JP2002306163A - Method of preparing gene-recombinant human thrombin using escherichia coil as host - Google Patents
Method of preparing gene-recombinant human thrombin using escherichia coil as hostInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本願発明は、医療用医薬品の分野
に係る血漿蛋白質に関する。詳細には、遺伝子組換え技
術を利用したトロンビンの調製方法に関し、さらに詳細
には、形質転換大腸菌より発現されるヒトプレトロンビ
ンの封入体(インクルージョンボディ)からの効率的な回
収及びまき直し工程を含むヒトトロンビンの調製方法に
関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a plasma protein in the field of pharmaceuticals. Specifically, the present invention relates to a method for preparing thrombin using a gene recombination technique, and more particularly, to an efficient recovery and re-rolling step from an inclusion body (inclusion body) of human prethrombin expressed from transformed E. coli. And a method for preparing human thrombin.
【０００２】トロンビンは、トリプシンファミリーに属
する凝固因子群の一つで、様々な基質と相互作用し、凝
固(procoagulant)、抗凝固(anticoagulant)的に作用す
る多様な機能を有するセリンプロテアーゼである。凝固
の場では、最終的にトロンビンがフィブリノーゲンを限
定分解し(その際フィブリノーゲンＡα、Ｂβ鎖中のＡ
ｒｇ−Ｇｌｙ間の結合を切断し、フィブリノペプチド(F
ibrinopeptide)Ａ及びＢを遊離する)、これにより、フ
ィブリンモノマーはポリマー化し、さらに、トロンビン
によって活性化されたトランスグルタミナーゼ(trasglu
taminase)である血液凝固第ＸＩＩＩａ因子によって架
橋され、ポリマー化したフィブリン凝塊は安定化され
る。また、トロンビンはこの他に、血液凝固第Ｖ因子、
ＶＩＩＩ因子、ＸＩ因子をフィードバック的に活性化す
る。さらに、トロンビンは、血管内皮細胞表面蛋白質(e
ndothelial cell surface protein)であるトロンボモジ
ュリン(thrombomodulin)と複合体を形成することで、th
rombin-activatable fibrinolysis inhibitor(ＴＡＦ
Ｉ)あるいは、抗凝固性のプロテインＣ(protein Ｃ)を
活性化する。そして、さらには血小板上のトロンビンレ
セプターを活性化することで、血小板凝集を惹き起こす
ことが知られている。このトロンビン活性は、アンチト
ロンビン(antithrombin) III、ヘパリンコファクター(h
eparin cofactor)II などのいくつかのセリンプロテア
ーゼインヒビターによって、制御されている。[0002] Thrombin is one of a group of coagulation factors belonging to the trypsin family and is a serine protease having various functions that interacts with various substrates and acts as a procoagulant and anticoagulant. In the case of coagulation, thrombin eventually degrades fibrinogen to a limited extent (the fibrinogen Aα, A in the Bβ chain).
The bond between rg-Gly is cleaved and the fibrinopeptide (F
ibrinopeptide) to release A and B), whereby the fibrin monomer is polymerized and transglutaminase (trasglu
The coagulation factor XIIIa, which is a coagulation factor, is stabilized by the coagulation factor XIIIa. In addition, thrombin also has blood coagulation factor V,
Factors VIII and XI are activated in a feedback manner. In addition, thrombin is a vascular endothelial cell surface protein (e
ndothelial cell surface protein) by forming a complex with thrombomodulin,
rombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAF
I) Alternatively, activates anticoagulant protein C (protein C). Further, it is known that platelet aggregation is caused by activating the thrombin receptor on platelets. This thrombin activity is determined by antithrombin III, heparin cofactor (h
It is regulated by several serine protease inhibitors such as eparin cofactor) II.
【０００３】ヒトトロンビンは、生体内では、もともと
５７９アミノ酸残基からなるビタミンＫ依存性の一本鎖
糖蛋白質であるプロトロンビンとして存在する。このプ
ロトロンビンは、Ａｓｎ７８,１００,３７３にＮ-link
糖鎖を有し、γ−カルボキシグルタミン酸(Ｇｌａ)ドメ
イン(領域)、二つのクリングルドメインおよびプロテア
ーゼドメイン(領域)からなる分子量７２,０００のセリ
ンプロテアーゼ前駆体で、主に肝臓で合成され血液中に
分泌される。血液凝固カスケードが作動するとプロトロ
ンビンはプロトロンビナーゼ(血液凝固Ｘａ因子、Ｖａ
因子、リン脂質及びＣａ２＋からなる複合体)により、
Ａｒｇ２７１−Ｔｈｒ２７２およびＡｒｇ３２０−Ｉｌ
ｅ３２１の二カ所が限定分解され、最終的に一本のジス
ルフィド結合でつながった３０８アミノ酸残基からなる
二本鎖(Ｔｈｒ２７２からＡｒｇ３２０までの４９アミ
ノ酸残基からなるＡ鎖と、Ｉｌｅ３２１からＧｌｕ５７
９までの２５９アミノ酸残基からなるＢ鎖)のαトロン
ビンを生成する。[0003] Human thrombin originally exists in vivo as prothrombin, a vitamin K-dependent single-chain glycoprotein consisting of 579 amino acid residues. This prothrombin is N-link to Asn78,100,373.
It has a sugar chain and is a serine protease precursor with a molecular weight of 72,000 consisting of a γ-carboxyglutamic acid (Gla) domain (region), two kringle domains and a protease domain (region). Secreted. When the blood coagulation cascade is activated, prothrombin becomes prothrombinase (coagulation factor Xa, Va
Complex consisting of factor, phospholipid and Ca 2+ )
Arg271-Thr272 and Arg320-Il
Two sites of e321 were limited and finally a double chain consisting of 308 amino acid residues linked by one disulfide bond (A chain consisting of 49 amino acid residues from Thr272 to Arg320, and Ile321 to Glu57
Α-thrombin of up to 9 259 amino acid residues (B chain).
【０００４】上述の多様な機能を有するトロンビンは医
薬品として製剤化され、止血剤、そして生体組織接着剤
のコンポーネントとして広く用いられている。αトロン
ビン製剤は、現在は、そのコストの安価さなどからウシ
血漿由来のものが通常経口医薬品として用いられている
が、アナフィラキシーの問題などが報告されている。ま
た、ヒト血漿由来のものもあるが、病原性の夾雑ウイル
スの問題等その安全性においては、格段の対処を必要と
する。一方で安価で安定的に遺伝子組換え品が調製でき
ることが望まれている。[0004] Thrombin having various functions as described above is formulated as a pharmaceutical, and is widely used as a hemostatic agent and a component of a biological tissue adhesive. Currently, bovine plasma-derived α-thrombin preparations are usually used as oral pharmaceuticals due to their low cost, but problems such as anaphylaxis have been reported. In addition, some of them are derived from human plasma, but the safety of them, such as the problem of pathogenic contaminating viruses, requires considerable measures. On the other hand, it is desired that a genetically modified product can be stably prepared at low cost.
【０００５】プレトロンビンは、プロトロンビンのＧｌ
ａ領域及びクリングル１(Ｋ１)領域が欠失した分子形態
を言い、その中の１分子態様であるプレトロンビン−２
は、プロトロンビンの最初のＡｒｇ２７１−Ｔｈｒ２７
２のみが切断された一本鎖のＡ、Ｂ鎖に相当するもの
で、一カ所の糖鎖付加サイト(Ａｓｎ３７３)と分子内に
合計４組のジスルフィド結合を持つ(Ａ鎖とＢ鎖をつな
ぐＣｙｓ２９３−Ｃｙｓ４３９、Ｂ鎖内のＣｙｓ３４８
−Ｃｙｓ３６４、Ｃｙｓ４９３−Ｃｙｓ５０７及びＣｙ
ｓ５２１−Ｃｙｓ５５１)。一カ所の付加された糖鎖
は、生物活性には大きな影響を及ぼさないことが大腸菌
を宿主としたウシ由来トロンビンで報告されている(Ｄ
ｉＢｅｌｌａら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ２７０:１６
３−１６９(１９９５))。従って、上記知見より、大腸
菌を宿主として簡便に安価に、ヒトαトロンビンの前駆
物質としてのヒトプレトロンビンを調製することができ
れば、有用なヒトαトロンビン製剤を供し得ることが期
待される。[0005] Prethrombin is Gl of prothrombin.
a region and the kringle 1 (K1) region are deleted.
Is the first Arg271-Thr27 of prothrombin
2 corresponds to single-chain A and B chains that have been cleaved, and has a total of four disulfide bonds in the molecule with one glycosylation site (Asn373) (connects the A and B chains) Cys293-Cys439, Cys348 in the B chain
-Cys364, Cys493-Cys507 and Cy
s521-Cys551). It has been reported that thrombin derived from cattle using Escherichia coli as a host does not significantly affect the biological activity of a single added sugar chain (D.
iBella et al., J. Biol. Chem. 270: 16.
3-169 (1995)). Therefore, based on the above findings, if human prethrombin as a precursor of human α-thrombin can be prepared simply and inexpensively using Escherichia coli as a host, it is expected that a useful human α-thrombin preparation can be provided.
【０００６】しかし、大腸菌を宿主として外来性の遺伝
子産物を大量に発現させた場合、インクルージョンボデ
ィ(封入体)を形成することが多く、リフォールディング
(まき直し)が重要なステップとなる。大腸菌で発現させ
たヒトプレトロンビンのリフォールディングは困難であ
ることが報告されており、(Ｃｈｏｉら、ｋｏｒｅａｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ. ２２:１５４−１６０(１９８９)、
Ｓｏら、ｋｏｒｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ. ２５:６０
−６５(１９９２))、得られた蛋白質の性状解析まで実
施された報告はない。通常、蛋白質を還元後リフォール
ディングする際には、ジスルフィド結合の数が多ければ
多いほど、ジスルフィド結合が再形成される確率は低く
なる。プレトロンビンのリフォールディングに関して
は、今までウシプレトロンビン−２に関して、スルホ化
を利用した報告があるのみであるが(ＤｉＢｅｌｌａ
ら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ２７０:１６３−１６９(１
９９５))、本願発明者が当該報告に準じてヒトプレトロ
ンビン−２のリフォールディングを試みたところ、理由
はなお不明であるが、効率は低かった。そこでこのスル
ホ化によるまき直しを経ずに、簡便に効率良くまき直し
のできる方法を追求することを本願発明の技術的課題と
した。However, when a large amount of exogenous gene products are expressed using Escherichia coli as a host, an inclusion body (inclusion body) is often formed and refolding occurs.
(Rerolling) is an important step. Refolding of human prethrombin expressed in E. coli has been reported to be difficult (Choi et al., Korean).
Biochem. J. 22: 154-160 (1989),
So et al., Korean Biochem. J. 25:60.
-65 (1992)), there is no report that has been performed up to the characterization of the obtained protein. Generally, when refolding a protein after reduction, the greater the number of disulfide bonds, the lower the probability that disulfide bonds will be reformed. Regarding refolding of prethrombin, only bovine prethrombin-2 has so far been reported using sulfonation (DiBella).
J. Biol. Chem. 270: 163-169 (1
995)), when the present inventor tried to refold human prethrombin-2 according to the report, the reason was still unknown, but the efficiency was low. Therefore, an object of the present invention is to pursue a method that allows simple and efficient rerolling without the rerolling due to sulfonation.
【０００７】[0007]
【問題を解決するための手段、発明の構成】本願発明の
組換え産物の対象物質としての組換えプレトロンビン
は、封入体内で強く凝集しており、その殆どが不活性で
アンフォールドな状態と考えられた。一般に、封入体を
可溶化して活性をもった蛋白質を得るには、リフォール
ディングプロセスが必要になる。しかし、このプロセス
においては、天然状態への巻戻りと競合して分子間の重
合が起こる。従って、効率の良いリフォールディングを
行うには、分子間凝集を抑制し、分子内の巻戻りを優先
させるための条件検討が必要で、この条件は対象たる蛋
白質毎に異なる。そのため、可溶化・リフォールディン
グの最適な条件決定までには様々な試行錯誤を要する。[Means for Solving the Problems, Constitution of the Invention] Recombinant prethrombin as a target substance of the recombinant product of the present invention is strongly aggregated in the inclusion body, and most of it is in an inactive and unfolded state. it was thought. Generally, a refolding process is required to solubilize inclusion bodies to obtain active proteins. However, in this process, intermolecular polymerization occurs in competition with the reversion to the natural state. Therefore, in order to perform efficient refolding, it is necessary to examine conditions for suppressing intermolecular aggregation and giving priority to unwinding within a molecule, and these conditions differ for each target protein. Therefore, it takes various trial and error to determine the optimal conditions for solubilization and refolding.
【０００８】本願発明者等は、上記課題を達成するため
鋭意研究した結果、封入体の可溶化からリフォールディ
ングまでの工程に関し、1)封入体の可溶化バッファーへ
の懸濁、2)超音波処理による可溶化、3)リフォールディ
ングバッファーへの希釈を基本構成とする簡便且つ効率
的な方法を見出し、本願発明を完成するに至った。The inventors of the present application have conducted intensive studies to achieve the above object. As a result, regarding the steps from solubilization of the inclusion body to refolding, 1) suspension of the inclusion body in the solubilization buffer, 2) ultrasonic wave The inventors have found a simple and efficient method based on solubilization by treatment and 3) dilution into a refolding buffer, and have completed the present invention.
【０００９】本願発明においては、蛋白質の発現効率等
を考慮し、大腸菌を宿主としてプレトロンビン、中でも
好適な実施態様としてプレトロンビン−２を発現させ、
宿主細胞の培養、前記封入体の回収、可溶化、リフォー
ルディングを経て回収されるプレトロンビンをエカリン
等の活性化剤によって活性化させ、所望のヒトトロンビ
ンを調製する態様を採る。以下、その概要を記す。In the present invention, in consideration of protein expression efficiency and the like, prethrombin is expressed using Escherichia coli as a host, and in particular, prethrombin-2 is expressed in a preferred embodiment.
Prethrombin recovered through culture of host cells, recovery of the inclusion body, solubilization, and refolding is activated by an activating agent such as ecarin to prepare a desired human thrombin. The outline is described below.
【００１０】プレトロンビンを産生する組換え形質転換
大腸菌の作製は、今や常法と化した遺伝子組換え技術を
適用し得る。即ち、ヒト肝臓より例えば、配列表及び表
１（プラスミド構築に用いたプライマー）に記載の既知
のプライマーを用いたＰＣＲを実施してプロトロンビン
遺伝子を単離し、さらにプレトロンビン遺伝子を増幅さ
せる。増幅されたプレトロンビン遺伝子を好適なプロモ
ーターを有する発現プラスミドに挿入し、当該発現プラ
スミドを宿主大腸菌、例えばＪＭ１０９に導入し、ヒト
プレトロンビンを発現し得る形質転換体を作製する。形
質転換された前記大腸菌を培養し、培養後４℃の条件
下、遠心機にて集菌する。For the production of recombinant transformed Escherichia coli which produces prethrombin, a genetic recombination technique which has become a standard method can be applied. That is, for example, the prothrombin gene is isolated from human liver by performing PCR using known primers described in the Sequence Listing and Table 1 (primers used for plasmid construction), and the prethrombin gene is further amplified. The amplified prethrombin gene is inserted into an expression plasmid having a suitable promoter, and the expression plasmid is introduced into host Escherichia coli, for example, JM109, to prepare a transformant capable of expressing human prethrombin. The transformed Escherichia coli is cultured, and after the culture, the cells are collected by a centrifuge at 4 ° C.
【表１】 [Table 1]
【００１１】集菌した大腸菌ペレットを蒸留水にて再懸
濁し、リゾチームを添加して静置後菌体を破砕する。そ
して、さらに超音波処理後、遠心機にて遠心分離しペレ
ットを回収し、これをバッファー、(例えば５０ｍＭト
リス、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、ｐ
Ｈ８.０)にて再懸濁する。遠心分離、超音波処理、再懸
濁操作を数回繰り返したのち、ペレットを蒸留水に再懸
濁し、同様に遠心分離、超音波処理、再懸濁操作を数回
繰り返し、インクルージョンボディーを回収する。回収
されたインクルージョンボディーは、可溶化バッファー
によって可溶化される。可溶化バッファーは、１０ｍＭ
〜１００ｍＭ好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭのシステイ
ン、グルタチオン(ＧＳＨ)、ヂチオスレイトール(ＤＴ
Ｔ)及び２−メルカプトエタノール(２ＭＥ)より選択さ
れる還元剤並びに４Ｍ〜８Ｍの尿素もしくは２Ｍ〜６Ｍ
のグアニジン塩酸塩の変性剤を含有し、ｐＨ７〜１１で
ある。好適には、２３ｍＭ 酢酸アンモニウム、８Ｍ 尿
素(もしくは６Ｍグアニジン塩酸塩)、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、及び３０ｍＭ システイン、ｐＨ９.５の組成が例示
される。当該可溶化バッファーにインクルージョンボデ
ィー重量１０ｍｇ/ｍｌ(蛋白含量でおよそ２ｍｇ/ｍｌ)
となるように再懸濁後、超音波処理またはポリトロンで
例示される物理的せん断力を利用した破砕処理を行い、
室温にて振とうする。The collected E. coli pellet is resuspended in distilled water, and lysozyme is added thereto. Then, after further sonication, the pellet was collected by centrifugation using a centrifuge, and the pellet was collected in a buffer (for example, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1% Triton X-100, p
H8.0). After repeating centrifugation, sonication, and resuspension several times, the pellet is resuspended in distilled water, and centrifugation, sonication, and resuspension are repeated several times to collect the inclusion body. . The collected inclusion body is solubilized by the solubilization buffer. Solubilization buffer is 10 mM
Cysteine, glutathione (GSH), dithiothreitol (DT
T) and a reducing agent selected from 2-mercaptoethanol (2ME) and 4M to 8M urea or 2M to 6M
Guanidine hydrochloride denaturant, pH 7-11. Preferably, 23 mM ammonium acetate, 8 M urea (or 6 M guanidine hydrochloride), 10 mM EDT
A, and a composition of 30 mM cysteine, pH 9.5 are exemplified. Inclusion body weight 10 mg / ml (about 2 mg / ml in protein content) in the solubilization buffer
After resuspension to become, crushing treatment using physical shear force exemplified by sonication or Polytron,
Shake at room temperature.
【００１２】その後、遠心処理し、上清を０.４５μｍ
のメンブレンフィルターにて濾過する。そして、濾液を
含有蛋白質終濃度５０〜１００μｇ/ｍｌとなるよう
に、徐々にリフォールディングバッファーへ撹拌しなが
ら希釈する。ここで、本願発明のリフォールディングバ
ッファーは、０.３Ｍ以上好ましくは０.５Ｍ以上のアル
ギニン、０.３Ｍ以上好ましくは０.５Ｍ以上の塩化ナト
リウム、１％〜５０％好ましくは５％〜２０％のグリセ
ロール及び０.０１％以上の非イオン性界面活性剤を含
有することを特徴とし、好適な例として、５０ｍＭトリ
ス、２０ｍＭ塩化カルシウム、５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６００ｍＭアルギニン、１ｍＭ
システイン、０.１ｍＭシスチン、１０％グリセロール
および０.２％Ｂｒｉｊ−５８、ｐＨ８.５が推奨され
る。なお、非イオン性界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ
系、Ｂｒｉｊ系及びトリトン(Ｔｒｉｔｏｎ)系のもの等
が使用され得る。また、本願発明のリフォールディング
バッファーを使用する限り、まき直しの希釈操作におけ
る温度は特段留意する必要はない。即ち、４℃あるいは
室温下のいずれにおいても好ましい結果を得ることがで
きる。希釈終了からさらに一晩で撹拌し、まき直しを進
行させる。After that, the mixture was centrifuged, and the supernatant was collected at 0.45 μm.
Filter with a membrane filter. Then, the filtrate is gradually diluted with stirring into a refolding buffer so that the final concentration of the contained protein becomes 50 to 100 μg / ml. Here, the refolding buffer of the present invention comprises 0.3 M or more, preferably 0.5 M or more arginine, 0.3 M or more, preferably 0.5 M or more sodium chloride, 1% to 50%, preferably 5% to 20%. Glycerol and 0.01% or more of a nonionic surfactant. Preferred examples include 50 mM Tris, 20 mM calcium chloride, 500 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 600 mM arginine, 1 mM
Cysteine, 0.1 mM cystine, 10% glycerol and 0.2% Brij-58, pH 8.5 are recommended. In addition, as a nonionic surfactant, Tween
System, Brij system, Triton system and the like can be used. Further, as long as the refolding buffer of the present invention is used, it is not necessary to pay particular attention to the temperature in the re-dilution operation. That is, favorable results can be obtained at 4 ° C. or at room temperature. The mixture is further stirred overnight after completion of the dilution, and re-rolling is advanced.
【００１３】まき直しが完了した溶液より、透析により
変性剤を除去し、その後イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の手段により
所望のヒトプレトロンビンを精製する。精製されたヒト
プレトロンビンは好適な活性剤、例えば蛇毒エカリン等
によりトロンビンに変換され、その後、アフィニティー
クロマトグラフィー等の手段により精製ヒトトロンビン
として得ることができる。From the solution after re-rolling, the denaturing agent is removed by dialysis, and then the desired human prethrombin is purified by means such as ion exchange chromatography and affinity chromatography. Purified human prethrombin can be converted to thrombin with a suitable activator, for example, snake venom ecarin, and then obtained as purified human thrombin by means such as affinity chromatography.
【００１４】本願発明の、とりわけ大腸菌によって発現
されるプレトロンビンのリフォールディング工程に特長
を有する大腸菌を宿主とした遺伝子組換えヒトトロンビ
ンの作製方法は、リフォールディング効率４〜５％、精
製後最終収率０.５〜１％(大腸菌培養１リットル当たり
０.５〜１ｍｇに相当)であり、従来報告されたトロンビ
ンのリフォールディング法を含む方法に比較して、収率
において同等以上であり、簡便さの点で従来法をはるか
に凌駕するものであった。また、本願発明に基づいて調
製された組換えトロンビンの物理化学的性状は、プラズ
マ由来のものに比較して糖鎖付加の有無を除き同等であ
り、酵素学的性状についても種々の基質に対して同等で
あった。かくして、本願発明によって、従来のウシ血液
またはヒト血漿に由来するトロンビン製剤に代替し得る
所望の組換えトロンビン製剤をもたらすことができる。The method of producing recombinant human thrombin using Escherichia coli as a host, which has a feature in the prefolding step of prethrombin expressed by Escherichia coli, in particular, has a refolding efficiency of 4 to 5% and a final yield after purification. 0.5 to 1% (equivalent to 0.5 to 1 mg per liter of Escherichia coli culture), and the yield is equal to or higher than that of the method including the thrombin refolding method reported previously. It far exceeded the conventional method in point. In addition, the physicochemical properties of the recombinant thrombin prepared based on the present invention are the same as those derived from plasma except for the presence or absence of glycosylation, and the enzymatic properties of various types of substrates And were equivalent. Thus, the present invention can provide a desired recombinant thrombin preparation which can replace the conventional thrombin preparation derived from bovine blood or human plasma.
【００１５】以下に、実施例を用いて本願発明を詳説す
るが、本願発明は当該実施例に何等限定されるものでは
ない。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
【００１６】[0016]
【実施例】実施例１ (プラスミドの構築と形質転換大腸菌の作製)以下に記載
の遺伝子組換え技術の一般的方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ)に従った。人肝臓ＲＮＡよりＰＴ１とＰＴ
２プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりプロトロンビ
ン遺伝子を単離した。そのＰＣＲ断片からさらにＰＴ３
とＰＴ４プライマーを用いてプレトロンビン遺伝子を増
幅させ、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIにより消化し
た。発現プラスミドはｐＵＣ１８(宝酒造)の複製開始点
を含む領域をｐＫＫ２３３−２(ファルマシア)に導入し
ｐＵＴ１を構築した。ｐＵＣ１８のＰｖｕIIサイトにＥ
ｃｏＲＩリンカーによりＥｃｏＲＩ部位を導入した。そ
のプラスミドからＥｃｏＲＩ/ＰｖｕＩ断片を単離し、
ｐＫＫ２３３−２のＥｃｏＲＩ/ＰｖｕＩ部位に挿入
し、ｐＵＴ１を構築した。その発現プラスミドｐＵＴ１
のｐｔｒｃプロモーター下流のクローニングサイト(Ｎ
ｃｏＩ, ＨｉｎｄIII部位)にＮｃｏＩとＨｉｎｄIII部
位を両端に持つプレトロンビン−２遺伝子断片を挿入し
ｐＵＴＢを構築した。上記、プラスミドの構築に係る一
連の流れを図１に示した。そのプラスミドｐＵＴＢを大
腸菌ＪＭ１０９に導入し、ヒトプレトロンビンを発現し
得る形質転換体を作製した。EXAMPLES Example 1 (Construction of plasmid and preparation of transformed Escherichia coli) The general method of the genetic recombination technique described below is Molecular
Cloning (Cold Spring Harbor)
Press). PT1 and PT from human liver RNA
The prothrombin gene was isolated by RT-PCR using two primers. From the PCR fragment further PT3
And a PT4 primer to amplify the prethrombin gene, and digested with restriction enzymes NcoI and HindIII. For the expression plasmid, a region containing the replication origin of pUC18 (Takara Shuzo) was introduced into pKK233-2 (Pharmacia) to construct pUT1. E on the PvuII site of pUC18
An EcoRI site was introduced by a coRI linker. Isolating the EcoRI / PvuI fragment from the plasmid,
It was inserted into the EcoRI / PvuI site of pKK233-2 to construct pUT1. Its expression plasmid pUT1
Cloning site downstream of the ptrc promoter (N
Then, a prethrombin-2 gene fragment having NcoI and HindIII sites at both ends was inserted into the (coI, HindIII site) to construct pUTB. FIG. 1 shows a series of flows relating to the construction of the plasmid. The plasmid pUTB was introduced into Escherichia coli JM109 to prepare a transformant capable of expressing human prethrombin.
【００１７】大腸菌の培養 ヒトプレトロンビン−２の遺伝子を含む発現プラスミド
を導入した宿主大腸菌を５０μｇ/ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ培地２００ｍｌ中に３０℃で一晩前培養し、
それを８リットルのＬＢ培地を含むファーメンターに播
種し、６００ｎｍの濁度が０.２〜０.５になるまで３０
℃にて培養した。その後、終濃度１ｍＭとなるようにイ
ソプロピル−1−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを
添加して、さらに一晩培養し、ヒトプレトロンビン−２
の発現を誘導した。そして、培養した大腸菌を３０分４
℃の条件下、遠心機にて集菌した。Culture of Escherichia coli A host Escherichia coli transfected with an expression plasmid containing the gene for human prethrombin-2 was pre-cultured overnight at 30 ° C. in 200 ml of LB medium containing 50 μg / ml of ampicillin.
It was inoculated into a fermenter containing 8 liters of LB medium, and the turbidity at 600 nm was increased to 30 to 30% until the turbidity became 0.2 to 0.5.
The cells were cultured at ℃. Thereafter, isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside was added to a final concentration of 1 mM, and the mixture was further cultured overnight.
Was induced. Then, the cultured E. coli was transformed for 30 minutes 4
The cells were collected with a centrifuge under the condition of ° C.
【００１８】実施例２ (インクルージョンボディーの回収、可溶化及びそれか
らのまき直し)集菌した大腸菌ペレットを蒸留水にて再
懸濁し、終濃度０.６ｍｇ/ｍｌのリゾチームを添加し
て、室温下３０分撹拌後、一晩４℃に静置し、菌体を破
砕した。そして、さらに超音波処理後、遠心機にて(２
０分４℃)遠心分離しペレットを回収し、これをバッフ
ァー(５０ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％ トリト
ンＸ−１００、ｐＨ８.０)にて再懸濁した。この遠心分
離、超音波処理、再懸濁操作を数回繰り返したのち、ペ
レットを蒸留水に再懸濁し、同様に遠心分離、超音波処
理、再懸濁操作を数回繰り返し、インクルージョンボデ
ィーを回収した。Example 2 (Recovery, solubilization and re-rolling of the inclusion body) The harvested E. coli pellet was resuspended in distilled water, and lysozyme having a final concentration of 0.6 mg / ml was added thereto. After stirring for 30 minutes, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight to crush the cells. And after further sonication, (2
The pellet was collected by centrifugation (0 min, 4 ° C) and resuspended in a buffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1% Triton X-100, pH 8.0). After repeating the centrifugation, sonication, and resuspension operations several times, the pellet is resuspended in distilled water, and the same centrifugation, sonication, and resuspension operations are repeated several times to collect the inclusion body. did.
【００１９】インクルージョンボディーは、バッファー
(２３ｍＭ 酢酸アンモニウム、８Ｍ尿素(もしくは６Ｍ
グアニジン塩酸塩)、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び３０ｍＭ
システイン、ｐＨ９.５)にインクルージョンボディー
重量１０ｍｇ/ｍｌ(蛋白含量でおよそ２ｍｇ/ｍｌ)とな
るように再懸濁後、超音波処理して、室温にて２時間振
とうした。その後、１０,０００×ｇにて１０分間遠心
し、上清を０.４５μｍのメンブレンフィルターにて濾
過した。そして、濾液を含有蛋白質終濃度５０〜１００
μｇ/ｍｌとなるように、徐々にバッファー(５０ｍＭト
リス、２０ｍＭ塩化カルシウム、５００ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６００ｍＭアルギニン、１ｍ
Ｍシステイン、０.１ｍＭシスチン、１０％グリセロー
ルおよび０.２％Ｂｒｉｊ−５８、ｐＨ８.５)へ撹拌し
ながら室温で希釈した。希釈終了からさらに一晩室温で
撹拌し、まき直しを進行させた。The inclusion body includes a buffer.
(23 mM ammonium acetate, 8 M urea (or 6 M
Guanidine hydrochloride), 10 mM EDTA, and 30 mM
The suspension was resuspended in cysteine (pH 9.5) to an inclusion body weight of 10 mg / ml (about 2 mg / ml in protein content), sonicated, and shaken at room temperature for 2 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes, and the supernatant was filtered with a 0.45 μm membrane filter. Then, the filtrate contains the final protein concentration of 50-100.
Buffer (50 mM Tris, 20 mM calcium chloride, 500 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 600 mM arginine, 1 mM
M cysteine, 0.1 mM cystine, 10% glycerol and 0.2% Brij-58, pH 8.5) with stirring at room temperature. After the completion of the dilution, the mixture was further stirred overnight at room temperature, and rerolling was allowed to proceed.
【００２０】実施例３ まき直し蛋白質の精製 まき直した溶液は２０ｍＭクエン酸バッファー(ｐＨ５.
５)に対して、４℃で１〜２日透析し、変性剤を除去し
た。この時生じた沈殿を０.４５μｍメンブレンフィル
ターで濾過し、除去後、濾液をＳＰ−セファロース陽イ
オン交換クロマトグラフィーに供した。その後、０〜１
Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸バッファー
の直線的な勾配により溶出し、活性のある画分を集め
た。引き続き、集めた画分を透析もしくは希釈等によ
り、塩濃度を生理的条件に近いレベルまで下げ、ｐＨを
中性(７〜８付近)に上げた後、トロンビン特異的インヒ
ビターであるヒルジンのＣ末端１２残基からなるペプチ
ドを固定化したアフィニティークロマトグラフィー(下
記参照)に供した。その後、０〜１Ｍの塩化ナトリウム
を含む５０ｍＭトリス、ｐＨ７.６バッファーを用いて
直線的な勾配により溶出し、活性のある画分を集めた。Example 3 Purification of re-wound protein The re-wound solution was a 20 mM citrate buffer (pH 5.
5) was dialyzed at 4 ° C for 1 to 2 days to remove the denaturant. The precipitate formed at this time was filtered through a 0.45 μm membrane filter, and after removal, the filtrate was subjected to SP-Sepharose cation exchange chromatography. Then, 0-1
The active fractions were eluted with a linear gradient of 20 mM citrate buffer containing M sodium chloride. Subsequently, the collected fractions were subjected to dialysis or dilution to lower the salt concentration to a level close to physiological conditions, raise the pH to neutral (around 7 to 8), and then to the C-terminus of hirudin, a thrombin-specific inhibitor. The peptide consisting of 12 residues was subjected to immobilized affinity chromatography (see below). Thereafter, elution was performed with a linear gradient using 50 mM Tris, pH 7.6 buffer containing 0 to 1 M sodium chloride, and the active fraction was collected.
【００２１】ヒルジンＣ末端領域ペプチド固定化アフィ
ニティーカラムの調製 ヒルジンＣ末端領域のアミノ酸１２残基(アミノ酸配
列；ＧＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＱ)を、ペプチド自動合成
装置(Applied Biosystems Peptide Synthesyzer)を用い
て固相法で合成し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣにて精製し、
凍結乾燥した。このペプチド粉末を１ｍｇ/ｍｌとなる
ように０.２Ｍリン酸バッファー(ｐＨ８.５)にて調整
し、あらかじめ蒸留水で洗浄、乾燥したリガンド固定化
用アフィニティー担体ホルミルセルロファインに、ゲル
乾燥重量１グラムあたりペプチド溶液１.５ｍｌに懸濁
させ、室温にて一晩振とう反応した。その後、還元剤で
ある水素化ホウ素ナトリウムを７ｍｇ/ゲルｇで反応さ
せて、さらに一晩振とう反応し、蒸留水にて洗浄後、１
Ｍエタノールアミン/０.２Ｍ トリス塩酸バッファー(ｐ
Ｈ７.８)で一晩振とうした。これを、蒸留水で洗浄後、
使用するバッファーにて平衡化した。Preparation of Hirudin C-terminal Peptide-Immobilized Affinity Column Amino acid 12 residues (amino acid sequence; GDFEEIPEEYLQ) of the hirudin C-terminal region were synthesized by a solid phase method using an automatic peptide synthesizer (Applied Biosystems Peptide Synthesyzer). , Purified by C-18 reverse phase HPLC,
Lyophilized. This peptide powder was adjusted to a concentration of 1 mg / ml with a 0.2 M phosphate buffer (pH 8.5), washed with distilled water in advance, and dried, and then dried with a gel dry weight of 1 mg / ml. The peptide solution was suspended in 1.5 ml of the peptide solution per gram and shaken at room temperature overnight. Thereafter, sodium borohydride as a reducing agent was reacted at 7 mg / gel g, further shaken overnight, washed with distilled water, and washed with distilled water.
M ethanolamine / 0.2 M Tris-HCl buffer (p
H7.8). After washing this with distilled water,
Equilibrated with the buffer used.
【００２２】実施例４ 精製蛋白質の活性化 精製されたヒトプレトロンビン−２は蛇毒エカリンを用
いて以下の行程でαトロンビンへ変換した。終濃度２０
μｇ/ｍｌの精製ヒトプレトロンビン−２に、エカリン
２単位/ｍｌをバッファー(５０ｍＭ トリス、０.１％ポ
リエチレングリコール８０００、５０ｍＭベンザミジン
塩酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８.０)中で室
温下、一晩静置した。反応液を前述のヒルジンペプチド
を固定化したアフィニティークロマトグラフィーに供し
た。その後、０〜１Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ
トリスバッファー(ｐＨ７.６)を用いて、直線的な勾配
により溶出し、活性のある画分を集めた。Example 4 Activation of Purified Protein Purified human prethrombin-2 was converted to α-thrombin by the following process using snake venom ecarin. Final concentration 20
2 units / ml of ecarin was added to μg / ml of purified human prethrombin-2 in a buffer (50 mM Tris, 0.1% polyethylene glycol 8000, 50 mM benzamidine hydrochloride, 100 mM sodium chloride, pH 8.0) at room temperature. It was left still overnight. The reaction solution was subjected to affinity chromatography in which the above-mentioned hirudin peptide was immobilized. Then, 50 mM containing 0-1 M sodium chloride
Elution was carried out with a linear gradient using Tris buffer (pH 7.6), and the active fraction was collected.
【００２３】実施例５ (大腸菌由来まき直しヒト遺伝子組換えトロンビンの諸
性質) 単一性および分子量 Ｌａｅｍｍｌｉ(Ｎａｔｕｒｅ ２２７: ６８０−６８５
(１９７０)の方法に準じて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを実施し、クマジーブリリアントブルーで染色した。
まき直した遺伝子組換えヒトプレトロンビン−２は、単
一のバンドを示した。また、活性化した遺伝子組換えヒ
トαトロンビンは、活性化に伴って生じたＡ鎖とＢ鎖の
二つのバンドが確認された。さらに、これらは、ヒトプ
ラズマ由来のαトロンビンのＢ鎖内に存在するＮ−グリ
コシド結合した糖鎖を酵素的に除去したものと同等の移
動度を示したことから、ヒトプラズマ由来のαトロンビ
ンとはその分子量において糖鎖の有無の違いを有するの
みでポリペプチド鎖においては同等であることが示され
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて算出された分子量は、プレト
ロンビン−２でおよそ３６,０００、αトロンビンでＡ
鎖４,０００、Ｂ鎖が３２,０００であった(図２)。Example 5 (Properties of Escherichia coli-originated recombined human recombinant thrombin) Unity and molecular weight Laemmli (Nature 227: 680-685)
(S970) under reducing conditions according to the method of (1970).
E was performed and stained with Coomassie brilliant blue.
Re-wound recombinant human prethrombin-2 showed a single band. Further, in the activated recombinant human α-thrombin, two bands of the A chain and the B chain generated upon activation were confirmed. Furthermore, since they exhibited the same mobility as those obtained by enzymatically removing the N-glycoside-linked sugar chain present in the B chain of α-thrombin derived from human plasma, α-thrombin derived from human plasma and Has only a difference in the presence or absence of a sugar chain in its molecular weight, and is similar in a polypeptide chain. The molecular weight calculated by SDS-PAGE was approximately 36,000 for prethrombin-2 and A for α-thrombin.
There were 4,000 chains and 32,000 B chains (FIG. 2).
【００２４】酵素活性 エカリンによって活性化した遺伝子組換えヒトαトロン
ビンを、ヒトプラズマ由来αトロンビン(Haematologic
Technologies Inc.より購入)とを以下に示す酵素活性に
おいて比較し、同等もしくはそれ以上の活性を有するこ
とを確認した(表２)。Enzyme activity Recombinant human α-thrombin activated by ecarin was converted to human plasma-derived α-thrombin (Haematologic).
(Purchased from Technologies Inc.) in the following enzyme activities, and it was confirmed that they had the same or higher activity (Table 2).
【表２】 [Table 2]
【００２５】1)合成発色基質(Ｓ２２３８)の切断活性に
おけるｋｃａｔ、Ｋｍの測定 プラズマ由来および遺伝子組換えαトロンビンを終濃度
０.５ｎＭ、種々の濃度の合成発色基質(Ｓ２２３８；終
濃度３から５０μＭ)を添加し、バッファー(５０ｍＭト
リス、０.１％ポリエチレングリコール８０００、０.０
１％ヒト血清アルブミン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、
ｐＨ８.０)中、３７℃で反応させ、４０５ｎｍの吸光度
の変化の初速度を測定し、得られた値からＨａｎｅｓ−
Ｗｏｏｌｆプロットにて、Ｓ２２３８に対するｋｃａ
ｔ、Ｋｍを測定し両者で比較した(表２)。1) Measurement of kcat and Km in Cleavage Activity of Synthetic Chromogenic Substrate (S2238) Plasma-derived and recombinant α-thrombin were prepared at a final concentration of 0.5 nM, and various concentrations of synthetic chromogenic substrate (S2238; final concentration of 3 to 50 μM) ) And buffer (50 mM Tris, 0.1% polyethylene glycol 8000, 0.0
1% human serum albumin, 100 mM sodium chloride,
(pH 8.0) at 37 ° C., the initial rate of change in absorbance at 405 nm was measured, and the Hanes-
In the Woolf plot, kca for S2238
t and Km were measured and compared between the two (Table 2).
【００２６】2)フィブリノペプチドＡの遊離におけるｋ
ｃａｔ/Ｋｍの測定 プラズマ由来および遺伝子組換えαトロンビンを終濃度
０.２ｎＭで、そしてヒト精製フィブリノーゲン３４０
ｎＭをバッファー(５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ 塩化ナ
トリウム、０.１％ポリエチレングリコール８０００、
ｐＨ７.５)中３７℃で反応させ、経時的に(１,２,３,
４,５,７,９,１２分)サンプリングし、終濃度０.３Ｍの
過塩素酸で反応を停止し、０.４５μｍのメンブランフ
ィルターで濾過後、濾液を逆相Ｃ１８ＨＰＬＣクロマト
グラフィーにて生じたフィブリノペプチドＡを定量し、
Ln{([FpA]f-[FpA]t)/([FpA]f-[FpA]0)}を時間に対して
プロットし(図３)、最小自乗により当てはめた直線から
得られる傾きを、用いたトロンビン濃度(０.２ｎＭ)で
除することでフィブリノペプチドＡの遊離に対するｋｃ
ａｔ/Ｋｍを測定した(表２)。2) k in the release of fibrinopeptide A
Determination of cat / Km Plasma-derived and recombinant α-thrombin were purified to a final concentration of 0.2 nM and purified human purified fibrinogen 340.
nM buffer (50 mM phosphoric acid, 100 mM sodium chloride, 0.1% polyethylene glycol 8000,
(pH 7.5) at 37 ° C, and over time (1, 2, 3,
(4, 5, 7, 9, 12 minutes) Sampled, the reaction was stopped with perchloric acid having a final concentration of 0.3 M, filtered through a 0.45 μm membrane filter, and the filtrate was subjected to reverse phase C18 HPLC chromatography. Quantifying fibrinopeptide A,
Ln {([FpA] f- [FpA] t) / ([FpA] f- [FpA] 0)} is plotted against time (FIG. 3), and the slope obtained from a straight line fitted by least squares is The kc for fibrinopeptide A release is divided by the thrombin concentration used (0.2 nM).
at / Km was measured (Table 2).
【００２７】3)グリコサミノグリカン修飾トロンボモジ
ュリン(ＧＡＧ−ＵＴＭ)との見かけの解離定数(Ｋｄａ
ｐｐ)の測定 終濃度０.５ｎＭのトロンビン溶液に対して、種々の濃
度(終濃度０.８〜５０ｎＭ)のグリコサミノグリカン修
飾トロンボモジュリン(ＧＡＧ−ＵＴＭ; Ｅｄａｎｏ
ら、Ｉｎｔ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ.,３０:７７−８８(１９８８))と基質であるプロテイ
ンＣを終濃度１μＭで添加してバッファー(５０ｍＭト
リス、０.１％ポリエチレングリコール８０００、０.０
１％ヒト血清アルブミン、５ｍＭ塩化カルシウム、１０
０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７.５)中で３７℃で９０秒
反応させ、その後トロンビン特異的インヒビターである
ヒルジンを終濃度５単位/ｍｌ添加して、反応を停止さ
せ、生じた活性化プロテインＣ(ＡＰＣ)の濃度を終濃度
１ｍＭの合成発色基質Ｓ２３６６にて定量し、Ｈａｎｅ
ｓ−Ｗｏｏｌｆプロットにより、ＧＡＧ−ＵＴＭに対す
る見かけの解離定数(Ｋｄａｐｐ)を測定した(表２)。3) Apparent dissociation constant (Kda) with glycosaminoglycan-modified thrombomodulin (GAG-UTM)
Measurement of pp) To a thrombin solution having a final concentration of 0.5 nM, various concentrations (0.8 to 50 nM) of glycosaminoglycan-modified thrombomodulin (GAG-UTM; Edano)
Et al., Int. J. Biochem. Cell Bio.
, 30: 77-88 (1988)) and protein C as a substrate at a final concentration of 1 μM, and added to a buffer (50 mM Tris, 0.1% polyethylene glycol 8000, 0.0
1% human serum albumin, 5 mM calcium chloride, 10
Reaction at 37 ° C. for 90 seconds in 0 mM sodium chloride, pH 7.5), followed by the addition of a thrombin-specific inhibitor, hirudin, at a final concentration of 5 units / ml, to terminate the reaction, and to generate activated protein C (APC). ) Was quantified using a synthetic chromogenic substrate S2366 having a final concentration of 1 mM.
The apparent dissociation constant (Kdapp) for GAG-UTM was measured by s-Woolf plot (Table 2).
【００２８】4)プロテインＣの活性化におけるｋｃａ
ｔ、Ｋｍの測定 グリコサミノグリカン修飾トロンボモジュリンの存在
下、不在下でプロテインＣの活性化に対してのｋｃａ
ｔ、Ｋｍを以下に示す方法で測定した。グリコサミノグ
リカン修飾トロンボモジュリンの存在下では、終濃度
０.５ｎＭのαトロンビンと５０ｎＭのＧＡＧ−ＵＴＭ
に対して、種々の濃度(終濃度１.２５〜２０μＭ)のプ
ロテインＣをバッファー(５０ｍＭトリス、０.１％ポリ
エチレングリコール８０００、０.０１％ヒト血清アル
ブミン、５ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化ナトリ
ウム、ｐＨ７.５)中で混合し、３７℃９０秒反応させ
て、その後トロンビン特異的インヒビターであるヒルジ
ンを終濃度５単位/ｍｌ添加して、反応を停止させ、生
じた活性化プロテインＣ(ＡＰＣ)の濃度を終濃度１ｍＭ
の低分子発色基質Ｓ２３６６にて定量し、既知量のＡＰ
Ｃを用いた検量線から一分間あたりのＡＰＣの出来高を
算出し、これを、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットに当
てはめることにより、ｋｃａｔ、Ｋｍを測定した(図
４、表２)。4) kca in protein C activation
Measurement of t, Km kca for protein C activation in the presence and absence of glycosaminoglycan modified thrombomodulin
t and Km were measured by the following methods. In the presence of glycosaminoglycan modified thrombomodulin, a final concentration of 0.5 nM α-thrombin and 50 nM GAG-UTM
With various concentrations (final concentration 1.25-20 μM) of protein C in buffer (50 mM Tris, 0.1% polyethylene glycol 8000, 0.01% human serum albumin, 5 mM calcium chloride, 100 mM sodium chloride, pH7) .5) and allowed to react at 37 ° C. for 90 seconds. Thereafter, the reaction was stopped by adding a thrombin-specific inhibitor, hirudin, at a final concentration of 5 units / ml, and the resulting activated protein C (APC) was added. The final concentration is 1 mM
And a known amount of AP
The amount of APC per minute was calculated from the calibration curve using C, and kcat and Km were measured by applying this to the Hanes-Woolf plot (FIG. 4, Table 2).
【００２９】グリコサミノグリカン修飾トロンボモジュ
リンの不在下では、終濃度５ｎＭのαトロンビンに対し
て種々の濃度(終濃度１.２５〜４０μＭ)のプロテイン
Ｃをバッファー(５０ｍＭトリス、０.１％ポリエチレン
グリコール８０００、０.０１％ヒト血清アルブミン、
１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７.５)中で混合し、３
７℃１５分反応させて、その後トロンビン特異的インヒ
ビターであるヒルジンを終濃度５単位/ｍｌ添加して、
反応を停止させ、生じた活性化プロテインＣ(ＡＰＣ)の
濃度を終濃度１ｍＭの低分子発色基質Ｓ２３６６にて定
量し、既知量のＡＰＣを用いた検量線から一分間あたり
のＡＰＣの出来高を算出し、これを、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏ
ｏｌｆプロットに当てはめることにより、ｋｃａｔ、Ｋ
ｍを測定した(図４、表２)。In the absence of glycosaminoglycan-modified thrombomodulin, various concentrations (final concentration of 1.25-40 μM) of protein C were added to a buffer (50 mM Tris, 0.1% polyethylene glycol) against α-thrombin at a final concentration of 5 nM. 8000, 0.01% human serum albumin,
Mix in 100 mM sodium chloride, pH 7.5) and mix
After reacting at 7 ° C. for 15 minutes, a thrombin-specific inhibitor, hirudin, was added at a final concentration of 5 units / ml.
The reaction is stopped, and the concentration of the activated protein C (APC) generated is quantified using a low-molecular-weight chromogenic substrate S2366 having a final concentration of 1 mM, and the amount of APC per minute is calculated from a calibration curve using a known amount of APC. And this, Hanes-Wo
kcat, K
m was measured (FIG. 4, Table 2).
【００３０】5)阻害剤アンチトロンビンIII(ATIII)との
反応における二次速度定数の測定 この測定は、擬一次反応の条件下、ヘパリン不在下で行
った。阻害反応は終濃度５ｎＭのαトロンビンに対し
て、種々の濃度のアンチトロンビンIII(終濃度100ｎＭ
〜１.７μＭ)を添加して、経時的に残存トロンビン量を
合成発色基質Ｓ２２３８を終濃度４００μＭ添加するこ
とで定量した。各アンチトロンビンIII濃度における経
時的な残存活性と時間をプロットしたグラフの傾きか
ら、その濃度における擬一次反応速度定数を算出し(図
５ａ)、続いて、各濃度での求まった擬一次反応速度定
数をアンチトロンビンIII濃度に対してプロットしたグ
ラフの傾きから阻害剤アンチトロンビンIIIに対する二
次速度定数を決定した(図５ｂ、表２)。5) Measurement of second-order rate constant in reaction with inhibitor antithrombin III (ATIII) This measurement was performed in the absence of heparin under conditions of pseudo first-order reaction. Inhibition reaction was carried out against various concentrations of antithrombin III (final concentration of 100 nM) against αthrombin at a final concentration of 5 nM
１1.7 μM) and the amount of residual thrombin over time was quantified by adding the synthetic chromogenic substrate S2238 to a final concentration of 400 μM. The pseudo-first-order reaction rate constant at each concentration was calculated from the slope of a graph plotting the residual activity and time at each concentration of antithrombin III over time (FIG. 5a). The second order rate constant for the inhibitor antithrombin III was determined from the slope of the graph plotting the constant against the antithrombin III concentration (FIG. 5b, Table 2).
【００３１】6)トロンビン欠乏血漿を用いた凝固時間の
測定 あらかじめキュベット内で３７℃に加温しておいたヒト
トロンビン欠乏血漿１００μｌに対して、６〜１８ｎＭ
のαトロンビン溶液をバッファー(５０ｍＭトリス、０.
１％ポリエチレングリコール８０００、０.０１％ヒト
血清アルブミン、１００ｍＭM塩化ナトリウム、ｐＨ７.
５)で希釈調製したものを２００μｌ添加して、凝固反
応を開始させ、フィブリンタイマーで凝固時間を測定し
た(図６)。凝固時間をαトロンビン濃度に対してプロッ
トしたグラフから、プラズマ由来のものと遺伝子組換え
体との活性の相対比較を行った(表２)。6) Measurement of Coagulation Time Using Thrombin-Deficient Plasma 6 to 18 nM with respect to 100 μl of human thrombin-deficient plasma previously heated to 37 ° C. in a cuvette.
A thrombin solution in buffer (50 mM Tris, 0.
1% polyethylene glycol 8000, 0.01% human serum albumin, 100 mM sodium chloride, pH 7.
The coagulation reaction was started by adding 200 μl of the dilution prepared in 5), and the coagulation time was measured with a fibrin timer (FIG. 6). From a graph in which the clotting time was plotted against the α-thrombin concentration, the relative activities of those derived from plasma and the recombinants were compared (Table 2).
【００３２】7)血小板凝集能の測定 洗浄血小板を健常人全血より調製し、１.３×１０８血
小板/ｍｌとなるよう０.３５％ヒト血清アルブミンを含
むＴｙｒｏｄｅ'ｓバッファー(ｐＨ７.３)にて調整し、
あらかじめ３７℃に加温したこの血小板浮遊液３００μ
ｌに対して、種々の濃度に希釈したαトロンビン(６.２
５〜５０ｎＭ)１００μｌを添加し、光の透過率の変化
をアグリゴメータにて測定した。ここで、用いた血小板
の完全凝集までの時間(光の透過が最大になり、プラト
ーを示すまでの時間)を定義し、これをαトロンビンの
終濃度に対してプロットし(図７)、その直線からプラズ
マ由来のものと遺伝子組換え体との活性を相対比較した
(表２)。7) Measurement of Platelet Aggregation Ability Washed platelets were prepared from whole blood of a healthy subject, and Tyrode's buffer (pH 7.3) containing 0.35% human serum albumin was adjusted to 1.3 × 10 8 platelets / ml. )
300 μl of this platelet suspension pre-warmed to 37 ° C.
For each l, α-thrombin diluted to various concentrations (6.2
5 to 50 nM), and the change in light transmittance was measured with an aggregometer. Here, the time until complete aggregation of the used platelets (the time until the light transmission becomes maximum and shows a plateau) was defined and plotted against the final concentration of α-thrombin (FIG. 7). The relative activities of the recombinant and those derived from the plasma from the straight line were compared.
(Table 2).
【００３３】大腸菌由来まき直しヒト遺伝子組換えトロ
ンビンの諸性質に関する考察 プラズマ由来αトロンビンと、本法により調製された組
換えαトロンビンの酵素学的性状に関して種々のアッセ
イを行った。具体的には合成低分子発色基質であるＳ２
２３８の水解活性、高分子天然基質であるフィブリノー
ゲンの切断活性及びプロテインＣの活性化並びにトロン
ビンのレセプターの一つであるトロンボモジュリンの改
変体に対する親和定数の測定、そして、天然の阻害剤で
あるアンチトロンビンIIIに対する阻害の二次速度定数
の測定、さらにはこれら素反応の複合系と想定される凝
固時間の測定及び血小板凝集能の測定を行った。その結
果、表２に示すごとく、いずれの項目においても両者で
有意な差は認められないと判断された。特に天然の基質
であるフィブリノーゲンに対するフィブリノペプチドＡ
の遊離活性及びトロンボモジュリン存在下のプロテイン
Ｃの活性化速度及びアンチトロンビンIIIによる阻害速
度定数の比較では、両者の間でその値に良い一致が認め
られた。さらには、生体内の反応に近い凝固時間の測定
及び血小板の凝集能に差がないことから、本方法で調製
されたαトロンビンは試薬としてのみならず生体内での
止血・血栓等の凝固因子製剤として有用であると結論さ
れた。Discussion on Various Properties of Recombinant Human Recombinant Thrombin Derived from Escherichia coli Various assays were performed on the enzymatic properties of plasma-derived α-thrombin and recombinant α-thrombin prepared by the present method. Specifically, a synthetic low-molecular-weight chromogenic substrate, S2
238, the activity of cleaving fibrinogen which is a high molecular weight natural substrate, the activation of protein C, the measurement of the affinity constant for a modified thrombomodulin which is one of the receptors for thrombin, and the measurement of the natural inhibitor antithrombin The second-order rate constant of inhibition of III was measured, and the coagulation time, which was assumed to be a complex system of these elementary reactions, and the platelet aggregation ability were measured. As a result, as shown in Table 2, it was determined that no significant difference was observed between any of the items. Fibrinopeptide A specifically against the natural substrate fibrinogen
A good agreement was found between the two activities in the comparison of the free activity of, the activation rate of protein C in the presence of thrombomodulin and the inhibition rate constant by antithrombin III. Furthermore, since there is no difference in the measurement of coagulation time close to the reaction in the living body and the aggregation ability of platelets, α-thrombin prepared by this method can be used not only as a reagent but also as a coagulation factor such as hemostasis and thrombus in vivo. It was concluded that it was useful as a formulation.
【配列表】SEQUENCE LISTING<110>JURIDICAL FOUNDATI
ON THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE<1
20>Method for preparing yeast-derived recombinant
thorombin<130>JP401YS<160>5<210>1<211>30<212>DNA<2
13>Human<400>1atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct<210
>2<211>29<212>DNA<213>Human<400>2ctactctcca aactga
tcaa tgaccttct<210>3<211>24<212>DNA<213>Human<400>
3atgcccatgg ccacaagtga gtac<210>4<211>33<212>DNA<2
13>Human<400>4tagcataagc ttctactctc caaactgatc aat
<210>5<211>12<212>PRT<213>Human<400>5Gly Asp Phe G
lu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln1
5 10[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> JURIDICAL FOUNDATI
ON THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <1
20> Method for preparing yeast-derived recombinant
thorombin <130> JP401YS <160> 5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <2
13> Human <400> 1atggcgcacg tccgaggctt gcagctgcct <210
> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Human <400> 2ctactctcca aactga
tcaa tgaccttct <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Human <400>
3atgcccatgg ccacaagtga gtac <210> 4 <211> 33 <212> DNA <2
13> Human <400> 4tagcataagc ttctactctc caaactgatc aat
<210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 5Gly Asp Phe G
lu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln1
5 10
【図１】ヒトプレトロンビン−２の発現プラスミドの構
築を示す。FIG. 1 shows the construction of an expression plasmid for human prethrombin-2.
【図２】本願発明で得られた組換えヒトトロンビンのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの泳動図を示す。FIG. 2 shows S of recombinant human thrombin obtained in the present invention.
The electrophoretogram of DS-PAGE is shown.
【図３】本願発明で得られた組換えヒトトロンビンのフ
ィブリノペプチドＡリリースアッセイの結果を示す。FIG. 3 shows the results of a fibrinopeptide A release assay of the recombinant human thrombin obtained in the present invention.
【図４】本願発明で得られた組換えヒトトロンビンのプ
ロテインＣの活性化能の測定結果を示す。FIG. 4 shows the results of measuring the protein C activating ability of the recombinant human thrombin obtained in the present invention.
【図５】本願発明で得られた組換えヒトトロンビンの阻
害剤アンチトロンビンIII(ATIII)との反応における二次
速度定数の測定結果を示す。FIG. 5 shows the measurement results of the second-order rate constant in the reaction of the recombinant human thrombin obtained by the present invention with the inhibitor antithrombin III (ATIII).
【図６】本願発明で得られた組換えヒトトロンビンのト
ロンビン欠乏血漿を用いた凝固時間の測定結果を示す。FIG. 6 shows the results of measuring the coagulation time of the recombinant human thrombin obtained by the present invention using thrombin-deficient plasma.
【図７】本願発明で得られた組換えヒトトロンビンの血
小板凝集能の測定結果を示す。FIG. 7 shows the results of measuring the platelet aggregation ability of the recombinant human thrombin obtained in the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中武 博 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 財団法人化学及血清療法研究所 菊池研 究所内 (72)発明者 今村 隆幸 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 財団法人化学及血清療法研究所 菊池研 究所内 (72)発明者 野崎 周英 熊本県菊池郡旭志村川辺四の西沖1314−１ 財団法人化学及血清療法研究所 菊池研 究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 FF01C FF02C LL01 4B065 AA26X AA93Y AA99Y AB01 AC14 BA02 BD03 CA33 ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (72) Inventor Hiroshi Nakatake 134-1, Nishioki, Kawabe, Asahishi-mura, Kikuchi-gun, Kumamoto Prefecture Kikuchi Laboratory, Institute for Chemistry and Serological Therapy (72) Inventor, Takayuki Imamura Kikuchi, Kumamoto 134-1 Kawanishi Nishioki, Asahi Shimura-gun, Gunma 13314 Kikuchi Laboratory, Chemistry and Serum Therapy Research Institute (72) Inventor Shuhide Nozaki 134-1 Kawanishi Nishioki, Asahi Shimura, Kikuchi-gun, Kumamoto Pref. Tokoro Kikuchi Laboratory F-term (reference) 4B024 AA01 BA14 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 FF01C FF02C LL01 4B065 AA26X AA93Y AA99Y AB01 AC14 BA02 BD03 CA33
Claims (4)
ヒトプレトロンビンを産生する大腸菌を培養し、形成さ
れたヒトプレトロンビンを含有する封入体を回収し、可
溶化後、まき直し(以下、リフォールディングともいう)
を経る工程を含む遺伝子組換えヒトトロンビンの調製方
法において、前記封入体の回収、可溶化及びそれに引き
続くまき直しの工程が、1)封入体の可溶化バッファーへ
の懸濁、2)超音波または物理的せん断力を利用した破砕
処理による可溶化、3)リフォールディングバッファーへ
の希釈より構成されることを特徴とする、遺伝子組換え
ヒトトロンビンの調製方法。1. An Escherichia coli producing human prethrombin transformed by a genetic recombination technique is cultured, an inclusion body containing human prethrombin thus formed is recovered, solubilized, and then re-rolled (hereinafter referred to as "re-entry"). (Also called folding)
In the method for preparing a recombinant human thrombin comprising a step of passing through, the step of recovering the inclusion body, solubilization and subsequent re-rolling, 1) suspension of the inclusion body in a solubilization buffer, 2) ultrasonic or A method for preparing recombinant human thrombin, comprising: solubilization by crushing using physical shearing force; and 3) dilution into a refolding buffer.
１００ｍＭ好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭのシステイ
ン、グルタチオン(ＧＳＨ)、ジチオスレイトール(ＤＴ
Ｔ)及び２−メルカプトエタノール(２ＭＥ)より選択さ
れる還元剤並びに４Ｍ〜８Ｍの尿素もしくは２Ｍ〜６Ｍ
のグアニジン塩酸塩の変性剤を含有し、ｐＨ７〜１１で
あることを特徴とする、請求項１記載の遺伝子組換えヒ
トトロンビンの調製方法。2. The method of claim 1, wherein the solubilization buffer of the inclusion body is 10 mM or less.
100 mM, preferably 10 mM to 50 mM cysteine, glutathione (GSH), dithiothreitol (DT
T) and a reducing agent selected from 2-mercaptoethanol (2ME) and 4M to 8M urea or 2M to 6M
The method for preparing a genetically modified human thrombin according to claim 1, wherein the method comprises a guanidine hydrochloride denaturing agent and has a pH of 7 to 11.
Ｍ以上好ましくは０.５Ｍ以上のアルギニン、０.３Ｍ以
上好ましくは０.５Ｍ以上の塩化ナトリウム、１％〜５
０％好ましくは５％〜２０％のグリセロール及び０.０
１％以上の非イオン性界面活性剤を含有することを特徴
とする、請求項１または請求項２記載の遺伝子組換えヒ
トトロンビンの調製方法。3. The method according to claim 2, wherein the refolding buffer is 0.3.
M or more, preferably 0.5M or more arginine, 0.3M or more, preferably 0.5M or more sodium chloride, 1% to 5%
0%, preferably 5% to 20% glycerol and 0.0%
The method for preparing recombinant human thrombin according to claim 1 or 2, comprising 1% or more of a nonionic surfactant.
ギニン、０.３Ｍ以上好ましくは０.５Ｍ以上の塩化ナト
リウム、１％〜５０％好ましくは５％〜２０％のグリセ
ロール及び０.０１％以上の非イオン性界面活性剤を含
有するリフォールディングバッファーを用いて希釈する
ことを特徴とする、大腸菌由来ヒトプレトロンビンのリ
フォールディング方法。4. Arginine of at least 0.3M, preferably at least 0.5M, sodium chloride of at least 0.3M, preferably at least 0.5M, glycerol of 1% to 50%, preferably 5% to 20%, and 0.01%. A method for refolding Escherichia coli-derived human prethrombin, comprising diluting with a refolding buffer containing at least 1% of a nonionic surfactant.
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