JP2002345499A

JP2002345499A - 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット

Info

Publication number: JP2002345499A
Application number: JP2001161486A
Authority: JP
Inventors: Kentaro Nagamine; 憲太郎長嶺; Manabu Yoshino; 学吉野
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-05-29
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2002-12-03

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】標的核酸配列の検出方法及びキットの提供。【解決手段】相補的な塩基配列がハイブリダイズしたと
きに塩基対合可能なループを形成し、3'末端が自身にア
ニールしてループを形成し自身にアニールした3'末端は
自身を鋳型とする相補鎖合成の起点となることができる
鋳型ポリヌクレチド、鋳型ポリヌクレチドのループにお
いて異なる位置に相補鎖合成の起点を与えることができ
る２種類以上のプライマー伸長生成物において前記プラ
イマーとは異なる位置に相補鎖ごうせいの起点を与える
１種類以上の固定プライマー、DNAポリメラーゼ及び基
質を混合してインキュベートし、ポリヌクレチドの増幅
反応に伴う凝集反応を観察する方法。さらに前記方法に
使用するキット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸配列の検出方
法及び該方法に使用する標的塩基配列の検出用キットに
関する。

【０００２】

【従来の技術】ゲノムドラフトが明らかにされ、時代は
ポストシーケンスへと移りつつある。SNPsのような遺伝
子の機能解析や、その解析結果に基づく遺伝子診断の必
要性がますます高まっている。遺伝子の塩基配列をより
正確に、より迅速に解析することができる技術の開発
は、機能解析を迅速に進めるために、また遺伝子の機能
解析の成果を実際の医療の現場で実用化するうえで、重
要な課題となっている。

【０００３】ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)法に
よる鋳型依存的な核酸の合成方法は、近年の生命科学分
野における研究の大きな推進力となった。ＰＣＲ法は、
少量の２本鎖核酸を鋳型として、鋳型に対して相補的な
塩基配列で構成される核酸の指数関数的な増幅を可能と
した。いまやＰＣＲ法は、遺伝子のクローニングや検出
のための道具として、広く普及している。ＰＣＲ法で
は、目的とする塩基配列の両端に対して相補的な塩基配
列からなる１組のプライマーが用いられる。一方のプラ
イマーによってもたらされる伸長生成物には、他方のプ
ライマーがアニールするように設計される。こうして、
互いの伸長生成物へのアニールと相補鎖合成が繰り返し
行われる合成反応が進み、指数関数的な増幅が達成され
る。

【０００４】ＰＣＲ法においては、複雑な温度制御が不
可欠である。複雑な温度制御に対応するには、専用の反
応装置を使わなければならない。したがって、ベッドサ
イドや野外でPCRを実施することは困難である。また、
反応特異性の向上も、公知の相補鎖合成反応の重要な課
題であった。たとえばＰＣＲ法では、相補鎖合成産物が
新たな鋳型として用いられるとき、プライマーがアニー
ルする領域は、厳密には試料に由来する塩基配列ではな
くプライマーの塩基配列を写し取ったものに過ぎない。
したがって、ＰＣＲ用のプライマーを利用してわずかな
塩基配列の相違を認識するのは、一般には困難とされて
いる。

【０００５】これらの課題を解決するための１つの方法
として、本発明者らは、LAMP法(Loop-mediated isother
mal amplification)を完成している(Nucleic Acid Res.
2000 Vol.28 No.12 e63、WO 00/28082)。LAMP法は、鋳
型ポリヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相
補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるル
ープにアニールするプライマーを組み合わせることによ
って等温での相補鎖合成反応を可能とした。またLAMP法
では、3'末端が常に試料に由来する領域に対してアニー
ルするために、塩基配列のチェック機構が繰り返し機能
する。その結果、わずかな塩基配列の判別が可能となっ
た。

【０００６】LAMP法やPCR法のような相補鎖合成反応に
基づいて、標的塩基配列の検出を行う場合、その反応に
要する時間と、検出感度との間には密接な関係がある。
つまり、反応がプラトーに達するまでは、できるだけ長
い時間反応させることが、高い検出感度を達成するため
の条件となる。LAMP法やPCR法のような公知の相補鎖合
成反応は、１時間前後で反応がプラトーに達する。つま
り、最大の感度を得るためには１時間前後の反応時間を
要すると言って良い。１時間は、反応時間としてはそれ
ほど長いものではないが、もしも検出感度や操作性を犠
牲にすることなく、より短い反応時間を実現することが
できれば有用である。

【０００７】核酸の増幅法によって得られた増幅産物の
検出は、核酸反応混合物をゲル電気泳動で展開し、増幅
産物と、鋳型核酸やプライマー等の非検出対象成分とを
分離した状態で、蛍光染色によって増幅産物のバンドを
その分子量などから判断して特定してから、そのバンド
の蛍光強度を測定することにより行われてきた。

【０００８】しかしながら、核酸の増幅法を用いた核酸
の検出においては、反応溶液中に鋳型核酸と大過剰なプ
ライマー等が含まれており、増幅対象の核酸配列の種類
によっては、非検出対象成分と増幅産物とのゲル電気泳
動による分離操作が困難な場合も多い。また、検体数が
多くなると、煩雑なゲル電気泳動を行うことが多大な労
力と時間の浪費を伴うことになり、効率良い検出操作を
行う上での障害となっていた。特に臨床等における遺伝
子解析においては、多くの検体をより短時間で効率良く
処理できることが要求され、従来の方法ではこのような
要求には十分対応できるものではないという問題があっ
た。

【０００９】上記問題を解決するために、より簡便な核
酸増幅産物検出方法の開発が試みられてきた。特開平９
−１６８４００には核酸増幅反応に用いるプライマーを
不溶性担体に固定化、もしくは固定可能な状態にしてお
き、核酸増幅産物を凝集反応により検出する方法が記載
されている。

【００１０】特開平９−１６８４００ではＰＣＲにより
核酸を増幅しているが、ＰＣＲにより増幅産物を検出す
るためには、２種類のプライマーを固定化、もしくは固
定化可能な状態にしておく必要がある。また、不溶性担
体に固定化したプライマーを用いてＰＣＲを行った場
合、ＰＣＲ特有の温度サイクルに伴って核酸増幅産物は
凝集と分散を繰り返すことになるので、凝集反応により
核酸増幅反応をリアルタイムにモニタリングするには適
さない。このように、１種類の固定化プライマーで核酸
増幅産物を凝集し検出する方法や、核酸増幅反応を凝集
反応によりリアルタイムにモニタリングする方法は未だ
知られていない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ポリ
ヌクレオチドを鋳型として用いるポリヌクレオチドの増
幅反応に伴う凝集反応の有無を観察することによって、
試料中の標的核酸配列を迅速に検出する方法の提供であ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために相補鎖合成の条件について研究を重ね
た。そして、相補鎖合成に用いるプライマーと、相補鎖
合成の起点となる3’末端との組み合わせが、相補鎖合
成の反応速度と密接に関連していることを見出した。更
に、特定の構造を持った鋳型ポリヌクレオチドと、この
ポリヌクレオチドの特定の位置で相補鎖合成の起点を与
えることができる不溶性担体に固定したプライマーを組
み合わせることによって、相補鎖合成の反応効率を改善
するとともにポリヌクレオチドの増幅反応に伴い凝集反
応が生じることを発見し、本発明を完成した。すなわち
本発明は、以下の核酸配列を検出する方法、ならびにそ
の方法に使用する検出用キットに関する。

【００１３】１．以下の要素〔１〕〜〔５〕を混合して
インキュベートし、ポリヌクレオチドの増幅反応に伴う
凝集反応の有無を観察することを特徴とする、試料中の
標的核酸配列を検出する方法。〔１〕：次の条件(a)〜(d)を持つ鋳型ポリヌクレオチ
ド、(a)少なくとも１組の相補的な塩基配列からなる標
的塩基配列を有する、(b)（a）の相補的な塩基配列がハ
イブリダイズしたときに、塩基対結合が可能なループを
形成することができる、(c)3'末端が自身にアニールし
てループを形成することができる、(d)自身にアニール
した3'末端は自身を鋳型とする相補鎖合成の起点となる
ことができる〔２〕：鋳型ポリヌクレオチドのループにおいて、異な
る位置に相補鎖合成の起点を与えることができる少なく
とも２種類のプライマー、〔３〕：鋳型ポリヌクレオチド、および／または鋳型ポ
リヌクレオチドに〔２〕のプライマーがアニールして生
成する伸長生成物において、〔２〕のプライマーとは異
なる位置に相補鎖合成の起点を与えることができる少な
くとも１種類のプライマーであって、５’末端を不溶性
担体に固定化したもの（固定プライマー）、〔４〕：鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができ
るDNAポリメラーゼ、〔５〕：相補鎖合成のための基質、２．前記固定プライマー〔３〕が、鋳型ポリヌクレオチ
ド、および／または鋳型ポリヌクレオチドに〔２〕のプ
ライマーがアニールして生成する伸長生成物が形成する
ループにおいて、〔２〕のプライマーとは異なる位置に
相補鎖合成の起点を与えることができるプライマー(固
定ループプライマー)であることを特徴とする１に記載
の方法。３．不溶性担体が天然高分子担体、合成高分子担体、金
属コロイド、または磁性粒子である１または２に記載の
方法。４．不溶性担体が合成高分子担体のラテックスであるこ
とを特徴とする３に記載の方法。５．鋳型ポリヌクレオチドが、自身の塩基配列の任意の
領域に対して相補的な塩基配列をその5’末端に備えて
いる１〜４のいずれかに記載の方法。６．次の工程によって鋳型ポリヌクレオチドを生成する
１〜５のいずれかに記載の方法。ａ）標的塩基配列に第１のプライマーをアニールさせ、
これを起点とする相補鎖合成反応を行う工程；ここで第
１のプライマーはその3'末端において標的塩基配列を構
成する一方の鎖の3'側を規定する領域に相補鎖合成の起
点を与えることができ、かつ第１のプライマーの5'側に
は、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるもので
ある、ｂ）工程ａ）で合成された第１のプライマーを起点とす
る伸長生成物における第２のプライマーがアニールすべ
き領域を塩基対結合が可能な状態とする工程；ここで第
２のプライマーはその3'末端において前記第１のプライ
マーを起点とする伸長生成物における標的塩基配列の3'
側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることがで
きる塩基配列を備え、かつ第２のプライマーの5'側に
は、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるもので
ある、ｃ）工程ｂ）において塩基対結合が可能となった領域に
第２のプライマーをアニールさせ、これを起点とする相
補鎖合成を行う工程、ｄ）工程ｃ）によって合成された第２のプライマーを起
点とする伸長生成物の3'末端を自身にアニールさせて、
自身を鋳型とする相補鎖合成を行う工程７．前記２種類のプライマー〔２〕が、第１のプライマ
ー、および第２のプライマーである６に記載の方法。８．前記固定プライマー〔３〕が、第１のプライマーを
起点とする伸長生成物における第１のプライマーに由来
する領域と、第１のプライマーに対する前記任意の領域
の間において相補鎖合成の起点を与えることができる第
１の固定プライマー；および／または第２のプライマー
を起点とする伸長生成物における第２のプライマーに由
来する領域と、第２のプライマーに対する前記任意の領
域の間において相補鎖合成の起点を与えることができる
第２の固定プライマーを含むものである７に記載の方
法。９．工程ｂ）および／または工程ｃ）において、第１の
プライマーまたは第２のプライマーに対してその上流に
相補鎖合成の起点を与えるアウタープライマーからの相
補鎖合成によって、第１のプライマーおよび／または第
２のプライマーを起点とする伸長生成物を置換して第１
のプライマーまたは第２のプライマーを起点とする各生
成物を１本鎖とする４に記載の方法。１０．工程ａ）において、標的塩基配列が２本鎖ポリヌ
クレオチドとして存在しており、第１のプライマーがア
ニールする領域が、任意のプライマーを起点とする相補
鎖合成反応によって塩基対結合が可能な状態とされる４
に記載の方法。１１．工程ａ）を融解温度調整剤の存在下で行う１０に
記載の方法。１２．融解温度調整剤が、ベタイン、プロリン、ジメチ
ルスルホキシド、およびトリメチルアミンＮ−オキシド
から選択される少なくとも１つの化合物である１１に記
載の方法。１３．ピロリン酸塩形成抑制剤の存在下にポリヌクレオ
チドの増幅反応を行う１〜１２のいずれかに記載の方
法。１４．ピロリン酸塩形成抑制剤がPyrophosphataseであ
る１３に記載の方法。１５．１〜１４のいずれかに記載の方法によって標的塩
基配列における変異を検出する方法であって、標的塩基
配列が予測された塩基配列でなかったときに、前記増幅
方法を構成する相補鎖合成反応から選択される少なくと
も１つの相補鎖合成反応が妨げられるものであり、前記
増幅反応に伴う凝集反応が生じたかどうかを観察し、凝
集反応が生じなかったときに標的塩基配列が予測した塩
基配列でないと判定する工程を含む方法。１６．１〜１４のいずれかに記載の方法によって標的塩
基配列における変異を検出する方法であって、前記増幅
反応に伴う凝集反応が生じたかどうかを観察し、凝集反
応が生じたときに標的塩基配列が予測した塩基配列であ
ると判定する工程を含む方法。１７．次の要素を含む、標的塩基配列の検出用キット。ａ）第１のプライマー；ここで第１のプライマーはその
3'末端において標的塩基配列を構成する一方の鎖の3'側
を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることがで
き、かつ第１のプライマーの5'側には、このプライマー
を起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対し
て相補的な塩基配列を備えるものである、ｂ）第２のプライマー；ここで第２のプライマーはその
3'末端において前記第１のプライマーを起点とする伸長
生成物における標的塩基配列の3'側を規定する領域に相
補鎖合成の起点を与えることができる塩基配列を備え、
かつ第２のプライマーの5'側には、このプライマーを起
点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相
補的な塩基配列を備えるものである、ｃ）少なくとも１種類の5’末端を不溶性担体に固定し
た固定プライマー；ここで該固定プライマーは、第１の
プライマー、または第２のプライマーを起点とする伸長
生成物において、各プライマーとは異なる位置に相補鎖
合成の起点を与えることができるものである、ｄ）鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができるDN
Aポリメラーゼ、ｅ）相補鎖合成のための基質、ｆ)ピロリン酸塩形成抑制剤、１８．固定プライマーが、鋳型ポリヌクレオチド、およ
び／または鋳型ポリヌクレオチドに第１のプライマーま
たは第２のプライマーがアニールして生成する伸長生成
物が形成するループにおいて、各プライマーとは異なる
位置に相補鎖合成の起点を与えることができるプライマ
ー(固定ループプライマー)であることを特徴とする１７
に記載のキット。１９．前記固定プライマーｃ）が、第１のプライマーを
起点とする伸長生成物における第１のプライマーに由来
する領域と、第１のプライマーに対する前記任意の領域
の間において相補鎖合成の起点を与えることができる第
１の固定プライマー；および第２のプライマーを起点と
する伸長生成物における第２のプライマーに由来する領
域と、第２のプライマーに対する前記任意の領域の間に
おいて相補鎖合成の起点を与えることができる第２の固
定プライマーを含むものである１７または１８に記載の
キット。２０．更に次の要素ｇ）を含む１７〜１９のいずれかに
記載のキット。ｇ）アウタプライマー；アウタープライマーは、第１の
プライマーおよび／または第２のプライマーの上流に相
補鎖合成の起点を与えることができる２１．ピロリン酸塩形成抑制剤がPyrophosphataseであ
る１７〜２０のいずれかに記載のキット。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、特定構造の鋳型ポリヌ
クレオチドと、このポリヌクレオチドの特定の領域に相
補鎖合成の起点を与えることができる、5’末端を不溶
性担体に固定したプライマーを組み合わせることによっ
て、迅速な相補鎖合成を可能とするとともに、ポリヌク
レオチドの増幅反応に伴う凝集反応の有無を観察するこ
とによって、試料中の標的核酸配列を迅速に検出するこ
とを可能とした。まず本発明に用いる鋳型ポリヌクレオ
チドは、次の構造を有する。 (a)少なくとも１組の相補的な塩基配列からなる標的塩
基配列を有する、(b)(a)の相補的な塩基配列がハイブリ
ダイズしたときに、塩基対結合が可能なループを形成す
ることができる、(c)3'末端が自身にアニールしてルー
プを形成することができる、(d)自身にアニールした3'
末端は自身を鋳型とする相補鎖合成の起点となることが
できる。

【００１５】本発明において、ポリヌクレオチドとは、
DNA、またはRNA、あるいはそれらのキメラ分子であるこ
とができる。ポリヌクレオチドは、天然のものであるこ
ともできるし、人工的に合成されたものであることもで
きる。また部分的に、あるいは全体が完全に人工的な構
造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基
対結合を形成しうるものであり、かつ必要に応じて相補
鎖合成の鋳型とすることが可能であるかぎり本発明のポ
リヌクレオチドに含まれる。このような分子としては、
たとえばペプチド結合によってバックボーンが形成され
ているPNAなどを示すことができる。本発明におけるポ
リヌクレオチドの構成塩基数は、制限されない。ポリヌ
クレオチドは、用語「核酸」と同義である。一方、本発
明におけるオリゴヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド
の中でも特に構成塩基数が少ないものを示す用語として
用いる。一般にオリゴヌクレオチドは、２〜１００、よ
り一般的には、２〜５０程度の塩基数のポリヌクレオチ
ドを指してオリゴヌクレオチドと呼ぶが、これらの数値
に限定されるものではない。

【００１６】本発明において標的塩基配列とは、合成す
べきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポ
リヌクレオチドの塩基配列は、5'側から3'側に向けてセ
ンス鎖の塩基配列を記載する。本発明における標的塩基
配列とは、センス鎖の塩基配列に加えて、その相補鎖、
すなわちアンチセンス鎖の塩基配列も含む。すなわち、
用語「標的塩基配列」とは、合成すべき塩基配列、およ
びその相補鎖の少なくともいずれかを意味する用語とし
て用いる。なお本発明はポリヌクレオチドの合成、増幅
のみならず標的塩基配列の検出をも可能とする方法を提
供する。本発明に基づいてポリヌクレオチドの増幅を行
う場合には、増幅すべき塩基配列を標的塩基配列と呼
ぶ。標的塩基配列は、長いポリヌクレオチドの中から選
択された任意の連続した塩基配列であることもできる
し、あるいは１本鎖や環状のポリヌクレオチドの全長を
標的塩基配列とすることもできる。なお合成(synthesi
s)とは１つの標的塩基配列を少なくとも２倍以上に増や
す行為を意味する。一方、合成された標的塩基配列に基
づいて、連続的に新たな標的塩基配列が合成されると
き、特に増幅(amplification)と呼ぶ。増幅とは、合成
が連続的に行われること、と言うこともできる。更に本
発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳
型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要
なプライマーとして機能するポリヌクレオチドの3'末端
をハイブリダイズさせることを言う。特定の領域におい
て相補鎖合成の起点を与えると言うときは、当該領域の
中の任意の位置に相補鎖合成の起点となる3'末端が位置
するように、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる
ことを意味する。このとき、3'末端が目的とする領域に
位置する限り、ハイブリダイズに必要な塩基配列の一部
をその領域の外に配置することもできる。また本発明に
おいて、3'末端、あるいは5'末端：3'末端、あるいは5'
末端とは、単にいずれかの末端の１塩基のみならず、末
端の１塩基を含み、かつ末端に位置する領域を意味す
る。より具体的には、いずれかの末端から５００塩基、
望ましくは１００塩基、あるいは少なくとも２０塩基
は、3'末端、あるいは5'末端に含まれる。これに対し
て、末端の１塩基や末端付近に存在する特定の位置の塩
基を示すためには、その位置を数値で特定することによ
って示すものとする。

【００１７】本発明の標的塩基配列は少なくとも１組の
相補的な塩基配列からなっている。本発明において同
一、あるいは相補的という用語は、いずれも完全に同一
でない場合、あるいは完全に相補的でない場合を含む。
すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してアニ
ールすることができる塩基配列に対して相補的な配列を
も含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェ
ントな条件下でアニールすることができ、相補鎖合成の
起点となる3'末端を提供することができる配列を意味す
る。具体的には、ある塩基配列に対して、一般に５０−
１００％、通常は７０−１００％、好ましくは８０−１
００％の同一性を有する塩基配列は、実質的に同一と言
うことができる。同一性はBLASTN等の公知のアルゴリズ
ムに基づいて決定することができる。

【００１８】本発明の鋳型ポリヌクレオチドは、前記相
補的な塩基配列がハイブリダイズしたときに、ループを
形成することができる。相補的な塩基配列はハイブリダ
イズした後には、塩基対結合が安定に維持される条件の
もとでは、もはや新たな塩基対結合を生じることは困難
である。一方ループは、このループを構成する塩基配列
に相補的な塩基配列からなる別のポリヌクレオチドと新
たな塩基対結合を形成することができる。ループを構成
する塩基配列は任意である。

【００１９】本発明において用いられるハイブリダイズ
という用語は、相補的な塩基配列からなるポリヌクレオ
チドが塩基対結合によって結合することを意味する。塩
基対結合するポリヌクレオチドは別の分子であることも
できるし、同一の分子であることもできる。異なる分子
間で生じたハイブリダイズを解消すれば、複数のポリヌ
クレオチド分子に解離する。一方、同一の分子上でハイ
ブリダイズしたポリヌクレオチドは、塩基対結合を解消
しても１分子のポリヌクレオチドのままである。本発明
においては、アニールという用語も用いられる。ポリヌ
クレオチドが相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズして相補鎖合成の起点となる3’末
端を与えるとき、特にアニールと表現する場合がある。

【００２０】本発明の鋳型ポリヌクレオチドは、その3'
末端が自身にアニールしてループを形成することがで
き、更に自身にアニールした3'末端は自身を鋳型とする
相補鎖合成の起点となることができる。アニールするた
めの塩基配列は、その3’末端からの相補鎖合成を可能
とする限り制限されない。具体的には、たとえばポリヌ
クレオチドの3’から１００−２００塩基、通常５０−
８０塩基、望ましくは２０−３０塩基が前記標的塩基配
列中の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有する。
このとき、アニールした3’末端の塩基は、標的塩基配
列に対して完全に相補的であることが望ましい。3’末
端の塩基が完全に相補的であることは、必須ではない
が、効率的な相補鎖合成の重要な条件である。本発明の
鋳型ポリヌクレオチドは、3’末端の自身へのアニール
によって、ループを形成することができる。ループは前
記ループと同様に、任意の塩基配列からなり、他のポリ
ヌクレオチドと塩基対結合が可能な状態で存在する。

【００２１】また本発明の鋳型ポリヌクレオチドは、そ
の5’末端において、自身が有する任意の領域に対して
相補的な塩基配列を備えることができる。このような鋳
型ポリヌクレオチドの相補鎖が合成されると、合成され
た新たなポリヌクレオチドの3’末端は、自身の任意の
領域に対してアニールして、自身を鋳型とする相補鎖合
成反応の起点となることができる。3’末端が自身にア
ニールすることによって、ループが形成される。こうし
て形成されるループには、本発明におけるプライマーが
アニールすることができる。このように、鋳型ポリヌク
レオチドの5’末端を、自身が有する任意の領域に対し
て相補的な塩基配列とすることによって、相補鎖合成の
生成物を再び鋳型ポリヌクレオチドとして利用すること
ができる。したがって、このような鋳型ポリヌクレオチ
ドは、本発明において、高度に効率的な相補鎖合成反応
を達成するための望ましい構造である。

【００２２】本発明における鋳型ポリヌクレオチドは、
酵素的に、あるいは化学的に合成することができる。た
とえば、以下の工程ａ）−ｄ）を経て鋳型ポリヌクレオ
チドを合成することができる。以下の工程ａ）−ｄ）
は、LAMP法を利用したポリヌクレオチドの合成方法と言
うことができる。ａ）標的塩基配列に第１のプライマーをアニールさせ、
これを起点とする相補鎖合成反応を行う工程；ここで第
１のプライマーはその3'末端において標的塩基配列を構
成する一方の鎖の3'側を規定する領域に相補鎖合成の起
点を与えることができ、かつ第１のプライマーの5'側に
は、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるもので
ある、ｂ）工程ａ）で合成された第１のプライマーを起点とす
る伸長生成物における第２のプライマーがアニールすべ
き領域を塩基対結合が可能な状態とする工程；ここで第
２のプライマーはその3'末端において前記第１のプライ
マーを起点とする伸長生成物における標的塩基配列の3'
側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることがで
きる塩基配列を備え、かつ第２のプライマーの5'側に
は、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるもので
ある、ｃ）工程ｂ）において塩基対結合が可能となった領域に
第２のプライマーをアニールさせ、これを起点とする相
補鎖合成を行う工程、ｄ）工程ｃ）によって合成された第２のプライマーを起
点とする伸長生成物の3'末端を自身にアニールさせて、
自身を鋳型とする相補鎖合成を行う工程。

【００２３】上記工程を図１に基づいてより具体的に説
明する。以下の説明では、仮にＲ２およびＲ１ｃからな
る第１のプライマー（ＲＡ）、ならびにＦ２およびＦ１
ｃからなる第２のプライマー（ＦＡ）を用いて、本発明
における鋳型ポリヌクレオチドを生成する行程を例示す
る。以下の説明においては、第１のプライマーおよび第
２のプライマーを、それぞれ仮にＲＡおよびＦＡと名づ
ける。第１のプライマーＲＡは、その3'末端において標
的塩基配列を構成する一方の鎖の3'側を規定する領域に
相補鎖合成の起点を与えることができ、かつ第１のプラ
イマーＲＡの5'側には、このプライマーを起点とする相
補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基
配列を備える。ＲＡの3’側の領域をＲ２、5’側の領域
をＲ１ｃと称する。一方、第２のプライマーＦＡは、そ
の3'末端において前記第１のプライマーＲＡを起点とす
る伸長生成物における標的塩基配列の3'側を規定する領
域に相補鎖合成の起点を与えることができる塩基配列を
備え、かつ第２のプライマーＦＡの5'側には、このプラ
イマーを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域
に対して相補的な塩基配列を備える。ＦＡの3’側はＦ
２、5’側はＦ１ｃと称する。更にＲＡとＦＡの3’側と
5’側を構成する各領域は、それぞれ次のような領域に
対して相補的な塩基配列からなっている。ＲＡの3’側（Ｒ２）：Ｒ２ｃＲＡの5’側（Ｒ１ｃ）：Ｒ１ＦＡの3’側（Ｆ２）：Ｆ２ｃＦＡの5’側（Ｆ１ｃ）：Ｆ１

【００２４】結局、ＲＡは標的塩基配列のＲ２ｃとＲ１
によって、またＦＡは標的塩基配列におけるＦ２ｃとＦ
１によってその構造が決定されることになる。したがっ
て本発明においては、標的塩基配列は、少なくともその
一部の塩基配列が明らかとなっている、あるいは推測が
可能な状態にある塩基配列であることが求められる。塩
基配列を明らかにすべき部分とは、ＲＡとＦＡの構造を
決定する各領域、あるいはその相補的な塩基配列からな
る領域である。Ｒ２ｃとＲ１ｃ（またはＦ２ｃとＦ１
ｃ）は、連続する場合、そして離れて存在する場合とを
想定することができる。両者の相対的な位置関係によ
り、生成物であるポリヌクレオチドが自己アニールした
ときに形成されるループ部分の状態が決定される。本発
明において、自己アニールとは、１本鎖ポリヌクレオチ
ドの3'末端を含む領域が、そのポリヌクレオチド自身の
相補的な塩基配列にハイブリダイズして、自身を鋳型と
する相補鎖合成の起点となることを意味する。生成物で
あるポリヌクレオチドが分子間のアニールではなく自己
アニールを優先的に行うためには、両者の距離が不必要
に離れないほうが望ましい。したがって、両者の位置関
係は、通常0-500塩基分の距離を介して連続するように
するのが望ましい。ただし、後に述べる自己アニールに
よるループの形成において、両者があまりにも接近して
いる場合には望ましい状態のループの形成を行うには不
利となるケースも予想される。

【００２５】ループにおいては、新たなオリゴヌクレオ
チドのアニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う
相補鎖合成反応がスムーズに開始できる構造が求められ
る。したがってより望ましくは、領域Ｒ２ｃおよびその
5'側に位置する領域Ｒ１ｃとの距離が、０〜１００塩
基、さらに望ましくは１０〜７０塩基となるように設計
する。なおこの数値はＲ１ｃとＲ２ｃを含まない長さを
示している。ループ部分を構成する塩基数は、更にＲ２
に相当する領域を加えた長さとなる。なお同様の条件が
ＦＡにおけるＦ２ｃとＦ１ｃにも適用される。

【００２６】上記標的塩基配列に対してＲＡおよびＦＡ
を構成する領域Ｒ２とＲ１ｃ（またはＦ２とＦ１ｃ）
は、通常は重複することなく連続して配置される。ある
いはもしも両者の塩基配列に共通の部分があるのであれ
ば、部分的に両者を重ねて配置することもできる。Ｒ２
（またはＦ２）はプライマーとして機能する必要がある
ことから、常に3'末端となるようにしなければならな
い。一方Ｒ１ｃ（またはＦ１ｃ）は、後に述べるよう
に、これを鋳型として合成された相補鎖の3'末端にプラ
イマーとしての機能を与える必要があることから、5'末
端に配置する。このオリゴヌクレオチドを合成起点とし
て得られる相補鎖は、次のステップにおいては逆向きか
らの相補鎖合成の鋳型となり、最終的にはＲＡとＦＡも
鋳型として相補鎖に写し取られる。写し取られることに
よって生じる3'末端は塩基配列Ｒ１（またはＦ１）を備
えており、同一鎖上のＲ１ｃ（またはＦ１ｃ）にアニー
ルするとともに、ループを形成する。

【００２７】まず１本鎖とされた標的塩基配列における
Ｒ２ｃに第１のプライマーのＲ２がアニールし、相補鎖
合成が行われる［図１―（１）］。第１のプライマーを
起点とする伸長生成物を、例えばアウタープライマーＲ
３を使用して鎖置換伸長反応を行うことによって１本鎖
とし[図１−（２）]、そのＦ２ｃに第２のプライマーの
Ｆ２をアニールさせて相補鎖合成を行うと[図１−
（３）]、相補鎖合成は第１のプライマーの5’末端に達
したところで終了する。このとき合成される第２のプラ
イマーを起点とする伸長生成物は、その3’末端にＲ１
を備えている[図１−（４）]。3’末端のＲ１は、第１
のプライマーの5’側Ｒ１ｃを鋳型として合成された領
域である。第２のプライマーを起点とする伸長生成物
を、例えばアウタープライマーＦ３を使用して鎖置換伸
長反応を行うことによって、両端にループを有する第１
のポリヌクレオチド（basic dumbbel form 1）が得られ
る[図−（５）]。このポリヌクレオチドでは、Ｒ１は自
身のＲ１ｃにアニールして相補鎖合成の起点となり、自
身を鋳型とする相補鎖合成が行われる［図２−
（６）］。以上の反応を経て生成されるポリヌクレオチ
ドは、標的塩基配列とその相補鎖からなる１組の相補的
な塩基配列を備え、それがハイブリダイズしたときには
塩基対結合が可能なループを形成する。加えて、その
3’末端には、自身のＦ１ｃに相補的な塩基配列からな
るＦ１を備えている。Ｆ１は第２のプライマーのＦ１ｃ
を鋳型として合成された領域である。すなわち、この生
成物は本発明における鋳型ポリヌクレオチドに他ならな
い。

【００２８】この生成物のループには、第１のプライマ
ーＲＡのＲ２がアニールし、鎖置換反応を伴なう相補鎖
合成が行われる。そして、鎖置換によって１本鎖とされ
た３’末端のＦ１は自身のＦ１Ｃにアニールしてループ
を形成するとともに、相補鎖合成の起点となり、自身を
鋳型とする相補鎖合成が行われる。[図２−（７）]この
Ｆ１を起点とする鎖置換伸長反応によって、図２−
（８）のループを有する鎖伸長生成物が得られるととも
に、前記ループにアニールした第１のプライマーを起点
とする伸長生成物が置換されて、両端にループを有する
第２のポリヌクレオチド（basic dumbble form 2）が得
られる。〔図２−（５’）〕

【００２９】そして、このbasic dumbbel form 2におい
てもbasic dumbbel form１と同様に、Ｆ１が自身のＦ１
ｃにアニールして相補鎖合成の起点となり、自身を鋳型
とする相補鎖合成反応〔図２−（５’）〕、ループへの
第２のプライマーＦＡのアニールと鎖置換伸長反応〔図
２−（６’）〕、および１本鎖とされた３’末端のＲ１
のＲ１ｃへのアニールと自身を鋳型とする相補鎖合成反
応が行われ、図２−（８’）のループを有する鎖伸長生
成物とともに図２−（５）のbasic dumbbel form１が得
られる。

【００３０】なお、図２−（８）において標的塩基配列
を構成しているのは、Ｆ２とＲ２ｃの間、ならびにその
相補的な塩基鎖であるＲ２とＦ２ｃの間を構成する塩基
配列である。図１における（１）〜（５）の反応は、実
際には標的塩基配列の相補鎖においても平行して進行
し、第２のプライマーＦＡの相補鎖合成から始まって、
図２−（５’）の両端にループを有する第２のポリヌク
レオチド（basic dumbbel form２）が得られる。

【００３１】次に、LAMP法に基づいて鋳型ポリヌクレオ
チドを合成するための反応における工程ｂ）、すなわち
工程ａ）で合成された第１のプライマーを起点とする伸
長生成物における第２のプライマーがアニールすべき領
域を塩基対結合が可能な状態とする工程を行うには、ア
ウタープライマーの利用が有利である。本発明におい
て、アウタープライマーとは、標的塩基配列に対してア
ニールする第１のプライマーおよび第２のプライマーよ
り上流に対して相補的な塩基配列からなるプライマーで
ある。本発明において、上流とは、鋳型における3'側を
意味する。したがってアウタープライマーがアニールす
るのは、第１のプライマーおよび第２のプライマーから
見れば5'側の領域となる。

【００３２】例えば図１−（２）においては、ＲＡがア
ニールする領域Ｒ２ｃの3'側に位置するＲ３ｃにアニー
ルするアウタープライマーＲ３が記載されている。同様
にその相補鎖においては、ＦＡがアニールする領域の3'
側に位置するＦ３ｃに対してアウタープライマーＦ３を
アニールさせることができる〔図１−（４）〕。アウタ
ープライマーは、プライマーとして機能する塩基配列を
少なくともその3'側に備えるオリゴヌクレオチドを用い
ることができる。第１のプライマーおよび第２のプライ
マー２種は、本発明における３種のプライマーのうちの
２種として用いることができる。一方ここで述べたアウ
タープライマーは、必ずしも本発明の３種のプライマー
を構成しなくても良い。アウタープライマーは、鋳型ポ
リヌクレオチドの合成のために用いられる。

【００３３】第１のプライマーおよび第２のプライマー
が通常２つのプライマーの組み合わせで構成されるのに
対して、アウタープライマーは、任意の数であることが
できる。本発明において、一般的なアウタープライマー
は、第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞ
れに対して上流に相補鎖合成の起点を与えることができ
る２つのアウタープライマーからなる。しかし、いずれ
かの第１のプライマーおよび第２のプライマーに対して
のみ、アウタープライマーを配置する場合でも、本発明
の方法を実施することができる。あるいは、第１のプラ
イマーおよび第２のプライマーのそれぞれ、あるいは一
方に対して、複数のアウタープライマーを組み合わせる
こともできる。いずれにせよ、より上流からの相補鎖合
成を伴う場合に、第１のプライマーおよび第２のプライ
マーを複製起点とする相補鎖合成反応の生成物を効率良
く生じさせることが可能となる。

【００３４】本発明におけるアウタープライマーからの
相補鎖合成は、第１のプライマーおよび第２のプライマ
ーを複製起点とする相補鎖合成よりも後に開始されるよ
うに設計する。そのための最も単純な方法は第１のプラ
イマーおよび第２のプライマーの濃度をアウタープライ
マーの濃度よりも高くすることである。具体的には、通
常２〜５０倍、望ましくは４〜１０倍の濃度差でプライ
マーを用いることにより、第１のプライマーおよび第２
のプライマーからの相補鎖合成を優先的に行わせること
ができる。またアウタープライマーの融解温度(Tm)を第
１のプライマーおよび第２のプライマーのTmより低くな
るように設定することによって合成のタイミングをコン
トロールすることもできる。

【００３５】すなわち、（アウタープライマーＦ３：Ｆ
３ｃ）≦（Ｒ２ｃ／Ｒ２）≦（Ｒ１ｃ／Ｒ１）、であ
る。なおここで（Ｒ２ｃ／Ｒ２）≦（Ｒ１ｃ／Ｒ１）と
したのは、Ｒ２がループ部分にアニールするよりも先に
Ｒ１ｃ／Ｒ１間のアニールを行わせるためである。Ｒ１
ｃ／Ｒ１間のアニールは分子内の反応なので優先的に進
む可能性が高い。しかしより望ましい反応条件を与える
ためにTmを考慮することには意義がある。同様の条件
は、リバースプライマーの設計においても考慮すべきで
あることは言うまでもない。このような関係とすること
により、確率的に理想的な反応条件を達成することがで
きる。融解温度(Tm)は、他の条件が一定であればアニー
ルする相補鎖の長さと塩基対結合を構成する塩基の組み
合わせによって理論的に算出することができる。したが
って当業者は、本明細書の開示に基づいて望ましい条件
を容易に導くことができる。

【００３６】更にアウタープライマーのアニールのタイ
ミングを調整するために、コンティギュアス・スタッキ
ング(contiguous stacking)と呼ばれる現象を応用する
こともできる。コンティギュアス・スタッキングとは、
単独ではアニールすることができないオリゴヌクレオチ
ドが２本鎖部分に隣接することによってアニールが可能
となる現象である(Chiara Borghesi-Nicoletti et.al.
Bio Techniques 12, 474-477, 1992)。つまり、アウタ
ープライマーを第１のプライマーおよび第２のプライマ
ーに隣接させ、しかもアウタープライマー単独ではイン
キュベーションの条件下ではアニールできないように設
計しておくのである。こうすれば、第１のプライマーお
よび第２のプライマーがアニールしたときに初めてアウ
タープライマーのアニールが可能となるので、必然的に
第１のプライマーおよび第２のプライマーのアニールが
優先されることになる。この原理に基づいて、一連の反
応にプライマーとして必要なオリゴヌクレオチドの塩基
配列を設定した例が実施例に記載されている。

【００３７】上記反応において、標的塩基配列を含むポ
リヌクレオチド試料は、相補鎖合成の鋳型となりうる任
意のポリヌクレオチドを利用することができる。具体的
には、DNAやRNA、それらの誘導体、並びにキメラ分子を
示すことができる。更にポリヌクレオチド試料には、ゲ
ノムDNAやmＲＮＡ等の天然のポリヌクレオチドの他、プ
ラスミドやファージなどに人為的に組みこまれたポリヌ
クレオチドを用いることもできる。ポリヌクレオチド試
料は精製したもののみならず、未精製の状態のまま用い
ることもできる。細胞中のポリヌクレオチドをIn situ
で合成の対象とすることもできる。

【００３８】次に本発明においては、ループの異なる領
域に相補鎖合成の起点を与えることができる少なくとも
３種類のプライマーが用いられる。プライマーが相補鎖
合成の起点を与えるループとは、前記鋳型ポリヌクレオ
チドが備えているループに加え、その3’末端やいずれ
かのプライマーを起点とする相補鎖合成の結果生成され
る新たなポリヌクレオチドによって形成されるループが
含まれる。鋳型ポリヌクレオチドは、少なくとも次の２
つのループを有する。 1.標的塩基配列がハイブリダイズすることによって形成
されるループ 2.鋳型ポリヌクレオチドの3'末端が自身にアニールする
ことによって形成されるループ

【００３９】鋳型ポリヌクレオチドが２組以上の相補的
な標的塩基配列からなり、かつ相補的な塩基配列が交互
に並んでいる場合には、その数に応じたループが鋳型ポ
リヌクレオチド上に形成される。例えば、ある塩基配列
Ａと、その相補的な塩基配列ａとで構成されるポリヌク
レオチドを想定する。複数組の相補的な塩基配列が交互
に並んだ状態とは、たとえば次のように表すことができ
る。 5'-［Ａ］-(L)-［ａ］−［Ａ］-(L)-［ａ］−［Ａ］-
(L)-［ａ］-3'

【００４０】この例では、隣り合う［Ａ］−［ａ］間で
ハイブリダイズが起きたときに３つのループを形成する
ことができる。相補的な塩基配列のハイブリダイズによ
ってループが形成される部分を-(L)-で示した。更に3'
末端の自身へのアニールによって形成されるループが加
わり、この鋳型ポリヌクレオチドは合計４つのループを
形成することになる。なお、3’末端が自身へのアニー
ルによってループを形成するときには、［ａ］の塩基配
列の一部がアニールのために利用される。したがって、
3’末端の［ａ］においては、［Ａ］と相補的な塩基配
列でありながら、［Ａ］とはハイブリダイズすることな
く自身へのアニールに利用される領域が存在することに
なる。なお本発明における鋳型ポリヌクレオチドが含む
ことができる相補的な塩基配列の数は制限されない。し
たがって、［Ａ］と［ａ］とで構成される鋳型ポリヌク
レオチドを一般式で表すとすれば、次のように表すこと
ができる。式中、ｎは任意の自然数を意味する。 5'-｛［Ａ］-(L)-［ａ］｝n-3'

【００４１】一方、鋳型ポリヌクレオチドの3’末端、
あるいはいずれかのプライマーを起点とする相補鎖合成
の結果生成される新たなポリヌクレオチドによって形成
されるループは、具体的には次のようにして形成され
る。まず鋳型ポリヌクレオチドは、その3’末端を自身
にアニールさせて自身を鋳型とする相補鎖合成反応を行
うことができる。この反応は、3'末端とそれがアニール
する領域とを繰り返し塩基対結合が可能な状態にするこ
とができれば、連続的に進行する。その結果、鋳型ポリ
ヌクレオチドに相補的な塩基配列が繰り返し伸長するこ
とになる。したがって、鋳型ポリヌクレオチドが１組の
相補的な塩基配列からなる場合、相補鎖合成によって得
られた新たなポリヌクレオチドには、相補鎖合成反応を
繰り返す度に相補的な塩基配列の数は倍になる。ここで
新たに生成されたポリヌクレオチドにおける２組の相補
的な塩基配列がそれぞれハイブリダイズすると、相補的
な塩基配列のセットの数に応じた数のループを生じる
［たとえば図３−（９）等］。これらのループのうち、
あるものは鋳型ポリヌクレオチドがもともと有していた
ループである。他方のループは、鋳型ポリヌクレオチド
のループの相補的な塩基配列からなっている。このよう
にして生じた新たなループも、本発明におけるプライマ
ーがアニールするループに含まれる。

【００４２】更に本発明におけるループには、鋳型ポリ
ヌクレオチドが有するループにプライマーがアニールし
て相補鎖合成の起点となることによって生成した新たな
ポリヌクレオチドに形成されたループが含まれる。たと
えば、鋳型ポリヌクレオチドの3’末端が自身にアニー
ルすることによって形成されるループに相補鎖合成の起
点を与えることができるプライマーを起点として相補鎖
を合成することができる。その生成物は、鋳型に対して
相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとなる。こ
のポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドと同様に
相補的な塩基配列がハイブリダイズすることによって、
ループを形成する。すなわち、鋳型ポリヌクレオチドが
有するループに相補的な塩基配列からなるループを備え
るポリヌクレオチドが生成する。

【００４３】本発明におけるプライマーは、このように
して形成される新たなループに相補鎖合成の起点を与え
ることができるプライマーが含まれる。あるいは、既に
述べたように鋳型ポリヌクレオチドが自身の任意の領域
に相補的な塩基配列を5’末端に含む場合、これを鋳型
として合成されたポリヌクレオチドの3’末端は、自身
にアニールしてループを形成することができる。本発明
では、このようにして形成されるループに相補鎖合成の
起点を与えることができるプライマーを用いることもで
きる。なお鋳型ポリヌクレオチドの5'末端が自身の任意
の領域に対して相補的な塩基配列を含むとき、5’末端
は自身にハイブリダイズしてループを形成することがで
きる。5’末端のループも塩基対結合が可能な状態には
ある。しかし、このループに相補鎖合成の起点を与える
プライマーからは、通常、ループから5’末端までのわ
ずかな領域についてしか相補鎖合成の対象とすることが
できない。

【００４４】本発明のプライマーは、前記のような、い
くつかの種類のループから選択される少なくとも１種
類、好ましくは２種類、あるいは３種類以上のループに
おいて相補鎖合成の起点となることができるプライマー
を３種以上利用する。３種類以上とは、３つのプライマ
ーが相互に異なる位置において相補鎖合成の起点を与え
ることを意味する。

【００４５】本発明におけるプライマーの種類は、少な
くとも３種、好ましくは４種、あるいは５種類以上のプ
ライマーを組み合わせることもできる。なお相互に異な
る位置とは、プライマーがアニールしたときの各プライ
マーの3’末端の位置が相互に異なっていることを言
う。したがって、アニールに必要な塩基配列を部分的に
重複させることもできる。しかしながら、アニールに必
要な領域が重複する場合にはプライマーの間で競合を生
じるため、できるだけ相互に独立した領域に対してアニ
ールできるようにプライマーの塩基配列を設計すること
が望ましい。更に、鋳型ポリヌクレオチドにおいてハイ
ブリダイズやアニールの対象となる領域に対しても、で
きるだけ重複しないようにプライマーの塩基配列を設計
することにより、より迅速な相補鎖合成を期待すること
ができる。したがって、たとえば鋳型ポリヌクレオチド
と、鋳型ポリヌクレオチドを鋳型として生成する相補鎖
合成生成物に形成される、相互に異なるループに対して
アニールする３種類以上のプライマーの組み合わせは、
本発明に好適なプライマーの組み合わせと言うことがで
きる。

【００４６】本発明のプライマーを構成する塩基配列
は、前述した複数のループの塩基配列に相補的な塩基配
列を含む塩基配列とする。その3’側はループに相補鎖
合成の起点を与えられることが求められる。したがっ
て、少なくともその3'末端はループ内に位置するべきで
ある。しかし、アニールに必要な塩基配列の全てがルー
プ内に配置される必要はない。したがって、プライマー
が必要な反応条件の下で相補鎖合成の起点を与えること
ができる限り、たとえばアニールに必要な塩基配列の一
部が、ループに隣接する２本鎖ポリヌクレオチドを構成
する塩基配列と重複することが許される。また、プライ
マーの5’側には任意の塩基配列を付加することもでき
る。本発明において鋳型ポリヌクレオチドが有するルー
プに相補鎖合成の起点を与えるプライマーとして、前述
のLAMP用プライマーを用いることができる。

【００４７】LAMP法(Nucleic Acid Res. 2000 Vol.28 N
o.12 e63、WO 00/28082)は、鋳型ポリヌクレオチドに自
身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると
ともに、このとき形成されるループに相補鎖合成の起点
を与えることができるプライマーを組み合わせることに
よって高度な等温での相補鎖合成反応を可能とする方法
である。LAMP法には、少なくとも次の２つのプライマー
が用いられる。 [1]第１のプライマー；第１のプライマーはその3'末端
において標的塩基配列を構成する一方の鎖の3'側を規定
する領域に相補鎖合成の起点を与えることができ、かつ
第１のプライマーの5'側には、このプライマーを起点と
する相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的
な塩基配列を備えるものである、[2] 第２のプライマ
ー；第２のプライマーはその3'末端において前記第１の
プライマーを起点とする伸長生成物における標的塩基配
列の3'側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えるこ
とができる塩基配列を備え、かつ第２のプライマーの5'
側には、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生
成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるも
のである。

【００４８】つまり、上記鋳型ポリヌクレオチドの合成
に用いられた第１のプライマー、および第２のプライマ
ーは、本発明に基づくポリヌクレオチドの合成方法にお
ける少なくとも３種のプライマーの一部を構成すること
ができる。言い換えれば、鋳型ポリヌクレオチド、およ
び／または鋳型ポリヌクレオチドに第１または第２のプ
ライマーがアニールして生成する伸長生成物において、
前記第１のプライマーおよび第２のプライマーとは異な
る位置で相補鎖合成の起点を与えることができるその
５’末端を不溶性担体に固定した３つ目のプライマーを
組み合わせることにより、本発明を実施することができ
る。本発明において、標的塩基配列の合成に必要なプラ
イマーに加えて、組み合わせられる３つ目のプライマー
を固定プライマーと呼ぶことがある。

【００４９】この固定プライマーの５’末端を固定する
不溶性担体としては特に制限はなく、通常の不溶性担体
はいずれも使用することが可能である。好適な不溶性担
体としては、例えば不溶性アガロース、セルロース、不
溶性デキストランなどの天然高分子担体、ポリスチレ
ン、スチレンースチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニ
ルーアクリル酸エステル共重合体などの合成高分子担
体、その他、金コロイド、磁性粒子などの機能性粒子な
どが挙げられ、特に合成高分子担体が水などに均一に分
散されたラテックスが好ましい。

【００５０】なお鋳型ポリヌクレオチドの合成に用いた
プライマーを、標的塩基配列を合成するためのプライマ
ーとしても利用することは、必須の条件ではない。鋳型
ポリヌクレオチドを合成するためのプライマーとは別
に、更に標的塩基配列の合成用のプライマーを加えるこ
とも可能である。しかしながら、通常は、より少ない要
素で反応を構成するのが合理的である。

【００５１】本発明における好ましい固定プライマーと
しては、鋳型ポリヌクレオチド、および／または鋳型ポ
リヌクレオチドに第１または第２のプライマーがアニー
ルして生成する伸長生成物が形成するループにおいて、
第１または第２のプライマーとは異なる位置に相補鎖合
成の起点を与えることができるプライマー(固定ループ
プライマー)が挙げられる。特に望ましい固定ループプ
ライマーとして、Ｒ１−Ｒ２間（あるいはＦ１−Ｆ２
間）の領域に相補鎖合成の起点を与えることができるプ
ライマーを示すことができる。固定ループプライマー
は、Ｒ１−Ｒ２間、あるいはＦ１−Ｆ２間にアニールす
ることができるプライマーのいずれか１つをLAMP用のプ
ライマーに組み合わせるとき、３種のプライマーが用い
られることになる。更にＲ１−Ｒ２間、あるいはＦ１−
Ｆ２間にアニールすることができるプライマーを両方と
も組み合わせれば、LAMP用プライマーに２種類の固定ル
ーププライマーが加わって、合計で４種類のプライマー
を用いることになる。本発明における固定ループプライ
マーは、少なくとも１種類、望ましくは２種類、あるい
はそれ以上の種類を組み合わせることによって、ポリヌ
クレオチドの合成反応を促進する作用をも期待できる。

【００５２】この固定ループプライマーは、Ｒ２を含む
ループ［たとえば図３−（９）等］に対してアニールす
る。このループは、標的塩基配列におけるＲ１−Ｒ２に
かけての領域（ただし図３−（９）においてはＲ２を含
み、Ｒ１は含まない）で構成されている。このようなル
ープに対して、本発明の固定ループプライマーは、ルー
プを構成する塩基配列に相補的な塩基配列を含む任意の
塩基配列からなるヌクレオチドを固定ループプライマー
とすることができる。

【００５３】結局、本発明をLAMP法に適用したときに組
み合わせられる望ましい固定ループプライマーとして、
次の条件を満たすプライマーを挙げることができる。す
なわち、鋳型ポリヌクレオチド、および／または鋳型ポ
リヌクレオチドと第１のプライマーおよび第２のプライ
マーとの反応によって生成するポリヌクレオチドに形成
されるループのうち、第１のプライマーおよび第２のプ
ライマーがアニールできないループにおいて、相補鎖合
成の起点を提供することである。固定ループプライマー
は、ループ内に相補鎖合成の起点となる3'末端を配置す
る領域にアニールすることができれば良い。したがっ
て、アニールするための塩基配列が完全にループ内に含
まれる場合のみならず、その一部がループ以外の領域に
重なる場合であっても、3'末端がループ内に位置する場
合には、望ましい条件を満たしていると言うことができ
る。たとえば、固定ループプライマーがアニールすべき
塩基配列の一部が、ループに隣接する２本鎖構造に及ん
でいる場合であっても、アニールすべき領域を完全にル
ープ内に配置したときと同様の反応促進効果を得られ
る。

【００５４】固定ループプライマーと鋳型ポリヌクレオ
チドを構成する塩基配列との好ましい位置関係を図５に
示した。図５は、自身にアニールするＦ１の3'末端を起
点として相補鎖合成が行われるところを示している。図
５は、図２−（５’）と同じ構造を示している。すなわ
ちこの図に示された相補鎖合成が完了すれば、本発明に
おける鋳型ポリヌクレオチドが完成するところである。
固定ループプライマーＲは、Ｒ２を含むループにアニー
ルするプライマーであることが、図５に示されている。
なお図５は、固定ループプライマーＲがアニールする領
域を示すために記載したものである。図５の構造に対し
てアニールした固定ループプライマーＲからの相補鎖合
成は、実際にはすぐに5'末端に達してしまう。鋳型ポリ
ヌクレオチドから生成する反応生成物に形成される同様
の塩基配列からなるループにアニールして相補鎖合成が
行われるとき、固定ループプライマーＲを起点とする相
補鎖合成が反応効率の向上に貢献する。

【００５５】本発明をLAMP法に適用するとき、固定プラ
イマーは、LAMP法の条件と同じ条件下でアニールできる
ことが望ましい。全ての反応を温度変化無しで実施でき
ることは、LAMP法の大きな利点である。この利点を損な
わないように、本発明のための固定プライマーを組み合
わせるときにも、LAMP法のための反応と同じ温度条件で
固定プライマーを用いることが理想的である。そのため
には、固定プライマーのTmが、LAMP法のためのプライマ
ーと同じレベルとなるように設計する。Tmはプライマー
を構成する塩基の種類と数、並びに反応液に含まれる塩
類や各種のTmに影響を与える成分によって決定される。
したがって、本発明においては、LAMP法のための反応液
の条件に合わせて、固定プライマーのTmをその塩基配列
によって調整する。当業者は、各種の条件に合わせてプ
ライマーの塩基配列を調整し適切なTmを与えることがで
きる。なお、固定ループプライマーに関するこれらの条
件は、Ｆ１ｃ−Ｆ２ｃ（あるいはＲ１ｃ−Ｒ２ｃ）によ
って構成されるループについても適用されることは言う
までも無い。

【００５６】前記のとおり、図２−（５）、あるいは図
２−（５’）に示された、3'末端を自身にアニールさせ
て相補鎖合成を行う工程が完了すると、本発明における
鋳型ポリヌクレオチドが得られる。更にこの鋳型ポリヌ
クレオチドのループには、それぞれＲＡ［図２−
（６）］、あるいはＦＡ［図２−（６’）］がアニール
して相補鎖合成が行われ、鋳型ポリヌクレオチドの3'末
端は置換によって再び１本鎖となる。１本鎖となった3'
末端は、自身にアニールして相補鎖合成が進む結果〔図
２−（７）及び図２−（７’）〕、図２−（８）、およ
び図２−（８’）が生成する。このように、ループにプ
ライマーＲＡ、あるいはＦＡのアニール、相補鎖合成、
鋳型ポリヌクレオチドの3'末端の置換、自身へのアニー
ルと相補鎖合成というサイクルが繰り返し行われる。

【００５７】このとき、鋳型ポリヌクレオチドの自身を
鋳型とする3'末端の伸長によって、やがてループにアニ
ールしたＲＡやＦＡを複製起点とする相補鎖合成の生成
物が置換され、新たな１本鎖のポリヌクレオチドが生成
する〔図２−（７）及び図２−（７’）〕。この１本鎖
ポリヌクレオチドは、3'末端と5'末端に自身に相補的な
塩基配列を備える。つまり、ちょうど図２−（５）や図
２−（５’）と同じ構造の生成物となる。これらは新た
な鋳型ポリヌクレオチドとなって、同様の反応が繰り返
し進行することとなる。ここまでは、全てLAMP法として
明らかにされている反応機序である。

【００５８】さて、図２−（８）において、ループにア
ニールしたプライマーＦＡは、鋳型ポリヌクレオチドの
２本鎖構造を置換しながら伸長して、やがてその5'末端
に達する。このとき、置換された鋳型ポリヌクレオチド
の3'末端側は１本鎖構造となっている。そのため、自身
の相補的な塩基配列が相互にハイブリダイズする。こう
して形成されるのが図３−（９）に示す構造である。す
なわち鋳型ポリヌクレオチドの3'が自身にアニールし、
同時に相補的な塩基配列がハイブリダイズしてループを
形成している。相補的な塩基配列がハイブリダイズする
ことによって形成されるループは、もとになった鋳型ポ
リヌクレオチドのループ部分を写し取った相補鎖となっ
ている。このループは、図からも明らかなようにＲ２を
含むループで、ＦＡやＲＡはアニールすることができな
い。しかし固定ループプライマーＲは、Ｒ２を含むルー
プにアニールすることができる。そこで、Ｒ２を含むル
ープに固定ループプライマーＲがアニールして相補鎖合
成を開始する。一方で、公知のLAMP法に基づくポリヌク
レオチドの増幅反応は継続する。すなわち、鋳型ポリヌ
クレオチドによる自身を鋳型とする伸長反応と、ループ
にアニールするプライマーＦＡとによる増幅反応が継続
している。この反応そのものは、新たな鋳型ポリヌクレ
オチドを連続して生成するポリヌクレオチドの増幅反応
に他ならない。なお、既にLAMP法で明らかにされている
図３−（９）以降の増幅反応については、ここでは図示
しない。

【００５９】本発明では、５’末端を不溶性担体に固定
した固定プライマーを使用することによって、この固定
プライマーを起点とする増幅反応の進行に伴なって、以
下に示す凝集反応が生じる。図３−（９）のポリヌクレ
オチドの１本鎖構造のＲ２を含むループには固定ループ
プライマーＲ（ＬｏｏｐＲ）がアニールし、このＬｏｏ
ｐＲを起点とする相補鎖伸長反応の進行に伴なって、図
２−（８）でプライマーＦＡを起点として得られた伸長
生成物が置換され、図３−（１０）に示す１本鎖のポリ
ヌクレオチドが生成する。一方、ＬｏｏｐＲの伸長生成
物は、図３−（９）のポリヌクレオチドの３’末端Ｆ１
からの自己を鋳型とする鎖伸長反応によって置換され、
図３−（１１）に示す１本鎖のポリヌクレオチドが生成
する。

【００６０】図４にみられるように、この１本鎖ポリヌ
クレオチド（１１）にはＦ２を含むループ、Ｒ２を含む
ループ、ならびに３’末端のＦ１がＦ１ｃにアニールし
て形成されるループの計３個のループが存在する。Ｆ２
及びＲ２を含むループには、固定ループプライマーＬｏ
ｏｐＦ及びＬｏｏｐＲがアニールし、それぞれ鎖伸長反
応が進行する。また、３’末端Ｆ１からも自己を鋳型と
する鎖伸長反応が進行する。そして、ＬｏｏｐＦの伸長
生成物は、ＬｏｏｐＲを起点とする鎖伸長反応の進行に
伴なって置換され、１本鎖のポリヌクレオチド（１２）
が生成する。このポリヌクレオチド（１２）の３’末端
にはＬｏｏｐＲと相補的な配列ＬｏｏｐＲｃが存在し、
このＬｏｏｐＲｃにＬｏｏｐＲがアニールして鎖伸長反
応が進行すると、両末端にそれぞれ固定ループプライマ
ーＬｏｏｐＦ及びＬｏｏｐＲを有する安定な二本鎖ポリ
ヌクレオチドからなる凝集生成物（１３）が生成する。

【００６１】一方、ＬｏｏｐＲの伸長生成物は、ポリヌ
クレオチド（１１）の３’末端Ｆ１からの自己を鋳型と
する鎖伸長反応によって置換され、１本鎖のポリヌクレ
オチド（１４）が生成する。このポリヌクレオチド（１
４）の３’末端にはＬｏｏｐＲと相補的な配列Ｌｏｏｐ
Ｒｃが存在し、このＬｏｏｐＲｃにＬｏｏｐＲがアニー
ルして鎖伸長反応が進行すると、両末端に固定ループプ
ライマーＬｏｏｐＲを有する安定な２本鎖ポリヌクレオ
チドからなる凝集生成物（１５）が生成する。

【００６２】同様の凝集生成物は、図２−（５’）に示
されたbasic dumbbel form ２を出発物質とし、図２−
（５’）〜図２−（８’）の相補鎖合成を経由して進行
する対応する反応においても生成する。そして、反応の
進行に伴なって生成するこれらの凝集生成物は反応系に
おける濁度の変化として分光光度計等の光学的手段を利
用するか、もしくは肉眼によって検知することができ
る。すなわち、本発明によれば、基本ＬＡＭＰ法で使用
される第１のプライマーＲＡ、及び第２のプライマーＦ
Ａに加えて、少なくとも１種類の５’末端を不溶性担体
に固定した固定プライマーを使用することによって、新
たな検出工程を必要とせずに、単に反応系における凝集
反応の有無を観察することにより、標的塩基配列が予測
された塩基配列であったかどうかを判定することが可能
となる。

【００６３】本発明における凝集反応は、前記したよう
に２種類の固定ループプライマー（ＬｏｏｐＲ及びＬｏ
ｏｐＦ）を使用する場合のみならず、ＬｏｏｐＲ又はＬ
ｏｏｐＦいずれか１種類の固定ループプライマーを使用
する場合にも速かに進行する。そして、この固定ループ
プライマーは、ポリヌクレオチドの増幅反応開始時点か
ら反応液中に含まれるものであり、試薬調製が不要であ
ることから、反応中にコンタミネーションが生じるおそ
れがない。さらに、増幅開始から検出までを一連の反応
として等温で行なうことができ、凝集反応後の濁度の測
定は分光光度計等の光学的分析機器を使用しなくても、
肉眼によっても行なうことができるので、きわめて簡便
なポリヌクレオチドの検出方法となる。また、ＬＡＭＰ
反応自体には影響を及ぼさず、固定ループプライマーを
使用することによって、基本ＬＡＭＰ法におけるポリヌ
クレオチドの増幅反応は大幅に促進される。

【００６４】ところで本発明の鋳型ポリヌクレオチド
は、２本鎖の状態にあるポリヌクレオチドに含まれる標
的塩基配列を出発物質として合成することができる。２
本鎖の状態にある標的塩基配列にプライマーをアニール
させ、相補鎖合成を行う方法は、本出願人によって出願
された特許出願2000-111939に記載されている。図１に
おいては１本鎖の標的塩基配列を出発物質として鋳型ポ
リヌクレオチドを合成している。しかし２本鎖の状態に
あるポリヌクレオチドに含まれる標的塩基配列を出発物
質として用いる方法を応用すれば、１本鎖に変性する工
程を省略し、２本鎖のポリヌクレオチドをそのまま出発
物質として利用することができる。２本鎖ポリヌクレオ
チドとしては、たとえばcDNAやゲノムDNAを示すことが
できる。あるいはこれらのDNAを各種のベクターに挿入
したものを本発明の２本鎖ポリヌクレオチドとして用い
ることもできる。一方１本鎖の状態にあるポリヌクレオ
チドとは、これら２本鎖ポリヌクレオチドを加熱やアル
カリ条件等の変性処理によって１本鎖としたものや、あ
るいはmRNAのようにもともと１本鎖として存在している
ポリヌクレオチドを示すことができる。本発明の２本鎖
ポリヌクレオチドは、精製されたものであっても良い
し、未精製のものであることもできる。また、細胞内に
存在する状態(in situ)で、本発明の方法を適用するこ
ともできる。細胞内のポリヌクレオチドを鋳型とするこ
とによって、ゲノムのin situ解析が可能となる。

【００６５】本発明においてcDNAを鋳型として用いる場
合、cDNAを合成する工程と、本発明におけるポリヌクレ
オチドの合成方法とを、同一の条件下で実施することが
できる。RNAを鋳型としてcDNAの第１鎖を合成すると、D
NA-RNAハイブリッドによる２本鎖ポリヌクレオチドが完
成する。この２本鎖ポリヌクレオチドを本発明における
鋳型として、ポリヌクレオチドの検出方法を実施するこ
とができる。本発明のポリヌクレオチドの検出方法に用
いるDNAポリメラーゼが、逆転写酵素活性を備えるもの
であれば、単一の酵素を用い、同一の条件下でポリヌク
レオチドの合成を行うことができる。たとえばBca DNA
ポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、逆転写酵素活性を
併せ持つDNAポリメラーゼである。なお、第２鎖を合成
したうえで完全な２本鎖cDNAとした後に、本発明による
ポリヌクレオチドの検出方法を適用しうることは言うま
でも無い。

【００６６】２本鎖の状態にあるポリヌクレオチドに含
まれる標的塩基配列から鋳型ポリヌクレオチドを合成す
るときには、まず２本鎖ポリヌクレオチドに任意のプラ
イマーを加え、このプライマーを起点とする相補鎖合成
反応が達成できる条件のもとでインキュベートされる。
ここで用いられる任意のプライマーとは、第１のプライ
マーがアニールすべき領域を塩基対結合可能な状態とす
るために用いられる。したがって、任意のプライマー
は、標的塩基配列における、第１のプライマーがアニー
ルすべきポリヌクレオチド鎖に対して、その相補鎖にア
ニールすることができるものである必要がある。更に、
本発明における任意のプライマーを複製起点とする相補
鎖合成は、第１のプライマーがアニールすべき領域の方
向に向かって進行するような位置関係にあるべきであ
る。言いかえれば、第１のプライマーを起点とする相補
鎖合成反応において鋳型として機能する領域の、任意の
領域に対してアニールするものであることができる。任
意のプライマーは、この条件を満たす限り、任意の領域
から選択することができる。たとえば、第２のプライマ
ーを、任意のプライマーとして用いることもできる。こ
のような態様は反応に必要な成分を少なくすることか
ら、本発明における望ましい態様の一つである。

【００６７】したがってLAMP法に基づいて鋳型ポリヌク
レオチドを合成するための反応における工程ａ）、すな
わち標的塩基配列に第１のプライマーをアニールさせ、
これを起点とする相補鎖合成反応を行う工程では、任意
のプライマーを起点とする相補鎖合成で２本鎖ポリヌク
レオチドの一方の鎖を置換し、第１のプライマーによる
塩基対結合が可能な状態とすることができる。この条件
を採用したことによって、温度変化の不要な合成反応が
実現できた。任意のプライマーの２本鎖ポリヌクレオチ
ドに対するアニール、およびこのプライマーを起点とす
る相補鎖合成反応が達成できる条件とは、実際には次の
複数の工程を同じ条件下で進めることができる条件とい
うことができる。 i) ２本鎖ポリヌクレオチドの状態にある鋳型に対して
プライマーがアニールする ii) アニールしたプライマーを複製起点とする相補鎖合
成が進む。

【００６８】プライマーは、少なくともそれがアニール
すべき領域が１本鎖でなければアニールすることはでき
ないと考えられていた。そのため従来は、２本鎖のポリ
ヌクレオチドを鋳型とする場合には、プライマーのアニ
ールに先立って必ず変性によって１本鎖とする工程が実
施されてきた。しかし必ずしも完全な１本鎖としなくと
も、何らかの手段によって２本鎖が不安定化される条件
のもとで、プライマーとインキュベートすることによ
り、プライマーを起点とする相補鎖合成反応が開始され
る。２本鎖が不安定化される条件としては、たとえば融
解温度（以下、Tmと省略する）近くにまで加温する方法
を示すことができる。あるいは、更にTm調整剤を存在さ
せることも有効である。

【００６９】本発明において、一連の反応は、酵素反応
に好適なpHを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やア
ニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要
に応じて融解温度(Tm)の調整剤等の共存下で行う。緩衝
剤としては、Tris-HCl等の中性から弱アルカリ性に緩衝
作用を持つものが用いられる。pHは使用するDNAポリメ
ラーゼに応じて調整する。塩類としてはKCl、NaCl、あ
るいは(NH_４)_２SO_４等が、酵素の活性維持とポリヌクレ
オチドの融解温度(Tm)調整のために適宜添加される。酵
素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用
される。更に融解温度(Tm)の調整剤には、ベタイン、プ
ロリン、ジメチルスルホキシド（以下、DMSOと省略す
る）、ホルムアミド、およびトリメチルアミンＮ−オキ
シドが一般に利用される。融解温度(Tm)の調整剤を利用
することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニール
を限られた温度条件の下で調整することができる。更に
ベタイン(N,N,N,-trimethylglycine)やテトラアルキル
アンモニウム塩は、そのisostabilize作用によって鎖置
換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中0.
2〜3.0 M、好ましくは0.5〜1.5 M程度の添加により、本
発明におけるポリヌクレオチド増幅反応の促進作用を期
待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下
げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他
の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反
応性を与える条件を設定する。Tm調整剤を利用すること
により、酵素反応に好適な温度条件を容易に設定するこ
とができる。Tmはプライマーと標的塩基配列の関係によ
って変動する。したがって、酵素活性を維持できる条件
と、本発明の条件を満たすインキュベーションの件とが
一致するように、Tm調整剤の使用量を調整することが望
ましい。本発明の開示に基づいて、プライマーの塩基配
列に応じて適切なTm調整剤の使用量を設定することは、
当業者にとって自明である。たとえば、アニールする塩
基配列の長さとそのGC含量、塩濃度、およびTm調整剤の
濃度に基づいて、Tmを算出することができる。

【００７０】このような条件下における２本鎖のポリヌ
クレオチドに対するプライマーのアニールは、おそらく
不安定であると推測される。しかし鎖置換型のポリメラ
ーゼとともにインキュベートすることにより、不安定な
がらアニールしたプライマーを複製起点として相補鎖が
合成される。相補鎖が合成されれば、プライマーのアニ
ールは次第に安定化されることになる。

【００７１】また、本発明の核酸配列を検出する方法で
は、ピロリン酸塩形成抑制剤の存在下にポリヌクレオチ
ドの増幅反応を行うようにすることができる。ＬＡＭＰ
反応において、加速度的に特異的塩基配列を有するＤＮ
Ａが増幅する課程で、ピロリン酸が大量に生成され、反
応液中に含まれるマグネシウムと結合して、ピロリン酸
マグネシウムの白色沈澱が形成される。この白色沈澱の
形成は、目視によっても識別することが可能であり、増
幅反応の進行の有無を判断する最も簡易な手段として使
用することができるものであるが、本発明のポリヌクレ
オチドの増幅反応に伴う凝集反応の有無を観察する際に
は、障害となるものである。このような障害は、ＬＡＭ
Ｐ反応液に酵素Pyrophosphatase等のピロリン酸塩形成
抑制剤剤を反応開始時から一定量添加しておくことによ
って、抑制することができる。すなわち、ピロリン酸塩
形成抑制剤によって、ＤＮＡ伸長反応により生成するリ
ン酸はモノリン酸のままの状態に保たれ、ピロリン酸マ
グネシウムの白色沈澱が形成されるのを抑制することが
できる。ピロリン酸塩形成抑制剤を添加せずに本発明の
検出方法を実施する場合には、反応液中の濁度の上昇を
分光光度計等の光学的手段を利用して測定する際に、反
応液の測定値からピロリン酸マグネシウムの白色沈澱に
よる濁度上昇分をバックグラウンドとして差し引くこと
によって、固定プライマーによる凝集反応の有無を確認
することができる。

【００７２】本発明に用いるプライマーは、いずれも化
学的に合成することができる。DNAの合成方法は公知で
ある。あるいは天然のポリヌクレオチドを制限酵素など
によって切断し、必要な塩基配列で構成されるように改
変する、あるいは連結することも可能である。また本発
明に用いる各種のプライマーは、天然のDNAと同じ構造
のもののみならず、人工的な変異体であることもでき
る。プライマーとは、標的塩基配列と相補的な塩基対結
合を形成できること、そしてその3'末端において相補鎖
合成の起点となる-OH基を与えること、の２つの条件を
満たすものを意味する。更にプライマーは、望ましく
は、相補鎖合成の鋳型となることができる。したがっ
て、そのバックボーンは必ずしもホスホジエステル結合
によるものに限定されない。たとえばホスホチオエート
体やペプチド結合に基づくペプチド核酸からなるもので
あることもできる。また、塩基は、相補的な塩基対結合
を可能とするものであれば良い。天然の状態では、一般
にはACTGおよびUの５種類となるが、たとえばブロモデ
オキシウリジン(bromodeoxyuridine)といった類似体で
あることもできる。本発明に用いるオリゴヌクレオチド
は、合成の起点となるのみならず、相補鎖合成の鋳型と
しても機能するものであることが望ましい。

【００７３】本発明に用いるプライマーは、本発明を構
成する各種のポリヌクレオチド合成反応において、与え
られた環境の下で必要な特異性を維持しながら相補鎖と
の塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を持つ。具
体的には、5-200塩基、より望ましくは10-50塩基対とす
る。配列依存的なポリヌクレオチド合成反応を触媒する
公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長が、最
低5塩基前後であることから、アニールする部分の鎖長
はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列として
の特異性を期待するためには、確率的に10塩基以上の長
さを利用するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基
配列は化学合成によって調製することが困難となること
から、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示され
る。なお、ここで例示した鎖長はあくまでも相補鎖とア
ニールする部分の鎖長である。たとえばＲＡは、少なく
とも２つの領域Ｒ２およびＲ１ｃからなっている。した
がって、ここに例示する鎖長は、プライマーを構成する
各領域の鎖長と理解するべきである。本発明において用
いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側
のポリヌクレオチドを意味する。鋳型に相補的な塩基配
列を持つ相補鎖は、鋳型に対応する鎖としての意味を持
つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎな
い。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型
として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型に
なることができる。

【００７４】本発明におけるポリヌクレオチドの合成方
法、あるいは増幅方法には、鎖置換を伴う相補鎖合成反
応を触媒することができるDNAポリメラーゼが利用され
る。この種のポリメラーゼは、SDAなどに用いられたDNA
ポリメラーゼと同様のものが用いられる。すなわち、あ
る塩基配列の3'側に相補的なプライマーを合成起点とし
て相補鎖合成を行うときに、5'側に２本鎖の領域が有る
とその２本鎖を置換しながら相補鎖の合成を行う特殊な
ポリメラーゼが公知である。本発明においては、更に相
補鎖合成に必要な基質が添加される。

【００７５】本発明におけるポリヌクレオチドの合成方
法を支えているのは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒
することができるDNAポリメラーゼである。この種のDNA
ポリメラーゼには、以下のようなものが知られている。
また、これらの酵素の各種変異体についても、それが配
列依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、
本発明に利用することができる。ここで言う変異体と
は、酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取
り出したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒
活性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示す
ことができる。 Bst DNAポリメラーゼ Bca(exo-)DNAポリメラーゼ DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント Vent DNAポリメラーゼ Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼか
らエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの） DeepVent DNAポリメラーゼ DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメ
ラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの） Φ29ファージDNAポリメラーゼ MS-2ファージDNAポリメラーゼ Z-Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造） KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）

【００７６】これらの酵素の中でもBst DNAポリメラー
ゼやBca(exo-)DNAポリメラーゼは、ある程度の耐熱性を
持ち、触媒活性も高いことから特に望ましい酵素であ
る。本発明において、特に２本鎖の状態にあるポリヌク
レオチドを鋳型として用いる場合には、プライマーのア
ニールと相補鎖合成反応とを同一条件下で行う。このよ
うな反応は、しばしばある程度の加温を必要とすること
から、酵素が耐熱性であることは望ましい条件の一つで
ある。耐熱性の酵素を用いることにより、幅広い反応条
件に対応することができる。

【００７７】たとえばVent(Exo-)DNAポリメラーゼは、
鎖置換活性と共に高度な耐熱性を備えた酵素である。と
ころでDNAポリメラーゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成
反応は、１本鎖結合タンパク質(single strand binding
protein)の添加によって促進されることが知られてい
る(Paul M.Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-2
32, July,1998)。この作用を本発明に応用し、１本鎖結
合タンパク質を添加することによって相補鎖合成の促進
効果を期待することができる。Vent(Exo-)DNAポリメラ
ーゼに対しては、１本鎖結合タンパク質としてT4 gene
32が有効である。なお3'-5'エクソヌクレアーゼ活性を
持たないDNAポリメラーゼには、相補鎖合成が鋳型の5'
末端に達した部分で停止せず、１塩基突出させた状態ま
で合成を進める現象が知られている。本発明では、相補
鎖合成が末端に至ったときの3'末端の配列が次の相補鎖
合成の開始につながるため、このような現象は望ましく
ない。しかし、DNAポリメラーゼによる3'末端への塩基
の付加は、高い確率でAとなる。したがって、dATPが誤
って１塩基付加しても問題とならないように、3'末端か
らの合成がAで開始するように配列を選択すれば良い。
また、相補鎖合成時に3'末端がたとえ突出してしまって
も、これを消化してblunt endとする3'→5'エクソヌク
レアーゼ活性を利用することもできる。たとえば、天然
型のVent DNAポリメラーゼはこの活性を持つことから、
Vent(Exo-)DNAポリメラーゼと混合して利用することに
より、この問題を回避することができる。

【００７８】これらのDNAポリメラーゼに対して、PCRな
どで一般に用いられているTaqポリメラーゼ等のDNAポリ
メラーゼは、通常の条件では鎖置換作用は実質的に見ら
れない。しかし、この種のDNAポリメラーゼであって
も、鎖置換が可能な条件を与えることができる場合に
は、本発明に利用することができる。

【００７９】LAMP法は、標的塩基配列のプライマーがア
ニールすべき領域が適切な位置関係にあり、しかもその
塩基配列が設計どおりであった場合に、高度な増幅反応
が起きる。言いかえれば、相補鎖合成の起点としなけれ
ばならない領域において、標的塩基配列が予測した塩基
配列と異なっていたときには、LAMP法が著しく阻害され
る。特に、自身にアニールする3'末端を起点とする相補
鎖合成は重要である。LAMP法においては、自身にアニー
ルする3'末端は、プライマーの5'末端に配置された塩基
配列を鋳型として合成される相補鎖の3'末端に相当す
る。したがって、第１のプライマー（ＲＡ）および／ま
たは第２のプライマー（ＦＡ）の5'側に配置された領域
（Ｒ１あるいはＦ１）の5'末端、あるいはその近辺に、
検出すべき変異部位に相補的な塩基を配置するようにす
るのが望ましい。そこで、この重要な配列を検出すべき
変異に対応するように設計すれば、LAMP法による増幅反
応の進行に伴なって生じる凝集生成物を観察することに
よって、塩基の欠失や挿入といった変異の有無、あるい
はSNPsのような遺伝子多型を分析することができる。

【００８０】より具体的には、変異や多型が予想される
塩基が、相補鎖合成の起点となる3'末端付近（相補鎖が
起点となる場合には5'末端付近）に相当するように設計
するのである。すなわち、プライマーや、自身に相補的
な3'末端がアニールする領域において、いずれかの塩基
が予測された塩基とは異なっているときに、そのプライ
マーを起点とする相補鎖合成が妨げられるように設計す
るのである。ここで、予測される塩基配列とは、野生型
であっても、変異型であっても良い。変異型を予測した
場合には、特定の変異があったときにのみ、相補鎖合成
が開始することになる。相補鎖の合成起点となる3'末端
や、その付近にミスマッチが存在するとポリヌクレオチ
ドの相補鎖合成反応は著しく阻害される。したがって増
幅反応に伴なう凝集生成物が観察されたときには、標的
塩基配列は予測した塩基配列からなっていると判定する
ことができる。逆に、もしも増幅に伴なう凝集生成物が
対照と同程度に生じないときには、標的塩基配列は予測
した塩基配列とは異なっていると判定できる。LAMP法に
おいては、反応初期の生成物における末端構造が繰り返
し反応を行わなければ高度な増幅反応に結びつかない。
したがって、たとえ誤った合成が行われたとしても、増
幅反応を構成する相補鎖合成がいずれかの段階で常に妨
げられるのでミスマッチを含んだままでは高度な増幅は
起きない。結果的にミスマッチが増幅反応を効果的に抑
制し、最終的には正確な結果をもたらすことになる。つ
まりLAMP法に基づくポリヌクレオチドの増幅反応は、よ
り完成度の高い塩基配列のチェック機構を備えていると
言うことができる。これらの特徴は、たとえば単純に２
つの領域で増幅反応を行っているＰＣＲ法などでは期待
しにくい利点である。

【００８１】本発明によるポリヌクレオチドの検出方法
に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングし
てキットとして供給することができる。すなわち、本発
明はポリヌクレオチドの増幅反応に伴なう凝集反応の有
無を利用した標的塩基配列の検出用キットを提供する。
具体的には、本発明のために、第１のプライマーおよび
第２のプライマー、不溶性担体に５’末端を固定した固
定プライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、
相補鎖合成の基質となるdNTP、鎖置換型の相補鎖合成を
行うDNAポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える
緩衝液といった試薬類で構成されるキットが提供され
る。本発明のキットには、アウタープライマーを組み合
わせることができる。アウタープライマーを組み合わせ
ることにより、等温での反応が可能となる。また、本発
明による標的塩基配列の検出用キットには、アウタープ
ライマーに加えて、融解温度調整剤やピロリン酸塩形成
抑制剤、更に必要に応じて合成反応生成物の検出のため
に必要な試薬類を組み合わせることができる。特に、本
発明の望ましい態様においては、反応途中で試薬の添加
が不要なことから、１回の反応に必要な試薬を反応容器
に分注した状態で供給することにより、サンプルの添加
のみで反応を開始できる状態とすることができる。ま
た、増幅反応に伴なう凝集生成物の検出を反応容器のま
まで行なうことが可能となり、反応後の容器の開封を全
面的に廃止することができる。これは、コンタミネーシ
ョンの防止上、たいへん望ましいことである。以下、実
施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。

【００８２】

【実施例】１．固定ループプライマーの設計以下に示す塩基配列（配列番号１）を有するλＤＮＡを
標的塩基配列として、公知のLAMP法(WO 00/28082)に基
づいて、以下のプライマーをそれぞれ設計した。（λＤＮＡ：配列番号１） GCTTATCTTT CCCTTTATTT TTGCTGCGGT AAGTCGCATA AAAACCATTC TTCATAATTC AATCCATTTA CTATGTTATG TTCTGAGGGG AGTGAAAATT CCCCTAATTC GATGAAGATT CTTGCTCAAT TGTTATCAGC TATGCGCCGA CCAGAACACC TTGCCGATCA GC (172base)

【００８３】インナープライマーFA（Inner F：配列番
号２）：CGTGAGCAAT GGGTATATGC AAATAGAGCT CTGTGTTTG
T CTTCCTGC (48base)、インナープライマーRA（Inner R：配列番号３）：ATGTC
CTTGT CGATATAGGG ATGAAGCACA TTATCCTGAA TTTTCGGTG
(49base)、アウタープライマーF3（Outer F：配列番号４）：CCTGC
CTCCA AACGATACCT (20base)、及びアウタープライマーR3（Outer R：配列番号５）：TTGTG
GTGAT ATAGGACAGA CA (22base)

【００８４】次に、上記プライマーによって規定される
Ｒ１とＦ１に同方向となるように、以下のループプライ
マーを設計した。ループプライマーを設計する場所は、
LAMP反応中に生成するループ構造のＲ２あるいはＦ２領
域以外とし、方向はＲ１あるいはＦ１と同じ向きとし
た。なおＲ１やＦ１とは、鋳型ポリヌクレオチドが自身
にアニールして相補鎖合成を行う方向と同じ方向を意味
する。ループプライマーは、公知の方法により５’末端
をアミノ基で修飾したものを使用した。ループプライマーF（Loop F：配列番号６）：(NH_２)GGA
ACTCCGG GTGCTATCAG (20base)、およびループプライマーR（Loop R：配列番号７）：(NH_２)TGA
CCTTTCT CTCCCATATT GCAGTCG (27base)

【００８５】つぎに、以下に示す塩基配列（配列番号
８）を有するＭ１３ＤＮＡを標的塩基配列として、同様
に以下のプライマーをそれぞれ設計した。（Ｍ１３ＤＮＡ：配列番号８） GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCTTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG AATTCGAGCT CGGTACCCGG GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGAATGC AAGCTTGGCA CTGGCCGTCG TTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGCGCT TTGCCTGGTT TCCGGCACCA GAAGCGGTGC CGGAAAGCTG GCTGGAGTGC GATCTTCCTG AGGCCGATAC GGTCGTCGTC CCCTCAAACT GGCAGATGCA CGGTTACGAT GCGCCCATCT ACACCAACGT AACCTATCCC ATTACGGTCA (600base)

【００８６】インナープライマーFA (Innner F：配列番
号９):CGACTCTAGA GGATCCCCGG GTACTTTTTG TTGTGTGGAA
TTGTGAGCGG AT (52base) インナープライマーRA (Inner R：配列番号１０):ACAAC
GTCGT GACTGGGAAA ACCCTTTTTG TGCGGGCCTC TTCGCTATTA
C (51base) アウタープライマーF3 (Outer F：配列番号１１):ACTTT
ATGCT TCCGGCTCGT A (21base) アウタープライマーR3 (Outer R：配列番号１２):GTTGG
GAAGG GCGATCG (17base)

【００８７】次に、上記プライマーによって規定される
R1とF1に同方向となるように、以下のループプライマー
を設定した。また、ループプライマーは公知の方法にて
5'末端をアミノ基修飾したものを用いた。ループプライマーF (Loop F：配列番号１３) : (NH_２)C
ATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGT(24base) ループプライマーR (Loop R：配列番号１４) :(NH_２)CA
ACTTAATC GCCTTGCAGC AC(22base)

【００８８】２．固定ループプライマーの調製上記の各ループプライマーについて、次の手順でその
5’末端をラテックス粒子に固定して、固定ループプラ
イマーを調製した。10mM MES（Morpholinol Ethane sul
fonic acid）(pH6)緩衝液（和光純薬工業社製）中で、
平均粒径103nmのカルボキシル基含有ポリスチレンラテ
ックス（固形分1%(w/w)、JSR社製）100μlおよび2000pm
olの5'末端アミノ修飾ループプライマーを混合し（最終
容量1ml）、水溶性カルボジイミドEDC(1-Ethyl-3-[3-di
methylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride)水溶
液 10mg/mlを必要量添加する。EDC水溶液の必要量と
は、使用するカルボキシラテックス表面上のカルボキシ
ル基の総量の約5倍等量が好ましい。EDC添加後、65℃温
浴中で4時間反応させた後、更に2M Glycine（和光純薬
社製）を含有する上記MES緩衝液 1mlを添加し、さらに6
5℃温浴中で1時間反応させた。この反応によって、ラテ
ックス粒子上のカルボキシル基とループプライマーの5'
末端アミノ基の間で安定なエステル結合を形成し、さら
にGlycineによって余剰のEDCとラテックス粒子上の活性
化カルボキシル基をブロックする。

【００８９】上記の化学結合反応終了後、洗浄液の添加
と超遠心分離（80,000rpm/10分）後の上清除去、そして
超音波処理による再分散を繰り返すことによって、ラテ
ックス粒子の洗浄を行った。洗浄液は以下のものを用い
た。洗浄液1:0.1% SDSを含むTE緩衝液（10mM Tris/HCl pH7.
5、1mM EDTA）洗浄液2:0.25M NaClおよび0.1% SDSを含むTE緩衝液（10
mM Tris/HCl pH7.5、1mMEDTA）洗浄液3:滅菌水各洗浄液で少なくとも二回ずつ洗浄を行った。洗浄後、
最終的に固形分0.25%になるように滅菌水で再分散さ
せ、固定ループプライマーを含むラテックス液を得、４
℃で保存した。

【００９０】３．固定ループプライマーによる凝集反応上記２．で得られた５’末端をラテックス粒子に固定し
た固定ループプライマーを、LAMP法の増幅反応開始時当
初から反応液に添加し、増幅反応後に生じる凝集反応に
ついて検討した。

【００９１】(実施例１) （λDNA LAMP反応液の組成：25μl中）・20mM Tris-HCl pH8.8 ・10mM KCl ・10mM (NH_４)₂SO₄ ・4mM MgSO₄ ・1M Betaine ・0.1% Triton X100 ・0.4mM dNTPs ・8U Bst polymerase (NEB) ・1600nM λDNA Inner F(配列番号２) ・1600nM λDNA Inner R(配列番号３) ・400nM λDNA Outer F(配列番号４) ・400nM λDNA Outer R(配列番号５) 上記のλDNA LAMP反応液に、次のa.) 〜c.) を添加し、
反応後に生じる凝集反応について、観察した。 a.) ループプライマー溶液〔λDNA Loop F（配列番号
６）およびλDNA Loop R（配列番号７）〕 b.) ループプライマー溶液 (λDNA Loop FおよびλDNA
Loop R)、および未感作ラテックス液（0.25%固形分） c.) 固定ループプライマーを含むラテックス液 (λDNA
Loop FおよびλDNA LoopRをそれぞれ上記２．によりラ
テックス粒子に固定したものの等量混合物：0.25%固形
分)

【００９２】上記のλDNA LAMP反応液に、a.)〜c.)をそ
れぞれ4μl添加する。したがって、b.) および c.)の反
応液中には10μgのラテックス(0.04%固形分）が含まれ
る。Positive/Nagativeの比較のため、Positive試料と
してλDNA 1x10⁵分子、Nagative試料としてDNAを含まな
い滅菌水を被験体として用いた。90分間・65℃で反応を
行い、反応終了後の濁度をPharmacia社製分光光度計Ult
rospect2000を用い、可視光570nmの波長での濁度を測定
した（反応液量が少ないために、滅菌水でそれぞれ4倍
に希釈して測定に供した）。結果を、図６及び図７に示
す。

【００９３】Negative試料では、増幅反応が進行しない
ので、濁度の上昇は確認されないが（ラテックスが含ま
れる反応液はラテックス分の濁度のみ）、特異的な配列
を含むPositive試料では、すべての例において濁度の上
昇が観察される（図６）。ラテックスを含まない a.)の
濁度の上昇は増幅反応中に生成されるピロリン酸マグネ
シウムによる白色沈殿によるもので、この白沈による濁
度上昇は b.) および c.)においても同様に起こる。し
かし、そのa.)の白色沈殿による濁度上昇分を差し引く
と、 b.)ではPositive試料とNegative試料で、有意の濁
度の変化は確認されないが（OD570nm / 0.089及び0.06
5）、c.) においては有意な濁度の上昇が確認された（O
D570nm / 0.064及び0.329）（図７）。以上の結果か
ら、固定ループプライマーを、特異的なLAMP反応液に最
初から添加した場合にのみ、増幅反応の進行に伴って凝
集反応が生じることわかる。増幅反応の進行によってピ
ロリン酸マグネシウムによる白色沈殿が生じるが、それ
による濁度上昇分を差し引けば、特異的な増幅が進んだ
かどうかをラテックス同士の凝集による濁度上昇で判別
することが可能である（上記白色沈殿への対応について
は実施例４で記述する）。

【００９４】(実施例２：凝集反応の特異性の確認その
１）この例では、本発明の固定ループプライマーの塩基
配列による特異性を確認するために、対照として特定の
増幅産物のSingle Strand Loop部分とはアニールしな
い、異種の固定ループプライマーを使用して、実施例１
と同様にして凝集反応を観察した。実施例１のλDNA LA
MP反応液に、次のa.) 〜c.) をそれぞれ4μl添加し、反
応後に生じる凝集反応について、観察した。したがっ
て、 b.) および c.)の反応液中には10μgのラテックス
(0.04%固形分）が含まれる。 a.) ループプライマー溶液〔λDNA Loop F（配列番号
６）およびλDNA Loop R（配列番号７）〕 b.) 固定ループプライマーを含むラテックス液 (λDNA
Loop FおよびλDNA LoopRをそれぞれ上記２．によりラ
テックス粒子に固定したものの等量混合物：0.25%固形
分) c.) 固定ループプライマーを含むラテックス液〔M13 D
NA Loop F(配列番号１３)およびM13 DNA Loop R(配列番
号１４）をそれぞれ上記２．によりラテックス粒子に固
定したものの等量混合物：0.25%固形分〕

【００９５】Positive/Nagativeの比較のため、Positiv
e試料としてλDNA 1x10⁵分子、Nagative試料としてDNA
を含まない滅菌水を被験体として用いた。90分間・65℃
で反応を行い、反応終了後の濁度をPharmacia社製分光
光度計Ultrospect2000を用い、可視光570nmの波長での
濁度を測定した（反応液量が少ないために、滅菌水でそ
れぞれ4倍に希釈して測定に供した）。結果を、図８及
び図９に示す。図８及び図９によれば、実施例１と同様
に、濁度の上昇が確認されないNegative試料に対し、Po
sitive試料では、ピロリン酸マグネシウムの白色沈殿分
の濁度上昇分も併せてすべてにおいて濁度が上昇する
（図８）。しかし、この白色沈殿による濁度上昇分を差
し引いた、ラテックスだけによる濁度上昇は、生成され
る増幅産物が有する塩基配列に特異的な固定ループプラ
イマーを含むラテックス液を加えたb.)の系でしか起こ
らない。図９にみられるように、b.)では0.087から0.28
5に上昇したのに対して、c.)では0.141から0.129と有意
の変化は見られない。

【００９６】すなわち、たとえ別の増幅産物が加速度的
に増幅されようとも、目的の増幅産物が生成されない限
り、特異的塩基配列を有する固定ループプライマーによ
る凝集反応は生じないことがわかる。データには示さな
いが、この逆、つまりM13 DNA LAMP反応系にM13 DNA用
またはλDNA用の固定ループプライマーを添加して、増
幅反応の進行にともなう凝集の有無を確認したところ、
M13 DNA 用固定ループプライマーを添加した場合にのみ
凝集反応が認められた。以上の結果から、当該凝集反応
は目的とする増幅反応のみを極めて特異的に認識し、進
行する。その反応特異性はループプライマーの塩基配列
に厳密に規定されるもので、使用するその塩基配列によ
って特異性は大きく影響される。

【００９７】（実施例３：凝集反応の特異性の確認その
２）ラテックス凝集反応と同時に、LAMP反応の増幅特異
性を再確認するために、λDNA LAMP反応液に、λDNA 用
固定ループプライマーを添加した反応系に、次のa.)〜
c.)を添加して反応を行った。 a.) 滅菌水 (DNA フリー) b.) λDNA (1x10⁵分子) c.) M13 DNA (6x10⁵分子) 各反応においては、実施例１のλDNA LAMP反応液に、実
施例１のc.)λDNA 用固定ループプライマーを含むラテ
ックス液を４μl添加した。したがって、すべての反応
液中には10μgのラテックス(0.04%固形分）が含まれ
る。

【００９８】すなわち、この例では比較のために、Nagat
ive試料としてa.)にDNAを含まない滅菌水を、c.)にM13
DNAを 6x10⁵分子、そしてPositive試料としてλDNA 1x1
0⁵分子を、それぞれ被験体として使用した。90分間・65
℃で反応を行い、反応終了後の濁度をPharmacia社製分
光光度計Ultrospect2000を用い、可視光570nmの波長で
の濁度を測定した（反応液量が少ないために、滅菌水で
それぞれ4倍に希釈して測定に供した）。結果を図１０
に示す。また、増幅終了後の反応液を2%アガロースゲル
にて電気泳動し、SYBR-Greenで染色し、増幅の確認を行
った。結果を図１１に示す。

【００９９】LAMP反応の特異性により、目的の塩基配列
が含まれるλDNA のみで増幅が確認された（図１１）。
同時に、ラテックス凝集による濁度の上昇もb.) のλDN
A のみで認められ、凝集反応の特異性をも確認すること
ができた（図１０）。データには示さないが、この逆、
つまりM13 DNA LAMP/M13 DNA用固定ループプライマーの
反応系においても同様に反応特異性が認められた。以上
の結果から、当該凝集反応は目的とする増幅反応のみを
極めて特異的に認識し、進行する。特に標的塩基配列を
含まないDNA検体が含まれた場合でも、固定ループプラ
イマーのみでは増幅反応も凝集反応も進行しない。その
反応特異性は、ループプライマーの塩基配列に厳密に規
定されるもので、使用するその塩基配列によって特異性
は大きく影響される。

【０１００】(実施例４：ピロリン酸マグネシウム白色
沈殿への対応)この例では、ピロリン酸塩形成抑制剤と
して酵素Pyrophosphataseを使用し、LAMP法による増幅
及び凝集反応を行った。λDNA LAMP反応液として、実施
例１のλDNA LAMP反応液に、5mUのPyrophosphataseを添
加したものを使用し、このλDNA LAMP反応液に、実施例
１のa.)〜c.)をそれぞれ4μl添加する。したがって、
b.) および c.)の反応液中には10μgのラテックス(0.04
%固形分）が含まれる。被検体DNAとして、Positive試料
であるλDNA（1x10⁵分子）をすべてに添加し、90分間・
65℃で反応を行い、反応終了後の濁度をPharmacia社製
分光光度計Ultrospect2000を用い、可視光570nmの波長
での濁度を測定した（反応液量が少ないために、滅菌水
でそれぞれ4倍に希釈して測定に供した）。結果を図１
２に示す。また、増幅終了後の反応液を2%アガロースゲ
ルにて電気泳動し、SYBR-Greenで染色し、増幅の確認を
行った。結果を図１３に示す。全ての例において特異的
な増幅反応は行われたが（図１３）、これまで懸案であ
ったピロリン酸マグネシウムの白色沈殿はa.) において
も確認されず、濁度の上昇はなかった。ラテックスを含
むb.) とc.) を比較して、固定ループプライマーを含む
c.)において、有意に濁度が上昇していることから、Pyr
ophosphataseの使用によって、増幅反応の進行に伴う特
異的な凝集反応には影響が無いことが確認された（図１
２）。

【０１０１】(実施例５)実施例４で使用した、ピロリン
酸塩形成抑制剤として酵素Pyrophosphataseを含有する
λDNA LAMP反応液に、次のa.)〜d.)をそれぞれ4μl添加
した。したがって、すべての反応液中には10ugのラテッ
クス(0.04%固形分）が含まれる。 a.) λDNA 用固定Loop F を含むラテックス液 (λDNA L
oop Fを上記２．によりラテックス粒子に固定したも
の：0.25%固形分) b.) λDNA 用固定Loop R を含むラテックス液 (λDNA L
oop Rを上記２．によりラテックス粒子に固定したも
の：0.25%固形分) c.) 上記 a.)および b.) の等量混合物 d.) λDNA 用Loop F およびλDNA 用Loop R を混合して
固定した固定ループプライマー（2種類のループプライ
マーを、同時に上記２．によりラテックス粒子に固定し
たもの：0.25%固形分）

【０１０２】Positive/Nagativeの比較のため、Positiv
e試料としてλDNA 1x10⁵分子、Nagative試料としてDNA
を含まない滅菌水を被験体として用いた。90分間・65℃
で反応を行い、反応終了後の濁度をPharmacia社製分光
光度計Ultrospect2000を用い、可視光570nmの波長での
濁度を測定した（反応液量が少ないために、滅菌水でそ
れぞれ4倍に希釈して測定に供した）。結果を図１４に
示す。固定ループFまたは固定ルールRをそれぞれ単独で
使用した場合にも、濁度に若干の差は認められるもの
の、凝集反応は進行する。同様に、固定ループFおよび
固定ルールRの等量混合物を使用した場合においても、
凝集反応は問題なく進行するが、濁度の上昇は最も大き
かった。

【０１０３】これに対して、同一ラテックス上にループ
FおよびループRを同時に固定した固定ループプライマー
を使用した場合には、濁度の上昇は極めて小さい（図１
４）。この場合には、ラテックス上に固定したループプ
ライマーから伸長した塩基配列に相補的なループプライ
マーが同一ラテックス上に存在するので、同じラテック
ス上でハイブリダイズを完了してしまう機会が多くな
り、複数のラテックス粒子が結合することによる凝集反
応が生じにくくなるためと考えられる。すなわち、ラテ
ックス上に固定したループプライマーから伸長した塩基
配列に、別の固定ループプライマーがハイブリダイズす
る過程において、別のラテックス粒子とハイブリダイズ
してマトリクスを形成し凝集塊を形成しやすい、他の
a.) b.) およびc.) と比較して、d.)では同じラテック
ス上でハイブリダイズを完了してしまう機会が多く、凝
集に不適当な条件であると推測される。

【０１０４】これを確認するために、上記と同様のLAMP
増幅・凝集反応において、反応液中にエチジウムブロマ
イドをインターカレーターとして添加し、増幅速度をAB
I社7700を用いてそれぞれ確認を行った。結果を図１５
に示す。上記の結果に呼応するように、増幅効率はc.)
＞b.)＞a.)の順で速く、d.)は最も遅かった。おそらく
d.) は伸長鎖とそれと相補なループプライマーとのハイ
ブリダイズが同一ラテックス上で起きてしまい、ループ
プライマー本来の増幅効率を高める効果も反応の過程で
失ってしまうものと推測される。

【０１０５】

【発明の効果】本発明によれば、特定の構造を持った鋳
型ポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドの特定の
位置で相補鎖合成の起点を与えることができる不溶性担
体に固定したプライマーを組み合わせることにより、次
のような顕著な効果を奏する。（１）LAMP反応による増幅産物は自己相補配列の繰り返
しを持つので、１種類の固定化プライマーのみで増幅産
物は凝集反応を起こす。（２）相補鎖合成の反応効率を改善するとともにポリヌ
クレオチドの増幅反応の進行に伴って生じる凝集反応を
観察することによって、きわめて簡単かつ迅速に試料中
の標的核酸配列を検出することができる。（３）反応系にピロリン酸塩形成抑制剤を添加した場合
には、LAMP法の増幅反応に伴うピロリン酸マグネシウム
の形成を防止することができるので、きわめて簡単に凝
集反応の有無を確認することが可能になる。（４）反応の途中で試薬を添加する必要がなく、増幅反
応に伴なう凝集生成物の検出を反応容器のままで行なう
ことが可能となり、反応後の容器の開封を全面的に廃止
することができるるので、容易にコンタミネーションを
防止することができる。（５）LAMP反応は等温で連続的に進行するので、凝集反
応による吸光度の変化を経時的に測定することにより、
核酸の増幅の有無をリアルタイムにモニタリングするこ
とが可能である。本発明は、等温での反応が可能で、増幅反応時のミスマ
ッチを抑制し、効率良く標的核酸配列を検出することが
できるというLAMP法の特徴を全て実現しつつ、きわめて
簡単に標的核酸配列を検出する方法と、その方法に使用
する検出用キットを提供するものであり、実用的価値の
高い発明である。

【０１０６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Eiken Chemical Co., Ltd. <120> A Method for Detecting Polynucleotide and a kit therefor <130> <140> <141> <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 172 <212> DNA <213> Bacteriophage lambda <400> 1 gcttatcttt ccctttattt ttgctgcggt aagtcgcata aaaaccattc ttcataattc 60 aatccattta ctatgttatg ttctgagggg agtgaaaatt cccctaattc gatgaagatt 120 cttgctcaat tgttatcagc tatgcgccga ccagaacacc ttgccgatca gc 172 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 2 cgtgagcaat gggtatatgc aaatagagct ctgtgtttgt cttcctgc 48 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 atgtccttgt cgatataggg atgaagcaca ttatcctgaa ttttcggtg 49 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 4 cctgcctcca aacgatacct 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 5 ttgtggtgat ataggacaga ca 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 6 ggaactccgg gtgctatcag 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 7 tgacctttct ctcccatatt gcagtcg 27 <210> 8 <211> 600 <212> DNA <213> <400> 8 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gctttggccg attcattaat gcagctggca 60 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120 cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180 tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 240 cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggaatgc aagcttggca ctggccgtcg 300 ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 360 atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 420 agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 480 cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac ggtcgtcgtc ccctcaaact 540 ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca 600 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 9 cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 10 acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c 51 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 11 actttatgct tccggctcgt a 21 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 12 gttgggaagg gcgatcg 17 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 13 catggtcata gctgtttcct gtgt 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 14 caacttaatc gccttgcagc ac 22

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を利用したポリヌクレオチドの増幅方法
の反応原理を示す図。図中、ＦＡ：LAMP法用プライマーＦＡＲＡ：LAMP法用プライマーＲＡ

【図２】本発明を利用したポリヌクレオチドの増幅方法
の反応原理を示す図。図中の略号は図１と同じ意味を表
す。

【図３】本発明を利用したポリヌクレオチドの増幅方法
の反応原理を示す図。 loop F：固定ループプライマーＦ loop R：固定ループプライマーＲ

【図４】本発明を利用したポリヌクレオチドの増幅方法
の反応原理を示す図。図中の略号は図３と同じ意味を表
す。

【図５】ループプライマーと鋳型ポリヌクレオチドを構
成する塩基配列との好ましい位置関係を示す図。

【図６】実施例１でλDNA LAMP反応を行った反応液の可
視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。 a.)未固定ループプライマーを使用した場合。 b.)未固定ループプライマー及び未感作ラテックス液を
使用した場合。 c.)固定ループプライマーを含むラテックス液を使用し
た場合。

【図７】実施例１でλDNA LAMP反応を行った反応液の可
視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。増
幅反応の進行に伴って形成されるピロリン酸マグネシウ
ムによるによる濁度上昇分を差し引いたもの。

【図８】実施例２でλDNA LAMP反応を行った反応液の可
視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。 a.)未固定ループプライマーを使用した場合。 b.)λDNA用固定ループプライマーを含むラテックス液を
使用した場合。 c.)M13 DNA用固定ループプライマーを含むラテックス液
を使用した場合。

【図９】実施例２でλDNA LAMP反応を行った反応液の可
視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。増
幅反応の進行に伴って形成されるピロリン酸マグネシウ
ムによるによる濁度上昇分を差し引いたもの。

【図１０】実施例３でλDNA LAMP反応を行った反応液の
可視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。 a.) 滅菌水 (DNA フリー)を試料とした場合。 b.) λDNA (1x10⁵分子)を試料とした場合。 c.) M13 DNA (6x10⁵分子)を試料とした場合。

【図１１】実施例３で増幅終了後の反応液を2%アガロー
スゲルにて電気泳動し、SYBR-Greenで染色した結果を示
す図。

【図１２】実施例４でλDNA LAMP反応を行った反応液の
可視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。 a.)未固定ループプライマーを使用した場合。 b.)未固定ループプライマー及び未感作ラテックス液を
使用した場合。 c.)固定ループプライマーを含むラテックス液を使用し
た場合。

【図１３】実施例４で増幅終了後の反応液を2%アガロー
スゲルにて電気泳動し、SYBR-Greenで染色した結果を示
す図。

【図１４】実施例５でλDNA LAMP反応を行った反応液の
可視光570nmの波長での濁度を測定した結果を示す図。 a.) λDNA 用固定Loop F を含むラテックス液を使用し
た場合。 b.) λDNA 用固定Loop R を含むラテックス液を使用し
た場合。 c.) 上記 a.)および b.) の等量混合物を使用した場
合。 d.) λDNA 用Loop F およびλDNA 用Loop R を混合して
固定した固定ループプライマーを使用した場合。

【図１５】実施例５で反応液中にエチジウムブロマイド
をインターカレーターとして添加し、増幅速度をABI社7
700を用いてそれぞれ確認を行った結果を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 CA20 HA08 HA14 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR13 QR32 QR41 QR49 QR62 QR83 QS24 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の要素〔１〕〜〔５〕を混合してイン
キュベートし、ポリヌクレオチドの増幅反応に伴う凝集
反応の有無を観察することを特徴とする、試料中の標的
核酸配列を検出する方法。〔１〕：次の条件(a)〜(d)を持つ鋳型ポリヌクレオチ
ド、(a)少なくとも１組の相補的な塩基配列からなる標
的塩基配列を有する、(b)（a）の相補的な塩基配列がハ
イブリダイズしたときに、塩基対結合が可能なループを
形成することができる、(c)3'末端が自身にアニールし
てループを形成することができる、(d)自身にアニール
した3'末端は自身を鋳型とする相補鎖合成の起点となる
ことができる〔２〕：鋳型ポリヌクレオチドのループに
おいて、異なる位置に相補鎖合成の起点を与えることが
できる少なくとも２種類のプライマー、〔３〕：鋳型ポ
リヌクレオチド、および／または鋳型ポリヌクレオチド
に〔２〕のプライマーがアニールして生成する伸長生成
物において、〔２〕のプライマーとは異なる位置に相補
鎖合成の起点を与えることができる少なくとも１種類の
プライマーであって、５’末端を不溶性担体に固定化し
たもの（固定プライマー）、〔４〕：鎖置換を伴う相補
鎖合成を触媒することができるDNAポリメラーゼ、
〔５〕：相補鎖合成のための基質、
【請求項２】前記固定プライマー〔３〕が、鋳型ポリヌ
クレオチド、および／または鋳型ポリヌクレオチドに
〔２〕のプライマーがアニールして生成する伸長生成物
が形成するループにおいて、〔２〕のプライマーとは異
なる位置に相補鎖合成の起点を与えることができるプラ
イマー(固定ループプライマー)であることを特徴とする
請求項１に記載の方法。
【請求項３】不溶性担体が天然高分子担体、合成高分子
担体、金属コロイド、または磁性粒子である請求項１ま
たは２に記載の方法。
【請求項４】不溶性担体が合成高分子担体のラテックス
であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】鋳型ポリヌクレオチドが、自身の塩基配列
の任意の領域に対して相補的な塩基配列をその5’末端
に備えている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】次の工程によって鋳型ポリヌクレオチドを
生成する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。ａ）標的塩基配列に第１のプライマーをアニールさせ、
これを起点とする相補鎖合成反応を行う工程；ここで第
１のプライマーはその3'末端において標的塩基配列を構
成する一方の鎖の3'側を規定する領域に相補鎖合成の起
点を与えることができ、かつ第１のプライマーの5'側に
は、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるもので
ある、ｂ）工程ａ）で合成された第１のプライマーを起点とす
る伸長生成物における第２のプライマーがアニールすべ
き領域を塩基対結合が可能な状態とする工程；ここで第
２のプライマーはその3'末端において前記第１のプライ
マーを起点とする伸長生成物における標的塩基配列の3'
側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることがで
きる塩基配列を備え、かつ第２のプライマーの5'側に
は、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物
の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるもので
ある、ｃ）工程ｂ）において塩基対結合が可能となった領域に
第２のプライマーをアニールさせ、これを起点とする相
補鎖合成を行う工程、ｄ）工程ｃ）によって合成された第２のプライマーを起
点とする伸長生成物の3'末端を自身にアニールさせて、
自身を鋳型とする相補鎖合成を行う工程
【請求項７】前記２種類のプライマー〔２〕が、第１の
プライマー、および第２のプライマーである請求項６に
記載の方法。
【請求項８】前記固定プライマー〔３〕が、第１のプラ
イマーを起点とする伸長生成物における第１のプライマ
ーに由来する領域と、第１のプライマーに対する前記任
意の領域の間において相補鎖合成の起点を与えることが
できる第１の固定プライマー；および／または第２のプ
ライマーを起点とする伸長生成物における第２のプライ
マーに由来する領域と、第２のプライマーに対する前記
任意の領域の間において相補鎖合成の起点を与えること
ができる第２の固定プライマーを含むものである請求項
７に記載の方法。
【請求項９】工程ｂ）および／または工程ｃ）におい
て、第１のプライマーまたは第２のプライマーに対して
その上流に相補鎖合成の起点を与えるアウタープライマ
ーからの相補鎖合成によって、第１のプライマーおよび
／または第２のプライマーを起点とする伸長生成物を置
換して第１のプライマーまたは第２のプライマーを起点
とする各生成物を１本鎖とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】工程ａ）において、標的塩基配列が２本
鎖ポリヌクレオチドとして存在しており、第１のプライ
マーがアニールする領域が、任意のプライマーを起点と
する相補鎖合成反応によって塩基対結合が可能な状態と
される請求項４に記載の方法。
【請求項１１】工程ａ）を融解温度調整剤の存在下で行
う請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】融解温度調整剤が、ベタイン、プロリ
ン、ジメチルスルホキシド、およびトリメチルアミンＮ
−オキシドから選択される少なくとも１つの化合物であ
る請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】ピロリン酸塩形成抑制剤の存在下にポリ
ヌクレオチドの増幅反応を行う請求項１〜１２のいずれ
かに記載の方法。
【請求項１４】ピロリン酸塩形成抑制剤がPyrophosphat
aseである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】請求項１〜１４のいずれかに記載の方法
によって標的塩基配列における変異を検出する方法であ
って、標的塩基配列が予測された塩基配列でなかったと
きに、前記増幅方法を構成する相補鎖合成反応から選択
される少なくとも１つの相補鎖合成反応が妨げられるも
のであり、前記増幅反応に伴う凝集反応が生じたかどう
かを観察し、凝集反応が生じなかったときに標的塩基配
列が予測した塩基配列でないと判定する工程を含む方
法。
【請求項１６】請求項１〜１４のいずれかに記載の方法
によって標的塩基配列における変異を検出する方法であ
って、前記増幅反応に伴う凝集反応が生じたかどうかを
観察し、凝集反応が生じたときに標的塩基配列が予測し
た塩基配列であると判定する工程を含む方法。
【請求項１７】次の要素を含む、標的塩基配列の検出用
キット。ａ）第１のプライマー；ここで第１のプライマーはその
3'末端において標的塩基配列を構成する一方の鎖の3'側
を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることがで
き、かつ第１のプライマーの5'側には、このプライマー
を起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対し
て相補的な塩基配列を備えるものである、ｂ）第２のプライマー；ここで第２のプライマーはその
3'末端において前記第１のプライマーを起点とする伸長
生成物における標的塩基配列の3'側を規定する領域に相
補鎖合成の起点を与えることができる塩基配列を備え、
かつ第２のプライマーの5'側には、このプライマーを起
点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相
補的な塩基配列を備えるものである、ｃ）少なくとも１種類の5’末端を不溶性担体に固定し
た固定プライマー；ここで該固定プライマーは、第１の
プライマー、または第２のプライマーを起点とする伸長
生成物において、各プライマーとは異なる位置に相補鎖
合成の起点を与えることができるものである、ｄ）鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒することができるDN
Aポリメラーゼ、ｅ）相補鎖合成のための基質、ｆ)ピロリン酸塩形成抑制剤、
【請求項１８】固定プライマーが、鋳型ポリヌクレオチ
ド、および／または鋳型ポリヌクレオチドに第１のプラ
イマーまたは第２のプライマーがアニールして生成する
伸長生成物が形成するループにおいて、各プライマーと
は異なる位置に相補鎖合成の起点を与えることができる
プライマー(固定ループプライマー)であることを特徴と
する請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】前記固定プライマーｃ）が、第１のプラ
イマーを起点とする伸長生成物における第１のプライマ
ーに由来する領域と、第１のプライマーに対する前記任
意の領域の間において相補鎖合成の起点を与えることが
できる第１の固定プライマー；および第２のプライマー
を起点とする伸長生成物における第２のプライマーに由
来する領域と、第２のプライマーに対する前記任意の領
域の間において相補鎖合成の起点を与えることができる
第２の固定プライマーを含むものである請求項１７また
は１８に記載のキット。
【請求項２０】更に次の要素ｇ）を含む請求項１７〜１
９のいずれかに記載のキット。ｇ）アウタプライマー；アウタープライマーは、第１の
プライマーおよび／または第２のプライマーの上流に相
補鎖合成の起点を与えることができる
【請求項２１】ピロリン酸塩形成抑制剤がPyrophosphat
aseである請求項１７〜２０のいずれかに記載のキッ
ト。