JP2002350732A - Fluorescent observation apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光顕微鏡等の蛍
光観察装置に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a fluorescence observation device such as a fluorescence microscope.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、試料にある特定範囲の波長の照明
光を照射して、試料から発生する蛍光を観察する装置と
して、蛍光顕微鏡などの蛍光観察装置が知られている。
図３に、従来用いられている蛍光顕微鏡の光学系の概要
図を示す。光源としての水銀ランプ１１から紫外線を含
む連続スペクトルの光束が発生する。光源から発せられ
た光束は、投光管２０に配置されたレンズ２１、２２と
ダイクロイックミラー１３を介して対物レンズ２３の像
側焦点位置に結像される。ダイクロイックミラー１３と
光源１１の間には励起フィルターと呼ばれる波長選択フ
ィルター１２が配置され、特定の波長のみを選択して透
過させる。光束は、対物レンズ２３を通過後、平行光束
となって試料面を照明する。2. Description of the Related Art Conventionally, a fluorescence observation device such as a fluorescence microscope has been known as a device for irradiating a sample with illumination light of a specific range of wavelengths and observing fluorescence generated from the sample.
FIG. 3 shows a schematic diagram of an optical system of a conventionally used fluorescence microscope. A mercury lamp 11 as a light source generates a continuous spectrum light beam including ultraviolet rays. The luminous flux emitted from the light source is focused on the image side focal position of the objective lens 23 via the lenses 21 and 22 and the dichroic mirror 13 arranged on the light projecting tube 20. A wavelength selection filter 12 called an excitation filter is disposed between the dichroic mirror 13 and the light source 11, and selects and transmits only a specific wavelength. After passing through the objective lens 23, the light beam becomes a parallel light beam and illuminates the sample surface.
【０００３】試料は、照明光を受けて照明光の波長とは
異なる波長の蛍光を発生し、その蛍光の光束は対物レン
ズ２３で集光される。集光された光束は、ダイクロイッ
クミラー１３を透過して、波長選択フィルター１４に入
射する。波長選択フィルターでは、所定の波長の蛍光の
みが選択されて透過される。透過した波長の光束は、結
像レンズ２４、ミラー１５、１６を介して結像され、観
察像１７が形成される。観察像１７は接眼レンズ２５に
よって拡大され、観察者の肉眼２６で観察される。ミラ
ー１５は移動可能とされており、ミラー１５が光路から
外れた場合には、観察像１８がＣＣＤなどの撮像素子３
３の撮像面に形成されて撮像され、モニタ３４上で観察
される。[0003] The sample receives the illumination light and generates fluorescence having a wavelength different from the wavelength of the illumination light, and the light flux of the fluorescence is condensed by the objective lens 23. The collected light beam passes through the dichroic mirror 13 and enters the wavelength selection filter 14. In the wavelength selection filter, only fluorescence of a predetermined wavelength is selected and transmitted. The transmitted light flux is imaged through the imaging lens 24 and the mirrors 15 and 16 to form an observation image 17. The observation image 17 is magnified by the eyepiece 25 and is observed with the naked eye 26 of the observer. The mirror 15 is movable. When the mirror 15 deviates from the optical path, the observation image 18 is displayed on the image pickup device 3 such as a CCD.
The image is formed on the imaging surface of No. 3 and imaged, and is observed on the monitor 34.
【０００４】観察試料に応じて異なった蛍光を観察する
ことができるように、波長選択フィルター１２とダイク
ロイックミラー１３および波長選択フィルター１４は、
観察試料に応じてそれぞれ交換して使用可能とされてい
る。[0004] The wavelength selection filter 12, the dichroic mirror 13 and the wavelength selection filter 14 are provided so that different fluorescence can be observed depending on the observation sample.
It can be used by replacing each according to the observation sample.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】上記のような従来の蛍
光観察装置では、光源に高圧水銀ランプを用いている。
水銀ランプの特徴としては連続した波長の照明光が得ら
れる反面、特定の波長を選択するために励起フィルター
と呼ばれる波長選択フィルター１２が必要である。また
水銀ランプの連続点燈時間は百時間前後と短いので、ラ
ンプの交換等のメンテナンスに手間がかかるという問題
がある。さらに頻繁なランプの交換は維持費の増加につ
ながる。さらに水銀ランプは大きさも大きく、また、熱
が発生するという問題がある。In the above-mentioned conventional fluorescence observation apparatus, a high-pressure mercury lamp is used as a light source.
As a feature of the mercury lamp, while illumination light having a continuous wavelength can be obtained, a wavelength selection filter 12 called an excitation filter is required to select a specific wavelength. Further, since the continuous lighting time of the mercury lamp is as short as about 100 hours, there is a problem that maintenance such as replacement of the lamp is troublesome. More frequent lamp replacements increase maintenance costs. Further, the mercury lamp has a problem that it is large in size and generates heat.
【０００６】本発明はこのような事情に鑑みてなされた
ものであり、波長選択フィルターを必要とせず、かつ、
光源が小型で熱を発生せず、寿命の長い蛍光観察装置を
提供することを課題とする。[0006] The present invention has been made in view of such circumstances, does not require a wavelength selection filter, and
It is an object of the present invention to provide a fluorescent observation device in which a light source is small, does not generate heat, and has a long life.
【０００７】[0007]
【課題を解決する為の手段】前記課題を解決するための
第１の手段は、試料に照明光を照射して前記試料から発
生する蛍光を観察する蛍光観察装置であって、光源と、
対物レンズとを備え、前記光源が、異なる波長の光を放
出する複数の発光ダイオードからなることを特徴とする
蛍光観察装置（請求項１）である。A first means for solving the above problems is a fluorescence observation apparatus for irradiating a sample with illumination light and observing fluorescence generated from the sample, comprising: a light source;
A fluorescence observation apparatus (Claim 1), comprising an objective lens, wherein the light source comprises a plurality of light emitting diodes that emit light of different wavelengths.
【０００８】本手段においては、光源に発光ダイオード
を使用している。発光ダイオードの放出光は半値幅が10
〜30nm程度の限られた範囲の波長であるので、連続スペ
クトルを有する光を放出する水銀ランプを使用する場合
と異なり、波長選択フィルターを必要としない。よっ
て、構成が簡単になる。また、連続スペクトルを波長選
択フィルターで選択する場合は、どうしても目的の波長
の前後の波長の光を除去することができず、これらの光
が背景光（バックグラウンド）となってＳ／Ｂ比（信号
とバックグラウンドノイズとの比）を低下させるが、本
手段においては、このようなことがないので、Ｓ／Ｂ比
を高くすることができる。In this means, a light emitting diode is used as a light source. The light emitted from the light emitting diode has a half width of 10
Since the wavelength is within a limited range of about 30 nm, a wavelength selection filter is not required unlike the case of using a mercury lamp that emits light having a continuous spectrum. Therefore, the configuration is simplified. When a continuous spectrum is selected by a wavelength selection filter, light having wavelengths before and after a target wavelength cannot be removed, and these lights become background light (background), and the S / B ratio ( The ratio of the signal to the background noise is reduced, but in the present means, since such a situation does not occur, the S / B ratio can be increased.
【０００９】さらに、発光ダイオードの寿命は極めて長
いので、水銀ランプのように頻繁に交換する必要がな
い。さらに本手段においては、異なる波長の光を放出す
る複数の発光ダイオードを光源に使用しているので、発
光ダイオードを切り替えることにより、異なる波長の励
起光を照射することができる。また、顕微鏡で問題にな
る熱の発生もほとんど無い。Further, the life of the light emitting diode is extremely long, so that it is not necessary to replace the light emitting diode as frequently as a mercury lamp. Further, in this means, since a plurality of light emitting diodes emitting light of different wavelengths are used as the light source, it is possible to irradiate excitation light of different wavelengths by switching the light emitting diodes. Also, there is almost no generation of heat which is a problem in the microscope.
【００１０】前記課題を解決するための第２の手段は、
前記第１の手段であって、前記複数の発光ダイオード
が、前記対物レンズの像側焦点面又は像側焦点面の共役
面内に配置されていることを特徴とするもの（請求項
２）である。[0010] A second means for solving the above-mentioned problems is as follows.
The first means, wherein the plurality of light emitting diodes are arranged in an image-side focal plane of the objective lens or in a conjugate plane of the image-side focal plane (claim 2). is there.
【００１１】本手段においては、光源である発光ダイオ
ードが、対物レンズの像側焦点面又は像側焦点面の共役
面内に配置されているので、試料を照射する照明がケー
ラー照明となる。よって、光源に明るさのむらがあって
も、試料を一様な照明強度で照明することが可能とな
る。In this means, the illumination for irradiating the sample is Koehler illumination because the light emitting diode as the light source is arranged in the image side focal plane of the objective lens or in the conjugate plane of the image side focal plane. Therefore, even if the light source has uneven brightness, it is possible to illuminate the sample with uniform illumination intensity.
【００１２】前記課題を解決するための第３の手段は、
前記第１の手段又は第２の手段であって、各波長の光を
放出する発光ダイオードが、それぞれ複数個設けられて
いることを特徴とするもの（請求項３）である。A third means for solving the above-mentioned problem is as follows.
The first means or the second means, wherein a plurality of light emitting diodes each emitting light of each wavelength are provided (claim 3).
【００１３】本手段においては、発光ダイオードは、各
波長ごとに複数個設けられているので、観察する試料面
が広い場合でも、十分な強度の励起光を試料面に照射す
ることができる。In this means, since a plurality of light emitting diodes are provided for each wavelength, even if the sample surface to be observed is wide, it is possible to irradiate the sample surface with excitation light of sufficient intensity.
【００１４】[0014]
【発明の実施の形態】図１は本発明の実施の形態の１例
である蛍光顕微鏡の光学系を示す概要図である。光源と
しての発光ダイオード１、２、３から発せられた光束が
投光管２０に配置されたレンズ２１、２２とダイクロイ
ックミラー１３を介して対物レンズ２３の像側焦点位置
に結像される。対物レンズ２３の像側焦点面に結像され
た光源は平行光束となってステージ３２上の試料面を照
明する。光源にはそれぞれ別の波長の発光ダイオードが
用いられ、例えば光源１、２、３に順に青色発光ダイオ
ード、緑色発光ダイオード、赤色発光ダイオードなどが
それぞれ用いられる。FIG. 1 is a schematic view showing an optical system of a fluorescence microscope which is an example of an embodiment of the present invention. Light beams emitted from the light emitting diodes 1, 2, and 3 serving as light sources are focused on the image side focal position of the objective lens through the lenses 21 and 22 and the dichroic mirror 13 arranged in the light projecting tube 20. The light source formed on the image-side focal plane of the objective lens 23 illuminates the sample surface on the stage 32 as a parallel light flux. Light emitting diodes of different wavelengths are used as the light sources, and for example, blue light emitting diodes, green light emitting diodes, red light emitting diodes, and the like are used for the light sources 1, 2, and 3, respectively.
【００１５】電流供給装置３０は、発光ダイオードを、
それぞれの波長の発光ダイオードごとに点滅制御するこ
とが可能であり、必要に応じてそれぞれの波長の光を放
出する発光ダイオードが選択的に点灯されて試料を照明
する。発光ダイオードは、光軸に垂直な面内に２次元的
に配置し、異なる波長の発光ダイオードごとに、それぞ
れが均等になるようにするのがよい。また、望ましくは
電流供給装置３０によってそれぞれの発光ダイオードに
流す電流値を制御して、照明光の強度を制御するのがよ
い。The current supply device 30 includes a light emitting diode,
Blinking control can be performed for each light emitting diode of each wavelength, and a light emitting diode that emits light of each wavelength is selectively turned on to illuminate the sample as needed. The light emitting diodes are preferably arranged two-dimensionally in a plane perpendicular to the optical axis so that each light emitting diode of a different wavelength has a uniform light emitting diode. Preferably, the intensity of the illumination light is controlled by controlling the value of the current supplied to each light emitting diode by the current supply device 30.
【００１６】光源配置の例を図２に詳しく示す。図２の
左方は断面図であり、右方は光軸方向から見た図であ
る。各色の発光ダイオード、それぞれ青色発光ダイオー
ド１、緑色発光ダイオード２、赤色発光ダイオード３
が、軸に垂直な面内にバランス良く配置されている。こ
れらの発光ダイオードは、発光の広がりの中心方向が光
軸に平行になるように調整される。そして図１における
配置においては、すべての発光ダイオードは、対物レン
ズ２３の像側焦点面（＝照明側の前側焦点面）の共約面
上配置されているので、それぞれの光源から発する光
は、対物レンズ２３の作用により試料をケーラー照明す
ることになり、試料は一様な強度の光で照明される。FIG. 2 shows an example of the light source arrangement in detail. The left side of FIG. 2 is a cross-sectional view, and the right side is a view as viewed from the optical axis direction. Light-emitting diodes of each color, blue light-emitting diode 1, green light-emitting diode 2, red light-emitting diode 3, respectively
Are well-balanced in a plane perpendicular to the axis. These light emitting diodes are adjusted such that the center direction of the spread of light emission is parallel to the optical axis. In the arrangement shown in FIG. 1, all the light-emitting diodes are arranged on a common plane of the image-side focal plane (= front focal plane on the illumination side) of the objective lens 23, so that the light emitted from each light source is The sample is Koehler-illuminated by the action of the objective lens 23, and the sample is illuminated with light of uniform intensity.
【００１７】試料より発生した、照明波長とは異なる波
長の蛍光光束は、対物レンズ２３で集光され、さらに、
ダイクロイックミラー１３を透過して、波長選択フィル
ター１４によって選択され、結像レンズ２４によって観
察像１７が形成される。観察像は観察者に観察しやすい
ようにミラー１５、１６で折り曲げられ、接眼レンズ２
５を介して拡大され、観察者の肉眼２６で観察される。A fluorescent light beam having a wavelength different from the illumination wavelength, which is generated from the sample, is condensed by the objective lens 23.
The light passes through the dichroic mirror 13, is selected by the wavelength selection filter 14, and the observation image 17 is formed by the imaging lens 24. The observation image is bent by mirrors 15 and 16 so that the observer can easily observe the image.
5 and is observed by the observer's naked eye 26.
【００１８】また、ミラー１５は移動可能に配置されて
おり、光路から外れた場合には観察像１８が形成され配
置されたＣＣＤなどの撮像素子３３によって撮像され、
モニタ３４上で観察される。The mirror 15 is arranged so as to be movable. When the mirror 15 deviates from the optical path, an observation image 18 is formed and imaged by an image sensor 33 such as a CCD arranged.
It is observed on the monitor 34.
【００１９】発光ダイオードの波長と試料の関係の例で
は、生物分野で良く用いられる蛍光試薬フルオレセイン
を用いた試料を観察するときには、４７５ｎｍの青色発
光ダイオードを用い、ダイクロイックミラーには５０５
ｎｍを境に短波長側で反射、長波長側で透過する特性を
持つミラーが良く、さらに波長選択フィルターには５２
０ｎｍ以上を透過する特性のものが選択される。In the example of the relationship between the wavelength of the light emitting diode and the sample, when observing a sample using the fluorescent reagent fluorescein often used in the biological field, a blue light emitting diode of 475 nm is used and a dichroic mirror is 505.
It is preferable to use a mirror having a characteristic of reflecting light on the short wavelength side and transmitting light on the long wavelength side with a boundary of nm.
Those having characteristics of transmitting light of 0 nm or more are selected.
【００２０】さらに、発光ダイオードの波長としては、
たとえば、４００〜５００ｎｍの範囲の波長の光を放出
するもの、５００〜６００ｎｍの範囲の波長の光を放出
するもの、６００〜７００ｎｍの範囲の波長の光を放出
するものを選んで設けておけば、それぞれ青色系、緑色
系、赤色系の励起光で試料を照明することができる。ま
た、最近開発された紫外領域の光を放出する発光ダイオ
ードを用いれば、紫外光を励起光として用いることもで
きる。Further, the wavelength of the light emitting diode is as follows:
For example, a device that emits light having a wavelength in the range of 400 to 500 nm, a device that emits light having a wavelength in the range of 500 to 600 nm, and a device that emits light having a wavelength in the range of 600 to 700 nm are provided. The sample can be illuminated with blue, green, and red excitation light, respectively. In addition, if a recently developed light emitting diode that emits light in the ultraviolet region is used, ultraviolet light can be used as excitation light.
【００２１】ダイクロイックミラー１３と波長選択フィ
ルター１４は、選択された発光ダイオードの波長に応じ
て交換するようにしてもよいが、それぞれマルチバンド
の分光透過率を有するものを使用すれば、それぞれ１枚
で済ますことも可能である。The dichroic mirror 13 and the wavelength selection filter 14 may be exchanged according to the wavelength of the selected light emitting diode. However, if one having a multi-band spectral transmittance is used, one of each is used. It is also possible to do.
【００２２】[0022]
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
安価な発光ダイオードを用い、簡単な光学系構成で所望
の蛍光観察装置が形成されるため、全体として装置が安
価になる。さらに発光ダイオードは寿命が長いために、
長時間使用の目的に極めて都合が良い。また、各波長の
発光ダイオードを目的に応じて切り替えることで、従来
の蛍光顕微鏡などで用いられていた励起フィルターも不
要になり、構成が簡単になる上に原理的に他の波長の照
明光は発生しないため、背景光（バックグラウンド）が
低くなり、蛍光シグナルとの比Ｓ／Ｂ（ＳＢレシオ）が
改善される。また、発光ダイオードは消費電力も小さく
熱も発生せず小型であるため、顕微鏡で問題になる熱の
発生もほとんど無いという極めて優れた特徴がある。As described above, according to the present invention,
Since a desired fluorescence observation device is formed with a simple optical system configuration using an inexpensive light-emitting diode, the overall device is inexpensive. In addition, light emitting diodes have a long life,
Very convenient for long-term use. In addition, by switching the light emitting diode of each wavelength according to the purpose, an excitation filter used in a conventional fluorescence microscope or the like is not required, the configuration is simplified, and illumination light of another wavelength can be used in principle. Since this does not occur, the background light (background) is reduced, and the ratio S / B (SB ratio) to the fluorescence signal is improved. Further, since the light emitting diode is small in power consumption and generates no heat, it has an extremely excellent feature that almost no heat is generated which is a problem in a microscope.
【図１】本発明の実施の形態の１例である蛍光顕微鏡の
光学系を示す概要図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing an optical system of a fluorescence microscope which is an example of an embodiment of the present invention.
【図２】本発明の実施の形態の１例における光源配置の
例を示す図である。FIG. 2 is a diagram illustrating an example of a light source arrangement according to an example of an embodiment of the present invention.
【図３】従来用いられている蛍光顕微鏡の光学系を示す
概要図である。FIG. 3 is a schematic view showing an optical system of a conventionally used fluorescence microscope.
１、２、３…光源、１３…ダイクロイックミラー、１４
…波長選択フィルター、１５、１６…ミラー、１７…観
察像、２０…投光管、２１、２２…レンズ、２３…対物
レンズ、２４…結像レンズ、２５…接眼レンズ、２６…
肉眼、３０…電流供給装置、３２…ステージ、３３…撮
像素子、３４…モニタ1, 2, 3 ... light source, 13 ... dichroic mirror, 14
… Wavelength selection filters, 15, 16 mirrors, 17 observation images, 20 projection tubes, 21 22 lenses, 23 objective lenses, 24 imaging lenses, 25 eyepieces, 26
Naked eye, 30 current supply device, 32 stage, 33 image sensor, 34 monitor
Claims (3)
生する蛍光を観察する蛍光観察装置であって、光源と、
対物レンズとを備え、前記光源が、異なる波長の光を放
出する複数の発光ダイオードからなることを特徴とする
蛍光観察装置。1. A fluorescence observation apparatus for irradiating a sample with illumination light and observing fluorescence generated from the sample, comprising: a light source;
A fluorescence observation apparatus comprising: an objective lens; wherein the light source includes a plurality of light emitting diodes that emit light of different wavelengths.
て、前記複数の発光ダイオードが、前記対物レンズの像
側焦点面又は像側焦点面の共役面内に配置されているこ
とを特徴とする蛍光観察装置。2. The fluorescence observation apparatus according to claim 1, wherein the plurality of light emitting diodes are arranged in an image-side focal plane of the objective lens or a conjugate plane of the image-side focal plane. Fluorescent observation device.
装置であって、各波長の光を放出する発光ダイオード
が、それぞれ複数個設けられていることを特徴とする蛍
光観察装置。3. The fluorescence observation device according to claim 1, wherein a plurality of light emitting diodes each emitting light of each wavelength are provided.
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