JP2002325582A - デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 - Google Patents
デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤Info
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Abstract
を誘導することによるデュシェンヌ型筋ジストロフィー
治療のための手段を提供すること。 【解決手段】 ヒトジストリフィン由来の特定な塩基配
列で示された配列に対して相補的な塩基配列を含んでな
るアンチセンスオリゴヌクレオチド及びこれを含有して
なるデュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤。
Description
伝子に生じた異常に起因する、アミノ酸読みとり枠(リ
ーディングフレーム)のずれた前駆体mRNAに対し
て、所定のエクソンスキッピングを誘導してリーディン
グフレームのずれを解消するための、デュシェンヌ(Du
chenne)型筋ジストロフィー治療剤に関する。更に具体
的には、本発明は、特定のタイプのデュシェンヌ型筋ジ
ストロフィーの治療剤の製造のために用いることのでき
る、ジストロフィン遺伝子のスプライシング促進配列
(SES)、並びに、該スプライシング促進配列に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド及びこれを含んだ治
療剤に関する。
イシングによる遺伝子疾患が診断可能となり、特に、難
病である筋ジストロフィーが注目されている。筋ジスト
ロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD:
Duchenne Muscular Dystrophy)とベッカー型筋ジスト
ロフィー(BMD:Becker Muscular Dystrophy)とに
大別される。DMDは、最も頻度の高い遺伝子性筋疾患
であり、出生男子3,500人に1人の割合で発症する。本
症の患者は、幼児期に筋力低下症状を現し、その後一貫
して筋萎縮が進行して、20歳前後で死に至る。現在、D
MDに対する有効な治療薬はなく、全世界の患者から治
療薬の開発が強く求められている。1987年にDMDの原
因遺伝子であるジストロフィン遺伝子が、逆行遺伝学の
手法により発見され、またBMBも同じジストロフィン
遺伝子の異常から発症することが明らかにされた[Koen
ig, M. et al., Cell, 50: 509-517 (1987)]。BMD
では、その発症年齢は成人期と比較的遅く、発症後に軽
度の筋力低下は見られるものの、ほぼ正常な生存が可能
である。
域に存在し、その遺伝子サイズは3.0 メガ塩基であり、
ヒトの最大の既知遺伝子である。このように大きなサイ
ズであるが、ジストロフィン遺伝子中でジストロフィン
タンパク質をコードしている領域はわずか14kbに過ぎ
ず、しかもそのコード領域は79ものエクソンに分かれて
遺伝子内に分散して存在している[Roberts, RG., et a
l., Genomics, 16: 536-538 (1993)]。ジストロフィン
遺伝子の転写物であるmRNA前駆体は、スプライシン
グを受けて14kbの成熟mRNAとなる。更に、この遺
伝子には8種の異なるプロモーター領域が遺伝子内にや
はり分散して存在し、それぞれが異なったmRNAを産
生している[Nishio, H., et al., J. Clin. Invest.,
94: 1073-1042 (1994), Ann, AH. and Kunkel, LM., Na
ture Genet., 3: 283-291 (1993), D'Souza, VN. et a
l., Hum. Mol. Genet., 4: 837-842 (1995)]。これら
のことから、ジストロフィン遺伝子及びその転写物は、
非常に複雑な構成になっている。
はジストロフィンの遺伝子断片を用い、次いで、cDN
Aをプローブとして用いたサザンブロット法により行わ
れ、約6割のDMD/BMD患者でジストロフィン遺伝
子に大きな欠失あるいは重複という異常の存在すること
が明らかにされた[Hoffman, EP. and Kunkel, LM.,Neu
ron, 2: 1019-1029 (1989)]。これらDMD/BMDで
発見される遺伝子異常の殆どは遺伝子欠失であり、しか
もそのサイズは数kbと大きなものであった。遺伝子診
断に関しては、サザンブロット法で発見されたジストロ
フィン遺伝子の異常が、遺伝子の2カ所のホットスポッ
トに集中していることから、このホットスポットの19個
のエクソンに的を絞り、2つのPCR(Polymerase Cha
in Reaction)反応系を用いて簡易に欠失を発見する、
重複PCR法が考案された[Chamberlain JS., et al.,
Nucleic Acids Res., 16: 11141-11156 (1988), Beggs
AH., et al., Hum. Genet., 86: 45-48 (1990)]。この
重複PCR法は、短時間で結果を得ることができ、サザ
ンブロット法で検出できる遺伝子異常の98%がこの方法
で検出できることから、今日では最もポピュラーな遺伝
子診断法となっている。
omosome-linked muscular dystrophy)マウスがある[Bu
lfield, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
81:1189-1192 (1984)]。
23内のナンセンス変異により、mdxマウスのこの遺伝
子が不活性化され、結果としてエクソン23内で翻訳が
終止することとなる。mdxマウスでは、如何なる機能的
なジストロフィンも発現されないが、免疫化学的にはジ
ストロフィン陽性筋繊維が微量に検出される。
の、しかも同じ様な遺伝子異常から発症する2種の疾病
であるDMDとBMDの臨床的な病態における大きな相
違は謎とされていたが、いわゆるフレームシフト説[Mo
naco, AP., et al., Genomics,2: 90-95 (1988)]で説
明されるようになっている。すなわち、「DMDでは、
遺伝子内の部分的な欠失によりジストロフィンmRNA
にコードされるアミノ酸読みとり枠(リーディングフレ
ーム)にずれが生じ(アウトフレーム:out-of-fram
e)、結果的にストップコドンが出現しジストロフィン
の合成が途中で停止してしまう。これに対し、BMDで
は、遺伝子に部分欠失が存在してもリーディングフレー
ムが維持され(インフレーム:in-frame)て、本来のジ
ストロフィンとはサイズが異なるものの、ジストロフィ
ンタンパク質が生成できる」とするものである。実際、
患者の筋肉中のジストロフィンを調べると、DMDでは
ジストロフィンが消失しているのに対して、BMDでは
染色性を正常とは異にしたジストロフィンが存在してい
る。またDMD/BMD患者でジストロフィン遺伝子異
常から計算されたリーディングフレームの型と患者の表
現型とを比較すると、90%以上の患者でこのフレームシ
フト説が当てはまっている。
しては、筋芽細胞の移植等やプラスミド又はウイルスベ
クターを用いることによる機能的ジストロフィン遺伝子
の導入等が試みられている [Morgan, J., Hum. Gene. T
her. 5:195-173(1994)]。
D患者にも見出されている [Nicholson, L. et al., J.
Neurol. Sci., 94:137-146(1989)]。DMD患者に見ら
れるジストロフィン陽性筋繊維は、エクソンスキッピン
グ機構により生じることが提唱されており [Klein, C.
et al., Am. J. Hum. Genet., 50:950-959(1992)]、実
際、mdxマウスの例で、主要なナンセンス変異を含有す
るエクソンをスキップしているリーディングフレームの
維持されたジストロフィン遺伝子転写物が同定された
[Wilton, S. et al., Muscle Nerve, 20:728-734(199
7)]。
伝情報は、スプライシングによりイントロン配列が除去
される等の修飾を受け、エクソン配列のみからなる成熟
mRNAとなる。更に、この成熟mRNAがそのリーデ
ィングフレームに従って翻訳され、遺伝子にコードされ
た遺伝情報に忠実に従ったタンパク質の合成が可能とな
る。mRNA前駆体のスプライシング時には、mRNA
前駆体の塩基配列のうちでイントロン配列とエクソン配
列を正確に決定する機構がある。そのためにイントロン
・エクソン境界部の配列は一定のルールで全ての遺伝子
で保存されており、コンセンサス配列として知られてい
る。
の5’末端のスプライスドナーサイトと呼ばれるエクソ
ンからイントロンへまたがる部位、イントロンの3’末
端のスプライスアクセプターサイトと呼ばれる部位、そ
して、ブランチングポイントと呼ばれる部位の、3カ所
の配列が知られている。
1塩基の置換でも発生すると、スプライシングの異常を
起こすことが各種の疾病で報告されているように[Saku
raba, H. et al., Genomics, 12: 643-650 (1992)]、
コンセンサス配列は、スプライシングを進行させる鍵と
なっている。
対象としたジストロフィン遺伝子異常の診断を日本で初
めてPCR法を用いて実施した。そして、ジストロフィ
ン遺伝子の異常型が欧米人と日本人とで大きな差がない
こと、すなわち大きな人種差のないことを明らかにし
た。こうした遺伝子診断で見出された遺伝子異常は、塩
基数において数kbから数百kbの巨大なものばかりで
あったが、更に詳細な分析を重ねることにより、あるジ
ストロフィン遺伝子の欠失部位の塩基配列を決定するこ
とに世界で初めて成功し、「ジストロフィン神戸」と命
名して報告した[Matsuo, M, et al., Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 170: 963-967 (1990)]。
異常を有する症例は、DMDであり、重複PCR分析の
結果によれば、エクソン19に相当するゲノムDNAの
増幅産物のバンドが、本来存在すべき位置に認められ
ず、一見、エクソン19の欠失と考えられた。しかしな
がら、ゲノムDNAについてエクソン19領域の単独増
幅を試みたところ、エクソン19が正常より小さいサイ
ズの増幅産物として検出され、ジストロフィン遺伝子に
よく見られる単純なエクソン欠失ではないことが判明し
た。この患者の家系の構成員のジストロフィンのエクソ
ン19領域をPCR法で増幅することにより、母親と妹
のDNAから正常な増幅産物と共に患者と同じサイズの
増幅産物が得られ、両者がこの遺伝子異常の保因者であ
ることが判明した。
の塩基配列を決定すると、88塩基からなるエクソン19
の配列のうち52塩基が欠失していることが判明した。エ
クソン内のこの52塩基の欠失は、この患者のジストロフ
ィンmRNAのリーディングフレームにずれを生じさせ
(アウトフレーム)、エクソン20内にストップコドン
を出現させることになる。この遺伝子診断の結果は、こ
の患者のDMDという臨床診断と一致するものであっ
た。
19の欠失部分がスプライシングに及ぼす影響を調べる
ために、患者のジストロフィンmRNAを分析した[Ma
tsuo, M., et al., J. Clin. Invest., 87: 2127-2131
(1991)]。
によりcDNAに変換し、これを入れ子型PCR(nest
ed-PCR)法を用いて増幅した。エクソン18から20に
わたる領域を増幅したところ、ゲノムで発見された異常
を基に計算されたサイズより更に短くなった増幅断片が
得られた。これはmRNAにゲノムDNAの異常とは異
なったレベルの異常が存在する可能性あるいは白血球と
筋肉でmRNAが異なる可能性を示唆した。そこで、こ
のmRNA異常が疾病と関連する筋肉のmRNAにも存
在することを確認するため、筋肉のmRNAから合成し
たcDNAを鋳型としてPCR法でエクソン18からエ
クソン20の領域を増幅した。その結果得られた増幅産
物のサイズは、白血球のエクソン18から20の増幅産
物と全く同じであった。
配列決定により、ジストロフィン神戸の患者のジストロ
フィンcDNAではエクソン18の配列が直接エクソン
20の配列につながっており、エクソン19の配列が完
全に消失していることが判明した。この結果は、ゲノム
では、エクソン19内の52塩基のみが欠失し36塩基がエ
クソンとして残存していたことと矛盾している。これら
のことから、ジストロフィン神戸では、前駆体mRNA
の成熟過程で36塩基のエクソン19がスプライスアウト
され、エクソンのスキッピングが起こったことが示され
た。
が生ずる例は少なからず報告されている。既に、本発明
者等はジストロフィン遺伝子の点突然変異例でエクソン
のスキッピングが生じることを世界で初めて発見してい
る[Hagiwara, Y., Am. J. Hum. Genet., 54: 53-61 (1
994)]。これらのエクソンのスキッピングを生じる生じ
る遺伝子変異は、いずれも、先に述べたスプライシング
部位を決定するコンセンサス配列内に生じた異常に起因
している。
クソン「内」に52塩基の欠失を認めたのみで、コンセン
サス配列には異常がなく、この例でエクソンのスキッピ
ングが生じる原因は不明であった。
スキッピングの原因がDNA及びmRNA前駆体の一次
構造の異常には求められないことから、mRNA前駆体
の2次構造にエクソンスキッピングの原因が存在するも
のと推察され、その2次構造を解析した。解析は、2次
構造でエネルギー的に最も安定した塩基結合を算出する
Zuker等のアルゴリズムを用い、コンピュータを用いて
行った[Matsuo, M. etal., Biochem. Biophys. Res. C
ommun., 182: 495-500 (1992)]。野生型のジストロフ
ィンのエクソン19及びその両側のイントロンの塩基配
列を含む617塩基を対象にした解析結果では、mRNA
前駆体は比較的単純なステムループ構造を呈した。特徴
的な構造として、エクソン19の配列それ自体が塩基対
をなすイントラエクソンヘアピン構造が確認された。こ
れに対し、52塩基のエクソン内欠失を有するジストロフ
ィン神戸のエクソンとその近傍のイントロンの塩基配列
からmRNA前駆体の2次構造を演繹すると、野生型と
大きく異なっており、ジストロフィン神戸における最大
の特徴は、エクソンの配列がイントロンの配列のみと塩
基対をなす単純なステム構造を形成することであった。
この結果は野生株で見られたイントラエクソンヘアピン
構造が、ジストロフィン遺伝子のエクソン構造を特徴づ
ける要素である可能性を示唆した。
クソンのうちから、近傍のイントロンの塩基配列の明ら
かにされている22個のエクソンを選び、そのmRNA前
駆体の2次構造を解析した。解析した全てのエクソン
は、イントラエクソンヘアピン構造を形成する結果とな
り、このイントラエクソンヘアピン構造が、エクソンの
機能の必須な要素と考えられた。これらのことは、ジス
トロフィン神戸に見出されたエクソンのスキッピングが
mRNA前駆体のイントラエクソンヘアピン構造の消失
により発生したことを強く示唆した。これはまた、エク
ソン自体の配列がスプライシング時のエクソン認識に重
要な役割を果たしていることをも示唆した。
内の配列の異常によってもエクソンのスキッピングが生
じ得ることが報告され[Dietz, HC., et al., Science,
259: 680-683 (1993)]、コンセンサス配列に加えてエ
クソンの配列もスプライシング部位決定要因として機能
しているとして注目を集めている。これらのことは、従
来の分子生物学のスプライシングに関する概念を崩すも
のとなっている。
決定に重要なことが示唆されたので、in vitro のスプ
ライシング反応系を構築し、このことを実験的に明らか
にする試みを行った[Takeshima, Y., et al., J. Cli
n. Invest., 95: 515-520 (1995)]。まず、ジストロフ
ィン遺伝子のエクソン18と19並びにイントロン18
からなるミニジーンを作成し、このミニジーンからラジ
オアイソトープでラベルしたmRNA前駆体を合成し
た。得られたmRNA前駆体をHeLa細胞の核抽出液と混
合しスプライシング反応を試験管内で進行させ、産生さ
れた成熟mRNAを電気泳動により分離した。この反応
系で正常のエクソン19塩基配列を有するmRNA前駆
体を用いるとスプライシングは正常に進行し、エクソン
18が19に繋がった成熟mRNAを得ることができ
た。しかしエクソン19の塩基配列をジストロフィンの
それと置換すると、成熟mRNAは産生されなくなっ
た。これは、ジストロフィン神戸でエクソン19から欠
失した52塩基がスプライシングに重要な役割を果たして
いることを示すものであった。
ン19の「サイズ」が36塩基と短くなった結果による可
能性もあるため、ジストロフィン神戸のエクソン19の
欠失部を補うものとして、欠失した遺伝子を逆方向に挿
入し、同様の実験を行った。このmRNA前駆体では、
スプライシングは進行するものの、その効率は低かっ
た。この結果は、たとえエクソンが正常な長さを有して
も、エクソン内の塩基配列が異なるとスプライシング効
率は低下することを示し、エクソンの(サイズでなく)
エクソン内の塩基配列自体が重要であることを示すもの
であった。
ライシングへの影響を更に解析するため、52塩基の欠失
配列に代わって、2種の異なる配列を挿入したmRNA
前駆体を作成し、そのスプライシング効率を調べた。β
−グロビン遺伝子の一部あるいはアンピシリン耐性遺伝
子の一部をそれぞれ挿入した2種のmRNA前駆体にお
いて、いずれもスプライシングは進行したが、ともに極
めて低い効率であった。しかし、β−グロビン遺伝子を
挿入した方が、アンピシリン耐性遺伝子を挿入した方よ
りも相対的に高いスプライシング効率を示した。前者の
塩基配列には多くのプリン基が含まれており、エクソン
内のプリン配列がエクソン認識に関与していると考えら
れている[Watanabe, A., et al., Genes Dev., 7: 407
-418 (1993)]。
は、コンセンサス配列のみならずその下流のエクソンの
配列が関与していることを実験的に明らかにしたもの
で、遺伝情報処理プロセスに新しい概念を導入するもの
であった。
スプライシング制御>ジストロフィン遺伝子のエクソン
19内の配列がスプライシングの進行に極めて重要であ
るという上記発見から、この配列を破壊することにより
スプライシングの異常が人為的に誘導できるのではない
かという可能性に着目し、本発明者等は続けて検討を行
った。すなわち、ジストロフィン神戸で欠失した52塩基
のうち配列表の配列番号1に示した塩基配列部分を含ん
だ配列表の配列番号2に示した31塩基に対し、これに相
補的な2’−O−メチルオリゴRNAを合成し、これ
が、エクソン18−イントロン18−エクソン19より
なるmRNA前駆体のスプライシングに及ぼす影響を、
前述の試験管内スプライシング反応系で調べた。その結
果、スプライシング反応はアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの添加量に、またその反応時間に依存して阻害され
た。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによりジ
ストロフィンのイントロンのスプライシングが阻止でき
ることを実験的に初めて証明したものであった。そし
て、このことは、核内でおこるスプライシング反応が人
為的な手段により制御できる可能性を示した[Takeshim
a, Y. etal., J. Clin. Invest., 95: 515-520 (199
5)]。
た細胞の核内でもアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
りジストロフィンmRNA前駆体のスプライシングが制
御できることを明らかにするため、本発明者等は、正常
なヒトリンパ芽球細胞を用い、配列表の配列番号1に示
した塩基配列部分を含んだ配列表の配列番号2に示され
た塩基配列に対し、これに相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスオリゴDNAの導入を行って、その存在下に
産生されるジストロフィン成熟mRNAについて解析を
行った[Zacharias A. DP. et al., B.B. R.C., 226: 4
45-449 (1996)]。すなわち、アンチセンスオリゴDN
Aの核内への導入は、リポフェクタミンと混合後、これ
をリンパ芽球培養液に加えることにより行った。その結
果、先に試験管内スプライシング反応系で得られた結果
とは異なって、ジストロフィンのエクソン19の塩基配
列に対するアンチセンスオリゴDNAはヒトリンパ芽球
細胞においてエクソン19のスキッピングを誘導し、m
RNAにおいてエクソン18がエクソン20に直接つな
がったものが得られることが確認された。また培養時間
を延長することにより、このエクソンスキッピング誘導
効果は完全なものとなり、全てのmRNAがエクソン1
9を欠失したものとして認められるようになった。更
に、用いたアンチセンスオリゴDNAは、他のエクソン
のスプライシングには問題を起こさなかったことも確認
された。
(AOs: Antisense oligonucleotides)は、タンパク質の
翻訳阻害のために遺伝子発現を抑制するために適用され
てきた。AOsはまた、RNAポリメラーゼIIによる転写を阻
害するためにDNAの特異的な領域を標的とするために
も用いられてきた。また、別のアプローチとして、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて前駆体mRNA分
子の異常スプライシングを阻害する方法も報告されてい
る[特表平8-510130号]。また、ホスホロチオエート−
2'−O−メチルオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアー
ゼ−H活性を誘導しないため、サラセミア症貧血患者に
おいて、前駆体mRNA中ずれたスプライシング部位を
阻害することにより正しいスプライシングを回復する目
的で、用いられてきた。
応用>先述のように、DMDでは、ジストロフィンmR
NAのリーディングフレームがずれてアウトフレームと
なるような遺伝子異常を有している。もしこのリーディ
ングフレームの異常をインフレームに転換できるとすれ
ば、それによりDMDはBMDとなり、症状の改善が期
待できる筈である。例えば、仮に、エクソン20のみが
単独で欠失している患者を想定すると、エクソン20は
242塩基からなっており、当然ながらその単独欠失はフ
レームシフトを起こして翻訳途中で停止コドンが出現し
てジストロフィン合成が途中で停止し、その結果DMD
の表現型となる。しかしながら、この症例に対し、前記
の実験で用いたようなエクソン19に対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドを投与してエクソン19のスキッ
ピングを人為的に誘発できたとすると、エクソン20の
242塩基に加えエクソン19の88塩基が前駆体mRNA
から欠失することとなり、合計330塩基の欠失となっ
て、リーディングフレームは一転してインフレームとな
る可能性が、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド
の使用によりDMDの表現型をBMDに転換できる可能
性が、理論上はある。
述の通り非常に複雑な構造をしており、そのmRNA前
駆体も、スプライスアウトされるべき多数の長いイント
ロンを含んだ複雑な2次構造をなしておりそれがスプラ
イシングの正常な進行を制御している。従って、正常な
ヒトのリンパ芽球細胞でなく、エクソン20の単独欠失
を有する患者の筋芽細胞においても、エクソン19に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって期待通り
エクソン19のスキッピングを起こすことができるか否
か、またエクソン19のスキッピングにうまく成功した
としても、元々エクソン20のスプライスアウトを引き
起こす異常を有するmRNA前駆体において、エクソン
20のスプライスアウトや他の部位のスプライシングに
対して影響を及ぼすことなくmRNAのリーディングフ
レームをアウトフレームからインフレームへと転換する
ことができるか否か、そして更には、インフレームへと
転換できたとしてもそのmRNAがジストロフィンに近
似のタンパク質を有効に産生できるか否か、という現実
の可能性は不明であった。
は、ジストロフィン成熟mRNAにおいてエクソン20
の完全欠失を有するDMD患者の細胞で、エクソン19
に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてその
スプライスアウトを誘導できること、そしてそれにより
ジストロフィン成熟mRNAのリーディングフレームの
ずれを修正でき、ジストロフィン陰性細胞を陽性細胞に
転換できることを明らかにし、その結果に基づきDMD
に対する治療薬を先に開示した(特願平11-140930
号)。
に対するアンチセンスオリゴリボヌクレオチドをエクソ
ン20の単独欠失を有するDMD患者の筋芽細胞の培養
液中に投与することにより、これが筋芽細胞内へ、次い
で核内へと取り込まれ、その結果、エクソン19とエク
ソン20とを完全欠失はするもののアミノ酸読み取り枠
はアウトフレームからインフレームになるよう回復され
て、エクソン19とエクソン20がコードする部分以外
は完全長のジストロフィンを産生できるようになること
が確認された。このことは、エクソン20の単独欠失に
基づくDMD患者に対して、エクソン19に対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、極
めて重篤な疾患であるDMDを比較的軽い疾患であるB
MDへと転換させ得るという可能性を強く支持してい
る。
A前駆体がスプライシングを受けて成熟mRNAとなる
ときに、スプライシングの部位決定に、従来より知られ
ているエクソン・イントロン境界部に存在するコンセン
サス配列に加えて、エクソン内に存在するスプライシン
グ促進配列(Splicing Enhancer Sequence: SES)が
重要な役割を果たしている。本発明の一人は、上記の通
り、ジストロフィン遺伝子エクソン19内にSESが存
在することを示し、更にそのSESに対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドによりエクソン19のスキッピン
グを導入し得ることを明らかにした。
のスプライシング系を用いて、ジストロフィンのエキソ
ン43及び53内に、それぞれ配列表の配列番号3及び
配列番号4で示される新たなSESを同定することに成
功した。それらSES配列に基づき、それらに対する相
補的な塩基配列、取り分け、それぞれ配列表の配列番号
5及び配列番号6に示す塩基配列を有するアンチセンス
オリゴヌクレオチド含んだ、デュシェンヌ型筋ジストロ
フィーに対する治療剤を創り出した〔特願2000-12544
8〕。これらの治療剤は、ヒトジストロフィンmRNA
におけるエクソン43又は53に隣接するエクソンを構
成する塩基配列において正常な塩基配列からの塩基の欠
失による塩基数の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジス
トロフィーであって、該塩基数の正味の変化が(3×N
+1)個(Nはゼロ又は自然数)の塩基の減少として表
されるものであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治
療に、それぞれ用いられる。
トロフィンの前駆体mRNAのスプライシングに際しエ
クソンスキッピングを誘導することによりリーディング
フレームのずれを修復すると、部分的に機能回復したジ
ストロフィンタンパク質が産生されることになり、それ
によりDMDをBMDへと変化させることが可能であ
る。しかしながら、DMDにおけるジストロフィン遺伝
子の変異部位は多種存在し得る。それぞれの変異に対応
して発症するDMDを治療するには、更なるジストロフ
ィンエクソンについてSESを同定し、これに対するア
ンチセンスを提供する必要がある。本発明は、上記エク
ソン以外のジストロフィンエキソン内のSESを同定
し、それに基づきエキソン45のスキッピングを誘導す
ることによる、DMDの更なる治療剤を提供することを
目的とする。
者らは、in vitroのスプライシング系を用いて、ジスト
ロフィン遺伝子のエクソン45内に新たなSESを同定
することに成功し、それに基づきデュシェンヌ型筋ジス
トロフィーに対する新たな治療手段を創り出した。
号15で示された塩基配列を有するDNA及び該塩基配
列に対する相補的塩基配列に対して相補的である塩基配
列を有するRNAよりなる群より選ばれるオリゴヌクレ
オチドを提供する。
Aは、ヒトジストロフィンのmRNA前駆体のエクソン
45内のSES部分である。これらのDNA及びRNA
は、後述のタイプのデュシェンヌ型筋ジストロフィーの
治療剤としてのアンチセンスの製造のための鋳型として
使用できる。
5で示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を含ん
でなるアンチセンスオリゴヌクレオチドをも提供する。
トジストロフィンmRNAエクソン45内のSESと相
補的であるため、それらの投与により、ヒトジストロフ
ィンmRNAのスプライシングに際してエクソン45の
スキッピングを誘導することができる。このため、該ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のデュシェンヌ
型筋ジストロフィーにおいて、リーディングフレームの
ずれを修復することに基づく治療剤として用いることが
できる。
列表において配列番号19で示された塩基配列を有する
DNA又はホスホロチオエートDNAであってよい。こ
れらの配列は、エクソン45内のSES及びそれらの両
端の隣接塩基配列をも含んだ配列に対して相補的な配列
であり、従って、これらの配列を有するDNA(又はホ
スホロチオエートDNA)は、それぞれmRNA前駆体
のエクソン45のSESに、一層強力にハイブリダイズ
してその機能をブロックできる。
Aのエクソン45に隣接するエクソンを構成する塩基配
列における正常な塩基配列からの塩基の欠失による塩基
数の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーで
あって、該塩基数の正味の変化が(3×N+1)個(N
はゼロ又は自然数)の塩基の減少として表されるもので
あるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の製造の
ための、配列表において配列番号15で示された塩基配
列に対して相補的である塩基配列を有するアンチセンス
オリゴヌクレオチドの使用をも提供する。ここにおい
て、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列表にお
いて配列番号19で示された塩基配列を有するDNA又
はホスホロチオエートDNAであってよい。
可能な媒質中に、エクソン45のSESに対する上記ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの何れかを含有すること
を特徴とする、治療剤をも提供する。該治療剤は、ヒト
ジストロフィンmRNAにおけるエクソン45に隣接す
るエクソンを構成する塩基配列において正常な塩基配列
からの塩基の欠失による塩基数の変化に起因するデュシ
ェンヌ型筋ジストロフィーであって、該塩基数の正味の
変化が(3×N+1)個(Nはゼロ又は自然数)の塩基
の減少として表されるものであるデュシェンヌ型筋ジス
トロフィーに対して用いられる。
は、オリゴDNA、オリゴRNAのみならず、ホスホロ
チオエートオリゴDNA等のホスホロチオエート類似体
をも包含する。ホスホロチオエートDNAは、リン酸基
の酸素原子がイオウ原子で置換されたヌクレオチドであ
り、各種の核酸分解酵素に対して耐性があること等か
ら、部位特異的な遺伝子の置換その他で遺伝子工学の分
野において汎用されているヌクレオチド類似体であり、
その製法及び性質、及び種々の用途は当業者に周知であ
る。ホスホロチオエートDNAは、通常のDNAと同様
に塩基対を形成するが、各種分解酵素に対して抵抗性が
大きく本発明において用いるのに特に有利である。ここ
に、「ホスホロチオエート類似体」は、通常のDNAの
ヌクレオチド間のホスホロジエステル基の1個以上がホ
スホロチオエート基に置き換えられている構造のもので
ある。
μmoles/mlの該アンチセンスオリゴヌクレオチド、
0.02〜10%w/vの炭水化物又は多価アルコール及び0.
01〜0.4%w/vの薬剤学的に許容し得る界面活性剤を
含有する、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの更に好
ましい範囲は、0.1〜1μmoles/mlである。
糖類が特に好ましい。これら炭水化物及び多価アルコー
ルの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノー
ス、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソルビ
トールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併用
してもよい。
ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステル、
アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウ
ロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコール
エステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステルであ
り、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オ
レエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテート
である。これらは単独で用いても、併用してもよい。
0.03〜0.09Mの薬剤学的に許容し得る中性塩、例えば、
塩化ナトリウム、塩化カリウム及び/又は塩化カルシウ
ムを、含有する。
0.002〜0.05Mの薬剤学的に許容し得る緩衝剤を含有す
ることができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン
酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリ
ウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが挙げ
られる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用して
もよい。
てもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等
のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化し
て治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥して
おくことが好ましく、その場合は用時に溶解液(注射用
蒸留水など)で復元(reconstitution)して、即ち投与
される液体状態にして用いればよい。従って、本発明の
治療剤は、各成分が所定の濃度範囲になるよう患者への
使用に先立って復元されるための、凍結乾燥された状態
で該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むものも包含
する。凍結乾燥物の溶解性を高める目的で、アルブミ
ン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させておいてもよ
い。凍結乾燥製剤の設計に際し、復元のための溶解液
は、注射用蒸留水としてもよく、また該治療剤のうちの
アンチセンスオリゴヌクレオチド以外の成分の一部を含
有させたものとしてもよい。
明を更に詳細に説明する。
エクソンスキッピングの誘導 前述の通り、正常のジストロフィン遺伝子構造を持つ遺
伝子から転写されたmRNA前駆体のスプライシング反
応において、エクソン19中の塩基配列に対する本発明
者等のデザインしたアンチセンスオリゴヌクレオチドが
エクソン19のスキッピングを有効に誘導することが確
認された。一方、エクソン20を欠失したDMD患者で
は、正常とは遺伝子構造を異にするため、ジストロフィ
ンのmRNA前駆体の2次構造あるいは3次構造が正常
とは異なると予想される。そのようなエクソン20を欠
失したDMD患者でも、前記31塩基のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが有効か否かを検討した。すなわち、以
下に詳述するように、ジストロフィンのエクソン20を
欠失したDMD患者2名からEBウイルスでトランスフ
ォームしたリンパ芽球細胞株を樹立し、これを用いてア
ンチセンスオリゴヌクレオチドによりエクソンスキッピ
ングを誘導できること確認した。
の樹立 ジストロフィンのエクソン20を欠失したDMD患者2
名から、EBウイルスで形質転換したリンパ芽球細胞株
を次のようにして樹立した。すなわち、患者より採取し
た2mlの全血を2mlのRPMI1640培地(10%FBSを補
充)と混和し、3mlのFicoll Paque(Pharmacia社)
上に重層し、濃度勾配遠心した。その後、リンパ球層の
みを回収し、RPMI1640培地(10%FBSを補充)にて2回
洗浄し、最後に0.5mlのRPMI1640培地(10%FBSを補
充)に浮遊させ、リンパ浮遊液とした。この液と、予め
用意しておいたEBウイルス液0.5mlを混和し、混和
液を37℃にて1週間培養した。1週間後にEBウイルス
を除くためRPMI1640培地(10%FB Sを補充)にて洗浄
し、その後同じ培養液を使用して培養を継続した。こう
して、EBウイルスが患者リンパ球に感染し、形態的に
大きな、リンパ芽球となった細胞を得た。
心し、細胞成分のみに分離した。そして、配列表におい
て配列番号2で示した塩基配列に相補的な配列よりなる
31塩基のアンチセンスオリゴDNAを約200nM(200pm
oles/ml)と2%胎仔牛血清(FBS)を含む維持培地
で、この細胞を36℃にて5時間培養した。次いで血清培
地に交換した後に、引き続き12時間培養した。培養終了
後に、常法により細胞を集めて全RNAを抽出した。
ドからなるランダムオリゴヌクレオチドをプライマーと
して、常法に従い逆転写酵素の作用によりcDNAを合
成した。合成したcDNAよりジストロフィンのエクソ
ン18から21にわたる領域をnested PCR法を用い
て増幅した。まず、プライマーをエクソン18と21に
デザインしたもので1回増幅した。この増幅産物をテン
プレートとして、1回目に用いたプライマーの内側に位
置する領域にマッチするプライマーをデザインして2回
目のPCR増幅を行った。この増幅は、アニーリング温
度を60℃に設定して行った。
認 こうして、ジストロフィンcDNAのエクソン18〜2
1の領域を増幅したところ、アンチセンスの無添加では
384塩基対のきれいなバンドが得られた。この増幅産物
の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソ
ン18、19、21からなることが示された。これは患
者の遺伝子解析結果とよく一致していた。
のcDNAでは、アンチセンスオリゴDNAを導入しな
い細胞から得られた産物と同じサイズの増幅産物が得ら
れたのみならず、培養4日目から小さなサイズの、リー
ディングフレームの維持された産物が得られた。また、
症例2より確立したリンパ芽球細胞でも、同様の処理に
より2種類のバンドが得られた。これらのうち小さなサ
イズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン
18の配列が直接エクソン21の配列につながってお
り、エクソン19と20とは欠失していることが判明し
た。このことは、アンチセンス処理によりエクソン19
がスキッピングしたことを示している。一方、正常者か
ら確立したリンパ芽球細胞では、この条件で小さなサイ
ズの転写物、すなわちエクソン19のスキッピングを有
するもののみが得られた。また、ジストロフィンcDN
Aの全領域を10抗体に分けて増幅して調べたが、スプラ
イシングの異常を示す断片は得られなかった。
ピング誘導効果が正常とDMD患者で異なっている原因
は、エクソン19近辺のmRNA前駆体の2次構造ある
いは3次構造の差に由来するものと考えられた。アンチ
センスオリゴヌクレオチドの濃度を変えることにより、
更にDMD患者におけるエクソンスキッピング誘導効率
を調べた。しかし、正常患者由来細胞で見られたよう
な、全ての転写産物がエクソンスキッピングを示すよう
な条件は得られなかった。なお、このアンチセンス誘導
は、センスオリゴヌクレオチドでも、また他の領域に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、見られなか
った。
前駆体のスプライシングを制御することによりエクソン
のスキッピングを誘導し、その結果リーディングフレー
ムの修正ができることを示している。しかし、筋細胞に
おいてもこうしたmRNAの修正でアミノ酸読み取り枠
が維持できるようになったmRNAが有効にタンパク質
を合成できるか否かは依然として不明であった。
トロフィン近似タンパク質の発現 そこで、次に、エクソン20の欠失したDMD患者の筋
芽細胞を用いて、ジストロフィン近似のタンパク質が発
現するか否かにつき検討した。
り、無菌的に筋組織を取り出し、細切した後、トリプシ
ンにて遊離細胞を得た。これを洗浄した後、生育培地
(Growth medium: 20% FCS、0.5% chicken胚抽出物を
補充したHam-F10)中にて培養した。継代に際し細胞培
養用のシャーレの中にカバーグラスをおき、その上で筋
細胞の培養を行った。筋芽細胞の割合が80%程度になる
まで増殖したとき、培養液をFusion培地(2%HSを補
充したDMEM)に交換して分化を誘導し、筋細胞とした。
0 pmol)をリポフェクタミン(6μl)によって細胞内
に導入し、更に3、7、及び10日間培養した。
C末端に対する抗体を用いたジストロフィン免疫染色を
行った。その結果、当初全くジストロフィンの染色のな
かった細胞で、ジストロフィンが染色されるようになっ
た。何れにおいても、ジストロフィン陽性細胞が確認さ
れた。また、ジストロフィンのN末端領域を認識する抗
体を用いてもC末端領域の染色と同様な染色結果が得ら
れ、この産生されたジストロフィンがN末端からC末端
に及ぶものであることが確認された。
添加した筋芽細胞には、ジストロフィンの染色が認めら
れたのに対し、同様の方法でアンチセンスオリゴDNA
無添加の筋芽細胞を検討したところでは、ジストロフィ
ンの染色は全く認められていない。
胞から、常法によりRNAを抽出した。得られたRNA
よりcDNAを合成し、リンパ芽球細胞からのRNAに
ついて上記したのと同様にして、ジストロフィンのエク
ソン18〜21の領域を増幅した。
配列決定した。その結果、培養4日目から、エクソン1
8の塩基配列がエクソン21の塩基配列に直接つながっ
てアミノ酸読み取り枠がインフレームとなった増幅産物
が得られた。
養筋芽細胞から作成したcDNAにつき、その全領域を
10個の部分に分けてPCR法により増幅し、増幅産物
として得られた各断片のサイズを常法により電気泳動し
て検討した。その結果、エクソン19及び20のスキッ
ピング以外、スプライシングの異常を示唆するような断
片は認めらなかった。これらの結果は、得られたジスト
ロフィン成熟mRNAが、エクソン19とエクソン20
とを完全欠失していること以外は、リーディングフレー
ムの維持された完全長のmRNAであることを示すもの
である。
の移行 次いで、アンチセンスオリゴDNAが実際に核内に移行
して作用していることの裏付けを得るために、蛍光標識
したアンチセンスオリゴDNAを用いて、その核内への
移行の様子を観察した。
法によりFITC(フルオレセインイソチオシアネー
ト)標識して、アンチセンスオリゴDNAの核内への移
行について検討した。すなわち、DMD患者から採取し
た筋細胞を生育培地(Growth medium: 20% FCS、0.5%
chicken胚抽出物を補充したHam-F10)中にて培養し
た。培養は、細胞培養用のシャーレ内においたカバーグ
ラス上で行い、細胞がセミコンフルエントになったとき
Fusion培地(2%HSを補充したDMEM)に置換して分化
を誘導し、筋細胞とした。分化誘導して4日目にFIT
C標識したアンチセンスオリゴDNA(200 pmol)をリ
ポフェクタン(6μl)によって細胞内に導入し、1、
2、3、7及び10日後に蛍光顕微鏡にてFITCの局在
を確認した。
出された。このことは、アンチセンスオリゴDNAが実
際に核内に移行してエクソン19のスプライシングをス
キップさせたことを裏付けるものである。
の筋芽細胞において、アミノ酸読み取り枠をインフレー
ムへと転換させることによって、ジストロフィンに対応
するタンパク質を合成させることができる。これは、従
来極めて重篤な不治の疾患であったDMDにおいて、特
にエクソン20の単独欠失を有する患者を、比較的穏や
かなBMDへと転換させる可能性を示すものである。
ヌクレオチドの腹腔内投与によるエクソンスキッピング
の誘導 生体への投与による効果を検討するため、6〜8週齢の
雄性mdxマウスに、ジストロフィンmRNAのエクソン19
に対する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを 20m
g/kg腹腔内投与した。腹腔内投与の2、4、7及び
14日後にマウスの心筋及び骨格筋組織サンプルを採取
し、そこに含まれるmRNAを常法により抽出した。こ
れを鋳型としてジストロフィンmRNAのエクソン18
〜20の領域をRT−PCRにより増幅した後、増幅産
物をゲル電気泳動により分離した。その結果、心筋及び
骨格筋サンプル共に、投与2日後において、エクソン1
8とエクソン20のみからなる、エクソン19のスキッ
ピングされたヌクレオチド断片が明瞭に確認された。ま
たこの断片は、投与4日後にも僅かながら認められた。
これらの結果は、試験管内での試験におけるだけでな
く、動物への注射投与でも、ジストロフィンmRNA前
駆体中のエクソンに対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドによって、該動物の心筋及び骨格筋細胞における該
エクソンのスキッピングが誘導されることを示してい
る。また、投与されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
の骨格筋における局在の有無及びその経時的変化を調べ
るため、FITC標識した同アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド20mg/kgをmdxマウスに腹腔内投与し、投与の
2、4、7及び14日後におけるマウスの骨格筋組織サ
ンプルを採取して、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、
FITC標識した前記アンチセンスオリゴヌクレオチド腹腔
内投与2日後に骨格筋細胞膜が蛍光陽性となっているの
が観察された。投与4日以降には、筋細胞核にも蛍光が
認められた。この結果は、注射されたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが筋細胞核へと移行したことを示すもの
である。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与
量−効果関係を見るため、mdxマウスに前記アンチセン
スオリゴヌクレオチドをそれぞれ0.2、2、20又は200m
g/kg腹腔内投与した。投与2日後、心筋及び骨格筋
組織を採取してそこに含まれるmRNAを常法により抽
出した。エクソン18〜20をカバーする領域をRT−
PCRにより増幅し、増幅産物をゲル電気泳動により分
離した。その結果、20mg/kg又は200mg/kgの
アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与したマウスの組
織において、エクソン18とエクソン20のみからな
る、エクソン19のスキッピングされたヌクレオチド断
片が明瞭に確認された。該断片の生成は、アンチセンス
オリゴヌクレオチド20 mg/kgを投与されたマウス
からのサンプルにおいて最高であった。
1 上記の結果を基に、更に本発明等は、ジストロフィン遺
伝子における欠失好発部位であるエクソン45〜55周
辺の、リーディングフレームに関して端数の塩基よりな
るエクソン(即ち、その欠失が起こると、アミノ酸読み
取りに関しアウトフレームとなる)内より、SESを転
写物として与える配列の存在につき調べた。上記のよう
に、in vitroの系における解析よって、SESはプリン
残基(特にaagの繰り返し配列)に富んでいる。これに
基づき、本発明者等は、ヒトジストロフィン遺伝子のエ
キソン内にある、比較的プリン残基に富んだ転写物を与
える鋳型となりうる(1) エクソン43内の26塩基よりな
る塩基配列(配列表の配列番号3に示した塩基配列に相
補的な塩基配列)、(2) エクソン46内の28塩基よりな
る塩基配列、及び(3) エクソン53内の26塩基(配列表
の配列番号4に示した塩基配列に相補的な塩基配列)、
の3箇所を候補として選択し、それらの配列がSES活
性を有する転写物を与えるか否かを、次に検討した。
作製及び評価には、ショウジョウバエのdoublesex (ds
x)遺伝子のエクソン3、イントロン3、及びエクソン4
の5'末端部分を含んだ、Watakabe, A., et al., Genes
& Development, 7:407-418(1993)に記載のプラスミドを
基本プラスミドとして用いた。このプラスミドは、ショ
ウジョウバエのdoublesex (dsx)遺伝子のエクソン3か
ら雌性特異的アクセプター部位(female-specific acce
ptor site)の1128塩基下流までを含んだdsxのゲノム断
片をpSP73(Promega)にサブクローンして得られるプラ
スミドであるpSPdsxE34f〔Inoue et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:8092-8096(1992)〕のBglII-HincII
断片を、プラスミドpSP72のBglII-SmaI部位に挿入する
ことにより得られたものである。このBglII-HincII断片
は、その転写物において、雌性特異的エクソンであるエ
クソン4の5'末端部分のすぐ下流にSESが付加されな
いとイントロン3を挟むエクソン間のスプライシングが
見られないが、当該部分にSESが付加されるとスプラ
イシングが見られるようになる系を提供する。他方、解
析対象である塩基配列については、正逆両方向の一本鎖
DNAを各々合成した。このとき、正方向のDNAの5'
末端には制限酵素BamHI切断部位を付加し、逆方向のD
NAの5'末端には制限酵素XhoI切断部位を付加した。合
成した正逆両一本鎖DNAを混合し、熱処理(94℃、2
分間)後、室温に戻して両鎖をアニールさせて二本鎖と
した。この二本鎖DNAを、前記試験用の基本プラスミ
ド中のdsxエクソン4の5'末端部分のすぐ下流にあるBam
HI-Xhol部位に挿入した。こうして、dsxのエクソン3か
らエクソン4の5'末端部分までの塩基配列とその下流に
挿入された解析対象塩基配列とからなるミニジーンを含
んだプラスミドが得られた。これらのプラスミドを鋳型
として、常法によりRNAポリメラーゼによりラジオア
イソトープによって標識されたmRNA前駆体を合成し
た。このmRNA前駆体を前述の方法と同様にしてHela
細胞核抽出液と1時間反応させ、スプライシング反応を
進行させた後、常法によりゲル電気泳動で解析した。
候補を組み込んだmRNA前駆体を用いたスプライシン
グ反応では、何れもイントロン3を挟むエクソン間のス
プライシングを受けたmRNAの生成が明らかに認めら
れた。このことは、これら2種の候補配列がSES活性
を有することを示している。また両者の対比では、SE
S活性は、エクソン43の方が上回っていた。一方、エ
クソン46のSES候補を組み込んだmRNA前駆体を
用いたスプライシング反応では、スプライシング反応を
受けたmRNAは認められるものの、活性は非常に弱か
った。
ンmRNAのエクソン43及び53内にSESが存在す
ることを見出した。mRNA中におけるそれらのSES
は、それぞれ、配列表の配列番号3及び配列番号4に示
したリボヌクレオチド配列である。
フィン遺伝子の転写物である前駆体mRNAのエクソン
19内にSESが存在し、更にそのSESに対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドによりエクソン19のスキ
ッピングを誘導でき、それによりエクソン20欠失患者
におけるリーディングフレームの回復が可能となること
を見出している。同様に、上記で更に同定したエクソン
43及びエクソン53内にそれぞれ存在するSESにつ
いても、それらに対するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを用いることにより、それぞれエクソン43(173塩
基、即ち3×57+2塩基)及び53(212塩基、即ち3
×70+2塩基)のスキッピングを誘導できる。
のエクソン43に隣接するエクソン内の塩基配列の欠失
により塩基数が(3×N+1)個(Nはゼロ又は自然
数)減少しているタイプのDMD症例に対しては、エク
ソン43のSESに対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの投与により、スプライシングに際したエクソン4
3のスキッピングの誘導が行われる。これにより、スプ
ライシングに際してエクソン43を構成する173個の塩
基が更に欠失するため、スプライシング後におけるmR
NA中の欠失塩基個数を3の倍数にしてアウトフレーム
であった変異をインフレームに戻すことが可能である。
このため、スキッピングされた塩基配列に対応するアミ
ノ酸は欠落するもののその下流側のアミノ酸配列は遺伝
子異常の影響を受けずにジストロフィンタンパク質が合
成されることとなり、重症のDMDが比較的軽いBMD
へと転換される。そのようなDMD例としてはエクソン
44(148塩基、即ち3×49+1塩基)の欠失したもの、エ
クソン44から46まで(148+176+148=472塩基、即ち3
×157+1塩基)が欠失したもの、エクソン44から47
まで(148+176+148+150=622塩基、即ち3×207+1塩基)
が欠失したもの、エクソン44から48まで(148+176+
148+150+186=808塩基、即ち3×269+1塩基)が欠失した
もの、及びエクソン44から49まで(148+176+148+15
0+186+102=910塩基、即ち3×303+1塩基)が欠失したも
のが挙げられる。
ンの前駆体mRNAのエクソン53に隣接するエクソン
内の塩基配列の欠失により塩基数が(3×N+1)個
(Nはゼロ又は自然数)減少しているタイプのDMD症
例に対しては、エクソン53のSESに対するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの投与により、スプライシング
に際したエクソン53のスキッピングの誘導が行われ
る。該当する例としては、エクソン52(118塩基、即
ち3×39+1塩基)を欠失、又はエクソン50・エクソ
ン51・エクソン52を欠失(109+233+118=460塩基、
即ち3×153+1塩基)を欠失したDMD症例が挙げられ
る。これらに対し、エクソン53のSESに対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドを導入してスプライシング
に際したエクソン53のスキッピングを誘導することに
より、スプライシング後におけるmRNA中の欠失の長
さをそれぞれ330塩基及び672塩基とすることが可能であ
る。そうすることにより、スプライシング後のmRNA
中の欠失塩基の個数が3の倍数となるため、元の欠失に
より起こっていたリーディングフレームのずれが正常に
復帰する。
−2 本発明等は更に、ジストロフィン遺伝子における欠失好
発部位にあるエクソン45(この塩基配列を、配列表に
おいて配列番号7に示す)中のSESを同定することを
目的として検討を行った。すなわち、エクソン45の塩
基配列(176塩基)より、スプライシング部位(5'側の
7塩基及び3'側の6塩基)を除去してなる163塩基より
なる塩基配列を、約30塩基よりなる断片(断片1〜5)
へと5分割した。それにより、5'側より3'側へと、それ
ぞれ31塩基(断片1:配列表において配列番号8で示
す)、32塩基(断片2:配列表において配列番号9で示
す)、33塩基(断片3:配列表において配列番号10で
示す)、32塩基(断片4:配列表において配列番号11
で示す)及び35塩基(断片5:配列表において配列番号
12で示す)よりなる断片を作製した。各断片につい
て、前述のようにして、ショウジョウバエのdouble sex
(dsx)遺伝子のエクソン3・イントロン3・エクソン4
を組み込んだプラスミドの3'側にこれらSES候補の鋳
型となる配列を有するDNAを組み込み、ミニジーンを
作成した。また、陽性対照として、エクソン19のSE
S配列(配列表の配列番号1で示す)を有するDNAを
同様に組み込んだミニジーンをも作製した。このSES
活性測定系を用いて各断片のSES活性を測定した。す
なわち、それらのプラスミドを鋳型として、常法により
RNAポリメラーゼによりラジオアイソトープによって
標識されたmRNA前駆体を合成した。このmRNA前
駆体を前述の方法と同様にしてHela細胞核抽出液と1時
間反応させ、スプライシング反応を進行させた後、常法
によりゲル電気泳動で解析した。その結果、断片4が、
他の断片に比してやや強いSES活性を有することが認
められた。
S活性を調べた。すなわち、エクソン45の塩基配列に
おいて断片4に対応する領域より、1)16塩基だけ上流
側に位置する同長の領域の塩基配列よりなる断片(断片
4a:配列表において配列番号13で示す)、2)13塩
基だけ上流側に位置する同長の領域の塩基配列よりなる
断片(断片4b:配列表において配列番号14で示
す)、16塩基だけ下流側に位置する同長の領域の塩基配
列よりなる断片(断片4c:配列表において配列番号1
5で示す)を作製し、それぞれにつき上記と同様にして
SES活性を検討した。その結果、断片4cが元の断片
4よりも強い活性を有することが判明した。断片4cの
活性は、エクソン19のSESに匹敵する強さを示し
た。
を短くした配列についても、SES活性を検討した。す
なわち、断片4cの5'側を10塩基削除したもの(断片4
ca:配列表において配列番号16で示す)、3'側を10
塩基削除したもの(断片4cb:配列表において配列番
号17で示す)、及び5'側及び3'側の双方からそれぞれ
5塩基ずつ削除したもの(断片4cc:配列表において
配列番号18で示す)を作製して、それぞれについて上
記の手順でSES活性を検討した。その結果何れの配列
も、元の断片4cよりもSES活性が弱かった。このこ
とは、断片4c(配列表において配列番号15で示す)
の塩基配列が、エクソン45において最もSES活性の
強い領域を構成していることを示している。このこと
は、断片4cの塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドによりエクソン45のスキッピングが誘導で
きることを意味する。該アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの一例は、配列表において配列番号19に示した塩基
配列を有するDNA又はホスホロチオエートDNAであ
る。
よりなる。従って、ヒトジストロフィンmRNAにおけ
るエクソン45に隣接するエクソンを構成する塩基配列
において正常な塩基配列からの塩基の欠失による塩基数
の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーであ
って、該塩基数の正味の変化が(3×N+1)個(Nは
ゼロ又は自然数)の塩基の減少として表すことのできる
ものは、エクソン45のスキッピングによる176塩基の
更なる減少を誘導することによって、リーディングフレ
ームの回復が可能となる。そのようなDMD例として
は、エクソン44(148塩基、即ち3×49+1塩基)の欠失
したもの、エクソン46(148塩基、即ち3×49+1塩基)
の欠失したもの、エクソン46及び47(148+150=298
塩基、即ち3×99+1塩基)が欠失したもの、エクソン4
6から48まで(148+150+186=484塩基、即ち3×161+1
塩基)が欠失したもの、エクソン46、47及び49
(148+150+102=400塩基、即ち3×133+1塩基)が欠失し
たもの、エクソン46、47、49、50及び51(14
8+150+102+109+233=742塩基、即ち3×247+1塩基)が欠
失したもの、エクソン46、47、49、50、51、
52、53、54及び55(148+150+102+109+233+118+
212+155+190=1417塩基、即ち3×472+1塩基)が欠失した
もの等が挙げられる。
ロチオエートDNAの調製 配列表において配列番号15で示されたヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列を有するDNA及びホス
ホロチオエートDNAの製造は、Applied Biosystems M
odel 1380B等のような市販のDNA合成装置を用いて、
また、Zon et al., 「Oligonucleotides and Analogue
s」:A Practical Approach, F. Eckstein, Ed., p. 87
-108, Oxford University Press, Oxford, England、米
国特許第5,151,510号に記載された方法を用いて、行う
ことができる。
センスヌクレオチドの臨床的利用 適合するDMD患者への該アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの投与は、例えば次の通りに行うことができる。す
なわち、配列表において配列番号15に示された塩基配
列に対して相補的な塩基配列を含んでなる、例えば配列
表において配列番号19に示された塩基配列よりなるア
ンチセンスDNA又はアンチセンスホスホロチオエート
DNAを当業者に周知の方法で製造し、これを常法によ
り滅菌処理し、例えば1200μg/mlの注射用溶液を調
製する。この溶液を、患者静脈内に該アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの投与量が体重1kg当たり例えば20m
gとなるように、例えば輸液の形で点滴投与する。投与
は、例えば2週間の間隔で4回繰り返し、その後も、筋
生検組織におけるジストロフィンタンパク質の発現、血
清クレアチンキナーゼ値、臨床症状を指標とした治療効
果の確認をしながら、適宜この治療を繰り返す。治療効
果があり明らかな副作用が見られない限り、治療を継続
し、原則として生涯投与が行われる。
に具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定される
ことは意図しない。
の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイズ
0.22μmのメンブランフィルターにより濾過して、静脈
内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド(注1)・・・500mg 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.6g 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3g 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33g 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ml 注1: 配列表の配列番号19に示された塩基配列より
なるホスホロチオエートDNA
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ15nmのフィルター(PLANOVE 15:旭化成)により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド(注2)・・・100mg 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3g 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3g 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33g リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8g 1N塩酸・・・・・・・・・・・・・適量(pH7.4) 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ml 注2: 配列表の配列番号19に示された塩基配列より
なるホスホロチオエートDNA
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ35nmのフィルター(PLANOVE 35:旭化成)により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド(注3)・・・100mg 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3g 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3g 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33g グルコース・・・・・・・・・・・・・・・・・0.4g リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8g 1N塩酸・・・・・・・・・・・・・適量(pH7.4) 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000m
l注3: 配列表の配列番号19に示された塩基配列よ
りなるホスホロチオエートDNA
Claims (16)
- 【請求項1】配列表において配列番号15で示された塩
基配列を有するDNA及び該塩基配列に対する相補的塩
基配列に対して相補的である塩基配列を有するRNAよ
りなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項2】配列表において配列番号15で示された塩
基配列に対して相補的な塩基配列を含んでなるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項3】配列表において配列番号19で示された塩
基配列を有するDNA又はホスホロチオエートDNAで
ある、請求項2のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項4】ヒトジストロフィンmRNAのエクソン4
5に隣接するエクソンを構成する塩基配列における正常
な塩基配列からの塩基の欠失による塩基数の変化に起因
するデュシェンヌ型筋ジストロフィーであって、該塩基
数の正味の変化が(3×N+1)個(Nはゼロ又は自然
数)の塩基の減少として表すことのできるものであるデ
ュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の製造のため
の、請求項2又は3のアンチセンスオリゴヌクレオチド
の使用。 - 【請求項5】薬剤学的に許容し得る注射可能な媒質中
に、請求項2又は3のアンチセンスオリゴヌクレオチド
を含有することを特徴とする、デュシェンヌ型筋ジスト
ロフィー治療剤。 - 【請求項6】0.05〜5μmoles/mlの該アンチセンス
オリゴヌクレオチドを含有する、請求項5の治療剤。 - 【請求項7】0.02〜10%w/vの炭水化物又は多価アル
コール及び0.01〜0.4%w/vの薬剤学的に許容し得る
界面活性剤を含有する、請求項5又は6の治療剤。 - 【請求項8】0.03〜0.09Mの薬剤学的に許容し得る中性
塩を含有する、請求項5ないし7の何れかの治療剤。 - 【請求項9】該中性塩が塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、及び塩化カルシウムよりなる群より選ばれるもので
ある、請求項8の治療剤。 - 【請求項10】0.002〜0.05Mの薬剤学的に許容し得る
緩衝剤を含有する、請求項5ないし9の何れかの治療
剤。 - 【請求項11】該緩衝剤が、クエン酸ナトリウム、ナト
リウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス(ヒド
ロキシメチル)アミノメタンよりなる群より選ばれるも
のである、請求項10の治療剤。 - 【請求項12】該炭水化物が単糖類及び2糖類よりなる
群より選ばれるものである、請求項7の治療剤。 - 【請求項13】該炭水化物又は多価アルコールが、グル
コース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マル
トース、マンニトール及びソルビトールよりなる群より
選ばれるものである、請求項7又は12の治療剤。 - 【請求項14】該界面活性剤が、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノ〜トリ−エステル、アルキルフェニルポリ
オキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウ
ムコラート及び多価アルコールエステルよりなる群より
選ばれるものである、請求項7又は12の治療剤。 - 【請求項15】該ポリオキシエチレンソルビタンエステ
ルが、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパル
ミテートよりなる群より選ばれるエステルである、請求
項14の治療剤。 - 【請求項16】患者への使用に先立って復元されるため
に、凍結乾燥された状態の該アンチセンスオリゴヌクレ
オチドを含むものである、請求項5ないし15の何れか
の治療剤。
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