JP2002370985A - Therapeutic agent for asthma - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an agent effective for treatment and prophylaxis of asthma. SOLUTION: This therapeutic agent or a prophylactic agent for the asthma comprises one or more kinds of compounds represented by the general formula (I) (wherein, R1 denotes CH2 or the like) and its salt as an active ingredient.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明はメトトレキセート誘
導体を含有する薬剤に関する。さらに詳しくは、喘息の
治療および予防に有効なメトトレキセート誘導体を含有
する薬剤に関する。The present invention relates to a drug containing a methotrexate derivative. More specifically, the present invention relates to a drug containing a methotrexate derivative effective for treating and preventing asthma.

【０００２】[0002]

【従来の技術】気管支喘息は、可逆的気道狭窄、好酸球
を中心とする気道炎症、気道過敏性および気道の器質的
変化（気道リモデリングと呼ばれる）を特徴とする疾患
である。特に、好酸球を主体とする気道炎症は、気道過
敏性および気道リモデリングに関与する病態であること
が報告されている（Ｐｕｅｒｉｎｇｅｒ ＲＪ， Ｈｕ
ｎｎｉｎｇｈａｋｅ ＧＷ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ａｉｒｗａｙ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｉｎ ａｓｔｈｍａ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ １９９
２； ９２： ３２Ｓ−３８Ｓ、 Ｏｈｎｏ Ｉ， Ｎ
ｉｔｔａ Ｙ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ， Ｈｏｓｈ
ｉ Ｈ， Ｈｏｎｍａ Ｍ， Ｗｏｏｌｌｅｙ Ｋ，
Ｏ’Ｂｙｒｎｅ Ｐ， Ｔａｍｕｒａ Ｇ， Ｊｏｒｄ
ａｎａ Ｍ，Ｓｈｉｒａｔａ Ｋ． Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ
１ （ＴＧＦ ｂｅｔａ １） ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｂｙ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ａ
ｓｔｈｍａｔｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔ
ｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ １９９６； １５： ４０４−４０９、
Ｏｈｎｏ Ｉ， Ｎｉｔｔａ Ｙ， Ｙａｍａｇｕｃ
ｈｉ Ｋ， Ｈｏｓｈｉ Ｈ， ＨｏｍｎａＭ， Ｗｏ
ｏｌｌｅｙ Ｋ， Ｏ’Ｂｙｒｎｅ Ｐ， Ｄｏｌｏｖ
ｉｃｈ Ｊ，Ｊｏｒｄａｎａ Ｍ， Ｔａｍｕｒａ
Ｇ． Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅ
ｎｔｉａｌ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ−
ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｂ−ｃ
ｈａｉｎ （ＰＤＧＦ−Ｂ）ｉｎ ｎａｓａｌ ｐｏｌ
ｙｐｏｓｉｓ， ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｔ
ｈｍａ． Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏ
ｌ Ｂｌｏｌ １９９５； １３： ６３９−６４
７）。BACKGROUND OF THE INVENTION Bronchial asthma is a disease characterized by reversible airway stenosis, airway inflammation centered on eosinophils, airway hyperreactivity, and organic changes in the airway (called airway remodeling). In particular, airway inflammation mainly composed of eosinophils has been reported to be a pathological condition involved in airway hyperresponsiveness and airway remodeling (Pueringer RJ, Hu).
ninhake GW. Inflammati
on and airway reactivity
in asthma. Am J Med 199
2: 92: 32S-38S, Ohno I, N
itta Y, Yamaguchi K, Hash
iH, Honma M, Woolley K,
O'Byrne P, Tamura G, Jord
ana M, Shirata K .; Transfo
rming growth factor beta
1 (TGF beta 1) gene express
session by eosinophils in a
sthmatic airway inflammat
ion. Am J Respir Cell Mo
1 Biol 1996; 15: 404-409;
Ohno I, Nita Y, Yamaguc
hi K, Hoshi H, HommaM, Wo
olley K, O'Byrne P, Dolov
ich J, Jordana M, Tamura
G. FIG. Eosinophils as a pote
natural source of platelet-
Derived growth factor B-c
hain (PDGF-B) in nasal pol
yposis, and bronchial ast
hma. Am J Respir Cell Mo
13 Bol 1995; 13: 639-64.
7).

【０００３】抗原曝露の直後に観察される気道収縮反応
による即時型喘息反応（ＩＡＲ）は、肥満細胞からのヒ
スタミンなどのケミカルメディエーター遊離によること
が知られているが、抗原曝露４から８時間後に観察され
る遅発型喘息反応（ＬＡＲ）および気道過敏性の発症に
は、好酸球増多性の気道炎症が重要な役割を有している
ことが推察されている。臨床においても、近年、抗炎症
作用を期待して、ステロイド吸入療法が盛んに取り入れ
られている。[0003] The immediate asthmatic response (IAR) due to the airway constriction observed immediately after antigen exposure is known to be due to the release of chemical mediators such as histamine from mast cells. It is speculated that eosinophilia airway inflammation plays an important role in the observed delayed asthmatic response (LAR) and the development of airway hyperresponsiveness. In clinical practice, in recent years, steroid inhalation therapy has been actively adopted in anticipation of anti-inflammatory effects.

【０００４】葉酸代謝拮抗剤であるメトトレキセート
（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）は、制癌剤とし
て急性白血病、悪性リンパ腫などの治療に用いられてい
るが、免疫抑制剤としても知られており、おもに骨髄移
植における急性移植片宿主反応の予防に用いられてい
る。さらに、低用量のＭＴＸの投与は慢性関節リウマチ
の治療に有効であることも知られている。近年、ＭＴＸ
が、肺組織へのリンパ球や好酸球浸潤の抑制効果、二相
性喘息モデルにおける遅発型喘息反応に対する抑制効果
を示すことが報告されている（日本胸部疾患学会誌、１
９９３；３１（Ｓｕｐｐｌ．），１８５−１９０）。し
かしＭＴＸを長期投与すると骨髄抑制等が生じる可能性
があるため、こうした作用の少ない治療剤の開発が待た
れていた。[0004] Methotrexate (MTX), which is an antifolate, is used as an anticancer drug in the treatment of acute leukemia, malignant lymphoma, etc., but is also known as an immunosuppressant and is mainly used for acute transplantation in bone marrow transplantation. It is used to prevent one-host reactions. Furthermore, it is known that administration of low doses of MTX is effective in treating rheumatoid arthritis. Recently, MTX
Has been reported to show an inhibitory effect on lymphocyte and eosinophil infiltration into lung tissue and an inhibitory effect on late-onset asthmatic response in a biphasic asthma model (Japanese Journal of Thoracic Diseases, 1
993; 31 (Suppl.), 185-190). However, long-term administration of MTX may cause bone marrow suppression and the like, and thus development of a therapeutic agent having a small effect has been awaited.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、優れ
た喘息の治療剤および予防剤を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide excellent therapeutic and prophylactic agents for asthma.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】国際公開ＷＯ９２／０３
４３６号公報に開示されるメトトレキセート誘導体は、
ヒトリンパ球、ラットおよびヒトのケラチノサイト、マ
ウス癌細胞（Ｐ３８８、ｃｏｌｏｎ２６）の増殖を抑制
することが示されており、リウマチ、乾癬および癌の治
療剤として有用であることが示唆されている。さらに、
国際公開ＷＯ９４／１４８１０号公報に開示されるメト
トレキセート誘導体は、リウマチ患者由来の滑膜細胞の
増殖を抑制することが示されており、抗リウマチ剤とし
て有用であることが示唆されている。また、国際公開Ｗ
Ｏ０１／１２１９８号公報に開示されるメトトレキセー
ト誘導体は、心筋梗塞の治療剤あるいは予防剤として有
用であることが示されている。Means for Solving the Problems International Publication WO92 / 03
No. 436 discloses a methotrexate derivative,
It has been shown to suppress the proliferation of human lymphocytes, rat and human keratinocytes, and mouse cancer cells (P388, colon 26), and is suggested to be useful as a therapeutic agent for rheumatism, psoriasis and cancer. further,
The methotrexate derivative disclosed in International Publication WO94 / 14810 has been shown to suppress the proliferation of synovial cells derived from a rheumatic patient, and has been suggested to be useful as an antirheumatic agent. In addition, international publication W
The methotrexate derivative disclosed in O01 / 12198 has been shown to be useful as a therapeutic or preventive agent for myocardial infarction.

【０００７】しかしながら、こうしたメトトレキセート
誘導体が喘息の治療あるいは予防に有効であることにつ
いての記載は全くない。本発明者は鋭意研究を重ねた結
果、ある種のメトトレキセート誘導体またはその塩が、
喘息の治療剤および予防剤として有用であることを見い
だし本発明を完成した。[0007] However, there is no description that such a methotrexate derivative is effective for treating or preventing asthma. The present inventors have conducted intensive studies and as a result, certain methotrexate derivatives or salts thereof,
The present invention has been found to be useful as a therapeutic or prophylactic agent for asthma, and has completed the present invention.

【０００８】すなわち本発明は、一般式（Ｉ）That is, the present invention provides a compound represented by the general formula (I)

【０００９】[0009]

【化３】 （式中、Ｒ₁はＣＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂、ＣＨ₂Ｏ、ＣＨ₂Ｓお
よびＣＨ₂ＳＯからなる群より選ばれた基を示し、Ｒ₂は
水素原子または炭素数１から４の低級アルキル基または
ベンジル基を示し、Ｒ₃は一般式ＣＯＯＲ₄（ここでＲ₄
は水素原子または炭素数１から４の低級アルキル基を示
す）または一般式ＮＨＣＯＲ₅（ここでＲ₅は置換基を有
していてもよいフェニル基を示す）または一般式ＣＯＮ
Ｒ₆Ｒ₇（ここでＲ₆は水素原子または炭素数１から４の
低級アルキル基を示し、Ｒ₇は炭素数１から４の低級ア
ルキル基または置換基を有していてもよいフェニル基ま
たはカルボキシアルキル基または低級アルキルスルホニ
ル基を示す）またはＰＯ₃Ｈ₂またはＳＯ₃Ｈで表される
基を示し、ｎは１から４の整数を示す）で表される化合
物およびその塩の１種または２種以上を有効成分として
含有する喘息の治療剤または予防剤に関する。Embedded image (Wherein, R ₁ represents a group selected from the group consisting of CH ₂ , CH ₂ CH ₂ , CH ₂ O, CH ₂ S and CH ₂ SO, and R ₂ represents a hydrogen atom or a lower group having 1 to 4 carbon atoms. an alkyl group or a benzyl group, R ₃ is the formula COOR ₄ (where R ₄
Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) or the general formula NHCOR ₅ (where R ₅ represents a phenyl group which may have a substituent) or the general formula CON
R ₆ R ₇ (where R ₆ represents a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and R ₇ represents a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a phenyl group which may have a substituent or A carboxyalkyl group or a lower alkylsulfonyl group) or a group represented by PO ₃ H ₂ or SO ₃ H, and n represents an integer of 1 to 4); The present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for asthma containing two or more active ingredients.

【００１０】また、本発明は、一般式（ＩＩ）Further, the present invention provides a compound represented by the general formula (II):

【００１１】[0011]

【化４】 （式中、Ｒ₈、Ｒ₉は同一または異なって、水素原子また
は炭素数１から４の低級アルキル基を示す）で表される
化合物およびその塩の１種または２種以上を有効成分と
して含有する喘息の治療剤または予防剤に関する。Embedded image (Wherein, R ₈ and R ₉ are the same or different and each represent a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) and one or more salts thereof as an active ingredient. The present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for asthma.

【００１２】また、本発明は、上述の一般式（Ｉ）また
は（ＩＩ）で表される化合物およびその塩の１種または
２種以上を使用する、喘息の治療方法または予防方法に
関する。例えば、こうした治療または予防を必要とする
対象に対して、治療上または予防上の有効量の一般式
（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物およびその塩の
１種または２種以上を投与するステップを含む方法に関
する。The present invention also relates to a method for treating or preventing asthma, using one or more of the compounds represented by the above general formula (I) or (II) and salts thereof. For example, to a subject in need of such treatment or prevention, a therapeutically or prophylactically effective amount of one or more compounds of the formula (I) or (II) and salts thereof is administered. A method comprising the steps of:

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】本発明において、低級アルキル基
とは、特に炭素数の限定がない場合は炭素数１から６の
直鎖又は分岐鎖状のアルキル基を示し、好ましくはメチ
ル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ
−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒ
ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等を示
す。また、炭素数１から４の低級アルキル基としては、
メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル
基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、
ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, a lower alkyl group means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms unless there is a particular limitation on the number of carbon atoms. Group, n-propyl group, isopropyl group, n
-Butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, ter
and t-butyl, n-pentyl, n-hexyl and the like. Further, as the lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms,
Methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group,
A tert-butyl group is exemplified.

【００１４】置換基を有していてもよいフェニル基にお
ける置換基とは、低級アルキル基、水酸基、アミノ基、
ハロゲノ基、シアノ基、低級アルキルオキシ基、メルカ
プト基、アシル基、アシルオキシ基、フェニル基、カル
ボキシル基、低級アルキルオキシカルボニル基等であり
好ましくはカルボキシル基、低級アルキルオキシカルボ
ニル基等である。The substituent in the optionally substituted phenyl group includes a lower alkyl group, a hydroxyl group, an amino group,
Examples include a halogeno group, a cyano group, a lower alkyloxy group, a mercapto group, an acyl group, an acyloxy group, a phenyl group, a carboxyl group, and a lower alkyloxycarbonyl group, and preferably a carboxyl group and a lower alkyloxycarbonyl group.

【００１５】カルボキシアルキル基とは、１以上のカル
ボキシル基で置換された低級アルキル基を示し、好まし
くは１つのカルボキシル基で置換された低級アルキル基
があげられ、さらに好ましい例としては、たとえば、３
−カルボキシプロピル基などがあげられる。The carboxyalkyl group refers to a lower alkyl group substituted by one or more carboxyl groups, preferably a lower alkyl group substituted by one carboxyl group, and more preferably, for example, 3
-Carboxypropyl group and the like.

【００１６】低級アルキルスルホニル基の好ましい例と
してはたとえばメタンスルホニル基などがあげられる。
本発明の化合物は通常の方法により塩の形にして用いる
こともできる。用いられる塩としては例えば、塩酸塩、
臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など
の無機酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、酢酸塩、マレイ
ン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、マン
デル酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、メタンスルホン
酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸
塩など有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシ
ウム塩などの金属塩があげられ、好ましくは無機酸塩ま
たは有機酸塩であり、さらに好ましくは、臭化水素酸塩
またはメタンスルホン酸塩である。Preferred examples of the lower alkylsulfonyl group include a methanesulfonyl group.
The compound of the present invention can be used in the form of a salt by a conventional method. Examples of the salt used include hydrochloride,
Inorganic acid salts such as hydrobromide, hydroiodide, sulfate, phosphate, succinate, malonate, acetate, maleate, fumarate, citrate, gluconate And organic salts such as mandelate, benzoate, salicylate, methanesulfonate, benzenesulfonate, and p-toluenesulfonate, and metal salts such as sodium salt, potassium salt, and magnesium salt. Is an inorganic acid salt or an organic acid salt, more preferably a hydrobromide or a methanesulfonate.

【００１７】本発明の治療剤の好ましい化合物の例とし
てはたとえば国際公開ＷＯ９２／０３４３６号公報およ
び国際公開ＷＯ９４／１４８１０号公報の実施例に記載
されている化合物があげられ、さらに好ましい例として
は、国際公開ＷＯ９４／１４８１０号公報の実施例に記
載されている化合物があげられる。最も好ましい例とし
ては、国際公開ＷＯ９４／１４８１０号公報の実施例に
化合物１として記載されている化合物があげられる。Examples of preferred compounds for the therapeutic agent of the present invention include, for example, compounds described in Examples of International Publication WO92 / 03436 and International Publication WO94 / 14810, and more preferred examples are Examples of the compound include those described in Examples of International Publication WO94 / 14810. The most preferred example is the compound described as compound 1 in the examples of WO94 / 14810.

【００１８】本発明の喘息の治療剤または予防剤の投与
経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与（静脈
内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、経気道投
与、皮内投与、皮下投与など）でもよい。好ましくは経
口投与が挙げられる。The administration route of the therapeutic or prophylactic agent for asthma of the present invention is not particularly limited, and may be oral administration or parenteral administration (intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, transdermal administration, transtracheal administration, transdermal administration, Internal administration, subcutaneous administration, etc.). Preferably, oral administration is mentioned.

【００１９】本発明の喘息の治療剤または予防剤を使用
する場合には、製薬上許容しうる担体、賦型剤、崩壊
剤、滑沢剤、結合剤、香料、着色剤等とともに、適当な
剤型に製剤化して用いるのが好ましく、そのような剤型
としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、散剤、
注射剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、経皮吸収剤、吸入剤、
軟膏、ローション、坐剤等が挙げられる。経口的に投与
する場合の剤形としては、たとえば国際公開ＷＯ００／
００４９２号公報に開示される剤形等が好ましく、同公
報に開示される方法などにより調製することができる。When the therapeutic or prophylactic agent for asthma of the present invention is used, it may be used together with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, disintegrant, lubricant, binder, flavor, coloring agent and the like. It is preferable to use it by formulating it into a dosage form, and such dosage forms include tablets, granules, fine granules, capsules, powders,
Injections, solutions, suspensions, emulsions, transdermal absorbers, inhalants,
Ointments, lotions, suppositories and the like. As a dosage form for oral administration, for example, WO 00 /
The dosage form disclosed in JP-A-00492 is preferable, and can be prepared by the method disclosed in the publication.

【００２０】投与量は、疾患の種類、患者の体重、症状
などにより異なるが、性別、また、投与経路、剤型等に
より適宜選択することができるが、一般的に経口剤の場
合は、通常、有効成分として、０．０１から１００ｍｇ
／日／人であり、１日１〜３回に分けて使用することが
できる。The dose varies depending on the type of the disease, the weight of the patient, the symptoms and the like, but can be appropriately selected depending on the sex, the administration route, the dosage form, and the like. , As an active ingredient, 0.01 to 100 mg
/ Day / person and can be used once to three times a day.

【００２１】[0021]

【実施例】以下に実施例を示して本発明をより詳細に説
明する。なお、実施例では本発明の薬物として、Ｎ−
（１−（（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチ
ル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾチアジ
ン−７−カルボニル）−Ｌ−α−アミノアジピン酸（以
下、ＭＸ−６８と称する）The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. In Examples, N- as a drug of the present invention was used.
(1-((2,4-diamino-6-pteridinyl) methyl) -3,4-dihydro-2H-1,4-benzothiazine-7-carbonyl) -L-α-aminoadipic acid (hereinafter referred to as MX-68) Is called)

【００２２】[0022]

【化５】 を用いた。Embedded image Was used.

【００２３】また、各実施例の成績は平均値±標準誤差
で示した。独立２標本間の有意差検定は、Ｆ検定により
分散の均一性を検討し、等分散の場合はＳｔｕｄｅｎ
ｔ'ｓｔ−ｔｅｓｔを、不等分散の場合はＭａｎｎ−Ｗ
ｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔを用いて行った。The results of each example are shown as the average value ± standard error. The significant difference test between two independent samples is performed by examining the uniformity of variance by F-test.
t'st-test is Mann-W for unequal variance
The test was performed using a hitney test.

【００２４】多群間有意差検定は、Ｂａｒｔｌｅｔｔ法
により等分散性の検定を行った。分散が一様の場合は一
元配置分散分析を実施し、その結果、有意差が認められ
た場合はｐａｒａｍｅｔｒｉｃ型Ｄｕｎｎｅｔｔの多重
比較検定により平均値の比較を行った。分散が等しくな
い場合にはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの検定を行
い、その結果、有意差が認められた場合はｎｏｎ−ｐａ
ｒａｍｅｔｒｉｃ型のＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定に
より平均値の比較を行った。危険率は（Ｐ）５％未満を
もって有意差ありとした。 （実施例１）マウスの気道炎症および気道過敏性に対す
る本願の薬物の影響 発明者は、マウスを用いた抗原反復吸入による実験的気
道過敏性モデルを作成し、現在までに種々の検討を行っ
てきた（Ｎａｇａｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ， Ｔｉｍｅ
ｃｏｕｒｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｉ
ｎｄｕｃｅｄａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖ
ｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌ
ｕｂｌｅ ＩＬ−５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ １９９４； ５４： ＰＬ４７１−４７５；
Ｎａｇａｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ， Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃ
ｔ ｏｆ ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ｍｏｎｏｃｒｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｏｎ ａｉｒｗａｙ ｈｙｐ
ｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｃｅｔｙｌｃｈｏ
ｌｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａ
ｌｌｅｒｇｙ１９９７； ２７： ２１８−２２４；Ｔ
ａｎａｋａ Ｈ， ｅｔ ａｌ， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＩＬ−５
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉ
ｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ
ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ １９９８；６
２ ＰＬ１６９−１７４）。本モデルでは、抗原反復吸
入により、気管支喘息の特徴的な病態である気道反応性
の亢進、好酸球を中心とする炎症性細胞の浸潤および血
清中抗原特異的ＩｇＥ値の上昇が認められる。The test for significant difference between multiple groups was performed by the Bartlett method to test for equal variance. If the variance was uniform, a one-way analysis of variance was performed. As a result, if a significant difference was observed, the average value was compared by a parametric Dunnett's multiple comparison test. If the variances are not equal, a Kruskal-Wallis test is performed. As a result, if a significant difference is observed, non-pa
Mean values were compared by a rametic Dunnett's multiple comparison test. The risk ratio was determined to be significantly different when (P) was less than 5%. (Example 1) Effect of the drug of the present application on airway inflammation and airway hyperreactivity in mice The present inventors have created an experimental airway hypersensitivity model by repeated inhalation of antigens using mice, and have been conducting various studies to date. (Nagai H, et al, Time
course study of antigen-i
nseducairway hyperreactive
ity and the effect of sol
uble IL-5 receptor. Life
Sci 1994; 54: PL471-475;
Nagai H, et al, The effect
t of anti-IL-4 monochronal
antibody, rapamycin and i
interferon-γ on airway hyp
erreactivity to acetylcho
line in mice. Clin Exp A
llergy 1997; 27: 218-224; T
anaka H, et al, Effect of
anti-IL-4 and anti-IL-5
antibodies on allergy ai
rway hyperresponsiveness
in mice. Life Sci 1998; 6
2 PL169-174). In this model, repetitive inhalation of antigens shows an increase in airway reactivity, infiltration of inflammatory cells, mainly eosinophils, and an increase in serum antigen-specific IgE levels, which are characteristic pathologies of bronchial asthma.

【００２５】（１） 実験動物 雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢）を、温度２２±１
℃、湿度６０±５％の恒温飼育室で、自由給水下に固形
飼料を用いて１週間以上予備飼育した後、実験に用い
た。(1) Experimental animals Male BALB / c mice (7 weeks old) were cultured at a temperature of 22 ± 1.
The animals were preliminarily reared for 1 week or more using a solid feed under free water supply in a constant temperature breeding room at 60 ° C. and a humidity of 60 ± 5%, and then used for experiments.

【００２６】（２） 試薬 市販のオーバルミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＡ、５×
Ｃｒｙｓｔ．（５回再結晶による精製を行ったもの）
ｃｈｉｃｋｅｎ； 生化学工業）、塩化アセチルコリン
（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａ
ｃｈ、ナカライテスク）、ペントバルビタールナトリウ
ム（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ ｓｏｄｉｕｍ、Ａｂ
ｂｏｔｔ）、ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ）、酢酸プレドニゾロ
ン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ、塩野
義製薬）、臭化パンクロニウム（ｐａｎｃｕｒｏｎｉｕ
ｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ）、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）（和光純薬工業株式会社）を使用した。Ｍ
Ｘ−６８は、特開平６−２３９８６３号公報に記載の方
法で中外製薬において製造した。(2) Reagents Commercially available ovalbumin (Ovalbumin, OA, 5 ×)
Cryst. (Purified by recrystallization 5 times)
chicken; Seikagaku Corporation, acetylcholine chloride, A
ch, Nacalai Tesque), sodium pentobarbital (Pentobarbital sodium, Ab)
boott), MTX (Sigma), prednisolone acetate (prednisone acetic acid, Shionogi & Co., Ltd.), pancuronium bromide (pancuroniu)
mbromide, Sigma) and bovine serum albumin (BSA) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were used. M
X-68 was produced by Chugai by the method described in JP-A-6-239863.

【００２７】（３） 感作および抗原反復吸入 ５０μｇのＯＡおよびアジュバントとして１ｍｇの水酸
化アルミニウムを含む生理食塩水溶液０．５ｍｌを１２
日間隔でマウスの腹腔内に２回注射して、能動的に感作
した。初回感作の２２日後より、抗原吸入を４日おきに
計３回繰り返し、反応を惹起した。抗原吸入は、１％Ｏ
Ａ生理食塩水溶液を超音波ネブライザー（ＵＮ−７０
１、アズウェル社製、流速３ｍｌ／ｍｉｎ、平均粒子径
４．０−５．０μｍ）を用いて３０分間吸入させること
で行った。(3) Sensitization and repeated inhalation of antigen 0.5 ml of a physiological saline solution containing 50 μg of OA and 1 mg of aluminum hydroxide as an adjuvant was added.
Mice were actively sensitized with two intraperitoneal injections at daily intervals. From 22 days after the first sensitization, antigen inhalation was repeated three times in total every four days to elicit a reaction. Antigen inhalation is 1% O
A saline solution is ultrasonically nebulized (UN-70
1. Inhalation was performed for 30 minutes using Aswell Co., Ltd., flow rate 3 ml / min, average particle diameter 4.0-5.0 μm).

【００２８】マウスを６群に分け、それぞれ、０．１ｍ
ｇ／ｋｇのＭＸ−６８を投与する群（６匹）、０．３ｍ
ｇ／ｋｇのＭＸ−６８を投与する群（６匹）、１．０ｍ
ｇ／ｋｇのＭＸ−６８を投与する群（７匹）、０．３ｍ
ｇ／ｋｇのＭＴＸを投与する群（６匹）、５ｍｇ／ｋｇ
の酢酸プレドニゾロンを投与する群（７匹）、投薬を行
わない陽性コントロール群（感作ＯＡ吸入群、Ｓ−ＯＡ
群、７匹）とした。Ｓ−ＯＡ群を除き、初回抗原吸入の
前日より１０日間連続で１日１回経口で投薬した。抗原
吸入日の各群の投薬は、抗原吸入の１時間前に行った。
さらに、ＯＡ感作および投薬のいずれも行わない６匹の
マウスを、陰性コントロール群（非感作ＯＡ吸入群、Ｎ
Ｓ−ＯＡ群）として、抗原吸入のみを行った。The mice were divided into six groups, each of which was 0.1 m
g / kg MX-68 administration group (6 animals), 0.3 m
g / kg of MX-68 (6 animals), 1.0 m
g / kg of MX-68 (7 animals), 0.3 m
g / kg MTX administration group (6 animals), 5 mg / kg
Group (7 animals) to which no prednisolone acetate was administered, a positive control group where no drug was administered (sensitized OA inhalation group, S-OA
Group, 7 animals). Except for the S-OA group, the mice were orally dosed once a day for 10 consecutive days from the day before the first antigen inhalation. Dosing of each group on the day of antigen inhalation was performed one hour before antigen inhalation.
In addition, 6 mice without any OA sensitization or administration were treated with a negative control group (non-sensitized OA inhalation group, N
(S-OA group), only antigen inhalation was performed.

【００２９】投薬開始から終了までの各マウスの体重を
測定した。結果を図１、２に示す。図から明らかなよう
に、いずれのＭＸ−６８投与群およびＭＴＸ投与群にお
いても、顕著な体重変化は認められなかった。一方、プ
レドニゾロン投与群において、有意な体重減少が認めら
れた。The weight of each mouse was measured from the start to the end of the administration. The results are shown in FIGS. As is clear from the figure, no significant change in body weight was observed in any of the MX-68 administration groups and the MTX administration groups. On the other hand, significant weight loss was observed in the prednisolone-administered group.

【００３０】（４） アセチルコリン（Ａｃｈ）に対す
る気道反応性の測定 気道反応性の測定は、Ｋｏｎｚｅｔｔ ＆ Ｒｏｓｓｌ
ｅｒ法（Ｋｏｎｚｅｔｔ Ｈ，ｅｔ ａｌ、 Ｖｅｒｓ
ｕｃｈｓａｎｏｒｄｈｕｎｇ ｚｕ Ｕｎｔｅｒｓｕｃ
ｈｕｎｇｅｎ ａｎｄｅｒ Ｂｒｏｎｃｈｉａｌｍｕｓ
ｋｕｌｔｕｒ．Ａｒｃｈ Ｅｘｐ Ｐａｃｈ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ １９４０； １９５：７１−７７）を一部
改変した方法で行った（Ｔａｎａｋａ Ｈ，ｅｔ ａ
ｌ、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ａｎｄ
ａｎｔｉ−ＩＬ−５ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ
ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐ
ｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉ １９９８；６２ ＰＬ１６９−１７４）。(4) Measurement of Airway Reactivity to Acetylcholine (Ach) Measurement of airway reactivity was performed according to Konzet & Rossl.
er method (Konzet H, et al, Vers
uchsanordhung zu Untersuc
hungen ander Bronchialmus
kultur. Arch Exp Pach Phar
macol 1940; 195: 71-77) by a partially modified method (Tanaka H, et a).
1, Effect of anti-IL-4 and
anti-IL-5 antibodies on
allic airway hyperresp
onsiveness in mice. Life
Sci 1998; 62 PL169-174).

【００３１】概説すると、初回感作の３１日後、すなわ
ち最終抗原吸入の２４時間後、ペントバルビタールナト
リウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）麻酔下に、各群
のマウスの気管および頸静脈にカニューレを挿入した。
頸静脈のカニューレを介して、臭化パンクロニウム
（０．１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し自発呼吸を停止さ
せた。その後、人工呼吸（換気量０．６ｍｌ／匹および
呼吸数６０回／分）の下に、３１．２５から２０００μ
ｇ／ｋｇのＡｃｈ生理食塩水溶液を、頸静脈のカニュー
レを介して静脈内に注射し、生じる気道収縮を測定し
た。気道収縮の変化は、気管を完全に閉塞した場合の最
大オーバーフロー量に対する百分率で表した。また、得
られたＡｃｈの用量反応曲線から得られた曲線下面積
（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ： ＡＵ
Ｃ）およびＰＤ２０（ｐｒｏｖｏｃａｔｉｖｅ ｄｏｓ
ｅ ２０： ２０％の気道収縮反応を示すＡｃｈ用量）
を算出し、これをＡｃｈに対する気道反応性の指標とし
て用いた（Ｎａｇａｉ Ｈ，ｅｔａｌ． Ｔｈｅ ｅｆ
ｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ｍｏｎｏｃｒｏ
ｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａ
ｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｏｎ ａｉｒｗａｙ
ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｃｅｔｙ
ｌｃｈｏｌｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘ
ｐ Ａｌｌｅｒｇｙ１９９７； ２７： ２１８−２２
４）。結果を図３、４に示す。Briefly, 31 days after the first sensitization, ie, 24 hours after the final inhalation of the antigen, cannulae were injected into the trachea and jugular vein of each group of mice under pentobarbital sodium (60 mg / kg, intraperitoneal) anesthesia. Inserted.
Pancuronium bromide (0.1 mg / kg) was administered intravenously via the jugular vein cannula to stop spontaneous breathing. Then, under artificial respiration (ventilation volume: 0.6 ml / animal and respiration rate: 60 breaths / min), 31.25 to 2000 μ
g / kg of Ach saline solution was injected intravenously via the jugular vein cannula and the resulting airway constriction was measured. Changes in airway constriction were expressed as a percentage of the maximum overflow when the trachea was completely obstructed. In addition, the area under the curve obtained from the obtained dose response curve of Ach (area under the curve: AU)
C) and PD20 (provocative dos)
e 20: Ach dose showing 20% airway constriction response)
Was used as an index of airway responsiveness to Ach (Nagai H, et al. The ef).
fact of anti-IL-4 monocro
nal antibody, rapamycin a
nd interferon-γ on airway
hyperreactivity to activity
lcholine in mice. Clin Ex
p Allergy 1997; 27: 218-22
4). The results are shown in FIGS.

【００３２】図から明らかなように、非感作ＯＡ吸入群
（ＮＳ−ＯＡ）に比し、感作ＯＡ吸入群（Ｓ−ＯＡ）で
は抗原反復吸入による気道反応性の亢進が認められた。
これに対し、ＭＸ−６８は気道反応性の亢進を用量依存
的に抑制し、いずれの用量においても有意な抑制が認め
られた。一方、対照薬として用いたＭＴＸおよびプレド
ニゾロンも同様に気道反応性の亢進を有意に抑制した。As is apparent from the figure, compared with the non-sensitized OA inhalation group (NS-OA), the airway responsiveness was enhanced in the sensitized OA inhalation group (S-OA) by repeated inhalation of the antigen.
In contrast, MX-68 suppressed the enhancement of airway responsiveness in a dose-dependent manner, and significant suppression was observed at any dose. On the other hand, MTX and prednisolone used as control drugs also significantly suppressed the enhancement of airway responsiveness.

【００３３】（５） 気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ） Ａｃｈに対する気道反応性の測定終了後に、気管支肺胞
洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇ
ｅ ｆｌｕｉｄ、ＢＡＬＦ）の採取をＴａｎａｋａらの
方法（Ｔａｎａｋａ Ｈ， ｅｔ ｌ． Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＩＬ
−５ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ａｌｌｅｒｇｉｃ
ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅ
ｓｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ １９９
８； ６２ ＰＬ１６９−１７４）を一部改変して行っ
た。概説すると、装着した気管カニューレを介して、
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５
ｍＭ ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（以
下、ＢＡＬ液と記す）０．５ｍｌを用いて、注入、吸引
する操作を４回繰り返して、マウスの気道内を洗浄し、
ＢＡＬ液を回収した。この洗浄を３回行い、回収された
３回分のＢＡＬ液を合わせてＢＡＬＦとして使用した。
採取したＢＡＬＦは、直ちに４℃で１５０×ｇ、１０分
間遠心し、得られた細胞を０．５ｍｌのＢＡＬ液に浮遊
させた。この細胞浮遊液５０μｌに１５０μｌのチュー
ク（Ｔｕｒｋ）液（和光純薬）を加えて染色し、ＢＡＬ
Ｆ中の総白血球数を顕微鏡下（×４００）に測定した。
ついで、サイトスピンＩＩ（ＣＹＴＯＳＰＩＮ ＩＩ、
Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いて、室温にて３００ｒｐｍで４
分間遠心し、塗沫標本を作製した。この標本をディフク
イック（Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ）染色（国際試薬）し、
顕微鏡下（×４００）に約３００個の白血球を調べて、
その中に含まれるマクロファージ、好中球、好酸球およ
びリンパ球の数をそれぞれカウントした。得られた成績
は、ＢＡＬＦ中に存在する総細胞数として表した。結果
を図５〜９に示す。(5) Bronchoalveolar lavage fluid (BALF) After measurement of airway reactivity to Ach, bronchoalveolar lavage fluid (bronchoalveolar lavag)
e fluid, BALF) was collected according to the method of Tanaka et al. (Tanaka H, et l. Effect).
of anti-IL-4 and anti-IL
-5 antibodies on allergic
airway hyperresponsivene
ss in mice. Life Sci 199
8; 62 PL169-174). Briefly, through the attached tracheal cannula,
0.1% bovine serum albumin (BSA) and 0.05
Using 0.5 ml of a phosphate buffer solution (PBS) containing mM EDTA (hereinafter referred to as BAL solution), the operation of injecting and aspirating was repeated four times to wash the airway of the mouse,
The BAL solution was collected. This washing was performed three times, and the collected BAL solutions for the three times were combined and used as BALF.
The collected BALF was immediately centrifuged at 4 ° C. at 150 × g for 10 minutes, and the obtained cells were suspended in 0.5 ml of a BAL solution. To 50 μl of the cell suspension, 150 μl of Turk's solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stained.
The total leukocyte count in F was measured under a microscope (x400).
Then, Cytospin II (CYTOSPIN II,
(Shandon) at room temperature at 300 rpm.
After centrifugation for minutes, a smear was prepared. The specimen is subjected to Diff Quick staining (international reagent),
Check about 300 white blood cells under a microscope (× 400)
The numbers of macrophages, neutrophils, eosinophils and lymphocytes contained therein were counted respectively. The results obtained were expressed as the total number of cells present in BALF. The results are shown in FIGS.

【００３４】図から明らかなように、非感作ＯＡ吸入群
に比し、感作ＯＡ吸入群では抗原反復吸入によりＢＡＬ
Ｆ中の白血球総数、マクロファージ数、好酸球数および
リンパ球数の有意な増加が認められた。これに対し、Ｍ
Ｘ−６８はＢＡＬＦ中の炎症性細胞数の増加を用量依存
的に抑制し、０．１ｍｇ／ｋｇ投与群ではＢＡＬＦ中の
白血球総数の増加を、０．３および１ｍｇ／ｋｇ投与群
ではＢＡＬＦ中の白血球総数、好酸球数およびリンパ球
数の増加を有意に抑制した。一方、対照薬としたＭＴＸ
投与群では、ＢＡＬＦ中の白血球総数の増加のみ有意な
抑制が認められた。また、同じく対照薬としたプレドニ
ゾロンは、ＢＡＬＦ中の白血球総数、マクロファージ
数、好酸球数およびリンパ球数の増加を有意に抑制し
た。As is clear from the figure, the BAL was obtained by repeated inhalation of the antigen in the sensitized OA inhalation group compared to the non-sensitized OA inhalation group.
A significant increase in the number of leukocytes, the number of macrophages, the number of eosinophils and the number of lymphocytes in F was observed. In contrast, M
X-68 suppressed the increase in the number of inflammatory cells in BALF in a dose-dependent manner, and increased the total number of leukocytes in BALF in the 0.1 mg / kg group and the BALF in the 0.3 and 1 mg / kg groups. Increased the total number of leukocytes, eosinophils and lymphocytes significantly. On the other hand, MTX as a control drug
In the administration group, significant suppression was observed only in the increase in the total number of leukocytes in BALF. Prednisolone, which was also a control drug, significantly suppressed the increase in the number of leukocytes, macrophages, eosinophils and lymphocytes in BALF.

【００３５】（６） ＢＡＬＦ中サイトカインの定量 ＢＡＬＦ中に遊離したインターロイキン−４（ＩＬ−
４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）およびインタ
ーフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の量は、市販の酵素結合
免疫吸着法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）キット（Ｅ
ｎｄｏｇｅｎ）により定量した。結果を図１０〜１２に
示す。(6) Quantification of cytokines in BALF Interleukin-4 (IL-
4) The amounts of interleukin-5 (IL-5) and interferon-γ (IFN-γ) were determined by a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immun).
sorbent assay, ELISA) kit (E
ndogen). The results are shown in FIGS.

【００３６】図１０から明らかなように、感作ＯＡ吸入
群においては、非感作ＯＡ吸入群に比し、ＢＡＬＦ中Ｉ
Ｌ−４量の有意な増加が認められた。これに対し、ＭＸ
−６８はＢＡＬＦ中ＩＬ−４量の増加を用量依存的に抑
制し、いずれの用量においても有意な抑制が認められ
た。一方、対照薬として用いたＭＴＸおよびプレドニゾ
ロンも同様にＢＡＬＦ中１Ｌ−４量の増加を有意に抑制
した。As is clear from FIG. 10, the sensitized OA inhalation group had a higher BALF I than the non-sensitized OA inhalation group.
A significant increase in the amount of L-4 was observed. In contrast, MX
-68 inhibited the increase in IL-4 level in BALF in a dose-dependent manner, and significant inhibition was observed at all doses. On the other hand, MTX and prednisolone used as control drugs also significantly inhibited the increase in the amount of 1L-4 in BALF.

【００３７】図１１から明らかなように、非感作ＯＡ吸
入群ではＢＡＬＦ中のＩＬ−５は検出されなかった。一
方、感作ＯＡ吸入群では、感作およびその後の抗原反復
吸入によりＢＡＬＦ中ＩＬ−５量の増加が認められた。
これに対し、ＭＸ−６８はＢＡＬＦ中ＩＬ−５量の増加
を用量依存的に抑制し、いずれの用量においても有意な
抑制が認められた。一方、対照薬として用いたＭＴＸお
よびプレドニゾロンも同様にＢＡＬＦ中のＩＬ−５量の
増加を有意に抑制した。As apparent from FIG. 11, no IL-5 was detected in BALF in the non-sensitized OA inhalation group. On the other hand, in the sensitized OA inhalation group, the amount of IL-5 in BALF was increased by sensitization and subsequent repeated inhalation of the antigen.
In contrast, MX-68 dose-dependently suppressed the increase in the amount of IL-5 in BALF, and significant suppression was observed at all doses. On the other hand, MTX and prednisolone used as control drugs also significantly suppressed the increase in the amount of IL-5 in BALF.

【００３８】図１２から明らかなように、非感作ＯＡ吸
入群に比し、感作ＯＡ吸入群においてＢＡＬＦ中ＩＦＮ
−γ量の有意な減少が認められた。ＭＸ−６８はＢＡＬ
Ｆ中ＩＦＮ−γ量の減少に対し影響を及ぼさなかった。
一方、対照薬として用いたＭＴＸおよびプレドニゾロン
も同様に、ＢＡＬＦ中ＩＦＮ−γ量の減少に対し影響を
及ぼさなかった。As is clear from FIG. 12, IFN in BALF was higher in the sensitized OA inhalation group than in the non-sensitized OA inhalation group.
-A significant decrease in the amount of γ was observed. MX-68 is BAL
It had no effect on the decrease in the amount of IFN-γ in F.
On the other hand, MTX and prednisolone used as control drugs also did not affect the decrease in the amount of IFN-γ in BALF.

【００３９】（７） 免疫グロブリン量の測定 初回感作直前、２回目の感作直前、１回目の抗原吸入直
前および３回目の抗原吸入直前に各群のマウスの眼底静
脈叢から採血した。各マウスの血清中の、抗原特異的Ｉ
ｇＥ抗体量、総ＩｇＥ抗体量および総ＩｇＧ抗体量を、
ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。以下に、それぞれのＥ
ＬＩＳＡ法を示す。(7) Measurement of Immunoglobulin Amount Immediately before the first sensitization, immediately before the second sensitization, immediately before the first antigen inhalation, and immediately before the third antigen inhalation, blood was collected from the fundus venous plexus of each group of mice. Antigen-specific I in serum of each mouse
gE antibody amount, total IgE antibody amount and total IgG antibody amount,
It was measured using an ELISA method. Below, each E
The LISA method is shown.

【００４０】（ｉ） 抗原（ＯＡ）特異的ＩｇＥ抗体量
の測定 抗原（ＯＡ）特異的ＩｇＥ抗体量はＮａｇａｉらの方法
（Ｎａｇａｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃ
ｔ ｏｆ ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ｍｏｎｏｃｒｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｎｄ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｏｎ ａｉｒｗａｙ ｈｙ
ｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｃｅｔｙｌｃｈ
ｏｌｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａ
ｌｌｅｒｇｙ １９９７； ２７： ２１８−２２４）
に従って定量した。すなわち、９６ウエルのプレート
（ＮＵＮＣ ＩＭＭＵＮＯＰＬＡＴＥ Ｉ： Ｎｕｎ
ｃ）に、５μｇ／ｍｌのモノクロナル抗マウスＩｇＥ抗
体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を含むＰＢＳ希釈液を１００μｌ
／ｗｅｌｌで分注し、４℃にて１晩反応させてプレート
をコートした。その後、各ウエルを０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０−ＰＢＳ（−）（Ｃａ²⁺及びＭｇ²⁺を含まない）
（洗浄用バッファー）にて５回洗浄し、１％ＢＳＡ（和
光純薬工業株式会社）−ＰＢＳを１５０μｌ／ｗｅｌｌ
で加え、室温にて１時間インキュベートした。ついで、
洗浄用バッファーにて５回洗浄し、マウスの血清サンプ
ルを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、室温にて１時間イ
ンキュベートした。同時に、標準曲線作成用として、あ
らかじめ総ＩｇＥ抗体量測定の系で定量したモノクロナ
ル抗−ＯＡ ＩｇＥ抗体を、１％ＢＳＡ−０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（希釈バッファー）で各種濃度に
希釈して、同一プレートの別のウエルに加えた。各ウエ
ルを洗浄バッファーで５回洗浄した後、希釈バッファー
で５０倍に希釈したビオチン標識ＯＡを１００μｌ／ｗ
ｅｌｌで加え、さらに室温で１時間インキュベートし
た。各ウエルを、洗浄バッファーで５回洗浄し、希釈バ
ッファーで３０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合
ストレプトアビジン（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＤＡＫＯ）を
１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、さらに室温で１時間イン
キュベートした。各ウエルを、洗浄バッファーで５回洗
浄し、基質溶液（０．１Ｍ クエン酸、０．２Ｍ Ｎａ
ＨＰＯ₄、Ｏ−フェニレンジアミン、および３０％Ｈ₂Ｏ
₂を含む）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加えて、室温暗所
にて約３０分間反応させた後、プレートの各ウエルの吸
光度を４９２ｎｍで測定した。結果を図１３、１４に示
す。(I) Measurement of the amount of antigen (OA) -specific IgE antibody The amount of antigen (OA) -specific IgE antibody was determined by the method of Nagai et al. (Nagai H, et al. The effect).
t of anti-IL-4 monochronal
antibody, rapamycin and
interferon-γ on airway hy
perreactivity to acetylch
oline in mice. Clin Exp A
llergy 1997; 27: 218-224).
Quantified according to That is, a 96-well plate (NUNC IMMUNOPLATE I: Nun
c) 100 μl of a PBS dilution containing 5 μg / ml of a monoclonal anti-mouse IgE antibody (Serotec)
/ Well, and reacted at 4 ° C. overnight to coat the plate. Then, each well was put in 0.1% Tween.
20-PBS (-) (excluding Ca ²⁺ and Mg ²⁺ )
(Washing buffer) 5 times, 1% BSA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)-PBS 150 μl / well
And incubated at room temperature for 1 hour. Then
After washing five times with a washing buffer, a mouse serum sample was added at 100 μl / well, and incubated at room temperature for 1 hour. At the same time, for the preparation of a standard curve, the monoclonal anti-OA IgE antibody quantified in advance by a total IgE antibody amount measurement system was compared with 1% BSA-0.1% T
It was diluted to various concentrations with ween 20-PBS (dilution buffer) and added to another well of the same plate. After each well was washed 5 times with a washing buffer, 100 μl / w of biotin-labeled OA diluted 50-fold with a dilution buffer was used.
and further incubated for 1 hour at room temperature. Each well was washed 5 times with a washing buffer and diluted 3000 times with a diluting buffer. Peroxidase-conjugated streptavidin (peroxidase conj).
ugged streptavidin DAKO) was added at 100 μl / well, and the mixture was further incubated at room temperature for 1 hour. Each well was washed 5 times with a washing buffer, and the substrate solution (0.1 M citric acid, 0.2 M Na
HPO _4, O-phenylene diamine, and 30% H ₂ O
₂ ) was added at 100 μl / well, and the mixture was reacted at room temperature in a dark place for about 30 minutes, and then the absorbance of each well of the plate was measured at 492 nm. The results are shown in FIGS.

【００４１】図から明らかなように、非感作ＯＡ吸入群
では実験期間中、血清中の抗原特異的ＩｇＥは検出され
なかった。一方、感作ＯＡ吸入群では感作およびその後
の抗原反復吸入により血清中の抗原特異的ＩｇＥ値の上
昇が認められた。これに対し、ＭＸ−６８は血清中の抗
原特異的ＩｇＥ値の上昇を用量依存的に抑制し、１ｍｇ
／ｋｇの用量においては血清中の抗原特異的ＩｇＥ値の
上昇を有意に抑制した。一方、対照薬として用いたＭＴ
Ｘおよびプレドニゾロンも同様に血清中の抗原特異的Ｉ
ｇＥ値の上昇を有意に抑制した。As is clear from the figure, in the non-sensitized OA inhaled group, no antigen-specific IgE was detected in the serum during the experiment. On the other hand, in the sensitized OA inhalation group, an increase in the antigen-specific IgE value in the serum was observed by sensitization and subsequent repeated inhalation of the antigen. On the other hand, MX-68 dose-dependently suppressed the elevation of antigen-specific IgE levels in serum,
/ Kg dose significantly suppressed the rise of serum antigen-specific IgE levels. On the other hand, MT used as a control drug
X and prednisolone also have antigen-specific I
The increase in gE value was significantly suppressed.

【００４２】（ｉｉ） 血清中の総ＩｇＥ抗体量の測定 総ＩｇＥ抗体量の測定はＮａｇａｉらの方法（Ｎａｇａ
ｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ
ｎｔｉ−ＩＬ−４ ｍｏｎｏｃｒｏｎａｌａｎｔｉｂｏ
ｄｙ， ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ−γｏｎ ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔ
ｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｉｎ
ｍｉｃｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ １
９９７； ２７： ２１８−２２４）に従って行った。
９６ウエルのプレート（ＮＵＮＣ ＩＭＭＵＮＯＰＬＡ
ＴＥ Ｉ： Ｎｕｎｃ）に、５μｇ／ｍｌのモノクロナ
ル抗マウスＩｇＥ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を含むＰＢＳ
希釈液を１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、４℃にて一晩
プレートをコートした。各ウエルを洗浄用バッファーで
３回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μｌ／ｗ
ｅｌｌで加え、室温にて１時間インキュベートした。次
いで、各ウエルを洗浄用バッファーで５回洗浄し、血清
サンプルを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、１時間イン
キュベートした。同時に、標準曲線作成用として、モノ
クロナル抗ジニトロフェノールＩｇＥ抗体（ＳＩＧＭ
Ａ）を希釈バッファーで各種濃度に希釈して、同一プレ
ートの別のウエルに加えた。各ウエルを洗浄バッファー
で５回洗浄した後、希釈バッファーで調製したパーオキ
シダーゼ標識ポリクロナル抗マウスＩｇＥ抗体（Ｎｏｒ
ｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｃｌ ｌａｂ．）を
１０μｌ／ｗｅｌｌで加え、さらに室温にて１時間イン
キュベートした。各ウエルを洗浄用バッファーで５回洗
浄し、基質を１００μｌ／ｗｅｌｌで加えて室温暗所に
て約３０分反応させ、２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄を５０μｌ／ｗｅ
ｌｌで加えて反応を停止させた後、各ウエルの吸光度を
４９２ｎｍで測定した。結果を図１５，１６に示す。(Ii) Measurement of Total IgE Antibody Level in Serum The total IgE antibody level was determined by the method of Nagai et al.
i H, et al. The effect of a
anti-IL-4 monoclonalantibo
dy, rapamycin and interfe
ron-γon airway hyperreact
ivity to acetylcholine in
mice. Clin Exp Allergy 1
997; 27: 218-224).
96-well plate (NUNC IMMUNOPLA
PBS containing 5 μg / ml monoclonal anti-mouse IgE antibody (Serotec) in TE I: Nunc)
The diluted solution was dispensed at 100 μl / well, and the plate was coated at 4 ° C. overnight. After each well was washed three times with a washing buffer, 1% BSA-PBS was added at 200 μl / w.
and then incubated for 1 hour at room temperature. Next, each well was washed 5 times with a washing buffer, and a serum sample was added at 100 μl / well and incubated for 1 hour. At the same time, a monoclonal anti-dinitrophenol IgE antibody (SIGM
A) was diluted to various concentrations with dilution buffer and added to another well of the same plate. After washing each well five times with a washing buffer, a peroxidase-labeled polyclonal anti-mouse IgE antibody (Nor
dic Immunologicacl lab. ) Was added at 10 μl / well, and further incubated at room temperature for 1 hour. Each well was washed 5 times with a washing buffer, and the substrate was added at 100 μl / well, reacted at room temperature in a dark place for about 30 minutes, and 2 MH ₂ SO ₄ was added at 50 μl / well.
After stopping the reaction by adding 11 liters, the absorbance of each well was measured at 492 nm. The results are shown in FIGS.

【００４３】図から明らかなように、非感作ＯＡ吸入群
に比し、感作ＯＡ吸入群では抗原反復吸入により血清中
の総ＩｇＥ値の有意な上昇が認められた。これに対し、
ＭＸ−６８は血清中の総ＩｇＥ値の上昇を用量依存的に
抑制し、１ｍｇ／ｋｇの用量においては血清中の総Ｉｇ
Ｅ値の上昇を有意に抑制した。一方、対照薬として用い
たＭＴＸは血清中の総ＩｇＥ値の上昇に対し抑制傾向は
認められるものの、有意な差は認められなかった。ま
た、同じく対照薬として用いたプレドニゾロンは、血清
中の総ＩｇＥ値の上昇を有意に抑制した。As is apparent from the figure, the total IgE value in the serum was significantly increased in the sensitized OA inhalation group by repeated inhalation of the antigen, as compared with the non-sensitized OA inhalation group. In contrast,
MX-68 dose-dependently suppresses the increase in serum total IgE levels, and at a dose of 1 mg / kg, total serum IgE.
The increase in E value was significantly suppressed. On the other hand, MTX used as a control drug showed a tendency to suppress an increase in serum total IgE value, but no significant difference was observed. In addition, prednisolone, which was also used as a control drug, significantly suppressed an increase in the total IgE level in serum.

【００４４】（ｉｉｉ） 血清中の総ＩｇＧ抗体量の測
定 総ＩｇＧ抗体量の測定はＮａｇａｉ ｅｔ ａｌの方法
（Ｎａｇａｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃ
ｔ ｏｆ ａｎｔｉ−ＩＬ−４ ｍｏｎｏｃｒｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｎｄ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ｏｎ ａｉｒｗａｙ ｈｙ
ｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａｃｅｔｙｌｃｈ
ｏｌｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａ
ｌｌｅｒｇｙ １９９７； ２７： ２１８−２２４）
に従って行った。９６ウエルのプレート（ＮＵＮＣ Ｉ
ＭＭＵＮＯＰＬＡＴＥ Ｉ： Ｎｕｎｃ）に、５μｇ／
ｍｌのモノクロナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅ
ｌ）を含むＰＢＳ希釈液を１００μｌ／ｗｅｌｌで分注
し、４℃にて一晩プレートをコートした。各ウエルを洗
浄用バッファーで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
を２００μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で１時間インキ
ュベートした。次いで、各ウエルを洗浄用バッファーで
３回洗浄し、血清サンプルを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ
加え、３７℃で２時間インキュベートした。同時に、標
準曲線作成用として、マウスＩｇＧ（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）を希釈バッファーで各種濃度に希釈
して、同一プレートの別のウエルに加えた。各ウエルを
洗浄バッファーで３回洗浄した後、希釈バッファーで調
製したヤギ抗マウスＩｇＧパーオキシダーゼ（Ｃａｐｐ
ｅｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、さらに３７℃に
て１時間インキュベートした。各ウエルを洗浄用バッフ
ァーで５回洗浄し、基質を１００μｌ／ｗｅｌｌ宛加え
て室温暗所にて約３０分反応させ、各ウエルの吸光度を
４９２ｎｍで測定した。結果を図１７、１８に示す。(Iii) Measurement of Total IgG Antibody Level in Serum The total IgG antibody level was measured by the method of Nagai et al (Nagai H, et al. The effect).
t of anti-IL-4 monochronal
antibody, rapamycin and
interferon-γ on airway hy
perreactivity to acetylch
oline in mice. Clin Exp A
llergy 1997; 27: 218-224).
Was performed according to 96-well plate (NUNC I
MMUNOPLATE I: Nunc) at 5 μg /
ml of monoclonal anti-mouse IgG antibody (Cappe
The diluted PBS containing 1) was dispensed at 100 μl / well, and the plate was coated at 4 ° C. overnight. After each well was washed three times with a washing buffer, 1% BSA-PBS was used.
Was added at 200 μl / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Next, each well was washed three times with a washing buffer, a serum sample was added at 100 μl / well, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. At the same time, mouse IgG (Miles Sc
Initiative) was diluted to various concentrations with a dilution buffer and added to another well of the same plate. After washing each well three times with a washing buffer, goat anti-mouse IgG peroxidase (Capp) prepared with a dilution buffer was used.
e) was added at 100 μl / well and further incubated at 37 ° C. for 1 hour. Each well was washed 5 times with a washing buffer, and the substrate was added to 100 μl / well and reacted at room temperature in a dark place for about 30 minutes, and the absorbance of each well was measured at 492 nm. The results are shown in FIGS.

【００４５】図から明らかなように、非感作ＯＡ吸入群
に比し、感作ＯＡ吸入群では抗原反復吸入により血清中
の総ＩｇＧ値の上昇が認められた。これに対し、ＭＸ−
６８は血清中の総ＩｇＧ値の上昇を用量依存的に抑制
し、１ｍｇ／ｋｇの用量においては血清中の総ＩｇＧ値
の上昇を有意に抑制した。一方、対照薬として用いたＭ
ＴＸおよびプレドニゾロンも同様に血清中の総ＩｇＧ値
の上昇を有意に抑制した。 （実施例２） 抗原誘発即時型喘息反応、抗原誘発二相
性喘息反応、気道炎症および気道過敏性に対する本願の
薬物の影響 発明者は、モルモットを用いた抗原反復吸入による実験
的喘息モデルを作成し、種々の検討を行ってきた。本モ
デルの特徴は、抗原反復吸入によりその喘息症状が重症
化してくることである。すなわち、本モデルにおいて
は、抗原反復吸入により初回の抗原吸入ではみられなか
った遅発型喘息反応（ＬＡＲ）、気道過敏性（ＡＨ
Ｒ）、好酸球浸潤、気道上皮の剥離および肺浮腫が順次
観察され、またそれらは抗原反復吸入により徐々に増強
してくる。As is clear from the figure, the total IgG value in the serum was increased in the sensitized OA inhalation group by repeated inhalation of the antigen, as compared with the non-sensitized OA inhalation group. On the other hand, MX-
No. 68 dose-dependently suppressed an increase in serum total IgG value, and significantly suppressed an increase in serum total IgG value at a dose of 1 mg / kg. On the other hand, M used as a control drug
TX and prednisolone also significantly suppressed the increase in serum total IgG levels. Example 2 Effect of the Drug of the Present Invention on Antigen-Induced Immediate Asthma Response, Antigen-Induced Biphasic Asthma Response, Airway Inflammation and Airway Hypersensitivity The inventors have prepared an experimental asthma model by repeated inhalation of antigen using guinea pigs. Various studies have been conducted. The feature of this model is that asthma symptoms become severe due to repeated inhalation of the antigen. That is, in this model, delayed asthmatic response (LAR) and airway hyperresponsiveness (AH) which were not observed in the first inhalation of antigen by repeated inhalation of antigen were not observed.
R), eosinophil infiltration, airway epithelial detachment and pulmonary edema are observed sequentially, and they gradually increase with repeated inhalation of the antigen.

【００４６】（１） 実験動物および試薬 ４週令Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモットを日本ＳＬＣ株
式会社より購入し、温度２５℃、湿度５５％の恒温恒湿
飼育室にて、自由給水下に固形飼料を用いて１週間以上
予備飼育した後、実験に用いた。(1) Experimental Animals and Reagents Four-week-old Hartley male guinea pigs were purchased from SLC Japan, and solid feed was used in a constant temperature / humidity breeding room at a temperature of 25 ° C. and a humidity of 55% under free water supply. The animals were preliminarily reared for at least one week before use in experiments.

【００４７】試薬は、特に記載がない限りは、実施例１
と同じものを使用した。 （２） 感作および抗原反復吸入 １および３日目にＯＡをそれぞれ０．５および１ｍｇ含
む生理食塩水溶液をモルモット腹腔内に注射して能動的
に感作した。感作されたモルモットを４群に分け、それ
ぞれ、０．５ｍｇ／ｋｇのＭＸ−６８を投与する群（Ｍ
Ｘ−６８ ０．５ｍｇ／ｋｇ群、６匹）、１．０ｍｇ／
ｋｇのＭＸ−６８を投与する群（ＭＸ−６８ １ｍｇ／
ｋｇ群、６匹）、１．０ｍｇ／ｋｇのＭＴＸを投与する
群（ＭＴＸ １ｍｇ／ｋｇ群、６匹）および投薬を行わ
ない陽性コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群、６匹）と
した。さらに、ＯＡ感作、抗原吸入および投薬のいずれ
も行わない陰性コントロール群（Ｎｏｒｍａｌ群、６
匹）を用意したＭＸ−６８投与群、ＭＴＸ投与群および
陽性コントロール群のモルモットに対しては、ＯＡ生理
食塩水溶液を、２２、２５、２９、３２、３６および３
９日目に、ネブライザーを用いて１分間吸入させた。吸
入させるＯＡ生理食塩水溶液の濃度は、２２日目は０．
１％、２５日目は０．２％、２９日目は０．０４％、３
２日目は０．０５％、３６日目は０．０５％、３９日目
は０．１％とした。Reagents were used in Example 1 unless otherwise noted.
The same as was used. (2) Sensitization and repeated antigen inhalation On the 1st and 3rd days, physiological saline solutions containing 0.5 and 1 mg of OA were injected intraperitoneally into guinea pigs to actively sensitize. The sensitized guinea pigs were divided into four groups, each group receiving 0.5 mg / kg of MX-68 (M
X-68 0.5 mg / kg group, 6 animals), 1.0 mg / kg
kg-MX-68 group (MX-68 1 mg /
kg group, 6 animals), a group to which 1.0 mg / kg of MTX was administered (MTX 1 mg / kg group, 6 animals) and a positive control group without administration (Control group, 6 animals). Furthermore, a negative control group (Normal group, 6
The OA physiological saline solution was administered to the MX-68 administration group, the MTX administration group, and the guinea pig of the positive control group, which had been prepared, at 22, 25, 29, 32, 36 and 3
On the ninth day, they were inhaled for 1 minute using a nebulizer. The concentration of the OA physiological saline solution to be inhaled was 0.1% on the 22nd day.
1%, 0.2% on day 25, 0.04% on day 29, 3
The second day was 0.05%, the 36th day was 0.05%, and the 39th day was 0.1%.

【００４８】ＭＸ−６８投与群およびＭＴＸ投与群に対
しては、２２、２５、２９、３２、３６および３９日目
の抗原吸入の１時間前に、腹腔内に、それぞれＭＸ−６
８およびＭＴＸを注射投与した。For the MX-68 administration group and the MTX administration group, one hour before the inhalation of the antigen on days 22, 25, 29, 32, 36 and 39, the intraperitoneal injection of MX-6 was performed.
8 and MTX were injected.

【００４９】抗原吸入を行う場合には、２０ × １０
× １０ｃｍの小部屋を合計１０部屋有するプラスチ
ック製小動物用吸入チャンバー内にモルモットを固定
し、超音波ネブライザー（ＵＮ−７０１、アズウェル社
製、流速３ｍｌ／ｍｉｎ、平均粒子径４．０−５．０μ
ｍ）を用いて抗原を吸入させた。When inhaling antigen, 20 × 10
A guinea pig was fixed in a plastic small animal inhalation chamber having a total of 10 small chambers of 10 cm × 10 cm, and an ultrasonic nebulizer (UN-701, manufactured by Aswell, flow rate 3 ml / min, average particle diameter 4.0-5.0 μm)
m) was used to inhale the antigen.

【００５０】（３） 気道抵抗の測定 気道抵抗（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｉｓｔａｎ
ｃｅ ： Ｒｒｓ）の測定は、体プレスチモグラフ（ｂ
ｏｄｙ ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ、オシレーショ
ン法，日本光電）を用いてＭｅａｄ法の変法であるＹａ
ｍａｕｃｈｉらの方法に従い、ＩＡＲについては２５日
目の初回吸入直後に測定し、ＬＡＲについては３９日目
の最終抗原吸入後から６時間の間に測定した。すなわ
ち、無麻酔下のモルモットを動物チャンバー内に固定
し、頚部にはゴムパッキンを備えてチャンバーの空気の
漏出を防いだ。次いで、呼吸流量計トランスデューサー
（ＴＰ−６０２Ｔ）に継続されている円錐形ゴムマスク
を、モルモットの鼻頭部を完全に覆うように適切にあて
た。同時に、圧波として、スピーカーボックスから３０
Ｈｚのサイン波を発生させて、モルモットの体腔部に一
定圧力を負荷してＲｒｓを測定した。レコーダー１チャ
ンネルにはサイン波により増幅された呼吸波形が１ｃｍ
の一定振幅で記録され、２チャンネルにはチャンバーに
接続された差圧トランスデューサーを介してチャンバー
内圧が１ｃｍの一定振幅で記録された。Ｒｒｓは以下の
式に従って算出した。尚、ＰＢＯＸおよびＶはそれぞれ
動物チャンバー内の圧力および気流量を示す。(3) Measurement of airway resistance Airway resistance (Respiratory resistance)
ce: Rrs) was measured using a body plethysmograph (b
Yay, which is a modification of the Mead method, using Odysplethysmograph (oscillation method, Nihon Kohden).
According to the method of Mauchi et al., IAR was measured immediately after the first inhalation on day 25, and LAR was measured during 6 hours after the last antigen inhalation on day 39. That is, a non-anesthetized guinea pig was fixed in the animal chamber, and a rubber packing was provided on the neck to prevent air leakage from the chamber. A conical rubber mask continued to the respiratory flow meter transducer (TP-602T) was then applied appropriately to completely cover the guinea pig nasal head. At the same time, as pressure waves, 30
A sine wave of Hz was generated, and a constant pressure was applied to the body cavity of the guinea pig to measure Rrs. Respiratory waveform amplified by sine wave is 1cm in recorder 1 channel
And the pressure in the chamber was recorded at a constant amplitude of 1 cm on channel 2 via a differential pressure transducer connected to the chamber. Rrs was calculated according to the following equation. Here, PBOX and V indicate the pressure and air flow rate in the animal chamber, respectively.

【００５１】Ｒｒｓ（ｃｍ Ｈ₂Ｏ／ｍｌ／ｓｅｃ）＝
圧波によるＰＢＯＸの振幅／圧波によるＶの振幅 結果を図１９、２０に示す。図１９から明らかなよう
に、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、２２日目の初回抗原吸入
後、約４−５分をピークとする気道抵抗の上昇が観察さ
れた。これに対し、ＭＸ−６８は、本反応を用量依存的
に有意に抑制した。一方、対照薬であるＭＴＸは、本反
応に対し抑制傾向を示すにすぎなかった。Rrs (cm H ₂ O / ml / sec) =
19 and 20 show the results of the amplitude of the PBOX due to the pressure wave / the amplitude of V due to the pressure wave. As is clear from FIG. 19, in the Control group, an increase in airway resistance peaking at about 4 to 5 minutes after the first antigen inhalation on the 22nd day was observed. In contrast, MX-68 significantly suppressed this reaction in a dose-dependent manner. On the other hand, the control drug MTX only showed a tendency to suppress the reaction.

【００５２】図２０から明らかなように、Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ群では、３９日目の最終抗原吸入後、約１分および４
時間をピークとする２相性喘息反応が観察された。これ
に対し、ＭＸ−６８投与群では、遅発型喘息反応を用量
依存的に有意に抑制した。また、即時相に対して抑制傾
向を示した。As is clear from FIG.
In group 1, approximately 1 minute and 4 minutes after the last antigen inhalation on day 39
A biphasic asthmatic response with a time peak was observed. In contrast, the MX-68 administration group significantly suppressed the late asthmatic response in a dose-dependent manner. In addition, there was a tendency of suppression for the immediate phase.

【００５３】（４） 気道反応性の測定 気道反応性は、３９日目の最終抗原吸入２４時間後に測
定した。すなわち、モルモットを動物チャンバー内に固
定し、ジェットネブライザーを用いて０．５、１、２お
よび４ｍｇ／ｍｌのＡｃｈを３０秒間ずつ順次吸入さ
せ、それぞれの吸入の３０〜６０秒後のＲｒｓを上述と
同様に測定した成績を、Ｒｒｓを前値より５０％増加さ
せるのに必要なＡｃｈの用量、すなわち誘発濃度５０
（ｐｒｏｖｏｃａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ
ｎ ５０、ＰＣ５０）値で示した。結果を図２１に示
す。(4) Measurement of Airway Reactivity Airway reactivity was measured 24 hours after the last antigen inhalation on day 39. That is, a guinea pig was fixed in an animal chamber, and Ach of 0.5, 1, 2, and 4 mg / ml was sequentially inhaled for 30 seconds using a jet nebulizer, and the Rrs 30 to 60 seconds after each inhalation was determined as described above. The Ach dose required to increase Rrs by 50% from the previous value, that is, the induced concentration was 50%.
(Provocative concentratio
n50, PC50). The results are shown in FIG.

【００５４】図から明らかなように、Ｎｏｒｍａｌ群と
比べて、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、最終抗原吸入２４時間
後、Ａｃｈに対する気道反応性亢進、すなわち気道過敏
性が観察された。これに対し、ＭＸ−６８投与群では、
抗原反復吸入による気道過敏性を用量依存的に有意に抑
制した。As is clear from the figure, compared to the Normal group, in the Control group, an increase in airway responsiveness to Ach, that is, airway hypersensitivity was observed 24 hours after the last inhalation of the antigen. In contrast, in the MX-68 administration group,
Airway hyperresponsiveness due to repeated inhalation of antigen was significantly suppressed in a dose-dependent manner.

【００５５】（５） 気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中
の白血球数の測定 ＢＡＬＦは気道反応性の測定後、直ちに採取した。モル
モットの腹腔内にウレタン（５ ｇ／ｋｇ）を注射して
致死させ、定法に従って気管を切開して気管カニューレ
を装着した。この気管カニューレを介して、ＢＡＬ液５
ｍｌを用いて、注入、吸引する操作を５回繰り返してモ
ルモットの気道内を洗浄し、ＢＡＬ液を回収した。この
洗浄を２回行って、回収したＢＡＬ液を合わせてＢＡＬ
Ｆとした。採取したＢＡＬＦは、直ちに４℃で８００ｒ
ｐｍ，１０分間遠心し、沈渣した細胞を２ｍｌのＢＡＬ
液に浮遊させた。この細胞浮遊液２５μｌにＴｕｒｋ液
１７５μｌおよび生理食塩水３００μｌを加えて細胞を
染色し、ＢＡＬＦ中の総白血球数を顕微鏡下（× ５０
０）に計測した。次いで、細胞数を５ × １０⁵ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌに調整した後、ＣＹＴＯＳＰＩＮ ＩＩ
（Ｓｈａｎｄｏｎ社）を用いて室温にて４００ｒｐｍで
４分間遠心し、塗抹標本を作成した。この標本をＤｉｆ
ｆ−Ｑｕｉｋ液を用いて染色し、顕微鏡下（× ５０
０）に約３００個の白血球を調べて、その中に含まれる
マクロファージ、好酸球、好中球およびリンパ球の数を
それぞれカウントした。得られた成績は、ＢＡＬＦ中に
存在する総細胞数として表した。結果を図２２に示す。(5) Measurement of white blood cell count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) BALF was collected immediately after the measurement of airway reactivity. Guinea pigs were sacrificed by injecting urethane (5 g / kg) intraperitoneally, the trachea was incised according to a standard method, and a tracheal cannula was attached. Through this tracheal cannula, BAL fluid 5
The operation of injecting and suctioning was repeated 5 times using the ml, and the guinea pig airway was washed to collect the BAL solution. This washing is performed twice, and the collected BAL solution is combined with BAL.
F. Immediately at 800C at 4 ° C
pm, and centrifuged for 10 minutes.
Suspended in liquid. 175 μl of Turk solution and 300 μl of physiological saline were added to 25 μl of the cell suspension to stain the cells, and the total leukocyte count in BALF was measured under a microscope (× 50
0) was measured. Next, the cell number was increased to 5 × 10 ⁵ ce.
After adjusting to 11 s / ml, CYTOSPIN II
(Shandon) and centrifuged at 400 rpm for 4 minutes at room temperature to prepare a smear. This sample is Dif
Stain with f-Quik solution and place under a microscope (x50
In 0), about 300 leukocytes were examined, and the numbers of macrophages, eosinophils, neutrophils and lymphocytes contained therein were counted. The results obtained were expressed as the total number of cells present in BALF. The results are shown in FIG.

【００５６】図から明らかなように、Ｎｏｒｍａｌ群と
比べて、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、最終抗原吸入２４時間
後、気管支肺胞洗浄液中において、好酸球およびリンパ
球数の増加が観察された。これに対し、ＭＸ−６８投与
群では、抗原反復吸入による好酸球数およびリンパ球数
の増加を用量依存的に有意に抑制した。一方、対照薬と
して用いたＭＴＸは、ＭＸ−６８と同様にリンパ球数の
増加を有意に抑制したが、好酸球数の増加に対しては影
響を及ぼさなかった。 （実施例３）以下に本発明の治療剤の製剤例を示す。As is clear from the figure, an increase in the number of eosinophils and lymphocytes in the bronchoalveolar lavage fluid was observed 24 hours after the last inhalation of the antigen in the Control group as compared with the Normal group. In contrast, in the MX-68 administration group, the increase in the number of eosinophils and lymphocytes due to repeated inhalation of the antigen was significantly suppressed in a dose-dependent manner. On the other hand, MTX used as a control drug significantly suppressed the increase in lymphocyte count similarly to MX-68, but did not affect the increase in eosinophil count. (Example 3) Formulation examples of the therapeutic agent of the present invention are shown below.

【００５７】 製剤例１：錠剤の製剤処方及び調製法 ＜処方＞ 配合量（ｍｇ／錠） ＭＸ−６８ ５ 乳糖 ６５．５ 結晶セルロース ２０ クロスカルメロースナトリウム ５ ヒドロキシプロピルセルロース ４ステアリン酸マグネシウム ０．５ 合計 １００ ＜調製法＞ＭＸ−６８、乳糖、結晶セルロース、クロス
カルメロースナトリウムを乾式混合後、水を加えて練合
し造粒を行った。この造粒物を５０℃で乾燥後、ステア
リン酸マグネシウムと混合し、加圧成形して、直径６ｍ
ｍの錠剤を得た。Formulation Example 1: Formulation and preparation method of tablet <Formulation> Formulation amount (mg / tablet) MX-685 Lactose 65.5 Microcrystalline cellulose 20 Croscarmellose sodium 5 Hydroxypropyl cellulose 4 Magnesium stearate 0.5 Total 100 <Preparation method> MX-68, lactose, crystalline cellulose, and croscarmellose sodium were dry-mixed, then water was added and kneaded to perform granulation. After drying this granulated product at 50 ° C., it is mixed with magnesium stearate, pressed and molded to a diameter of 6 m.
m tablets were obtained.

【００５８】製剤例２：注射剤の製剤処方及び調製法
（３００ｍｌスケール） ＜処方＞ ＭＸ−６８ ３００ｍｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ６．０ｇ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ３．３ｇ 上記試薬を注射用蒸留水を用いて溶解し、全量を３００
ｍｌとした。[0058] Formulation Example 2: Formulation Formulation and preparation of injectables (300ml scale) <Formulation> for injection _{MX-68 300mg Na 2 HPO 4} · 12H 2 O 6.0g NaH 2 PO 4 3.3g the reagent distillation Dissolve with water and bring the total to 300
ml.

【００５９】ＭＸ−６８については、〔ＭＸ−６８原体
採取量×（１００−水分量（％））／１００〕で表し
た。＜調製法＞Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂ＯおよびＮａＨ₂
ＰＯ₄を約２５０ｍｌの注射用蒸留水に溶解した。その
液にＭＸ−６８原体を加え、スターラーで軽く攪拌した
後、超音波槽（ＢＲＡＮＳＯＮＩＣ Ｂ２２００、ヤマ
ト製）を使用して約５分間超音波溶解した。超音波処理
によって、ＭＸ−６８溶液の液温が上昇し、分解物を生
成する恐れがあるため、超音波溶解後は液温が下がるま
で放冷した。上記操作を３回繰り返した後、ＭＸ−６８
溶液が、黄色透明溶液（蛍光）になっていることを目視
により確認した。十分に溶解していることを確認した
後、残りの注射用蒸留水を加え、液量を３００ｍｌとし
た。この溶液を０．２２μｍディスポーサブル滅菌濾過
器（ＳＴＥＲＩＣＵＰ ０．２２μｍ ＧＶ Ｄｕｒａ
ｐｏｒｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ 製）で滅菌濾過し、注
射用製剤とした。MX-68 was represented by [MX-68 original substance collection amount × (100-water content (%)) / 100]. <Preparation method> Na ₂ HPO ₄ .12H ₂ O and NaH ₂
Was dissolved PO ₄ in distilled water for injection to about 250 ml. The MX-68 drug substance was added to the solution, and the mixture was lightly stirred with a stirrer, and then ultrasonically dissolved using an ultrasonic bath (BRANSONIC B2200, manufactured by Yamato) for about 5 minutes. Since the liquid temperature of the MX-68 solution may increase due to the ultrasonic treatment and a decomposition product may be generated, the solution was cooled until the liquid temperature decreased after the ultrasonic dissolution. After repeating the above operation three times, the MX-68
It was visually confirmed that the solution was a yellow transparent solution (fluorescence). After confirming that it was sufficiently dissolved, the remaining amount of distilled water for injection was added to adjust the volume to 300 ml. This solution was sterilized with a 0.22 μm disposable sterile filter (STERICUP 0.22 μm GV Dura).
(made by MILLIPORE) and sterilized by filtration to give an injectable preparation.

【００６０】製剤例３：注射剤の製剤処方及び調製法
（３００ｍｌスケール） ＜処方＞ ＭＸ−６８ ３００ｍｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ６．０ｇ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ３．３ｇ 上記試薬を注射用蒸留水を用いて溶解し、全量を３００
ｍｌとした。ＭＸ−６８については、〔ＭＸ−６８原体
採取量×（１００−水分量（％））／１００〕で表して
いる。[0060] Formulation Example 3: Formulation Formulation and preparation of injectables (300ml scale) <Formulation> for injection _{MX-68 300mg Na 2 HPO 4} · 12H 2 O 6.0g NaH 2 PO 4 3.3g the reagent distillation Dissolve with water and bring the total to 300
ml. MX-68 is represented by [MX-68 drug substance collection amount × (100−water content (%)) / 100].

【００６１】＜調製法＞Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏを約
２５０ｍｌの注射用蒸留水に溶解した。その液にＭＸ−
６８原体を加え、スターラーで攪拌した。ＭＸ−６８原
体が溶解したことを確認した後、ＮａＨ₂ＰＯ₄を加えて
溶解させた。十分に溶解していることを確認した後、残
りの注射用蒸留水を加え、全量を３００ｍｌとした。こ
の溶液を０．２２μｍディスポーサブル滅菌濾過器で滅
菌濾過し、注射用製剤とした。<Preparation method> Na ₂ HPO ₄ .12H ₂ O was dissolved in about 250 ml of distilled water for injection. MX-
68 ingredients were added and stirred with a stirrer. After MX-68 drug substance was confirmed to be dissolved, it was added and dissolved NaH ₂ PO _4. After confirming that it was sufficiently dissolved, the remaining distilled water for injection was added to bring the total volume to 300 ml. This solution was sterile-filtered with a 0.22 μm disposable sterile filter to obtain a preparation for injection.

【００６２】[0062]

【発明の効果】上記から明らかなように、抗原反復吸入
によるマウス気道過敏性モデルを用いて、本発明の薬物
が気道炎症および気道過敏性の発症に及ぼす影響を検討
したところ、抗原反復吸入による気道過敏性を用量依存
的に抑制し、いずれの用量においても有意な抑制が認め
られた。また、本発明の薬物は、ＢＡＬＦ中の炎症性細
胞数の増加を用量依存的に抑制した。ＢＡＬＦ中のサイ
トカイン量については、本発明の薬物は、ＢＡＬＦ中Ｉ
Ｌ−４量およびＩＬ−５量の増加を用量依存的に抑制
し、いずれの用量においても有意な抑制が認められた。
血清中の抗体値に及ぼす影響については、本発明の薬物
の投与により、血清中抗原特異的ＩｇＥ値、総ＩｇＥ値
および総ＩｇＧ値のいずれの抗体値の上昇に対しても用
量依存的な抑制が認められた。これらの結果は、本発明
の薬物が、気道過敏性、気道炎症、Ｔｈ２サイトカイン
の産生および血清中抗体値の上昇を抑制することを示
す。As is clear from the above, the effect of the drug of the present invention on the development of airway inflammation and airway hyperreactivity was examined using a mouse airway hyperreactivity model by repeated inhalation of antigen. Airway hyperresponsiveness was suppressed in a dose-dependent manner, and significant suppression was observed at all doses. The drug of the present invention suppressed the increase in the number of inflammatory cells in BALF in a dose-dependent manner. Regarding the amount of cytokines in BALF, the drug of the present invention
The increase in L-4 and IL-5 levels was suppressed in a dose-dependent manner, and significant suppression was observed at all doses.
Regarding the effect on serum antibody levels, administration of the drug of the present invention resulted in dose-dependent suppression of any increase in serum antigen-specific IgE levels, total IgE levels and total IgG levels. Was observed. These results indicate that the drug of the present invention suppresses airway hyperresponsiveness, airway inflammation, production of Th2 cytokines and elevation of serum antibody levels.

【００６３】この気道過敏性の抑制機序については、断
定するわけではないが、本発明の薬物が気道内への炎症
性細胞浸潤ならびにＴｈ２サイトカインの産生の両者を
抑制するためと推測される。Although the mechanism of the suppression of airway hyperreactivity is not conclusively determined, it is presumed that the drug of the present invention suppresses both inflammatory cell infiltration into the airway and production of Th2 cytokine.

【００６４】さらに、抗原反復吸入によるモルモット実
験的喘息モデルを用いて、本発明の薬物が、抗原誘発即
時型喘息反応、抗原誘発二相性喘息反応、気道炎症およ
び気道過敏性に及ぼす影響を検討したところ、遅発型喘
息反応および気道過敏性を有意に抑制した。抗原反復吸
入による気道炎症に対しては、本発明の薬物は、リンパ
球数の増加を用量依存的に抑制した。また、気管支喘息
の特徴の一つである好酸球浸潤も用量依存的に抑制し
た。Further, the effects of the drug of the present invention on antigen-induced immediate asthmatic response, antigen-induced biphasic asthmatic response, airway inflammation and airway hyperreactivity were examined using a guinea pig experimental asthma model by repeated inhalation of antigen. However, delayed asthmatic response and airway hyperresponsiveness were significantly suppressed. The drug of the present invention suppressed the increase in lymphocyte count in a dose-dependent manner against airway inflammation due to repeated inhalation of the antigen. In addition, eosinophil infiltration, one of the features of bronchial asthma, was suppressed in a dose-dependent manner.

【００６５】上記の結果は、本発明の薬剤が気管支喘息
の治療剤および予防剤として有用であることを示すもの
である。The above results indicate that the agent of the present invention is useful as a therapeutic or prophylactic agent for bronchial asthma.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例１における各群の体重変化を表すグラフ
である。グラフにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．
Ｍ．を示す。白丸はＮＳ−ＯＡ群（非感作ＯＡ吸入
群）、黒丸はＳ−ＯＡ群（感作ＯＡ吸入群）、白三角は
０．１ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒三角は０．３ｍ
ｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、白逆三角は１．０ｍｇ／ｋ
ｇＭＸ−６８投与群、黒菱形は０．３ｍｇ／ｋｇＭＴＸ
投与群、黒四角は５ｍｇ／ｋｇ酢酸プレドニゾロン投与
群を示す。FIG. 1 is a graph showing a change in body weight of each group in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG.
M. Is shown. Open circles are NS-OA group (non-sensitized OA inhalation group), closed circles are S-OA group (sensitized OA inhalation group), open triangles are 0.1 mg / kg MX-68 administration group, and closed triangles are 0.3 m.
g / kg MX-68 administration group, white inverted triangle is 1.0 mg / k
gMX-68 administration group, closed diamonds are 0.3 mg / kg MTX
The administration group and the black square indicate the 5 mg / kg prednisolone acetate administration group.

【図２】３１日目のアセチルコリンによる気道の反応性
の測定直前の各群の体重を表すグラフである。グラフに
おいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。††
はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉ
ｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ による検定
で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 2 is a graph showing the body weight of each group immediately before measurement of airway reactivity by acetylcholine on day 31. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents ††
Is Dunnett's multi for the S-OA group
It shows that the risk ratio p <0.01 was determined by the test using the ple comparison test.

【図３】実施例１における各群の気道反応性を表すグラ
フである。白丸はＮＳ−ＯＡ群（非感作ＯＡ吸入群）、
黒丸はＳ−ＯＡ群（感作ＯＡ吸入群）、白三角は０．１
ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒三角は０．３ｍｇ／ｋ
ｇＭＸ−６８投与群、白逆三角は１．０ｍｇ／ｋｇＭＸ
−６８投与群、黒菱形は０．３ｍｇ／ｋｇＭＴＸ投与
群、黒四角は５ｍｇ／ｋｇ酢酸プレドニゾロン投与群を
示す。FIG. 3 is a graph showing airway reactivity of each group in Example 1. Open circles are NS-OA group (non-sensitized OA inhalation group),
Closed circles are S-OA group (sensitized OA inhalation group), open triangles are 0.1.
mg / kg MX-68 administration group, closed triangles are 0.3 mg / k
gMX-68 administration group, white inverted triangle is 1.0 mg / kg MX
The -68 administration group, the black diamonds represent the 0.3 mg / kg MTX administration group, and the black squares represent the 5 mg / kg prednisolone acetate administration group.

【図４】図３において得られた気道反応性の用量反応曲
線より算出された曲線下面積（ＡＵＣ）を表すグラフで
ある。††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ
による検定で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示
す。＊＊＊はＳ−ＯＡ群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ
−ｔｅｓｔ による検定で、危険率ｐ＜０．００１であ
ったことを示す。FIG. 4 is a graph showing the area under the curve (AUC) calculated from the dose-response curve of the airway responsiveness obtained in FIG. †† is Dunnett's for S-OA group
multiple comparison test
Indicates that the risk factor p <0.01. *** is Student'st for S-OA group
It indicates that the risk ratio p <0.001 was determined by the test using -test.

【図５】実施例１において、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）中に含まれる白血球総数を示すグラフである。グラ
フにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ による
検定で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。＊＊
はＳ−ＯＡ群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓ
ｔあるいはＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔによる検
定で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 5: In Example 1, bronchoalveolar lavage fluid (BAL
It is a graph which shows the total number of leukocytes contained in F). In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents
†† is Dunnett's mul for S-OA group
It shows that the risk ratio was p <0.01 in the test by the single comparison test. **
Is Student's t-tes for the S-OA group
It indicates that the risk ratio was p <0.01 in the test by t or MannWhitney test.

【図６】実施例１において、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）中に含まれるマクロファージ数を示すグラフであ
る。グラフにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．
を表す。†はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ
による検定で、危険率ｐ＜０．０５であったことを示
す。＊＊＊はＳ−ＯＡ群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ
ｔ−ｔｅｓｔあるいはＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅ
ｓｔによる検定で、危険率ｐ＜０．００１であったこと
を示す。FIG. 6: In Example 1, bronchoalveolar lavage fluid (BAL
It is a graph which shows the number of macrophages contained in F). In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M.
Represents † is Dunnett's for S-OA group
multiple comparison test
Indicates that the risk factor p <0.05. *** is Student's for S-OA group
t-test or Mann Whitney te
The test by st indicates that the risk factor p <0.001.

【図７】実施例１において、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）中に含まれる好中球数を示すグラフである。グラフ
において、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。FIG. 7: In Example 1, bronchoalveolar lavage fluid (BAL
It is a graph which shows the number of neutrophils contained in F). In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents

【図８】実施例１において、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）中に含まれる好酸球数を示すグラフである。グラフ
において、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。†
および††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ
による検定で、それぞれ危険率ｐ＜０．０５および危険
率ｐ＜０．０１であったことを示す。＊＊はＳ−ＯＡ群
に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔあるいはＭ
ａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔによる検定で、危険
率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 8: In Example 1, bronchoalveolar lavage fluid (BAL
It is a graph which shows the number of eosinophils contained in F). In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents †
And †† are Dunnett's for S-OA group
multiple comparison test
Indicate that the risk ratio p <0.05 and the risk ratio p <0.01, respectively. ** is Student's t-test or M for S-OA group
It shows that the risk ratio p <0.01 was determined by the test using the anna Whitney test.

【図９】実施例１において、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）中に含まれるリンパ球数を示すグラフである。グラ
フにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
†および††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ
による検定で、それぞれ危険率ｐ＜０．０５および危
険率ｐ＜０．０１であったことを示す。＊＊はＳ−ＯＡ
群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔあるいは
Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔによる検定で、危
険率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 9: In Example 1, bronchoalveolar lavage fluid (BAL
It is a graph which shows the number of lymphocytes contained in F). In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents
† and †† are Dunnett's for S-OA group
multiple comparison test
Indicate that the risk ratio p <0.05 and the risk ratio p <0.01, respectively. ** is S-OA
It indicates that the risk ratio was p <0.01 by a test using Student's t-test or Mann Whitney test for the group.

【図１０】実施例１においてＢＡＬＦ中に遊離したイン
ターロイキン−４の量を表すグラフである。グラフにお
いて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。††は
Ｓ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｅｓｔ による検定で、
危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。＊＊＊はＳ−
ＯＡ群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ に
よる検定で、危険率ｐ＜０．００１であったことを示
す。FIG. 10 is a graph showing the amount of interleukin-4 released into BALF in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents †† indicates Dunnett's multiple for the S-OA group
In the test by le comparison test,
It indicates that the risk factor p <0.01. *** is S-
A test by Student's t-test for the OA group shows that the risk ratio p <0.001.

【図１１】実施例１においてＢＡＬＦ中に遊離したイン
ターロイキン−５の量を表すグラフである。グラフにお
いて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。††は
Ｓ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐ
ｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｅｓｔ による検定で、
危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。Ｎ．Ｄ．は検
出されなかったことを示す。FIG. 11 is a graph showing the amount of interleukin-5 released in BALF in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents †† indicates Dunnett's multiple for the S-OA group
In the test by le comparison test,
It indicates that the risk factor p <0.01. N. D. Indicates that it was not detected.

【図１２】実施例１においてＢＡＬＦ中に遊離したイン
ターフェロン−γの量を表すグラフである。グラフにお
いて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊＊＊
はＳ−ＯＡ群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓ
ｔ による検定で、危険率ｐ＜０．００１であったこと
を示す。FIG. 12 is a graph showing the amount of interferon-γ released into BALF in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents ***
Is Student's t-tes for the S-OA group
The test with t indicates that the risk factor p <0.001.

【図１３】実施例１における、血清中の抗原特異的Ｉｇ
Ｅ抗体量の経時的変化を表すグラフである。白丸はＮＳ
−ＯＡ群（非感作ＯＡ吸入群）、黒丸はＳ−ＯＡ群（感
作ＯＡ吸入群）、白三角は０．１ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８
投与群、黒三角は０．３ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、
白逆三角は１．０ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒菱形
は０．３ｍｇ／ｋｇＭＴＸ投与群、黒四角は５．０ｍｇ
／ｋｇ酢酸プレドニゾロン投与群を示す。FIG. 13 shows an antigen-specific Ig in serum in Example 1.
It is a graph showing the time-dependent change of E antibody amount. The white circle is NS
-OA group (non-sensitized OA inhalation group), closed circles are S-OA group (sensitized OA inhalation groups), open triangles are 0.1 mg / kg MX-68.
Administration group, closed triangles are 0.3 mg / kg MX-68 administration group,
The inverted white triangle is the 1.0 mg / kg MX-68 administration group, the black diamond is the 0.3 mg / kg MTX administration group, and the black square is 5.0 mg.
4 shows a group administered with prednisolone acetate / kg.

【図１４】実施例１における、最後の抗原吸入直前に採
血した血清中の抗原特異的ＩｇＥ抗体量を表すグラフで
ある。グラフにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．
Ｍ．を表す。††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔ
ｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔ
ｅｓｔ による検定で、危険率ｐ＜０．０１であったこ
とを示す。Ｎ．Ｄ．は検出されなかったことを示す。FIG. 14 is a graph showing the amount of antigen-specific IgE antibody in serum collected immediately before the last inhalation of antigen in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG.
M. Represents †† indicates Dunnet for the S-OA group
t's multiple comparison t
est indicates that the risk ratio p <0.01. N. D. Indicates that it was not detected.

【図１５】実施例１における、血清中の総ＩｇＥ抗体量
の経時的変化を表すグラフである。白丸はＮＳ−ＯＡ群
（非感作ＯＡ吸入群）、黒丸はＳ−ＯＡ群（感作ＯＡ吸
入群）、白三角は０．１ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、
黒三角は０．３ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、白逆三角
は１．０ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒菱形は０．３
ｍｇ／ｋｇＭＴＸ投与群、黒四角は５．０ｍｇ／ｋｇ酢
酸プレドニゾロン投与群を示す。FIG. 15 is a graph showing the change over time in the total amount of IgE antibodies in serum in Example 1. Open circles are NS-OA group (non-sensitized OA inhalation group), closed circles are S-OA group (sensitized OA inhalation group), open triangles are 0.1 mg / kg MX-68 administration group,
Black triangles are 0.3 mg / kg MX-68 administration group, white inverted triangles are 1.0 mg / kg MX-68 administration group, black rhombus is 0.3
The mg / kg MTX administration group and the solid squares indicate the 5.0 mg / kg prednisolone acetate administration group.

【図１６】実施例１における、最後の抗原吸入直前に採
血した血清中の総ＩｇＥ抗体量を表すグラフである。グ
ラフにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表
す。††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ に
よる検定で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。
Ｎ．Ｄ．は検出されなかったことを示す。＊＊はＳ−Ｏ
Ａ群に対するＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ によ
る検定で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 16 is a graph showing the total amount of IgE antibodies in serum collected immediately before the last inhalation of the antigen in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents †† is Dunnett's m for the S-OA group
It shows that it was p <0.01 by the test by the multiple comparison test.
N. D. Indicates that it was not detected. ** is SO
It shows that the risk ratio p <0.01 was determined by the Mann Whitney test for Group A.

【図１７】実施例１における、血清中の総ＩｇＧ抗体量
の経時的変化を表すグラフである。白丸はＮＳ−ＯＡ群
（非感作ＯＡ吸入群）、黒丸はＳ−ＯＡ群（感作ＯＡ吸
入群）、白三角は０．１ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、
黒三角は０．３ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、白逆三角
は１．０ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒菱形は０．３
ｍｇ／ｋｇＭＴＸ投与群、黒四角は５．０ｍｇ／ｋｇ酢
酸プレドニゾロン投与群を示す。FIG. 17 is a graph showing the change over time in the amount of total IgG antibody in serum in Example 1. Open circles are NS-OA group (non-sensitized OA inhalation group), closed circles are S-OA group (sensitized OA inhalation group), open triangles are 0.1 mg / kg MX-68 administration group,
Black triangles are 0.3 mg / kg MX-68 administration group, white inverted triangles are 1.0 mg / kg MX-68 administration group, black rhombus is 0.3
The mg / kg MTX administration group and the solid squares indicate the 5.0 mg / kg prednisolone acetate administration group.

【図１８】実施例１における、最後の抗原吸入直前に採
血した血清中の総ＩｇＧ抗体量を表すグラフである。グ
ラフにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表
す。†および††はＳ−ＯＡ群に対するＤｕｎｎｅｔ
ｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔ
ｅｓｔ による検定で、危険率ｐ＜０．０５および危険
率ｐ＜０．０１であったことを示す。＊＊はＳ−ＯＡ群
に対するＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ による
検定で、危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 18 is a graph showing the total amount of IgG antibodies in serum collected immediately before the last inhalation of the antigen in Example 1. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Represents † and †† are Dunnet for S-OA group
t's multiple comparison t
est indicates that the risk ratio was p <0.05 and the risk ratio p <0.01. ** indicates that the risk rate was p <0.01 in the test using the Mann Whitney test for the S-OA group.

【図１９】実施例２における、抗原誘発即時型喘息反応
（ＩＡＲ）に対する各薬物の効果を表すグラフである。
グラフにおいて、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示
す。黒丸は陽性コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、白
三角は０．５ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、白四角は
１．０ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒菱形は１．０ｍ
ｇ／ｋｇＭＴＸ投与群を示す。＊は、陽性コントロール
群に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃ
ｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ による検定で、危険率
ｐ＜０．０５であったことを示す。FIG. 19 is a graph showing the effect of each drug on antigen-induced immediate asthmatic response (IAR) in Example 2.
In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Is shown. Closed circles are positive control group (Control), open triangles are 0.5 mg / kg MX-68 administration group, open squares are 1.0 mg / kg MX-68 administration group, and black diamonds are 1.0 m
The g / kg MTX administration group is shown. * Indicates Dunnett's multiple c for the positive control group
The test by the omparison test shows that the risk ratio p <0.05.

【図２０】実施例２における、遅発型喘息反応（ＬＡ
Ｒ）に対する各薬物の効果を表すグラフである。グラフ
において、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。黒
丸は陽性コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、白三角は
０．５ｍｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、白四角は１．０ｍ
ｇ／ｋｇＭＸ−６８投与群、黒菱形は１．０ｍｇ／ｋｇ
ＭＴＸ投与群を示す。＊＊は、陽性コントロール群に対
するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａ
ｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ による検定で、危険率ｐ＜０．
０１であったことを示す。FIG. 20 shows delayed asthmatic response (LA) in Example 2.
It is a graph showing the effect of each drug on R). In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Is shown. Closed circles are positive control group (Control), open triangles are 0.5 mg / kg MX-68 administration group, open squares are 1.0 m
g / kg MX-68 administration group, black diamonds are 1.0 mg / kg
The MTX administration group is shown. ** indicates Dunnett's multiple compa
The risk test p <0.
01.

【図２１】実施例２における、気道過敏性（ＡＨＲ）に
対する各薬物の効果を表すグラフである。グラフにおい
て、バー（Ｉ）は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。††は陰
性コントロール群（Ｎｏｒｍａｌ）に対するＭａｎｎ
Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔによる検定で、危険率ｐ＜
０．０１であったことを示す。＊および＊＊は、陽性コ
ントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対するＤｕｎｎｅｔ
ｔ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔ
ｅｓｔ による検定で、それぞれ危険率ｐ＜０．０５お
よび危険率ｐ＜０．０１であったことを示す。FIG. 21 is a graph showing the effect of each drug on airway hyperresponsiveness (AHR) in Example 2. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Is shown. †† indicates Mann against the negative control group (Normal)
By the test using the Whitney test, the risk factor p <
It shows that it was 0.01. * And ** indicate Dunnet for the positive control group (Control).
t's multiple comparison t
est indicates that the risk rates were p <0.05 and p <0.01, respectively.

【図２２】実施例２における、ＢＡＬＦ中の各種白血球
数を表すグラフである。グラフにおいて、バー（Ｉ）は
平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。††は陰性コントロール群
（Ｎｏｒｍａｌ）に対するＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ
ｔｅｓｔ による検定で、危険率ｐ＜０．０１であった
ことを示す。＊および＊＊は、陽性コントロール群（Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ）に対するＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｍｕｌｔ
ｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ による検
定で、それぞれ危険率ｐ＜０．０５および危険率ｐ＜
０．０１であったことを示す。FIG. 22 is a graph showing the numbers of various leukocytes in BALF in Example 2. In the graph, bar (I) means ± SEM. E. FIG. M. Is shown. †† indicates Mann Whitney for the negative control group (Normal)
The test indicates that the risk ratio p <0.01. * And ** indicate the positive control group (C
Dunnett's multi to control
In the test by the iple comparison test, the risk factor p <0.05 and the risk factor p <
It shows that it was 0.01.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】 （式中Ｒ₁はＣＨ₂、ＣＨ₂ＣＨ₂、ＣＨ₂Ｏ、ＣＨ₂Ｓおよ
びＣＨ₂ＳＯからなる群より選ばれた基を示し、 Ｒ₂は水素原子または炭素数１から４の低級アルキル基
またはベンジル基を示し、 Ｒ₃は一般式ＣＯＯＲ₄（ここでＲ₄は水素原子または炭
素数１から４の低級アルキル基を示す）または一般式Ｎ
ＨＣＯＲ₅（ここでＲ₅は置換基を有していてもよいフェ
ニル基を示す）または一般式ＣＯＮＲ₆Ｒ₇（ここでＲ₆
は水素原子または炭素数１から４の低級アルキル基を示
し、Ｒ₇は炭素数１から４の低級アルキル基または置換
基を有していてもよいフェニル基またはカルボキシアル
キル基または低級アルキルスルホニル基を示す）または
ＰＯ₃Ｈ₂またはＳＯ₃Ｈで表される基を示し、ｎは１か
ら４の整数を示す）で表される化合物およびその塩の１
種または２種以上を有効成分として含有する喘息の治療
剤または予防剤。1. A compound of the general formula (I) (Wherein R ₁ represents a group selected from the group consisting of CH ₂ , CH ₂ CH ₂ , CH ₂ O, CH ₂ S and CH ₂ SO, and R ₂ represents a hydrogen atom or a lower alkyl having 1 to 4 carbon atoms. R ₃ represents a general formula COOR ₄ (where R ₄ represents a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) or a general formula N
HCOR ₅ (where R ₅ represents a phenyl group which may have a substituent) or a general formula CONR ₆ R ₇ (where R ₆
Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and R ₇ represents a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a phenyl group, a carboxyalkyl group or a lower alkylsulfonyl group which may have a substituent. ) Or a group represented by PO ₃ H ₂ or SO ₃ H, and n represents an integer of 1 to 4) or a salt thereof.
A therapeutic or prophylactic agent for asthma, comprising one or more species as an active ingredient. 【請求項２】 一般式（ＩＩ） 【化２】 （式中、Ｒ₈、Ｒ₉は同一または異なって、水素原子また
は炭素数１から４の低級アルキル基を示す）で表される
化合物およびその塩の１種または２種以上を有効成分と
して含有することを特徴とする請求項１記載の治療剤ま
たは予防剤。2. A compound of the general formula (II) (Wherein, R ₈ and R ₉ are the same or different and each represent a hydrogen atom or a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms) and one or more salts thereof as an active ingredient. The therapeutic or prophylactic agent according to claim 1, wherein the therapeutic or prophylactic agent is used.