JP2002340899A - Immunoassay method and reagent for it - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an immunoassay method and a reagent for it having excellent effects such as good measurement sensitivity and few nonspecific reactions. SOLUTION: In this immunoassay method, one or two kinds of substances selected from chondroitin sulfate, its salt, polyacrylic acid, and its salt and one or more kinds of substances selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, caprolactam, valerolactam, and pyroridone coexist in a reaction solution.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は免疫反応を利用する
測定方法、即ち免疫測定方法に関し、詳細には測定感度
が良好でありかつ非特異反応が少ないという優れた効果
を有する免疫測定方法およびそのための試薬に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a measurement method utilizing an immune reaction, that is, an immunoassay method. More specifically, the present invention relates to an immunoassay method having an excellent effect of good measurement sensitivity and low nonspecific reaction, and a method therefor. Related to the reagent.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、臨床検査等の各種検査では自動化
および測定時間の短縮が図られている。その検査の方法
として、生体試料中の微量物質を測定するために免疫反
応を利用する測定方法が広く用いられている。免疫測定
方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテ
ックス凝集法、金属コロイド凝集法、イムノクロマト法
等多くの方法がある。その中でもラテックス凝集法や金
属コロイド凝集法は反応液の分離や洗浄を行わないた
め、自動化に適している。免疫測定では、一般に、測定
する生体試料中の被測定物質濃度に応じた方法の使い分
けがされている。ラテックス凝集法や金属コロイド凝集
法は免疫比濁よりも微量物質の測定が行えるが、ＲＩＡ
法やＥＩＡ法ほどの微量物質の測定は行うことができな
い。何れの免疫測定方法においても、反応系の微量化や
測定時間の短縮が望まれており、測定感度を向上させる
ことが重要な課題である。しかるに一方、免疫測定にお
いて血清、血漿、尿または髄液のような生体試料中に含
まれる反応に無関係な物質、例えばリュウマチ因子など
が非特異反応を引き起こす場合のあることが知られてい
る。そして、免疫測定において測定感度の向上を図るほ
ど、非特異反応を生じやすくなり、非特異反応は擬陽性
の結果を招くという問題がある。特にこの傾向は免疫比
濁、ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法等のホモジ
ニアス測定系で生じやすい。2. Description of the Related Art In recent years, various tests such as clinical tests have been automated and shortened in measurement time. As a test method, a measurement method utilizing an immune reaction to measure a trace substance in a biological sample is widely used. As the immunoassay method, there are many methods such as RIA, EIA, immunoturbidimetry, latex agglutination, metal colloid agglutination, and immunochromatography. Among them, the latex agglutination method and the metal colloid agglutination method are suitable for automation because the reaction solution is not separated or washed. In the immunoassay, generally, a method is selectively used according to the concentration of a substance to be measured in a biological sample to be measured. The latex agglutination method and the metal colloid agglutination method can measure trace substances more than immunoturbidimetry.
It is not possible to measure trace substances as much as the EIA method or EIA method. In any of the immunoassay methods, miniaturization of the reaction system and reduction of the measurement time are desired, and improving measurement sensitivity is an important issue. On the other hand, it is known that, in an immunoassay, substances unrelated to the reaction contained in a biological sample such as serum, plasma, urine or cerebrospinal fluid, for example, rheumatoid factor may cause a nonspecific reaction. Then, as the sensitivity of the immunoassay is improved, a nonspecific reaction is more likely to occur, and the nonspecific reaction has a problem that a false positive result is caused. In particular, this tendency is likely to occur in a homogeneous measurement system such as immunoturbidity, latex agglutination and metal colloid agglutination.

【０００３】そのため、自動化を行いやすいラテックス
凝集法や金属コロイド凝集法等のホモジニアス測定系
で、測定感度の向上と非特異反応の抑制を図る技術が望
まれている。血液検体（血清、血漿）中の物質をｎｇ／
ｍｌのオーダーで測定するほとんどの場合、専用の分析
装置とその装置特有の試薬で測定される。専用の測定装
置は非常に高価であり、その装置専用の試薬以外の試薬
を使用することが出来ないという大きな制約がある。そ
のため、ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法によっ
て非特異反応が少なくかつ測定感度が良好な測定ができ
るならば、汎用的な自動分析装置を用いて微量物質の測
定が可能となり、分析の自動化および測定時間の短縮に
対応できる。さらには、専用の測定装置を必要としない
ため、結果的に安価に測定することができ、臨床検査分
野等での有用性が著しく増す。[0003] Therefore, there is a demand for a technique for improving measurement sensitivity and suppressing non-specific reactions in a homogeneous measurement system such as a latex agglutination method or a metal colloid agglutination method, which can be easily automated. Substances in blood samples (serum, plasma) in ng /
In most cases, measurement in the order of ml is performed using a dedicated analyzer and reagents specific to the device. A dedicated measuring device is very expensive, and there is a major restriction that a reagent other than a reagent dedicated to the device cannot be used. Therefore, if the latex agglutination method or the metal colloid agglutination method can perform non-specific reactions with good measurement sensitivity, measurement of trace substances can be performed using a general-purpose automatic analyzer. Can respond to a reduction in time. Furthermore, since a dedicated measuring device is not required, the measurement can be performed at low cost as a result, and the usefulness in the field of clinical examinations and the like is remarkably increased.

【０００４】免疫測定において測定感度の向上あるいは
非特異反応抑制を図るための技術は多く開示されてい
る。例えば、γ−グロブリンやその変性物を用いる方法
（特開昭５５−１２４１９）、尿素、Ｎ−メチル尿素、
Ｎ’，Ｎ’−ジメチル尿素、Ｎ−メチルホルムアミド等
を用いる方法（特開昭５５−１６０８５３）、グアニジ
ン類を用いる方法（特開昭５６−２５５６）、デキスト
ラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、フタル
酢酸セルロ−ス、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等
のポリアニオンを用いる方法（特開昭５７−１８２１６
９）、ポリエチレングリコールを共存させる方法（特開
昭５８−４７２５６）、ゼラチン、オボアルブミン、ラ
クトアルブミン、動物血清アルブミン等の分解物のポリ
ペプチドを添加する方法（特開昭５８−１４４７４
８）、非イオン界面活性剤を用いる方法（特開昭５８−
１８７８６２）、疎水性蛋白の０．１％以上を塩類の存
在下に用いる方法（特開昭５９−２５１８４）、ブチロ
ラクトン、バレロラクトン、カプロラクトン、ピロリド
ン等を用いる方法（特開昭５９−１５１０６１）、デキ
ストランのような多糖類を用いる方法（特開昭５９−２
２０６４６）、マウス血清、マウス腹水等を用いる方法
（特開昭６１−６５１６２）、メチルセルロ−スやエチ
ルセルロースのようなアルキル化多糖類を用いる方法
（特開平２−１７３５６７）、カルボキシル基含有重合
体を含有する方法（特開平２−１９４３６０）、二価陽
イオンを存在させる方法（特開平２−２２８５６０）、
カルボキシメチルセルロ−スを用いる方法（特開平２−
２３８３６０）、コンドロイチン硫酸を用いる方法（特
開平２−２３８３６１）、アミノ酸を添加する方法（特
開平３−１４８０６５）、ポリビニルピロリドンを用い
る方法（特開平４−２０８５９）、グリコシド誘導体含
有重合体を存在させる方法（特開平４−１２２８５
８）、アルギン酸を用いる方法（特表平４−５０５５１
０）、ヒドロキシメチルセルロースやヒドロキシエチル
セルロースのようなヒドロキシアルキルセルロースを用
いる方法（特開平５−１７２８１８）、プルランやポリ
ビニルピロリドンを用いる方法（特開平５−１８０８３
８）、ＨＬＢが１２から１９の非イオン界面活性剤を用
いる方法（特開平６−６６７９８）、塩化ナトリウムイ
オン等のアルカリ金属イオン存在下の方法（特開平６−
１３８１２４）、プルランやデンプンの分解物のような
マルトトリオ−ス重合体を用いる方法（特開平６−１６
７４９３）、ヘパリンを含有する方法（特開平７−１５
１７５４）、１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノ
プロピル）ウレア、１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリノエチル）ウレア−メト−ｐ−トルエンスルホネ
ート、ジメチルアミン、ジエチルアミン等を含有する方
法（特開平７−２５３４３０）、血漿蛋白質等と有機酸
とを組合わせる方法（特開平７−２７０４１３）、グル
コシルエチルメタクリレートやガラクトシルエチルメタ
クリレートのポリマーのような側鎖に糖類を有する高分
子を用いる方法（特開平７−２７０４１７）、スレオ−
１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオールを添加
する方法（特開平８−８６７８３）、ＥＤＴＡ、塩化ナ
トリウムを添加する方法（特開平８−１０５８９７）、
マグネシウムイオンを存在させる方法（特開平８−２１
１０５７）、ポリエチレングリコールのような凝集促進
剤とアミノエタンスルホン酸誘導体等を組合わせて用い
る方法（特開平８−２７８３０８）、卵アルブミンを含
有する方法（特開平９−１０１３０９）、高分子非イオ
ン界面活性剤を用いる方法（特開平９−２６９３２
７）、スルホン酸基を含有する共役ジエン系重合体の存
在下に行う方法（特開平９−３０４３８４）、ポリエチ
レングリコールやポリビニルピロリドンを用いる方法
（特開平１０−２６６２２）、ＨＬＢが９−２０のモノ
マーからなる分子量が１０００−１５０万のポリマ−を
含む方法（特開平１０−２８２１０１）、分子量が５０
０−２０００でステロイド環を有する界面活性剤を含む
方法（特開平１０−２８２１０２）、硝酸塩やチオシア
ン酸塩を用いる方法（特開平１０−３１１８３０）、ア
ルカリ性塩化物、アルカリ性酒石酸塩や改変熱ＢＳＡを
用いる方法（特開平１１−２２３６３１）、Ｄ−アミノ
酸からなるペプチドの使用（特開平１１−２４２０２
８）、シクロデキストリンやその誘導体を含有する方法
（特開平１１−２４８７０６）、親水部に二糖類を有す
る非イオン性界面活性剤を含有する方法（特開平１１−
２５８２３９）、非特異因子に対する抗体を用いる方法
（特開平１１−２８７８０１）、免疫学的に反応しない
抗原を固定化した不溶性担体を用いる方法（特開平１１
−３３７５５１）、リュウマチ因子またはリュウマチ因
子様物質を添加する方法（特開平１１−３４４４９１）
等である。Many techniques have been disclosed for improving the measurement sensitivity or suppressing nonspecific reactions in immunoassays. For example, a method using γ-globulin or a modified product thereof (JP-A-55-12419), urea, N-methylurea,
A method using N ', N'-dimethylurea, N-methylformamide or the like (JP-A-55-160853), a method using guanidines (JP-A-56-2556), dextran sulfate, heparin, polystyrenesulfonic acid, phthalate A method using a polyanion such as cellulose acetate, hyaluronic acid, chondroitin sulfate or the like (JP-A-57-18216).
9), a method of coexisting with polyethylene glycol (JP-A-58-47256), and a method of adding a polypeptide of a degradation product such as gelatin, ovalbumin, lactalbumin, animal serum albumin (JP-A-58-14474).
8), a method using a nonionic surfactant (JP-A-58-1983)
187,862), a method using 0.1% or more of a hydrophobic protein in the presence of salts (JP-A-59-25184), a method using butyrolactone, valerolactone, caprolactone, pyrrolidone and the like (JP-A-59-151061). A method using a polysaccharide such as dextran (JP-A-59-2)
20646), a method using mouse serum, mouse ascites, etc. (JP-A-61-65162), a method using alkylated polysaccharides such as methylcellulose and ethylcellulose (JP-A-2-173567), and a method using carboxyl group-containing polymer. (JP-A-2-194360), a method in which a divalent cation is present (JP-A-2-228560),
Method using carboxymethyl cellulose (Japanese Unexamined Patent Publication No.
238360), a method using chondroitin sulfate (JP-A-2-238361), a method of adding an amino acid (JP-A-3-14865), a method of using polyvinylpyrrolidone (JP-A-4-20859), and the presence of a glycoside derivative-containing polymer. Method (JP-A-4-12285)
8), a method using alginic acid (Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 4-50551)
0), a method using hydroxyalkylcellulose such as hydroxymethylcellulose or hydroxyethylcellulose (JP-A-5-172818), a method using pullulan or polyvinylpyrrolidone (JP-A-5-18083)
8), a method using a nonionic surfactant having an HLB of 12 to 19 (JP-A-6-66798), and a method using an alkali metal ion such as sodium chloride ion (JP-A-6-66798).
138124), a method using a maltotriose polymer such as a decomposition product of pullulan or starch (JP-A-6-16)
7493), a method containing heparin (JP-A-7-15)
1754), 1-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) urea, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) urea-meth-p-toluenesulfonate, dimethylamine, diethylamine and the like ( JP-A-7-253430), a method of combining a plasma protein or the like with an organic acid (JP-A-7-270413), a method of using a polymer having a saccharide in a side chain such as a polymer of glucosylethyl methacrylate or galactosylethyl methacrylate ( JP-A-7-270417), Threo-
A method of adding 1,4-dimercapto-2,3-butanediol (JP-A-8-86683), a method of adding EDTA and sodium chloride (JP-A-8-105897),
Method for Presence of Magnesium Ion (JP-A-8-21)
1057), a method using a combination of an aggregation promoting agent such as polyethylene glycol and an aminoethanesulfonic acid derivative or the like (JP-A-8-278308), a method containing egg albumin (JP-A-9-101309), a polymer nonionic Method using a surfactant (JP-A-9-26932)
7), a method performed in the presence of a conjugated diene polymer containing a sulfonic acid group (JP-A-9-304384), a method using polyethylene glycol or polyvinylpyrrolidone (JP-A-10-26622), and an HLB of 9-20. A method comprising a polymer comprising a monomer and having a molecular weight of 10 to 1.5 million (JP-A-10-282101);
0-2000 containing a surfactant having a steroid ring (JP-A-10-282102), nitrate or thiocyanate (JP-A-10-31830), alkaline chloride, alkaline tartrate or modified heat BSA Method (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 11-223631), use of a peptide composed of D-amino acids (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 11-24202)
8), a method containing a cyclodextrin or a derivative thereof (JP-A-11-248706), and a method containing a nonionic surfactant having a disaccharide in a hydrophilic part (JP-A-11-248).
258239), a method using an antibody against a non-specific factor (JP-A-11-287801), and a method using an insoluble carrier on which an immunologically unreactive antigen is immobilized (JP-A-11-287801).
-337551), a method of adding a rheumatoid factor or a rheumatoid factor-like substance (JP-A-11-344491)
And so on.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】これら公知の免疫反応
の測定感度向上技術では、微量物質の測定に十分な感度
を有していない場合が多く、更なる測定感度向上のため
の新たな技術が切望されている。しかし、前記のとお
り、免疫測定において測定感度の向上を図るほど非特異
反応を生じやすくなる。従って、免疫測定においては、
測定感度の向上のみならず、それに伴って生じる非特異
反応を良好に抑制する技術も合わせて望まれている。In many cases, these known techniques for improving the sensitivity of an immune reaction do not have sufficient sensitivity for the measurement of a trace substance. Coveted. However, as described above, as the measurement sensitivity is improved in the immunoassay, a non-specific reaction is more likely to occur. Therefore, in the immunoassay,
There is a demand for not only an improvement in measurement sensitivity but also a technique for satisfactorily suppressing non-specific reactions caused by the improvement.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは、免疫測定においてその測定感度を向上させ、
同時に非特異反応を抑制することの可能性を、免疫測定
方法のひとつである金コロイド凝集法を用いて検討した
結果、被測定物質を含む免疫反応液中に特殊な組合わせ
の試薬を共存させることで、免疫反応の測定感度を向上
させ、同時に非特異反応を抑制できることを見い出し
た。Under such circumstances, the present inventors have improved the measurement sensitivity in immunoassay,
At the same time, the possibility of suppressing non-specific reactions was examined using a colloidal gold agglutination method, which is one of the immunoassay methods.As a result, a special combination of reagents was allowed to coexist in the immunoreaction solution containing the analyte. As a result, it has been found that the measurement sensitivity of the immune reaction can be improved, and at the same time, the nonspecific reaction can be suppressed.

【０００７】即ち、本発明は、 （１）被測定物質が含まれる免疫反応液中にコンドロイ
チン硫酸またはその塩およびポリアクリル酸またはその
塩から選ばれる１種または２種と、ブチロラクトン、バ
レロラクトン、カプロラクトン、バレロラクタム、カプ
ロラクタムおよびピロリドンから選ばれる１種以上とを
共存させることを特徴とする、免疫反応を利用して該被
測定物質を測定するための免疫測定方法；好ましくは、
コンドロイチン硫酸またはその塩およびポリアクリル酸
またはその塩から選ばれる１種または２種の免疫反応液
中における全濃度が０．５−１０％であることを特徴と
する、および／またはブチロラクトン、バレロラクト
ン、カプロラクトン、バレロラクタム、カプロラクタム
およびピロリドンから選ばれる１種以上の免疫反応液中
における全濃度が０．５−１０％であることを特徴とす
る本発明の方法；That is, the present invention provides: (1) one or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof in an immunoreaction solution containing a substance to be measured, butyrolactone, valerolactone, An immunoassay method for measuring the substance to be measured using an immune reaction, characterized by coexisting with at least one selected from caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone;
Characterized in that the total concentration in one or two immunoreaction solutions selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof is 0.5 to 10%, and / or butyrolactone, valerolactone A method according to the present invention, wherein the total concentration in one or more immunoreaction solutions selected from the group consisting of, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone is 0.5 to 10%;

【０００８】より好ましくは、免疫反応液中における全
濃度が０．０１−５％であるデキストラン硫酸またはそ
の塩をさらに含有させることを特徴とする本発明の方
法；さらに好ましくは、免疫反応が免疫凝集反応、より
好ましくはラテックス凝集または金属コロイド凝集、さ
らに好ましくは金コロイド凝集であることを特徴とする
本発明の方法；[0008] More preferably, the method of the present invention further comprises dextran sulfate or a salt thereof having a total concentration of 0.01-5% in the immunoreaction solution; An agglutination reaction, more preferably a latex agglutination or metal colloid agglomeration, even more preferably a gold colloid agglomeration;

【０００９】（２）コンドロイチン硫酸またはその塩お
よびポリアクリル酸またはその塩から選ばれる１種また
は２種と、ブチロラクトン、バレロラクトン、カプロラ
クトン、バレロラクタム、カプロラクタムおよびピロリ
ドンから選ばれる１種以上とを含有する免疫測定用試
薬；好ましくは、被測定物質が含まれる免疫反応液中に
おける全濃度が０．５−１０％となるような量のコンド
ロイチン硫酸またはその塩およびポリアクリル酸または
その塩から選ばれる１種または２種を含有すること、お
よび／または被測定物質が含まれる免疫反応液中におけ
る全濃度が０．５−１０％となるような量のブチロラク
トン、バレロラクトン、カプロラクトン、バレロラクタ
ム、カプロラクタムおよびピロリドンから選ばれる１種
以上を含有することを特徴とする本発明の免疫測定用試
薬；(2) One or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof, and one or more selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone A reagent for immunoassay; preferably selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof in such an amount that the total concentration in the immune reaction solution containing the substance to be measured is 0.5 to 10%. Butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam in an amount containing one or two and / or a total concentration of 0.5-10% in the immunoreaction solution containing the substance to be measured. And one or more selected from pyrrolidone Immunoassay reagent of the present invention, wherein;

【００１０】より好ましくは、免疫反応液中において全
濃度が０．０１−５％となる量のデキストラン硫酸また
はその塩をさらに含有することを特徴とする本発明の免
疫測定用試薬；さらに好ましくは、免疫反応が免疫凝集
反応、より好ましくはラテックス凝集または金属コロイ
ド凝集、さらに好ましくは金コロイド凝集であることを
特徴とする本発明の免疫測定用試薬；および[0010] More preferably, the immunoassay reagent of the present invention further comprises dextran sulfate or a salt thereof in such an amount that the total concentration becomes 0.01-5% in the immunoreaction solution; The immunoassay of the present invention, wherein the immune reaction is an immunoagglutination reaction, more preferably a latex agglutination or a metal colloid agglutination, even more preferably a gold colloid agglutination; and

【００１１】（３）被測定物質を含有する試料を調製す
るための第１試薬と、該被測定物質に対する免疫学的パ
ートナーを含有する第２試薬とを含有する免疫測定用試
薬キットにおいて、第１試薬にコンドロイチン硫酸また
はその塩およびポリアクリル酸またはその塩から選ばれ
る１種または２種と、ブチロラクトン、バレロラクト
ン、カプロラクトン、バレロラクタム、カプロラクタム
およびピロリドンから選ばれる１種以上とを含有するこ
とを特徴とする免疫測定用試薬キット；に関する。(3) An immunoassay reagent kit comprising a first reagent for preparing a sample containing a substance to be measured and a second reagent containing an immunological partner for the substance to be measured, One reagent contains one or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof, and one or more selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone. A reagent kit for immunoassay;

【００１２】上記特開昭５９−１５１０６１記載のよう
にγ−ブチロラクトンを加えた場合、γ−ブチロラクト
ンの添加量に伴って測定感度が著しく低下する。詳細は
以下の表１に示す。そこで、本発明者らは、このγ−ブ
チロラクトンによって低下した測定感度を上げる物質を
探索すべく、以下の参考例４に示すベース緩衝液中にγ
−ブチロラクトンを３％濃度、さらに各種の試薬を各種
濃度になるように添加し、α−フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）標準に対するＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬の反応
性を調べた。その結果、試薬添加ベース緩衝液中濃度と
して、５％ポリデキストロース、０．５％カルボキシメ
チルセルロースナトリウム、８％ポリビニルピロリドン
２５、６％ポリビニルピロリドンＫ−３０、０．５％ア
ルギン酸ナトリウム（粘度１００−１５０ｃｐ）、０．
５％ペクチン、３％フィコール（分子量４０万）、１％
アラビアゴム、０．４％ペクチンでは、ＡＦＰ標準での
測定可能な感度が得られなかった。これに対し、２．２
％ポリエチレングリコール２０，０００、４．８％デキ
ストラン（分子量２０−３０万）、１．４％ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース、２．３％コンドロイチン硫
酸ナトリウム、３％ポリビニルアルコール（ｎ＝５０
０）、４．１％プルラン、５．６％ポリアクリル酸アン
モニウムでは好ましい測定感度が得られた（データは示
していない）。即ち、測定感度を向上させる試薬として
使用可能なのは、ポリエチレングリコール、デキストラ
ン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コンドロイ
チン硫酸、ポリビニルアルコール、プルラン、ポリアク
リル酸、であることが判明した。しかし、これらとブチ
ロラクトンとの組合わせにおいて、デキストラン、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコー
ル、プルラン、ポリエチレングリコールではリュウマチ
因子による非特異反応を抑制する効果が余り認められな
かった（以下の実施例２参照）。リュウマチ因子の非特
異反応の抑制が効果的に認められたのは、コンドロイチ
ン硫酸とポリアクリル酸のみであった（以下の実施例２
参照）。次に、リュウマチ因子による非特異反応を抑制
する物質を検索した結果、ブチロラクトン以外にもバレ
ロラクトン、カプロラクトン、バレロラクタム、カプロ
ラクタムおよびピロリドンに非特異反応抑制効果が認め
られた（実施例３）。When γ-butyrolactone is added as described in JP-A-59-151061, the measurement sensitivity is significantly reduced with the amount of γ-butyrolactone added. Details are shown in Table 1 below. In order to search for a substance that increases the measurement sensitivity reduced by this γ-butyrolactone, the present inventors added γ to the base buffer shown in Reference Example 4 below.
-Butyrolactone at a concentration of 3% and various reagents at various concentrations were added to α-fetoprotein (AF
P) The reactivity of the AFP antibody-conjugated gold colloid reagent with the standard was examined. As a result, 5% polydextrose, 0.5% sodium carboxymethylcellulose, 8% polyvinylpyrrolidone 25, 6% polyvinylpyrrolidone K-30, and 0.5% sodium alginate (viscosity 100-150 cp) ), 0.
5% pectin, 3% ficoll (molecular weight 400,000), 1%
Gum arabic, 0.4% pectin did not provide measurable sensitivity with AFP standards. In contrast, 2.2
% Polyethylene glycol 20,000, 4.8% dextran (molecular weight 200,000-300,000), 1.4% hydroxypropyl methylcellulose, 2.3% sodium chondroitin sulfate, 3% polyvinyl alcohol (n = 50)
0), 4.1% pullulan, 5.6% ammonium polyacrylate gave favorable measurement sensitivity (data not shown). That is, it was found that polyethylene glycol, dextran, hydroxypropylmethylcellulose, chondroitin sulfate, polyvinyl alcohol, pullulan, and polyacrylic acid can be used as reagents for improving the measurement sensitivity. However, in the combination of these and butyrolactone, dextran, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, pullulan, and polyethylene glycol showed little effect in suppressing the nonspecific reaction due to rheumatoid factor (see Example 2 below). Only chondroitin sulfate and polyacrylic acid effectively suppressed the nonspecific reaction of rheumatoid factor (see Example 2 below).
reference). Next, as a result of searching for a substance that suppresses a nonspecific reaction caused by a rheumatoid factor, a nonspecific reaction suppressing effect was observed for valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam, and pyrrolidone in addition to butyrolactone (Example 3).

【００１３】また、実際に非特異反応が認められる患者
血清において検討した結果、ブチロラクトン以外にも、
デキストラン硫酸ナトリウムに非特異抑制効果が認めら
れた。他方、デキストラン硫酸と同じく硫酸基をもつヘ
パリンには同様の抑制効果は認められなかった（以下の
実施例４参照）。さらに、実際に非特異反応が認められ
る患者血清において検討した結果、ブチロラクトンとデ
キストラン硫酸とを組合わせることによって、非特異反
応がより強く抑制されることが見出された（以下の実施
例５参照）。これらのことから、本発明者らは、測定感
度の向上および非特異反応の抑制の両方を十分に図るに
は、コンドロイチン硫酸またはその塩およびポリアクリ
ル酸またはその塩から選ばれる１種または２種と、ブチ
ロラクトン、バレロラクトン、カプロラクトン、バレロ
ラクタム、カプロラクタムおよびピロリドンから選ばれ
る１種以上との、さらにはデキストラン硫酸を組合わせ
ることのできる特殊な試薬の組合わせのみが有効である
ことを見い出した。[0013] Further, as a result of examination in a patient serum in which a non-specific reaction is actually observed, in addition to butyrolactone,
Dextran sodium sulfate exhibited a non-specific inhibitory effect. On the other hand, heparin having a sulfate group like dextran sulfate did not show the same inhibitory effect (see Example 4 below). Furthermore, as a result of examination in patient sera in which a non-specific reaction was actually observed, it was found that the combination of butyrolactone and dextran sulfate suppressed the non-specific reaction more strongly (see Example 5 below). ). From these facts, the present inventors have found that in order to sufficiently improve both measurement sensitivity and suppress non-specific reactions, one or two types selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof are used. And one or more selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam, and pyrrolidone, and furthermore, it has been found that only a combination of special reagents capable of combining dextran sulfate is effective.

【００１４】[0014]

【発明の実施の形態】本発明は第１の態様として、被測
定物質が含まれる免疫反応液中にコンドロイチン硫酸ま
たはその塩およびポリアクリル酸またはその塩から選ば
れる１種または２種と、ブチロラクトン、バレロラクト
ン、カプロラクトン、バレロラクタム、カプロラクタム
およびピロリドンから選ばれる１種以上とを共存させる
ことを特徴とする、免疫反応を利用して該被測定物質を
測定するための免疫測定方法に関する。本発明の免疫測
定方法は定量測定あるいは定性測定のいずれにも使用で
きる。本発明の免疫測定方法にて測定される被測定物質
としては、タンパク質、脂質、糖類があり、それには例
えば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素などが含まれ
る。具体的にはＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）、繊維素分
解産物（ＦＤＰ）、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１
ｃ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳ
Ａ）、ペプシノーゲンＩおよびＩＩ、コラーゲンなどの
血液中タンパク質や、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイ
ルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、
およびこれらに対する抗体などの、感染症に関する抗原
や抗体などが挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION According to a first aspect of the present invention, one or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof are contained in an immunoreaction solution containing a substance to be measured, and butyrolactone. And valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam, and pyrrolidone. The present invention relates to an immunoassay method for measuring the substance to be measured using an immune reaction. The immunoassay method of the present invention can be used for either quantitative measurement or qualitative measurement. Substances to be measured by the immunoassay of the present invention include proteins, lipids, and saccharides, and include, for example, various antigens, antibodies, receptors, enzymes, and the like. Specifically, C-reactive protein (CRP), fibrin degradation product (FDP), hemoglobin, hemoglobin A1
c, α-fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), CA19-9, prostate specific antigen (PS
A), blood proteins such as pepsinogen I and II, collagen, hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus, Helicobacter pylori,
And antigens and antibodies related to infectious diseases such as antibodies against these.

【００１５】「免疫反応を利用して被測定物質を測定す
る」とは、免疫反応液中にて被測定物質とその免疫学的
パートナーとを反応させて当業者に周知の免疫測定方法
により被測定物質を測定することを意味する。本明細書
において、「免疫学的パートナー」とは免疫反応を引き
起こす相手であり、例えば被測定物質が抗原であれば、
免疫学的パートナーは抗体となり、被測定物質が抗体で
あれば抗原となる。当然ながら、被測定物質にはハプテ
ンを含む物質が含まれ、その場合はそのハプテンに対す
る抗体が該被測定物質の免疫学的パートナーとなる。[0015] "Measurement of a substance to be measured using an immune reaction" means that a substance to be measured and its immunological partner are reacted in an immunoreaction solution, and the substance is measured by an immunoassay method well known to those skilled in the art. It means measuring a measurement substance. In the present specification, the "immunological partner" is a partner that causes an immune reaction, for example, if the analyte is an antigen,
The immunological partner is an antibody, and if the analyte is an antibody, it is an antigen. Naturally, the test substance includes a substance containing a hapten, and in that case, an antibody against the hapten becomes an immunological partner of the test substance.

【００１６】本発明の免疫測定方法はＲＩＡ法、ＥＩＡ
法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集
法、イムノクロマト法、血球凝集法などの免疫反応を利
用する測定方法が包含される。その中でも特に、ラテッ
クス凝集法、金属コロイド凝集法を利用する測定方法が
好ましい。金属コロイド凝集法で用いられる金属コロイ
ドは金、銀、セレン等のコロイドがあるが、金コロイド
が利用し易く好ましい。[0016] The immunoassay of the present invention can be performed by RIA, EIA, or the like.
And immunoassay, immunoturbidimetry, latex agglutination, metal colloid agglutination, immunochromatography, hemagglutination and the like. Among them, a measurement method using a latex agglutination method or a metal colloid agglutination method is particularly preferable. The metal colloid used in the metal colloid aggregation method includes colloids such as gold, silver, and selenium, and gold colloid is preferable because it is easily used.

【００１７】例えば、抗原または抗体である被測定物質
を測定する場合には、ラテックス凝集法、金属コロイド
凝集法では、被測定物質である抗原または抗体に対応す
る抗体または抗原を担体のラテックスや金属コロイドに
あらかじめ結合させておく。その測定の例として、金コ
ロイド凝集法の場合、あらかじめ結合させた金コロイド
標識抗体または金コロイド標識抗原が被測定物質である
抗原または抗体を介して凝集する。その際に生じる色差
（色調変化）を光学的に測定し、抗原量または抗体量を
測定する。For example, in the case of measuring a substance to be measured which is an antigen or an antibody, the latex agglutination method and the metal colloid agglutination method use an antibody or an antigen corresponding to the antigen or antibody to be measured in a latex or metal carrier. Pre-bound to the colloid. As an example of the measurement, in the case of the colloidal gold agglutination method, a gold colloid-labeled antibody or a gold colloid-labeled antigen bound in advance is aggregated via an antigen or antibody as a substance to be measured. The color difference (color tone change) generated at that time is measured optically, and the amount of antigen or antibody is measured.

【００１８】本発明の測定方法に使用されるコンドロイ
チン硫酸またはその塩およびポリアクリル酸またはその
塩、ならびにブチロラクトン、バレロラクトン、カプロ
ラクトン、バレロラクタム、カプロラクタムおよびピロ
リドンはすべて、市販品を用いることができる。コンド
ロイチン硫酸またはその塩としてはコンドロイチン硫
酸、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃやそ
れらのナトリウム塩などが挙げられる。ポリアクリル酸
またはその塩としては、ポリアクリル酸、ポリアクリル
酸ナトリウム、ポリアクリル酸アンモニウムなどが挙げ
られる。その平均分子量が約５，０００から１，００
０，０００のもの等が市販されている。分子量等によっ
て好ましい使用濃度は変動するが、免疫反応液中での使
用濃度はコンドロイチン硫酸またはその塩とポリアクリ
ル酸またはその塩の１種または２種の全濃度がそれぞれ
０．５−１０％（重量％、以下同じ）であり、好ましく
は１−７％である。Commercially available chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof, as well as butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone used in the measurement method of the present invention can be used. Examples of chondroitin sulfate or a salt thereof include chondroitin sulfate, chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate C, and sodium salts thereof. Examples of polyacrylic acid or a salt thereof include polyacrylic acid, sodium polyacrylate, and ammonium polyacrylate. Its average molecular weight is about 5,000 to 1,000
000 and the like are commercially available. Although the preferred concentration used varies depending on the molecular weight and the like, the concentration used in the immunoreaction solution is such that the total concentration of one or two of chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof is 0.5 to 10% ( Wt%, the same applies hereinafter), and preferably 1-7%.

【００１９】ブチロラクトン、バレロラクトン、カプロ
ラクトン、バレロラクタム，カプロラクタムおよびピロ
リドンから選ばれる１種以上の免疫反応液中の全濃度は
０．５−１０％であり、好ましくは２−６％であり、よ
り好ましくは３−５％である。The total concentration in one or more immunoreactants selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone is 0.5-10%, preferably 2-6%, Preferably it is 3-5%.

【００２０】コンドロイチン硫酸またはその塩およびポ
リアクリル酸またはその塩から選ばれる１種または２種
と、ブチロラクトン、バレロラクトン、カプロラクト
ン、バレロラクタム、カプロラクタムおよびピロリドン
から選ばれる１種以上とを含有する、免疫反応時に存在
させる免疫測定用試薬は、被測定物質に対応する免疫学
的パートナーと一緒に、または別々に免疫反応液中に加
えることができる。An immune system comprising one or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof, and one or more selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone. The immunoassay reagent to be present during the reaction can be added to the immunoreaction solution together with or separately from the immunological partner corresponding to the substance to be measured.

【００２１】本発明の測定方法ではデキストラン硫酸ま
たはその塩をさらに共存させることにより、非特異反応
をより抑制することができる。デキストラン硫酸または
その塩としては、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸
ナトリウム、デキストラン硫酸カリウム等があり分子量
約１，０００から１０，０００のもの等が市販されてい
る。使用濃度は免疫反応液中、０．０１−５％であり、
好ましくは０．０５−１％である。In the measurement method of the present invention, non-specific reaction can be further suppressed by coexisting dextran sulfate or a salt thereof. Dextran sulfate or a salt thereof includes dextran sulfate, sodium dextran sulfate, potassium dextran sulfate and the like, and those having a molecular weight of about 1,000 to 10,000 are commercially available. The concentration used is 0.01-5% in the immune reaction solution,
Preferably it is 0.05-1%.

【００２２】本発明の測定方法における免疫反応にとっ
て、極端な酸やアルカリ条件下は好ましくなく、ｐＨと
しては４．５−９．５、好ましくは５．５−８．５の範
囲である。ｐＨの維持のためには適当な緩衝剤、例えば
リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、あ
るいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリ
ノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロ
キシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、
ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モル
ホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジ
ン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＤＩＰ
ＳＯ（３−（Ｎ’Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）ア
ミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、Ｔｒｉ
ｃｉｎｅ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシ
ン）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル−３−アミノプロパンスルホン酸)等のグッド緩衝液
が好適に用いられる。使用濃度は５−１０００ｍＭ、好
ましくは２０−２００ｍＭである。For the immune reaction in the assay method of the present invention, extreme acid or alkaline conditions are not preferred, and the pH is in the range of 4.5-9.5, preferably 5.5-8.5. To maintain the pH, a suitable buffer such as phosphate buffer, Tris-HCl buffer, succinate buffer, or glycylglycine, MES (2- (N-monophorino) ethanesulfonic acid), HEPES (N -2-hydroxyethyl-piperazine-N'-ethanesulfonic acid),
TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-
Aminoethanesulfonic acid), MOPS (3- (N-morpholino) propanesulfonic acid), PIPES (piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)), DIP
SO (3- (N'N-bis (2-hydroxyethyl) amino) -2-hydroxypropanesulfonic acid), Tri
Good buffers such as cine (tris (hydroxymethyl) methylglycine) and TAPS (N-tris (hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulfonic acid) are preferably used. The working concentration is 5-1000 mM, preferably 20-200 mM.

【００２３】本発明の免疫反応液中にはアジ化ナトリウ
ム、動物血清、γ−グロブリンまたはヒトＩｇＧやＩｇ
Ｍに対する特異抗体、アルブミン、塩化ナトリウムやそ
の他の無機塩類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡ等のキレ
ート剤、ＤＴＴ等のＳＨ試薬や界面活性剤等を含有させ
てもよい。アジ化ナトリウムの濃度としては０．０１−
１％、好ましくは０．０３−０．３％である。動物血
清、γ−グロブリンまたは特異抗体やアルブミンは牛、
馬、豚、羊、兎、ヒト、ラット等の由来のものが使用で
き、それらの変性物や分解物も選択でき、添加濃度も適
宜選択できる。塩化ナトリウムは生理的食塩濃度付近が
好ましい。その他の物質についても使用濃度は適宜選択
できる。The immunoreaction solution of the present invention contains sodium azide, animal serum, γ-globulin or human IgG or Ig.
Specific antibodies to M, albumin, sodium chloride and other inorganic salts, sugars, amino acids, chelating agents such as EDTA, SH reagents such as DTT, surfactants and the like may be contained. The concentration of sodium azide is 0.01-
1%, preferably 0.03-0.3%. Animal serum, γ-globulin or specific antibodies and albumin are cattle,
Horses, pigs, sheep, rabbits, rabbits, humans, rats and the like can be used, and their denatured and degraded products can also be selected, and the addition concentration can also be appropriately selected. Sodium chloride preferably has a physiological salt concentration. The use concentration of other substances can be appropriately selected.

【００２４】さらに、本発明は上記本発明の方法に用い
ることのできる試薬およびそのためのキットを提供す
る。Further, the present invention provides a reagent which can be used in the method of the present invention and a kit therefor.

【００２５】[0025]

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるも
のではない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but it should not be construed that the invention is limited thereto.

【００２６】参考例１： 金コロイド液の調製 ９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸溶液２ｍｌを撹拌
しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム溶液１
０ｍｌを加え、さらに２０分間撹拌した後３０℃に冷却
した。冷却後、０．１Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ７．１
に調節した。Reference Example 1: Preparation of gold colloid solution 2 ml of a 10% chloroauric acid solution was added to 1 liter of distilled water at 95 ° C. while stirring, and 1 minute later, a 2% sodium citrate solution 1 was added.
0 ml was added, and the mixture was further stirred for 20 minutes and then cooled to 30 ° C. After cooling, the solution was adjusted to pH 7.1 with 0.1 M potassium carbonate solution.
Was adjusted to

【００２７】参考例２： 抗α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体結合金コロイド
試薬の調製 抗ＡＦＰ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を０．０５％
アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ
７．１で希釈し５０μｇ／ｍｌの濃度にした。この液１
００ｍｌを（１）で調製した金コロイド液約１Ｌに加
え、冷蔵で２時間撹拌した。５．４６％マンニトール、
０．５％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１を１１０ｍｌ添加し、
３７℃で９０分撹拌した。８，０００回転で４０分遠心
し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％Ｂ
ＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳｐＨ７．５（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金
コロイドを分散させた後、８，０００回転で４０分遠心
し、上清を除去し、Ａ溶液で抗体結合金コロイドを分散
させ全量を１６０ｍｌとし、抗ＡＦＰ抗体結合金コロイ
ド試薬を調製した。Reference Example 2: Preparation of anti-α-fetoprotein (AFP) antibody-bound gold colloid reagent 0.05% anti-AFP antibody (Dako Japan)
10 mM HEPES pH with sodium azide
Diluted with 7.1 to a concentration of 50 μg / ml. This liquid 1
00 ml was added to about 1 L of the colloidal gold solution prepared in (1), and the mixture was refrigerated and stirred for 2 hours. 5.46% mannitol,
1 containing 0.5% BSA, 0.05% sodium azide
110 ml of 0 mM HEPES pH 7.1 was added,
The mixture was stirred at 37 ° C for 90 minutes. After centrifugation at 8,000 rpm for 40 minutes and removal of the supernatant, 3% mannitol, 0.1% B
SA, 5 mM HE with 0.05% sodium azide
About 1 L of PES pH 7.5 (A solution) was added to disperse the antibody-bound gold colloid, followed by centrifugation at 8,000 rpm for 40 minutes, removing the supernatant, dispersing the antibody-bound gold colloid with the A solution, and dissolving the whole amount. The volume was adjusted to 160 ml, and an anti-AFP antibody-bound gold colloid reagent was prepared.

【００２８】参考例３： ＡＦＰ標準の調製 ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．９％塩化ナトリウム、１％
ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．５の
溶液にＡＦＰ抗原（ダコ・ジャパン株式会社）を、０ｎ
ｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌとなるよ
うに添加し、それぞれをマイクロチューブに１．０ｍｌ
ずつ小分け分注し、−４０℃で凍結保存した。使用時に
は室温で融解し使用した。Reference Example 3: Preparation of AFP standard 20 mM HEPES, 0.9% sodium chloride, 1%
AFP antigen (Dako Japan Co., Ltd.) was added to a solution of pH 7.5 containing BSA and 0.1% sodium azide at 0n.
g / ml, 20 ng / ml, and 100 ng / ml.
Each was aliquoted and stored frozen at -40 ° C. It was melted at room temperature before use.

【００２９】参考例４： ベース緩衝液の調製 ０．９％塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、０．２％Ｅ
ＤＴＡ、０．２％トリトンＸ−１００、０．１５％ポリ
アクリル酸（分子量２５万）、０．１％アジ化ナトリウ
ムを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−
ビス（２−エタンスルホン酸））ｐＨ６．５のベース緩
衝液が使用時に得られるように、その２倍濃度の溶液を
調製した。Reference Example 4: Preparation of base buffer solution 0.9% sodium chloride, 0.1% BSA, 0.2% E
50 mM PIPES (piperazine-1,4-) containing DTA, 0.2% Triton X-100, 0.15% polyacrylic acid (molecular weight 250,000), 0.1% sodium azide
A twice-fold solution of bis (2-ethanesulfonic acid)) was prepared so that a base buffer of pH 6.5 was obtained at the time of use.

【００３０】実施例１ ポリエチレングリコール２０，０００またはコンドロイ
チン硫酸ナトリウムとγ−ブチロラクトンとの組み合わ
せを被検試薬とし、ＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬によ
るＡＦＰ測定における測定感度への影響を調べた。 （１）試験溶液の調製 被検試薬を、ポリエチレングリコール２０，０００また
はコンドロイチン硫酸ナトリウムが各１．５％およびγ
−ブチロラクトンが以下の表１の各濃度となるようにベ
ース緩衝液に添加し、試験溶液を調製した。Example 1 Using polyethylene glycol 20,000 or a combination of sodium chondroitin sulfate and γ-butyrolactone as test reagents, the effect of AFP antibody-bound gold colloid reagent on measurement sensitivity in AFP measurement was examined. (1) Preparation of test solution The test reagent was prepared by mixing polyethylene glycol 20,000 or sodium chondroitin sulfate at 1.5% and γ.
-Butyrolactone was added to the base buffer to the concentrations shown in Table 1 below to prepare test solutions.

【００３１】（２）試験方法 （１）の試験溶液を用い、以下のようにして、ＡＦＰに
対するＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬の反応性を調べ
た。ＥＩＡ用マイクロプレートに参考例３にて調製した
ＡＦＰ標準１５μｌを分注し、上記（１）の試験溶液１
４０μｌを添加後、マイクロミキサー（三光純薬株式会
社）で約２０秒撹拌し、３分間室温放置した。次いで、
抗ＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬３５μｌを添加し、２
０秒間撹拌した後測定を開始した。測定開始０分と１０
分後の吸光度（主波長５４０ｎｍ、副波長７００ｎｍ）
をマイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイ
ス株式会社）を用いて測定した。測定開始０分と１０分
後の吸光度変化（吸光度の差）をＡＦＰに対するＡＦＰ
抗体結合金コロイド試薬の反応性の指標とした。得られ
た結果を表１に示す。(2) Test Method Using the test solution of (1), the reactivity of the AFP antibody-bound gold colloid reagent to AFP was examined as follows. 15 μl of the AFP standard prepared in Reference Example 3 was dispensed into a microplate for EIA, and the test solution 1 of the above (1) was dispensed.
After adding 40 μl, the mixture was stirred for about 20 seconds with a micromixer (Sanko Junyaku Co., Ltd.) and left at room temperature for 3 minutes. Then
Add 35 μl of anti-AFP antibody-bound gold colloid reagent, add 2 μl
After stirring for 0 seconds, the measurement was started. 0 minutes and 10 at the start of measurement
Absorbance after one minute (main wavelength 540nm, sub wavelength 700nm)
Was measured using a microplate reader (Nippon Molecular Devices Co., Ltd.). The change in absorbance (difference in absorbance) between 0 minute and 10 minutes after the start of measurement is expressed as AFP versus AFP
It was used as an index of the reactivity of the antibody-bound gold colloid reagent. Table 1 shows the obtained results.

【００３２】[0032]

【表１】 [Table 1]

【００３３】γ−ブチロラクトンの添加濃度を増加させ
るとともに吸光度変化量が減少し、即ち反応性（測定感
度）が著しく低下し、γ-ブチロラクトン共存下ではＡ
ＦＰの低濃度における定量測定は実質的に不可能であっ
た。そのため、γ−ブチロラクトンの共存下で定量測定
可能とするにはポリエチレングリコール２０，０００ま
たはコンドロイチン硫酸ナトリウムの濃度を更に増やす
必要があった。As the concentration of added γ-butyrolactone was increased, the change in absorbance was decreased, that is, the reactivity (measurement sensitivity) was significantly reduced.
Quantitative measurement at low concentrations of FP was virtually impossible. Therefore, it was necessary to further increase the concentration of polyethylene glycol 20,000 or sodium chondroitin sulfate to enable quantitative measurement in the presence of γ-butyrolactone.

【００３４】実施例２ 予備実験において、測定感度を向上させることが確認さ
れた試薬はデキストラン（２０−３０万）、コンドロイ
チン硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース、ポリアクリル酸アンモニウム、ポリビニルアルコ
ール（ｎ＝５００）、プルランおよびポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）２０，０００であった。これら測定感
度を向上させる試薬とγ−ブチロラクトンとの組み合わ
せを被検試薬とし、ＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬によ
るＡＦＰ測定においてリュウマチ因子が引き起こす非特
異反応に対する影響を調べた。 （１）試験溶液の調製 被検試薬を、γ−ブチロラクトンが３％、および測定感
度を向上させる試薬が下記表２の各濃度となるようにベ
ース緩衝液に添加し、試験溶液を調製した。 （２）検体の調製 干渉チェック・ＲＦプラス（国際試薬株式会社）のリュ
ウマチ因子を含有する凍結乾燥物または含有しない凍結
乾燥物を添加し、ＡＦＰ標準０ｎｇ／ｍｌの溶液で溶解
し、それぞれリュウマチ因子（＋）検体、リュウマチ因
子（−）検体とした。 （３）試験方法 ＥＩＡマイクロプレートにＡＦＰ標準（０ｎｇ／ｍｌ、
２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）、リュウマチ因子
（＋）検体およびリュウマチ因子（−）検体１５μｌを
分注し、さらに上記（１）の試験溶液１４０μｌを添加
した後、以下、実施例１（２）と同様の方法にて吸光度
変化を測定した。、ＡＦＰ標準（０、２０、１００ｎｇ
／ｍｌ）で得られた検量線から、リュウマチ因子（＋）
検体およびリュウマチ因子（−）検体の測定値を算出し
た。得られた結果を表２に示す。Example 2 In preliminary experiments, reagents confirmed to improve measurement sensitivity were dextran (200,000 to 300,000), sodium chondroitin sulfate, hydroxypropylmethylcellulose, ammonium polyacrylate, and polyvinyl alcohol (n = 500). , Pullulan and polyethylene glycol (PEG) 20,000. Using a combination of these reagents for improving the measurement sensitivity and γ-butyrolactone as test reagents, the effect of a rheumatoid factor on non-specific reactions caused by AFP measurement using an AFP antibody-bound gold colloid reagent was examined. (1) Preparation of test solution A test solution was prepared by adding a test reagent to a base buffer so that γ-butyrolactone was 3% and a reagent for improving measurement sensitivity was each concentration shown in Table 2 below. (2) Preparation of sample Lyophilized product containing or not containing rheumatoid factor of Interference Check RF Plus (International Reagents Co., Ltd.) was added and dissolved with a solution of AFP standard 0 ng / ml. (+) Specimen and rheumatoid factor (-) specimen were used. (3) Test method AFP standard (0 ng / ml,
20 ng / ml, 100 ng / ml), 15 μl of a rheumatoid factor (+) specimen and a rheumatoid factor (−) specimen, and after adding 140 μl of the test solution of the above (1), the following Example 1 (2) The change in absorbance was measured in the same manner as described above. , AFP standard (0, 20, 100 ng)
/ Ml), the rheumatoid factor (+)
The measured values of the sample and the rheumatoid factor (-) sample were calculated. Table 2 shows the obtained results.

【表２】 [Table 2]

【００３５】表２の結果では、リュウマチ因子がある場
合（＋）と無い場合（−）とでＡＦＰの測定値に差異が
ないほど、非特異反応が抑制できていることが示され
る。デキストラン（２０−３０万）、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ポリビニルアルコール（ｎ＝５０
０）、プルラン、ポリエチレングリコール２０，０００
では、リュウマチ因子による非特異反応が大きく認めら
れた。これに対し、コンドロイチン硫酸ナトリウムとポ
リアクリル酸アンモニウムでは、非特異反応はほとんど
もしくは全く認められなかった。The results in Table 2 indicate that non-specific reactions can be suppressed when there is no difference in the measured values of AFP between the presence (+) and the absence (-) of rheumatoid factor. Dextran (200,000-300,000), hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl alcohol (n = 50
0), pullulan, polyethylene glycol 20,000
Showed a large nonspecific reaction by rheumatoid factor. In contrast, little or no nonspecific reaction was observed between sodium chondroitin sulfate and ammonium polyacrylate.

【００３６】実施例３ 被検試薬を、コンドロイチン硫酸ナトリウム、およびγ
−ブチロラクトン、γ−バレロラクトン、ε−カプロラ
クトン、ε−カプロラクタム、δ−バレロラクタムまた
は２−ピロリドンが下記表３の各濃度となるようにベー
ス緩衝液に添加して調製した試験溶液を使用する以外
は、実施例２と同様の方法にて、リュウマチ因子による
非特異反応に対する影響を調べた。得られた結果を表３
に示す。Example 3 The test reagents were sodium chondroitin sulfate and γ
-Except that a test solution prepared by adding butyrolactone, γ-valerolactone, ε-caprolactone, ε-caprolactam, δ-valerolactam or 2-pyrrolidone to a base buffer so as to have the respective concentrations shown in Table 3 below is used. Investigated the effect of rheumatoid factor on non-specific reactions in the same manner as in Example 2. Table 3 shows the obtained results.
Shown in

【表３】 [Table 3]

【００３７】コンドロイチン硫酸ナトリウム１．５−
２．８％との各組合わせで、γ−ブチロラクトンでは３
％ではリュウマチ因子による非特異反応が僅かに認めら
れたが、４％では認められなかった。γ−ブチロラクト
ン、γ−バレロラクトン、ε−カプロラクトン、ε−カ
プロラクタム、δ−バレロラクタム、２−ピロリドンの
各１％ではリュウマチ因子による非特異反応は少なく、
３％ではほとんどもしくは全く認めなかった。なお、対
照とした１．５％のコンドロイチン硫酸のみの添加では
非特異反応が大きく認められた。Sodium chondroitin sulfate 1.5-
At each combination of 2.8%, 3 for gamma-butyrolactone
%, Nonspecific reaction due to rheumatoid factor was slightly observed, but not 4%. Non-specific reaction due to rheumatoid factor is small in 1% of each of γ-butyrolactone, γ-valerolactone, ε-caprolactone, ε-caprolactam, δ-valerolactam, and 2-pyrrolidone;
Little or no recognition was observed at 3%. In addition, a large nonspecific reaction was observed when only 1.5% chondroitin sulfate as a control was added.

【００３８】実施例４ 非特異反応を起こすヒト患者血清（Ａ、ＢおよびＣの３
検体）を用いるＡＦＰ測定において、γ−ブチロラクト
ン、デキストラン硫酸ナトリウムおよびヘパリンナトリ
ウムの非特異反応抑制の効果を他社試薬（イアトロメイ
トＡＦＰ：株式会社ダイアヤトロン販売）と比較して調
べた。 （１）試験溶液の調製 被検試薬を、コンドロイチン硫酸ナトリウムが１．５％
およびγ−ブチロラクトン、デキストラン硫酸ナトリウ
ムまたはヘパリンナトリウムが表４の各濃度となるよう
にベース緩衝液に添加し、試験溶液を調製した。 （２）試験方法 ヒト患者血清１５μｌに上記試験溶液２００μｌを添加
し、さらに抗ＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬５０μｌを
添加し、自動分析装置日立７０７０（株式会社日立製作
所）を用いて主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで測
光ポイント１８と３１で測定した。測定の標準には正常
ヒト血清にＡＦＰを添加したものを用いた。比較用の測
定試薬として、他社試薬を用い添付文書の方法で、自動
分析装置日立７０７０で測定した。得られた結果を表４
に示す。Example 4 Serum of a human patient causing a non-specific reaction (A, B and C
In the AFP measurement using the sample, the effect of suppressing the non-specific reaction of γ-butyrolactone, dextran sodium sulfate and sodium heparin was examined in comparison with a reagent of another company (IATROMATE AFP: sold by Diatron Co., Ltd.). (1) Preparation of test solution The test reagent was 1.5% sodium chondroitin sulfate.
And γ-butyrolactone, dextran sodium sulfate or sodium heparin were added to the base buffer to the respective concentrations shown in Table 4 to prepare test solutions. (2) Test method 200 μl of the above test solution was added to 15 μl of human patient serum, 50 μl of an anti-AFP antibody-bound gold colloid reagent was further added, and a main wavelength of 546 nm was added using an automatic analyzer Hitachi 7070 (Hitachi, Ltd.). Measurements were taken at photometric points 18 and 31 at a wavelength of 700 nm. As a measurement standard, a normal human serum to which AFP was added was used. The measurement was performed by an automatic analyzer Hitachi 7070 according to the package insert method using a reagent from another company as a measurement reagent for comparison. Table 4 shows the obtained results.
Shown in

【００３９】[0039]

【表４】 [Table 4]

【００４０】被検試薬としてコンドロイチン硫酸ナトリ
ウムのみを添加した対照では、他社試薬と比較して大き
な測定値の差があり、非特異反応が認められた。これに
対し、コンドロイチン硫酸ナトリウムとともに１％γ−
ブチロラクトンを添加または０．２５％デキストラン硫
酸ナトリウムを添加すると、それぞれ測定値の差が減少
し、非特異反応抑制の効果が認められた。γ−ブチロラ
クトンおよびデキストラン硫酸ナトリウムではそれぞ
れ、検体による相違があるものの、非特異反応抑制効果
が認められた。ヘパリンナトリウム（硫酸基を多く含む
多糖）では対照との間に測定値に大差なく、非特異反応
抑制効果が認められなかった。In the control to which only sodium chondroitin sulfate was added as the test reagent, there was a large difference in measured values as compared with the reagents of other companies, and a non-specific reaction was observed. On the other hand, 1% γ-
When butyrolactone was added or 0.25% dextran sodium sulfate was added, the difference between the measured values was reduced, and the effect of suppressing nonspecific reaction was observed. γ-butyrolactone and sodium dextran sulfate each showed a nonspecific reaction inhibitory effect, although there was a difference depending on the sample. Heparin sodium (a polysaccharide containing a large amount of sulfate group) showed no significant difference in measured values from the control, and no nonspecific reaction inhibitory effect was observed.

【００４１】実施例５ 被検試薬を、コンドロイチン硫酸ナトリウムが２．４
％、γ−ブチロラクトンが３．６％、デキストラン硫酸
ナトリウムが０．５％となるようにベース緩衝液に添加
して調製した試験溶液（本発明試薬）を使用する以外
は、実施例４と同様の方法にて測定を行った。同時に他
社試薬および対照（コンドロイチン硫酸ナトリウム１．
５％のみ）についても測定を行い比較した。得られた結
果を５に示す。Example 5 A test reagent was prepared using sodium chondroitin sulfate of 2.4.
%, Γ-butyrolactone to 3.6%, and dextran sulfate sodium to 0.5% were added to the base buffer to prepare a test solution (reagent of the present invention). The measurement was carried out by the following method. At the same time, use other company's reagent and control (sodium chondroitin sulfate 1.
5%) was also measured and compared. The results obtained are shown in FIG.

【表５】 [Table 5]

【００４２】他社試薬と比較し対照は測定値が何れも大
きな値となっている。他方、本発明試薬は他社試薬とほ
ぼ同等の測定値であり、非特異反応が抑制されているこ
とが判明した。As compared with the reagents of other companies, the measured values of the control were all large. On the other hand, the measured value of the reagent of the present invention was almost the same as that of other reagents, and it was found that the nonspecific reaction was suppressed.

【００４３】本実施例では、０．１５％のポリアクリル
酸を含有するベース緩衝液を使用している。他方、この
０．１５％ポリアクリル酸の代わりに０．３％コンドロ
イチン硫酸ナトリウムを含むベース緩衝液に、コンドロ
イチン硫酸ナトリウムを２．４％、γ−ブチロラクトン
を３．６％およびデキストラン硫酸ナトリウムを０．５
％になるように添加した試験溶液（コンドロイチン硫酸
ナトリウム全濃度は２．７％）を使用しても同様の非特
異反応抑制の効果が得られた。In this embodiment, a base buffer containing 0.15% of polyacrylic acid is used. On the other hand, in a base buffer containing 0.3% sodium chondroitin sulfate instead of 0.15% polyacrylic acid, 2.4% sodium chondroitin sulfate, 3.6% γ-butyrolactone and 0% dextran sodium sulfate were added. .5
% Of the test solution (total concentration of sodium chondroitin sulfate is 2.7%), the same effect of suppressing nonspecific reaction was obtained.

【００４４】[0044]

【発明の効果】免疫測定において、コンドロイチン硫酸
またはその塩、ポリアクリル酸またはその塩から選ばれ
る１種または２種と、ブチロラクトン、バレロラクト
ン、カプロラクトン、カプロラクタム、バレロラクタ
ム、ピロリドンから選ばれる１種以上を反応液中に共存
させることにより、さらにデキストラン硫酸またはその
塩を共存させることにより、測定感度の上昇および非特
異反応の抑制が図られる。従って、本発明によれば、臨
床検査分野等での測定精度の向上や測定の自動化および
測定時間の短縮等に寄与することができる。In the immunoassay, one or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof, polyacrylic acid or a salt thereof, and one or more selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, caprolactam, valerolactam, and pyrrolidone In the reaction solution, and by coexisting dextran sulfate or a salt thereof, the measurement sensitivity can be increased and nonspecific reaction can be suppressed. Therefore, according to the present invention, it is possible to contribute to improvement of measurement accuracy in the field of clinical examination, automation of measurement, reduction of measurement time, and the like.

フロントページの続き (72)発明者 小谷 至彦 大阪府豊中市服部本町３丁目９−４ (72)発明者 土居 洋介 大阪府寝屋川市点野５丁目29−７Continued on the front page (72) Inventor, Toshihiko Kotani 3-chome, Hattori-Honcho, Toyonaka-shi, Osaka (72) Inventor, Yosuke Doi 5-29-7, Tono, Neyagawa-shi, Osaka

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 被測定物質が含まれる免疫反応液中にコ
ンドロイチン硫酸またはその塩およびポリアクリル酸ま
たはその塩から選ばれる１種または２種と、ブチロラク
トン、バレロラクトン、カプロラクトン、バレロラクタ
ム、カプロラクタムおよびピロリドンから選ばれる１種
以上とを共存させることを特徴とする、免疫反応を利用
して該被測定物質を測定するための免疫測定方法。1. An immunoreaction solution containing a substance to be measured, one or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof, and butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and An immunoassay method for measuring the substance to be measured using an immune reaction, wherein the immunoassay is performed by coexisting with one or more kinds selected from pyrrolidone. 【請求項２】 コンドロイチン硫酸またはその塩および
ポリアクリル酸またはその塩から選ばれる１種または２
種の免疫反応液中における全濃度が０．５−１０％であ
ることを特徴とする請求項１記載の方法。2. One or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof.
2. The method according to claim 1, wherein the total concentration of the species in the immunoreaction solution is 0.5-10%. 【請求項３】 ブチロラクトン、バレロラクトン、カプ
ロラクトン、バレロラクタム、カプロラクタムおよびピ
ロリドンから選ばれる１種以上の免疫反応液中における
全濃度が０．５−１０％であることを特徴とする請求項
１または２記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the total concentration in one or more immunoreaction solutions selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone is 0.5 to 10%. 2. The method according to 2. 【請求項４】 免疫反応液中における全濃度が０．０１
−５％であるデキストラン硫酸またはその塩をさらに含
有させることを特徴とする請求項１から３までのいずれ
かに記載の方法。4. The immunoreaction solution has a total concentration of 0.01
The method according to any one of claims 1 to 3, further comprising dextran sulfate or a salt thereof at -5%. 【請求項５】 免疫反応が免疫凝集反応であることを特
徴とする請求項１から４までのいずれかに記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein the immune reaction is an immunoagglutination reaction. 【請求項６】 免疫凝集反応がラテックス凝集または金
属コロイド凝集であることを特徴とする請求項５記載の
方法。6. The method according to claim 5, wherein the immunoagglutination reaction is latex aggregation or metal colloid aggregation. 【請求項７】 金属コロイド凝集が金コロイド凝集であ
ることを特徴とする請求項６記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the metal colloid aggregation is gold colloid aggregation. 【請求項８】 コンドロイチン硫酸またはその塩および
ポリアクリル酸またはその塩から選ばれる１種または２
種と、ブチロラクトン、バレロラクトン、カプロラクト
ン、バレロラクタム、カプロラクタムおよびピロリドン
から選ばれる１種以上とを含有する免疫測定用試薬。8. One or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof.
An immunoassay reagent comprising a species and one or more selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam, and pyrrolidone. 【請求項９】 被測定物質が含まれる免疫反応液中にお
ける全濃度が０．５−１０％となるような量のコンドロ
イチン硫酸またはその塩およびポリアクリル酸またはそ
の塩から選ばれる１種または２種を含有することを特徴
とする請求項８記載の免疫測定用試薬。9. One or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof in an amount such that the total concentration in the immunoreaction solution containing the substance to be measured is 0.5 to 10%. 9. The reagent for immunoassay according to claim 8, comprising a seed. 【請求項１０】 被測定物質が含まれる免疫反応液中に
おける全濃度が０．５−１０％となるような量のブチロ
ラクトン、バレロラクトン、カプロラクトン、バレロラ
クタム、カプロラクタムおよびピロリドンから選ばれる
１種以上を含有することを特徴とする請求項８または９
記載の免疫測定用試薬。10. An amount of at least one selected from butyrolactone, valerolactone, caprolactone, valerolactam, caprolactam, and pyrrolidone in such an amount that the total concentration in the immunoreaction solution containing the substance to be measured is 0.5 to 10%. 10. The composition according to claim 8, wherein
The reagent for immunoassay according to the above. 【請求項１１】 被測定物質が含まれる免疫反応液中に
おいて全濃度が０．０１−５％となる量のデキストラン
硫酸またはその塩をさらに含有することを特徴とする請
求項８から１０までのいずれかに記載の免疫測定用試
薬。11. The immunoreaction solution containing the substance to be measured, further comprising dextran sulfate or a salt thereof in an amount such that the total concentration becomes 0.01-5%. The reagent for immunoassay according to any one of the above. 【請求項１２】 免疫反応が免疫凝集反応であることを
特徴とする請求項８から１１までのいずれかに記載の免
疫測定用試薬。12. The immunoassay reagent according to claim 8, wherein the immune reaction is an immunoagglutination reaction. 【請求項１３】 免疫凝集反応がラテックス凝集または
金属コロイド凝集であることを特徴とする請求項１２記
載の免疫測定用試薬。13. The reagent for immunoassay according to claim 12, wherein the immunoagglutination reaction is latex aggregation or metal colloid aggregation. 【請求項１４】 金属コロイド凝集が金コロイド凝集で
あることを特徴とする請求項１３記載の免疫測定用試
薬。14. The immunoassay reagent according to claim 13, wherein the metal colloid aggregation is gold colloid aggregation. 【請求項１５】 被測定物質を含有する試料を調製する
ための第１試薬と、該被測定物質に対する免疫学的パー
トナーを含有する第２試薬とを含有する免疫測定用試薬
キットにおいて、第１試薬にコンドロイチン硫酸または
その塩およびポリアクリル酸またはその塩から選ばれる
１種または２種と、ブチロラクトン、バレロラクトン、
カプロラクトン、バレロラクタム、カプロラクタムおよ
びピロリドンから選ばれる１種以上とを含有することを
特徴とする免疫測定用試薬キット。15. An immunoassay reagent kit comprising a first reagent for preparing a sample containing an analyte and a second reagent containing an immunological partner for the analyte, comprising: One or two selected from chondroitin sulfate or a salt thereof and polyacrylic acid or a salt thereof, and butyrolactone, valerolactone,
A reagent kit for immunoassay comprising: at least one selected from caprolactone, valerolactam, caprolactam and pyrrolidone.