュータ３２が、蛍光の強度に応じて粒子径を算出す
る。なお、このシステムは、基本的に共焦点蛍光顕微鏡
で構成されている。The output of the avalanche photodiode 28 is a multi-channel counter (Multichannel).
nel Counter) 30 and the computer 3
2 is input. Thus, the computer 32 measures the number of photons incident on the avalanche photodiode 28, that is, the intensity of the fluorescence emitted from the dye present in the particles in the observation region. Then, the computer 32 calculates the particle diameter according to the intensity of the fluorescence. This system is basically constituted by a confocal fluorescence microscope.
【００２４】次に、このシステムによる粒子径の測定に
ついて、具体的に説明する。試料（サンプル）として、
水中油滴型・油中水滴型エマルション等を利用すること
ができ、これらにおける分散質粒子の粒子径を測定す
る。Next, the measurement of the particle diameter by this system will be specifically described. As a sample (sample)
An oil-in-water type / water-in-oil type emulsion can be used, and the particle size of the dispersoid particles in these types is measured.
【００２５】まず、分散質となる液体中に、蛍光色素を
所定の濃度、例えば１０-9Ｍ／Ｌ程度の濃度で溶解す
る。次に、この分散質液を分散媒に添加し混合してエマ
ルションを調製する。このために、混合液に超音波照射
（例えば、２８ｋＨｚ，１０ｍｉｎ）して、分散質のエ
マルション滴を調製する。First, a fluorescent dye is dissolved in a liquid serving as a dispersoid at a predetermined concentration, for example, a concentration of about 10 −9 M / L. Next, this dispersion is added to a dispersion medium and mixed to prepare an emulsion. For this purpose, the mixture is irradiated with ultrasonic waves (for example, 28 kHz, 10 min) to prepare emulsion droplets of the dispersoid.
【００２６】ここで、蛍光色素には、分散質に溶け、分
散媒に溶けないものを用いることが好適である。これに
よって、色素は分散質粒子内のみに存在する。また、分
散質に溶解した色素はエマルション滴中に均一な濃度で
存在する。そこで、励起光により励起された色素から発
光される蛍光の強度は、観測領域にある色素の量と基本
的には比例関係があり、また濃度が均質なことから粒子
径とも基本的には比例関係がある。ここで、基本的には
比例関係があるとしたのは、通常は照射するレーザ光の
強度に分布があり、観測領域内に均一にレーザ光が照射
されるわけではないからである。これについては、後述
する。Here, it is preferable to use a fluorescent dye which is soluble in a dispersoid and insoluble in a dispersion medium. Thereby, the dye is present only in the dispersoid particles. The pigment dissolved in the dispersoid is present in the emulsion droplets at a uniform concentration. Therefore, the intensity of the fluorescence emitted from the dye excited by the excitation light is basically proportional to the amount of the dye in the observation area, and since the concentration is homogeneous, it is basically proportional to the particle size. Have a relationship. Here, the reason why there is basically a proportional relationship is that the intensity of the laser light to be irradiated normally has a distribution and the laser light is not uniformly irradiated in the observation region. This will be described later.
【００２７】また、エマルションには、界面活性剤など
の安定化剤を用いる場合が多いが、界面活性剤を用いて
いないエマルションを例に挙げ説明する。水中油滴型エ
マルションとしては、分散質が炭化水素であるデカンま
たは長鎖アルコールであるドデカノールを用い、油中水
滴型エマルションとしては、分散質・分散媒にそれぞれ
水・デカンを用いて実験を行った。これらのうち、特に
デカン滴／水エマルションについて詳細に説明する。Further, in many cases, a stabilizer such as a surfactant is used in the emulsion, but an emulsion in which no surfactant is used will be described as an example. For oil-in-water emulsions, experiments were performed using decane, a hydrocarbon dispersoid, or dodecanol, a long-chain alcohol. Was. Among them, the decane droplet / water emulsion will be described in detail.
【００２８】エマルション滴（デカン）中に蛍光色素
（Ｃ５４０）を１０-9Ｍ／Ｌ程度の濃度で溶解し、これ
を水中に添加し、超音波照射によりデカン滴／水エマル
ションを調製する。蛍光色素はデカン滴の中に溶けてお
り、水の中には存在しない。A fluorescent dye (C540) is dissolved in an emulsion droplet (decane) at a concentration of about 10 −9 M / L, added to water, and a decane droplet / water emulsion is prepared by ultrasonic irradiation. The fluorescent dye is dissolved in the decane droplet and does not exist in the water.
【００２９】この試料を直径０．５３ｍｍのキャピラリ
ー１０中に約１２５ｍｍ／ｓｅｃの速度で流す。エマル
ション滴が共焦点蛍光顕微鏡の観測領域を通過すると、
エマルション滴中に含まれる色素がレーザ光により励起
され、蛍光シグナルを放出する。そして、この蛍光を検
出することにより、エマルション滴１個ずつを個別に観
測する。すなわち、観測領域には、基本的に粒子が１つ
しか入らず、単一粒子検出となっている。This sample is allowed to flow through the capillary 10 having a diameter of 0.53 mm at a speed of about 125 mm / sec. When the emulsion droplet passes through the observation area of the confocal fluorescence microscope,
The dye contained in the emulsion droplets is excited by the laser light and emits a fluorescent signal. Then, by detecting the fluorescence, each emulsion droplet is individually observed. That is, basically, only one particle enters the observation region, and single particle detection is performed.
【００３０】エマルション滴からの蛍光シグナルの時間
変化（約１．３秒間）を図２に示す。横軸が時間（ｔｉ
ｍｅ／ｓｅｃ（秒））、縦軸は蛍光の強度に対応するカ
ウント数（Ｃｏｕｎｔｓ）である。エマルション滴が観
測領域を通過するたびに蛍光強度が強くなり、バンチン
グとして観察される。一方、観測領域になにもない時に
は、蛍光はない。これがアンチバンチングである。この
ように、単一粒子検出の特徴である蛍光バンチング及び
アンチバンチングが観測されている。色素は、デカン中
に均一に溶解しており、単位体積中の色素量は、一定で
ある。従って、バンチングの高さ（色素量）は、粒子体
積に比例する。このためバンチングの高さから粒子径を
求めることができる。FIG. 2 shows the time change (about 1.3 seconds) of the fluorescence signal from the emulsion droplet. The horizontal axis is time (ti
me / sec (seconds)), and the vertical axis indicates counts (Counts) corresponding to the intensity of fluorescence. Each time the emulsion droplet passes through the observation area, the fluorescence intensity increases and is observed as bunching. On the other hand, when there is nothing in the observation area, there is no fluorescence. This is anti-bunching. Thus, fluorescence bunching and anti-bunching, which are features of single particle detection, have been observed. The dye is uniformly dissolved in decane, and the amount of the dye per unit volume is constant. Therefore, the bunching height (the amount of dye) is proportional to the particle volume. Therefore, the particle diameter can be determined from the bunching height.
【００３１】しかし、実際には、照射レーザ光にはその
強度に分布があり、観測領域全体に均一な強度で光が照
射されるわけではない。そこで、このレーザ光の強度分
布を考慮して粒子径を検出する。すなわち、図３に示す
バンチングの強度分布曲線（強度と頻度のヒストグラ
ム）の減衰度（減衰定数）を利用して、観測領域を通過
した粒子の粒径分布を求める。図３は、図２に示された
時間毎のカウント数（フォトン数：蛍光強度）の１３秒
分を蛍光強度毎の頻度に書き直したものであり、蛍光強
度毎にその頻度が示されている。この例では、蛍光強度
５０程度がピークとなっている。However, in practice, the irradiation laser light has a distribution in its intensity, and the entire observation area is not irradiated with light at a uniform intensity. Therefore, the particle size is detected in consideration of the intensity distribution of the laser light. That is, the particle size distribution of the particles that have passed through the observation region is determined using the degree of attenuation (attenuation constant) of the bunching intensity distribution curve (intensity and frequency histogram) shown in FIG. FIG. 3 rewrites 13 seconds of the count number (photon number: fluorescence intensity) for each time shown in FIG. 2 to the frequency for each fluorescence intensity, and shows the frequency for each fluorescence intensity. . In this example, the peak of the fluorescence intensity is about 50.
【００３２】ここで、通常の場合、レーザ光の焦点領域
の強度分布は、図４の左側に示すように、ガウス分布と
なっており、中心部が強度が強く周辺部が強度が弱い。
なお、観測領域には単一粒子（滴）が基本的に通過す
る。従って、観察領域を単一色素分子が通過した場合に
は、その蛍光強度分布（蛍光強度（バンチングの高さ）
と頻度ヒストグラム）は指数関数で近似することができ
る。すなわち、中心を通る確率が低く周辺を通る確率が
高いことから、図４の右側に示すように、強度が強くな
るに従って頻度が小さくなる指数関数となる。これを式
で表すと、ガウス分布は、ｇ＝ｅｘｐ（−Γｘ）で表さ
れ、Γが減衰定数である。そして、この減衰定数Γの分
布はｇ（ｘ）＝∫Ｇ（Γ）ｅｘｐ（−Γｘ）ｄΓであ
り、指数関数となる。Here, in the normal case, the intensity distribution of the focal region of the laser light is a Gaussian distribution as shown on the left side of FIG. 4, and the intensity is strong at the center and weak at the periphery.
A single particle (drop) basically passes through the observation region. Therefore, when a single dye molecule passes through the observation area, its fluorescence intensity distribution (fluorescence intensity (height of bunching))
And the frequency histogram) can be approximated by an exponential function. That is, since the probability of passing through the center is low and the probability of passing through the periphery is high, an exponential function is obtained in which the frequency decreases as the intensity increases, as shown on the right side of FIG. When this is represented by an equation, the Gaussian distribution is represented by g = exp (−Γx), and Γ is an attenuation constant. The distribution of the attenuation constant ｇ is g (x) = {G (Γ) exp (− {x) d}}, which is an exponential function.
【００３３】また、色素を１個だけ含んだエマルション
滴のみが存在する試料を想定した場合、蛍光強度分布
（バンチングの高さと頻度ヒストグラム）が減衰定数
（Γ）の指数関数で近似できるとすると、色素を２つだ
け含んだエマルション滴のみの試料では、ヒストグラム
はΓ／２の減衰定数を持つ指数関数で近似できる。すな
わち、色素２個であれば、真ん中に入った場合の蛍光強
度は２倍になる。Further, assuming a sample in which only an emulsion droplet containing only one dye exists, assuming that the fluorescence intensity distribution (bunching height and frequency histogram) can be approximated by an exponential function of an attenuation constant (Γ), For a sample containing only emulsion drops containing only two dyes, the histogram can be approximated by an exponential function with a decay constant of Γ / 2. That is, if there are two dyes, the fluorescence intensity in the middle is doubled.
【００３４】同様に、色素３個、４個・・・の場合、減
衰定数は、Γ／３、Γ／４・・・となる。従って、減衰
定数の分布は、試料中の１個のエマルション滴に入って
いる蛍光色素の数の分布に対応する。Similarly, in the case of three dyes, four dyes,..., The attenuation constants are Γ / 3, Γ / 4. Therefore, the distribution of the decay constant corresponds to the distribution of the number of fluorescent dyes contained in one emulsion droplet in the sample.
【００３５】実際の測定では、色素の数が異なるエマル
ション滴が含まれており、得られた蛍光強度に対する頻
度（ヒストグラム）は観察領域を通ったエマルション滴
の色素数に応じた減衰定数の分布を持った指数関数の重
ね合わせとなる。すなわち、減衰定数の分布は、試料中
の観測領域を通った各エマルション滴に入っている蛍光
色素の数の分布に対応したものになる。In the actual measurement, emulsion droplets having different numbers of dyes are included, and the frequency (histogram) with respect to the obtained fluorescence intensity indicates the distribution of the decay constant according to the number of dyes of the emulsion droplets passing through the observation region. It becomes a superposition of the exponential functions. That is, the distribution of the decay constant corresponds to the distribution of the number of fluorescent dyes contained in each emulsion droplet passing through the observation region in the sample.
【００３６】図５に示すように、実験のヒストグラムに
クムラント解析（Ｃｕｍｕｌａｎｎｔ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）によってフィッティングすることにより係数Ｋ1，
Ｋ2が得られる。図４の下側に示すように、この係数
Ｋ1，Ｋ2は、それぞれ減衰定数の分布の平均と分散（分
布の幅）になる。なお、係数Ｋ3は、分布のゆがみであ
る。また、クムラント解析は、下のような多項式As shown in FIG. 5, cumulant analysis (Cumulant Analysis) is shown in the histogram of the experiment.
s), the coefficients K 1 ,
K 2 is obtained. As shown in the lower part of FIG. 4, the coefficients K 1 and K 2 are the average and the variance (width of distribution) of the distribution of the attenuation constant, respectively. The coefficient K 3 is a distortion of the distribution. In addition, cumulant analysis is based on the following polynomial
【数１】（１／２）ｌｎ［ｆ（ｘ）−ｇ（∞）］＝Ｃ0
−Ｋ1ｘ＋（１／２！）Ｋ2ｘ2−（１／３！）Ｋ3ｘ3＋
・・・ へのフィッティングである。## EQU1 ## (1/2) ln [f (x) -g (∞)] = C 0
-K 1 x + (1/2!) K 2 x 2 - (! 1/3) K 3 x 3 +
... fitting.
【００３７】得られた減衰定数の平均と分散をガウス分
布で表すと図６のように表される。上述のように、減衰
定数Γと色素数は同じであり、減衰定数分布は、粒子中
の色素数分布となる。FIG. 6 shows the average and variance of the obtained attenuation constants in Gaussian distribution. As described above, the attenuation constant Γ is equal to the number of dyes, and the attenuation constant distribution is the distribution of the number of dyes in the particles.
【００３８】一方、デカンエマルション滴中の色素数分
布はポアソン分布に従い、デカン中の色素濃度とデカン
エマルション滴の粒子径によって決定される。従って、
蛍光色素１個の場合の減衰定数を基に粒子径を概算する
ことができ、図７に示すような粒子分布を得ることがで
きる。このように、粒子径４４７ｎｍ程度がピークとな
り、粒子径４４６ｎｍ〜４５２ｎｍの範囲に渡っている
ことが分かる。On the other hand, the distribution of the number of dyes in the decane emulsion droplets follows the Poisson distribution, and is determined by the concentration of the dye in decane and the particle size of the decane emulsion droplets. Therefore,
The particle diameter can be roughly estimated based on the decay constant of one fluorescent dye, and a particle distribution as shown in FIG. 7 can be obtained. Thus, it can be seen that the peak is at a particle diameter of about 447 nm, and the particle diameter ranges from 446 nm to 452 nm.
【００３９】このように、共焦点蛍光顕微鏡を用いて、
粒子中の色素の蛍光強度を計測することで、粒子径を測
定することができる。Thus, using a confocal fluorescence microscope,
By measuring the fluorescence intensity of the dye in the particles, the particle size can be measured.
【００４０】「測定例」この方法を適用して、水中にデ
カンが分散したエマルションの粒子径時間変化を測定し
た。図８は、エマルション滴からの蛍光信号がどのよう
に時間変化するかを示している。上図が超音波によるエ
マルション化の後３分経過、中図が６０分経過、下図が
１８０分経過後の測定値を示している。なお、図におい
て、横軸が時間（秒）、縦軸が蛍光強度に対応するカウ
ント値である。"Measurement Example" By applying this method, a time-dependent change in the particle diameter of an emulsion in which decane was dispersed in water was measured. FIG. 8 shows how the fluorescence signal from the emulsion droplet changes over time. The upper diagram shows the measured values after 3 minutes elapse from the emulsion by ultrasonic, the middle diagram shows the measured values after 60 minutes, and the lower diagram shows the measured values after 180 minutes. In the figure, the horizontal axis represents time (seconds), and the vertical axis represents the count value corresponding to the fluorescence intensity.
【００４１】この図から明らかなように、時間の経過に
伴い蛍光バンチングの高さが増加している。この結果
は、エマルション滴の粒子径が時間とともに増加してい
ることを示している。バンチングの平均高さを平均的な
粒子径と見なし、それを時間スケールに対してプロット
すると図９が得られる。この図からわかるように、平均
的な粒子径は、時間と共に階段状に増加する。粒子径が
変化しないこれらの準安定状態を、ＰｈａｓｅＩ，Ｐｈ
ａｓｅＩＩ，ＰｈａｓｅＩＩＩと呼ぶ。すなわち、ほぼ
１０〜４０分がＰｈａｓｅＩ、ほぼ６０〜２００分がＰ
ｈａｓｅＩＩ、２２０〜３００分がＰｈａｓｅＩＩＩと
なっている。なお、図９は、横軸が時間（分）、縦軸が
粒子径に対応する減衰定数Γ（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕ
ｎｉｔ：任意単位）である。As is apparent from this figure, the height of the fluorescent bunching increases with time. This result indicates that the particle size of the emulsion droplet increases with time. Considering the average bunching height as the average particle size and plotting it against the time scale, FIG. 9 is obtained. As can be seen from this figure, the average particle size increases stepwise with time. These metastable states in which the particle size does not change are referred to as Phase I, Ph
These are called caseII and PhaseIII. That is, Phase I is about 10 to 40 minutes, and P is about 60 to 200 minutes.
PhaseII, 220 to 300 minutes is PhaseIII. In FIG. 9, the horizontal axis represents time (minutes), and the vertical axis represents the attenuation constant Γ (arbitrary u) corresponding to the particle diameter.
nit: arbitrary unit).
【００４２】各測定時間において、同様の測定を１０回
程度繰り返し、上述と同様の手法によってデータ解析を
行い、粒子径分布を求めた。各測定時間における蛍光強
度分布曲線（バンチングの強度と頻度のヒストグラム）
を求めた結果を図１０（ａ）に示す。この図より、時間
が進むにつれて、蛍光強度の小さなバンチング（図にお
ける左側のピーク）が減少し、蛍光強度の大きな裾の部
分（図における右側）が増大してゆくことが分かる。At each measurement time, the same measurement was repeated about 10 times, and data analysis was performed by the same method as described above to obtain the particle size distribution. Fluorescence intensity distribution curve at each measurement time (histogram of bunching intensity and frequency)
Is shown in FIG. 10 (a). From this figure, it can be seen that as time progresses, the bunching with small fluorescence intensity (peak on the left side in the figure) decreases, and the skirt portion with large fluorescence intensity (right side in the figure) increases.
【００４３】裾の部分を拡大したものを図１０（ｂ）に
示す。このように時間経過に伴って減衰度が小さくなっ
ていることが分かる。これは先に想定したエマルション
滴中の色素の個数と減衰定数の関係（図４）に一致して
いる。FIG. 10B shows an enlarged skirt portion. Thus, it can be seen that the degree of attenuation decreases with time. This agrees with the relationship between the number of dyes in the emulsion droplets and the attenuation constant (FIG. 4) assumed earlier.
【００４４】これらの減衰曲線をクムラント解析し、減
衰定数の平均値と分散を求め、これらの値を用いて減衰
定数（粒子中の色素分子数）分布を導出した。These decay curves were subjected to cumulant analysis to determine the average value and variance of the decay constant, and the distribution of the decay constant (the number of dye molecules in the particles) was derived using these values.
【００４５】ここで、減衰定数分布をガウス分布で表し
た。ＰｈａｓｅＩＩからＰｈａｓｅＩＩＩへの変化に伴
う減衰定数（色素分子数）分布曲線と粒子径分布曲線を
図１１と図１２にそれぞれ示す。図１１においては、減
衰定数の大きなＰｈａｓｅＩＩの減衰定数分布が右側の
群であり、減衰定数の小さなＰｈａｓｅＩＩＩが左側の
群である。図１２では、粒子径の小さな左側の群がＰｈ
ａｓｅＩＩの粒径分布であり、粒子径の大きな右側の群
がＰｈａｓｅＩＩＩの粒径分布である。このように、時
間が進行するにつれて、粒子分布（直径４４８ｎｍ程
度）は群をなして粒子径が増大する方向（直径４７５ｎ
ｍ程度）に移動しており、図９の階段的な経時変化と対
応している。なお、図１１、１２においては、各分布と
経過時間の対応を記載していないが、図１１において
は、右側から左側に時間と共に分布に移動し、図１２に
おいては、左側から右側に時間と共に分布が移動する。Here, the attenuation constant distribution is represented by a Gaussian distribution. FIGS. 11 and 12 show a decay constant (number of dye molecules) distribution curve and a particle size distribution curve accompanying the change from Phase II to Phase III, respectively. In FIG. 11, the distribution of the attenuation constant of Phase II having a large attenuation constant is the group on the right side, and the Phase III having the small attenuation constant is the group on the left side. In FIG. 12, the left group having a small particle diameter is Ph
It is the particle size distribution of caseII, and the group on the right side having a large particle size is the particle size distribution of PhaseIII. Thus, as time progresses, the particle distribution (diameter of about 448 nm) forms a group and the direction in which the particle diameter increases (diameter of 475 n).
m), which corresponds to the stepwise change with time in FIG. In FIGS. 11 and 12, the correspondence between each distribution and the elapsed time is not described. In FIG. 11, the distribution moves from right to left with time, and in FIG. 12, the distribution moves from left to right with time. The distribution moves.
【００４６】現在の解析法から得られたＰｈａｓｅＩＩ
とＰｈａｓｅＩＩＩの粒子径の違いは３０ｎｍ程度であ
った（図１２によればＰｈａｓｅＩＩが４５０ｎｍ程度
で、ＰｈａｓｅＩＩＩが４７０ｎｍ程度）。動的光散乱
法では、この粒子径の差を検出することが不可能であ
り、本実施形態に係る粒子測定法は、これまでにない粒
子径識別分解能を持つことが明らかになった。Phase II obtained from the current analysis method
The difference between the particle size of Phase III and that of Phase III was about 30 nm (Phase II was about 450 nm and Phase III was about 470 nm according to FIG. 12). The dynamic light scattering method cannot detect this difference in particle diameter, and it has been revealed that the particle measurement method according to the present embodiment has an unprecedented particle diameter discrimination resolution.
【００４７】このように、本実施形態の粒子測定法で
は、 （ｉ）単一粒子測定が可能である。 （ｉｉ）直径の小さい粒子径を測定することができる。
色素濃度を高めることにより、５ｎｍ以下のエマルショ
ン滴を観察することができることが確認されている。さ
らに、原理的には、色素分子が１つのみ入る大きさの粒
子径を測定することができるため、分子レベルの粒子径
測定が可能である。 （ｉｉｉ）粒子径変化測定の時間分解能が高い。特に、
測定時間を１秒以下にすることが可能であり、短時間で
測定を終了することができる。 （ｉｖ）粒子径測定の分解能が高い。粒子１個ずつを観
測する手法とクムラント法による解析法を組み合わせる
ことにより、上述のように粒子径の分解能を高いものに
できる。なお、上述の例では、減衰定数についての係数
を２次までのみ利用したが、さらに高次のものを利用す
ることで、より高精度の測定が行える。例えば、３次の
係数は分布のゆがみを表している。As described above, according to the particle measuring method of the present embodiment, (i) single particle measurement is possible. (Ii) The particle diameter having a small diameter can be measured.
It has been confirmed that by increasing the dye concentration, an emulsion droplet of 5 nm or less can be observed. Furthermore, in principle, a particle diameter that can accommodate only one dye molecule can be measured, so that a particle diameter measurement at a molecular level is possible. (Iii) The time resolution of the particle diameter change measurement is high. In particular,
The measurement time can be reduced to 1 second or less, and the measurement can be completed in a short time. (Iv) The resolution of particle size measurement is high. As described above, the resolution of the particle diameter can be increased by combining the method of observing each particle one by one and the analysis method by the Kumlant method. In the above-described example, the coefficient of the attenuation constant is used only up to the second order. However, by using a higher order coefficient, measurement with higher accuracy can be performed. For example, a cubic coefficient represents the distortion of the distribution.
【００４８】このようにして、本実施形態の粒子径測定
方法によれば、従来に比べ、高精度の粒子径測定が行え
る。特に、液体微粒子や界面活性剤ミセルなどのを粒子
径を高精度に計測することができる。As described above, according to the particle diameter measuring method of the present embodiment, the particle diameter can be measured with higher accuracy than before. In particular, the particle diameter of liquid fine particles, surfactant micelles and the like can be measured with high accuracy.
【００４９】また、本測定法は、色素の数を測定するこ
とができるため、粒子径だけでなく、粒子の内包力など
の粒子性状も測定することができる。すなわち、粒子内
の色素数から、その粒子が色素をいくつ保持できるかを
測定することができる。また、分散媒中の色素が粒子側
へ移動する状況を検出することなどもできる。Further, since the present measurement method can measure the number of dyes, it is possible to measure not only the particle size but also the particle properties such as the encapsulating force of the particles. That is, from the number of dyes in a particle, it is possible to determine how many dyes the particle can hold. It is also possible to detect the situation where the dye in the dispersion medium moves to the particle side.
【００５０】また、上述の例では、分散媒中には、色素
が溶解しないことを条件としたが、分散媒と粒子とで色
素濃度が異なれば粒子の性状についての測定は可能であ
る。さらに、粒子は容器内に貯めておき測定を行うこと
ができる。In the above-described example, the condition is that the pigment is not dissolved in the dispersion medium. However, if the pigment concentration is different between the dispersion medium and the particles, the properties of the particles can be measured. Further, the particles can be stored in a container for measurement.
【００５１】なお、このような粒子測定は、薬品製造な
ど各種の分野において、広く利用することができる。Note that such particle measurement can be widely used in various fields such as drug production.
【００５２】[0052]
【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る粒子
測定方法によれば、粒子内に溶解した物質の励起強度を
測定するため、例えば液滴などに溶解された色素の量を
容易に測定できる。物質の濃度が一定であれば、粒子径
を測定することが可能になる。また、励起光の照射領域
を調整することで、単粒子測定も可能である。As described above, according to the particle measuring method of the present invention, since the excitation intensity of the substance dissolved in the particles is measured, the amount of the dye dissolved in, for example, a droplet can be easily measured. Can be measured. If the concentration of the substance is constant, the particle size can be measured. Further, by adjusting the irradiation area of the excitation light, single particle measurement is also possible.
【００５３】また、蛍光剤を用いることにより、励起光
の照射に応じ、蛍光剤の分子数に応じた蛍光強度が得ら
れ、粒子径などを容易に測定することが可能となる。Further, by using the fluorescent agent, a fluorescent intensity corresponding to the number of molecules of the fluorescent agent can be obtained in response to the irradiation of the excitation light, and the particle diameter and the like can be easily measured.
【００５４】また、前記測定対象の粒子を分散媒中に分
散した状態で、励起光照射領域に流通して、励起強度の
頻度分布を測定し、この頻度分布から粒子の性状を測定
することで、粒子性状の時間変化などの測定をすること
が可能である。Further, in a state where the particles to be measured are dispersed in a dispersion medium, the particles are circulated through an excitation light irradiation area to measure the frequency distribution of excitation intensity, and the properties of the particles are measured from the frequency distribution. In addition, it is possible to measure the time change of the particle properties.
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】 測定システムの構成を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a measurement system.
【図２】 蛍光のカウントの時間変化を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a time change of a fluorescence count.
【図３】 蛍光強度とその頻度を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing fluorescence intensity and its frequency.
【図４】 粒子中の色素数推定の手法を説明する図であ
る。FIG. 4 is a diagram illustrating a technique for estimating the number of dyes in particles.
【図５】 実験値における蛍光強度と、頻度の関係を示
す図である。FIG. 5 is a diagram showing the relationship between fluorescence intensity and frequency in experimental values.
【図６】 減衰定数の分布を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing a distribution of an attenuation constant.
【図７】 粒子径分布を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing a particle size distribution.
【図８】 時間経過にともなう蛍光カウントの変化を示
す図である。FIG. 8 is a diagram showing a change in a fluorescence count over time.
【図９】 頻度の時間経過にともなう変化を示す図であ
る。FIG. 9 is a diagram showing a change in frequency with time.
【図１０】 蛍光強度とその頻度を示す図である。FIG. 10 is a diagram showing fluorescence intensity and its frequency.
【図１１】 時間の経過による減衰定数の分布を示す図
である。FIG. 11 is a diagram showing a distribution of a damping constant over time.
【図１２】 粒子径の分布の時間変化を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing a temporal change of a particle size distribution.
１０ キャピラリー、１２ レーザ光源、２８ アバラ
ンシェフォトダイオード、３０ マルチチャンネルカウ
ンタ、３２ コンピュータ。10 capillaries, 12 laser light sources, 28 avalanche photodiodes, 30 multi-channel counters, 32 computers.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 真船 文隆 東京都江東区東雲２−７−５ トミンタワ ー東雲1905 (72)発明者 武田 佳宏 千葉県浦安市今川３−６−５ ビッグファ ーム101号 (72)発明者 酒井 俊郎 埼玉県川越市仙波町４−28−５−２−203 Ｆターム(参考） 2G043 AA03 CA04 CA06 DA02 EA01 GA07 GB21 HA01 HA02 KA09 LA01 NA02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Fumitaka Mafune 2-7-5 Shinonome, Koto-ku, Tokyo 1905 Tomin Tower Shinonome 1905 (72) Inventor Yoshihiro Takeda 3-6-5 Imagawa 3-6-5 Urayasu-shi, Chiba (72) Inventor Toshiro Sakai 4-28-5-2-203 Senba-cho, Kawagoe-shi, Saitama F-term (reference) 2G043 AA03 CA04 CA06 DA02 EA01 GA07 GB21 HA01 HA02 KA09 LA01 NA02
Claims (11)
より励起可能な物質を溶解させる工程と、 前記物質を溶解した粒子に励起光を照射し励起強度を測
定する工程と、 測定された励起強度から測定対象の粒子の性状を求める
工程と、 を含む粒子測定方法。A step of dissolving a substance that can be dissolved in particles to be measured and can be excited by excitation light; a step of irradiating the particles in which the substance is dissolved with excitation light to measure an excitation intensity; Determining the properties of the particles to be measured from the strength;
測定方法。2. The method according to claim 1, wherein the substance excitable by the excitation light is a fluorescent agent.
て、 前記粒子の性状は、粒子径である粒子測定方法。3. The method according to claim 1, wherein the property of the particles is a particle diameter.
法において、 前記測定対象の粒子を分散媒中に分散した状態で前記励
起強度の測定を行う粒子測定方法。4. The method according to claim 1, wherein the excitation intensity is measured in a state where the particles to be measured are dispersed in a dispersion medium.
光照射領域に流通して、励起強度の頻度分布を測定し、
この頻度分布から粒子の性状を測定する粒子測定方法。5. The method according to claim 4, wherein the particles to be measured are dispersed in a dispersion medium and flow through an excitation light irradiation area to measure a frequency distribution of excitation intensity.
A particle measuring method for measuring the properties of particles from this frequency distribution.
法において、 前記測定した励起強度について、励起光の強度分布を考
慮して、頻度分布から粒径分布を算出する粒子測定方
法。6. The method according to claim 1, wherein the particle size distribution is calculated from a frequency distribution of the measured excitation intensity in consideration of an intensity distribution of the excitation light. .
法において、 前記励起光により励起可能な物質は、粒子に溶解するが
分散媒には溶解しない物質である粒子測定方法。7. The method according to claim 1, wherein the substance excitable by the excitation light is a substance that dissolves in particles but does not dissolve in a dispersion medium.
粒子を分散媒中に分散した流体を保持する容器と、 前記容器内の流体に対し励起光を照射する照射手段と、 物質の励起強度を測定する励起強度測定手段と、 測定された励起強度から測定対象の粒子の性状を求める
性状検出手段と、 を含む粒子測定装置。8. A container for holding a fluid in which particles dissolving a substance excitable by excitation light are dispersed in a dispersion medium, irradiation means for irradiating the fluid in the container with excitation light, excitation intensity of the substance. A particle measuring apparatus, comprising: an excitation intensity measuring means for measuring a property of the target; and a property detecting means for obtaining a property of a particle to be measured from the measured excitation intensity.
粒子測定装置。9. The particle measuring apparatus according to claim 8, wherein the container is constituted by a pipe through which a fluid flows.
て、 前記励起強度測定手段は、物質から放出される光の強度
を測定する粒子測定装置。10. The particle measuring apparatus according to claim 8, wherein the excitation intensity measuring means measures the intensity of light emitted from the substance.
の装置において、 前記粒子の性状は、粒子の粒子径である粒子測定装置。11. The particle measuring device according to claim 8, wherein the property of the particle is a particle diameter of the particle.
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